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TW202146435A - 含有病原性抗原及免疫刺激物之組合物 - Google Patents

含有病原性抗原及免疫刺激物之組合物 Download PDF

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TW202146435A
TW202146435A TW110107784A TW110107784A TW202146435A TW 202146435 A TW202146435 A TW 202146435A TW 110107784 A TW110107784 A TW 110107784A TW 110107784 A TW110107784 A TW 110107784A TW 202146435 A TW202146435 A TW 202146435A
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艾納達南路普 慕克荷帕德亞
約翰 羅德里葛茲
大衛 Ａ 坎頓
克里斯多夫 Ｇ 推堤
金 賈菲
丹尼爾 Ｊ 歐康納
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美商昂科賽醫藥公司
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Abstract

本發明描述用於誘導針對病原體之免疫反應的包含病原性抗原及免疫刺激物之組合物。亦描述用於治療癌症之包含免疫刺激性細胞介素及病原性抗原之組合物。

Description

含有病原性抗原及免疫刺激物之組合物
前言
可能會感染哺乳動物及鳥類兩者且在其中造成疾病之冠狀病毒通常導致諸如普通感冒之輕度呼吸道感染。然而，一些冠狀病毒株可能會致死。在2019年12月，最初由世界衛生組織(World Health Organization，WHO)創造為2019-nCoV且後續命名為SARS-CoV-2之新的冠狀病毒株係在追蹤於中國武漢爆發之肺炎之來源之後發現到。SARS-CoV-2識別為新的β冠狀病毒株且能夠人傳人(Zhu N等人「Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019」 N Engl J Med. 2020 382(8):727-733)。先前國際緊急β冠狀病毒爆發包括基因上類似之重度急性呼吸道症候群(SARS-CoV)及中東呼吸道症候群(MERS-CoV)兩者(Corman VM等人「Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR.」Euro Surveill. 202025 (3))。世界衛生組織判定SARS-CoV-2爆發為全球大流行的。
因為新型冠狀病毒及其他新出現的病原體代表全球健康威脅，因此需要可容易地適應於新識別之傳染性病原體的改良疫苗。
描述針對病原體之疫苗。所描述之疫苗組合物可用於接種針對病原體感染之疫苗。亦描述使用所描述之疫苗組合物向個體接種針對感染之疫苗之方法。病原體可為造成疾病或病況之微生物。病原性微生物包括但不限於病毒、細菌、原蟲、寄生蟲及真菌。病毒可為但不限於：C型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、德國麻疹病毒(rubella virus)、輪狀病毒、人類乳突狀瘤病毒、腸病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、伊波拉病毒(Ebola virus)、茲卡病毒(Zika virus)、人類免疫缺乏病毒、麗沙病毒(lyssavirus)、狂犬病病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、漢坦病毒(hantavirus)及冠狀病毒。細菌病原體可為但不限於：白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae )、b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b)、百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis )、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )、肺炎雙球菌(pneumococcus )、破傷風梭菌(Clostridium tetani )、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis )、傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi )、霍亂弧菌(Vibrio cholerae )及耶氏桿菌(Yersinia pestis )。寄生蟲病原體可為但不限於：瘧原蟲屬(Plasmodium spp. )、惡性瘧原蟲(P. falciparum )、間日瘧原蟲(P. vivax )、卵形瘧原蟲(P. ovale )、三日瘧原蟲(P. malariae )、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei )及利什曼原蟲(Leishmania )。所描述之疫苗組合物組合至少一種病原體抗原性多肽與至少一種免疫刺激物。免疫刺激物可為免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。免疫刺激性細胞介素可選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/受體α、IL-21、IL-23、IL-27、IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β及C-X-C基序趨化介素配位體9 (CXCL9)。基因佐劑可選自由以下組成之群：Fms樣酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)、LAMP-1、鈣網伴護蛋白、人類熱休克蛋白96、GM-CSF及CSF受體1。在一些實施例中，編碼基因佐劑之核酸進一步編碼病原性抗原，且經編碼之產物包含基因佐劑-病原性抗原融合多肽。病原性抗原可為經分離之多肽或編碼病原性抗原之核酸。免疫刺激物可為經分離之多肽或編碼免疫刺激物之核酸。
所描述之疫苗可用於引發針對病原體之免疫反應，提供針對病原體感染之保護性免疫，預防與病原體感染相關之一或多種症狀，預防由病原體造成之疾病，降低與病原體感染相關之疾病之嚴重程度或減少其持續時間，或降低與病原體感染相關之一或多種症狀之嚴重程度或減少其持續時間。
描述基於核酸之疫苗。所描述之基於核酸之疫苗組合物可用於接種針對感染之疫苗。亦描述使用所描述之基於核酸之疫苗組合物向個體接種針對感染之疫苗之方法。
