TW202216111A - 香氛釋放機制、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種包括一蛋白質及一活性劑的釋放組合物,其中該活性劑在存在電解質溶液時被釋放。本發明還涉及一種包括該釋放組合物的套組及製品。
Description
本發明涉及一種涉及香氛分子以及一氣味結合蛋白(odorant-binding protein, OBP-I)的吸附以及解離機制,同時受人體汗液以及溫度調節。此系統可用於化妝品配方中,在體溫下汗液存在時會釋放香氛。
氣味結合蛋白(odorant-binding protein, OBP-I)是小的水溶性蛋白,屬於脂質運載蛋白超家族(1-2)。它們負責將疏水性氣味分子(稱為氣味劑(odorants))在它們的花萼形腔中運輸,穿過水性粘液屏障朝向嗅覺受體,其中一連串的傳導信號在大腦的解釋中被轉換(3-4)。這些蛋白質也被描述為參與在刺激後從嗅覺受體中去除氣味(5-6)。
已經鑑定了幾種哺乳動物氣味結合蛋白,其中一些是從鼻粘液中分離出來的,例如牛(bovine)、豬、公豬(boar)、熊貓、小鼠、大鼠及人類(7-13)。
哺乳動物OBP的DNA序列呈現低相似性:豬OBP(OBP-I)與人OBP(hOBP
IIa)僅呈現13.9%的DNA序列相似性;OBP-I與牛OBP 存在 42.7%(4)。儘管來自不同哺乳動物物種的 OBP 之間存在廣泛的遺傳變異性,但脂質運載蛋白(lipocalin)成員幾乎沒有特徵性特徵可以將其鑑定為保守的三級結構,呈現由7個環連接的8個β鏈組成的 β桶(β-barrel)結構,並連接到靠近C端的短 α螺旋以及第9個β鏈,然後是無序的C端尾部(14-16)。OBP的結構高度穩定,並且能夠抵抗溫度、有機溶劑、pH 變化或蛋白水解消化的降解(17-19)。豬OBP 的FT-IR光譜顯示其結構對熱變性(高達 80°C)特別穩定,尤其是在配體存在的情況下(20)。此外,脊椎動物 OBP 顯示出即使在變性後,也具有逆轉蛋白質解折疊的能力(20)。
人體會產生與壓力、焦慮、緊張以及體育鍛煉相關的難聞氣味(21)。為了防止或減少它們的發生,通常在化妝品配方中添加抗菌劑以及香氛。 然而,缺點是關於與對不同氣味的效果有限,以及在衣服以及皮膚中檢測到這些除臭劑的殘留量(22)。
OBPs對幾種與氣味感覺相關的分子具有親和力。所有這些分子都是揮發性的,可以在非常低的濃度下被 OBP 檢測到,是一個高度敏感的系統。 OBP的快速響應時間以及這些蛋白質的高穩定性創造了一種極好的生物元件作為生物傳感器,用於檢測食物或水中存在的危險物質以及病原體、殺蟲劑及藥物 (18、23),並作為除臭劑以及醫療的潛在用途診斷(24-25)。
氣味分子可與愉快或不愉快的感覺有關。OBP 對所有與氣味相關的分子都有親和力(3-4)。香水是含有氣味分子的組合物,具有令人愉悅的感覺。
1-氨基蒽(1-aminoanthracene, 1-AMA)作為氣味模型分子的使用提供了通過螢光測定測量氣味結合蛋白的結合能力的能力。與豬OBP-I結合的遊離 1-AMA以及1-AMA 可通過測量激發波長為 295 nm 的螢光進行量化。 與 OBP-I 結合的 1-AMA 的最大波長從 537 nm 移至 481 nm(20)。可以通過競爭性測定(competitive assay)或氣相色譜法-質譜聯用(gas chromatography–mass spectrometry)來測量非螢光氣味。
以下工作已經報導了 OBP與氣味模型分子之間的相互作用,以及與脂質結構例如脂質體之間的相互作用。
Filipa Gonçalves 等人(2018)「對1-氨基蒽具有相反溫度依賴性親和力的兩個工程化(OBPs Two Engineered OBPs with opposite temperature-dependent affinities towards 1-aminoanthracene)」提到了兩種基於豬OBP序列的重組蛋白:(i)截短型(truncated)OBP(tOBP-F44A/F66A),通過刪除N端的前16個殘基並使用丙胺酸(alanine)殘基(F44A以及F66A)替換結合袋(binding pocket)處的兩個苯丙胺酸(phenylalanine)殘基獲得;以及(ii)OBP::GQ
20::SP-DS3,是OBP-I與20個重複的甘胺酸-麩醯胺酸(glycine-glutamine)殘基的一間隔基(spacer)以及錨定肽SP-DS3融合的結果(34)。實驗及分子建模數據表明,1-AMA模型配體在25°C時優先結合tOBP-F44A/F66A,而配體結合OBP ::GQ
20::SP-DS3則在 37°C時有利(34)。
Filipa Gonçalves 等人(2018)「與細胞穿透肽融合的 OBP 促進脂質體傳導(OBP fused with cell-penetrating peptides promotes liposomal transduction)」報導了豬OBP 與細胞穿透肽(CPP,例如 TAT、Pep-1 及 pVEC)的融合。該研究揭示了 1-AMA 傳導到脂質體的不同效率(30)。
Filipa Gonçalves 等人(2018)「鄰近氣味結合蛋白驅動1-氨基蒽進入脂質體中(1-Aminoanthracene Transduction into Liposomes Driven by Odorant-Binding Protein Proximity)」公開了基於豬OBP與錨肽SP-DS332 在不存在以及存在間隔基的情況下融合的兩種融合蛋白的設計 (GQ
20)。這項工作證明 1-AMA 傳導到脂質體中是由錨定在脂質體膜上的蛋白質的接近度驅動的(沒有間隔基的優勢)(33)。
Filipa Gonçalves 等人(2019)「從用碳水化合物結合模塊蛋白質功能化的棉花中釋放香味(Release of Fragrances from Cotton Functionalized with Carbohydrate-Binding Module Proteins)」公開了基於與間隔基(GQ
