TW202207970A - Ｉｌ－２融合多肽組成物及其製造與使用方法（一） - Google Patents

Abstract

本文係提供包括多肽的組成物以及製造和使用此等組成物的方法，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)。

Description

IL-2融合多肽組成物及其製造與使用方法(一)

相關申請案之交互參照

本申請案係主張2020年5月11日申請的美國臨時申請案序號63/022,853的利益，其全部的揭示文係以引用的方式併入本文中。

本揭示文係關於包括多肽的組成物以及製造和使用此等組成物的方法，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)。

包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)[介白素-2(IL-2)介白素-2受體α(IL-2Rα)]之多肽在做為抗癌劑上大有可為。這些多肽保留了經由表現在記憶CD8+ T細胞和天然殺手(NK)細胞上的中度-親和力IL-2R複合物之完全訊號傳遞能力，但在空間上防阻與優勢表現在CD4+ FOXP3+調節T細胞(CD4+ Tregs)和內皮細胞上之高親和力IL-2R複合物相結合。由於該選擇性的IL-2R結合，此多肽選擇性活化了CD8+ T細胞和NK細胞，藉藉此提升了腫瘤細胞的殺滅。失去活化內皮細胞上高親和力IL-2R的能力亦可降低由於毛細血管滲漏症候群所導致之毒性風險(一種已知的IL-2治療風險)。

當用於治療人類對象時，前述的多肽在使用前必須經儲存並運送至給藥的點。在一對象中重複達到所欲的多肽量需要將該多肽儲存於維持該多肽生物活性的調配物中。因此，安定的多肽組成物在本項技術為需要的。較佳地，此等組成物將具有長的保存期限，且在儲存和運送時為安定的。

本揭示文係提供包括多肽的組成物以及製造和使用此等組成物的方法，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)。這些組成物係經特別調配用以提升包含在其中之多肽的安定性和保存期限。

在一方面，本揭示文係提供一組成物，其係包括： a)約1 mg至約50 mg的多肽，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組IL-2； b)蔗糖； c)檸檬酸鹽緩衝劑；及 d)聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該多肽係包括與SEQ ID NO: 1具有至少95%相同性的胺基酸。在特定的具體實例中，該多肽係包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在特定的具體實例中，該多肽係由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列所組成。

在特定的具體實例中，該組成物係包括約100 mg至約120 mg蔗糖。在特定的具體實例中，該組成物係包括約110 mg蔗糖。

在特定的具體實例中，該組成物係包括約4.0 mg至約6.0 mg的檸檬酸鹽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約5.0 mg檸檬酸鹽。在特定的具體實例中，該檸檬酸鹽緩衝劑係由2.03 mg/mL檸檬酸三鈉二水合物和0.97 mg/mL檸檬酸單水合物於水溶液中混合所形成。在特定的具體實例中，該檸檬酸鹽緩衝劑係由2.91 mg/mL檸檬酸三鈉二水合物和0.34 mg/mL檸檬酸單水合物於水溶液中混合所形成。

在特定的具體實例中，該組成物係包括介於約1：10至約1：2(亦即，約1：10，約1：9，約1：8，約1：7，約1：6，約1：5，約1：4，約1：3和約1：2)之檸檬酸：檸檬酸三鈉二水合物質量比的檸檬酸和檸檬酸三鈉二水合物。在特定的具體實例中，該組成物係包括約1：9之檸檬酸：檸檬酸三鈉二水合物質量比的檸檬酸和檸檬酸三鈉二水合物。在特定的具體實例中，該組成物係包括約1：2之檸檬酸和檸檬酸三鈉二水合物質量比的檸檬酸：檸檬酸三鈉二水合物。

在特定的具體實例中，該組成物係包括約0.20 mg至約0.24 mg聚山梨醇酯20。在特定的具體實例中，該組成物係包括約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該組成物係包括約2.2 mg的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約11 mg的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約33 mg的多肽。

在特定的具體實例中，該組成物為冷凍乾燥的餅塊。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生具有pH約5.5至約6.5之水溶液。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生具有pH約6.1之水溶液。

在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生具有約160至約230 mOsm/kg滲透壓的水溶液。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生具有約179 mOsm/kg滲透壓的水溶液。

在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係溶於氯化鈉溶液中產生具有約240至約340 mOsm/kg滲透壓的水溶液。

在特定的具體實例中，該水溶液進一步係以水或氯化鈉溶液稀釋。

在特定的具體實例中，該水溶液係包括約0.03 mg/mL的多肽至約0.2 mg/mL的多肽。

在特定的具體實例中，該組成物為水溶液。

在特定的具體實例中，該組成物為一包括2.2 mg多肽的2.2 ml水溶液。在特定的具體實例中，該組成物為一包括11 mg多肽的2.2 ml水溶液。在特定的具體實例中，該組成物為一包括33 mg多肽的2.2 ml水溶液。在特定的具體實例中，該組成物為一包括44 mg多肽的2.2 ml水溶液。

在特定的具體實例中，溶液的pH為約6.1。

在特定的具體實例中，該組成物為單一單位劑量的多肽。

在一方面，本揭示文係提供一組成物，其係包括： a)       約1 mg至約50 mg (例如，約2、11或33 mg)的多肽，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組IL-2； b)       約100 mg至約120 mg蔗糖； c)       約4.0 mg至約6.0 mg的檸檬酸陰離子；及 d)       約0.20 mg至約0.24 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該多肽係包括與SEQ ID NO：1具有至少95%相同性的胺基酸。在特定的具體實例中，該多肽係包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列。

在特定的具體實例中，該組成物係包括約110 mg蔗糖。在特定的具體實例中，該組成物係包括約5.0 mg 檸檬酸陰離子。在特定的具體實例中，該組成物係包括約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該組成物係包括約2.2 mg的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約11 mg的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約33 mg的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約44 mg的多肽。

在特定的具體實例中，該組成物為冷凍乾燥的餅塊。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係包括： a)               約2.2 mg之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)               約110 mg蔗糖； c)               約5.0 mg 的檸檬酸陰離子；及 d)               約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係包括： a)               約11 mg之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)               約110 mg蔗糖； c)               約5.0 mg的檸檬酸陰離子；及 d)               約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的餅塊係包括： a)               約33 mg之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)               約110 mg蔗糖； c)               約5.0 mg的檸檬酸陰離子；及 d)               約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該組成物為水溶液。在特定的具體實例中，該組成物為2.2 ml水溶液，其係包括： a)               約2.2 mg之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)               約110 mg蔗糖； c)               約5.0 mg的檸檬酸陰離子；及 d)               約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該組成物為2.2 ml水溶液，其係包括： a)               約11 mg之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)               約110 mg蔗糖； c)               約5.0 mg的檸檬酸陰離子；及 d)               約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，該組成物為2.2 ml水溶液，其係包括： a)               約33 mg之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)               約110 mg蔗糖； c)               約5.0 mg的檸檬酸陰離子；及 d)               約0.22 mg聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，水溶液的pH為約6.1。

在特定的具體實例中，該組成物為單一單位劑量的多肽。

在另外方面，本揭示文係提供一水性組成物，其係包括： a)        約1 mg/mL至約20 mg/mL的多肽，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組IL-2； b)       約45 mg/mL至約55 mg/mL蔗糖； c)        約10 mM至約20 mM(例如，約10 mM至約13 mM)檸檬酸鹽；及 d)       約0.09 mg/mL至約1.1 mg/mL聚山梨醇酯20， 其中溶液的pH為約5.5至約6.5。

在特定的具體實例中，該多肽係包括與SEQ ID NO: 1具有至少95%相同性的胺基酸。在特定的具體實例中，該多肽係包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列。

在特定的具體實例中，該水性組成物係包括約50 mg/mL蔗糖。在特定的具體實例中，該水性組成物係包括約12 mM檸檬酸鹽。

在特定的具體實例中，該水性組成物係包括約0.1 mg/mL聚山梨醇酯20。在特定的具體實例中，該水性組成物係具有pH約6.1。

在特定的具體實例中，該組成物係包括約1 mg/mL的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約5 mg/mL的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約15 mg/mL的多肽。在特定的具體實例中，該組成物係包括約20 mg/mL的多肽。

