TW202227466A

TW202227466A - 用於改進封閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）的產生之經修飾的桿狀病毒系統

Info

Publication number: TW202227466A
Application number: TW110131139A
Authority: TW
Inventors: 亞傑馬霍迪亞
Original assignee: 美商百歐維拉提夫治療公司
Priority date: 2020-08-23
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2022-07-16
Also published as: US20220090130A1; BR112023002395A2; JP2023538666A; MX2023002221A; IL300445A; KR20230046323A; CA3189673A1; EP4199971A1; WO2022046665A1; AU2021330936A1; CN116194152A

Abstract

本公開文涉及一種用於在昆蟲細胞中產生封閉端DNA(ceDNA)的重組桿狀病毒(rBV)表現系統。

Description

用於改進封閉端DNA(ceDNA)的產生之經修飾的桿狀病毒系統

基因療法提供了治療多種疾病的持久手段。在過去，基因療法通常依賴於病毒載體的使用。AAV載體已經作為一種更常見類型的病毒載體出現。然而，衣殼的存在限制了AAV載體在基因療法中的效用。具體地，衣殼自身可能將載體中包括的轉殖基因的大小限制到低至小於4.5kb。即使在添加表現控制序列之前，可用於基因療法的各種治療性蛋白也可以輕易超過這個大小。此外，構成衣殼的蛋白質可能充當受試者的免疫系統可靶向的抗原。AAV在一般群體中非常常見，大多數人在其一生中已經暴露於AAV。因此，大多數潛在的基因療法接受者可能已經產生過針對AAV的免疫反應，因此更有可能排斥所述療法。此外，哺乳動物細胞中的病毒載體產生可能會遇到產量低和難以擴大以大規模商業生產的問題。

已經表明，在不存在AAV cap基因表現的情況下，AAV載體基因組經歷無效率的複製，並且分子內中間體的互補股(藉由兩端的ITR共價連接)以封閉端線性雙股體DNA(ceDNA)的新構象積累。ceDNA沒有由病毒衣殼內的有限空間強加的包裝限制。因此，ceDNA載體可以用作病毒載體基因療法的替代方案。控制元件、大轉殖基因和多個轉殖基因可包括在ceDNA構築體中，而無需擔心大小限制。

桿狀病毒表現載體(BEV)是具有經過基因修飾以包括感興趣的外來基因的雙股環狀DNA基因組的重組桿狀病毒。BEV是能存活的，並且可以感染易感宿主、通常是經培養的昆蟲細胞。BEV可用於產生基因療法用的封閉端DNA(ceDNA)，從而避免了對病毒載體的需要。然而，已經發現，當在用BEV轉導後從昆蟲細胞中純化感興趣的核酸(諸如ceDNA)時，可以發現桿狀病毒基因組DNA連同感興趣的核酸一起被共純化。這似乎是由於所產生的病毒顆粒。

因此，業內需要在桿狀病毒系統中有效地產生經純化的感興趣的核酸，並且減少後代病毒顆粒的數量，並且最終減少經純化的核酸製劑中桿狀病毒基因組DNA的污染。

本公開文至少部分係關於一種表現系統，所述表現系統包含(1)包含經編輯的基因組的重組桿狀病毒質體(bacmid)或重組桿狀病毒表現載體(rBEV)，所述經編輯的基因組具有桿狀病毒複製所必需的失活的或減弱的桿狀病毒基因(例如，失活的衣殼基因，例如失活的VP80基因)和感興趣的核酸(例如，ceDNA載體)；和(2)所述失活的或減弱的必需桿狀病毒基因的功能對應物，所述功能對應物以反式提供，使得宿主細胞(例如，昆蟲細胞)能夠在用rBV感染所述宿主細胞後繁殖所述rBEV。

已經發現，本公開文的表現系統使得能夠產生感興趣的核酸(例如，ceDNA)，而沒有明顯水準的污染性BV基因組DNA。因此，從用經基因組編輯的rBEV感染的宿主細胞(例如，昆蟲細胞)中分離的DNA所產生的DNA滴度高於用具有含有必需桿狀病毒基因的功能對應物的基因組的rBV感染的宿主細胞。這些發現已經被用於開發本公開文，本公開文部分涉及一種重組桿狀病毒系統、其組分、以及使用專門編輯的rBV用於產生異源DNA(例如，ceDNA)的方法。

在一態樣，本公開文提供一種重組桿狀病毒質體，所述重組桿狀病毒質體包含：(i)桿狀病毒複製所需的桿狀病毒基因的變異體，其中所述變異體基因表現出其編碼的蛋白質的降低的表現；(ii)細菌複製起點(ori)；和(iii)至少一個用於整合包含轉殖基因的異源DNA序列的整合位點。

在一個實施例中，所述桿狀病毒基因是衣殼基因或衣殼相關基因。

在一個實施例中，所述桿狀病毒基因選自由以下組成之群組：VP80、VP39、GP41、P333、VP1-54、VLF-1和PP78/83。

在一個實施例中，所述桿狀病毒基因是VP80。

在一個實施例中，由於使所述必需基因的變異體的表現失活的破壞或突變，所述必需基因的變異體不表現。

在一個實施例中，所述必需基因的變異體包含破壞其表現的插入和/或缺失(「插入缺失(indel)」)。

在一個實施例中，所述插入缺失是由靶向核酸酶系統產生的。

在一個實施例中，所述複製起點是微型F複製子、ColE1、oriC、OriV、OriT或OriS。

在一個實施例中，所述桿狀病毒質體進一步包含報告子基因。

在一個實施例中，所述桿狀病毒質體進一步包含選擇標記表現基因盒。

在一個實施例中，所述桿狀病毒質體進一步包含Rep蛋白。

在另一態樣，本公開文提供一種重組桿狀病毒表現載體(rBEV)，所述表現載體是藉由將異源DNA序列位點特異性整合到如前述請求項中任一項所述的桿狀病毒質體的整合位點中產生的。

在一個實施例中，所述異源DNA序列是Rep蛋白。

在另一個實施例中，所述異源核酸序列包含側接反向末端重複(ITR)的轉殖基因。

在一個實施例中，所述異源核酸表現為封閉端DNA(ceDNA)。

在另一態樣，本公開文提供了一種桿狀病毒表現系統，所述表現系統包含(i)如本文揭示的rBEV；和(ii)功能蛋白的來源，其中所述功能蛋白能夠補充變異體必需基因，並且其中所述功能蛋白以反式提供給所述rBEV。

在一個實施例中，所述功能蛋白以單獨的表現載體提供，所述表現載體以反式表現所述功能蛋白。

在一個實施例中，所述功能蛋白由昆蟲細胞提供，所述昆蟲細胞表現與變異體衣殼蛋白相對應的功能衣殼蛋白。

在一個實施例中，所述昆蟲細胞是Sf9、Sf21、S2、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、E4a或BTI-TN-5B1-4細胞。

在另一個實施例中，所述昆蟲細胞是編碼異源核酸序列的穩定細胞株。

在另一個實施例中，異源DNA序列包含側接反向末端重複(ITR)的轉殖基因。

在另一個實施例中，所述異源核酸表現為封閉端DNA(ceDNA)。

在另一態樣，本公開文提供了一種在昆蟲細胞中繁殖桿狀病毒表現載體的方法，所述方法包括：(a)用如本文揭示的重組桿狀病毒表現載體(rBEV)轉染所述昆蟲細胞；(b)提供能夠補充變異體必需基因的功能蛋白，其中所述功能蛋白以反式提供給所述rBEV；以及(c)培養所述昆蟲細胞，從而繁殖所述桿狀病毒表現系統載體。

在一個實施例中，所述功能蛋白是藉由用所述功能衣殼蛋白電穿孔所述昆蟲細胞來提供的。

在一個實施例中，所述功能蛋白是藉由用單獨的表現載體轉染所述昆蟲細胞來提供的，所述表現載體穩定地整合並且以反式表現所述功能蛋白。

在一個實施例中，功能衣殼基因是藉由在所述昆蟲細胞中表現與變異體衣殼蛋白相對應的功能衣殼蛋白來提供的。

在一個實施例中，所述功能衣殼基因在誘導型或活化(transactivating)啟動子的控制下在所述細胞中表現。

在一個實施例中，所述誘導型啟動子是苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcMNPV)39K啟動子。

在另一態樣，本公開文提供一種產生包含轉殖基因的異源DNA序列的方法，(a)繁殖如本文揭示的重組桿狀病毒表現載體(rBEV)；(b)收穫所述rBEV；(c)用所收穫的rBEV感染穩定昆蟲細胞昆蟲細胞，其中所述穩定昆蟲細胞株編碼異源核酸序列；以及(d)純化在所述穩定昆蟲細胞株中表現的所述異源DNA序列。

在另一態樣，本公開文提供一種產生包含轉殖基因的異源DNA序列的方法，(a)繁殖如本文揭示的重組桿狀病毒表現載體(rBEV)；(b)收穫所述rBEV；(c)感染昆蟲細胞以表現異源DNA序列；以及(d)從所述昆蟲細胞中純化所述異源DNA序列。

在一個實施例中，所述異源DNA序列基本上不含桿狀病毒基因組DNA。

在一個實施例中，所述異源DNA序列包含側接反向末端重複(ITR)的轉殖基因。

在一個實施例中，所述異源核酸表現為封閉端DNA(ceDNA)。

在另一態樣，本公開文提供一種包含編碼治療性蛋白的轉殖基因的異源DNA序列，所述異源DNA序列是藉由本文揭示的方法產生的。

當與附圖一起閱讀時，本公開文的前述和其他目的、其各種特徵以及本公開文本身可以從以下描述中更充分地理解。

圖1描繪編碼AAV2.Rep的重組桿狀病毒表現載體(AcBIVVBac.Polh.AAV2.Rep^Tn7)的示意圖譜。

圖2展示兩種單指導RNA(sgRNA)靶向桿狀病毒表現載體內的VP80基因座的位置。

圖3和圖4展示了兩個單獨選殖株的TIDE(藉由分解追蹤插入缺失(Tracking of Indels by Decomposition))分析以確定由每種sgRNA誘導的插入缺失。

圖5A是用於產生Sf.39K.VP80補體細胞株的在誘導型AcMNPV 39K啟動子下編碼AcMNPV vp80基因的轉移載體的展示。圖5B示出了在AcMNPV立即早期(ie1)啟動子下編碼新黴素抗性標記的質體的示意圖譜，所述啟動子之前是轉錄增強子hr5元件，之後是AcMNPV p10多聚腺苷酸化信號。圖5C示出了側接AAV2 ITR的hFVIIIco6XTEN表現盒的示意圖譜，所述表現盒穩定地整合到Sf9細胞基因組中以產生穩定細胞株。

圖6是示出了與其未經修飾的對應物相比，由經修飾的rBEV產生的hFVIIIco6XTEN封閉端DNA(ceDNA)的單條厚條帶的凝膠測定。

圖7示出了如在實例5中所述，在限制性內切酶消化之前(未切割)和之後(標記的右側)分析的hFVIIIco6XTEN ceDNA的瓊脂糖凝膠圖像。在「熱處理」泳道下指示以不同體積運行的熱處理樣品，並且在「未處理」泳道下指示以不同體積運行的未處理樣品。根據圖8中所述的圖譜獲得的DNA大小片段在右側用箭頭和大小(以kb表示)指示。

圖8示出了hFVIIIco6XTEN ceDNA的AscI限制性核酸內切酶消化的示意圖譜。AscI在大小為6556bp的hFVIIIco6XTEN單體中具有單個識別位點，並且消化後產生2.9kb和3.6kb的片段。紅色矩形指示5' ITR的位置，並且黑色矩形指示3' ITR的位置。還示出了呈尾對尾或頭對頭構象的兩個二聚體圖形的示意圖譜，連同一個或多個AscI識別位點和以kb表示的預測的DNA片段大小。

圖9A-9C示出了在不同啟動子下包含HBoV1 NS1的重組桿狀病毒表現載體(BEV)的示意圖。

圖9A示出了在AcMNPV多角體蛋白啟動子下編碼NS1的 AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7的示意圖譜。

圖9B示出了在AcMNPV立即早期1(IE1)(前面是AcMNPV轉錄增強子hr5元件)下編碼NS1的AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1^Tn7的示意圖譜。

圖9C示出了在OpMNPV立即早期2(IE2)啟動子下編碼NS1的AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1^Tn7的示意圖譜。

圖10A-10C示出了從TwoBAC系統產生FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA載體的示意圖。

圖10A是FVIIIXTEN ceDNA載體產生的TwoBAC方法的示意圖，其中用編碼FVIIIXTEN表現盒(側接HBoV1 ITR)(AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs^Tn7)和/或HBoV1 NS1基因(在AcMNPV多角體蛋白啟動子下)(AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7)的重組BEV共感染Sf9細胞。

圖10B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs^Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7 BEV的示意圖譜。

圖10C是從以如所指示的不同MOI的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs^Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7 BEV共感染的Sf9細胞中分離的FVIIIXTEN ceDNA載體的瓊脂糖凝膠圖像。與FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA載體(ceDNA)、桿狀病毒DNA(vDNA)和Sf9細胞基因組DNA(gDNA)大小相對應的DNA條帶由箭頭指示。

圖11A-11C示出了根據本發明的一個實施例，用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7桿狀病毒質體DNA和VP80 sgRNA共轉染的Sf9細胞的紅色螢光(上圖)或亮視野(下圖)顯微圖像。

圖11A示出了用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7桿狀病毒質體DNA和僅Cas9共轉染的細胞的顯微圖像。

圖11B示出了用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7桿狀病毒質體 DNA和sgRNA.VP80.T1共轉染的細胞的顯微圖像。

圖11C示出了用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7桿狀病毒質體DNA和sgRNA.VP80.T2共轉染的細胞的顯微圖像。

對電子提交的序列表之引用

將以ASCII文字檔案電子提交的序列表(名稱：SA9-475PC_ST25.txt；大小：39kB；創建日期：2021年8月22日)的內容藉由引用以其整體併入本文。

本公開文描述了下調來自桿狀病毒基因組的衣殼基因之表現以防止用於基因療法目的的異源DNA製劑中的污染。

定義

除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語均具有與本公開文本所屬領域的一般熟習此項技術者通常所理解的相同的含義。除非另外指示，否則為本文中的基團或術語提供的初始定義單獨地或作為另一個基團的一部分在整個說明書中適用於該基團或術語。

應注意，術語「一個/一種(a)」或「一個/一種(an)」實體是指一個/一種或多個/多種該實體：例如，「一個核苷酸序列」應理解為代表一個或多個核苷酸序列。類似地，「一種治療性蛋白」和「一種桿狀病毒表現載體」應理解為分別代表一種或多種治療性蛋白和一種或多種桿狀病毒表現載體。因此，術語「一個/一種(a或an)」、「一個/一種或多個/多種(one or more)」以及「至少一個/一種(at least one)」在本文中可以互換使用。

術語「約」在本文中用於意指大約、大致、大概或在......左右。當術語「約」聯合數值範圍使用時，其藉由擴展所述數值上下的邊界來修飾該範圍。一般而言，術語「約」在本文中用於向上或向下(較高或較低)以10%的差異修飾高於和低於所述值的數值。