20)以及碳水化合物結合模塊(CBM)融合的豬OBP的融合蛋白的設計。 這項工作證明瞭蛋白質對一種香味(β-香茅醇)的親和力,以及這種香味在汗液存在下從棉花中釋放出來(25)。無論如何,與天然 OBP 相比,汗液存在下的釋放能力較差。
Alessandro Capo 等人(2018)「豬氣味結合蛋白作為苯檢測分子探針(The porcine odorant-binding protein asmolecular probe for benzo detection)」公開了豬氣味結合蛋白可用作通過螢光分析檢測大氣中苯的探針(28)。
Nunzio Cennamo 等人(2015)「基於塑料光纖的丁醛簡易生物傳感器(Easy to Use Plastic Optical Fiber-Based Biosensor for Detection of Butanal)」報導了通過競爭性測定法檢測豬氣味結合蛋白對丁醛(20至1000 µM)的檢測。 這種醛的毒性很大,對人類健康有很高的風險,如細胞毒性及癌症。作者描述了一種用於檢測液體樣品中丁醇的光學生物傳感器(27)。
Carla Silva等人(2014)「氣味結合蛋白:氣味控制的生物技術工具(Odorant binding proteins: a biotechnological tool for odour control)」公開了豬氣味結合蛋白在從棉織物中釋放香味,以掩蓋煙味的應用。作者證實了 OBP 在織物上的功能化。他們僅測試了紡織品中一種香味的釋放。與 Silva 等人的工作相反,本發明包括不同香味或其他分子的釋放機制,作為對人類排汗的高效響應。 此外,本發明的主題適用於紡織及化妝品領域。
Paolo Pelosi 等人(2014)「氣味結合蛋白的結構以及生物技術應用(Structure and biotechnological applications of odorant-binding proteins)」公開了 OBP 用作傳感器以檢測氣味分子的揮發性以及緩慢釋放的可能性。
Lei Han 等人(2014)「pH對信息素結合蛋白ASP1作用機理及分子動力學的影響(Operating Mechanism and Molecular Dynamics of Pheromone-Binding Protein ASPl as Influenced by pH)」表明信息素結合蛋白ASPl在低 pH 下結合氣味劑,並且解離響應pH變化。 作者描述了這項研究在生物技術及農業方面的好處。結果由分子對接以及動力學模擬確定。
Alberto Mazzini 等人(2007)「牛氣味結合蛋白在酸性 pH 下的解離及展開(Dissociation and unfolding of bovine odorant binding protein at acidic pH)」通過分子模擬公開了牛 OBP 在中性以及酸性 pH下的結構。
Mariella Parisi等人(2003)「豬氣味結合蛋白在鹽酸胍中的展開和複性:中性pH下的平衡研究(Unfolding and refolding of porcine odorant binding protein in guanidinium hydrochloride: equilibrium studies at neutral pH)」揭示了眾所周知的促潮劑,鹽酸胍在蛋白質折疊/展開中的變性作用。這項基礎研究的目的是瞭解OBP蛋白的結構,特別是它的展開以及重折疊過程。
文件WO 0123890A1公開了一種基於固體支持物內的傳感元件的檢測器陣列,用於氣態的臨床樣品或細胞提取物。它是一種利用病毒肽的免疫測定法。
文件EP0335654A3公開了從大鼠中分離氣味結合蛋白的基因的方法以及蛋白質生產方法。
文件WO2001012806A3將OBPII描述為疏水性配體的固定劑,例如可用於個人衛生、農業食品系統以及營養以及治療用途的氣味。
公開這些事實是為了說明本發明所解決的技術問題。
本發明涉一種天然氣味結合蛋白(OBP-I),特別是豬OBP-I (SEQ ID NO:1),以及與接頭(linker)GQ 20x及KP肽融合的OBP(OBP::GQ
20::KP,SEQ ID NO:21)的吸附及解離機制。由於天冬氨酸(aspartic acid)以及麩胺酸(aspartic acid)殘基的含量高,這些蛋白質具有大約-20(pH 7.4)的負電荷。這些蛋白質的等電點值在 4.08至4.65.26 之間(26)。
在一實施例中,本文公開的解決方案可以對與出汗問題相關聯的人類社會生活產生很大影響。此系統有幾個優點,包括使用仿生化妝品生物成分(綠色解決方案),而不會破壞生態系統。
本文公開的機制揭示了氣味結合蛋白,特別是豬氣味結合蛋白 (OBP-I),在 37°C 下,在 50 mM Tris-HCl且pH 7.5的緩衝液中呈現對香氛的高親和力(吸附)。OBP-I 的親和常數(Ka) 為 4.00±0.03微莫耳濃度(µM)。 另一方面,OBP-I 呈現出一種逆向的機制,即,當暴露出汗水(perspiration)(汗水(pswea))時,即使在不同的 pH 值下(4.0-8.5 的範圍,表 2),香氛從其結合袋(binding pocket)中分離,且Ka 值降低(0.20±0.02 µM)。 類似地,在 37°C(Ka=4.00±0.04 µM)下,OBP::GQ
20::KP對緩衝液中的香氛表現出高親和力,而在存在電解質溶液(例如:汗液)(Ka=0.59±0.01 µM)時則會降低。因此,當與汗液接觸時,OBP的親和力降低,在這種情況下會釋放香味。
令人驚訝的是,OBP::GQ
20::KP(SEQ ID NO:21)在汗液存在下比在緩衝液存在下顯示出多6.8倍的香味釋放。這些值優於現有技術中報導的值,特別是OBP::GQ
20::CBM(SEQ ID NO:22)報導的值,其中釋放機制顯示出在汗液存在下1.3倍的香味釋放(25)。