在另外方面本揭示文係提供一水性組成物，其係包括： a)約1、5或15 mg/mL之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)約50 mg/mL至約55 mg/mL蔗糖； c)約12 mM檸檬酸鹽緩衝劑；及 d)約0.1mg/mL聚山梨醇酯20， 其中組成物的pH為約6.1。

在特定的具體實例中，該水性組成物係包括： a)        約1 mg/mL之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)       約50 mg/mL蔗糖； c)        約12 mM (例如，11.95 mM)檸檬酸鹽；及 d)       約0.1 mg/mL聚山梨醇酯20， 其中該溶液的pH為約6.1。

在特定的具體實例中，該水性組成物係包括： a)        約5 mg/mL之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)       約50 mg/mL蔗糖； c)        約12 mM (例如，11.95 mM)檸檬酸鹽；及 d)       約0.1 mg/mL聚山梨醇酯20， 其中該溶液的pH為約6.1。

在特定的具體實例中，該水性組成物係包括： a)        約15 mg/mL之包括SEQ ID NO：1胺基酸序列的多肽； b)       約50 mg/mL蔗糖； c)        約12 mM(例如，11.95 mM) 檸檬酸鹽；及 d)       約0.1 mg/mL聚山梨醇酯20， 其中該溶液的pH為約6.1。

在另外方面，本揭示文係提供包括任何前述組成物之製品。在特定的具體實例中，該製品為玻璃小瓶。

在另外方面，本揭示文係提供藉由冷凍乾燥任何前述水溶液所製造的凍乾組成物。

在另外方面，本揭示文係提供製造冷凍乾燥的組成物之方法，該方法係包括將任何前述水溶液冷凍乾燥。

在另外方面，本揭示文係提供製造水性組成物的方法，該方法係包括將任何前述冷凍乾燥的組成物溶於水性溶劑。

在特定的具體實例中，該水性溶劑為注射用水。在特定的具體實例中，該水性溶劑為氯化鈉溶液。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.1% NaCl至約0.5% NaCl。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.12% NaCl至約0.41% NaCl。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.02 M NaCl至約0.07 M NaCl。在特定的具體實例中，該水性組成物係包括約240至約340 mOsm/kg的滲透壓。

在特定的具體實例中，該水性組成物的pH係調整至約6.1。在特定的具體實例中，該水性組成物的pH係以鹼調整至約6.1。在特定的具體實例中，該鹼為氫氧化鈉。

在特定的具體實例中，該水性組成物進一步係以包括約1% (w/w)界面活性劑的水溶液稀釋。在特定的具體實例中，該界面活性劑為聚山梨醇酯20。在特定的具體實例中，該水性組成物進一步係包括約0.1% (w/w)檸檬酸單水合物，0.2% (w/w)檸檬酸三鈉二水合物和98.7% (w/w)注射用水。

在特定的具體實例中，該組成物係包括一醫藥組成物。

在另外方面，本揭示文係提供活化一對象中的天然殺手(NK)細胞之方法，該方法係包括投予該對象一有效量的任何前述組成物。

在另外方面，本揭示文係提供於一有此需要的對象中治療癌症的方法，該方法係包括投予該對象一有效量的任何前述組成物。在特定的具體實例中，該癌症為腎細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌或肺癌。在特定的具體實例中，該癌症係包括難治性實體腫瘤。

文中係提供包括多肽的組成物以及製造和使用此等組成物的方法，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組IL-2。

文中所揭示的調配物係提供包含在其中之多肽提升的安定性和保存期限。特言之，此多肽產品係保留生物活性，包括冷凍乾燥於所述的調配物中並以注射用水(WFI)或類似的可接受稀釋劑重建後。重要地，文中所述的調配物係經設計而得以讓冷凍乾燥的產物重建於WFI中，且對病患或醫療人員為容易取得。

文中所提供的調配物亦產生具有較佳外觀的冷凍乾燥的餅塊。特言之，該餅塊為完整的(非裂成碎片)，在容器中(例如，玻璃小瓶)幾乎無收縮並具有平整的凹面。選擇的定義

除非文中另有定義，否則文中所使用的科學和技術術語係具有本項技術一般技術者正常理解之意義。在任何潛在歧義的情況下，則文中所提供的定義係優先於任何辭典或外部定義。除非內容要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。除非另有指出，否則「或」之用法係指「及/或」。術語「包括」以及其他形式之用法，例如「包含」和「含有」並無限制。

如文中所用，術語「包括」、「包含」和「具有」及其文法上變化係用來指定所述的內容、整數、步驟或組成份，但並未排除加入一或多項其另外的內容、整數、步驟、組成份或群族。這些術語係涵蓋術語「由…組成」和「基本上由…組成」。

如文中所用，術語「環形序列重組」係指取一直鏈蛋白或其同源核酸序列並融合天然N-和C-端(使用蛋白或重組DNA法，直接或經由一連接子)形成一環形分子，及然後於不同的位置切開(打開)環形分子形成其中端點係與原有分子的端點不同的新直鏈蛋白或同源核酸分子之過程。環形序列重組因此係保存蛋白的序列、結構和功能，同時在不同位置產生新的C-和N-端，當相較於原來分子時，對於融合所欲的多肽融合伙伴產生提升的取向。

如文中所用，熟習本項技術之一般技術者應能了解術語「約」且在其使用的內容中將有某種程度上的變化。如文中所用，當指一可測量的數值，例如量、短暫持續時間等等，術語「約」係指涵蓋至高±5%的變化，包括與所指數值相比±5%，±1%和±0.1%，因此此等變化係適用於進行所揭示的方法。

如文中所用，術語「治療」係包括減少或緩和至少一種與所欲治療之狀態、病症或疾病有關或由其所造成之症候。

如文中所用，術語「有效量」在給予一對象治療的情況下係指治療的量達到所欲的預防或治療效用。

如文中所用，術語「病患」、「個體」或「對象」係指人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括，例如家畜和寵物，例如羊、牛、豬、狗、貓和鼠科哺乳動物。在特定的具體實例中，該對象為人類。IL-2 融合多肽

在一方面，本揭示文係提供一多肽之組成物，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)。用於文中所揭示的組成物中的多肽，相對於高親和力IL-2R複合物(包括IL-2Rα，IL-2Rβ和IL-2Rγ)，展現與中度親和力IL-2R複合物(包括IL-2Rβ和共用γ鏈，IL-2Rγ)優勢結合並作為中間親和力IL-2R複合物之選擇性拮抗劑。此等多肽之設計和產生係描述於美國專利第9,359,415號，該專利係以全文引用的方式併入本文中。

可用於包括在文中所揭示的組成物中之示例多肽係如下列SEQ ID. NO：1所述： SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG (SEQ ID NO：1)

因此，在特定的具體實例中，該多肽之胺基酸序列係包括SEQ ID. NO：1之胺基酸序列。在特定的具體實例中，該多肽之胺基酸序列係由SEQ ID. NO：1之胺基酸序列所組成。

熟習工作者應了解，SEQ ID. NO：1的胺基酸序列變體亦可用於文中所述的組成物中。例如，在特定的具體實例中，該多肽之胺基酸序列係包括或由與SEQ ID. NO：1胺基酸序列具有至少80% (例如，80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)相同性的胺基酸序列所組成。在特定的具體實例中，該多肽之胺基酸序列係包括或由與SEQ ID. NO：1胺基酸序列具有至少95%相同性的胺基酸序列所組成。