同樣如本文所用，「和/或」是指並且涵蓋一個或多個相關列示專案的任何和所有可能組合，以及在替代方案(「或」)中解釋時組合的缺乏。

「核酸」、「核酸分子」、「核苷酸」、「一個或多個核苷酸的序列」和「多核苷酸」可互換使用，並且是指呈單股形式或雙股螺旋的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷或去氧胞苷；「DNA分子」)的磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯和硫代酸酯。單股核酸序列是指單股DNA(ssDNA)或單股RNA(ssRNA)。雙股DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術語核酸分子、特別是DNA或RNA分子僅僅是指分子的一級和二級結構，並且不將其限制為任何特定三級形式。因此，這個術語包括尤其在線性或環狀DNA分子(例如，限制性片段)、質體、超螺旋化DNA和染色體中發現的雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子的結構時，在本文中可以根據僅沿著DNA的非轉錄股(即，具有與mRNA同源的序列的股)以5'至3'方向給出序列的常規習慣描述序列。「重組DNA分子」是已經經歷分子生物學操縱的DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因組DNA、質體DNA、合成DNA和半合成DNA。本公開文的「核酸組合物」包含如本文所述的一種或多種核酸。

如本文所用，術語「異源核苷酸序列」是指不與給定多核苷酸序列一起天然存在的核苷酸序列。在某些實施例中，異源核苷酸序列包含轉殖基因。

如本文所用，術語「轉殖基因」是指如本文所公開的，摻入並且可以藉由核酸分子(例如，ceDNA載體)遞送並表現的感興趣的核酸(編碼衣殼多肽的核酸除外)。感興趣的轉殖基因包括但不限於編碼多肽(較佳地治療性多肽(例如，用於醫療、診斷或獸醫用途)或免疫原性多肽(例如，用於疫苗))的核酸。在一些實施例中，感興趣的核酸包括轉錄成治療性RNA的核酸。被包括以用於在本公開文本的核酸分子(例如，ceDNA載體)中使用的轉殖基因包括但不限於表現或編碼一種或多種多肽、肽、核酶、適體、肽核酸、siRNA、RNAi、miRNA、lncRNA、反義寡核苷酸或多核苷酸、抗體、抗原結合片段或其任何組合的那些。

如本文所用，「反向末端重複」(或「ITR」)是指位於單股核酸序列(例如，表現盒或轉殖基因)的5'端或3'端的核酸子序列，所述核酸子序列包含一組核苷酸(初始序列)，之後下游是其反向互補體，即回文序列。初始序列與反向互補體之間的插入核苷酸序列可以具有任何長度，包括零。在一個實施例中，可用於本公開文本的ITR包含一個或多個「回文序列」。因此，如本文所用的「ITR」可以折疊回於自身並形成雙股區段。例如，在折疊以形成雙螺旋時，序列GATCXXXXGATC包含GATC的初始序列及其互補體(3'CTAG5')。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的連續回文序列(例如，GATCGATC)。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的中斷的回文序列(例如，GATCXXXXGATC；SEQ ID NO：11)。在一些實施例中，連續或中斷的回文序列的互補部分彼此相互作用以形成「髮夾環」結構。如本文所用，在單股核苷酸分子上的至少兩個互補序列鹼基配對以形成雙股部分時，產生「髮夾環」結構。在一些實施例中，僅ITR的一部分形成髮夾環。在其他實施例中，整個ITR形成髮夾環。在一些實施例中，ITR形成T形髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成非T形髮夾結構，例如U形髮夾結構。

ITR可以具有任何數量的功能。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的長期存活。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的永久存活(例如，持續細胞的整個壽命)。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的穩定性。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的保留。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的持久性。在一些實施例中，ITR抑制或防止核酸分子在細胞的細胞核中的降解。在病毒的背景下，ITR介導複製、病毒包裝、整合和原病毒拯救。在沒有衣殼基因且側接ITR序列的核酸分子(例如，ceDNA載體)的背景下，ITR能夠介導核酸分子(例如，ceDNA載體)的複製。

在某些實施例中，ITR是病毒末端重複或合成序列，所述末端重複或合成序列包含至少一個最小所需複製起點和含有回文髮夾結構的區域。Rep結合序列(「RBS」)(也稱為RBE(Rep結合元件))和末端解析位點(terminal resolution site，「TRS」)可以一起構成「最小所需複製起點」。

應理解，可以存在多於兩個的ITR或不對稱的ITR對。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或者可以衍生自AAV ITR或非AAV ITR。例如，ITR可以衍生自細小病毒科(Parvoviridae)，所述細小病毒科涵蓋細小病毒(parvoviruses)和依賴病毒(dependoviruses)(例如，犬細小病毒、牛細小病毒、小鼠細小病毒、豬細小病毒、人細小病毒B-19)。細小病毒科病毒由兩個亞科組成：感染脊椎動物的細小病毒亞科(Parvovirinae)和感染無脊椎動物的濃核病毒亞科(Densovirinae)。依賴細小病毒(dependoparvovirus)包括能夠在脊椎動物宿主(包括但不限於人、靈長類動物、牛、犬、馬和綿羊物種)中複製的腺相關病毒(AAV)的病毒家族。

在某些實施例中，至少一個ITR是非腺病毒相關病毒(非AAV)的ITR。在某些實施例中，ITR是病毒科細小病毒科的非AAV成員的ITR。在一些實施例中，ITR是依賴病毒屬(Dependovirus)或紅病毒屬(Erythrovirus)的非AAV成員的ITR。在特定實施例中，ITR是以下病毒的ITR：鵝細小病毒(GPV)、番鴨細小病毒(MDPV)或紅病毒屬細小病毒B19(也稱為細小病毒B19、靈長類紅細小病毒1、B19病毒和紅病毒)。在某些實施例中，兩個ITR中的一個ITR是AAV的ITR。在其他實施例中，構築體中兩個ITR中的一個ITR是選自以下的AAV血清型的ITR：血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及其任何組合。在一個特定實施例中，ITR衍生自AAV血清型2，例如AAV血清型2的ITR。

在某些實施例中，ITR可以藉由截短、取代、缺失、插入和/或添加進行進一步修飾。在一個實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-600個核苷酸、約2-550個核苷酸、約2-500個核苷酸、約2-450個核苷酸、約2-400個核苷酸、約2-350個核苷酸、約2-300個核苷酸或約2-250個核苷酸。在一些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約5-600個核苷酸、約10-600個核苷酸、約 15-600個核苷酸、約20-600個核苷酸、約25-600個核苷酸、約30-600個核苷酸、約35-600個核苷酸、約40-600個核苷酸、約45-600個核苷酸、約50-600個核苷酸、約60-600個核苷酸、約70-600個核苷酸、約80-600個核苷酸、約90-600個核苷酸、約100-600個核苷酸、約150-600個核苷酸、約200-600個核苷酸、約300-600個核苷酸、約350-600個核苷酸、約400-600個核苷酸、約450-600個核苷酸、約500-600個核苷酸或約550-600個核苷酸。在一些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約5-550個核苷酸、約5至500個核苷酸、約5-450個核苷酸、約5至400個核苷酸、約5-350個核苷酸、約5至300個核苷酸或約5-250個核苷酸。在一些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約10-550個核苷酸、約15-500個核苷酸、約20-450個核苷酸、約25-400個核苷酸、約30-350個核苷酸、約35-300個核苷酸或約40-250個核苷酸。在某些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約225個核苷酸、約250個核苷酸、約275個核苷酸、約300個核苷酸、約325個核苷酸、約350個核苷酸、約375個核苷酸、約400個核苷酸、約425個核苷酸、約450個核苷酸、約475個核苷酸、約500個核苷酸、約525個核苷酸、約550個核苷酸、約575個核苷酸或約600個核苷酸。在特定實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約400個核苷酸。

在其他實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-200個核苷酸、約5-200個核苷酸、約10-200個核苷酸、約20-200個核苷酸、約30-200個核苷酸、約40-200個核苷酸、約50-200個核苷酸、約60-200個核苷酸、約70-200個核苷酸、約80-200個核苷酸、約90-200個核苷酸、約100-200個核苷酸、約125-200個核苷酸、約150-200個核苷酸或約175-200個核苷酸。在其他實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-150個核苷酸、約5-150個核苷酸、約10-150個核苷酸、約20-150個核苷酸、約30-150個核苷酸、約40-150個核苷酸、約50-150個核苷酸、約75-150個核苷酸、約100-150個核苷酸或約125-150個核苷酸。在其他實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-100個核苷酸、約5-100個核苷酸、約10-100個核苷酸、約20-100個核苷酸、約30-100個核苷酸、約40-100個核苷酸、約50-100 個核苷酸或約75-100個核苷酸。在其他實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-50個核苷酸、約10-50個核苷酸、約20-50個核苷酸、約30-50個核苷酸、約40-50個核苷酸、約3-30個核苷酸、約4-20個核苷酸或約5-10個核苷酸。在另一個實施例中，初始序列和/或反向互補體由兩個核苷酸、三個核苷酸、四個核苷酸、五個核苷酸、六個核苷酸、七個核苷酸、八個核苷酸、九個核苷酸、十個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸或20個核苷酸組成。在其他實施例中，初始序列與反向互補體之間的插入核苷酸是(例如，由以下組成)0個核苷酸、1個核苷酸、兩個核苷酸、三個核苷酸、四個核苷酸、五個核苷酸、六個核苷酸、七個核苷酸、八個核苷酸、九個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸或20個核苷酸。

在本公開文的某些態樣，核酸分子包含兩個ITR 5' ITR和3' ITR，其中5' ITR位於核酸分子的5'末端，並且3' ITR位於核酸分子的3'末端。5' ITR和3' ITR可以衍生自相同病毒或不同病毒。在某些實施例中，5' ITR衍生自AAV，並且3' ITR並非衍生自AAV病毒(例如，非AAV)。在一些實施例中，3' ITR衍生自AAV，並且5' ITR並非衍生自AAV病毒(例如，非AAV)。在其他實施例中，5' ITR並非衍生自AAV病毒(例如，非AAV)，並且3' ITR衍生自相同或不同的非AAV病毒。

在某些實施例中，ITR對是不對稱的ITR。如本文所用，術語「不對稱的ITR」是指在其全長上不是反向互補體的一對ITR。這兩個ITR之間的序列差異可能是由於核苷酸添加、缺失、截短或點突變。在一個實施例中，所述對中的一個ITR可以是野生型AAV序列或非AAV序列，而另一個是非野生型序列或合成序列。在另一個實施例中，所述對中的任何一個ITR都不是野生型序列，並且這兩個ITR在序列上彼此不同。在本文中為方便起見，位於表現盒5'(上游)的ITR可以被稱為「5' ITR」或「左ITR」，並且位於表現盒3'(下游)的ITR可以被稱為「3' ITR」或「右ITR」。

如本文所用，術語「Rep結合位點」、Rep結合元件、「RBE」和「RBS」可互換使用，並且是指Rep蛋白(例如，AAV Rep 78或AAV Rep 68)的結合位點，所述結合位點在被Rep蛋白結合時允許Rep蛋白對摻入RBS的序列執行其位點特異性核酸內切酶活性。RBS序列及其反向互補體一起形成單個RBS。任何已知的RBS序列(包括天然已知的或合成的RBS序列)均可以用於本發明的實施例中。Rep蛋白與每條股上的含氮鹼基和磷酸二酯骨架均相互作用。與含氮鹼基的相互作用提供序列特異性，而與磷酸二酯骨架的相互作用是非序列特異性或較少序列特異性的並且使蛋白質-DNA複合物穩定。

如本文所用，術語「基因盒」或「表現盒」意指能夠指導特定多核苷酸序列在適當的宿主細胞中表現的DNA序列，所述DNA序列包含與感興趣的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子。基因盒可以涵蓋位於編碼區上游(5'非編碼序列)、內部或下游(3'非編碼序列)，並且影響相關編碼區的轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯的核苷酸序列。如果旨在在真核細胞中表現編碼區，則多聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常將位於編碼序列的3'。在一些實施例中，基因盒包含編碼基因產物的多核苷酸。在一些實施例中，基因盒包含編碼miRNA的多核苷酸。在一些實施例中，基因盒包含異源多核苷酸序列。

編碼產物(例如，miRNA或基因產物(例如，多肽，諸如治療性蛋白))的多核苷酸可以包括與一個或多個編碼區可操作地締合的啟動子和/或其他表現(例如，轉錄或轉譯)控制序列。在可操作的締合中，基因產物(例如，多肽)的編碼區與一個或多個調控區以這樣的方式締合，使得將基因產物的表現置於一個或多個調控區的影響或控制之下。例如，如果啟動子功能的誘導引起編碼由編碼區所編碼的基因產物的mRNA的轉錄，並且如果啟動子與編碼區之間的連接的性質不干擾啟動子指導基因產物表現的能力或者不干擾DNA範本被轉錄的能力，則編碼區和啟動子「可操作地締合」。除了啟動子以外的其他表現控制序列(例如，增強子、操縱子、阻遏物和轉錄終止信號)也可以與編碼區可操作地締合以指導基因產物表現。

「表現控制序列」是指提供編碼序列在宿主細胞中的表現的調控核苷酸序列，諸如啟動子、增強子、終止子等。表現控制序列通常涵蓋促進與其可操作連接的編碼核酸的有效轉錄和轉譯的任何調控核苷酸序列。表現控制序列的非限制性例子包括啟動子、增強子、轉譯前導序列、內含子、多聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點或莖環結構。多種表現控制序列是熟習此項技術者已知的。這些表現控制序列包括但不限於在脊椎動物細胞中發揮作用的表現控制序列，諸如但不限於來自巨細胞病毒(立即早期啟動子，與內含子-A聯合)、猿猴病毒40(早期啟動子)和反轉錄病毒(如勞斯肉瘤病毒)的啟動子和增強子區段。其他表現控制序列包括衍生自脊椎動物基因的那些控制序列，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔ß-珠蛋白，以及能夠控制真核細胞中的基因表現的其他序列。另外的合適的表現控制序列包括組織特異性啟動子和增強子以及淋巴因子誘導型啟動子(例如，可由干擾素或白介素誘導的啟動子)。其他表現控制序列包括內含子序列、轉錄後調控元件和多聚腺苷酸化信號。在本公開文的其他地方討論了另外的示例性表現控制序列。

類似地，多種轉譯控制元件是一般熟習此項技術者已知的。這些轉譯控制元件包括但不限於核糖體結合位點、轉譯起始和終止密碼子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特別是內部核糖體進入位點，或IRES)。

如本文所用的術語「表現」是指多核苷酸產生基因產物(例如，RNA或多肽)的過程。它包括但不限於將多核苷酸轉錄成信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)或任何其他RNA產物，以及將mRNA轉譯為多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可以是核酸(例如，藉由基因轉錄產生的信使RNA)或從轉錄物轉譯的多肽。本文所述的基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如，多聚腺苷酸化或剪接)的核酸，或者具有轉譯後修飾(例如，甲基化、糖基化、脂質添加、與其他蛋白質亞基締合或蛋白質水解切割)的多肽。如本文所用，術語「產量」是指藉由基因表現產生的多肽的量。

「載體」是指用於將核酸選殖和/或轉移到宿主細胞中的任何載具。載體可以是複製子，其上可以附接另一個核酸區段，以便實現所附接的區段的複製。術語「載體」包括用於在體外、離體或在體內將核酸引入細胞中的載具。很多載體是業內已知並使用的，包括例如質體、經修飾的真核病毒或經修飾的細菌病毒。藉由將適當的多核苷酸片段連接到具有互補粘性末端的選擇載體中，可以實現將多核苷酸插入合適的載體中。