描述針對冠狀病毒之疫苗。所描述之冠狀病毒疫苗組合物可用於接種針對冠狀病毒感染之疫苗。在一些實施例中，所描述之冠狀病毒疫苗組合物可用於接種針對肺或鼻腔中之冠狀病毒感染或病毒複製之疫苗。亦描述使用所描述之疫苗組合物向個體接種針對冠狀病毒感染之疫苗之方法。冠狀病毒可為但不限於β冠狀病毒、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬(subgenusEmbecovirus ))、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬(subgenusSarbecovirus ))、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬(subgenusMerbecovirus ))、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬(subgenusNobecovirus ))、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2或相關β冠狀病毒。所描述之冠狀病毒疫苗組合物組合至少一種冠狀病毒抗原性多肽與至少一種免疫刺激物。免疫刺激物可為免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。免疫刺激性細胞介素可選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/受體α、IL-21、IL-23、IL-27、IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β及C-X-C基序趨化介素配位體9 (CXCL9)。基因佐劑可選自由以下組成之群：Fms樣酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)、LAMP-1、鈣網伴護蛋白、人類熱休克蛋白96、GM-CSF及CSF受體1。在一些實施例中，編碼基因佐劑之核酸進一步編碼冠狀病毒抗原性多肽，且經編碼之產物包含基因佐劑-冠狀病毒抗原性多肽融合多肽。冠狀病毒抗原性多肽可為經分離之多肽或編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸。免疫刺激物可為經分離之多肽或編碼免疫刺激物之核酸。
描述雜交蛋白/核酸冠狀病毒疫苗。所描述之雜交冠狀病毒疫苗組合物可用於接種針對冠狀病毒感染之疫苗。亦描述使用所描述之疫苗組合物向個體接種針對冠狀病毒感染之疫苗之方法。冠狀病毒可為但不限於β冠狀病毒、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2或相關β冠狀病毒。所描述之冠狀病毒疫苗組合物組合至少一種冠狀病毒抗原性多肽與一或多個編碼至少一種免疫刺激物之核酸序列。免疫刺激物可為免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。免疫刺激性細胞介素可選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/受體α、IL-21、IL-23、IL-27、IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β及C-X-C基序趨化介素配位體9 (CXCL9)。基因佐劑可選自由以下組成之群：Fms樣酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)、LAMP-1、鈣網伴護蛋白、人類熱休克蛋白96、GM-CSF及CSF受體1。在一些實施例中，編碼基因佐劑之核酸進一步編碼冠狀病毒抗原性多肽，且經編碼之產物包含基因佐劑-冠狀病毒抗原性多肽融合多肽。核酸可為但不限於RNA、mRNA、DNA、質體或表現載體。
描述冠狀病毒基於核酸之疫苗。所描述之基於核酸之疫苗組合物可用於接種針對冠狀病毒感染之疫苗。亦描述使用所描述之基於核酸之疫苗組合物向個體接種針對冠狀病毒感染之疫苗之方法。冠狀病毒可為但不限於β冠狀病毒、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2或相關β冠狀病毒。所描述之冠狀病毒疫苗組合物組合至少一種編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸與一或多個編碼至少一種免疫刺激物之核酸序列。免疫刺激物可為免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。免疫刺激性細胞介素可選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/受體α、IL-21、IL-23、IL-27、IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β及C-X-C基序趨化介素配位體9 (CXCL9)。基因佐劑可選自由以下組成之群：Fms樣酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)、LAMP-1、鈣網伴護蛋白、人類熱休克蛋白96、GM-CSF及CSF受體1。在一些實施例中，編碼基因佐劑之核酸進一步編碼冠狀病毒抗原性多肽，且經編碼之產物包含基因佐劑-冠狀病毒抗原性多肽融合多肽。核酸可為但不限於RNA、mRNA、DNA、質體或表現載體。
冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於β冠狀病毒抗原性多肽、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、SARS-CoV抗原性多肽、MERS-CoV抗原性多肽、SARS-CoV-2抗原性多肽或相關β冠狀病毒抗原性多肽。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於S蛋白抗原性多肽。各種臨床前重度急性呼吸道症候群(SARS)-CoV研究中以及臨床前及臨床中東呼吸道症候群(MER)-CoV研究中已顯示，S蛋白誘導長期且強效之中和抗體及/或保護性免疫。S蛋白抗原性多肽包含冠狀病毒棘狀多肽(亦即S醣蛋白或S蛋白)或其抗原片段或經修飾之冠狀病毒棘狀多肽或其抗原片段。冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段可為但不限於SARS-CoV棘狀多肽或其抗原片段、MERS-CoV棘狀多肽或其抗原片段或SARS-CoV-2棘狀多肽或其抗原片段。S蛋白抗原性多肽可包含S蛋白或其抗原片段之胞外域。在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽可包含對應於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1-1208、14-1208、21-1208、14-305 (N端域)或330-521 (受體結合域)的多肽。S蛋白抗原性多肽可包含包括但不限於分泌信號、三聚域或Fc標籤之一或多種額外組分。分泌信號(亦即信號序列或信號肽)可為天然分泌信號(亦即S蛋白分泌信號)或異源分泌信號。三聚域可為天然三聚域或異源三聚域。S蛋白抗原性多肽亦可含有一或多個破壞內部弗林蛋白酶(furin)裂解位點之突變及/或一或多個使蛋白質穩定之突變。編碼S蛋白抗原性多肽之核酸可經密碼子最佳化。
在一些實施例中，免疫刺激物包含IL-12。在一些實施例中，免疫刺激物包含CXCL9。在一些實施例中，免疫刺激物包含Flt3L。在一些實施例中，免疫刺激物包含抗CD3半BiTE。在一些實施例中，免疫刺激物包含IL-12及CXCL9、Flt3L或抗CD3半BiTE。在一些實施例中，免疫刺激物包含IL-12及CXCL9。在一些實施例中，免疫刺激物包含IL-12及Flt3L。在一些實施例中，免疫刺激物包含IL-12及抗CD3半BiTE。在一些實施例中，免疫刺激物包含IL-12、CXCL9及抗CD3半BiTE。
在一些實施例中，編碼IL-12之核酸包含編碼藉由內部核糖體進入位點或2A肽跳躍基序間隔開之IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元之核酸。在一些實施例中，編碼IL-12之核酸包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4具有至少90%一致性之核酸序列。在一些實施例中，編碼IL-12之核酸包含編碼具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之多肽的核酸或編碼與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽的核酸。