豬氣味結合蛋白的吸附以及解離機制可以以重複的方式進行。
人類的汗液可以用作從OBP-I釋放/解離香味的一觸發物。因此,本發明的主題可用於護膚產品以及紡織品,特別是衣服。
在一實施例中,本發明涉及一種具有與哺乳動物氣味結合蛋白相似的胺基酸序列的蛋白質,該蛋白質將被摻入用於化妝品或紡織品應用的製劑中。
在一實施例中,該氣味結合蛋白的天然形式可以來自豬、人、狗、貓、大鼠、小鼠、牛、公豬(boar)、熊貓、中國倉鼠(Chinese hamster)、眉山豬(Meishan pig)、豚鼠(Guinea pig)、藏豬(Tibetan pig)、馬、海豚及黑猩猩。
在本發明的一方面中,本發明的應用可以基於在體溫下由電解質溶液觸發的氣味分子從氣味結合蛋白的釋放。
在一實施例中,電解質溶液是指NaCl濃度高於9.5克/升的溶液,尤其是指NaCl濃度在9.5至45克/升範圍內的溶液。 較佳地,電解質溶液是人類汗液、寵物汗液、鹽水或膠束水(micellar water)。
在一實施例中,人類汗液可包含水、乳酸、尿素及礦物質,例如鈉、鉀、鈣及鎂。
在一實施例中,化妝品應用可以用於皮膚及頭髮護理。 護膚應用可能與配製在護膚霜、口紅、唇霜、面膜粉、面霜、身體霜、皮膚淨化劑、妝前底霜及粉底的特殊配方中的OBP 有關。
在進一步的一實施例中,護髮應用可以與配製在睫毛膏、洗髮劑、護髮素、髮膜、護髮素或染髮膏中的OBP相關。
本發明涉及一種釋放組合物,包括一分離或人工的蛋白質,該蛋白質與選自於以下列表的一胺基酸序列具有至少 90%的一致性;較佳地,91%的一致性、92%的一致性、93%的一致性、94%的一致性、95%的一致性、96%的一致性、97%的一致性、98%的一致性、99%的一致性,或相同:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID:NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或其混合;一活性劑,選自於包括一除臭劑、一天然香精、一香氛、一保濕劑或其混合物的一列表;其中,該活性劑結合及/或包埋至該蛋白質;在10至60°C的一溫度下,在一電解質溶液的存在下,該蛋白質釋放該活性劑。
在一實施例中,該釋放組合物,包括一分離或人工未修飾的蛋白質,該蛋白質與選自於以下列表的一胺基酸序列具有至少 90%的一致性;較佳地,91%的一致性、92%的一致性、93%的一致性、94%的一致性、95%的一致性、96%的一致性、97%的一致性、98%的一致性、99%的一致性,或相同:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID:NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或其混合。
用於比較的序列比對的方法是本領域眾所周知的,此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。 GAP 使用 Needleman及Wunsch (《分子生物學雜誌》((1970) J Mol Biol 48: 443-453)) 的算法來找到兩個序列的整體(在整個序列上)排比(global alignment),這樣可以最大化匹配的數量並最小化間隙的數量。BLAST 算法(Altschul 等人(1990)《分子生物學雜誌》215:403-10(Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10))計算序列一致性百分比,並對兩個序列之間的相似性進行統計分析。用於執行 BLAST 分析的軟件可通過國家生物技術信息中心 (NCBI) 公開獲得。也可以使用 MatGAT 軟體套件中可用的方法之一來確定相似性及一致性的整體百分比(Global percentage)(Campanella 等人;《BMC生物信息學》;使用蛋白質或 DNA 序列生成相似性/一致性矩陣的應用(Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)。可以進行少量手動編輯以優化保守基序之間的比對,這對於本領域技術人員來說是顯而易見的。在本發明中以百分比表示的序列一致性的值是使用具有默認參數的BLAST在整個胺基酸序列上確定的。
在一實施例中,本發明的組合物包含0.01至5000 µM的該未修飾的蛋白質。
在一實施例中,本發明的組合物包含0.01至5000 µM的該蛋白質。
在另一實施例中,該釋放組合物包含0.1 µM至2 M的活性劑,較佳地,0.2 µM至1 M。
在一實施例中,在水或緩衝溶液中,較佳地,在Tris-HCl、磷酸鹽溶液及/或磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline, PBS)中,該蛋白質對該活性劑的親和常數(affinity constant)為1至4.5 µM。 在另一實施例中,在電解質溶液中,較佳地在汗液中,該蛋白質對該活性劑的親和常數為0.1至0.99 µM。
本發明涉及一種香味釋放組合物,包括:0.01至5000 µM的一分離或人工的蛋白質,該蛋白質與選自於以下列表的一胺基酸序列具有至少90%的一致性:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID:NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或其混合;0.1µM至2M的一活性劑,選自於包括一除臭劑、一天然香精、一香氛、一保濕劑或其混合物的一列表;其中,該活性劑結合及/或包埋至該蛋白質; 在10至70°C的一溫度下,較佳地,10至60°C的一溫度下,在一電解質溶液的存在下,該蛋白質釋放該活性劑;該蛋白質對該活性劑的親和常數在水中的範圍在1至4.5 µM之間;該活性劑的一分子量為20至1000克/莫耳;以及該電解質溶液是汗液、鹽水或膠束水。