載體可以被工程化為編碼可選標記或報告子，其提供對已經摻入載體的細胞的選擇或鑑定。可選標記或報告子的表現允許鑑定和/或選擇摻入並表現含於載體上的其他編碼區的宿主細胞。業內已知並使用的可選標記基因的例子包括：提供針對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺膦除草劑、磺醯胺等的抗性的基因；和用作表型標記的基因，即花色苷調控基因、異戊烷基轉移酶基因等。業內已知並使用的報告子的例子包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。也可以將可選標記視為報告子(reporter)。

如本文所用，術語「封閉端DNA載體」、「ceDNA載體」和「ceDNA」可互換使用，並且是指具有至少一個共價封閉端的非病毒無衣殼的DNA載體(即，分子內雙股體)。在一些實施例中，ceDNA包含兩個共價封閉端。在某些實施例中，ceDNA由進一步摻入至少一個ITR的範本DNA或表現盒產生。在某些實施例中，ceDNA作為DNA的分子間雙股體多核苷酸摻入本文所述的桿狀病毒表現載體中。ceDNA載體可以用許多方式與基於質體的表現載體區分開來。例如，ceDNA載體可以具有以下一個或多個特徵：(1)缺乏原始(即未插入)細菌DNA，(2)缺乏原核覆制起點，(3)自含(即它們不需要)除ITR以外的任何序列，(4)存在形成髮夾的ITR序列，(5)它們是真核來源的(即，它們在真核細胞中產生)，以及(6)不存在細菌型DNA甲基化。區分ceDNA載體與質體表現載體的另一個重要特徵是ceDNA載體是具有封閉端的單股線性DNA，而質體始終是雙股DNA。在某些實施例中，如藉由限制性內切酶消化測定確定的，ceDNA載體具有線性且連續的結構而不是非連續結構。質體的互補股可以在變性後分離以產生兩個核酸分子，而相比之下，ceDNA載體雖然具有互補股，但是單個DNA分子，因此即使變性，仍保持單個分子。在某些實施例中，由於存在一個或多個共價封閉端，ceDNA載體對核酸外切酶(例如核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化(例如在37℃下持續一個多小時)具有抗性。

如本文所用的術語「宿主細胞」是指例如可以或已經用作ssDNA或載體的接受者的微生物、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。所述術語包括已經轉導的原始細胞的後代。因此，如本文所用的「宿主細胞」通常是指已經用外源DNA序列轉導的細胞。應理解，由於天然、偶然或刻意突變，單個親代細胞的後代的形態或基因組或總DNA互補體可能不一定與原始親代完全相同。在一些實施例中，宿主細胞可以是體外宿主細胞。

術語「可選標記」是指能夠基於標記基因的效應(即，對抗生素的抗性、對除草劑的抗性、比色標記、酶、螢光標記等)加以選擇的鑑定因子(通常是抗生素或化學抗性基因)，其中所述效應用於跟蹤感興趣的核酸的遺傳和/或鑑定已經遺傳感興趣的核酸的細胞或生物體。業內已知並使用的可選標記基因的例子包括：提供針對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺膦除草劑、磺醯胺等的抗性的基因；和用作表型標記的基因，即花色苷調控基因、異戊烷基轉移酶基因等。

術語「報告子基因」是指編碼能夠基於報告子基因的效應加以鑑定的鑑定因子的核酸，其中所述效應用於追蹤感興趣的核酸的遺傳、鑑定已經遺傳感興趣的核酸的細胞或生物體和/或測量基因表現誘導或轉錄。業內已知並使用的報告子基因的例子包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。也可以將可選標記基因視為報告子基因。

「啟動子」與「啟動子序列」可互換使用，並且是指能夠控制編碼序列或功能RNA的表現的DNA序列。一般而言，編碼序列位於啟動子序列的3'。啟動子可以整體衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界中發現的不同啟動子的不同元件構成，或者甚至包含合成DNA區段。熟習此項技術者應理解，不同啟動子可以指導基因在不同組織或細胞類型中、或在不同發育階段、或回應於不同環境或生理條件而表現。使基因在大多數細胞類型中在大多數時間表現的啟動子一般被稱為「組成型啟動子」。使基因在特定細胞類型中表現的啟動子一般被稱為「細胞特異性啟動子」或「組織特異性啟動子」。使基因在發育或細胞分化的特定階段表現的啟動子一般被稱為「發育特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」。在用誘導啟動子的試劑、生物分子、化學品、配體、光等暴露或處理細胞後被誘導並且使基因表現的啟動子一般被稱為「誘導型啟動子」或「調控型啟動子」。應進一步認識到，由於在大多數情況下，尚未完全界定調控序列的確切邊界，所以不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。

術語「表現載體」是指設計為使得所插入核酸序列在插入宿主細胞中之後能夠表現的載具。將所插入核酸序列以如以上所述的與調控區可操作地締合地放置。

藉由業內熟知的方法將載體引入宿主細胞中，所述方法是例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂轉染(溶酶體融合)、使用基因槍或DNA載體轉運蛋白。如本文所用，「培養(culture)」、「培養(to culture)」和「培養(culturing)」意指在允許細胞生長或分裂的體外條件下培育細胞或使細胞維持存活狀態。如本文所用，「經培養的細胞」意指在體外繁殖的細胞。

如本文所用，術語「多肽」旨在涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，並且是指由藉由醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)構成的分子。術語「多肽」是指兩個或更多個胺基酸的任何一條或多條鏈，並且不涉及產物的具體長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指代兩個或更多個胺基酸的一條或多條鏈的任何其他術語包括在「多肽」的定義內，並且術語「多肽」可以代替這些術語中的任一個術語或與其可互換使用。術語「多肽」還旨在指代多肽的表現後修飾的產物，所述修飾包括但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知的保護/阻斷基團衍生、蛋白質水解切割或藉由非天然存在的胺基酸修飾。多肽可以衍生自天然生物來源或藉由重組技術產生，但是不一定是從指定的核酸序列轉譯而來。它可以以任何方式(包括藉由化學合成)產生。

如本文所用的術語「連接」是指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別與第二胺基酸序列或核苷酸序列共價或非共價接合。第一胺基酸或核苷酸序列可以與第二胺基酸或核苷酸序列直接接合或並置，或者可替代地，插入序列可以將第一序列共價接合至第二序列。術語「連接」不僅意指第一胺基酸序列與第二胺基酸序列在C末端或N末端融合，還包括將完整的第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或分別地，第一胺基酸序列)中的任兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列可以藉由肽鍵或連接子連接至第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可以藉由磷酸二酯鍵或連接子連接至第二核苷酸序列。連接子可以是肽或多肽(對於多肽鏈)或者核苷酸或核苷酸鏈(對於核苷酸鏈)或者任何化學部分(對於多肽和多核苷酸鏈二者)。術語「連接」還藉由連字號(-)指示。

如本文所用，術語「治療性蛋白」是指業內已知的可以投予給受試者的任何多肽。在一些實施例中，治療性蛋白包括選自以下的蛋白質：凝血因子、生長因子、抗體、抗體的功能片段或其組合。

如本文所用，術語「異源的」或「外源的」是指此類分子通常在給定背景下(例如，在細胞中或在多肽中)未被發現。例如，可以將外源或異源分子引入細胞中並且僅在例如藉由轉染或其他形式的基因工程化操縱細胞之後存在，或者異源胺基酸序列可以存在於其天然不存在的蛋白質中。

如本文所用，術語「基因編輯」是指多核苷酸或核酸已經被編輯以修飾所述多核苷酸或核酸的表現。多核苷酸或核酸可以編碼蛋白質。基因編輯可以靶向基因組的特定基因或基因座或異源核酸(諸如桿狀病毒表現載體)。

術語「桿狀病毒質體(bacmid)」是指可以在大腸桿菌(E.coli)和昆蟲兩種細胞中繁殖的穿梭載體。經基因組編輯的桿狀病毒質體是具有失活的或減弱的衣殼基因的桿狀病毒質體。

經基因組編輯的桿狀病毒質體

在某些態樣，本公開文提供了變異體重組桿狀病毒質體，所述桿狀病毒質體由於桿狀病毒(BV)複製所必需的桿狀病毒基因的表現減弱或失活而不能複製，或表現出減少的複製。例如，本公開文本的重組桿狀病毒質體包含一部分WT桿狀病毒基因組，但是缺乏至少一種桿狀病毒複製所必需的桿狀病毒基因。BV複製所必需的基因可以不存在於基因組中，或者其表現可以被阻止或減弱。在某些實施例中，使基因突變(例如，藉由缺失)，或截短，或以其他方式失活。

在某些實施例中，本公開文的重組桿狀病毒質體包含DNA骨架，其中藉由基因組編輯使桿狀病毒複製所需的至少一種桿狀病毒基因失活或減弱。在其他實施例中，桿狀病毒基因藉由桿狀病毒質體上或待被桿狀病毒感染的宿主細胞(例如，昆蟲細胞)中提供的表現控制系統減少。

任何衍生自通常用於重組表現蛋白質和生物製藥產品的桿狀病毒的基因組均可以進行基因組編輯。例如，桿狀病毒基因組可以衍生自例如AcMNPV、BmNPV、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)(HearNPV)或甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)MNPV，較佳地衍生自AcMNPV或BmNPV。特別地，桿狀病毒基因組可以衍生自AcMNPV殖株C6(基因組序列：Genbank登錄號NC_001623.1)。在某些實施例中，可以藉由編輯WT桿狀病毒基因組中的桿狀病毒複製所需的必需基因，從包含WT桿狀病毒基因組(AcMNPV(NC_001623)的桿狀病毒質體產生經基因組編輯的骨架。

在某些實施例中，桿狀病毒基因是桿狀病毒病毒體組裝所必需的基因。在某些實施例中，基因的缺乏或失活對由BV感染的細胞產生的BV病毒體產生負面影響。在某些實施例中，本公開文的桿狀病毒質體包含編碼以下蛋白質中的任一種的失活的或減弱的桿狀病毒基因：Ac100(P6.9 DNA結合蛋白)；AC89(VP39衣殼)；Ac80(Gp41被膜)、Ac142、Ac144、Ac66、Ac92(P33)、p6.9、Ac54(VP1054)、Ac77(VLF-1)、Ac104(VP80)和Ac9(PP78/83)。在某些示例性實施例中，待靶向的桿狀病毒基因是VP80。

在某些實施例中，可以藉由引入導致完全不存在功能必需基因產物的所述基因的修飾使桿狀病毒基因失活。因此，所述突變可能導致在從必需基因轉錄的mRNA的開放閱讀框中引入一個或幾個終止密碼子，或者可能對應於必需基因的缺失(完全的或部分的)。可替代地，可以藉由在全部或部分野生型基因的序列中的核苷酸取代、插入或缺失的方式使基因突變。突變可以對應於基因的完全缺失，或僅對應於所述基因的一部分。例如，可以缺失基因的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在某些實施例中，突變型桿狀病毒基因組可以藉由定點誘變產生。

在某些實施例中，經編輯的基因可以藉由「敲入」破壞WT桿狀病毒基因的閱讀框的異源序列來產生。例如，側接兩個翻轉酶識別標靶(FRT)的選擇標記表現盒可以PCR擴增，可以重組到衣殼基因中以經由λ red系統破壞衣殼。在選擇桿狀病毒質體DNA並且確認缺失後，可以用FLP-FRT重組技術去除選擇標記表現盒，僅在桿狀病毒質體中留下一個FRT位點。

在一些實施例中，經編輯的衣殼序列是用基因調控系統產生的。在本文中，術語「基因調控系統」是指能夠修飾靶DNA序列從而調控所編碼的基因產物的表現或功能的蛋白質、核酸或其組合。適用於在本發明的方法中使用的許多基因調控系統是業內已知的，包括但不限於鋅指核酸酶系統、TALEN系統和CRISPR/Cas系統。如本文所用，「調控」當關於基因調控系統對靶基因的影響使用時涵蓋在內源靶基因序列的任何變化和/或在由內源靶基因編碼的蛋白質的表現或功能的任何變化。

在一些實施例中，基因調控系統可以介導桿狀病毒基因的序列的變化，例如藉由將一個或多個突變引入基因中，諸如藉由插入和/或缺失一種或多種核酸。可以介導衣殼基因改變的示例性機制包括但不限於非同源末端連接(NHEJ)(例如，經典的或選擇性的)、微同源介導的末端連接(MMEJ)、同源定向修復(例如，內源供體範本介導的)、SDSA(依賴合成的股黏合(annealing))、單股黏合或單股侵入。

在一些實施例中，基因調控系統可以介導由桿狀病毒衣殼基因編碼的蛋白質的表現的變化。在此類實施例中，基因調控系統可以藉由修飾DNA序列或藉由作用於由DNA序列編碼的mRNA產物來調控所編碼的衣殼基因的表現。在一些實施例中，基因調控系統可以導致經修飾的桿狀病毒基因的表現。在一些實施例中，相對於未經修飾的桿狀病毒基因的表現水準，經修飾的桿狀病毒基因的表現水準可以降低。

在一些實施例中，基因調控系統是基於核酸的基因調控系統。在本文中，基於核酸的基因調控系統是包含一種或多種核酸分子的系統，所述系統能夠在不需要外源蛋白的情況下調控桿狀病毒基因的表現。

在一些實施例中，基因調控系統是基於蛋白質的基因調控系統。在本文中，基於蛋白質的基因調控系統是包含一種或多種蛋白質的系統，所述系統在不需要核酸指導分子的情況下能夠以序列特異性方式調控桿狀病毒基因的表現。

在一些實施例中，基於蛋白質的基因調控系統包含含有一個或多個鋅指結合結構域和酶促結構域的蛋白質。鋅指結合結構域可以被工程化為與選擇的序列結合。參見例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416。

在一些實施例中，基於蛋白質的基因調控系統包含含有轉錄啟動因子樣效應子(effector)核酸酶(TALEN)結構域和酶促結構域的蛋白質。此類實施例在本文中被稱為「TALEN」。基於TALEN的系統包含含有TAL效應子DNA結合結構域和酶促結構域的蛋白質。它們是藉由將TAL效應子DNA結合結構域與DNA切割結構域(一種切割DNA股的核酸酶)融合而製備的。以上所述的FokI限制性內切酶是適用於在基於TALEN的基因調控系統中使用的示例性酶促結構域。