在一些實施例中，編碼IL-12及Flt3L之核酸包含有包含SEQ ID NO: 23之核酸序列、與SEQ ID NO: 23具有至少90%一致性之核酸序列、編碼具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之多肽(Flt3L)的核酸序列或編碼與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽的核酸序列。
在一些實施例中，編碼IL-12及CXCL9之核酸包含有包含SEQ ID NO: 21之核酸序列、與SEQ ID NO: 21具有至少90%一致性之核酸序列、編碼具有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之多肽的核酸序列、編碼與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽的核酸序列、包含SEQ ID NO: 6之核酸序列、與SEQ ID NO: 6具有至少90%一致性之核酸序列、編碼SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的核酸序列或編碼與SEQ ID NO: 7具有至少90%一致性之胺基酸序列的核酸序列。
在一些實施例中，編碼IL-12及抗CD3半BiTE之核酸包含有包含SEQ ID NO: 25之核酸序列、與SEQ ID NO: 25具有至少90%一致性之核酸序列、編碼具有SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之多肽的核酸序列、編碼與SEQ ID NO: 26之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽的核酸序列、包含SEQ ID NO: 8之核酸序列、與SEQ ID NO: 8具有至少90%一致性之核酸序列、編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 9之核酸序列或編碼與SEQ ID NO: 9具有至少90%一致性之胺基酸序列的核酸序列。
一或多種經分離之多肽或編碼一或多種多肽之一或多種核酸可藉由注射投與。一或多種經分離之多肽及/或編碼一或多種多肽之一或多種核酸可與一或多種佐劑、載劑、賦形劑或其組合進行組合。一或多種經分離之多肽及/或編碼一或多種多肽之一或多種核酸可經調配用於注射及用於誘導免疫反應。一或多種經分離之多肽或編碼一或多種多肽之一或多種核酸可經調配用於肌內注射、皮內注射、瘤內注射或其組合。
編碼病原性抗原及/或免疫刺激物之核酸可藉由電穿孔或此項技術中可用之其他非病毒手段來投與，該等非病毒手段包括但不限於直接注射(伴隨或不伴隨電穿孔)、無針注射(伴隨或不伴隨電穿孔)、微彈轟擊(例如基因槍)、流體動力學注射、磁轉染(magneto-fection)、超音波穿孔(sono-poration) (例如超音波介導之遞送)、光穿孔(photo-poration)及水穿孔(hydro-poration)。核酸序列可處於奈米粒子、脂質奈米粒子、脂質體、脂複合體、聚合複合體、脂聚合複合體或其他非病毒粒子或複合體中。
編碼病原性抗原及/或免疫刺激物之核酸可經調配用於投與至真皮中(皮內投與)、投與至骨骼肌中(肌內投與)及/或投與至腫瘤中(瘤內投與)。在一些實施例中，編碼病原性抗原及/或免疫刺激物之核酸可經調配用於藉由皮內電穿孔(ID-EP)投與至真皮中、藉由肌內電穿孔(IM-EP)投與至肌肉中、藉由瘤內電穿孔(IT-EP)投與至腫瘤中或其組合。在一些實施例中，編碼病原性抗原及/或免疫刺激物之核酸可經調配用於藉由直接注射、無針注射、微彈轟擊、流體動力學注射、磁轉染、超音波穿孔、光穿孔或水穿孔投與至真皮、肌肉及/或腫瘤中。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
經分離之病原性抗原或免疫刺激物肽可經調配用於投與至真皮中(皮內投與)、投與至骨骼肌中(肌內投與)及/或投與至腫瘤中(瘤內投與)。經分離之病原性抗原或免疫刺激物肽可在投與之前與免疫佐劑組合。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
描述引發針對冠狀病毒之免疫反應之方法。冠狀病毒可為但不限於β冠狀病毒、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2或相關β冠狀病毒。在一些實施例中，該等方法包含：向個體投與有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及有效劑量之免疫刺激物。在一些實施例中，該等方法包含：(a)向個體投與第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及(b)向個體投與第一有效劑量之免疫刺激物。在一些實施例中，該方法進一步包含在與第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽之投與不同之部位處投與第二劑量之冠狀病毒抗原性多肽。在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物係同時、在彼此之約5分鐘內、約10分鐘內、約15分鐘內、約20分鐘內、約25分鐘內、約30分鐘內、約35分鐘內、約40分鐘內、約45分鐘內、約50分鐘內、約55分鐘內或約60分鐘內投與至個體。冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物可經皮內、肌內、瘤內或其組合方式投與。
在一些實施例中，該等方法包含：藉由皮內投與向個體投與第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。免疫刺激物可為但不限於IL-12或IL-12與第二免疫刺激物之組合。在一些實施例中，第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物係藉由皮內投與在同一部位投與。在一些實施例中，第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物係藉由皮內投與在不同部位投與。冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物可分開投與至真皮，或其可在皮內投與之前組合。皮內投與部位可為但不限於個體之肩部、腿部或臀部。
在一些實施例中，該等方法包含：(a)藉由皮內投與向個體投與第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物，及(b)藉由肌內投與向個體投與第二有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。免疫刺激物可為但不限於IL-12或IL-12與第二免疫刺激物之組合。在一些實施例中，第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物係藉由皮內投與在同一部位投與。冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物可分開投與至真皮，或其可在皮內投與之前組合。皮內及肌內投與部位可為但不限於個體之肩部、腿部或臀部。皮內與肌內投與部位可極為接近(≤ 10 cm)或較遠(＞ 10 cm)。
