TW202216689A - １－［１－（４－苄氧基－３，５－二氟－苯甲醯）－４－氟－吡咯烷－２－羰基］－吡咯烷－２－腈 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種具有藥理活性的1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲醯基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-腈衍生物，

Description

1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲醯)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-腈

本發明係關於一種具有藥理活性的化合物，更具體而言，關於1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲醯基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-腈、它的立體異構物及其鹽，還關於這類化合物的製備方法、包含其的藥物組合物、及其在製造用於治療和/或預防神經退行性疾病和/或認知障礙的藥物中的用途。

脯氨醯寡肽酶（prolyl oligopeptidase (EC 3.4.21.26) (POP)）又稱為脯氨醯內肽酶（PREP），是一種絲氨酸蛋白酶，可在L-脯氨酸殘基C端側催化水解肽。它廣泛分佈於哺乳動物中，可從包括大腦在內的各種器官中純化出來。

該酶在與學習和記憶功能有關的含脯氨酸神經肽的斷裂中起重要作用（Wilk S等, Life Sci.1983;33:2149-57; O'Leary RM, O'Connor B, J. Neurochem.1995;65:953-63）。

脯氨醯寡肽酶的抑制作用已在與神經退行性進程有關的認知障礙的治療中得到測試。通過用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）（一種可導致P物質消耗的神經毒素）進行處理，使猴子產生帕金森病。隨後用S-17092（一種強效POP抑制劑）進行治療，可提高認知任務的表現（Schneider JS等, Neuropsychopharmacology2002;26(2):176-82）。還發現，POP抑制可防止α-突觸核蛋白（α-synuclein）在體外低聚（Myöhänen TT等, Br. J. Pharmacol.2012;166(3):1097-113）。對於阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD），數個在動物模型中進行的體內實驗表明，POP抑制可起到神經保護和認知增強作用（Kato A等, J. Pharmacol. Exp. Ther.1997;283(1):328-35 and Toide K等, Rev. Neurosci.1998;9(1):17-29）。Katsube小組在用POP抑制劑ONO-1603進行處理以使皮質細胞和小腦顆粒細胞免於發生衰老引起的細胞凋亡時，最初觀察到了神經保護作用（Katsube N等, J. Pharmacol. Exp. Ther.1999;288(1):6-13）。

POP抑制劑治療認知障礙的臨床試驗只有很少的案例。在第I期臨床研究中，Morain小組（Morain P等, Br. J. Clin. Pharmacol.2000;50(4):350-9）發現上述S-17092脯氨醯內肽酶抑制劑具有明確的劑量依賴性，並且在健康的老年受試者中顯示出認知增強特性；並且，沒有發現任何副作用。後來的研究表明，該化合物具有另外的輕微的情緒穩定特性（Morain P等, Neuropsychobiology2007;55(3-4):176-83）。

據報道，脯氨醯寡肽酶的活性在多種神經退行性疾病中會發生變化（死後），這些神經退行性疾病包括阿爾茨海默病（AD）、帕金森病、亨廷頓病和多發性硬化症（MS）（Mantle D et al., Clin. Chim. Acta1996;249(1-2):129-39）。

有大量證據表明，神經炎症在諸如AD、MS和帕金森病等神經退行性疾病的發病機制中起到了作用（Hirsch EC等, Lancet Neurol.2009;8(4):382-97, Philips T等, Lancet Neurol.2011;10(3):253-63）。POP被認為是牽涉入從大腦中的Tβ4釋放抗炎四肽Ac-SDKP的主要酶（Yang F等, Hypertension2004;43(2):229-36, Nolte WM等, Biochemistry2009;48(50):11971-81）。這表明，POP的抑制可有助於減少神經炎症，因此，POP抑制劑可能在具有炎症成分的神經退行性疾病（例如，阿爾茨海默病和帕金森病）的治療上是有用的，特別是有助於改善與這些疾病有關的認知障礙。

遍佈大腦皮質區的老年斑是AD的典型神經病理特徵。這些斑塊的主要蛋白質成分是β-澱粉樣蛋白（amyloid β-peptide，Aβ）。Aβ的沉積會引發大腦內神經元功能障礙和壞死。這種肽源自β-澱粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）。在正常情況下，APP被α-分泌酶切割產生可溶性APPα，其會防止產生Aβ。

有趣的是，POP抑制會增加細胞內的IP3水平，這可有助於刺激產生APPα，而APPα會減少Aβ產生。

此外，Rossner（Rossner S等, Neurochem . Res.2005;30(6-7):695-702）發現，受Aβ斑影響的AD患者的大腦結構中有較少POP免疫反應陽性神經元。

另外，P物質似乎可抑制β-澱粉樣蛋白的神經毒性作用（Kowall NW等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1991;88(16):7247-51）。脯氨醯寡肽酶抑制劑可抑制P物質的代謝，有助於維持P物質的水平，從而抑制β-澱粉樣蛋白的神經毒性作用。

鑒於以上作用，人們認為脯氨醯寡肽酶抑制劑可能是用於治療阿爾茨海默病的有用藥物，有助於預防腦損傷、改善與該疾病有關的認知障礙。

脯氨醯寡肽酶還與可能與多發性硬化症（MS）相關的若干因素有關。例如，POP會參與小神經膠質毒性的調節（Klegeris A等, Glia2008;56(6):675-85）。事實上，POP與MS之間建立了直接聯繫；患有復發-緩解型硬化症（Relapsing-Remitting-MS (RR-MS)）的患者的血漿POP活性明顯降低（Tenorio-Laranga J等, J Neuroinflammation2010;7:23）。有趣的是，這種降低與疾病症狀的嚴重程度有關，而與患者年齡無關。而在健康對照組中觀察到POP活性與年齡之間負相關，並且，在老年對照中，其水平與在MS患者中發現的水平相當。

帕金森病的神經病理特徵是黑質緻密部中黑色素化的多巴胺能神經元的進行性退化以及被稱為路易氏體（Lewy bodies）的細胞內含物。路易氏體的主要成分是140個氨基酸的蛋白質——α-突觸核蛋白。在某些情況下，α-突觸核蛋白單體相互作用形成前纖維聚集體（prefibrillar aggregate）或原纖維（protofibril），其會產生毒害細胞的不溶性纖維。這些小纖維不能被蛋白酶體降解，它們會損害這種細胞內蛋白水解系統的功能。這樣會導致α-突觸核蛋白原纖維（及其它被蛋白酶體降解的蛋白質）在細胞溶質中積累（Bennett MC, Pharmacol. Ther.2005;105(3):311-31），由此，帕金森病患者大腦中的α-突觸核蛋白原纖維就會增加。在過表達α-突觸核蛋白的細胞和小鼠模型中，這些小纖維與神經毒性有關（Masliah E等， Science2000；287(5456)：1265-9；Gosavi N等， J. Biol. Chem.2002；277 (50):48984-92)。錯誤折疊的α-突觸核蛋白的異常積累可導致線粒體變化，從而促進氧化應激並引起細胞死亡（Hsu LJ 等， Am. J. Pathol.2000;157(2):401-10）。此外，已知α-突觸核蛋白基因中的三個點突變（A53T、A30P或E46K）與家族性帕金森病的發病機制有關（Polymeropoulos MH 等， Science1997;276(5321):2045-7；Zarranz JJ等， Ann. Neurol.2004；55(2)：164-73)。

體外研究表明，當α-突觸核蛋白與野生型豬POP的克隆一起孵育時，該蛋白質的聚集速率會增大，並且，這種增大依賴於POP濃度（Brandt I等， Peptides2008；29 (9):1472-8)。此外，沒有POP活性的突變變體（S544A）沒有加快聚集速率。

通過添加POP抑制劑也可以防止聚集增強，這表明該作用依賴於POP酶活性。實驗數據表明，POP抑制劑可以阻止由過表達人α-突觸核蛋白的成神經細胞瘤SH-SY5Y細胞中的氧化應激誘導的α-突觸核蛋白聚集增加（Myöhänen TT等， Br. J. Pharmacol.2012; 166(3):1097 -113）。POP與α-突觸核蛋白在SH-SY5Y細胞中共定位，而在與POP抑制劑孵育後這種共定位消失，這表明POP和α-突觸核蛋白之間存在相互作用。用POP抑制劑處理5天可減少A30P α-突觸核蛋白轉基因小鼠大腦中可溶性α-突觸核蛋白的量。在這方面，據報道，POP抑制劑可通過調節自體吞噬來增強α-突觸核蛋白的清除（Myöhänen TT等， Pharmacological Research2020；151:104558）。

因此，抑制腦POP活性可防止α-突觸核蛋白聚集，從而防止路易氏體中細胞毒性原纖維的形成。因此，POP 抑制劑在治療描述有加速的α-突觸核蛋白聚集的神經退行性疾病方面具有潛在的治療價值。

能夠抑制POP的化合物可有效預防由東莨菪鹼誘導的大鼠實驗認知障礙，由此推斷，POP抑制劑具有緩解記憶功能障礙的功能（Yoshimoto T等, J. Pharmacobiodyn.1987;10:730-5）。

在大鼠Morris水迷宮中測試了迷迭香酸（一種非競爭性POP抑制劑（具有相對較高的IC50值，其為63.7 μM））亞慢性給藥的作用，並報道了其具有增強空間記憶的作用（Park DH等, Fitoterapia2010;81(6):644-8）。

人們發現，患有雙相型障礙的患者的血清具有較高水平的POP活性。近年來，POP作為治療該疾病的靶點起了非常重要的作用，特別是由於其參與了1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）的代謝。IP3是神經肽級聯反應中的信號轉導中的關鍵分子。通過與特定受體結合，神經肽誘導IP3增加，IP3與其內質網膜上的受體結合，誘導Ca ²⁺的釋放，人們認為Ca ²⁺在學習和記憶上起到了至關重要的作用。最新研究結果表明，POP可調控IP3的濃度（Komatsu Y J. Neurosci. 1996;16:6342-52）。因此，已知真核生物盤基網柄菌（Dictyostelium discoideum）中POP基因的破壞會通過IP3的升高誘導對鋰的抗性（Schulz I等, Eur. J. Biochem.2002;269:5813-20），並且還會降低POP的蛋白水解活性，這是反義人神經膠質瘤細胞中針對POP的IP3濃度高的原因。當這些細胞用特定POP抑制劑處理時，也會觀察到這種效果（Williams RS等, EMBO J.1999;18:2734-45）。

