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TW202146663A - 基因標記組合及其應用 - Google Patents

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TW202146663A
TW202146663A TW109134190A TW109134190A TW202146663A TW 202146663 A TW202146663 A TW 202146663A TW 109134190 A TW109134190 A TW 109134190A TW 109134190 A TW109134190 A TW 109134190A TW 202146663 A TW202146663 A TW 202146663A
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張志偉
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鄒鴻志
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大陸商廣州康立明生物科技股份有限公司
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Abstract

本發明屬於生物醫藥領域，特別涉及一種基因標記組合及其應用。本發明通過研究發現：通過檢測HOXB4、SRCIN1、HOXA7基因組合的甲基化水平，可以很好的區分肺癌標本。本發明的試劑經試驗證實，可以高靈敏、高特異地檢測和診斷肺癌，有極高的臨床應用價值。

Description

基因標記組合及其應用
本發明屬於生物醫藥領域，特別涉及一種基因標記組合及其應用。
肺癌是起源於支氣管粘膜、腺體或肺泡上皮的肺部惡性腫瘤。按照病理類型可以分為：1）小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）：一種特殊病理學類型的肺癌，有明顯的遠處轉移傾向，預後較差，但多數病人對放化療敏感；2）非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）：除小細胞肺癌以外其他病理學類型的肺癌，包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等。在生物學行為和臨床病程方面具有一定差異。按照發生位置又可以分為：1）中心型肺癌（central lung cancer）：生長在肺段支氣管開口及以上的肺癌；2）周圍型肺癌（peripheral lung cancer）：生長在肺段支氣管開口以遠的肺癌。
近年來，人口老齡化、大氣污染及吸煙等因素的影響，致使中國肺癌的發病率和死亡率逐年遞增，根據國家癌症中心發佈的《2017中國腫瘤登記年報》顯示，全國每分鐘約 7 人確診患癌，其中肺癌發病率與死亡率均為第一位。中國已成為世界上肺癌人數最多的國家，專家預測到2025年中國肺癌的人數將達到100萬。而根據流行病學研究顯示：吸煙是引起肺癌的重要因素。世界上約80%-90%的肺癌可歸因於吸煙。與非吸煙者相比，45-64歲每日吸香煙1-19支和20支以上者患肺癌的相對危險度分別為4.27和8.61，與從不吸煙者比較，長期每日吸煙1-19支和20支以上者死於肺癌的相對危險度分別為6.14和10.73。雖然肺癌的治療技術日新月異，但5年生存率從4%僅上升至12%左右，現有的抗腫瘤藥物仍只能起到緩解病情作用，患者無進展生存期平均僅延長3個月~5個月，但對於I期肺癌患者，手術後5年生存率高達約60%~70%。因此肺癌的早期診斷與早期手術是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。
肺癌目前的臨床輔助診斷主要有以下幾種，但是它們都不能完全做到早發現，早診斷：
（1）血液生化檢查：對於原發性肺癌，目前無特異性血液生化檢查。肺癌病人血液鹼性磷酸酶或血鈣升高考慮骨轉移的可能，血液鹼性磷酸酶、穀草轉氨酶、乳酸脫氫酶或膽紅素升高考慮肝轉移的可能。
（2）腫瘤標記檢查：1）CEA：30%～70%肺癌患者血清中有異常高水平的CEA，但主要見於較晚期肺癌患者。目前血清中CEA的檢查主要用於估計肺癌預後以及對治療過程的監控。2）NSE：是小細胞肺癌首選標記，用於小細胞肺癌的診斷和監測治療反應，根據檢測方法和使用試劑的不同，參考值不同。3）CYFRA21-1：是非小細胞肺癌的首選標記物，對肺鱗癌診斷的敏感性可達60%，根據檢測方法和使用試劑的不同，參考值不同。
（3）影像學檢查：1）胸部X線檢查：應包括胸部正位和側位片。在基層醫院，胸部正側位片仍是肺癌初診時最基本和首選的影像診斷方法。一旦診斷或疑診肺癌，即行胸部CT檢查。2）CT檢查：胸部CT是肺癌的最常用和最重要的檢查方法，用於肺癌的診斷與鑒別診斷、分期及治療後隨診。CT引導下肺穿刺活檢是肺癌的重要診斷技術，有條件的醫院可將其用於難以定性的肺內病變的診斷，以及臨床診斷肺癌需經細胞學、組織學證實而其它方法又難以取材的病例。近年來，多層螺旋CT和低劑量CT（LDCT）是發現早期肺癌和降低死亡率的有效篩查工具，全美國家肺癌篩查研究（NLST）已經表明LDCT相比胸部X線篩查可降低20%肺癌的死亡率。低劑量螺旋CT被推薦為早期肺癌篩查的重要手段，但是人為影響因素較多，假陽性率非常高。3）超聲檢查：主要用於發現腹部重要器官及腹腔、腹膜後淋巴結有無轉移，也用於頸部淋巴結的檢查。對於貼鄰胸壁的肺內病變或胸壁病變，可鑒別其囊實性及進行超聲引導下穿刺活檢；超聲還常用于胸水抽取定位。4）骨掃描：對肺癌骨轉移檢出的敏感性較高，但有一定的假陽性率。可用於以下情況：肺癌的術前檢查；伴有局部症狀的病人。
（4）其它檢查：1）痰細胞學檢查：目前肺癌簡單方便的無創診斷方法，連續塗片檢查可提高陽性率約達60%，是可疑肺癌病例的常規診斷方法。2）纖維支氣管鏡檢查：肺癌診斷中最重要的手段之一，對於肺癌的定性定位診斷和手術方案的選擇有重要的作用。對擬行手術治療的患者為必需的常規檢查項目。而經支氣管鏡穿刺活檢檢查（TBNA），雖利於治療前分期，但因技術難度和風險較大，有需要者應轉上級醫院進一步檢查。3）其他：如經皮肺穿刺活檢、胸腔鏡活檢、縱隔鏡活檢、胸水細胞學檢查等，在有適應證的情況下，可根據現有條件分別採用以協助診斷。
影像學檢查中的多層螺旋CT和低劑量CT（LDCT）是發現早期肺癌和降低死亡率的有效篩查工具，全美國家肺癌篩查研究（NLST）已經表明LDCT相比胸部X線篩查可降低20%肺癌的死亡率。在臨床實踐工作中證明，任何肺癌篩查項目的成敗取決於高危人群的識別，融合多重高危因素的風險預測模型已被世界公認是識別肺癌高危人群的方法之一。風險模型通過協助臨床醫生改進干預措施或治療手段，從而進一步改善肺癌患者的療效。雖然世界已經認同針對高危人群的篩查能夠降低肺癌目前較高的死亡率，但高危人群界定仍然是難以解決的問題。為了使肺癌篩查的效益-傷害比達到最大化，關鍵的問題第一是如何界定高危患病風險的人群；第二是用什麼方法對該人群進行篩查，包括高危因素的界定，總體風險的量化匯總以及篩查效益界值的選擇。
隨著技術的飛速發展，腫瘤標記檢測成為繼影像學診斷，病理診斷之後的腫瘤診斷治療新領域，能夠對腫瘤的診斷，檢測，治療產生重大的影響。腫瘤標記可以在體液或者是組織中檢測到，能夠反映腫瘤的存在，分化程度，預後估計和個性化用藥以及治療效果等。早期肺癌患者沒有明顯的症狀，難以被醫生和患者察覺，再加之其在血液或生化項目上沒有明顯的特異性的標識物，因此難以通過常規的診斷方法進行早期發現和早期診斷，因此對肺癌早期診斷，尤其是大規模應用人群篩查上較為困難。
越來越多的研究表明，在腫瘤形成過程中包含兩大類機制。一個是通過DNA核苷酸序列改變而形成突變，即遺傳學機制。腫瘤作為一種遺傳學疾病在分子生物學領域已經得到證實。另外一個就是表觀遺傳學（epigenetics）機制，即不依賴DNA序列改變導致基因表達水平的變化，它在腫瘤形成過程中的作用越來越受到重視。遺傳學與表觀遺傳學兩種機制相互交叉存在，共同促進了腫瘤的形成。基因的異常甲基化在腫瘤發生的早期就可出現，並且在腫瘤逐步發展的過程中，基因異常甲基化的程度增加。對常見的98種人類原發腫瘤的基因組進行分析，發現每種腫瘤至少有600個異常甲基化的CpG島。
許多研究顯示啟動子異常甲基化在許多腫瘤的發生過程中是一個頻發的早期事件，因此腫瘤相關基因的甲基化狀態是腫瘤發生的一個早期敏感指標，被認為是一種有前景的腫瘤分子生物標記（biomarker）。更為重要的是，癌變細胞可以釋放DNA到外周血中。正常人外周血中都存在納克級的游離DNA。研究發現外周血血漿/血清、腫瘤累及器官相關的體液（如唾液、痰等）中同樣可以檢測到腫瘤組織中存在的腫瘤相關基因的啟動子異常甲基化。這些生物樣品比較容易獲得，並且通過PCR技術將其中的DNA進行大量的擴增後能夠很靈敏的檢測到，因此檢測其中某些腫瘤相關基因的啟動子區甲基化狀態，可以為腫瘤的早期診斷提供非常有價值的資訊。與其它類型的腫瘤分子標記物相比，檢測啟動子異常甲基化有更多的優點。某一基因在不同類型腫瘤中，其啟動子異常甲基化的區域是相同的，檢測比較方便；另外與等位基因缺失這樣的標記相比，異常甲基化是一個陽性信號，很容易與正常組織中的陰性背景區分。Esteller 等檢測了22例非小細胞肺癌（NSCLC）的腫瘤組織和血清中p16、DAPK、GSTP1及MGM T等基因的啟動子區異常甲基化狀態，發現68%（15/22）的腫瘤組織中存在至少一種基因的啟動子甲基化；而在15例組織陽性病例中，有11例同時在血清中也檢測到了啟動子異常甲基化的存在。另有許多研究者也分別從肝癌、頭頸部癌、食管癌及結腸癌患者的腫瘤組織和血清中同時檢測出了某些腫瘤相關基因的啟動子甲基化。
