TW202140565A - 抗ｃｄ４７抗體及其用途 - Google Patents
抗ｃｄ４７抗體及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202140565A TW202140565A TW110112951A TW110112951A TW202140565A TW 202140565 A TW202140565 A TW 202140565A TW 110112951 A TW110112951 A TW 110112951A TW 110112951 A TW110112951 A TW 110112951A TW 202140565 A TW202140565 A TW 202140565A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- seq
- acid sequence
- sequence shown
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 179
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims abstract description 149
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 142
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 142
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 142
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 132
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims abstract description 124
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 167
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 13
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010004950 Birth mark Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims 1
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 48
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 118
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 53
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 51
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 48
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 41
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 37
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 26
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 26
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 26
- 102000044459 human CD47 Human genes 0.000 description 25
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 23
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 18
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 14
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 12
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 101100356020 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) recA gene Proteins 0.000 description 11
- 101100042680 Mus musculus Slc7a1 gene Proteins 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 8
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 7
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 6
- 102200072304 rs1057519530 Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 5
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 5
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 4
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 206010049190 Red blood cell agglutination Diseases 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- -1 poly(n -Vinylpyrrolidone) Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101001037147 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-69 Proteins 0.000 description 1
- 101001138126 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-16 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100040232 Immunoglobulin heavy variable 1-69 Human genes 0.000 description 1
- 102100020946 Immunoglobulin kappa variable 1-16 Human genes 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010046798 Uterine leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000037844 advanced solid tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003039 myelosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000004308 thiabendazole Substances 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本發明提供抗CD47抗體或其抗原結合片段、其製備方法及用於治療或預防CD47相關的疾病的用途。
Description
本發明涉及抗體，尤其是涉及抗CD47抗體及其用於製備治療或預防CD47相關的疾病的藥物的用途。
CD47(分化群47)在20世紀80年代首次被確定為人類卵巢癌的腫瘤抗原。CD47也稱為整聯蛋白相關蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh-相關抗原和MER6，是一種屬於免疫球蛋白超家族的多次膜受體，具有一個免疫球蛋白樣結構域和五個跨膜區，其作為信號調節蛋白α(SIRPα)的配體，與SIRPα的NH2末端的V樣結構域結合。SIRPα主要表現於骨髓細胞，包括巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞(DCs)、肥大細胞和它們的前體細胞，包括造血幹細胞。正常細胞上CD47與巨噬細胞上的SIRPα相互結合，釋放“不要吃我”的信號，抑制巨噬細胞的吞噬作用，是先天免疫系統中巨噬細胞識別自我和非我的重要機制。CD47在人類腫瘤細胞和組織中上廣泛表現，包括急性髓系白血病(AML)、慢性粒細胞白血病、急性淋巴細胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多發性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其它實體腫瘤。腫瘤細胞藉由高表現的CD47與巨噬細胞表面SIRPα結合，逃避巨噬細胞的吞噬作用，並促進腫瘤生長。CD47免疫檢查點被認為是腫瘤免疫治療的一個潛在有效並可廣泛應用的靶點。目前，已開發出多種針對
CD47與SIRPα的相互作用的特異性阻斷劑。正在開展的多項臨床前和臨床試驗涉及針對治療彌漫性大B淋巴細胞淋巴瘤、急性髓系白血病以及晚期實體瘤等的藥物，包括抗CD47抗體以及SIRPα融合蛋白等。這些藥物藉由單藥或者與其他抗腫瘤治療藥物聯用方式給藥。以Forty Seven公司開發的抗CD47抗體Hu5F9為例，一項用於評估Hu5F9治療22例淋巴瘤患者的效果的臨床I期試驗中，Hu5F9與利妥昔單抗聯用可使50%對利妥昔單抗單用無效的患者產生客觀緩解。在2019年公佈的臨床資料中，Hu5F9與阿紮胞苷聯用治療14例復發性/難治性急性髓系白血病病人的完全緩解率可達36%，治療11例骨髓抑制綜合征的患者中，聯用的緩解率更可達55%。
本發明提供了一種新的CD47抗體或其抗原結合片段，其具有高效的抗腫瘤活性，且不引起顯著的紅血球凝集反應，以滿足更多的臨床需求。
本發明提供了結合CD47或其片段的抗CD47抗體或其抗原結合片段，及其製備和使用的方法，包括治療CD47相關的疾病的方法。
一方面，本發明提供抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含選自重鏈可變區(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示。
一方面，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，包含選自重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中，該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列。
一方面，本發明提供抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含選自輕鏈可變區(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該VL的胺基酸序列如SEQ ID NO2、4、8、9或10所示。
一方面，本發明提供了抗CD47抗體或其抗原結合片段，包含選自輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中，該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供了抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)的三個CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區(VL)的三個CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示，且該VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示。
在一些實施方案中，本發明提供了抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)的三個CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區(VL)的三個CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該VH和VL選自：
(1)VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；
(2)VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；
(3)VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列；
(4)VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列；或
(5)VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3和輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3和輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列、該LCDR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含與SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含與SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，其中該VL包含與SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，其中該VL包含與SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH和VL選自：
(1)VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；
(2)VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；
(3)VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列；
(4)VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列；或