在一些實施例中，CRISPR(規律間隔成簇短回文重複序列)/Cas(CRISPR相關)核酸酶系統可以用於編輯衣殼基因。在一些實施例中，採用CRISPR相關核酸內切酶(「Cas」核酸內切酶)和核酸指導分子(例如，指導RNA或gRNA)。Cas多肽是指可以與核酸指導分子相互作用並且與核酸指導分子協同歸巢或定位於靶DNA的多肽，並且包括天然存在的Cas蛋白和與天然存在的Cas序列區別在於一個或多個胺基酸殘基的經工程化的、經改變的或以其他方式經修飾的Cas蛋白。在一些實施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白。Cas9是這樣的多結構域酶，它使用HNH核酸酶結構域來切割DNA的靶股，並且使用RuvC樣結構域來切割非靶股。在一些實施例中，Cas9的突變異體可以藉由選擇性結構域失活產生，使得WT Cas9能夠轉化為不能切割DNA的酶促失活突變異體(例如，dCas9)或能夠藉由切割靶股或非靶股中的一條或另一條產生單股DNA斷裂的切口酶突變異體。靶修飾位點的精確位置由(i)gRNA與靶DNA序列之間的鹼基配對互補性；和(ii)短基序(稱為原型間隔子鄰近基序(PAM))在靶DNA序列中的位置二者決定。PAM序列是Cas與靶DNA序列結合所需的。業內已知並且適用於與特定Cas核酸內切酶(例如，Cas9核酸內切酶)一起使用的多種PAM序列是業內已知(參見例如，Nat Methods.2013年11月；10(11)：1116-1121和Sci Rep.2014；4：5405)。在一些實施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白或Cas9直向同源物，並且選自SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9和NmeCas9。在一些實施例中，核酸內切酶選自C2C1、C2C3、 Cpf1(也稱為Cas12a)、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也稱為Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4。另外的Cas9直向同源物描述於國際PCT公開號WO 2015/071474中。

根據本公開文的示例性經基因組編輯的桿狀病毒DNA骨架包含由於VP80基因座中的插入和/或缺失而失活的VP80基因(參見圖2-4)。在某些實施例中，由於VP80基因座中的插入和/或缺失而失活的VP80基因是由靶向VP80基因座的一種或多種gRNA介導的。在某些實施例中，由於VP80基因座中的插入和/或缺失而失活的VP80基因是由與序列CACGTTGACCAGCATGGTGT(SEQ ID NO：9)包含至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%同一性的gRNA介導的。在某些實施例中，由於VP80基因座中的插入和/或缺失而失活的VP80基因是由與序列GACGTGTCCAAGAAATTGAT(SEQ ID NO：10)包含至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%同一性的gRNA介導的。

在某些示例性實施例中，根據本公開文的經基因組編輯的桿狀病毒DNA骨架包含由於VP80基因座中的插入和/或缺失而失活的VP80基因，所述基因座包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的序列。在某些示例性實施例中，根據本公開文的經基因組編輯的桿狀病毒DNA骨架包含由於基因組序列中的插入和/或缺失而失活的VP80基因，所述基因組序列包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的序列。在某些示例性實施例中，根據本公開文本的經基因組編輯的桿狀病毒DNA骨架包含由於基因組序列中的插入和/或缺失而失活的VP80基因，所述基因組序列由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的序列組成。

在某些實施例中，本公開文的重組桿狀病毒質體進一步包含使得能夠將表現盒(例如，ceDNA載體範本)整合到骨架中的至少一個整合位點(例如，微型att Tn7位點)。在某些實施例中，重組桿狀病毒質體是如題為「桿狀病毒表現系統(Baculovirus Expression System)」的美國專利申請號63/069,073中所述的「BIVVBac」，將其藉由引用併入本文。在某些實施例中，該重組桿狀病毒質體包含至少兩個整合位點並且允許減少需要產生的桿狀病毒表現載體的總數量。在某些實施例中，桿狀病毒質體進一步包含用於藉由Cre-Lox介導的重組整合另外的基因的10xP位點。

在某些實施例中，重組桿狀病毒質體包含Rep基因(例如，B19 Rep基因)。在某些實施例中，表現Rep基因以促進側接對稱或不對稱的AAV或非AAV反向末端重複(ITR)的異源核酸區段(例如，ceDNA載體)的複製。

重組桿狀病毒質體可以進一步包含其在細菌(例如，大腸桿菌)和昆蟲兩種細胞中繁殖的能力所需的其他元件。在某些實施例中，重組桿狀病毒質體包含細菌複製起點或細菌複製子。各種細菌複製子是熟習此項技術者已知的，並且包括例如F質體衍生來源的複製子。在某些實施例中，合適的細菌複製子是微型F複製子，它是由複製和調控所需的DNA區域oriS和incC組成的F質體的衍生物。在某些實施例中，細菌複製子是低拷貝數複製子。在某些實施例中，低拷貝數複製子是微型F複製子。

本公開文的重組桿狀病毒質體的其他元件包括一個或多個可選標記序列和其他報告子基因。業內已知並使用的可選標記基因的例子包括：提供針對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺膦除草劑、磺醯胺等的抗性的基因；和用作表型標記的基因，即花色苷調控基因、異戊烷基轉移酶基因等。在某些實施例中，重組桿狀病毒質體包含含有抗生素抗性基因的可選標記序列。在某些實施例中，抗生素抗性基因是康黴素抗性基因並且賦予對康黴素的抗性。業內已知並使用的報告子的例子包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。在一些情況下，也可以將可選標記視為報告子。在某些實施例中，重組桿狀病毒質體包含編碼螢光蛋白的報告子基因。在某些實施例中，螢光蛋白是紅色螢光蛋白。

熟習此項技術者應認識到本文所述的重組桿狀病毒質體的各種元件彼此可操作地連接。桿狀病毒質體中各種編碼序列中的每一個均可以與包含例如啟動子序列的調控區可操作地連接。業內已知的任何啟動子序列均可以是合適的。在某些實施例中，啟動子是桿狀病毒誘導型啟動子。

經基因組編輯的重組桿狀病毒表現載體(rBEV)

在某些實施例中，本公開文提供了經基因組編輯的重組桿狀病毒表現載體(rBEV)，在所述表現載體中將外來序列(例如，異源DNA序列)整合到上述經基因組編輯的桿狀病毒質體的一個或多個整合位點中。在某些實施例中，經由Cre-Lox重組將外來序列引入桿狀病毒質體的LoxP位點中。在其他實施例中，經由Tn7介導的轉位將外來序列插入桿狀病毒質體中。可以將任何外來序列(減弱的或失活的桿狀病毒基因的功能對應物除外)引入經基因組編輯的桿狀病毒質體中，以便產生本公開文本的經基因組編輯的rBEV。在某些實施例中，重組桿狀病毒表現載體包含一種或多種以下所述的ceDNA表現盒。

在某些實施例中，包含外來序列的重組桿狀病毒表現載體包含細菌複製子、第一可選標記序列、插入第一報告子基因中的外來序列(例如，異源序列)，其中所插入外來序列破壞第一報告子基因的閱讀框，第二報告子基因與桿狀病毒誘導型啟動子可操作地連接。

在某些實施例中，rBEV包含一種AAV或非AAV Rep基因(例如，B19 Rep)。在某些實施例中，rBEV包含：微型F複製子；第一抗生素抗性基因；編碼插入LacZα或其功能部分中的Rep(例如，B19 Rep)的序列，其中所插入B19 Rep破壞LacZα或其功能部分的閱讀框；編碼螢光蛋白的與桿狀病毒誘導型啟動子可操作地連接的基因。

在某些實施例中，rBEV包含：微型F複製子；第一抗生素抗性基因；編碼插入LacZα或其功能部分中的GPV Rep的序列，其中所插入GPV Rep破壞LacZα或其功能部分的閱讀框；和編碼螢光蛋白的與桿狀病毒誘導型啟動子可操作地連接的基因。在某些實施例中，重組桿狀病毒質體包含：微型F複製子；第一抗生素抗性基因；編碼插入LacZα或其功能部分中的AAV2 Rep的序列，其中所插入AAV2 Rep破壞LacZα或其功能部分的閱讀框；和編碼螢光蛋白的與桿狀病毒誘導型啟動子可操作地連接的基因。

在某些示例性實施例中，出於產生基因療法載體的目的，rBEV包含側接對稱或不對稱的AAV或非AAV反向末端重複(ITR)的轉殖基因。在某些實施例中，重組桿狀病毒質體包含：微型F複製子；抗生素抗性基因；LacZα或其功能部分；側接對稱或不對稱的AAV或非AAV ITR的轉殖基因。

在某些實施例中，出於產生基因療法載體的目的，rBEV包含：編碼插入LacZα或其功能部分中的B19 Rep的序列，其中所插入B19 Rep破壞LacZα或其功能部分的閱讀框；以及包含異源序列的多重選殖位點，其中異源序列從5'至3'包含：衍生自細小病毒B19的野生型或截短的5'反向末端重複；編碼蛋白質的序列；一個或多個與編碼蛋白質的序列可操作地連接的表現控制序列；和衍生自細小病毒B19的野生型或截短的3'反向末端重複。

在其他實施例中，出於產生基因療法載體的目的，rBEV包含：編碼插入LacZα或其功能部分中的GPV Rep的序列，其中所插入GPV Rep破壞LacZα或其功能部分的閱讀框；以及包含異源序列的多重選殖位點，其中異源序列從5'至3'包含：衍生自GPV的野生型或截短的5'反向末端重複；編碼蛋白質的序列；一個或多個與編碼蛋白質的序列可操作地連接的表現控制序列；和衍生自GPV的野生型或截短的3'反向末端重複。

在其他實施例中，出於產生基因療法載體的目的，rBEV包含：編碼插入LacZα或其功能部分中的AAV2 Rep的序列，其中所插入AAV2 Rep破壞LacZα或其功能部分的閱讀框；以及包含異源序列的多重選殖位點，其中異源序列從5'至3'包含：衍生自AAV2的野生型或截短的5'反向末端重複；編碼蛋白質的序列；一個或多個與編碼蛋白質的序列可操作地連接的表現控制序列；和衍生自AAV2的野生型或截短的3'反向末端重複。

以反式提供功能基因

為了恢復或「拯救」以上所述的經修飾的桿狀病毒質體或rBEV的複製，本公開文提供了桿狀病毒表現系統，所述表現系統包含以上所述的重組桿狀病毒質體或桿狀病毒表現載體和功能蛋白(例如，功能衣殼蛋白)，所述功能蛋白補充重組桿狀病毒質體或rBEV表現載體的失活的或減弱的基因(例如，失活的衣殼基因)。

因此，在某些實施例中，功能基因(例如，功能衣殼基因)以反式提供給重組桿狀病毒質體或桿狀病毒表現載體。在某些實施例中，功能基因可以由宿主細胞表現。因此，在某些實施例中，本公開文提供了能夠藉由以反式表現基因的互補拷貝來拯救缺陷桿狀病毒基因的宿主昆蟲細胞。在某些實施例中，本公開文提供了昆蟲細胞，所述昆蟲細胞表現在桿狀病毒中有缺陷的桿狀病毒病毒體正確組裝所必需的至少一種基因的互補拷貝。例如，在某些實施例中，本公開文提供了組成性地產生功能基因產物的Sf9衍生的細胞株，使得可以建立桿狀病毒病毒體的正確組裝。將這種重組細胞株用於產生桿狀病毒種子儲備，同時可以用所產生的桿狀病毒感染傳統的昆蟲細胞株(像Sf9、Sf21或High-five細胞株)以用於核酸分子(例如，ceDNA載體)的異源表現。因此，本發明的桿狀病毒表現系統還涉及被修飾以便表現桿狀病毒正確組裝所必需的桿狀病毒基因的功能對應物的昆蟲細胞，其中功能基因的對應物已經在桿狀病毒質體或桿狀病毒表現載體中失活。

在一個特定實施例中，將用於產生桿狀病毒的昆蟲細胞藉由用編碼桿狀病毒病毒體正確組裝所必需的基因的功能對應物的表現盒轉染進行修飾。在一個實施例中，將所述表現盒整合到所述細胞的基因組中。還可以使用用至少一種包含表現盒的質體暫態轉染的昆蟲細胞。這種表現盒可以是包含放置在於選定的昆蟲細胞中具有功能的啟動子的控制之下的桿狀病毒病毒體的正確組裝所必需的基因的ORF的質體，並且不含有除待補充的桿狀病毒病毒體正確組裝所必需的基因以外的桿狀病毒基因組序列、和任選地允許所述基因表現的啟動子序列(特別地，表現盒不是桿狀病毒質體或任何其他桿狀病毒全基因組)。示例性表現控制序列可以選自啟動子、增強子、絕緣子等。在一個實施例中，互補基因衍生自桿狀病毒的基因組，在所述桿狀病毒基因組中已經使桿狀病毒病毒體正確組裝所必需的基因有缺陷。在另一個實施例中，互補基因源自不同桿狀病毒物種的基因組。

在又另一個實施例中，將桿狀病毒病毒體正確組裝所必需的基因的功能對應物放置在誘導型啟動子的控制之下，從而允許在受控的條件下表現或阻抑所述基因。在某些實施例中，誘導型啟動子是桿狀病毒誘導型啟動子。在某些實施例中，誘導型啟動子是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)39K啟動子。在某些實施例中，昆蟲細胞包含編碼桿狀病毒病毒體組裝所必需的基因的功能對應物的表現盒，在重組桿狀病毒質體或rBEV中已經使所述基因有缺陷。

ceDNA表現盒

在某些實施例中，本文所述的桿狀病毒表現載體系統可以用於產生可用於基因療法的質體樣、無衣殼的核酸分子。因此，在某些實施例中，本公開文的桿狀病毒表現載體包括異源核酸分子的範本DNA，所述異源核酸分子是具有一個或多個共價封閉端的非病毒、無衣殼的DNA載體(在本文中稱為「封閉端DNA載體」或「ceDNA載體」，也稱為「封閉端線性雙股體DNA載體」或「CELiD DNA載體」)。ceDNA載體可以進一步包含用於有需要的受試者的遞送的轉殖基因。

在某些實施例中，ceDNA載體可從載體多核苷酸獲得，所述載體多核苷酸編碼可操作地定位於兩個反向末端重複(ITR)之間的異源核酸。在某些實施例中，ceDNA載體由具有共價封閉端的互補DNA的連續股(線性、連續且非衣殼化的結構)形成，所述連續股包含5'反向末端重複(ITR)序列和3' ITR序列。在某些實施例中，ITR相對於彼此可以是對稱的。在其他實施例中，ITR相對於彼此可以是不同的，或不對稱的。在某些實施例中，TTR中的至少一個包含末端解析位點和複製蛋白結合位點(replication protein binding site，PRS)(有時稱為複製蛋白結合位點(replicative protein binding site))(例如Rep結合位點)，並且ITR的一個相對於另一個ITR包含缺失、插入或取代。在某些實施例中，ITR中的至少一個是AAV ITR，例如野生型AAV ITR或經修飾的AAV ITR。在某些實施例中，ITR中的至少一個是非AAV ITR，例如野生型非AAV ITR或經修飾的非AAV ITR。在其他實施例中，ITR中的至少一個相對於另一個ITR是經修飾的ITR。在一個實施例中，ITR中的至少一個是非功能ITR。在一些實施例中，如與野生型ITR序列相比，ITR中的一個藉由缺失、插入和/或取代進行修飾；並且ITR中的至少一個包含功能末端解析位點(trs)和Rep結合位點。

在某些實施例中，本公開文涉及ceDNA載體範本，所述載體範本包含第一ITR、第二ITR和含有異源多核苷酸序列(例如，轉殖基因)的基因表現盒。在一些實施例中，第一ITR和第二ITR側接基因表現盒。在一些實施例中，表現盒包含順式調控元件、啟動子和至少一種轉殖基因。在一些實施例中，核酸分子不包含編碼衣殼蛋白、複製蛋白和/或組裝蛋白的基因。在一些實施例中，基因盒編碼治療性蛋白。在一些實施例中，治療性蛋白包括凝血因子。在一些實施例中，基因盒編碼miRNA。在某些實施例中，基因盒定位於第一ITR與第二ITR之間。在一些實施例中，核酸分子進一步包含一個或多個非編碼區。在某些實施例中，所述一個或多個非編碼區包含啟動子序列、內含子、轉錄後調控元件、3'UTR多聚(A)序列或其任何組合。在一個實施例中，表現盒是單股核酸。在另一個實施例中，基因盒是雙股核酸。

