TW202142250A

TW202142250A - 乳酸菌用於製備抗病毒組合物的用途

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Publication number: TW202142250A
Application number: TW109115052A
Authority: TW
Inventors: 吳彰哲; 陳勁初; 陳炎鍊; 林詩偉; 王啟憲; 侯毓欣; 石仰慈; 林靜雯; 陳雅君; 江佳琳; 蔡侑珊; 吳姿和; 林明義; 陳彥博
Original assignee: 葡萄王生技股份有限公司
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2021-11-16
Also published as: TWI757735B

Abstract

一種乳酸菌及/或其活性物質的用途，其係用於製備抗流感病毒之組合物，其中該乳酸菌包含：副乾酪乳桿菌GKS6、乳雙歧桿菌GKK2、洛德乳桿菌GKR1、鼠李醣乳桿菌GKLC1、胚芽乳桿菌GK4、胚芽乳桿菌GKD7、乳酸片球菌GKA4、長雙岐桿菌GKL7、兩歧雙歧杆菌GKB2、短雙歧杆菌GKV1、短乳酸桿菌GKJOY、或其組合。

Description

乳酸菌用於製備抗病毒組合物的用途

本揭露關於一種乳酸菌及/或其活性物質的用途；更明確地說，該乳酸菌及/或其活性物質係用於製備預防或治療流感病毒感染之組合物。

流感是一種為核醣核酸（RNA）病毒所引起的呼吸道疾病。已知流感病毒分為三種類型：A型、B型和C型，其中A型可感染人、豬、馬、禽鳥等，較容易發生變異而會造成季節性大流行；B型及C型則僅感染人，但只會發生微變異，B型一般造成地區性的流行，而C型則是較不會使人類產生症狀。A型流感病毒可依據病毒表面的兩種醣蛋白作為抗原類型，分別是血凝素（haemagglutinin，即H）及神經胺酸酶（neuraminidase，即N），其又分別包含17種（H1-H17）及9種（N1-N9）。根據這兩種抗原的配對，又再細分為不同亞型，如H1N1、H3N2及H2N2等。

新型流感H1N1病毒在世界各地陸續引發大流行，而演變為嚴重的問題。2009年初，新型流感H1N1病毒首次於墨西哥出現並導致人類感染個案後，隨即引發大流行，並於當年度造成超過60萬起的確認案例其中更高達上1萬多起的死亡病例而現今H1N1流感病毒也演變成為全球季節性流感病毒株之一。H1N1新型流感屬A型流感病毒，為飛沫傳染與接觸傳染，潛伏期估計1至4天，傳染期由發病前一天至發病後7天。兒童病例可傳染期通常較成人病例為長，也是造成流感傳播的主要來源。H1N1新型流感症狀，包括發燒、咳嗽、喉嚨痛、全身酸痛、頭痛、寒顫與疲勞，有些病例出現腹瀉、嘔吐症狀。截至目前為止，H1N1新型流感之流行病學顯示，其病程嚴重度仍屬溫和，死亡率還是千分之一到四左右。在一些高危險族群，產生併發症或死亡的機率會比較高，其包括五歲以下的幼兒、孕婦、65歲以上長者、有潛在疾病者（如HIV、糖尿病、心血管疾病、慢性肺病）、免疫抑制患者、肥胖者等。

施打疫苗是目前針對流感的主要防治手段，但遺憾的是疫苗仍無法充分應對病毒變異。季節性流感病毒抗原很容易累積變異，因此會在短時間內不斷演化，並產生出新的病毒株，故世界衞生組織每年會預測建議流感季節所應採用的流感疫苗組合。但是，由於病毒的變異沒有規律而難以精準預測，過去數年間曾發生預測病毒變異的結果失準，導致多次當季流行的病毒株與預測的流感疫苗不吻合。最終，所施打的疫苗無法提供人體足夠的保護力，而無法充分發揮避免流感大流行的效用。