(5)VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區例如人IgG1恆定區、人IgG4恆定區、人IgG4P恆定區或人IgG1TM恆定區。本發明的人IgG4P恆定區是突變的人IgG4，其具有S228P的胺基酸取代(根據EU編號)。在一些實施方案中，人IgG1TM恆定區是突變的人IgG1恆定區，其具有L234F、L235E和P331S的胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段包含輕鏈恆定區，例如人κ或λ恆定區。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段是單株抗體。在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施方案中，至少部分的本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段的框架序列是人共有框架序列。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段是全長抗體、單域抗體例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2、單鏈抗體例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或雙(多)特異性抗體。
另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，其編碼本發明提供的任一的抗CD47抗體或其抗原結合片段，較佳地，該核酸編碼本發明抗體的重鏈或輕鏈，或重鏈可變區或輕鏈可變區。
另一方面，本發明提供了一種重組載體或表現載體，其包含一個或多個本發明提供的核酸，其中所述載體適合用於重組產生本發明提供的任一的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，該載體是表現載體。
另一方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含一個或多個本發明提供的核酸、或重組載體或表現載體。
另一方面，本發明提供了一種免疫綴合物或免疫融合物，其包含本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本發明提供了一種醫藥組成物，其包含本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段、本發明提供的核酸、載體或宿主細胞，以及任選地包含至少一種藥學上可接受的藥用輔料(例如載體或賦形劑)。
另一方面，本發明提供了治療或預防CD47相關的疾病的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本文所述的任一抗體或其抗原結合片段、本發明提供的核酸、載體或宿主細胞，本發明提供的免疫綴合物或免疫融合物，或本發明提供的醫藥組成物。
另一方面，本發明還提供了本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段在製備治療或預防CD47相關的疾病的藥物中的用途。
在一些實施方案中，該CD47相關的疾病包括各種血液癌和實體瘤，包括但不限於膀胱癌、結腸直腸癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、(惡性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、(良性)胎記瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌。
本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段還能與其他治療劑或治療方式組合，用於治療或預防CD47相關的疾病。
在一些實施方案中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段可以用來檢測樣品中CD47蛋白，或用來診斷/檢測CD47相關的疾病。
本發明還涵蓋本文所述的任何實施方案的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任何組合適用於本文所述的發明的任何和所有抗CD47抗體或其片段、方法和用途。
發明詳述
本發明提供了能夠阻斷CD47與SIRPα相互作用，具有高效的抗腫瘤活性，且不引起顯著水準的紅血球凝集反應的抗CD47抗體或其抗原結合片段。
本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段表現出抑制活性，例如抑制CD47的表現(如抑制細胞表面CD47的表現)、活性和/或信號傳遞，或阻斷CD47和SIRPα之間的相互作用。本發明提供的CD47抗體在結合CD47(如人CD47)或與其相互作用後完全或部分地降低或調節CD47的表現或活性。在抗體與人CD47多肽和/或肽之間相互作用後，CD47生物學功能的降低或調節是完全、顯著或部分的。當與不存在同本文所述的抗CD47抗體相互作用(如結合)時
CD47的表現或活性水準相比，存在抗CD47抗體時CD47的表現或活性水準降低了至少95%(例如降低了96%、97%、98%、99%或100%)時，該抗體被認為能夠完全抑制CD47的表現或活性。與不存在同本文所述的抗CD47抗體相互作用(如結合)時CD47的表現或活性水準相比，存在抗CD47抗體時CD47的表現或活性水準降低了至少50%(例如降低了55%、60%、75%、80%、85%或90%)，此時該CD47抗體被認為能夠顯著抑制CD47的表現或活性。與不存在同本文所述的抗CD47抗體相互作用(如結合)時CD47的表現或活性水準相比，存在抗CD47抗體時CD47的表現或活性水準降低了少於95%(例如降低了10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%)，此時該抗體被認為能夠部分抑制CD47的表現或活性。
本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段與不存在本文所述抗CD47抗體或其抗原結合片段時CD47與SIRPα之間的相互作用水準相比，本發明的CD47抗體或其抗原結合片段阻斷了CD47與SIRPα之間至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少95%或至少99%的相互作用。
本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段不會導致顯著水準的細胞凝集，例如本發明的CD47抗體不會導致顯著水準的紅血球細胞凝集。在一些實施方案中，如果與現有CD47抗體Hu5F9存在時的紅血球細胞凝集水準相比，本發明的CD47抗體存在時的紅血球細胞凝集水準下降了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%，則說明本發明的CD47抗體未導致顯著的紅血球細胞凝集水準。
與本領域已知的抗體相比，在腫瘤模型中本發明提供的抗體也顯著有效。在一些實施方案中，本發明提供的抗體能夠顯著抑制腫瘤生長。在一些實施方案，本發明的抗體存在時，與不存在該抗體時相比，腫瘤體積體積被抑制至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%，或100%。例如，與現有CD47抗體存在時巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力相比，本發明的CD47抗體存在時巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力升高了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。
本發明還提供了抗CD47抗體或其抗原結合片段的製備方法和其用於諸如癌症治療或預防的用途。
定義
除非另有說明，本發明的實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的一般技術，這些都在本領域的技術範圍內。
為了可以更容易地理解本發明，某些科技術語具體定義如下。除非本文其它部分另有明確定義，否則本文所用的科技術語都具有本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。胺基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-胺基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。本文(包括申請專利範圍)所用單數形式包括其相應的複數形式，除非文中另有明確規定。
術語“約”是指如所屬技術領域中具有通常知識者所確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其部分取決於如何測量或確定該值或組成，即測量系統的限制。比如，“約”可以是指根據本領域中的實踐在1個或大
於1個標準差內。或者，“約”可以是指多達5%、10%或20%的範圍(即，±5%、±10%或±20%)。
術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或更多項。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
術語“整聯蛋白相關蛋白(IAP)”、“CD47”當用於本文中時是指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)和囓齒類動物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然CD47，除非另有說明。該術語涵蓋“全長”未加工的CD47以及由細胞內加工產生的任何形式的CD47或其任何片段。該術語還包括天然存在的CD47的變體，例如，剪接變體或等位變體。在一些實施方案中，CD47是指來自人的CD47全長或其片段(諸如其缺乏信號肽的成熟片段)。在一些實施方案中，人CD47是指與NCBI登錄號NP_001768.1所示的胺基酸序列一致的CD47或其片段。在一些實施方案中，該術語也涵蓋包含CD47或其片段的融合蛋白。
“SIRPα”是指野生型信號調節蛋白α、或含有野生型信號調節蛋白α的胺基酸序列的重組或非重組多肽、或天然或天然存在的信號調節蛋白α的等位基因變體。
術語“抗CD47抗體”、“抗CD47”、“CD47抗體”或“結合CD47的抗體”是指這樣的抗體或其抗原結合片段，其能夠以足夠的親和力結合CD47蛋白或
其片段以致該抗體可以用作靶向CD47中的診斷劑和/或治療劑。在一些實施方案中，本文提供的抗CD47的抗體的解離常數(KD)
100nM，
10nM，
5nM、
4nM、
3nM、
2nM、
1nM，
0.9nM，
0.8nM。在一些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段結合全長人CD47或其片段(尤其是其胞外結合片段)。在一些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段結合包含全長CD47或其片段的蛋白。在另一些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段結合細胞表面表現的CD47或其片段。
本文術語“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1：1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(KD)來表述。本領域中已知測定結合親和力的分析的實例包括表面等離子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如，ForteBio)。
本文術語“CD47相關的疾病”是指與CD47的表現或功能或活性相關或與CD47介導的信號轉導活性相關的非生理狀態，包括但不限於癌症。在一些實施方案中，該疾病將受益於阻斷CD47相關的信號轉導。
本文術語“免疫應答”或“免疫反應”可互換使用，是指由例如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞和由上述細胞或肝產生可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的作用，該作用導致從人體選擇性損害、破壞或清除侵入的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞或者在自體免疫或病理性炎症的情況下的正常人細胞或組織。
本文術語“信號轉導”是指通常由蛋白質間相互作用諸如CD47對其受體的結合啟動的生化因果關係，該關係導致信號從細胞的一部分傳遞至細
胞的另一部分。一般地，傳遞包括引起信號轉導的系列反應中的一種或多種蛋白質上的一個或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基的特定磷酸化。倒數第二過程通常包括細胞核事件，從而導致基因表現的變化。
本文術語“活性”或“生物活性”，或術語“生物性質”或“生物特徵”此處可互換使用，並包括但不局限於表位/抗原親和力和特異性、在體內或體外中和或拮抗CD47活性的能力、增強或啟動CD47活性、IC50、抗體的體內穩定性和抗體的免疫原性質。本領域公知的抗體的其它可鑑定的生物學性質或特徵包括，例如，交叉反應性(即通常與靶定肽的非人同源物，或與其它蛋白質或組織的交叉反應性)，和保持哺乳動物細胞中抗體高表現水準的能力。可以使用本領域公知的技術觀察、測定或評估前面提及的性質或特徵，該技術包括但不局限於ELISA、FACS或BIACORE等離子體共振分析、體外或體內中和測定、受體結合、細胞因子或生長因子的產生和/或分泌、信號轉導和不同來源(包括人類、靈長類或任何其它來源)的組織切片的免疫組織化學。
本文術語“抗體”是指具有所需生物活性的任何形式的抗體。因此，其以最廣義使用，具體包括但不限於單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體、CrossMab抗體、或駱駝源化單結構域抗體。
術語“全抗體”、“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分
為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR依次被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR依次被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。
在一個給定的VH或VL胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知方案的任意一種方案或其組合確定，該方案包括例如：Chothia方案(Chothia等人，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987))；Kabat方案(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)和Contact(University College London)；North方案(North等人，A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))。本發明中的抗CD47抗體的CDR可以根據本領域的任何方案或其組合及人為評估確定邊界。
