TW202221130A

TW202221130A - 唾液酸化雙醣及/或寡醣的細胞生產

Info

Publication number: TW202221130A
Application number: TW110129385A
Authority: TW
Inventors: 蘇菲艾薩爾特; 喬立畢普瑞茲; 彼得卡斯曼; 湯馬士狄康; 諾希卡蘭諾; 葛特彼得斯; 克里斯多夫凡德沃
Original assignee: 比利時商因比奧斯公司
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2021-08-10
Publication date: 2022-06-01
Also published as: CN116323930A; WO2022034080A1; EP4192945A1; US20230313252A1

Abstract

本發明屬於合成生物學及代謝工程改造之技術領域。更特定言之，本發明屬於代謝上經工程改造之細胞及該等細胞在醱酵中之用途的技術領域。本發明描述一種代謝上經工程改造之細胞及一種藉由用該細胞醱酵生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法。該代謝上經工程改造之細胞包含用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，且經修飾以用於表現及/或過度表現編碼一或多種催化相同化學反應之同功蛋白質的多個編碼DNA序列。此外，本發明提供該唾液酸化雙醣及/或寡醣自培養物之純化。

Description

唾液酸化雙醣及/或寡醣的細胞生產

唾液酸化雙醣及寡醣，通常以與蛋白質及脂質之醣結合形式存在，參與許多生命現象，諸如發育、分化、受精、胚胎發生、宿主病原體黏附及發炎。唾液酸化寡醣亦可以非結合聚醣形式存在於體液及哺乳動物乳中，其中唾液酸化寡醣在重要的發育及免疫過程中作為生物活性聚醣進行調節（Bode, Early Hum. Dev. 2015, 91(11): 619-622；Bode, Nestle Nutr. Inst. Workshop Ser. 2019, 90: 191-201；Reily等人, Nat. Rev. Nephrol. 2019, 15: 346-366；Varki, Glycobiology 2017, 27: 3-49；Walsh等人, J. Funct. Foods 2020, 72: 10474）。由於唾液酸化雙醣及寡醣具有寬功能譜，因此存在針對其的巨大科學及商業興趣。然而，唾液酸化雙醣及/或寡醣之可用性受到限制，因為生產依賴於化學或化學酶合成，或依賴於自天然來源，例如動物乳純化。化學合成方法為費力且耗時的，且由於所涉及之大量步驟，該等方法難以擴大規模。使用核苷酸活化糖及醣基轉移酶之酶方法提供優於化學合成之許多優點。醣基轉移酶催化糖部分自核苷酸活化糖供體轉移至醣或非醣受體上（Coutinho等人, J. Mol. Biol. 2003, 328: 307-317）。此等醣基轉移酶為生物技術人員合成唾液酸化雙醣及寡醣之來源，且用於（化學）酶方法以及基於細胞之生產系統兩者中。然而，醣基轉移酶之立體特異性及區位選擇性仍為難對付的挑戰。另外，化學酶方法需要原位再生核苷酸活化糖供體。唾液酸化雙醣及寡醣之細胞生產需要緊密控制互補醣基轉移酶附近足夠含量之核苷酸活化糖供體的時空可用性。歸因於此等困難，當前方法通常導致唾液酸化雙醣及/或寡醣之小規模合成。

PEP或磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate）為細胞合成代謝中之常見前驅物，且對於次級代謝物（諸如類黃酮、芳族胺基酸及唾液酸化雙醣及寡醣或唾液酸化雙醣及寡醣修飾之許多單醣次單元）之合成至關重要。此類單醣次單元為例如N-乙醯基神經胺酸、退伍軍人菌胺酸（legionaminic acid）、酮去氧辛酸、酮-去氧-壬酮糖酸、偽胺酸（pseudaminic acid）、N,N'-二乙醯基-8-表退伍軍人菌胺酸（epilegionaminate）、N-乙醯基-D-胞壁酸及其核苷酸及磷酸化衍生物。為了增強此等單醣次單元及唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成，可藉助於若干基因之過度表現及缺失來增強細胞中之PEP濃度。

Zhu等人（Biotechnol. Lett. 2017, 39: 227-234）已顯示，藉由過度表現PEP合酶（EC：2.7.9.2）及PEP羧激酶（EC：4.1.1.49），N-乙醯基神經胺酸之合成與對照相比分別增加96.4%及61%，組合過度表現與對照相比進一步增加合成高達116.7%。Zhu等人（Biotechnol. Lett 2016, doi 10.1007/s10529-016-2215-z）已進一步顯示缺失受質磷酸轉移酶（phosphotransferase；PTS）系統，如大腸桿菌（ E. coli）中由基因 nagE編碼之N-乙醯基葡萄糖胺PTS系統，使用PEPN-乙醯基葡萄糖胺（N-acetylglucosamine；GlcNAc）及葡萄糖胺（glucosamine；GlcN）輸送及磷酸化至細胞中，或如大腸桿菌中由基因 manX、 manY及 manZ編碼之甘露糖PTS系統，使用PEP甘露糖、N-乙醯基甘露糖胺、葡萄糖、果糖、GlcN及GlcNAc輸送及磷酸化至細胞中，顯著增加Neu5Ac合成。後續亦在EP3697805及EP3575404中顯示大腸桿菌中 ppsA之上調有效，亦將 ppsA過度表現與 manXYZ及 nagE之缺失組合。

Zhang等人（Biotech and Bioeng. 2018, 115(9): 217-2231）以類似方式改良枯草桿菌（ Bacillus subtilis）中之PEP合成。缺失葡萄糖PTS系統以減少葡萄糖吸收後之PEP使用，缺失基因丙酮酸激酶（EC：2.7.1.40）以減少PEP消耗，且過度表現基因PEP羧激酶（EC：4.1.1.49）以增強通量朝向。為了補償葡萄糖PTS系統之缺失，葡萄糖透過酶（glucose permase）及葡萄糖激酶用於內化及磷酸化細胞中之葡萄糖。此外，引入蘋果酸酶（EC：1.1.1.38，EC：1.1.1.39或EC: 1.1.1.40）以增加自克氏循環（Krebs cycle）朝向丙酮酸，即PEP之前驅物的通量。減少之醣解及恩納杜道夫途徑（Entner-Doudoroff pathway）之引入進一步增強N-乙醯基神經胺酸之生產。注意，此等菌株在其基礎上其乙酸及乳酸合成能力經修飾，此本質上引起PEP、丙酮酸及乙醯基-CoA之可用性改良。

Zhang等人（Biotech. Adv. 2019, 37: 787-800）亦評述且描述可如何調節N-乙醯基神經胺酸及唾液酸化寡醣之前驅物。藉由影響細胞中之PEP及丙酮酸可用性，增強朝向唾液酸化寡醣及N-乙醯基神經胺酸（或如上文所描述之其他單醣次單元）的通量。同樣在此，描述缺失或減弱醣解途徑（包含磷酸果糖激酶（phosphofructokinase；pfkA基因，E.C.：2.7.1.11）及丙酮酸激酶（pyruvate kinase；pyk，EC：2.7.1.40））及上調磷酸烯醇丙酮酸合酶基因（phosphoenolpyruvate synthase gene；ppsA，EC：2.7.9.2）的技術。引入或過度表現恩納杜道夫途徑及PTS活性降低進一步引起合成改良。所描述之系統不僅藉由過度表現或缺失，而且藉由經由生物感測器之動力控制來達成，該等生物感測器選擇性上調及下調細胞生物化學中之反應。

本發明之一目標為提供工具及方法，藉助於該等工具及方法，唾液酸化雙醣及/或寡醣可藉由細胞生產，且較佳地以一種高效、有時間效益及成本效益之方式生產，且該等工具及方法產生大量所需唾液酸化雙醣及/或寡醣。

根據本發明，此目標及其他目標藉由提供一種細胞及一種用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法來達成，其中該細胞經用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑代謝工程改造，且其中該細胞經能夠表現及/或過度表現一或多種催化相同化學反應之蛋白質的多個編碼DNA序列修飾。出人意料地，現已發現，代謝上經工程改造以用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之本發明細胞不因引入編碼一或多種催化相同化學反應之蛋白質的多個編碼DNA序列而遭受純系不穩定性、純系異質性或轉殖基因靜默。本發明細胞中該等多個編碼DNA序列之引入及表現及/或過度表現較佳對該唾液酸化雙醣及/或寡醣之醱酵生產具有正面效果，且甚至更佳為，在該等序列用於代謝工程改造生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之細胞時，當與具有相同遺傳背景但缺少如本發明中所定義之該等多個編碼DNA序列之細胞相比時，提供該細胞之較好產率、生產率、比生產率及/或生長速度。本發明亦提供一種用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法。該方法包含以下步驟：提供包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑的細胞，其中該細胞經編碼一或多種催化相同化學反應之蛋白質的多個編碼DNA序列修飾，及在允許生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之條件下培養該細胞。由多個編碼DNA序列編碼之蛋白質尤其包含參與核苷酸活化糖合成之酶，其中該核苷酸活化糖將用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣，及膜運輸蛋白。本發明亦提供分離該唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法。定義

用於本說明書中以描述本發明之字組及其各種具體實例應不僅以其通常所定義之含義來理解，而且應包括在通常所定義含義之範圍以外之在本說明書中特定定義的結構、材料或作用。因此，若元件在本說明書之上下文中可理解為包括多於一個含義，則其在申請專利範圍中之使用必須理解為由本說明書及字組自身支持之一般至所有可能含義。

本文所揭示之本發明之各種具體實例及具體實例之態樣應不僅以本說明書中特定描述之次序及情形來理解，而且包括任何次序及其任何組合。每當情形需要時，將認為以單數形式使用之所有字組包括複數形式，且反之亦然。除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語一般具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解相同之含義。一般而言，本文所使用之命名法及本文所描述的細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合為所屬技術領域中熟知且常用之命名法、細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合。使用標準技術進行核酸及肽合成。一般而言，酶反應及純化步驟係根據製造商說明書進行。

在圖式及本說明書中，已揭示本發明之具體實例，且儘管採用特定術語，但該等術語僅以描述性意義使用且並非出於限制本發明之範圍之目的，本發明之範圍闡述於以下申請專利範圍中。必須理解，所說明之具體實例僅出於示例目的而闡述，且不應視為限制本發明。所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見，改變、其他具體實例、改良、細節及用途可與本文中本發明之文字及精神一致且在本發明之範圍內作出，本發明之範圍僅受申請專利範圍限制，申請專利範圍根據專利法解釋，包括等同原則。在以下申請專利範圍中，用於指定請求項步驟之參考標號僅為便於描述而提供，且並不意欲暗示進行該等步驟之任何特定順序。

在此文件及其申請專利範圍中，動詞「包含（to comprise）」及其詞形變化形式以其非限制性意義使用，意謂包括該字組之後的項目，但不排除未具體提及之項目。在整個申請案中，動詞「包含」可由「由……組成（to consist）」或「基本上由……組成（to consist essentially of）」替換，且反之亦然。另外，動詞「由……組成」可由「基本上由……組成」替換，意謂如本文所定義之組成物可包含除具體鑑別之組分外的（多種）額外組分，該（等）額外組分不改變本發明之獨特特徵。另外，藉由不定冠詞「一（a或an）」提及一元件並不排除存在多於一個元件的可能性，除非上下文明確要求存在一個且僅存在一個元件。因此不定冠詞「一」通常意謂「至少一個（at least one）」。在整個申請案中，除非另外明確陳述，否則冠詞「一」較佳由「至少兩個（at least two）」替換，更佳由「至少三個（at least three）」替換，甚至更佳由「至少四個（at least four）」替換，甚至更佳由「至少五個（at least five）」替換，甚至更佳由「至少六個（at least six）」替換，最佳由「至少七個（at least seven）」替換。

在整個本申請案中，除非另外明確陳述，否則特徵「合成（synthesize）」、「合成（synthesized）」及「合成（synthesis）」可分別與特徵「生產（produce）」、「生產（produced）」及「生產（production）」互換地使用。

除非另外指示，否則如本文中鑑別之各具體實例可組合在一起。本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經具體且個別地指示以引用的方式併入一般。優先權申請案，包括EP21168997、EP20190198、EP20190200、EP20190205之全部內容亦以引用之方式併入，其引用的程度如同該等優先權申請案具體且個別地指示以引用的方式併入一般。

根據本發明，術語「聚核苷酸（polynucleotide）」一般係指可為未修飾RNA或DNA或經修飾RNA或DNA之任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸。「聚核苷酸」包括但不限於單股及雙股DNA；為單股及雙股區或單股、雙股及三股區之混合物的DNA；單股及雙股RNA；及為單股及雙股區之混合物的RNA；包含可為單股或更通常雙股或三股區、或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA的雜合分子。另外，如本文所用，「聚核苷酸」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。此類區中之股可來自相同分子或來自不同分子。該等區可包括一或多個分子之全部，但更通常僅涉及一些分子之區。三螺旋區之分子中之一者通常為寡核苷酸。如本文所用，術語「聚核苷酸」亦包括含有一或多個經修飾鹼基之如上文所描述之DNA或RNA。因此，出於穩定性或其他原因主鏈經修飾之DNA或RNA為根據本發明之「聚核苷酸」。此外，包含不常見鹼基（諸如肌苷）或經修飾鹼基（諸如三苯甲基化鹼基）的DNA或RNA應理解為由術語「聚核苷酸」涵蓋。應瞭解，已對DNA及RNA進行多種修飾，此用於所屬技術領域中具有通常知識者已知之許多適用目的。如本文所採用之術語「聚核苷酸」涵蓋聚核苷酸之此類化學、酶或代謝修飾形式，以及病毒及細胞，包括例如簡單及複雜細胞之DNA及RNA特徵的化學形式。術語「聚核苷酸」亦涵蓋通常稱為寡核苷酸之短聚核苷酸。

「多肽（polypeptide）」係指包含兩個或更多個藉由肽鍵或經修飾肽鍵彼此接合之胺基酸的任何肽或蛋白質。「多肽」係指短鏈（通常稱為肽、寡肽及寡聚物）及長鏈（通常稱為蛋白質）兩者。多肽可含有除20種基因編碼之胺基酸以外之胺基酸。「多肽」包括藉由自然過程（諸如加工及其他轉譯後修飾）以及藉由化學修飾技術修飾之多肽。此類修飾充分描述於基本教材及更詳細專論中以及大量研究文獻中，且為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。相同類型之修飾可在給定多肽中若干位點處以相同或不同程度存在。此外，給定多肽可含有多種類型之修飾。修飾可發生在多肽中之任何位置，包括肽主鏈、胺基酸側鏈及胺基端或羧基端。修飾包括例如乙醯化、醯化、ADP核糖基化、醯胺化、黃素之共價連接、血基質部分之共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價連接、脂質或脂質衍生物之共價連接、磷脂醯肌醇之共價連接、交聯、環化、雙硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、焦麩胺酸之形成、甲醯化、γ-羧化、醣基化、GPI錨定物形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、脂質連接、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧化、羥基化及ADP核糖基化、硒化、轉移RNA介導之向蛋白質添加胺基酸，諸如精胺醯化，及泛素化。多肽可為分支鏈的，或為環狀，具有或不具有分支。環狀、分支鏈及分支鏈環狀多肽可由轉譯後自然過程產生，且亦可藉由完全合成方法製備。

「經分離（isolated）」意謂自天然狀態「人工（by the hand of man）」改變，亦即若其存在於自然界中，則其自其原始環境改變或移除或兩者。舉例而言，天然存在於活生物體中之聚核苷酸或多肽未「經分離」，但與其天然狀態之共存物質分離的相同聚核苷酸或多肽「經分離」，如該術語在本文中所用。類似地，如本文所用之術語「合成（synthetic）」序列意謂已合成產生且不直接自天然來源分離之任何序列。如本文所用之術語「合成（synthesized）」意謂任何合成產生之序列且不直接自天然來源分離。

「重組（recombinant）」意謂藉由將來自一種物種之基因移植或剪接至不同物種之宿主生物體之細胞中來製備的經基因工程改造之DNA。此類DNA成為宿主基因組成之一部分且經複製。

在本發明之上下文內，術語「內源（endogenous）」係指任何作為細胞之天然部分且存在於其在細胞染色體中之天然位置處且與作用於其表現之天然控制機制相比，表現之控制尚未改變的聚核苷酸、多肽或蛋白質序列。術語「外源（exogenous）」係指任何來源於研究下之細胞的外部且不來源於細胞之天然部分或不存在於其在細胞染色體或質體中之天然位置處的聚核苷酸、多肽或蛋白質序列。

當提及聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶使用時，術語「異源（heterologous）」係指來自宿主生物體物種之外的源或衍生自宿主生物體物種之外的源的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相反，本文使用「同源（homologous）」聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶表示衍生自宿主生物體物種的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。當提及基因調節序列或用於維持或操縱基因序列的輔助核酸序列（例如啟動子、5'非轉譯區、3'非轉譯區、聚A添加序列、內含子序列、剪接位點、核糖體結合位點、內部核糖體進入序列、基因體同源區、重組位點等）時，“異源”意謂調節序列或輔助序列不與調節或輔助核酸序列在構築體、基因體、染色體或游離基因體中並置的基因天然相關。因此，可操作地連接於在天然狀態下（亦即在非基因工程改造生物體之基因體中）不與啟動子可操作連接之基因的啟動子在本文中稱為「異源啟動子（heterologous promoter）」，即使該啟動子可衍生自與其連接之基因相同的物種（或在一些情況下，相同的生物體）。

如本文所用，術語「編碼多肽之聚核苷酸（polynucleotide encoding a polypeptide）」涵蓋包括編碼本發明多肽之序列的聚核苷酸。術語亦涵蓋包括編碼多肽之單個連續區或非連續區（例如間雜有整合噬菌體或插入序列或編輯）以及亦可含有編碼及/或非編碼序列之額外區的聚核苷酸。

術語基因之「經修飾表現（modified expression）」係指在所需唾液酸化雙醣及/或寡醣之生產過程的任何階段中，與該基因之野生型表現相比的表現變化。該經修飾表現與野生型相比為較低或較高表現，其中術語「較高表現（higher expression）」亦定義為在內源基因情況下該基因之「過度表現（overexpression）」，或在不存在於野生型菌株中之異源基因情況下的「表現（expression）」。較低表現藉助於所屬技術領域中具有通常知識者之常見熟知技術（諸如使用siRNA、CrispR、CrispRi、核糖開關、重組工程、同源重組、ssDNA突變誘發、RNAi、miRNA、asRNA、突變基因、剔除基因、轉位子突變誘發……）而獲得，該等技術用於以使基因生產功能性最終產物之能力減弱（亦即與功能性野生型基因相比，統計顯著『能力減弱』）或完全不能生產功能性最終產物（諸如剔除基因）的方式改變基因。如本文所用，術語「核糖開關（riboswitch）」定義為信使RNA之一部分，其摺疊成藉由干擾轉譯而阻斷表現之錯綜複雜的結構。效應分子之結合誘導構形變化，允許轉錄後之調節表現。過度表現或表現藉助於所屬技術領域中具有通常知識者之常見熟知技術（諸如使用人工轉錄因子、從頭設計啟動子序列、核糖體工程改造、在常染色質處引入或再引入表現模組、使用高複製數質體）而獲得，其中該基因為「表現卡匣（expression cassette）」之一部分，表現卡匣係指任何序列，其中存在啟動子序列、非轉譯區序列（含有核糖體結合序列或科札克序列（Kozak sequence））、編碼序列（例如N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶）及視情況選用之轉錄終止子，且引起功能性活性蛋白之表現。該表現為持續性或條件性或調節或可調的。

術語「持續性表現（constitutive expression）」定義為在某些生長條件下不受除RNA聚合酶之次單元（例如細菌σ因子）外之轉錄因子調節的表現。此類轉錄因子之非限制性實例為大腸桿菌中之CRP、LacI、ArcA、Cra、IclR，或釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）中之Aft2p、Crz1p、Skn7，或枯草桿菌（ B. subtilis）中之DeoR、GntR、Fur。此等轉錄因子結合於特定序列上且可在某些生長條件下阻斷或增強表現。RNA聚合酶為用於自DNA模板合成RNA之催化機構。RNA聚合酶結合特定序列以起始轉錄，例如經由原核宿主中之σ因子或經由酵母中之MTF1。持續性表現在不需要誘導或抑制之情況下提供恆定表現量。

術語「調節表現（regulated expression）」定義為在某些生長條件下受除RNA聚合酶之次單元（例如與RNA聚合酶核心酶共締合之細菌σ因子，如σ ⁷⁰、σ ⁵⁴或相關σ因子，及酵母粒線體RNA聚合酶特異性因子MTF1）外之轉錄因子調節的表現。此類轉錄因子之實例描述於上文。通常表現調節藉助於以下者獲得：誘導因子，諸如但不限於IPTG、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、別乳糖（allo-lactose），或pH變化，或溫度變化，或碳耗乏或受質或生產的產物。

術語「控制序列（control sequence）」係指藉由宿主細胞轉錄及轉譯系統識別之序列，允許聚核苷酸序列轉錄及轉譯成多肽。因此，此類DNA序列為在特定宿主細胞或生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需。此類控制序列可為但不限於啟動子序列、核糖體結合序列、夏因達爾加諾序列（Shine Dalgarno sequence）、科札克序列、轉錄終止子序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。若前序列或分泌性前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其可與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。該等控制序列另外可經由誘導型啟動子或經由誘導或抑制該聚核苷酸轉錄或轉譯成多肽之遺傳迴路，經外部化學物質，諸如但不限於IPTG、阿拉伯糖、乳糖、別乳糖、鼠李糖或岩藻糖控制。

一般而言，「可操作地連接（operably linked）」意謂所連接之DNA序列為連續的且在分泌性前導序列之情況下，為連續的且處於閱讀階段。然而，增強子不必為連續的。

術語「野生型（wild type）」係指其在自然界中存在時通常已知的遺傳或表型情況。

如本文所用，術語「蛋白質之經修飾表現或活性（modified expression or activity of a protein）」係指i）內源蛋白之較高表現或過度表現，ii）異源蛋白之表現或iii）與野生型（亦即天然）蛋白質相比，具有較高活性之變異蛋白的表現及/或過度表現。

如本文所用，術語「乳腺細胞（mammary cell）」大體上係指乳腺上皮細胞、乳腺上皮管腔細胞或哺乳動物上皮肺泡細胞或其任何組合。如本文所用，術語「類乳腺細胞（mammary-like cell）」大體上係指具有類似於（或實質上類似於）天然乳腺細胞但衍生自非乳腺細胞來源之表型/基因型的細胞。此類的類乳腺細胞可經工程改造以移除至少一個非所需遺傳組件及/或包括至少一個乳腺細胞典型的預定遺傳構築體。類乳腺細胞之非限制性實例可包括類乳腺上皮細胞、類乳腺上皮管腔細胞、展現乳腺細胞譜系之細胞之一或多種特徵的非乳腺細胞或其任何組合。類乳腺細胞之進一步非限制性實例可包括具有類似於（或實質上類似於）天然乳腺細胞之表型，或更特定言之類似於（或實質上類似於）天然乳腺上皮細胞之表型的細胞。具有類似於（或實質上類似於）天然乳腺細胞或乳腺上皮細胞之表型，或展現至少一種類似於（或實質上類似於）天然乳腺細胞或乳腺上皮細胞之特徵的細胞可包含展現天然或已經工程改造以能夠表現至少一種乳組分的細胞（例如衍生自乳腺細胞譜系或非乳腺細胞譜系）。

如本文所用，術語「非乳腺細胞（non-mammary cell）」一般可包括任何非乳腺譜系之細胞。在本發明之上下文中，非乳腺細胞可為能夠經工程改造以表現至少一種乳組分之任何哺乳動物細胞。此類非乳腺細胞之非限制性實例包括肝細胞、血細胞、腎細胞、臍帶血細胞、上皮細胞、表皮細胞、肌細胞、纖維母細胞、間葉細胞或其任何組合。在一些情況下，分子生物學及基因體編輯技術可經工程改造以同時消除、靜默或減弱無數基因。

在整個本申請案中，除非另外明確陳述，否則表述「能夠……＜動詞＞（capable of…＜verb＞）」及「能夠……＜動詞＞（capable to…＜verb＞）」較佳地用該動詞之主動語態替換，且反之亦然。舉例而言，表述「能夠表現（capable of expressing）」較佳地用「表現（express）」替換，且反之亦然，亦即「表現」較佳地用「能夠表現」替換。

如本文所用，術語「變異體（variant）」為分別與參考聚核苷酸或多肽不同但保持基本特性之聚核苷酸或多肽。聚核苷酸之典型變異體與另一參考聚核苷酸在核苷酸序列方面不同。變異體之核苷酸序列之變化可能會或可能不會改變由參考聚核苷酸編碼之多肽的胺基酸序列。如下文所論述，核苷酸變化可能在參考序列編碼之多肽中引起胺基酸取代、添加、缺失、融合及截斷。多肽之典型變異體與另一參考多肽在胺基酸序列方面不同。通常，差異係有限的，以致參考多肽之序列與變異體之序列總體上十分相似且在許多區中一致。藉由呈任何組合之一或多個取代、添加、缺失，變異體與參考多肽可在胺基酸序列方面不同。取代或插入之胺基酸殘基可為或可不為由遺傳密碼編碼之殘基。聚核苷酸或多肽之變異體可為天然產生的，諸如對偶基因變異體，或其可為未已知為天然產生的變異體。聚核苷酸及多肽之非天然產生變異體可藉由突變誘發技術、藉由直接合成及藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他重組方法製得。

在一些具體實例中，本發明考慮藉由修飾如本發明中所用之所關注蛋白質之結構來製備功能變異體。變異體可藉由胺基酸取代、缺失、添加或其組合產生。舉例而言，可合理地預期，白胺酸用異白胺酸或纈胺酸之獨立置換、天冬胺酸用麩胺酸之獨立置換、蘇胺酸用絲胺酸之獨立置換或胺基酸用結構上相關之胺基酸之類似置換（例如保守突變）不會對所得分子之生物活性產生重大影響。保守置換為在側鏈相關之胺基酸家族內發生的置換。藉由評定變異多肽以類似於野生型多肽之方式在細胞中產生反應的能力，可容易地確定本發明之多肽之胺基酸序列的變化是否產生功能同源物。

如本文所用，術語「功能同源物（functional homolog）」描述具有序列相似性且亦共有至少一種功能特徵，諸如生物化學活性的彼等分子。更特定言之，如本文所用之術語「功能同源物」描述具有序列相似性（換言之，同源性）且同時具有至少一種功能相似性，諸如生物化學活性的彼等蛋白質（Altenhoff等人, PLoS Comput. Biol. 8 (2012) e1002514）。

功能同源物有時稱為異種同源物，其中「異種同源物（ortholog）」係指作為另一物種中所參考之基因或蛋白質之功能等效物的同源基因或蛋白質。功能同源物典型地將產生類似但未必相同程度之相同特徵。功能上同源之蛋白質產生相同特徵，其中藉由一種同源物產生之定量量測值為另一者之至少10%；更典型地，為由原始分子產生之定量量測值的至少20%，在約30%與約40%之間；例如在約50%與約60%之間；在約70%與約80%之間；或在約90%與約95%之間；在約98%與約100%之間，或大於100%。因此，在分子具有酶活性的情況下，功能同源物將具有與原始酶相比以上所列舉之酶活性百分比。在分子為DNA結合分子（例如多肽）的情況下，與原始分子相比，如藉由結合分子之重量所量測，同源物將具有結合親和力之以上所列舉百分比。

功能同源物及參考多肽可為天然產生的多肽，且序列相似性可歸因於趨同或趨異進化事件。

可藉由分析核苷酸及多肽序列比對來鑑別功能同源物。舉例而言，對核苷酸或多肽序列之資料庫執行查詢可鑑別例如生物質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質或膜運輸蛋白。序列分析可涉及分別使用生物質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質或膜運輸蛋白之胺基酸序列作為參考序列對非冗餘資料庫進行BLAST、相互BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情況下，胺基酸序列係自核苷酸序列推導出。典型地，資料庫中具有超過40%序列一致性之彼等多肽為進一步評估是否適合分別作為生物質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質或膜運輸蛋白的候選物。胺基酸序列相似性允許保守胺基酸取代，諸如一個疏水性殘基取代另一個或一個極性殘基取代另一個。較佳地，藉由保守取代，意指以下組合，諸如甘胺酸藉由丙胺酸取代，且反之亦然；纈胺酸、異白胺酸及白胺酸藉由甲硫胺酸取代，且反之亦然；天冬胺酸藉由麩胺酸取代，且反之亦然；天冬醯胺藉由麩醯胺酸取代，且反之亦然；絲胺酸藉由蘇胺酸取代，且反之亦然；離胺酸藉由精胺酸取代，且反之亦然；半胱胺酸藉由甲硫胺酸取代，且反之亦然；及苯丙胺酸及酪胺酸藉由色胺酸取代，且反之亦然。視需要，可進行此類候選物之人工檢驗以便限制待進一步評估之候選物之數目。視需要，可進行此類候選物之人工檢驗以便限制待進一步評估之候選物之數目。人工檢驗可藉由選擇似乎具有存在於生產力調節多肽中之域（例如保守功能域）之彼等候選物來進行。

域可例如藉由Pfam（El-Gebali等人, Nucleic Acids Res. 47 (2019) D427-D432）、InterPro域（InterPro domain；IPR）（Mitchell等人, Nucleic Acids Res. 47 (2019) D351-D360）、蛋白質指紋域（PRINTS）（Attwood等人, Nucleic Acids Res. 31 (2003) 400-402）、SUBFAM域（Gough等人, J. Mol. Biol. 313 (2001) 903-919）、TIGRFAM域（Selengut等人, Nucleic Acids Res. 35 (2007) D260-D264）、保守域資料庫（Conserved Domain Database；CDD）名稱（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）（Lu等人, Nucleic Acids Res. 48 (2020) D265-D268）、PTHR域（http://www.pantherdb.org）（Mi等人, Nucleic Acids. Res. 41 (2013) D377-D386; Thomas等人, Genome Research 13 (2003) 2129-2141）或PATRIC標識符或PATRIC DB全球家族域（https://www.patricbrc.org/）（Davis等人, Nucleic Acids Res. 48(D1) (2020) D606-D612）定性。所屬技術領域中具有通常知識者應理解，對於本文所用之包含Pfam 32.0（2018年9月發佈）、CDD v3.17（2019年4月3日發佈）、eggnogdb 4.5.1（2016年9月發佈）、InterPro 75.0（2019年7月4日發佈）、TCDB（2019年6月17日發佈）及PATRIC 3.6.9（2020年3月發佈）的資料庫，各資料庫之內容在各發佈版本中為固定的且不會改變。當特定資料庫之內容改變時，此特定資料庫接收具有新的發佈日期之新的發佈版本。各資料庫之所有發佈版本及其對應發佈日期及如在此等特定發佈日期標註之特定內容均為可獲得的且為所屬技術領域中具有通常知識者已知。

在整個申請案中，聚核苷酸序列可由SEQ ID NO或可替代地由GenBank NO表示。因此，除非另外明確陳述，否則術語「聚核苷酸SEQ ID NO（polynucleotide SEQ ID NO）」及「聚核苷酸GenBank NO.（polynucleotide GenBank NO.）」可互換使用。

在整個申請案中，多肽序列可由SEQ ID NO或可替代地由UniProt ID或GenBank NO表示。因此，除非另外明確陳述，否則術語「多肽SEQ ID NO（polypeptide SEQ ID NO）」及「多肽UniProt ID（polypeptide UniProt ID）」及「多肽GenBank NO.（polypeptide GenBank NO.）」可互換使用。

如本文所用，術語「同功蛋白質（isoprotein）」係指具有相似結構及功能特性、催化相同化學反應之密切相關酶或蛋白質的任何家族。

如本文所用，術語「化學反應（chemical reaction）」係指一或多種物質，亦即反應物，分別轉化或易位至一或多種不同物質或位置、產物或細胞位置的過程。物質為化學元素或化合物。化學反應重排或運輸反應物之組成原子或分子以產生不同物質作為產物，或將原子或分子易位至細胞質或細胞外空間。此類化學反應之實例為生物化學、酶、有機化學、無機化學、生物催化及代謝反應，或為包含輸入、流出、分泌及排泄反應之運輸反應。

在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中，術語「一致（identical）」或「一致性百分比（percent identity）」或「一致性%（%identity）」係指當出於最大對應性比較及比對時，如使用序列比較演算法或藉由目視檢驗所量測，兩個或更多個序列或子序列相同或具有相同核苷酸或胺基酸殘基之指定百分比。對於序列比較，一個序列充當參考序列，將測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。接著，序列比較演算法根據所指定之程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。可在參考序列之全長序列內全域計算一致性百分比，得到整體一致性百分比評分。或者，可在參考序列之部分序列內計算一致性百分比，得到局部一致性百分比評分。在局部序列比對中使用參考序列之全長產生測試與參考序列之間的整體一致性百分比評分。

一致性百分比可使用不同演算法如例如BLAST及PSI-BLAST（Altschul等人, 1990, J Mol Biol 215:3, 403- 410；Altschul等人, 1997, Nucleic Acids Res 25: 17, 3389-402）、Clustal Omega方法（Sievers等人, 2011, Mol. Syst. Biol. 7:539）、MatGAT方法（Campanella等人, 2003, BMC Bioinformatics, 4:29）或EMBOSS Needle測定。

基本局部比對檢索工具（Basic Local Alignment Search Tool；BLAST）比對方法為由國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information；NCBI）提供以使用預設參數比較序列之演算法。程式將核苷酸或蛋白質序列與序列資料庫比較且計算統計顯著性。位置特異性迭代基本局部比對檢索工具（Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool；PSI-BLAST）使用蛋白質-蛋白質BLAST（BLASTp）自偵測超過給定評分臨限值的序列之多個序列比對導出位置特異性評分矩陣（position-specific scoring matrix；PSSM）或概況。BLAST方法可用於成對或多序列比對。成對序列比對用於鑑別具有相似性之區，其可以指示兩個生物序列（蛋白質或核酸）之間的功能、結構及/或進化關係。BLAST之網頁介面可在以下獲得：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

Clustal Omega（Clustal Ω）為一種使用種子導引樹及HMM概況-概況技術以在三個或更多個序列之間產生比對的多序列比對程式。其產生發散序列之生物學上有意義的多序列比對。Clustal Ω之網頁介面可在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/下獲得。使用Clustal Ω方法進行多序列比對及蛋白質序列一致性百分比計算之預設參數為：啟用輸入序列之去比對：FALSE；啟用mbed類集群引導樹：TRUE；啟用mbed類集群迭代：TRUE；（組合引導樹/HMM）迭代之數目：預設(0)；最大引導樹迭代：預設[-1]；最大HMM迭代：預設[-1]；命令：比對。

矩陣全域比對工具（Matrix Global Alignment Tool；MatGAT）為一種在不需要預比對資料之情況下產生DNA或蛋白質序列之相似性/一致性矩陣的電腦應用。程式使用邁爾斯及米勒全域比對演算法（Myers and Miller global alignment algorithm）進行一系列成對比對，計算相似性及一致性，且接著將結果置於距離矩陣中。使用者可以指定採用何種類型之比對矩陣（例如BLOSUM50、BLOSUM62及PAM250）進行其蛋白質序列檢查。

當考慮到兩個序列的整個長度時，EMBOSS Needle（https://galaxy-iuc.github.io/emboss-5.0-docs/needle.html）使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch）全局比對演算法尋找兩個序列之最佳比對（包括空位）。藉由動態程式化方法藉由探究所有可能的比對且選擇最佳比對來確保最佳比對。尼德曼-翁施演算法為一類演算法之成員，其可按mn步驟之次序計算最佳評分及比對（其中『n』及『m』為兩個序列之長度）。空位開放罰分（預設10.0）為當產生空位時所扣除之分數。預設值假設您將EBLOSUM62矩陣用於蛋白質序列。空位延伸（預設0.5）罰分被添加至空位中之每一鹼基或殘基之標準空位罰分。此為懲罰長空位之方式。

如本文所用，與參考多肽序列之全長序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列的多肽應理解為與參考多肽序列之胺基酸序列全長具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、91.50%、92.00%、92.50%、93.00%、93.50%、94.00%、94.50%、95.00%、95.50%、96.00%、96.50%、97.00%、97.50%、98.00%、98.50%、99.00%、99.50%、99.60%、99.70%、99.80%、99.90%、100%序列一致性的序列。在整個申請案中，除非另外明確指定，否則包含與參考多肽（或核苷酸序列）之全長胺基酸序列（或核苷酸序列）具有至少80%序列一致性的胺基酸序列（或核苷酸序列）的多肽（或DNA序列）/由與參考多肽（或核苷酸序列）之全長胺基酸序列（或核苷酸序列）具有至少80%序列一致性的胺基酸序列（或核苷酸序列）的多肽（或DNA序列）組成/具有與參考多肽（或核苷酸序列）之全長胺基酸序列（或核苷酸序列）具有至少80%序列一致性的胺基酸序列（或核苷酸序列）的多肽（或DNA序列），通常用SEQ ID NO或UniProt ID或Genbank NO.指示，與全長參考序列較佳具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，更佳具有至少85%，甚至更佳具有至少90%，最佳具有至少95%的序列一致性。

出於本發明之目的，一致性百分比係使用MatGAT2.01（Campanella等人, 2003, BMC Bioinformatics 4:29）來測定。採用針對蛋白質之以下預設參數：（1）空位成本存在：12及延伸：2；（2）所用矩陣為BLOSUM65。在一個較佳具體實例中，序列一致性係基於給定SEQ ID NO，亦即參考序列之全長序列或其部分計算。其部分較佳意謂完整參考序列之至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。

術語「唾液酸（sialic acid）」、「N-乙醯基神經胺酸（N-acetylneuraminate）」「N-醯基神經胺酸（N-acylneuraminate）」、「N-乙醯基神經胺酸（N-acetylneuraminic acid）」可互換使用且係指具有包含但不限於以下者之九碳主鏈的酸糖：Neu4Ac；Neu5Ac；Neu4,5Ac2；Neu5,7Ac2；Neu5,8Ac2；Neu5,9Ac2；Neu4,5,9Ac3；Neu5,7,9Ac3；Neu5,8,9Ac3；Neu4,5,7,9Ac4；Neu5,7,8,9Ac4，Neu4,5,7,8,9Ac5及Neu5Gc。

Neu4Ac亦稱為4-O-乙醯基-5-胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸或4-O-乙醯基神經胺酸且具有C11H19NO9作為分子式。Neu5Ac亦稱為5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、D-甘油-5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-半乳-壬-2-酮-哌喃糖酸、5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮哌喃糖酸、5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-壬酮糖酸或5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸且具有C11H19NO9作為分子式。Neu4,5Ac2亦稱為N-乙醯基-4-O-乙醯基神經胺酸、4-O-乙醯基-N-乙醯基神經胺酸、4-O-乙醯基-N-乙醯基神經胺酸、4-乙酸5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸、4-乙酸5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、4-乙酸5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸或4-乙酸5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸且具有C13H21NO10作為分子式。Neu5,7Ac2亦稱為7-O-乙醯基-N-乙醯基神經胺酸、N-乙醯基-7-O-乙醯基神經胺酸、7-O-乙醯基-N-乙醯基神經胺酸、7-乙酸5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸、7-乙酸5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、7-乙酸5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸或7-乙酸5-(乙醯基胺基)-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸且具有C13H21NO10作為分子式。Neu5,8Ac2亦稱為5-n-乙醯基-8-o-乙醯基神經胺酸且具有C13H21NO10作為分子式。Neu5,9Ac2亦稱為N-乙醯基-9-O-乙醯基神經胺酸、9-鳳梨, 9-O-乙醯基唾液酸、9-O-乙醯基-N-乙醯基神經胺酸、5-n-乙醯基-9-O-乙醯基神經胺酸、N,9-O-二乙醯基神經胺酸或N,9-O-二乙醯基神經胺酸且具有C13H21NO10作為分子式。Neu4,5,9Ac3亦稱為5-N-乙醯基-4,9-二-O-乙醯基神經胺酸。Neu5,7,9Ac3亦稱為5-N-乙醯基-7,9-二-O-乙醯基神經胺酸。Neu5,8,9Ac3亦稱為5-N-乙醯基-8,9-二-O-乙醯基神經胺酸。Neu4,5,7,9Ac4亦稱為5-N-乙醯基-4,7,9-三-O-乙醯基神經胺酸。Neu5,7,8,9Ac4亦稱為5-N-乙醯基-7,8,9-三-O-乙醯基神經胺酸。Neu4,5,7,8,9Ac5亦稱為5-N-乙醯基-4,7,8,9-四-O-乙醯基神經胺酸。Neu5Gc亦稱為N-羥乙醯基-神經胺酸、N-羥乙醯基神經胺酸、N-羥乙醯基神經胺酸、N-羥乙醯基-神經胺酸、N-羥乙醯基-神經胺酸、N-羥乙醯基神經胺酸、3,5-雙去氧-5-((羥基乙醯基)胺基)-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、3,5-雙去氧-5-(羥乙醯基胺基)-D-甘油-D-半乳-2-壬酮哌喃糖酸、3,5-雙去氧-5-(羥乙醯基胺基)-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、3,5-雙去氧-5-[(羥基乙醯基)胺基]-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、D-甘油-5-羥乙醯基醯胺基-3,5-雙去氧-D-半乳-壬-2-酮-哌喃糖酸且具有C11H19NO10作為分子式。

如本文所用之術語「NeunAc合酶（NeunAc synthase）、「N-乙醯基神經胺酸合酶（N-acetylneuraminic acid synthase）」、「N-乙醯基神經胺酸合酶（N-acetylneuraminate synthase）」、「唾液酸合酶（sialic acid synthase）」、「NeuAc合酶（NeuAc synthase）」、「NeuB」、「NeuB1」、「NeuNAc合酶（NeuNAc synthase）」、「NANA縮合酶（NANA condensing enzyme）」、「N-乙醯基神經胺酸解離酶合酶（N-acetylneuraminate lyase synthase）」、「N-乙醯基神經胺酸縮合酶（N-acetylneuraminic acid condensing enzyme）」可互換使用且係指能夠在反應中使用磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate；PEP）自N-乙醯基甘露糖胺（N-acetylmannosamine；ManNAc）合成唾液酸之酶。

如本文所用之術語「CMP-唾液酸合酶（CMP-sialic acid synthase）」、「N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶（N-acylneuraminate cytidylyltransferase）」、「CMP-唾液酸合酶（CMP-sialate synthase）」、「CMP-NeuAc合酶（CMP-NeuAc synthase）」、「NeuA」及「CMP-N-乙醯基神經胺酸合酶（CMP-N-acetylneuraminic acid synthase）」可互換使用且係指能夠在反應中使用CTP自N-乙醯基神經胺酸合成CMP-N-乙醯基神經胺酸之酶。

如本文所用之術語「N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶（N-acylneuraminate-9-phosphate synthetase）」、「NANA合酶（NANA synthase）」、「NANAS」、「NANS」、「NmeNANAS」、「N-乙醯基神經胺酸丙酮酸解離酶（丙酮酸磷酸化）（N-acetylneuraminate pyruvate-lyase (pyruvate-phosphorylating)）」可互換使用且係指能夠在反應中使用磷酸烯醇丙酮酸（PEP）自N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸（ManNAc-6-磷酸）合成N-醯基神經胺酸-9-磷酸之酶。

術語「N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶（N-acylneuraminate-9-phosphatase）」係指能夠使N-醯基神經胺酸-9-磷酸去磷酸化以合成N-醯基神經胺酸之酶。

N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶為催化反應N-醯基-D-葡萄糖胺=N-醯基-D-甘露糖胺之酶。此酶之替代名稱包含N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶、GlcNAc 2-表異構酶及N-醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶。

UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶為催化反應N-乙醯基-D-葡萄糖胺=N-乙醯基甘露糖胺之酶。此酶之替代名稱包含UDP-N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-GlcNAc-2-表異構酶及UDP-N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶。

N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶為催化反應N-乙醯基-D-葡萄糖胺6-磷酸=N-乙醯基-D-甘露糖胺6-磷酸之酶。

雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶為催化反應UDP-N-乙醯基-D-葡萄糖胺=N-乙醯基-D-甘露糖胺及反應N-乙醯基-D-甘露糖胺+ATP=ADP+N-乙醯基-D-甘露糖胺6-磷酸之雙官能酶。

術語「N-乙醯基神經胺酸解離酶（N-acetylneuraminate lyase）」、「Neu5Ac解離酶（Neu5Ac lyase）」、「N-乙醯基神經胺酸丙酮酸解離酶（N-acetylneuraminate pyruvate-lyase）」、「N-乙醯基神經胺酸醛縮酶（N-acetylneuraminic acid aldolase）」、「NAL酶（NALase）」、「唾液酸解離酶（sialate lyase）」、「唾液酸醛縮酶（sialic acid aldolase）」、「唾液酸解離酶（sialic acid lyase）」及「nanA」可互換使用且係指將N-乙醯基神經胺酸降解為N-乙醯基甘露糖胺（ManNAc）及丙酮酸之酶。

術語「N-乙醯基神經胺酸激酶（N-acetylneuraminate kinase）」、「ManNAc激酶（ManNAc kinase）」、「N-乙醯基-D-甘露糖胺激酶（N-acetyl-D-mannosamine kinase）」及「nanK」可互換使用且係指使ManNAc磷酸化以合成N-乙醯基甘露糖胺-磷酸（ManNAc-6-P）之酶。

術語「ManNAc-6-P異構酶（ManNAc-6-P isomerase）」、「ManNAc-6-P 2-表異構酶（ManNAc-6-P 2-epimerase）」及「nanE」可互換使用且係指將ManNAc-6-P轉化為N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6-P）之酶。

術語「N-乙醯基葡萄糖胺-6-P脫乙醯基酶（N-acetylglucosamine-6-P deacetylase）」及「nagA」可互換使用且係指催化N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6-P）之N-乙醯基的水解以產生葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN6P）及乙酸之酶。

術語「葡萄糖胺-6-P脫胺酶（glucosamine-6-P deaminase）」、「GlcN6P脫胺酶（GlcN6P deaminase）」、「葡萄糖胺-6-磷酸異構酶（glucosamine-6-phosphate isomerase）」、「glmD」及「nagB」可互換使用且係指催化葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN6P）之可逆異構化-脫胺作用以形成果糖-6-磷酸及銨離子之酶。

如本文所用，術語「醣基轉移酶」係指能夠催化糖部分自活化供體分子轉移至特異性受體分子，形成醣苷鍵之酶。已描述使用核苷酸二磷酸-糖、核苷酸單磷酸-糖及磷酸糖及相關蛋白將醣基轉移酶分類成不同的基於序列之家族（Campbell等人, Biochem. J. 326, 929-939 (1997)）且可在碳水化合物活性酶（CArbohydrate-Active EnZymes；CAZy）網站（www.cazy.org）上獲得。

如本文所用，醣基轉移酶可選自包含但不限於以下清單：岩藻糖基轉移酶（例如α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3/1,4-岩藻糖基轉移酶、α-1,6-岩藻糖基轉移酶）、唾液酸基轉移酶（例如α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶、α-2,8-唾液酸基轉移酶）、半乳糖基轉移酶（例如β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶、α-1,4-半乳糖基轉移酶）、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（例如β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶）、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶（例如α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶）、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳糖醛酸苷轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-羥乙醯基神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶。

岩藻糖基轉移酶為將岩藻糖殘基（Fuc）自GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。岩藻糖基轉移酶包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶，該等岩藻糖基轉移酶催化經由α-醣苷鍵使Fuc殘基自GDP-Fuc轉移至聚醣受體上。岩藻糖基轉移酶可發現但不限於為GT10、GT11、GT23、GT65及GT68 CAZy家族。唾液酸基轉移酶為將唾液酸（如Neu5Ac或Neu5Gc）自供體（如CMP-Neu5Ac或CMP-Neu5Gc）轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。唾液酸基轉移酶包含α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及α-2,8-唾液酸基轉移酶，其催化經由α-醣苷鍵將唾液酸轉移至聚醣受體上。唾液酸基轉移酶可發現但不限於為GT29、GT42、GT80及GT97 CAZy家族。半乳糖基轉移酶為將半乳糖基（Gal）自UDP-半乳糖（UDP-Gal）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。半乳糖基轉移酶包含β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶，其經由α-醣苷鍵或β-醣苷鍵將Gal殘基自UDP-Gal轉移至聚醣受體上。半乳糖基轉移酶可發現但不限於為GT2、GT6、GT8、GT25及GT92 CAZy家族。葡萄糖基轉移酶為將葡萄糖基（Glc）自UDP-葡萄糖（UDP-Glc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。葡萄糖基轉移酶包含α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶，其經由α-醣苷鍵或β-醣苷鍵將Glc殘基自UDP-Glc轉移至聚醣受體上。葡萄糖基轉移酶可發現但不限於為GT1、GT4及GT25 CAZy家族。甘露糖基轉移酶為將甘露糖基（Man）自GDP-甘露糖（GDP-Man）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。甘露糖基轉移酶包含α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶，其經由α-醣苷鍵將Man殘基自GDP-Man轉移至聚醣受體上。甘露糖基轉移酶可發現但不限於為GT22、GT39、GT62及GT69 CAZy家族。N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶為將N-乙醯基葡萄糖胺基（GlcNAc）自UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）供體轉移至聚醣受體上之醣基轉移酶。N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶可發現但不限於為GT2及GT4 CAZy家族。半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶之一部分且經由β-1,3-鍵將GlcNAc自UDP-GlcNAc供體轉移至存在於聚醣受體中之末端半乳糖單元上。β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶為經由β-1,6-鍵將GlcNAc自UDP-GlcNAc供體轉移至聚醣受體上之N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶。N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶為將N-乙醯基半乳糖胺基（GalNAc）自UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶可發現但不限於為GT7、GT12及GT27 CAZy家族。α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶為N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶之一部分，且經由α-1,3-鍵將GalNAc自UDP-GalNAc供體轉移至聚醣受體。N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶為將N-乙醯基甘露糖胺基（ManNAc）自UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。木糖基轉移酶為將木糖殘基（Xyl）自UDP-木糖（UDP-Xyl）供體轉移至聚醣受體上之醣基轉移酶。木糖基轉移酶可發現但不限於為GT14、GT61及GT77 CAZy家族。葡萄糖醛酸苷轉移酶為經由α-醣苷鍵或β-醣苷鍵將葡萄糖醛酸自UDP-葡萄糖醛酸供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。葡萄糖醛酸苷轉移酶可發現但不限於為GT4、GT43及GT93 CAZy家族。半乳糖醛酸苷轉移酶為將半乳糖醛酸自UDP-半乳糖醛酸供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。N-羥乙醯基神經胺基轉移酶為將N-羥乙醯基神經胺酸基（Neu5Gc）自CMP-Neu5Gc供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。鼠李糖基轉移酶為將鼠李糖殘基自GDP-鼠李糖供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。鼠李糖基轉移酶可發現但不限於為GT1、GT2及GT102 CAZy家族。N-乙醯基鼠李糖基轉移酶為將N-乙醯基鼠李糖胺殘基自UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺供體轉移至聚醣受體上之醣基轉移酶。UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶為使用UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-阿拉伯-4-己酮醣用於偽胺酸之生物合成的醣基轉移酶，該偽胺酸為用於修飾鞭毛蛋白之類唾液酸糖。UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶（murA）為將烯醇丙酮醯基（enolpyruvyl）自磷酸烯醇丙酮酸（PEP）轉移至UDP- N-乙醯基葡萄糖胺（UDPAG）以形成UDP- N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮酸的醣基轉移酶。岩藻糖胺基轉移酶為將N-乙醯基岩藻糖胺殘基自dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺或UDP-N-乙醯基岩藻糖胺供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。

如本發明中所用之術語「α-2,3-唾液酸基轉移酶（alpha-2,3-sialyltransferase）」、「α 2,3唾液酸基轉移酶（alpha 2,3 sialyltransferase）」、「3-唾液酸基轉移酶（3-sialyltransferase）」、「α-2,3-唾液酸基轉移酶（α-2,3-sialyltransferase）」、「α 2,3唾液酸基轉移酶（α 2,3 sialyltransferase）」、「3唾液酸基轉移酶（3 sialyltransferase）」、「3-ST」或「3ST」可互換使用且係指催化唾液酸自供體CMP-Neu5Ac轉移至α-2,3-鍵中之受體分子的醣基轉移酶。如本發明中所用之術語「3'唾液酸基乳糖（3' sialyllactose）」、「3'-唾液酸基乳糖（3'-sialyllactose）」、「α-2,3-唾液酸基乳糖（alpha-2,3-sialyllactose）」、「α 2,3唾液酸基乳糖（alpha 2,3 sialyllactose）」、「α-2,3-唾液酸基乳糖（α-2,3-sialyllactose）」、「α 2,3唾液酸基乳糖（α 2,3 sialyllactose）」、「3SL」或「3'SL」可互換使用且係指藉由α-2,3-岩藻糖基轉移酶催化將唾液酸基自CMP-Neu5Ac移轉至α-2,3-鍵中之乳糖獲得的產物。如本發明中所用之術語「α-2,6-唾液酸基轉移酶（alpha-2,6-sialyltransferase）」、「α 2,6唾液酸基轉移酶（alpha 2,6 sialyltransferase）」、「6-唾液酸基轉移酶（6-sialyltransferase）」、「α-2,6-唾液酸基轉移酶（α-2,6-sialyltransferase）」、「α 2,6唾液酸基轉移酶（α 2,6 sialyltransferase）」、「6唾液酸基轉移酶（6 sialyltransferase）」、「6-ST」或「6ST」可互換使用且係指催化唾液酸自供體CMP-Neu5Ac轉移至α-2,6-鍵中之受體分子的醣基轉移酶。如本發明中所用之術語「6'唾液酸基乳糖（6' sialyllactose）」、「6'-唾液酸基乳糖（6'-sialyllactose）」、「α-2,6-唾液酸基乳糖（alpha-2,6-sialyllactose）」、「α 2,6唾液酸基乳糖（alpha 2,6 sialyllactose）」、「α-2,6-唾液酸基乳糖（α-2,6-sialyllactose）」、「α 2,6唾液酸基乳糖（α 2,6 sialyllactose）」、「6SL」或「6'SL」可互換使用且係指藉由α-2,6-岩藻糖基轉移酶催化將唾液酸基自CMP-Neu5Ac移轉至α-2,6-鍵中之乳糖獲得的產物。

如本發明中所用之術語「α-2,8-唾液酸基轉移酶（alpha-2,8-sialyltransferase）」、「α 2,8唾液酸基轉移酶（alpha 2,8 sialyltransferase）」、「8-唾液酸基轉移酶（8-sialyltransferase）」、「α-2,8-唾液酸基轉移酶（α-2,8-sialyltransferase）」、「α 2,8唾液酸基轉移酶（α 2,8 sialyltransferase）」、「8唾液酸基轉移酶（8 sialyltransferase）」、「8-ST」或「8ST」可互換使用且係指催化唾液酸自供體CMP-Neu5Ac轉移至α-2,8-鍵中之受體的醣基轉移酶。

術語「經活化單醣（activated monosaccharide）」、「核苷酸活化糖（nucleotide-activated sugar）」、「核苷酸糖（nucleotide-sugar）」、「經活化糖（activated sugar）」、「核苷（nucleoside）」或「核苷酸供體（nucleotide donor）」在本文中可互換使用且係指單醣之活化形式。活化單醣之實例包括但不限於UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（pneumosamine）（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、CMP-唾液酸（CMP-Neu5Ac或CMP-N-乙醯基神經胺酸）、CMP-N-羥乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。核苷酸糖在醣基化反應中充當醣基供體。醣基化反應為由醣基轉移酶催化之反應。

如本文所用，術語「單醣（monosaccharide）」係指不可藉由水解分解為更簡單的糖的糖，分為醛醣或酮醣，且每分子含有一或多個羥基。單醣為僅含有一個簡單糖的醣。單醣之實例包含己醣、D-葡萄哌喃糖、D-半乳呋喃糖、D-半乳哌喃糖、L-半乳哌喃糖、D-甘露哌喃糖、D-別哌喃糖、L-阿卓哌喃糖、D-古洛哌喃糖、L-艾杜哌喃糖、D-塔羅哌喃糖、D-核呋喃糖、D-核哌喃糖、D-阿拉伯呋喃糖、D-阿拉伯哌喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯哌喃糖、D-木哌喃糖、D-來蘇哌喃糖、D-赤藻呋喃糖、D-蘇呋喃糖、庚醣、L-甘油-D-甘露-庚哌喃糖（LDmanHep）、D-甘油-D-甘露-庚哌喃糖（DDmanHep）、6-去氧-L-阿卓哌喃糖、6-去氧-D-古洛哌喃糖、6-去氧-D-塔羅哌喃糖、6-去氧-D-半乳哌喃糖、6-去氧-L-半乳哌喃糖、6-去氧-D-甘露哌喃糖、6-去氧-L-甘露哌喃糖、6-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-去氧-D-阿拉伯-己醣、2-去氧-D-赤藻-戊醣、2,6-雙去氧-D-阿拉伯-己哌喃糖、3,6-雙去氧-D-阿拉伯-己哌喃糖、3,6-雙去氧-L-阿拉伯-己哌喃糖、3,6-雙去氧-D-木-己哌喃糖、3,6-雙去氧-D-核-己哌喃糖、2,6-雙去氧-D-核-己哌喃糖、3,6-雙去氧-L-木-己哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-別哌喃糖、2-胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-塔羅哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-別哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-塔羅哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-塔羅哌喃糖、D-葡萄哌喃糖醛酸、D-半乳哌喃糖醛酸、D-甘露哌喃糖醛酸、D-別哌喃糖醛酸、L-阿卓哌喃糖醛酸、D-古洛哌喃糖醛酸、L-古洛哌喃糖醛酸、L-艾杜哌喃糖醛酸、D-塔羅哌喃糖醛酸、唾液酸、5-胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸、5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸、5-羥乙醯基醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、D-核-己-2-酮哌喃糖、D-阿拉伯-己-2-酮呋喃糖（D-果呋喃糖）、D-阿拉伯-己-2-酮哌喃糖、L-木-己-2-酮哌喃糖、D-來蘇-己-2-酮哌喃糖、D-蘇-戊-2-酮哌喃糖、D-阿卓-庚-2-酮哌喃糖、3-C-(羥甲基)-D-赤藻呋喃糖、2,4,6-三去氧-2,4-二胺基-D-葡萄哌喃糖、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖、2,6-雙去氧-3-甲基-D-核-己醣、2-胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙醯胺基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-羥乙醯基醯胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、3-去氧-D-來蘇-庚-2-酮哌喃糖酸、3-去氧-D-甘露-辛-2-酮哌喃糖酸、3-去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油-L-甘露-壬-2-酮哌喃糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油-L-阿卓-壬-2-酮哌喃糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-塔羅-壬-2-酮哌喃糖酸、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-阿拉伯-4-己酮糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮糖、N-乙醯基-L-鼠李糖胺、N-乙醯基-D-岩藻糖胺、N-乙醯基-L-紐莫糖胺、N-乙醯基胞壁酸、N-乙醯基-L-異鼠李糖胺、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、N-乙醯基葡萄糖胺（GlcNAc）、葡萄糖胺（Glcn）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、N-乙醯基甘露糖胺（ManNAc）、N-羥乙醯基神經胺酸、N-乙醯基半乳糖胺（GalNAc）、半乳胺糖（Galn）、岩藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、果糖（Fru）及多元醇。