再者，疫苗的接種有一定的限制。疫苗需要保存於特定溫度範圍，其保存期限也有限，還需要負責接種疫苗的技術人員，以及接種疫苗的民眾等等因素需要考慮。此外，更有一些不適宜接種疫苗的特定族群，包含： 1.嬰兒（年齡小於六個月者）、 2.孕婦（懷孕最初的三個月以內）、 3.對「蛋」之蛋白質或疫苗內的其他成分過敏者、 4.患有急性疾病、嚴重慢性疾病、慢性疾病的急性發病期、感冒或發燒中者、 5.過去14天內，曾經接種過其他疫苗者、 6.曾服用過抗免疫、抗病毒或消炎藥物者、 7.自體免疫性疾病患者或病毒感染者等。

此外亦有部分接種者在接種疫苗後出現不良反應。2009年新型流感病毒H1N1大流行期間，多國民眾接種疫苗後約有超過1萬五千起不良事件通報案例，其中更有將近約5 %會引起病人住院、造成永久性殘疾、延長住院時間、胎兒先天性畸形、危及生命或死亡者等等嚴重不良事件發生。接種疫苗後的不良反應在在都降低了一般民眾接種疫苗的意願，因此極需找尋有效物質來預防或治療新型流感H1N1的感染。

乳酸菌屬於益生菌（Probiotics）的一種，乃泛指利用碳水化合物進行發酵，生產多量乳酸之細菌。乳酸菌為原生保健性菌種，功能上來說，係藉由附著在宿主的腸道上，而防止病原菌入侵，對宿主有正面效益。目前對於乳酸菌的研究已愈來愈廣泛，文獻指出其功效包含改善腸躁症、抗發炎、改善異位性皮膚炎和抗過敏等功能外，其他預防或治療常見疾病亦有相關的報導。此外許多研究也指出，乳酸菌無論是活菌或熱致死菌，均具有某些特定保健之用途。在乳酸菌抗病毒的研究上多為利用攝取活乳酸菌來提升食用者自身免疫力並抵抗病毒感染，並無法真正代表病毒入侵體內時，由藥物明確抵抗病毒感染的效益。據此，本發明提供一種乳酸菌的組合物之用途，其具有有效抵抗病毒感染細胞的功效。

本揭露提供乳酸菌及/或其活性物質的用途，其係用於製備抗流感病毒感染之組合物，其中該乳酸菌為：副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6以BCRC 910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）GKK2以BCRC 910826寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；洛德乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）GKR1 以BCRC 910827寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；鼠李醣乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）GKLC1以BCRC 910828寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GK4以BCRC 910858寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GKD7 以BCRC 910877寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici ）GKA4 以BCRC 910876寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum ）GKL7 以BCRC 910988寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；兩歧雙歧杆菌（Bifidobacterium bifidum ）GKB2 以BCRC 910986寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；短雙歧杆菌（Bifidobacterium breve ）GKV1 以BCRC 910989寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）GKJOY 以BCRC 910920寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；或其組合。

較佳地，其中該活性物質為該乳酸菌的菌液。

較佳地，其中該組合物以一有效量施予受試者，該有效量為0.2至1 g/60 kg body weight/day。

較佳地，其中該流感病毒係A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒。

較佳地，其中該流感病毒係H1N1。

較佳地，其中該抗流感病毒係指預防或治療流感病毒感染。

較佳地，其中該預防流感病毒感染係指相對於流感病毒感染前未施予該組合物的受試者，流感病毒感染前施予該組合物的受試者於流感病毒感染後被流感病毒感染的細胞數量比例較低。

較佳地，其中該治療流感病毒感染係指相對於流感病毒感染後未施予該組合物的受試者，流感病毒感染後施予該組合物的受試者於流感病毒感染後被流感病毒感染的細胞數量比例較低。

較佳地，其中該等乳酸菌的活性物質係以下列方法製備：

（a）取該乳酸菌的菌體接種於固態培養基進行固態培養以形成菌落；

（b）將步驟（a）培養的菌落（colony）接種於液體培養基進行液態培養以得含菌體之液態培養基的菌液。

較佳地，其中該組合物包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。

較佳地，其中該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

較佳地，其中該組合物的形態為粉劑、錠劑、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。

本揭露所使用的全部技術和科學名詞與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所瞭解的意義相同，除非本揭露中另有說明。