抗體的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列歸入兩種類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。抗體的重鏈可以根據取決於其重鏈恆定區的胺基酸序列而劃分為主要5種不同的類型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並
且這些類型中的幾種可以進一步劃分成亞類，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。
“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬的IgG形式。例如，IgG4形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG4。
本文術語“單株抗體”是指獲自基本均質抗體群的抗體，即組成該群的各個抗體除可少量存在的可能天然存在的突變之外是相同的。抗體是高度特異性的，針對單一抗原表位。相比之下，一般(多株)抗體製備物通常包括大量針對不同表位(或對不同表位有特異性)的抗體。修飾語“單株”表明獲自基本均質抗體群的抗體的特徵，且不得解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。
本文術語抗體的“抗原結合片段”包括抗體的片段或衍生物，通常該抗原結合片段包括該抗體的抗原結合區或可變區的至少一個片段(例如一個或多個CDR)，並保持該抗體的至少一些結合特性。抗原結合片段的實例包括但不限於Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成的奈米抗體(nanobody)和多特異性抗體。當抗原的結合活性在莫耳濃度基礎上表示時，結合片段或衍生物通常保持其來源抗體的抗原結合活性的至少10%。較佳為結合片段或衍生物保持其來源抗體的抗原結合活性的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高。
可以預期抗體或其抗原結合片段可包括不明顯改變其生物活性的保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體的“保守變體”或“功能保守變體”)。在一個較佳的方面，保守取代來自以下表A中所示的保守取代殘基，較佳為表A中所示的保守胺基酸取代殘基。
表位元是抗體所結合的抗原區域。表位可以由連續的胺基酸形成或者藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。
本文術語“分離的抗CD47抗體或其抗原結合片段”是指抗CD47抗體或其抗原結合片段的純化狀態。例如，“分離的”可以指該分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白質、脂質、糖或其它物質例如細胞碎片和生長培養基。然而，如所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，術語“分離(的)”並非意指完全不存在這類物質或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以明顯干擾本文所述抗體的實驗或治療應用的量存在。在一些實施方案中，分離的抗體或抗原結合片段可以具有大於95%，大於96%，大於97%，大於98%或大於99%的純度，該純度藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)確定。關於評價抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
本文術語“嵌合抗體”是具有第一抗體的可變結構域和第二抗體的恆定結構域的抗體，其中第一抗體和第二抗體來自不同物種。通常可變結構域獲自齧齒動物等實驗動物的抗體，而恆定結構域序列獲自人抗體，使得與該實驗動物抗體相比，所得嵌合抗體在人受試者中誘導不良免疫應答的可能性較低。
本文術語“人源化抗體”是指含有來自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗體的序列的抗體形式。一般而言，人源化抗體包含至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本所有的超變環相當於非人免疫球蛋白的超變環，而所有或基本所有的構架(FR)區是人免疫球蛋白的構架區。人源化抗體任選可包含至少一部分的人免疫球蛋白恆定區(Fc)。在一些情況下，如所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，可以在人源化抗體(例如，可變結構域、構架區、和/或恆定區(如果存
在))中引入胺基酸突變，例如以改善抗體的某些性質；這樣的抗體形式也仍落入本發明“人源化抗體”的範疇。
如所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，抗體可以具有用於生產該抗體的細胞的糖鏈形式。例如，當在小鼠中、在小鼠細胞中或在來源於小鼠細胞的融合瘤中產生時，抗體可含有小鼠糖鏈。或者，如果在大鼠中、在大鼠細胞中或在來源於大鼠細胞的融合瘤中產生時，抗體可含有大鼠糖鏈。
本文術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恆定區一部分的C端區。該術語包括天然序列Fc區和Fc區變體。天然序列Fc區涵蓋天然存在的各種免疫球蛋白Fc序列，例如各種Ig亞型以及其同種異型的Fc區(Gestur Vidarsson等，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions，20 October 2014,doi：10.3389/fimmu.2014.00520.)。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc區自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規定，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU索引，如描述於Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
本文中的術語“Fc區變體”或“變體Fc區”在本文中可互換使用，指相對於天然序列Fc區包含修飾的Fc區。本發明的Fc區變體按照組成它們的胺基酸修飾來定義。
術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。
術語“醫藥組成物”指這樣的組合物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該組合物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
在本文中，“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。“免疫融合物”是與一個或多個其它的肽或多肽藉由共價連接而融合的抗體。
本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療相關疾病，例如癌症中有效的任何物質。
術語“細胞毒性劑”用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。
“化療劑”包括在治療癌症或免疫系統疾病中有用的化學小分子藥物。
術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。“小分子”被定義為分子量小於10kD、通常小於2kD和較佳為小於1kD的分子。小分子包括但不限於無機分子、有機分子、含無機組分的有機分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模擬物和抗體模擬物。作為治療劑，小分子可以比大分子更能透過細胞、對降解更不易感和更不易於引發免疫應答。
本文使用的術語“免疫調節劑”指調節(抑制或增強)免疫應答的天然或合成活性劑或者藥物。免疫應答可以是體液應答或細胞應答。免疫調節劑包含免疫抑制劑。在一些實施方案中，免疫調節劑包含增強免疫應答的活性劑或藥物，例如，有利於在癌症治療中增強抗癌免疫應答的活性劑或藥物。
本文使用的“免疫抑制劑”、“免疫抑制藥物”或“免疫抑制物”是在免疫抑制治療中用於抑制或阻止免疫系統活性的治療劑。
術語“癌”及“癌症”指或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調控的生理疾患。此定義中包括良性和惡性癌症以及休眠腫瘤或微轉移。癌症包括但不限於實體瘤和血液癌。各種癌症的實例包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。
本文術語“載體”是指任何重組多核苷酸構建體，該構建體可用於轉化的目的(即將異源DNA引入到宿主細胞中)。一種類型的載體為“質粒”，是指環狀雙鏈DNA環，可將額外DNA區段連接至該環中。另一類型的載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段連接至病毒基因組中。某些載體能夠在被引入到的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體及游離型哺乳動物載體)。在引入到宿主細胞中後，其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)整合至宿主細胞的基因組中，且因此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠導引被操作性連接的基因的表現。本文將此類載體稱為“表現載體”，表現載體是指能夠在轉化、轉染或轉導至宿主細胞中時複製及表現目的基因的核酸。表現載體包含一或多個表型選擇標記及複製起點，以確保維護載體及以在需要的情況下於宿主內提供擴增。
本文術語“受試者”或“患者”或“個體”包括任何人或非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
本文術語“治療有效量”、“治療有效劑量”和“有效量”是指本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段當單獨或與其它治療藥物組合給予細胞、組織或
受試者時，有效預防或改善一種或多種疾病或病況的症狀或該疾病或病況的發展的量。治療有效劑量還指足以導致症狀改善的抗體或其抗原結合片段的量，例如治療、治癒、預防或改善相關醫學病況或者提高這類病況的治療、治癒、預防或改善的速度的量。當對個體施用單獨給予的活性成分時，治療有效劑量僅是指該成分。當組合施用時，治療有效劑量是指引起治療效果的活性成分的綜合量，不論是組合、依次給予還是同時給予。治療劑的有效量將導致診斷標準或參數提高至少10%，通常至少20%，較佳為至少約30%，更佳為至少40%，最佳為至少50%。
在本文中，“治療”包括1)治療性措施，該措施治癒、減緩、減輕經診斷的病理狀況或疾患的症狀及/或停止該經診斷的病理狀況或疾患的進展及2)預防性或防範性措施，該措施預防及/或減緩病理狀況或疾患的發展。因此，治療者包括已罹患疾患的個體、易於罹患疾患的個體，以及欲預防疾患的個體。在一些實施方案中，本發明涉及疾病或病徵的治療；在另一些實施方案中，本發明涉及疾病或病徵的預防。
在根據本發明的一些實施方案中，疾病或病徵的“治療”是指改善疾病或病徵(即，減緩或阻止或減少疾病的進展或其臨床症狀的至少一個)。在另一些實施方案中，“治療”是指緩解或改善至少一個身體參數，包括可能不能被患者辨別出的那些物理參數。在另一些實施方案中，“治療”是指在身體上(例如，可辨別的症狀的穩定)、生理上(例如，身體參數的穩定)或在這兩方面調節疾病或病徵。除非在本文中明確描述，否則用於評估疾病的治療和/或預防的方法在本領域中通常是已知的。
在根據本發明的再一些實施方案中，疾病或病徵的“預防”包括對疾病或病徵或特定疾病或病徵的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。
在某些實施方式中，經本發明的方法"治療"癌症，若病患個體顯示下列一或多項，則認為該個體獲得了成功治療：癌細胞的數量減少或完全消失；腫瘤大小減少；抑制或缺乏癌細胞浸潤至週邊器官包括例如癌擴散至軟組織及骨；抑制或缺乏腫瘤轉移；抑制或缺乏腫瘤生長；緩解一或多種與該特定癌相關的症狀；減少發病率及死亡率；改善生活品質；減少腫瘤的腫瘤發生性、腫瘤發生頻率或腫瘤發生能力；減少腫瘤中的癌幹細胞的數量或頻率；使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生狀態；或一些效應的組合。
“抑制腫瘤生長”是指腫瘤細胞生長可藉以被抑制的任何機制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由延緩腫瘤細胞增生而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由停止腫瘤細胞增生而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由殺死腫瘤細胞而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由誘導腫瘤細胞凋亡而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由誘導腫瘤細胞分化而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由剝奪腫瘤細胞養分而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由預防腫瘤細胞移動而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由預防腫瘤細胞入侵而被抑制。
在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“(百分比)序列同一性”：
將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)軟體。所屬技術領域中具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何演算法。在本發明中，就抗體序列而言，胺基酸序列同一性百分數藉由將候選抗體序列與參考抗體序列最佳比對後，在一個較佳的方案中按照Kabat編號規則進行最佳比對後，予以確定。
本文術語“凝集”表示細胞結塊，而術語“血凝反應”表示特定的一類細胞(即血紅血球)結塊。因此，血凝反應是凝集的一種類型。
本文中對照抗體“Hu5F9”是根據專利US2015/0183874 A1中公開的5F9可變區序列，由GenScript重組表現的IgG4P形式的抗CD47抗體。對照抗體“SRF231”是根據專利US20180201677A1中公開的2.3D11可變區序列，由GenScript重組表現的IgG4P形式的抗CD47抗體。
抗CD47抗體及其產生
本發明的抗體可採用用於產生抗體的任何合適方法來產生。任何合適形式的CD47都可用作產生抗體的免疫原(抗原)。藉由舉例而非限制，任何CD47變體或其片段都可用作免疫原。在一些實施方案中，產生鼠源的單株抗人CD47抗