熟習工作者亦應了解，用於文中所述組成物中的多肽之胺基酸序列可經衍生化或修飾，例如peg化，醯胺化等。

在特定的具體實例中，調配物中多肽的量為約1 mg至約50 mg (例如，約1 mg，約2 mg，約3 mg，約4 mg，約5 mg，約6 mg，約7 mg，約8 mg，約9 mg，約10 mg，約11 mg，約12 mg，約13 mg，約14 mg，約15 mg，約16 mg，約17 mg，約18 mg，約19 mg，約20 mg，約25 mg，約30 mg，約33 mg，約40 mg，約44 mg，約45 mg或約50 mg)。在特定的具體實例中，多肽的量為約2.2 mg。在特定的具體實例中，多肽的量為約11 mg。在特定的具體實例中，多肽的量為約33 mg。在特定的具體實例中，多肽的量為約44 mg。

在特定的具體實例中，水性調配物中多肽的濃度為約1 mg/mL至約50 mg/mL。在特定的具體實例中，多肽的濃度為約1 mg/mL至約20 mg/mL(例如，約1 mg/mL，約2 mg/mL，約3 mg/mL，約4 mg/mL，約5 mg/mL，約6 mg/mL，約7 mg/mL，約8 mg/mL，約9 mg/mL，約10 mg/mL，約11 mg/mL，約12 mg/mL，約13 mg/mL，約14 mg/mL，約15 mg/mL，約16 mg/mL，約17 mg/mL，約18 mg/mL，約19 mg/mL，約20 mg/mL，約25 mg/mL，約30 mg/mL，約35 mg/mL，約40 mg/mL，約45 mg/mL或約50 mg/mL)。在特定的具體實例中，多肽的濃度為約1 mg/mL。在特定的具體實例中，多肽的濃度為約5 mg/mL。在特定的具體實例中，多肽的濃度為約15 mg/mL。在特定的具體實例中，多肽的濃度為約20 mg/mL。

在特定的具體實例中，水性調配物進一步係以水或氯化鈉溶液稀釋，藉此降低調配物中多肽的濃度。在特定的具體實例中，該水溶液係包括約0.03 mg/mL的多肽至約0.2 mg/mL的多肽(例如，約0.03 mg/mL，約0.04 mg/mL，約0.05 mg/mL，約0.06 mg/mL，約0.07 mg/mL，約0.08 mg/mL，約0.09 mg/mL，約0.10 mg/mL，約0.11 mg/mL，約0.12 mg/mL，約0.13 mg/mL，約0.14 mg/mL，約0.15 mg/mL，約0.16 mg/mL，約0.17 mg/mL，約0.18 mg/mL，約0.19 mg/mL或約0.2 mg/mL)。

在特定的具體實例中，水性調配物進一步係以包括約1% (w/w)界面活性劑的水溶液稀釋。在特定的具體實例中，該界面活性劑為聚山梨醇酯20。在特定的具體實例中，該水溶液進一步係包括約0.1%(w/w)檸檬酸單水合物，0.2% (w/w)檸檬酸三鈉二水合物和98.7% (w/w)注射用水。賦形劑 & 緩衝劑

在特定的具體實例中，文中所揭示的組成物係包括一或更多的賦形劑及/或緩衝劑。

如文中所用，術語「賦形劑」係指任何加入組成物或調配物中用以提供所欲的稠度、黏度或安定效用之非治療性試劑。用於文中所揭示的組成物之適合的賦形劑可供作為，例如增黏劑、安定劑、增溶劑等。賦形劑可為離子或非離子。適合的離子賦形劑包括鹽類，例如NaCl或胺基酸組份，例如精胺酸-HCl。適合的非離子賦形劑包括糖類，例如，單糖(例如，果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等)；雙糖(例如，乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等)；多糖(例如，棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、澱粉等)；及糖醇(例如，甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)等)。例如，此糖可為蔗糖、海藻糖、棉仔糖、麥芽糖、山梨醇或甘露醇。另外或另一種選擇，此糖可為糖醇或胺基糖。在特定的具體實例中，該糖為蔗糖。

在特定的具體實例中，調配物中賦形劑(例如，蔗糖)的量為約1 mg至約150 mg (例如，約1 mg，約10 mg，約20 mg，約30 mg，約40 mg，約50 mg，約60 mg，約70 mg，約80 mg，約90 mg，約100 mg，約110 mg，約120 mg，約130 mg，約140 mg或約150 mg)。在特定的具體實例中，調配物中賦形劑(例如，蔗糖)的量為約90 mg至約130 mg。在特定的具體實例中，調配物中賦形劑(例如，蔗糖)的量為約99 mg至約121 mg。在特定的具體實例中，調配物中賦形劑(例如，蔗糖)的量為約110 mg。

在特定的具體實例中，水性調配物中賦形劑(例如，蔗糖)的濃度為約1 mg/mL至約100 mg/mL(例如，約1 mg/mL，約10 mg/mL，約20 mg/mL，約30 mg/mL，約40 mg/mL，約45 mg/mL，約50 mg/mL，約55 mg/mL，約60 mg/mL，約70 mg/mL，約80 mg/mL，約90 mg/mL或約100 mg/mL)。在特定的具體實例中，賦形劑(例如，蔗糖)的濃度為約30 mg/mL至約70 mg/mL。在特定的具體實例中，賦形劑(例如，蔗糖)的濃度為約45 mg/mL至約55 mg/mL。在特定的具體實例中，賦形劑(例如，蔗糖)的濃度為約50 mg/mL。

適合用於文中所揭示的組成物之緩衝劑包括有機酸和鹽類，例如檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或酞酸的鹽類；Tris、三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽或磷酸鹽緩衝劑。此外，胺基酸組份亦可用作為緩衝劑。此等胺基酸組份包括甘胺酸、組胺酸和甲硫胺酸。在特定的具體實例中，該緩衝劑為檸檬酸鹽緩衝劑。如文中所用，術語「檸檬酸鹽緩衝劑」係指一利用檸檬酸離子之pH緩衝系統(水溶液或冷凍乾燥形式)。檸檬酸鹽緩衝劑可使用任何已知的方法來製造，包括，藉由將：(i)檸檬酸、檸檬酸三鈉二水合物和檸檬酸單水合物混合；或(ii)檸檬酸單水合物、磷酸氫二鈉和檸檬酸混合。在特定的具體實例中，檸檬酸鹽緩衝劑係使用檸檬酸鈉二水合物和檸檬酸所製作。

在特定的具體實例中，調配物中緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)的量為約1mg至約10 mg (例如，約1 mg，約2 mg，約3 mg，約4 mg，約5 mg，約6 mg，約7 mg，約8 mg，約9 mg，約10 mg)。在特定的具體實例中，緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)的量為約5.9 mg至約7.2 mg (例如，約5.9 mg，約6.0 mg，約6.1 mg，約6.2 mg，約6.3 mg，約6.4 mg，約6.5 mg，約6.6 mg，約6.7 mg，約6.8 mg，約6.9 mg，約7.0 mg，約7.1 mg或約7.2 mg)。在特定的具體實例中，緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)的量為約6.6 mg。在特定的具體實例中，緩衝劑中(例如，檸檬酸鹽)檸檬酸陰離子的量為約4.0 mg至約6.0 mg。在特定的具體實例中，緩衝劑中(例如，檸檬酸鹽)檸檬酸陰離子的量為約5.0 mg。

在特定的具體實例中，文中所揭示的水性調配物中緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)的濃度為約1 mM至約50 mM (例如，約1 mM，約2 mM，約3 mM，約4 mM，約5 mM，約6 mM，約7 mM，約8 mM，約9 mM，約10 mM，約11 mM，約12 mM，約13 mM，約14 mM，約15 mM，約16 mM，約17 mM，約18 mM，約19 mM，約20 mM，約25 mM，約30 mM，約35 mM，約40 mM，約45 mM或約50 mM)。在特定的具體實例中，緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)的濃度為約11 mM至約13 mM (例如，約11.1 mM、11.2 mM、11.3 mM、11.4 mM、11.5 mM、11.6 mM、11.7 mM、11.8 mM、11.9 mM、12.1 mM、12.2 mM、12.3 mM、12.4 mM、12.5 mM、12.6 mM、12.7 mM、12.8 mM或12.9 mM)。在特定的具體實例中，緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)的濃度為約12 mM。在特定的具體實例中，緩衝劑(例如，檸檬酸鹽)的濃度為約11.95 mM。在特定的具體實例中，該檸檬酸鹽緩衝劑係含有2.03 mg/mL(6.90 mM)檸檬酸三鈉二水合物和0.97 mg/mL(5.05 mM)檸檬酸。