IP3信號通路會參與若干種藥物治療情緒穩定劑（鋰、卡馬西平和丙戊酸）的作用，並且，調控IP3信號轉導的機制的缺陷可導致雙相型障礙。此外，常用於治療雙相型障礙的情緒穩定藥物丙戊酸可直接抑制重組POP的活性（Cheng L等, Mol. CeII. Neurosci.2005;29: 155-61）。總之，有強有力的證據表明，POP抑制劑可用於預防和/或治療哺乳動物的雙相情感障礙。因此，提供新型POP抑制劑在此疾病的治療上是很受關注的。

總之，已對數種POP抑制劑在各種認知任務中的作用作了表徵，並達成以下共識：POP抑制劑對學習和記憶具有積極作用（Morain P等, CNS Drug. Rev.2002;8(1):31-52; Shinoda M等, Eur. J. Pharmacol.1996;305(1-3):31-8; Marighetto A等, Learn. Mem.2000;7(3):159-69; Toide K等, Pharmacol . Biochem. Behav.1997;56(3):427-34; Schneider JS等, Neuropsychopharmacology2002;26(2):176-82）。

有數件專利和專利申請公開了POP抑制劑：WO 2008/077978 A1、WO 2005/027934 A1、JP 2011-037874 A2、WO 2005/002624 A1、WO 2004/060862 A2、WO 03/04468 A1、DE 196 03 510 A1、US 2006/0100253 A1和US 6,159,938 A，但只有很少的化合物進行了體內研究（JTP-4819、S-17092、Z-321、ONO-1603、Y-29794、ZTTA、Z-Pro-Prolinal和KYP-2047）。在該列表中，僅前四種抑制劑進入了臨床試驗，但它們當中沒有一個進入市場。

WO 2014/072498 A1公開了對POP具有高親和性且能夠較好地透過血腦屏障到達大腦（當用於治療認知障礙時抑制劑發生作用的地方）的POP抑制劑。這是化合物成為用於治療認知障礙的良好候選物的重要特徵。

WO 2014/072498 A1描述稱其所公開的化合物的製劑可適於任何給藥途徑。但，在該專利申請所公開的僅有的體內實施例中，所述化合物是以皮下途徑給藥的。

能夠通過口服途徑施用POP抑制劑將是有利的，因為從患者角度來說這是最方便的方式。

因此，需要找到特別適於口服給藥且可有效到達大腦的新型POP抑制劑（當所述POP抑制劑用於治療認知障礙時，大腦是其發生作用的地方）。5-羥色胺受體拮抗劑（5-HT1A受體）常用作抗抑鬱藥物。然而，它們可誘導產生顯著的性功能障礙（Uphouse L, Pharmacol . Biochem. Behav.2014;0:31-42），從而限制其用於對成年人群的慢性治療。為此，對情緒障礙的認知具有積極作用且沒有這種不良事件的POP抑制劑將對患者的生活質量有重大影響。

本申請發明人現已成功地發現，1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲醯基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-腈（1-[1-(4-benzyloxy-3,5-difluoro-benzoyl)-4-fluoro-pyrrolidine-2-carbonyl]-pyrrolidine-2-carbonitrile）、其立體異構物、及其鹽不僅能夠高效抑制POP，而且還顯示出高的胃腸道滲透能力，還可實現高的大腦暴露，從而使其在口服時特別有效，並且對5-HT1A受體幾乎沒有結合，從而避免了諸如性功能障礙等不良副作用。

因此，本發明的一個方面涉及具有下式（I）的1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲醯基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]-吡咯烷-2-腈、其立體異構物、及其藥學上可接受的鹽。

（其中，該式中的星號表示存在手性中心）

本發明的另一方面涉及如上定義的式（I）化合物、其立體異構物、及其藥學上可接受的鹽的製備方法。

本發明的另一方面涉及一種藥物或藥物組合物，其包含至少一種如上定義的式（I）化合物、其立體異構物、及其藥學上可接受的鹽；及藥學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。

本發明的還一方面涉及如上定義的式（I）化合物、其立體異構物、及其藥學上可接受的鹽用作藥物的用途，特別是用於預防和/或治療認知障礙和/或諸如共核蛋白病（synucleinopathy，其是由於突觸核蛋白積累而引起的疾病，例如，帕金森病、快速眼球運動（REM）睡眠期行為障礙、路易體癡呆症或多系統萎縮症）等神經退行性疾病的藥物。特別地，所述認知障礙可與選自於由以下疾病組成的群組中的疾病相關：精神分裂症（schizophrenia）、重性抑鬱障礙（major depressive disorder）、雙相情感障礙（bipolar affective disorder）、REM睡眠期行為障礙、阿爾茲海默病、額顳癡呆（frontotemporal dementia）、帕金森病、路易體癡呆症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy）、皮質基底變性（cortico-basal degeneration）或肌萎縮性脊髓側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）。

本發明的再一方面涉及一種用於治療或預防哺乳動物認知障礙的方法，其中，將治療量的如上定義的式（I）化合物、其立體異構物、及其藥學上可接受的鹽施用給需要所述治療的患者。在一特定實施方式中，所述認知障礙是與選自於由以下疾病組成的群組中的疾病相關的認知障礙：精神分裂症、重性抑鬱障礙、雙相情感障礙、REM睡眠期行為障礙、阿爾茲海默病、額顳癡呆、帕金森病、路易體癡呆症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痹、皮質基底變性或肌萎縮性脊髓側索硬化症。

本發明的另一方面涉及如上定義的式（I）化合物、其立體異構物、及其藥學上可接受的鹽用於製備藥物的用途，特別是用於預防和/或治療認知障礙的藥物，更具體而言是與選自於由以下疾病組成的群組中的疾病相關的認知障礙：精神分裂症、重性抑鬱障礙、雙相情感障礙、REM睡眠期行為障礙、阿爾茲海默病、額顳癡呆、帕金森病、路易體癡呆症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痹、皮質基底節變性或肌萎縮性脊髓側索硬化症。這些方面和其優選實施方式還另外限定在了申請專利範圍中。

在本發明的上下文中，以下術語具有下面詳述的含義。

“鹽”須理解為根據本發明使用的活性化合物的任何形式，在該形式中，所述化合物為離子形式、或帶電並與反離子（陽離子或陰離子）結合、或在溶液中。該定義還包括季銨鹽及活性分子與其它分子和離子的絡合物，特別是通過離子相互作用形成的絡合物。該定義特別包括生理上可接受的鹽；該術語須理解成相當於“藥學上可接受的鹽”或“可藥用鹽”。

在本發明的上下文中，“藥學上可接受的鹽”是指當以適當的方式用於治療、施用或用於特別是人和/或哺乳動物時生理上耐受（通常是指其無毒，特別是由於反離子的原因）的任何鹽。這些生理上可接受的鹽可用陽離子或鹼形成，並且，在本發明的上下文中，被理解為由根據本發明使用的至少一種化合物形成的鹽，該化合物通常為酸（去質子化的），例如，陰離子，特別是當用於人和/或哺乳動物時。這些生理上可接受的鹽也可用陰離子或酸形成，並且，在本發明的上下文中，被理解為由根據本發明使用的至少一種化合物形成的鹽，該化合物通常為質子化的（例如，在氮上），例如，陽離子和至少一種生理上耐受的陰離子，特別是當用於人和/或哺乳動物時。在本發明的上下文中，該定義特別包括由生理上耐受的酸形成的鹽，即，特定活性化合物與生理上耐受的有機酸或無機酸的鹽，特別是當用於人和/或哺乳動物時。這種類型的鹽的示例是用以下酸形成的那些鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、甲基磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、扁桃酸、富馬酸、乳酸或檸檬酸。

由上述式（I）表示的本發明的化合物可包括由分子中存在三個手性中心產生的對映異構體。單一對映異構體及它們中兩種或更多種的任何混合物都落入本發明的範圍內。

除非另有說明，否則，本發明的化合物還意在包括同位素標記形式，即，不同之處僅在於存在一個或多個同位素富集的原子的化合物。例如，除了至少一個氫原子被氘或氚取代、或至少一個碳原子被 ¹³C或 ¹⁴C富集的碳取代、或至少一個氮原子被 ¹⁵N富集的氮取代外，具有本發明結構的化合物在本發明的範圍內。

式（I）的化合物或其鹽優選為藥學上接受的形式或基本上為純的形式。藥學上可接受的形式尤其是指除正常藥品添加劑（例如，稀釋劑和載體）外具有藥學上可接受的純度水平，並且不包含在正常劑量水平下被認為有毒的材料。藥物物質的純度優選大於50%，更優選大於70%，最優選大於90%。在一優選實施方式中，式（I）化合物或其鹽的純度大於95%。

如前所述，“藥學上可接受的鹽”是指在施用給接受者後，能夠提供（直接或間接地）本文所述化合物的任何鹽。然而，應當理解，非藥學上可接受的鹽也落入本發明的範圍內，因為這些可用於製備藥學上可接受的鹽、溶劑化物和前藥。鹽的製備可採用本領域已知的方法進行。

本文所用的術語“治療”包括根治、消除、逆轉、緩解、改變或控制疾病，例如，認知障礙。

本文所用的術語“預防”和“預防性的”是指式（I）化合物能夠在疾病（例如，認知障礙）發作前避免該疾病發作或出現，或使疾病的發作或出現最小化或變得困難。

因此，“治療”和/或“預防”作為一個整體是指至少抑制或改善與困擾對象的疾病相關的症狀，其中，抑制和改善用於在廣義上指至少參數幅度的減小，該參數例如是與被治療疾病（例如，認知障礙）有關的症狀。因此，本發明的方法還包括疾病被完全抑制住（例如，免於發生）或停止（例如，終止）使得對象不再遭受所述疾病的情況。由此，本發明的方法包括預防和控制認知障礙二者。