本文中所述「抗病毒（antivirus或antiviral）」係指治療或預防病毒的感染。其中所述「預防（prevention或preventing）」係指使一個體免於一疾病、不適、或有害症狀的發生。在一個可行態樣中，本文中所述「預防（prevention或preventing）」係指患者在未感染流感病毒前或未出現流感病毒感染的症狀時，避免該患者感染流感病毒或出現感染流感病毒的症狀。本文中所述「治療（treatment或treating）」係指於一個體中消除、終止、或減少一疾病、不適、或有害症狀的進程。在一個可行態樣中，本文中所述「治療（treatment或treating）」係指患者在感染流感病毒或出現流感病毒感染的症狀時，減緩該患者的感染流感病毒的症狀。

本文中所述「有效量」係指一使用量，其足以使預防或治療流感病毒的效果產生。

本文中所述「菌體」係指本揭露所採用的乳酸菌在各種培養階段中乳酸菌本身的結構。在一個具體態樣中，菌體係指完整或部分的乳酸菌結構。在一個具體態樣中，菌體係指由單一個細菌分裂、繁殖所形成的乳酸菌族群的菌落。在一個具體態樣中，培養階段係指固態培養、液態培養或接種於發酵槽的液態放大。

本文中所述「活性物質」係指本揭露所採用的乳酸菌菌體經過特定實驗步驟處理後所篩選出來的物質，或是菌體與培養基或培養液的混合物。在一個具體態樣中，活性物質係指含有菌體的固態培養基、含菌體的液態培養基的菌液。

本揭露為了抗流感病毒，研發出一種包含乳酸菌及/或其活性物質的組合物。在一較佳的實施態樣中，上述乳酸菌包含：副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6以BCRC 910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）GKK2以BCRC 910826寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；洛德乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）GKR1 以BCRC 910827寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；鼠李醣乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）GKLC1以BCRC 910828寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GK4以BCRC 910858寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GKD7 以BCRC 910877寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici ）GKA4 以BCRC 910876寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum ）GKL7 以BCRC 910988寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；兩歧雙歧杆菌（Bifidobacterium bifidum ）GKB2 以BCRC 910986寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；短雙歧杆菌（Bifidobacterium breve ）GKV1 以BCRC 910989寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）GKJOY 以BCRC 910920寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；或其組合。

但本揭露所述的菌種不限於由此管道取得，所屬技術領域中具有通常知識者亦可由其他微生物菌株保存單位取得該等乳酸菌的菌種。

關於菌種培養，將乳酸菌體接種於固態培養基上，以進行固態培養來活化菌體並形成菌落（colony formation）。在一較佳的實施態樣中，該固態培養的溫度為27至42 ℃，更佳為32至37 ℃。在一較佳的實施態樣中，該固態培養的時間為1至4天，更佳為2至3天。在一較佳的實施態樣中，該固態培養基為MRS agar。待固態培養基上的菌落生長完成後，將單一菌落挑起接種於含有MRS液態培養基的試管，以液態培養來活化。在一較佳的實施態樣中，MRS液態培養的溫度為30至55 ℃，更佳為32至45 ℃。在一較佳的實施態樣中，MRS液態培養的時間為14至18小時，更佳為16小時。在一較佳的實施態樣中，液態培養的酸鹼值為pH 5.0至7.0，更佳為pH 5.5至6.5。在一較佳的實施態樣中，液態培養基的配方如下述表1所示。

表1

成分	比例（重量百分比）
碳源	0至5 %
蛋白腖	0.1~5 %
酵母抽出物	0.1~5%
氮源	0.1~5 %
離子	0.01~2 %
水	剩餘部分

液態培養後所得的菌液經調整酸鹼值至pH 7.0後，再經121 ℃滅菌1分鐘，待菌液溫度降至室溫後以DMEM 培養液配置為濃度5 %，作為以下實驗的試驗物質。

本揭露提供的乳酸菌及/或其活性物質的組合物，進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣、蔗糖或其組合。該防腐劑可延長醫藥組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸（parabens）。稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。填充劑可選自乳糖、半乳糖、高分子量聚乙二醇或其組合。吸收促進劑可選自二甲基亞碸（DMSO）、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。甜味劑可選自安塞甜（Acesulfame K）、阿斯巴甜（aspartame）、糖精（saccharin）、三氯蔗糖／蔗糖素（sucralose）、紐甜（neotame）或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響組合物的醫藥效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。