現有的肺癌檢測技術中主要存在靈敏度低、假陽性高，有創，並且，目前常規檢測技術難以檢出早期肺癌。
而肺癌的無創檢測，例如，痰液檢測，難度則更大。儘管也有研究者研究肺癌患者痰液中的腫瘤標記，然而，對比起其他腫瘤患者血液樣本的腫瘤標記檢測及評估，痰液樣本的成功率卻很低。這主要由於以下原因：①痰液的成分比較複雜，不同的人群在不同的疾病或者環境下痰液的成分和粘度等差異比較大；②痰液中含有較多的氣管上皮細胞和細菌，口腔黏膜細胞等非肺癌細胞的成分，一般的樣本處理方法無法有效的富集到數目充足的肺癌來源的DNA；③有很多的吸煙患者並不表現出咳痰。A J Hubers等人在《Molecular sputum analysis for the diagnosis of lung cancer》中對過去10篇文獻研究顯示，肺癌組織中標記的中位數的甲基化程度為48%，而痰液的中位數的甲基化程度為38%，結果顯示甲基化標記在組織中的檢出率明顯高於痰液。同時，Rosalia Cirincione（Methylation profile in tumor and sputum samples of lung cancer patientsdetected by spiral computed tomography: A nested case–contro）報道了RARbeta2、P16、RASSF1A在肺癌組織中檢出率分別達到65.5%、41.4%、51.7%，而在痰液中分別只有44.4%、5%、5%。
一些實施方案中，本發明提供了一種基因標記組合，以及檢測該基因標記組合的檢測/診斷試劑及其應用。
一些實施方案中，本發明提供了一種基因標記組合，所述基因標記包括HOXB4、SRCIN1和HOXA7。
一些實施方案中，本發明的基因標記組合，還包括了各基因標記中的任意長度的片段，也就是說，來自HOXB4、SCRIN1和HOXA7各自任意一個片段（該片段可以為任意長度）組合，均落入本發明的保護範圍中。
HOXB4基因是Antp同源盒基因家族的一員，屬於染色體17上的同源盒B簇基因。編碼帶有同源盒DNA結合結構域的核蛋白，編碼的蛋白作為參與發育的特異性序列轉錄因子。該蛋白的細胞內或異位表達可在體內和體外擴增造血幹細胞和祖細胞，使其成為治療性幹細胞擴增的潛在候選者。
SRCIN1（SRC kinase signaling inhibitor 1）全稱為SRC激酶信號傳導抑制基因1。SRCIN1基因和蛋白質作為SRC的負調控因子，通過激活CSK抑制SRC活性和下游信號傳導，導致細胞擴散和遷移受損。調節樹突棘的形態。參與鈣依賴性的胞吐作用。目前研究顯示SRCIN1在多種腫瘤生長中起到重要作用。
HOXA7基因是HOX（homebox 同源盒）基因家族的一員，屬於染色體7p15-p14上的HOXA簇基因，與其他的HOX基因一樣，均含有一段180bp的DNA片段，轉錄由60個氨基酸酸組成的同源結構域。HOXA7在正常造血細胞的增殖分化中發揮調節作用，目前研究比較多的是HOXA7的異常表達在白血病的發生和發展中起著重要的作用。
一些實施方案中，本發明還提供了多基因的甲基化聯合檢測試劑在製備肺癌檢測試劑或者試劑盒中的應用，所述基因包括HOXB4、SRCIN1和HOXA7。
目前肺癌的漏檢率較高。特別是，對於腺癌這種類型，痰液無創檢測更加是難上加難，檢出率極其低。這是因為，多數腺癌起源於較小的支氣管，為周圍型肺癌，肺深部的脫落細胞更加難以通過痰液咳出。因此，目前腺癌的痰液檢測手段幾乎為零。
降低漏檢率在腫瘤早期篩查中是尤其重要的。如果一個腫瘤早期篩查產品無法將所有或絕大部分的病患篩查出來的話，那麼漏檢的那些將無法得到足夠的風險提示，從而延誤的治療時機，這對患者來說是一個巨大的損失。
儘管現有技術中已經發現了一些肺癌相關的腫瘤標記，但是，受限於針對這些腫瘤標記的檢測試劑或者檢測手段，導致這些腫瘤標記的靈敏度和特異性不能滿足需求，因此，目前本領域中仍然需要進一步研究能夠切實地應用於肺癌的篩查手段。然而，雖然無創式的篩查具有取樣方面獨到的優勢，然而，其也具有其他方面的一些局限，例如，肺癌中的腺癌這種類型，由於其肺深部的脫落細胞難以通過痰液咳出，通常說來，本領域技術人員會認為該種類型的肺癌不適宜採用無創篩查。另一方面，即使是其他類型的肺癌，目前已報道的無創篩查方法也很難達到臨床使用的要求。儘管相關研究已進展多年，但至今仍未有可以推向臨床的肺癌無創篩查方法。
一些實施方案中，本發明還提供了一種多基因甲基化聯合檢測試劑或試劑盒，包括HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化檢測的試劑。
一些實施方案中，「甲基化檢測試劑」，包括以下內容：針對所述基因或基因內容的更小/短的任意序列進行檢測的試劑。也就是說，任意針對所述基因中的任意位點（例如，一段更小的片段）進行的檢測及檢測試劑，均落入本發明的保護範圍中。
一些實施方案中，本發明中的基因標記HOXB4、SRCIN1和HOXA7是聯合檢測的，也就是說，本發明中的幾個基因標記是同時被檢測的。
一些實施方案中，本發明中的「檢測」同「診斷」，除了肺癌的早期診斷，還包括肺癌中期和晚期的診斷，且也包括肺癌篩選、風險評估、預後、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。
一些實施方案中，肺癌標記組合HOXB4、SRCIN1和HOXA7的應用使得肺癌的早期診斷成為可能。當確定在癌症細胞中甲基化的基因在臨床上或形態學上正常表像的細胞中甲基化時，這就表明該正常表像的細胞向癌症發展。這樣，肺癌可在早期通過在正常表像的細胞中的肺癌特異性HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合的甲基化而診斷。
一些實施方案中，其中，早期診斷包括在轉移之前發現癌症的可能性，優選在可觀察到組織或者細胞的形態學變化之前。
一些實施方案中，除了肺癌的早期診斷，本發明的試劑/試劑盒還有希望用於肺癌篩選、風險評估、預後診斷、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。
一些實施方案中，作為病症階段可選的實施方案，可通過在肺癌在不同階段或時期的進展可通過從樣品中獲取的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合的甲基化程度的測量進行診斷。通過比較從肺癌的每個階段的樣品中分離出的核酸的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合甲基化程度與從沒有細胞增殖性異常的組織中的樣品中分離出的一個或多個核酸的HOXB4、SRCIN1和HOXA7因組合甲基化程度，可檢測樣品中肺癌的具體階段。
一些實施方案中，通常來說，CpG島是指富含CpG二核苷酸的一些區域，通常位於啟動子及其附近的區域，本發明中的CpG島，不僅指啟動子及其附近的區域富含CpG二核苷酸，也包括雜合甲基化的CpG位點，或者是孤立的CpG位點。
一些實施方案中，所述的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合的甲基化聯合檢測試劑可以是現有技術中的甲基化檢測試劑。現有技術中，已經有多種方法可以檢測目的基因的甲基化，如甲基化特異性PCR（MSP）、甲基化特異性定量PCR（qMSP）、甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR，定量PCR以及DNA芯片、甲基化敏感的限制性內切酶、重亞硫酸鹽測序法或者焦磷酸測序等等。每種檢測方法均有其相對應的試劑，這些試劑均可以用於本發明檢測HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合的甲基化。
本發明還提供了HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合的甲基化聯合檢測試劑，包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合中每個基因的獲得的引子和/或探針。
在一些實施方案中，本發明提供了一種肺癌的診斷方法，所述方法包括以下步驟：（1）檢測來源於受試者的待測樣本HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平；（2）將待測樣本與正常對照樣本的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因甲基化水平比較；及（3）基於待測樣本與正常對照樣本的甲基化水平的偏離，診斷肺癌。
上述步驟（3）所述的偏離，是指HOXB4、SRCIN1和HOXA7這三個基因中任意一個的甲基化水平的偏離。