在本申請中，“認知障礙”與“輕度認知功能障礙”互換著使用，用於指代以與思想、學習或記憶相關的精神活動的缺陷為特徵的任何疾病。這類疾病的示例包括認識不能（agnosia）、失憶症（amnesia）、失語症（aphasia）、 失用症（apraxia）、譫妄（delirium）、癡呆（dementia）和學習障礙（learning disorder）。

認知障礙可（並且經常）與以神經元或參與神經元間信號傳遞的其它結構的損傷或喪失為特徵的其它疾病相關（即，由其引起或在其存在下發生）。因此，認知障礙可與諸如阿爾茲海默病、皮質基底節變性、克雅（氏）病（Creutzfeldt-Jacob disease）、額顳葉變性、亨廷頓病（Huntington's disease）、多發性硬化症、正常壓力腦積水、慢性腦綜合征、帕金森病、皮克病（Pick disease）、血管性癡呆、路易體癡呆病、多系統萎縮症和進行性核上性麻痹等神經退行性疾病相關。

認知障礙還可與損害中樞神經系統正常功能的其它疾病相關，包括精神障礙如焦慮症、解離性/間歇性人格分離（dissociative disorder）、情感障礙如雙相情感障礙、精神分裂症、身體形式症（somatoform disorder）和做作性障礙。

本文所述的化合物可用於治療認識不能（agnosia）、失憶症（amnesia）、失語症（aphasia）、 失用症（apraxia）、譫妄（delirium）、癡呆症（dementia）、學習障礙（learning disorder）和其它認知障礙。

可用本發明的方法進行治療的癡呆症的示例包括：艾滋病癡呆綜合征（AIDS dementia complex）、賓斯旺格病（Binswanger's disease）、路易體癡呆、額顳癡呆、多發腦梗死性癡呆、皮克病（Pick's disease）、語義性癡呆和血管性癡呆。

可用本發明的方法進行治療的學習障礙的示例包括：阿斯伯格綜合症（Asperger's syndrome）、注意力缺失症、注意力缺陷多動障礙、自閉症、兒童崩解症（childhood disintegrative disorder）、唐氏綜合症和Rett綜合征。

可用本發明的方法進行治療的失語症的示例包括進行非流利性失語（progressive non-fluent aphasia）。

本申請所述的化合物還可用於治療患有輕度或不會明顯干擾日常活動的精神活動缺陷的患者。輕度認知功能障礙是這種疾病的一個示例：患有輕度認知功能障礙的患者表現出癡呆的症狀（例如，語言或記憶困難），但這些症狀的嚴重程度使得診斷為癡呆症不太合適。本申請所述的化合物可用於治療輕度認知功能障礙和其它類似的不太嚴重的形式的認知障礙。

因此，本發明的另一方面為用於治療或預防哺乳動物的認知障礙的方法，其中，將治療量的本發明的化合物施用給需要所述治療的患者。

在一特定實施方式中，所述治療或預防方法通過向需要所述治療的患者通過口服途徑施用治療量的本發明的化合物來實現。

在一特定實施方式中，本發明的化合物以0.01~1.90 mg/kg的日劑量口服給藥，例如，0.01、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85或1.90 mg/kg。本發明的化合物可以以上指定的任意日口服劑量一日一次、一日兩次、一日三次、一日四次、一日五次或一日六次給藥。

在本發明的一特定實施方式中，本文所述化合物可用於治療具有與精神分裂症、雙相情感障礙、阿爾茲海默病或帕金森病相關的認知障礙的患者。

在本發明的一特定實施方式中，所述化合物具有下式（Ia）：

屬於式（I）的本發明的具體化合物包括下面列出的這些化合物： ．(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈 ．(R)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈 ．(S)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈 ．(R)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈 ．(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈 ．(R)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈 ．(S)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈 ．(R)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈

或其藥學上可接受的鹽。

上面定義的式（I）化合物可通過如下通用路線所示的可用合成工藝獲得：

在第一步中，將式（II）的酯溶解或懸浮於極性有機溶劑（優選質子極性有機溶劑）中，例如，乙醇（EtOH）或甲醇或極性有機溶劑的混合物。加入鹼的水溶液，使混合物（通常在回流下）保持在室溫與溶劑混合物的回流溫度之間的溫度下進行水解反應，直到水解完成，該反應通常進行0.5~4 h，優選1~2 h。該鹼溶液優選是無機的，例如，稀鹼液（dillute alkali），如NaOH。然後，使反應混合物達至室溫，並且，優選被濃縮到反應體積的約1/5。之後，將反應混合物緩慢地加到酸溶液（例如，1M HCl溶液）中，以在冰浴中冷卻的同時進行中和。如果酸化導致沉澱產生，則過濾固體並用水洗滌，從而提供式（VII）的產物。如果沒有獲得沉澱，則用合適的有機溶劑（例如，乙酸乙酯）對所得溶液萃取數次，然後乾燥並蒸發有機相。式（VII）的粗產物用快速色譜（flash chromatography）進行純化。

式（III）胺的去保護是在0℃至室溫的低溫下在溫和的酸性條件下實現的，例如，加到氯化氫的有機溶劑溶液（有機溶劑例如是二惡烷）中或用TFA/DCM混合物。該反應在室溫下攪拌1~3 h。然後，蒸乾溶劑，獲得式（VI）胺的鹽酸鹽或三氟乙酸鹽（具體取決於所使用的酸）。

式（IX）化合物由式（VII）的羧酸和式（VI）的胺在Schotten-Baumann條件下製備而成。因此，將氯化劑（例如，草醯氯）加到式（VII）羧酸的有機溶劑溶液中（有機溶劑例如是甲苯）。在50~80℃下攪拌反應1~2 h，以形成式（VIII）的醯氯。在蒸發掉溶劑後，將所得粗品溶解在有機溶劑（例如，THF）中，然後在低溫（例如，0℃）下加到式（VI）胺的鹼性水溶液（通常是式（VI）胺的NaOH水溶液）中。將反應混合物在低溫下攪拌1~2 h，並在室溫下攪拌2~4 h。然後，蒸發掉溶劑，並通過添加HCl溶液將剩餘含水部分調節至酸性pH（3-4），並用乙酸乙酯萃取。有機相用鹽水（brine）洗滌，然後乾燥、過濾並蒸發。必要時，所得粗產物用快速色譜進行純化。

然後，在鹼（例如，N,N-二異丙基乙胺（DIEA））的存在下，通過偶聯劑（例如，碳化二亞胺（carbodiimide））的輔助，使式（IX）產物與式（IV）的吡咯烷-2-腈偶聯。具體而言，將式（IX）化合物溶解在非質子有機溶劑（例如，二氯甲烷）中，然後加到碳化二亞胺（例如，固體負載型碳化二亞胺，如，N-環己基碳化二亞胺（N-cyclohexylcarbodiimide））、N'-甲基聚苯乙烯（N'-methyl polystyrene）與DIEA中。5 min後，加入式（IV）的吡咯烷-2-腈和額外的DIEA。在室溫下攪拌反應8~16 h。然後，對反應混合物進行過濾，殘留固體用非質子有機溶劑進行洗滌。將濾液蒸乾。然後，所得粗產物通過製備型RP-HPLC進行純化。

或者，式（I）化合物可根據如下路線按照如下所述進行製備：

將式（X）的胺官能團化樹脂（例如，Sieber醯胺樹脂）置於裝有聚乙烯多孔盤的注射器中。通過用合適的有機溶劑（例如，二氯甲烷（DCM）和二甲基甲醯胺（DMF））洗滌使樹脂溶脹。在樹脂的胺基被保護後（即，在Sieber醯胺樹脂的情況下），通過用胺鹼溶液（例如，呱啶的DMF溶液）進行處理實現保護基（例如，芴甲氧羰基（Fmoc）保護基）的去除。

在去除樹脂的保護基後，使用活化劑（例如，三唑，即TBTU）和在適當有機溶劑（例如，DMF）中的胺鹼（例如，DIEA）將式（V）的Fmoc保護的脯氨酸連到樹脂上。將混合物攪拌1~2 h。過濾並洗滌後，使用Kaiser試驗監測偶聯程度，如果需要則進行再偶聯。通過用胺鹼溶液（例如，呱啶的DMF溶液）和/或呱啶/DBU/甲苯/DMF混合物處理去除Fmoc,獲得式（XI）的產物。使用對硝基苯基酯NF31測試評估Fmoc的去除。

使用活化劑（例如，PyBOP）（存在或不存在添加劑，如HOAt）和在適當有機溶劑（例如，DMF）中的胺鹼（例如，DIEA），使式（XI）產物與式（IX）產物偶聯生成式（XII）的產物。在1~2 h的總反應時間內對混合物進行手動攪拌。使用相同的量和時間完成系統的再偶聯。可使用對硝基苯基酯NF31測試監測偶聯程度。

或者，式（XII）產物也可通過先使產物（XI）與式（XIII）化合物偶聯，在去除Fmoc保護基後再與式（VII）化合物偶聯的逐步偶聯獲得。

將用適當有機溶劑（例如，DCM）充分洗滌並乾燥的式（XII）產物轉移到燒瓶中，向其中加入在少量有機溶劑中的三氟乙酸酐和吡啶。將該混合物在20~40℃下保持8~16 h。之後，對反應混合物過濾，並用相同的有機溶劑對樹脂進行洗滌。收集濾液，然後將溶劑蒸乾。將所得粗品溶解在合適的溶劑（例如，乙酸乙酯）中，並用飽和NaHCO ₃溶液和5% KHSO ₄水溶液洗滌。乾燥、過濾並蒸發有機相。將粗產物吸收於H ₂O:CH ₃CN中，凍乾，產生式（I）的肽腈化合物。

或者，式（XII）肽基樹脂可用TFA/H ₂O/TIS混合物處理1~2 h。然後，過濾樹脂，並用TFA洗滌；收集濾液，蒸乾溶劑。將所得粗產物重新懸浮於H ₂O:CH ₃CN混合物中，並凍乾。將所得肽醯胺粗產物吸收於合適的有機溶劑（例如，DCM）中，並例如在五氧化二磷（phosphorus pentoxide）、四氯化鈦（titanium tetrachloride）、氯化亞碸（thionyl chloride）、三氟乙酸酐/吡啶（trifluoroacetic anhydride/pyridine）或三苯基膦/四氯化碳（triphenylphosphine/carbontetrachloride）存在下轉化為腈。將混合物在室溫下保持8~16 h，蒸發掉溶劑，將殘餘物吸收於乙酸乙酯中。隨後，用KHSO ₄水溶液和NaHCO ₃水溶液洗滌有機溶液。乾燥並蒸發有機相，產生式（I）的肽腈化合物。