在特定的具體實例中，文中所揭示的組成物係具有pH約5.0至約8.0，約5.5至約7.5，約5.0至約7.0，約6.0至約8.0，或約6.0至約7.0。在特定的具體實例中，該組成物係具有pH 約5.5至約6.5。在特定的具體實例中，該組成物係具有pH約5.8至約6.4。在特定的具體實例中，此組成物係具有pH約6.1。特定的具體實例中，該組成物的pH係調整至pH約6.1。在特定的具體實例中，係以鹼調整pH。在特定的具體實例中，該鹼為氫氧化物鹽，例如氫氧化鈉(NaOH)或氫氧化鉀(KOH)。在特定的具體實例中，該組成物為水性組成物且該水性組成物的pH係調整至pH約6.1。

如文中所用，術語「界面活性劑」係指具有兩親性結構的有機物質；亦即，其係由相反的溶解性傾向的基團所組成，典型地一油溶性烴鏈和一水溶性離子基團。依照表面活性基團的電荷，界面活性劑可分類為陰離子、陽離子和用於各種醫藥組成物及生物物質的製備物的分散劑。適合用於文中所揭示的組成物之界面活性劑包括非離子界面活性劑、離子界面活性劑和二性離子界面活性劑。本發明所用的典型界面活性劑包括山梨醇酐脂肪酸酯(例如，山梨醇酐單辛酸酯、山梨醇酐單月桂酸酯、山梨醇酐單棕櫚酸酯)，山梨醇酐三油酸酯、甘油脂肪酸酯(例如，甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯)，聚甘油脂肪酸酯(例如，十聚甘油單硬脂酸酯、十聚甘油二硬脂酸酯、十聚甘油單亞麻油酸酯)，聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐三油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯)，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯)，聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯)，聚乙二醇脂肪酸酯(例如，聚乙二醇二硬脂酸酯)，聚氧乙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚)，聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟醚)，聚氧乙烯烷基苯基醚(例如，聚氧乙烯壬基苯基醚)，聚氧乙烯氫化蓖麻油(例如，聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油)，聚氧乙烯蜂蠟衍生物(例如，聚氧乙烯山梨醇蜂蠟)，聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如，聚氧乙烯羊毛脂)，以及聚氧乙烯脂肪酸醯胺(例如，聚氧乙烯硬脂酸醯胺)；C10-C18烷基硫酸酯(例如，鯨蠟基硫酸酯鈉、月桂基硫酸酯鈉、油基硫酸酯鈉)，具有加入平均2至4莫耳的氧化乙烯單元之聚氧乙烯C10-C18烷基醚硫酸酯(例如，聚氧乙烯月桂基硫酸鈉)，和C1-C18烷基磺基琥珀酸酯鹽類(例如，月桂基磺基琥珀酸酯鈉)；及天然界面活性劑，例如卵磷脂、甘油磷脂、神經鞘磷脂類 (例如，髓磷脂)，和蔗糖的C12-C18脂肪酸酯。組成物可包括一或多種的這些界面活性劑。在特定的具體實例中，文中所揭示的組成物係包括聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，例如，聚山梨醇酯20、40、60或80。在特定的具體實例中，文中所揭示的組成物係包括聚山梨醇酯20。

在特定的具體實例中，調配物中界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.1 mg至約1 mg(例如，約0.1 mg，約0.15 mg，約0.2 mg，約0.25 mg，約0.3 mg，約0.35 mg，約0.4 mg，約0.45 mg，約0.5 mg，約0.55 mg，約0.6 mg，約0.65 mg，約0.7 mg，約0.75 mg，約0.8 mg，約0.85 mg，約0.9 mg，約0.95 mg或約1 mg)。在特定的具體實例中，界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.15 mg至約0.3 mg (例如，約0.16 mg，約0.17 mg，約0.18 mg，約0.19 mg，約0.21 mg，約0.22 mg，約0.23 mg，約0.24 mg，約0.26 mg，約0.27 mg，約0.28 mg或約0.29 mg)。在特定的具體實例中，界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.20 mg至約0.24 mg。在特定的具體實例中，水性調配物中界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.22 mg。

在特定的具體實例中，水性調配物中界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.01 mg/mL至約1 mg/mL (例如，約0.01 mg/mL，約0.1 mg/mL，約0.2 mg/mL，約0.3 mg/mL，約0.4 mg/mL，約0.5 mg/mL，約0.6 mg/mL，約0.7 mg/mL，約0.8 mg/mL，約0.9 mg/mL或約1 mg/mL)。在特定的具體實例中，界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.05 mg/mL至約0.15 mg/mL (例如，約0.05 mg/mL，約0.06 mg/mL，約0.07 mg/mL或約0.08 mg/mL約0.09 mg/mL，約0.1 mg/mL，約0.11 mg/mL，約0.12 mg/mL，約0.13 mg/mL，約0.14 mg/mL或約0.15 mg/mL,)。在特定的具體實例中，界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.09 mg/mL至約0.11 mg/mL。在特定的具體實例中，水性調配物中界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20)的濃度為約0.1 mg/mL。

熟習本項技術者應了解，組成物和本發明組成物的組份可以mg/mL以外的單位來描述。例如，組成物和本發明組成物的組份可以體積莫耳濃度之單位來描述。組成物和本發明組成物的組份可進一步以重量或質量百分比之單位來描述。冷凍乾燥

在一方面，本揭示文係提供冷凍乾燥的文中所述多肽之組成物(例如，凍乾餅塊)，以及製造彼等之方法。

冷凍乾燥一般係包括三個主要階段：冷凍、一次乾燥和二次乾燥。冷凍需要將水轉變成冰或某些非晶調配組份係轉變為晶體形式。一次乾燥為藉由於低壓和低溫直接昇華，從冷凍的產品中移除冰之程序步驟。二次乾燥為利用將殘餘水擴散至蒸發表面，從產品基質移除結合水之程序步驟。在二次乾燥期間產品的溫度一般係高於一次乾燥期間。參見，Tang X. et al. (2004) “Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals：Practical advice,” Pharm. Res., 21：191-200；Nail S.L. et al. (2002) “Fundamentals of freeze-drying,” in Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Nail SL editors. New York：Kluwer Academic/Plenum Publishers, pp 281-353；Wang et al. (2000) “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals,” M J Pharm., 203：1-60；Williams NA et al. (1984) “The lyophilization of pharmaceuticals；A literature review.” J. Parenteral Sci. Technol, 38：48-59；及WO 2010/148337 A1。

因為整個冷凍乾燥程序之溫度和壓力的變化，所以需要適當選擇賦形劑或其他組份，例如安定劑、緩衝劑、增量劑和界面活性劑，用以防止文中所述的多肽在冷凍乾燥和儲存期間降解(例如，蛋白聚集、去醯胺化及/或氧化)。文中所揭示的冷凍乾燥的組成物含有特別的組成份之組合，使得文中所揭示的多肽(其係包括與IL-2Rα鏈的胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2))得以安定的長期儲存。

在另外方面，本揭示文係提供藉由將任一文中所揭示的水性組成物冷凍乾燥所製造的冷凍乾燥的組成物，而該文中所揭示的水性組成物係包括與IL-2Rα鏈的胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的組成物為一冷凍乾燥的餅塊。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的組成物係藉由依循表2、表3或表4中所述的冷凍乾燥方法將任一文中所揭示的水性組成物冷凍乾燥製備。

在另外方面，本揭示文係提供製造冷凍乾燥的組成物之方法，該方法係包括將任一文中所揭示的水性組成物冷凍乾燥，而該文中所揭示的水性組成物係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)。在特定的具體實例中，製造冷凍乾燥的組成物的方法係包括依循表2、表3或表4中所述的冷凍乾燥方法。