在一實施例中,活性劑的分子量為20至1000 g/mol,較佳地,為75至300 g/mol。在另一實施例中,活性劑是香料分子。在又一實施例中,生物活性劑包含選自芳香族、醛或醇的官能基。在又一實施例中,活性劑是香氛分子,選自於包含表1中所列分子的一列表。
[表1]香氛及其特性的列表:
| CAS# | 名稱 | 氣味描述 | 化學家族 | 分子量(g/mol) |
| 85213-22-5 | 2-乙醯基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline) | 烤/麵包 | 酮 | 111,14 |
| 8000-41-7 | α-萜品醇(α-terpineol) | 紫丁香 | 酒精/萜烯 | 154,25 |
| 502-99-8 | β-羅勒烯(β-ocimene) | 甜草本 | hydrocarbon/萜烯 | 136,24 |
| 140-11-4 | 乙酸芐酯(benzyl acetate) | 草莓/梨 | 酯 | 150,17 |
| 123-86-4 | 乙酸正丁酯(butyl acetate) | 香蕉 | 酯 | 116,16 |
| 76-22-2 | 樟腦(camphor) | 樟腦 | 酮/萜烯 | 152,24 |
| 6485-40-1 | 香芹酮(carvone) | 薄荷 | 酮/萜烯 | 150,22 |
| 5392-40-5 | 檸檬醛(citral) | 檸檬/柑橘 | 醛/萜烯 | 152,24 |
| 106-22-9 | 香茅醇citronellol | 香茅/像玫瑰 | 酒精/萜烯 | 156,27 |
| 91-64-5 | 香豆素(coumarin) | 甜香草/令人愉快 | 內酯/芳香族 | 146,15 |
| 431-03-8 | 雙乙醯diacetyl | 黃油味 | 酮 | 86,09 |
| 97-53-0 | 丁二酮(diacetyl) | 丁香 | 芳香族/酒精 | 164,20 |
| 6413-10-1 | 果酮(fructone) | 蘋果 | 酯 | 174,19 |
| 706-14-9 | γ-癸內酯(gamma decalactone) | 椰子 | 內酯 | 170,25 |
| 104-61-0 | γ-壬內酯(gamma nonalactone) | 桃子/果味 | 內酯 | 156,23 |
| 106-24-1 | 香葉醇(geraniol) | 花香/甜玫瑰 | 萜烯 | 154,24 |
| 24851-98-7 | 希蒂鶯(hedione) | 花香/茉莉花 | 酯 | 226,32 |
| 123-92-2 | 乙酸異戊酯(isoamyl acetate) | 梨/香蕉 | 酯 | 130,19 |
| 67920-63-2 | 丁香醛(lilac aldehyde) | 花香/丁香 | 醛/萜烯 | 168,24 |
| 5989-27-5 | 檸烯(limonene) | 檸檬酸 | 萜烯 | 136,23 |
| 126-91-0 | 芳樟醇(linalool) | 薰衣草/佛手柑 | 萜烯 | 154,25 |
| 55066-48-3 | 玫瑰花醇(mefrosol) | 花香/玫瑰 | 酒精 | 178,27 |
| 2216-51-5 | 薄荷醇(menthol) | 辣薄荷 | 酒精 | 156,26 |
| 623-42-7 | 丁酸甲酯(methyl butyrate) | 蘋果/菠蘿 | 酯 | 102,13 |
| 123-35-3 | 月桂烯(myrcene) | 草本/木香 | 萜烯 | 136,24 |
| 80-56-8 | 蒎烯(pinene) | 松樹 | 萜烯 | 136,24 |
| 357650-26-1 | 波馬玫瑰酮(pomarose) | 李子/蘋果玫瑰 | 酮 | 166,26 |
| 89-82-7 | 胡薄荷酮(pulegone) | 辣薄荷 | 酮/萜烯 | 152,24 |
| 65113-99-7 | 合成檀香(sandalore) | 檀香 | 酒精 | 210,36 |
| 121-33-5 | 香草醛(vanillin) | 香草 | 醛/芳香族 | 152,15 |
在一實施例中,活性劑的釋放發生在30秒至24小時期間。
在一實施例中,電解質溶液的 pH在4.0至8.5之間。 在另一實施例中,電解質溶液是汗液、鹽水或膠束水,較佳地,是人的汗液或寵物的汗液。
在一實施例中,未修飾的蛋白質在極性溶劑及非極性溶劑中穩定,包括甲醇、丁醇、苯、乙醇、十一醇、以及緩衝溶液,較佳地Tris-HCl、磷酸鹽或磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline, PBS)。在進一步的實施例中,未修飾的蛋白質在18至70°C之間的溫度,優選18至60°C,以及4.0至10.0的pH範圍內也是穩定的。
在一實施例中,蛋白質在極性溶劑及非極性溶劑中穩定,包括甲醇、丁醇、苯、十一醇以及緩衝溶液(Tris-HCl、磷酸鹽、PBS)。在進一步的實施例中,蛋白質在18至70°C之間的溫度,較佳地,18至60°C,以及4.0至10.0的pH範圍內也是穩定的。
在一實施例中,活性劑從蛋白質的釋放發生在20至40°C。
在一實施例中,該組合物進一步包括:甘油、赤蘚醇(erythritol)、阿糖醇(arabitol)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、木糖醇(xylitol)、葡萄糖基苷(glucosylglycerol)、葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、蔗糖(sucrose)、海藻糖(trehalose)、異氟代苷(isofluoroside)、右旋糖酐(dextrans)、果聚醣(levans)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、氯化物鹽(salts of chloride)、檸檬酸鹽 (citrate)、硫酸鹽(sulfates,)、醋酸鹽(acetate)或磷酸鹽(phosphates)、或其混合物。