粗產物用RP-HPLC純化。

在用於製備本發明的化合物的上述方法產生立體異構物的混合物的情況下，可通過常規技術將這些同分異構體分開，例如，製備色譜法。如果存在手性中心，則可將化合物製成外消旋體（racemic form）；或者，可通過對映選擇性合成或通過對映體拆分（resolution）來製備單獨的對映體。

用作起始原料的式（II）、式（III）、式（IV）和式（V）的化合物以及式（VII）的一些化合物可商購，也可使用本領域技術人員已知的方法製備而成。

因此，在一個方面，本發明提供用於製備式（I）化合物或其藥學上可接受的鹽、同分異構體、前藥或溶劑化物的方法。

在一種實施方式中，該方法包括以下步驟：

a）使式（IX）化合物與式（XI）化合物反應生成式（XII）化合物，

其中，聚合物代表在本文所公開的合成方法的反應條件下為惰性且在本文所採用的溶劑中不溶但可溶脹的聚合物，例如，低交聯聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚合物；

b）使式（XII）化合物水解生成式（XIV）化合物；及

c）使式（XIV）化合物經受能夠將羧醯胺基（carboxamide group）轉化為腈基的條件，以生成式（I）化合物；

其中，步驟b）和c）可分開進行，也可為一鍋反應。

在本發明的另一實施方式中，用於製備式（I）化合物或其藥學上可接受的鹽、同分異構體、前藥或溶劑化物的方法包括以下步驟：

a）使式（IX）化合物與式（IV）化合物反應。

在再一實施方式中，所述方法包括以下步驟：

a）使式（XI）化合物與式（XIII）化合物反應，

其中，聚合物代表在本文所公開的合成方法的反應條件下為惰性且在本文所採用的溶劑中不溶但可溶脹的聚合物，例如，低交聯聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚合物；

b）去除Fmoc保護基；

c）與式（VII）化合物反應；

d）使所得產物自負載聚合物水解，得到式（I）化合物，

。

已發現，通式（I）的化合物可用於治療認知障礙，特別是與其它中樞神經系統的疾病相關的認知障礙。

在本發明的一特定實施方式中，所述認知障礙是與選自於由以下疾病組成的群組中的疾病相關的認知障礙：精神分裂症（schizophrenia）、雙相情感障礙（bipolar affective disorder）、阿爾茲海默病和帕金森病。

本發明還提供用於施用給患者的藥物或藥物組合物，其包含本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽、衍生物、前藥或立體異構物；及藥學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。

根據本發明的藥物組合物的輔料或添加劑可選自於載體、賦形劑、支撐材料、潤滑劑、填料、溶劑、稀釋劑、著色劑、風味調節劑（flavour conditioner）（例如，糖）、抗氧化劑、黏合劑（binder）、黏結劑（adhesive）、崩解劑、防黏劑、助流劑（glidant）和/或黏著劑（agglutinant）。在栓劑的情況下，其可意味著用於腸胃外施用的蠟或脂肪酸酯或防腐劑、乳化劑和/或載體。這些輔料和/或添加劑及所用量的選擇將依賴於藥物組合物的施用形式。

根據本發明的藥物或藥物組合物可為適於人和/或動物施用的任何形式，優選人包括嬰兒、兒童和成年人，並且可通過本領域技術人員已知的標準流程來生產。因此，根據本發明的製劑可適於局部或全身施用，特別是適於真皮（dermal）、透皮、皮下、肌肉內、關節內、腹膜內、靜脈內、動脈內、膀胱內、骨內、海綿體內（intracavernosal）、鼻內、肺部、頰、舌下、眼、玻璃體腔內、經皮、直腸、陰道、經口、硬腦膜外、鞘內、心室內、腦內、腦室內、腦池內、椎管內、髓周、顱內、借助或不借助泵裝置通過注射針或導管遞送、或其它施用途徑。

在本發明的一優選實施方式中，所述藥物組合物為口服型，可為固體或液體。適用於口服給藥的劑型可以是片劑、丸劑、囊片（caplet）、膠丸（gel cap）、口香糖、膠囊（capsule）、顆粒劑、滴劑、糖漿或溶液，並且可包含本領域已知的常規賦形劑，例如，黏合劑（binding agent），如糖漿、阿拉伯膠（acacia）、明膠、山梨醇、黃芪膠或聚乙烯吡咯烷酮；填料，如乳糖（lactose）、糖（sugar）、玉米澱粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸；壓片潤滑劑，如硬脂酸鎂；崩解劑，如澱粉、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇酸澱粉鈉（sodium starch glycollate）或微晶纖維素；或藥學上可接受的潤濕劑，如十二烷基硫酸鈉。

在另一實施方式中，所述藥物組合物為非胃腸外（non-parenteral）鼻內給藥的產品形式，優選為用於鼻內給藥的產品形式。通常，鼻內給藥通過使用鼻噴霧器（nasal spray）、塑料擠瓶（squeeze bottle）、及滴管作為遞送裝置來實現。為了與這些裝置一起使用，有利地，所述藥物組合物為本發明化合物的液體溶液或懸浮液。

所述組合物可通過混合、填充或壓片的常規方法製備。反復混合操作可用於將活性劑分佈在採用大量填料的那些組合物中。這些操作是本領域的常規操作。片劑可例如通過濕法制粒或乾法制粒來製備，並任選地根據常規製藥實踐中眾所周知的方法進行包衣，特別是用腸溶衣來進行包衣。

所述藥物組合物也可適於腸胃外給藥，例如，適當單位劑型的無菌溶液、懸浮液或可重構乾製劑（reconstitutable dry preparation）、氣霧劑（aerosol）或噴霧劑（spray）。可以使用適當的賦形劑，例如，膨脹劑（bulking agent）、緩衝劑或表面活性劑。

本發明的組合物可配製成用於經皮給藥的溶解態或貼劑的沉積物（deposit）。

皮膚應用包括軟膏（ointment）、凝膠（gel）、乳膏（cream）、洗液、懸浮劑或乳劑。

直腸給藥的合適形式是通過栓劑。

上述製劑將採用標準方法來製備，例如，西班牙和美國藥典及類似參考文本中所述或所提及的那些方法。

在本發明的一個實施方式中，優選以治療有效量使用式（I）化合物。醫生將確定本發明治療劑最為合適的劑量，其會隨著給藥形式及所選擇的具體化合物而發生變化，此外，其還會隨著接受治療的患者、患者的年齡、所治療的疾病類型而發生變化。當所述組合物以口服方式給藥時，可能需要更大量的活性劑來產生與較小量的胃腸外給藥相同的效果。所述化合物可以與可比治療劑相同的方式使用，並且，其劑量水平與這些其它治療劑通常使用的劑量水平為同一數量級。通常，所述活性化合物每日給藥一次或多次，例如，每日1、2、3或4次，通常總日劑量為0.011~1.90 mg/kg/日。

本發明的化合物和組合物可與其它藥物一起使用，從而提供組合治療。這些其它藥物可形成同一組合物的一部分，或者可作為單獨的組合物提供，用於同時或在不同時間給藥。

特別地，至少一種式（I）化合物與至少一種其它藥物的組合可與至少一種藥學上可接受的載體、添加劑、佐劑或賦形劑一起配製，用於同時、分開或相繼給藥。這意味著式（I）化合物與所述其它藥物的組合可按如下方式施用：

作為同一藥物配方的一部分的組合，因此，其二者總是同時施用。

作為兩個單元的組合，每個單元具有其二者之一，從而可以同時、相繼或分開施用。在一特定實施方式中，式（I）化合物獨立於所述其它藥物（即，以兩個單元）但同時施用。在另一特定實施方式中，先施用式（I）化合物，然後分開或相繼施用其它藥物。在還一特定實施方式中，先施用其它藥物，然後分開或相繼施用式（I）化合物。

在本發明的上下文中，使用了首字母縮略詞和縮寫，其意思如下： AcOEt：乙酸乙酯 AD：阿爾茲海默病 AUC：曲線下面積 BBB：血腦屏障 Boc：叔丁氧羰基（tert-Butoxycarbonyl） BSA：牛血清白蛋白（Bovine serum albumin） DBU：1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯（1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene） DCM：二氯甲烷 DMEM：達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium） DI：鑒別指數（Discrimination index） DIEA：N,N-二異丙基乙胺（N,N’-Diisopropylethylamine） DMF：二甲基甲醯胺 DMSO：二甲亞碸 EtOH：乙醇 Fmoc：9-芴甲氧羰基（9-Fluorenylmethoxycarbonyl） FPLC：快速蛋白液相色譜 FTIR：傅里葉變換紅外光譜儀 HBSS：Hanks平衡鹽溶液（Hanks’ balanced solution salt） HOAt：1-羥基-7-氮雜苯並三唑（1-Hydroxy-7-azabenzotriazole） hPOP：人脯氨醯寡肽酶 IP：腹膜內 IP3：肌醇三磷酸 IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside） LB：溶原性肉湯（Lysogeny broth） MALDI-TOF：基質輔助激光解吸/電離飛行時間（Matrix-assisted laser desorption/ionization - time-of-flight） MK-801：地佐環平（Dizocilpine） MS：多發性硬化 NMR：核磁共振 NOR：新物體再認（Novel object recognition） OD：光密度 PAMPA：平行人工膜滲透性試驗 PBS：磷酸鹽緩衝生理鹽水 PC：磷脂醯膽鹼（或卵磷脂） PE：磷脂醯乙醇胺 pETM10：質粒pETM10 PI：磷脂醯肌醇 POP：脯氨醯寡肽酶 PS：磷脂醯絲氨酸 PyBOP：1H-苯並三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽（Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate） RP-HPLC：反相高效液相色譜 SD：標準差 SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis） TBTU ：O-苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯（O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate） TEER：跨內皮電阻 TFA：三氟乙酸 THF：四氫呋喃 TIS：三異丙基矽烷 Tris：三羥甲基甲胺（Tris(hydroxymethyl)aminomethane） Tβ4：胸腺肽β4蛋白質 UPLC：超高效液相色譜 Z-G-P-AMC：N-苄氧羰基-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-醯胺（N-Benzyloxycarbonyl-Gly-Pro-methylcoumarinyl-7-amide）