在一些實施方案中，本發明提供了一種肺癌的診斷方法，所述方法包括以下步驟：（1）檢測來源於受試者的待測樣本HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平； 所述檢測包括將受試者待測樣本與檢測HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因到甲基化水平的檢測試劑接觸；（2）將待測樣本與正常對照樣本的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因甲基化水平比較；及（3）基於待測樣本與正常對照樣本的甲基化水平的偏離，診斷肺癌。
在一些實施方案中，本發明提供了一種肺癌的診斷方法，所述方法包括以下步驟：將基因的甲基化檢測試劑加入來自受試者的待測樣本中，檢測該待測樣本中HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平；將待測樣本與正常對照樣本的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因甲基化水平比較；及基於待測樣本與正常對照樣本的甲基化水平的偏離，診斷肺癌。
在一些實施方案中，本發明提供了一種肺癌的治療方法，所述方法包括以下步驟：（1）檢測來源於受試者的待測樣本HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平； （2）將待測樣本與正常對照樣本的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因甲基化水平比較；及（3）基於待測樣本與正常對照樣本的甲基化水平的偏離，診斷肺癌；如果受試者診斷為肺癌患者，則給予所述受試者肺癌藥物治療。
在一些實施方案中，包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合中每個基因的CpG島獲得的引子和/或探針。
在一些實施方案中，引子和/或探針通過quantitative Methylation-Specific PCR (qMSP)檢測HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合中的每個基因的甲基化。
在一些實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑通過檢測HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合中的每個基因的基因體、基因間區或啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平。
在一些實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因組合中的每個基因的啟動子區或所述啟動子區附近區域的CpG島獲得的引子和/或探針。
在一些實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑中所述HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
I、與如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及
II、如I所示序列的互補序列；和/或
所述HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
III、與如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及
IV、如III所示序列的互補序列；和/或
所述SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
V、與如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及
VI、如V所示序列的互補序列；和/或
所述SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
VII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及
VIII、如VII所示序列的互補序列；和/或
所述HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
IX、與如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及
X、如IX所示序列的互補序列；和/或
所述HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XI、與如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及
XII、具有XI所示序列的互補序列。
在一些實施方案中，所述HOXB4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
在一些實施方案中，所述SRCIN1基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
在一些實施方案中，所述HOXA7基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
在一些實施方案中，所述HOXB4基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XIII、與如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及
XIV、如XIII所示序列的互補序列；和/或
所述SRCIN1基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XV、與如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；
XVI、如XV所示序列的互補序列；和/或
所述HOXA7基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XVII、與如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；
XVIII、如XVII所示序列的互補序列。
一些實施方案中，所述的引子或探針為分離的引子或探針。
在一些實施方案中，所述肺癌選自小細胞肺癌和非小細胞肺癌。
在一些實施方案中，所述的非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、腺癌。
本發明還提供了一種檢測肺癌的試劑盒，包括所述的甲基化聯合檢測試劑。
在一些實施方案中，本發明提供的試劑盒包括：第一容器，其包含用於擴增的引子對；第二容器，其包含探針。
在一些實施方案中，本發明提供的試劑盒還包括試劑盒中的常用試劑，如qMSP中常用轉化劑，用於將非甲基化的胞嘧啶堿基都轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶堿基保持不變。所述的轉化劑無特別限制，現有技術中報道的可實現胞嘧啶到尿嘧啶轉化的試劑均可以，如肼鹽、重亞硫酸氫鹽和亞硫酸氫鹽（例如偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫銫、亞硫酸氫銨等）中的一種或幾種。又如擴增基因中常用的DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+離子和緩衝液等等。
在一些實施方案中，本發明提供了HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化聯合檢測試劑在製備肺癌檢測試劑或者試劑盒中的應用。
在一些實施方案中，本發明提供了一種引子，所述引子選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19所示序列，和它們互補序列中的至少任意一條。
在一些實施方案中，作為本發明優選的實施方案，所述引子選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8所示序列，和它們互補序列中的至少任意一條。
在一些實施方案中，作為本發明優選的實施方案，所述引子選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的至少一對引子對。
在一些實施方案中，作為本發明優選的實施方案，所述引子選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的引子對。
在一些實施方案中，，本發明還提供了一種核酸探針，所述核酸探針選自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18所示序列或其互補序列中的至少任意一條。
在一些實施方案中，作為本發明優選的實施方案，所述核酸探針選自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 9所示的序列。
在一些實施方案中，本發明還提供了上述的甲基化檢測試劑、試劑盒、引子、探針在製備甲基化檢測的試劑或試劑盒，或者製備檢測肺癌的試劑或試劑盒中的應用。