體的融合瘤細胞可藉由本領域公知的方法產生。這些方法包括但不限於最初由Kohler等(1975)(Nature 256：495-497)研發的融合瘤技術。較佳為根據標準方案，分離出小鼠脾細胞，用PEG或藉由電融合與小鼠骨髓瘤細胞株融合。然後篩選分泌抗體具有CD47結合等活性的融合瘤細胞。本發明的融合瘤細胞免疫球蛋白可變區的DNA序列可利用基於簡並引物PCR的方法測定。
來源於齧齒動物(如小鼠)的抗體在體內用作治療藥物時可引起不需要的抗體免疫原性，重複使用導致人體產生針對治療性抗體的免疫應答，這類免疫應答至少導致喪失治療功效，而嚴重的則導致潛在致死過敏反應。降低齧齒動物抗體的免疫原性的一種方法包括嵌合抗體的產生，其中將小鼠抗體可變區與人恆定區融合(Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43)。然而，嵌合抗體中的完整齧齒動物可變區的保留仍可在患者中引起有害的免疫原性。
將齧齒動物可變區的CDR移植到人構架上(即人源化)已被用於進一步將齧齒動物序列減至最低。本發明所述的人源化抗體，可以使用本領域已知的方法將鼠源CDR區插入人種系框架區。參見Winter等人的美國專利No.5,225,539及Queen等人的美國專利US5,530,101；US5,585,089；US5,693,762和US6,180,370。然而，CDR環交換仍不能均勻產生具有與起始抗體相同的結合性質的抗體。在人源化抗體中，常常還需要構架殘基(FR)(參與CDR環支持的殘基)改變以保持抗原結合親和力。Kabat等(1991)J.Immunol.147：1709。簡言之，人源化改造過程涉及以下步驟：A、把各候選抗體的基因序列與人胚胎系抗體基因序列進行比對，找出同源性高的序列；B、分析考察HLA-DR親和性，選出親和力低的人胚胎系框架序列；C、利用電腦類比技術，應用分子對接分析可變區及其周邊的框架胺基酸序列，考察其空間立體結合方式。藉由計算靜電力，凡得
瓦力，親疏水性和熵值，分析各候選的抗體基因序列中可與CD47作用以及維護空間構架的關鍵胺基酸個體，將其嫁接回已經選擇的人胚胎系基因框架，並在此基礎上標配出必須保留的框架區胺基酸位點，合成人源化抗體。
本發明的抗體可變區CDR的精確胺基酸序列邊界可使用許多公知的方案(例如Kabat、Chothia、AbM、Contact或North)中的任何方案來確定。應該注意，基於不同的定義系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體分子的CDR邊界是基於Kabat指派系統確定的。
具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內隻有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如所屬技術領域中具有通常知識者明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。在一些實施方案中，本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段在一個CDR的變體中，最小
結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或IMGT定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含選自重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該HCDR1包含與SEQ ID NO：11的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的胺基酸序列，HCDR2包含與SEQ ID NO：12的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的胺基酸序列，HCDR3包含與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含選自輕鏈互補決定區1(HCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該LCDR1包含與SEQ ID NO：14的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的胺基酸序列，該LCDR2包含與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的胺基酸序列，該LCDR3包含與SEQ ID NO：16的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段還涵蓋這樣的抗體或其抗原結合片段，其中在重鏈可變區的三個CDR上，相
對於本文具體公開的三個CDR，共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的序列，和/或在輕鏈可變區的三個CDR上，相對於本文具體公開的三個CDR，共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代)的序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段還涵蓋這樣的抗體或其抗原結合片段，其中與本文具體公開抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區相比，該重鏈可變區和/或輕鏈可變區有1個或多個(較佳為不超過10個，更佳為不超過6、5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳為胺基酸取代，更佳為胺基酸保守取代)，較佳為該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其重鏈可變區(VH)包含與選自SEQ ID NO：1、3、5、6或7的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，本發明所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其輕鏈可變區(VL)包含與選自SEQ ID NO：2、4、8、9或10的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的取代、插入或缺失。本文所述的胺基酸改變較佳為胺基酸取代，較佳為保守取代。
在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。本發明所述的胺基酸改變更佳為發生在重鏈可變區外和
/或輕鏈可變區外的區域。在一些實施方案中，胺基酸改變發生在重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，包含胺基酸改變的本發明的抗體與本文所公開的具體抗體具有相當或相似的性質。
在一些實施方案中，本發明的抗CD47抗體包括對CDR、輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈或重鏈的翻譯後修飾。
在一些實施方案中，本發明所提供的抗CD47抗體，其是全長抗體、單域抗體例如VHH、Fab抗體、Fab’抗體、Fab’-SH、(Fab’)2抗體、單鏈抗體例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或雙(多)特異性抗體。
在一些實施方案中，本發明所提供的抗CD47抗體，是任何IgG形式的抗體，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗體。在一些實施方案中，本發明所述的抗CD47抗體是IgG4P形式的抗體，即對人IgG4恆定區內的鉸鏈區進行修飾Ser228Pro(S228P，根據EU編號)，以避免或減少鏈交換。
在一些實施方案中，本發明所提供的抗體Fc區可引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區)，例如在Bruhns和Jönsson發表在Immunol Rev.2015 Nov；268(1)：25-51的文章中，在第44頁上，總結了多個對人IgG1進行改造以增強或降低其對FcγR的結合及增強或降低相應的功能。
在一些實施方案中，本發明所提供的抗CD47抗體包含Fc區變體，該Fc區變體具有降低或缺乏的Fcγ R結合活性。在一些實施方案中，該Fc區變體具有胺基酸取代，具體地，該胺基酸取代在選自免疫球蛋白重鏈E233、
L234、L235、N297和P331的位置處包含其它的胺基酸取代。在一些實施方案中，該Fc區變體的胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。
在一些實施方案中，本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一個或多個糖基化位點而方便地實現。糖基化可以被改變以例如增加抗體對“抗原”的親和力。可以藉由例如改變抗體序列內一個或多個糖基化位點來完成這種修飾。例如，可以進行一個或多個胺基酸取代，其導致消除一個或多個可變區框架糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這種無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。這樣的方法在例如美國專利No.5,426,300中有所描述。當抗體包含Fc區時，可以改變附著於其上的糖類。在一些應用中，除去不想要的糖基化位點的修飾是有用的，例如除去岩藻糖模組以提高抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC)功能。在其它應用中，可以進行半乳糖苷化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在一些實施方案中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。
在一些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步被修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。該非蛋白質部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、
聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
抗體表現
本發明涉及包含一種或多種表現載體的宿主細胞以及用於產生本發明的任何抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括培養該宿主細胞、純化和回收該抗體或抗原結合片段。
在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗CD47抗體或其抗原結合片段的核酸。例如，本發明提供了編碼包含本文所述重鏈、輕鏈、可變區或互補決定區的核酸。在一些方面，編碼重鏈可變區的核酸與SEQ ID NO：19所示的核酸具有至少85%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性。在一些方面，編碼輕鏈可變區的核酸與SEQ ID NO：20所示的核酸具有至少85%，89%，90%91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性。
在一方面，提供包含該核酸的一個或多個載體。在一些實施方案中，載體是表現載體。表現載體的選擇取決於載體要在其中表現的預期宿主細胞。通常，表現載體包含與編碼抗CD47抗體鏈或其抗原結合片段的核酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列(例如，增強子)。在一些實施方案中，該表現載體還包含編碼該抗體恆定區的序列。在一些實施方案中，該表現載體是PTT5載體或pCDNA載體，例如pCDNA3.4。
在一方面，本發明提供用於表現本發明的重組抗體的宿主細胞，包括原核或真核的。在一些實施方案中，大腸桿菌是一種可用於選殖和表現本發明的多核苷酸的原核宿主。其他適用的微生物宿主包括桿菌，例如枯草芽孢桿
菌，以及其他腸桿菌科，例如沙門氏菌，沙雷氏菌和各種假單胞菌。在這些原核宿主中，還可以製備表現載體，其通常包含與宿主細胞相容的表現調控序列(例如，複製起點)。在一些實施方案中，哺乳動物宿主細胞用於表現和產生本發明的抗CD47抗體多肽。例如，它們可以是表現內源性免疫球蛋白基因的融合瘤細胞株，也可以是具有外源性表現載體的哺乳動物細胞株，包括正常人細胞，或永生的動物或人細胞。例如，已經開發了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞株，包括CHO細胞株，各種COS細胞株，Expire293細胞、HEK293細胞，骨髓瘤細胞株，轉化的B細胞和融合瘤。
在一方面，本發明提供製備抗CD47抗體的方法，其中該方法包括，將表現載體導入哺乳動物宿主細胞中，藉由將宿主細胞培養足夠長的一段時間，以允許抗體在宿主細胞中表現，或者更佳為將抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中，來產生抗體。可採用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體。如本文該製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域中具有通常知識者是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，該熟知分析方法包括尺寸排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。
由不同細胞株表現或在轉基因動物中表現的抗體彼此間很可能具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸編碼的或包含本文提供的胺基酸序列的所有抗體是本發明的組成部分，而不論抗體的糖基化如何。
測定法
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗CD47抗體進行鑑定、篩選或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如藉由已知的方法諸如ELISA，Western印跡，等來進行。可使用本領域已知方法來測定對CD47的結合，本文中公開了例示性方法。
本發明還提供了用於鑑定具有生物學活性的抗CD47抗體的測定法。生物學活性可以包括例如與CD47(例如結合人CD47)的結合，與細胞表面CD47的結合，對CD47與其配體的阻斷作用、對紅血球凝集活性的促進特性的影響以及對人巨噬細胞吞噬腫瘤細胞作用的影響等。還提供了在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。在某些實施方案中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。
供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表現CD47或經改造而表現CD47細胞株，例如腫瘤細胞株。此類細胞還包括表現CD47和並非正常情況下表現CD47的轉染了編碼CD47的DNA的細胞株。