以下實施例僅用於對本發明的某些實施方式進行說明，但不能被理解為以任何方式對其進行限制。 實施例 實施例中各製劑的具體合成條件

步驟A：將式（II）的酯水解為式（VII）的羧酸

將式（II）的酯（1 mmol）溶解於95 % EtOH中。加入NaOH（3.7 mmol），回流下反應約2 h。然後，使反應混合物達至室溫。將反應混合物濃縮到約15~20 mL，然後，在於冰浴中冷卻的同時將該溶液緩慢地加到1 M HCl溶液中。過濾收集白色固體沉澱，用水洗滌，並充分乾燥，然後進行下一合成步驟。在無沉澱生成的情況下，將所得溶液用AcOEt萃取（3x），乾燥並蒸發有機相。需要的話通過快速色譜純化粗產物。

步驟B：使式（III）的Boc保護的胺脫保護生成式（VI）的胺

於0℃下，將式（III）的Boc保護的胺（1 mmol）緩慢地加入到濃度為4 M的HCl的二惡烷溶液（20 ml）中。室溫下攪拌反應2 h。然後，將溶劑蒸乾，得到式（VI）胺的鹽酸鹽。

步驟C：通過生成式（VIII）的醯氯使式（VI）的胺與式（VII）的羧酸偶聯

將草醯氯（1.5 mmol）加入到式（VII）羧酸（1 mmol）的甲苯溶液（5 ml）中。在50℃下攪拌反應1.5 h，使得生成式（VIII）的醯氯。蒸發溶劑後，將所得粗產物溶解在THF中，然後在0℃下加到式（VI）胺（1.1 mmol）的NaOH水溶液中。將反應混合物在0℃下攪拌1.5 h，然後在室溫下攪拌3 h。之後，蒸發掉THF，剩餘水性部分通過添加1 M HCl溶液將其調節至酸性pH（3-4），然後用AcOEt萃取。所得有機相用鹽水洗滌，然後進行乾燥、過濾和蒸發。如果需要則通過快速色譜純化式（IX）的粗產物。

步驟D：式（IX）產物與溶液中的式（IV）的吡咯烷-2-腈偶聯

將式（IX）產物（1.2 mmol）溶解於DCM中，然後加到N-環己基碳化二亞胺（N-cyclohexylcarbodiimide）、N’-甲基聚苯乙烯（3 mmol）與DIEA（1 mmol）中。5 min後，加入式（IV）的（S）-吡咯烷-2-腈（1 mmol）與DIEA（1mmol）。室溫下攪拌反應過夜。之後，過濾反應混合物，殘留固體用DCM洗滌。將濾液蒸乾。所得粗產物通過製備型RP-HPLC純化，然後凍乾，得到式（I）的產物。

步驟E：在固相上合成的一般步驟

樹脂的溶脹/調整（conditioning）：將式（X）的Sieber醯胺樹脂（1當量）置於裝有聚乙烯多孔盤的注射器中。用DCM和DMF洗滌樹脂使其溶脹。通過用濃度為20%的呱啶的DMF溶液進行處理來去除芴甲氧羰基（Fmoc）保護基。

然後，使用DMF中的TBTU（4當量（eq））和DIEA（8當量）將式（V）的Fmoc保護的脯氨酸（V）（4當量）連到樹脂上。間歇地手動攪拌該混合物90 min。過濾並洗滌後，使用Kaiser試驗監測偶聯程度，如果需要則進行再偶聯。通過先用濃度為20%的呱啶的DMF溶液處理，隨後用呱啶/DBU/甲苯/DMF（20:5:5:70）溶液處理來去除Fmoc，得到式（XI）的產物。採用對硝基苯酯NF31試驗評估Fmoc的去除（參見Madder, A.等, Eur. J. Org. Chem.1999;(11):2787-91）。

使用DMF中的PyBOP (2當量)、HOAt (6當量)和DIEA (6當量)使式（IX）產物（2當量）與式（XI）產物偶聯，得到式（XII）的產物。在90 min的總反應時間內間歇地手動攪拌該混合物。使用相同的量和時間完成系統的再偶聯。採用對硝基苯酯NF31試驗監測偶聯程度。

或者，使用DMF中的PyBOP (4當量)、HOAt (12當量)和DIEA (12當量)使式（XIII）產物（4當量）與式（XI）產物偶聯。在90 min的總反應時間內間歇地手動攪拌該混合物。採用對硝基苯酯NF31試驗監測偶聯程度，如果需要則進行再偶聯。通過用濃度為20%的呱啶的DMF溶液處理並用呱啶/DBU/甲苯/DMF（20:5:5:70）溶液處理來去除Fmoc基團。隨後，使用DMF中的PyBOP (4當量)、HOAt (12當量)和DIEA (12當量)，併入式（VII）的產物（4當量），獲得式（XII）的產物。在90min的總反應時間內間歇地手動攪拌該混合物。採用對硝基苯酯NF31試驗監測偶聯程度，如果需要則進行再偶聯。

式（XII）產物用DCM充分洗滌並乾燥後，轉移至圓底燒瓶中，向其內加入三氟乙酸酐（5當量）和吡啶（10當量）的DCM溶液（約2 mL/100 mg）。將該混合物保持在室溫下過夜。然後，過濾反應混合物，並用DCM洗滌樹脂。收集濾液，將溶劑蒸乾。將所得粗產物溶解在AcOEt中，並用飽和NaHCO ₃溶液和5% KHSO ₄水溶液洗滌。對有機相進行乾燥、過濾和蒸發。將所得粗產物吸收於H ₂O:CH ₃CN (1:1)中，然後凍乾，獲得式（I）的肽腈化合物。

或者，式（XII）的肽基樹脂可用TFA/H ₂O/TIS（95:2.5:2.5, 約2-5 mL/100 mg）混合物處理1-2 h。然後，過濾樹脂，並用TFA洗滌，收集濾液，蒸乾溶劑。將所得粗產物重懸浮於H ₂O:CH ₃CN (1:1)混合物中，並凍乾。將所得肽醯胺粗品放入DCM中，並向其內加入三氟乙酸酐（5當量）和呱啶（10當量）。將該混合物保持在室溫下過夜，蒸發掉溶劑，將殘餘物放入AcOEt中。隨後用5% KHSO ₄水溶液和10% NaHCO ₃水溶液洗滌該有機溶液。乾燥並蒸發有機相產生式（I）的肽腈化合物。

所得粗產物用RP-HPLC進行純化。 實施例 1 (S)-1-((2S,4R)-1-(4-( 苄氧基 )-3,5- 二氟苯甲醯基 )-4- 氟吡咯烷 -2- 羰基 ) 吡咯烷 -2- 腈（ (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(benzyloxy)-3,5-difluorobenzoyl)-4-fluoropyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carbonitrile ）

式（V）的市售Fmoc保護的L-脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH，249.7 mg, 0.7 mmol）、式（III）的(2S,4R)-4-氟-1-Fmoc-吡咯烷-2-羧酸（533 mg, 1.5 mmol）及式（VII）的4-苄氧基-3,5-二氟苯甲酸（271 mg, 1 mmol）通過上面步驟E中所述的逐步偶聯依次偶聯至市售Sieber醯胺樹脂（333.3 mg, 0.2 mmol, 1當量）。通過RP-HPLC純化得到156 mg（0.341 mmol）最終產物。

mp 137.6-139.1 ºC. FTIR: 1642, 1582, 1517, 1414, 1381, 1317, 1230, 1203, 1172, 1064, 1036 cm ^-1。 ¹H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ(ppm): 7.42 (2H, m), 7.35 (3H, m), 7.12 (2H, m), 5.30 (1H, m), 5.23 (1H, m), 4.93 (1H, dd), 4.82 (1H, m), 3.87 (2H, m), 4.08/3.69 (2H, m), 2.58/2.36 (2H, m), 2.26 (2H, m), 2.24 (2H, m)。 實施例 2 (S)-1-((2S,4S)-1-(4-( 苄氧基 )-3,5- 二氟苯甲醯基 )-4- 氟吡咯烷 -2- 羰基 ) 吡咯烷 -2- 腈（ (S)-1-((2S,4S)-1-(4-(benzyloxy)-3,5-difluorobenzoyl)-4-fluoropyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carbonitrile ）

該化合物根據實施例1所述的方法進行製備，不同之處在於用(2S,4S)-4-氟-1-Fmoc-吡咯烷-2-羧酸代替(2S,4R)-4-氟-1-Fmoc-吡咯烷-2-羧酸。通過RP-HPLC純化得到138 mg（0.302 mmol）最終產物。

mp 135-137 ºC. FTIR: 3483, 2954, 1653, 1581, 1518, 1437, 1417, 1383, 1356, 1321, 1234, 1203, 1172, 1065, 1039, 1005, 960, 901, 856, 762, 737, 696 cm ^-1。 比較例 3 (S)-1-((2S)-1-(4-( 苄氧基 )-3,5- 二甲氧基苯甲醯基 )-4,4- 二氟吡咯烷 -2- 羰基 ) 吡咯烷 -2- 腈（ (S)-1-((2S)-1-(4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxybenzoyl)-4,4-difluoropyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carbonitrile ）

從市售Sieber醯胺樹脂（250 mg, 0.19 mmol, 1當量）、市售Fmoc-L-脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH，258 mg, 0.77 mmol）及(S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二甲氧基苯甲醯基)-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸（161 mg, 0.38 mmol）開始，根據上述步驟E製備該產物。通過RP-HPLC純化得到18 mg（0.036 mmol）最終產物。 比較例 4 (S)-1-((S)-1-(4-( 苄氧基 )-3- 氟苯甲醯基 )-4,4- 二氟吡咯烷 -2- 羰基 ) 吡咯烷 -2- 腈（ (S)-1-((S)-1-(4-(benzyloxy)-3-fluorobenzoyl)-4,4-difluoropyrrolidine-2-carbonyl) pyrrolidine-2-carbonitrile ）