術語多元醇意謂含有多個羥基之醇。舉例而言，甘油、山梨糖醇或甘露糖醇。

如本文所用，術語「雙醣（disaccharide）」係指含有兩個簡單糖，亦即單醣之醣聚合物。此類雙醣含有單醣，其較佳選自如本文上文所用之單醣清單。雙醣之實例包含乳糖（Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二醣（Gal-b1,3-GlcNAc）、N-乙醯基乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）、LacDiNAc（GalNAc-b1,4-GlcNAc）、N-乙醯基半乳糖胺基葡萄糖（GalNAc-b1,4-Glc）。

如本文所用，術語「唾液酸化雙醣」係指含有兩個單醣之雙醣，其中該等單醣中之一者為如本文所定義之唾液酸。唾液酸化雙醣之實例包含Neu5Ac-a2,3-Gal、Neu5Ac-a2,6-Gal及岩藻哌喃糖基- (1-4)-N-羥乙醯基神經胺酸（Fuc-(1-4)-Neu5Gc）。

如本文所用之術語且如目前先進技術中通常所理解，「寡醣（Oligosaccharide）」係指含有少量、典型地三至二十個簡單糖，亦即單醣的醣聚合物。較佳地，如本文所描述之寡醣含有選自如本文上文所用之清單的單醣。如本發明中所用之寡醣可為直鏈結構或可包括分支。兩個糖單元之間的鍵（例如醣苷鍵、半乳糖苷鍵、葡萄糖苷鍵等）可表示為例如1,4、1-＞4或(1-4)，在本文中可互換使用。舉例而言，術語「Gal-b1,4-Glc」、「β-Gal-(1-＞4)-Glc」、「Galβ1-4-Glc」及「Gal-b(1-4)-Glc」具有相同含義，亦即半乳糖（Gal）之碳-1與葡萄糖（Glc）之碳-4的β-醣苷鍵連接。各單醣可呈環狀形式（例如哌喃糖或呋喃糖形式）。寡醣可含有α-醣苷鍵及β-醣苷鍵兩者或可僅含有α-醣苷鍵或僅含有β-醣苷鍵。術語「多醣（polysaccharide）」係指由大量的（典型地大於二十個)經醣苷連接之單醣組成的化合物。

寡醣之實例包括但不限於路易斯（Lewis）型抗原寡醣、哺乳動物（包括人類）乳寡醣、O-抗原、腸內菌共同抗原（enterobacterial common antigen；ECA）、存在於脂多醣（lipopolysaccharide；LPS）中之聚醣鏈、存在於莢膜多醣中之寡醣重複、肽聚醣（peptidoglycan；PG）、胺基-糖及人類ABO血型系統之抗原。

如本文所用，術語「聚醣受體（glycan acceptor）」係指如本文所定義之單醣、雙醣及寡醣。

如本文所用，「哺乳動物乳寡醣」（mammalian milk oligosaccharide；MMO）係指諸如但不限於以下寡醣：3-岩藻糖基乳糖、2'-岩藻糖基乳糖、6-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、2',2-二岩藻糖基乳糖、3,4-二岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、3,6-二唾液酸基乳糖、6,6'-二唾液酸基乳糖、8,3-二唾液酸基乳糖、3,6-二唾液酸基乳-N-四醣、乳二岩藻四醣、乳-N-丙醣II、乳-N-四醣、乳-N-新四醣、乳-N-岩藻五醣II、乳-N-岩藻五醣I、乳-N-岩藻五醣III、乳-N-岩藻五醣V、乳-N-岩藻五醣VI、唾液酸基乳-N-四醣c、唾液酸基乳-N-四醣b、唾液酸基乳-N-四醣a、乳-N-二岩藻六醣I、乳-N-二岩藻六醣II、乳-N-六醣、乳-N-新六醣、對-乳-N-六醣、單岩藻糖基單唾液酸基乳-N-四醣c、單岩藻糖基對-乳-N-六醣、單岩藻糖基乳-N-六醣III、異構岩藻糖基化乳-N-六醣III、異構岩藻糖基化乳-N-六醣I、唾液酸基乳-N-六醣、唾液酸基乳-N-新六醣II、二岩藻糖基-對-乳-N-六醣、二岩藻糖基乳-N-六醣、二岩藻糖基乳-N-六醣a、二岩藻糖基乳-N-六醣c、半乳糖基化幾丁聚醣、岩藻糖基化寡醣、中性寡醣及/或唾液酸化寡醣。

如本文所用且如目前先進技術中通常所理解，『岩藻糖基化寡醣（fucosylated oligosaccharide）』為攜帶岩藻糖殘基之寡醣。實例包含2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL）、乳二岩藻四醣（LDFT）、乳-N-岩藻五醣I（LNF I）、乳-N-岩藻五醣II（LNF II）、乳-N-岩藻五醣III（LNF III）、乳-N-岩藻五醣V（LNF V）、乳-N-岩藻五醣VI（LNF VI）、乳-N-新岩藻五醣I、乳-N-岩藻六醣I（LDFH I）、乳-N-岩藻六醣II（LDFH II）、單岩藻糖基乳-N-六醣III（MFLNH III）、二岩藻糖基乳-N-六醣（DFLNHa）、二岩藻糖基-乳-N-新六醣。哺乳動物乳寡醣包含在泌乳期間之任何階段中發現的乳汁中所存在之寡醣，該乳汁包括來自人類及哺乳動物之初乳，該等哺乳動物包括但不限於牛（歐洲牛（ Bos Taurus））、綿羊（綿羊（ Ovis aries））、山羊（家畜山羊（ Capra aegagrus hircus））、雙峰駱駝（雙峰駝（ Camelus bactrianus））、馬（歐洲野馬（ Equus ferus caballus））、豬（野豬（ Sus scropha））、犬（家犬亞種（ Canis lupus familiaris））、蝦夷棕熊（ ezo brown bear）（日本棕熊（ Ursus arctos yesoensis））、北極熊（海熊（ Ursus maritimus））、日本黑熊（亞洲黑熊（ Ursus thibetanus japonicus））、條紋臭鼬（條紋臭鼬（ Mephitis mephitis））、冠海豹（冠海豹（ Cystophora cristata））、亞洲大象（亞洲象（ Elephas maximus））、非洲大象（非洲象（ Loxodonta africana））、巨食蟻獸（大食蟻獸（ Myrmecophaga tridactyla））、真瓶鼻海豚（瓶鼻海豚（ Tursiops truncates））、北極小鬚鯨（小鬚鯨（ Balaenoptera acutorostrata））、尤金袋鼠（尤金袋鼠（ Macropus eugenii））、紅袋鼠（紅袋鼠（ Macropus rufus））、普通袋狐（帚尾袋貂（ Trichosurus Vulpecula））、無尾熊（考拉（ Phascolarctos cinereus））、東袋鼬（細腳袋鼩（ Dasyurus viverrinus））、鴨嘴獸（鴨嘴獸（ Ornithorhynchus anatinus））。人乳寡醣（Human milk oligosaccharide；HMO）亦稱為人類一致乳寡醣，其在化學上與人類母乳中發現之人乳寡醣一致，但為生物技術生產的（例如使用不含細胞之系統或細胞及包含細菌、真菌、酵母、植物、動物或原蟲細胞之生物體，較佳經基因工程改造之細胞及生物體）。人類一致乳寡醣以名稱HiMO出售。

如本文所用，『唾液酸化寡醣（sialylated oligosaccharide）』應被理解為含有帶電唾液酸之寡醣，亦即具有唾液酸殘基之寡醣。其具有酸性性質。一些實例為3-SL（3'-唾液酸基乳糖或3'-SL或Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-Glc）、3'-唾液酸基乳糖胺、6-SL（6'-唾液酸基乳糖或6'-SL或Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-Glc）、3,6-二唾液酸基乳糖（Neu5Ac-a2,3-(Neu5Ac-a2,6)-Gal-b1,4-Glc）、6,6'-二唾液酸基乳糖（Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-(Neu5Ac-a2,6)-Glc）、8,3-二唾液酸基乳糖（Neu5Ac-a2,8-Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-Glc）、6'-唾液酸基乳糖胺、包含6'-唾液酸基乳糖之寡醣、SGG六醣（Neu5Acα-2,3Galβ -1,3GalNacβ-1,3Galα-1,4Galβ-1,4Gal）、唾液酸化四醣（Neu5Acα-2,3Galβ-1,4GlcNacβ -14GlcNAc）、五醣LSTD（Neu5Acα-2,3Galβ-1,4GlcNacβ-1,3Galβ-1,4Glc）、唾液酸化乳-N-丙醣、唾液酸化乳-N-四醣、唾液酸基乳-N-新四醣、單唾液酸基乳-N-六醣、二唾液酸基乳-N-六醣I、單唾液酸基乳-N-新六醣I、單唾液酸基乳-N-新六醣II、二唾液酸基乳-N-新六醣、二唾液酸基乳-N-四醣、二唾液酸基乳-N-六醣II、唾液酸基乳-N-四醣a、二唾液酸基乳-N-六醣I、唾液酸基乳-N-四醣b、3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、二唾液單岩藻糖基乳-N-新六醣、單岩藻糖基單唾液酸基乳-N-八醣（唾液酸基Lea）、唾液酸基乳-N-岩藻六醣II、二唾液酸基乳-N-岩藻五醣II、單岩藻糖基二唾液酸基乳-N-四醣及攜帶一或若干個唾液酸殘基之寡醣，包括但不限於選自以下神經節苷脂的寡醣部分：GM3（3'唾液酸基乳糖，Neu5Acα-2,3Galβ-4Glc）及包含GM3模體之寡醣；GD3 Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,4Glc GT3（Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,4Glc）；GM2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc、GM1 Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc、GD1a Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc、GT1a Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc、GD2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GT2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GD1b、Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GT1b Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GQ1b Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAc β -1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GT1c Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GQ1c Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAc β -1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GP1c Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAc β -1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc、GD1a Neu5Acα-2,3Galβ-1,3(Neu5Acα-2,6)GalNAcβ -1,4Galβ-1,4Glc、岩藻糖基-GM1 Fucα-1,2Galβ-1,3GalNAcβ -1,4(Neu5Acα-2,3)Gal β -1,4Glc；其皆可藉由使以上寡醣部分與神經醯胺反應或在神經醯胺上合成以上寡醣而擴展至相應神經節苷脂之生產。

如本文所用且如目前先進技術中通常所理解，『中性寡醣（neutral oligosaccharide）』為不具有源自羧酸基之負電荷的寡醣。此類中性寡醣之實例為2'-岩藻基乳糖（2'FL）、3-岩藻基乳糖（3FL）、2',3-二岩藻基乳糖（diFL）、乳-N-丙醣II、乳-N-四醣、乳-N-新四醣、乳-N-岩藻五醣I、乳-N-新岩藻五醣I、乳-N-岩藻五醣II、乳-N-岩藻五醣III、乳-N-岩藻五醣V、乳-N-岩藻五醣VI、乳-N-新岩藻五醣V、乳-N-二岩藻六醣I、乳-N-二岩藻六醣II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六醣、乳-N-新六醣、對-乳-N-六醣、對-乳-N-新六醣、二岩藻基-乳-N-六醣及二岩藻基-乳-N-新六醣。

如本文所使用，術語「路易斯型抗原（Lewis-type antigen）」包含以下寡醣：H1抗原，其為Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc，或簡言之2'FLNB；Lewisa，其為三醣Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或簡言之4-FLNB；Lewisb，其為四醣Fucα1-2Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或簡言之DiF-LNB；唾液酸基Lewisa，其為5-乙醯基神經胺基-(2-3)-半乳糖基-(1-3)-(岩藻哌喃糖基-(1-4))-N-乙醯基葡萄糖胺，或簡寫為Neu5Acα2-3Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc；H2抗原，其為Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，或另外稱作2'岩藻糖基-N-乙醯基-乳糖胺，簡言之2'FLacNAc；Lewisx，其為三醣Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc，或另外稱為3-岩藻糖基-N-乙醯基-乳糖胺，簡言之3-FLacNAc；Lewisy，其為四醣Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc；及唾液酸基Lewisx，其為5-乙醯基神經胺基-(2-3)-半乳糖基-(1-4)-(岩藻哌喃糖基-(1-3))-N-乙醯基葡萄糖胺，或簡寫為Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc。

如本文所用，術語「O-抗原（O-antigen）」係指革蘭氏陰性細菌之表面脂多醣（LPS）的重複聚醣組分。術語「脂多醣（lipopolysaccharide）」或「LPS」係指在由脂質A、核心寡醣及O-抗原構成之革蘭氏陰性細菌之外膜中發現的醣脂。術語「莢膜多糖（capsular polysaccharides）」係指存在於細菌莢膜中之具有寡醣重複結構的長鏈多醣，該等細菌莢膜為位於細胞包膜外部之多醣層。術語「肽聚醣（peptidoglycan）」或「胞壁質（murein）」係指大部分細菌細胞壁中之基本結構元件，其由糖及胺基酸構成，其中糖組分由β-1,4連接之GlcNAc及N-乙醯基胞壁酸之交替殘基組成。如本文所用，術語「胺基-糖（amino-sugar）」係指羥基已經胺基置換之糖分子。如本文所用，人類ABO血型系統之抗原為寡醣。人類ABO血型系統之此類抗原不限於人類結構。該等結構涉及存在於包含Gal-β1,3-GlcNAc、Gal-β1,4-GlcNAc、Gal-β1,3-GalNAc及Gal-β1,4-Glc之雙醣核心結構上的A決定子GalNAc-α1,3(Fuc-α1,2)-Gal-、B決定子Gal-α1,3(Fuc-α1,2)-Gal-及H決定子Fuc-α1,2-Gal-。

如本發明中所用之術語「LNT II」、「LNT-II」、「LN3」、「乳-N-丙醣II（lacto-N-triose II）」、「乳- N-丙醣II（lacto- N-triose II）」、「乳-N-丙醣（lacto-N-triose）」、「乳- N-丙醣（lacto- N-triose）」或「GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LNT」、「乳-N-四醣（lacto-N-tetraose）」、「乳- N-四醣（lacto- N-tetraose）」或「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LNnT」、「乳-N-新四醣（lacto-N- neotetraose）」、「乳- N-新四醣（lacto- N-neotetraose）」、「新-LNT（neo-LNT）」或「Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LSTa」、「LS-四醣a（LS-Tetrasaccharide a）」、「唾液酸基-乳-N-四醣a（Sialyl-lacto-N-tetraose a）」、「唾液酸基乳-N-四醣a（sialyllacto-N-tetraose a）」或「Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LSTb」、「LS-四醣b（LS-Tetrasaccharide b）」、「唾液酸基-乳-N-四醣b（Sialyl-lacto-N-tetraose b）」、「唾液酸基乳-N-四醣b（sialyllacto-N-tetraose b）」或「Gal-b1,3-(Neu5Ac-a2,6)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LSTc」、「LS-四醣c（LS-Tetrasaccharide c）」、「唾液酸基-乳-N-四醣c（Sialyl-lacto-N-tetraose c）」、「唾液酸基乳-N-四醣c（sialyllacto-N-tetraose c）」、「唾液酸基乳-N-新四醣c（sialyllacto-N-neotetraose c）」或「Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LSTd」、「LS-四醣d（LS-Tetrasaccharide d）」、「唾液酸基-乳-N-四醣d（Sialyl-lacto-N-tetraose d）」、「唾液酸基乳-N-四醣d（sialyllacto-N-tetraose d）」、「唾液酸基乳-N-新四醣d（sialyllacto-N-neotetraose d）」或「Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。

術語「DSLNnT」及「二唾液酸基乳-N-新四醣（Disialyllacto-N-neotetraose）」可互換使用且係指Neu5Ac-a2,6-[Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc。

術語「DSLNT」及「二唾液酸基乳-N-四醣（Disialyllacto-N-tetraose）」可互換使用且係指Neu5Ac-a2,6-[Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc。術語「LNFP-I」、「乳-N-岩藻五醣I（lacto-N-fucopentaose I）」、「LNFP I」、「LNF I OH I型決定子（LNF I OH type I determinant）」、「LNF I」、「LNF1」、「LNF 1」及「H血型抗原五醣第1型（Blood group H antigen pentaose type 1）」可互換使用且係指Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。

術語「LNB」及「乳-N-二醣（Lacto-N-biose）」可互換使用且係指雙醣Gal-b1,3-GlcNAc。

術語「LacNAc」及「N-乙醯基乳糖胺（N-acetyllactosamine）」可互換使用且係指雙醣Gal-b1,4-GlcNAc。

如本文所用，術語「膜運輸蛋白（membrane transporter protein）」係指作為細胞膜之一部分或與細胞膜交互作用且控制分子及資訊跨越細胞之流動的蛋白質。因此，膜蛋白參與運輸，不論其輸入至細胞中或自細胞輸出。

如本文所用，術語「螯鐵蛋白（Siderophore）」係指各種微生物之次級代謝物，其主要為鐵離子特異性螯合劑。此等分子已分類為兒茶酚鹽（catecholate）、氧肟酸鹽（hydroxamate）、羧酸鹽及混合類型。螯鐵蛋白一般藉由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase；NRPS）依賴性途徑或NRPS非依賴性途徑（NRPS independent pathway；NIS）合成。NRPS依賴性螯鐵蛋白生物合成途徑中最重要之前驅物為分支酸（chorismate）。2,3-DHBA可藉由異分支酸合酶、異分支酸酶及2,3-二羥基苯甲酸-2,3-脫氫酶催化之三步驟反應自分支酸形成。螯鐵蛋白亦可由水楊酸形成，該水楊酸藉由異分支酸丙酮酸解離酶自異分支酸形成。當鳥胺酸用作螯鐵蛋白之前驅物時，生物合成取決於由L-鳥胺酸N5-單加氧酶催化之鳥胺酸的羥基化。在NIS途徑中，螯鐵蛋白生物合成中之重要步驟係N(6)-羥基離胺酸合酶。

需要運輸蛋白以將螯鐵蛋白輸出至細胞外部。至此在此過程中鑑別出膜蛋白之四個超家族：主要易化子超家族（major facilitator superfamily；MFS）；多藥/寡醣基脂質/多醣翻轉酶超家族（Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide Flippase Superfamily；MOP）；抗性、結節性及細胞分裂超家族（resistance, nodulation and cell division superfamily；RND）；及ABC超家族。一般而言，參與螯鐵蛋白輸出之基因與螯鐵蛋白生物合成基因簇聚在一起。如本文所用，術語「螯鐵蛋白輸出蛋白（siderophore exporter）」係指將螯鐵蛋白輸出至細胞外部所需的此類運輸蛋白。

ATP結合卡匣（ATP-binding cassette；ABC）超家族含有吸收及流出運輸系統兩者，且此兩個搬運體（porter）組中之成員通常鬆散地簇聚在一起。無蛋白質磷酸化之ATP水解為運輸供以能量。ABC超家族內存在數十個家族，且家族一般與受質特異性相關。成員根據如藉由運輸蛋白分類資料庫所定義的類別3.A.1分類，該資料庫藉由Saier Lab Bioinformatics Group運作，可經由www.tcdb.org獲得，且提供膜運輸蛋白之功能性及系統發生分類。

主要易化子超家族（MFS）為膜運輸蛋白之超家族，其催化單向運輸蛋白、溶質:陽離子（H+，但幾乎不為Na+）同向運輸蛋白及/或溶質:H+或溶質:溶質反向運輸蛋白。大多數長度為400-600個胺基醯基殘基且具有12、14或偶爾24個跨膜α-螺旋扳手（transmembrane α-helical spanner；TMS），如由Saier Lab Bioinformatics Group運作之運輸蛋白分類資料庫（wwwd. tcdb. org）所定義。

如本文所用，「SET」或「糖流出運輸蛋白（Sugar Efflux Transporter）」係指SET家族之膜蛋白，其為具有InterPRO域IPR004750之蛋白質及/或為屬於eggNOGv4.5家族ENOG410XTE9之蛋白質。InterPro域之鑑別可藉由使用https://www.ebi.ac.uk/interpro/上之線上工具或InterProScan之獨立版本（https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html）使用預設值進行。在eggNOGv4.5中鑑別直系同源家族可使用eggNOG-mapperv1（http://eggnogdb.embl.de/#/app/home）之在線版本或獨立版本進行。

所屬技術領域中具有通常知識者應理解，對於本文所用之包含eggnogdb 4.5.1（發佈於2016年9月）及InterPro 75.0（發佈於2019年7月4日）的資料庫，各資料庫之內容在各發佈版本中為固定的且不會改變。當特定資料庫之內容改變時，此特定資料庫接收具有新的發佈日期之新的發佈版本。各資料庫之所有發佈版本及其對應發佈日期及如在此等特定發佈日期標註之特定內容均為可獲得的且為所屬技術領域中具有通常知識者已知。

在本發明的上下文內，術語「經基因修飾以用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之細胞（cell genetically modified for the production of a sialylated di- and/or oligosaccharide）」係指經基因操縱以包含至少一種唾液酸基轉移酶與以下者中之任何一或多者之組合的細胞：i）編碼該唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成所必需之醣基轉移酶的基因，ii）生產適於由該醣基轉移酶轉移至碳水化合物前驅物之核苷酸供體的生物合成途徑及/或iii）生產前驅物之生物合成途徑或前驅物自培養基內化至細胞中之機制，在細胞中前驅物經醣基化以生產唾液酸化雙醣及/或寡醣。

如本文所用，「用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑（pathway for production of a sialylated di- and/or oligosaccharide）」係由參與如本文所定義之唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成的酶及其各別基因組成的生物化學途徑。用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之該途徑包含至少一種唾液酸基轉移酶。此外，用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之該途徑可包含但不限於參與核苷酸活化糖之合成及將該核苷酸活化糖轉移至受體以產生本發明之唾液酸化雙醣及/或寡醣的途徑。此類途徑之實例包含但不限於岩藻糖基化、唾液酸化、半乳糖基化、N-乙醯基葡萄糖胺基化、N-乙醯基半乳糖基化、甘露糖基化、N-乙醯基甘露糖胺基化途徑。

如本文所用，『岩藻糖基化途徑（fucosylation pathway）』係包含至少一種選自包含以下者之清單的酶及其各別基因的生化途徑：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶以及岩藻糖基轉移酶，產生α 1,2、α 1,3、α 1,4及/或α 1,6岩藻糖基化寡醣。

『唾液酸化途徑（sialylation pathway）』包含至少一種選自包含以下者之清單的酶及其各別基因的生化途徑：N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸運輸蛋白以及唾液酸基轉移酶，產生α 2,3、α 2,6及/或α 2,8唾液酸化寡醣。

如本文所用，『半乳糖基化途徑（galactosylation pathway）』係包含至少一種選自包含以下者之清單的酶及其各別基因的生化途徑：半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖磷酸變位酶以及半乳糖基轉移酶，產生包含單醣、雙醣或寡醣之半乳糖基化化合物，該化合物在該單醣、該雙醣或該寡醣之2、3、4及6羥基中之一或多者上具有α或β結合半乳糖。

如本文所用，『N-乙醯基葡萄糖胺基化途徑（N-acetylglucosaminylation pathway）』係包含至少一種選自包含以下者之清單的酶及其各別基因的生化途徑：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶以及醣基轉移酶，產生包含單醣、雙醣或寡醣之GlcNAc修飾之化合物，該化合物在該單醣、該雙醣或該寡醣之3、4及6羥基中之一或多者上具有α或β結合N-乙醯基葡萄糖胺（GlcNAc）。

如本文所用，『N-乙醯基半乳糖基化途徑（N-acetylgalactosylation pathway）』係包含至少一種選自包含以下者之清單的酶及其各別基因的生化途徑：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、UDP-半乳糖4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶及/或UDP-GalNAc焦磷酸化酶以及醣基轉移酶，產生包含單醣、雙醣或寡醣之GalNAc修飾之化合物，該化合物在該單醣、該雙醣或該寡醣上具有α或β結合N-乙醯基半乳糖胺。

如本文所用，『甘露糖基化途徑（mannosylation pathway）』係包含至少一種選自包含以下者之清單的酶及其各別基因的生化途徑：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶及/或甘露糖-1-磷酸甲脒基轉移酶，以及醣基轉移酶，產生包含單醣、雙醣或寡醣之甘露糖基化化合物，該化合物在該單醣、該雙醣或該寡醣上具有α或β結合甘露糖。

如本文所用，『N-乙醯基甘露糖胺基化途徑（N-acetylmannosaminylation pathway）』係包含至少一種選自包含以下者之清單的酶及其各別基因的生化途徑：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶及/或ManNAc激酶，以及醣基轉移酶，產生包含單醣、雙醣或寡醣之ManNAc修飾之化合物，該化合物在該單醣、該雙醣或該寡醣上具有α或β結合N-乙醯甘露糖胺。

術語「甘露糖-6-磷酸異構酶（mannose-6-phosphate isomerase）」、「磷酸甘露糖異構酶（phosphomannose isomerase）」、「甘露糖磷酸異構酶（mannose phosphate isomerase）」、「磷酸己醣異構酶（phosphohexoisomerase）」、「磷酸甘露糖異構酶（phosphomannoisomerase）」、「磷酸甘露糖-異構酶（phosphomannose-isomerase）」、「磷酸己醣變位酶（phosphohexomutase）」、「D-甘露糖-6-磷酸酮醇-異構酶（D-mannose-6-phosphate ketol-isomerase）」及「manA」可互換使用且係指催化D-果糖6-磷酸可逆地轉化為D-甘露糖6-磷酸之酶。

術語「磷酸甘露糖變位酶（phosphomannomutase）」、「甘露糖磷酸變位酶（mannose phosphomutase）」、「磷酸甘露糖變位酶（phosphomannose mutase）」、「D-甘露糖1,6-磷酸變位酶（D-mannose 1,6-phosphomutase）」及「manB」可互換使用且係指催化D-甘露糖6-磷酸可逆地轉化為D-甘露糖1-磷酸之酶。

術語「甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（mannose-1-phosphate guanylyltransferase）」、「GTP-甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase）」、「磷酸甘露糖異構酶-鳥苷5'-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶（phosphomannose isomerase-guanosine 5'-diphospho-D-mannose pyrophosphorylase；PIM-GMP）」、「GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GDP-mannose pyrophosphorylase）」、「鳥苷5'-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶（guanosine 5'-diphospho-D-mannose pyrophosphorylase）」、「鳥苷二磷酸甘露糖焦磷酸化酶（guanosine diphosphomannose pyrophosphorylase）」、「鳥苷三磷酸-甘露糖1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（guanosine triphosphate-mannose 1-phosphate guanylyltransferase）」、「甘露糖1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（鳥苷三磷酸）（mannose 1-phosphate guanylyltransferase (guanosine triphosphate)）」及「manC」可互換使用且係指使用GTP將D-甘露糖-1-磷酸轉化為GDP-甘露糖及二磷酸之酶。

術語「GDP-甘露糖4,6-脫水酶（GDP-mannose 4,6-dehydratase）」、「鳥苷5'-二磷酸-D-甘露糖氧化還原酶（guanosine 5'-diphosphate-D-mannose oxidoreductase）」、「鳥苷二磷酸甘露糖氧化還原酶（guanosine diphosphomannose oxidoreductase）」、「鳥苷二磷酸甘露糖4,6-脫水酶（guanosine diphosphomannose 4,6-dehydratase）」、「GDP-D-甘露糖脫水酶（GDP-D-mannose dehydratase）」、「GDP-D-甘露糖4,6-脫水酶（GDP-D-mannose 4,6-dehydratase）」、「GDP-甘露糖4,6-氫-解離酶（GDP-mannose 4,6-hydro-lyase）」、「GDP-甘露糖4,6-氫-解離酶（形成GDP-4-脫氫-6-去氧-D-甘露糖）（GDP-mannose 4,6-hydro-lyase (GDP-4-dehydro-6-deoxy-D-mannose-forming)）」及「gmd」可互換使用且係指形成GDP-鼠李糖及GDP-岩藻糖之生物合成的第一步之酶。

術語「GDP-L-岩藻糖合酶（GDP-L-fucose synthase）」、「GDP-4-酮-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶-4-還原酶（GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reductase）」、「GDP-L-岩藻糖:NADP+ 4-氧化還原酶（3,5-表異構）（GDP-L-fucose:NADP+ 4-oxidoreductase (3,5-epimerizing)）」及「fcl」可互換使用且係指形成GDP-岩藻糖之生物合成的第二步之酶。

術語「L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶（L-fucokinase/GDP-fucose pyrophosphorylase）」、「L-岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-P鳥苷醯基轉移酶（L-fucokinase/L-fucose-1-P guanylyltransferase）」、「GDP-岩藻糖焦磷酸化酶（GDP-fucose pyrophosphorylase）」、「GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶（GDP-L-fucose pyrophosphorylase）」及「fkp」可互換使用且係指催化使用GTP將L-岩藻糖-1-磷酸轉化為GDP-岩藻糖之酶。

術語「L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（L-glutamine-D-fructose-6-phosphate aminotransferase）」、「麩醯胺酸---果糖-6-磷酸轉胺酶（異構化）（glutamine---fructose-6-phosphate transaminase (isomerizing)）」、「磷酸己醣胺基轉移酶（hexosephosphate aminotransferase）」、「葡萄糖胺-6-磷酸異構酶（形成麩醯胺酸）（glucosamine-6-phosphate isomerase (glutamine-forming）」、「麩醯胺酸-果糖-6-磷酸轉胺酶（異構化）（glutamine-fructose-6-phosphate transaminase (isomerizing)）」、「D-果糖-6-磷酸醯胺轉移酶（D-fructose-6-phosphate amidotransferase）」、「果糖-6-磷酸胺基轉移酶（fructose-6-phosphate aminotransferase）」、「磷酸葡萄糖胺異構酶（glucosaminephosphate isomerase）」、「葡萄糖胺6-磷酸合酶（glucosamine 6-phosphate synthase）」、「GlcN6P合酶（GlcN6P synthase）」、「GFA」、「glms」、「glmS」及「glmS*54」可互換使用且係指催化使用L-麩醯胺酸將D-果糖-6-磷酸轉化為D-葡萄糖胺-6-磷酸之酶。

術語「葡萄糖胺-6-P脫胺酶（glucosamine-6-P deaminase）」、「葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶（glucosamine-6-phosphate deaminase）」、「GlcN6P脫胺酶（GlcN6P deaminase）」、「葡萄糖胺-6-磷酸異構酶（glucosamine-6-phosphate isomerase）」、「glmD」及「nagB」可互換使用且係指催化葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN6P）之可逆異構化-脫胺作用以形成果糖-6-磷酸及銨離子之酶。

術語「磷酸葡萄糖胺變位酶（phosphoglucosamine mutase）」及「glmM」可互換使用且係指催化葡萄糖胺-6-磷酸轉化成葡萄糖胺-1-磷酸之酶。磷酸葡萄糖胺變位酶亦可催化自葡萄糖-1-P形成葡萄糖-6-P，儘管速率要低1400倍。

術語「N-乙醯基葡萄糖胺-6-P脫乙醯基酶（N-acetylglucosamine-6-P deacetylase）」、「N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶（N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase）」及「nagA」可互換使用且係指催化N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6-P）之N-乙醯基的水解以產生葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN6P）及乙酸的酶。

N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶為催化反應N-醯基-D-葡萄糖胺=N-醯基-D-甘露糖胺之酶。此酶之替代名稱包含N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶、GlcNAc 2-表異構酶、N-醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶及N-乙醯基葡萄糖胺表異構酶。

葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶為催化乙醯基自乙醯基-CoA轉移至D-葡萄糖胺-6-磷酸從而產生自由CoA及N-乙醯基-D-葡萄糖胺6-磷酸之酶。替代名稱包含胺基去氧葡萄糖磷酸乙醯基轉移酶、D-葡萄糖胺-6-P N-乙醯基轉移酶、葡萄糖胺6-磷酸乙醯基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、葡萄糖胺-磷酸N-乙醯基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸乙醯基酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡萄糖胺乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺N-乙醯基酶磷酸葡萄糖胺N-乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺轉乙醯基酶、GNA及GNA1。

術語「N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶（N-acetylglucosamine-6-phosphate phosphatase）」係指使N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6-P）去磷酸化由此合成N-乙醯基葡萄糖胺（GlcNAc）之酶。

術語「N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶（N-acetylmannosamine-6-phosphate phosphatase）」係指使N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸（ManNAc-6P）去磷酸化成N-乙醯基甘露糖胺（ManNAc）之酶。

術語「N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶（N-acetylmannosamine-6-phosphate 2-epimerase）」、「ManNAc-6-P異構酶（ManNAc-6-P isomerase）」、「ManNAc-6-P 2-表異構酶（ManNAc-6-P 2-epimerase）」、「N-乙醯基葡萄糖胺-6P 2-表異構酶（N-acetylglucosamine-6P 2-epimerase）」及「nanE」可互換使用且係指將ManNAc-6-P轉化為N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6-P）之酶。

術語「磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶（phosphoacetylglucosamine mutase）」、「乙醯基葡萄糖胺磷酸變位酶（acetylglucosamine phosphomutase）」、「乙醯基胺基去氧葡萄糖磷酸變位酶（acetylaminodeoxyglucose phosphomutase）」、「磷酸-N-乙醯基葡萄糖胺變位酶（phospho-N-acetylglucosamine mutase）」及「N-乙醯基-D-葡萄糖胺1,6-磷酸變位酶（N-acetyl-D-glucosamine 1,6-phosphomutase）」可互換使用且係指催化將N-乙醯基-葡萄糖胺1-磷酸轉化成N-乙醯基葡萄糖胺6-磷酸之酶。

術語「N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶（N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase）」、「N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase）」、「UDP-N-乙醯基葡萄糖胺二磷酸酶（UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase）」、「UDP-N-乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（uridine diphosphoacetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「UTP:2-乙醯胺基-2-去氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UTP:2-acetamido-2-deoxy-alpha-D-glucose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「UDP-GlcNAc焦磷酸化酶（UDP-GlcNAc pyrophosphorylase）」、「GlmU尿苷醯基轉移酶（GlmU uridylyltransferase）」、「乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶（Acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase）」、「UDP-乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（UDP-acetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「二磷酸尿苷-N-乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸乙醯基葡萄糖胺磷酸化酶（uridine diphosphoacetylglucosamine phosphorylase）」及「乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶（acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase）」可互換使用且係指催化藉由轉移尿苷5-單磷酸（自尿苷5-三磷酸（uridine 5-triphosphate；UTP）轉移）將N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸（GlcNAc-1-P）轉化為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）之酶。

術語葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶（glucosamine-1-phosphate acetyltransferase）係指催化乙醯基自乙醯劑輔酶A轉移至葡萄糖胺-1-磷酸（GlcN-1-P）以生產N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）之酶。

術語「glmU」係指具有N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶及葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶活性兩者且催化UDP-GlcNAc之從頭生物合成途徑中之兩個依序反應的雙官能酶。C端域催化乙醯基自乙醯基輔酶A至GlcN-1-P之轉移以生產GlcNAc-1-P，其藉由尿苷5-單磷酸之轉移而轉化成UDP-GlcNAc，此為由N端域催化之反應。

如本文所用之術語「N-醯基神經胺酸-9-磷酸合酶（N-acylneuraminate-9-phosphate synthase）」、「N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶（N-acylneuraminate-9-phosphate synthetase）」、「NANA合酶（NANA synthase）」、「NANAS」、「NANS」、「NmeNANAS」、「N-乙醯基神經胺酸丙酮酸解離酶（丙酮酸磷酸化）（N-acetylneuraminate pyruvate-lyase (pyruvate-phosphorylating)）」可互換使用且係指能夠在反應中使用磷酸烯醇丙酮酸（PEP）自N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸（ManNAc-6-磷酸）合成N-醯基神經胺酸-9-磷酸之酶。

術語「半乳糖-1-表異構酶（galactose-1-epimerase）」、「醛糖1-表異構酶（aldose 1-epimerase）」、「變旋酶（mutarotase）」、「醛醣變旋酶（aldose mutarotase）」、「半乳糖變旋酶（galactose mutarotase）」、「半乳糖1-表異構酶（galactose 1-epimerase）」及「D-半乳糖1-表異構酶（D-galactose 1-epimerase）」可互換使用且係指催化β-D-半乳糖轉化為α-D-半乳糖之酶。

術語「半乳糖激酶（galactokinase）」、「半乳糖激酶（磷酸化）（galactokinase(phosphorylating)）」及「ATP:D-半乳糖-1-磷酸轉移酶（ATP:D-galactose-1-phosphotransferase）」可互換使用且係指催化使用ATP將α-D-半乳糖轉化成α-D-半乳糖1-磷酸之酶。

術語葡萄糖激酶（glucokinase）及「葡萄糖激酶（磷酸化）（glucokinase (phosphorylating)）」可互換使用且係指催化使用ATP將D-葡萄糖轉化成D-葡萄糖6-磷酸之酶。

術語「半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（galactose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「Gal-1-P尿苷醯基轉移酶（Gal-1-P uridylyltransferase）」、「UDP-葡萄糖---己醣-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UDP-glucose---hexose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「尿苷醯基轉移酶（uridyl transferas）」、「己醣-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（hexose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「尿苷醯基轉移酶（uridyltransferase）」、「己醣1-磷酸尿苷醯基轉移酶（hexose 1-phosphate uridyltransferase）」、「UDP-葡萄糖:α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UDP-glucose:alpha-D-galactose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「galB」及「galT」可互換使用且係指催化反應D-半乳糖1-磷酸+UDP-D-葡萄糖=D-葡萄糖1-磷酸+UDP-D-半乳糖之酶。

術語「UDP-葡萄糖4-表異構酶（UDP-glucose 4-epimerase）」、「UDP-半乳糖4-表異構酶（UDP-galactose 4-epimerase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖表異構酶（uridine diphosphoglucose epimerase）」、「半乳糖瓦爾登轉化酶（galactowaldenase）」、「UDPG-4-表異構酶（UDPG-4-epimerase）」、「尿苷二磷酸半乳糖4-表異構酶（uridine diphosphate galactose 4-epimerase）」、「尿苷二磷酸-半乳糖-4-表異構酶（uridine diphospho-galactose-4-epimerase）」、「UDP-葡萄糖表異構酶（UDP-glucose epimerase）」、「4-表異構酶（4-epimerase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表異構酶（uridine diphosphoglucose 4-epimerase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表異構酶（uridine diphosphate glucose 4-epimerase）」及「UDP-D-半乳糖4-表異構酶（UDP-D-galactose 4-epimerase）」可互換使用且係指催化UDP-D-葡萄糖轉化為UDP-半乳糖之酶。

術語「葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（glucose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「UTP---葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UTP---glucose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UDP glucose pyrophosphorylase）」、「UDPG磷酸化酶（UDPG phosphorylase）」、「UDPG焦磷酸化酶（UDPG pyrophosphorylase）」、「尿苷5'-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine 5'-diphosphoglucose pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸-D-葡萄糖焦磷酸化酶（uridine diphosphate-D-glucose pyrophosphorylase）」、「尿苷-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine-diphosphate glucose pyrophosphorylase）」及「galU」可互換使用且係指催化使用UTP將D-葡萄糖-1-磷酸轉化為UDP-葡萄糖之酶。

術語「磷酸葡萄糖變位酶（α-D-葡萄糖-1,6-二磷酸依賴型）（phosphoglucomutase (alpha-D-glucose-1,6-bisphosphate-dependent)）」、「葡萄糖磷酸變位酶（不明確）（glucose phosphomutase (ambiguous)）」及「磷酸葡萄糖變位酶（不明確）（phosphoglucose mutase (ambiguous)）」可互換使用且係指催化D-葡萄糖1-磷酸轉化為D-葡萄糖6-磷酸之酶。

術語「UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶（UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase）」、「UDP乙醯基葡萄糖胺表異構酶（UDP acetylglucosamine epimerase）」、「尿苷二磷酸乙醯基葡萄糖胺表異構酶（uridine diphosphoacetylglucosamine epimerase）」、「尿苷二磷酸N-乙醯基葡萄糖胺-4-表異構酶（uridine diphosphate N-acetylglucosamine-4-epimerase）」、「尿苷5'-二磷酸-N-乙醯基葡萄糖胺-4-表異構酶（uridine 5'-diphospho-N-acetylglucosamine-4-epimerase）」及「UDP-N-乙醯基-D-葡萄糖胺4-表異構酶（UDP-N-acetyl-D-glucosamine 4-epimerase）」可互換使用且係指催化UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）表異構化為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）之酶。

術語「N-乙醯基半乳糖胺激酶（N-acetylgalactosamine kinase）」、「GALK2」、「GK2」、「GalNAc激酶（GalNAc kinase）」、「N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)-1-磷酸激酶（N-acetylgalactosamine (GalNAc)-1-phosphate kinase）」及「ATP:N-乙醯基-D-半乳糖胺1-磷酸轉移酶（ATP:N-acetyl-D-galactosamine 1-phosphotransferase）」可互換使用且係指催化使用ATP自N-乙醯基半乳糖胺（GalNAc）合成N-乙醯基半乳糖胺1-磷酸（GalNAc-1-P）之酶。

術語「UDP-N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶（UDP-N-acetylgalactosamine pyrophosphorylase）」及「UDP-GalNAc焦磷酸化酶（UDP-GalNAc pyrophosphorylase）」可互換使用且係指使用UTP催化N-乙醯基半乳糖胺1-磷酸（GalNAc-1-P）轉化為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）之酶。

術語「乙醯基-輔酶A合成酶（acetyl-coenzyme A synthetase）」、「acs」、「乙醯基-CoA合成酶（acetyl-CoA synthetase）」、「AcCoA合成酶（AcCoA synthetase）」、「乙酸--CoA接合酶（acetate--CoA ligase）」、「醯基活化酶（acyl-activating enzyme）」及「yfaC」可互換使用且係指在ATP依賴性反應中催化乙酸轉化為乙醯基-輔酶A（AcCoA）之酶。

術語「丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase）」、「丙酮酸氧化酶（pyruvate oxidase）」、「POX」、「poxB」及「丙酮酸:泛醌-8氧化還原酶（pyruvate:ubiquinone-8 oxidoreductase）」可互換使用且係指催化丙酮酸之氧化去羧以生產乙酸及CO2之酶。

術語「乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）、「D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase）」、「ldhA」、「hslI」、「htpH」、「D-LDH」、「醱酵性乳酸脫氫酶（fermentative lactate dehydrogenase）」及「D-特異性2-羥基酸脫氫酶（D-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase）」可互換使用且係指催化乳酸轉化成丙酮酸由此生成NADH之酶。

術語「致能流出（enabled efflux）」意謂在細胞質膜及/或細胞壁上引入溶質之運輸活性。該運輸可藉由引入及/或增加如本發明所描述之運輸蛋白的表現來實現。術語「增強之流出（enhanced efflux）」意謂改良溶質在細胞質膜及/或細胞壁上之運輸活性。可藉由引入及/或增加如本發明所描述之膜運輸蛋白的表現來增強溶質在細胞質膜及/或細胞壁上之運輸。膜運輸蛋白之「表現（expression）」定義為在編碼該膜運輸蛋白之基因為內源基因的情況下該基因之「過度表現（overexpression）」，或在編碼該膜運輸蛋白之基因為不存在於野生型菌株或細胞中之異源基因的情況下「表現（expression）」。

如本文所用，術語「細胞生產力指數（cell productivity index，CPI）」係指藉由細胞生產之產物的質量除以培養物中生產之細胞的質量。

術語「純化（purified）」係指實質上或基本上不含干擾生物分子活性之組分的物質。對於細胞、醣、核酸及多肽，術語「純化」係指實質上或基本上不含通常伴隨天然狀態下發現之物質的組分的物質。典型地，如藉由銀染色凝膠上之條帶強度或用於確定純度之其他方法所量測，本發明之純化醣、寡醣、蛋白質或核酸為至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%純，通常至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%純。純度或均質性可藉由所屬技術領域中熟知之多種方式指示，該等方式諸如蛋白質或核酸樣品之聚丙烯醯胺凝膠電泳，之後在染色後進行觀測。出於某些目的，將需要高解析度及採用HPLC或用於純化之類似方式。關於雙醣及寡醣，純度可使用諸如但不限於薄層層析、氣相層析、NMR、HPLC、毛細管電泳或質譜之方法測定。

術語「培養物（cultivation）」係指其中培養或醱酵細胞之培養基、細胞本身及由細胞在全培養液中生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣，亦即在細胞內部（胞內）以及細胞外部（胞外）。

如本文所用，術語「前驅物（precursor）」係指藉由細胞吸收及/或合成以用於特異性生產根據本發明之唾液酸化雙醣及/或寡醣之物質。在此意義上，前驅物可為如本文所定義之受體，但亦可為另一物質，亦即代謝物，其首先在細胞內作為唾液酸化雙醣及/或寡醣之生物化學合成途徑之一部分經修飾。此類前驅物之實例包含如本文所定義之受體；及/或葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、二羥基丙酮、葡萄糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙醯基-甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺；磷酸化糖，如例如但不限於葡萄糖-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、甘露糖-6-磷酸、甘露糖-1-磷酸、甘油-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸、二羥基丙酮-磷酸、葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙醯基-葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸、N-乙醯基-神經胺酸-9-磷酸；及/或如本文所定義之核苷酸活化糖，如例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺、CMP-唾液酸、GDP-甘露糖、GDP-4-脫氫-6-去氧-α-D-甘露糖、GDP-岩藻糖。

視情況，細胞經轉形以包含及表現至少一種核酸序列，該核酸序列編碼選自由以下者組成之群的蛋白質：乳糖運輸蛋白；海藻糖運輸蛋白；用於核苷酸活化糖之運輸蛋白，其中該運輸蛋白將a內化至添加前驅物以用於合成本發明之唾液酸化雙醣及/或寡醣的培養基中。

如本文所用，術語「受體（acceptor）」係指可藉由醣基轉移酶修飾之單醣、雙醣或寡醣。此類受體之實例包含葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、乳-N-丙醣、乳-N-四醣（LNT）、乳-N-新四醣（LNnT）、乳-N-五醣（LNP）、乳-N-新五醣、對乳-N-五醣、對乳-N-新五醣、乳-N-新型五醣I、乳-N-六醣（LNH）、乳-N-新六醣（LNnH）、對乳-N-新六醣（pLNnH）、對乳-N-六醣（pLNH）、乳-N-七醣、乳-N-新七醣、對乳-N-新七醣、對乳-N-七醣、乳-N-八醣（LNO）、乳-N-新八醣、異乳-N-八醣、對乳-N-八醣、異乳-N-新八醣、新型乳-N-新八醣、對乳-N-新八醣、異乳-N-九醣、新型乳-N-九醣、乳-N-九醣、乳-N-十醣、異乳-N-十醣、新型乳-N-十醣、乳-N-新十醣及含有1或多個N-乙醯基乳糖胺單元及/或1或多個乳-N-二醣單元之寡醣或寡醣之中間物，其岩藻糖基化及唾液酸化形式。 具體實施方式

根據第一具體實例，本發明提供一種用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之代謝上經工程改造之細胞。在本文中，提供包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑的代謝上經工程改造之細胞，其經修飾以用於表現及/或過度表現編碼一或多種催化相同化學反應之蛋白質的多個編碼DNA序列。

根據第二具體實例，本發明提供一種藉由代謝上經工程改造之細胞生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法。該方法包含以下步驟： 1）提供如本文所描述之細胞，及 2）在允許生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之條件下培養該細胞。

較佳地，將唾液酸化雙醣及/或寡醣按本文中所解釋自培養物分離。

在本發明之範圍內，允許條件應理解為與物理或化學參數相關之條件，該等參數包括但不限於溫度、pH、壓力、滲透壓及產物/前驅物/受體濃度。

在一特定具體實例中，允許條件可包括30 +/- 20攝氏度之溫度範圍、7 +/- 3之pH範圍。

根據本發明之方法及/或細胞之一個態樣，藉由表現及/或過度表現多個編碼DNA序列在細胞中編碼且催化相同化學反應之一或多種蛋白質為同功蛋白質。同功蛋白質為具有相同蛋白質活性之替代形式，其不同之處可在於胺基酸組成、序列、三維結構、多聚四級結構、蛋白質穩定性、調節特性及動力學參數，包含 K _M、 k _cat、催化效率、酶速率及速度中之任何一或多者。同功蛋白質可具有催化相同化學反應的不同催化效率。

根據本發明之方法及/或細胞之一替代態樣，藉由表現及/或過度表現多個編碼DNA序列在細胞中編碼且催化相同化學反應之一或多種蛋白質為參與待用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之核苷酸活化糖之合成的蛋白質。

根據本發明之方法及/或細胞之一替代態樣，藉由表現及/或過度表現多個編碼DNA序列在細胞中編碼且催化相同化學反應之一或多種蛋白質為膜運輸蛋白。根據本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例，該一或多種膜運輸蛋白選自包含如本文所定義之螯鐵蛋白輸出蛋白、ABC運輸蛋白、MFS運輸蛋白及糖流出運輸蛋白之清單。

本發明提供藉由用於用代謝上經工程改造之細胞生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之不同類型之細胞。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，細胞表現由多個編碼DNA序列表現之一種蛋白質。在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞表現由多個編碼DNA序列表現之兩種同功蛋白質。在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞表現由多個編碼DNA序列表現之三種或更多種同功蛋白質。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，細胞代謝上經工程改造以包含用於生產如本文所定義之唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑。在本發明之方法及/或細胞之一替代較佳具體實例中，細胞代謝上經工程改造以包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑且表現及/或過度表現催化相同化學反應之任何一或多種同功蛋白質。

根據本發明之方法及/或細胞之一較佳態樣，藉由在細胞中表現及/或過度表現多個編碼DNA序列編碼之蛋白質及/或兩種或更多種同功蛋白質參與用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑。

在本發明之方法及/或細胞之一另外較佳態樣中，用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑包含如本文所定義之唾液酸化途徑。

根據本發明之方法及/或細胞之一較佳態樣，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白。

根據本發明之方法及/或細胞之一另外較佳態樣，細胞表現至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白，其中該至少一種蛋白質由該等多個編碼DNA序列編碼。

根據本發明之方法及/或細胞之另一更佳態樣，該N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白中之任一者為具有經修飾之表現或活性之細胞的內源蛋白，較佳該內源N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白中之任一者經過度表現；或者，該N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白中之任一者為異質引入且表現於該細胞中、較佳過度表現之異源蛋白。該內源N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白中之任一者可在細胞中具有經修飾之表現，該細胞亦表現異源N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白中之任一者。

在方法及/或細胞之一較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現唾液酸運輸蛋白，其例如搬運體或P-P鍵水解驅動運輸蛋白，如可經由www.tcdb.org.獲得之由Saier Lab Bioinformatics Group運作且管理之運輸蛋白分類資料庫所定義，如例如具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的nanT。唾液酸可添加至細胞中或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供，如本文所描述。

在方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現選自包含α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及α-2,8-唾液酸基轉移酶之清單的唾液酸基轉移酶，其將唾液酸自CMP-唾液酸轉移至一或多個聚醣受體以生產唾液酸化雙醣及/或寡醣。在方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞表現多於一種唾液酸基轉移酶，其合成如本文所定義之任何一或多種唾液酸化雙醣及/或寡醣。CMP-唾液酸可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供。此類生產CMP-唾液酸之細胞描述於本文中。較佳地，如本文所描述，細胞經修飾以生產CMP-唾液酸。更佳地，如本文所描述，細胞經修飾以用於增強CMP-唾液酸之生產。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現如已知例如來自腦膜炎奈瑟氏菌（ N. meningitidis）、智人（ Homo sapiens）、褐鼠（ R. norvegicus）、鏈黴菌屬物種（ Streptomycessp.）、空腸彎曲桿菌（ C. jejuni）之N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，其將唾液酸轉化成CMP-唾液酸，及唾液酸基轉移酶，包括α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶。唾液酸可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供。此類生產唾液酸之細胞可表現N-乙醯基神經胺酸合酶，如已知例如來自包括腦膜炎奈瑟氏菌及空腸彎曲桿菌之若干物種。較佳地，細胞經修飾以生產唾液酸。更佳地，細胞經修飾以用於增強唾液酸之生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：N-乙醯基神經胺酸解離酶之剔除、N-乙醯基神經胺酸合酶之過度表現及N-乙醯基神經胺酸運輸蛋白之過度表現。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現如已知例如來自腦膜炎奈瑟氏菌、鏈黴菌屬空腸彎曲桿菌之N-乙醯基神經胺酸合酶，其將N-乙醯基甘露糖胺（ManNAc）轉化成N-乙醯基神經胺酸，N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸基轉移酶，如本文所描述。ManNAc可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供。此類生產ManNAc之細胞可表現如本文所描述之UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶。較佳地，細胞經修飾以生產ManNAc。更佳地，細胞經修飾以用於增強ManNAc之生產。該修飾可為例如UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶之表現。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現磷酸酶，如例如大腸桿菌類HAD磷酸酶基因，包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU，來自戀臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL（如WO18122225中所描述），其將N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6P）轉化成N-乙醯基葡萄糖胺（GlcNAc），及/或磷酸酶，如例如來自候選種（ Candidatus）趨磁桑葚狀菌屬物種（ Magnetomorumsp.）HK-1或多形擬桿菌（ Bacteroides thetaiotaomicron）之N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶，其將N-醯基神經胺酸-9-磷酸轉化成唾液酸，以及例如表現N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸基轉移酶，如本文所描述。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現如已知例如來自包括空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、枯草桿菌、鼠檸檬酸桿菌（ Citrobacter rodentium）之若干物種的UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶，其將UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）轉化成ManNAc，N-乙醯基神經胺酸合酶及唾液酸基轉移酶，其中酶如本文所定義。UDP-GlcNAc可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。此類生產UDP-GlcNAc之細胞描述於本文中。較佳地，細胞經修飾以生產UDP-GlcNAc。更佳地，如本文所描述，細胞經修飾以用於增強UDP-GlcNAc生產。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現如已知例如來自包括智人、小鼠（ Mus musculus）、褐鼠之若干物種的N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶，其將N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸（ManNAc-6-P）轉化成N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸，磷酸酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸基轉移酶，如本文所描述。ManNAc-6-P可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。此類生產ManNAc-6-P之細胞可例如表現如本文所描述之雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶。較佳地，細胞經修飾以生產ManNAc-6-P。更佳地，細胞經修飾以用於增強ManNAc-6-P生產。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現如已知例如來自包括智人、褐鼠及小鼠之若干物種的雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶，其將UDP-GlcNAc轉化成ManNAc-6-P，N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸基轉移酶，其中酶如本文所定義。UDP-GlcNAc可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。此類生產UDP-GlcNAc之細胞描述於本文中。較佳地，細胞經修飾以生產UDP-GlcNAc。更佳地，如本文所描述，細胞經修飾以用於增強UDP-GlcNAc生產。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現如已知例如來自包括大腸桿菌、流感嗜血桿菌（ Haemophilus influenzae）、腸桿菌屬物種（ Enterobactersp.）、鏈黴菌屬之若干物種的N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶，其將N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6P）轉化成ManNAc-6-P，N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸基轉移酶e，其中酶如本文所定義。GlcNAc-6P可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。此類生產GlcNAc-6P之細胞可表現將例如待添加至細胞中之中GlcN6P轉化為GlcNAc-6P之酶。此酶可為來自包括釀酒酵母、乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis）、智人之若干物種的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶。較佳地，細胞經修飾以生產GlcNAc-6P。更佳地，細胞經修飾以用於增強GlcNAc-6P生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶之剔除及L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及/或葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶之過度表現。

在一替代及/或額外較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其中該細胞表現如已知例如來自包括卵形擬桿菌（ Bacteroides ovatus）、大腸桿菌、智人、褐鼠之若干物種的N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶，其將GlcNAc轉化成ManNAc，N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸基轉移酶，其中酶如本文所定義。GlcNAc可添加至細胞中及/或可藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供。此類生產GlcNAc之細胞可表現將GlcNAc-6-磷酸轉化成GlcNAc之磷酸酶，如例如以下者中之任何一或多者：大腸桿菌類HAD磷酸酶基因，包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU，來自戀臭假單胞菌之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL，如WO18122225中所描述。較佳地，細胞經修飾以生產GlcNAc。更佳地，細胞經修飾以用於增強GlcNAc生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶及/或N-乙醯基-D-葡萄糖胺激酶之剔除及L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及/或葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶之過度表現。