本發明的一方面包括:包括本主題中描述的組合物的套組或製品。在一實施例中,包括該組合物的製品可選自於包括以下各項所組成的一列表:織物、紡織品、纖維、衣服、圍巾、帽子、手套、襪子、頭巾、鞋、鞋墊、袋子、手提包、洗滌劑、霜、乳液、泡沫、香水、柔軟劑、氣膠(aerosol)、除臭劑、口紅、唇膏、面膜粉、面霜、身體霜、皮膚淨化劑、妝前底霜、粉底、洗髮劑、護髮素、髮膜、護髮素或染髮膏。
本發明還涉及一種本主題中描述的香氛釋放組合物在化妝品中的用途,較佳地作為化妝品/組合物,更佳地為護膚或護髮;以及一種該組合物在紡織業中的用途。
本發明還涉及一種香氛釋放組合物作為除臭劑/組合物的用途。
本發明的內容涉及香氛(fragrance)/蛋白質複合物的製造方法以及天然氣味結合蛋白(odorant-binding protein, OBP-I),特別是豬OBP-I,以及與GQ
20及KP肽融合的天然蛋白質的吸附及解離機制 。此機制涉及釋放活性劑,較佳地是氣味分子(或香氛),以響應人類的汗水。
本發明在紡織以及化妝品領域具有重要影響,特別是在從乳液(lotion)以及霜(cream)基產品以及紡織織物中釋放香氛方面,提供了一種綠色解決方案。
在一實施例中,所產生的氣味結合蛋白以及香氛/蛋白複合物在不同溶劑(如甲醇、丁醇、苯及十一醇)、不同溫度範圍(18至60°C)以及不同 pH 值範圍 (4.0至10.0)非常易溶且穩定(12、27-29)。
在進一步的實施例中,氣味分子與OBP-1或OBP::GQ
20::KP蛋白的混合物在緩衝溶液以及汗液中顯示出關於親和常數的改進結果(表2)。特別地,當汗液引發反應時,汗液中較低的Ka會強制使用OBP蛋白。值得注意的是,蛋白質的吸附以及解離機制是可逆的。與其他基於豬氣味結合蛋白的融合蛋白相比,響應人類在不同pH值範圍(pH 4.0至8.5)下的排汗,本發明的蛋白質釋放超過 20倍至6.8倍(分別為 OBP-1及OBP::GQ
20::KP)的氣味分子(表 2)。因此,香氛的釋放發生在汗水的反應中,並且它與每個人的汗水的 pH 值無關。 此外,香氛的釋放至少在 0.5至24 小時內發生。
在一實施例中,多種活性劑,包括除臭劑、天然香精、香氛、保濕劑或它們的混合物,可用於複合物的形成,允許廣泛的化妝品用途。特別地,令人愉快的氣味分子(不同大小及形狀)對氣味結合蛋白,特別是豬氣味結合蛋白表現出極大的親和力。
在一實施例中,本發明中使用的氣味分子屬於不同的官能基(芳香族、醛類、醇類)。在進一步的實施例中,氣味分子包括分子量在20,00至1000,00 克/莫耳(g/mol)範圍內的分子,並且濃度在0.2至2000微莫耳濃度(µM)之間變化。
在一實施例中,氣味分子具有75至300 g/mol的分子量。
在一實施例中,該系統有效地響應人類的排汗,隨著時間釋放香氛。重要的是,該系統對人體中存在的水沒有反應,從而使本發明內容中提出的主題具有特異性及穩健性。倘若沒有這種選擇性,即若系統對水有反應,當與皮膚接觸時,OBP蛋白會立即釋放氣味分子。
實施例:
在一實施例中,天然豬氣味結合蛋白(OBP-I)、與間隔基甘胺酸-麩醯胺酸(spacer glycine-glutamine)融合,重複20x(GQ
20),以及與碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding module, CBM)(OBP::GQ
20::CBM)融合的OBP-I被克隆到質粒pET28a中,並轉化到大腸桿菌 BL21(DE3)中。 蛋白質通過鎳磁珠表達及純化,且對蛋白質 N 端存在的 His標籤具有特異性。在還原條件下,將 10 µM 蛋白質加載到十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺(SDS-PAGE)凝膠電泳上。相同的濃度用於通過圓二色性 (CD)光譜確定蛋白質的結構。
在實驗室純化的蛋白質顯示出高純度(通過SDS-PAGE凝膠觀察,第1圖中的A)以及桶(barrel)中的二級結構,這是存在大量β折疊的結果,如通過分析圓二色性光譜(第1圖中的B)。
在一實施例中,將純氣味結合蛋白凍乾,並用於進一步的程序中。為了確定氣味結合蛋白對氣味分子的親和力,使用1-氨基蒽(1-AMA)作為一氣味模型分子。將濃度增加的螢光配體模型1-氨基蒽(1-AMA)添加到 1 µM蛋白質中,並在 37°C下1小時之後通過 481 nm 的螢光發射(在295 nm處激發)量化配體/蛋白質複合物的形成(30)。解離常數 (Kd)由螢光強度與配體的濃度的關係圖確定,使用在Malpeli等人(1998)中描述的標準非線性回歸方法(standard non-linear regression method)獲得(31)。蛋白質在汗液存在下的親和行為是通過一競爭性螢光測定(competitive fluorescence assay)進行的。在這裡,1 µM的蛋白質與2 µM的1-AMA混合,並在 37°C下溫育1小時。在這段時間之後,將增加體積的汗液添加到複合物中,並在相同條件下進行溫育。
在一實施例中,如AATCC方法15-2009「耐汗漬色牢度(Colorfastness to Perspiration)」中所示來製備汗液溶液。製備的溶液的pH值在 4.0至8.5之間變化。根據其組成,汗液也被視為電解質溶液。
在另一個實施例中,記錄在481 nm處的螢光發射(在295nm處激發)以及計算解離常數(Kd)。結合常數(Ka)由公式 Kd=1/Ka進行計算。
在一個實施例中,香氛的釋放通過氣相色譜法–質譜法聯用(Gas chromatography–mass spectrometry, GC-MS)進行定量。在不同的小瓶(vial)中使用了更高濃度的香氛,並且頂部空間(headspace)中的香氛通過校準曲線(峰面積與香料濃度)進行量化。香氛與氣味結合蛋白在 37°C 下進行溫育。添加汗液並在汗液暴露幾個時間段(0.5至24 小時)後測定香氛的釋放。