在一些實施方案中，本發明還提供了上述的甲基化檢測試劑、試劑盒、引子、探針在甲基化檢測中的應用，或者在檢測肺癌中的應用。
在一些實施方案中，本發明還提供了一種肺癌的檢測系統，所述的系統包含有以下構件： （1）HOXB4，SRCIN1和HOXA7基因的甲基化聯合檢測構件； （2）數據處理構件；以及 （3）結果輸出構件。
在一些實施方案中，所述的甲基化檢測構件含有甲基化檢測儀器。
在一些實施方案中，所述的甲基化檢測構件還含有所述的甲基化聯合檢測試劑、試劑盒、引子、探針。
在一些實施方案中，所述的甲基化檢測儀器包含螢光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種。
在一些實施方案中，所述的數據處理構件含有數據處理機器。
所述的數據處理機器包括本領域技術人員可使用的任何可以進行數據處理的設備或儀器或裝置。
在一些實施方案中，所述的數據處理機器包含計算機、電腦中的一種或多種。
所述的電腦中附載有本領域技術人員可使用的任何可以進行數據處理或統計分析的軟體或程式。
在一些實施方案中，所述的電腦包含附載有SPSS、SAS、Excel中一種或多種軟體的電腦。
在一些實施方案中，所述的結果輸出構件含有結果輸出器。
所述的輸出器包含任何可以將數據處理結果顯示為可閱讀的內容的設備或儀器或裝置。
在一些實施方案中，所述的結果輸出器包含螢幕、紙質報告中的一種或多種。
在一些實施方案中，所述的數據處理器被配置於a.接收待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；b.儲存待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；c.比對同種類型的待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；d.根據比對結果，響應於測試者罹患肺癌的概率或者可能性。
在一些實施方案中，所述的結果輸出構件用於輸出測試者罹患肺癌的概率或者可能性。
在一些實施方案中，數據處理構件的判斷標準為：根據界值判斷肺癌標本和正常標本。
在一些實施方案中，根據目標基因即HOXB4、SRCIN1、HOXA7的Cp值和/或ΔCp值（ΔCp值=Cp靶向基因 -Cp內參基因 ）來判斷標本的甲基化水平。
在一些實施方案中，本中的Cp值的界值取值範圍為35~39，ΔCp值的界值取值範圍為4~12。
在一些實施方案中，HOXB4、SRCIN1和HOXA7三者組合，只要其中一個基因在所述組織標本中的ΔCp值小於所述ΔCp值的界值則判斷為肺癌標本，只有三個基因在所述組織標本的ΔCp值同時大於等於所述ΔCp值的界值則判斷為正常標本。
在一些實施方案中，HOXB4與SRCIN1聯合及HOXA7檢測，在所述灌洗液標本的Cp值和ΔCp值任何一個數值小於所述Cp值和ΔCp的界值則判斷為肺癌標本，所述灌洗液標本的Cp值和ΔCp值均大於等於所述Cp值和ΔCp值的界值則判斷為正常標本。
在一些實施方案中，本發明所述腫瘤為肺癌。
在一些實施方案中，本發明所述腫瘤為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。
在一些實施方案中，本發明所述非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、腺癌。
在一些實施方案中，本發明針對的待測樣本或者樣本類型選自肺泡灌洗液、組織、胸水、痰液、血液、血清、血漿、尿液、前列腺液或糞便中的至少一種。
在一些實施方案中，本發明所述的樣本選自肺泡灌洗液、組織、痰液中的至少一種。
在一些實施方案中，本發明所述的樣本選自肺泡灌洗液。
本發明通過研究發現：在一些具體的實施方案中，通過檢測HOXB4，SRCIN1和HOXA7基因組合中每個基因的啟動子區的甲基化水平，可以很好的從樣本中區分出肺癌樣本。對肺癌的檢測敏感性和特異性極高。
以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案，具體實施例不代表對本發明保護範圍的限制。其他人根據本發明理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬本發明的保護範圍。
本發明中的「引子」或「探針」是指一種寡核苷酸，其包含與靶分子（例如靶核酸片段）的至少6個連續核苷酸的序列互補的區域。在一些實施方案中，所述引子或探針至少一部分序列與擴增的序列不互補。在一些實施方案中，引子或探針包含與靶分子的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20連續核苷酸的序列互補的區域。當引子或探針包含「與靶分子的至少x個連續核苷酸互補」的區域時，所述引子或探針與靶分子的至少x個連續或不連續的分塊核苷酸至少95%互補。在一些實施方案中，引子或探針與靶分子至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%互補。
本發明中，「正常」樣本指分離自已知無所述癌症或腫瘤的個體的相同類型的樣本。
本發明中，甲基化檢測的樣本包括但不限於DNA，或RNA，或含mRNA的DNA和RNA樣品、或DNA-RNA雜交體。其中DNA或者RNA可為單鏈或雙鏈。
本發明中，所述「受試者」是哺乳動物，例如是人。
本發明中，「甲基化水平」同「甲基化程度」，通常可以表示為甲基化胞嘧啶的百分比，其為甲基化的胞嘧啶數量除以甲基化胞嘧啶的數量與未甲基化胞嘧啶數量的總和；以及目前普遍採用甲基化靶向基因數量除以內參基因數量的方法來表示甲基化水平；以及其他現有技術中甲基化水平表示方法。
本發明中，「樣本」同「標本」。
如本發明所使用的術語「和/或」是指並且涵蓋一個或多個相關聯的所列項目的任何和所有可能的組合。當在兩個或多個項目的列表中使用時，術語「和/或」表示所列出的項目中的任何一個可以單獨使用，或者可以使用兩個或多個所列出的項目的任何組合。例如，如果組合物，組合，構造等被描述為包括（或包含）組分A，B，C和/或D，則該組合物可以單獨包含A；單獨包含B；單獨包含C；單獨包含D；包含A和B的組合；包含A和C的組合；包含A和D的組合；包含B和C的組合；包含B和D的組合；包含C和D的組合；包含A，B和C的組合；包含A，B和D組合；包含A，C和D的組合；包含B，C和D組合；或A，B，C和D組合使用。
實施例 1
發明人篩選了數百個基因，在組織樣本中進行篩選，以β-actin基因作為內參基因，比較HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因聯合檢測結果，各基因檢測引子探針如下：
HOXB4的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 1  HOXB4-F1 引子F：TTCGTCGTTTTCGTTATCATTC SEQ ID NO: 2  HOXB4-R1 引子R：TACTAACCGCCTCGCTAC SEQ ID NO: 3  HOXB4-P1  探針P：FAM-CGGGTTTTTGCGTCGTTATTCGTC-BQ1
SRCIN1的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 4  SRCIN1 引子F：TCGTGTGTCGTCGTTCAGAC SEQ ID NO: 5  SRCIN1 引子R：GAAATACCCGCGAAAATACTG SEQ ID NO: 6  SRCIN1 探針P：FAM-AGTTTTACGTTGGAGAAGCGTCGG-BQ1
HOXA7的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 7  HOXA7 引子F：CGTCGTTTCCGTTTCGATC SEQ ID NO: 8  HOXA7 引子R：GCAAAACAAATTACCGTAAAAGT SEQ ID NO: 9  HOXA7 探針P：FAM- TTGCGTTCGGTTACGGTTTGG-BQ1
β-actin的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 10  β-actin 引子F：GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT SEQ ID NO: 11  β-actin 引子R：CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA SEQ ID NO: 12  β-actin 探針P：FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1
實驗過程：
1、提取DNA
收集確診肺癌患者的標本和非肺癌患者的標本，分別包括石蠟組織標本、痰液標本、灌洗液標本。樣品經過預處理及分離細胞後，按美基生物公司試劑盒HiPure FFPE DNA Kit（D3126-03）說明書進行DNA提取。
2 、 DNA 修飾
以ZYMO RESEARCH生物公司試劑盒EZ DNA MethylationTM KIT（D5002）說明進行重亞硫酸氫鹽修飾。
3 、擴增與檢測 【表1】配液體系
  HOXB4 SRCIN1 HOXA7 β-actin
反應組份 加入量（μl） 加入量（μl） 加入量（μl） 加入量（μl）