在另外方面，本揭示文係提供製造水性組成物的方法，該方法係包括將任一文中所揭示的冷凍乾燥的組成物溶於水性溶劑中，而該文中所揭示的冷凍乾燥的組成物係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組介白素-2(IL-2)。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的組成物為凍乾的餅塊。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的組成物係溶於2.2 ml的水。在特定的具體實例中，該冷凍乾燥的組成物係溶於氯化鈉溶液。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.1% NaCl至約0.5% NaCl。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.12% NaCl至約0.41% NaCl。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.10%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%、0.17%、0.18%、0.19%、0.20%、0.21%、0.22%、0.23%、0.24%、0.25%、0.26%、0.27%、0.28%、0.29%、0.30%、0.31%、0.32%、0.33%、0.34%、0.35%、0.36%、0.37%、0.38%、0.39%、0.40%、0.41%、0.42%、0.43%、0.44%、0.45%、0.46%、0.47%、0.48%、0.49%或 0.50% NaCl。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.02 M NaCl至約0.07 M NaCl。在特定的具體實例中，該氯化鈉溶液係包括約0.02 M、0.03 M、0.04 M、0.05 M、0.06 M或0.07 M NaCl。在特定的具體實例中，當溶於氯化鈉溶液時，該水性組成物係包括約240至約340 mOsm/kg之滲透壓。在特定的具體實例中，溶於氯化鈉溶液的水性組成物可經由皮下給藥投予一病患。多肽組成物之用途

文中所揭示的組成物特別可用於治療、預防或改善任何與介白素2受體訊號傳遞有關的疾病或病症。

在一方面，係提供於一對象中活化天然殺手(NK)細胞的方法，該方法係包括投予該對象一有效量之任一文中所揭示的組成物，而該文中所揭示的組成物係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組IL-2。

在另外方面，係提供於一有此需要的對象中治療癌症的方法，該方法係包括投予該對象一有效量之任一文中所揭示的組成物，而該文中所揭示的組成物係包括與IL-2Rα鏈的胞外部分融合的環形序列重組IL-2。適合使用文中所揭示的組成物治療的癌症包括腎細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌和肺癌。在特定的具體實例中，該癌症係包括難治性實體腫瘤。

在特定的具體實例中，該組成物係由靜脈內給藥。

在特定的具體實例中，該組成物係以約1 µg/kg至約15 µg/kg的劑量由靜脈內給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約1 µg/kg，約2 µg/kg，約3 µg/kg，約4 µg/kg，約5 µg/kg，約6 µg/kg，約7 µg/kg，約8 µg/kg，約9 µg/kg，約10 µg/kg，約11 µg/kg，約12 µg/kg，約13 µg/kg，約14 µg/kg或約15 µg/kg的劑量由靜脈內給藥。

在特定的具體實例中，該組成物係每天由靜脈內給藥進行連續5天。

在特定的具體實例中，該組成物係每天由靜脈內給藥進行連續5天，接著連續9天無靜脈內給予該組成物。

在特定的具體實例中，該組成物係每天由靜脈內給藥進行連續5天，接著連續16天無靜脈內給予該組成物。

在特定的具體實例中，該組成物係1)包括每天由靜脈內給予該組成物進行連續5天，接著連續9天無靜脈內給予該組成物的第一周期；及2)包括每天由靜脈內給予該組成物進行連續5天，接著連續16天無靜脈內給予該組成物的第二周期來給藥。

在特定的具體實例中，該方法係包括至少一另外的給藥週期，其中各另外的週期係包括每天由靜脈內給予該組成物進行連續5天，接著連續16天無靜脈內給予該組成物。

在特定的具體實例中，該組成物係由皮下給藥。

在特定的具體實例中，該方法係包括由皮下投予包括約240至約340 mOsm/kg滲透壓之上述水性組成物。

在特定的具體實例中，該組成物係以約1 mg至約15 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約1 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約2 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約3 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約4 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約5 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約6 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約7 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約8 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約9 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約10 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約11 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約12 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約13 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約14 mg的劑量由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約15 mg的劑量由皮下給藥。

在特定的具體實例中，該組成物係每週一次(Q1W)，每二週一次(Q2W)或每三週一次(Q3W)由皮下給藥。

在特定的具體實例中，該組成物係以約1 mg至約15 mg的劑量每週一次(Q1W)，每二週一次(Q2W)或每三週一次(Q3W)由皮下給藥。

在特定的具體實例中，該組成物係以約3 mg的劑量每週一次(Q1W)由皮下給藥。在特定的具體實例中，該組成物係以約6 mg的劑量每三週一次(Q3W)由皮下給藥。

在特定的具體實例中，此黑色素瘤為黏膜黑色素瘤或晚期皮膚黑色素瘤其中之一或二者。

熟習本項技術者應容易明瞭，在不悖離文中所揭示的具體實例之範圍下，可使用適合的同等物就文中所述方法作其他適合的修改和調整。現在已詳細地描述特定具體實例，參照下列實例將能更清楚瞭解該等特定的具體實例，而下列具體實例僅就說明之目的納入且不希望受限。實例

本發明係以下列實例進一步說明，該等實例不應視為進一步的限制。除非另有指出，否則本發明之實現將應用本項技術內的習知有機合成、細胞生物學、細胞培養、分子生物學、基因轉殖生物學、微生物學和免疫學之技術。實例 1– 多肽組成物的設計和檢測

為了測定多肽A(一種包括SEQ ID NO：1胺基序列，與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組IL-2)之最佳調配物，係將數種多肽A的調配物就其對蛋白安定性、pH安定性、物化特性、冷凍乾燥的餅塊均勻度以及冷凍乾燥後對儲存小瓶之黏附阻抗性的效應進行檢測。下表1係敘述所檢測的各調配物之特定組份及其濃度。將不同的組成物進行其中一項下表2-4中所述的冷凍乾燥週期處理。 表1：多肽A調配物之組成份

組份	調配物 1	調配物 2	調配物 3
增量賦形劑(濃度)	蔗糖(50mg/mL)	甘露醇(50mg/mL)	蔗糖(50mg/mL)
緩衝劑(濃度)	甘胺酸(10mg/mL)	甘胺酸(10mg/mL)	組胺酸 (10mg/mL)
界面活性劑 (濃度)	聚山梨醇酯20 (0.1 mg/mL)	聚山梨醇酯20 (0.1 mg/mL)	聚山梨醇酯20 (0.1 mg/mL)
緩衝劑pH	5.9	5.7	6.5
密度	1.020 g/mL	1.021 g/mL	1.018 g/mL
過濾後pH	6.6	6.6	6.5
過濾後多肽A濃度	0.75 mg/mL	0.96 mg/mL	0.79 mg/mL
增量賦形劑(濃度)	蔗糖(50mg/mL)	無	蔗糖(50mg/mL)
緩衝劑(濃度)	檸檬酸鈉 (3 mg/mL)	琥珀酸 (40mg/mL)	甲硫胺酸 (10mg/mL)
界面活性劑 (濃度)	聚山梨醇酯20 (0.1 mg/mL)	聚山梨醇酯20 (0.1 mg/mL)	聚山梨醇酯20 (0.1 mg/mL)
緩衝劑pH	6.3	5.5	5.9
密度	1.015 g/mL	1.021 g/mL	1.011 g/mL
過濾後pH	6.1	5.4	6.3
過濾後多肽A濃度	1.03 mg/mL	1.00 mg/mL	0.85 mg/mL

表2：冷凍乾燥週期– 2 mg小瓶

區段	類型	溫度設定點(°C) (±5°C)	時間設定點(小時) (±0.5小時)	箱槽壓力設定點(µmHg) (± 20 µmHg)
1	保持	5	4.0	≤ 14.7 psia
2	斜坡溫度	-50	3.7	≤ 14.7 psia
3	保持	-50	7.0	≤ 14.7 psia
4	真空	-50		40
5	斜坡溫度	-28	0.7	40
6	保持	-28	60	40
7	斜坡溫度	25	3.5	40
8	保持	25	9	40
9	塞蓋	25		14.7 psia ± 0.7 psia