在某些實施例中，編碼ceDNA載體的範本以5'至3'方向包含：第一反向末端重複(ITR)、感興趣的核苷酸序列(例如，如本文所述的表現盒或轉殖基因)和第二ITR，其中第一ITR和第二ITR相對於彼此是不對稱的-也就是說，它們彼此不同。作為示例性實施例，第一ITR可以是野生型ITR，並且第二ITR可以是經突變的或經修飾的ITR。在一些實施例中，第一ITR可以是經突變的或經修飾的ITR，並且第二ITR可以是野生型ITR。在另一個實施例中，第一ITR和第二ITR均被修飾但是是不同的序列，或者具有不同修飾，或不是相同的經修飾的ITR。

在一些實施例中，本文所述的ceDNA載體包含具有轉殖基因的表現盒，所述轉殖基因可以是例如調控序列、編碼核酸的序列(例如，諸如miR或反義序列)或編碼多肽的序列(例如，諸如轉殖基因)。在一個實施例中，轉殖基因編碼治療性蛋白，其中治療性蛋白包括因子VIII(FVIII)多肽。在一個實施例中，轉殖基因可以與一個或多個允許或控制轉殖基因表現的調控序列可操作地連接。在一個實施例中，多核苷酸包含第一ITR序列和第二ITR序列，其中感興趣的核苷酸序列側接第一ITR序列和第二ITR序列，並且第一ITR序列和第二ITR序列相對於彼此是不對稱的。

在於這些態樣中的每一個的一個實施例中，表現盒位於兩個ITR之間，所述表現盒以以下順序包含以下中的一種或多種：與轉殖基因可操作地連接的啟動子、轉錄後調控元件以及多聚腺苷酸化和終止信號。在一個實施例中，啟動子是調控型的、誘導型的或阻抑型的。轉錄後調控元件是調節轉殖基因表現的序列，作為非限制性例子，任何產生增強轉殖基因表現的三級結構的序列。

ceDNA表現盒可以包含多於4000個核苷酸、5000個核苷酸、10,000個核苷酸或20,000個核苷酸、或30,000個核苷酸、或40,000個核苷酸或50,000個核苷酸、或約4000-10,000個核苷酸或10,000-50,000個核苷酸之間的任何範圍、或多於50,000個核苷酸。在一些實施例中，表現盒可以包含長度在500至50,000個核苷酸的範圍內的轉殖基因或核酸。在一些實施例中，表現盒可以包含長度在500至75,000個核苷酸的範圍內的轉殖基因或核酸。在一些實施例中，表現盒可以包含長度在500至10,000個核苷酸的範圍內的轉殖基因或核酸。在一些實施例中，表現盒可以包含長度在1000至10,000個核苷酸的範圍內的轉殖基因或核酸。在一些實施例中，表現盒可以包含長度在500至5,000個核苷酸的範圍內的轉殖基因或核酸。

在一些實施例中，核酸分子包含編碼治療性蛋白的表現盒。在一些實施例中，治療性蛋白包括凝血因子。在一些實施例中，表現盒編碼miRNA。在一些實施例中，表現盒包含至少一個非編碼區。在某些實施例中，非編碼區包含啟動子序列、內含子、轉錄後調控元件、3'UTR多聚(A)序列或其任何組合。

在一些實施例中，基因盒包含編碼經密碼子優化的FVIII(由mTTR啟動子驅動)的核苷酸序列。在一些實施例中，mTTR啟動子包含SEQ ID NO：17的核酸序列。在一些實施例中，基因盒進一步包含A1MB2增強子元件。在一些實施例中，A1MB2增強子元件包含SEQ ID NO：16的核酸序列。在一些實施例中，基因盒進一步包含嵌合或合成內含子。在一些實施例中，嵌合內含子由雞β-肌動蛋白/兔β-珠蛋白內含子組成，並且已經被修飾以消除五個現有的ATG序列以減少錯誤轉譯開始。在一些實施例中，內含子序列定位於編碼FVIII多肽的核酸序列的5'。在一些實施例中，嵌合內含子定位於啟動子序列(諸如mTTR啟動子)的5'。在一些實施例中，嵌合內含子包含SEQ ID NO：18的核酸序列。在一些實施例中，基因盒進一步包含土撥鼠轉錄後調控元件(WPRE)。在一些實施例中，WPRE包含SEQ ID NO：19的核酸序列。在一些實施例中，基因盒進一步包含牛生長激素多聚腺苷酸化(bGHpA)信號。在一些實施例中，bGHpA信號包含SEQ ID NO：20的核酸序列。在一些實施例中，基因盒包含與SEQ ID NO：14具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列。在一些實施例中，基因盒包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列。

反向末端重複

如本文所揭示的，ceDNA載體含有定位於兩個反向末端重複(ITR)序列之間的異源基因。在某些實施例中，5' ITR和3' ITR是腺相關病毒(AAV)ITR或非AAV ITR。在某些實施例中，非AAV ITR是從病毒科細小病毒科的成員獲得的ITR。合適的ITR序列包括熟習此項技術者已知的AAV血清型的AAV ITR。用於在ceDNA載體中使用的示例性AAV和非AAV ITR序列揭示於WO 2019/051255、WO 2019032898A1、WO 2020033863A1和WO 2017152149A1以及美國專利申請號63/069,114中，將其揭示內容藉由引用以其整體併入本文。

本公開文的ceDNA載體可以採用來自任何已知細小病毒(例如依賴病毒，諸如AAV(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh1O、AAV-DJ和AAV-DJ8基因組，例如，NCBI：NC 002077；NC 001401；NC 001729；NC 001829；NC 006152；NC 006260；NC 006261)的ITR序列、嵌合ITR或來自任何合成AAV的ITR。在一些實施例中，AAV(例如，禽(AAAV)、牛(BAAV)、犬、馬和綿羊腺相關病毒)可以感染溫血動物。在一些實施例中，ITR來自B19細小病毒(GenBank登錄號：NC 000883)；來自小鼠的微小病毒(MVM)(GenBank登錄號NC 001510)；鵝細小病毒(GenBank登錄號NC 001701)；蛇細小病毒1(GenBank登錄號NC 006148)。

在一些實施例中，ITR序列可以來自細小病毒科的病毒，所述細小病毒科包括兩個亞科：感染脊椎動物的細小病毒亞科和感染昆蟲的濃核病毒亞科。細小病毒亞科(稱為細小病毒)包括依賴病毒屬，所述依賴病毒屬的成員在大多數條件下需要與輔助病毒(諸如腺病毒或皰疹病毒)共感染以用於生產性感染。依賴病毒屬包括通常感染人(例如，血清型2、3A、3B、5和6)或靈長類動物(例如，血清型1和4)的腺相關病毒(AAV)，以及感染其他溫血動物的相關病毒(例如，牛、犬、馬和綿羊腺相關病毒)。細小病毒科的細小病毒和其他成員籠統地描述於FIELDS VIROLOGY(第3版1996)的Kenneth I.Berns,"Parvoviridae：The Viruses and Their Replication,"第69章中。

在某些實施例中，ITR是從病毒科細小病毒科的成員獲得的。例如，非AAV ITR序列可以衍生自鵝細小病毒(GPV)或細小病毒B19。在一些實施例中，ITR並非衍生自AAV基因組。在一些實施例中，ITR是非AAV的ITR。在一些實施例中，ITR是來自選自但不限於由以下組成之群組的病毒科細小病毒科的非AAV基因組的ITR：博卡病毒屬(Bocavirus)、依賴病毒屬、紅病毒屬、阿留申病毒屬(Amdovirus)、細小病毒屬(Parvovirus)、濃核病毒屬(Densovirus)、重複病毒屬(Iteravirus)、康特拉病毒屬(Contravirus)、阿維細小病毒屬(Aveparvovirus)、科皮細小病毒屬(Copiparvovirus)、原細小病毒屬(Protoparvovirus)、四型細小病毒屬(Tetraparvovirus)、雙義濃核病毒屬(Ambidensovirus)、短濃核病毒屬(Brevidensovirus)、肝胰濃核病毒屬(Hepandensovirus)、對蝦濃核病毒屬(Penstyldensovirus)及其任何組合。在某些實施例中，ITR衍生自紅病毒屬細小病毒B19(人病毒)。在另一個實施例中，ITR衍生自番鴨細小病毒(MDPV)株。在某些實施例中，MDPV株是減毒的，例如MDPV株FZ91-30。在其他實施例中，MDPV株是病原性的，例如MDPV株YY。在一些實施例中，ITR衍生自豬細小病毒，例如豬細小病毒U44978。在一些實施例中，ITR衍生自小鼠微小病毒，例如小鼠微小病毒U34256。在一些實施例中，ITR衍生自犬細小病毒，例如犬細小病毒M19296。在一些實施例中，ITR衍生自水貂腸炎病毒，例如水貂腸炎病毒D00765。在一些實施例中，ITR衍生自依賴細小病毒。在一個實施例中，依賴細小病毒是依賴病毒屬鵝細小病毒(GPV)株。在一個具體實施例中，GPV株是減毒的，例如GPV株82-0321V。在另一個具體實施例中，GPV株是病原性的，例如GPV株B。合適的細小病毒TTR序列的例子在表1中列出。

本文提供的野生型或經突變的或以其他方式經修飾的ITR序列代表在用於產生ceDNA載體的桿狀病毒表現構築體(例如，ceDNA範本DNA)中包括的DNA序列。因此，由於在產生過程期間發生的天然存在的變化(例如，複製錯誤)，實際含於由桿狀病毒表現構築體產生的ceDNA載體中的ITR序列與本文提供的ITR序列可以相同也可以不相同。

轉殖基因

在某些實施例中，核酸分子(例如，ceDNA載體)可以在靶細胞中遞送並編碼一種或多種轉殖基因。轉殖基因可以是蛋白質編碼轉錄物、非編碼轉錄物或二者。核酸分子可以包含多個編碼序列和非經典轉譯起始位點或多於一種啟動子，以表現蛋白質編碼轉錄物、非編碼轉錄物或二者。轉殖基因可以包含編碼多於一種蛋白質的序列，或者可以是非編碼轉錄物的序列。

表現盒可以包含任何感興趣的轉殖基因。感興趣的轉殖基因包括但不限於編碼多肽(較佳地治療性(例如，用於醫療、診斷或獸醫用途)或免疫原性(例如，用於疫苗)多肽)的核酸，或非編碼核酸(例如，RNAi、miR等)。在某些實施例中，表現盒中的轉殖基因編碼一種或多種多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反義寡核苷酸、反義多核苷酸、抗體、抗原結合片段或其任何組合。在一些實施例中，轉殖基因是治療性基因或標記蛋白。在一些實施例中，轉殖基因是激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，拮抗劑是模擬物或抗體、或其抗體片段或抗原結合片段，例如中和抗體或抗體片段等。在一些實施例中，轉殖基因編碼抗體，包括全長抗體或抗體片段，如本文所定義的。在一些實施例中，抗體是抗原結合結構域或免疫球蛋白可變結構域序列。

在一些實施例中，本文所述的轉殖基因可以針對宿主細胞進行密碼子優化。如本文所用，術語「經密碼子優化的」或「密碼子優化」是指藉由將至少一個、多於一個或大量的天然序列(例如，原核序列)的密碼子用在感興趣的脊椎動物的基因中更頻繁或最頻繁使用的密碼子替換來修飾核酸序列以在該脊椎動物(例如，小鼠或人(例如，人源化))的細胞中增強表現的過程。不同物種表現出對特定胺基酸的某些密碼子的特別偏好。通常，密碼子優化不會改變原始轉譯的蛋白質的胺基酸序列。可以使用公開可用的資料庫確定經優化的密碼子。

在某些實施例中，表現構築體編碼轉殖基因，所述轉殖基因編碼治療性蛋白。在一些實施例中，基因盒編碼一種治療性蛋白。在一些實施例中，基因盒編碼多於一種治療性蛋白。在一些實施例中，基因盒編碼同一治療性蛋白的兩個或更多個拷貝。在一些實施例中，基因盒編碼同一治療性蛋白的兩種或更多種變異體。在一些實施例中，基因盒編碼兩種或更多種不同的治療性蛋白。

可以藉由本公開文本的桿狀病毒表現載體系統產生任何治療性蛋白，包括但不限於凝血因子的產生。在一些實施例中，凝血因子選自FI、FII、FIII、FIV、FV、FVI、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII、VWF、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖連蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、纖溶酶原、α2-抗纖維蛋白溶酶、組織纖溶酶原啟動物(tPA)、尿激酶、纖溶酶原啟動物抑制劑-1(PAI-1)、纖溶酶原啟動物抑制劑-2(PAI-2)、其任何酶原、其任何活性形式及其任何組合。在一個實施例中，凝血因子包括FVIII或其變異體或片段。在另一個實施例中，凝血因子包括FIX或其變異體或片段。在另一個實施例中，凝血因子包括FVII或其變異體或片段。在另一個實施例中，凝血因子包括VWF或其變異體或片段。

生長因子

在一些態樣，本文提供了核酸分子的產生，所述核酸分子包含第一ITR、第二ITR和編碼靶序列的基因盒，其中靶序列編碼治療性蛋白，並且其中治療性蛋白包括生長因子。生長因子可以選自業內已知的任何生長因子。在一些實施例中，生長因子是激素。在其他實施例中，生長因子是細胞因子。在一些實施例中，生長因子是趨化因子。