可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物或免疫融合物替換或補充抗CD47抗體來進行任何上述測定法。
可以理解的是，能夠使用抗CD47抗體和別的活性劑的組合來進行任何上述測定法。
免疫綴合物和免疫融合物
在一些實施方案中，本發明提供了免疫綴合物，其包含本文中提供的任何抗CD47抗體或其抗原結合片段和其它物質。在一個實施方案中，該其它物質例如細胞毒性劑，其包括任何對細胞有害的藥劑。
在一些實施方案中，本發明提供包含提供的任何抗CD47抗體或其抗原結合片段的免疫融合物。
在一些實施方案中，該免疫綴合物和該免疫融合物用於預防或治療CD47相關的疾病。
醫藥組成物
術語“醫藥組成物”指這樣的製劑，其允許包含在其中的活性成分以生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該製劑的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
術語“藥用輔料”指與治療劑一起施用的藥用載體、稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、或賦形劑。
本發明的醫藥組成物可包括本發明的抗體和藥用輔料。這些醫藥組成物可包括於試劑盒中，如診斷試劑盒。
如本文所用，“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些具有石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時，水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。
合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，Pharmaceutical Press，London，Chicago。該組合物還可以含有少量的
潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、緩釋劑等形式。口服配製劑可以包含標準載體，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精等。
本發明提供了包括本發明的一種或多種結合CD47的單株抗體或其抗原結合片段、核酸、載體或宿主細胞或免疫綴合物或融合物的醫藥組成物。應理解，本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段、核酸、載體或宿主細胞或免疫綴合物或融合物或其醫藥組成物可以整合製劑中合適的藥用載體、賦形劑和其他試劑以聯合給藥，從而提供改善的轉移、遞送、耐受等。
可以藉由將具有所需純度的本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段與一種或多種任選的藥用輔料混合來製備包含本文所述的抗CD47抗體的藥物製劑，較佳為以水溶液或凍乾製劑的形式。示例性的凍乾抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分，該活性成分是治療特定疾病所需的，較佳為具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還包含其它治療劑。在一些實施方案中，該其它治療劑為化療劑、放療劑、細胞因子、疫苗、其他抗體、免疫調節劑或者其他生物大分子藥物。
在一些實施方案中，本發明的醫藥組成物還包含編碼抗CD47抗體或其抗原結合片段的核酸的組合物。
方法或用途
在一方面，本發明提供預防、診斷或治療受試者CD47相關的疾病的方法。該方法包括向需要的患者施用有效量的本文所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段，或包含其的免疫綴合物或免疫融合物或醫藥組成物，或者本文所述的核酸、載體或宿主細胞。
在一方面，本發明提供抗CD47抗體或其抗原結合片段在生產或製備用於預防、診斷或治療受試者CD47相關的疾病的藥物的用途。
在一方面，本發明提供的抗CD47抗體及其抗原結合片段和包含其的醫藥組成物可以用作治療劑，用於預防或治療受試者CD47相關的疾病。針對藉由使用標準方法鑑定的受試者中CD47相關的疾病，可以施用本發明公開的抗CD47抗體及其抗原結合片段和包含其的醫藥組成物或免疫綴合物或免疫融合物，或者本文所述的核酸、載體或宿主細胞。
在一些實施方案中，本文所述的方法和用途還包括向該個體施用有效量的至少一種另外的治療劑或治療方式。在一些實施方案中，該治療劑例如化療劑、放療劑、細胞因子、疫苗、其他抗體、免疫調節劑或者其他生物大分子藥物。在一些實施方案中，治療方式包括外科手術；放射療法、局部照射或聚焦照射等。
上述聯合療法包括組合給藥(其中兩種以上治療劑被包含在相同或分開的製劑中)和分別給藥，其中，本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段的給藥可以發生在另外的治療劑和/或佐劑和/或治療方式的給藥前、同時和/或之後。
在一些實施方案中，本發明所述的CD47相關的疾病指與受試者中CD47表現、活性和/或信號傳遞異常相關的疾病，包括但不限於癌症。在一
些實施方案中，CD47相關的疾病中，編碼CD47的核酸(水準或含量)升高，或CD47表現升高，或CD47蛋白質水準升高、或活性升高，或活性信號傳遞增強。
在一些實施方案中，該疾病的治療將受益於抑制核酸或蛋白質水準的CD47，或受益於阻斷CD47與其配體的結合或CD47介導的信號傳遞。
在一些實施方案中，受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳為高等靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的個體)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。
在一些實施方案中，該癌症包括各種血液癌和實體瘤，以及轉移性病灶。在一個實施方案中，實體瘤的例子包括惡性腫瘤。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。該癌症例如膀胱癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、(惡性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、(良性)胎記瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌。在一些實施方案中，該淋巴瘤選自Burkitt淋巴瘤、彌漫性大細胞淋巴瘤或套細胞淋巴瘤。在一些實施方案中，該白血病為早幼粒細胞白血病。
本發明的抗體或抗原結合片段可以藉由任何合適的方式給藥，包括經口、腸胃外，肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內，靜脈內，動脈內，腹膜內或皮下給藥。給藥可以藉由任何合適的途徑進行，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於給藥是短
暫的還是長期的。本文考慮了各種給藥方案，包括但不限於在各個時間點上的單次或多次給藥，推注給藥和脈衝輸注。
本發明的抗體或抗原結合片段將以與良好醫學實踐一致的方式配製和施用。不是必須的，但任選地，該抗體與目前用於預防或治療該疾病的一種或多種試劑一起配製。這些其他試劑的有效量取決於製劑中存在的抗體的量，病徵或治療疾病的類型以及上面討論的其他因素。為了預防或治療疾病，本發明的抗體或抗原結合片段的合適劑量將取決於要治療的疾病的類型，抗體的類型，疾病的嚴重程度和病程，抗體是否為出於預防或治療目的，先前的治療，患者的臨床病史和對抗體的反應以及主治醫師的判斷力而施用。一次或經過一系列治療將抗體適當地施用於患者。
在某些實施方案中，本文中提供的任何抗CD47抗體或其抗原結合片段可以用於檢測CD47在樣品中的存在。在一些實施方案中，檢測方法包括：
(a)將樣品與本發明提供的抗體或其抗原結合片段或綴合物或融合物接觸；和
(b)檢測該抗體或其抗原結合片段或綴合物或融合物和CD47蛋白之間複合物的形成。
術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測。在某些實施方案中，樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，樣品來自過度增生性或癌性病灶相關病灶。
在一個實施方案中，可以使用本發明抗體或其抗原結合片段診斷CD47相關的疾病，例如癌症，例如評價(例如，監測)個體中本文所述疾病的治
療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中，提供標記的抗CD47抗體或其抗原結合片段。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。在一些實施方案中，本文提供用於診斷CD47相關的疾病的試劑盒，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段。
在本文中提供的一些實施方案中，樣品是在用抗CD47抗體或其抗原結合片段治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法治療過程中，或者用其他療法治療後獲得的。
本發明包括本文所述的特定實施方案的任何組合。應當理解，儘管描述了特定的內容和實施例來表明本發明較佳的實施方案，但是這僅僅是說明性的，用於舉例，本發明還涵蓋對所屬技術領域中具有通常知識者來說顯而易見的針對本發明的較佳實施方案的進行修改的實施方案。出於所有目的，包括引文在內的本文所引用的所有公開物、專利及專利申請將以引用的方式全部併入本文作為參考。
圖1顯示了抗體HMA02h14-48與Raji細胞表面CD47的結合活性。
圖2顯示了抗體HMA02h14-48與Toledo細胞表面CD47的結合活性。
圖3顯示了抗體HMA02h14-48與REC-1細胞表面CD47的結合活性。
圖4顯示了抗體HMA02h14-48阻斷人CD47與SIRPα的相互作用的活性。
圖5顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬Raji細胞的作用。
圖6顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬Toledo細胞的作用。
圖7顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬REC-1細胞的作用。
圖8顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬HL-60細胞的作用。
圖9顯示了抗體HMA02h14-48對紅血球體外凝集活性的影響。
圖10顯示了抗體HMA02h14-48結合人紅血球表面CD47的能力。
圖11顯示了Hu5F9和HMA02h14-48對Toledo腫瘤生長的抑制。
圖12顯示了Hu5F9和HMA02h14-48對REC-1腫瘤生長的抑制。
實施例1融合瘤抗體的製備與篩選
利用融合瘤技術獲得抗CD47抗體，採用帶有Fc標籤的人CD47胞外結構域的重組蛋白CD47-Fc(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5256)作為抗原免疫小鼠。將CD47-Fc重組蛋白與完全或不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)混合並乳化後，免
疫SJL(北京維通利華實驗動物技術有限公司)和BALB/c(揚州大學醫學中心)小鼠。小鼠經過一輪免疫(完全弗氏佐劑)以及兩輪加強免疫(不完全弗氏佐劑)後，並於每次加強免疫後取血，分別藉由ELISA技術檢測免疫後小鼠血清與重組人CD47-Fc(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5256)蛋白結合活性，同時藉由流式細胞術(FACS)檢測小鼠血清與過表現人CD47的CHO細胞(GenScript構建)的結合效價。選取血清效價高的小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞株SP2/0(ATCC)融合。在融合前四天，將人CD47胞外結構域的重組蛋白CD47-Fc腹腔注射於小鼠體內以加強免疫。融合當日，將小鼠安樂死後，取小鼠脾臟細胞進行勻質化以獲得單細胞懸浮液。使用電融合儀將小鼠脾臟細胞與鼠骨髓瘤細胞株SP2/0融合(3：1)。將融合後的細胞重新懸浮於含HAT(次黃嘌呤，胺基蝶呤和胸腺嘧啶去氧核苷，GIBCO，Cat：21060016)培養基篩選出成功融合的融合瘤細胞。收集融合瘤細胞的上清液，藉由兩輪ELISA篩選出具有分泌特異性結合人CD47抗體的融合瘤細胞。隨後利用CD47相關的功能篩選實驗(例如與人或食蟹猴的CD47結合特異性；無促紅血球凝集的活性；促進巨噬細胞對腫瘤細胞吞噬)，鑑定融合瘤分泌上清活性，陽性的融合瘤純株進行單輪或多輪亞選殖以得到單株。經篩選，125G4A4為最終選定的融合瘤純株。
將候選融合瘤細胞125G4A4擴大培養，經過7-10天培養後，收集上清，離心並過濾以去除細胞及碎片。將上清流過Protein A的純化管柱(GenScript)，繼而用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH 8.0)的緩衝液清潔平衡後，用0.1M檸檬酸鈉(pH 3.5)沖提，並立刻用九分之一體積的1M Tris-HCl(pH 9)中和，然後用PBS緩衝液透析。最終得到融合瘤抗體125G4A4用於進一步表徵。
1.1 FACS檢測抗體與過表現人CD47蛋白的CHO-K1細胞的結合活性
將人CD47蛋白(NCBI登錄號：NP_001768.1)過表現於倉鼠卵巢細胞株CHO-K1中，建立過表現人CD47蛋白的CHO-K1細胞株。將此細胞與經梯度稀釋後的抗體125G4A4以及對照抗體C0774CK230-C(即Hu5F9)共孵育(最高濃度300nM，三倍稀釋，共12個濃度點)，4℃孵育50分鐘。用冰的PBS將細胞洗滌兩次，加入iFluor647標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Genscript)，4℃避光孵育40分鐘。將細胞用冰的PBS洗滌兩次後，藉由Calibur(BD Biosciences)流式細胞儀檢測螢光信號，並根據其平均螢光強度(MFI)用GraphPad擬合濃度依賴的曲線並計算EC50。如表1所示，最終得到的融合瘤抗體125G4A4與過表現人CD47蛋白的CHO-K1具有較高的結合活性，EC50為0.22nM。
1.2 FACS檢測抗體與腫瘤細胞株表面上CD47結合活性
人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞表面內源性表現人CD47，將抗體125G4A4以及對照抗體Hu5F9梯度稀釋到含2%胎牛血清(FBS,Gibco,Cat：10100147)的PBS中(最高濃度46.3nM，三倍稀釋，共8個濃度點)，將稀釋後的抗體與Raji細胞(購至ATCC)(每孔5*105個細胞)混合後，4℃孵育1小時。然後用含2%胎牛血清(FBS)的PBS將細胞洗滌三次，加入PE標記的小鼠抗人IgG Fc抗體(Biolegend,Cat：409304)，4℃避光孵育1小時。將細胞用含2%胎牛血清(FBS)的PBS洗滌三次後，藉由CantoII(BD Biosciences)流式細胞儀檢測螢光信號，並根據其平均螢光強度(MFI)用GraphPad擬合濃度依賴的曲線並計算EC50。如表1所示，融合瘤抗體125G4A4與Raji細胞具有結合活性，EC50為0.84±0.02nM。