上游引子（100 μM） 0.125 0.125 0.125 0.125
下游引子（100 μM） 0.125 0.125 0.125 0.125
探針（100 μM） 0.05 0.05 0.05 0.05
鎂離子（25 mM） 6 6 6 6
dNTPs（10 mM） 1 1 1 1
Taq聚合酶（5 unit/μl） 0.5 0.5 0.5 0.5
5X緩衝液 6 6 6 6
滅菌水 11.2 11.2 11.2 11.2
模板DNA 5 5 5 5
總體積 30 30 30 30
擴增體系 ：各檢測基因的擴增體系一致，具體見表2。 【表2】擴增體系
步驟 溫度和時間 循環數目
預變性 95ºC 5分鐘 1
擴增 95℃ 15秒 48
58ºC 30秒
72℃ 30秒
冷卻 40℃ 30秒 1
4 、檢測結果
樣本資訊：肺組織樣本共計169例，其中正常組織樣本91例，癌組織樣本78例，78例癌症組樣本中有鱗癌27例，腺癌38例，小細胞癌3例，大細胞癌4例，複合型癌1例，未明確分類的肺癌5例，其中癌和癌旁對照樣本77對。
HOXB4在組織標本中的ΔCp值的界值為5.4；SRCIN1在組織標本中的ΔCp值的界值為6.5；HOXA7在組織標本中的ΔCp值的界值為8.3。在多基因標記聯合檢測時，只要其中一個基因在所述組織標本中的ΔCp值小於所述ΔCp值的界值則判斷為肺癌標本，只有該組合基因在所述組織標本的ΔCp值同時大於等於所述ΔCp值的界值則判斷為正常標本。
HOXB4、SRCIN1、HOXA7在所有組織標本中檢測的ROC曲線圖1所示。各基因在組織中檢測的統計結果表3所示。 【表3】組織中的檢測結果
分析組別 指標 HOXB4 SRCIN1 HOXA7 HOXB4與SRCIN1 聯合 HOXB4與HOXA7 聯合 SRCIN1與HOXA7 聯合 HOXB4、SRCIN1、HOXA7聯合
正常組和全部癌症組比較 特異性 100% 97.8% 98.9% 97.8% 98.9% 96.7% 96.7%
靈敏度 73.1% 71.8% 78.2% 89.7% 92.3% 93.6% 98.7%
正常組和鱗癌組比較 特異性 100% 97.8% 98.9% 97.8% 98.9% 96.7% 96.7%
靈敏度 74.1% 51.9% 74.1% 81.5% 96.3% 88.9% 96.3%
正常組和腺癌組比較 特異性 100% 97.8% 98.9% 97.8% 98.9% 96.7% 96.7%
靈敏度 78.9% 89.5% 78.9% 100% 86.8% 97.4% 100%
正常組和小細胞癌組比較 特異性 100% 97.8% 98.9% 97.8% 98.9% 96.7% 96.7%
靈敏度 0% 33.3% 100% 33.3% 100% 100% 100%
正常組和大細胞癌組比較 特異性 100% 97.8% 98.9% 97.8% 98.9% 96.7% 96.7%
靈敏度 50.0% 75.0% 75.0% 75.0% 100% 100% 100%
從以上結果可以看出，在組織樣本中，HOXB4與SRCIN1聯合檢測，特異性為97.8%，靈敏度89.7%；HOXB4、SRCIN1和HOXA7聯合檢測，特異性為96.7%，靈敏度98.7%，尤其是靈敏度有顯著的提升。
根據以上結果，HOXB4、SRCIN1和HOXA7在組織樣本中，在高特異性下，仍然具有較高的靈敏度。特別是通過聯合檢測，在基本不影響特異性的情況下，靈敏度有非常大的提升。
實施例 2 ： HOXB4 、 SRCIN1 、 HOXA7 基因在灌洗液中的檢測
樣本資訊：測試肺泡灌洗液樣本共計387例，其中正常對照組樣本303例，癌症組對照樣本84例，84例癌症組樣本中有鱗癌21例，腺癌40例，小細胞癌10例，未明確肺癌類型13例。
HOXB4、SRCIN1、HOXA7和β-actin的檢測引子和探針序列與實施例1相同。
試驗過程：
a. 收集確診為肺癌患者和非肺癌患者的肺泡灌洗液標本，離心分離細胞，然後使用美基生物公司的DNA提取試劑盒（HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03）提取DNA。
b. 使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA轉化試劑盒（EZ DNA Methylation Kit，D5002）進行DNA的重亞硫酸氫鹽修飾。
c. 反應體系如下： 【表4】反應體系
反應組份 加入量（μl）
HOXB4-F1 (100 μM) 0.125
HOXB4-R1 (100 μM) 0.125
HOXB4-P1 (100 μM) 0.05
SRCIN1-F1 (100 μM) 0.125
SRCIN1-R1 (100 μM) 0.125
SRCIN1-P1 (100 μM) 0.05
β-actin -F1 (100 μM) 0.125
β-actin -R1 (100 μM) 0.125
β-actin -P2 (100 μM) 0.05
鎂離子(25 mM) 6
dNTPs (10 mM) 1
Taq聚合酶(5unit/μl) 0.5
5X緩衝液 6
滅菌水 10.6
模板DNA 5
總體積 30
【表5】HOXA7反應體系
反應組份 加入量（ul）
HOXA7-F1 (100uM) 0.125
HOXA7-R1 (100uM) 0.125
HOXA7-P1 (100uM) 0.05
β-actin -F1 (100uM) 0.125
β-actin -R1 (100uM) 0.125
β-actin -P2 (100uM) 0.05
鎂離子(25mM) 6
dNTPs(10mM) 1
Taq聚合酶(5unit/ul) 0.5
5X緩衝液 6
滅菌水 10.9
模板DNA 5
總體積 30
d. 擴增體系如下： 【表6】擴增體系
步驟 溫度和時間 循環數目
預變性 95ºC 5分鐘 1
擴增 95℃ 15秒 48
58ºC 30秒
72℃ 30秒
冷卻 40℃ 30秒 1
e. 檢測結果如下：
以ACTB作為內參基因，根據靶向基因即HOXB4、SRCIN1、HOXA7的Cp值和ΔCp值（ΔCp值=Cp靶向基因 -CpACTB ）來判斷標本的甲基化水平，HOXB4與SRCIN1的閾值線為：Cp值=37.2，ΔCp值=9；HOXA7的閾值線為：Cp值=38.5，ΔCp值=10。當檢測結果中的一項小於以上閾值，則可判定為陽性，若檢測結果中4項結果均大於或等於閾值，則可判定為陰性。387例灌洗液標本的檢測結果如下： 【表7】檢測結果
分析組別 指標 HOXB4與SRCIN1聯合 HOXA7 HOXB4、SRCIN1、HOXA7聯合
正常組和全部癌症組比較 特異性 96.0% 99.0% 95.7%
靈敏度 77.4% 44.0% 81.0%
正常組和全部鱗癌組比較 特異性 96.0% 99.0% 95.7%
靈敏度 71.4% 66.7% 81.0%
正常組和全部腺癌組比較 特異性 96.0% 99.0% 95.7%
靈敏度 75.0% 37.5% 77.5%
正常組和全部小細胞癌組比較 特異性 96.0% 99.0% 95.7%
靈敏度 90.0% 40.0% 90.0%
HOXB4與SRCIN1聯合檢測，以及HOXA7在所有灌洗液標本中檢測的PCR擴增圖見圖2和圖3，統計結果見表7。從以上結果可以看出，HOXB4與SRCIN1聯合檢測在96.0%的特異性下，靈敏度為77.4%；HOXA7在99.0%的特異性下，靈敏度為44.0%；HOXB4、SRCIN1、HOXA7聯合檢測特異性為95.7%，即在基本不影響特異性的情況下，令人意外的是，靈敏度由77.4%提高到81.0%。按照肺癌的亞型進行比較分析，鱗癌組HOXB4與SRCIN1聯合檢測的檢出率僅為71.4%，3個基因聯合檢測高達81.0%。對腺癌的檢測效果，HOXB4與SRCIN1聯合檢測的靈敏性高達到75.0%，3基因聯合檢測高達77.5%。因為腺癌一般為周圍型，由於支氣管的樹狀生理結構，肺泡灌洗液不容易接觸到肺深部的肺泡或者癌組織。而本發明發現一種能以灌洗液作為樣本檢測腺癌，在保持高特異性的同時，可將靈敏度大幅提升至77.5%的標記，這一突破對腺癌的檢測具有重大的意義。
實施例 3 不同標記組合在組織樣本的檢測結果
發明人同時比較了不同標記組合在組織樣本中的檢測情況，對比的組別如下： 組合1：HOXB4+SRCIN1+HOXA7 組合2：HOXB4+ HOXA7 組合3：SRCIN1+HOXA7 組合4：HOXB4+ PCDHGA12 組合5：SRCIN1+ PCDHGA12 組合6：HOXB4+ HOXD8 組合7：SRCIN1+ HOXD8 組合8：HOXB4+ PCDHGA12+ HOXD8 組合9：SRCIN1+ PCDHGA12+ HOXD8
HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的檢測引子探針同實施例1，PCDHGA12和HOXD8基因檢測引子探針如下：
PCDHGA12的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 20 PCDHGA12 引子F：TTGGTTTTTACGGTTTTCGAC SEQ ID NO: 21 PCDHGA12 引子R：AAATTCTCCGAAACGCTCG SEQ ID NO: 22 PCDHGA12 探針P：FAM-ATTCGGTGCGTATAGGTATCGCGC-BQ1