另外或可替代地，本文所用之宿主細胞視情況經基因修飾以藉由引入及/或過度表現能夠將各別前驅物及/或受體輸入至細胞中之膜運輸蛋白，將前驅物及/或受體輸入至細胞中。此類運輸蛋白為例如膜運輸蛋白，其屬於螯鐵蛋白輸出蛋白家族、主要易化子超家族（MFS）、ATP結合卡匣（ABC）運輸蛋白家族、糖流出運輸蛋白家族或參與例如單醣、雙醣及/或寡醣之吸收的PTS系統。

另外或可替代地，本文所用之宿主細胞視情況經基因修飾以藉由引入及/或過度表現乳糖透過酶來將乳糖輸入至細胞中。該乳糖透過酶例如由lacY基因或lac12基因編碼。

另外或可替代地，本文所用之宿主細胞視情況經基因修飾以在膜上輸出唾液酸化雙醣及/或寡醣。此類運輸蛋白為例如膜運輸蛋白，其屬於螯鐵蛋白輸出蛋白家族、主要易化子超家族（MFS）、ATP結合卡匣（ABC）運輸蛋白家族或糖流出運輸蛋白家族。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，細胞包含多個編碼DNA序列，其中該等多個編碼DNA序列包含編碼一種蛋白質之相同編碼DNA序列的多個複本。

在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞包含多個編碼DNA序列，其中該等多個編碼DNA序列包含編碼一種蛋白質之多個不同編碼DNA序列。

在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞包含多個編碼DNA序列，其中該等多個編碼DNA序列包含編碼催化相同化學反應之多個同功蛋白質的多個不同編碼DNA序列。

根據本發明之方法及/或細胞之一個態樣，術語「多個（multiple）」係至少兩個。在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，術語「多個」係至少三個。在本發明之方法及/或細胞之一更佳具體實例中，術語「多個」係至少五個。

在本發明之方法及/或細胞之一例示性具體實例中，細胞包含編碼相同蛋白質之兩個相同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼相同蛋白質之兩個不同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼催化相同化學反應之兩種同功蛋白質的兩個不同編碼DNA序列。

在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼相同蛋白質之三個相同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含兩個相同編碼DNA序列及一個不同於另外兩個編碼DNA序列之編碼DNA序列，其中該三個編碼DNA序列編碼相同蛋白質。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含兩個相同編碼DNA序列及一個不同於另外兩個編碼DNA序列之編碼DNA序列，其中該三個編碼DNA序列編碼催化相同化學反應之兩種同功蛋白質。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼相同蛋白質之三個不同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼催化相同化學反應之三種同功蛋白質的三個不同編碼DNA序列。

在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼相同蛋白質之五個相同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼相同蛋白質之五個不同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼催化相同化學反應之兩種同功蛋白質的五個不同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼催化相同化學反應之三種同功蛋白質的五個不同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼催化相同化學反應之四種同功蛋白質的五個不同編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之另一例示性具體實例中，細胞包含編碼催化相同化學反應之五種同功蛋白質的五個不同編碼DNA序列。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳態樣中，代謝上經工程改造之細胞經一或多個包含多個編碼DNA序列之基因表現模組修飾，其中由該等多個編碼DNA序列中之任一者表現受一或多個調節序列調節。在本發明之方法及/或細胞之另一較佳態樣中，表現模組中之任何一或多者的表現為持續性或可調的。

該等表現模組亦稱為轉錄單元且包含用於表現重組基因之聚核苷酸，包括編碼DNA序列及可操作地連接於編碼基因之適當轉錄及/或轉譯控制信號。該等控制信號包含啟動子序列、非轉譯區、核糖體結合位點、終止子序列。該等表現模組可含有用於表現一個單一重組基因之元件，但亦可含有用於表現更多重組基因之元件或可組織於用於整合表現兩個或更多個重組基因之操縱子結構中。該等聚核苷酸可藉由重組DNA技術，使用所屬技術領域中熟知之技術來產生。所屬技術領域中具有通常知識者熟知的構築表現模組之方法包括例如試管內重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。參見例如描述於以下者中之技術：Sambrook等人(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual,第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York或Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989且每年更新)。

根據本發明之一較佳態樣，細胞經一或多個表現模組修飾。表現模組可整合於該細胞之基因體中或可在載體上呈現至該細胞。該載體可以質體、黏接質體、噬菌體、脂質體或病毒形式存在，其將穩定轉形/轉染至該代謝上經工程改造之細胞中。此類載體包括尤其染色體、游離型及病毒衍生之載體，例如衍生自細菌質體、噬菌體、轉位子、酵母游離基因體、插入元件、酵母染色體元件、病毒之載體及衍生自其組合之載體，諸如衍生自質體及噬菌體遺傳元件之載體，諸如黏接質體及噬質體。此等載體可含有選擇標記，諸如但不限於抗生素標記、營養缺陷型標記、毒素-抗毒素標記、RNA有義/反義標記。表現系統構築體可含有調節以及產生表現之控制區。一般而言，就此而言，適用於在宿主中維持、擴增或表現聚核苷酸及/或表現多肽之任何系統或載體可用於表現。適當DNA序列可藉由各種熟知及慣例技術，諸如闡述於Sambrook等人（參見上文）中之彼等技術中之任一者插入至表現系統中。對於重組生產，細胞可經基因工程改造以併入表現系統或其部分或本發明之聚核苷酸。向細胞中引入聚核苷酸可藉由許多標準實驗室手冊，諸如Davis等人, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)及Sambrook等人, 1989,前述文獻中所描述之方法來實現。

如本文所用，表現模組包含用於表現至少一種重組基因之聚核苷酸。該重組基因參與在該唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成中起作用之多肽的表現；或該重組基因連接至該宿主細胞中不參與該唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成的其他途徑。該等重組基因編碼具有經修飾之表現或活性之內源蛋白，較佳該等內源蛋白經過度表現；或該等重組基因編碼異質引入且表現於該經修飾細胞中、較佳過度表現之異源蛋白。內源蛋白可在亦表現異源蛋白之細胞中具有經修飾之表現。

根據本發明之一較佳態樣，該等表現模組中之各者的表現為持續性或可調的，如本文所定義。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，由多個編碼DNA序列編碼之蛋白質及/或同功蛋白質參與核苷酸活化糖之合成。在本文中，核苷酸活化糖將用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣。在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，核苷酸活化糖選自包含以下者之清單：UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、CMP-唾液酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、CMP-N-羥乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。在本發明之方法及/或細胞之一更佳具體實例中，核苷酸活化糖選自包含以下者之清單：UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、CMP-唾液酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂及CMP-N-羥乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Gc）。

根據本發明之方法及/或細胞之一較佳態樣，由多個編碼DNA序列編碼且參與核苷酸活化糖之合成的蛋白質及/或同功蛋白質選自包含以下者之清單：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、N-乙醯基葡萄糖胺表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6P 2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、唾液酸合酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸磷酸酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖磷酸變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、UDP-半乳糖4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶、UDP-GalNAc焦磷酸化酶、甘露糖-1-磷酸甲脒基轉移酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶及ManNAc激酶。

在本發明之方法及/或細胞之另一態樣中，細胞在參與核苷酸活化糖之合成之該蛋白質及/或同功蛋白質中之至少一者的表現或活性方面經修飾。在一較佳具體實例中，參與核苷酸活化糖之合成的該蛋白質及/或同功蛋白質為具有經修飾之表現或活性的細胞之內源蛋白，較佳參與核苷酸活化糖之合成的該內源蛋白及/或同功蛋白質經過度表現；或者，參與核苷酸活化糖之合成的該蛋白質及/或同功蛋白質為異質引入且表現於該細胞中、較佳過度表現之異源蛋白。參與核苷酸活化糖之合成的該內源蛋白及/或同功蛋白質可在細胞中具有經修飾之表現，該細胞亦表現參與核苷酸活化糖之合成的異源蛋白及/或同功蛋白質。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，細胞經修飾以藉由酶之表現自例如GlcNAc生產UDP-GlcNAc，該等酶如例如來自包括智人、大腸桿菌之若干物種的N-乙醯基-D-葡萄糖胺激酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺變位酶及N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶。更佳地，細胞經修飾以用於增強UDP-GlcNAc生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶之剔除、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶之過度表現、磷酸葡萄糖胺變位酶之過度表現以及N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶之過度表現。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳具體實例中，細胞經修飾以表現CMP-唾液酸，如例如CMP-Neu5Ac或CMP-Neu5Gc之從頭合成。

此類生產CMP-Neu5Ac之細胞可表現將例如唾液酸轉化為CMP-Neu5Ac之酶。此酶可為CMP-唾液酸合成酶，如來自包括智人、腦膜炎奈瑟氏菌及多殺性巴氏桿菌（ Pasteurella multocida）之若干物種的N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶。更佳地，細胞經修飾以用於增強CMP-Neu5Ac生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶之剔除、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶之剔除、CMP-唾液酸合成酶之過度表現以及N-乙醯基-D-葡萄糖胺-2-表異構酶編碼基因之過度表現。

CMP-Neu5Gc可經由藉由脊椎動物CMP-Neu5Ac羥化酶（CMAH）酶進行之羥基化反應由CMP-Neu5Ac直接合成。更佳地，細胞經修飾以用於增強CMP-Neu5Gc生產。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳具體實例中，本文所用之宿主細胞視情況經基因修飾以表現GDP-岩藻糖之從頭合成。GDP-岩藻糖可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。此類生產GDP-岩藻糖之細胞可表現將例如待添加至細胞中之岩藻糖轉化為GDP-岩藻糖之酶。此酶可為例如雙官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶，如來自脆弱擬桿菌（ Bacteroides fragilis）之Fkp，或一種單獨岩藻糖激酶連同一種單獨岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶之組合，如已知其來自若干物種，包括智人、野豬（ Sus scrofa）及褐鼠。較佳地，細胞經修飾以生產GDP-岩藻糖。更佳地，細胞經修飾以用於增強GDP-岩藻糖生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因之剔除、GDP-L-岩藻糖合酶編碼基因之過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因之過度表現、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶編碼基因之過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因之過度表現及甘露糖-6-磷酸異構酶編碼基因之過度表現。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳具體實例中，本文所用之宿主細胞視情況經基因修飾以表現UDP-Gal之從頭合成。UDP-Gal可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。此類生產UDP-Gal之細胞可表現將例如UDP-葡萄糖轉化為UDP-Gal之酶。此酶可例如為如自包括智人、大腸桿菌及褐鼠之若干物種已知之UDP-葡萄糖-4-表異構酶GalE。較佳地，細胞經修飾以生產UDP-Gal。更佳地，細胞經修飾以用於增強UDP-Gal生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：雙官能5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因之剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶編碼基因之剔除及UDP-葡萄糖-4-表異構酶編碼基因之過度表現。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳具體實例中，本文所用之宿主細胞視情況經基因修飾以表現UDP-GalNAc之從頭合成。可使用UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶，如例如來自類志賀鄰單胞菌（ Plesiomonas shigelloides）之wbgU、來自小腸大腸炎耶氏桿菌（ Yersinia enterocolitica）之gne或來自綠膿桿菌（ Pseudomonas aeruginosa）血清型O6之wbpP，藉由單步反應之作用由UDP-GlcNAc合成UDP-GalNAc。較佳地，細胞經修飾以生產UDP-GalNAc。更佳地，細胞經修飾以用於增強UDP-GalNAc生產。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳具體實例中，本文所用之宿主細胞視情況經基因修飾以表現UDP-ManNAc之從頭合成。可經由藉由UDP-GlcNAc 2-表異構酶（如例如來自金黃色葡萄球菌（ Staphylococcusaureus）之cap5P、來自大腸桿菌之RffE、來自肺炎鏈球菌（ S. pneumoniae）之Cps19fK及來自腸沙門氏菌（ S. enterica）之RfbC）進行表異構化反應，由UDP-GlcNAc直接合成UDP-ManNAc。較佳地，細胞經修飾以生產UDP-ManNAc。更佳地，細胞經修飾以用於增強UDP-ManNAc生產。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，細胞表現至少一種選自包含以下者之清單的醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳糖醛酸苷轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-羥乙醯基神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，岩藻糖基轉移酶選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，唾液酸基轉移酶選自包含以下者之清單：α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及α-2,8-唾液酸基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，半乳糖基轉移酶選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，葡萄糖基轉移酶選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，甘露糖基轉移酶選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶選自包含α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶之清單。

在本發明之方法及/或細胞之另一態樣中，細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾。在一較佳具體實例中，該醣基轉移酶為具有經修飾之表現或活性之細胞的內源蛋白，較佳該內源醣基轉移酶經過度表現；或者，該醣基轉移酶為異質引入且表現於該細胞中、較佳過度表現之異源蛋白。該內源醣基轉移酶可在亦表現異源醣基轉移酶之細胞中具有經修飾之表現。

在本發明之方法及/或細胞之額外及/或替代其他態樣中，細胞經修飾以用於表現及/或過度表現編碼兩種或更多種催化相同化學反應之醣基轉移酶的多個編碼DNA序列。在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有α-1,2-；α-1,3-；α-1,4-及/或α-1,6-岩藻糖基轉移酶活性之酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有α-2,3-；α-2,6-及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶活性之酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有α-1,3-；α-1,4-；β-1,3-及/或β-1,4-半乳糖基轉移酶活性之酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-及/或N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶活性之酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有α-；β-1,2-；β-1,3-及/或β-1,4-葡萄糖基轉移酶活性之酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有α-1,2-；α-1,3-及/或α-1,6-甘露糖基轉移酶活性之酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有半乳糖苷β-1,3-及/或β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶活性之酶。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外具體實例中，由多個編碼DNA序列在細胞中表現之一或多種醣基轉移酶為具有α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶活性之酶。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，由多個編碼DNA序列編碼之蛋白質為膜運輸蛋白。根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，該膜運輸蛋白參與唾液酸化雙醣及/或寡醣之生產。

根據本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例，細胞表現選自包含以下者之清單之膜運輸蛋白的兩個或更多個複本：螯鐵蛋白輸出蛋白、ABC運輸蛋白、MFS運輸蛋白及糖流出運輸蛋白。在本發明之方法及/或細胞之一例示性具體實例中，細胞包含兩個或更多個編碼DNA序列，其編碼相同螯鐵蛋白輸出蛋白，如例如包含具有SEQ ID NO 49之entS、具有SEQ ID NO 50之MdfA及具有SEQ ID NO 51之iceT的大腸桿菌基因。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含兩個或更多個編碼DNA序列，其編碼相同ABC運輸蛋白，如例如具有SEQ ID NO 52之來自大腸桿菌的oppF、來自乳酸乳球菌乳酸亞種二乙醯基乳酸生物型（ Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis）的lmrA及來自長雙叉桿菌嬰兒亞種（ Bifidobacterium longum subsp. infantis）之Blon_2475。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含兩個或更多個編碼相同MFS運輸蛋白之編碼DNA序列，如例如包含具有SEQ ID NO 49之entS、具有SEQ ID NO 50之MdfA及具有SEQ ID NO 51之iceT的大腸桿菌基因。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含兩個或更多個編碼相同糖流出運輸蛋白之編碼DNA序列，如例如包含具有SEQ ID NO 55之setA、具有SEQ ID NO 56之setB及具有SEQ ID NO 57之setC的大腸桿菌基因。

在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含螯鐵蛋白輸出蛋白之一個編碼DNA序列與ABC運輸蛋白、MFS運輸蛋白及/或糖流出運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含ABC運輸蛋白之一個編碼DNA序列與螯鐵蛋白運輸蛋白、MFS運輸蛋白及/或糖流出運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含MFS運輸蛋白之一個編碼DNA序列與螯鐵蛋白運輸蛋白、ABC運輸蛋白及/或糖流出運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含糖流出運輸蛋白之一個編碼DNA序列與螯鐵蛋白運輸蛋白、ABC運輸蛋白及/或MFS運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。

在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含螯鐵蛋白運輸蛋白之一個編碼DNA序列及ABC運輸蛋白之一個編碼DNA序列與MFS運輸蛋白及/或糖流出運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含螯鐵蛋白運輸蛋白之一個編碼DNA序列及MFS運輸蛋白之一個編碼DNA序列與ABC運輸蛋白及/或糖流出運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含螯鐵蛋白運輸蛋白之一個編碼DNA序列及糖流出運輸蛋白之一個編碼DNA序列與ABC運輸蛋白及/或MFS運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含ABC運輸蛋白之一個編碼DNA序列及MFS運輸蛋白之一個編碼DNA序列與螯鐵蛋白運輸蛋白及/或糖流出運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含ABC運輸蛋白之一個編碼DNA序列及糖流出運輸蛋白之一個編碼DNA序列與螯鐵蛋白運輸蛋白及/或MFS運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含MFS運輸蛋白之一個編碼DNA序列及糖流出運輸蛋白之一個編碼DNA序列與螯鐵蛋白運輸蛋白及/或ABC運輸蛋白中之任何一或多者的兩個或更多個編碼DNA序列的組合。

在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含螯鐵蛋白運輸蛋白之一個編碼DNA序列、ABC運輸蛋白之一個編碼DNA序列及MFS運輸蛋白之一個編碼DNA序列與糖流出運輸蛋白之兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含螯鐵蛋白運輸蛋白之一個編碼DNA序列、MFS運輸蛋白之一個編碼DNA序列及糖流出運輸蛋白之一個編碼DNA序列與ABC運輸蛋白之兩個或更多個編碼DNA序列的組合。在本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外例示性具體實例中，細胞包含ABC運輸蛋白之一個編碼DNA序列、MFS運輸蛋白之一個編碼DNA序列及糖流出運輸蛋白之一個編碼DNA序列與螯鐵蛋白運輸蛋白之兩個或更多個編碼DNA序列的組合。

在本發明之方法及/或細胞之另一態樣中，細胞在該膜運輸蛋白中之至少一者的表現或活性方面經修飾。在一較佳具體實例中，該膜運輸蛋白為具有經修飾之表現或活性之細胞的內源蛋白，較佳該內源膜運輸蛋白經過度表現；或者，該膜運輸蛋白為異質引入且表現於該細胞中、較佳過度表現之異源蛋白。該內源膜運輸蛋白可在亦表現異源膜運輸蛋白之細胞中具有經修飾之表現。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，唾液酸化雙醣及/或寡醣選自包含以下者之清單：乳寡醣、O-抗原、腸內菌共同抗原（ECA）、存在於莢膜多醣中之寡醣重複、肽聚醣、胺基-糖及路易斯型抗原寡醣。在一較佳具體實例中，乳寡醣為哺乳動物乳寡醣。在一更佳具體實例中，乳寡醣為人乳寡醣。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，細胞包含如本文所描述之岩藻糖基化途徑。根據一較佳具體實例，至少一種編碼作為岩藻糖基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的多個編碼DNA序列編碼。根據一更佳具體實例，至少一種編碼作為岩藻糖基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的兩個編碼DNA序列編碼。根據一甚至更佳具體實例，至少一種編碼作為岩藻糖基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的三個或更多個編碼DNA序列編碼。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，細胞包含如本文所描述之半乳糖基化途徑。根據一較佳具體實例，至少一種編碼作為半乳糖基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的多個編碼DNA序列編碼。根據一更佳具體實例，至少一種編碼作為半乳糖基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的兩個編碼DNA序列編碼。根據一甚至更佳具體實例，至少一種編碼作為半乳糖基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的三個或更多個編碼DNA序列編碼。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，細胞包含如本文所描述之N-乙醯基葡萄糖胺基化途徑。根據一較佳具體實例，至少一種編碼作為N-乙醯基葡萄糖胺基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的多個編碼DNA序列編碼。根據一更佳具體實例，至少一種編碼作為N-乙醯基葡萄糖胺基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的兩個編碼DNA序列編碼。根據一甚至更佳具體實例，至少一種編碼作為N-乙醯基葡萄糖胺基化途徑之一部分之酶的蛋白質由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的三個或更多個編碼DNA序列編碼。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳態樣，細胞能夠合成N-乙醯基甘露糖胺（ManNAc）、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸（ManNAc-6-磷酸）及/或磷酸烯醇丙酮酸（PEP）。

在一較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其包含用於生產ManNAc之途徑。ManNAc可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供。此類生產ManNAc之細胞可表現如已知例如來自包括卵形擬桿菌、大腸桿菌、智人、褐鼠之若干物種的N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶，其將GlcNAc轉化成ManNAc。可替代地及/或另外，生產ManNAc之細胞可表現如已知例如來自包括空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、枯草桿菌、鼠檸檬酸桿菌之若干物種的UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶，其將UDP-GlcNAc轉化成ManNAc。GlcNAc及/或UDP-GlcNAc可添加至細胞中及/或藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供，如本文所描述。

在一更佳具體實例中，細胞經修飾以用於增強ManNAc生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：N-乙醯基甘露糖胺激酶之剔除、N-乙醯基神經胺酸解離酶之過度表現。

在另一較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其包含用於生產ManNAc-6-磷酸之途徑。ManNAc-6-磷酸可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供。此類生產ManNAc-6-磷酸之細胞可表現如已知例如來自包括智人、褐鼠及小鼠之若干物種的雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶，其將UDP-GlcNAc轉化成ManNAc-6-磷酸。可替代地及/或另外，生產ManNAc-6-磷酸之細胞可表現將GlcNAc-6-磷酸轉化成ManNAc-6-磷酸之N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶。UDP-GlcNAc及/或GlcNAc-6-磷酸可添加至細胞中及/或藉由細胞中表現之酶提供或藉由細胞機制提供，如本文所描述。在一更佳具體實例中，細胞經修飾以用於增強ManNAc-6-磷酸生產。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶之過度表現、N-乙醯基-D-葡萄糖胺激酶之過度表現、磷酸葡萄糖胺變位酶之過度表現、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶之過度表現。

在另一較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其包含用於生產磷酸烯醇丙酮酸（PEP）之途徑。

在另一較佳具體實例中，細胞包含用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其包含用於增強PEP之生產及/或供應的任何一或多種修飾。

在一較佳具體實例中及作為用於PEP之經增強生產及/或供應的手段，一或多種PEP依賴型、糖運輸磷酸轉移酶系統被破壞，諸如但不限於：1）N-乙醯基-D-葡萄糖胺Npi-磷酸轉移酶（EC 2.7.1.193），其舉例而言由大腸桿菌或芽孢桿菌物種中之 nagE基因（或簇 nagABCD）編碼，2）ManXYZ，其編碼輸入外源己醣（甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺、果糖、2-去氧葡萄糖、甘露糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺等）及釋放磷酸至細胞細胞質中之酶ll Man複合物（甘露糖PTS透過酶、蛋白質-Npi-磷酸組胺酸-D-甘露糖磷酸轉移酶），3）葡萄糖特異性PTS運輸蛋白（舉例而言由PtsG/Crr編碼），其在細胞質中吸收葡萄糖且形成葡萄糖-6-磷酸，4）蔗糖特異性PTS運輸蛋白，其在細胞質中吸收蔗糖且形成蔗糖-6-磷酸，5）果糖特異性PTS運輸蛋白（舉例而言由基因 fruA及 fruB編碼及激酶 fruK編碼，該激酶fruK在第一步驟中吸收果糖且形成果糖-1-磷酸且在第二步驟中形成果糖1,6二磷酸，6）乳糖PTS運輸蛋白（舉例而言由乾酪乳球菌（ Lactococcus casei）中之 lacE編碼），其吸收乳糖且形成乳糖-6-磷酸，7）半乳糖醇特異性PTS酶，其吸收半乳糖醇及/或山梨糖醇且分別形成半乳糖醇-1-磷酸或山梨糖醇-6-磷酸，8）甘露糖醇特異性PTS酶，其吸收甘露糖醇及/或山梨糖醇且分別形成甘露糖醇-1-磷酸或山梨糖醇-6-磷酸，及9）海藻糖特異性PTS酶，其吸收海藻糖且形成海藻糖-6-磷酸。

在另一及/或額外較佳具體實例中及作為用於PEP之經增強生產及/或供應的手段，藉由破壞PtsIH/Crr基因簇來破壞完整PTS系統。PtsI（酶I）為充當大腸桿菌K-12之磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸轉移酶系統（PTS ^糖）之閘道的細胞質蛋白。PtsI為PTS ^糖之兩種（PtsI及PtsH）糖非特異性蛋白質成分中之一者，其與糖特異性內膜透過酶一起實現引起多種碳水化合物受質之偶合磷酸化及運輸的磷酸轉移級聯。HPr（含有組胺酸之蛋白質）為PTS ^糖之兩種糖非特異性蛋白質成分中之一者。其接受來自磷酸化酶I（PtsI-P）之磷醯基且接著將其轉移至PTS ^糖之許多糖特異性酶（統稱為酶II）中之任一者的EIIA域。在需要PtsH及PtsI之反應中，Crr或EIIA ^Glc由PEP磷酸化。

在另一及/或額外較佳具體實例中，細胞進一步修飾以藉由對應透過酶之引入及/或過度表現來補償碳源之PTS系統的缺失。此等為例如透過酶或ABC運輸蛋白，其包含但不限於特異性地輸入乳糖之運輸蛋白，諸如由來自大腸桿菌之 LacY基因編碼之運輸蛋白；輸入蔗糖之運輸蛋白，諸如由來自大腸桿菌之 cscB基因編碼之運輸蛋白；輸入葡萄糖之運輸蛋白，諸如由來自大腸桿菌之 galP基因編碼之運輸蛋白；輸入果糖之運輸蛋白，諸如由來自變形鏈球菌（ Streptococcus mutans）之 fruI基因編碼之運輸蛋白；或為山梨糖醇/甘露糖醇ABC運輸蛋白，諸如由類球紅細菌（ Rhodobacter sphaeroides）之簇 SmoEFGK編碼之運輸蛋白；海藻糖/蔗糖/麥芽糖運輸蛋白，諸如由苜蓿中華根瘤菌（ Sinorhizobium meliloti）之基因簇 ThuEFGK編碼之運輸蛋白；及N-乙醯基葡萄糖胺/半乳糖/葡萄糖運輸蛋白，諸如由奧奈達希瓦氏菌（ Shewanella oneidensis）之 NagP編碼之運輸蛋白。PTS缺失與替代運輸蛋白之過度表現的組合之實例為：1）葡萄糖PTS系統（例如 ptsG基因）之缺失與葡萄糖透過酶（例如glcP之galP）之引入及/或過度表現組合，2）果糖PTS系統（例如 fruB、 fruA、 fruK基因中之一或多者）之缺失與果糖透過酶（例如fruI）之引入及/或過度表現組合，3）乳糖PTS系統之缺失與乳糖透過酶（例如LacY）之引入及/或過度表現組合，及/或4）蔗糖PTS系統之缺失與蔗糖透過酶（例如cscB）之引入及/或過度表現組合。

在另一較佳具體實例中，細胞經修飾以藉由引入碳水化合物激酶，諸如葡萄糖激酶（EC 2.7.1.1、EC 2.7.1.2、EC 2.7.1.63）、半乳糖激酶（EC 2.7.1.6）及/或果糖激酶（EC 2.7.1.3、EC 2.7.1.4）來補償碳源之PTS系統的缺失。PTS缺失與替代運輸蛋白及激酶之過度表現的組合之實例為：1）葡萄糖PTS系統（例如ptsG基因）之缺失，與葡萄糖透過酶（例如glcP之galP）之引入及/或過度表現組合，與葡萄糖激酶（例如glk）之引入及/或過度表現組合，及/或2）果糖PTS系統（例如 fruB、 fruA、 fruK基因中之一或多者）之缺失，與果糖透過酶（例如fruI）之引入及/或過度表現組合，與果糖激酶（例如frk或mak）之引入及/或過度表現組合。

在另一及/或額外較佳具體實例中且作為用於PEP之經增強生產及/或供應的手段，細胞藉由引入包含以下者之清單中之任何一或多者或在包含以下者之清單中之任何一或多者方面進行修飾來修飾：磷酸烯醇丙酮酸合酶活性（EC: 2.7.9.2，舉例而言在大腸桿菌中藉由ppsA編碼）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性（EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49，舉例而言分別在麩胺酸棒狀桿菌（ Corynebacterium glutamicum）中藉由PCK編碼或在大腸桿菌中藉由pckA編碼）；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性（EC 4.1.1.31，舉例而言在大腸桿菌中藉由ppc編碼）；草醯乙酸脫羧酶活性（EC 4.1.1.112，舉例而言在大腸桿菌中藉由eda編碼）；丙酮酸激酶活性（EC 2.7.1.40，舉例而言在大腸桿菌中藉由pykA及pykF編碼）；丙酮酸羧化酶活性（EC 6.4.1.1，舉例而言在枯草桿菌中藉由pyc編碼）；及蘋果酸脫氫酶活性（EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.40，舉例而言在大腸桿菌中分別藉由maeA或maeB編碼）。

在一更佳具體實例中，細胞經修飾以過度表現該等多肽中之任一或多者，該等多肽包含具有SEQ ID NO 41之來自大腸桿菌的ppsA、具有SEQ ID NO 42之來自麩胺酸棒狀桿菌的PCK、具有SEQ ID NO 43之來自大腸桿菌的pcka、具有SEQ ID NO 44之來自大腸桿菌的eda、具有SEQ ID NO 45之來自大腸桿菌的maeA及具有SEQ ID NO 46之來自大腸桿菌的maeB。

在另一及/或額外較佳具體實例中，細胞經修飾以表現SEQ ID NO 41、42、43、44、45或46中之任一者的功能同源物、變異體或衍生物中之任何一或多者，其與具有SEQ ID NO 41、42、43、44、45或46之該多肽中之任一者的全長具有至少80%整體序列一致性，且分別具有磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、草醯乙酸去脫羧酶活性或蘋果酸脫氫酶活性。

在另一及/或額外較佳具體實例中且作為用於PEP之經增強生產及/或供應的手段，細胞藉由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶活性之降低活性，較佳缺失編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶之基因加以修飾。

在一例示性具體實例中，細胞藉由不同調適經基因修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、蘋果酸脫氫酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、蘋果酸脫氫酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合及/或蘋果酸脫氫酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性具體實例中，細胞藉由不同調適經基因修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現組合，磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合及/或磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合。

在另一例示性具體實例中，細胞藉由不同調適經基因修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合。

在另一例示性具體實例中，細胞藉由不同調適經基因修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性具體實例中，細胞藉由不同調適經基因修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性具體實例中，細胞藉由不同調適經基因修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性具體實例中，細胞藉由不同調適經基因修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，細胞包含編碼具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性之蛋白質的至少一個編碼DNA序列、編碼2種或更多種具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性之同功蛋白質的兩個或更多個編碼DNA序列及α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶之一或多個編碼DNA序列的兩個或更多個複本。在本發明之方法及/或細胞之一較佳具體實例中，具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性之蛋白質為具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NmNeuB）。在本發明之方法及/或細胞之一替代較佳具體實例中，具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性之蛋白質為具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NmNeuB）之功能同源物或功能片段。在本發明之方法及/或細胞之另一替代較佳具體實例中，具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性之蛋白質為與具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NmNeuB）之全長序列具有至少80%序列一致性且具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性的多肽序列。在本發明之方法及/或細胞之另一較佳具體實例中，具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性之同功蛋白質選自包含以下者之清單：具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌的蛋白質（CjNeuA）、具有SEQ ID NO 03之來自流感螺旋桿菌（ Helicobacter influenzae）的蛋白質（HiNeuA）及具有SEQ ID NO 04之來自多殺性巴氏桿菌的蛋白質（PmultNeuA）。在本發明之方法及/或細胞之一替代較佳具體實例中，具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性之同功蛋白質為具有SEQ ID NO 02、03或04之蛋白質中之任一者的功能同源物或功能片段。在本發明之方法及/或細胞之另一替代較佳具體實例中，具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性之同功蛋白質為與具有SEQ ID NO 02、03或04之該等蛋白質中之任一者的全長序列分別具有至少80%序列一致性，且具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性的多肽序列。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，細胞包含編碼具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶活性之酶之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。在方法及/或細胞之一較佳具體實例中，細胞包含編碼具有SEQ ID NO 05之來自大腸桿菌的酶（glmS*54）之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。在方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞包含編碼具有SEQ ID NO 05之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）之功能同源物或功能片段之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。在方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞包含編碼與具有SEQ ID NO 05之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）之全長序列具有至少80%序列一致性，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶活性之多肽序列之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。

根據本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外態樣，細胞包含編碼具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶活性之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。在方法及/或細胞之一較佳具體實例中，細胞包含編碼具有SEQ ID NO 06之來自釀酒酵母的酶（GNA1）之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。在方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞包含編碼具有SEQ ID NO 06之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）之功能同源物或功能片段之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。在方法及/或細胞之另一及/或額外較佳具體實例中，細胞包含編碼與具有SEQ ID NO 06之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）之全長序列具有至少80%序列一致性，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶活性之多肽序列之編碼DNA序列的兩個或更多個複本。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳態樣，細胞包含用於減少乙酸生產之修飾。該修飾可為選自包含以下者之群組的任何一或多者：乙醯基-輔酶A合成酶之過度表現、完全或部分剔除丙酮酸脫氫酶或致使其功能較弱及完全或部分剔除乳酸脫氫酶或致使其功能較弱。

在本發明之方法及/或細胞之另一態樣中，細胞在至少一種乙醯基-輔酶A合成酶，如例如來自大腸桿菌、釀酒酵母、智人、小鼠之acs的表現或活性方面經修飾。在一較佳具體實例中，該乙醯基-輔酶A合成酶為具有經修飾之表現或活性之細胞的內源蛋白，較佳該內源乙醯基-輔酶A合成酶經過度表現；或者，該乙醯基-輔酶A合成酶為異質引入且表現於該細胞中、較佳過度表現之異源蛋白。該內源乙醯基-輔酶A合成酶可在亦表現異源之細胞具有經修飾之表現，可在亦表現異源之細胞具有經修飾之表現。在一更佳具體實例中，細胞在具有SEQ ID NO 47之來自大腸桿菌的乙醯基-輔酶A合成酶acs之表現或活性方面經修飾。在另一及/或額外較佳具體實例中，細胞在與具有SEQ ID NO 47之該多肽之全長具有至少80%整體序列一致性且具有乙醯基-輔酶A合成酶活性的SEQ ID NO 47之功能同源物、變異體或衍生物的表現或活性方面經修飾。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外其他態樣中，細胞在至少一種如例如來自大腸桿菌、釀酒酵母、智人及褐鼠之丙酮酸脫氫酶的表現或活性方面經修飾。在一較佳具體實例中，細胞已藉由所屬技術領域中具有通常知識者通常已知之方式經修飾以具有至少一種部分或完全剔除或突變之丙酮酸脫氫酶編碼基因，從而產生至少一種丙酮酸脫氫酶活性功能較弱或失能之蛋白質。在一更佳具體實例中，細胞在poxB編碼基因中具有完全剔除，從而產生缺少丙酮酸脫氫酶活性之細胞。

在本發明之方法及/或細胞之一替代及/或額外其他態樣中，細胞在至少一種如例如來自大腸桿菌、釀酒酵母、智人及褐鼠之乳酸脫氫酶的表現或活性方面經修飾。在一較佳具體實例中，細胞已藉由所屬技術領域中具有通常知識者通常已知之方式經修飾以具有至少一種部分或完全剔除或突變之乳酸脫氫酶編碼基因，從而產生至少一種乳酸脫氫酶活性功能較弱或失能之蛋白質。在一更佳具體實例中，細胞在ldhA編碼基因中具有完全剔除，從而產生缺少乳酸脫氫酶活性之細胞。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳態樣，該細胞包含包括以下蛋白質中之任何一或多者的較低或降低表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性易位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性易位磷酸轉移酶（PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳態樣，細胞包含用於所選單醣、雙醣或寡醣之分解代謝途徑，該分解代謝途徑至少部分不活化，該等單醣、雙醣或寡醣參與唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成及/或為該合成所需。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳態樣，細胞使用用於合成唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。在本文中，前驅物自培養基進料至細胞中。在另一較佳具體實例中，細胞生產用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳態樣，細胞在全培養液及/或上清液中生產90 g/L或更多唾液酸化雙醣及/或寡醣。在一更佳具體實例中，根據全培養液及/或上清液中由細胞生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣及其前驅物的總量量測，全培養液及/或上清液中生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣之純度分別為至少80%。

本發明之另一態樣提供一種方法及一種細胞，其中唾液酸化雙醣及/或寡醣在如本文所描述之細菌、真菌、酵母、昆蟲、植物、動物或原蟲表現系統或細胞中生產及/或由其生產。表現系統或細胞選自包含細菌、真菌或酵母之清單，或係指植物、動物或原蟲細胞。後者之細菌較佳屬於變形菌（Proteobacteria）門或厚壁菌（Firmicutes）門或藍菌（Cyanobacteria）門或異常球菌-棲熱菌（Deinococcus-Thermus）門。屬於變形菌門之後者之細菌較佳屬於腸細菌科，較佳屬於大腸桿菌種。後者之細菌較佳係指屬於大腸桿菌種之任何菌株，諸如但不限於大腸桿菌B、大腸桿菌C、大腸桿菌W、大腸桿菌K12、大腸桿菌Nissle。更特定言之，後者之術語係指經培養之大腸桿菌菌株（命名為大腸桿菌K12菌株），其良好適於實驗室環境，且不同於野生型菌株，已損失其在腸中茁壯成長之能力。大腸桿菌K12菌株之熟知實例為K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111及AA200。因此，較佳地，本發明特定關於如上文所指示之突變及/或轉形之大腸桿菌菌株，其中該大腸桿菌菌株為K12菌株。更特定言之，本發明係關於如上文所指示之突變及/或轉形之大腸桿菌菌株，其中該K12菌株為大腸桿菌MG1655。屬於厚壁菌門之後者之細菌較佳屬於桿菌綱（Bacilli），較佳來自桿菌屬物種。後者之真菌較佳屬於根黴菌屬（ Rhizopus）、網柄菌屬（ Dictyostelium）、青黴菌屬（ Penicillium）、白黴菌屬（ Mucor）或麴菌屬（ Aspergillus）。後者之酵母較佳屬於子囊菌（Ascomycota）門或擔子菌（Basidiomycota）門或半知菌（Deuteromycota）門或接合菌（Zygomycetes）門。後者之酵母較佳屬於以下屬：酵母菌屬（ Saccharomyces）、接合酵母屬（ Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（ Pichia）、駒形氏酵母屬（ Komagataella）、漢森酵母屬（ Hansenula）、亞羅酵母屬（ Yarrowia）、球擬假絲酵母屬（ Starmerella）、克魯維酵母屬（ Kluyveromyces）或德巴利酵母屬（ Debaromyces）。植物細胞包括開花及非開花植物之細胞，以及藻類細胞，例如衣藻屬（Chlamydomonas）、綠球藻屬（Chlorella）等。較佳地，該植物為菸草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物。後者之動物細胞較佳衍生自非人類哺乳動物（例如牛、水牛、豬、綿羊、小鼠、大鼠）、鳥類（例如雞、鴨、鴕鳥、火雞、野雞）、魚類（例如劍魚、鮭魚、鮪魚、海鱸、鱒魚、鯰魚）、無脊椎動物（例如龍蝦、蟹、蝦、蚌蛤、牡蠣、貽貝、海膽）、爬蟲類（例如蛇、鱷魚、龜）、兩棲動物（例如蛙）或昆蟲（例如蠅、線蟲）或為衍生自不包括胚胎幹細胞之人類細胞的經基因修飾之細胞系。人類及非人類哺乳動物細胞均較佳選自包含以下者之清單：上皮細胞（如例如乳腺上皮細胞）、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary；CHO）細胞、鼠類骨髓瘤細胞（如例如N20、SP2/0或YB2/0細胞）、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，諸如WO21067641中所描述。後者之昆蟲細胞較佳衍生自：草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）如例如Sf9或Sf21細胞、家蠶（ Bombyx mori）、甘藍夜蛾（ Mamestra brassicae）、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）如例如BTI-TN-5B1-4細胞或黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）如例如果蠅屬S2細胞。後者之原蟲細胞較佳為蜥蜴利什曼原蟲（ Leishmania tarentolae）細胞。

在本發明之方法及/或細胞的一較佳具體實例中，該細胞為活的革蘭氏陰性細菌，與未經修飾之先驅細胞相比，其包含減少或消除的聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG）、腸內菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸（colanic acid）、核心寡醣、滲透調節周質葡聚醣（Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或海藻糖之合成。

在方法及/或細胞之一更佳具體實例中，聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）、腸內菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核心寡醣、滲透調節周質葡聚醣（OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或海藻糖之該經減少或消除的合成係藉由參與該聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）、腸內菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核心寡醣、滲透調節周質葡聚醣（OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或海藻糖中之任一者的合成中的任何一或多種醣基轉移酶之突變提供，其中該突變提供該等醣基轉移酶中之任一者的缺失或較低表現。該等醣基轉移酶包含編碼聚-N-乙醯基-D-葡萄糖胺合酶次單元之醣基轉移酶基因、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺-十一異戊烯基-磷酸N-乙醯基葡萄糖胺磷酸轉移酶、Fuc4NAc（4-乙醯胺基-4,6-雙去氧-D-半乳糖）轉移酶、UDP-N-乙醯基-D-甘露糖胺醛酸轉移酶、編碼纖維素合酶催化次單元之醣基轉移酶基因、纖維素生物合成蛋白、可拉酸生物合成葡萄糖醛酸基轉移酶、可拉酸生物合成半乳糖基轉移酶、可拉酸生物合成岩藻糖基轉移酶、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、推定可拉生物合成醣基轉移酶、UDP-葡萄糖醛酸:LPS（HepIII）醣基轉移酶、ADP-庚醣-LPS庚醣基轉移酶2、ADP-庚醣:LPS庚醣基轉移酶1、推定ADP-庚醣:LPS庚醣基轉移酶4、脂多醣核心生物合成蛋白、UDP-葡萄糖:(葡萄糖基)LPS α-1,2-葡萄糖基轉移酶、UDP-D-葡萄糖:(葡萄糖基)LPS α-1,3-葡萄糖基轉移酶、UDP-D-半乳糖:(葡萄糖基)脂多糖-1,6-D-半乳糖基轉移酶、脂多醣葡萄糖基轉移酶I、脂多醣核心庚醣基轉移酶3,β-1,6-半乳糖呋喃酮基轉移酶、十一異戊烯基-磷酸4-去氧-4-甲醯胺基-L-阿拉伯糖轉移酶、脂質IVA 4-胺基-4-去氧-L-阿拉伯糖基轉移酶、細菌萜醇葡萄糖基轉移酶、推定家族2醣基轉移酶、滲透調節周質葡聚醣（OPG）生物合成蛋白G、OPG生物合成蛋白質H、葡萄糖基甘油酸磷酸化酶、肝醣合酶、1,4-α-葡聚醣分支酶、4-α-葡聚醣轉移酶及海藻糖-6-磷酸合酶。在一例示性具體實例中，細胞在包含以下醣基轉移酶中之任何一或多者中經突變：pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP，其中該突變提供該等醣基轉移酶中之任一者的缺失或較低表現。

在方法及/或細胞之一替代及/或額外較佳具體實例中，聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）之該經減少或消除的合成藉由碳儲存調節子編碼基因之過度表現、Na+/H+反向運輸蛋白調節子編碼基因之缺失及/或感測器組胺酸激酶編碼基因之缺失提供。

另一態樣提供待在培養基中穩定培養之細胞，其中該培養基可為任何類型之生長培養基，其包含基本培養基、複合培養基或富含某些化合物，如例如但不限於維生素、痕量元素、胺基酸之生長培養基。

如本文所用之細胞能夠以單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、甘油、複合培養基或其混合物作為主要碳源生長。術語主要（main）意謂細胞用於生產所關注唾液酸化雙醣及/或寡醣、生物質形成、二氧化碳及/或副產物形成（諸如酸及/或醇，諸如乙酸、乳酸及/或乙醇）之最重要碳源，亦即所有所需碳之20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、98、99%衍生自以上指定碳源。在本發明之一個具體實例中，該碳源為該生物體之唯一碳源，亦即所有所需碳之100%衍生自以上指定碳源。常見主要碳源包含但不限於葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽寡醣、麥芽三醣、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖糖漿、乙酸、檸檬酸、乳酸及丙酮酸。如本文所用，如本文所定義之前驅物無法用作用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之碳源。

根據本發明之方法及/或細胞之另一態樣，細胞能夠合成包含至少一種唾液酸化寡醣之寡醣的混合物。在一替代及/或額外態樣中，細胞能夠合成包含至少一種唾液酸化雙醣及/或寡醣之雙醣及/或寡醣的混合物；或者，細胞能夠合成唾液酸、雙醣及/或寡醣之混合物。

在另一較佳態樣中，用於生產如本文所描述之唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法包含以下步驟中之至少一者： i) 向反應器中之培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前該培養基之體積的三倍、較佳不超過兩倍、更佳小於2倍； ii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料； iii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在該培養基之該最終體積中產生濃度為至少50 g/L、較佳至少75 g/L、更佳至少90 g/L、更佳至少100 g/L、更佳至少125 g/L、更佳至少150 g/L、更佳至少175 g/L、更佳至少200 g/L之唾液酸化雙醣及/或寡醣。

在另一及/或額外其他較佳態樣中，用於生產如本文所描述之唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法包含以下步驟中之至少一者： i) 以一個脈衝或以不連續（脈衝）方式向培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該（等）前驅物及/或受體進料脈衝之前該培養基之體積的三倍、較佳不超過兩倍、更佳小於2倍； ii) 歷經5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以不連續（脈衝）方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料； iii) 歷經5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以不連續（脈衝）方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在該培養基之該最終體積中產生濃度為至少50 g/L、較佳至少75 g/L、更佳至少90 g/L、更佳至少100 g/L、更佳至少125 g/L、更佳至少150 g/L、更佳至少175 g/L、更佳至少200 g/L之唾液酸化雙醣及/或寡醣。

在另一更佳態樣中，用於生產如本文所描述之唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法包含以下步驟中之至少一者： i) 向培養基中添加包含每公升初始反應器體積至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前該培養基之體積的三倍、較佳不超過兩倍、更佳小於2倍； ii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加乳糖進料； iii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加乳糖進料，且其中該乳糖進料溶液之濃度為50 g/L、較佳75 g/L、更佳100 g/L、更佳125 g/L、更佳150 g/L、更佳175 g/L、更佳200 g/L、更佳225 g/L、更佳250 g/L、更佳275 g/L、更佳300 g/L、更佳325 g/L、更佳350 g/L、更佳375 g/L、更佳400 g/L、更佳450 g/L、更佳500 g/L、甚至更佳550 g/L、最佳600 g/L；且其中較佳地，該溶液之pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在該培養基之該最終體積中產生濃度為至少50 g/L、較佳至少75 g/L、更佳至少90 g/L、更佳至少100 g/L、更佳至少125 g/L、更佳至少150 g/L、更佳至少175 g/L、更佳至少200 g/L之由該乳糖生產之唾液酸化寡醣。

較佳地，乳糖進料係藉由自培養開始以至少5 mM之濃度，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150 mM之濃度，更佳以＞300 mM之濃度添加乳糖來實現。

在另一態樣中，乳糖進料係藉由以一定濃度向培養基中添加乳糖，使得在培養之整個生產階段中獲得至少5 mM、較佳10 mM或30 mM之乳糖濃度來實現。

在本文所描述之方法之另一具體實例中，宿主細胞培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。

在一較佳具體實例中，在培養基中提供碳源，較佳蔗糖，持續3天或更多天，較佳至多7天；及/或在培養基中以連續方式提供每公升初始培養物體積至少100、有利至少105、更有利至少110、甚至更有利至少120公克蔗糖，使得培養基之最終體積不超過培養之前培養基之體積的三倍、有利不超過兩倍、更有利小於兩倍。

較佳地，當進行如本文所描述之方法時，指數式細胞生長之第一階段係藉由將碳源、較佳葡萄糖或蔗糖添加至培養基中來提供，隨後在第二階段中將乳糖添加至培養基中。

在一替代較佳具體實例中，在如本文所描述之方法中，已在指數式生長之第一階段中將乳糖與以碳為基礎的基質一起添加。

根據本發明，如本文所描述之方法較佳包含自該培養物分離該唾液酸化雙醣及/或寡醣的步驟。

術語「自該培養物分離（separating from said cultivation）」意謂自細胞及/或其生長培養基收穫、收集或擷取該唾液酸化雙醣及/或寡醣。

唾液酸化雙醣及/或寡醣可以習知方式自水性培養基分離，細胞在該水性培養基中生長。在該唾液酸化雙醣及/或寡醣仍存在於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之細胞中的情況下，可使用自細胞中釋放或萃取該唾液酸化雙醣及/或寡醣之習知方式，諸如使用高pH、熱休克、音波處理、法式壓碎機（French press）、均質化、酶水解、化學水解、溶劑水解、清潔劑、水解……破壞細胞。培養基及/或細胞萃取物一起且分別可接著進一步用於分離該唾液酸化雙醣及/或寡醣。

此較佳涉及澄清該唾液酸化雙醣及/或寡醣以移除懸浮粒子及污染物，尤其細胞、細胞組分、不可溶代謝物及由培養經基因修飾之細胞產生之碎片。在此步驟中，該唾液酸化雙醣及/或寡醣可以習知方式澄清。較佳地，該唾液酸化雙醣及/或寡醣藉由離心、絮凝、傾析及/或過濾澄清。分離該唾液酸化雙醣及/或寡醣之第二步驟較佳涉及自該唾液酸化雙醣及/或寡醣移除實質上所有蛋白質、肽、胺基酸、RNA及DNA，及可干擾後續分離步驟之任何內毒素及醣脂，較佳在該唾液酸化雙醣及/或寡醣已澄清之後進行。在此步驟中，可以習知方式自該唾液酸化雙醣及/或寡醣移除蛋白質及相關雜質。較佳地，蛋白質、鹽、副產物、染料、內毒素及其他相關雜質自該唾液酸化雙醣及/或寡醣藉由超過濾、奈米過濾、二相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、用非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流高效過濾、切向流超過濾、電泳（例如使用平板（slab）-聚丙烯醯胺或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis；PAGE））、親和層析（使用親和配位體，包括例如DEAE-瓊脂糖凝膠、聚-L-離胺酸及多黏菌素-B、內毒素-選擇性吸附劑基質）、離子交換層析（諸如但不限於陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換、由內而外配位體連接）、疏水性交互作用層析及/或凝膠過濾（亦即粒徑排阻層析），特定言之藉由層析，更特定言之藉由離子交換層析或疏水性交互作用層析或配位體交換層析移除。除粒徑排阻層析之外，剩餘蛋白質及相關雜質由層析介質或所選膜保留。

在另一較佳具體實例中，如本文所描述之方法亦提供本發明之唾液酸化雙醣及/或寡醣的進一步純化。該唾液酸化雙醣及/或寡醣之進一步純化例如藉由使用（活性）炭或碳、奈米過濾、超過濾、電泳、酶處理或離子交換以移除任何剩餘DNA、蛋白質、LPS、內毒素或其他雜質。亦可使用醇（諸如乙醇）及水醇混合物。另一純化步驟藉由該唾液酸化雙醣及/或寡醣之結晶、蒸發或沈澱實現。另一純化步驟為對所生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣進行乾燥，例如噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥（band dry）、帶式乾燥（belt dry）、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。

在一例示性具體實例中，在一種方法中進行唾液酸化雙醣及/或寡醣之分離及純化，該方法按任何次序包含以下步驟： a）使培養物或其澄清形式與截留分子量（molecular weight cut-off；MWCO）為600-3500 Da之奈米過濾膜接觸，確保保留所生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣且使蛋白質、鹽、副產物、染料及其他相關雜質中之至少一部分通過， b）使用該膜，用無機電解質之水溶液對來自步驟a）之保留物進行透濾程序，接著視情況用純水進行透濾以移除過量電解質， c）及收集呈來自該電解質之陽離子之鹽形式的該唾液酸化雙醣及/或寡醣中富集的保留物。

在一替代例示性具體實例中，在一種方法中進行該唾液酸化雙醣及/或寡醣之分離及純化，該方法按任何次序包含以下步驟：使用不同膜使培養物或其澄清形式經受兩個膜過濾步驟，其中 - 一個膜具有約300至約500道爾頓（Dalton）之間的截留分子量，及 - 作為在約600至約800道爾頓之間之分子量截留的另一膜。

在一替代例示性具體實例中，在一種方法中進行該唾液酸化雙醣及/或寡醣之分離及純化，該方法按任何次序包含以下步驟：用呈H+形式之強陽離子交換樹脂及呈自由鹼形式之弱陰離子交換樹脂處理培養物或其澄清形式。

在一替代例示性具體實例中，該唾液酸化雙醣及/或寡醣之分離及純化按以下方式進行。將包含所生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣、生物質、培養基組分及污染物之培養物施加至以下純化步驟： i）自培養物分離生物質， ii）進行陽離子交換劑處理以便移除帶正電物質， iii）進行陰離子交換劑處理以便移除帶負電物質， iv）進行奈米過濾步驟及/或電滲析步驟，其中提供包含純度大於或等於80%之所生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣的純化溶液。視情況，純化溶液藉由選自包含以下者之清單的任何一或多個乾燥步驟乾燥：噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥、帶式乾燥、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥及真空滾筒乾燥。

在一替代例示性具體實例中，在一種方法中進行唾液酸化雙醣及/或寡醣之分離及純化，該方法按任何次序包含以下步驟：對培養物進行酶處理；自培養物移除生物質；超過濾；奈米過濾；及管柱層析步驟。較佳地，此類管柱層析為單個管柱或多個管柱。更佳地，管柱層析步驟為模擬移動床層析。此類模擬移動床層析較佳包含i）至少4個管柱，其中至少一個管柱包含弱或強陽離子交換樹脂；及/或ii）具有不同流速之四個區域I、II、III及IV；及/或iii）包含水之洗提劑；及/或iv）15至60攝氏度之操作溫度。

在一特定具體實例中，本發明提供所生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣，其藉由選自包含以下者之清單的任何一或多個乾燥步驟乾燥成粉末：噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥、帶式乾燥、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥及真空滾筒乾燥，其中乾燥粉末含有＜ 15 wt.%水、較佳＜ 10 wt.%水、更佳＜ 7 wt.%水、最佳＜ 5 wt.%水。

本發明之另一態樣提供如本文所定義之細胞在用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法中的用途。本發明之另一態樣提供如本文所定義之方法用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之用途。

此外，本發明亦關於藉由根據本發明之方法獲得之唾液酸化雙醣及/或寡醣，以及關於如上文所描述之聚核苷酸、載體、宿主細胞或多肽用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之用途。該唾液酸化雙醣及/或寡醣可用作食品添加劑、益生質、共生物，用於嬰兒食品、成人食品或飼料之補充，或用作治療或醫藥活性化合物或用於化妝品應用。利用新穎方法，可容易且有效地提供唾液酸化雙醣及/或寡醣，而無需複雜、耗時且耗費成本的合成方法。

為鑑別如本文所描述之細胞中生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣，單體建構嵌段（例如單醣或聚醣單元組成物）、側鏈之變旋異構組態、取代基之存在及位置、聚合度/分子量及鍵聯模式可藉由所屬技術領域中已知之標準方法鑑別，該等標準方法諸如甲基化分析、還原裂解、水解、氣相層析-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry；GC-MS）、基質輔助雷射脫附/離子化-質譜法（Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry；MALDI-MS）、電灑離子化-質譜法（Electrospray ionization-mass spectrometry；ESI-MS）、具有紫外線或折射率偵測之高效液相層析（HPLC）、具有脈衝安培偵測之高效陰離子交換層析（High-Performance Anion-Exchange chromatography with Pulsed Amperometric Detection；HPAEC-PAD）、毛細管電泳（capillary electrophoresis；CE）、紅外（infrared；IR）/拉曼光譜法及核磁共振（Nuclear magnetic resonance；NMR）波譜技術。可使用例如固態NMR、傅立葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy；FT-IR）及廣角X射線散射（wide-angle X-ray scattering；WAXS）來解析晶體結構。聚合度（degree of polymerization；DP）、DP分佈及多分散性可藉由例如黏度測定法及SEC（SEC-HPLC，高效粒徑排阻層析（high performance size-exclusion chromatography））確定。為鑑別唾液酸化雙醣及/或寡醣之單體組分，可使用方法諸如酸催化之水解、高效液相層析（high performance liquid chromatography；HPLC）或氣液層析（gas-liquid chromatography；GLC）（在轉化成醛醣醇乙酸酯之後）。為了確定醣苷鍵，將唾液酸化雙醣及/或寡醣在DMSO中用碘甲烷及強鹼甲基化，進行水解，達成還原為部分甲基化醛醣醇，進行乙醯化為甲基化醛醣醇乙酸酯，且藉由氣液層析聯合質譜（GLC/MS）進行分析。為了確定聚醣序列，使用酸或酶進行部分解聚合以確定結構。為了鑑別變旋異構組態，使唾液酸化雙醣及/或寡醣經受酶分析，例如使其與對特定類型鍵聯具特異性之酶，例如β-半乳糖苷酶或α-葡萄糖苷酶等接觸，且可使用NMR來分析產物。

將如本文所描述之分離且較佳亦純化之唾液酸化雙醣及/或寡醣併入至食品（例如人類食品或飼料）、膳食補充劑、醫藥成分、化妝品成分或醫藥中。在一些具體實例中，唾液酸化雙醣及/或寡醣與一或多種適用於食品、飼料、膳食補充劑、醫藥成分、化妝品成分或醫藥之成分混合。