在一些實施例中，該等方法包含：向個體投與第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物。在一些實施例中，該等方法進一步包含投與第二有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及/或第二有效劑量之免疫刺激物。第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽可投與至真皮、肌肉或腫瘤。第一有效劑量之免疫刺激物可投與至真皮、肌肉或腫瘤。第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物可投與至同一部位或不同部位。在一些實施例中，第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽及第一有效劑量之免疫刺激物係藉由皮內、肌內或瘤內投與在同一部位投與。在不同部位之投與可為向同一組織(例如不同真皮部位，例如相對肢體)或不同組織(例如真皮及肌肉或腫瘤)之投與。在一些實施例中，第二有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽與第一有效劑量之免疫刺激物一起投與。在一些實施例中，第二有效劑量之免疫刺激物與第一有效劑量之冠狀病毒抗原性多肽一起投與。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。免疫刺激物可為但不限於IL-12或IL-12與第二免疫刺激物之組合。為了投與至同一部位，冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物可分開投與，或其可在投與之前組合。
引發針對冠狀病毒之免疫反應可用於： (a)     引發針對冠狀病毒之細胞免疫反應； (b)     引發針對冠狀病毒之體液免疫反應； (c)     引發針對冠狀病毒之細胞及體液免疫反應兩者； (d)     增強細胞毒性T淋巴球之增殖； (e)     引發抗冠狀病毒抗體之生成； (f)     引發中和抗冠狀病毒抗體之生成； (g)     引發能夠預防冠狀病毒感染之抗體之生成； (h)     減少冠狀病毒感染之可能性或降低冠狀病毒感染之嚴重程度； (i)      減少罹患COVID-19之可能性或降低COVID-19之嚴重程度或減少COVID-19之持續時間； (j)      向患者接種針對冠狀病毒之疫苗； (k)     引發針對COVID-19或重度COVID-19之保護性免疫； (l)      預防COVID-19疾病之至少一種症狀，及/或 (m)    預防症狀性COVID-19疾病。
在一些實施例中，引發針對冠狀病毒之免疫反應之方法包含：藉由皮內投與向個體投與第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。免疫刺激物可為但不限於IL-12或IL-12與第二免疫刺激物之組合。在一些實施例中，第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸係藉由皮內投與在同一部位投與。在一些實施例中，第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸係藉由皮內投與在不同部位投與。編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可分開投與至真皮，或其可在皮內投與之前組合。在一些實施例中，皮內投與包含在個體之肩部中之一部位之皮內投與。皮內投與部位可為但不限於個體之肩部、腿部或臀部。
在一些實施例中，引發針對冠狀病毒之免疫反應之方法包含：(a)藉由皮內投與向個體投與第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸；(b)藉由肌內投與向個體投與第二有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。免疫刺激物可為但不限於IL-12或IL-12與第二免疫刺激物之組合。在一些實施例中，第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸係藉由皮內投與在同一部位投與。編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可分開投與至真皮，或其可在皮內投與之前組合。皮內及肌內投與部位可為但不限於個體之肩部、腿部或臀部。皮內與肌內投與部位可極為接近(≤ 10 cm)或較遠(＞ 10 cm)。皮內投與可包含皮內電穿孔(ID-EP)。肌內投與可包含肌內電穿孔(IM-EP)。瘤內投與可包含瘤內電穿孔(IM-EP)。
在一些實施例中，引發針對冠狀病毒之免疫反應之方法包含：向個體投與第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸。在一些實施例中，該等方法進一步包含投與第二有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及/或第二有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸。第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸可投與至真皮、肌肉或腫瘤。第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸可投與至真皮、肌肉或腫瘤。第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸可投與至同一部位或不同部位。在一些實施例中，第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸係藉由皮內、肌內或瘤內投與在同一部位投與。在不同部位之投與可為向同一組織(例如不同真皮部位，例如相對肢體)或不同組織(例如真皮及肌肉或腫瘤)之投與。在一些實施例中，第二有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸與第一有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸一起投與。在一些實施例中，第二有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸與第一有效劑量之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸一起投與。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。免疫刺激物可為但不限於IL-12或IL-12與第二免疫刺激物之組合。為了投與至同一部位，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可分開投與，或其可在投與之前組合。皮內投與可包含皮內電穿孔(ID-EP)。肌內投與可包含肌內電穿孔(IM-EP)。瘤內投與可包含瘤內電穿孔(IM-EP)。
投與可包含初次投與(單次投與)或初次投與及一或多次加強投與(兩次或更多次投與)。初次投與及加強投與可在個體之同一部位或不同部位，例如在同一肢體或不同肢體中執行。在一些實施例中，該等方法包含至少一種冠狀病毒抗原性多肽及至少一種免疫刺激物之至少兩輪投與。在一些實施例中，各輪執行至少一種冠狀病毒抗原性多肽之投與及至少一種免疫刺激物之投與。第二輪投與(加強)可在第一輪投與(初次)之後2週至12個月執行。在一些實施例中，第一輪(初次)係在第1天投與且第二輪(加強)係在第一輪投與之後14-63天投與。在一些實施例中，第一次及後續加強投與可以2-12週之間隔執行。在一些實施例中，第一次及後續加強投與可以約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週或約12週之間隔執行。在一些實施例中，額外加強係在初次或加強投與之後約1-5年投與。