該組合物於醫藥領域中可開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

本揭露的組合物在不影響菌體或活性物質發揮效果的前提下，組合物可根據受施予者之需要，而製為任何藥物型態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、栓劑、微膠囊、安瓶（ampoule/ampule）、液劑噴劑或塞劑。

本揭露的組合物根據該組合物的型態，在預定的時間點以適用的途徑施予受試者適合劑量的組合物。在一較佳實施態樣中，施予途徑包含經口或非經腸，還包括靜脈內、肌內、腹膜內、皮下、經皮、呼吸道（氣霧劑）、直腸、陰道或局部（包括口腔及舌下）。在一較佳實施態樣中，預定時間點包含每餐、每天、每週。在一較佳實施態樣中，受試者為人類或動物。在一較佳實施態樣中，作為受試者的母體是透過胎盤或哺乳將免疫球蛋白提供給子體，故受試者為處於妊娠或哺乳時期的母體。

有效量於活體外細胞培養實驗，在每一個培養中所用之細胞培養液的總體積定義為「μg/mL」。於動物實驗，有效量定義為「g/60 kg body weight/day」。經下列計算公式，由活體外細胞培養實驗所得到的有效量可轉換為供動物使用的有效量，供動物使用的有效量可再根據新陳代謝率轉換為人類的有效量。 I. 一般來說（Reagan-Shawet al ., 2008），1「μg/mL」單位（基於活體外細胞培養實驗所得的有效量）可等同於1「mg/kg body weight/day」單位（基於大鼠模型實驗所得的有效量）。基於已知大鼠的新陳代謝率是人類的6.2倍，能進一步求得人類的有效劑量。 II. 若基於活體外細胞培養實驗求得有效量為500 μg/mL，則於大鼠中使用的有效量可計為500 mg/kg body weight/day（即，0.5 g/kg body weight/day）。進一步地，參酌前述新陳代謝率的差異，供人類使用的有效量則可計為約5 g/60 kg body weight/day。 III. 根據下述的試驗結果，基於細胞試驗的有效量為50 μg/mL，經上述換算公式求出人類的有效劑量為約0.5 g/60 kg body weight/day。

在一較佳實施態樣中，組合物中所含的乳酸菌菌體或活性物質的有效量為0.05 g至5 g/60 kg body weight/day，再佳為0.1 g至2 g/60 kg body weight/day，更佳為0.2 g至1 g/60 kg body weight/day。

實施例一：菌種來源

本揭露的實施例中用以製備試驗物質所使用的乳酸菌的菌種，寄存於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心。乳酸菌菌種及其對應的寄存編號如下表2。表2

編號	菌種	寄存編號
1	副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6	BCRC 910788
2	乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）GKK2	BCRC 910826
3	洛德乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）GKR1	BCRC 910827
4	鼠李醣乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）GKLC1	BCRC 910828
5	胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GK4	BCRC 910858
6	胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GKD7	BCRC 910877
7	乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici ）GKA4	BCRC 910876
8	長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum ）GKL7	BCRC 910988
9	兩歧雙歧杆菌（Bifidobacterium bifidum ）GKB2	BCRC 910986
10	短雙歧杆菌（Bifidobacterium breve ）GKV1	BCRC 910989
11	短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）GKJOY	BCRC 910920

實施例二：菌種培養

將乳酸菌體接種於作為固態培養基的MRS agar上，以37 ℃進行固態培養2天來活化菌體，並形成菌落（colony formation）。待MRS agar上的菌落生長完成後，將單一菌落挑起接種於含有MRS液態培養基之試管，以37 ℃液態培養活化16小時。液態培養基的配方如上述表1所示。液態培養後所得的菌液經調整酸鹼值至pH 7.0後，再經121 ℃滅菌1分鐘，待菌液溫度降至室溫後以DMEM 培養液配置為濃度5 %，作為以下實驗的試驗物質。