在一些具體實例中，膳食補充劑包含至少一種益生質成分及/或至少一種益生菌成分。

「益生質（prebiotic）」為促進有益於宿主之微生物，尤其胃腸道中之微生物生長的物質。在一些具體實例中，膳食補充劑提供多種益生質，包括唾液酸化雙醣及/或寡醣，其為藉由本說明書中所揭示之方法生產及/或純化之純化益生質，以促進一或多種有益微生物之生長。膳食補充劑之益生質成分的實例包括其他益生質分子（諸如HMO）及植物多醣（諸如菊糖、果膠、b-葡聚醣及木寡醣）。「益生菌（probiotic）」產品典型地含有置換或添加至胃腸道微生物群以便接受體受益之活微生物。此類微生物之實例包括乳桿菌屬物種（例如嗜酸乳桿菌（ L. acidophilus）及保加利亞乳桿菌（ L. bulgaricus））、雙叉桿菌屬物種（例如動物雙叉桿菌（ B. animalis）、長雙叉桿菌（ B. longum）及嬰兒雙叉桿菌（ B. infantis）（例如Bi-26））及布拉氏酵母菌（ Saccharomyces boulardii）。在一些具體實例中，藉由此說明書之方法生產及/或純化之唾液酸化雙醣及/或寡醣與此類微生物組合經口投予。

用於膳食補充劑之其他成分之實例包括寡醣（諸如2'-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖）、雙醣（諸如乳糖）、單醣（諸如葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖、唾液酸、葡萄糖胺及N-乙醯基葡萄糖胺）、增稠劑（諸如阿拉伯膠）、酸度調節劑（諸如檸檬酸三鈉）、水、脫脂乳及調味劑。

在一些具體實例中，唾液酸化寡醣併入至人類嬰兒食品（例如嬰兒乳（infant formula））中。嬰兒乳通常為用於作為人類母乳之完整或部分替代物向嬰兒餵養之製造食品。在一些具體實例中，嬰兒乳以粉末形式出售，且藉由與水混合製備以用於向嬰兒瓶餵或杯餵。嬰兒乳之組成典型地經設計以大致模擬人類母乳。在一些具體實例中，藉由此說明書之方法生產及/或純化之唾液酸化寡醣包括於嬰兒乳中，以提供與由人類母乳中之寡醣提供之營養益處類似的營養益處。在一些具體實例中，將唾液酸化寡醣與嬰兒乳之一或多種成分混合。嬰兒乳成分之實例包括脫脂乳、碳水化合物源（例如乳糖）、蛋白質源（例如乳清蛋白濃縮物及酪蛋白）、脂肪源（例如植物油，諸如棕櫚油、高油酸紅花油、菜籽油、椰子油及/或葵花油；及魚油）、維生素（諸如維生素A、Bb、Bi2、C及D）、礦物質（例如檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、氯化鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉及磷酸鈣）及可能人乳寡醣（HMO）。此類HMO可包括例如DiFL、乳-N-丙醣II、LNT、LNnT、乳-N-岩藻五醣I、乳-N-新岩藻五醣、乳-N-岩藻五醣II、乳-N-岩藻五醣III、乳-N-岩藻五醣V、乳-N-新岩藻五醣V、乳-N-二岩藻六醣I、乳-N-二岩藻六醣II、6'-半乳醣基乳醣、3'-半乳醣基乳醣、乳-N-六醣及乳-N-新六醣。

在一些具體實例中，一或多種嬰兒乳成分包含脫脂乳、碳水化合物源、蛋白質源、脂肪源及/或維生素及礦物質。

在一些具體實例中，一或多種嬰兒乳成分包含乳糖、乳清蛋白濃縮物及/或高油酸紅花油。

在一些具體實例中，嬰兒乳中唾液酸化寡醣之濃度與通常存在於人類母乳中之唾液酸化寡醣之濃度為大致相同濃度。

在一些具體實例中，唾液酸化寡醣併入至飼料製劑中，其中該飼料選自包含寵物食品、動物代乳品、獸醫學產品、斷奶後飼料或教槽飼料之清單。

如將在本文中之實施例中展示，本發明之方法及細胞較佳提供以下出人意料的優點中之至少一者： -較高唾液酸化雙醣及/或寡醣滴定度（g/L）， -較高生產速率r（g唾液酸化雙醣及/或寡醣/L/h）， -較高細胞性能指數（cell performance index）CPI（g唾液酸化雙醣及/或寡醣/g X）， -較高比生產率Qp（g唾液酸化雙醣及/或寡醣/g X/h）， -較高基於蔗糖之產率Ys（g唾液酸化雙醣及/或寡醣/g蔗糖）， -較高蔗糖吸收/轉化速率Qs（g蔗糖/g X/h）， -較高乳糖轉化/消耗速率rs（g乳糖/h）， -較高唾液酸化雙醣及/或寡醣分泌，及/或 -較高生產宿主生長速度，相比於用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之宿主，該宿主缺少編碼一或多種催化相同化學反應之蛋白質之多個編碼DNA序列的表現及/或過度表現。

除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語一般具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解相同之含義。一般而言，本文所用之命名法及上文及下文所描述之細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合為所屬技術領域中熟知且常用之命名法、細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合。使用標準技術進行核酸及肽合成。一般而言，純化步驟係根據製造商說明書進行。

其他優點來自特定具體實例及實施例。不言而喻，以上提及之特徵及仍有待下文闡述之特徵，在不脫離本發明之範圍之情況下，不僅可以分別指定之組合使用而且可以其他組合或獨立地使用。

此外，本發明係關於以下特定具體實例： 1. 一種用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之代謝上經工程改造之細胞，該細胞包含用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其特徵在於該細胞經修飾以用於表現及/或過度表現編碼一或多種催化相同化學反應之蛋白質的多個編碼DNA序列。 2. 如具體實例1之細胞，其中該蛋白質參與用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之該途徑。 3. 如具體實例1或2中任一項之細胞，其中用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之該途徑包含唾液酸化途徑。 4. 如具體實例3之細胞，其中該唾液酸化途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶、唾液酸基轉移酶及唾液酸運輸蛋白，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由該等多個編碼DNA序列編碼。 5. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該等多個編碼DNA序列編碼包含以下者中之任何一或多者： - 編碼一種蛋白質之相同編碼DNA序列的多個複本， - 編碼一種蛋白質之多個編碼DNA序列，及 - 編碼催化相同化學反應之多種同功蛋白質的多個編碼DNA序列。 6. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中多個為至少2個、較佳至少3個、更佳至少5個。 7. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該等編碼DNA序列在一或多個基因表現模組中呈現至該細胞，其中表現受一或多個調節序列調節。 8. 如具體實例7之細胞，其中該等表現模組整合於宿主細胞之基因體中及/或在包含質體、黏接質體、噬菌體、脂質體或病毒之載體上呈現至該細胞，該載體將穩定轉形至該宿主細胞中。 9. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該蛋白質參與核苷酸活化糖之合成，其中該核苷酸活化糖將用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣。 10. 如具體實例9之細胞，其中該核苷酸活化糖係選自包含以下者之清單：UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、CMP-唾液酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、CMP-N-羥乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-鼠李糖及UDP-木糖，較佳地，該核苷酸活化糖係選自包含以下者之清單：UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、CMP-唾液酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂及CMP-N-羥乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Gc）。 11. 如具體實例9或10中任一項之細胞，其中參與核苷酸活化糖之合成的該蛋白質係選自包含以下者之清單：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、N-乙醯基葡萄糖胺表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6P 2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、唾液酸合酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸磷酸酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖磷酸變位酶、 N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、UDP-半乳糖4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶、UDP-GalNAc焦磷酸化酶、甘露糖-1-磷酸甲脒基轉移酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶及ManNAc激酶。 12. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞進一步表現至少一種選自包含以下者之清單的醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳糖醛酸苷轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-羥乙醯基神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP- N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶， - 較佳地，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾， - 較佳地，該岩藻糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， - 較佳地，該唾液酸基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及α-2,8-唾液酸基轉移酶， - 較佳地，該半乳糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， - 較佳地，該葡萄糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， - 較佳地，該甘露糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自包含α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶之清單。 13. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該蛋白質係選自包含以下者之清單的膜運輸蛋白：螯鐵蛋白輸出蛋白、ABC運輸蛋白、MFS運輸蛋白及糖流出運輸蛋白。 14. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該唾液酸化雙醣及/或寡醣係選自包含以下者之清單：乳寡醣、O-抗原、腸內菌共同抗原（ECA）、存在於莢膜多醣中之寡醣重複、肽聚醣、胺基-糖及路易斯型抗原寡醣，較佳該乳寡醣係哺乳動物乳寡醣，更佳該乳寡醣係人乳寡醣。 15. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞包含岩藻糖基化途徑，該途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、岩藻糖基轉移酶，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的該等多個編碼DNA序列編碼，其中多個較佳為兩個、更佳三個或更多個。 16. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞包含半乳糖基化途徑，該途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖磷酸變位酶、半乳糖基轉移酶，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的該等多個編碼DNA序列編碼，其中多個較佳為兩個、更佳三個或更多個。 17. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞包含N-乙醯基葡萄糖胺基化途徑，該途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由編碼一或多種催化相同化學反應之酶的該等多個編碼DNA序列編碼，其中多個較佳為兩個、更佳三個或更多個。 18. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以用於增強磷酸烯醇丙酮酸（PEP）之合成及/或供應。 19. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞包含： - 至少一個編碼選自包含以下者之清單之蛋白質的編碼DNA序列：i）具有SEQ ID NO 01且具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性之來自腦膜炎奈瑟氏菌的酶（NmNeuB），ii）具有SEQ ID NO 01之該酶的功能同源物或功能片段，及iii）與具有SEQ ID NO 01之該酶之全長序列具有至少80%序列一致性且具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性的多肽序列， - 兩個或更多個編碼選自包含以下者之清單之蛋白質的編碼DNA序列：i）具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌的酶（CjNeuA）、具有SEQ ID NO 03之來自流感螺旋桿菌的酶（HiNeuA）及具有SEQ ID NO 04之來自多殺性巴氏桿菌的酶（PmultNeuA），其中具有SEQ ID NO 02、03及04之該等酶具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性，ii）具有SEQ ID NO 02、03或04之該等酶中之任一者的功能同源物或功能片段，及iii）與具有SEQ ID NO 02、03或04之該等酶中之任一者之全長序列分別具有至少80%序列一致性，且具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性的多肽序列，及 - 一或多個以下編碼DNA序列的兩個或更多個複本：α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶。 20. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞包含： - 編碼DNA序列之兩個或更多個複本，該編碼DNA序列編碼具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶活性且較佳選自包含以下者之清單的酶：i）具有SEQ ID NO 05之來自大腸桿菌的酶（glmS*54），及ii）具有SEQ ID NO 05之該酶的功能同源物或功能片段，及iii）與具有SEQ ID NO 05之該酶之全長序列具有至少80%序列一致性，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶活性的多肽序列，及/或 - 編碼DNA序列之兩個或更多個複本，該編碼DNA序列編碼具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶活性且較佳選自包含以下者之清單的酶：i）具有SEQ ID NO 06之來自釀酒酵母的酶（GNA1），ii）具有SEQ ID NO 06之該酶的功能同源物或功能片段，及iii）與具有SEQ ID NO 06之該酶之全長序列具有至少80%序列一致性，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶活性的多肽序列。 21. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞包含用於減少乙酸之生產的修飾。 22. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞進一步包含包括以下者之蛋白質中之任何一或多者的較低或降低表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性易位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性易位磷酸轉移酶（PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。 23. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞包含用於所選單醣、雙醣或寡醣之分解代謝途徑，該分解代謝途徑至少部分不活化，該等單醣、雙醣或寡醣參與該唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成及/或為該合成所需。 24. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞使用用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物，該前驅物自培養基進料至該細胞中。 25. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞生產用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。 26. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞在全培養液及/或上清液中生產90 g/L或更多之該唾液酸化雙醣及/或寡醣，及/或其中根據該全培養液及/或上清液中由該細胞生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣及其前驅物的總量量測，該全培養液及/或上清液中該唾液酸化雙醣及/或寡醣之純度分別為至少80%。 27. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞係細菌、真菌、酵母、植物細胞、動物細胞或原蟲細胞， - 較佳地，該細菌係大腸桿菌菌株，更佳為K-12菌株之大腸桿菌菌株，甚至更佳該大腸桿菌K-12菌株係大腸桿菌MG1655， - 較佳地，該真菌屬於選自包含以下者之群組的屬：根黴菌屬、網柄菌屬、青黴菌屬、白黴菌屬或麴菌屬， - 較佳地，該酵母屬於選自包含以下者之群組的屬：酵母菌屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、駒形氏酵母屬、漢森酵母屬、亞羅酵母屬、球擬假絲酵母屬、克魯維酵母屬或德巴利酵母屬， - 較佳地，該植物細胞係藻類細胞或衍生自菸草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物， - 較佳地，該動物細胞衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬蟲類、兩棲動物或昆蟲，或為衍生自不包括胚胎幹細胞之人類細胞的經基因修飾之細胞系，更佳該人類及非人類哺乳動物細胞係上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、鼠類骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，更佳該昆蟲細胞衍生自草地貪夜蛾、家蠶、甘藍夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅， - 較佳地，該原蟲細胞係蜥蜴利什曼原蟲細胞。 28. 如具體實例27之細胞，其中該細胞係活的革蘭氏陰性細菌，與未經修飾之先驅細胞相比，其包含減少或消除的聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）、腸內菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核心寡醣、滲透調節周質葡聚醣（OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或海藻糖之合成。 29. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞在培養基中穩定培養。 30. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞能夠合成包含至少一種唾液酸化寡醣之寡醣的混合物。 31. 如前述具體實例中任一項之細胞，其中該細胞能夠合成包含至少一種唾液酸化雙醣及/或寡醣之雙醣及寡醣的混合物。 32. 一種藉由細胞生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法，該方法包含以下步驟： i) 提供如具體實例1至31中任一項之細胞，及 ii) 在允許生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之條件下培養該細胞， iii) 較佳地，自該培養物分離該唾液酸化雙醣及/或寡醣。 33. 如具體實例32之方法，該方法進一步包含以下步驟中之至少一者： i) 向反應器中之培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前該培養基之體積的三倍、較佳不超過兩倍、更佳小於2倍； ii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料； iii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在該培養基之該最終體積中產生濃度為至少50 g/L、較佳至少75 g/L、更佳至少90 g/L、更佳至少100 g/L、更佳至少125 g/L、更佳至少150 g/L、更佳至少175 g/L、更佳至少200 g/L之唾液酸化雙醣及/或寡醣。 34. 如具體實例32之方法，該方法進一步包含以下步驟中之至少一者： i) 向培養基中添加包含每公升初始反應器體積至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前該培養基之體積的三倍、較佳不超過兩倍、更佳小於2倍； ii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加乳糖進料； iii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加乳糖進料，且其中該乳糖進料溶液之濃度為50 g/L、較佳75 g/L、更佳100 g/L、更佳125 g/L、更佳150 g/L、更佳175 g/L、更佳200 g/L、更佳225 g/L、更佳250 g/L、更佳275 g/L、更佳300 g/L、更佳325 g/L、更佳350 g/L、更佳375 g/L、更佳400 g/L、更佳450 g/L、更佳500 g/L、甚至更佳550 g/L、最佳600 g/L；且其中較佳地，該溶液之pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在該培養基之該最終體積中產生濃度為至少50 g/L、較佳至少75 g/L、更佳至少90 g/L、更佳至少100 g/L、更佳至少125 g/L、更佳至少150 g/L、更佳至少175 g/L、更佳至少200 g/L之由該乳糖生產之唾液酸化寡醣。 35. 如具體實例34之方法，其中該乳糖進料係藉由自培養開始以至少5 mM之濃度，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150 mM之濃度，更佳以＞300 mM之濃度添加乳糖來實現。 36. 如具體實例34或35中任一項之方法，其中該乳糖進料係藉由以一定濃度向培養基中添加乳糖，使得在培養之整個生產階段中獲得至少5 mM、較佳10 mM或30 mM之乳糖濃度來實現。 37. 如具體實例32至36中任一項之方法，其中該等宿主細胞培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。 38. 如具體實例32至37中任一項之方法，其中該細胞培養於包含碳源之培養基中，該碳源包含單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、甘油，包括糖蜜、玉米浸液、蛋白腖、胰腖或酵母萃取物之複合培養基；較佳地，其中該碳源係選自包含以下者之清單：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽寡醣、麥芽三醣、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖糖漿、乙酸、檸檬酸、乳酸及丙酮酸。 39. 如具體實例32至38中任一項之方法，其中該細胞使用至少一種用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物，較佳該細胞使用兩種或更多種用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。 40. 如具體實例32至39中任一項之方法，其中該培養基含有至少一種選自包含以下者之群組的化合物：乳糖、半乳糖、唾液酸、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二醣（LNB）、N-乙醯基乳糖胺（LacNAc）。 41. 如具體實例32至40中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由將較佳葡萄糖或蔗糖之以碳為基礎的基質添加至該培養基中來提供，隨後在第二階段中將乳糖添加至培養基中。 42. 如具體實例32至41中任一項之方法，其中該細胞生產至少一種用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。 43. 如具體實例32至42中任一項之方法，其中用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之該前驅物完全轉化成該唾液酸化雙醣及/或寡醣。 44. 如具體實例32至43中任一項之方法，其中將該唾液酸化雙醣及/或寡醣與該培養基及/或該細胞分離。 45. 如具體實例32至44中任一項之方法，其中該分離包含以下步驟中之至少一者：澄清、超過濾、奈米過濾、二相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、用非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流高效過濾、切向流超過濾、電泳、親和層析、離子交換層析、疏水性交互作用層析及/或凝膠過濾、配位體交換層析。 46. 如具體實例32至45中任一項之方法，其中該方法進一步包含純化該唾液酸化雙醣及/或寡醣。 47. 如具體實例46之方法，其中該純化包含以下步驟中之至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾、電泳、酶處理或離子交換、使用醇、使用水醇混合物、結晶、蒸發、沈澱、乾燥、噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥、帶式乾燥、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。 48. 一種如具體實例1至29中任一項之細胞之用途，其用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣。 49. 一種如具體實例30之細胞之用途，其用於生產包含至少一種唾液酸化寡醣之寡醣的混合物。 50. 一種如具體實例31之細胞之用途，其用於生產包含至少一種唾液酸化雙醣及/或寡醣之雙醣及寡醣的混合物。 51. 一種如具體實例32至47中任一項之方法之用途，其用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣。

本發明將在實施例中更詳細地描述。以下實施例將充當本發明之進一步說明及闡明，且並不意欲為限制性的。

實施例 實施例 1. 計算多肽序列之間的一致性百分比

用於比較之序列比對方法為所屬技術領域中熟知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。GAP使用尼德曼及翁施之演算法（J. Mol. Biol. (1970) 48: 443-453）尋找使匹配數達至最大且使空位數使減至最小之兩個序列的全局（亦即跨越全長序列）比對。BLAST演算法（Altschul等人, J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-10）計算全局序列一致性百分比（亦即在全長序列上進行）且對兩個序列之間的相似度進行統計分析。用於進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心（NCBI）公開獲得。可使用例如ClustalW多重序列比對演算法（1.83版）用預設成對比對參數及百分比評分法容易地鑑別同源物。亦可使用MatGAT軟體包（Campanella等人, BMC Bioinformatics (2003) 4:29）中可獲得的一種方法來確定全局相似性及一致性百分比（亦即跨越全長序列）。如所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見，可進行輕微手動編輯以使保守模體之間的比對最佳化。此外，亦可使用特定域而非使用全長序列來鑑別同源物，以確定所謂的局部序列一致性。可使用上文所提及之程式使用預設參數，在整個核酸或胺基酸序列上確定序列一致性值（=在全長序列上進行局部序列一致性搜尋，產生全局序列一致性評分），或在所選域或保守模體上確定序列一致性值（=在部分序列上進行局部序列一致性搜尋，產生局部序列一致性評分）。對於局部比對，史密斯-沃特曼演算法（Smith-Waterman algorithm）尤其適用（Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195-7）。 實施例 2. 大腸桿菌材料及方法 培養基

魯利亞培養液（Luria Broth；LB）培養基由1%胰腖蛋白腖（Difco，Erembodegem, Belgium）、0.5%酵母萃取物（Difco）及0.5%氯化鈉（VWR，Leuven, Belgium）組成。培養實驗中在96孔盤或搖瓶中使用之基本培養基含有2.00 g/L NH4Cl、5.00 g/L (NH4)2SO4、2.993 g/L KH2PO4、7.315 g/L K2HPO4、8.372 g/L MOPS、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1 ml/L維生素溶液、100 µl/L鉬酸鹽溶液及1 mL/L硒溶液。如各別實施例中所指定，另外將0.30 g/L唾液酸、20 g/L乳糖、20 g/L LacNAc及/或20 g/L LNB作為前驅物添加至培養基中。使用1 M KOH將基本培養基設定為pH 7。維生素溶液由3.6 g/L FeCl2.4H2O、5 g/L CaCl2.2H2O、1.3 g/L MnCl2.2H2O、0.38 g/L CuCl2.2H2O、0.5 g/L CoCl2.6H2O、0.94 g/L ZnCl2、0.0311 g/L H3BO4、0.4 g/L Na2EDTA.2H2O及1.01 g/L硫胺.HCl組成。鉬酸鹽溶液含有0.967 g/L NaMoO4.2H2O。硒溶液含有42 g/L Seo2。

用於醱酵之基本培養基含有6.75 g/L NH4Cl、1.25 g/L (NH4)2SO4、2.93 g/L KH2PO4及7.31 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1 mL/L維生素溶液、100 µL/L鉬酸鹽溶液及1 mL/L硒溶液，其組成與上文所描述相同。如各別實施例中所指定，另外將0.30 g/L唾液酸、20 g/L乳糖、20 g/L LacNAc及/或20 g/L LNB作為前驅物添加至培養基中。

藉由高壓處理（121℃，21分鐘）對複合培養基進行滅菌且藉由過濾（0.22 µm Sartorius）對基本培養基進行滅菌。必要時，藉由添加抗生素使培養基具有選擇性：例如氯黴素（20 mg/L）、卡本西林（100 mg/L）、觀黴素（40 mg/L）及/或康黴素（50 mg/L）。質體

pKD46（Red輔助質體，安比西林抗性）、pKD3（含有FRT側接氯黴素抗性（cat）基因）、pKD4（含有FRT側接康黴素抗性（kan）基因）及pCP20（表現FLP重組酶活性）質體獲自R. Cunin教授（比利時布魯塞爾自由大學（Vrije Universiteit Brussel, Belgium），2007）。將質體保持在購自Invitrogen之宿主大腸桿菌DH5α（F ^-、phi80d lacZΔM15、Δ( lacZYA- argF) U169、 deoR、 recA1、 endA1、hsdR17(rk ^-, mk ⁺)、 phoA、 supE44、λ ^-、 thi-1、 gyrA96、 relA1）中。菌株及突變

大腸桿菌K12 MG1655[λ ^-、F ^-、rph-1]於2007年3月獲自大腸桿菌基因儲備中心（Coli Genetic Stock Center）（美國），CGSC菌株編號：7740。基因破壞、基因引入及基因置換使用由Datsenko及Wanner（PNAS 97 (2000), 6640-6645）公開之技術進行。此技術基於藉由λ Red重組酶進行同源重組之後的抗生素選擇。翻轉酶重組酶之後續催化確保在最終生產菌株中移除抗生素選擇卡匣。攜帶Red輔助質體pKD46之轉形體在30℃下在10 mL含安比西林（100 mg/L）及L-阿拉伯糖（10 mM）之LB培養基中生長至OD ₆₀₀nm為0.6。藉由第一次用50 mL冰冷水且第二次用1 mL冰冷水洗滌細胞使其電勝任。接著，將細胞再懸浮於50 µL冰冷水中。用50 µL細胞及10-100 ng線性雙股DNA產物，藉由使用Gene Pulser™（BioRad）（600 Ω，25 µFD及250伏）進行電穿孔。在電穿孔之後，將細胞添加至1 mL LB培養基中，在37℃下培育1小時，且最後塗敷至含有25 mg/L氯黴素或50 mg/L康黴素之LB瓊脂上以選擇抗生素抗性轉形體。藉由PCR用在經修飾區上游及下游之引子驗證所選突變體，且使其在42℃下生長於LB瓊脂中以使輔助質體損失。測試突變體之安比西林敏感性。藉由PCR使用pKD3、pKD4及其衍生物作為模板獲得線性ds-DNA擴增子。所用引子具有與模板互補之序列的一部分及與染色體DNA上必須發生重組之側互補之另一部分。對於基因體剔除，同源區經設計在所關注基因之起始及終止密碼子上游50-nt及下游50-nt。對於基因體嵌入，必須考慮轉錄起始點（+1）。將PCR產物進行PCR純化，用Dpnl消化，自瓊脂糖凝膠再純化，且懸浮於洗提緩衝液（5 mM Tris，pH 8.0）中。用pCP20質體轉形所選突變體，該質體為顯示溫度敏感性複製及FLP合成之熱誘導的安比西林及氯黴素抗性質體。在30℃下選擇安比西林抗性轉形體，其後將一些轉形體在42℃下在LB中群落純化，且接著測試所有抗生素抗性及FLP輔助質體之損失。用對照引子檢查基因剔除及基因嵌入。

在唾液酸生產之一實施例中，突變菌株衍生自大腸桿菌K12 MG1655，其包含持續型轉錄單元之基因體嵌入，該等持續型轉錄單元含有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 7之來自釀酒酵母的GNA1的一或多個複本；N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶，如例如具有SEQ ID NO 9之來自卵形擬桿菌的AGE；及N-乙醯基神經胺酸合酶，如例如具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌的NeuB的一或多個複本。

可替代地及/或另外，唾液酸生產可藉由持續型轉錄單元之基因體嵌入獲得，該等持續型轉錄單元含有UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶，如例如具有SEQ ID NO 12之來自空腸彎曲桿菌的NeuC；及N-乙醯基神經胺酸合酶，如例如具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌的NeuB的一或多個複本。

可替代地及/或另外，唾液酸生產可藉由持續型轉錄單元之基因體嵌入獲得，該等持續型轉錄單元含有磷酸葡萄糖胺變位酶，如例如具有SEQ ID NO 10之來自大腸桿菌的glmM；N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 11之來自大腸桿菌的glmU；UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶，如例如具有SEQ ID NO 12之來自空腸彎曲桿菌的NeuC；及N-乙醯基神經胺酸合酶，如例如具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌的NeuB的一或多個複本。

可替代地及/或另外，唾液酸生產可藉由持續型轉錄單元之基因體嵌入獲得，該等持續型轉錄單元含有雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯基甘露糖胺激酶，如例如來自小鼠（C57BL/6J品系）具有SEQ ID NO 13；N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶，如例如來自互養棍狀菌屬（ Syntrophorhabdus）PtaU1.Bin058具有SEQ ID NO 14；及N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶，如例如來自候選種趨磁桑葚狀菌屬HK-1具有SEQ ID NO 15及/或來自多形擬桿菌（ATCC 29148菌株）具有SEQ ID NO 16。

可替代地及/或另外，唾液酸生產可藉由持續型轉錄單元之基因體嵌入獲得，該等持續型轉錄單元含有磷酸葡萄糖胺變位酶，如例如具有SEQ ID NO 10之來自大腸桿菌的glmM；N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 11之來自大腸桿菌的glmU；雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯基甘露糖胺激酶，如例如來自小鼠（C57BL/6J品系）具有SEQ ID NO 13；N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶，如例如來自互養棍狀菌屬PtaU1.Bin058具有SEQ ID NO 14；及N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶，如例如來自候選種趨磁桑葚狀菌屬HK-1具有SEQ ID NO 15及/或來自多形擬桿菌（ATCC 29148菌株）具有SEQ ID NO 16。

唾液酸生產可進一步在突變大腸桿菌菌株中最佳化，該菌株具有包含以下者中之任何一或多者之大腸桿菌基因的基因體剔除： nagA、 nagB、 nagC、 nagD、 nagE、 nanA、 nanE、 nanK、 manX、 manY及manZ，如WO18122225中所描述；及/或包含以下者中之任何一或多者之大腸桿菌基因的基因體剔除： nanT、 poxB、 ldhA、 adhE、 aldB、 pflA、 pflC、 ybiY、 ackA及/或 pta；且具有包含以下者中之任何一或多者之持續型轉錄單元之基因體嵌入：唾液酸運輸蛋白，如例如具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的nanT的一或多個複本；膜運輸蛋白，如例如具有SEQ ID NO 49之來自大腸桿菌的entS、具有SEQ ID NO 50之來自大腸桿菌的MdfA、具有SEQ ID NO 51之來自大腸桿菌的iceT、具有SEQ ID NO 52之來自大腸桿菌的oppF、具有SEQ ID NO 53之來自乳酸乳球菌乳酸亞種二乙醯基乳酸生物型的lmrA、具有SEQ ID NO 54之來自長雙叉桿菌嬰兒亞種的Blon_2475、具有SEQ ID NO 55之來自大腸桿菌的SetA、具有SEQ ID NO 56之來自大腸桿菌的SetB及具有SEQ ID NO 57之來自大腸桿菌的SetC或其任何組合的一或多個複本；L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的突變glmS*54（與野生型大腸桿菌glmS之不同之處在於A39T、R250C及G472S突變）的一或多個複本；較佳如例如以下者中之任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU之大腸桿菌基因，或來自戀臭假單胞菌之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL，如WO18122225中所描述；及具有SEQ ID NO 47之來自大腸桿菌的乙醯基-CoA合成酶acs。

對於唾液酸化寡醣生產，該等唾液酸生產菌株經進一步修飾以表現兩種或更多種具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性之同功蛋白質，如例如具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶；且表現以下者之一或多個複本：β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶，如例如來自多殺性巴氏桿菌之SEQ ID NO 17（PmultST3）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之SEQ ID NO 18（NmeniST3）或來自多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株之SEQ ID NO 48（PmultST2），β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶，如例如來自美人魚發光菌（ Photobacterium damselae）之SEQ ID NO 19（PdST6）或來自發光菌屬JT-ISH-224之SEQ ID NO 20（P-JT-ISH-224-ST6）及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶，如例如來自小鼠具有SEQ ID NO 21。

N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶及唾液酸基轉移酶之持續型轉錄單元可經由基因體嵌入或經由表現質體遞送至突變菌株。若生產唾液酸及CMP-唾液酸之突變菌株意欲構造唾液酸化乳糖結構，則菌株另外經大腸桿菌 LacZ、 LacY及 LacA基因之基因體剔除及經乳糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 22之大腸桿菌LacY之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾。生產唾液酸、CMP-唾液酸及/或唾液酸化寡醣之所有突變菌株可視情況經由含有以下持續型轉錄單元之基因體嵌入而適用於在蔗糖上生長：蔗糖運輸蛋白，如例如具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的CscB；果糖激酶，如例如具有SEQ ID NO 24之源自運動醱酵單胞菌（ Z. mobilis）的Frk；及蔗糖磷酸化酶，如例如來自青春雙叉桿菌（ B. adolescentis）具有SEQ ID NO 25。

可替代地及/或另外，唾液酸及/或唾液酸化寡醣生產可進一步用持續型轉錄單元之基因體嵌入在突變大腸桿菌菌株中最佳化，該持續型轉錄單元包含膜運輸蛋白，如例如唾液酸運輸蛋白，如例如來自大腸桿菌K-12 MG1655之nanT（UniProt ID P41036）、來自大腸桿菌O6:H1之nanT（UniProt ID Q8FD59）、來自大腸桿菌O157:H7之nanT（UniProt ID Q8X9G8）或來自艾伯特氏埃希氏菌（ E. albertii）之nanT（UniProt ID B1EFH1）；或搬運體，如例如來自大腸桿菌之EntS（UniProt ID P24077）、來自抗壞血酸克呂沃爾氏菌（ Kluyvera ascorbata）之EntS（UniProt ID A0A378GQ13）或來自腸沙門氏菌亞利桑那亞種（ Salmonella enterica subsp. arizonae）之EntS（UniProt ID A0A6Y2K4E8）、來自莫金斯克羅諾桿菌（ Cronobacter muytjensii）之MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌（ Citrobacter youngae）之MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌之MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自雷金斯堡預研菌（ Yokenella regensburgei）之MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌之iceT（UniProt ID A0A024L207）、來自楊氏檸檬酸桿菌之iceT（UniProt ID D4B8A6）、來自大腸桿菌之SetA（UniProt ID P31675）、來自大腸桿菌之SetB（UniProt ID P33026）或來自大腸桿菌之SetC（UniProt ID P31436）；或ABC運輸蛋白，如例如來自大腸桿菌之oppF（UniProt ID P77737）、來自乳酸乳球菌乳酸亞種二乙醯基乳酸生物型之lmrA（UniProt ID A0A1V0NEL4）或來自長雙叉桿菌嬰兒亞種之Blon_2475（UniProt ID B7GPD4）。

在生產唾液酸之大腸桿菌菌株中GDP-岩藻糖生產之一實施例中，此等實施例中之突變菌株經進一步修飾，包含大腸桿菌 wcaJ及 thyA基因之剔除及持續型轉錄單元之基因體嵌入，該等持續型轉錄單元含有蔗糖運輸蛋白，如例如具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的CscB；果糖激酶，如例如具有SEQ ID NO 24之源自運動醱酵單胞菌的Frk；及蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase；SP），如例如來自青春雙叉桿菌具有SEQ ID NO 25。為生產岩藻糖基化寡醣，突變GDP-岩藻糖生產菌株另外經表現質體修飾，表現質體包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 26之來自幽門螺旋桿菌（ H. pylori）的HpFutC及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 27之來自幽門螺旋桿菌的HpFucT的持續型轉錄單元，及經作為選擇性標記的具有SEQ ID NO 28之大腸桿菌thyA的持續型轉錄單元修飾。岩藻糖基轉移酶基因之持續型轉錄單元亦可經由基因體嵌入存在於突變大腸桿菌菌株中。如WO2016075243及WO2012007481中所描述，GDP-岩藻糖生產可進一步藉由包含 glgC、 agp、 pfkA、 pfkB、 pgi、 arcA、 iclR、 pgi及 lon之大腸桿菌基因中之任何一或多者的基因體剔除在突變大腸桿菌菌株中最佳化。GDP-岩藻糖生產可另外經最佳化，包含以下者之持續型轉錄單元之基因體嵌入：甘露糖-6-磷酸異構酶，如例如具有SEQ ID NO 29之來自大腸桿菌的manA；磷酸甘露糖變位酶，如例如具有SEQ ID NO 30之來自大腸桿菌的manB；甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 31之來自大腸桿菌的manC；GDP-甘露糖4,6-脫水酶，如例如具有SEQ ID NO 32之來自大腸桿菌的gmd；及GDP-L-岩藻糖合酶，如例如具有SEQ ID NO 33之來自大腸桿菌的fcl。GDP-岩藻糖生產亦可藉由大腸桿菌 fucK及 fucI基因之基因體剔除及持續型轉錄單元之基因體嵌入獲得，該等持續型轉錄單元含有岩藻糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 34之來自大腸桿菌的fucP，及雙官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶，如例如具有SEQ NO ID 35之來自脆弱擬桿菌的fkp。若生產唾液酸及CMP-岩藻糖之突變菌株意欲構造岩藻糖基化乳糖結構，則菌株另外經大腸桿菌 LacZ、 LacY及 LacA基因之基因體剔除及經乳糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 22之大腸桿菌LacY之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾。此外，若突變菌株亦意欲構造唾液酸化結構，則菌株另外經包含以下者之一或多個複本的持續型轉錄單元之基因體嵌入或表現質體修飾：N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA及/或具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA；且表現以下者之一或多個複本：β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶，如例如來自多殺性巴氏桿菌之SEQ ID NO 17（PmultST3）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之SEQ ID NO 18（NmeniST3）或來自多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株之SEQ ID NO 48（PmultST2），β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶，如例如來自美人魚發光菌之SEQ ID NO 19（PdST6）及/或來自發光菌屬JT-ISH-224之SEQ ID NO 20（P-JT-ISH-224-ST6）及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶，如例如來自小鼠具有SEQ ID NO 21。

可替代地及/或另外，GDP-岩藻糖及/或岩藻糖基化結構之生產可進一步經持續型轉錄單元的基因體嵌入在突變大腸桿菌菌株中最佳化，該持續型轉錄單元包含膜運輸蛋白，如例如來自莫金斯克羅諾桿菌之MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌之MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌之MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自雷金斯堡預研菌之MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌之iceT（UniProt ID A0A024L207）或來自楊氏檸檬酸桿菌之iceT（UniProt ID D4B8A6）。

在生產唾液酸之大腸桿菌菌株中生產LN3（GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之一實施例中，此等實施例中之突變菌株經進一步修飾，包含大腸桿菌 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及以下者之持續型轉錄單元之基因體嵌入：乳糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 22之大腸桿菌LacY，及半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的LgtA。

在用於生產LN-3衍生之寡醣，如乳- N-四醣（LNT）及乳- N-新四醣（LNnT）之一實施例中，生產突變LN3之菌株進一步用經由基因體嵌入或自表現質體遞送至菌株的以下者之持續型轉錄單元修飾：N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 37之來自大腸桿菌O55:H7的WbgO以生產LNT，或N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 38之來自腦膜炎奈瑟氏菌的LgtB以生產LNnT。視情況，可將半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶編碼基因之多個複本添加至突變大腸桿菌菌株中。另外，菌株可視情況經大腸桿菌 ushA及 galT基因之基因體剔除修飾以增強UDP-半乳糖生產。突變大腸桿菌菌株亦可視情況經UDP-葡萄糖-4-表異構酶，如例如具有SEQ ID NO 39之來自大腸桿菌的galE之持續型轉錄單元的基因體嵌入調適。此外，若突變菌株亦意欲構造唾液酸化結構，則菌株另外經包含以下者之一或多個複本的持續型轉錄單元之基因體嵌入或表現質體修飾：N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA及/或具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA；且表現以下者之一或多個複本：β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶，如例如來自多殺性巴氏桿菌之SEQ ID NO 17（PmultST3）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之SEQ ID NO 18（NmeniST3）或來自多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株之SEQ ID NO 48（PmultST2），β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶，如例如來自美人魚發光菌之SEQ ID NO 19（PdST6）及/或來自發光菌屬JT-ISH-224之SEQ ID NO 20（P-JT-ISH-224-ST6）及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶，如例如來自小鼠具有SEQ ID NO 21。突變大腸桿菌菌株亦可視情況經由持續型轉錄單元之基因體嵌入而適用於在蔗糖上生長，該等持續型轉錄單元含有蔗糖運輸蛋白，如例如具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的CscB；果糖激酶，如例如具有SEQ ID NO 24之源自運動醱酵單胞菌的Frk；及蔗糖磷酸化酶，如例如來自青春雙叉桿菌具有SEQ ID NO 25。

可替代地及/或另外，LN3、LNT、LNnT及其衍生之寡醣的生產可進一步經持續型轉錄單元的基因體嵌入在突變大腸桿菌菌株中最佳化，該持續型轉錄單元包含膜運輸蛋白，如例如來自莫金斯克羅諾桿菌之MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌之MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌之MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自雷金斯堡預研菌之MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌之iceT（UniProt ID A0A024L207）或來自楊氏檸檬酸桿菌之iceT（UniProt ID D4B8A6）。較佳但未必，醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質及/或膜運輸蛋白經N端及/或C端融合至如例如以下者之溶解度強化子標籤：SUMO標籤、MBP標籤、His、FLAG、Strep-II、Halo標籤、NusA、硫氧還原蛋白、GST及/或Fh8標籤以增強其溶解度（Cost等人, Front. Microbiol. 2014, https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063；Fox等人, Protein Sci. 2001, 10(3), 622-630；Jia及Jeaon, Open Biol. 2016, 6: 160196）。

視情況，突變大腸桿菌菌株經編碼伴隨蛋白，如例如DnaK、DnaJ、GrpE或GroEL/ES伴隨蛋白系統之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾（Baneyx F., Palumbo J.L. (2003) Improving Heterologous Protein Folding via Molecular Chaperone and Foldase Co-Expression. 在：Vaillancourt P.E. (編) E. coliGene Expression Protocols. Methods in Molecular Biology™, 第205卷. Humana Press中）。

視情況，突變大腸桿菌菌株經修飾以產生醣基最小化之大腸桿菌菌株，其包含非必需醣基轉移酶基因中之任何一或多者的基因體剔除，該等非必需醣基轉移酶基因包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP。

所有持續型啟動子、UTR及終止子序列源自Cambray等人（Nucleic Acids Res. 2013, 41(9), 5139-5148）、Dunn等人（Nucleic Acids Res. 1980, 8, 2119-2132）、Edens等人（Nucleic Acids Res. 1975, 2, 1811-1820）、Kim及Lee（FEBS Letters 1997, 407, 353-356）及Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 第10期, 354-360）所描述之庫。

所有基因在Twist Bioscience（twistbioscience.com）或IDT（eu.idtdna.com）處合成訂購，且使用供應商之工具調適密碼子使用。

所有菌株在-80℃下儲存於冷凍小瓶中（隔夜LB培養物以1:1的比與70%甘油混合）。表 1：本發明中所描述之SEQ ID NO之概述

SEQ ID NO	名稱 / 標識符	生物體	來源	數位序列資訊之原產國
01	NeuB	腦膜炎奈瑟氏菌	合成	英國
02	NeuB	空腸彎曲桿菌	合成	美國
03	NeuA	空腸彎曲桿菌	合成	美國
04	NeuA	流感嗜血桿菌	合成	美國
05	NeuA	多殺性巴氏桿菌	合成	美國
06	glmS*54	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
07	GNA1	釀酒酵母	合成	美國
08	nanT (P41036)	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
09	AGE	卵形擬桿菌	合成	美國
10	glmM	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
11	glmU	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
12	NeuC	空腸彎曲桿菌	合成	美國
13	GNE	小鼠（C57BL/6J品系）	合成	美國
14	NANS	互養棍狀菌屬物種PtaU1.Bin058	合成	美國
15	NANP	候選種趨磁桑葚狀菌屬物種HK-1	合成	德國
16	NANP	多形擬桿菌	合成	未知
17	α-2,3-唾液酸基轉移酶	多殺性巴氏桿菌	合成	美國
18	α-2,3-唾液酸基轉移酶	腦膜炎奈瑟氏菌	合成	英國
19	α-2,6-唾液酸基轉移酶	美人魚發光菌	合成	日本
20	α-2,6-唾液酸基轉移酶	發光菌屬物種JT-ISH-224	合成	日本
21	α-2,8-唾液酸基轉移酶	小鼠	合成	美國
22	LacY	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
23	CscB	大腸桿菌W	合成	美國
24	Frk	運動醱酵單胞菌	合成	英國
25	BaSP	青春雙叉桿菌	合成	德國
26	HpFutC	幽門螺旋桿菌UA1234	合成	英國
27	HpFucT	幽門螺旋桿菌UA1234	合成	英國
28	thyA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
29	manA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
30	manB	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
31	manC	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
32	gmd	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
33	fcl	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
34	fucP	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
35	fkp	脆弱擬桿菌NCTC 9343	合成	英國
36	lgtA	腦膜炎奈瑟氏菌	合成	英國
37	wbgO	大腸桿菌O55:H7	合成	德國
38	lgtB	腦膜炎奈瑟氏菌MC58	合成	英國
39	galE	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
40	LAC12	乳酸克魯維酵母	合成	美國
41	ppsA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
42	PCK	麩胺酸棒狀桿菌	合成	丹麥
43	pcka	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
44	eda	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
45	maeA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
46	maeB	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
47	acs	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
48	α-2,3-唾液酸基轉移酶	多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株	合成	未知
49	entS	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
50	MdfA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
51	iceT	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
52	oppF	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
53	LmrA	乳酸乳球菌乳酸亞種二乙醯基乳酸生物型	合成	塞爾維亞
54	Blon_2475	長雙叉桿菌嬰兒亞種	合成	德國
55	SetA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
56	SetB	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
57	SetC	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國

培養條件

96孔微量滴定盤實驗之預培養始於冷凍小瓶，於150 µL LB中，且在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育隔夜。此培養物用作96孔正方形微量滴定盤之接種物，在400 µL基本培養基情況下藉由稀釋400倍。此等最終96孔培養盤接著在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育72小時或更短或更長。為量測培養實驗結束時之糖濃度，藉由使培養液在60℃下沸騰15分鐘，之後使細胞短暫離心而自各孔獲取全培養液樣品（=細胞內及細胞外糖濃度之平均值）。

生物反應器之預培養始於某一菌株之整個1 mL冷凍小瓶，在1 L或2.5 L搖瓶中之250 mL或500 mL基本培養基中接種，且在37℃下在定軌振盪器上以200 rpm培育24小時。接著接種5 L生物反應器（具有5 L工作體積）（2 L分批培養基中之250 mL接種物）；該方法受MFCS控制軟體（Sartorius Stedim Biotech，德國梅爾松根（Melsungen, Germany））控制。培養條件設定為37℃及最大攪拌；壓力氣體流動速率視菌株及生物反應器而定。使用0.5 M H2S04及20% NH4OH將pH控制在6.8。冷卻廢氣。在醱酵期間起泡產生時，添加10%聚矽氧消泡劑溶液。光密度

培養物之細胞密度通常藉由量測600 nm下之光密度（Implen Nanophotometer NP80, Westburg，比利時，或用Spark 10M微量盤讀取器，Tecan，瑞士）來監測。解析型分析

標準品，諸如但不限於蔗糖、乳糖、N-乙醯基乳糖胺（LacNAc，Gal-b1,4-GlcNAc）、乳-N-二醣（LNB，Gal-b1,3-GlcNAc）、岩藻糖基化LacNAc（2'FLacNAc、3-FLacNAc）、唾液酸化LacNAc（3'SLacNAc、6'SLacNAc）、岩藻糖基化LNB（2'FLNB、4'FLNB）、乳- N-丙醣II（LN3）、乳- N-四醣（LNT）、乳- N-新-四醣（LNnT）、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LNFP-VI、LSTa、LSTc及LSTd購自Carbosynth（英國）、Elicityl（法國）及IsoSep（瑞典）。用內部製造之標準品分析其他化合物。

在Waters Acquity H級UPLC上用折射率（Refractive Index；RI）偵測分析唾液酸化寡醣。在Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱（2.1×100 mm；130 Å；1.7 µm）上注射0.5 µL體積之樣品。管柱溫度為50℃。移動相由添加0.05%吡咯啶之70%乙腈、26%乙酸銨緩衝液（150 mM）及4%甲醇之混合物組成。該方法以0.150 mL/min之流速等度。RI偵測器之溫度設定為35℃。在Waters Acquity H級UPLC上用蒸發光散射偵測器（Evaporative Light Scattering Detector；ELSD）或折射率（RI）偵測分析中性寡醣。在Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱（2.1×100 mm；130 Å；1.7 µm）管柱及Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱（130 Å，2.1×5 mm）上注射0.7 µL體積之樣品。管柱溫度為50℃。移動相由添加0.2%三乙胺之¼水及¾乙腈溶液組成。該方法以0.130 mL/min之流速等度。ELS偵測器之漂移管溫度為50℃，且N2氣體壓力為50 psi，增益為200且資料速率為10 pps。RI偵測器之溫度設定為35℃。在Waters Acquity H級UPLC上用折射率（RI）偵測分析中性糖及唾液酸化糖兩者。在Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱（2.1×100 mm；130 Å；1.7 µm）上注射0.5 µL體積之樣品。管柱溫度為50℃。移動相由添加0.1%三乙胺之72%乙腈與28%乙酸銨緩衝液（100 mM）之混合物組成。該方法以0.260 mL/min之流速等度。RI偵測器之溫度設定為35℃。

對於質譜儀上之分析，使用具有電灑離子化（ESI）之Waters Xevo TQ-MS，去溶劑化溫度為450℃，氮氣去溶劑化氣體流速為650 L/h且錐電壓為20 V。對於所有寡醣，MS在選擇離子監測（selected ion monitoring；SIM）中在負模式下操作。在具有Thermo Hypercarb管柱（2.1×100 mm；3 µm）之Waters Acquity UPLC上在35℃下進行分離。使用梯度，其中洗提劑A為含0.1%甲酸之超純水且其中洗提劑B為含0.1%甲酸之乙腈。寡醣在55分鐘內使用以下梯度分離：在21分鐘內自2%至12%洗提劑B初始增加，在11分鐘內自12%至40%洗提劑B第二增加，及在5分鐘內自40%至100%洗提劑B第三增加。作為洗滌步驟，使用100%洗提劑B 5分鐘。對於管柱平衡，2%洗提劑B之起始條件在1分鐘內恢復且維持12分鐘。

在Dionex HPAEC系統上用脈衝安培偵測（PAD）分析低濃度（低於50 mg/L）下之中性糖及唾液酸化糖兩者。在Dionex CarboPac PA200管柱4×250 mm及Dionex CarboPac PA200保護管柱4×50 mm上注射5 µL體積之樣品。管柱溫度設定為30℃。使用梯度，其中洗提劑A為去離子水，其中洗提劑B為200 mM氫氧化鈉且其中洗提劑C為500 mM乙酸鈉。寡醣在60分鐘內分離，同時使用以下梯度維持25%之洗提劑B的恆定比率：75%洗提劑A之初始等度步驟維持10分鐘，0%至4%洗提劑C在8分鐘內之初始增加，71%洗提劑A及4%洗提劑C之第二等度步驟維持6分鐘，4%至12%洗提劑C在2.6分鐘內之第二增加，63%洗提劑A及12%洗提劑C之第三等度步驟維持3.4分鐘，及12%至48%洗提劑C在5分鐘內之第三增加。作為洗滌步驟，使用48%洗提劑C 3分鐘。對於管柱平衡，75%洗提劑A及0%洗提劑C之初始條件在1分鐘內恢復且維持11分鐘。應用之流速為0.5 mL/min。 實施例 3. 釀酒酵母材料及方法 培養基

在具有完整補充混合物（SD CSM）或CSM缺陷型（drop-out）（SD CSM-Ura，SD CSM-Trp，SD CSM-His）之合成限定酵母培養基上生長菌株，該培養基含有6.7 g/L之不含胺基酸的酵母氮源基礎（不含AA之YNB，Difco）、20 g/L瓊脂（Difco）（固體培養物）、22 g/L葡萄糖單水合物或20 g/L乳糖及0.79 g/L CSM或0.77 g/L CSM-Ura、0.77 g/L CSM-Trp或0.77 g/L CSM-His（MP Biomedicals）。菌株

使用由Brachmann等人（Yeast (1998) 14:115-32）產生之釀酒酵母BY4742，可獲自Euroscarf培養物收集。所有突變菌株藉由使用Gietz方法（Yeast 11:355-360, 1995）之同源重組或質體轉形產生。質體

在生產唾液酸及CMP-唾液酸之一實施例中，酵母表現質體可衍生自pRS420質體系列（Christianson等人, 1992, Gene 110: 119-122），其含有TRP1選擇標記及以下者之持續型轉錄單元：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的突變glmS*54的一或多個複本；如例如以下者中之任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU之大腸桿菌基因，或來自戀臭假單胞菌之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL，如WO18122225中所描述；N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶，如例如具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的AGE；N-乙醯基神經胺酸合酶，如例如具有SEQ ID NO 01之腦膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌的NeuB的一或多個複本；及N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA及/或具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA的一或多個複本。視情況，亦添加包含葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的GNA1之一或多個複本的持續型轉錄單元。

為了生產唾液酸化寡醣，質體進一步包含以下者之持續型轉錄單元：乳糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 40之乳酸克魯維酵母的LAC12；及以下者之一或多個複本：β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶，如例如來自多殺性巴氏桿菌之SEQ ID NO 17（PmultST3）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之SEQ ID NO 18（NmeniST3）或來自多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株之SEQ ID NO 48（PmultST2），β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶，如例如來自美人魚發光菌之SEQ ID NO 19（PdST6）及/或來自發光菌屬JT-ISH-224之SEQ ID NO 20（P-JT-ISH-224-ST6）及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶，如例如來自小鼠具有SEQ ID NO 21。

在生產GDP-岩藻糖之一實施例中，如p2a_2µ_Fuc（Chan 2013, Plasmid 70, 2-17）之酵母表現質體可用於在釀酒酵母中表現外來基因。此質體含有安比西林抗性基因及細菌複製起點以允許在大腸桿菌中進行選擇及維持，且含有2µ酵母ori及Ura3選擇標記用於在酵母中進行選擇及維持。此質體進一步經以下者之持續型轉錄單元修飾：乳糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 40之來自乳酸克魯維酵母的LAC12；GDP-甘露糖4,6-脫水酶，如例如具有SEQ ID NO 32之來自大腸桿菌的gmd；及GDP-L-岩藻糖合酶，如例如具有SEQ ID NO 33之來自大腸桿菌的fcl。酵母表現質體p2a_2µ_Fuc2可用作p2a_2µ_Fuc質體之替代表現質體，該質體包含緊接於安比西林抗性基因、細菌ori、2µ酵母ori及Ura3選擇標記的以下者之持續型轉錄單元：乳糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 40之來自乳酸克魯維酵母的LAC12；岩藻糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 34之來自大腸桿菌的fucP；及雙官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶，如例如具有SEQ NO ID 35之來自脆弱擬桿菌的fkp。為進一步生產岩藻糖基化寡醣，p2a_2µ_Fuc及其變異體p2a_2µ_Fuc2另外含有一或多種海藻糖基轉移酶，如SEQ ID NO 26及27之持續型轉錄單元。

在生產UDP-半乳糖之一實施例中，酵母表現質體可衍生自pRS420-質體系列（Christianson等人, 1992, Gene 110: 119-122），其含有HIS3選擇標記及如例如具有SEQ ID NO 39之來自大腸桿菌的galE的UDP-葡萄糖-4-表異構酶之持續型轉錄單元。此質體進一步經以下者之持續型轉錄單元修飾以生產LN3：乳糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 40之來自乳酸克魯維酵母的LAC12；半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的lgtA。為進一步生產LN3衍生之寡醣，如LNT或LNnT，亦在質體上分別添加N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 37之來自大腸桿菌O55:H7的WbgO，或N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，如例如具有SEQ ID NO 38之來自腦膜炎奈瑟氏菌的lgtB。

較佳但未必，醣基轉移酶經N端融合至SUMOstar標籤（例如獲自pYSUMOstar, Life Sensors, Malvern, PA）以增強其溶解度。

將質體保持在購自Invitrogen之宿主大腸桿菌DH5α（F ^-、phi80d lacZdeltaM15、Δ( lacZYA- argF)U169、 deoR、 recA1、 endA1、hsdR17(rk ^-, mk ⁺)、 phoA、 supE44、λ ^-、 thi-1、 gyrA96、 relA1）中。異源及同源表現

需要表現之基因，無論其來自質體或來自基因體，均以合成方式經以下公司中之一者合成：DNA2.0、Gen9、IDT或Twist Bioscience。可藉由使密碼子使用最佳化為表現宿主之密碼子使用來進一步促進表現。使用供應商之工具使基因最佳化。培養條件

一般而言，酵母菌株最初在SD CSM盤上生長以獲得單一菌落。使此等盤在30℃下生長2-3天。始於單一菌落，使預培養物在30℃下在5 mL中生長隔夜，以200 rpm振盪。後續之125 mL搖瓶實驗以25 mL培養基中2%之此預培養物接種。在30℃下以200 rpm定軌振盪下培育此等搖瓶。基因表現啟動子

使用合成持續型啟動子表現基因，如由Blazeck（Biotechnology and Bioengineering, 第109卷, 第11期, 2012）所描述。 實施例 4. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 6' - 唾液酸基乳糖 （ 6' -SL ）

如實施例2中所描述，大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾用於唾液酸及6'-唾液酸基乳糖生產，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）及具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶。由此獲得之突變大腸桿菌菌株S0進一步經具有持續型轉錄單元之基因體嵌入及/或表現質體修飾以表現 a）一種具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，及一種具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST， b）兩種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的兩個複本，或 c）三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的三個複本，分別產生如表2中所概述之突變大腸桿菌菌株S1、S2及S3。用於表現該等NeuA酶或PdbST之啟動子、UTR及終止子序列的細節概述於表3中。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。各菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。

實驗證明所有新穎菌株生產6'-SL。在本文中，與表現一種具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的PdbST酶的一個複本的菌株S1相比，表現兩種具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性的同功蛋白質（亦即SEQ ID NO 03及04）及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的PdbST酶的兩個複本的菌株S2的6'-SL產量高2.60倍。在相同實驗中，與表現一種具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的PdbST酶的一個複本的菌株S1相比，表現三種具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性的同功蛋白質（亦即SEQ ID NO 03、04及05）及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的PdbST酶的三個複本的菌株S3的6'-SL產量高11.50倍。實驗進一步證明所有突變菌株具有相似生長速率且在培養期間不遭受任何基因體或質體DNA不穩定性或重組（結果未示出）。表 2：與親本大腸桿菌菌株S0相比，大腸桿菌菌株S1、S2及S3中存在的額外轉錄單元

菌株	位置	轉錄單元
		啟動子序列*	UTR序列*	編碼DNA序列	終止子序列*
S1	基因體嵌入	P35	U18	CjNeuA = SEQ ID NO 3	T2
	基因體嵌入	P50	U10	PdbST = SEQ ID NO 19	T1
S2	基因體嵌入	P35	U18	CjNeuA = SEQ ID NO 3	T2
基因體嵌入	P26	U18	HiNeuA = SEQ ID NO 04	T9
基因體嵌入	P50	U10	PdbST = SEQ ID NO 19	T1
基因體嵌入	P5	U10	PdbST = SEQ ID NO 19	T7
S3	基因體嵌入	P35	U18	CjNeuA = SEQ ID NO 3	T2
基因體嵌入	P26	U18	HiNeuA = SEQ ID NO 04	T9
質體	P26	U18	PmultNeuA = SEQ ID NO 05	T9
基因體嵌入	P50	U10	PdbST = SEQ ID NO 19	T1
基因體嵌入	P5	U10	PdbST = SEQ ID NO 19	T7
質體	P5	U10	PdbST = SEQ ID NO 19	T7