在一些實施例中，生長因子是腎上腺髓質素(AM)。在一些實施例中，生長因子是血管生成素(Ang)。在一些實施例中，生長因子是自分泌運動因子。在一些實施例中，生長因子是骨形態發生蛋白(BMP)。在一些實施例中，BMP選自BMP2、BMP4、BMP5和BMP7。在一些實施例中，生長因子是睫狀神經營養因子家族成員。在一些實施例中，睫狀神經營養因子家族成員選自睫狀神經營養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、白介素-6(IL-6)。在一些實施例中，生長因子是集落刺激因子。在一些實施例中，集落刺激因子選自巨噬細胞集落刺激因子(m-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些實施例中，生長因子是表皮生長因子(EGF)。在一些實施例中，生長因子是肝配蛋白。在一些實施例中，肝配蛋白選自肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2和肝配蛋白B3。在一些實施例中，生長因子是促紅細胞生成素(EPO)。在一些實施例中，生長因子是成纖維細胞生長因子(FGF)。在一些實施例中，FGF選自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。在一些實施例中，生長因子是胎牛促體素(FBS)。在一些實施例中，生長因子是GDNF家族成員。在一些實施例中，GDNF家族成員選自神經膠質細胞株衍生的神經營養因子(GDNF)、神經秩蛋白、persephin和artemin。在一些實施例中，生長因子是生長分化因子-9(GDF9)。在一些實施例中，生長因子是肝細胞生長因子(HGF)。在一些實施例中，生長因子是肝細胞瘤衍生的生長因子(HDGF)。在一些實施例中，生長因子是胰島素。在一些實施例中，生長因子是胰島素樣生長因子。在一些實施例中，胰島素樣生長因子是胰島素樣生長因子-1(IGF-1)或IGF-2。在一些實施例中，生長因子是白介素(IL)。在一些實施例中，IL選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。在一些實施例中，生長因子是角質形成細胞生長因子(KGF)。在一些實施例中，生長因子是遷移刺激因子(MSF)。在一些實施例中，生長因子是巨噬細胞刺激蛋白(MSP或肝細胞生長因子樣蛋白(HGFLP))。在一些實施例中，生長因子是肌生成抑制蛋白(GDF-8)。在一些實施例中，生長因子是神經調節蛋白。在一些實施例中，神經調節蛋白選自神經調節蛋白1(NRG1)、NRG2、NRG3和NRG4。在一些實施例中，生長因子是神經營養蛋白。在一些實施例中，生長因子是腦衍生的神經營養因子(BDNF)。在一些實施例中，生長因子是神經生長因子(NGF)。在一些實施例中，NGF是神經營養蛋白-3(NT-3)或NT-4。在一些實施例中，生長因子是胎盤生長因子(PGF)。在一些實施例中，生長因子是血小板衍生的生長因子(PDGF)。在一些實施例中，生長因子是腎胺酶(RNLS)。在一些實施例中，生長因子是T細胞生長因子(TCGF)。在一些實施例中，生長因子是血小板生成素(TPO)。在一些實施例中，生長因子是轉化生長因子。在一些實施例中，轉化生長因子是轉化生長因子α(TGF-α)或TGF-β。在一些實施例中，生長因子是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。在一些實施例中，生長因子是血管內皮生長因子(VEGF)。

微小RNA(miRNA)

微小RNA(miRNA)是藉由抑制轉譯或誘導信使RNA(mRNA)降解來負調控基因表現的小非編碼RNA分子(約18-22個核苷酸)。自其發現以來，miRNA已經牽涉多種細胞過程，包括細胞凋亡、分化和細胞增殖，並且已經顯示它們在致癌中發揮關鍵作用。miRNA調控基因表現的能力使得體內miRNA表現成為基因療法中有價值的工具。

在一些態樣，本文提供了核酸分子的產生，所述核酸分子包含第一ITR、第二ITR和編碼靶序列的基因盒，其中靶序列編碼miRNA，並且其中第一ITR和/或第二ITR是非腺相關病毒的ITR(例如，第一ITR和/或第二ITR來自非AAV)。miRNA可以是業內已知的任何miRNA。在一些實施例中，miRNA下調靶基因的表現。在某些實施例中，靶基因選自SOD1、HTT、RHO或其任何組合。

在一些實施例中，基因盒編碼一種miRNA。在一些實施例中，基因盒編碼多於一種miRNA。在一些實施例中，基因盒編碼兩種或更多種不同的miRNA。在一些實施例中，基因盒編碼同一miRNA的兩個或更多個拷貝。在一些實施例中，基因盒編碼同一治療性蛋白的兩種或更多種變異體。在某些實施例中，基因盒編碼一種或多種miRNA以及一種或多種治療性蛋白。

在一些實施例中，miRNA是天然存在的miRNA。在一些實施例中，miRNA是經工程化的miRNA。在一些實施例中，miRNA是人工miRNA。在某些實施例中，miRNA包括Evers等人，Molecular Therapy 26(9)：1-15(電子版先於印刷版，2018年6月)披露的miHTT工程化的miRNA。在某些實施例中，miRNA包括Dirren等人，Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2)：167-84(2015年2月)披露的miR SOD1人工miRNA。在某些實施例中，miRNA包括miR-708，其靶向RHO(參見Behrman等人，JCB 192(6)：919-27(2011))。

在一些實施例中，miRNA藉由下調基因抑制劑的表現來上調所述基因的表現。在一些實施例中，抑制劑是天然(例如，野生型)抑制劑。在一些實施例中，抑制劑得自經突變的、異源的和/或錯誤表現的基因。

表現控制元件

在一些實施例中，由本文所述的桿狀病毒表現載體系統產生的核酸分子或載體進一步包含至少一個表現控制序列。如本文所用的表現控制序列是促進與其可操作地連接的編碼核酸的有效轉錄和轉譯的任何調控核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-增強子組合。例如，藉由本公開文本的方法產生的分離的核酸分子可以可操作地連接至至少一個轉錄控制序列。

基因表現控制序列可以是例如哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成型或誘導型啟動子。組成型哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷脫胺酶、丙酮酸激酶；β-肌動蛋白啟動子和其他組成型啟動子。在真核細胞中組成性地發揮作用的示例性病毒啟動子包括例如來自以下病毒的啟動子：巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如，SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒、巨細胞病毒、莫洛尼白血病病毒的長末端重複(LTR)和其他反轉錄病毒；以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。

其他組成型啟動子是一般熟習此項技術者已知的。可用作本公開文本的基因表現序列的啟動子還包括誘導型啟動子。誘導型啟動子在誘導劑的存在下進行表現。例如，在某些金屬離子的存在下誘導金屬硫蛋白啟動子以促進轉錄和轉譯。其他誘導型啟動子是一般熟習此項技術者已知的。

在一個實施例中，本公開文包括轉殖基因在組織特異性啟動子和/或增強子控制下的表現。在另一個實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉殖基因在肝細胞中的表現。肝臟特異性啟動子的例子包括但不限於小鼠轉甲狀腺素蛋白啟動子(mTTR)、內源人因子VIII(F8)啟動子、內源人因子IX(F9)啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人白蛋白最小啟動子和小鼠白蛋白啟動子。在一個特定實施例中，啟動子包括mTTR啟動子。mTTR啟動子描述於R.H.Costa等人，1986,Mol.Cell.Biol.6：4697中。F8啟動子描述於Figueiredo和Brownlee,1995,J.Biol.Chem.270：11828-11838中。在某些實施例中，啟動子包括如在美國專利公開號US 2019/0048362中揭示的任何mTTR啟動子(例如，mTTR202啟動子、mTTR202opt啟動子、mTTR482啟動子)，將其藉由引用以其整體併入本文。

在一些實施例中，核酸分子包含組織特異性啟動子。在某些實施例中，組織特異性啟動子驅動治療性蛋白(例如，凝血因子)在肝臟中(例如，在肝細胞和/或內皮細胞中)的表現。在特定實施例中，啟動子選自小鼠轉甲狀腺素蛋白啟動子(mTTR)、內源人因子VIII啟動子(F8)、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、三重四脯胺酸(tristetraprolin，TTP)啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子及其任何組合。在一些實施例中，啟動子選自肝臟特異性啟動子(例如，α1-抗胰蛋白酶(AAT))、肌肉特異性啟動子(例如，肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重鏈α(αMHC)、肌紅蛋白(MB)和結蛋白(DES))、合成啟動子(例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK和tMCK)及其任何組合。

可以使用一種或多種增強子進一步增強表現水準以實現治療功效。一種或多種增強子可以單獨提供，或與一種或多種啟動子元件一起提供。通常，表現控制序列包含多個增強子元件和組織特異性啟動子。在一個實施例中，增強子包含一個或多個拷貝的α-1-微球蛋白/雙庫尼茨抑制劑(bikunin)增強子(Rouet等人，1992,J.Biol.Chem.267：20765-20773；Rouet等人，1995,Nucleic Acids Res.23：395-404；Rouet等人，1998,Biochem.J.334：577-584；Ill等人，1997,Blood Coagulation Fibrinolysis 8：S23-S30)。在另一個實施例中，增強子衍生自肝臟特異性轉錄因子結合位點，諸如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和Enh1，包括HNF1、(有義)-HNF3、(有義)-HNF4、(反義)-HNF1、(反義)-HNF6、(有義)-EBP、(反義)-HNF4(反義)。

在一個特定例子中，可用於本公開文的啟動子是ET啟動子，其還作為GenBank編號AY661265而已知。還參見Vigna等人，Molecular Therapy 11(5)：763(2005)。其他合適的載體和表現控制序列的例子描述於WO 02/092134、EP1395293或美國專利號6,808,905、7,745,179或7,179,903中，將其藉由引用以其整體併入本文。

一般而言，表現控制序列應當根據需要包括分別參與轉錄起始和轉譯起始的5'非轉錄序列和5'非轉譯序列，諸如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。尤其地，此類5'非轉錄序列將包括啟動子區，所述啟動子區包括用於可操作地連接的編碼核酸的轉錄控制的啟動子序列。根據需要，基因表現序列任選地包括增強子序列或上游啟動子序列。

另外的順式調控元件包括但不限於核糖開關、絕緣子、mir調控型元件、轉錄後調控元件(例如，WPRE)以及多聚腺苷酸化和終止信號(例如，BGH多聚A)。在某些實施例中，表現盒還可以包含內部核糖體進入位點(IRES)和/或2A元件。在一些實施例中，ceDNA載體包含調控轉殖基因表現的另外的組分，例如調控開關，其是殺傷開關以使得能夠控制包含ceDNA載體的細胞的細胞死亡。

在某些實施例中，藉由本文所述的桿狀病毒表現載體系統產生的核酸分子包含例如與轉殖基因可操作地連接的一個或多個miRNA靶序列。

在一些實施例中，靶序列是miR-223標靶，已經報導其可在骨髓定向祖細胞中以及至少部分地在更原始的HSPC中最有效地阻斷表現。miR-223標靶可以在分化的骨髓細胞(包括粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、骨髓樹突細胞)中阻斷表現。miR-223標靶還可以適用於依賴於淋巴或紅細胞譜系中的穩健轉殖基因表現的基因療法應用。miR-223標靶還可以在人HSC中非常有效地阻斷表現。

在一些實施例中，靶序列是miR-142標靶。在一些實施例中，將造血特異性微小RNA(諸如miR-142(142T))的互補序列摻入包含轉殖基因的核酸分子中，使得編碼轉殖基因的轉錄物易發生miRNA介導的下調。藉由這種方法，可以在造血譜系抗原呈現細胞(APC)中防止轉殖基因表現，而在非造血細胞中維持所述轉殖基因表現。這種策略可以對轉殖基因表現施加嚴格的轉錄後控制，因此使得能夠穩定遞送和長期表現轉殖基因。在一些實施例中，miR-142調控防止經轉導細胞的免疫介導的清除和/或誘導抗原特異性調控T細胞(T reg)，並且介導對轉殖基因編碼抗原的穩健的免疫耐受。

在一些實施例中，靶序列是miR181標靶。Chen C-Z和Lodish H,Seminars in Immunology(2005)17(2)：155-165披露了miR-181，它是在小鼠骨髓內的B細胞中特異性表現的miRNA(Chen和Lodish,2005)。所述文獻還披露，一些人miRNA與白血病相關。

靶序列可以與miRNA完全或部分互補。術語「完全互補」意指，靶序列的核酸序列與識別所述靶序列的miRNA的序列100%互補。術語「部分互補」意指，靶序列與識別所述靶序列的miRNA的序列僅部分互補，借此部分互補的序列仍然被miRNA識別。換句話說，在本公開文的上下文中，部分互補的靶序列有效識別相應miRNA，並且實現在表現該miRNA的細胞中防止或減少轉殖基因表現。miRNA靶序列的例子描述於WO 2007/000668、WO 2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471中，將其藉由引用以其整體併入本文。

宿主細胞

可以使本公開文本的桿狀病毒表現系統繁殖以產生可以在允許宿主細胞中產生的非病毒無衣殼ceDNA分子。合適的宿主細胞是熟習此項技術者已知的。「宿主細胞」是指包含或能夠包含任何感興趣的物質的任何細胞。

在一些實施例中，適用於使用的宿主細胞是昆蟲來源的。在一些實施例中，合適的昆蟲宿主細胞包括例如從草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)分離的細胞株或從粉紋夜蛾分離的細胞株。示例性昆蟲宿主細胞包括但不限於來自秋粘蟲(草地貪夜蛾)的Sf9細胞、Sf21細胞、Express Sf+細胞和S2細胞，或來自粉紋夜蛾(cabbage looper Trichoplusia ni)(鱗翅目(Lepidoptera))的BTI-TN-5B1-4(High Five細胞)，黑腹果蠅(D.melanogaster)細胞株，和其他細胞株。在一個特定實施例中，昆蟲宿主細胞是Sf9細胞。這些細胞可從多種來源(例如，ThermoFisher Scientific、ATCC和Expression Systems)商購獲得。其他合適的宿主昆蟲細胞是熟習此項技術者已知的。

rBV在有助於病毒進入細胞的條件下接觸後感染昆蟲細胞，例如藉由在有助於外來蛋白表現的培養基中(例如，在Gibco昆蟲培養基(ExpiSf CD培養基、Sf-900 III SFM、Express Five SFM或SF-900 II SEM(ThermoFisher Scientific)、ESF921或ESF AF培養基(Expression Systems))中)在約28℃下將經接觸的細胞培養約三天。可以例如藉由視覺上可檢測的選擇標記蛋白的表現或已經整合到rBV基因組中的基因的表現來監測成功的感染。

使包含本公開文的載體的宿主細胞在適當的生長培養基中生長。如本文所用，術語「適當的生長培養基」意指含有細胞生長所需的營養素的培養基。細胞生長所需的營養素可以包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素、礦物質和生長因子。任選地，培養基可以含有一種或多種選擇因子。任選地，培養基可以含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。可以在有助於維持和生長的培養基中培養昆蟲細胞，所述培養基諸如但不限於Gibco昆蟲培養基ExpiSf CD培養基、Sf-900 III SFM、Express Five SFM或SF-900 II SEM(ThermoFisher Scientific)、 ESF921和ESFAF(Expression Systems)。生長培養基通常將例如藉由藥物選擇或必需營養素的缺乏來選擇含有載體的細胞，所述營養素藉由載體上的可選標記來補充。

ceDNA載體表現和分離

在某些態樣，本公開文係關於藉由繁殖這裡所述的桿狀病毒表現載體來產生本文所述的核酸分子(例如，ceDNA載體)。在某些實施例中，藉由繁殖包含多核苷酸表現構築體範本的桿狀病毒表現載體來獲得無衣殼的非病毒DNA載體(ceDNA載體)，所述多核苷酸表現構築體範本以此順序包含：第一5' ITR；表現盒；和3' ITR。在一個實施例中，5'和3' ITR中的至少一個是經修飾的ITR，或者其中當5'和3' ITR二者均被修飾時，它們具有彼此不同的修飾並且不是相同的序列，即它們是不對稱的。在某些實施例中，ITR序列來自選自細小病毒、依賴病毒和腺相關病毒(AAV)的病毒。在某些實施例中，ITR來自不同病毒血清型。