在一些實施例中，該等方法包含冠狀病毒抗原性多肽與免疫刺激物之組合之第一次(初次)投與。在一些實施例中，該等方法進一步包含冠狀病毒抗原性多肽與免疫刺激物之組合之至少一次加強投與，其中加強係在初次投與之後投與(初次加上加強)。加強投與可在初次投與之後2、3、4、5、6、7、8週或更多週(各± 4天)。冠狀病毒抗原性多肽及/或免疫刺激物可為一或多種編碼冠狀病毒抗原性多肽及/或免疫刺激物之核酸。
在一些實施例中，該等方法包含冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之第一次(初次)皮內投與。在一些實施例中，該等方法進一步包含冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之至少一次加強皮內投與，其中加強投與係在初次投與之後投與。加強投與可在初次投與之後1、2、3、4、5、6、7、8週或更多週(各± 4天)。
在一些實施例中，該等方法包含編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸的第一次(初次)皮內投與。在一些實施例中，該等方法進一步包含編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸的至少一次加強皮內投與，其中加強投與係在初次投與之後投與。加強投與可在初次投與之後2、3、4、5、6、7、8週或更多週(各± 4天)。
在一些實施例中，該等方法包含冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之第一次(初次)皮內投與及冠狀病毒抗原性多肽之肌內投與。在一些實施例中，該等方法進一步包含冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之至少一次加強皮內投與及冠狀病毒抗原性多肽之肌內投與，其中加強投與係在初次投與之後投與。加強投與可在初次投與之後2、3、4、5、6、7、8週或更多週(各± 4天)。
在一些實施例中，該等方法包含編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸的第一次(初次)皮內投與及編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的肌內投與。在一些實施例中，該等方法進一步包含編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸的至少一次加強皮內投與及編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的肌內投與，其中加強投與係在初次投與之後投與。加強投與可在初次投與之後2、3、4、5、6、7、8週或更多週(各± 4天)。
在一些實施例中，該等方法包含編碼免疫刺激物之核酸及視情況選用之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第一次(初次)瘤內投與。在一些實施例中，該等方法進一步包含編碼免疫刺激物之核酸及視情況選用之編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的至少一次加強瘤內投與，其中加強投與係在初次投與之後投與。加強投與可在初次投與之後2、3、4、5、6、7、8週或更多週(各± 4天)。
對於皮內投與，冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物可在同一部位或在不同部位投與。對於在不同部位之投與，冠狀病毒抗原性多肽之皮內投與及免疫刺激物之皮內投與可彼此靠近(≤ 10 cm)，或彼此相距較遠(＞ 10 cm)。遠距離部位包括但不限於對側部位(例如在相對肩部或大腿中)。
皮內投與及肌內投與之部位可彼此靠近(≤ 10 cm)，或彼此相距較遠(＞ 10 cm)。遠距離部位包括但不限於對側部位。在一些實施例中，皮內部位距肌內部位1-5 cm或2-3 cm。在一些實施例中，皮內部位距肌內部位超過10 cm。在一些實施例中，皮內部位係在肌內部位之對側部位。
皮內投與可在肌內或瘤內投與之前、與其並行或在其之後執行。在一些實施例中，皮內投與係在肌內或瘤內投與60分鐘內、30分鐘內、25分鐘內、20分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內執行。在一些實施例中，皮內投與係在肌內或瘤內投與之前執行。在一些實施例中，皮內投與係在肌內或瘤內投與之後執行。在一些實施例中，皮內投與係在肌內或瘤內投與5-15分鐘內、在其之前或在其之後執行。
在一些實施例中，該等方法包含編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸的單輪ID-EP投與。在一些實施例中，該等方法包含編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸的至少兩輪ID-EP投與。第二輪ID-EP投與(加強)可在第一輪ID-EP投與(初次)之後兩週至12個月執行。在一些實施例中，第二輪ID-EP投與係在第一輪ID-EP投與之後14-63天執行。在一些實施例中，第一次及後續加強投與可以2-12週之間隔執行。在一些實施例中，第一次及後續加強投與可以約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週或約12週之間隔執行。在一些實施例中，額外加強係在初次或加強投與之後約1-5年投與。
編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸可藉由ID-EP在同一部位或在不同部位投與。對於在不同部位之ID-EP，部位可彼此靠近(≤ 10 cm)，或彼此相距較遠(＞ 10 cm)。遠距離部位包括但不限於對側部位(例如相對肩部或大腿)。在一些實施例中，不同部位相隔1-5 cm或2-3 cm。
編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸之ID-EP投與及編碼免疫刺激物之核酸之ID-EP投與可並行或依序發生。對於依序投與，ID-EP投與可在彼此60分鐘內、30分鐘內、25分鐘內、20分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內發生。在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的ID-EP投與係在編碼免疫刺激物之核酸的ID-EP投與之前執行。在一些實施例中，編碼免疫刺激物之核酸的ID-EP投與係在編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的ID-EP投與之前執行。
在一些實施例中，該等方法包含編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸的單輪ID-EP投與及編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的IM-ED投與。在一些實施例中，該等方法包含編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸的至少兩輪ID-EP投與及編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的IM-ED投與。各輪執行ID-EP及IM-EP投與。第二輪ID-EP及IM-EP投與(加強)可在第一輪ID-EP及IM-EP投與(初次)之後兩週至12個月執行。在一些實施例中，第二輪ID-EP及IM-EP投與係在第一輪ID-EP及IM-EP投與之後14-63天執行。在一些實施例中，第一次及後續加強投與可以2-12週之間隔執行。在一些實施例中，第一次及後續加強投與可以約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週或約12週之間隔執行。在一些實施例中，額外加強係在初次或加強投與之後約1-5年投與。