*參見表3 表 3：用於在如表2中給出之突變大腸桿菌菌株S1、S2及S3中表現neuA同功蛋白質或α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的啟動子、UTR及終止子序列

啟動子序列	參考文獻
P5 = PROM0005 = Mutalik_P5	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
P26 = PROM0026 = Mutalik_apFAB110	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
P35 = PROM0035 = Mutalik_apFAB37	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
P50 = PROM0050 = Mutalik_apFAB82	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
UTR 序列	參考文獻
U10 = UTR0010_GalE_BCD12	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
U18 = UTR0018_GalE_BCD18	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
終止子序列	參考文獻
T1 = TER0001_TT5-T7	Dunn等人（Nucleic Acids Res. 1980, 8, 2119-2132）
T2 = TER0002_rrnBT1_rrnBT2	Kim及Lee（FEBS Letters 1997, 407, 353-356）
T7 = TER0007_ilvGEDA	Cambray等人（Nucleic Acids Res. 2013, 41, 5139-5148）
T9 = TER0009_M13_central	Edens等人（Nucleic Acids Res. 1975, 2, 1811-1820）

實施例 5. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 3' - 唾液酸基乳糖 （ 3'-SL ）

如實施例2中所描述，大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾用於唾液酸及3'-唾液酸基乳糖生產，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）的兩個複本、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）及具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶。由此獲得之突變大腸桿菌菌株S30進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾以表現 a）具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶的一個複本，及具有SEQ ID NO 17之來自多殺性巴氏桿菌的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶PmultST3的一個複本，或 b）具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶的兩個複本，及具有SEQ ID NO 17之來自多殺性巴氏桿菌的PmultST3唾液酸基轉移酶的兩個複本，分別產生如表4中所概述之突變大腸桿菌菌株S4及S5。用於表現該等NeuA酶或PmultST3之啟動子、UTR及終止子序列的細節概述於表5中。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。各菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。

實驗證明新穎菌株S4及S5兩者生產3'-SL。在本文中，與表現具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶的一個複本及具有SEQ ID NO 17之來自多殺性巴氏桿菌的PmultST3酶的一個複本的菌株S30相比，表現具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶的兩個複本及具有SEQ ID NO 17之來自多殺性巴氏桿菌的PmultST3酶的兩個複本的菌株S4的3'-SL產量高3.70倍。實驗進一步證明突變菌株S4及S5兩者具有相似生長速率且在培養期間不遭受任何基因體或質體DNA不穩定性或重組。表 4：與親本大腸桿菌菌株S30相比，大腸桿菌菌株S4及S5中存在的額外轉錄單元

菌株	位置	轉錄單元
		啟動子序列*	UTR序列*	編碼DNA序列	終止子序列*
S4	基因體嵌入	P26	U18	PmultNeuA = SEQ ID NO 05	T9
	基因體嵌入	P50	U14	PmultST3 = SEQ ID NO 17	T7
S5	基因體嵌入	P26	U18	PmultNeuA = SEQ ID NO 05	T9
基因體嵌入	P26	U11	PmultNeuA = SEQ ID NO 05	T9
基因體嵌入	P50	U14	PmultST3 = SEQ ID NO 17	T7
基因體嵌入	P50	U14	PmultST3 = SEQ ID NO 17	T7

*參見表5 表 5：用於在如表4中所給出之突變大腸桿菌菌株S4及S5中表現PmultNeuA或α-2,3-唾液酸基轉移酶PmultST3的啟動子、UTR及終止子序列

啟動子序列	參考文獻
P26 = PROM0026 = Mutalik_apFAB110	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
P50 = PROM0050 = Mutalik_apFAB82	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
UTR 序列	參考文獻
UTR11 = UTR0011_Gene10_LeuL	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
U14 = UTR0014_GalE_LeuAB	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
U18 = UTR0018_GalE_BCD18	Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 10, 354-360）
終止子序列	參考文獻
T7 = TER0007_ilvGEDA	Cambray等人（Nucleic Acids Res. 2013, 41, 5139-5148）
T9 = TER0009_M13_central	Edens等人（Nucleic Acids Res. 1975, 2, 1811-1820）

實施例 6. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 6' - 唾液酸基乳糖 （ 6' -SL ）

在第一步驟中，大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY、 LacA、 ackA-pta、 ldhA及 poxB基因及包含 wbbK與 wcaN之間的所有基因且包括 wbbK及 wcaN的O-抗原簇的剔除。在下一步驟中，突變菌株進一步經含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）的兩個複本、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 47之來自大腸桿菌的乙醯基-輔酶A合成酶（acs）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）及具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入及表現質體修飾以表現三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的三個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。實驗證明，新穎菌株生產唾液酸（Neu5Ac）及6'-SL且在培養期間不遭受任何基因體或質體DNA不穩定性或重組。 實施例 7. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 3' - 唾液酸基乳糖 （ 3'-SL ）

如實施例2中所描述，大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾用於唾液酸及3'-唾液酸基乳糖生產，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）的兩個複本、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）及具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入及表現質體修飾以表現三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 17之來自多殺性巴氏桿菌的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶PmultST3的三個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 8. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 3' - 唾液酸基乳糖 （ 3'-SL ）

如實施例2中所描述，大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾用於唾液酸及3'-唾液酸基乳糖生產，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）的兩個複本、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）及具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經具有持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾，以表現具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶NeuA的兩個複本，及具有SEQ ID NO 17之來自多殺性巴氏桿菌的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶PmultST3的兩個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。實驗證明，新穎菌株生產0.64 g/L 3'-SL且在培養期間不遭受任何基因體或質體DNA不穩定性或重組。 實施例 9. 分批補料醱酵中突變大腸桿菌 6'-SL 生產菌株之評估

在分批補料醱酵程序中評估如實施例4及6中所描述之突變大腸桿菌菌株。如實施例2中所描述，在生物反應器規模下進行分批補料醱酵。蔗糖用作碳源且乳糖作為前驅物添加至分批培養基中。未將唾液酸（Neu5Ac）添加至醱酵程序中。與本文所描述且其中僅在培養結束時（亦即如本文所描述之72小時）獲取最終樣品的培養實驗形成對比，在醱酵程序期間之若干時間點處獲取常規培養液樣品，且如實施例2中所描述，使用UPLC來量測該等時間點中之各者處唾液酸（Neu5Ac）及6'-唾液酸基乳糖的生產。實驗證明，例如在分批階段結束時及在分批補料階段期間獲取之培養液樣品包含唾液酸生產以及6'-唾液酸基乳糖及未經修飾之乳糖。在分批補料階段結束時獲取之培養液樣品包含6'-唾液酸基乳糖，且幾乎不包含或包含極低濃度之Neu5Ac，且幾乎不包含或包含極低濃度之未經修飾之乳糖，證明幾乎所有或所有前驅物乳糖經生產6'-SL之突變細胞之醱酵期間生產的幾乎所有或所有Neu5Ac修飾。實驗進一步顯示突變菌株在培養期間不遭受任何基因體或質體DNA不穩定性或重組。 實施例 10. 分批補料醱酵中突變大腸桿菌 3'-SL 生產菌株之評估

在分批補料醱酵程序中評估如實施例5、7及8中所描述之突變大腸桿菌菌株。如實施例2中所描述，在生物反應器規模下進行分批補料醱酵。蔗糖用作碳源且乳糖作為前驅物添加至分批培養基中。未將唾液酸（Neu5Ac）添加至醱酵程序中。與本文所描述且其中僅在培養結束時（亦即如本文所描述之72小時）獲取最終樣品的培養實驗形成對比，在醱酵程序期間之若干時間點處獲取常規培養液樣品，且如實施例2中所描述，使用UPLC來量測該等時間點中之各者處唾液酸（Neu5Ac）及3'-唾液酸基乳糖的生產。 實施例 11. 用經修飾之大腸桿菌宿主生產包含 6'-SL 、 LN3 、 唾液酸化 LN3 、 LNnT 及 LSTc 之寡醣混合物

如實施例6中所描述經修飾用於唾液酸生產（Neu5Ac）及6'-唾液酸基乳糖之大腸桿菌宿主進一步經包含以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾：具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（LgtA）及具有SEQ ID NO 38之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（LgtB），以生產包含6'-SL、LN3、LNnT及LSTc（Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖及乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 12. 用經修飾之大腸桿菌宿主生產寡醣混合物 LN3 、 唾液酸化 LN3 、 LNT 、 3'-SL 及 LSTa

如實施例8中所描述經修飾用於唾液酸生產（Neu5Ac）及3'-唾液酸基乳糖之大腸桿菌宿主進一步經包含以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾：具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（LgtA）及具有SEQ ID NO 37之來自大腸桿菌O55:H7的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（wbgO），以生產包含LN3、3'-唾液酸化LN3（Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）LNT、3'-SL及LSTa（Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖及乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 13. 用經修飾之大腸桿菌宿主生產包含 LN3 、 唾液酸化 LN3 、 LNnT 、 3'-SL 及 LSTd 之寡醣混合物

如實施例8中所描述經修飾用於唾液酸生產（Neu5Ac）及3'-唾液酸基乳糖之大腸桿菌宿主進一步經包含以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾：具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（LgtA）及具有SEQ ID NO 38之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（LgtB），以生產包含3'-SL、LN3、3'-唾液酸化LN3（Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、LNnT及LSTd（Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖及乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 14. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 6' - 唾液酸基乳糖 （ 6' -SL ）

如實施例2中所描述，大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾用於唾液酸及6'-唾液酸基乳糖生產，包含大腸桿菌 nagA、nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 10之來自大腸桿菌的磷酸葡萄糖胺變位酶（glmM）、具有SEQ ID NO 11之來自大腸桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶（glmU）、具有SEQ ID NO 12之來自空腸彎曲桿菌的UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（NeuC）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）及具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入及表現質體修飾以表現三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的三個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 15. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 6' - 唾液酸基乳糖 （ 6' -SL ）

如實施例2中所描述，大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾用於唾液酸及6'-唾液酸基乳糖生產，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 10之來自大腸桿菌的磷酸葡萄糖胺變位酶（glmM）、具有SEQ ID NO 11之來自大腸桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶（glmU）、具有SEQ ID NO 13之來自小鼠（C57BL/6J品系）的雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯基甘露糖胺激酶、具有SEQ ID NO 14之來自互養棍狀菌屬PtaU1.Bin058的N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶、具有SEQ ID NO 15之來自候選種趨磁桑葚狀菌屬HK-1的N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）及具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入及表現質體修飾以表現三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的三個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 16. 用經修飾之釀酒酵母菌株生產 6' - 唾液酸基乳糖 （ 6' -SL ）

如實施例3中所描述，釀酒酵母菌株經pRS420衍生酵母表現質體調適用於唾液酸（Neu5Ac）及唾液酸化乳糖生產，該質體包含TRP1選擇標記及以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本；如例如以下者中之任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU之大腸桿菌基因，或來自戀臭假單胞菌之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL，如WO18122225中所描述；具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）；具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）；三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成；具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的三個複本；及具有SEQ ID NO 40之乳酸克魯維酵母的乳糖透過酶（LAC12）。根據實施例3中所提供之培養條件，在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Trp缺陷型培養基上評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 17. 用經修飾之釀酒酵母宿主生產包含 6'-SL 、 LN3 、 唾液酸化 LN3 、 LNnT 及 LSTc 之寡醣混合物

如實施例16中所描述之突變釀酒酵母宿主進一步經包含HIS3選擇標記及以下者之持續型轉錄單元的第二pRS420衍生酵母表現質體修飾：具有SEQ ID NO 39之來自大腸桿菌的galE、具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（lgtA）及具有SEQ ID NO 38之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（lgtB），以生產包含6'-SL、LN3、LNnT及LSTc（Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物。根據實施例3中所提供之培養條件，在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Trp-His缺陷型培養基上評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 18. 用經修飾之釀酒酵母菌株生產 3' - 唾液酸基乳糖 （ 3' -SL ）

如實施例3中所描述，釀酒酵母菌株經pRS420衍生酵母表現質體調適用於唾液酸（Neu5Ac）及唾液酸化乳糖生產，該質體包含TRP1選擇標記及以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本；如例如以下者中之任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU之大腸桿菌基因，或來自戀臭假單胞菌之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL，如WO18122225中所描述；具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）；具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）；三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成；具有SEQ ID NO 17之來自多殺性巴氏桿菌的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶PmultST3的三個複本；及具有SEQ ID NO 40之乳酸克魯維酵母的乳糖透過酶（LAC12）。根據實施例3中所提供之培養條件，在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Trp缺陷型培養基上評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 19. 用經修飾之釀酒酵母宿主生產包含 LN3 、 唾液酸化 LN3 、 LNT 、 3'-SL 及 LSTa 之 寡醣混合物

如實施例18中所描述之突變釀酒酵母宿主進一步經包含HIS3選擇標記及以下者之持續型轉錄單元的第二pRS420衍生酵母表現質體修飾：具有SEQ ID NO 39之來自大腸桿菌的galE、具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（lgtA）及具有SEQ ID NO 37之來自大腸桿菌O55:H7的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（wbgO），以生產包含LN3, 3'-唾液酸化LN3（Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、LNT、3'-SL及LSTa（Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物。根據實施例3中所提供之培養條件，在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Trp-His缺陷型培養基上評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 20. 用經修飾之釀酒酵母宿主生產包含 LN3 、 唾液酸化 LN3 、 LNnT 、 3'-SL 及 LSTd 之寡醣混合物

如實施例18中所描述之突變釀酒酵母宿主進一步經包含HIS3選擇標記及以下者之持續型轉錄單元的第二pRS420衍生酵母表現質體修飾：具有SEQ ID NO 39之來自大腸桿菌的galE、具有SEQ ID NO 36之來自腦膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（lgtA）及具有SEQ ID NO 38之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（lgtB），以生產包含3'-SL、LN3、3'-唾液酸化LN3（Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、LNnT及LSTd（Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物。根據實施例3中所提供之培養條件，在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Trp-His缺陷型培養基上評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 21. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 6' - 唾液酸基乳糖 （ 6' -SL ）

在第一步驟中，大腸桿菌K-12菌株MG1655如實施例2中所描述經修飾，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）的兩個複本、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 47之來自大腸桿菌的乙醯基-輔酶A合成酶（acs）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）、具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶及具有SEQ ID NO 49之來自大腸桿菌的膜運輸蛋白entS的兩個複本。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入及表現質體修飾以表現三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的三個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 22. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 6' - 唾液酸基乳糖 （ 6' -SL ）

在第一步驟中，大腸桿菌K-12菌株MG1655如實施例2中所描述經修飾，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）的兩個複本、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 47之來自大腸桿菌的乙醯基-輔酶A合成酶（acs）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）、具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶、具有SEQ ID NO 50之來自大腸桿菌的膜運輸蛋白MdfA及具有SEQ ID NO 49之來自大腸桿菌的膜運輸蛋白entS的兩個複本。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入及表現質體修飾以表現三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 19之來自美人魚發光菌的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdbST的三個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 23. 用經修飾之大腸桿菌菌株生產 3' - 唾液酸基乳糖 （ 3'-SL ）

在第一步驟中，大腸桿菌K-12菌株MG1655如實施例2中所描述經修飾，包含大腸桿菌 nagA、 nagB、 nanA、 nanT、 nanE、 nanK、 LacZ、 LacY及 LacA基因之剔除及含有以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）、具有SEQ ID NO 08之來自大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白（nanT）、具有SEQ ID NO 06之來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）的兩個複本、具有SEQ ID NO 07之來自釀酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）的兩個複本、具有SEQ ID NO 09之來自卵形擬桿菌的N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）、具有SEQ ID NO 01之來自腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）、具有SEQ ID NO 47之來自大腸桿菌的乙醯基-輔酶A合成酶（acs）、具有SEQ ID NO 23之來自大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白（CscB）、具有SEQ ID NO 24之來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）、具有SEQ ID NO 25之來自青春雙叉桿菌的蔗糖磷酸化酶、具有SEQ ID NO 50之來自大腸桿菌的膜運輸蛋白MdfA的兩個複本及具有SEQ ID NO 49之來自大腸桿菌的膜運輸蛋白entS的兩個複本。由此獲得之突變大腸桿菌菌株進一步經持續型轉錄單元之基因體嵌入及表現質體修飾以表現三種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶同功蛋白質，其由具有SEQ ID NO 03之來自空腸彎曲桿菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04之來自流感嗜血桿菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05之來自多殺性巴氏桿菌的NeuA酶組成，及具有SEQ ID NO 48之來自多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶的三個複本。根據實施例2中所提供之培養條件在生長實驗中評估新穎菌株，其中培養基含有30 g/L蔗糖及20 g/L乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 24. 枯草桿菌材料及方法 培養基

使用兩種不同培養基，亦即富魯利亞培養液（LB）及搖瓶用基本培養基（minimal medium for shake flask；MMsf）。基本培養基使用痕量元素混合物。

痕量元素混合物由0.735 g/L CaCl2.2H2O、0.1 g/L MnCl2.2H2O、0.033 g/L CuCl2.2H2O、0.06 g/L CoCl2.6H2O、0.17 g/L ZnCl2、0.0311 g/L H3BO4、0.4 g/L Na2EDTA.2H2O及0.06 g/L Na2MoO4組成。檸檬酸鐵溶液含有0.135 g/L FeCl3.6H2O、1 g/L檸檬酸鈉（Hoch 1973 PMC1212887）。

魯利亞培養液（LB）培養基由1%胰腖蛋白腖（Difco，Erembodegem, Belgium）、0.5%酵母萃取物（Difco）及0.5%氯化鈉（VWR，Leuven, Belgium）組成。魯利亞培養液瓊脂（Luria Broth agar；LBA）盤由LB培養基組成，其中添加12 g/L瓊脂（Difco，Erembodegem, Belgium）。

搖瓶用基本培養基（MMsf）實驗含有2.00 g/L (NH4)2SO4、7.5 g/L KH2PO4、17.5 g/L K2HPO4、1.25 g/L檸檬酸鈉、0.25 g/L MgSO4.7H2O、0.05 g/L色胺酸、10至30 g/L葡萄糖或另一碳源（包括但不限於實施例中指定之果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油及麥芽三糖）、10 ml/L痕量元素混合物及10 ml/L檸檬酸鐵溶液。用1 M KOH將培養基設定為pH 7。視實驗而定，可添加乳糖、LNB或LacNAc。

藉由高壓處理（121℃，21'）對複合培養基（例如LB）進行滅菌及藉由過濾（0.22 µm Sartorius）對基本培養基進行滅菌。必要時，藉由添加抗生素（例如吉歐黴素（zeocin）（20 mg/L））使培養基具有選擇性。菌株、質體及突變

枯草桿菌168，可獲自於芽孢桿菌基因儲備中心（美國俄亥俄州（Ohio, USA））。

經由Cre/lox之基因缺失的質體如由Yan等人（Appl. & Environm. Microbial., 2008年9月, 第5556-5562頁）所描述進行構築。基因破壞經由與線性DNA同源重組及經由電穿孔轉形進行，如Xue等人（J. Microb. Meth. 34 (1999) 183-191）所描述。基因剔除之方法由Liu等人（Metab. Engine. 24 (2014) 61-69）描述。此方法使用目標基因之上游及下游的1000 bp同源性。

如由Popp等人（Sci. Rep., 2017, 7, 15158）所描述之整合載體用作表現載體且必要時可進一步用於基因體整合。適用於表現之啟動子可衍生自部分儲存庫（iGem）：序列id：Bba_K143012、Bba_K823000、Bba_K823002或Bba_K823003。選殖可使用吉布森組裝（Gibson Assembly）、金門組裝（Golden Gate assembly）、Cliva組裝、LCR或限制接合來進行。

在生產基於乳糖之寡醣之一實施例中，產生枯草桿菌突變菌株以含有編碼乳糖輸入體（importer）之基因（諸如具有SEQ ID NO 22之大腸桿菌lacY）。在2'FL、3FL及/或diFL生產之一實施例中，將α-1,2-及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶表現構築體另外添加至菌株。在LN3生產之一實施例中，將包含半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtA（SEQ ID NO 236））之持續型轉錄單元另外添加至菌株。在LNT生產之一實施例中，生產LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（如例如來自大腸桿菌O55:H7之WbgO（SEQ ID NO 37））的持續型轉錄單元修飾。在LNnT生產之一實施例中，生產LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB（SEQ ID NO 38））的持續型轉錄單元修飾。

在唾液酸生產之一實施例中，突變枯草桿菌菌株藉由過度表現果糖-6-P-胺基轉移酶如天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID P0CI73）以增強胞內葡萄糖胺-6-磷酸池來產生。另外，基因nagA、nagB及gamA之酶活性藉由基因剔除破壞且如例如釀酒酵母之葡萄糖胺-6-P-胺基轉移酶（SEQ ID NO 07）、如例如來自卵形擬桿菌之N-乙醯基葡萄糖胺-2-表異構酶（SEQ ID NO 09）及一或多種N-乙醯基神經胺酸合酶，如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌（SEQ ID NO 01）、空腸彎曲桿菌（SEQ ID NO 02）的一或兩個複本過度表現於基因體上。為允許唾液酸化寡醣生產，生產唾液酸之菌株進一步經持續型轉錄單元修飾，該持續型轉錄單元包含N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，如例如來自空腸彎曲桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 03）、來自流感嗜血桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 04）及來自多殺性巴氏桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 05）；及β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶，如例如來自多殺性巴氏桿菌之PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）或由UniProt ID Q9CLP3之胺基酸殘基1至268組成具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶活性的類PmultST3多肽（SEQ ID NO 17），或來自腦膜炎奈瑟氏菌之NmeniST3（SEQ ID NO 18）或來自多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株之PmultST2（GenBank NO. AAK02592.1）的一或多個複本；β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶，如例如來自美人魚發光菌之PdST6（UniProt ID O66375）或由UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497組成具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶活性的類PdST6多肽（SEQ ID NO 19）或來自發光菌屬JT-ISH-224之P-JT-ISH-224-ST6（UniProt ID A8QYL1）或由UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514組成具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶活性之類P-JT-ISH-224-ST6多肽（SEQ ID NO 20）及/或如例如來自小鼠之α-2,8-唾液酸基轉移酶（SEQ ID NO 21）。異源及同源表現

需要表現之基因，無論其來自質體或來自基因體，均以合成方式經以下公司中之一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。

可藉由使密碼子使用最佳化為表現宿主之密碼子使用來進一步促進表現。使用供應商之工具使基因最佳化。培養條件

96孔微量滴定盤實驗之預培養始於冷凍小瓶或始於LB盤之單一菌落，於150 µL LB中進行，且在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育隔夜。此培養物用作96孔正方形微量滴定盤之接種物，在400 µL MMsf培養基情況下藉由稀釋400倍。使各菌株在96孔盤之多個孔中作為生物學重複生長。此等最終96孔培養盤接著在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育72小時或更短或更長。在培養實驗結束時，自各孔獲取樣品以量測上清液濃度（胞外糖濃度，在短暫離心細胞5分鐘後），或在短暫離心細胞前藉由使培養液在90℃下沸騰15分鐘或在60℃下沸騰60分鐘（=全培養液濃度，胞內及胞外糖濃度，如本文所定義）。

此外，對培養物進行稀釋以量測600 nm下之光密度。藉由寡醣濃度除以生物質（以與參考菌株相比之相對百分比）來確定細胞性能指數或CPI。憑經驗確定生物質為在600 nm下量測之光密度之大致1/3。 實施例 25 . 使用經修飾之枯草桿菌宿主生產包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 3 ' SL 、 6 ' SL 、 3 ' S-2 ' FL 、 3 ' S-3-FL 、 6 ' S-2 ' FL 、 6 ' S-3-FL 之寡醣混合物

如實施例24中所描述，枯草桿菌菌株經 nagA、 nagB、 glmS及 gamA基因之基因體剔除及以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾：具有SEQ ID NO 22之來自大腸桿菌的乳糖透過酶（LacY）；來自大腸桿菌W之蔗糖運輸蛋白（CscB）（SEQ ID NO 23）；來自運動醱酵單胞菌之果糖激酶（Frk）（SEQ ID NO 24）；來自青春雙叉桿菌之蔗糖磷酸化酶（BaSP）（SEQ ID NO 25）；天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID P0CI73）；來自釀酒酵母之葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶GNA1（SEQ ID NO 07）的兩個複本；來自大腸桿菌之突變L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）（SEQ ID NO 06）；磷酸酶，如例如選自以下者之磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU之大腸桿菌基因，或來自戀臭假單胞菌之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL，如WO18122225中所描述；來自卵形擬桿菌之N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）（SEQ ID NO 09）；來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）（SEQ ID NO 01）；及N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶來自空腸彎曲桿菌之NeuA（SEQ ID NO 03）、來自流感嗜血桿菌之NeuA（SEQ ID NO 04）及來自多殺性巴氏桿菌之NeuA（SEQ ID NO 05）。在下一步驟中，菌株用表現質體轉形，該表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：由UniProt ID Q9CLP3之胺基酸殘基1至268組成具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶活性的類PmultST3多肽（如SEQ ID NO 17）之三個複本；及由UniProt ID O66375之胺基酸殘基108至497組成具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶活性的類PdST6多肽（SEQ ID NO 19）之三個複本。在另一步驟中，突變菌株經第二相容性表現質體轉形，該第二相容性表現質體包含具有SEQ ID NO 26之α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC及具有SEQ ID NO 27之α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT的持續型轉錄單元。在生長實驗中在包含乳糖之MMsf培養基上根據實施例24中所提供之培養條件，針對生產2'FL、3-FL、DiFL、3'SL、6'SL、3'S-2'FL、3'S-3-FL、6'S-2'FL、6'S-3-FL評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 26. 用經修飾之枯草桿菌宿主生產包含 3 ' SL 、 LN3 、 LNT 、 唾液酸化 LN3 及 LSTa 之 寡醣混合物

如實施例24中所描述，枯草桿菌菌株藉由 nagA、 nagB、 glmS及 gamA基因之基因體剔除及包含基因之持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾以用於LN3生產及在蔗糖上之生長，該等基因編碼來自大腸桿菌之乳糖透過酶（LacY）（SEQ ID NO 22）、天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID P0CI73）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶LgtA（SEQ ID NO 36）、來自大腸桿菌W之蔗糖運輸蛋白（CscB）（SEQ ID NO 23）、來自運動醱酵單胞菌之果糖激酶（Frk）（SEQ ID NO 24）及來自青春雙叉桿菌之蔗糖磷酸化酶（BaSP）（SEQ ID NO 25）。在下一步驟中，突變菌株進一步經包含來自大腸桿菌O55:H7之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶WbgO（SEQ ID NO 37）的持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾以生產LNT。突變枯草桿菌菌株進一步經包含以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾：來自釀酒酵母之葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶GNA1（SEQ ID NO 07）的兩個複本；來自大腸桿菌之突變L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）（SEQ ID NO 06）的兩個複本；磷酸酶，如例如選自以下者之磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU之大腸桿菌基因，或來自戀臭假單胞菌之PsMupP，來自釀酒酵母之ScDOG1，及來自枯草桿菌之BsAraL，如WO18122225中所描述；來自卵形擬桿菌之N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）（SEQ ID NO 09）；來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基神經胺酸合酶（NeuB）（SEQ ID NO 01）；N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶來自空腸彎曲桿菌之NeuA（SEQ ID NO 03）、來自流感嗜血桿菌之NeuA（SEQ ID NO 04）及來自多殺性巴氏桿菌之NeuA（SEQ ID NO 05）；及由UniProt ID Q9CLP3之胺基酸殘基1至268組成具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶活性的類PmultST3多肽（如SEQ ID NO 17）的三個複本。在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之MMsf培養基上根據實施例24中提供之培養條件，針對生產包含3'SL、LN3、唾液酸化LN3、LNT及LSTa（Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之混合物評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 27. 麩胺酸棒狀桿菌材料及方法 培養基

使用兩種不同培養基，亦即富胰腖-酵母萃取物（tryptone-yeast extract；TY）培養基及搖瓶用基本培養基（MMsf）。基本培養基使用1000×儲備痕量元素混合物。

痕量元素混合物由10 g/L CaCl2、10 g/L FeSO4.7H2O、10 g/L MnSO4.H2O、1 g/L ZnSO4.7H2O、0.2 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2.6H2O、0.2 g/L生物素（pH 7.0）及0.03 g/L原兒茶酸組成。

搖瓶用基本培養基（MMsf）實驗含有20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4.7H2O、42 g/L MOPS、10至30 g/L葡萄糖或另一碳源（包括但不限於實施例中指定之果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油及麥芽三糖）及1 ml/L痕量元素混合物。視實驗而定，可將乳糖、LNB及/或LacNAc添加至培養基中。

TY培養基由1.6%胰腖（Difco，Erembodegem, Belgium）、1%酵母萃取物（Difco）及0.5%氯化鈉（VWR，Leuven, Belgium）組成。TY瓊脂（TY agar；TYA）盤由TY培養基組成，其中添加12 g/L瓊脂（Difco，Erembodegem, Belgium）。

藉由高壓處理（121℃，21'）對複合培養基（例如TY）進行滅菌及藉由過濾（0.22 µm Sartorius）對基本培養基進行滅菌。必要時，藉由添加抗生素（例如康黴素、安比西林）使培養基具有選擇性。菌株及突變

麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032可獲自於美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection）。

如藉由Suzuki等人（Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005年4月, 67(2):225-33）所描述基於Cre/loxP技術之整合質體載體及如藉由Okibe等人（Journal of Microbiological Methods 85, 2011, 155-163）所描述之溫度敏感穿梭載體經構築用於基因缺失、突變及插入。用於（異源）基因表現之適合啟動子可衍生自Yim等人（Biotechnol. Bioeng., 2013年11月, 110(11):2959-69）。選殖可使用吉布森組裝、金門組裝、Cliva組裝、LCR或限制接合來進行。

在生產基於乳糖之寡醣之一實施例中，產生麩胺酸棒狀桿菌突變菌株以含有編碼乳糖輸入體之基因（諸如具有SEQ ID NO 22之大腸桿菌lacY）。在2'FL、3FL及/或diFL生產之一實施例中，將α-1,2-及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶表現構築體另外添加至菌株。

在LN3生產之一實施例中，將包含半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtA（SEQ ID NO 36））之持續型轉錄單元另外添加至菌株。在LNT生產之一實施例中，生產LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（如例如來自大腸桿菌O55:H7之WbgO（SEQ ID NO 37））的持續型轉錄單元修飾。在LNnT生產之一實施例中，生產LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB（SEQ ID NO 38））的持續型轉錄單元修飾。

在唾液酸生產之一實施例中，麩胺酸棒狀桿菌菌株藉由過度表現果糖-6-P-胺基轉移酶如天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID Q8NND3）以增強胞內葡萄糖胺-6-磷酸池來產生。另外，基因nagA、nagB及gamA之酶活性藉由基因剔除破壞且如例如釀酒酵母之葡萄糖胺-6-P-胺基轉移酶（SEQ ID NO 07）、如例如來自卵形擬桿菌之N-乙醯基葡萄糖胺-2-表異構酶（SEQ ID NO 09）及如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基神經胺酸合酶（SEQ ID NO 01）的一或兩個複本過度表現於基因體上。為允許唾液酸化寡醣生產，生產唾液酸之菌株進一步經持續型轉錄單元修飾，該持續型轉錄單元包含兩種或更多種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，如例如來自空腸彎曲桿菌之NeuA（SEQ ID NO 03）、來自流感嗜血桿菌之NeuA（SEQ ID NO 04）及來自多殺性巴氏桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 05）；及β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶，如例如來自多殺性巴氏桿菌之PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）或由UniProt ID Q9CLP3之胺基酸殘基1至268組成具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶活性的類PmultST3多肽（SEQ ID NO 17），或來自腦膜炎奈瑟氏菌之NmeniST3（SEQ ID NO 18）或來自多殺性巴氏桿菌多殺性亞種Pm70菌株之PmultST2（GenBank NO. AAK02592.1）的一或多個複本；β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶，如例如來自美人魚發光菌之PdST6（UniProt ID O66375）或由UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497組成具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶活性的類PdST6多肽（SEQ ID NO 19）或來自發光菌屬JT-ISH-224之P-JT-ISH-224-ST6（UniProt ID A8QYL1）或由UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514組成具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶活性之類P-JT-ISH-224-ST6多肽（SEQ ID NO 20）及/或如例如來自小鼠之α-2,8-唾液酸基轉移酶（SEQ ID NO 21）。異源及同源表現

96孔微量滴定盤實驗之預培養始於冷凍小瓶或始於TY盤之單一菌落，於150 µL TY中進行，且在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育隔夜。此培養物用作96孔正方形微量滴定盤之接種物，在400 µL MMsf培養基情況下藉由稀釋400倍。使各菌株在96孔盤之多個孔中作為生物學重複生長。此等最終96孔培養盤接著在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育72小時或更短或更長。在培養實驗結束時，自各孔獲取樣品以量測上清液濃度（胞外糖濃度，在短暫離心細胞5分鐘後），或在短暫離心細胞前藉由使培養液在60℃下沸騰15分鐘（=全培養液濃度，胞內及胞外糖濃度，如本文所定義）。

此外，對培養物進行稀釋以量測600 nm下之光密度。藉由完全培養液中量測之寡醣濃度除以生物質（以與參考菌株相比之相對百分比）來確定細胞性能指數或CPI。憑經驗確定生物質為在600 nm下量測之光密度之大致1/3。 實施例 28. 用經修飾之麩胺酸棒狀桿菌宿主生產包含 LN3 、 唾液酸化 LN3 、 6'SL 、 LNnT 及 LSTc 之寡醣混合物

如實施例27中所描述，麩胺酸棒狀桿菌菌株藉由 ldh、 cgl2645、 nagB、 gamA及 nagA基因之基因體剔除及包含基因之持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾以用於LN3生產及在蔗糖上之生長，該等基因編碼來自大腸桿菌之乳糖透過酶（LacY）（SEQ ID NO 22）、天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID Q8NND3）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶LgtA（SEQ ID NO 36）、來自大腸桿菌W之蔗糖運輸蛋白（CscB）（SEQ ID NO 23）、來自運動醱酵單胞菌之果糖激酶（Frk）（SEQ ID NO 24）及來自青春雙叉桿菌之蔗糖磷酸化酶（BaSP）（SEQ ID NO 25）。在下一步驟中，突變菌株進一步經包含來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB（SEQ ID NO 38）的持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾以生產LNnT。在下一步驟中，突變菌株進一步經包含以下者之持續型轉錄單元的基因體嵌入修飾以生產唾液酸：天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID Q8NND3）、來自釀酒酵母之葡萄糖胺-6-P-胺基轉移酶（SEQ ID NO 07）、來自卵形擬桿菌之乙醯基葡萄糖胺乙醯基葡萄糖胺-2-表異構酶（SEQ ID NO 09）及來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基神經胺酸合酶（SEQ ID NO 01）。在下一步驟中，新穎菌株經包含以下者之持續型轉錄單元的表現質體轉形：來自空腸彎曲桿菌之NeuA（SEQ ID NO 03）、來自流感嗜血桿菌之NeuA（SEQ ID NO 04）及來自多殺性巴氏桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 05）及來自美人魚發光菌之β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdST6（UniProt ID O66375）。在生長實驗中在包含乳糖之MMsf培養基上根據實施例27中提供之培養條件，針對生產包含LN3、6'-唾液酸化LN3（Neu5Ac-a2,6-(GlcNAc-b1,3)-Gal-b1,4-Glc）、6'SL、LNnT及LSTc之寡醣混合物評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 29. 使用經修飾之麩胺酸棒狀桿菌宿主生產包含 3'SL 、 6'SL 、 LNB 、 3'- 唾液酸化 LNB 及 6'- 唾液酸化 LNB 之寡醣混合物

如實施例27中所描述，麩胺酸棒狀桿菌菌株藉由 ldh、 cgl2645、 nagB、 gamA及 nagA基因之基因體剔除及包含基因之持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾，該等基因編碼來自大腸桿菌之乳糖透過酶（LacY）（SEQ ID NO 22）、來自大腸桿菌O55:H7具有SEQ ID NO 37之WbgO、來自大腸桿菌具有SEQ ID NO 39之galE、天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID Q8NND3）、具有SEQ ID NO 06之glmS*54、來自釀酒酵母之葡萄糖胺-6-P-胺基轉移酶（SEQ ID NO 07）、來自卵形擬桿菌之N-乙醯基葡萄糖胺-2-表異構酶（SEQ ID NO 09）及來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基神經胺酸合酶（SEQ ID NO 01）。在下一步驟中，新穎菌株用包含以下者之持續型轉錄單元的表現質體轉形：來自空腸彎曲桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 03）、來自流感嗜血桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 04）及來自多殺性巴氏桿菌之NeuA酶（SEQ ID NO 05）、來自多殺性巴氏桿菌之β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）及來自美人魚發光菌之β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶PdST6（UniProt ID O66375）。在生長實驗中在包含乳糖及葡萄糖之MMsf培養基上根據實施例27中所提供之培養條件，針對生產包含3'SL、6'SL、LNB、3'-唾液酸化LNB（3'SLNB）及6'-唾液酸化LNB（6'SLNB）之寡醣混合物評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 30. 萊茵衣藻 （ Chlamydomonas reinhardtii ） 材料及方法 培養基

將萊茵衣藻細胞在Tris-乙酸-磷酸（Tris-acetate-phosphate；TAP）培養基（pH 7.0）中培養。TAP培養基使用1000×儲備赫特納氏（Hutner's）痕量元素混合物。赫特納氏痕量元素混合物由50 g/L Na2EDTA.H2O（Titriplex III）、22 g/L ZnSO4.7H2O、11.4 g/L H3BO3、5 g/L MnCl2.4H2O、5 g/L FeSO4.7H2O、1.6 g/L CoCl2.6H2O、1.6 g/L CuSO4.5H2O及1.1 g/L (NH4)6MoO3組成。

TAP培養基含有2.42 g/L Tris（參(羥甲基)胺基甲烷）、25 mg/L鹽儲備溶液、0.108 g/L K2HPO4、0.054 g/L KH2PO4及1.0 mL/L冰醋酸。鹽儲備溶液由15 g/L NH4CL、4 g/L MgSO4.7H2O及2 g/L CaCl2.2H2O組成。作為醣合成之前驅物及/或受體，可添加如例如半乳糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖、乳糖、LacNAc、LNB之化合物。藉由高壓處理（121℃，21'）來對培養基進行滅菌。對於斜面瓊脂上之培養物，使用含有1%瓊脂（具有經純化高強度，1000 g/cm2）之TAP培養基。菌株、質體及突變

萊茵衣藻野生型菌株21gr（CC-1690，野生型，mt+）、6145C（CC-1691，野生型，mt－）、CC-125（137c，野生型，mt+）、CC-124（137c，野生型，mt－）可購自美國明尼蘇達大學（University of Minnesota, U.S.A.）之衣藻屬資源中心（Chlamydomonas Resource Center）（https://www.chlamycollection.org）。

表現質體源自pSI103，如可購自衣藻屬資源中心。選殖可使用吉布森組裝、金門組裝、Cliva組裝、LCR或限制接合來進行。用於（異源）基因表現之適合啟動子可衍生自例如Scranton等人（Algal Res. 2016, 15: 135-142）。靶向基因修飾（如基因剔除或基因置換）可使用如例如藉由Jiang等人（Eukaryotic Cell 2014, 13(11): 1465-1469）所描述之Crispr-Cas技術進行。

經由電穿孔之轉形係如藉由Wang等人（Biosci. Rep. 2019, 39: BSR2018210）所描述進行。在恆定通氣及光強度為8000 Lx之連續光照下，使細胞在液體TAP培養基中生長，直至細胞密度達到1.0-2.0×107個細胞/毫升。接著，將細胞以1.0×106個細胞/毫升之濃度接種至新鮮液體TAP培養基中且在連續光照下生長18-20小時，直至細胞密度達到4.0×106個細胞/毫升。接下來，將細胞藉由在室溫下以1250 g離心5分鐘收集，洗滌且用含有60 mM山梨糖醇（Sigma，美國）之預冷卻液體TAP培養基再懸浮，且冰凍10分鐘。接著，將250 µL細胞懸浮液（對應於5.0×107個細胞）置放於具有100 ng質體DNA（400 ng/mL）之預冷卻0.4 cm電穿孔比色管中。使用BTX ECM830電穿孔裝置（1575 Ω，50 μFD）用6個500 V脈衝進行電穿孔，各脈衝具有4 ms之脈衝長度及100 ms之脈衝間隔時間。在電穿孔之後，立即將比色管置放於冰上10分鐘。最後，將細胞懸浮液轉移至含有10 mL含60 mM山梨糖醇之新鮮液體TAP培養基的50 ml錐形離心管中，以便在暗光下藉由緩慢振盪隔夜恢復。在隔夜恢復之後，將細胞再收集且用澱粉包埋方法接種至含有安比西林（100 mg/L）或氯黴素（100 mg/L）之選擇性1.5%（w/v）瓊脂-TAP盤上。接著在23+-0.5℃下在光強度為8000 Lx之連續照明下培育盤。5-7天後分析細胞。

在生產UDP-半乳糖之一實施例中，萊茵衣藻細胞經包含基因之轉錄單元修飾，該等基因編碼如例如阿拉伯芥（ Arabidopsis thaliana）之半乳糖激酶（KIN，UniProt ID Q9SEE5）及UDP-糖焦磷酸化酶，如例如來自阿拉伯芥之USP（UniProt ID Q9C5I1）。

在LN3生產之一實施例中，持續型轉錄包含半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtA（SEQ ID NO 36）。在LNT生產之一實施例中，生產LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（如例如來自大腸桿菌O55:H7之WbgO（SEQ ID NO 37））的持續型轉錄單元修飾。在LNnT生產之一實施例中，生產LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB（SEQ ID NO 38））的持續型轉錄單元修飾。

在生產GDP-岩藻糖之一實施例中，萊茵衣藻細胞經用於如例如來自阿拉伯芥之GDP-岩藻糖合酶（GER1，UniProt ID O49213）之轉錄單元修飾。

在岩藻糖基化之一實施例中，萊茵衣藻細胞可經包含以下者之持續型轉錄單元的表現質體修飾：α-1,2-岩藻糖基轉移酶，如例如來自幽門螺旋桿菌之HpFutC（SEQ ID NO 26）及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶，如例如來自幽門螺旋桿菌之HpFucT（SEQ ID NO 27）。

在CMP-唾液酸合成之一實施例中，萊茵衣藻細胞經以下者之持續型轉錄單元修飾：一或多種UDP- N-乙醯基葡萄糖胺-2-表異構酶/ N-乙醯基甘露糖胺激酶，如例如來自智人之GNE（UniProt ID Q9Y223）或包含R263L突變之人類GNE多肽的突變形式，或來自小鼠之GNE（UniProt ID Q91WG8）；一或多種N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶，如例如來自智人之NANS（UniProt ID Q9NR45）、來自假單胞菌屬UW4之NANS（UniProt ID K9NPH9）；及一或多種N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶，如例如來自智人之CMAS（UniProt ID Q8NFW8）。在生產唾液酸化寡醣之一實施例中，萊茵衣藻細胞經CMP-唾液酸運輸蛋白修飾，該運輸蛋白如例如來自小鼠之CST（UniProt ID Q61420）及選自如例如智人、小鼠、褐鼠之物種的高爾基體定位之唾液酸基轉移酶。異源及同源表現

在23 +/- 0.5℃下，在14/10 h光/暗循環下以8000 Lx之光強度，在選擇性TAP-瓊脂盤中培養萊茵衣藻細胞。在培養5至7天之後分析細胞。

對於高密度培養，細胞可在封閉系統中培養，封閉系統如例如Chen等人（Bioresour. Technol. 2011, 102: 71-81）及Johnson等人（Biotechnol. Prog. 2018, 34: 811-827）所描述之豎直或水平管光生物反應器、攪拌槽光生物反應器或平板光生物反應器。 實施例 31 . 在突變萊茵衣藻細胞中生產包含唾液酸化 LNB 及唾液酸化 LacNAc 結構之寡醣混合物

萊茵衣藻細胞如實施例30中所描述經持續型轉錄單元之基因體嵌入工程改造以用於生產CMP-唾液酸，該等持續型轉錄單元包含來自小鼠之GNE（UniProt ID Q91WG8）及與天然人類GNE多肽之不同之處在於R263L突變的人類GNE（UniProt ID UniProt ID Q9Y223）之突變形式、來自智人之N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶NANS（UniProt ID Q9NR45）及來自智人之N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶CMAS（UniProt ID Q8NFW8）。在下一步驟中，細胞經持續型轉錄單元之基因體嵌入修飾，該等持續型轉錄單元包含來自小鼠之CMP-唾液酸運輸蛋白CST（UniProt ID Q61420）、來自褐鼠之α-2,3-唾液酸基轉移酶（UniProt ID P61943及E9PSJ1）及來自褐鼠之α-2,6-唾液酸基轉移酶（UniProt ID P13721）。在最終步驟中，細胞用包含阿拉伯芥基因之持續型轉錄單元之基因體嵌入轉形，該等基因編碼半乳糖激酶（KIN，UniProt ID Q9SEE5）及UDP-糖焦磷酸化酶（USP）（UniProt ID Q9C5I1）、以及具有SEQ ID NO 37之來自大腸桿菌O55:H7的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶WbgO及具有SEQ ID NO 38之來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB。在培養實驗中在包含半乳糖、葡萄糖及N-乙醯基葡萄糖胺作為前驅物之TAP瓊脂盤上根據實施例30中提供之培養條件，針對生產包含3'-唾液酸基乳-N-二醣（3'SLNB）、6'-唾液酸基乳-N-二醣（6'SLNB）、3'-唾液酸基乳糖胺（3'SLacNAc）及6'-唾液酸基乳糖胺（6'SLacNAc）之寡醣混合物評估新穎菌株。培育5天之後，收集細胞，且在UPLC上分析醣生產。 實施例 32. 動物細胞材料及方法 自不同哺乳動物之脂肪組織分離間葉幹細胞

新鮮脂肪組織係獲自屠宰場（例如，牛、豬、綿羊、雞、鴨、鯰魚、蛇、蛙）或抽脂手術（例如，在人類之情況下，在簽署知情同意書之後）且保持在補充有抗生素之磷酸鹽緩衝鹽水中。進行脂肪組織之酶消化，之後進行離心以分離間葉幹細胞。將經分離之間葉幹細胞轉移至細胞培養燒瓶中且在標準生長條件（例如37℃，5% CO2）下生長。初始培養基包括DMEM-F12、RPMI及Alpha-MEM培養基（補充有15%胎牛血清）及1%抗生素。隨後在第一次繼代之後，培養基用補充有10%胎牛血清（fetal bovine serum；FBS）之培養基置換。舉例而言，Ahmad及Shakoori（2013, Stem Cell Regen Med. 9(2): 29- 36），其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，描述此實施例中所描述之方法之某些變化形式。自乳汁分離間葉幹細胞

此實施例說明自在無菌條件下自人類或任何其他哺乳動物（諸如本文所描述）收集之乳汁分離間葉幹細胞。將等體積的磷酸鹽緩衝生理食鹽水添加至稀釋乳汁中，接著離心20分鐘。將細胞沈澱用磷酸鹽緩衝生理食鹽水洗滌三次，且在標準培養條件下將細胞接種於細胞培養燒瓶中補充有10%胎牛血清及1%抗生素之DMEM-F12、RPMI及Alpha-MEM培養基中。舉例而言，Hassiotou等人（2012, Stem Cells. 30(10): 2164-2174），其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，描述此實施例中所描述之方法之某些變化形式。使用2D及3D培養系統分化幹細胞

經分離之間葉細胞可在2D及3D培養系統中分化成類乳腺上皮細胞及腔細胞。參見例如Huynh等人. 1991. Exp Cell Res. 197(2): 191 -199；Gibson等人. 1991, In Vitro Cell Dev Biol Anim. 27(7): 585-594；Blatchford等人. 1999; Animal Cell Technology': Basic & Applied Aspects, Springer, Dordrecht. 141-145；Williams等人. 2009, Breast Cancer Res 11(3): 26-43；及Arevalo等人. 2015, Am J Physiol Cell Physiol. 310(5): C348 - C356；其中之各者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。

對於2D培養，經分離細胞最初接種於培養盤中補充有10 ng/ml上皮生長因子及5 pg/ml胰島素之生長培養基中。在匯合時，將細胞用補充有2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素（100 U/ml青黴素，100 μg/ml鏈黴素）及5 pg/ml胰島素之生長培養基餵飼48小時。為誘發分化，將細胞用含有5 pg/ml胰島素、1 pg/ml皮質醇、0.65 ng/ml三碘甲狀腺素、100 nM地塞米松（dexamethasone）及1 pg/ml促乳素之完整生長培養基餵飼。24小時後，自完全誘導培養基移除血清。

對於3D培養，將經分離細胞用胰蛋白酶消化且在基質膠、玻尿酸或超低附著表面培養盤中培養六天，且藉由添加補充有10 ng/ml上皮生長因子及5 pg/ml胰島素之生長培養基誘導以分化及泌乳。在匯合時，將細胞用補充有2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素（100 U/ml青黴素，100 μg/ml鏈黴素）及5 pg/ml胰島素之生長培養基餵飼48小時。為誘發分化，將細胞用含有5 pg/ml胰島素、1 pg/ml皮質醇、0.65 ng/ml三碘甲狀腺素、100 nM地塞米松及1 pg/ml促乳素之完整生長培養基餵飼。24小時後，自完全誘導培養基移除血清。製造類乳腺細胞之方法

哺乳動物細胞藉由用編碼Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc之病毒載體再程式化來誘導多能性。接著將所得再程式化細胞在Mammocult培養基（可獲自Stem Cell Technologies）或乳腺細胞富集培養基（DMEM、3% FBS、雌激素、孕酮、肝素、皮質醇、胰島素、EGF）中培養以使其類乳腺，可自其誘導所選乳組分之表現。或者，使用諸如CRISPR/Cas9之重構系統進行表觀遺傳重構以活化所關注之所選基因，諸如酪蛋白、α-乳白蛋白持續性啟動，允許其各別蛋白質表現，及/或下調及/或剔除所選內源基因，如例如WO21067641中所描述，其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。培養

完全生長培養基包括高葡萄糖DMEM/F12、10% FBS、1% NEAA、1%青黴素-鏈黴素、1% ITS-X、1% F-Glu、10 ng/ml EGF及5 pg/ml皮質醇。完全泌乳培養基包括高葡萄糖DMEM/F12、1% NEAA、1%青黴素-鏈黴素、1% ITS-X、1% F-Glu、10 ng/ml EGF、5 pg/ml皮質醇及1 pg/ml促乳素（5 μg/ml，在Hyunh 1991中）。細胞以20,000個細胞/cm2之密度接種於經膠原蛋白塗佈之培養瓶上完全生長培養基中，且在完全生長培養基中靜置以黏附及擴增48小時，其後將培養基換為完全泌乳培養基。在暴露於泌乳培養基後，細胞開始分化且停止生長。在約一週內，細胞開始分泌泌乳產物，諸如乳脂質、乳糖、酪蛋白及乳清至培養基中。可藉由超過濾藉由濃縮或稀釋來達成所需濃度之泌乳培養基。可藉由透析，例如以自培養基移除非所需代謝產物來達成泌乳培養基之所需鹽平衡。可藉由樹脂純化，例如使用鎳樹脂以移除HIS標記之生長因子來選擇性萃取激素及所使用之其他生長因子，以進一步減少泌乳產物中之污染物含量。 實施例 33. 評估非乳腺成體幹細胞中之 LacNAc 、唾液酸化 LacNAc 及唾液酸基 - 路易斯 x 生產

如實施例32中所描述之經分離間葉細胞及經再程式化成類乳腺細胞經由CRISPR-CAS修飾以過度表現來自智人之β-1,4-半乳糖基轉移酶4 B4GalT4（UniProt ID O60513）、來自智人之GDP-岩藻糖合酶GFUS（UniProt ID Q13630）、來自智人之半乳糖苷α-1,3-海藻糖基轉移酶FUT3（UniProt ID P21217）、來自小鼠之N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶（UniProt ID Q99KK2）及來自智人之N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶（UniProt ID Q8NFW8），及來自智人之CMP-N-乙醯基神經胺酸-β-1,4-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶ST3GAL3（UniProt ID Q11203）及來自褐鼠之α-2,6-唾液酸基轉移酶（UniProt ID P13721）。引入細胞中之所有基因針對宿主經密碼子最佳化。細胞以20,000個細胞/cm2之密度接種於經膠原蛋白塗佈之培養瓶上完全生長培養基中，且在完全生長培養基中靜置以黏附及擴增48小時，其後將培養基換為完全泌乳培養基，持續約7天。在如實施例32中所描述培養之後，對細胞進行UPLC以分析LacNAc、3'-唾液酸化LacNAc、6'-唾液酸化LacNAc及唾液酸基-路易斯x之生產。