在某些實施例中，使桿狀病毒表現載體在Rep蛋白的存在下在允許宿主細胞(例如，昆蟲細胞)中繁殖。在某些實施例中，多核苷酸範本在宿主細胞中複製以產生ceDNA載體。ceDNA載體的產生經歷兩個步驟：第一步，經由Rep蛋白從範本骨架上切除(「拯救」)範本；和第二步，Rep介導的經切除的ceDNA載體的複製。特定ITR序列的Rep蛋白和Rep結合位點是一般熟習此項技術者熟知的。一般熟習此項技術者理解基於至少一個功能ITR從結合並且複製核酸序列的血清型中選擇Rep蛋白。例如，如果有複製能力的ITR來自AAV血清型2，則相應的Rep將來自與該血清型一起起作用的AAV血清型，諸如與AAV2或AAV4 Rep(但是不是AAV5 Rep，它不起作用)一起的AAV2 ITR。在複製後，共價封閉端DNA載體繼續在允許細胞中積累，並且ceDNA載體較佳地在標準複製條件下在Rep蛋白的存在下隨著時間的推移足夠穩定，例如以至少1pg/細胞、較佳地至少2pg/細胞、較佳地至少3pg/細胞、更佳地至少4pg/細胞、甚至更佳地至少5pg/細胞的量積累。

因此，在一態樣，產生過程包括以下步驟：a)在有效誘導在宿主細胞內產生ceDNA載體的條件下並且持續足以誘導在宿主細胞內產生ceDNA載體的時間，在Rep蛋白的存在下，將宿主細胞(例如昆蟲細胞)群與本文所述的桿狀病毒表現載體一起培育；以及b)從宿主細胞中收穫和分離ceDNA載體。Rep蛋白的存在誘導具有經修飾的ITR的載體多核苷酸複製以在宿主細胞中產生ceDNA載體。

在某些實施例中，將Rep以約3的MOI添加到宿主細胞中。在某些實施例中，桿狀病毒表現載體用於遞送編碼Rep蛋白的多核苷酸和ceDNA的非病毒DNA載體多核苷酸表現構築體範本二者。在其他實施例中，宿主細胞被工程化為表現Rep蛋白。

可以藉由裂解細胞並且收穫ceDNA載體，從受感染的昆蟲細胞中獲得ceDNA載體。裂解可以藉由物理力(例如，用弗氏壓碎器或超聲處理)、含有去污劑的裂解緩衝液或用例如由桿狀病毒基因組天然表現的幾丁質酶對細胞基質進行酶促消化來完成。可以使用質體純化套組(諸如Qiagen Endo-Free質體套組)分離ceDNA載體。為質體分離開發的其他方法也可以適用於DNA載體。通常，可以採用任何核酸純化方法。

使用方法

本文提供的桿狀病毒表現載體系統可用於產生由插入本文所述的重組桿狀病毒質體中的外來序列編碼的產物。可以藉由業內已知的幾種方法實現產物的可擴大生產。

一種方法包括感染支援桿狀病毒生長的合適的昆蟲宿主細胞。在某些實施例中，首先使本文所述的包含外來序列的重組桿狀病毒質體在合適的細菌宿主細胞(例如，大腸桿菌)中繁殖。然後從細菌宿主細胞中分離重組桿狀病毒質體，並且使用合適的轉染試劑(例如，CELLFECTIN)將其轉染到合適的昆蟲宿主細胞中。昆蟲宿主細胞產生重組桿狀病毒顆粒，然後可以使所述病毒顆粒感染到宿主昆蟲細胞中以用於外來序列的病毒擴增。

在某些實施例中，本文提供產生由外來序列編碼的產物的方法，所述方法包括在適當的條件下將本文所述的重組桿狀病毒質體轉染到合適的昆蟲細胞中以產生重組桿狀病毒；以及在適當的條件下用重組桿狀病毒感染第二合適的昆蟲細胞以產生由外來序列編碼的產物。在某些實施例中，出於產生基因治療劑的目的，重組桿狀病毒質體包含Rep編碼序列和兩邊均側接ITR的編碼蛋白質的序列。

在某些實施例中，本文提供產生核酸分子的方法，所述方法包括在適當的條件下將本文所述的重組桿狀病毒質體轉染到合適的昆蟲細胞中以產生重組桿狀病毒；以及在適當的條件下用重組桿狀病毒感染第二合適的昆蟲細胞以產生核酸分子。在某些實施例中，本文提供了產生ceDNA的方法，所述方法包括在適當的條件下將本文所述的重組桿狀病毒質體轉染到合適的昆蟲細胞中以產生重組桿狀病毒；以及在適當的條件下用重組桿狀病毒感染第二合適的昆蟲細胞以產生ceDNA。

在另一種方法中，可以藉由在桿狀病毒基因啟動子(例如，桿狀病毒組成型基因啟動子)的控制下穩定地整合蛋白質編碼序列來產生穩定細胞株。在某些實施例中，穩定細胞株是穩定的昆蟲細胞株。序列的穩定整合可以藉由熟習此項技術者已知的任何方法進行。用於將核酸穩定整合到多種宿主細胞株中的方法是業內已知的(關於藉由穩定整合核酸產生的示例性生產細胞株的更詳細描述，參見下文的實例)。例如，重複選擇(例如，藉由使用可選標記)可以用於選擇已經整合含有可選標記(和AAV cap和rep基因和/或rAAV基因組)的核酸的細胞。在其他實施例中，核酸可以以位點特異性方式整合到細胞株中以產生生產細胞株。幾種位點特異性重組系統是業內已知的，諸如FLP/FRT(參見例如，O'Gorman,S.等人(1991)Science 251：1351-1355)、Cre/loxP(參見例如，Sauer,B.和Henderson,N.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5166-5170)和phi C31-att(參見例如，Groth,A.C.等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97：5995-6000)。

在穩定細胞株方法中，在一個實施例中，將編碼蛋白質編碼序列正確表現所需的補充蛋白的BEV引入穩定細胞株中。在某些實施例中，出於產生基因治療劑的目的，穩定細胞株包含具有穩定整合在其中的側接對稱或不對稱的AAV或非AAV ITR的治療性蛋白編碼基因。然後在產生基因治療劑所必需的條件下將包含編碼合適的Rep的BEV引入穩定細胞株中。

產生特定穩定細胞株的示例性方法描述於美國專利申請號63/069,073中。

在又另一種方法中，可以使用穩定細胞株以無桿狀病毒的方式來實現由外來序列編碼的產物的產生。在某些實施例中，出於產生基因治療劑的目的，穩定細胞株包含具有穩定整合在其中的側接對稱或不對稱的AAV或非AAV ITR的治療性蛋白編碼基因。在某些實施例中，穩定細胞株中的無桿狀病毒生產包括在桿狀病毒基因啟動子的控制下在穩定細胞株中暫態表現Rep蛋白。合適的桿狀病毒基因啟動子是熟習此項技術者已知的。在某些實施例中，桿狀病毒基因啟動子是黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)多核多角體病毒(OpMNPV)的立即早期(ie)基因啟動子。在某些實施例中，桿狀病毒基因啟動子是OpMNPV的OpIE2啟動子。介導暫態基因表現的各種方法是熟習此項技術者已知的。在某些實施例中，暫態基因表現可以藉由聚乙烯亞胺(PEI)介導的轉染來實現。

產物的下游純化可以涉及熟習此項技術者已知的任何方法。例如，對於用於基因療法目的的病毒或非病毒載體，可以藉由含有基於矽膠的柱的質體DNA分離套組進行純化，所述柱藉由離子交換色譜法將低分子量DNA與RNA、高分子量DNA、蛋白質和其他雜質分離。

本文所述的所有各個態樣、實施例和選擇均可以以任何和所有變化組合。

將本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均藉由引用併入本文，併入程度就像每個單獨的出版物、專利或專利申請被明確且單獨地指出藉由引用併入一樣。

實例

已提供前述公開文，可藉由參考本文提供的實例獲得進一步的理解。這些實例僅用於說明的目的，而不旨在是限制性的。

實例1：封閉端DNA(ceDNA)載體產量改進

在桿狀病毒-昆蟲細胞株統中，重組BEV在強啟動子下遞送感興趣的基因，並且提供病毒在昆蟲細胞中複製所必需的轉錄複合物。通常，桿狀病毒DNA基因組在細胞核中複製並且產生數千萬個後代病毒顆粒，每個顆粒均含有全長DNA基因組。已經證明在使用基於質體DNA的純化方法(諸如矽膠柱)從昆蟲細胞中分離DNA時桿狀病毒基因組DNA與ceDNA共純化。商業質體DNA套組柱通常不是設計用於基於它們的分子量分離DNA，因此，通常樣品中存在的所有形式的DNA均可以與這些柱結合。此外，大分子量DNA的結合能力可能與低分子量DNA不同，並且基於陰離子交換的套組柱未針對不同大小DNA的結合效率進行優化。

假設在ceDNA製劑中觀察到的高分子量DNA(>20kb)很可能是與低分子量ceDNA(約7kb)共純化的桿狀病毒基因組DNA。為了驗證這一假設，使用剔除在昆蟲細胞(Sf9)中產生感染性病毒顆粒所需的桿狀病毒基因組的必需基因的間接方法。這種方法將減少所產生的後代病毒顆粒的數量，並且最終減少ceDNA製劑中桿狀病毒基因組DNA的污染。靶向AcMNPV vp80衣殼基因，它是Sf9細胞中的後代(出芽病毒)病毒的產生和感染所必需的。作為概念驗證，AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV(圖1)(參見題為「桿狀病毒表現系統(Baculovirus Expression System)」的USSN 63/069,073，將其藉由引用併入本文)用於藉由CRISPR-Cas9系統剔除vp80基因。隨後，還製備了在AcMNPV誘導型39K啟動子下表現VP80的補體Sf9細胞株，以產生vp80剔除(KO)病毒的工作BEV儲液(P2)。這將允許vp80KO AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV經歷一輪複製，並且可以在Sf9細胞中啟動AAV ITR介導的ceDNA載體基因組複製。

實例2：AcMNPV VP80的CRISPR-Cas剔除(Knock-Ouf)

為了剔除AcMNPV vp80基因，設計了兩種靶向編碼序列的crRNA，並且將其用於使用Alt-R CRISPR-Cas9系統(Integrated DNA Technology^TM)根據製造商的說明書產生功能sgRNA(圖2和表2)。

然後使用Cellfectin®(Invitrogen^TM)轉染試劑，每種sgRNA在Sf9細胞(在T25燒瓶中的無血清ESF-921培養基中以0.5 x 10⁶/mL接種)中與SpCas9核酸酶和AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7桿狀病毒質體DNA共轉染。在轉染後4-5天，在螢光顯微鏡下使細胞視覺化，並且結果顯示對於兩種sgRNA標靶均有約10% RFP+細胞，這表明最有可能是由於經突變的vp80編碼序列將病毒感染限制為單個細胞。為了確定由每種sgRNA誘導的插入缺失，在補體Sf.39K.VP80細胞株中收穫了後代桿狀病毒並且對其進行噬斑(plaque)純化，如之前(Jarvis,2014)所述。在感染後5-6天，使十個噬斑純化的RFP+殖株在Sf.39K.VP80細胞(在T25燒瓶中的補充有10% FBS的ESF-921培養基中以0.5 x 106/mL接種)中擴增為P1。經擴增的殖株的螢光顯微鏡觀察結果顯示有約80% RFP+細胞，這表明Sf.39K.VP80細胞株能夠以反式補充後代病毒產生所需的VP80功能。藉由低速離心收穫每個選殖病毒，然後將等分試樣用於桿狀病毒DNA分離，所述分離是藉由Qiagen的DNeasy血液和組織基因組DNA分離套組(目錄號69506)根據製造商的說明書進行的。將所得的DNA(作為範本)以及對AcMNPV vp80編碼序列具有特異性的引物用於PCR擴增每個靶序列。然後對PCR擴增物進行凝膠純化並且藉由Genewiz測序設備直接測序。藉由TIDE(藉由分解跟蹤插入缺失)程式(tide.deskgen.com)使用默認設置分析所得的序列，以確定由每種sgRNA誘導的插入缺失。TIDE分析顯示在vp80編碼序列中對於sgRNA.T1，在2/10殖株中有移碼突變，其中最高(91%)為-2bp缺失(圖3)；並且對於sgRNA.T2，在1/10殖株中有移碼突變，其中最高(89%)為-10bp缺失，而沒有可檢測的插入(圖4)。擴增sgRNA.T1的殖株中的一個以產生工作BEV儲液(第2代)，然後在Sf.39K.VP80細胞中進行滴定，如之前(Jarvis,2014)所述。然後將AcBIVVBac.Polh.AAV2.Rep^Tn7 vp80KO BEV的經滴定的工作儲液用於在用以產生ceDNA載體的穩定細胞株中進行感染。

實例3：Sf39K.VP80補體細胞株的產生

產生了Sf.39K.VP80穩定細胞株以便以反式補充VP80功能以用於產生AcBIVVBac.Polh.AAV2.Rep^Tn7 vp80KO BEV的工作儲液。將AcMNPV誘導型39K啟動子用於vp80，以避免VP80過表現對Sf9細胞生長的任何毒性影響，如之前(Marek等人，2011)觀察到的。為了產生補體細胞株，產生了在AcMNPV 39K啟動子下編碼AcMNPV vp80基因(之後是p10多聚腺苷酸化信號)的轉移載體(圖5A)。然後如上所述使用Cellfectin®(InvitrogenTM)轉染試劑，將此轉移載體與在AcMNPV ie1啟動子下編碼新黴素抗性基因(之前是轉錄增強子hr5元件，之後是p10多聚腺苷酸化信號)的質體共轉染(圖5B)。還共轉染了編碼hFVIIIco6XTEN表現盒(側接AAV的對稱和不對稱的ITR)的質體(圖5C)。

在轉染後24h，在螢光顯微鏡下使細胞視覺化以確定轉染效率，並且結果顯示有>80% GFP+細胞，這表明了較高的轉染效率。在轉染後72h，用G418抗生素(Sigma Aldrich)選擇細胞，所述抗生素以1.0mg/mL終濃度懸浮在完全TNMFH培養基(補充有10% FBS+0.1% Pluronic F68的Grace昆蟲培養基)中。在約一周的選擇後，回收了約50%的經轉化細胞，這表明新黴素抗性標記穩定地整合到這個細胞群中。將存活細胞從選擇培養基中取出並且用新鮮的完全TNMFH培養基飼喂直至匯合生長。隨著它們繼續分裂，將匯合的細胞作為貼壁培養物逐漸擴大到更大的培養容器中。隨後，藉由在搖瓶中生長以在完全TNMFH中傳代一次並且在補充有10% FBS的ESF-921培養基中傳代一次，使每個細胞株適應懸浮培養。最後，作為懸浮培養物，使每個細胞株適應在搖瓶中的無血清ESF-921。將這些搖瓶培養物常規地維持在無血清ESF-921培養基中，其中每四天傳代一次，並且監測細胞生長。最後，如實例2中所述，將Sf.39K.VP80 細胞株的多重選殖細胞群用於AcBIVVBac.Polh.AAV2.Rep^Tn7 vp80KO BEV的噬斑純化和擴增。

實例4：使用VP80KO BEV產生人FVIIIco6XTEN ceDNA

為了確定使用vp80KO病毒的方法是否可以減少編碼人FVIII轉殖基因的ceDNA製劑中的桿狀病毒DNA污染，測試了AcBIVVBac.Polh.AAV2.Rep^Tn7 vp80KO BEV，以與含有完整vp80的相應野生型BEV進行比較。