ID-EP及IM-EP部位可彼此靠近(≤ 10 cm)，或彼此相距較遠(＞ 10 cm)。遠距離部位包括但不限於對側部位。在一些實施例中，ID-EP部位距IM-EP部位1-5 cm或2-3 cm。在一些實施例中，ID-EP部位距IM-EP部位超過10 cm。在一些實施例中，ID-EP部位係在IM-EP之對側部位。IM-EP部位可為但不限於三角肌。在一些實施例中，ID-EP部位係在一個肩部中且IM-EP部位係在相對肩部之三角肌中。
ID-EP投與可在IM-EP投與之前、與其並行或在其之後執行。在一些實施例中，ID-EP投與係在IM-EP投與60分鐘內、30分鐘內、25分鐘內、20分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內執行。在一些實施例中，ID-EP投與係在IM-EP投與之前執行。在一些實施例中，ID-EP投與係在IM-EP投與之後執行。在一些實施例中，ID-EP投與係在IM-EP投與5-15分鐘內、在其之前或在其之後執行。
在一些實施例中，該等方法包含編碼免疫刺激物之核酸的至少一輪(循環) IT-EP投與(IT-EP IL-12療法)及編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的IT-EP、ID-EP或IM-EP投與。在一些實施例中，該等方法包含編碼免疫刺激物之核酸的至少兩輪(循環) IT-EP投與及編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的IT-EP、ID-EP或IM-EP投與，其中第二輪係在第一輪之後投與。
IT-EP投與可在ID-EP或IM-EP投與之前、與其並行或在其之後執行。在一些實施例中，IT-EP投與係在ID-EP或IM-EP投與60分鐘內、30分鐘內、25分鐘內、20分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內執行。在一些實施例中，IT-EP投與係在ID-EP或IM-EP投與之前執行。在一些實施例中，IT-EP投與係在ID-EP或IM-EP投與之後執行。在一些實施例中，IT-EP投與係在IT-EP或IM-EP投與5-15分鐘內、在其之前或在其之後執行。
在一些實施例中，IT-EP IL-12療法之循環包含在3週循環之第1天(± 2天)；第1天(± 2天)及第5天(± 2天)；第1天(± 2天)及第8天(± 2天)；或第1天(± 2天)、第5天(± 2天)及第8天(± 2天)編碼免疫刺激物之核酸的IT-EP投與。在一些實施例中，IL-12係在各循環之第1天(± 2天)、第5天(± 2天)及第8天(± 2天)投與，且冠狀病毒抗原性多肽係在各循環之第1天(± 2天)；第5天(± 2天)；第8天(± 2天)；第1天(± 2天)及第5天(± 2天)；第1天(± 2天)及第8天(± 2天)；第1天(± 2天)、第5天(± 2天)及第8天(± 2天)；或第5天(± 2天)及第8天(± 2天)投與。在一些實施例中，IL-12係在各循環之第1天(± 2天)及第8天(± 2天)投與，且冠狀病毒抗原性多肽係在各循環之第1天(± 2天)、第8天(± 2天)或第1天(± 2天)及第8天(± 2天)投與。在一些實施例中，IL-12係在各循環之第1天(± 2天)及第5天(± 2天)投與，且冠狀病毒抗原性多肽係在各循環之第1天(± 2天)、第5天(± 2天)或第1天(± 2天)及第5天(± 2天)投與。在一些實施例中，IL-12係在各循環之第1天(± 2天)、第5天(± 2天)及第8天(± 2天)投與，且冠狀病毒抗原性多肽係在各循環之第1天(± 2天)投與。
在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激性細胞介素經注射至個體之諸如癌性腫瘤之腫瘤中。在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激性細胞介素之核酸經注射至腫瘤中。在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激性細胞介素之核酸係藉由瘤內電穿孔投與至腫瘤。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於SARS-CoV-2 S蛋白或其抗原片段。免疫刺激性細胞介素可為但不限於介白素、IL-12、CXCL9、抗CD3半BiTE、基因佐劑或其組合。
在一些實施例中，所描述之疫苗經投與至癌症患者。在一些實施例中，冠狀病毒疫苗接種係藉由投與至個體之腫瘤與腫瘤治療組合，藉由瘤內電穿孔與編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激性細胞介素之核酸組合。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於SARS-CoV-2 S蛋白或其抗原片段。免疫刺激性細胞介素可為但不限於介白素、IL-12、CXCL9、抗CD3半BiTE、基因佐劑或其組合。組合冠狀病毒抗原性多肽之瘤內電穿孔(IT-EP)及諸如IL-12之免疫刺激性細胞介素之IT-EP的所描述之疫苗向此等患者提供針對冠狀病毒之疫苗接種及抗癌療法。諸如患有癌症之患者之免疫功能不全患者受益於不僅驅動抗腫瘤反應且亦藉由加強其免疫系統以建立針對諸如COVID-19之病毒感染之防禦來產生針對SARS-CoV-2的持續免疫的疫苗。
在一些實施例中，電穿孔為可逆電穿孔且使用任何合適之電穿孔裝置來投與。該等電穿孔裝置包括但不限於Cliniporator (IGEA)、Cliniporator Vitae (IGEA)、Apollo (OncoSec)、GenPulse (OncoSec)、MedPulse (OncoSec)、Cellectra (Inovio)及Agilepulse (BTX Harvard Apparatus)。
本文所揭示之用於接種針對冠狀病毒之疫苗之方法中的任一種可藉由用所關注之病原體抗原性多肽取代冠狀病毒多肽來加以修改以接種針對另一病原體之疫苗。類似地，本文所描述之冠狀病毒疫苗組合物中之任一種可藉由用所關注之病原體抗原性多肽取代冠狀病毒多肽來容易地加以修改以製備針對不同病原體之疫苗組合物。
描述用於治療癌症之編碼免疫刺激性細胞介素、病原性抗原或細胞介素及病原性抗原之表現載體。亦描述使用所描述之表現載體治療包括癌症及轉移性癌症之腫瘤之方法。當藉由視情況與皮內電穿孔(ID-EP)或肌內電穿孔(IM-EP)組合之瘤內電穿孔(IT-EP)將所描述之表現載體遞送至個體時，引起經編碼蛋白之表現，從而引起T細胞募集及抗腫瘤活動性。該等表現載體及方法可用於使腫瘤消退(亦即減小腫瘤體積)，使個體之一或多種腫瘤消退，軟化腫瘤，延長存活，延長無腫瘤存活，及/或增強針對腫瘤之免疫反應。在一些實施例中，所描述之方法亦產生遠端效應，亦即一或多種未經治療腫瘤之消退。在一些實施例中，消退包括實體腫瘤減積。
描述治療癌症之方法，其包含藉由瘤內電穿孔(IT-EP)向個體投與包含治療有效量之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及治療有效量之編碼病原性抗原之表現載體的組合物。編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及編碼病原性抗原之表現載體可存在於同一質體或載體或不同質體或載體中。對於編碼免疫刺激性細胞介素及病原性抗原兩者之質體或載體，如在多順反子質體或載體中，編碼免疫刺激性細胞介素及病原性抗原之序列可操作地連接至單一啟動子且經IRES或2A轉譯修飾元件連接；或編碼免疫刺激性細胞介素及病原性抗原之序列可操作地連接至單獨啟動子。組合物經注射至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，且電穿孔療法經施用至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織。電穿孔療法可藉由此項技術中已知之任何合適之電穿孔系統來施用。在一些實施例中，電穿孔係在約60 V/cm至約1500 V/cm之場強及約10微秒至約20毫秒之持續時間下。在一些實施例中，電穿孔併有電化學阻抗譜法(EIS)。個體可為哺乳動物。哺乳動物可為但不限於人類、犬類、貓類或馬類。