1.3 抗CD47抗體阻斷人CD47與SIRPα的相互作用
利用ELISA的方法檢測125G4A4在阻斷人CD47與SIRPα結合的能力。將人CD47胞外段與人IgG Fc端重組蛋白hCD47-Fc(ACROBiosystems,Cat：CD7-H5256)包被於96孔盤，4℃孵育過夜。用PBST(含有0.5%的Tween-20的PBS)洗盤3次後，加入含1% BSA的PBST封閉2小時。用PBST洗盤三次後，加入梯度稀釋的抗體125G4A4或對照抗體Hu5F9(最高濃度66.7nM，三倍稀釋，共8個濃度點)與終濃度為2.5μg/ml的SIRPα-His重組蛋白(ACROBiosystems,Cat：SIA-5225)的混合物，並在室溫孵育1小時。PBST洗盤3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗His-tag二抗(CWBIO,Cat：CW0285M)，用以檢測被包被的CD47捕獲的SIRPα。將96孔盤在37℃孵育30分鐘後，用PBST洗盤5次，加入TMD(Surmodics，Cat：TMBW-1000-01)顯色液，避光孵育15分鐘。加入2N H2SO4終止顯色反應。在酶標儀上讀取OD450。吸光度值反應了與CD47結合的SIRPα的量，用Graphpad擬合出濃度依賴的曲線並計算抗CD47抗體阻斷CD47與SIRPα結合的IC50。如表1所示，125G4A4能有效阻斷CD47與SIRPα的相互作用，IC50為3.06nM。
1.4 抗CD47抗體誘導人紅血球凝集活性的檢測
已知現有技術中，大多數的抗CD47抗體具有誘導紅血球凝集的特性。普遍認為，該特性與治療性抗CD47抗體治療時出現的貧血等副作用密切相關。為此，我們藉由體外紅血球凝集實驗對本發明中抗CD47抗體進行評估以篩選無促紅血球凝集特性的抗體。具體的方法如下，採集健康捐贈者的新鮮人的血液，用PBS洗五次後，稀釋成含10%人紅血球的懸浮液，將紅血球懸浮液與實驗抗體(抗體125G4A4以及對照抗體Hu5F9，最高濃度667nM，三倍稀釋，總共12個濃度點)混合後加入到圓底96孔盤中，在室溫孵育16個小時後拍照並根據細胞
在孔中的表現判定結果。如果發生了紅血球的凝集，則細胞會平鋪成網狀，孔中呈現出一個較大的片狀細胞層，直徑大於陰性對照孔；相反的，如果未發生凝集，則紅血球會沉積在孔底，孔中會出現較小的點狀的細胞團的沉澱。125G4A4在本實驗中未發生明顯的誘導紅血球凝集特性。
1.5 檢測抗CD47抗體對人巨噬細胞吞噬腫瘤細胞作用的影響
基於流式細胞術的測定方法檢測本發明抗體125G4A4促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。採集健康捐贈者的新鮮血液，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,Cat：17-1440-02)經密度梯度離心得到外周血單個核細胞(PBMC)。利用人總單核細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec,Cat：130-096-537)進一步分離得到單核細胞，加入巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF,R&D Systems,Cat：216-MC)貼壁培養連續7天，將單核細胞誘導分化為巨噬細胞。在進行吞噬試驗實驗當天，將上述已經完成分化的巨噬細胞置於無血清的培養基中饑餓2個小時。同時將靶腫瘤細胞Raji按照CFSE(eBioscience,Cat：65-0850-85)說明書推薦的標記步驟進行螢光標記。將標記好的腫瘤細胞與巨噬細胞按照4：1的比例混合，同時加入待測濃度的實驗抗體在37℃孵育2小時。然後用PBS將細胞洗滌兩次後用胰酶(Gibco,Cat：25200072)消化，加入APC標記的抗CD14抗體(Biolegend,Cat：325608)，在含2%胎牛血清的PBS中冰上避光孵育30分鐘。將細胞洗滌兩次並藉由流式細胞術進行分析。計算CD14陽性的巨噬細胞群體中CFSE陽性的細胞占比。如表1所述，125G4A4能有效促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬效應。
實施例2融合瘤抗體人源化改造
2.1 測定融合瘤抗體可變區序列
利用融合瘤測序的方法，將融合瘤純株125G4A4的細胞進行擴大培養並利用TRIzol(購自Ambio)提取總RNA，利用抗體特異性的引物將其反轉錄為DNA(Takara，PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)，並使用抗體特異性引物對編碼鼠免疫球蛋白V-區域的基因片段進行擴增，藉由序列測定分析，得到融合瘤抗體可變區序列，125G4A4抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQ.ID No.：1和2所示，核苷酸序列分別如SEQ.ID No.：19和20所示。
2.2 構建和表現嵌合抗體
根據CD47作用機理，本發明具體實施例中使用人IgG4(S228P)的恆定區作為抗體的重鏈恆定區，以人輕鏈κ鏈恆定區作為抗體輕鏈恆定區。將IgG4核心鉸鏈區228位的絲胺酸突變為脯胺酸(S228P)可增強核心鉸鏈區的二硫鍵連接，減少IgG4 Fab臂交換，大大減少了半分子的形成。重鏈和輕鏈恆定區基因合成後，重鏈和輕鏈可變區基因藉由EcoRI，BamHI雙酶切載體PTT5，同源重組進
載體。經測序正確後將抗體重鏈、輕鏈按摩爾比1.5：1的比例共轉染HEK293細胞。培養120小時後離心收集上清純化得到嵌合抗體。
在進行抗體人源化設計之前，需要將一些在CDR區的翻譯後修飾(post translational modification,PTM)的位點進行突變以避免對蛋白構像進而對其功能產生影響。經過PTM分析，在125G4A4的CDR鑑定出2個PTM位點，包括在重鏈存在一個NSS糖基化位點，和在輕鏈存在的一個DG異構化位點。NSS糖基化位點和DG異構化位點分別突變為QSS和EG。根據本實例純化得到突變後的嵌合抗體命名為Ch-125G4-m35。Ch-125G4-m35抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQ.ID No.：3和4所示。
2.3 嵌合抗體人源化設計
將嵌合抗體125G4A4m抗體可變區序列經過和PDB_Antibody database資料庫做Blast對比，選定與其相似度最高的人骨架序列進行人源化：125G4A4m重鏈可變區和人germline IGHV1-69，輕鏈可變區和人germline IGKV1-16有較高序列同源性。再藉由Kabat指派系統定義可變區CDR的胺基酸序列及其精確邊界。繼而將與鼠源抗體可變區CDR段嫁接至人骨架序列中，以實現抗體的人源化。
為了保持抗體活性，可利用電腦類比技術，應用分子對接分析可變區及其周邊的框架胺基酸序列，考察其空間立體結合方式。藉由計算靜電力，凡得瓦力，親疏水性和熵值，分析各候選的抗體基因序列中可與CD47作用及維護空間構架的關鍵胺基酸個體，將其嫁接回已經選擇的人抗體基因框架，並在此基礎上標出必須保留的框架區胺基酸位點，合成人源化抗體。抗體框架區一些關鍵位點要回復突變為嵌合抗體Ch-125G4-m35的抗體框架區序列。根據回復突變
數目和排列，分別設計出多條不同的人源化重鏈可變區(SEQ.ID No.：5，SEQ.ID No.：6，SEQ.ID No.：7)以及輕鏈可變區(SEQ.ID No.：8，SEQ.ID No.：9，SEQ.ID No.：10)(見表2)。本發明最後確定的人源化抗體Hu-125G4A4-48，在後續的實驗中將其命名為HMA02h14-48。該抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQ.ID No.：7和8所示。
2.4 人源化抗體表現
將上述人源化設計的重鏈和輕鏈可變區的DNA片段擴增並選殖至包含表現人抗體恆定區的載體中構建表現抗體的質粒(pCDNA3.4，購至Thermo Cat#
A14697)。將重鏈和輕鏈的表現載體共轉染Expire293細胞(Thermo Cat#A14525)，於37℃培養6天後，收集上清，根據前述方法，藉由Protein A親和純化，得到重組抗體用於抗體的進一步表徵。人源化抗體為IgG4 S228P(IgG4P)亞型。
實施例3人源化抗體的篩選
藉由檢測人源化抗體與食蟹猴B細胞的結合能力，人巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力及促紅血球凝集能力篩選高活性的人源化抗體。
檢測人源化抗體與食蟹猴B細胞的結合能力：利用流式細胞術方法檢測125G4A4人源化系列抗體與食蟹猴B細胞表面CD47的結合進行測定。具體方法如下：從食蟹猴血(由上海益諾思生物技術股份有限公司提供)中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,Cat：17-1440-02)經密度梯度離心分離獲得外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)。PBMC與125G4A4人源化系列抗體或isotype(IgG4P)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃孵育30分鐘。然後將細胞洗滌三次，與二抗(PE標記的小鼠抗人IgG Fc抗體，Biolegend,Cat：409304)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃避光孵育30分鐘。將細胞洗滌三次並藉由流式細胞術進行分析。用與食蟹猴有交叉反應性的抗人CD20的抗體(Brilliant Violet 421TM標記的抗人CD20 Antibody，Biolegend，Cat：302330)標記B細胞，在Canto II(BD Biosciences)上進行流式細胞儀檢測，得到其平均螢光強度(MFI)。
按照實施例1.5及1.4中描述方法分別檢測巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力及紅血球凝集能力。
結果如表5所示，125G4A4人源化系列抗體在測試濃度條件下與食蟹猴B細胞上表現的CD47結合，促進巨噬細胞對腫瘤細胞Raji的吞噬能力，
其中Hu-125G4A4m-48在33nM時吞噬效率最強，其它活性與嵌合抗體Ch-125G4m-m35相近，回突變數目較少。故選定其做進一步測試，後續測試命名為HMA02h14-48。
實施例4 FACS檢測HMA02h14-48與腫瘤細胞的結合能力
人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞(上海生命科學研究院，SIBS,CCL-86TM/ATCC)，人彌漫性大細胞淋巴瘤Toledo細胞(ATCC® CRL-2631TM))以及人套細胞淋巴瘤REC-1細胞(ATCC® CRL-3004TM)表面內源性表現人CD47，如前述實施例1.2所描述的檢測方法，利用流式細胞術檢測人源化抗體HMA02h14-48與上述腫瘤細胞表面CD47的結合。抗體濃度最高為667nM，梯度稀釋，總共測試8個濃度。
結果如圖1-3所示，HMA02h14-48與Hu5F9均與腫瘤細胞Raji,Toledo和REC-1細胞表面表現的CD47結合，HMA02h14-48在達到平臺期時的最大螢光強度高於Hu5F9，其EC50和最大螢光強度見表6。
本實施例中以及其他實施例中使用的陰性同型對照抗體(isotype)為人IgG4P，購自上海睿智化學研究有限公司。
實施例5 Biacore檢測抗體HMA02h14-48與人CD47的親和力
Biacore藉由測量表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)進行結合動力學參數的測定。此技術檢測抗體與抗原的結合(ka)和解離(kd)的微觀速率常數，藉由計算得到抗體與抗原的親和力數值。Biacore儀器(Biacore T200)及試劑均購自GE Healthcare。將抗人Fc抗體固定於sensor chip CM5。將純化的抗體(HMA02H14-48和Hu5F9)稀釋於流動相緩衝液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% Tween-20,pH 7.4)，流過包板了抗人Fc抗體的CM5晶片。然後將梯度稀釋過的人CD47-His(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5227)融合蛋白流過檢測晶片以測量抗原與抗體的結合，進而將流動相緩衝液流過晶片以檢測抗原與抗體的解離。收集不同濃度下，抗原與抗體的結合和解離信號資料，藉由1：1 Langmuir模型擬合，計算抗原與抗體的親和力。
結果如表7所示，HMA02h14-48與人CD47高親和力結合，KD值為7.77E-10(M)。
實施例6 ELISA檢測HMA02h14-48阻斷人CD47和SIRPα相互作用的活性
如前述實施例1.3所描述的檢測方法，利用ELISA檢測HMA02h14-48在阻斷人CD47與SIRPα相互作用的能力。抗體濃度最高為67nM，梯度稀釋，總共測試8個濃度。
結果如圖4所示，本發明抗體HMA02h14-48阻斷人CD47和SIRPα相互作用，IC50=1.58nM。
實施例7 HMA02h14-48對人巨噬細胞吞噬腫瘤細胞作用的影響
根據實施例1.5描述的方法，檢測HMA02h14-48促進人巨噬細胞對人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞，人彌漫性大細胞淋巴瘤Toledo細胞，人套細胞淋巴瘤REC-1細胞以及人早幼粒細胞白血病細胞株HL-60細胞的吞噬效果。抗體濃度最高為100μg/mL，梯度稀釋，總共測試8個濃度。
從結果顯示，相比對照抗體Hu5F9以及SRF231，HMA02h14-48能促進巨噬細胞對人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji的吞噬作用，最高吞噬效率可達36.5%，在0.1~100μg/ml不同濃度下的吞噬率均高於Hu5F9以及SRF231。HMA02h14-48對於人套細胞淋巴瘤REC-1的最高吞噬效率可達84.6%，並且在低濃度0.1μg/ml的情況下也可維持吞噬率於70%左右，高於Hu5F9以及SRF231。HMA02h14-48促進巨噬細胞對於Toledo細胞的吞噬，吞噬率可達94.2%。HMA02h14-48能促進巨噬細胞對腫瘤細胞HL-60的吞噬作用，最高吞噬效率可達65%。
實施例8檢測HMA02h14-48對紅血球體外凝集活性的影響
人紅血球在PBS中稀釋到10%，與滴入的CD47抗體在圓底96孔盤內在室溫孵育16小時。未沉澱的紅血球的存在是證明血細胞凝聚的證據，與未凝聚的紅血球沉澱形成白色圓點相比，未沉澱的紅血球呈網狀，面積大於陰性同型對照抗體(見圖9)。陰性同型對照抗體(Isotype)的檢測結果作為正常標準。