實施例三：病毒培養及增幅（Virus amplify）

將A型流感病毒（H1N1）液以約100半數組織細胞感染劑量（50 % tissue culture infective dose，TCID50）注射100 μL至無特定病原（Specific pathogen free，SPF）雞胚蛋的尿囊膜。接著，以蠟封住雞胚蛋尿囊膜的洞口，放在培養箱中培養1至2天讓病毒繁殖，再放入4℃ 等待凝結。最後，再將注射病毒的雞胚蛋尿囊膜中的液體抽出，置入-80℃中保存，待作為實驗用的病毒溶液。

實施例四：細胞株來源與培養

犬腎上皮細胞（Madin-Darby Canine Kidney cells，MDCK）購自食品工業研究所之生物資源中心（Bioresource Collection and Research Center, BCRC），該細胞株編號為 BCRC 60004。當細胞長到八分滿時進行繼代培養，首先吸除舊有細胞培養液，用磷酸緩衝生理食鹽水PBS 洗去殘留的血清及代謝物，加入1 mL 胰蛋白酶 typsin-EDTA 後，置於37℃ 下作用3至5 分鐘，輕拍細胞盤側促使貼附於盤底之細胞脫落，鏡檢確認細胞被切下後，以0.5 mL 胎牛血清FBS 中止胰蛋白酶的作用，以DMEM 培養液沖下細胞並收集於50 mL 離心管中，於4 ℃以500 xg離心5 分鐘。而後吸除上清液，再以DMEM 培養液回溶沉澱的細胞並進行計數，並將細胞濃度調整為 3 x10⁵ 細胞/盤。最後，將細胞種於細胞培養皿中，並加入含有10 % 胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）之 DMEM 培養液共 10 mL，培養於37℃ 及5% CO₂ 的培養箱。

實施例五：預防（Pre-treatment）試驗

實驗組是將1×10⁴ 細胞/孔的 MDCK 種在96 孔盤中，置於含有37 ℃ 與5 % CO₂ 培養箱中隔夜培養。待MDCK貼附96 孔盤後，加入5 %濃度的乳酸菌菌液並於培養箱中作用1 小時。接著吸除培養液，再加入病毒感染劑量（multiplicity of infection, MOI） m.o.i. = 0.05 之 H1N1 溶液與細胞於培養箱作用1 小時，移除培養液並加入含2 % FBS 之新鮮 DMEM 培養液，於37℃、5 % CO₂ 培養箱培養48 小時，而後進行細胞存活率分析。負對照組相對於實驗組的流程，不加入病毒與乳酸菌菌液。正對照組相對於實驗組流程，則是加入病毒但不加入乳酸菌菌液。

實施例六：共培養（Co-treatment）試驗

實驗組是將MDCK 種在 96 孔盤中，置於含有37 ℃ 與5 % CO₂ 培養箱中隔夜培養待細胞貼附後，先將5 %之乳酸菌發酵全液與 m.o.i. = 0.05 之 H1N1溶液混合為混合液後共同培養1 小時，將混合液加入含1×10⁴ 細胞/孔的MDCK（隔夜培養）96孔盤中於培養箱繼續作用1 小時，移除原培養液並加入含2 % FBS 之新鮮 DMEM 培養液，於37 ℃、5 % CO₂ 培養箱培養48 小時，最後以MTS 檢測套組測量MDCK的細胞存活率。負對照組相對於實驗組的流程，不加入病毒與乳酸菌菌液。正對照組相對於實驗組流程，則是加入病毒但不加入乳酸菌菌液。

實施例七：MTS 檢測

將 1×10⁴ 細胞/孔的MDCK種在96 孔盤中，置於含37℃ 的 5% CO₂ 培養箱中培養24 小時。爾後再分別加入不同濃度之樣品作用48 小時，再利用 MTS 檢測樣本的細胞存活率。培養液與 MTS試劑添加的比例為 5:1，將 MTS reagent 加入細胞液後，於培養箱中避光反應1 小時，再使用酵素免疫分析測讀儀（ELISA reader）在490 nm 測量樣本的吸光值進行計算細胞存活率。

試驗統計

實驗數據以平均值（mean）及標準差（standard deviation, S.D.）表示。統計分析方法採用Student’s t-test，檢驗試驗物質組與對照組之間的差異，p>0.05表示顯著差異。