在一實施例中,作為比較數據,豬氣味結合蛋白與一間隔基GQ
20以及一碳水化合物結合模塊(CBM)融合,如先前所報導的(25)。 透過融合糞堿纖維單胞菌(
Cellulomonas fimi)的內切葡聚醣酶C的CBM
N1(PDB ID 1ULP),OBP對棉花有特殊的親和力。修飾的蛋白質顯示出一高結合常數(association constant)(Ka=4.17±0.05 µM),當添加汗液溶液時,該高結合常數的Ka下降=3.16 ± 0.02 µM。天然OBP-I(SEQ ID NO: 1)以及OBP::GQ
20::KP(SEQ ID NO:21)顯示出的一結合常數(Ka=4.00±0.03 µM)與OBP::GQ
20::CBM(SEQ ID NO:22, Ka=4.17±0.05)得到的值非常相似。然而,汗液溶液的添加對天然蛋白質(Ka=0.20±0.02 µM)以及OBP::GQ
20::KP(Ka=0.59±0.01 µM)的親和力常數有顯著影響。與使用 CBM(SEQ ID NO:22)融合的蛋白質的定量的值相比,觀察到親和力的高度降低,其中使用天然OBP(SEQ ID NO:1)降低20倍,使用 OBP::GQ
20::KP(SEQ ID NO:21)降低6.8倍,其中僅驗證了1.3倍的減少(Ka=3.16±0.02,表2)。因此,OBP-I 與 KP 融合的 OBP 釋放的香氛在汗水的反應中很明顯。
[表 2]天然OBP-1(SEQ ID NO:1)以及基於OBP的融合蛋白,SEQ ID NO:21以及 SEQ ID NO:22的親和常數 (Ka)。SEQ ID NO:22作為比較數據。 數值是 37°C下的2次獨立實驗的平均值。
| 蛋白質 | 緩衝液中的Ka(µM) | 汗液中的 Ka(µM) |
| 天然豬OBP (OBP-I)–SEQ ID NO:1 | 4.00 ± 0.03 | 0.20 ± 0.02 |
| OBP::GQ 20::KP–SEQ ID NO:21 | 4.00 ± 0.04 | 0.59 ± 0.01 |
| OBP::GQ 20::CBM (融合蛋白) 25–SEQ ID NO:22 | 4.17 ± 0.05 | 3.16 ± 0.02 |
在一實施例中,以下蛋白質序列可以摻入不同的基材中,以在汗液存在下釋放香氛。 在這方面,基材可選自於包括紡織品(textile)、織物(fabric)、護膚產品及護髮產品等組成的一列表。
蛋白質序列列表:
蛋白質的序列由胺基酸的一個字母代碼描述。代碼如下:
| 一字代碼 | 胺基酸 |
| A | 丙胺酸(Alanine) |
| C | 半胱胺酸(Cysteine) |
| D | 天門冬胺酸(Aspartic acid) |
| E | 麩胺酸(Glutamic acid) |
| F | 苯丙胺酸(Phenylalanine) |
| G | 甘胺酸(Glycine) |
| H | 組胺酸(Histidine) |
| I | 異白胺酸(Isoleucine) |
| K | 離胺酸(Lysine) |
| L | 白胺酸(Leucine) |
| M | 甲硫胺酸(Methionine) |
| N | 天門冬醯胺(Asparagine) |
| P | 脯胺酸(Proline) |
| Q | 麩醯胺酸(Glutamine) |
| R | 精胺酸(Arginine) |
| S | 絲胺酸(Serine) |
| T | 蘇胺酸(Threonine) |
| V | 纈胺酸(Valine) |
| W | 色胺酸(Tryptophan) |
| Y | 酪胺酸(Tyrosine) |
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(31) 細胞視黃醇結合蛋白的純化和螢光滴定;《在分子生物學方法中》(Malpeli, G.; Folli, C.; Cavazzini, D.; Sartori, G.; Berti, R. Purification and Fluorescent Titration of Cellular Retinol-Binding Protein. In Methods in Molecular Biology; Redfern, C. P. F., Ed.; 1998; pp 111-122);
(32) 葉酸靶向脂質體遞送的肽錨定物;《生物大分子》(Nogueira, E.; Mangialavori, I. C.; Loureiro, A.; Azoia, N. G.; Sárria, M. P.; Nogueira, P.; Freitas, J.; Harmark, J.; Shimanovich, U.; Rollet, A.; Lacroix, G.; Bernardes, G. J. L.; Guebitz, G.; Hebert, H.; Moreira, A.; Carmo, A. M.; Rossi, J. P. F. C.; Gomes, A. C.; Preto, A.; Cavaco-Paulo, A. Peptide anchor for folate-targeted liposomal delivery. Biomacromolecules 2015, 16 (9), 2904-2910, DOI: 10.1021/acs.biomac.5b00823);
(33) 鄰近氣味結合蛋白驅動1-氨基蒽進入脂質體;《美國化學學會應用材料與界面》(Gonçalves, F.; Silva, C.; Ribeiro, A.; Cavaco-Paulo, A. 1-Aminoanthracene Transduction into Liposomes Driven by Odorant-Binding Protein Proximity. ACS Applied Materials & Interfaces 2018, DOI: 10.1021/acsami.8b10158);