市售Fmoc保護的L-脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH，150 mg, 0.45 mmol）、Fmoc-4,4-二氟-L-脯氨酸（166 mg, 0.45 mmol）及4-苄氧基-3-氟苯甲酸（109 mg, 0.45 mmol）通過上面步驟E中所述的逐步偶聯依次偶聯至市售Sieber醯胺樹脂（200 mg, 0.15 mmol, 1當量）。通過RP-HPLC純化得到14 mg（0.030 mmol）最終產物。 藥理數據 測定新型化合物對（人）脯氨醯寡肽酶活性的抑制作用 脯氨醯寡肽酶（ POP ）的表達與純化

根據文獻方法（Tarragó T等, ChemBioChem2006;7:827-33），通過在大腸桿菌（E. coli）中表達並使用His尾融合親和純化獲得POP。該方法概述如下：

hPOP表達：用pETM10 hPOP轉化E. coli BL21轉化態細胞。為了誘導表達，含卡那黴素（kanamycin）（50 μg/mL）的LB培養基的預培養物（50 mL）以一個菌落進行接種，並在37℃下過夜生長。第二天，用過夜培養物（10 mL）接種LB培養基的兩個培養物（500 mL）。接種後的培養物在37℃和220 rpm下生長，直到OD595為1.2（2.5-3 h）。然後，加入IPTG（最終濃度為1 mM），並在25℃下誘導過夜。收集細胞（3500 g, 15 min, 4℃），將收集的細胞團懸浮於懸浮緩衝液（50 mL）（Tris-HCl pH 8 (50 mM), NaCl (300 mM),咪唑 (1 mM)）中，並在將樣品保持在冰塊上的情況下使用四個循環（每個循環由15 s超聲處理和15 s休止組成）以50%強度和0.5脈衝進行超聲處理。超聲處理完成後，將樣品離心（40 000 g, 30 min, 4℃），所得上清液立即用於POP純化。ÄKTA explorer FPLC系統用於進行純化。將上清液以1 mL/min的流速加到先前用5倍柱體積的懸浮緩衝液平衡過的HiTrapQuelating柱（5 mL）上。該柱用懸浮緩衝液洗滌直到280 nm處的吸光度返回到基礎水平。然後，用5倍體積的洗滌緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH 8, 300 mM NaCl, 30 mM咪唑）沖洗柱子。用4倍體積洗脫緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH 8, 300 mM NaCl, 500 mM咪唑）進行洗脫。在整個洗脫期間收集各級分（4 mL）。檢查所有級分的POP活性，活性呈陽性的級分通過SDS-PAGE進行分析，並用Biosafe Comassie Stain G-250染色。收集陽性級分，並使用HiPrep 26/10脫鹽柱用Tris-HCl（50 mM, pH 8）作緩衝液進行脫鹽。使用Bio-Rad蛋白質測定（Bio-Rad Protein Assay）以BSA作為標準品對重組hPOP定量。製備重組酶的等分試樣，並立即用液氮冷凍，並在-80℃下儲存。 POP 抑制試驗

用Z-G-P-AMC（N-苄氧羰基-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-醯胺）作POP底物，按照Toide等人描述的方法（Toide K等, J. Pharmacol. Exp. Ther.1995;274:1370-8）確定POP活性。在96-孔微量滴定板（其允許同時監測多個反應）上進行反應。對於每個反應，活性緩衝液（134 ml, 100 mM Na/K磷酸鹽緩衝液, pH 8.0）用hPOP（20~60 nM，取決於hPOP批次的活性）和相應的新化合物溶液（3 ml）在37℃下預培養15 min。以DMSO為溶劑製備新化合物的儲備溶液（100 mM），並由該儲備溶液用DMSO製備稀釋液。

預培養後，將Z-G-P-AMC (10 ml, 3 mM, 溶劑為40% 1,4-二氧六環)加入其中（在條件B下：3μl, 1.5 mM，溶劑為40% 1,4-二氧六環），並且在37℃下靜置反應1 h。通過加入乙酸鈉（150 ml, 1 M, pH 4）終止反應，並通過螢光法測定AMC的形成。激發波長和發射波長分別為360/40 nm和485/20 nm。

對每一化合物測定若干個濃度點（25 pm~400μM）。根據方程1計算對脯氨醯寡肽酶的抑制活性。針對每一新化合物，測定在存在（a）和不存在hPOP（b）時的螢光性。在不存在抑制化合物時由hPOP樣品獲得了最大螢光（0%抑制活性）。為了評估新化合物的抑制效力，繪製活性-化合物對數濃度圖，使用GraphPad Prism軟件將其調為sigmoid曲線，並由所得曲線確定IC50值（定義為抑制50%POP活性所需的化合物濃度）。 抑制活性(%) =

(方程1)

其中， a對應於底物+被測化合物+hPOP存在時的螢光強度 b對應於底物+被測化合物存在時的螢光強度 c對應於底物+hPOP存在時的螢光強度 d對應於底物存在時的螢光強度。 新化合物對人脯氨醯寡肽酶具有較高的抑制效力。結果總結於表1中。 表1  對人脯氨醯寡肽酶的抑制作用

化合物 （實施例 n 0 ）	IC 50(nM)	SD
實施例1	45.0	7.01
比較例3	48.7	20.3
比較例4	365.3	103.6

將表1中的數據表示在圖1中。在該圖中，條形表示均值±標準差（SD）。 測定化合物的滲透性 平行人工膜滲透性試驗（ PAMPA ）

使用文獻（Kansy M等, J. Med. Chem. 1998;41(7):1007-10）中描述的平行人工膜滲透性試驗（PAMPA）測定化合物通過被動擴散（Di L等, Eur. J. Med. Chem.2003;38(3):223-32）跨過血腦屏障（BBB）的能力。在200 μM的初始濃度下測定化合物的有效滲透率（ P _e ）。由市售濃縮緩衝溶液按照製造商的說明製備所需的緩衝溶液。使用0.5 M NaOH溶液將pH調為7.4。用DMSO為溶劑製備新化合物的儲備溶液，並用緩衝溶液稀釋至200 μM的最終濃度（含0.5% DMSO）。將PAMPA的sandwich結構分開，每個供給孔裝入200 μL化合物溶液。將接收板放入供給板內，確保膜的下側接觸緩衝液。將4 μL的磷脂（20 mg/mL）/十二烷混合物加入每個孔的過濾器中，並將200 μL緩衝溶液加入每個接收孔中。蓋上板，在室溫、飽和濕度氣氛及100 rpm的軌道攪動下孵育4 h。4 h後，通過HPLC分析接收和供給隔室內的內容物：將供給板各孔內150 μL內容物和接收板各孔內150 μL內容物轉移至HPLC小瓶中，將各樣品注射入反向C18柱（150 mm × 4.6 mm × 5 μm, 100 Å）（100 μL/接收孔注射液，10 μL/供給孔注射液，用於t0參考）。還通過MALDI-TOF光譜法證實了轉運。

所使用的磷脂混合物為由Avanti polar lipids提供的豬腦極性脂質提取物（porcine polar brain lipid extract），其具有以下組成：12.6%卵磷脂（PC）、33.1%磷脂醯乙醇胺（PE）、18.5% 磷脂醯絲氨酸（PS）、4.1%磷脂醯肌醇（PI）、0.8%磷脂酸和30.9%的其它化合物。

使用方程2計算4 h後的有效滲透率（P _e），使用方程3計算轉運百分比（T%），使用方程4計算磷脂膜的化合物保留率（R%）：

(方程2)

(方程3)

(方程4)

其中， t為時間（h）； C _A(t) 為在時間t時接收孔內的化合物濃度，CD(t)為在時間t時供給孔內的化合物濃度；及 C _D(t ₀) 為在t0時供給孔內的化合物濃度。

基於表2中所示的指示性P _e值可知，新型化合物具有良好的跨BBB滲透性（表3）。 表2  指示性P _e值

指示性 P e 值 (cm/s)	CNS 內轉運
P e＞= 4 ·10 -6	良好
2 ·10 -6＜= P e＜ 4 · 10 -6	不確定
P e＜ 2 · 10 -6	差

表3 新化合物的有效滲透率（P _e）和轉運百分比

化合物 （實施例 Nº ）	P e(×10 -6cm/s)	SD	%T	SD	% R	SD
1	4.7	0.1	18.1	0.4	24	3.5
比較 3	22.14	5.86	29.92	4.80	10.93	1.60
比較 4	-	-	10.43	2.06	-	-

將表3中的數據表示在圖2中。在該圖中，條形表示均值±標準差（SD）。 Caco-2 試驗（ Caco-2 assay ）

Caco-2細胞被廣泛用作用於預測人類藥物吸收的體外模型。Caco-2細胞系來源於人的結直腸癌，在培養時，這些細胞會自發地分化成極化腸上皮細胞單層。

跨Caco-2細胞單層的藥物滲透性已被證實與人體的體內吸收密切相關（Zhao YH等, 2001, J. Pharmaceut. Sci.90:749-784），並且已成為確立已久的用於預測腸吸收的體外方法（Kansy M等, 2001, Pharmcacokinetic optimization in drug research, Ed. Testa B等, 447-646）。

使用CacoReay滲透性試劑盒（ReadyCell，巴塞羅那（Barcelona），西班牙（Spain））進行實驗。

在收到試劑盒的同一周，根據試劑盒隨附的用戶手冊將細胞的運輸培養基液化，在此之後，該運輸培養基被新鮮的達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM，低葡萄糖）取代。

三天後，相當於細胞培養的第20天，通過測定細胞屏障的跨內皮電阻（TEER）確定屏障系統的質量和細胞之間是否存在緊密連接。200 Ω·cm ²（或更高）的TEER值意味著屏障系統對吸收試驗是可接受的。通過將電極在紫外光下浸入乙醇（70%）中30 min來對其進行殺菌。之後，將電極在DMEM培養基中平衡30 min，室溫下預熱。在室溫下進行TEER測定，得到均值為1357 ± 168 Ω·cm ²，這證實了細胞屏障的完整性。