HOXD8的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 23 HOXD8 引子F：TTAGTTTCGGCGCGTAGC SEQ ID NO: 24  HOXD8 引子R：CCTAAAACCGACGCGATCTA SEQ ID NO: 25 HOXD8 探針P：FAM-AAAACTTACGATCGTCTACCCTCCG-BQ1
HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的配液體系及擴增體系同實施例1，PCDHGA12和HOXD8基因的配液體系及擴增體系如下： 【表8】配液體系
  PCDHGA12 HOXD8
反應組份 加入量（μl） 加入量（μl）
上游引物 (100 μM) 0.125 0.05
下游引物 (100 μM) 0.125 0.125
探針(100 μM) 0.05 0.05
鎂離子(25 mM) 6 6
dNTPs(10 mM) 1 1
Taq聚合酶(5 unit/μl) 0.5 0.5
5X緩衝液 6 6
滅菌水 11.2 11.275
模板DNA 5 5
總體積 30 30
擴增體系： 擴增體系參見表9。 【表9】PCDHGA12和HOXD8的擴增體系
步驟 溫度和時間 循環數目
預變性 95 °C  5分鐘 1
擴增1 95 °C 20秒 10
60 °C  30秒
70 °C 30秒
擴增2 95 °C 20秒 45
55 °C 60秒
72 °C 30秒
冷卻 40 °C 30秒 1
在169例肺組織樣本對不同引子探針組合進行檢測，其中正常組織樣本91例，癌組織樣本78例，各組合的檢測結果如表10： 【表10】（正常組vs.全部癌症組）
  組合1 組合2 組合3 組合4 組合5 組合6 組合7 組合8 組合9
靈敏度 98.7% 92.3% 93.6% 75.6% 82.1% 78.2% 85.9% 79.5% 88.5%
特異性 96.7% 98.9% 96.7% 97.8% 95.6% 97.8% 95.6% 96.7% 94.5%
AUC 0.949 0.932 0.913 0.886 0.883 0.915 0.926 0.920 0.940
表10的結果表明不同標記組合對樣本中肺癌檢出率有較大的影響。分析組合1、組合2、組合3的結果顯示，通過HOXB4、SRCIN1和HOXA7三個標記聯合檢測檢出性能達到最優，其特異性為96.7%，靈敏度為98.7%。分析組合1、組合8、組合9，結果顯示任意三個標記組合，檢出率差異較大，組合1中HOXB4、SRCIN1和HOXA7三個標記聯合檢測檢出率遠高於另外兩個組合。本發明的三個標記聯合檢測，其靈敏度較2個標記聯合檢測、任意3個標記聯合檢測均有更好的結果，本發明的基因標記組合，其靈敏度提升至98.7%。
實施例 4 引子探針組合的選擇
引子和探針也對腫瘤標記的檢測效果有極大的影響，發明人在研究過程中，設計了多對引子及其對應的探針，以尋找到盡可能提高檢測靈敏度和特異性的探針和引子，以使本發明的檢測試劑能夠實際應用到臨床檢測中。
在40例痰液樣本對不同引子探針組合進行檢測，其中正常對照組樣本15例，癌症組對照樣本25例。 【表11】引子和探針
名稱 序列編號 序列 作用
HOXB4-F1 SEQ ID NO: 1 TTCGTCGTTTTCGTTATCATTC HOXB4上游引子
HOXB4-R1 SEQ ID NO: 2 TACTAACCGCCTCGCTAC HOXB4下游引子
HOXB4-P1 SEQ ID NO: 3 FAM-CGGGTTTTTGCGTCGTTATTCGTC-BQ1 HOXB4檢測探針
HOXB4-F2 SEQ ID NO: 16 ATTCGTTCGGGTATTACGTC HOXB4上游引子
HOXB4-R2 SEQ ID NO: 17 CCAAAATCCCGACAAACCG HOXB4下游引子
HOXB4-P2 SEQ ID NO: 18 FAM-CGGTTAGAGGCGAGAGAGTAGTTT-BQ1 HOXB4檢測探針
HOXB4-F3 SEQ ID NO: 19 CG GGTTTCG GGCG GCGCG C HOXB4上游引子
HOXB4-R3 SEQ ID NO: 20 CG AACG ATAACG AAAACG ACG HOXB4下游引子
HOXB4-P3 SEQ ID NO: 21 FAM-CG TGTATCG TGTAGCG TTACGCG G-BQ1 HOXB4檢測探針
SRCIN1-F1 SEQ ID NO: 4 TCGTGTGTCGTCGTTCAGAC SRCIN1上游引子
SRCIN1-R1 SEQ ID NO: 5 GAAATACCCGCGAAAATACTG SRCIN1下游引子
SRCIN1-P1 SEQ ID NO: 6 AGTTTTACGTTGGAGAAGCGTCGG SRCIN1檢測探針
SRCIN1-F2 SEQ ID NO: 22 TATCGTGTATCGTCGTTCGGAC SRCIN1上游引子
SRCIN1-R1 SEQ ID NO: 5 GAAATACCCGCGAAAATACTG SRCIN1下游引子
SRCIN1-P1 SEQ ID NO: 6 AGTTTTACGTTGGAGAAGCGTCGG SRCIN1檢測探針
A3-TqMF SEQ ID NO: 13 GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT β-actin基因上游引子
A3-TqMR SEQ ID NO: 14 CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA β-actin基因下游引子
A3-TqP SEQ ID NO: 15 FAM- TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT -BQ1 β-actin基因檢測探針
各配液體系均一致，配液體系、各擴增程序均一致，擴增程序同實施例1。
檢測結果如表12、13所示。 【表12】HOXB4在痰液樣本中的檢測結果（正常組vs.全部癌症組）
組別 特異性 靈敏性
F1，R1，P1 93.3% 72.0%
F2，R2，P2 93.3% 44.0%
F3，R3，P3 93.3% 68.0%
【表13】SRCIN1在痰液樣本中的檢測結果（正常組vs.全部癌症組）
組別 特異性 靈敏性
F1，R1，P1 93.3% 56.0%
F2，R1，P1 93.3% 52.0%
結果表明針對同一區域的不同引子對，對檢測結果會產生影響。在特異性一致的情況下，HOXB-F1，HOXB-R1，HOXB-P1和SRCIN1-F1，SRCIN1-R1，SRCIN1-P1的引子和探針組合有更高的靈敏性。
圖1為不同標記組合在組織樣本中檢測的ROC曲線； 圖2為HOXB4與SRCIN1聯合檢測灌洗液標本中檢測的擴增曲線； 圖3為HOXA7在灌洗液標本中檢測的擴增曲線。

Claims (11)

  1. 一種基因標記組合，該基因標記包括HOXB4、SRCIN1和HOXA7。
  2. 一種多基因的甲基化聯合檢測試劑在製備肺癌檢測試劑或者試劑盒中的應用，該基因包括HOXB4、SRCIN1和HOXA7； 優選地，該檢測試劑/檢測試劑盒包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化檢測的引子和/或探針； 優選地，針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的基因體、基因間區、啟動子區或該啟動子區附近區域的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、與如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 II、如I所示序列的互補序列；和/或 該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： III、與如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 IV、如III所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、與如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 VI、如V所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： VII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及 VIII、如VII所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、與如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 X、如IX所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XI、與如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XII、具有XI所示序列的互補序列； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示； 優選的，該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示； 優選的，該HOXA7基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、與如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XIV、如XIII所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XV、與如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVI、如XV所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、與如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVIII、如XVII所示序列的互補序列。