如前述實施例1.4所述的方法，對抗體HMA0214-48進行促紅血球凝集的檢測。抗體濃度最高為667nM，梯度稀釋，總共測試12個濃度。
結果如圖9所示，CD47抗體Hu5F9顯示在等於或高於0.9nM的濃度下，紅血球會顯著凝集，而本發明中抗體HMA02h14-48在0.004~667nM不同濃度下無明顯的引起人紅血球在體外的凝集。
實施例9 FACS檢測HMA02h14-48與人紅血球結合能力
已知現有技術中，治療性抗CD47抗體在臨床應用的時候，經常出現貧血的副作用。普遍認為抗CD47抗體與紅血球表面的CD47結合，進而造成巨噬細胞對紅血球的吞噬，可能是貧血發生的另一大主要原因。本發明中，我們利用流式
細胞術的方法對HMA02h14-48與人紅血球結合能力進行檢測，以評估抗體的風險。具體的，來源於健康捐獻者的紅血球與稀釋後的HMA02h14-48(最高濃度667nM，共8個測試濃度)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃孵育30分鐘。然後將細胞洗滌三次，與二抗(PE標記的小鼠抗人IgG Fc抗體，Biolegend,Cat：409304)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃避光孵育30分鐘。將細胞用含2%胎牛血清(FBS)的PBS洗滌三次後，並藉由Canto II(BD Biosciences)流式細胞儀檢測螢光信號，並根據其平均螢光強度(MFI)，用GraphPad擬合濃度依賴的曲線並計算EC50。
結果如圖10所示，HMA02h14-48結合人紅血球表面CD47的最大平均螢光強度低於對照抗體Hu5F9。其EC50和最大平均螢光強度見表9。
實施例10人源化抗體HMA02h14-48對Toledo腫瘤生長的抑制
目的：在NOD-Scid小鼠上建立Toledo皮下腫瘤模型，研究本發明抗體的抗腫瘤活性。
方法：用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養人彌漫性大細胞淋巴瘤細胞Toledo(ATCC® CRL-2631TM)。將腫瘤細胞懸浮於RPMI1640中，按1×107細胞/隻的劑量植入雄性NOD-Scid小鼠(上海靈暢生物科技有限公司)右肋皮下。
在腫瘤細胞接種後15天，將小鼠按腫瘤體積隨機分成6組，用PBS分別稀釋Hu5F9和HMA02h14-48抗體，以10mg/kg的劑量按表10所示方案給藥。陰性同型對照抗體(isotype)IgG4P購自上海睿智化學研究有限公司。
定期測量腫瘤體積(腫瘤體積=0.5×長徑×短徑2)和小鼠體重。用Excel軟體中student t檢驗對腫瘤體積變化和體重進行統計學分析，p<0.05為有顯著性統計學差異。統計給藥後各抗體治療組的腫瘤消退率。
各治療組腫瘤消退率計算公式為：[(D0腫瘤平均體積-Dt腫瘤平均體積)/D0腫瘤平均體積]×100%。
小鼠相對體重計算公式為：(測量當天小鼠體重/分組時小鼠體重)×100%。
結果：
實驗結果如表11和圖11所示。
Isotype對照抗體組腫瘤生長良好，而其餘治療組在給予抗體後，均出現了皮下腫瘤較起始體積逐漸縮小，直至完全消失的現象。其中，Hu5F9和HMA02h14-48抗體各劑量組均在第11天測量時達到腫瘤完全消失的效應(消退率100%)，與對照抗體對照組比較，腫瘤體積變化具有極顯著性差異。並且停藥後，持續觀察動物至第67天，仍然沒有發現腫瘤重新生長的跡象。此外，HMA02h14-48各劑量組動物狀態良好，第21天小鼠體重較治療前未見明顯差異。而Hu5F9高劑量組第21天的體重較第0天時降低了約5%，但與起始體重比較未見統計學差異(p>0.05)；而低劑量組未見體重下降的情況，提示Hu5F9對體重的影響具有一定的量效關係。
綜合以上資料，Hu5F9和HMA02h14-48抗體治療均具有極其顯著的抗腫瘤效應，10mg/kg單次給藥就可以使腫瘤完全消失，且持續時間長。
實施例11人源化抗體HMA02h14-48對REC-1腫瘤生長的抑制
目的：在NOD-Scid小鼠上建立REC-1皮下腫瘤模型，研究本發明抗體的抗腫瘤活性。
方法：用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養人套細胞淋巴瘤細胞REC-1(ATCC® CRL-3004TM)。將腫瘤細胞懸浮於RPMI1640中，按5×106細胞/隻的劑量植入雄性NOD-Scid小鼠(上海靈暢生物科技有限公司)右肋皮下。
在腫瘤細胞接種後11天，將小鼠按腫瘤體積隨機分成5組，用PBS稀釋Hu5F9和HMA02h14-48抗體，按表12所示方案給藥。抗體Hu5F9由GenScript製備，抗體HMA02h14-48根據實施例2方法製備。同型對照抗體(isotype)IgG4p購自上海睿智化學研究有限公司。
定期測量腫瘤體積(腫瘤體積=0.5×長徑×短徑2)、小鼠體重。統計給藥後第12天抗體治療組的腫瘤抑制率和消退率。
腫瘤抑制率計算公式為：[(對照組腫瘤平均體積變化-給藥組腫瘤平均體積變化)/對照組腫瘤平均體積變化]×100%。用Excel軟體中Student t檢驗對腫瘤體積變化和體重進行統計學分析，p<0.05為有顯著性統計學差異。
各治療組腫瘤消退率計算公式為：[(D0腫瘤平均體積-Dt腫瘤平均體積)/D0腫瘤平均體積]×100%。
小鼠相對體重計算公式為：(測量當天小鼠體重/分組時小鼠體重)×100%。
結果：
實驗結果如表13和圖12所示。
給藥後12天，與Isotype組比較，抗體Hu5F9在單次給藥3mg/kg的劑量下對腫瘤生長的抑制率為16.7%(p>0.05)；抗體HMA02h14-48在單次給藥1mg/kg,3mg/kg和10mg/kg的劑量下對腫瘤生長的抑制率分別為3.8%(p>0.05),54.7%(p<0.01)和107.2%(p<0.001)。其中，HMA02h14-48抗體高劑量組在第10天測量時達到腫瘤完全消失的效應(消退率100%)，此外，各抗體治療組小鼠相對體重未見明顯差異。
綜合以上資料，在REC-1模型上，HMA02h14-48抗體治療具有劑量依賴性，10mg/kg單次給藥就可以使腫瘤完全消失。
本發明的序列：
<110> 大陸商和記黃埔醫藥(上海)有限公司
<120> 抗CD47抗體及其用途
<130> PF210205PCT
<160> 22
<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 1
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 2
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 3
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 4
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 5
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 6
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 7
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 8
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 9
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 11
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 12
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 13
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 15
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 16
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 17
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 18
<210> 19
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 19
<210> 20
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<400> 20
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> misc_特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸，較佳為N或Q或H、D、K、R或E，或其保守胺基
酸
<400> 21
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> misc_特徵
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸，較佳為D或E或N或Q，或其保守胺基酸
<400> 22
Claims (21)
- 一種分離的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含(1)選自重鏈可變區(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示；和/或(2)選自輕鏈可變區(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示。
- 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其包含VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3和VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該VH和VL選自：(1)VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；(2)VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；(3)VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列；(4)VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列；或(5)VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列。
- 一種分離的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含(1)選自重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列；和/或(2)選自輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
- 如請求項3所述的抗體或其抗原結合片段，其包含(1)重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列和該HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列；和/或(2)輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，(1)該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列和該HCDR3包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；和/或(2)該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含(1)重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或(2)輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
- 如請求項6所述的抗體或其抗原結合片段，其中該VH包含SEQ ID NO：1、3、5、6或7中任一所示的胺基酸序列，該VL包含選自SEQ ID NO：2、4、8、9或10中任一所示的胺基酸序列。
- 如請求項7所述的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，且其中該VH和VL選自：(1)VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；和VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；(2)VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；和VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；(3)VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；和VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列；(4)VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列；和VL包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列；或(5)VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；和VL包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列。
- 如請求項8所述的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈恆定區，如人IgG1恆定區、人IgG1TM恆定區、人IgG4恆定區或人IgG4P恆定區。
- 如請求項1至10中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈恆定區，例如人輕鏈κ鏈恆定區。
- 如請求項1至11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
- 如請求項1至12中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是全長抗體、單鏈抗體、單域抗體例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2、單鏈抗體例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或雙(多)特異性抗體。
- 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種重組載體或表現載體，其包含一個或多個如請求項14所述的核酸，其中該載體適合用於重組產生如請求項1至13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種宿主細胞，其包含一個或多個如請求項15所述的重組載體或表現載體。