表3：冷凍乾燥週期–10 mg小瓶

區段	類型	溫度設定點(°C) (±5°C)	時間設定點(小時) (±0.5小時)	箱槽壓力設定點(µmHg) (± 20 µmHg)
1	保持	5	4.0	≤14.7 psia
2	斜坡溫度	-50	1.8	≤14.7 psia
3	保持	-50	4.0	≤14.7 psia
4	真空	-50		30
5	斜坡溫度	-28	0.7	30
6	保持	-28	66	30
7	斜坡溫度	25	3.5	30
8	保持	25	9	30
9	塞蓋	25		14.7 ± 0.7 psia

表4：冷凍乾燥週期–30 mg小瓶

區段	類型	溫度設定點(°C) (±5°C)	時間設定點(小時) (±0.5小時)	箱槽壓力設定點(µmHg) (± 20 µmHg)
1	保持	5	4.0	≤14.7 psia
2	斜坡溫度	-45	2.8	≤14.7 psia
3	保持	-45	4.0	≤14.7 psia
4	真空	-45		50
5	斜坡溫度	-25	0.8	50
6	保持	-25	66	50
7	斜坡溫度	30	3.1	50
8	保持	30	8	50
9	塞蓋	30		14.7 ± 0.7 psia

物化檢測

於低溫藉由測量電阻、進行冷凍乾燥顯微鏡檢查和進行示差掃描量熱法來定性調配物1-6中多肽A的物化特性。電阻

電阻係於20 mm玻璃樣本試管中大約1.8 mL的樣本上使用0至20 MΩ電阻儀和陶瓷盤上由二條平行黃金帶片所組成的陶磁電阻探針來測量。溫度係使用位於陶瓷探針在黃金帶片相反側的32-gauge T型熱電偶來測量。測量和記錄儀器係就整個用於分析的溫度範圍使用美國國家標準暨技術研究院(NIST)可追蹤參照標準進行校正。系統的準確性係使用標準參照溶液驗證。

使用標準方法，將物質以每分鐘0.5°C的平均控制速率冷卻及升溫評估其熱特性，以便建立物質特異性的相變。於大氣條件分析電阻樣本。在加溫後使用電阻偏差測定相變的發生。在整個分析期間使用Kaye Validator儀器以收集程式(Collect program)每10秒記錄溫度測量值。冷凍乾燥的顯微鏡檢查

將大約0.15 mL的溶液分散於玻璃槽中。然後將玻璃槽置於溫度控制的冷凍乾燥階段。將樣本槽裝配二個32-gauge T型熱電偶，其係直接放入物質底部以及玻璃槽中間用以監測樣本溫度。將液體樣本以每分鐘0.5°C的平均控制速率冷卻至-50°C或更低的目標設定點。在完全冷凍後，將階段箱槽抽真空用以啟動冰昇華。然後在昇華和乾燥期間，以每分鐘0.5°C的平均控制速率升溫。使用能放大16至330 X結合Super WDR CCD攝影機的Infinivar顯微鏡觀察樣本在冷凍和乾燥期間的行為特性。反映物質超過相變之觀察到的樣本冷凍乾燥部分變化係與樣本溫度相關。使用Kaye Validator儀器以收集程式在整個分析期間每10秒記錄溫度測量值。示差掃描量熱 法

將低溫示差掃描量熱法(LT DSC)和上述分析結合使用，做為冷凍和加溫期間供測定相變之評估物化特性的方法。LT DSC分析係依循當前的USP＜891＞並使用TA Instruments Q200 DSC來進行。TA Instruments Q200 DSC係以Refrigerated Cooling System來操作。試驗參數係使用TA Advantage software (v5.0.4)來執行。記錄掃描數據並使用TA Universal Analysis軟體(v4.5A)作圖。將樣本大小19.4 mg的溶液置於鋁製樣本盤中並將蓋子夾好。將氮，NF以50 ml/分鐘的流速連續通入樣本。依Lyophilization Technology, Inc.的校正程序校正儀器。在冷卻和加溫期間，樣本的放熱和吸熱係反映樣本經歷熱事件時之能量差。記錄熱能差供結果分析。物化特性定性結果

物化特性定性之結果顯示調配物4產生均勻表面的冷凍乾燥餅塊，其在倒置和震動後仍為完整，冷凍乾燥後有極少的殘餘物黏附在瓶側和瓶底，且具有最高的玻璃轉化性質。調配物4的結果優於所有其他的受試調配物。再者，其他的受試調配物就製造冷凍乾燥多肽A組成物，無法產生穩定的冷凍乾燥週期。安定性檢測

使用毛細管等電聚焦(cIEF)、粒徑排阻高效層析(HPLC)、SDS-PAGE和活性分析找出調配物1-6中多肽A的安定性特徵。毛細管等電聚焦 (cIEF)

使用cIEF測量受試調配物中存在的帶電變體。藉由以2.2 mL注射用水(WFI)重建樣本，製備藥品樣本。以目視檢查樣本確認內容物無可見粒子。藉由使用下列方程式計算下表所需之各試劑體積，藉由製備主混合液，製備用於分析的參照標準、樣本和空白試驗：「試劑的體積」=[(「n+2」)×「V」]其中：n =樣本數s；V =每個樣本之試劑體積(µL)(參見下表5)。 表5：用於cIEF分析的試劑混合物

試劑(200µL總體積)	V (µL/樣本)
1%甲基纖維素(0.35%最終濃度)	70
Pharmalytes 5-8(3%最終濃度)	6
Pharmalytes 3-10(1%最終濃度)	2
pI 5.12標記	0.5
pI 7.90 標記	0.5

於一適當大小的試管中加入所計算的試劑體積並渦漩混合。藉由將158 µL的主混合液轉置於1.5 mL微量離心試管及於試管中加入242 µL的WFI並緩和渦漩混合，製備空白試液。以如同空白試液相同的方式製備多肽A參照標準。就各樣本係藉由將79 µL的主混合物轉置於1.5 mL的試管製備樣本及將121 µL的樣本加到試管中並緩和渦漩混合。所使用的注射順序和分析條件係分別如表6和7中所述。就分析，係將介於pI標記間的所有波峰積分。藉由提報的pI和所有≥ 0.05%的波峰面積%，計算結果。 表6：用於cIEF分析的注射順序

樣本ID	注射數目
空白	1
多肽A參照標準	1
樣本	各1
多肽A參照標準	1
空白	1

表7：用於cIEF分析的分析條件

盤類型：	帶有4支沖洗小瓶的48小瓶托盤
盤溫：	5.0°C
聚焦期1：	1500 V進行1.00 min
聚焦期2：	3000 V進行7.00 min

粒徑排阻 HPLC

使用粒徑排阻HPLC測量受試調配物中的純度。藉由以2.2 mL WFI重建樣本，製備藥品樣本。目視檢查樣本用以確認內容物無可見粒子。分別使用下列分析條件和表8和9中所述的注射順序檢測參照標準、樣本和空白試液。 表8：用於HPLC分析的分析條件

移動相	50 mM磷酸鈉，200 mM NaCl，pH 7.2
運作時間	15分鐘
流速	1.0 mL/min
管柱	TSKgel G2000SWXL , 7.8 mm ID x 30 cm, 5 µm
管柱溫度	25°C ± 5°C
樣本溫度	5°C ± 3°C
偵測	280 nm之UV吸收度
注射體積	100 µL

表9：用於HPLC分析的注射順序

樣本ID	注射數目
移動相	1+
調配物緩衝劑空白試液	1
凝膠過濾標準(GFS)	1
多肽A參照標準	1
樣本	1
多肽A參照標準	1
凝膠過濾標準(GFS)	1