(34)對1-氨基蒽具有相反溫度依賴性親和力的兩個工程化氣味結合蛋白;《科學報告》(Goncalves, F.; Castro, T. G.; Azoia, N. G.; Ribeiro, A.; Silva, C.; Cavaco-Paulo, A. Two Engineered OBPs with opposite temperature-dependent affinities towards 1-aminoanthracene. Scientific reports 2018, 8 (1), 14844, DOI: 10.1038/s41598-018-33085-8)。
以下附圖提供了用於說明本公開的優選的實施例,並且不應被視為限製本發明的範圍。
第1圖:天然豬氣味結合蛋白在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺(SDS-PAGE)凝膠電泳(A)以及圓二色性(CD)光譜(B)的示意圖。Mw:Precision Plus Protein
TM標準品(BioRad)。
序列表
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Asn Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Phe Val Val Ser Tyr Ala Ser Glu Thr
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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65 70 75 80
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Ala Ile Met Ala Asp Asn Ile Asp Lys Ile Glu Thr Ser Gly Pro Leu
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Leu Met Glu Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Asp Leu Ser Ser Asp Ile Lys
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65 70 75 80
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Gly Asp Lys Thr Phe Gln Leu Met Glu Phe Tyr Gly Arg Lys Pro Asp
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Gly Ile Ile Lys Glu Asn Ile Ile Asp Leu Thr Lys Ile Asp Arg Cys
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Tyr Ala Gly Gly Asn Tyr His Gln Ile Leu Asp Val Thr Pro Asn Ala
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Leu Ile Gly Tyr Ile Val Asn Val Asp Asp Lys Gly Arg Ile Thr Lys
115 120 125
Leu Ala Ser Leu Val Gly Arg Gly Ala His Val Asn Glu Glu Asp Ile
130 135 140
Ala Lys Phe Lys Lys Leu Ser Arg Glu Lys Gly Ile Pro Glu Glu Asn
145 150 155 160
Ile Ile Tyr Leu Gly Asp Thr Asp Asn Cys Pro Asn His Glu
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Thr Ser Tyr Ile Gly Ser Ser Asp Leu Glu Lys Ile Gly Glu Asn Ala
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Gln Ile Ala Phe Gln Leu Gly Gly Phe Ser Ala Asp Ala Trp Thr Leu
325 330 335
Cys Leu Asp Asp Val Ala Leu Asp Ser Glu Val Glu Leu
340 345
Claims (22)
- 一種香氛釋放組合物,包含: 0.01至5000微莫耳濃度的一分離或人工的蛋白質,該蛋白質與選自於以下列表的一胺基酸序列具有至少 90%的一致性:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID:NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或其混合;以及 0.1微莫耳濃度至2莫耳濃度的一活性劑,選自於包括一除臭劑、一天然香精、一香氛、一保濕劑或其混合物的一列表, 其中,該活性劑結合及/或包埋至該蛋白質; 在10至70°C的一溫度下,在一電解質溶液的存在下該蛋白質釋放該活性劑; 該活性劑的一分子量為20至1000克/莫耳;以及 該電解質溶液是汗液、鹽水或膠束水。
- 如請求項1所述之除臭劑釋放組合物,其中該蛋白質與選自於以下列表的一胺基酸序列具有至少 95%的一致性:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID:NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或其混合。