試驗結果

預防試驗與共培養試驗中施予病毒與乳酸菌菌液的實驗組、施予病毒但不施予乳酸菌菌液的正對照組，以不施予病毒也不施予乳酸菌菌液的負對照組的細胞存活率作為基準（100 %），其細胞存活率顯示如圖1至圖11。預防試驗與共培養試驗中施予病毒與乳酸菌菌液的實驗組，相較於施予病毒但不施予乳酸菌菌液的正對照組，細胞存活率的提升比例如下表3：表3

編號	菌種	預防試驗	共培養試驗
1	GKS6	13.31 % （p>0.01）	23.35 % （p>0.05）
2	GKK2	12.56 % （p>0.05）	15.43 % （p>0.01）
3	GKR1	13.19 % （p>0.05）	13.70 % （p>0.001）
4	GKLC1	13.61 % （p>0.05）	26.16 % （p>0.01）
5	GK4	15.82 % （p>0.05）	24.54 % （p>0.01）
6	GKD7	8.26% （p>0.01）	16.90 % （p>0.05）
7	GKA4	11.33% （p>0.001）	24.70 % （p>0.001）
8	GKL7	14.89 % （p>0.05）	25.08 % （p>0.05）
9	GKB2	11.99 % （p>0.05）	27.96 % （p>0.01）
10	GKV1	12.54 % （p>0.05）	25.82 % （p>0.05）
11	GKJOY	8.99 % （p>0.01）	27.35 % （p>0.01）

由圖1至圖11來看，相對於不施予病毒也不施予乳酸菌菌液的負對照組的細胞存活率作為基準（100 %），施予病毒但不施予乳酸菌菌液的正對照組於各菌種的細胞存活率在20 %至40 %之間，約為30 %。正對照組相對於負對照組的細胞存活率大幅下降，顯示施予的病毒對細胞存有毒性，而造成大量細胞喪失活性或甚至死亡。

由表3來看，預防試驗中相對於正對照組的細胞存活率，實驗組的細胞存活率提升在5 %至20 %之間。實驗組相對於正對照組有更多的細胞保有活性，顯示實驗組使細胞與乳酸菌菌液預先培養，有助於降低後來病毒感染的細胞比例、或減緩後來的病毒感染的程度，達到抗病毒的效果。

同樣由表3來看，共培養試驗中相對於正對照組的細胞存活率，實驗組的細胞存活率提升在10 %至30 %之間。實驗組相對於正對照組有更多的細胞保有活性，顯示實驗組使病毒與乳酸菌菌液預先共同培養，再同時感染或施予細胞，有助於減低病毒的感染力，達到抗病毒的效果。

實施例八：組合物製備

本揭露之乳酸菌若作為食品應用於抗病毒用途，則以下組合物1至2之態樣作為例示性實例。

組合物1：取GKS6的菌粉（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8 wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）充分混合，並溶於純水（65 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

組合物2：將組合物1的GKS6替換為GKK2（20 wt%），其餘組成與組合物1相同。

在本揭露提供組合物1與組合物2的實例下，該領域具通常知識者可理解，本揭露中除GKS6與GKK2的其他乳酸菌菌種亦得用以製備組合物。

本揭露之乳酸菌若以液體劑型作為醫藥用品應用於抗病毒用途，則以下組合物3至4之態樣作為例示性實例。

組合物3：取GKS6的菌粉（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）、作為稀釋劑之蔗糖（10 wt%）充分混合，並溶於純水（55 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

組合物4：將組合物3的GKS6替換為GKK2（20 wt%），其餘組成與組合物3相同。

本揭露所請之發明的各個具體實例的細節說明如前。本揭露所請之發明的其他特徵已經由前述各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。

無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解如上的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。

無

圖1顯示於預防試驗（Pre-treatment）與共培養試驗（Co-treatment）中副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.01、共培養試驗 P>0.05）。

圖2顯示於預防試驗與共培養試驗中乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）GKK2對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.05、共培養試驗 P>0.01）。

圖3顯示於預防試驗與共培養試驗中洛德乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）GKR1對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.05、共培養試驗 P>0.01）。