報告結果為面積%和所有大於0.05%面積之積分波峰的溶析時間。圖2和圖3係描繪各受試調配物的SEC波峰。以細胞為基礎的活性分析

藉由測量調配物與HH細胞(一種具有存在其表面之βγIL2受體同型的人類T淋巴細胞株)結合，評估各調配物中多肽A的活性。與各調配物接觸後，使用ELISA分析藉由測量存在HH細胞中磷酸化STAT5(磷酸-STAT5或pSTAT5)的量，測量多肽A結合。使用Invitrogen InstantOne ELISA磷酸-STAT5α/β(pTyr694/pTyr699)套組進行ELISA分析。

藉由以2.2 mL WFI重建樣本，製備藥品樣本。以目視檢查樣本，確認內容物無可見粒子。

藉由將25 mL的胎牛血清(FBS)加到500 mL的漢克平衡鹽溶液(HBSS)，5% FBS最終濃度，並加溫至37°C，製備樣本稀釋液。使用含有0.05% Tween 20之包括磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)的清洗緩衝液。

將樣本和標準稀釋至750 ng/mL，250 ng/mL，83 ng/mL，28 ng/mL，9.3 ng/mL，3.1 ng/mL，1.0 ng/mL和0.3 ng/mL的分析最終蛋白濃度。製備密度大約1.2 x 10⁶ 個細胞/mL之HH細胞儲存液並將50 µl含有稀釋樣本或標準的細胞儲存液加到96孔盤的各孔槽。將細胞於37°C培養30分鐘。培養後，將細胞以細胞溶離緩衝液溶離10分鐘。溶離後，將50 µl的溶離細胞混合液轉置於ELISA盤，接著50 µl的磷酸-STAT5 A/B抗體混合液。然後將混合液培養1小時，然後以清洗緩衝液清洗3次。然後將100 µl的偵測試劑加到各孔槽並將此盤培養15分鐘。然後於各孔槽中加入100 µl的停止溶液並將此盤於微量盤式判讀儀上以450 nm讀取讀數。

測量個別的EC50並計算參照標準EC50值和對照組EC50值的%相對標準差(RSD)。

計算參照標準的三個EC50值(參照標準EC50GM)之幾何平均和對照組的三個EC50值(對照EC50)之幾何平均。使用下列方程式計算對照的相對效力：相對效力=(參照標準EC50GM)/(對照EC50)×100%。

以相同的方式計算樣本。藉由下列方程式決定分析結果：相對效力=(參照標準EC50GM)/(受試樣本EC50)×100%。

HH細胞株為基準的活性分析結果驗證了多肽A在各種受試調配物中保持活性(圖1)。安定性檢測結果

前述安定性定性結果顯露調配物4在維持pH和多肽A的蛋白安定性上優於其他受試調配物。實例 2– 篩選不同緩衝劑組份和其對安定性的效應

使用示差掃描量熱法，和以熱應力為基準的篩選為OD350時程分析，及以震盪應力為基準的篩選為微流影像分析，就多肽A之安定效應，篩選數種適合醫藥用途之pH範圍6.0–7.0的緩衝劑。

將多肽A(最初為11.6 mg/mL之PBS緩衝液)透析至五種pH 6.0緩衝液，10 mM 組胺酸，10 mM檸檬酸鹽，100 mM檸檬酸鹽，10 mM磷酸鹽或10 mM琥珀酸鹽。透析係以Slide-A-Lyzer卡匣以10,000 Da分子量截斷及3 mL量能，於4°C，及以1：500+的透析液體積與緩衝液體積比率，以2種緩衝劑變化以4+小時區間來進行，並培養至隔夜，之後透析液回收。將透析液以經過濾的(0.2 µm)透析緩衝液稀釋至1.0 mg/mL多肽A。然後於這些樣本上以三重複進行分析。就微流影像分析，係將雙重複的3 mL各樣本加入5 mL小瓶中，並將小瓶於300 RPM震盪3天，然後將雙重複匯集。亦將3 mL的緩衝液於相同的條件下震盪用於緩衝液的扣減和空白試驗。示差掃描量熱法 (DSC)

使用配置有自動取樣器的MicroCal毛細管示差掃描量熱儀，於1 mg/mL之所有多肽A濃度的樣本以三重複進行DSC實驗。將樣本以60°C/小時速率從10°C加熱至90°C並記錄溫譜圖。在各注射間清洗樣本和參照細胞。使用MicroCal Origin 7附加的分析套裝軟體分析數據，並內插到相同的x-軸值，使其能進行平均。

圖4係顯示隨緩衝劑組成物變化之溫譜圖Tm值。10 mM檸檬酸鹽的Tm值為所有的樣本中最高，而10 mM組胺酸緩衝液則具有相對較低的Tm值。OD350 時程 ( 動力學 ) 分析

以三重複於100 UV-可見光光譜儀上，每個比色管使用260 µL的蛋白溶液體積進行OD350時程(動力學)分析。每隔5分鐘以平均2秒的時間測量350 nm的光學密度，同時將溫度保持在72°C的恆定值。將所有的數據輸入Origin lab並內插到相同的x-軸值，使其能進行平均。

於72°C的恆定溫每隔5分鐘收集三重複之多肽A樣本的OD350值總計8小時。圖5係顯示8小時後的平均OD350值。72°C下8小時後，含有檸檬酸鹽緩衝劑的樣本具有最低的OD350值。微流影像分析

使用MFI DPA-4200 (Protein Simple, Santa Clara, CA)系統以塗覆100 µm矽烷的流通槽檢驗範圍從2至70 µm的微可見粒子。測量前使用10 µm聚苯乙烯粒子標準(Duke)校正儀器。以三重複於周圍溫度測量所有的樣本。於槽中通入無顆粒水並使用無顆粒水將照度最適化，之後進行所有測量。小心地以低蛋白結合的過濾嘴吸量管(Neptune Scientific)吸取樣本，並使用0.2 mL/min的流速分析。每次測量的通入量為0.4 mL，以及分析0.6 mL的樣本。

於300 RPM震盪3天後，將所有的多肽A樣本以三重複進行MFI，而結果係如圖6所示。10 mM組胺酸的樣本在震盪3天後具有最高的總微可視粒子濃度，而10 mM檸檬酸鹽的樣本具有最低的總微可視粒子濃度。緩衝劑 篩選之結論

10 mM組胺酸中的多肽A樣本具有最低的熱安定性，於72°C最高的隨時間變化之起始OD350，及震盪應力3天後最高的總微可視粒子濃度。檸檬酸鹽緩衝液中的樣本具有於72°C最低的隨時間變化之OD350，震盪應力3天後最低的總粒子濃度，及DSC數據中樣本最高的熱安定性。實例 3– 組胺酸緩衝劑與含蔗糖的檸檬酸鹽以及含蔗糖和聚山梨醇酯 20 的檸檬酸鹽之比較

為了測定在pH 6.1之3 mg/mL檸檬酸鹽，50 mg/mL蔗糖中聚山梨醇酯20存在對總微可見粒子濃度之效應，係進行隨震盪應力而變的微流影像分析。受試的緩衝劑有10 mM組胺酸、含50 mg/mL蔗糖之3 mg/mL檸檬酸鹽以及含50 mg/mL蔗糖和0.01%聚山梨醇酯20的3 mg/mL檸檬酸鹽。於300 RPM震盪3天後，藉由微流影像分析以三重複就所有多肽A樣本測量總微可視粒子濃度；及結果係如表7中所示。在含有聚山梨醇酯20之樣本中，總微可視粒子濃度為最低。

無

從下列說明性具體實例的詳細說明結合伴隨的圖式將能更充分了解本發明之前述和其他特徵及優點。專利或申請案檔案係含有至少一彩色圖式。此帶有彩色圖式的專利或專利申請公開案的副本將應要求及交付必要費用由官方提供。