- 一種免疫綴合物或免疫融合物，其包含如請求項1至13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如請求項14所述的核酸、如請求項15所述的載體、如請求項16所述的宿主細胞、或如請求項17所述的免疫綴合物或免疫融合物，以及任選地包含一種藥學上可接受的輔料。
- 一種治療或預防癌症的方法，其包括對該個體施用有效量的如請求項1至13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如請求項14所述的核酸、如請求項15所述的載體、如請求項16所述的宿主細胞、如請求項17所述的免疫綴合物或免疫融合物或如請求項18所述的醫藥組成物。
- 如請求項19所述的方法，其中該癌症包括血液癌和實體瘤，例如膀胱癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、(惡性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、(良性)胎記瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌、尿路上皮癌等。
- 一種檢測樣品中CD47蛋白的方法，包括：(a)將樣品與如請求項1至13中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合片段或如請求項17所述的免疫綴合物或融合物接觸；和(b)檢測該抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物或免疫融合物和CD47蛋白之間複合物的形成。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010282924 | 2020-04-10 | ||
| CN202010282924.0 | 2020-04-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202140565A true TW202140565A (zh) | 2021-11-01 |
| TWI869582B TWI869582B (zh) | 2025-01-11 |
Family
ID=78024001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW110112951A TWI869582B (zh) | 2020-04-10 | 2021-04-09 | 抗ｃｄ４７抗體及其用途 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230151110A1 (zh) |
| EP (1) | EP4132976A4 (zh) |
| JP (1) | JP7748389B2 (zh) |
| KR (1) | KR20230015331A (zh) |
| CN (1) | CN115698066A (zh) |
| AR (1) | AR121805A1 (zh) |
| AU (1) | AU2021251989A1 (zh) |
| BR (1) | BR112022020555A2 (zh) |
| CA (1) | CA3179373A1 (zh) |
| CL (1) | CL2022002727A1 (zh) |
| IL (1) | IL297171A (zh) |
| MX (1) | MX2022012588A (zh) |
| PE (1) | PE20230765A1 (zh) |
| PH (1) | PH12022552688A1 (zh) |
| TW (1) | TWI869582B (zh) |
| WO (1) | WO2021204281A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR127273A1 (es) * | 2021-10-09 | 2024-01-03 | Hutchmed Ltd | Anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a cd47 y her2 y usos de los mismos |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006089209A2 (en) * | 2005-02-17 | 2006-08-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Txr1 and enhanced taxane sensitivity based on the modulation of a pathway mediated thereby |
| PE20151408A1 (es) | 2013-02-06 | 2015-10-15 | Inhibrx Llc | Anticuerpos cd47 que no agotan plaquetas ni globulos rojos y metodos de uso de los mismos |
| CA2998644A1 (en) | 2015-09-18 | 2017-03-23 | Arch Oncology, Inc. | Therapeutic cd47 antibodies |
| US9650441B2 (en) * | 2015-09-21 | 2017-05-16 | Erasmus University Medical Center | Anti-CD47 antibodies and methods of use |
| CN106117354B (zh) * | 2016-06-24 | 2020-01-14 | 安徽未名细胞治疗有限公司 | 一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体及其应用 |
| CN107955071B (zh) * | 2016-10-18 | 2021-03-26 | 上海赛远生物科技有限公司 | 人源抗人cd47抗体及其编码基因与应用 |
| CN114773471A (zh) | 2016-10-20 | 2022-07-22 | 天境生物科技(上海)有限公司 | 新的cd47单克隆抗体及其应用 |
| NZ761568A (en) | 2017-08-02 | 2022-11-25 | Phanes Therapeutics Inc | Anti-cd47 antibodies and uses thereof |
| CN109422811A (zh) | 2017-08-29 | 2019-03-05 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 抗cd47抗体及其用途 |
| CN108503708B (zh) * | 2017-09-01 | 2021-07-30 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 抗人cd47抗体及其用途 |
| EP3743108A4 (en) | 2018-01-24 | 2022-01-26 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | ANTI-CD47 ANTIBODIES THAT DO NOT CAUSE SIGNIFICANT RBC AGGLUTINATION |
| WO2020043188A1 (zh) * | 2018-08-31 | 2020-03-05 | 南京圣和药业股份有限公司 | 抗cd47抗体及其应用 |
| CN110066336B (zh) * | 2019-05-12 | 2021-11-09 | 杭州科兴生物科技有限公司 | 抗cd47单克隆抗体、片段及其医药用途 |
| AR127273A1 (es) * | 2021-10-09 | 2024-01-03 | Hutchmed Ltd | Anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a cd47 y her2 y usos de los mismos |
| AR127271A1 (es) * | 2021-10-09 | 2024-01-03 | Hutchmed Ltd | Anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a cd47 y cd20, y usos de los mismos |
| AR127270A1 (es) * | 2021-10-09 | 2024-01-03 | Hutchmed Ltd | Formulación de anticuerpos anti-cd47 |
-
2021
- 2021-04-09 TW TW110112951A patent/TWI869582B/zh active
- 2021-04-09 AR ARP210100941A patent/AR121805A1/es unknown
- 2021-04-11 PH PH1/2022/552688A patent/PH12022552688A1/en unknown
- 2021-04-11 CN CN202180024295.4A patent/CN115698066A/zh active Pending
- 2021-04-11 CA CA3179373A patent/CA3179373A1/en active Pending
- 2021-04-11 WO PCT/CN2021/086339 patent/WO2021204281A1/en not_active Ceased
- 2021-04-11 KR KR1020227038980A patent/KR20230015331A/ko active Pending
- 2021-04-11 JP JP2022561627A patent/JP7748389B2/ja active Active
- 2021-04-11 EP EP21784434.9A patent/EP4132976A4/en active Pending
- 2021-04-11 BR BR112022020555A patent/BR112022020555A2/pt unknown
- 2021-04-11 PE PE2022002149A patent/PE20230765A1/es unknown
- 2021-04-11 MX MX2022012588A patent/MX2022012588A/es unknown
- 2021-04-11 AU AU2021251989A patent/AU2021251989A1/en active Pending
- 2021-04-11 IL IL297171A patent/IL297171A/en unknown
- 2021-04-11 US US17/995,810 patent/US20230151110A1/en active Pending
-
2022
- 2022-10-04 CL CL2022002727A patent/CL2022002727A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PE20230765A1 (es) | 2023-05-09 |
| US20230151110A1 (en) | 2023-05-18 |
| CA3179373A1 (en) | 2021-10-14 |
| IL297171A (en) | 2022-12-01 |
| CL2022002727A1 (es) | 2023-05-26 |
| EP4132976A1 (en) | 2023-02-15 |
| BR112022020555A2 (pt) | 2022-12-06 |
| AR121805A1 (es) | 2022-07-13 |
| JP2023521790A (ja) | 2023-05-25 |
| EP4132976A4 (en) | 2024-05-01 |
| WO2021204281A1 (en) | 2021-10-14 |
| JP7748389B2 (ja) | 2025-10-02 |
| MX2022012588A (es) | 2022-11-07 |
| AU2021251989A1 (en) | 2022-11-17 |
| TWI869582B (zh) | 2025-01-11 |
| KR20230015331A (ko) | 2023-01-31 |
| PH12022552688A1 (en) | 2022-12-19 |
| CN115698066A (zh) | 2023-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021254481A1 (zh) | 抗Claudin18.2抗体以及其用途 | |
| CN116261590B (zh) | 抗cd3抗体以及其用途 | |
| TWI877350B (zh) | 抗ｏｘ４０抗體及其用途 | |
| CN112166125B (zh) | 全人源的抗lag-3抗体及其应用 | |
| TW202325735A (zh) | 特異性結合ｃｄ４７及ｃｄ２０之雙特異性抗體及其用途 | |
| KR20210121102A (ko) | 항-cd79b 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 이의 약학적 용도 | |
| WO2022068810A1 (zh) | 抗Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及其用途 | |
| TW202330627A (zh) | 特異性結合cd47和her2的雙特異性抗體及其用途 | |
| CN118139639A (zh) | 治疗与免疫抑制b细胞相关联的癌症的方法 | |
| CN118176217A (zh) | 新型抗体-细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CA3209827A1 (en) | Anti-tnfr2 antibody and use thereof | |
| TWI869582B (zh) | 抗ｃｄ４７抗體及其用途 | |
| TW202442679A (zh) | 抗－ｆｇｆｒ２ｂ抗體及其用途 | |
| TW202330027A (zh) | 抗ｃｄ－４７抗體製劑 | |
| HK40085373A (zh) | 抗cd47抗体及其用途 | |
| HK40085344B (zh) | 抗ox40抗体及其用途 | |
| WO2025067442A1 (zh) | 抗fgfr2抗体和包含其的多特异性结合分子 | |
| CN120818052A (zh) | 抗il-15抗体以及其用途 | |
| HK40085822A (zh) | 抗ox40抗体及其用途 | |
| HK40085344A (zh) | 抗ox40抗体及其用途 | |
| TW202547880A (zh) | 抗cd3抗體以及其用途 |