無

                         
          <![CDATA[<110>  比利時商因比奧斯公司（Inbiose N.V.）]]>
          <![CDATA[<120>  唾液酸化雙醣及/或寡醣的細胞生產]]>
          <![CDATA[<130>  041-TW]]>
          <![CDATA[<140>  TW 110129385]]>
          <![CDATA[<141>  2021-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20190198.0]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20190200.4]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20190201.2]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20190202.0]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20190203.8]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20190205.3]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 21168997.1]]>
          <![CDATA[<151>  2021-04-16]]>
          <![CDATA[<160>  57    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  349]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Gln Asn Asn Asn Glu Phe Lys Ile Gly Asn Arg Ser Val Gly Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Asn His Glu Pro Leu Ile Ile Cys Glu Ile Gly Ile Asn His Glu Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Lys Thr Ala Phe Glu Met Val Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Gly 
                  35                  40                  45              
          Ala Glu Val Val Lys His Gln Thr His Ile Val Glu Asp Glu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Asp Glu Ala Lys Gln Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ile Met Glu Arg Cys Ala Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Val Glu Ser Lys Gly Met Ile Phe Ile Ser Thr Pro Phe 
                      100                 105                 110         
          Ser Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Gln Arg Met Asp Ile Pro Ala Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Ala Ser Phe Gly Lys Pro Ile Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Ile Lys Lys Ser Val Glu Ile Ile Arg Glu Ala Gly Val Pro 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ala Leu Leu His Cys Thr Asn Ile Tyr Pro Thr Pro Tyr Glu Asp 
                      180                 185                 190         
          Val Arg Leu Gly Gly Met Asn Asp Leu Ser Glu Ala Phe Pro Asp Ala 
                  195                 200                 205             
          Ile Ile Gly Leu Ser Asp His Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Cys Leu Gly 
              210                 215                 220                 
          Ala Val Ala Leu Gly Gly Ser Ile Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Met Asp Arg Pro Gly Pro Asp Ile Val Cys Ser Met Asn Pro Asp Thr 
                          245                 250                 255     
          Phe Lys Glu Leu Lys Gln Gly Ala His Ala Leu Lys Leu Ala Arg Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Lys Asp Thr Ile Ile Ala Gly Glu Lys Pro Thr Lys Asp Phe 
                  275                 280                 285             
          Ala Phe Ala Ser Val Val Ala Asp Lys Asp Ile Lys Lys Gly Glu Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Gly Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Asn Gly Asp Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Val Asn Glu Tyr Glu Thr Leu Phe Gly Lys Val Ala Ala Cys Asn 
                          325                 330                 335     
          Ile Arg Lys Gly Ala Gln Ile Lys Lys Thr Asp Ile Glu 
                      340                 345                 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  346]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Lys Glu Ile Lys Ile Gln Asn Ile Ile Ile Ser Glu Glu Lys Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Leu Val Val Pro Glu Ile Gly Ile Asn His Asn Gly Ser Leu Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Lys Ile Met Val Asp Ala Ala Phe Ser Ala Gly Ala Lys Ile 
                  35                  40                  45              
          Ile Lys His Gln Thr His Ile Val Glu Asp Glu Met Ser Lys Ala Ala 
              50                  55                  60                  
          Lys Lys Val Ile Pro Gly Asn Ala Lys Ile Ser Ile Tyr Glu Ile Met 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Cys Ala Leu Asp Tyr Lys Asp Glu Leu Ala Leu Lys Glu Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Lys Leu Gly Leu Val Tyr Leu Ser Thr Pro Phe Ser Arg Ala 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Asn Arg Leu Glu Asp Met Gly Val Ser Ala Phe Lys Ile Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Ile Lys His Ile Ala Ala Phe 
              130                 135                 140                 
          Lys Lys Pro Met Ile Val Ser Thr Gly Met Asn Ser Ile Glu Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Pro Thr Val Lys Ile Leu Leu Asp Asn Glu Ile Pro Phe Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Met His Thr Thr Asn Leu Tyr Pro Thr Pro His Asn Leu Val Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Asn Ala Met Leu Glu Leu Lys Lys Glu Phe Ser Cys Met Val Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Ser Asp His Thr Thr Asp Asn Leu Ala Cys Leu Gly Ala Val Val Leu 
              210                 215                 220                 
          Gly Ala Cys Val Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Ser Met His Arg Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Asp Ile Val Cys Ser Met Asp Thr Lys Ala Leu Lys Glu Leu 
                          245                 250                 255     
          Ile Ile Gln Ser Glu Gln Met Ala Ile Ile Arg Gly Asn Asn Glu Ser 
                      260                 265                 270         
          Lys Lys Ala Ala Lys Gln Glu Gln Val Thr Ile Asp Phe Ala Phe Ala 
                  275                 280                 285             
          Ser Val Val Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Gly Glu Val Leu Ser Met 
              290                 295                 300                 
          Asp Asn Ile Trp Val Lys Arg Pro Gly Leu Gly Gly Ile Ser Ala Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Phe Glu Asn Ile Leu Gly Lys Lys Ala Leu Arg Asp Ile Glu Asn 
                          325                 330                 335     
          Asp Ala Gln Leu Ser Tyr Glu Asp Phe Ala 
                      340                 345     
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  221]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  空腸彎曲桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met Ser Leu Ala Ile Ile Pro Ala Arg Gly Gly Ser Lys Gly Ile Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Lys Asn Leu Val Leu Leu Asn Asn Lys Pro Leu Ile Tyr Tyr Thr 
                      20                  25                  30          
          Ile Lys Ala Ala Leu Asn Ala Lys Ser Ile Ser Lys Val Val Val Ser 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Ser Asp Glu Ile Leu Asn Tyr Ala Lys Ser Gln Asn Val Asp 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Lys Arg Pro Ile Ser Leu Ala Gln Asp Asp Thr Thr Ser Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Val Leu Leu His Ala Leu Lys Phe Tyr Lys Asp Tyr Glu Asp Val 
                          85                  90                  95      
          Val Phe Leu Gln Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Asn Ile His Ile Asn 
                      100                 105                 110         
          Glu Ala Phe Asn Leu Tyr Lys Asn Ser Asn Ala Asn Ala Leu Ile Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Ser Glu Cys Asp Asn Lys Ile Leu Lys Ala Phe Val Cys Asn Asp 
              130                 135                 140                 
          Cys Gly Asp Leu Ala Gly Ile Cys Asn Asp Glu Tyr Pro Phe Met Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Gln Lys Leu Pro Lys Thr Tyr Met Ser Asn Gly Ala Ile Tyr Ile 
                          165                 170                 175     
          Leu Lys Ile Lys Glu Phe Leu Asn Asn Pro Ser Phe Leu Gln Ser Lys 
                      180                 185                 190         
          Thr Lys His Phe Leu Met Asp Glu Ser Ser Ser Leu Asp Ile Asp Cys 
                  195                 200                 205             
          Leu Glu Asp Leu Lys Lys Val Glu Gln Ile Trp Lys Lys 
              210                 215                 220     
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  224]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  流感嗜血桿菌（H. influenzae）]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Thr Arg Ile Ala Ile Ile Pro Ala Arg Ala Gly Ser Lys Gly Ile 
          1               5                   10                  15      
          Lys Asp Lys Asn Leu Gln Leu Val Gly Gly Val Ser Leu Val Gly Arg 
                      20                  25                  30          
          Ala Ile Leu Ala Ala Gln Glu Ser Gly Met Phe Asp Gln Ile Val Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Asp Gly Glu Asn Ile Leu Lys Glu Ala Thr Lys Tyr Gly Ala 
              50                  55                  60                  
          Lys Ala Val Ala Arg Pro Glu Ser Leu Ala Gln Ser Asp Thr Arg Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Asp Ala Ile Leu His Cys Leu Glu Thr Leu Asn Ile Ser Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Thr Ala Ala Leu Leu Gln Pro Thr Ser Pro Leu Arg Asn Ala Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Ile Arg Asn Ala Met Glu Ile Phe Leu Gly Gly Lys Tyr Lys Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Val Ser Ala Cys Glu Cys Glu His His Pro Tyr Lys Ser Phe Thr Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Gly Thr Glu Val Gln Pro Ile His Glu Leu Thr Asp Phe Glu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Arg Gln Lys Leu Pro Lys Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Ile Tyr 
                          165                 170                 175     
          Thr Asn Asp Ile Gln Ser Leu Phe Glu Glu Lys Arg Phe Phe Ile Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Met Arg Phe Tyr Leu Met Pro Thr Tyr Arg Ser Ile Asp Ile Asp 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Leu Asp Leu Gln Leu Ala Glu Ser Leu Ile Ser Lys Glu Phe 
              210                 215                 220                 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  223]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Met Thr Asn Ile Ala Ile Ile Pro Ala Arg Ala Gly Ser Lys Gly Ile 
          1               5                   10                  15      
          Pro Asp Lys Asn Leu Gln Pro Val Gly Gly His Ser Leu Ile Gly Arg 
                      20                  25                  30          
          Ala Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ala Asp Val Phe Asp Met Ile Val Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Asp Gly Asp Asn Ile Leu Arg Glu Ala Glu Lys Tyr Gly Ala 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Leu Lys Arg Pro Ala Glu Leu Ala Gln Asp Asn Ser Arg Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Asp Ala Ile Leu His Ala Leu Glu Ser Leu Asn Ile Arg Glu Gly 
                          85                  90                  95      
          Thr Cys Thr Leu Leu Gln Pro Thr Ser Pro Leu Arg Asp His Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Ile Lys Asn Ala Met Asp Met Tyr Val Asn Gly Gly Val His Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Val Ser Ala Cys Glu Cys Glu His His Pro Tyr Lys Ala Phe Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Lys Asp His Glu Val Leu Pro Val Arg Glu Ile Ala Asp Phe Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ala Arg Gln Thr Leu Pro Lys Met Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Ile 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ile Asn Asp Ile Ala Gln Leu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Phe Ile 
                      180                 185                 190         
          Pro Pro Leu Lys Phe Tyr Leu Met Pro Thr Tyr Arg Ser Val Asp Ile 
                  195                 200                 205             
          Asp Val Lys Gln Asp Leu Glu Leu Ala Glu Ile Leu Ser Asn Lys 
              210                 215                 220             
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  609]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Gly Leu Ala Val Val Asp Thr Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu 
              50                  55                  60                  
          His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val 
                          85                  90                  95      
          Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu 
                      100                 105                 110         
          Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly 
                          165                 170                 175     
          Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser 
                      180                 185                 190         
          Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu 
                  195                 200                 205             
          Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Cys His Tyr Met Gln Lys Glu 
                          245                 250                 255     
          Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile 
                      260                 265                 270         
          Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu 
                  275                 280                 285             
          Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser 
              290                 295                 300                 
          Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser 
                          325                 330                 335     
          Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu 
                      340                 345                 350         
          Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr 
                  355                 360                 365             
          Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu 
                          405                 410                 415     
          Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His 
                      420                 425                 430         
          Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp 
              450                 455                 460                 
          Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu 
                          485                 490                 495     
          Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp 
                      500                 505                 510         
          Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu 
                  515                 520                 525             
          Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu 
              530                 535                 540                 
          Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met 
          545                 550                 555                 560 
          His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe 
                          565                 570                 575     
          Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys 
                      580                 585                 590         
          Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val 
                  595                 600                 605             
          Glu 
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  159]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr 
                      20                  25                  30          
          Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly 
                      100                 105                 110         
          Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu 
              130                 135                 140                 
          Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys 
          145                 150                 155                 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  496]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Met Ser Thr Thr Thr Gln Asn Ile Pro Trp Tyr Arg His Leu Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gln Trp Arg Ala Phe Ser Ala Ala Trp Leu Gly Tyr Leu Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Gly Phe Asp Phe Val Leu Ile Ala Leu Val Leu Thr Glu Val Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Glu Phe Gly Leu Thr Thr Val Gln Ala Ala Ser Leu Ile Ser Ala Ala 
              50                  55                  60                  
          Phe Ile Ser Arg Trp Phe Gly Gly Leu Met Leu Gly Ala Met Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Tyr Gly Arg Arg Leu Ala Met Val Thr Ser Ile Val Leu Phe Ser 
                          85                  90                  95      
          Ala Gly Thr Leu Ala Cys Gly Phe Ala Pro Gly Tyr Ile Thr Met Phe 
                      100                 105                 110         
          Ile Ala Arg Leu Val Ile Gly Met Gly Met Ala Gly Glu Tyr Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Ser Ala Thr Tyr Val Ile Glu Ser Trp Pro Lys His Leu Arg Asn Lys 
              130                 135                 140                 
          Ala Ser Gly Phe Leu Ile Ser Gly Phe Ser Val Gly Ala Val Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Gln Val Tyr Ser Leu Val Val Pro Val Trp Gly Trp Arg Ala Leu 
                          165                 170                 175     
          Phe Phe Ile Gly Ile Leu Pro Ile Ile Phe Ala Leu Trp Leu Arg Lys 
                      180                 185                 190         
          Asn Ile Pro Glu Ala Glu Asp Trp Lys Glu Lys His Ala Gly Lys Ala 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Arg Thr Met Val Asp Ile Leu Tyr Arg Gly Glu His Arg Ile 
              210                 215                 220                 
          Ala Asn Ile Val Met Thr Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Trp Phe Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Ala Gly Asn Leu Gln Asn Ala Ala Ile Val Ala Val Leu Gly Leu 
                          245                 250                 255     
          Leu Cys Ala Ala Ile Phe Ile Ser Phe Met Val Gln Ser Ala Gly Lys 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp Pro Thr Gly Val Met Leu Met Val Val Val Leu Phe Ala Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Trp Pro Ile Gln Ala Leu Leu Pro Thr Tyr Leu Lys Thr 
              290                 295                 300                 
          Asp Leu Ala Tyr Asn Pro His Thr Val Ala Asn Val Leu Phe Phe Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Phe Gly Ala Ala Val Gly Cys Cys Val Gly Gly Phe Leu Gly Asp 
                          325                 330                 335     
          Trp Leu Gly Thr Arg Lys Ala Tyr Val Cys Ser Leu Leu Ala Ser Gln 
                      340                 345                 350         
          Leu Leu Ile Ile Pro Val Phe Ala Ile Gly Gly Ala Asn Val Trp Val 
                  355                 360                 365             
          Leu Gly Leu Leu Leu Phe Phe Gln Gln Met Leu Gly Gln Gly Ile Ala 
              370                 375                 380                 
          Gly Ile Leu Pro Lys Leu Ile Gly Gly Tyr Phe Asp Thr Asp Gln Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Ala Gly Leu Gly Phe Thr Tyr Asn Val Gly Ala Leu Gly Gly Ala 
                          405                 410                 415     
          Leu Ala Pro Ile Ile Gly Ala Leu Ile Ala Gln Arg Leu Asp Leu Gly 
                      420                 425                 430         
          Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Phe Ser Leu Thr Phe Val Val Ile Leu 
                  435                 440                 445             
          Leu Ile Gly Leu Asp Met Pro Ser Arg Val Gln Arg Trp Leu Arg Pro 
              450                 455                 460                 
          Glu Ala Leu Arg Thr His Asp Ala Ile Asp Gly Lys Pro Phe Ser Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Val Pro Phe Gly Ser Ala Lys Asn Asp Leu Val Lys Thr Lys Ser 
                          485                 490                 495     
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  421]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus）]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Met Asp Ser Lys Asn Asn Ile Gly His Ser Ala Asp Ile Ser Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Glu Leu Pro Ile Pro Ile Tyr Asn Gly Asn Thr Ile Met Asp Phe 
                      20                  25                  30          
          Lys Lys Leu Ala Ser Leu Tyr Lys Asp Glu Leu Leu Asp Asn Val Leu 
                  35                  40                  45              
          Pro Phe Trp Leu Glu His Ser Gln Asp His Glu Tyr Gly Gly Tyr Phe 
              50                  55                  60                  
          Thr Cys Leu Asp Arg Glu Gly Lys Val Phe Asp Thr Asp Lys Phe Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Trp Leu Gln Ser Arg Glu Val Trp Met Phe Ser Met Leu Tyr Asn Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Glu Lys Arg Gln Glu Trp Leu Asp Cys Ala Ile Gln Gly Gly Glu 
                      100                 105                 110         
          Phe Leu Lys Lys Tyr Gly His Asp Gly Asn Tyr Asn Trp Tyr Phe Ser 
                  115                 120                 125             
          Leu Asp Arg Ser Gly Arg Pro Leu Val Glu Pro Tyr Asn Ile Phe Ser 
              130                 135                 140                 
          Tyr Thr Phe Ala Thr Met Ala Phe Gly Gln Leu Ser Leu Thr Thr Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Gln Glu Tyr Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Phe Asp Ile Ile Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Lys Val Asp Asn Pro Lys Gly Arg Trp Asn Lys Leu His Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Arg Asn Leu Lys Asn Phe Ala Leu Pro Met Ile Leu Cys Asn Leu 
                  195                 200                 205             
          Ala Leu Glu Ile Glu His Leu Leu Asp Glu Thr Tyr Leu Arg Glu Thr 
              210                 215                 220                 
          Met Asp Thr Cys Ile His Glu Val Met Glu Val Phe Tyr Arg Pro Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Gly Gly Ile Ile Val Glu Asn Val Asp Ile Asp Gly Asn Leu Val 
                          245                 250                 255     
          Asp Cys Phe Glu Gly Arg Gln Val Thr Pro Gly His Ala Ile Glu Ala 
                      260                 265                 270         
          Met Trp Phe Ile Met Asp Leu Gly Lys Arg Leu Asn Arg Pro Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Lys Ala Lys Glu Thr Thr Leu Thr Met Leu Asn Tyr Gly Trp 
              290                 295                 300                 
          Asp Lys Gln Tyr Gly Gly Ile Tyr Tyr Phe Met Asp Arg Asn Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu Trp Trp Val His Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Thr Leu Ile Ser Leu Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Gly Asp Lys 
                      340                 345                 350         
          Lys Cys Leu Glu Trp Phe Glu Lys Val His Asp Tyr Thr Trp Glu His 
                  355                 360                 365             
          Phe Lys Asp Lys Glu Tyr Pro Glu Trp Tyr Gly Tyr Leu Asn Arg Arg 
              370                 375                 380                 
          Gly Glu Val Leu Leu Pro Leu Lys Gly Gly Lys Trp Lys Gly Cys Phe 
          385                 390                 395                 400 
          His Val Pro Arg Gly Leu Tyr Gln Cys Trp Lys Thr Leu Glu Glu Ile 
                          405                 410                 415     
          Lys Asn Ile Val Ser 
                      420     
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  445]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Met Ser Asn Arg Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Asp Ala Pro Ile Thr Pro Asp Phe Val Leu Lys Leu Gly Trp Ala 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Lys Val Leu Ala Arg His Gly Ser Arg Lys Ile Ile Ile Gly 
                  35                  40                  45              
          Lys Asp Thr Arg Ile Ser Gly Tyr Met Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ala Leu Phe Thr Gly Pro Met Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Pro Ala Val Ala Tyr Leu Thr Arg Thr Phe Arg Ala Glu Ala Gly 
                          85                  90                  95      
          Ile Val Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Phe Tyr Asp Asn Gly Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Phe Phe Ser Ile Asp Gly Thr Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Glu Ala 
                  115                 120                 125             
          Ile Glu Ala Glu Met Glu Lys Glu Ile Ser Cys Val Asp Ser Ala Glu 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Lys Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Ile Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Cys Lys Ala Thr Phe Pro Asn Glu Leu Ser Leu Ser Glu Leu Lys 
                          165                 170                 175     
          Ile Val Val Asp Cys Ala Asn Gly Ala Thr Tyr His Ile Ala Pro Asn 
                      180                 185                 190         
          Val Leu Arg Glu Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Ile Gly Cys Glu Pro 
                  195                 200                 205             
          Asn Gly Val Asn Ile Asn Ala Glu Val Gly Ala Thr Asp Val Arg Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Glu Lys Ala Asp Leu Gly Ile Ala Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Gly Asp Gly Asp Arg Val Ile Met Val Asp His Glu Gly Asn Lys 
                          245                 250                 255     
          Val Asp Gly Asp Gln Ile Met Tyr Ile Ile Ala Arg Glu Gly Leu Arg 
                      260                 265                 270         
          Gln Gly Gln Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Thr Leu Met Ser Asn Met 
                  275                 280                 285             
          Gly Leu Glu Leu Ala Leu Lys Gln Leu Gly Ile Pro Phe Ala Arg Ala 
              290                 295                 300                 
          Lys Val Gly Asp Arg Tyr Val Leu Glu Lys Met Gln Glu Lys Gly Trp 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ile Gly Ala Glu Asn Ser Gly His Val Ile Leu Leu Asp Lys Thr 
                          325                 330                 335     
          Thr Thr Gly Asp Gly Ile Val Ala Gly Leu Gln Val Leu Ala Ala Met 
                      340                 345                 350         
          Ala Arg Asn His Met Ser Leu His Asp Leu Cys Ser Gly Met Lys Met 
                  355                 360                 365             
          Phe Pro Gln Ile Leu Val Asn Val Arg Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Asp 
              370                 375                 380                 
          Pro Leu Glu His Glu Ser Val Lys Ala Val Thr Ala Glu Val Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Leu Gly Asn Arg Gly Arg Val Leu Leu Arg Lys Ser Gly Thr Glu 
                          405                 410                 415     
          Pro Leu Ile Arg Val Met Val Glu Gly Glu Asp Glu Ala Gln Val Thr 
                      420                 425                 430         
          Glu Phe Ala His Arg Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Val 
                  435                 440                 445 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  456]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Met Leu Asn Asn Ala Met Ser Val Val Ile Leu Ala Ala Gly Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Arg Met Tyr Ser Asp Leu Pro Lys Val Leu His Thr Leu Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Met Val Gln His Val Ile Asp Ala Ala Asn Glu Leu Gly Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala His Val His Leu Val Tyr Gly His Gly Gly Asp Leu Leu Lys Gln 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Lys Asp Asp Asn Leu Asn Trp Val Leu Gln Ala Glu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Thr Gly His Ala Met Gln Gln Ala Ala Pro Phe Phe Ala Asp Asp 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Ile Leu Met Leu Tyr Gly Asp Val Pro Leu Ile Ser Val Glu 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Gln Arg Leu Arg Asp Ala Lys Pro Gln Gly Gly Ile Gly Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Val Lys Leu Asp Asp Pro Thr Gly Tyr Gly Arg Ile Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Glu Asn Gly Lys Val Thr Gly Ile Val Glu His Lys Asp Ala Thr Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gln Arg Gln Ile Gln Glu Ile Asn Thr Gly Ile Leu Ile Ala Asn 
                          165                 170                 175     
          Gly Ala Asp Met Lys Arg Trp Leu Ala Lys Leu Thr Asn Asn Asn Ala 
                      180                 185                 190         
          Gln Gly Glu Tyr Tyr Ile Thr Asp Ile Ile Ala Leu Ala Tyr Gln Glu 
                  195                 200                 205             
          Gly Arg Glu Ile Val Ala Val His Pro Gln Arg Leu Ser Glu Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Val Asn Asn Arg Leu Gln Leu Ser Arg Leu Glu Arg Val Tyr Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Glu Gln Ala Glu Lys Leu Leu Leu Ala Gly Val Met Leu Arg Asp 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Arg Phe Asp Leu Arg Gly Thr Leu Thr His Gly Arg Asp Val 
                      260                 265                 270         
          Glu Ile Asp Thr Asn Val Ile Ile Glu Gly Asn Val Thr Leu Gly His 
                  275                 280                 285             
          Arg Val Lys Ile Gly Thr Gly Cys Val Ile Lys Asn Ser Val Ile Gly 
              290                 295                 300                 
          Asp Asp Cys Glu Ile Ser Pro Tyr Thr Val Val Glu Asp Ala Asn Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ala Ala Cys Thr Ile Gly Pro Phe Ala Arg Leu Arg Pro Gly Ala 
                          325                 330                 335     
          Glu Leu Leu Glu Gly Ala His Val Gly Asn Phe Val Glu Met Lys Lys 
                      340                 345                 350         
          Ala Arg Leu Gly Lys Gly Ser Lys Ala Gly His Leu Thr Tyr Leu Gly 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Glu Ile Gly Asp Asn Val Asn Ile Gly Ala Gly Thr Ile Thr 
              370                 375                 380                 
          Cys Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Ile Gly Asp Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Val Phe Val Gly Ser Asp Thr Gln Leu Val Ala Pro Val Thr Val Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Gly Ala Thr Ile Ala Ala Gly Thr Thr Val Thr Arg Asn Val Gly 
                      420                 425                 430         
          Glu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Arg Val Pro Gln Thr Gln Lys Glu Gly 
                  435                 440                 445             
          Trp Arg Arg Pro Val Lys Lys Lys 
              450                 455     
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  373]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  空腸彎曲桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Met Val Lys Lys Ile Leu Phe Ile Thr Gly Ser Arg Ala Asp Tyr Ser 
          1               5                   10                  15      
          Lys Ile Lys Ser Leu Met Tyr Arg Val Gln Asn Ser Ser Glu Phe Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Gly Met His Leu Ser Lys Asn Phe Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Thr Val Lys Glu Leu Tyr Lys Asn Gly Phe Lys Asn Ile Tyr Glu Phe 
              50                  55                  60                  
          Ile Asn Tyr Asp Lys Tyr Tyr Gln Thr Asp Lys Ala Leu Ala Thr Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Asp Gly Phe Ser Arg Tyr Ala Asn Glu Leu Lys Pro Asp Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Val His Gly Asp Arg Ile Glu Pro Leu Ala Ala Ala Ile Val Gly 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Asn Asn Ile Leu Val Ala His Ile Glu Gly Gly Glu Ile Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Ile Asp Asp Ser Leu Arg His Ala Ile Ser Lys Leu Ala His 
              130                 135                 140                 
          Ile His Leu Val Asn Asp Glu Phe Ala Lys Arg Arg Leu Met Gln Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Asp Glu Lys Ser Ile Phe Ile Ile Gly Ser Pro Asp Leu Glu 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Asn Asp Asn Lys Ile Ser Leu Ser Glu Ala Lys Lys Tyr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Asp Ile Asn Tyr Glu Asn Tyr Ala Leu Leu Met Phe His Pro Val Thr 
                  195                 200                 205             
          Thr Glu Ile Thr Ser Ile Lys Asn Gln Ala Asp Asn Leu Val Lys Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Ile Gln Ser Asn Lys Asn Tyr Ile Val Ile Tyr Pro Asn Asn Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Gly Phe Glu Leu Ile Leu Gln Ser Tyr Glu Glu Phe Lys Asn Asn 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Phe Lys Leu Phe Pro Ser Leu Arg Phe Glu Tyr Phe Ile Thr 
                      260                 265                 270         
          Leu Leu Lys Asn Ala Asp Phe Ile Ile Gly Asn Ser Ser Cys Ile Leu 
                  275                 280                 285             
          Lys Glu Ala Leu Tyr Leu Lys Thr Ala Gly Ile Leu Val Gly Ser Arg 
              290                 295                 300                 
          Gln Asn Gly Arg Leu Gly Asn Glu Asn Thr Leu Lys Val Asn Ala Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Asp Glu Ile Leu Lys Ala Ile Asn Thr Ile His Lys Lys Gln Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Ser Ala Lys Leu Glu Ile Leu Asp Ser Ser Lys Leu Phe Phe 
                      340                 345                 350         
          Glu Tyr Leu Gln Ser Gly Asp Phe Phe Lys Leu Ser Thr Gln Lys Val 
                  355                 360                 365             
          Phe Lys Asp Ile Lys 
              370             
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  722]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠（C57BL/6J品系）]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Met Glu Lys Asn Gly Asn Asn Arg Lys Leu Arg Val Cys Val Ala Thr 
          1               5                   10                  15      
          Cys Asn Arg Ala Asp Tyr Ser Lys Leu Ala Pro Ile Met Phe Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Thr Glu Pro Ala Phe Phe Glu Leu Asp Val Val Val Leu Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          His Leu Ile Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Tyr Arg Met Ile Glu Gln Asp 
              50                  55                  60                  
          Asp Phe Asp Ile Asn Thr Arg Leu His Thr Ile Val Arg Gly Glu Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Ala Met Val Glu Ser Val Gly Leu Ala Leu Val Lys Leu Pro 
                          85                  90                  95      
          Asp Val Leu Asn Arg Leu Lys Pro Asp Ile Met Ile Val His Gly Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Phe Asp Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ser Ala Ala Leu Met Asn Ile 
                  115                 120                 125             
          Arg Ile Leu His Ile Glu Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Ile Asp Asp 
              130                 135                 140                 
          Ser Ile Arg His Ala Ile Thr Lys Leu Ala His Tyr His Val Cys Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Arg Ser Ala Glu Gln His Leu Ile Ser Met Cys Glu Asp His Asp 
                          165                 170                 175     
          Arg Ile Leu Leu Ala Gly Cys Pro Ser Tyr Asp Lys Leu Leu Ser Ala 
                      180                 185                 190         
          Lys Asn Lys Asp Tyr Met Ser Ile Ile Arg Met Trp Leu Gly Asp Asp 
                  195                 200                 205             
          Val Lys Cys Lys Asp Tyr Ile Val Ala Leu Gln His Pro Val Thr Thr 
              210                 215                 220                 
          Asp Ile Lys His Ser Ile Lys Met Phe Glu Leu Thr Leu Asp Ala Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Ser Phe Asn Lys Arg Thr Leu Val Leu Phe Pro Asn Ile Asp Ala 
                          245                 250                 255     
          Gly Ser Lys Glu Met Val Arg Val Met Arg Lys Lys Gly Ile Glu His 
                      260                 265                 270         
          His Pro Asn Phe Arg Ala Val Lys His Val Pro Phe Asp Gln Phe Ile 
                  275                 280                 285             
          Gln Leu Val Ala His Ala Gly Cys Met Ile Gly Asn Ser Ser Cys Gly 
              290                 295                 300                 
          Val Arg Glu Val Gly Ala Phe Gly Thr Pro Val Ile Asn Leu Gly Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Gln Ile Gly Arg Glu Thr Gly Glu Asn Val Leu His Val Arg Asp 
                          325                 330                 335     
          Ala Asp Thr Gln Asp Lys Ile Leu Gln Ala Leu His Leu Gln Phe Gly 
                      340                 345                 350         
          Lys Gln Tyr Pro Cys Ser Lys Ile Tyr Gly Asp Gly Asn Ala Val Pro 
                  355                 360                 365             
          Arg Ile Leu Lys Phe Leu Lys Ser Ile Asp Leu Gln Glu Pro Leu Gln 
              370                 375                 380                 
          Lys Lys Phe Cys Phe Pro Pro Val Lys Glu Asn Ile Ser Gln Asp Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Asp His Ile Leu Glu Thr Leu Ser Ala Leu Ala Val Asp Leu Gly Gly 
                          405                 410                 415     
          Thr Asn Leu Arg Val Ala Ile Val Ser Met Lys Gly Glu Ile Val Lys 
                      420                 425                 430         
          Lys Tyr Thr Gln Phe Asn Pro Lys Thr Tyr Glu Glu Arg Ile Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ile Leu Gln Met Cys Val Glu Ala Ala Ala Glu Ala Val Lys Leu Asn 
              450                 455                 460                 
          Cys Arg Ile Leu Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Gly Arg Val Asn Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Gln Glu Gly Val Val Leu His Ser Thr Lys Leu Ile Gln Glu Trp Asn 
                          485                 490                 495     
          Ser Val Asp Leu Arg Thr Pro Leu Ser Asp Thr Leu His Leu Pro Val 
                      500                 505                 510         
          Trp Val Asp Asn Asp Gly Asn Cys Ala Ala Met Ala Glu Arg Lys Phe 
                  515                 520                 525             
          Gly Gln Gly Lys Gly Gln Glu Asn Phe Val Thr Leu Ile Thr Gly Thr 
              530                 535                 540                 
          Gly Ile Gly Gly Gly Ile Ile His Gln His Glu Leu Ile His Gly Ser 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Phe Cys Ala Ala Glu Leu Gly His Leu Val Val Ser Leu Asp Gly 
                          565                 570                 575     
          Pro Asp Cys Ser Cys Gly Ser His Gly Cys Ile Glu Ala Tyr Ala Ser 
                      580                 585                 590         
          Gly Met Ala Leu Gln Arg Glu Ala Lys Lys Leu His Asp Glu Asp Leu 
                  595                 600                 605             
          Leu Leu Val Glu Gly Met Ser Val Pro Lys Asp Glu Ala Val Gly Ala 
              610                 615                 620                 
          Leu His Leu Ile Gln Ala Ala Lys Leu Gly Asn Val Lys Ala Gln Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Ile Leu Arg Thr Ala Gly Thr Ala Leu Gly Leu Gly Val Val Asn Ile 
                          645                 650                 655     
          Leu His Thr Met Asn Pro Ser Leu Val Ile Leu Ser Gly Val Leu Ala 
                      660                 665                 670         
          Ser His Tyr Ile His Ile Val Lys Asp Val Ile Arg Gln Gln Ala Leu 
                  675                 680                 685             
          Ser Ser Val Gln Asp Val Asp Val Val Val Ser Asp Leu Val Asp Pro 
              690                 695                 700                 
          Ala Leu Leu Gly Ala Ala Ser Met Val Leu Asp Tyr Thr Thr Arg Arg 
          705                 710                 715                 720 
          Ile His 
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  348]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  互養棍狀菌屬物種（Syntrophorhabdus sp.）PtaU1.Bin058]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Met Glu Ser Phe Ser Phe Gly Lys Ser Thr Val Ser Lys Asn Gly Pro 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr Ile Ile Ala Glu Ile Gly Asn Asn His Gln Gly Asp Leu Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Ala Leu Lys Met Ile Lys Thr Ala Ala Gly Met Gly Val Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Val Lys Phe Gln Lys Arg Asp Asn Arg Thr Leu Tyr Thr Lys Ser Met 
              50                  55                  60                  
          Tyr Asn Lys Pro Tyr Glu Asn Glu Asn Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu His Arg Asp Tyr Leu Glu Phe Cys Trp Asp Lys Tyr Val Glu Met 
                          85                  90                  95      
          Lys Lys Cys Ala Glu Asp Asn Asp Val Glu Phe Met Cys Thr Ala Phe 
                      100                 105                 110         
          Asp Phe Lys Ser Val Asp Phe Leu Glu Gln Leu Gly Ile Thr Ser Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Ala Ser Gly Asp Val Thr Asn Thr Pro Leu Leu Glu Tyr Ile 
              130                 135                 140                 
          Ala Gln Thr Lys Lys Pro Met Phe Val Ser Thr Gly Gly Ala Thr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Ile Arg Val Ala Tyr Asp Thr Val Thr Lys Tyr Asn Asp Arg 
                          165                 170                 175     
          Val Cys Leu Leu His Cys Val Ala Gly Tyr Pro Thr Glu Tyr Glu Tyr 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Leu Asn Thr Ile Asn Ile Leu Lys Lys Glu Phe Pro Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Ile Gly Tyr Ser Gly His Asp Tyr Gly Ile Leu Ala Pro Val Val 
              210                 215                 220                 
          Ala Tyr Met Leu Gly Ala Val Val Val Glu Lys His Phe Thr Leu Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Ala Trp Lys Gly Thr Asp His Lys Phe Ser Leu Glu Pro Thr Gly 
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Met Thr Arg Asp Leu Arg Arg Val Asp Val Ser Ile Gly 
                      260                 265                 270         
          Asn Gly Lys Lys Val Val His Ala Phe Glu Lys Asp Pro Ile Ser Lys 
                  275                 280                 285             
          Met Ser Lys Ser Leu Tyr Ala Ser Arg Lys Leu Gln Ala Gly Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Leu Thr Ala Asp Asp Ile Ser Ile Lys Ser Pro Gly Gly Gly Ile Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Tyr Lys Met Glu Glu Val Leu Gly Lys Met Leu Lys Ile Asn Leu 
                          325                 330                 335     
          Pro Glu Glu Ala Leu Phe Ser Phe Asp Tyr Phe Glu 
                      340                 345             
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  241]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  候選種趨磁桑葚狀菌屬物種（Candidatus Magnetomorum sp.）HK-1]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Met Pro Ser Leu Lys Ala Ile Phe Phe Asp Leu Asp Asn Thr Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Asp Cys Ser Thr Ala Asp Ile Arg Thr Tyr Glu Ile Leu Ala Ser Ile 
                      20                  25                  30          
          Ala Arg Asp Lys Val Arg Gly Ile Asn Ser Pro Ala Leu Ile Asn His 
                  35                  40                  45              
          Phe Gln Lys Gln Leu Ile Asn Val Pro Phe Asp Pro Glu Lys Gln Ile 
              50                  55                  60                  
          Pro Val His Pro Trp Arg Thr Ile Leu Trp Thr Lys Ala Leu Lys Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Ile Asp Asp Ile Asp Leu Ala Glu Lys Leu Asn Ile Ala Phe 
                          85                  90                  95      
          His Arg Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Thr Phe Ile Tyr Gly Ser Gln Lys 
                      100                 105                 110         
          Met Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Tyr Thr Cys Val Ile Ile Thr Asn 
                  115                 120                 125             
          Gly Asp Ser Glu Ile Gln Arg Pro Lys Leu Lys Ala Cys Lys Ala Gln 
              130                 135                 140                 
          Lys Tyr Phe Ser His Ile Ile Val Gly Gly Glu Glu Pro Tyr Glu Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Pro His Pro Ser Ile Phe Lys Lys Ala Cys Glu Met Ala Lys Cys Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Glu Ser Ala Ile Ile Ile Gly Asp Ser Leu Glu Thr Asp Ile Lys 
                      180                 185                 190         
          Gly Gly Leu Asp Ala Gly Leu Ala Ser Thr Ile Trp Ile Asn Pro Lys 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Pro Ile Pro Glu Lys Gly Pro Val Pro His Tyr Gln Ala Val 
              210                 215                 220                 
          Ser Val Leu Glu Leu Pro Leu Ile Ile Gln His Ile Gln Gln Gln Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Gln 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  164]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Met Lys Glu Ile Lys Leu Ile Leu Thr Asp Ile Asp Gly Val Trp Thr 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gly Gly Met Phe Tyr Asp Gln Thr Gly Asn Glu Trp Lys Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Asn Thr Ser Asp Ser Ala Gly Ile Phe Trp Ala His Asn Lys Gly Ile 
                  35                  40                  45              
          Pro Val Gly Ile Leu Thr Gly Glu Lys Thr Glu Ile Val Arg Arg Arg 
              50                  55                  60                  
          Ala Glu Lys Leu Lys Val Asp Tyr Leu Phe Gln Gly Val Val Asp Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ser Ala Ala Glu Glu Leu Cys Asn Glu Leu Gly Ile Asn Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Gln Val Ala Tyr Ile Gly Asp Asp Leu Asn Asp Ala Lys Leu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Val Gly Ile Ala Gly Val Pro Ala Ser Ala Pro Phe Tyr Ile Arg 
                  115                 120                 125             
          Arg Leu Ser Thr Ile Phe Leu Glu Lys Arg Gly Gly Glu Gly Val Phe 
              130                 135                 140                 
          Arg Glu Phe Val Glu Lys Val Leu Gly Ile Asn Leu Glu Asp Phe Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Ile Gln 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  268]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  多殺性巴氏桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Met Asp Lys Phe Ala Glu His Glu Ile Pro Lys Ala Val Ile Val Ala 
          1               5                   10                  15      
          Gly Asn Gly Glu Ser Leu Ser Gln Ile Asp Tyr Arg Leu Leu Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Asp Val Phe Arg Cys Asn Gln Phe Tyr Phe Glu Glu Arg Tyr 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Gly Asn Lys Ile Lys Ala Val Phe Phe Thr Pro Gly Val Phe 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Gln Tyr Tyr Thr Leu Tyr His Leu Lys Arg Asn Asn Glu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Asp Asn Val Ile Leu Ser Ser Phe Asn His Pro Thr Val Asp 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Lys Ser Gln Lys Ile Gln Ala Leu Phe Ile Asp Val Ile Asn 
                      100                 105                 110         
          Gly Tyr Glu Lys Tyr Leu Ser Lys Leu Thr Ala Phe Asp Val Tyr Leu 
                  115                 120                 125             
          Arg Tyr Lys Glu Leu Tyr Glu Asn Gln Arg Ile Thr Ser Gly Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Met Cys Ala Val Ala Ile Ala Met Gly Tyr Thr Asp Ile Tyr Leu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ile Asp Phe Tyr Gln Ala Ser Glu Glu Asn Tyr Ala Phe Asp Asn 
                          165                 170                 175     
          Lys Lys Pro Asn Ile Ile Arg Leu Leu Pro Asp Phe Arg Lys Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Thr Leu Phe Ser Tyr His Ser Lys Asp Ile Asp Leu Glu Ala Leu Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Leu Gln Gln His Tyr His Val Asn Phe Tyr Ser Ile Ser Pro Met 
              210                 215                 220                 
          Ser Pro Leu Ser Lys His Phe Pro Ile Pro Thr Val Glu Asp Asp Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Thr Thr Phe Val Ala Pro Leu Lys Glu Asn Tyr Ile Asn Asp Ile 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Pro Pro His Phe Val Tyr Glu Lys Leu Gly 
                      260                 265             
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  371]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腦膜炎奈瑟氏菌]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Met Gly Leu Lys Lys Ala Cys Leu Thr Val Leu Cys Leu Ile Val Phe 
          1               5                   10                  15      
          Cys Phe Gly Ile Phe Tyr Thr Phe Asp Arg Val Asn Gln Gly Glu Arg 
                      20                  25                  30          
          Asn Ala Val Ser Leu Leu Lys Glu Lys Leu Phe Asn Glu Glu Gly Glu 
                  35                  40                  45              
          Pro Val Asn Leu Ile Phe Cys Tyr Thr Ile Leu Gln Met Lys Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Ile Met Ala Gln His Pro Gly Glu Arg Phe Tyr Val Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Met Ser Glu Asn Arg Asn Glu Lys Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asn Gln Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Asp Lys Ala Glu Arg Ala Tyr Phe Phe His Leu Pro Tyr Gly Leu 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys Ser Phe Asn Phe Ile Pro Thr Met Ala Glu Leu Lys Val Lys 
                  115                 120                 125             
          Ser Met Leu Leu Pro Lys Val Lys Arg Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Glu 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Ser Ile Ala Ala Phe Leu Ser Thr Tyr Pro Asp Ala Glu Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Thr Phe Asp Asp Gly Thr Gly Asn Leu Ile Gln Ser Ser Ser Tyr 
                          165                 170                 175     
          Leu Gly Asp Glu Phe Ser Val Asn Gly Thr Ile Lys Arg Asn Phe Ala 
                      180                 185                 190         
          Arg Met Met Ile Gly Asp Trp Ser Ile Ala Lys Thr Arg Asn Ala Ser 
                  195                 200                 205             
          Asp Glu His Tyr Thr Ile Phe Lys Gly Leu Lys Asn Ile Met Asp Asp 
              210                 215                 220                 
          Gly Arg Arg Lys Met Thr Tyr Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ser Glu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Thr Gly Asp Glu Thr Gly Gly Thr Val Arg Ile Leu Leu Gly Ser 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Lys Glu Met Lys Glu Ile Ser Glu Lys Ala Ala Lys Asn Phe 
                      260                 265                 270         
          Lys Ile Gln Tyr Val Ala Pro His Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Leu Ser 
                  275                 280                 285             
          Gly Val Thr Thr Leu Asn Ser Pro Tyr Val Ile Glu Asp Tyr Ile Leu 
              290                 295                 300                 
          Arg Glu Ile Lys Lys Asn Pro His Thr Arg Tyr Glu Ile Tyr Thr Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Ser Gly Ala Ala Leu Thr Met Lys Asp Phe Pro Asn Val His Val 
                          325                 330                 335     
          Tyr Ala Leu Lys Pro Ala Ser Leu Pro Glu Asp Tyr Trp Leu Lys Pro 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Ala Leu Phe Thr Gln Ser Gly Ile Pro Ile Leu Thr Phe Asp 
                  355                 360                 365             
          Asp Lys Asn 
              370     
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  391]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  美人魚發光菌（Photobacterium damselae）]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Met Thr Val Val Ala Pro Thr Leu Glu Val Tyr Ile Asp His Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Pro Ser Leu Gln Gln Leu Ile His Ile Ile Gln Ala Lys Asp Glu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Ser Asn Gln Arg Phe Val Ser Trp Lys Arg Val Thr Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Ala Asp Asn Ala Asn Lys Leu Asn Ile His Thr Tyr Pro Leu Lys Gly 
              50                  55                  60                  
          Asn Asn Thr Ser Pro Glu Met Val Ala Ala Ile Asp Glu Tyr Ala Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Lys Asn Arg Leu Asn Ile Glu Phe Tyr Thr Asn Thr Ala His Val 
                          85                  90                  95      
          Phe Asn Asn Leu Pro Pro Ile Ile Gln Pro Leu Tyr Asn Asn Glu Lys 
                      100                 105                 110         
          Val Lys Ile Ser His Ile Ser Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ser Glu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Val Ser Leu Tyr Gln Trp Lys Asp Thr Pro Asn Lys Ile Glu Thr Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Gly Glu Val Ser Leu Leu Ala Asn Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ala Pro Lys Gly Met Gly Asn Arg Tyr Asn Trp His Lys Leu Tyr 
                          165                 170                 175     
          Asp Thr Asp Tyr Tyr Phe Leu Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Val Glu Ala 
                      180                 185                 190         
          Asn Leu His Asp Leu Arg Asp Tyr Leu Gly Ser Ser Ala Lys Gln Met 
                  195                 200                 205             
          Pro Trp Asp Glu Phe Ala Lys Leu Ser Asp Ser Gln Gln Thr Leu Phe 
              210                 215                 220                 
          Leu Asp Ile Val Gly Phe Asp Lys Glu Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Ser Pro Leu Pro Asn Phe Ile Phe Thr Gly Thr Thr Thr Trp Ala 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Glu Thr Lys Glu Tyr Tyr Ala Gln Gln Gln Val Asn Val Ile 
                      260                 265                 270         
          Asn Asn Ala Ile Asn Glu Thr Ser Pro Tyr Tyr Leu Gly Lys Asp Tyr 
                  275                 280                 285             
          Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ala Gly Gly Val Ile Asn Asp Ile 
              290                 295                 300                 
          Ile Leu Gly Ser Phe Pro Asp Met Ile Asn Ile Pro Ala Lys Ile Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Glu Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Thr Val Ala Gly 
                          325                 330                 335     
          Ile Ala Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Asp Lys Val Asn Phe 
                      340                 345                 350         
          Ile Val Phe Thr Ser Ser Asp Thr Ile Thr Asp Arg Glu Glu Ala Leu 
                  355                 360                 365             
          Lys Ser Pro Leu Val Gln Val Met Leu Thr Leu Gly Ile Val Lys Glu 
              370                 375                 380                 
          Lys Asp Val Leu Phe Trp Ala 
          385                 390     
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  498]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  發光菌屬物種（Photobacterium sp.）JT-ISH-224]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Met Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ile Ile Asp Glu Glu Tyr Val Asn Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Ile Ser Phe Thr Lys His Ser Trp Val Gln Thr Cys Gly Thr Gln 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Leu Thr Glu Gln Asn Lys Glu Ser Ile Ser Leu Ser Val Val 
              50                  55                  60                  
          Ala Pro Arg Leu Asp Asp Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Asp Phe Asn Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Ser Asn Lys Gly Glu Lys Tyr Ile Thr Lys Val Thr Leu Asn Val 
                          85                  90                  95      
          Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser Leu Pro Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu Asn Pro Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr Asp Glu Gln 
              130                 135                 140                 
          Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn Asn His Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln Thr Lys His 
                          165                 170                 175     
          Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser Phe Asp Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn Val Thr Val 
                  195                 200                 205             
          Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu Lys Ile Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu Asp Thr Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Ala 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu Pro Ser Leu 
                  275                 280                 285             
          His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln Met Gln Trp 
              290                 295                 300                 
          Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu Phe Leu Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr Asn Ser Ser 
                          325                 330                 335     
          Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp Ala Gly Asn 
                      340                 345                 350         
          His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val Ile Asn Asn 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Asp Leu 
              370                 375                 380                 
          Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr Leu Ile Met 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile Ser Phe Glu 
                          405                 410                 415     
          Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala Gly Ile Ala 
                      420                 425                 430         
          Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys Phe Ile Val 
                  435                 440                 445             
          Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala Leu Arg Ser 
              450                 455                 460                 
          Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys Glu Glu Asn 
          465                 470                 475                 480 
          Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly Val Cys Ile 
                          485                 490                 495     
          Ala Val 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  380]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Met Arg Asn Cys Lys Met Ala Arg Val Ala Ser Val Leu Gly Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Met Leu Ser Val Ala Leu Leu Ile Leu Ser Leu Ile Ser Tyr Val Ser 
                      20                  25                  30          
          Leu Lys Lys Glu Asn Ile Phe Thr Thr Pro Lys Tyr Ala Ser Pro Gly 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Arg Met Tyr Met Phe His Ala Gly Phe Arg Ser Gln Phe Ala 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Phe Leu Asp Gln Ser Phe Val Pro Ile Thr Asn Ser Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          His Glu Leu Gln Glu Lys Pro Ser Lys Trp Thr Phe Asn Arg Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu His Gln Arg Gln Glu Ile Leu Gln His Val Asp Val Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Asn Phe Ser Leu Thr Lys Ser Ser Val Arg Ile Gly Gln Leu Met His 
                  115                 120                 125             
          Tyr Asp Tyr Ser Ser His Lys Tyr Val Phe Ser Ile Ser Asn Asn Phe 
              130                 135                 140                 
          Arg Ser Leu Leu Pro Asp Val Ser Pro Ile Met Asn Lys Arg Tyr Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Val Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Ile Leu Thr Gly Ser Gln Cys 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Glu Ile Asp Lys Ser Asp Phe Val Phe Arg Cys Asn Phe Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Thr Glu Ala Phe His Lys Asp Val Gly Arg Lys Thr Asn Leu Thr 
                  195                 200                 205             
          Thr Phe Asn Pro Ser Ile Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Asn Leu Leu Thr 
              210                 215                 220                 
          Ile Gln Asp Arg Asn Asn Phe Phe Leu Ser Leu Lys Lys Leu Asp Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ile Leu Trp Ile Pro Ala Phe Phe Phe His Thr Ser Ala Thr Val 
                          245                 250                 255     
          Thr Arg Thr Leu Val Asp Phe Phe Val Glu His Arg Gly Gln Leu Lys 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Leu Ala Trp Pro Gly Asn Ile Met Gln His Val Asn Arg Tyr 
                  275                 280                 285             
          Trp Lys Asn Lys His Leu Ser Pro Lys Arg Leu Ser Thr Gly Ile Leu 
              290                 295                 300                 
          Met Tyr Thr Leu Ala Ser Ala Ile Cys Glu Glu Ile His Leu Tyr Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Trp Pro Phe Gly Phe Asp Pro Asn Thr Arg Glu Asp Leu Pro Tyr 
                          325                 330                 335     
          His Tyr Tyr Asp Lys Lys Gly Thr Lys Phe Thr Thr Lys Trp Gln Glu 
                      340                 345                 350         
          Ser His Gln Leu Pro Ala Glu Phe Gln Leu Leu Tyr Arg Met His Gly 
                  355                 360                 365             
          Glu Gly Leu Thr Lys Leu Thr Leu Ser His Cys Ala 
              370                 375                 380 
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  417]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Met Tyr Tyr Leu Lys Asn Thr Asn Phe Trp Met Phe Gly Leu Phe Phe 
          1               5                   10                  15      
          Phe Phe Tyr Phe Phe Ile Met Gly Ala Tyr Phe Pro Phe Phe Pro Ile 
                      20                  25                  30          
          Trp Leu His Asp Ile Asn His Ile Ser Lys Ser Asp Thr Gly Ile Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Ala Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Leu Phe Gln Pro Leu Phe Gly 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Trp Ile Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Met Leu Val Met Phe Ala Pro Phe Phe Ile Phe Ile Phe Gly 
                          85                  90                  95      
          Pro Leu Leu Gln Tyr Asn Ile Leu Val Gly Ser Ile Val Gly Gly Ile 
                      100                 105                 110         
          Tyr Leu Gly Phe Cys Phe Asn Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ala Phe 
                  115                 120                 125             
          Ile Glu Lys Val Ser Arg Arg Ser Asn Phe Glu Phe Gly Arg Ala Arg 
              130                 135                 140                 
          Met Phe Gly Cys Val Gly Trp Ala Leu Cys Ala Ser Ile Val Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Met Phe Thr Ile Asn Asn Gln Phe Val Phe Trp Leu Gly Ser Gly Cys 
                          165                 170                 175     
          Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Phe Phe Ala Lys Thr Asp Ala Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ala Thr Val Ala Asn Ala Val Gly Ala Asn His Ser Ala Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Leu Phe Arg Gln Pro Lys Leu Trp Phe 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Tyr Val Ile Gly Val Ser Cys Thr Tyr Asp Val Phe Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gln Phe Ala Asn Phe Phe Thr Ser Phe Phe Ala Thr Gly Glu Gln 
                          245                 250                 255     
          Gly Thr Arg Val Phe Gly Tyr Val Thr Thr Met Gly Glu Leu Leu Asn 
                      260                 265                 270         
          Ala Ser Ile Met Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Asn Arg Ile Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Lys Asn Ala Leu Leu Leu Ala Gly Thr Ile Met Ser Val Arg Ile Ile 
              290                 295                 300                 
          Gly Ser Ser Phe Ala Thr Ser Ala Leu Glu Val Val Ile Leu Lys Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu His Met Phe Glu Val Pro Phe Leu Leu Val Gly Cys Phe Lys Tyr 
                          325                 330                 335     
          Ile Thr Ser Gln Phe Glu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ile Tyr Leu Val 
                      340                 345                 350         
          Cys Phe Cys Phe Phe Lys Gln Leu Ala Met Ile Phe Met Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Ala Gly Asn Met Tyr Glu Ser Ile Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Leu Val 
              370                 375                 380                 
          Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Thr Leu Ile Ser Val Phe Thr Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gln Val Asn Glu Val 
                          405                 410                 415     
          Ala 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  415]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌W]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Met Ala Leu Asn Ile Pro Phe Arg Asn Ala Tyr Tyr Arg Phe Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Tyr Ser Phe Leu Phe Phe Ile Ser Trp Ser Leu Trp Trp Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ala Ile Trp Leu Lys Gly His Leu Gly Leu Thr Gly Thr Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Thr Leu Tyr Ser Val Asn Gln Phe Thr Ser Ile Leu Phe Met Met 
              50                  55                  60                  
          Phe Tyr Gly Ile Val Gln Asp Lys Leu Gly Leu Lys Lys Pro Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Trp Cys Met Ser Phe Ile Leu Val Leu Thr Gly Pro Phe Met Ile Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Tyr Glu Pro Leu Leu Gln Ser Asn Phe Ser Val Gly Leu Ile Leu 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Leu Phe Phe Gly Leu Gly Tyr Leu Ala Gly Cys Gly Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Asp Ser Phe Thr Glu Lys Met Ala Arg Asn Phe His Phe Glu Tyr Gly 
              130                 135                 140                 
          Thr Ala Arg Ala Trp Gly Ser Phe Gly Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Gly Ile Phe Phe Ser Ile Ser Pro His Ile Asn Phe Trp Leu Val 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Phe Gly Ala Val Phe Met Met Ile Asn Met Arg Phe Lys Asp 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp His Gln Cys Val Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val Lys Lys Glu 
                  195                 200                 205             
          Asp Phe Ile Ala Val Phe Lys Asp Arg Asn Phe Trp Val Phe Val Ile 
              210                 215                 220                 
          Phe Ile Val Gly Thr Trp Ser Phe Tyr Asn Ile Phe Asp Gln Gln Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Val Phe Tyr Ser Gly Leu Phe Glu Ser His Asp Val Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asn Ser Phe Gln Val Val Leu Glu Ala Leu 
                      260                 265                 270         
          Cys Met Ala Ile Ile Pro Phe Phe Val Asn Arg Val Gly Pro Lys Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Leu Leu Ile Gly Val Val Ile Met Ala Leu Arg Ile Leu Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ala Leu Phe Val Asn Pro Trp Ile Ile Ser Leu Val Lys Leu Leu His 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ile Glu Val Pro Leu Cys Val Ile Ser Val Phe Lys Tyr Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Ala Asn Phe Asp Lys Arg Leu Ser Ser Thr Ile Phe Leu Ile Gly Phe 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Ala Ser Ser Leu Gly Ile Val Leu Leu Ser Thr Pro Thr Gly 
                  355                 360                 365             
          Ile Leu Phe Asp His Ala Gly Tyr Gln Thr Val Phe Phe Ala Ile Ser 
              370                 375                 380                 
          Gly Ile Val Cys Leu Met Leu Leu Phe Gly Ile Phe Phe Leu Ser Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Arg Glu Gln Ile Val Met Glu Thr Pro Val Pro Ser Ala Ile 
                          405                 410                 415 
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  301]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  運動醱酵單胞菌（Z. mobilis）]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Met Lys Asn Asp Lys Lys Ile Tyr Gly Cys Ile Glu Gly Gly Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Lys Phe Met Leu Ala Leu Ile Asp Ser Asp Arg Lys Met Leu Ala Val 
                      20                  25                  30          
          Glu Arg Val Pro Thr Thr Thr Pro Glu Glu Thr Leu Gly Lys Ser Val 
                  35                  40                  45              
          Glu Phe Phe Lys Lys Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Asp Ser Phe Ala Ser 
              50                  55                  60                  
          Phe Gly Ile Ala Ser Phe Gly Pro Leu Cys Leu Asp Arg Lys Ser Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Trp Gly Tyr Ile Thr Asn Thr Pro Lys Pro Phe Trp Pro Asn Thr 
                          85                  90                  95      
          Asp Val Val Thr Pro Phe Lys Glu Ala Phe Gly Cys Pro Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Asp Thr Asp Val Asn Gly Ala Ala Leu Ala Glu Asn Phe Trp Gly Ala 
                  115                 120                 125             
          Ser Lys Gly Thr His Thr Ser Val Tyr Val Thr Val Gly Thr Gly Phe 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Gly Val Leu Ile Asp Gly Lys Pro Ile His Gly Leu Ala His 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Glu Met Gly His Gly Ile Pro Ile Arg His Pro Asp Asp Arg Asp 
                          165                 170                 175     
          Phe Glu Gly Cys Cys Pro Tyr His Gly Gly Cys Tyr Glu Gly Leu Ala 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Thr Ala Ile Arg Lys Arg Trp Gly Lys Ala Leu Asn Glu Met 
                  195                 200                 205             
          Glu Pro Ala Glu Phe Glu Lys Ala Arg Glu Ile Ile Ala Phe Tyr Leu 
              210                 215                 220                 
          Ala His Phe Asn Val Thr Leu Gln Ala Phe Ile Ser Pro Glu Arg Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Val Phe Gly Gly Gly Val Met His Val Asp Gly Met Leu Ala Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Arg Arg Gln Thr Ala Glu Ile Ala Asn Ser Tyr Phe Glu Gly Ala Asp 
                      260                 265                 270         
          Phe Glu Lys Ile Ile Val Leu Pro Gly Leu Gly Asp Gln Ala Gly Met 
                  275                 280                 285             
          Met Gly Ala Phe Ala Leu Ala Leu Ala Ala Glu Asn Lys 
              290                 295                 300     
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  504]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  青春雙叉桿菌（B. adolescentis）]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Gly Thr Ile Lys Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 
                  35                  40                  45              
          Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg 
              50                  55                  60                  
          Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe 
                          85                  90                  95      
          Gln Asp Val Leu Ala Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys 
              130                 135                 140                 
          Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Asp Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser 
                          165                 170                 175     
          Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Ser Tyr Ile Arg Leu Asp 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys 
              210                 215                 220                 
          Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro 
                          245                 250                 255     
          Pro Leu Leu Leu His Ala Leu Ser Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala 
                      260                 265                 270         
          His Trp Thr Asp Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr 
                  275                 280                 285             
          His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg 
              290                 295                 300                 
          Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Gln Ala Ala Thr Gly Ala 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln 
                  355                 360                 365             
          Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala 
              370                 375                 380                 
          Gly Lys Asn Asp Met Glu Leu Leu Arg Lys Thr Asn Asn Gly Arg Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Lys 
                          405                 410                 415     
          Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu 
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Ala Phe Asp Gly Thr Phe Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Asp Thr 
                  435                 440                 445             
          Ser Ile Ser Phe Thr Trp Arg Gly Glu Thr Ser Gln Ala Thr Leu Thr 
              450                 455                 460                 
          Phe Glu Pro Lys Arg Gly Leu Gly Val Asp Asn Thr Thr Pro Val Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Met Leu Glu Trp Glu Asp Ser Ala Gly Asp His Arg Ser Asp Asp Leu 
                          485                 490                 495     
          Ile Ala Asn Pro Pro Val Val Ala 
                      500                 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  299]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  幽門螺旋桿菌UA1234]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met 
          1               5                   10                  15      
          Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Ser Asn Thr Pro 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln 
                  35                  40                  45              
          Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Glu Lys Glu Ile 
              50                  55                  60                  
          Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr 
                          85                  90                  95      
          Glu Pro Lys Leu Leu Lys Thr Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr 
                      100                 105                 110         
          Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln 
                  115                 120                 125             
          Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Glu Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Phe Val His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Met Ala Lys 
                      180                 185                 190         
          Arg Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe 
                  195                 200                 205             
          Thr Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Leu Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu 
                      260                 265                 270         
          Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser 
                  275                 280                 285             
          His Phe Glu Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala 
              290                 295                 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  478]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  幽門螺旋桿菌UA1234]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Met Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Tyr Val Glu Ser Ala Ser Ile Glu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Met Ala Ser Lys Ser Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val Ala Asn 
                      20                  25                  30          
          Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Asn Ser Val Leu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Thr Ile Thr Leu His Gln Asn Pro Asn 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Ser Asp Leu Val Phe Gly Asn Pro Leu Gly Ser Ala Arg Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Ala Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly Glu Asn 
                          85                  90                  95      
          Glu Ser Pro Asn Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Asp Phe Asn Asp Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr Asp Arg 
                  115                 120                 125             
          Leu His His Lys Ala Glu Ser Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro Tyr Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His Cys Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Lys His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Ser Asp 
                          165                 170                 175     
          Pro Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Pro Asn Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Ile Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu Pro Val 
                  195                 200                 205             
          Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Asn Val Lys Asn 
              210                 215                 220                 
          Lys Asn Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe Glu Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Ile Asp Ala Tyr Phe 
                          245                 250                 255     
          Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala Lys Asp 
                      260                 265                 270         
          Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Lys Asn Phe Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Lys Asn Ala Tyr 
              290                 295                 300                 
          Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly Lys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Phe Tyr Gln Asn Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Ala Phe Phe Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Asp Asn Pro Phe Ile Phe 
                      340                 345                 350         
          Cys Arg Asp Leu Asn Glu Pro Leu Val Thr Ile Asp Asp Leu Arg Val 
                  355                 360                 365             
          Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr 
              370                 375                 380                 
          Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr Asp Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg 
                          405                 410                 415     
          Ile Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Arg Leu Leu Ser Lys Ala Thr Pro Leu Leu Glu Leu Ser Gln 
                  435                 440                 445             
          Asn Thr Thr Ser Lys Ile Tyr Arg Lys Ala Tyr Gln Lys Ser Leu Pro 
              450                 455                 460                 
          Leu Leu Arg Ala Ile Arg Arg Trp Val Lys Lys Leu Gly Leu 
          465                 470                 475             
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  264]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Met Lys Gln Tyr Leu Glu Leu Met Gln Lys Val Leu Asp Glu Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Asn Asp Arg Thr Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ile Phe Gly His 
                      20                  25                  30          
          Gln Met Arg Phe Asn Leu Gln Asp Gly Phe Pro Leu Val Thr Thr Lys 
                  35                  40                  45              
          Arg Cys His Leu Arg Ser Ile Ile His Glu Leu Leu Trp Phe Leu Gln 
              50                  55                  60                  
          Gly Asp Thr Asn Ile Ala Tyr Leu His Glu Asn Asn Val Thr Ile Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Glu Trp Ala Asp Glu Asn Gly Asp Leu Gly Pro Val Tyr Gly Lys 
                          85                  90                  95      
          Gln Trp Arg Ala Trp Pro Thr Pro Asp Gly Arg His Ile Asp Gln Ile 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Leu Asn Gln Leu Lys Asn Asp Pro Asp Ser Arg Arg Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Val Ser Ala Trp Asn Val Gly Glu Leu Asp Lys Met Ala Leu Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Cys His Ala Phe Phe Gln Phe Tyr Val Ala Asp Gly Lys Leu Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Cys Asp Val Phe Leu Gly Leu Pro Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Val His Met Met Ala Gln Gln Cys 
                      180                 185                 190         
          Asp Leu Glu Val Gly Asp Phe Val Trp Thr Gly Gly Asp Thr His Leu 
                  195                 200                 205             
          Tyr Ser Asn His Met Asp Gln Thr His Leu Gln Leu Ser Arg Glu Pro 
              210                 215                 220                 
          Arg Pro Leu Pro Lys Leu Ile Ile Lys Arg Lys Pro Glu Ser Ile Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Tyr Arg Phe Glu Asp Phe Glu Ile Glu Gly Tyr Asp Pro His Pro 
                          245                 250                 255     
          Gly Ile Lys Ala Pro Val Ala Ile 
                      260                 
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  391]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Met Gln Lys Leu Ile Asn Ser Val Gln Asn Tyr Ala Trp Gly Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ala Leu Thr Glu Leu Tyr Gly Met Glu Asn Pro Ser Ser Gln Pro 
                      20                  25                  30          
          Met Ala Glu Leu Trp Met Gly Ala His Pro Lys Ser Ser Ser Arg Val 
                  35                  40                  45              
          Gln Asn Ala Ala Gly Asp Ile Val Ser Leu Arg Asp Val Ile Glu Ser 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Ser Thr Leu Leu Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe Gly Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Phe Leu Phe Lys Val Leu Cys Ala Ala Gln Pro Leu Ser Ile 
                          85                  90                  95      
          Gln Val His Pro Asn Lys His Asn Ser Glu Ile Gly Phe Ala Lys Glu 
                      100                 105                 110         
          Asn Ala Ala Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg Asn Tyr Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Pro Asn His Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Leu Thr Pro Phe Leu Ala 
              130                 135                 140                 
          Met Asn Ala Phe Arg Glu Phe Ser Glu Ile Val Ser Leu Leu Gln Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ala Gly Ala His Pro Ala Ile Ala His Phe Leu Gln Gln Pro Asp 
                          165                 170                 175     
          Ala Glu Arg Leu Ser Glu Leu Phe Ala Ser Leu Leu Asn Met Gln Gly 
                      180                 185                 190         
          Glu Glu Lys Ser Arg Ala Leu Ala Ile Leu Lys Ser Ala Leu Asp Ser 
                  195                 200                 205             
          Gln Gln Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg Leu Ile Ser Glu Phe Tyr 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Asp Ser Gly Leu Phe Ser Pro Leu Leu Leu Asn Val Val Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Asn Pro Gly Glu Ala Met Phe Leu Phe Ala Glu Thr Pro His Ala 
                          245                 250                 255     
          Tyr Leu Gln Gly Val Ala Leu Glu Val Met Ala Asn Ser Asp Asn Val 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Ala Gly Leu Thr Pro Lys Tyr Ile Asp Ile Pro Glu Leu Val 
                  275                 280                 285             
          Ala Asn Val Lys Phe Glu Ala Lys Pro Ala Asn Gln Leu Leu Thr Gln 
              290                 295                 300                 
          Pro Val Lys Gln Gly Ala Glu Leu Asp Phe Pro Ile Pro Val Asp Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Ala Phe Ser Leu His Asp Leu Ser Asp Lys Glu Thr Thr Ile Ser 
                          325                 330                 335     
          Gln Gln Ser Ala Ala Ile Leu Phe Cys Val Glu Gly Asp Ala Thr Leu 
                      340                 345                 350         
          Trp Lys Gly Ser Gln Gln Leu Gln Leu Lys Pro Gly Glu Ser Ala Phe 
                  355                 360                 365             
          Ile Ala Ala Asn Glu Ser Pro Val Thr Val Lys Gly His Gly Arg Leu 
              370                 375                 380                 
          Ala Arg Val Tyr Asn Lys Leu 
          385                 390     
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  456]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Met Lys Lys Leu Thr Cys Phe Lys Ala Tyr Asp Ile Arg Gly Lys Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gly Glu Glu Leu Asn Glu Asp Ile Ala Trp Arg Ile Gly Arg Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Glu Phe Leu Lys Pro Lys Thr Ile Val Leu Gly Gly Asp Val Arg 
                  35                  40                  45              
          Leu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Leu Ala Leu Ala Lys Gly Leu Gln Asp 
              50                  55                  60                  
          Ala Gly Val Asp Val Leu Asp Ile Gly Met Ser Gly Thr Glu Glu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Phe Ala Thr Phe His Leu Gly Val Asp Gly Gly Ile Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser His Asn Pro Met Asp Tyr Asn Gly Met Lys Leu Val Arg Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Arg Pro Ile Ser Gly Asp Thr Gly Leu Arg Asp Val Gln Arg 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Glu Ala Asn Asp Phe Pro Pro Val Asp Glu Thr Lys Arg Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Tyr Val Asp His Leu Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Tyr Ile Asn Val Lys Asn Leu Thr Pro Leu Lys Leu Val Ile Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Gly Asn Gly Ala Ala Gly Pro Val Val Asp Ala Ile Glu Ala Arg 
                      180                 185                 190         
          Phe Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Glu Leu Ile Lys Val His Asn Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Asp Gly Asn Phe Pro Asn Gly Ile Pro Asn Pro Leu Leu Pro Glu 
              210                 215                 220                 
          Cys Arg Asp Asp Thr Arg Asn Ala Val Ile Lys His Gly Ala Asp Met 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ile Ala Phe Asp Gly Asp Phe Asp Arg Cys Phe Leu Phe Asp Glu 
                          245                 250                 255     
          Lys Gly Gln Phe Ile Glu Gly Tyr Tyr Ile Val Gly Leu Leu Ala Glu 
                      260                 265                 270         
          Ala Phe Leu Glu Lys Asn Pro Gly Ala Lys Ile Ile His Asp Pro Arg 
                  275                 280                 285             
          Leu Ser Trp Asn Thr Val Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Gly Thr Pro 
              290                 295                 300                 
          Val Met Ser Lys Thr Gly His Ala Phe Ile Lys Glu Arg Met Arg Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Asp Ala Ile Tyr Gly Gly Glu Met Ser Ala His His Tyr Phe Arg 
                          325                 330                 335     
          Asp Phe Ala Tyr Cys Asp Ser Gly Met Ile Pro Trp Leu Leu Val Ala 
                      340                 345                 350         
          Glu Leu Val Cys Leu Lys Asp Lys Thr Leu Gly Glu Leu Val Arg Asp 
                  355                 360                 365             
          Arg Met Ala Ala Phe Pro Ala Ser Gly Glu Ile Asn Ser Lys Leu Ala 
              370                 375                 380                 
          Gln Pro Val Glu Ala Ile Asn Arg Val Glu Gln His Phe Ser Arg Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Leu Ala Val Asp Arg Thr Asp Gly Ile Ser Met Thr Phe Ala Asp 
                          405                 410                 415     
          Trp Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Asn Thr Glu Pro Val Val Arg Leu 
                      420                 425                 430         
          Asn Val Glu Ser Arg Gly Asp Val Pro Leu Met Glu Ala Arg Thr Arg 
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Leu Thr Leu Leu Asn Glu 
              450                 455     
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  478]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Met Ala Gln Ser Lys Leu Tyr Pro Val Val Met Ala Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Arg Leu Trp Pro Leu Ser Arg Val Leu Tyr Pro Lys Gln Phe Leu 
                      20                  25                  30          
          Cys Leu Lys Gly Asp Leu Thr Met Leu Gln Thr Thr Ile Cys Arg Leu 
                  35                  40                  45              
          Asn Gly Val Glu Cys Glu Ser Pro Val Val Ile Cys Asn Glu Gln His 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ile Val Ala Glu Gln Leu Arg Gln Leu Asn Lys Leu Thr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ile Ile Leu Glu Pro Ala Gly Arg Asn Thr Ala Pro Ala Ile Ala 
                          85                  90                  95      
          Leu Ala Ala Leu Ala Ala Lys Arg His Ser Pro Glu Ser Asp Pro Leu 
                      100                 105                 110         
          Met Leu Val Leu Ala Ala Asp His Val Ile Ala Asp Glu Asp Ala Phe 
                  115                 120                 125             
          Arg Ala Ala Val Arg Asn Ala Met Pro Tyr Ala Glu Ala Gly Lys Leu 
              130                 135                 140                 
          Val Thr Phe Gly Ile Val Pro Asp Leu Pro Glu Thr Gly Tyr Gly Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Arg Arg Gly Glu Val Ser Ala Gly Glu Gln Asp Met Val Ala Phe 
                          165                 170                 175     
          Glu Val Ala Gln Phe Val Glu Lys Pro Asn Leu Glu Thr Ala Gln Ala 
                      180                 185                 190         
          Tyr Val Ala Ser Gly Glu Tyr Tyr Trp Asn Ser Gly Met Phe Leu Phe 
                  195                 200                 205             
          Arg Ala Gly Arg Tyr Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Leu Asp Ala Cys Glu Lys Ala Met Ser Ala Val Asp Pro Asp Leu Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Ile Arg Val Asp Glu Glu Ala Phe Leu Ala Cys Pro Glu Glu Ser 
                          245                 250                 255     
          Val Asp Tyr Ala Val Met Glu Arg Thr Ala Asp Ala Val Val Val Pro 
                      260                 265                 270         
          Met Asp Ala Gly Trp Ser Asp Val Gly Ser Trp Ser Ser Leu Trp Glu 
                  275                 280                 285             
          Ile Ser Ala His Thr Ala Glu Gly Asn Val Cys His Gly Asp Val Ile 
              290                 295                 300                 
          Asn His Lys Thr Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Ala Glu Ser Gly Leu Val 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Thr Val Gly Val Lys Asp Leu Val Val Val Gln Thr Lys Asp Ala 
                          325                 330                 335     
          Val Leu Ile Ala Asp Arg Asn Ala Val Gln Asp Val Lys Lys Val Val 
                      340                 345                 350         
          Glu Gln Ile Lys Ala Asp Gly Arg His Glu His Arg Val His Arg Glu 
                  355                 360                 365             
          Val Tyr Arg Pro Trp Gly Lys Tyr Asp Ser Ile Asp Ala Gly Asp Arg 
              370                 375                 380                 
          Tyr Gln Val Lys Arg Ile Thr Val Lys Pro Gly Glu Gly Leu Ser Val 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Met His His His Arg Ala Glu His Trp Val Val Val Ala Gly Thr 
                          405                 410                 415     
          Ala Lys Val Thr Ile Asp Gly Asp Ile Lys Leu Leu Gly Glu Asn Glu 
                      420                 425                 430         
          Ser Ile Tyr Ile Pro Leu Gly Ala Thr His Cys Leu Glu Asn Pro Gly 
                  435                 440                 445             
          Lys Ile Pro Leu Asp Leu Ile Glu Val Arg Ser Gly Ser Tyr Leu Glu 
              450                 455                 460                 
          Glu Asp Asp Val Val Arg Phe Ala Asp Arg Tyr Gly Arg Val 
          465                 470                 475             
          <![CDATA[<210>  32]]>
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          <![CDATA[<400>  32]]>
          Met Ser Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Arg Arg Ala Ser Ser Phe Asn Thr Glu Arg Val Asp His Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Gln Asp Pro His Thr Cys Asn Pro Lys Phe His Leu His Tyr Gly Asp 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Asp Thr Ser Asn Leu Thr Arg Ile Leu Arg Glu Val Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Ala Val Ser Phe 
                          85                  90                  95      
          Glu Ser Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Met Gly Thr Leu Arg 
                      100                 105                 110         
          Leu Leu Glu Ala Ile Arg Phe Leu Gly Leu Glu Lys Lys Thr Arg Phe 
                  115                 120                 125             
          Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Leu Val Gln Glu Ile Pro 
              130                 135                 140                 
          Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Gly 
                          165                 170                 175     
          Met Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg 
                      180                 185                 190         
          Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ile Ala Asn Ile 
                  195                 200                 205             
          Ala Gln Gly Leu Glu Ser Cys Leu Tyr Leu Gly Asn Met Asp Ser Leu 
              210                 215                 220                 
          Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Lys Met Gln Trp Met Met 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Gln Gln Glu Gln Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Val Gln 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Val Arg Gln Phe Val Glu Met Ala Ala Ala Gln Leu Gly Ile 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Arg Phe Glu Gly Thr Gly Val Glu Glu Lys Gly Ile Val Val 
                  275                 280                 285             
          Ser Val Thr Gly His Asp Ala Pro Gly Val Lys Pro Gly Asp Val Ile 
              290                 295                 300                 
          Ile Ala Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Glu Thr Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala His Glu Lys Leu Gly Trp Lys Pro Glu 
                          325                 330                 335     
          Ile Thr Leu Arg Glu Met Val Ser Glu Met Val Ala Asn Asp Leu Glu 
                      340                 345                 350         
          Ala Ala Lys Lys His Ser Leu Leu Lys Ser His Gly Tyr Asp Val Ala 
                  355                 360                 365             
          Ile Ala Leu Glu Ser 
              370             
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  321]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Met Ser Lys Gln Arg Val Phe Ile Ala Gly His Arg Gly Met Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Ile Arg Arg Gln Leu Glu Gln Arg Gly Asp Val Glu Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Arg Thr Arg Asp Glu Leu Asn Leu Leu Asp Ser Arg Ala Val His 
                  35                  40                  45              
          Asp Phe Phe Ala Ser Glu Arg Ile Asp Gln Val Tyr Leu Ala Ala Ala 
              50                  55                  60                  
          Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gln Asn Met Met Ile Glu Ser Asn Ile Ile His Ala Ala His Gln 
                          85                  90                  95      
          Asn Asp Val Asn Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro 
                      100                 105                 110         