圖 1 係描繪在數種重建產品或冷凍乾燥的產品調配物中多肽A的活性。活性係以pSTAT5 ELISA分析測量。

圖 2 係描繪在數種冷凍乾燥的產品調配物中多肽A的粒徑排阻層析結果。

圖 3 係描繪在數種重建產品調配物中多肽A的粒徑排阻層析結果。

圖 4 係描繪隨緩衝劑組成物變化之多肽A的示差掃描量熱研究。係顯示展開結果的Tm。所有的誤差線(error bar)為來自三重複實驗的標準差。

圖 5 係描繪隨緩衝劑組成物變化之多肽A在72°C的OD350時間研究。所顯示的為於72°C，8小時之後的OD350。所有的誤差線為來自三重複實驗的標準差。

圖 6 係描繪以300 RPM震盪3天後，隨緩衝劑組成物變化之多肽A的微流影像研究。所顯示的為總微可見顆粒濃度(total subvisible particle concentration)，且誤差線為來自三重複實驗的標準差。

圖 7 係描繪隨震盪應力和緩衝劑組成物而變之多肽A的微流影像研究。所顯示的為總微可見顆粒濃度，且誤差線為來自三重複實驗的標準差。

無

Claims (65)

1. 一種組成物，其係包括： a)      約1 mg至約50 mg的多肽，而該多肽係包括與IL-2Rα鏈之胞外部分融合的環形序列重組IL-2； b)      蔗糖； c)      檸檬酸鹽緩衝劑；及 d)      聚山梨醇酯20。
2. 如請求項1之組成物，其中該多肽係包括與SEQ ID NO: 1具有至少95%相同性的胺基酸序列。
3. 如請求項1之組成物，其中該多肽係包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
4. 如請求項1-3中任一項之組成物，其中該組成物係包括約2.2 mg的多肽。
5. 如請求項1-3中任一項之組成物，其中該組成物係包括約11 mg的多肽。
6. 如請求項1-3中任一項之組成物，其中該組成物係包括約33 mg的多肽。
7. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約100 mg至約120 mg蔗糖。
8. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約110 mg蔗糖。
9. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約4.0 mg至約6.0 mg的檸檬酸陰離子。
10. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約5.0 mg檸檬酸陰離子。
11. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括介於約1：10至約1：2之檸檬酸：檸檬酸三鈉二水合物質量比的檸檬酸和檸檬酸三鈉二水合物。
12. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約1：9之檸檬酸：檸檬酸三鈉二水合物質量比的檸檬酸和檸檬酸三鈉二水合物。
13. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約1：2之檸檬酸：檸檬酸三鈉二水合物質量比的檸檬酸和檸檬酸三鈉二水合物。
14. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約0.20 mg至約0.24 mg聚山梨醇酯20。
15. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物係包括約0.22 mg聚山梨醇酯20。
16. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物為冷凍乾燥的餅塊。
17. 如請求項16之組成物，其中該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生pH約5.5至約6.5的水溶液。
18. 如請求項17之組成物，其中該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生pH約6.1的水溶液。
19. 如請求項16-18中任一項之組成物，其中該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生具有約160至約230 mOsm/kg滲透壓的水溶液。
20. 如請求項19之組成物，其中該冷凍乾燥的餅塊係溶於水中產生具有約179 mOsm/kg滲透壓的水溶液。
21. 如請求項16-18中任一項之組成物，其中該冷凍乾燥的餅塊係溶於氯化鈉溶液中產生具有約240至約340 mOsm/kg滲透壓的水溶液。
22. 如請求項21之組成物，其中該氯化鈉溶液係包括約0.1% NaCl至約0.5% NaCl。
23. 如請求項21之組成物，其中該氯化鈉溶液係包括約0.12% NaCl至約0.41% NaCl。
24. 如請求項21之組成物，其中該氯化鈉溶液係包括約0.02 M NaCl至約0.07 M NaCl。
25. 如請求項1-15中任一項之組成物，其中該組成物為水溶液。
26. 如請求項25之組成物，其中該組成物係包括約1 mg/mL的多肽。
27. 如請求項26之組成物，其中該組成物為包括約2.2 mg多肽的2.2 ml水溶液。
28. 如請求項25之組成物，其中該組成物係包括約5 mg/mL的多肽。
29. 如請求項28之組成物，其中該組成物為包括約11 mg多肽的2.2 ml水溶液。
30. 如請求項25之組成物，其中該組成物係包括約15 mg/mL的多肽。
31. 如請求項30之組成物，其中該組成物為包括約33 mg多肽的2.2 ml水溶液。
32. 如請求項25-31中任一項之組成物，其中該組成物係包括約45 mg/mL至約55 mg/mL蔗糖。
33. 如請求項32之組成物，其中該組成物係包括約50 mg/mL蔗糖。
34. 如請求項25-33中任一項之組成物，其中該組成物係包括約10 mM至約20 mM檸檬酸鹽緩衝劑。
35. 如請求項34之組成物，其中該組成物係包括約12 mM檸檬酸鹽緩衝劑。
36. 如請求項25-35中任一項之組成物，其中該檸檬酸鹽緩衝劑係藉由將2.03 mg/mL檸檬酸三鈉二水合物和0.97 mg/mL檸檬酸單水合物於水溶液混合所形成。
37. 如請求項25-36中任一項之組成物，其中該組成物係包括約0.09 mg/mL至約0.11 mg/mL聚山梨醇酯20。
38. 如請求項37之組成物，其中該組成物係包括約0.1 mg/mL聚山梨醇酯20。
39. 如請求項25-38中任一項之組成物，其中該組成物的pH為約5.5至約6.5。
40. 如請求項36之組成物，其中該組成物的pH為約6.1。
41. 如請求項25-40中任一項之組成物，其中該組成物的滲透壓為約160至約230 mOsm/kg。
42. 如請求項41之組成物，其中該組成物的滲透壓為約179 mOsm/kg.
43. 如請求項25-42中任一項之組成物，其中該水溶液係包括約0.03 mg/mL的多肽至約0.2 mg/mL的多肽。
44. 一種冷凍乾燥的組成物，其藉由將如請求項25-44中任一項之組成物冷凍乾燥製得。
45. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該組成物為單一單位劑量的多肽。
46. 一種製品，其係包括如前述請求項中任一項之組成物。
47. 如請求項46之製品，其為玻璃小瓶。
48. 一種製造冷凍乾燥的組成物之方法，該方法係包括將如請求項25-43中任一項之水溶液冷凍乾燥。
49. 一種製造水性組成物的方法，該方法係包括將如請求項16或44之組成物溶於水性溶劑中。
50. 如請求項49之方法，其中該水性溶劑係包括注射用水。
51. 如請求項49之方法，其中該水性溶劑係包括氯化鈉溶液。
52. 如請求項51之方法，其中該氯化鈉溶液係包括約0.1% NaCl至約0.5% NaCl。
53. 如請求項51之方法，其中該該氯化鈉溶液係包括約0.12% NaCl至約0.41% NaCl。
54. 如請求項51之方法，其中該該氯化鈉溶液係包括約0.02 M NaCl至約0.07 M NaCl。
55. 如請求項51-54中任一項之方法，其中該水性組成物係包括約240至約340 mOsm/kg的滲透壓。
56. 如請求項49-55中任一項之方法，其中該水性組成物的pH係調整至約6.1。
57. 如請求項49-56中任一項之方法，其中該水性組成物的pH係以鹼調整至約6.1。
58. 如請求項57之方法，其中該鹼為氫氧化鈉。
59. 如請求項49-58中任一項之方法，其中該水性組成物進一步係以包括約1% (w/w)界面活性劑的水溶液稀釋。
60. 如請求項59之方法，其中該界面活性劑為聚山梨醇酯20。
61. 如請求項59之方法，其中該水溶液進一步係包括約0.1% (w/w)檸檬酸單水合物，0.2% (w/w)檸檬酸三鈉二水合物和98.7% (w/w)注射用水。
62. 一種活化對象中的天然殺手(NK)細胞之方法，該方法係包括投予該對象一有效量之如請求項25-43中任一項的組成物。
63. 一種於有此需要的對象中治療癌症的方法，該方法係包括投予該對象一有效量之如請求項25-43中任一項的組成物。
64. 如請求項63之方法，其中該癌症為腎細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌或肺癌。
65. 如請求項63或64之方法，其中該癌症係包括難治性實體腫瘤。

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