在進行滲透性試驗之前，製備轉運緩衝液（HBSS (1x)-Ca ²⁺/Mg ²⁺），並將其加熱至37℃，以避免實驗過程中的細胞溫度應力。與此同時，將待測化合物溶解在轉運緩衝液（HBSS (1x)-Ca ²⁺/Mg ²⁺）中至最終濃度為50 µM。含有0.5% DMSO，這樣的量可使細胞很好地耐受，並且不會影響屏障的完整性。這些化合物在50 µM的濃度下進行測定。

在進行滲透性試驗之前，通過抽吸去除頂端隔室（apical compartment）和基底隔室（basal compartment）的DMEM。在每個隔室內留下10 µL培養基，以防止細胞變乾，破壞其屏障特性。用轉運緩衝液沖洗這兩種隔室，將基底（底部）隔室裝入300 µL轉運緩衝液，將頂端（頂部）隔室裝入75 µL轉運緩衝液。

通過抽吸去除基底隔室的全部內容物，並再次裝入250 µL轉運緩衝液。頂端隔室的內容物也通過抽吸去除，留下10 µL轉運緩衝液，以避免細胞變乾。將65 µL待測化合物溶液加入每個孔。

對於轉運實驗（頂端到基底），用含有所述化合物的溶液在37℃下孵育細胞2 h。之後，回收隔室的內容物，並用HPLC分析（Sunfire C18柱：100 mm × 4.6 mm, 3.5 mm, 100 Å, Waters；流速：1 mL/min；梯度：0-100% B 8 min，A為0.045%三氟乙酸水溶液，B為0.036%三氟乙酸乙腈溶液；檢測波長：220nm）。所有實驗都一式三份地進行。

在去除各隔室的樣品後，為了在試驗期間確定細胞屏障的完整性，再次將250 µL轉運緩衝液裝入基底隔室，並將65 µL在轉運緩衝液中濃度為20 µM的螢光黃（Lucifer Yellow，LY）溶液裝入頂端隔室。用該LY溶液在37℃下孵育細胞屏障1 h。LY用作滲透性試驗的屏障完整性標記。孵育後，收集隔室內容物，並用螢光計進行分析。

對於功能完整的Caco-2屏障，在1小時後，LY的滲透率應小於0.7 %。試驗結束後，LY滲透率低於該轉運均值，這表明了在對化合物評估期間屏障的屏障完整性。

在Caco-2滲透性試驗中，根據下面的方程計算化合物的轉運百分比（T%）：

其中，t為時間（h），C _A(t)為時間t時基底隔室（接收孔）內的化合物濃度，C _D(t ₀)為時間0時頂端隔室（供給孔）內的化合物濃度。 表4 滲透率（Caco-2試驗）

化合物 （實施例 Nº ）	%T	SD
1	45	3
比較例 3	5.7	1

如上所示，實施例1的化合物的胃滲透率比比較例3的高得多。在圖示中，條形代表均值±標準差（SD）。

將表4中的數據示出於圖3中。

體內腦暴露

對於每種化合物，使用24只在實驗當天7-8周齡的成年雄性小鼠進行研究，並將這些小鼠在各組間隨機分配。對示於下表中的3組動物進行實驗：

組	處理，途徑/劑量，給藥量	每組小鼠數量	血漿和大腦樣本時間
1	不作處理（對照組）	N=3	前劑量（pre-dose）
2	比較例3, IP, 5mg/kg, 10 mL/kg	N=21 （每次採樣時間3只動物）	T0+5 min, T0+30 min, T0+1h, T0+2h, T0+4h, T0+7h, T0+24h
3	實施例1, PO, 5mg/kg, 10 mL/kg	N=21 （每次採樣時間3只動物）	T0+5 min, T0+30 min, T0+1h, T0+2h, T0+4h, T0+7h, T0+24h
mg, 毫克; mL, 毫升; h, 小時; kg, 千克; min, 分鐘; N, 動物數量; IP, 腹膜內; PO, 口服; T, 時間; min, 分鐘

在施用化合物後，在腹腔給藥（比較例3）或口服給藥（實施例1）後的若干個時間點進行末梢采血。

在用磷酸鹽緩衝鹽水進行心臟灌流（transcardiac perfusion）後，還收集大腦。所有樣品在進行生物分析前都儲存在-80℃下。

將血漿樣品在室溫（RT）下解凍，將這些樣品用2倍體積的乙腈（含20 ng/mL非那西丁作為內標）進行蛋白沉澱。將樣品充分混合，然後以2,200 x g離心20 min。上清液用150 mM磷酸鹽緩衝鹽水（pH 7.4）進行1:1稀釋，然後用移液管移至UPLC 96孔板上等待分析。

對大腦樣品稱重，並在室溫下解凍，然後通過用4倍體積的磷酸鹽緩衝鹽水在珠磨勻漿器（bead homogeniser）中使該組織均質化來進行製備以用於分析。所得勻漿用與血漿樣品類似的方式進行處理。

在將空白血漿和腦勻漿加標至實施例1和比較例3的0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000和10000 ng/mL濃度後，用與實際研究樣品類似的方式製備參考（校準）樣品。在將空白血漿和腦勻漿加標至實施例1或比較例3的20、200和2000 ng/mL後，用與實際研究樣品類似的方式製備質量控制樣品。

自小鼠血漿和腦定量比較例3和實施例1的化合物的水平。採用fit-on-purpose生物分析方法使用UPLC/QE-Orbitrap-MS對樣品進行分析。

繪製隨時間變化的化合物濃度（ng/mL），並使用Graphpad PrismTM 5.0計算血漿和腦組織中的曲線下面積（AUC）。血漿/腦比計算如下： BBB透過率（%）=

表5  腦暴露

化合物 （實施例 Nº ）	%BBB
1	25.3
比較例 3	21

將表5中的數據示於圖4中。

如上所示，當通過口服給藥使用實施例1的化合物時，可以實現比其它化合物可實現的更高的腦暴露，即便所述化合物通過腹膜內給藥時也是如此。 微粒體穩定性（大鼠）

微粒體穩定性可用於預測一化合物在口服給藥後是否會克服首過代謝並達到全身性暴露。此外，其還可用於預測到達血流後的化合物半衰期。

根據供應商（BD Bioscience）提供的說明研究化合物在大鼠（Sprague-Dawley）混合肝微粒體（目錄號452501）中的穩定性。用DMSO為溶劑製備待測化合物的儲備溶液（500 µM）。將2 µL化合物以1 µM的最終濃度在具有如下組成的混合物中進行孵育： - 713 µL水； - 200 µL 0.5 M磷酸鉀（pH 7.4）； - 50 µL NADPH regenerating system solution A（BD Bioscience，目錄號451220）； - 10 µL NADPH regenerating system solution B（BD Bioscience，目錄號451200）。

將所得混合物加熱至37℃5分鐘。之後，加入25 µL肝微粒體，其最終濃度為0.5 mg/mL。將該混合物在37℃下在軌道攪動（100 rpm）下進行孵育。在選定的時間點，取100 µL等分試樣，並與100 µL乙腈混合。將獲得的沉澱在漩渦振盪器（vortex）中振盪1 min。將樣品在4℃下保持30 min，之後，在4℃、20,000 x g下離心30 min。濾出上清液，隨後通過UPLC-MS進行分析。所有穩定性測試均一式兩份地進行。 表6  微粒體穩定性（大鼠）

化合物 ( 實施例 nº)	半衰期 (min)
實施例1	12
比較例3	＜5
比較例4	＜5

這些數據表明，比較例3和比較例4在口服給藥後不會克服首過代謝，因此，在口服給藥後不會到達體循環。事實上，比較例3在口服給藥後沒有表現出任何藥效，檢測到的藥物血漿水平非常低。 小鼠體內的 PK

在雄性瑞士白化病小鼠（Swiss Albino mice）體內進行化合物經靜脈團注給藥（intravenous bolus administration）後的藥物動力學研究。該研究依照“機構動物倫理委員會（Institutional Animal Ethics Committee，IAEC）”的指南和“印度動物實驗控制和監督委員會（Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals，CPCSEA）”的規定進行。

採用稀疏採樣設計（n=3/時間點）對每種化合物在12只小鼠上進行研究以產生複合曲線圖（composite profile）。將化合物以0.5 mg/mL的濃度溶解在2% Twee80®的鹽水（0.9% NaCl）中。使用由26G針頭引導的1 mL BD注射器以2 mL/kg的劑量體積經靜脈團注（intravenous bolus）通過側尾靜脈（lateral tail vein）給小鼠施用單劑量1 mg/kg的該化合物溶液。

在給藥後的0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24和48 h採集血樣（n=3/時間點）。在每個時間點，通過眼眶後血管叢穿刺採集120 μL血樣，並轉移到含200 mM K2EDTA溶液（每mL血液20 μL）的有標簽的微量離心管中。將血樣在4±2℃、5000 x g下離心5 min。在進行生物分析之前將血漿樣品存儲在低於-60℃的溫度下。

採用1.06 ng/mL LLOQ使用LC-MS/MS法分析血漿樣品。使用經過驗證的Phoenix WinNonlin®軟件（6.3版）的非房室分析工具（non-compartmental analysis tool）計算血漿的藥物動力學參數。通過線性梯形法則（linear trapezoidal rule）計算濃度時間曲線下面積（AUClast）。血漿濃度峰值（Cmax）和達到血漿濃度峰值的時間（Tmax）為觀察值。清除率（CL）和分佈體積（Vss）為預測值。 表7  藥物動力學（小鼠）

化合物 （實施例 Nº ）	AUClast (ng·h/mL)	CL (mL/min/kg)	Vss (L/kg)
1	127	99.6	1.19
比較例 3	131	126	0.64
比較例 4	22.7	697	9.06

比較例4在對小鼠靜脈（iv）給藥後表現出非常高的清除率，這表明該化合物經歷了高首過代謝（與微粒體穩定性數據一致），意味著該化合物在口服給藥後不會進入體循環。 新化合物對認知障礙動物模型的學習和記憶的影響