用每種重組BEV的經滴定的工作儲液以3pfu/細胞的感染複數(MOI)感染細胞。然後將細胞在室溫下輕輕翻滾1.5h，以500xg沈澱5min，將上清液吸出，並且將細胞用10mL的新鮮ESF-921培養基洗滌一次。然後將細胞懸浮在50mL的ESF-921培養基中，然後在搖床培養箱中在28℃下培育72h。在感染後72h，收穫受感染的細胞，並且將沈澱物用1 x PBS洗滌一次以去除殘餘的桿狀病毒顆粒和/或培養基。然後使用PureLink Maxi Prep DNA分離套組(Invitrogen)根據製造商的說明書處理細胞沈澱物以純化ceDNA載體。藉由0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析溶析級分，以確定每種ceDNA載體的產量和純度。凝膠測定結果顯示與野生型BEV相比，在vp80KO BEV感染的樣品中有hFVIIIco6XTEN表現盒大小(約7.0kb)的單條厚條帶，而沒有可檢測的高分子量(>20kb)桿狀病毒基因組DNA污染(圖7)。結果表明，vp80KO方法能夠減少桿狀病毒基因組DNA污染，並且同時改進ceDNA產量。這種方法能夠從5 x 108個細胞中產生高達0.5mg的編碼hFVIIIco6XTEN(約7.0kb)的ceDNA載體。

實例5：人FVIIIco6XTEN ceDNA表徵

最後，我們對從vp80KO病毒感染後的穩定細胞株中獲得的線性的側接ITR的hFVIIIcooXTEN載體DNA進行了生化表徵。我們確定了此載體DNA在不同條件下是否具有共價封閉端、雙股構象和連環化多聚體形式。首先，我們將DNA(約8.5μg)在95℃下熱處理10min，然後在冰上使它們複性30min。隨後，將熱處理或未處理的載體DNA用獨特的限制性核酸內切酶AscI(它在 hFVIIIco6XTEN編碼序列中具有單個識別位點)消化。藉由天然瓊脂糖凝膠電泳以不同體積分析經消化的樣品。未切割的載體DNA基因組的凝膠測定顯示出一條6.5kb的主要條帶和兩條13.0kb和21.0kb的次要條帶。6.5kb條帶與單體載體基因組預期的一樣，並且13.0kb和21.0kb條帶與二聚體或三聚體連環化載體基因組一致(圖7，未切割)。然而，對於熱處理的樣品，我們預期熱處理將使DNA變性，並且可以分解除單體形式(它可以複性為雙股DNA)之外的連環化多聚體形式。確實，我們觀察到將熱處理的載體DNA隨後進行AscI消化解析為兩條3.6kb和2.9kb的主要條帶，而沒有可檢測的高分子量DNA條帶(圖7，左圖和圖8，單體)。3.6kb和2.9kb條帶與在冰上培育後複性的經消化的線性單體雙股體分子的預期一樣。高分子量DNA條帶的不存在與連環化多聚體形式在熱處理後的變性(在冰上培育後無法複性)一致。相比之下，經AscI消化的未處理的載體DNA的凝膠分析解析為兩條3.6kb和2.9kb的主要條帶和兩條7.2kb和5.8kb的次要條帶(圖7，右圖)。3.6kb和2.9kb條帶與用AscI消化載體基因組單體預期的一樣(圖8，單體)，而7.2kb和5.8kb條帶分別與多聚體載體基因組的尾對尾和頭對頭連環體一致(圖8，二聚體)。觀察到另一條>20kb的主要條帶，它可能是載體基因組的三聚體或四聚體形式，並且藉由簡單的限制性消化分析難以解釋。然而，這些結果表明hFVIIIco6XTEN ceDNA載體是在天然條件下以多聚體形式連環化的線性共價封閉的雙股DNA。

實例6：側接人博卡病毒(HBoV1)ITR的FVIIIXTEN的ceDNA產生

FVIIIXTEN HBoV1 ITR表現構築體

為了確定HBoV1 ITR(野生型HBoV1 ITR(SEQ ID NO：12和13))用於ceDNA產生的可行性，藉由GenScript®(皮斯卡塔韋，新澤西州)合成了DNA構築體，所述構築體包含在肝臟特異性經修飾的小鼠轉甲狀腺素蛋白(mTTR)啟動子(mTTR482)調控下的與XTEN 144肽融合的B結構域缺失(BDD)的經密碼子優化的人因子VIII(BDDcoFVIII)(FVIIIXTEN)以及增強子元件(A1MB2)、雜合合成內含子(嵌合內含子)、土撥鼠轉錄後調控元件(WPRE)、牛生長激素多聚腺苷酸化(bGBpA)信號並且側接人HBoV1 5'和3' ITR，以產生如SEQ ID NO：14所示的核酸序列。將此合成DNA選殖到pFastBac1(Invitrogen)載體中以產生pFastBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITR轉移載體。

非結構(NS1)桿狀病毒表現載體(BEV)

平行地，也將HBoV1非結構(NS1)cDNA選殖到Tn7轉移載體中，並且產生了在三種不同的啟動子控制下的以下三種重組BEV：(1)AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7，在AcMNPV多角體蛋白啟動子下編碼NS1(圖9A)：(2)AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1^Tn7，在AcMNPV立即早期1(IE1)(之後是AcMNPV轉錄增強子hr5元件)下編碼NS1(圖9B)；或(3)AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1^Tn7，在OpMNPV立即早期2(IE2)啟動子下編碼NS1(圖9C)，如題為「桿狀病毒表現系統(Baculovirus Expression System)」的美國專利申請號63/069,073號中所述。然後將所得的重組BEV用於在桿狀病毒系統中產生FVIHXTEN ceDNA，如下文所述。

實例7：根據TwoBAC產生FVIIIXTEN HBoV1 ITR ceDNA載體

在桿狀病毒系統中採用了產生FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN)的三種不同方法，如美國專利申請號63/069,073中所述。示例性TwoBAC方法在圖10中示出。

「TwoBAC」方法用於研究桿狀病毒系統中FVIIIXTEN ceDNA的產生。在用於轉殖基因表現的TwoBAC方法中，藉由Tn7轉位在兩種不同的BIVVBac桿狀病毒質體中在多角體蛋白基因座中在微型attTn7位點處，將經優化的FVIIIXTEN表現盒(具有HBoV1 ITR)與ITR特異性複製(Rep)基因表現盒一起插入。然後產生了重組BEV、AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs^Tn7(編碼經修飾的V2.0 FVIIIXTEN HBoV1 WT ITR)和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1^Tn7(編碼HBoV1 NS1)，並且將其用於在Sf9細胞中以不同感染複數(MOI)進行共感染，以產生FVIIIXTEN ceDNA，如圖10A所描繪。此外，桿狀病毒質體攜帶了RFP報告子基因以用於下游詢問。

為了研究在Sf9細胞中將產生最高ceFVIIIXTEN產量的MOI，從約2.5 x 10⁶/mL細胞中分離DNA，以0.1、0.3、0.5、1.0、3.0或5.0噬斑形成單位(pfu)/細胞的感染複數(MOI)用每種BEV的經滴定的工作儲液(P2)共感染這些細胞。將細胞懸浮於50mL的無血清ESF-921培養基中，然後在28℃搖床培養箱中培育72-96h或直至細胞活力達到60%-70%。在感染後約96h，收穫受感染的細胞，並且處理沈澱物以用於藉由PureLink Maxi Prep DNA分離套組(Invitrogen)根據製造商的說明書進行FVIIIXTEN ceDNA載體分離。在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳上分析最終溶析級分，以確定FVIIIXTEN ceDNA載體的生產率。

具有HBoV1 ITR和多角體蛋白驅動的HBoV1-NS1的編碼FVIIIXTEN的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs^Tn7的瓊脂糖凝膠分析在圖10B中示出。結果顯示出在所有測試劑量下有與FVIIIXTEN HBoV1 ITRceDNA大小(約8.5kb)相對應的DNA條帶，並且生產率隨著MOI的增加而增加。然而，污染性桿狀病毒DNA(vDNA)也隨著與共感染的MOI的增加而增加(圖10C)。

總之，這些實驗已經顯示，TwoBAC方法確實證實了從具有HBoV1 ITR和/或NS1轉殖基因的編碼FVIIIXTEN的兩種重組BEV產生ceDNA的概念。這些實驗還證明了最佳MOI比對於在Sf9細胞中實現更高的FVIIIXTEN ceDNA生產率的意義。

序列

<110> 美商百歐維拉提夫治療公司(BIOVERATIV THERAPEUTICS INC.)

<120> 用於改進封閉端DNA(ceDNA)的產生之經修飾的桿狀病毒系統

<130> SA9-475PC

<150> US 63/069,115

<151> 2020-08-23

<160> 22

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 248

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 1

<210> 2

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 2

<210> 3

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 3

<210> 4

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 4

<210> 5

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 5

<210> 6

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 6

<210> 7

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 7

<210> 8

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<400> 10

<210> 11

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸序列。

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (5)..(5)

<223> n可以是任何核苷酸。

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (6)..(6)

<223> n可以是任何核苷酸。

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (7)..(7)

<223> n可以是任何核苷酸。

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (8)..(8)

<223> n可以是任何核苷酸。

<400> 11

<210> 12

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBoV1 WT ITR 5'

<400> 12

<210> 13

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBoV1 WT TTR 3'

<400> 13

<210> 14

<211> 7891

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> V2.0人類密碼子優化的mTTR-內含子-BDD-FVIIIXTEN-WPRE-bGHPoly表現盒

<400> 14

<210> 15

<211> 4824

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼與144胺基酸XTEN融合的B結構域缺失(BDD)的經密碼子優化的人因子VIII(BDDcoFVIII)的核苷酸序列

<400> 15

<210> 16

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A1MB2增強子

<400> 16

<210> 17

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mTTR啟動子

<400> 17

<210> 18

<211> 1489

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合內含子

<400> 18

<210> 19

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WPRE

<400> 19

<210> 20

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bGHpA

<400> 20

<210> 21

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> coFVIII-6的核苷酸序列

<400> 21

<210> 22

<211> 4335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼B結構域缺失(BDD)的經密碼子優化的人因子VIII(BDDcoFVIII)(無XTEN)的核苷酸序列

<400> 22

Claims

一種重組桿狀病毒質體(bacmid)，其包含：

(i)桿狀病毒複製所需的桿狀病毒基因的變異體，其中所述變異體基因表現出其編碼的蛋白質的降低的表現；

(ii)細菌複製起點(ori)；和

(iii)至少一個用於整合包含轉殖基因的異源DNA序列的整合位點。
如請求項1所述的桿狀病毒質體，其中桿狀病毒基因是衣殼基因或衣殼相關基因。
如請求項1所述的桿狀病毒質體，其中所述桿狀病毒基因選自由VP80、VP39、GP41、P333、VP1-54、VLF-1和PP78/83組成之群組。
如請求項1所述的桿狀病毒質體，其中所述桿狀病毒基因是VP80。
如前述請求項中任一項所述的桿狀病毒質體，其中由於使所述必需基因的變異體的表現失活之破壞或突變，所述必需基因的變異體不表現。
如請求項5所述的桿狀病毒質體，其中所述變異體基因包含破壞其表現的插入和/或缺失(「插入缺失(indel)」)。
如請求項6所述的桿狀病毒質體，其中所述插入缺失是由靶向核酸酶系統產生的。
如前述請求項中任一項所述的桿狀病毒質體，其中所述複製起點是微型F複製子、ColE1、oriC、OriV、OriT或OriS。
如前述請求項中任一項所述的桿狀病毒質體，所述桿狀病毒質體進一步包含報告子基因。
如前述請求項中任一項所述的桿狀病毒質體，所述桿狀病毒質體進一步包含選擇標記表現基因盒。
如前述請求項中任一項所述的桿狀病毒質體，所述桿狀病毒質體進一步包含Rep蛋白。
一種重組桿狀病毒表現載體(rBEV)，其係藉由將異源DNA序列位點特異性整合到如前述請求項中任一項所述的桿狀病毒質體的整合位點中產生的。
如請求項12所述的rBEV，其中所述異源核酸序列包含側接反向末端重複(ITR)的轉殖基因。
如前述請求項中任一項所述的rBEV，其中所述異源核酸表現為封閉端DNA(ceDNA)。
一種桿狀病毒表現系統，其包含

(i)如前述請求項中任一項所述的rBEV；和

(ii)功能蛋白的來源，其中所述功能蛋白能夠補充變異體必需基因，並且其中所述功能蛋白以反式提供給所述rBEV。
如請求項15所述的桿狀病毒表現系統，其中所述功能蛋白以單獨的表現載體提供，所述表現載體以反式表現所述功能蛋白。
如請求項15所述的桿狀病毒表現系統，其中所述功能蛋白由昆蟲細胞提供，所述昆蟲細胞表現與變異體衣殼蛋白相對應的功能衣殼蛋白。
如請求項17所述的桿狀病毒表現系統，其中所述昆蟲細胞是Sf9、Sf21、S2、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、E4a或BTI-TN-5B1-4細胞。
一種在昆蟲細胞中繁殖桿狀病毒表現載體的方法，所述方法包括：

(a)用如請求項12-14中任一項所述的重組桿狀病毒表現載體(rBEV)轉染所述昆蟲細胞；

(b)提供能夠補充變異體必需基因的功能蛋白，其中所述功能蛋白以反式提供給所述rBEV；以及

(c)培養所述昆蟲細胞，從而繁殖所述桿狀病毒表現系統載體。
如請求項19所述的方法，其中所述功能蛋白是藉由用所述功能衣殼蛋白電穿孔所述昆蟲細胞來提供的。
如請求項19所述的方法，其中所述功能蛋白是藉由用單獨的表現載體轉染所述昆蟲細胞來提供的，所述表現載體穩定地整合並且以反式表現所述功能蛋白。
如請求項19所述的方法，其中功能衣殼基因是藉由在所述昆蟲細胞中表現與變異體衣殼蛋白相對應的功能衣殼蛋白來提供的。
如請求項22所述的方法，其中所述功能衣殼基因在誘導型或活化(transactivating)啟動子的控制下在所述細胞中表現。
如請求項23所述的方法，其中所述誘導型啟動子是苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcMNPV)39K啟動子。
一種產生包含轉殖基因的異源DNA序列的方法，

(a)如請求項19-24中任一項所述的方法繁殖重組桿狀病毒表現載體(rBEV)；

(b)收穫所述rBEV；

(c)感染昆蟲細胞以表現異源DNA序列；以及

(d)從所述昆蟲細胞中純化所述異源DNA序列。
如請求項25所述的方法，其中所述異源DNA序列基本上不含桿狀病毒基因組DNA。
如請求項26所述的方法，其中所述異源DNA序列包含側接反向末端重複(ITR)的轉殖基因。
如請求項27所述的方法，其中所述ITR衍生自細小病毒(parvovirus)。
如請求項28所述的方法，其中所述細小病毒選自由B19、GPV、AAV和人博卡病毒(HBoV1)組成之群組。
如請求項29所述的方法，其中所述細小病毒是HBoV1。
如請求項27-30中任一項所述的方法，其中所述異源核酸分子係以封閉端DNA(ceDNA)表現。
如請求項27-31中任一項所述的方法，其中所述異源核酸分子包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列，並且其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII活性的多肽。
如請求項27-32中任一項所述的方法，其中所述異源核酸分子包含含有SEQ ID NO：14的核苷酸序列的基因盒。
一種包含編碼治療性蛋白的轉殖基因的異源DNA序列，所述異源DNA序列是藉由如請求項25-33中任一項所述的方法產生的。