描述治療癌症之方法，其包含藉由瘤內電穿孔(IT-EP)向個體投與包含治療有效量之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體的組合物，及藉由皮內電穿孔(ID-EP)或肌內電穿孔(IM-EP)向個體投與編碼病原性抗原之表現載體。含有編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體的組合物經注射至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，且電穿孔療法經施用至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織。含有編碼病原性抗原之表現載體的組合物經注射至真皮或骨骼肌中，且電穿孔療法在注射部位經施用至真皮或骨骼肌。電穿孔療法可藉由此項技術中已知之任何合適之電穿孔系統來施用。在一些實施例中，電穿孔係在約60 V/cm至約1500 V/cm之場強及約10微秒至約20毫秒之持續時間下。在一些實施例中，電穿孔併有電化學阻抗譜法(EIS)。個體可為哺乳動物。哺乳動物可為但不限於人類、犬類、貓類或馬類。
免疫刺激性細胞介素可為但不限於IL-12或IL-15。在一些實施例中，免疫刺激性細胞介素包含IL-12。IL-12為具有IL-12A (p35)次單元及IL-12B (p40)次單元兩者之雜二聚細胞介素。經編碼之IL-12可包含編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白(IL12 p70)之融合構築體。在一些實施例中，IL-12 p35及p40編碼序列係由來自單一啟動子之多順反子表現載體表現且經IRES或2A元件連接。在一些實施例中，2A元件為P2A元件。在一些實施例中，多順反子表現載體包含IL12 p35編碼序列及IL-12 p40編碼序列以及病原性抗原編碼序列，其中各者係藉由IRES或2A元件間隔開。在一些實施例中，2A元件為P2A元件。編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體可在病原性抗原中之一或多者之前、在其之後或與其並行遞送。
病原體可為造成疾病或病況之微生物。病原性微生物包括但不限於病毒、細菌、原蟲、寄生蟲及真菌。病毒可為但不限於：C型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、德國麻疹病毒、輪狀病毒、人類乳突狀瘤病毒、腸病毒、西尼羅河病毒、伊波拉病毒、茲卡病毒、人類免疫缺乏病毒、麗沙病毒、狂犬病病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、漢坦病毒及冠狀病毒。在一些實施例中，病毒抗原為冠狀病毒抗原。冠狀病毒可為但不限於β冠狀病毒抗原、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)抗原、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)抗原、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)抗原、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)抗原、SARS-CoV抗原、MERS-CoV抗原或SARS-CoV-2抗原。在一些實施例中，SARS-CoV-2抗原為棘狀蛋白抗原。細菌病原體可為但不限於：白喉桿菌、b型流感嗜血桿菌、百日咳博德氏桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎雙球菌、破傷風梭菌、腦膜炎雙球菌、傷寒沙氏桿菌、霍亂弧菌及耶氏桿菌。寄生蟲病原體可為但不限於：瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、布氏錐蟲及利什曼原蟲。在一些實施例中，病原性抗原為病毒抗原。病原性抗原可為誘導針對病原體之免疫反應之任何抗原。
在一些實施例中，病原性抗原為SARS-CoV-2棘狀蛋白抗原且免疫刺激性細胞介素為IL-12。
在一些實施例中，該等方法進一步包含一或多種額外療法之投與。一或多種額外療法可為但不限於免疫檢查點療法。免疫檢查點療法可為但不限於一或多種免疫檢查點抑制劑之投與。
在一些實施例中，該等方法包含：藉由瘤內電穿孔向個體投與第一有效劑量之編碼病原性抗原之表現載體及第一有效劑量之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體。病原性抗原可為病毒抗原。病毒抗原可為冠狀病毒抗原性多肽。冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。免疫刺激性細胞介素可為但不限於IL-12或IL-12與第二免疫刺激物之組合。在一些實施例中，免疫刺激性細胞介素(例如IL-12)及病原性抗原(例如冠狀病毒S蛋白多肽)在多順反子質體上經編碼。
描述治療個體之腫瘤之方法，其包含：向個體投與至少一個治療循環，該循環包含：藉由IT-EP向腫瘤投與包含治療有效量之所描述之編碼病原性抗原及IL-12之表現載體中的一或多種的組合物。在一些實施例中，循環為四週、五週或六週循環。在一些實施例中，循環為三週循環。在一些實施例中，循環為四週循環。在一些實施例中，循環為六週循環。組合物可藉由IT-EP在一循環之第1、2、3、4、5或6天投與。在一些實施例中，組合物係藉由IT-EP在各循環之第1天投與。在一些實施例中，組合物係藉由IT-EP在各循環之第1天及第5天± 2天投與。在一些實施例中，組合物係藉由IT-EP在各循環之第1天及第8天± 2天投與。在一些實施例中，組合物係藉由IT-EP在各循環之第1天、第5天± 2天及第8天± 2天投與。循環可視需要常常重複以治療個體。在一些實施例中，循環進一步包含額外治療劑之投與。額外治療劑可為但不限於免疫檢查點療法。在一些實施例中，免疫檢查點療法係在循環之第1天、第2天或第3天投與至個體。
描述治療個體之腫瘤之方法，其包含：向個體投與至少一個治療循環，該循環包含：藉由IT-EP向腫瘤投與包含治療有效量之編碼IL-12之表現載體的組合物(IT-EP IL-12治療)，及藉由ID-EP或IM-EP向個體投與包含治療有效量之編碼病原性抗原之表現載體的組合物(ID-EP PA治療或IM-EP PA治療)。在一些實施例中，循環為四週、五週或六週循環。在一些實施例中，循環為三週循環。在一些實施例中，循環為四週循環。在一些實施例中，循環為六週循環。IT-EP IL-12治療可在一循環之第1、2、3、4、5或6天投與。在一些實施例中，IT-EP IL-12治療係在各循環之第1天投與。在一些實施例中，IT-EP IL-12治療係在各循環之第1天及第5天± 2天投與。在一些實施例中，IT-EP IL-12治療係在各循環之第1天及第8天± 2天投與。在一些實施例中，IT-EP IL-12治療係在各循環之第1天及第15天± 2天投與。在一些實施例中，IT-EP IL-12治療係在各循環之第1天、第5天± 2天及第8天± 2天投與。ID-EP PA治療或IM-EP PA治療可在一循環之第1、2、3、4、5或6天投與。在一些實施例中，ID-EP PA治療或IM-EP PA治療係在各循環之第1天投與。在一些實施例中，ID-EP PA治療或IM-EP PA治療係在各循環之第1天及第5天± 2天投與。在一些實施例中，ID-EP PA治療或IM-EP PA治療係在各循環之第1天及第8天± 2天投與。在一些實施例中，ID-EP PA治療或IM-EP PA治療係在各循環之第1天及第15天± 2天投與。在一些實施例中，ID-EP PA治療或IM-EP PA治療係在各循環之第1天、第5天± 2天及第8天± 2天投與。循環可視需要常常重複以治療個體。在一些實施例中，循環進一步包含額外治療劑之投與。額外治療劑可為但不限於免疫檢查點療法。在一些實施例中，免疫檢查點療法係在循環之第1天、第2天或第3天投與至個體。