          Lys Leu Ala Lys Gln Pro Met Ala Glu Ser Glu Leu Leu Gln Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Leu Glu Pro Thr Asn Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Arg Asp Tyr Arg Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro His Asp Asn Phe His Pro Ser 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser His Val Ile Pro Ala Leu Leu Arg Arg Phe His Glu Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Ala Gln Asn Ala Pro Asp Val Val Val Trp Gly Ser Gly Thr Pro Met 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Met Ala Ala Ala Ser Ile His Val 
              210                 215                 220                 
          Met Glu Leu Ala His Glu Val Trp Leu Glu Asn Thr Gln Pro Met Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ser His Ile Asn Val Gly Thr Gly Val Asp Cys Thr Ile Arg Glu Leu 
                          245                 250                 255     
          Ala Gln Thr Ile Ala Lys Val Val Gly Tyr Lys Gly Arg Val Val Phe 
                      260                 265                 270         
          Asp Ala Ser Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu Leu Asp Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu His Gln Leu Gly Trp Tyr His Glu Ile Ser Leu Glu Ala Gly 
              290                 295                 300                 
          Leu Ala Ser Thr Tyr Gln Trp Phe Leu Glu Asn Gln Asp Arg Phe Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Gly 
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  438]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Met Gly Asn Thr Ser Ile Gln Thr Gln Ser Tyr Arg Ala Val Asp Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp Ala Gly Gln Ser Arg Ser Tyr Ile Ile Pro Phe Ala Leu Leu Cys 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Phe Phe Leu Trp Ala Val Ala Asn Asn Leu Asn Asp Ile Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Pro Gln Phe Gln Gln Ala Phe Thr Leu Thr Asn Phe Gln Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Gln Ser Ala Phe Tyr Phe Gly Tyr Phe Ile Ile Pro Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Gly Ile Leu Met Lys Lys Leu Ser Tyr Lys Ala Gly Ile Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Gly Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Leu Phe Trp Pro Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Glu Ile Met Asn Tyr Thr Leu Phe Leu Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Leu Gly Cys Leu Glu Thr Ala Ala Asn Pro Phe Val Thr Val 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Pro Glu Ser Ser Gly His Phe Arg Leu Asn Leu Ala Gln Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Asn Ser Phe Gly Ala Ile Ile Ala Val Val Phe Gly Gln Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ile Leu Ser Asn Val Pro His Gln Ser Gln Asp Val Leu Asp Lys Met 
                      180                 185                 190         
          Ser Pro Glu Gln Leu Ser Ala Tyr Lys His Ser Leu Val Leu Ser Val 
                  195                 200                 205             
          Gln Thr Pro Tyr Met Ile Ile Val Ala Ile Val Leu Leu Val Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Ile Met Leu Thr Lys Phe Pro Ala Leu Gln Ser Asp Asn His Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Ala Lys Gln Gly Ser Phe Ser Ala Ser Leu Ser Arg Leu Ala Arg 
                          245                 250                 255     
          Ile Arg His Trp Arg Trp Ala Val Leu Ala Gln Phe Cys Tyr Val Gly 
                      260                 265                 270         
          Ala Gln Thr Ala Cys Trp Ser Tyr Leu Ile Arg Tyr Ala Val Glu Glu 
                  275                 280                 285             
          Ile Pro Gly Met Thr Ala Gly Phe Ala Ala Asn Tyr Leu Thr Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Met Val Cys Phe Phe Ile Gly Arg Phe Thr Gly Thr Trp Leu Ile Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Phe Ala Pro His Lys Val Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ile Ala Met 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Cys Leu Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gly His Val Gly Leu Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Thr Leu Cys Ser Ala Phe Met Ser Ile Gln Tyr Pro Thr Ile 
                  355                 360                 365             
          Phe Ser Leu Gly Ile Lys Asn Leu Gly Gln Asp Thr Lys Tyr Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Ser Phe Ile Val Met Thr Ile Ile Gly Gly Gly Ile Val Thr Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Met Gly Phe Val Ser Asp Ala Ala Gly Asn Ile Pro Thr Ala Glu Leu 
                          405                 410                 415     
          Ile Pro Ala Leu Cys Phe Ala Val Ile Phe Ile Phe Ala Arg Phe Arg 
                      420                 425                 430         
          Ser Gln Thr Ala Thr Asn 
                  435             
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  949]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）NCTC 9343]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Met Gln Lys Leu Leu Ser Leu Pro Ser Asn Leu Val Gln Ser Phe His 
          1               5                   10                  15      
          Glu Leu Glu Arg Val Asn Arg Thr Asp Trp Phe Cys Thr Ser Asp Pro 
                      20                  25                  30          
          Val Gly Lys Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Trp Leu Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Glu Cys Tyr Asn Glu Tyr Ser Asp Gly Ala Thr Phe Gly Glu Trp Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Glu Lys Arg Ile Leu Leu His Ala Gly Gly Gln Ser Arg Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Gly Tyr Ala Pro Ser Gly Lys Ile Leu Thr Pro Val Pro Val 
                          85                  90                  95      
          Phe Arg Trp Glu Arg Gly Gln His Leu Gly Gln Asn Leu Leu Ser Leu 
                      100                 105                 110         
          Gln Leu Pro Leu Tyr Glu Lys Ile Met Ser Leu Ala Pro Asp Lys Leu 
                  115                 120                 125             
          His Thr Leu Ile Ala Ser Gly Asp Val Tyr Ile Arg Ser Glu Lys Pro 
              130                 135                 140                 
          Leu Gln Ser Ile Pro Glu Ala Asp Val Val Cys Tyr Gly Leu Trp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Pro Ser Leu Ala Thr His His Gly Val Phe Ala Ser Asp Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          His Pro Glu Gln Leu Asp Phe Met Leu Gln Lys Pro Ser Leu Ala Glu 
                      180                 185                 190         
          Leu Glu Ser Leu Ser Lys Thr His Leu Phe Leu Met Asp Ile Gly Ile 
                  195                 200                 205             
          Trp Leu Leu Ser Asp Arg Ala Val Glu Ile Leu Met Lys Arg Ser His 
              210                 215                 220                 
          Lys Glu Ser Ser Glu Glu Leu Lys Tyr Tyr Asp Leu Tyr Ser Asp Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Leu Ala Leu Gly Thr His Pro Arg Ile Glu Asp Glu Glu Val Asn 
                          245                 250                 255     
          Thr Leu Ser Val Ala Ile Leu Pro Leu Pro Gly Gly Glu Phe Tyr His 
                      260                 265                 270         
          Tyr Gly Thr Ser Lys Glu Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ser Val Gln Asn 
                  275                 280                 285             
          Lys Val Tyr Asp Gln Arg Arg Ile Met His Arg Lys Val Lys Pro Asn 
              290                 295                 300                 
          Pro Ala Met Phe Val Gln Asn Ala Val Val Arg Ile Pro Leu Cys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Asn Ala Asp Leu Trp Ile Glu Asn Ser His Ile Gly Pro Lys Trp 
                          325                 330                 335     
          Lys Ile Ala Ser Arg His Ile Ile Thr Gly Val Pro Glu Asn Asp Trp 
                      340                 345                 350         
          Ser Leu Ala Val Pro Ala Gly Val Cys Val Asp Val Val Pro Met Gly 
                  355                 360                 365             
          Asp Lys Gly Phe Val Ala Arg Pro Tyr Gly Leu Asp Asp Val Phe Lys 
              370                 375                 380                 
          Gly Asp Leu Arg Asp Ser Lys Thr Thr Leu Thr Gly Ile Pro Phe Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Trp Met Ser Lys Arg Gly Leu Ser Tyr Thr Asp Leu Lys Gly Arg 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Asp Leu Gln Ala Val Ser Val Phe Pro Met Val Asn Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Glu Glu Leu Gly Leu Val Leu Arg Trp Met Leu Ser Glu Pro Glu Leu 
                  435                 440                 445             
          Glu Glu Gly Lys Asn Ile Trp Leu Arg Ser Glu His Phe Ser Ala Asp 
              450                 455                 460                 
          Glu Ile Ser Ala Gly Ala Asn Leu Lys Arg Leu Tyr Ala Gln Arg Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Phe Arg Lys Gly Asn Trp Lys Ala Leu Ala Val Asn His Glu Lys 
                          485                 490                 495     
          Ser Val Phe Tyr Gln Leu Asp Leu Ala Asp Ala Ala Glu Asp Phe Val 
                      500                 505                 510         
          Arg Leu Gly Leu Asp Met Pro Glu Leu Leu Pro Glu Asp Ala Leu Gln 
                  515                 520                 525             
          Met Ser Arg Ile His Asn Arg Met Leu Arg Ala Arg Ile Leu Lys Leu 
              530                 535                 540                 
          Asp Gly Lys Asp Tyr Arg Pro Glu Glu Gln Ala Ala Phe Asp Leu Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Asp Gly Leu Leu Asp Gly Ile Ser Asn Arg Lys Ser Thr Pro Lys 
                          565                 570                 575     
          Leu Asp Val Tyr Ser Asp Gln Ile Val Trp Gly Arg Ser Pro Val Arg 
                      580                 585                 590         
          Ile Asp Met Ala Gly Gly Trp Thr Asp Thr Pro Pro Tyr Ser Leu Tyr 
                  595                 600                 605             
          Ser Gly Gly Asn Val Val Asn Leu Ala Ile Glu Leu Asn Gly Gln Pro 
              610                 615                 620                 
          Pro Leu Gln Val Tyr Val Lys Pro Cys Lys Asp Phe His Ile Val Leu 
          625                 630                 635                 640 
          Arg Ser Ile Asp Met Gly Ala Met Glu Ile Val Ser Thr Phe Asp Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Gln Asp Tyr Lys Lys Ile Gly Ser Pro Phe Ser Ile Pro Lys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ala Leu Ser Leu Ala Gly Phe Ala Pro Ala Phe Ser Ala Val Ser Tyr 
                  675                 680                 685             
          Ala Ser Leu Glu Glu Gln Leu Lys Asp Phe Gly Ala Gly Ile Glu Val 
              690                 695                 700                 
          Thr Leu Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Ser Gly Leu Gly Thr Ser Ser 
          705                 710                 715                 720 
          Ile Leu Ala Ser Thr Val Leu Gly Ala Ile Asn Asp Phe Cys Gly Leu 
                          725                 730                 735     
          Ala Trp Asp Lys Asn Glu Ile Cys Gln Arg Thr Leu Val Leu Glu Gln 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Thr Thr Gly Gly Gly Trp Gln Asp Gln Tyr Gly Gly Val Leu 
                  755                 760                 765             
          Gln Gly Val Lys Leu Leu Gln Thr Glu Ala Gly Phe Ala Gln Ser Pro 
              770                 775                 780                 
          Leu Val Arg Trp Leu Pro Asp His Leu Phe Thr His Pro Glu Tyr Lys 
          785                 790                 795                 800 
          Asp Cys His Leu Leu Tyr Tyr Thr Gly Ile Thr Arg Thr Ala Lys Gly 
                          805                 810                 815     
          Ile Leu Ala Glu Ile Val Ser Ser Met Phe Leu Asn Ser Ser Leu His 
                      820                 825                 830         
          Leu Asn Leu Leu Ser Glu Met Lys Ala His Ala Leu Asp Met Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Ala Ile Gln Arg Gly Ser Phe Val Glu Phe Gly Arg Leu Val Gly Lys 
              850                 855                 860                 
          Thr Trp Glu Gln Asn Lys Ala Leu Asp Ser Gly Thr Asn Pro Pro Ala 
          865                 870                 875                 880 
          Val Glu Ala Ile Ile Asp Leu Ile Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Tyr Lys 
                          885                 890                 895     
          Leu Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Leu Tyr Met Val Ala Lys Asp 
                      900                 905                 910         
          Pro Gln Ala Ala Val Arg Ile Arg Lys Ile Leu Thr Glu Asn Ala Pro 
                  915                 920                 925             
          Asn Pro Arg Ala Arg Phe Val Glu Met Thr Leu Ser Asp Lys Gly Phe 
              930                 935                 940                 
          Gln Val Ser Arg Ser 
          945                 
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  348]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腦膜炎奈瑟氏菌]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Met Pro Ser Glu Ala Phe Arg Arg His Arg Ala Tyr Arg Glu Asn Lys 
          1               5                   10                  15      
          Leu Gln Pro Leu Val Ser Val Leu Ile Cys Ala Tyr Asn Val Glu Lys 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ala Gln Ser Leu Ala Ala Val Val Asn Gln Thr Trp Cys Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Asp Ile Leu Ile Val Asp Asp Gly Ser Thr Asp Gly Thr Leu Ala 
              50                  55                  60                  
          Ile Ala Gln Arg Phe Gln Glu Gln Asp Gly Arg Ile Lys Ile Leu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Gln Asn Ser Gly Leu Ile Pro Ser Leu Asn Ile Gly Leu Asp 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Ala Lys Ser Gly Met Gly Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Asp Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Ile Ala Ala Pro Asp Trp Ile Glu Lys Ile Val Gly Glu Met 
                  115                 120                 125             
          Glu Lys Asp Arg Ser Ile Ile Ala Met Gly Ala Trp Leu Glu Val Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Glu Glu Lys Asp Gly Asn Arg Leu Ala Arg His His Glu His Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ile Trp Lys Lys Pro Thr Arg His Glu Asp Ile Ala Asp Phe Phe 
                          165                 170                 175     
          Pro Phe Gly Asn Pro Ile His Asn Asn Thr Met Ile Met Arg Arg Ser 
                      180                 185                 190         
          Val Ile Asp Gly Gly Leu Arg Tyr Asn Thr Glu Arg Asp Trp Ala Glu 
                  195                 200                 205             
          Asp Tyr Gln Phe Trp Tyr Asp Val Ser Lys Leu Gly Arg Leu Ala Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Glu Ala Leu Val Lys Tyr Arg Leu His Ala Asn Gln Val Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Lys Tyr Ser Ile Arg Gln His Glu Ile Ala Gln Gly Ile Gln Lys 
                          245                 250                 255     
          Thr Ala Arg Asn Asp Phe Leu Gln Ser Met Gly Phe Lys Thr Arg Phe 
                      260                 265                 270         
          Asp Ser Leu Glu Tyr Arg Gln Ile Lys Ala Val Ala Tyr Glu Leu Leu 
                  275                 280                 285             
          Glu Lys His Leu Pro Glu Glu Asp Phe Glu Arg Ala Arg Arg Phe Leu 
              290                 295                 300                 
          Tyr Gln Cys Phe Lys Arg Thr Asp Thr Leu Pro Ala Gly Val Trp Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Phe Ala Ala Asn Gly Arg Met Arg Arg Leu Phe Thr Leu Arg Gln 
                          325                 330                 335     
          Tyr Phe Gly Ile Leu His Arg Leu Leu Lys Asn Arg 
                      340                 345             
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  265]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌O55:H7]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Met Ile Ile Asp Glu Ala Glu Ser Ala Glu Ser Thr His Pro Val Val 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Ile Leu Pro Val Asn Lys Lys Asn Pro Phe Leu Asp Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Ile Asn Ser Ile Leu Ser Gln Thr Phe Ser Ser Phe Glu Ile Ile Ile 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Asn Cys Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Asn Glu Leu Lys His Lys 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Asp Lys Ile Lys Leu Ile Arg Thr Asn Ile Ala Tyr Leu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ser Leu Asn Lys Ala Ile Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Ile Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Met Asp Ser Asp Asp Ile Ser His Pro Asp Arg Phe Thr Lys Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Phe Leu Lys Asn Asn Pro Tyr Val Asp Val Val Gly Thr Asn 
                  115                 120                 125             
          Ala Ile Phe Ile Asp Asp Lys Gly Arg Glu Ile Asn Lys Thr Lys Leu 
              130                 135                 140                 
          Pro Glu Glu Asn Leu Asp Ile Val Lys Asn Leu Pro Tyr Lys Cys Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Val His Pro Ser Val Met Phe Arg Lys Lys Val Ile Ala Ser Ile 
                          165                 170                 175     
          Gly Gly Tyr Met Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Trp Asn 
                      180                 185                 190         
          Arg Leu Ser Leu Ala Lys Ile Lys Phe Gln Asn Leu Pro Glu Tyr Leu 
                  195                 200                 205             
          Phe Tyr Tyr Arg Leu His Glu Gly Gln Ser Thr Ala Lys Lys Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Met Val Met Val Asn Asp Leu Val Ile Lys Met Lys Cys Phe Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Gly Asn Ile Asn Tyr Leu Phe Gly Gly Ile Arg Thr Ile Ala 
                          245                 250                 255     
          Ser Phe Ile Tyr Cys Lys Tyr Ile Lys 
                      260                 265 
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  275]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腦膜炎奈瑟氏菌MC58]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Met Gln Asn His Val Ile Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Arg Arg Ala 
          1               5                   10                  15      
          His Ile Ala Asp Thr Phe Gly Arg His Gly Ile Pro Phe Gln Phe Phe 
                      20                  25                  30          
          Asp Ala Leu Met Pro Ser Glu Arg Leu Glu Gln Ala Met Ala Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Val Pro Gly Leu Ser Ala His Pro Tyr Leu Ser Gly Val Glu Lys Ala 
              50                  55                  60                  
          Cys Phe Met Ser His Ala Val Leu Trp Lys Gln Ala Leu Asp Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Tyr Ile Thr Val Phe Glu Asp Asp Val Leu Leu Gly Glu Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Glu Lys Phe Leu Ala Glu Asp Ala Trp Leu Gln Glu Arg Phe Asp 
                      100                 105                 110         
          Pro Asp Thr Ala Phe Ile Val Arg Leu Glu Thr Met Phe Met His Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Ser Pro Ser Gly Val Ala Asp Tyr Cys Gly Arg Ala Phe Pro 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Glu Ser Glu His Trp Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Ile Ser Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ala Met Arg Phe Phe Leu Asp Arg Phe Ala Ala Leu Pro Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Gly Leu His Pro Val Asp Leu Met Met Phe Ser Asp Phe Phe Asp Arg 
                      180                 185                 190         
          Glu Gly Met Pro Val Cys Gln Leu Asn Pro Ala Leu Cys Ala Gln Glu 
                  195                 200                 205             
          Leu His Tyr Ala Lys Phe His Asp Gln Asn Ser Ala Leu Gly Ser Leu 
              210                 215                 220                 
          Ile Glu His Asp Arg Leu Leu Asn Arg Lys Gln Gln Arg Arg Asp Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asn Thr Phe Lys His Arg Leu Ile Arg Ala Leu Thr Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Glu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Arg Arg Glu Gln Phe Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Pro Phe Gln 
                  275 
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  338]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Met Arg Val Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr 
          1               5                   10                  15      
          Cys Val Gln Leu Leu Gln Asn Gly His Asp Val Ile Ile Leu Asp Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Cys Asn Ser Lys Arg Ser Val Leu Pro Val Ile Glu Arg Leu Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys His Pro Thr Phe Val Glu Gly Asp Ile Arg Asn Glu Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Met Thr Glu Ile Leu His Asp His Ala Ile Asp Thr Val Ile His Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Gln Lys Pro Leu Glu Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Asp Asn Asn Val Asn Gly Thr Leu Arg Leu Ile Ser Ala Met Arg 
                      100                 105                 110         
          Ala Ala Asn Val Lys Asn Phe Ile Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Gly Asp Gln Pro Lys Ile Pro Tyr Val Glu Ser Phe Pro Thr Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Pro Gln Ser Pro Tyr Gly Lys Ser Lys Leu Met Val Glu Gln Ile Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Asp Leu Gln Lys Ala Gln Pro Asp Trp Ser Ile Ala Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Asp Met Gly Glu Asp 
                      180                 185                 190         
          Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Ile Ala Gln Val Ala 
                  195                 200                 205             
          Val Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr 
              210                 215                 220                 
          Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Gly His Val Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Asn Lys Pro Gly Val 
                          245                 250                 255     
          His Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gly Val Gly Asn Ser Val Leu Asp Val 
                      260                 265                 270         
          Val Asn Ala Phe Ser Lys Ala Cys Gly Lys Pro Val Asn Tyr His Phe 
                  275                 280                 285             
          Ala Pro Arg Arg Glu Gly Asp Leu Pro Ala Tyr Trp Ala Asp Ala Ser 
              290                 295                 300                 
          Lys Ala Asp Arg Glu Leu Asn Trp Arg Val Thr Arg Thr Leu Asp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Met Ala Gln Asp Thr Trp His Trp Gln Ser Arg His Pro Gln Gly Tyr 
                          325                 330                 335     
          Pro Asp 
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  587]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Met Ala Asp His Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gln Lys Lys Pro Ile 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Ile Glu His Lys Asp Thr Leu Gly Asn Asp Arg Asp His Lys 
                      20                  25                  30          
          Glu Ala Leu Asn Ser Asp Asn Asp Asn Thr Ser Gly Leu Lys Ile Asn 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Pro Ile Glu Asp Ala Arg Glu Glu Val Leu Leu Pro Gly Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Lys Gln Tyr Tyr Lys Leu Tyr Gly Leu Cys Phe Ile Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Cys Ala Thr Met Gln Gly Tyr Asp Gly Ala Leu Met Gly Ser Ile 
                          85                  90                  95      
          Tyr Thr Glu Asp Ala Tyr Leu Lys Tyr Tyr His Leu Asp Ile Asn Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Gly Thr Gly Leu Val Phe Ser Ile Phe Asn Val Gly Gln Ile 
                  115                 120                 125             
          Cys Gly Ala Phe Phe Val Pro Leu Met Asp Trp Lys Gly Arg Lys Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Ile Leu Ile Gly Cys Leu Gly Val Val Ile Gly Ala Ile Ile Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Thr Thr Thr Lys Ser Ala Leu Ile Gly Gly Arg Trp Phe Val 
                          165                 170                 175     
          Ala Phe Phe Ala Thr Ile Ala Asn Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Cys Ala 
                      180                 185                 190         
          Glu Val Ala Pro Ala His Leu Arg Gly Lys Val Ala Gly Leu Tyr Asn 
                  195                 200                 205             
          Thr Leu Trp Ser Val Gly Ser Ile Val Ala Ala Phe Ser Thr Tyr Gly 
              210                 215                 220                 
          Thr Asn Lys Asn Phe Pro Asn Ser Ser Lys Ala Phe Lys Ile Pro Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Leu Gln Met Met Phe Pro Gly Leu Val Cys Ile Phe Gly Trp Leu 
                          245                 250                 255     
          Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Gly Val Gly Arg Glu Glu Glu 
                      260                 265                 270         
          Ala Arg Glu Phe Ile Ile Lys Tyr His Leu Asn Gly Asp Arg Thr His 
                  275                 280                 285             
          Pro Leu Leu Asp Met Glu Met Ala Glu Ile Ile Glu Ser Phe His Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Asp Leu Ser Asn Pro Leu Glu Met Leu Asp Val Arg Ser Leu Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Thr Arg Ser Asp Arg Tyr Arg Ala Met Leu Val Ile Leu Met Ala 
                          325                 330                 335     
          Trp Phe Gly Gln Phe Ser Gly Asn Asn Val Cys Ser Tyr Tyr Leu Pro 
                      340                 345                 350         
          Thr Met Leu Arg Asn Val Gly Met Lys Ser Val Ser Leu Asn Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Met Asn Gly Val Tyr Ser Ile Val Thr Trp Ile Ser Ser Ile Cys Gly 
              370                 375                 380                 
          Ala Phe Phe Ile Asp Lys Ile Gly Arg Arg Glu Gly Phe Leu Gly Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Thr Gly Leu Ser Ile Cys Thr Ala 
                          405                 410                 415     
          Arg Tyr Glu Lys Thr Lys Lys Lys Ser Ala Ser Asn Gly Ala Leu Val 
                      420                 425                 430         
          Phe Ile Tyr Leu Phe Gly Gly Ile Phe Ser Phe Ala Phe Thr Pro Met 
                  435                 440                 445             
          Gln Ser Met Tyr Ser Thr Glu Val Ser Thr Asn Leu Thr Arg Ser Lys 
              450                 455                 460                 
          Ala Gln Leu Leu Asn Phe Val Val Ser Gly Val Ala Gln Phe Val Asn 
          465                 470                 475                 480 
          Gln Phe Ala Thr Pro Lys Ala Met Lys Asn Ile Lys Tyr Trp Phe Tyr 
                          485                 490                 495     
          Val Phe Tyr Val Phe Phe Asp Ile Phe Glu Phe Ile Val Ile Tyr Phe 
                      500                 505                 510         
          Phe Phe Val Glu Thr Lys Gly Arg Ser Leu Glu Glu Leu Glu Val Val 
                  515                 520                 525             
          Phe Glu Ala Pro Asn Pro Arg Lys Ala Ser Val Asp Gln Ala Phe Leu 
              530                 535                 540                 
          Ala Gln Val Arg Ala Thr Leu Val Gln Arg Asn Asp Val Arg Val Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Asn Ala Gln Asn Leu Lys Glu Gln Glu Pro Leu Lys Ser Asp Ala Asp 
                          565                 570                 575     
          His Val Glu Lys Leu Ser Glu Ala Glu Ser Val 
                      580                 585         
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  792]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Met Ser Asn Asn Gly Ser Ser Pro Leu Val Leu Trp Tyr Asn Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gly Met Asn Asp Val Asp Arg Val Gly Gly Lys Asn Ala Ser Leu Gly 
                      20                  25                  30          
          Glu Met Ile Thr Asn Leu Ser Gly Met Gly Val Ser Val Pro Asn Gly 
                  35                  40                  45              
          Phe Ala Thr Thr Ala Asp Ala Phe Asn Gln Phe Leu Asp Gln Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Leu Asp Lys Thr Asp Ile Asp Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Val Thr Gln Leu Ala Lys Ala Gly Ala Gln Ile Arg Gln Trp Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Thr Pro Phe Gln Pro Glu Leu Glu Asn Ala Ile Arg Glu Ala Tyr 
                      100                 105                 110         
          Ala Gln Leu Ser Ala Asp Asp Glu Asn Ala Ser Phe Ala Val Arg Ser 
                  115                 120                 125             
          Ser Ala Thr Ala Glu Asp Met Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln 
              130                 135                 140                 
          Glu Thr Phe Leu Asn Val Gln Gly Phe Asp Ala Val Leu Val Ala Val 
          145                 150                 155                 160 
          Lys His Val Phe Ala Ser Leu Phe Asn Asp Arg Ala Ile Ser Tyr Arg 
                          165                 170                 175     
          Val His Gln Gly Tyr Asp His Arg Gly Val Ala Leu Ser Ala Gly Val 
                      180                 185                 190         
          Gln Arg Met Val Arg Ser Asp Leu Ala Ser Ser Gly Val Met Phe Ser 
                  195                 200                 205             
          Ile Asp Thr Glu Ser Gly Phe Asp Gln Val Val Phe Ile Thr Ser Ala 
              210                 215                 220                 
          Trp Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Tyr Val His Lys Pro Thr Leu Ala Ala Asn Arg Pro Ala Ile Val 
                          245                 250                 255     
          Arg Arg Thr Met Gly Ser Lys Lys Ile Arg Met Val Tyr Ala Pro Thr 
                      260                 265                 270         
          Gln Glu His Gly Lys Gln Val Lys Ile Glu Asp Val Pro Gln Glu Gln 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Ile Phe Ser Leu Thr Asn Glu Glu Val Gln Glu Leu Ala Lys 
              290                 295                 300                 
          Gln Ala Val Gln Ile Glu Lys His Tyr Gly Arg Pro Met Asp Ile Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Trp Ala Lys Asp Gly His Thr Gly Lys Leu Phe Ile Val Gln Ala Arg 
                          325                 330                 335     
          Pro Glu Thr Val Arg Ser Arg Gly Gln Val Met Glu Arg Tyr Thr Leu 
                      340                 345                 350         
          His Ser Gln Gly Lys Ile Ile Ala Glu Gly Arg Ala Ile Gly His Arg 
                  355                 360                 365             
          Ile Gly Ala Gly Pro Val Lys Val Ile His Asp Ile Ser Glu Met Asn 
              370                 375                 380                 
          Arg Ile Glu Pro Gly Asp Val Leu Val Thr Asp Met Thr Asp Pro Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Trp Glu Pro Ile Met Lys Lys Ala Ser Ala Ile Val Thr Asn Arg Gly 
                          405                 410                 415     
          Gly Arg Thr Cys His Ala Ala Ile Ile Ala Arg Glu Leu Gly Ile Pro 
                      420                 425                 430         
          Ala Val Val Gly Cys Gly Asp Ala Thr Glu Arg Met Lys Asp Gly Glu 
                  435                 440                 445             
          Asn Val Thr Val Ser Cys Ala Glu Gly Asp Thr Gly Tyr Val Tyr Ala 
              450                 455                 460                 
          Glu Leu Leu Glu Phe Ser Val Lys Ser Ser Ser Val Glu Thr Met Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Asp Leu Pro Leu Lys Val Met Met Asn Val Gly Asn Pro Asp Arg Ala 
                          485                 490                 495     
          Phe Asp Phe Ala Cys Leu Pro Asn Glu Gly Val Gly Leu Ala Arg Leu 
                      500                 505                 510         
          Glu Phe Ile Ile Asn Arg Met Ile Gly Val His Pro Arg Ala Leu Leu 
                  515                 520                 525             
          Glu Phe Asp Asp Gln Glu Pro Gln Leu Gln Asn Glu Ile Arg Glu Met 
              530                 535                 540                 
          Met Lys Gly Phe Asp Ser Pro Arg Glu Phe Tyr Val Gly Arg Leu Thr 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Gly Ile Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Tyr Pro Lys Arg Val Ile 
                          565                 570                 575     
          Val Arg Leu Ser Asp Phe Lys Ser Asn Glu Tyr Ala Asn Leu Val Gly 
                      580                 585                 590         
          Gly Glu Arg Tyr Glu Pro Asp Glu Glu Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg 
                  595                 600                 605             
          Gly Ala Gly Arg Tyr Val Ser Asp Ser Phe Arg Asp Cys Phe Ala Leu 
              610                 615                 620                 
          Glu Cys Glu Ala Val Lys Arg Val Arg Asn Asp Met Gly Leu Thr Asn 
          625                 630                 635                 640 
          Val Glu Ile Met Ile Pro Phe Val Arg Thr Val Asp Gln Ala Lys Ala 
                          645                 650                 655     
          Val Val Glu Glu Leu Ala Arg Gln Gly Leu Lys Arg Gly Glu Asn Gly 
                      660                 665                 670         
          Leu Lys Ile Ile Met Met Cys Glu Ile Pro Ser Asn Ala Leu Leu Ala 
                  675                 680                 685             
          Glu Gln Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Gly Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp 
              690                 695                 700                 
          Met Thr Gln Leu Ala Leu Gly Leu Asp Arg Asp Ser Gly Val Val Ser 
          705                 710                 715                 720 
          Glu Leu Phe Asp Glu Arg Asn Asp Ala Val Lys Ala Leu Leu Ser Met 
                          725                 730                 735     
          Ala Ile Arg Ala Ala Lys Lys Gln Gly Lys Tyr Val Gly Ile Cys Gly 
                      740                 745                 750         
          Gln Gly Pro Ser Asp His Glu Asp Phe Ala Ala Trp Leu Met Glu Glu 
                  755                 760                 765             
          Gly Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Pro Asp Thr Val Val Gln Thr Trp 
              770                 775                 780                 
          Leu Ser Leu Ala Glu Leu Lys Lys 
          785                 790         
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  610]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 
                  35                  40                  45              
          Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 
                          85                  90                  95      
          Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 
                      100                 105                 110         
          Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val 
                  115                 120                 125             
          Val Pro Phe Cys Met Gly Pro Ile Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg Ile Met 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Arg Met Gly Ile Glu Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ala Asn Gly Ser 
                          165                 170                 175     
          Phe Val Lys Cys Leu His Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln 
                      180                 185                 190         
          Glu Asp Val Ala Trp Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr Ile Thr Gln Phe 
                  195                 200                 205             
          Pro Glu Thr Lys Glu Ile Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn 
              210                 215                 220                 
          Ala Ile Leu Ala Lys Lys Cys Tyr Ala Leu Arg Ile Ala Ser Val Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Arg Glu Glu Gly Trp Met Ala Glu His Met Leu Ile Leu Lys Leu 
                          245                 250                 255     
          Ile Asn Pro Glu Gly Lys Ala Tyr His Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ile Thr Pro Thr Ile Pro Gly 
                  275                 280                 285             
          Trp Thr Ala Gln Val Val Gly Asp Asp Ile Ala Trp Leu Lys Leu Arg 
              290                 295                 300                 
          Glu Asp Gly Leu Tyr Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Pro Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Asn Pro Ile Ala Met Lys Thr Met 
                          325                 330                 335     
          Glu Pro Gly Asn Thr Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly 
                      340                 345                 350         
          Asp Ile Trp Trp Glu Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala His Leu Ile 
                  355                 360                 365             
          Asp Trp Lys Gly Asn Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala 
              370                 375                 380                 
          His Pro Asn Ser Arg Tyr Cys Val Ala Ile Asp Gln Ser Pro Ala Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Pro Glu Phe Asn Asp Trp Glu Gly Val Lys Ile Asp Ala Ile Leu 
                          405                 410                 415     
          Phe Gly Gly Arg Arg Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr 
                      420                 425                 430         
          Asp Trp Glu His Gly Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln 
                  435                 440                 445             
          Thr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro 
              450                 455                 460                 
          Met Ala Met Leu Pro Phe Ile Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Trp Ile Asp Met Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser Ile 
                          485                 490                 495     
          Phe Leu Val Asn Trp Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp 
                      500                 505                 510         
          Pro Gly Phe Gly Asp Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val Ile Asp Arg 
                  515                 520                 525             
          Ile Glu Gly Arg Val Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala 
              530                 535                 540                 
          Lys Ala Glu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro Ile Glu Asp 
          545                 550                 555                 560 
          Val Lys Glu Ala Leu Thr Ala Pro Ala Glu Gln Trp Ala Asn Asp Val 
                          565                 570                 575     
          Gln Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala 
                      580                 585                 590         
          Glu Val His Ser Gln Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ala 
                  595                 600                 605             
          His Ala 
              610 
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  540]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Met Arg Val Asn Asn Gly Leu Thr Pro Gln Glu Leu Glu Ala Tyr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ser Asp Val His Asp Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Asp Leu Leu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Gln Glu Glu Leu Asp Pro Ser Leu Thr Gly Tyr Glu Arg Gly Val 
                  35                  40                  45              
          Leu Thr Asn Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Arg Asp Asp Thr Thr Arg Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Phe Trp Trp Ala Asp Lys Gly Lys Gly Lys Asn Asp Asn Lys Pro 
                          85                  90                  95      
          Leu Ser Pro Glu Thr Trp Gln His Leu Lys Gly Leu Val Thr Arg Gln 
                      100                 105                 110         
          Leu Ser Gly Lys Arg Leu Phe Val Val Asp Ala Phe Cys Gly Ala Asn 
                  115                 120                 125             
          Pro Asp Thr Arg Leu Ser Val Arg Phe Ile Thr Glu Val Ala Trp Gln 
              130                 135                 140                 
          Ala His Phe Val Lys Asn Met Phe Ile Arg Pro Ser Asp Glu Glu Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Gly Phe Lys Pro Asp Phe Ile Val Met Asn Gly Ala Lys Cys Thr 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gln Trp Lys Glu Gln Gly Leu Asn Ser Glu Asn Phe Val Ala 
                      180                 185                 190         
          Phe Asn Leu Thr Glu Arg Met Gln Leu Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Glu Met Lys Lys Gly Met Phe Ser Met Met Asn Tyr Leu Leu Pro 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Gly Ile Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Glu Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Asp Val Ala Val Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr 
                          245                 250                 255     
          Leu Ser Thr Asp Pro Lys Arg Arg Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly 
                      260                 265                 270         
          Trp Asp Asp Asp Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys 
                  275                 280                 285             
          Thr Ile Lys Leu Ser Lys Glu Ala Glu Pro Glu Ile Tyr Asn Ala Ile 
              290                 295                 300                 
          Arg Arg Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Thr Val Arg Glu Asp Gly Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Asp Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr 
                          325                 330                 335     
          Pro Ile Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Lys Pro Val Ser Lys Ala Gly 
                      340                 345                 350         
          His Ala Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Pro Pro Val Ser Arg Leu Thr Ala Asp Gln Thr Gln Tyr His Phe Leu 
              370                 375                 380                 
          Ser Gly Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Thr Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu 
                          405                 410                 415     
          His Pro Thr Gln Tyr Ala Glu Val Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala 
                      420                 425                 430         
          Gly Ala Gln Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys 
                  435                 440                 445             
          Arg Ile Ser Ile Lys Asp Thr Arg Ala Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asn 
              450                 455                 460                 
          Gly Ser Leu Asp Asn Ala Glu Thr Phe Thr Leu Pro Met Phe Asn Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Ile Pro Thr Glu Leu Pro Gly Val Asp Thr Lys Ile Leu Asp Pro 
                          485                 490                 495     
          Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Pro Glu Gln Trp Gln Glu Lys Ala Glu Thr 
                      500                 505                 510         
          Leu Ala Lys Leu Phe Ile Asp Asn Phe Asp Lys Tyr Thr Asp Thr Pro 
                  515                 520                 525             
          Ala Gly Ala Ala Leu Val Ala Ala Gly Pro Lys Leu 
              530                 535                 540 
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Met Lys Asn Trp Lys Thr Ser Ala Glu Ser Ile Leu Thr Thr Gly Pro 
          1               5                   10                  15      
          Val Val Pro Val Ile Val Val Lys Lys Leu Glu His Ala Val Pro Met 
                      20                  25                  30          
          Ala Lys Ala Leu Val Ala Gly Gly Val Arg Val Leu Glu Val Thr Leu 
                  35                  40                  45              
          Arg Thr Glu Cys Ala Val Asp Ala Ile Arg Ala Ile Ala Lys Glu Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Glu Ala Ile Val Gly Ala Gly Thr Val Leu Asn Pro Gln Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Glu Val Thr Glu Ala Gly Ala Gln Phe Ala Ile Ser Pro Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Ala Thr Glu Gly Thr Ile Pro Leu Ile 
                      100                 105                 110         
          Pro Gly Ile Ser Thr Val Ser Glu Leu Met Leu Gly Met Asp Tyr Gly 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Glu Phe Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Asn Gly Gly Val Lys 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gln Ala Ile Ala Gly Pro Phe Ser Gln Val Arg Phe Cys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asn Tyr Arg Asp Tyr Leu Ala Leu Lys 
                          165                 170                 175     
          Ser Val Leu Cys Ile Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Ala Asp Ala Leu 
                      180                 185                 190         
          Glu Ala Gly Asp Tyr Asp Arg Ile Thr Lys Leu Ala Arg Glu Ala Val 
                  195                 200                 205             
          Glu Gly Ala Lys Leu 
              210             
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  565]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Met Glu Pro Lys Thr Lys Lys Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Val Leu Leu Glu Phe Pro Leu Leu Asn Lys Gly Ser Ala Phe 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Glu Glu Arg Arg Asn Phe Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro Glu 
                  35                  40                  45              
          Val Val Glu Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Arg Ala Trp Ile Gln Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Phe Lys Thr Glu Ile Asp Lys His Ile Tyr Leu Arg Asn Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Asp Thr Asn Glu Thr Leu Phe Tyr Arg Leu Val Asn Asn His Leu 
                          85                  90                  95      
          Asp Glu Met Met Pro Val Ile Tyr Thr Pro Thr Val Gly Ala Ala Cys 
                      100                 105                 110         
          Glu Arg Phe Ser Glu Ile Tyr Arg Arg Ser Arg Gly Val Phe Ile Ser 
                  115                 120                 125             
          Tyr Gln Asn Arg His Asn Met Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Pro Asn 
              130                 135                 140                 
          His Asn Ile Lys Val Ile Val Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Gly Asp Gln Gly Ile Gly Gly Met Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Tyr Thr Ala Cys Gly Gly Ile Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Pro 
                      180                 185                 190         
          Val Val Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Pro 
                  195                 200                 205             
          Leu Tyr Met Gly Trp Arg Asn Pro Arg Ile Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr 
              210                 215                 220                 
          Glu Phe Val Asp Glu Phe Ile Gln Ala Val Lys Gln Arg Trp Pro Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Val Leu Leu Gln Phe Glu Asp Phe Ala Gln Lys Asn Ala Met Pro Leu 
                          245                 250                 255     
          Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Glu Ile Cys Ser Phe Asn Asp Asp Ile Gln 
                      260                 265                 270         
          Gly Thr Ala Ala Val Thr Val Gly Thr Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala 
                  275                 280                 285             
          Ala Gly Gly Gln Leu Ser Glu Lys Lys Ile Val Phe Leu Gly Ala Gly 
              290                 295                 300                 
          Ser Ala Gly Cys Gly Ile Ala Glu Met Ile Ile Ser Gln Thr Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Arg Gln Lys Val Phe Met Val Asp 
                          325                 330                 335     
          Arg Phe Gly Leu Leu Thr Asp Lys Met Pro Asn Leu Leu Pro Phe Gln 
                      340                 345                 350         
          Thr Lys Leu Val Gln Lys Arg Glu Asn Leu Ser Asp Trp Asp Thr Asp 
                  355                 360                 365             
          Ser Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Val Val Arg Asn Val Lys Pro Asp 
              370                 375                 380                 
          Ile Leu Ile Gly Val Ser Gly Gln Thr Gly Leu Phe Thr Glu Glu Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Arg Glu Met His Lys His Cys Pro Arg Pro Ile Val Met Pro Leu 
                          405                 410                 415     
          Ser Asn Pro Thr Ser Arg Val Glu Ala Thr Pro Gln Asp Ile Ile Ala 
                      420                 425                 430         
          Trp Thr Glu Gly Asn Ala Leu Val Ala Thr Gly Ser Pro Phe Asn Pro 
                  435                 440                 445             
          Val Val Trp Lys Asp Lys Ile Tyr Pro Ile Ala Gln Cys Asn Asn Ala 
              450                 455                 460                 
          Phe Ile Phe Pro Gly Ile Gly Leu Gly Val Ile Ala Ser Gly Ala Ser 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Ile Thr Asp Glu Met Leu Met Ser Ala Ser Glu Thr Leu Ala Gln 
                          485                 490                 495     
          Tyr Ser Pro Leu Val Leu Asn Gly Glu Gly Met Val Leu Pro Glu Leu 
                      500                 505                 510         
          Lys Asp Ile Gln Lys Val Ser Arg Ala Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys 
                  515                 520                 525             
          Met Ala Gln Gln Gln Gly Val Ala Val Lys Thr Ser Ala Glu Ala Leu 
              530                 535                 540                 
          Gln Gln Ala Ile Asp Asp Asn Phe Trp Gln Ala Glu Tyr Arg Asp Tyr 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Arg Thr Ser Ile 
                          565 
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  759]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Met Asp Asp Gln Leu Lys Gln Ser Ala Leu Asp Phe His Glu Phe Pro 
          1               5                   10                  15      
          Val Pro Gly Lys Ile Gln Val Ser Pro Thr Lys Pro Leu Ala Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Arg Asp Leu Ala Leu Ala Tyr Ser Pro Gly Val Ala Ala Pro Cys Leu 
                  35                  40                  45              
          Glu Ile Glu Lys Asp Pro Leu Lys Ala Tyr Lys Tyr Thr Ala Arg Gly 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Val Ala Val Ile Ser Asn Gly Thr Ala Val Leu Gly Leu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ile Gly Ala Leu Ala Gly Lys Pro Val Met Glu Gly Lys Gly Val 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Lys Lys Phe Ala Gly Ile Asp Val Phe Asp Ile Glu Val Asp 
                      100                 105                 110         
          Glu Leu Asp Pro Asp Lys Phe Ile Glu Val Val Ala Ala Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Thr Phe Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Ala Pro Glu Cys Phe 
              130                 135                 140                 
          Tyr Ile Glu Gln Lys Leu Arg Glu Arg Met Asn Ile Pro Val Phe His 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Asp Gln His Gly Thr Ala Ile Ile Ser Thr Ala Ala Ile Leu Asn 
                          165                 170                 175     
          Gly Leu Arg Val Val Glu Lys Asn Ile Ser Asp Val Arg Met Val Val 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ala Cys Met Asn Leu Leu Val Ala 
                  195                 200                 205             
          Leu Gly Leu Gln Lys His Asn Ile Val Val Cys Asp Ser Lys Gly Val 
              210                 215                 220                 
          Ile Tyr Gln Gly Arg Glu Pro Asn Met Ala Glu Thr Lys Ala Ala Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Val Val Asp Asp Gly Lys Arg Thr Leu Asp Asp Val Ile Glu Gly 
                          245                 250                 255     
          Ala Asp Ile Phe Leu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Leu Thr Gln Glu 
                      260                 265                 270         
          Met Val Lys Lys Met Ala Arg Ala Pro Met Ile Leu Ala Leu Ala Asn 
                  275                 280                 285             
          Pro Glu Pro Glu Ile Leu Pro Pro Leu Ala Lys Glu Val Arg Pro Asp 
              290                 295                 300                 
          Ala Ile Ile Cys Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Val Leu Cys Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Gly Ala 
                          325                 330                 335     
          Thr Ala Ile Asn Glu Glu Met Lys Leu Ala Ala Val Arg Ala Ile Ala 
                      340                 345                 350         
          Glu Leu Ala His Ala Glu Gln Ser Glu Val Val Ala Ser Ala Tyr Gly 
                  355                 360                 365             
          Asp Gln Asp Leu Ser Phe Gly Pro Glu Tyr Ile Ile Pro Lys Pro Phe 
              370                 375                 380                 
          Asp Pro Arg Leu Ile Val Lys Ile Ala Pro Ala Val Ala Lys Ala Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Met Glu Ser Gly Val Ala Thr Arg Pro Ile Ala Asp Phe Asp Val Tyr 
                          405                 410                 415     
          Ile Asp Lys Leu Thr Glu Phe Val Tyr Lys Thr Asn Leu Phe Met Lys 
                      420                 425                 430         
          Pro Ile Phe Ser Gln Ala Arg Lys Ala Pro Lys Arg Val Val Leu Pro 
                  435                 440                 445             
          Glu Gly Glu Glu Ala Arg Val Leu His Ala Thr Gln Glu Leu Val Thr 
              450                 455                 460                 
          Leu Gly Leu Ala Lys Pro Ile Leu Ile Gly Arg Pro Asn Val Ile Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Met Arg Ile Gln Lys Leu Gly Leu Gln Ile Lys Ala Gly Val Asp Phe 
                          485                 490                 495     
          Glu Ile Val Asn Asn Glu Ser Asp Pro Arg Phe Lys Glu Tyr Trp Thr 
                      500                 505                 510         
          Glu Tyr Phe Gln Ile Met Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Glu Gln Ala 
                  515                 520                 525             
          Gln Arg Ala Leu Ile Ser Asn Pro Thr Val Ile Gly Ala Ile Met Val 
              530                 535                 540                 
          Gln Arg Gly Glu Ala Asp Ala Met Ile Cys Gly Thr Val Gly Asp Tyr 
          545                 550                 555                 560 
          His Glu His Phe Ser Val Val Lys Asn Val Phe Gly Tyr Arg Asp Gly 
                          565                 570                 575     
          Val His Thr Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Leu Leu Pro Ser Gly Asn 
                      580                 585                 590         
          Thr Phe Ile Ala Asp Thr Tyr Val Asn Asp Glu Pro Asp Ala Glu Glu 
                  595                 600                 605             
          Leu Ala Glu Ile Thr Leu Met Ala Ala Glu Thr Val Arg Arg Phe Gly 
              610                 615                 620                 
          Ile Glu Pro Arg Val Ala Leu Leu Ser His Ser Asn Phe Gly Ser Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Asp Cys Pro Ser Ser Ser Lys Met Arg Gln Ala Leu Glu Leu Val Arg 
                          645                 650                 655     
          Glu Arg Ala Pro Glu Leu Met Ile Asp Gly Glu Met His Gly Asp Ala 
                      660                 665                 670         
          Ala Leu Val Glu Ala Ile Arg Asn Asp Arg Met Pro Asp Ser Ser Leu 
                  675                 680                 685             
          Lys Gly Ser Ala Asn Ile Leu Val Met Pro Asn Met Glu Ala Ala Arg 
              690                 695                 700                 
          Ile Ser Tyr Asn Leu Leu Arg Val Ser Ser Ser Glu Gly Val Thr Val 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Pro Val Leu Met Gly Val Ala Lys Pro Val His Val Leu Thr Pro 
                          725                 730                 735     
          Ile Ala Ser Val Arg Arg Ile Val Asn Met Val Ala Leu Ala Val Val 
                      740                 745                 750         
          Glu Ala Gln Thr Gln Pro Leu 
                  755                 
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  652]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Met Ser Gln Ile His Lys His Thr Ile Pro Ala Asn Ile Ala Asp Arg 
          1               5                   10                  15      
          Cys Leu Ile Asn Pro Gln Gln Tyr Glu Ala Met Tyr Gln Gln Ser Ile 
                      20                  25                  30          
          Asn Val Pro Asp Thr Phe Trp Gly Glu Gln Gly Lys Ile Leu Asp Trp 
                  35                  40                  45              
          Ile Lys Pro Tyr Gln Lys Val Lys Asn Thr Ser Phe Ala Pro Gly Asn 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Ile Lys Trp Tyr Glu Asp Gly Thr Leu Asn Leu Ala Ala Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Leu Asp Arg His Leu Gln Glu Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Trp Glu Gly Asp Asp Ala Ser Gln Ser Lys His Ile Ser Tyr Lys Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu His Arg Asp Val Cys Arg Phe Ala Asn Thr Leu Leu Glu Leu Gly 
                  115                 120                 125             
          Ile Lys Lys Gly Asp Val Val Ala Ile Tyr Met Pro Met Val Pro Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Val Ala Met Leu Ala Cys Ala Arg Ile Gly Ala Val His Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ile Phe Gly Gly Phe Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Arg Ile Ile 
                          165                 170                 175     
          Asp Ser Asn Ser Arg Leu Val Ile Thr Ser Asp Glu Gly Val Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Gly Arg Ser Ile Pro Leu Lys Lys Asn Val Asp Asp Ala Leu Lys Asn 
                  195                 200                 205             
          Pro Asn Val Thr Ser Val Glu His Val Val Val Leu Lys Arg Thr Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Lys Ile Asp Trp Gln Glu Gly Arg Asp Leu Trp Trp His Asp Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Val Glu Gln Ala Ser Asp Gln His Gln Ala Glu Glu Met Asn Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Asp Pro Leu Phe Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Leu His Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Ala Leu Thr 
                  275                 280                 285             
          Phe Lys Tyr Val Phe Asp Tyr His Pro Gly Asp Ile Tyr Trp Cys Thr 
              290                 295                 300                 
          Ala Asp Val Gly Trp Val Thr Gly His Ser Tyr Leu Leu Tyr Gly Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ala Cys Gly Ala Thr Thr Leu Met Phe Glu Gly Val Pro Asn Trp 
                          325                 330                 335     
          Pro Thr Pro Ala Arg Met Ala Gln Val Val Asp Lys His Gln Val Asn 
                      340                 345                 350         
          Ile Leu Tyr Thr Ala Pro Thr Ala Ile Arg Ala Leu Met Ala Glu Gly 
                  355                 360                 365             
          Asp Lys Ala Ile Glu Gly Thr Asp Arg Ser Ser Leu Arg Ile Leu Gly 
              370                 375                 380                 
          Ser Val Gly Glu Pro Ile Asn Pro Glu Ala Trp Glu Trp Tyr Trp Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Ile Gly Asn Glu Lys Cys Pro Val Val Asp Thr Trp Trp Gln Thr 
                          405                 410                 415     
          Glu Thr Gly Gly Phe Met Ile Thr Pro Leu Pro Gly Ala Thr Glu Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Ala Gly Ser Ala Thr Arg Pro Phe Phe Gly Val Gln Pro Ala Leu 
                  435                 440                 445             
          Val Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu Glu Gly Ala Thr Glu Gly Ser Leu 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Thr Asp Ser Trp Pro Gly Gln Ala Arg Thr Leu Phe Gly Asp 
          465                 470                 475                 480 
          His Glu Arg Phe Glu Gln Thr Tyr Phe Ser Thr Phe Lys Asn Met Tyr 
                          485                 490                 495     
          Phe Ser Gly Asp Gly Ala Arg Arg Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Trp Ile 
                      500                 505                 510         
          Thr Gly Arg Val Asp Asp Val Leu Asn Val Ser Gly His Arg Leu Gly 
                  515                 520                 525             
          Thr Ala Glu Ile Glu Ser Ala Leu Val Ala His Pro Lys Ile Ala Glu 
              530                 535                 540                 
          Ala Ala Val Val Gly Ile Pro His Asn Ile Lys Gly Gln Ala Ile Tyr 
          545                 550                 555                 560 
          Ala Tyr Val Thr Leu Asn His Gly Glu Glu Pro Ser Pro Glu Leu Tyr 
                          565                 570                 575     
          Ala Glu Val Arg Asn Trp Val Arg Lys Glu Ile Gly Pro Leu Ala Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Asp Val Leu His Trp Thr Asp Ser Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly 
                  595                 600                 605             
          Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg Lys Ile Ala Ala Gly Asp Thr Ser 
              610                 615                 620                 
          Asn Leu Gly Asp Thr Ser Thr Leu Ala Asp Pro Gly Val Val Glu Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Leu Glu Glu Lys Gln Ala Ile Ala Met Pro Ser 
                          645                 650         
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  308]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  多殺性巴氏桿菌多殺性亞種（subsp. multocida）Pm70菌株]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Met Asn Leu Ile Ile Cys Cys Thr Pro Leu Gln Val Leu Ile Ala Glu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Ile Ile Ala Lys Phe Pro His Met Pro Phe Tyr Gly Val Met Leu 
                      20                  25                  30          
          Ser Thr Val Ser Asn Lys Lys Phe Asp Phe Tyr Ala Lys Arg Leu Ala 
                  35                  40                  45              
          Gln Gln Cys Gln Gly Phe Phe Ser Met Val Gln His Lys Asp Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Leu Lys Glu Ile Leu Tyr Leu Lys Arg Thr Phe Ser Gly Lys 
          65                  70                  75                  80  
          His Phe Asp Gln Val Phe Val Ala Asn Ile Asn Asp Leu Gln Ile Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Leu Ser Ala Ile Asp Phe Asn Leu Leu Asn Thr Phe Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Ile Asn Ile Val Pro Asn Ser Leu Phe Tyr Gln Asp Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Thr Leu Gln Arg Lys Leu Ile Asn Val Leu Leu Gly Asn Lys Tyr 
              130                 135                 140                 
          Ser Ile Gln Ser Leu Arg Ala Leu Ser His Thr His Tyr Thr Ile Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Gly Phe Lys Asn Ile Ile Glu Arg Val Glu Pro Ile Glu Leu Val 
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Asp Asn Ser Glu Lys Val Thr Ser Ala Val Ile Asn Val Leu 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Gln Pro Val Phe Ala Glu Asp Glu Arg Asn Ile Ala Leu Ala 
                  195                 200                 205             
          Glu Arg Val Ile Lys Gln Phe Asn Ile His Tyr Tyr Leu Pro His Pro 
              210                 215                 220                 
          Arg Glu Lys Tyr Arg Leu Ala Gln Val Asn Tyr Ile Asp Thr Glu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Phe Glu Asp Tyr Ile Leu Gln Gln Cys Gln Thr His Lys Tyr Cys 
                          245                 250                 255     
          Val Tyr Thr Tyr Phe Ser Ser Ala Ile Ile Asn Ile Met Asn Lys Ser 
                      260                 265                 270         
          Asp Asn Ile Glu Val Val Ala Leu Lys Ile Asp Thr Glu Asn Pro Ala 
                  275                 280                 285             
          Tyr Asp Ala Cys Tyr Asp Leu Phe Asp Glu Leu Gly Val Asn Val Ile 
              290                 295                 300                 
          Asp Ile Arg Glu 
          305             
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  416]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Met Asn Lys Gln Ser Trp Leu Leu Asn Leu Ser Leu Leu Lys Thr His 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Phe Arg Ala Val Phe Leu Ala Arg Phe Ile Ser Ile Val Ser 
                      20                  25                  30          
          Leu Gly Leu Leu Gly Val Ala Val Pro Val Gln Ile Gln Met Met Thr 
                  35                  40                  45              
          His Ser Thr Trp Gln Val Gly Leu Ser Val Thr Leu Thr Gly Gly Ala 
              50                  55                  60                  
          Met Phe Val Gly Leu Met Val Gly Gly Val Leu Ala Asp Arg Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Lys Lys Val Ile Leu Leu Ala Arg Gly Thr Cys Gly Ile Gly Phe 
                          85                  90                  95      
          Ile Gly Leu Cys Leu Asn Ala Leu Leu Pro Glu Pro Ser Leu Leu Ala 
                      100                 105                 110         
          Ile Tyr Leu Leu Gly Leu Trp Asp Gly Phe Phe Ala Ser Leu Gly Val 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Leu Leu Ala Ala Thr Pro Ala Leu Val Gly Arg Glu Asn Leu 
              130                 135                 140                 
          Met Gln Ala Gly Ala Ile Thr Met Leu Thr Val Arg Leu Gly Ser Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Ser Pro Met Ile Gly Gly Leu Leu Leu Ala Thr Gly Gly Val Ala 
                          165                 170                 175     
          Trp Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Gly Thr Phe Ile Thr Leu Leu Pro 
                      180                 185                 190         
          Leu Leu Ser Leu Pro Ala Leu Pro Pro Pro Pro Gln Pro Arg Glu His 
                  195                 200                 205             
          Pro Leu Lys Ser Leu Leu Ala Gly Phe Arg Phe Leu Leu Ala Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Leu Val Gly Gly Ile Ala Leu Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Ala Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Val Arg Val Leu Tyr Pro Ala Leu Ala Asp Asn Trp Gln Met Ser 
                          245                 250                 255     
          Ala Ala Gln Ile Gly Phe Leu Tyr Ala Ala Ile Pro Leu Gly Ala Ala 
                      260                 265                 270         
          Ile Gly Ala Leu Thr Ser Gly Lys Leu Ala His Ser Ala Arg Pro Gly 
                  275                 280                 285             
          Leu Leu Met Leu Leu Ser Thr Leu Gly Ser Phe Leu Ala Ile Gly Leu 
              290                 295                 300                 
          Phe Gly Leu Met Pro Met Trp Ile Leu Gly Val Val Cys Leu Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Gly Trp Leu Ser Ala Val Ser Ser Leu Leu Gln Tyr Thr Met Leu 
                          325                 330                 335     
          Gln Thr Gln Thr Pro Glu Ala Met Leu Gly Arg Ile Asn Gly Leu Trp 
                      340                 345                 350         
          Thr Ala Gln Asn Val Thr Gly Asp Ala Ile Gly Ala Ala Leu Leu Gly 
                  355                 360                 365             
          Gly Leu Gly Ala Met Met Thr Pro Val Ala Ser Ala Ser Ala Ser Gly 
              370                 375                 380                 
          Phe Gly Leu Leu Ile Ile Gly Val Leu Leu Leu Leu Val Leu Val Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Arg His Phe Arg Gln Thr Pro Pro Gln Val Thr Ala Ser Asp Ser 
                          405                 410                 415     
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  410]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Met Gln Asn Lys Leu Ala Ser Gly Ala Arg Leu Gly Arg Gln Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Phe Pro Leu Cys Leu Val Leu Tyr Glu Phe Ser Thr Tyr Ile Gly 
                      20                  25                  30          
          Asn Asp Met Ile Gln Pro Gly Met Leu Ala Val Val Glu Gln Tyr Gln 
                  35                  40                  45              
          Ala Gly Ile Asp Trp Val Pro Thr Ser Met Thr Ala Tyr Leu Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Phe Leu Gln Trp Leu Leu Gly Pro Leu Ser Asp Arg Ile Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Pro Val Met Leu Ala Gly Val Val Trp Phe Ile Val Thr Cys 
                          85                  90                  95      
          Leu Ala Ile Leu Leu Ala Gln Asn Ile Glu Gln Phe Thr Leu Leu Arg 
                      100                 105                 110         
          Phe Leu Gln Gly Ile Ser Leu Cys Phe Ile Gly Ala Val Gly Tyr Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Ile Gln Glu Ser Phe Glu Glu Ala Val Cys Ile Lys Ile Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Met Ala Asn Val Ala Leu Ile Ala Pro Leu Leu Gly Pro Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ala Ala Trp Ile His Val Leu Pro Trp Glu Gly Met Phe Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Phe Ala Ala Leu Ala Ala Ile Ser Phe Phe Gly Leu Gln Arg Ala Met 
                      180                 185                 190         
          Pro Glu Thr Ala Thr Arg Ile Gly Glu Lys Leu Ser Leu Lys Glu Leu 
                  195                 200                 205             
          Gly Arg Asp Tyr Lys Leu Val Leu Lys Asn Gly Arg Phe Val Ala Gly 
              210                 215                 220                 
          Ala Leu Ala Leu Gly Phe Val Ser Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ile Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Ser Pro Ile Ile Ile Ile Thr Gly Glu Gln Leu Ser Ser Tyr Glu 
                          245                 250                 255     
          Tyr Gly Leu Leu Gln Val Pro Ile Phe Gly Ala Leu Ile Ala Gly Asn 
                      260                 265                 270         
          Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Arg Arg Thr Val Arg Ser Leu Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Met Gly Gly Trp Pro Ile Met Ile Gly Leu Leu Val Ala Ala Ala 
              290                 295                 300                 
          Ala Thr Val Ile Ser Ser His Ala Tyr Leu Trp Met Thr Ala Gly Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Ile Tyr Ala Phe Gly Ile Gly Leu Ala Asn Ala Gly Leu Val Arg 
                          325                 330                 335     
          Leu Thr Leu Phe Ala Ser Asp Met Ser Lys Gly Thr Val Ser Ala Ala 
                      340                 345                 350         
          Met Gly Met Leu Gln Met Leu Ile Phe Thr Val Gly Ile Glu Ile Ser 
                  355                 360                 365             
          Lys His Ala Trp Leu Asn Gly Gly Asn Gly Leu Phe Asn Leu Phe Asn 
              370                 375                 380                 
          Leu Val Asn Gly Ile Leu Trp Leu Ser Leu Met Val Ile Phe Leu Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Lys Gln Met Gly Asn Ser His Glu Gly 
                          405                 410 
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  471]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Met Thr Asp Leu Pro Asp Ser Thr Arg Trp Gln Leu Trp Ile Val Ala 
          1               5                   10                  15      
          Phe Gly Phe Phe Met Gln Ser Leu Asp Thr Thr Ile Val Asn Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Leu Pro Ser Met Ala Gln Ser Leu Gly Glu Ser Pro Leu His Met His 
                  35                  40                  45              
          Met Val Ile Val Ser Tyr Val Leu Thr Val Ala Val Met Leu Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Trp Leu Ala Asp Lys Val Gly Val Arg Asn Ile Phe Phe Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ile Val Leu Phe Thr Leu Gly Ser Leu Phe Cys Ala Leu Ser Gly 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Asn Glu Leu Leu Leu Ala Arg Ala Leu Gln Gly Val Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Ala Met Met Val Pro Val Gly Arg Leu Thr Val Met Lys Ile Val Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg Glu Gln Tyr Met Ala Ala Met Thr Phe Val Thr Leu Pro Gly Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Gly Pro Leu Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Leu Leu Val Glu Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Trp His Trp Ile Phe Leu Ile Asn Ile Pro Val Gly Ile Ile 
                          165                 170                 175     
          Gly Ala Ile Ala Thr Leu Leu Leu Met Pro Asn Tyr Thr Met Gln Thr 
                      180                 185                 190         
          Arg Arg Phe Asp Leu Ser Gly Phe Leu Leu Leu Ala Val Gly Met Ala 
                  195                 200                 205             
          Val Leu Thr Leu Ala Leu Asp Gly Ser Lys Gly Thr Gly Leu Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Ile Ala Gly Leu Val Ala Val Gly Val Val Ala Leu Val Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Leu Leu His Ala Arg Asn Asn Asn Arg Ala Leu Phe Ser Leu Lys 
                          245                 250                 255     
          Leu Phe Arg Thr Arg Thr Phe Ser Leu Gly Leu Ala Gly Ser Phe Ala 
                      260                 265                 270         
          Gly Arg Ile Gly Ser Gly Met Leu Pro Phe Met Thr Pro Val Phe Leu 
                  275                 280                 285             
          Gln Ile Gly Leu Gly Phe Ser Pro Phe His Ala Gly Leu Met Met Ile 
              290                 295                 300                 
          Pro Met Val Leu Gly Ser Met Gly Met Lys Arg Ile Val Val Gln Val 
          305                 310                 315                 320 
          Val Asn Arg Phe Gly Tyr Arg Arg Val Leu Val Ala Thr Thr Leu Gly 
                          325                 330                 335     
          Leu Ser Leu Val Thr Leu Leu Phe Met Thr Thr Ala Leu Leu Gly Trp 
                      340                 345                 350         
          Tyr Tyr Val Leu Pro Phe Val Leu Phe Leu Gln Gly Met Val Asn Ser 
                  355                 360                 365             
          Thr Arg Phe Ser Ser Met Asn Thr Leu Thr Leu Lys Asp Leu Pro Asp 
              370                 375                 380                 
          Asn Leu Ala Ser Ser Gly Asn Ser Leu Leu Ser Met Ile Met Gln Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Met Ser Ile Gly Val Thr Ile Ala Gly Leu Leu Leu Gly Leu Phe 
                          405                 410                 415     
          Gly Ser Gln His Val Ser Val Asp Ser Gly Thr Thr Gln Thr Val Phe 
                      420                 425                 430         
          Met Tyr Thr Trp Leu Ser Met Ala Leu Ile Ile Ala Leu Pro Ala Phe 
                  435                 440                 445             
          Ile Phe Ala Arg Val Pro Asn Asp Thr His Gln Asn Val Ala Ile Ser 
              450                 455                 460                 
          Arg Arg Lys Arg Ser Ala Gln 
          465                 470     
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  334]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Met Asn Ala Val Thr Glu Gly Arg Lys Val Leu Leu Glu Ile Ala Asp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Val His Phe Glu Ile Lys Asp Gly Lys Gln Trp Phe Trp Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Pro Lys Thr Leu Lys Ala Val Asp Gly Val Thr Leu Arg Leu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Glu Gly Glu Thr Leu Gly Val Val Gly Glu Ser Gly Cys Gly Lys Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Phe Ala Arg Ala Ile Ile Gly Leu Val Lys Ala Thr Asp Gly His 
          65                  70                  75                  80  
          Val Ala Trp Leu Gly Lys Glu Leu Leu Gly Met Lys Pro Asp Glu Trp 
                          85                  90                  95      
          Arg Ala Val Arg Ser Asp Ile Gln Met Ile Phe Gln Asp Pro Leu Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser Leu Asn Pro Arg Met Thr Ile Gly Glu Ile Ile Ala Glu Pro Leu 
                  115                 120                 125             
          Arg Thr Tyr His Pro Lys Met Ser Arg Gln Glu Val Arg Glu Arg Val 
              130                 135                 140                 
          Lys Ala Met Met Leu Lys Val Gly Leu Leu Pro Asn Leu Ile Asn Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Pro His Glu Phe Ser Gly Gly Gln Cys Gln Arg Ile Gly Ile Ala 
                          165                 170                 175     
          Arg Ala Leu Ile Leu Glu Pro Lys Leu Ile Ile Cys Asp Glu Pro Val 
                      180                 185                 190         
          Ser Ala Leu Asp Val Ser Ile Gln Ala Gln Val Val Asn Leu Leu Gln 
                  195                 200                 205             
          Gln Leu Gln Arg Glu Met Gly Leu Ser Leu Ile Phe Ile Ala His Asp 
              210                 215                 220                 
          Leu Ala Val Val Lys His Ile Ser Asp Arg Val Leu Val Met Tyr Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly His Ala Val Glu Leu Gly Thr Tyr Asp Glu Val Tyr His Asn Pro 
                          245                 250                 255     
          Leu His Pro Tyr Thr Arg Ala Leu Met Ser Ala Val Pro Ile Pro Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Asp Leu Glu Lys Asn Lys Thr Ile Gln Leu Leu Glu Gly Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Pro Ser Pro Ile Asn Pro Pro Ser Gly Cys Val Phe Arg Thr Arg Cys 
              290                 295                 300                 
          Pro Ile Ala Gly Pro Glu Cys Ala Lys Thr Arg Pro Val Leu Glu Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Phe Arg His Ser Val Ser Cys Leu Lys Val Asp Pro Leu 
                          325                 330                 
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  584]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  乳酸乳球菌乳酸亞種二乙醯基乳酸生物型]]>
                 （Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis）
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Met Ala Asn Arg Ile Glu Gly Lys Ala Val Asp Lys Thr Ser Ile Lys 
          1               5                   10                  15      
          His Phe Ile Lys Leu Ile Arg Ala Ala Lys Pro Arg Tyr Leu Phe Phe 
                      20                  25                  30          
          Ile Ile Gly Ile Leu Ala Gly Ile Val Gly Thr Leu Ile Gln Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Val Pro Lys Met Val Gln Pro Leu Val Asn Ser Phe Gly His Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Asn Gly Gly Lys Val Ala Leu Val Ile Ala Leu Tyr Ile Gly Ser Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Val Ser Ala Ile Ala Ala Ile Val Leu Gly Ile Phe Gly Glu Ser 
                          85                  90                  95      
          Val Val Lys Asn Leu Arg Thr Arg Val Trp Asp Lys Met Ile His Leu 
                      100                 105                 110         
          Pro Val Lys Tyr Phe Asp Glu Val Lys Thr Gly Glu Met Ser Ser Arg 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Asn Asp Thr Thr Gln Val Lys Asn Leu Ile Ala Asn Ser Ile 
              130                 135                 140                 
          Pro Gln Ala Phe Thr Ser Ile Leu Leu Leu Val Gly Ser Ile Val Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Met Leu Gln Met Gln Trp Arg Leu Thr Leu Ala Met Ile Ile Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Pro Val Val Met Leu Ile Met Phe Pro Ile Met Thr Phe Gly Gln Lys 
                      180                 185                 190         
          Ile Gly Arg Thr Arg Gln Asp Ser Leu Ala Asn Phe Gln Gly Ile Ala 
                  195                 200                 205             
          Ser Glu Ser Leu Ser Glu Ile Arg Leu Val Lys Ser Ser Asn Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Lys Gln Ala Ser Lys Lys Ala Glu Asn Asp Val Asn Ala Leu Tyr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Gly Val Lys Glu Ala Ile Phe Asp Gly Leu Met Ser Pro Val Met 
                          245                 250                 255     
          Met Leu Ser Met Met Leu Met Ile Phe Gly Leu Leu Ala Tyr Gly Ile 
                      260                 265                 270         
          Tyr Leu Ile Ser Thr Gly Val Met Ser Leu Gly Thr Leu Leu Gly Met 
                  275                 280                 285             
          Met Met Tyr Leu Met Asn Leu Ile Gly Ala Val Pro Thr Val Ala Thr 
              290                 295                 300                 
          Phe Phe Thr Glu Leu Ala Lys Ala Ser Gly Ser Thr Gly Arg Leu Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Leu Leu Asp Glu Glu Gln Glu Val Leu His Gln Gly Glu Ser Leu 
                          325                 330                 335     
          Asp Leu Glu Gly Lys Thr Leu Ser Ala Arg His Val Asp Phe Ala Tyr 
                      340                 345                 350         
          Asp Asp Ser Glu Gln Ile Leu Arg Asp Ile Ser Phe Glu Ala Gln Pro 
                  355                 360                 365             
          Asn Ser Ile Ile Ala Phe Ala Gly Pro Ser Gly Gly Gly Lys Ser Thr 
              370                 375                 380                 
          Ile Phe Ser Leu Leu Glu Arg Phe Tyr Gln Pro Thr Ala Gly Glu Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Ile Asp Gly Gln Pro Ile Asp Asn Ile Ser Leu Glu Asn Trp Arg 
                          405                 410                 415     
          Ser Gln Ile Gly Phe Val Ser Gln Asp Ser Ala Ile Met Ala Gly Thr 
                      420                 425                 430         
          Ile Arg Glu Asn Leu Thr Tyr Gly Leu Glu Gly Asp Tyr Thr Asp Glu 
                  435                 440                 445             
          Asp Leu Trp Gln Val Leu Asp Leu Ala Phe Ala Arg Ser Phe Val Glu 
              450                 455                 460                 
          Asn Met Pro Asp Gln Leu Asn Thr Glu Val Gly Glu Arg Gly Val Lys 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Ser Gly Gly Gln Arg Gln Arg Leu Ala Ile Ala Arg Ala Phe Leu 
                          485                 490                 495     
          Arg Asn Pro Lys Ile Leu Met Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Leu Asp 
                      500                 505                 510         
          Ser Glu Ser Glu Ser Met Val Gln Lys Ala Leu Asp Ser Leu Met Lys 
                  515                 520                 525             
          Gly Arg Thr Thr Leu Val Ile Ala His Arg Leu Ser Thr Ile Val Asp 
              530                 535                 540                 
          Ala Asp Lys Ile Tyr Phe Ile Glu Lys Gly Gln Ile Thr Gly Ser Gly 
          545                 550                 555                 560 
          Lys His Asn Glu Leu Val Ala Thr His Pro Leu Tyr Ala Lys Tyr Val 
                          565                 570                 575     
          Ser Glu Gln Leu Thr Val Gly Gln 
                      580                 
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  375]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  長雙叉桿菌嬰兒亞種]]>
                 （Bifidobacterium longum subsp. Infantis）
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Met Ala Glu Val Val Phe Asp His Val Thr Arg Ile Tyr Pro Gly Asn 
          1               5                   10                  15      
          Asp Lys Pro Ser Val Asp Asp Leu Asn Leu Asp Ile Lys Asp Gly Glu 
                      20                  25                  30          
          Phe Leu Val Leu Val Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Thr Leu 
                  35                  40                  45              
          Arg Met Leu Ala Gly Leu Glu Glu Val Asn Lys Gly Arg Ile Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Lys Asp Val Thr Thr Met Gln Pro Lys Asp Arg Asp Ile Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Met Val Phe Gln Asn Tyr Ala Leu Tyr Pro His Met Thr Val Ala Asp 
                          85                  90                  95      
          Asn Met Gly Phe Ala Leu Lys Ile Ala Gly Thr Pro Lys Asp Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Arg Lys Arg Val Glu Lys Ala Ala Glu Ile Leu Asp Leu Thr Glu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Asp Arg Lys Pro Lys Ala Leu Ser Gly Gly Gln Arg Gln Arg Val 
              130                 135                 140                 
          Ala Met Gly Arg Ala Ile Val Arg Glu Pro Lys Val Phe Leu Met Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Pro Leu Ser Asn Leu Asp Ala Lys Leu Arg Val Gln Thr Arg Thr 
                          165                 170                 175     
          Gln Ile Ala Ala Leu Gln Arg Gln Leu Gly Val Thr Thr Leu Tyr Val 
                      180                 185                 190         
          Thr His Asp Gln Thr Glu Ala Leu Thr Met Gly Asp Arg Ile Ala Val 
                  195                 200                 205             
          Ile Lys Leu Gly Ile Leu Gln Gln Val Gly Ala Pro Thr Glu Leu Tyr 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Pro Ala Asn Val Phe Val Ala Gly Phe Ile Gly Ser Pro Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Met Asn Leu Asn Thr His Pro Val Val Asn Gly Lys Ala Lys Ile Gly 
                          245                 250                 255     
          Glu Asp Thr Val Asp Leu Pro Ala Glu Ala Val Asn Lys Leu Thr Ala 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Asn Gly Gln Ile Val Val Gly Phe Arg Pro Glu Asp Ala Gly 
                  275                 280                 285             
          Leu Ala Pro Val Asp Asp Pro Asn Ala Phe Ser Leu Lys Val Val Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Asp Leu Gly Ser Asp Gly Tyr Ile Tyr Gly Thr Ile Val Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Gly Ser Ala Ala Glu Ala Ser Gln Val Met Ser Asp Gln Asn Lys 
                          325                 330                 335     
          Leu Thr Thr Ile Arg Val Asn Pro Arg Ala Leu Pro Lys Val Gly Ala 
                      340                 345                 350         
          Thr Val Lys Ile Lys Ile Asp Pro Ala Lys Met His Leu Phe Ala Pro 
                  355                 360                 365             
          Ser Thr Glu Leu Arg Leu Asn 
              370                 375 
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  392]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Met Ile Trp Ile Met Thr Met Ala Arg Arg Met Asn Gly Val Tyr Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Met Leu Val Ala Phe Met Met Gly Val Ala Gly Ala Leu Gln 
                      20                  25                  30          
          Ala Pro Thr Leu Ser Leu Phe Leu Ser Arg Glu Val Gly Ala Gln Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Trp Ile Gly Leu Phe Tyr Thr Val Asn Ala Ile Ala Gly Ile Gly 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Leu Trp Leu Ala Lys Arg Ser Asp Ser Gln Gly Asp Arg Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Ile Ile Phe Cys Cys Leu Met Ala Ile Gly Asn Ala Leu Leu 
                          85                  90                  95      
          Phe Ala Phe Asn Arg His Tyr Leu Thr Leu Ile Thr Cys Gly Val Leu 
                      100                 105                 110         
          Leu Ala Ser Leu Ala Asn Thr Ala Met Pro Gln Leu Phe Ala Leu Ala 
                  115                 120                 125             
          Arg Glu Tyr Ala Asp Asn Ser Ala Arg Glu Val Val Met Phe Ser Ser 
              130                 135                 140                 
          Val Met Arg Ala Gln Leu Ser Leu Ala Trp Val Ile Gly Pro Pro Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Phe Met Leu Ala Leu Asn Tyr Gly Phe Thr Val Met Phe Ser Ile 
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Gly Ile Phe Thr Leu Ser Leu Val Leu Ile Ala Phe Met Leu 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Val Ala Arg Val Glu Leu Pro Ser Glu Asn Ala Leu Ser Met 
                  195                 200                 205             
          Gln Gly Gly Trp Gln Asp Ser Asn Val Arg Met Leu Phe Val Ala Ser 
              210                 215                 220                 
          Thr Leu Met Trp Thr Cys Asn Thr Met Tyr Ile Ile Asp Met Pro Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Trp Ile Ser Ser Glu Leu Gly Leu Pro Asp Lys Leu Ala Gly Phe Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Gly Thr Ala Ala Gly Leu Glu Ile Pro Ala Met Ile Leu Ala Gly 
                      260                 265                 270         
          Tyr Tyr Val Lys Arg Tyr Gly Lys Arg Arg Met Met Val Ile Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Ala Ala Gly Val Leu Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Phe Phe Asn Ser Arg 
              290                 295                 300                 
          Met Ala Leu Met Thr Leu Gln Leu Phe Asn Ala Val Phe Ile Gly Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Val Ala Gly Ile Gly Met Leu Trp Phe Gln Asp Leu Met Pro Gly Arg 
                          325                 330                 335     
          Ala Gly Ala Ala Thr Thr Leu Phe Thr Asn Ser Ile Ser Thr Gly Val 
                      340                 345                 350         
          Ile Leu Ala Gly Val Ile Gln Gly Ala Ile Ala Gln Ser Trp Gly His 
                  355                 360                 365             
          Phe Ala Val Tyr Trp Val Ile Ala Val Ile Ser Val Val Ala Leu Phe 
              370                 375                 380                 
          Leu Thr Ala Lys Val Lys Asp Val 
          385                 390         
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  393]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Met His Asn Ser Pro Ala Val Ser Ser Ala Lys Ser Phe Asp Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ala Phe Leu Ile Val Ala Phe Leu Thr Gly Ile Ala Gly Ala 
                      20                  25                  30          
          Leu Gln Thr Pro Thr Leu Ser Ile Phe Leu Thr Asp Glu Val His Ala 
                  35                  40                  45              
          Arg Pro Ala Met Val Gly Phe Phe Phe Thr Gly Ser Ala Val Ile Gly 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Val Ser Gln Phe Leu Ala Gly Arg Ser Asp Lys Arg Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Lys Ser Leu Ile Val Phe Cys Cys Leu Leu Gly Val Leu Ala Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Phe Ala Trp Asn Arg Asn Tyr Phe Val Leu Leu Phe Val Gly 
                      100                 105                 110         
          Val Phe Leu Ser Ser Phe Gly Ser Thr Ala Asn Pro Gln Met Phe Ala 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Arg Glu His Ala Asp Lys Thr Gly Arg Glu Ala Val Met Phe 
              130                 135                 140                 
          Ser Ser Phe Leu Arg Ala Gln Val Ser Leu Ala Trp Val Ile Gly Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Ala Met Gly Phe Ser Phe Thr Val Met Tyr 
                          165                 170                 175     
          Leu Ser Ala Ala Val Ala Phe Ile Val Cys Gly Val Met Val Trp Leu 
                      180                 185                 190         
          Phe Leu Pro Ser Met Arg Lys Glu Leu Pro Leu Ala Thr Gly Thr Ile 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Pro Arg Arg Asn Arg Arg Asp Thr Leu Leu Leu Phe Val Ile 
              210                 215                 220                 
          Cys Thr Leu Met Trp Gly Ser Asn Ser Leu Tyr Ile Ile Asn Met Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Phe Ile Ile Asn Glu Leu His Leu Pro Glu Lys Leu Ala Gly Val 
                          245                 250                 255     
          Met Met Gly Thr Ala Ala Gly Leu Glu Ile Pro Thr Met Leu Ile Ala 
                      260                 265                 270         
          Gly Tyr Phe Ala Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Leu Met Arg Val Ala 
                  275                 280                 285             
          Ala Val Gly Gly Val Cys Phe Tyr Ala Gly Met Leu Met Ala His Ser 
              290                 295                 300                 
          Pro Val Ile Leu Leu Gly Leu Gln Leu Leu Asn Ala Ile Phe Ile Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Leu Gly Gly Ile Gly Met Leu Tyr Phe Gln Asp Leu Met Pro Gly 
                          325                 330                 335     
          Gln Ala Gly Ser Ala Thr Thr Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Arg Val Gly 
                      340                 345                 350         
          Trp Ile Ile Ala Gly Ser Val Ala Gly Ile Val Ala Glu Ile Trp Asn 
                  355                 360                 365             
          Tyr His Ala Val Phe Trp Phe Ala Met Val Met Ile Ile Ala Thr Leu 
              370                 375                 380                 
          Phe Cys Leu Leu Arg Ile Lys Asp Val 
          385                 390             
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  394]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Met Gln Lys Thr Ala Thr Thr Pro Ser Lys Ile Leu Asp Leu Thr Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Phe Leu Leu Val Ala Phe Leu Thr Gly Ile Ala Gly Ala Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Thr Pro Thr Leu Ser Ile Phe Leu Ala Asp Glu Leu Lys Ala Arg 
                  35                  40                  45              
          Pro Ile Met Val Gly Phe Phe Phe Thr Gly Ser Ala Ile Met Gly Ile 
              50                  55                  60                  
          Leu Val Ser Gln Phe Leu Ala Arg His Ser Asp Lys Gln Gly Asp Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Leu Ile Leu Leu Cys Cys Leu Phe Gly Val Leu Ala Cys Thr 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Ala Trp Asn Arg Asn Tyr Phe Ile Leu Leu Ser Thr Gly Val 
                      100                 105                 110         
          Leu Leu Ser Ser Phe Ala Ser Thr Ala Asn Pro Gln Met Phe Ala Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Arg Glu His Ala Asp Arg Thr Gly Arg Glu Thr Val Met Phe Ser 
              130                 135                 140                 
          Thr Phe Leu Arg Ala Gln Ile Ser Leu Ala Trp Val Ile Gly Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ala Tyr Glu Leu Ala Met Gly Phe Ser Phe Lys Val Met Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Ala Ile Ala Phe Val Val Cys Gly Leu Ile Val Trp Leu Phe 
                      180                 185                 190         
          Leu Pro Ser Ile Gln Arg Asn Ile Pro Val Val Thr Gln Pro Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Ile Leu Pro Ser Thr His Arg Lys Arg Asp Thr Arg Leu Leu Phe Val 
              210                 215                 220                 
          Val Cys Ser Met Met Trp Ala Ala Asn Asn Leu Tyr Met Ile Asn Met 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Phe Ile Ile Asp Glu Leu His Leu Thr Asp Lys Leu Thr Gly 
                          245                 250                 255     
          Glu Met Ile Gly Ile Ala Ala Gly Leu Glu Ile Pro Met Met Leu Ile 
                      260                 265                 270         
          Ala Gly Tyr Tyr Met Lys Arg Ile Gly Lys Arg Leu Leu Met Leu Ile 
                  275                 280                 285             
          Ala Ile Val Ser Gly Met Cys Phe Tyr Ala Ser Val Leu Met Ala Thr 
              290                 295                 300                 
          Thr Pro Ala Val Glu Leu Glu Leu Gln Ile Leu Asn Ala Ile Phe Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ile Leu Cys Gly Ile Gly Met Leu Tyr Phe Gln Asp Leu Met Pro 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Ile Gly Ser Ala Thr Thr Leu Tyr Ala Asn Thr Ser Arg Val 
                      340                 345                 350         
          Gly Trp Ile Ile Ala Gly Ser Val Asp Gly Ile Met Val Glu Ile Trp 
                  355                 360                 365             
          Ser Tyr His Ala Leu Phe Trp Leu Ala Ile Gly Met Leu Gly Ile Ala 
              370                 375                 380                 
          Met Ile Cys Leu Leu Phe Ile Lys Asp Ile 
          385                 390