  3. 一種檢測試劑/試劑盒，包括HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化檢測的試劑； 優選地，該檢測試劑/檢測試劑盒包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化檢測的引子和/或探針； 優選地，針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的基因體、基因間區、啟動子區或該啟動子區附近區域的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、與如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 II、如I所示序列的互補序列；和/或 該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： III、與如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 IV、如III所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、與如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 VI、如V所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： VII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及 VIII、如VII所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、與如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 X、如IX所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XI、與如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XII、具有XI所示序列的互補序列； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示； 優選的，該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示； 優選的，該HOXA7基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、與如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XIV、如XIII所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XV、與如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVI、如XV所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、與如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVIII、如XVII所示序列的互補序列。
  4. 一種肺癌的診斷方法，包括以下步驟： 檢測來源於受試者的待測樣本HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平； 將待測樣本與正常對照樣本的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因甲基化水平比較；及 基於待測樣本與正常對照樣本的甲基化水平的偏離，診斷肺癌； 優選地，採用引子和/或探針檢測HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平； 優選地，針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的基因體、基因間區、啟動子區或該啟動子區附近區域的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、與如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 II、如I所示序列的互補序列；和/或 該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： III、與如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 IV、如III所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、與如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 VI、如V所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： VII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及 VIII、如VII所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、與如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 X、如IX所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XI、與如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XII、具有XI所示序列的互補序列； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示； 優選的，該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示； 優選的，該HOXA7基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、與如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XIV、如XIII所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XV、與如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVI、如XV所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、與如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVIII、如XVII所示序列的互補序列。
  5. 如請求項4所述的診斷方法， 其中該檢測包括將受試者待測樣本與檢測HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因到甲基化水平的檢測試劑接觸。