在認知障礙的藥理學模型中作為認知增強劑評估了新化合物的藥效。在未經處理和經MK-801處理的齧齒動物（小鼠或大鼠）上評估了新化合物的效果。MK-801是N-甲基-D-天門冬胺酸 (NMDA)受體的非競爭性拮抗劑，其會損害動物在各種學習和記憶範式中的表現（Castellano C等, Curr . Drug Targets2001;2:273–83.; Riedel G等, Behav . Brain Res.2003;140:1–47）。MK-801還會對齧齒動物的行為產生各種影響，包括感覺處理（sensory processing）上的缺陷、運動過強（hypermotility）、機械重複（stereotypy）和共濟失調（ataxia）。MK-801處理誘導的行為表型已被廣泛用作認知障礙的動物模型（Bardgett ME等, Brain Res. Bull.2003;60:131–42; Van der Staay FJ等, Behav. Brain Res.2011;220:215–29; Mutlu O等, Pharmacol . Biochem. Behav.2011;99:557–65）。

為了確定被測化合物是否起到認知增強劑的作用，通過廣泛使用的測試來測試它們恢復正常認知行為的能力，例如，新物體再認測試（Dere E等, Neurosci . Biobehav. Rev.2007;31:673–704; Boess FG 等, J. Pharmacol. Exp. Ther.2007;321:716–25）、被動或抑制逃避測試（passive or inhibitory avoidance task, Sarter M等, Psychopharmacology (Berl)1992;107:144–59）、Morris水迷宮（Morris water maze, D’Hooge R等, Brain Res. Rev.2001;36:60–90）及T迷宮交替測試（T-maze alternation task, Boess FG 等, Neuropharmacology2004;47:1081–92; Spowart-Manning L等, Behav . Brain Res.2004;151:37–46）。

作為評估新POP抑制劑的代表性示例，描述每個行為測試所遵循的協議以及物體再認測試和被動逃避測試中所獲得的結果。 新物體再認任務

新物體再認（NOR）任務是基於齧齒動物探索新物體的自然偏好（Ennaceur A等, Behav . Brain Res.1988;31:47–59）。它是一項用於研究視覺學習和記憶缺陷的相關非獎勵測試。簡言之，NOR任務過程由以下三個試驗組成：習慣化（habituation）、訓練（training）和保持（retention）。在不存在物體的情況下，使每只動物習慣於直徑為40 cm的圓形場地10 min（習慣期）。第二天，將動物放在該圓形場地上10 min進行訓練試驗，將兩個相同的物體放在對稱位置上。這一步驟連續進行兩天。在第三天，將其中一個物體替換為不同的物體。在該訓練試驗中未曾使用過的物體被用作保持試驗中的新物體。之後，讓動物自由探索10 min，並記錄探索每個物體所花費的時間。預期是動物會花費更多的時間探索新物體，這是完好再認記憶的標誌。辨別指數計算如下：探索新物體所花費的時間減去探索舊物體所花費的時間，除以探索兩個物體所花費的總時間，再乘以100。較高的辨別指數被認為反映較大的記憶力。 通過口服途徑給藥的化合物

使用8-9周齡的雄性C57/Bl6小鼠來進行實驗（n=7-9只動物/組）。用5% Tween80®與鹽水（0.9% NaCl）的混合物溶解化合物，獲得0.5 mg/mL的溶液濃度。

試驗分為三個部分：習慣化、訓練和測試。第一天，使動物習慣場地（圓形，直徑40 cm）10 min。在接下來的兩天，讓動物自由探索放在場地內的兩個相同的物體10 min。在測試期（第四天），將其中一個物體替換為新的物體。在該測試期之前，在測試前35分鐘，給動物口服（po）研究化合物（5% Tween80®鹽水，5 mg/kg）或賦形劑（5% Tween80®鹽水，1 mL/每100 g體重）。為了誘導認知障礙，在測試前20 min，以鹽水中0.2 mg/kg劑量向陰性對照組或藥物測試組通過皮下給藥方式給予地佐環平（MK-801）。基線對照組注射生理鹽水。

給藥後，讓每只小鼠自由探索物體10 min。鑒別指數（DI）被限定為評估參數：

使用置於場地上方1.5 m處的網絡攝像頭記錄實驗。使用Panlab SMART 2.0軟件分析小鼠行動距離作為在圓形場地區域上花費的時間的百分比。 通過腹腔途徑給藥的化合物

使用8-9周齡的雄性C57/Bl6小鼠來進行實驗（n=7-9只動物/組）。用5% Tween80®與鹽水（0.9% NaCl）的混合物溶解化合物，獲得0.5 mg/mL的溶液濃度。

試驗分為三個部分：習慣化、訓練和測試。第一天，使動物習慣場地（圓形，直徑40 cm）10 min。在接下來的兩天，讓動物自由探索放在場地內的兩個相同的物體10 min。在測試期（第四天），將其中一個物體替換為新的物體。在該測試期之前，在測試前35分鐘，通過腹腔給藥方式給動物施用研究化合物（5% Tween80®鹽水，5 mg/kg）或賦形劑（5% Tween80®鹽水，1 mL/每100 g體重）。為了誘導認知障礙，在測試前20 min，以鹽水中0.2 mg/kg劑量向陰性對照組或藥物測試組通過皮下給藥方式給予地佐環平（MK-801）。基線對照組注射生理鹽水。

給藥後，讓每只小鼠自由探索物體10 min。鑒別指數（DI）被限定為評估參數：

使用置於場地上方1.5 m處的網絡攝像頭記錄實驗。使用Panlab SMART 2.0軟件分析小鼠行動距離作為在圓形場地區域上花費的時間的百分比。

將施用實施例1化合物和比較例3化合物時獲得的結果示於下表中。 表8  NOR任務測試

	化合物	% 鑒別指數
腹腔給藥	對照	39.5 ± 3.9**
MK 801 (sc)	21 ± 4.7
MK 801 (sc) + 實施例1 (ip)	30.3 ± 3.9
MK 801 (sc) + 比較例3 (ip)	42.7 ± 3.3***
口服給藥	對照	53.3 ± 2.7***
MK 801 (sc)	16.6 ± 5.9
MK 801 (sc) + 實施例1 (po)	42.1 ± 5.1**
MK 801 (sc) + 比較例3 (po)	20.1 ± 2.9

將表8中的數據示出於圖5a（腹腔給藥）和圖5b（口服給藥）中。在該些圖中，條形代表均值±n只動物的s.e.m.。

*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001 vs.認知障礙的基礎（基礎MK801）狀態（單因素方差分析（one-way ANOVA test），然後進行Dunnett’s post-hoc檢驗）。

如上所示，實施例1的化合物在通過口服途徑給藥時優於比較例3，使其特別適於口服給藥。 選擇性特徵（ Selectivity profile ）（與 5-HT1A 結合）

使用來自於Cerep/Eurofins的SafetyScreen44®板進行實驗。化合物以100 µM的濃度（在1% DSMO中）進行測試。

化合物結合計算為對每個靶標特異的放射性標記的配體的結合的抑制百分比。

將結果表示為在被測化合物存在下獲得的控制特異性結合（control specific binding）的抑制百分比：

高於50%的抑制的結果被認為表明被測化合物具有顯著效果。 表9  與5-HT1A受體結合

化合物	控制特異性結合的抑制%	SD
實施例1	-6.3	1.2
比較例3	64.6	5.6

將表9中的數據示於圖6中。

圖1示出了實施例1、比較例3及比較例4的化合物的POP抑制試驗結果。 圖2示出了實施例1、比較例3和比較例4的化合物的PAMPA試驗的結果。 圖3示出了實施例1和比較例3的化合物的Caco-2試驗的結果。 圖4示出了實施例1和比較例3的化合物的體內腦暴露試驗的結果。 圖5a和圖5b示出了實施例1和比較例3的化合物的NOR任務試驗的結果。 圖6示出了實施例1和比較例3的化合物與5-HT1A受體結合的結果。 圖7示出了(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的紅外（IR）譜圖。 圖8示出了(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的 ¹H-NMR譜圖。 圖9示出了(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的IR譜圖。 圖10示出了(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的 ¹H-NMR譜圖。

無。

Claims (9)

1. 一種式（I）的化合物（其中，星號表示手性中心）、其立體異構物及其鹽

   

   。
2. 如請求項1所述的化合物、其立體異構物及其鹽，該化合物具有式（Ia）：

   

   。
3. 如請求項1所述的化合物，其中，所述化合物選自於： ．(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈； ．(R)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈； ．(S)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈； ．(R)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈； ．(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈； ．(R)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈； ．(S)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈； ．(R)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲醯基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈， 及其鹽。
4. 一種用於製備如請求項1至3中任一項所述的式（I）化合物的方法，其包括： a）使式（IX）化合物與式（XI）化合物反應生成式（XII）化合物；

   

   

   

   b）使式（XII）化合物水解生成式（XIV）化合物；及

   

   c）使式（XIV）化合物經受能夠將羧醯胺基轉化為腈基的條件，以生成式（I）化合物； 其中，步驟b）和c）可分開進行，也可為一鍋反應。
5. 一種用於製備如請求項1至3中任一項所述的式（I）化合物、其立體異構物及其鹽的方法，其包括使式（IX）化合物與式（IV）化合物反應

   

   

   。
6. 一種藥物組合物，其包含至少一種如請求項1至3中任一項所述的式（I）化合物、其立體異構物及其藥學上可接受的鹽；及藥學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。
7. 如請求項1至3中任一項所述的式（I）化合物用於製造藥物的用途。
8. 如請求項1至3中任一項所述的式（I）化合物用於製造用於治療和/或預防認知障礙的藥物的用途。
9. 如請求項8所述的用途，其中，所述認知障礙為與選自於由以下疾病組成的群組中的疾病相關的認知障礙：精神分裂症、重性抑鬱障礙、雙相情感障礙、REM睡眠期行為障礙、阿爾茲海默病、額顳癡呆、帕金森病、路易體癡呆症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痹、皮質基底變性或肌萎縮性脊髓側索硬化症。

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