Claims

一種用於生產唾液酸化（sialylated）雙醣及/或寡醣之代謝上經工程改造之細胞，該細胞包含用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑，其特徵在於該細胞經修飾以用於表現及/或過度表現編碼一或多種催化相同化學反應之蛋白質的多個編碼DNA序列。
如請求項1之細胞，其中該蛋白質參與該用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑。
如請求項1或2中任一項之細胞，其中該用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之途徑包含唾液酸化途徑。
如請求項3之細胞，其中該唾液酸化途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶水解、N-乙醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶（N-aceylneuraminate-9-phosphate synthetase）、磷酸酶（phosphatase）、N-乙醯基神經胺酸合酶、N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶（N-acylneuraminate cytidylyltransferase）、唾液酸基轉移酶（sialyltransferase）及唾液酸運輸蛋白，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由該等多個編碼DNA序列編碼。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該等多個編碼DNA序列包含以下者中之任何一或多者： - 編碼一種蛋白質之相同編碼DNA序列的多個複本， - 編碼一種蛋白質之多個編碼DNA序列，及 - 編碼催化相同化學反應之多種同功蛋白質（isoprotein）的多個編碼DNA序列。
如前述請求項中任一項之細胞，其中多個為至少2個、較佳至少3個、更佳至少5個。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該等編碼DNA序列在一或多個基因表現模組中呈現至該細胞，其中表現受一或多個調節序列調節。
如請求項7之細胞，其中該等表現模組整合於宿主細胞之基因體中及/或在包含質體、黏接質體、噬菌體、脂質體或病毒之載體上呈現至該細胞，該載體將穩定轉形至該宿主細胞中。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該蛋白質參與核苷酸活化糖之合成，其中該核苷酸活化糖將用於生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣。
如請求項9之細胞，其中該核苷酸活化糖係選自包含以下者之清單：UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-阿拉伯（arabino）-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇（lyxo）-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（rhamnosamine）（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺（acetylfucosamine）、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（pneumosamine）（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸（acetylmuramic acid）、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（quinovosamine）（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、CMP-唾液酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、CMP-N-羥乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-鼠李糖及UDP-木糖，較佳地，該核苷酸活化糖係選自包含以下者之清單：UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、CMP-唾液酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂及CMP-N-羥乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Gc）。
如請求項9或10中任一項之細胞，其中該參與核苷酸活化糖之合成的蛋白質係選自包含以下者之清單：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶（phosphomannomutase）、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（guanylyltransferase）、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、L-岩藻糖激酶（fucokinase）/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、N-乙醯基葡萄糖胺表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6P 2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（uridylyltransferase）、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、唾液酸合酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸磷酸酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖磷酸變位酶、 N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、UDP-半乳糖4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶、UDP-GalNAc焦磷酸化酶、甘露糖-1-磷酸甲脒基轉移酶（guanyltransferase）、UDP-GlcNAc 2-表異構酶及ManNAc激酶。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞進一步表現至少一種選自包含以下者之清單的醣基轉移酶（glycosyltransferase）：岩藻糖基轉移酶、唾液酸基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶（xylosyltransferase）、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳糖醛酸苷轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-羥乙醯基神經胺基轉移酶（N-glycolylneuraminyltransferase）、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺（altrosamine）轉胺酶、UDP- N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶， - 較佳地，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾， - 較佳地，該岩藻糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， - 較佳地，該唾液酸基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及α-2,8-唾液酸基轉移酶， - 較佳地，該半乳糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， - 較佳地，該葡萄糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， - 較佳地，該甘露糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自包含α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶之清單。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該蛋白質係選自包含以下者之清單的膜運輸蛋白：螯鐵蛋白輸出蛋白、ABC運輸蛋白、MFS運輸蛋白及糖流出運輸蛋白。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該唾液酸化雙醣及/或寡醣係選自包含以下者之清單：乳寡醣、O-抗原、腸內菌共同抗原（ECA）、存在於莢膜多醣中之寡醣重複、肽聚醣、胺基-糖及路易斯（Lewis）型抗原寡醣，較佳該乳寡醣係哺乳動物乳寡醣，更佳該乳寡醣係人乳寡醣。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞包含岩藻糖基化途徑，該途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、岩藻糖基轉移酶，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由該等編碼一或多種催化相同化學反應之酶的多個編碼DNA序列編碼，其中多個較佳為兩個、更佳三個或更多個。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞包含半乳糖基化途徑，該途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖磷酸變位酶、半乳糖基轉移酶，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由該等編碼一或多種催化相同化學反應之酶的多個編碼DNA序列編碼，其中多個較佳為兩個、更佳三個或更多個。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞包含N-乙醯基葡萄糖胺基化途徑，該途徑包含至少一種選自包含以下者之清單的蛋白質：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，較佳地，其中該等蛋白質中之至少一者由該等編碼一或多種催化相同化學反應之酶的多個編碼DNA序列編碼，其中多個較佳為兩個、更佳三個或更多個。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以用於增強磷酸烯醇丙酮酸（PEP）之合成及/或供應。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞包含： - 至少一個編碼選自包含以下者之清單之蛋白質的編碼DNA序列：i）具有SEQ ID NO 01且具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性之來自腦膜炎奈瑟氏菌（ Neisseria meningitidis）的酶（NmNeuB），ii）該具有SEQ ID NO 01之酶的功能同源物或功能片段，及iii）與該具有SEQ ID NO 01之酶之全長序列具有至少80%序列一致性且具有N-乙醯基神經胺酸合酶活性的多肽序列， - 兩個或更多個編碼選自包含以下者之清單之蛋白質的編碼DNA序列：i）具有SEQ ID NO 02之來自空腸彎曲桿菌（ Campylobacter jejuni）的酶（CjNeuA）、具有SEQ ID NO 03之來自流感螺旋桿菌（ Helicobacter influenzae）的酶（HiNeuA）及具有SEQ ID NO 04之來自多殺性巴氏桿菌（ Pasteurella multocida）的酶（PmultNeuA），其中該等具有SEQ ID NO 02、03及04之酶具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性，ii）該等具有SEQ ID NO 02、03或04之酶中之任一者的功能同源物或功能片段，及iii）與該等具有SEQ ID NO 02、03或04之酶中之任一者之全長序列分別具有至少80%序列一致性，且具有N-醯基神經胺酸胞苷醯基轉移酶活性的多肽序列，及 - 一或多個以下之編碼DNA序列的兩個或更多個複本：α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶及/或α-2,8-唾液酸基轉移酶。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞包含： - 編碼DNA序列之兩個或更多個複本，該編碼DNA序列編碼具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶活性且較佳選自包含以下者之清單的酶：i）具有SEQ ID NO 05之來自大腸桿菌（ Escherichia coli）的酶（glmS*54），及ii）該具有SEQ ID NO 05之酶的功能同源物或功能片段，及iii）與該具有SEQ ID NO 05之酶之全長序列具有至少80%序列一致性，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶活性的多肽序列，及/或 - 編碼DNA序列之兩個或更多個複本，該編碼DNA序列編碼具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶活性的酶，該酶較佳選自包含以下者之清單：i）具有SEQ ID NO 06之來自釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的酶（GNA1），ii）該具有SEQ ID NO 06之酶的功能同源物或功能片段，及iii）與該具有SEQ ID NO 06之酶之全長序列具有至少80%序列一致性，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶活性的多肽序列。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞包含用於減少乙酸之生產的修飾。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞進一步包含包括以下者之蛋白質中之任何一或多者的較低或降低表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基（undecaprenyl）-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶（L-fuculokinase）、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性易位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性易位磷酸轉移酶（PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶（phosphoacyltransferase）、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞包含對於所選單醣、雙醣或寡醣之分解代謝途徑，該分解代謝途徑至少部分不活化，該等單醣、雙醣或寡醣參與該唾液酸化雙醣及/或寡醣之合成及/或為該合成所需。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞使用用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物，該前驅物自培養基進料至該細胞。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞生產用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞在全培養液及/或上清液中生產90 g/L或更多之該唾液酸化雙醣及/或寡醣，及/或其中根據該全培養液及/或上清液中由該細胞生產之唾液酸化雙醣及/或寡醣及其前驅物的總量量測，該全培養液及/或上清液中該唾液酸化雙醣及/或寡醣之純度分別為至少80%。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞係細菌、真菌、酵母、植物細胞、動物細胞或原蟲細胞， - 較佳地，該細菌係大腸桿菌菌株，更佳為K-12菌株之大腸桿菌菌株，甚至更佳該大腸桿菌K-12菌株係大腸桿菌MG1655， - 較佳地，該真菌屬於選自包含以下者之群組的屬：根黴菌屬（ Rhizopus）、網柄菌屬（ Dictyostelium）、青黴菌屬（ Penicillium）、白黴菌屬（ Mucor）或麴菌屬（ Aspergillus）， - 較佳地，該酵母屬於選自包含以下者之群組的屬：酵母菌屬（ Saccharomyces）、接合酵母屬（ Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（ Pichia）、駒形氏酵母屬（ Komagataella）、漢森酵母屬（ Hansenula）、亞羅酵母屬（ Yarrowia）、球擬假絲酵母屬（ Starmerella）、克魯維酵母屬（ Kluyveromyces）或德巴利酵母屬（ Debaromyces）， - 較佳地，該植物細胞係藻類細胞或衍生自菸草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物， - 較佳地，該動物細胞衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬蟲類、兩棲動物或昆蟲，或為衍生自排除胚胎幹細胞之人類細胞的經基因修飾之細胞系，更佳該人類及非人類哺乳動物細胞係上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、鼠類骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，更佳該昆蟲細胞衍生自草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）、家蠶（ Bombyx mori）、甘藍夜蛾（ Mamestra brassicae）、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）或黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）， - 較佳地，該原蟲細胞係蜥蜴利什曼原蟲（ Leishmania tarentolae）細胞。
如具體實例27之細胞，其中該細胞係活的革蘭氏陰性細菌，與未經修飾之先驅細胞相比，其包含減少或消除的聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）、腸內菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸（colanic acid）、核心寡醣、滲透調節周質葡聚醣（OPG）、甘油葡萄糖苷（glucosylglycerol）、聚醣及/或海藻糖（trehalose）之合成。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞在培養基中穩定培養。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞能夠合成包含至少一種唾液酸化寡醣之寡醣的混合物。
如前述請求項中任一項之細胞，其中該細胞能夠合成包含至少一種唾液酸化雙醣及/或寡醣之雙醣及寡醣的混合物。
一種藉由細胞生產唾液酸化雙醣及/或寡醣之方法，該方法包含以下步驟： i) 提供如請求項1至31中任一項之細胞，及 ii) 在允許生產該唾液酸化雙醣及/或寡醣之條件下培養該細胞， iii) 較佳地，自該培養物分離該唾液酸化雙醣及/或寡醣。
如請求項32之方法，該方法進一步包含以下步驟中之至少一者： i) 向反應器中之培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料（acceptor feed），其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前該培養基之體積的三倍、較佳不超過兩倍、更佳小於2倍； ii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料； iii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定在3到7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在該培養基之最終體積中產生濃度為至少50 g/L、較佳至少75 g/L、更佳至少90 g/L、更佳至少100 g/L、更佳至少125 g/L、更佳至少150 g/L、更佳至少175 g/L、更佳至少200 g/L之唾液酸化雙醣及/或寡醣。
如請求項32之方法，該方法進一步包含以下步驟中之至少一者： i) 向培養基中添加包含每公升初始反應器體積至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前該培養基之體積的三倍、較佳不超過兩倍、更佳小於2倍； ii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加乳糖進料； iii) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基中添加乳糖進料，且其中該乳糖進料溶液之濃度為50 g/L、較佳75 g/L、更佳100 g/L、更佳125 g/L、更佳150 g/L、更佳175 g/L、更佳200 g/L、更佳225 g/L、更佳250 g/L、更佳275 g/L、更佳300 g/L、更佳325 g/L、更佳350 g/L、更佳375 g/L、更佳400 g/L、更佳450 g/L、更佳500 g/L、甚至更佳550 g/L、最佳600 g/L；且其中較佳地，該溶液之pH設定在3到7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在該培養基之最終體積中產生濃度為至少50 g/L、較佳至少75 g/L、更佳至少90 g/L、更佳至少100 g/L、更佳至少125 g/L、更佳至少150 g/L、更佳至少175 g/L、更佳至少200 g/L之從該乳糖生產之唾液酸化寡醣。
如請求項34之方法，其中該乳糖進料係藉由自培養開始以至少5 mM之濃度，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150 mM之濃度，更佳以＞300 mM之濃度添加乳糖來實現。
如請求項34或35中任一項之方法，其中該乳糖進料係藉由以使得在培養之整個生產階段中獲得至少5 mM、較佳10 mM或30 mM之乳糖濃度之濃度向培養基中添加乳糖來實現。
如請求項32至36中任一項之方法，其中宿主細胞培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。
如請求項32至37中任一項之方法，其中該細胞培養於包含碳源之培養基中，該碳源包含單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、甘油，包括糖蜜、玉米浸液、蛋白腖、胰腖或酵母萃取物之複合培養基；較佳地，其中該碳源係選自包含以下者之清單：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽寡醣、麥芽三醣、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖糖漿、乙酸、檸檬酸、乳酸及丙酮酸。
如請求項32至38中任一項之方法，其中該細胞使用至少一種用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物，較佳該細胞使用兩種或更多種用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。
如請求項32至39中任一項之方法，其中該培養基含有至少一種選自包含以下者之群組的化合物：乳糖、半乳糖、唾液酸、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二醣（LNB）、N-乙醯基乳糖胺（LacNAc）。
如請求項32至40中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由將較佳葡萄糖或蔗糖之以碳為基礎的基質添加至該培養基中來提供，隨後在第二階段中將乳糖添加至培養基中。
如請求項32至41中任一項之方法，其中該細胞生產至少一種用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物。
如請求項32至42中任一項之方法，其中該用於合成該唾液酸化雙醣及/或寡醣之前驅物完全轉化成該唾液酸化雙醣及/或寡醣。
如請求項32至43中任一項之方法，其中將該唾液酸化雙醣及/或寡醣與該培養基及/或該細胞分離。
如請求項32至44中任一項之方法，其中該分離包含以下步驟中之至少一者：澄清、超過濾、奈米過濾、二相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、用非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流高效過濾、切向流超過濾、電泳、親和層析、離子交換層析、疏水性交互作用層析及/或凝膠過濾、配位體交換層析。
如請求項32至45中任一項之方法，其中該方法進一步包含純化該唾液酸化雙醣及/或寡醣。
如請求項46之方法，其中該純化包含以下步驟中之至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾、電泳、酶處理或離子交換、使用醇、使用水醇（aqueous alcohol）混合物、結晶、蒸發、沈澱、乾燥、噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥（band drying）、帶式乾燥（belt drying）、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒（drum）乾燥、滾筒（roller）乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。
一種如請求項1至29中任一項之細胞之用途，其用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣。
一種如請求項30之細胞之用途，其用於生產包含至少一種唾液酸化寡醣之寡醣的混合物。
一種如請求項31之細胞之用途，其用於生產包含至少一種唾液酸化雙醣及/或寡醣之雙醣及寡醣的混合物。
一種如請求項32至47中任一項之方法之用途，其用於生產唾液酸化雙醣及/或寡醣。