  6. 一種肺癌的診斷方法，包括： 將基因的甲基化檢測試劑加入來自受試者的待測樣本中，檢測該待測樣本中HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平； 將待測樣本與正常對照樣本的HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因甲基化水平比較；及 基於待測樣本與正常對照樣本的甲基化水平的偏離，診斷肺癌； 優選地，採用引子和/或探針檢測HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化水平； 優選地，針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的基因體、基因間區、啟動子區或該啟動子區附近區域的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、與如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 II、如I所示序列的互補序列；和/或 該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： III、與如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 IV、如III所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、與如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 VI、如V所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： VII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及 VIII、如VII所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、與如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 X、如IX所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XI、與如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XII、具有XI所示序列的互補序列； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示； 優選的，該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示； 優選的，該HOXA7基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、與如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XIV、如XIII所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XV、與如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVI、如XV所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、與如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVIII、如XVII所示序列的互補序列。
  7. 一種肺癌的檢測系統，包含有以下構件； （1）HOXB4，SRCIN1和HOXA7基因的甲基化聯合檢測構件： （2）數據處理構件；以及 （3）結果輸出構件； 優選地，該甲基化檢測構件含有甲基化檢測儀器； 優選地，該甲基化檢測儀器包含螢光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種； 優選地，該數據處理構件含有數據處理機器； 優選地，該數據處理機器包含計算機、電腦中的一種或多種； 優選地，該電腦包含附載有SPSS、SAS、Excel中一種或多種軟體的電腦； 優選地，該結果輸出構件含有結果輸出器； 優選地，該結果輸出器包含螢幕、紙質報告中的一種或多種； 優選地，該甲基化檢測構件還含有如請求項3所述的多基因的甲基化聯合檢測試劑/試劑盒； 優選地，該數據處理構件被配置於a.接收待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；b.儲存待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；c.比對同種同種類型的待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；d.根據比對結果，響應於測試者罹患肺癌的概率或者可能性； 優選地，該結果輸出構件用於輸出測試者罹患肺癌的概率或者可能性； 優選地，該數據處理構件的判斷標準為：通過結果比較待測樣本與正常樣本的甲基化結果，當待測樣本與正常樣本的甲基化具有顯著差異或極顯著差異時，結果判斷待測樣本患病風險高。
  8. 一種針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的甲基化檢測的引子和/或探針在檢測肺癌或者製備檢測肺癌的檢測試劑/試劑盒中的應用； 優選地，針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，包括針對HOXB4、SRCIN1和HOXA7基因的基因體、基因間區、啟動子區或該啟動子區附近區域的CpG島獲得的引子和/或探針； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、與如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 II、如I所示序列的互補序列；和/或 該HOXB4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： III、與如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 IV、如III所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、與如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 VI、如V所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子中的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： VII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及 VIII、如VII所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、與如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 X、如IX所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XI、與如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XII、具有XI所示序列的互補序列； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示； 優選的，該SRCIN1基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示； 優選的，該HOXA7基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 優選地，該HOXB4基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、與如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列；及 XIV、如XIII所示序列的互補序列；和/或 該SRCIN1基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XV、與如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVI、如XV所示序列的互補序列；和/或 該HOXA7基因的甲基化檢測的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、與如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少85%或至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%，或100%同一性的核苷酸序列； XVIII、如XVII所示序列的互補序列。
  9. 如請求項1所述的基因標記組合或請求項3所述的檢測試劑/試劑盒在檢測肺癌中的應用。
  10. 4-9任一所述的應用、診斷方法或所述的檢測系統，該肺癌選自小細胞肺癌和非小細胞肺癌；更優選地，該非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、腺癌。
  11. 如請求項2-9任一所述的應用、檢測試劑/試劑盒、診斷方法或檢測系統，該檢測所針對的待測樣本選自肺泡灌洗液、組織、胸水、痰液、血液、血清、血漿、尿液、前列腺液或糞便中的至少一種； 優選地，該樣本選自肺泡灌洗液、組織、痰液中的至少一種； 更優選地，該樣本選自肺泡灌洗液。
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