圖4顯示於預防試驗與共培養試驗中鼠李醣乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）GKLC1對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.05、共培養試驗 P>0.01）。

圖5顯示於預防試驗與共培養試驗中胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GK4對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（Pre-treatment P>0.05、共培養試驗 P>0.01）。

圖6顯示於預防試驗與共培養試驗中胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GKD7對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（Pre-treatment P>0.01、共培養試驗 P>0.05）。

圖7顯示於預防試驗與共培養試驗中乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici ）GKA4對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.01、共培養試驗 P>0.01）。

圖8顯示於預防試驗與共培養試驗中長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum ）GKL7對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.05、共培養試驗 P>0.05）。

圖9顯示於預防試驗與共培養試驗中兩歧雙歧杆菌（Bifidobacterium bifidum ）GKB2對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.05、共培養試驗 P>0.01）。

圖10顯示於預防試驗與共培養試驗中短雙歧杆菌（Bifidobacterium breve ）GKV1對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.05、共培養試驗 P>0.05）。

圖11顯示於預防試驗與共培養試驗中短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）GKJOY對H1N1感染的MDCK細胞的存活率（預防試驗 P>0.01、共培養試驗 P>0.05）。

副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6 BCRC 910788；

乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）GKK2 BCRC 910826；

洛德乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）GKR1 BCRC 910827；

鼠李醣乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）GKLC1 BCRC 910828；

胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GK4 BCRC 910858；

胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GKD7 BCRC 910877；

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici ）GKA4 BCRC 910876；

長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum ）GKL7 BCRC 910988；

兩歧雙歧杆菌（Bifidobacterium bifidum ）GKB2 BCRC 910986；

短雙歧杆菌（Bifidobacterium breve ）GKV1 BCRC 910989；

短乳桿菌（Lactobacillus brevis ）GKJOY BCRC 910920。

Claims

一種乳酸菌及/或其活性物質的用途，其係用於製備抗流感病毒之組合物，其中該乳酸菌包含：副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6以BCRC 910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）GKK2以BCRC 910826寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；洛德乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）GKR1 以BCRC 910827寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；鼠李醣乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）GKLC1以BCRC 910828寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GK4以BCRC 910858寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）GKD7 以BCRC 910877寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici ）GKA4 以BCRC 910876寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum ）GKL7 以BCRC 910988寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；兩歧雙歧杆菌（Bifidobacterium bifidum ）GKB2 以BCRC 910986寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；短雙歧杆菌（Bifidobacterium breve ）GKV1 以BCRC 910989寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）GKJOY 以BCRC 910920寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心；或其組合。
如請求項1所述之用途，其中該活性物質為該乳酸菌的菌液。
如請求項1所述之用途，其中該組合物以一有效量施予受試者，該有效量為0.05 g至5 g/60 kg body weight/day。
如請求項1所述之用途，其中該流感病毒係A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒。
如請求項4所述之用途，其中該流感病毒係H1N1。
如請求項1所述之用途，其中該抗流感病毒係指預防或治療該流感病毒感染。
如請求項6所述之用途，其中該預防流感病毒感染係指相對於流感病毒感染前未施予該組合物的受試者，流感病毒感染前施予該組合物的受試者於流感病毒感染後被流感病毒感染的細胞數量比例較低。
如請求項6所述之用途，其中該治療流感病毒感染係指相對於流感病毒感染後未施予該組合物的受試者，流感病毒感染後施予該組合物的受試者於流感病毒感染後被流感病毒感染的細胞數量比例較低。
如請求項1所述之用途，其中該等乳酸菌的活性物質係以下列方法製備：（a）取該乳酸菌的菌體接種於固態培養基進行固態培養以形成菌落；（b）將步驟（a）培養的菌落（colony）接種於液體培養基進行液態培養以得含菌體之液態培養基的菌液。
如請求項1所述之用途，其中該組合物包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
如請求項1中所述之用途，其中該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
如請求項1所述之用途，其中該組合物的形態為粉劑、錠劑、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
如請求項2所述之用途，其中該乳酸菌的菌液係為請求項9步驟（b）之含菌體之液態培養基的菌液。