- 如前述權利要求中任一項所述之除臭劑釋放組合物,其中該蛋白質與選自於以下列表的一胺基酸序列相同:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID:NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或其混合。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該活性劑為0.2微莫耳濃度至1莫耳濃度。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中在水或一緩衝溶液中,該蛋白質對該活性劑的親和常數為1至4.5微莫耳濃度。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中在該電解質溶液中,該蛋白質對該活性劑的親和常數為0.1至0.99微莫耳濃度。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該活性劑的一分子量為75至300克/莫耳。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該活性劑是一香氛分子。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該活性劑包括一官能基,該官能基選自於芳香族、醛或醇。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該活性劑是選自於包括以下各項的一列表的一香氛分子:2-乙醯基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline)、α-萜品醇(α-terpineol)、β-羅勒烯(β-ocimene)、乙酸芐酯(benzyl acetate)、乙酸正丁酯(butyl acetate)、樟腦(camphor)、香芹酮(carvone)、檸檬醛(citral)、香茅醇(citronellol)、香豆素(coumarin)、丁二酮(diacetyl)、丁香油酚(eugenol)、果酮(fructone)、γ-癸內酯(gamma decalactone)、γ-壬內酯(gamma nonalactone)、香葉醇(geraniol)、希蒂鶯(hedione)、乙酸異戊酯(isoamyl acetate) 、丁香醛(lilac aldehyde)、檸烯(limonene)、芳樟醇(linalool)、玫瑰花醇(mefrosol)、薄荷醇(menthol)、丁酸甲酯(methyl butyrate)、月桂烯(myrcene)、蒎烯(pinene)、波馬玫瑰酮(pomarose)、胡薄荷酮(pulegone)、合成檀香(sandalore)、香草醛(vanillin)或其混合物。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該活性劑的釋放發生在30秒至24小時期間。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該電解質溶液的一pH在4.0至8.5之間。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該汗液是人的汗液或寵物的汗液。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該蛋白質在極性溶劑及非極性溶劑中穩定,並且較佳地為甲醇、乙醇、丁醇、苯及十一醇。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該蛋白質在18至70℃之間的溫度下是穩定的。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該蛋白質在4.0至10.0之間的一pH範圍內是穩定的。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該活性劑從該蛋白質的釋放發生在20至40℃。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該組合物還包含:甘油、赤蘚醇(erythritol)、阿糖醇(arabitol)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、木糖醇(xylitol)、葡萄糖基苷(glucosylglycerol)、葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、蔗糖(sucrose)、海藻糖(trehalose)、異氟代苷(isofluoroside)、右旋糖酐(dextrans)、果聚醣(levans)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、氯化物鹽(salts of chloride)、檸檬酸鹽 (citrate)、硫酸鹽(sulfates,)、醋酸鹽(acetate)或磷酸鹽(phosphates)、或其混合物。
- 一種如前述權利要求中任一項所述的組合物作為化妝品/組合物的用途。
- 一種如前述權利要求中任一項所述的組合物作為除臭劑/組合物的用途。
- 一種包含如前述權利要求中任一項所述的組合物的套組或製品。
- 如前述權利要求中任一項所述的組合物,其中該製品選自於包括以下各項所組成的一列表:織物、紡織品、纖維、衣服、圍巾、帽子、手套、襪子、頭巾、鞋、鞋墊、袋子、手提包、洗滌劑、霜、乳液、泡沫、香水、柔軟劑、氣膠、除臭劑、口紅、唇膏、面膜粉、面霜、身體霜、皮膚淨化劑、妝前底霜、粉底、睫毛膏、洗髮劑、護髮素、髮膜、護髮素或染髮膏。
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