在一些實施例中，個體經IT-EP IL-12加上PA治療、IT-EP IL12治療加上ID-EP PA治療或IT-EP IL-12治療加上IM-EP PA治療之更多個循環中之一者治療。以上循環中之任一者可在後續循環中重複。後續循環可為連續循環或交替循環。交替循環可具有無療法或替代療法(例如免疫檢查點療法)之一或多個介入循環。舉例而言，所描述之表現載體中之任一種可在交替循環(例如視需要而言，循環1、3、5等)之第1天、第5天± 2天、第8天± 2天及第15天± 2天中之一或多者投與，且替代療法可例如在連續循環(例如視需要而言，循環1、2、3、4、5等)之第1天± 2天、第2天± 2天或第3天± 2天投與。
免疫刺激性細胞介素加上病原性抗原治療之循環可在存在或不存在免疫檢查點抑制劑療法之情況下投與。換言之，可向個體投與包含治療有效量之所描述之編碼免疫刺激性細胞介素(例如IL-12)及/或病原性抗原之表現載體中之一或多種的組合物，且在奇數編號之循環(循環1、3等)時投與免疫檢查點抑制劑療法；且在經偶數編號之循環(循環2、4等)時投與免疫檢查點抑制劑療法。
該等表現載體及方法可用於治療患有晚期轉移性治療難治性腫瘤之個體。治療難治性腫瘤可為免疫檢查點抑制劑難治性腫瘤、激素難治性腫瘤、輻射難治性腫瘤或化學療法難治性腫瘤。在一些實施例中，個體已不能對免疫檢查點抑制劑療法之至少一個療程有反應。在一些實施例中，個體在一或多種諸如但不限於檢查點抑制劑療法之抗癌療法時在進展中或已有進展。
該等表現載體及方法可用於治療患有經預測為難以用一或多種抗癌療法治療或對一或多種抗癌療法無反應之腫瘤的個體。在一些實施例中，個體具有低腫瘤浸潤性淋巴球、低部分細胞毒性淋巴球或耗竭性T細胞。在一些實施例中，個體已在一或多種先前癌症療法時有進步。
該等表現載體及方法可用於治療先前已感染病原體之個體、先前已患有與病原體感染相關之疾病或病況之個體、先前已暴露於病原體之個體或先前已接種針對病原體之疫苗之個體。在一些實施例中，病原體為SARS-CoV-2且與病原體感染相關之疾病為COVID-19。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年1月27日申請之美國臨時申請案第63/142,250號、2021年1月27日申請之美國臨時申請案第63/142,229號、2020年3月29日申請之美國臨時申請案第63/001,353號、2020年3月25日申請之美國臨時申請案第62/994,375號及2020年3月4日申請之美國臨時申請案第62/985,192號的權益，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。 序列表
以文檔555179_SeqListing_ST25.txt書寫之序列表之大小為96千位元組，該序列表創建於2021年2月16日且特此以引用之方式併入。 1.      定義：
「疫苗」為用於刺激諸如抗體產生之免疫反應且在不誘發疾病之情況下提供針對疾病之免疫的一或多種物質或一或多種組合物。疫苗常由疾病之病原體(causative agent)或諸如多肽或編碼該多肽之核酸的該病原體之產物製備。當投與至個體時，疫苗誘導或刺激免疫反應。疫苗可使得個體對特定疾病或感染具有抗性或對其免疫。疫苗亦可降低感染之嚴重程度或減少感染之持續時間。
「病原體(pathogen)」為細菌、病毒或可能會感染諸如人類之宿主及/或造成疾病之其他微生物。
「核酸」包括RNA及DNA。RNA及DNA包括但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、縮合核酸、用陽離子型脂質調配之核酸、用肽或陽離子型聚合物調配之核酸、RNA及mRNA。核酸亦包括經修飾之RNA或DNA。包括質體之核酸可大規模及/或高產量地製造。核酸可進一步使用cGMP製造來製造。核酸可經調配為安全且有效之核酸以注射至哺乳動物個體中。
「同源」序列(例如核酸序列或胺基酸序列)係指與已知參考序列相同或實質上類似之序列，以使得舉例而言，其與已知參考序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。序列一致性可藉由使用諸如Wisconsin Genetics套裝軟體7.0版, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中之BESTFIT、FASTA及TFASTA的演算法、使用預設間隙參數或藉由檢驗及最佳比對(亦即在比較窗口上產生最高百分比之序列類似性)來比對序列加以確定。序列一致性百分比係藉由以下來計算：在比較窗口上比較兩個經最佳比對之序列，測定兩個序列中出現相同殘基之位置的數目以得到經匹配位置的數目，將經匹配位置的數目除以不計數比較窗口中之間隙之經匹配及未經匹配位置的總數目(亦即窗口尺寸)，且將結果乘以100以得到序列一致性百分比。除非另外指示，否則兩個序列之間的比較窗口由兩個序列中之較短序列之整個長度界定。
「表現載體」係指編碼一或多種表現產物(例如肽(亦即多肽或蛋白質))之核酸(例如RNA或DNA)。表現載體可為但不限於病毒、減毒病毒、質體、線性DNA分子或mRNA。表現載體能夠表現諸如哺乳動物細胞之細胞中之一或多種多肽。表現載體可包含表現經編碼表現產物所需之一或多個序列。各種序列可經併入表現載體中以更改編碼序列之表現。表現載體可包含以下中之一或多者：5'非轉譯區(5' UTR)、強化子、啟動子、內含子、3'非轉譯區(3' UTR)、終止子及可操作地連接至DNA編碼序列之polyA信號。所描述之編碼冠狀病毒抗原性多肽及/或免疫刺激物之核酸中之任一種可為經設計以在細胞中表現冠狀病毒抗原性多肽或免疫刺激物之表現載體的一部分。
術語「質體」係指能夠在哺乳動物細胞中表現之包括至少一個編碼多肽之序列的核酸(例如表現載體)。質體可為閉環DNA分子。各種序列可經併入質體中以在細胞中更改編碼序列之表現或以輔助質體之複製。可使用影響轉錄、信使RNA (mRNA)穩定性、RNA加工或轉譯效率之序列。該等序列包括但不限於5'非轉譯區(5' UTR)、啟動子、內含子及3'非轉譯區(3' UTR)。在一些實施例中，質體可經轉移至諸如大腸桿菌(E. coli )之細菌中。
「啟動子」為能夠在細胞中結合RNA聚合酶(例如直接地或經由其他結合啟動子之蛋白質或物質)且引發編碼序列轉錄之DNA調節區。啟動子可包含一或多個影響轉錄引發速率之額外區域或元件，包括但不限於強化子。啟動子可為但不限於組成型活性啟動子、條件性啟動子、可誘導型啟動子或細胞型特異性啟動子。啟動子之實例可例如見於WO 2013/176772中。啟動子可為但不限於CMV啟動子、Igκ啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子(諸如但不限於人類或雞β-肌動蛋白啟動子)、α-肌動蛋白啟動子、SRα啟動子、疱疹胸苷激酶啟動子、單純疱疹病毒(HSV)啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus，RSV)啟動子及EF1α啟動子。CMV啟動子可為但不限於CMV即刻早期啟動子、人類CMV啟動子、小鼠CNV啟動子及猴CMV啟動子。啟動子亦可為雜交啟動子。雜交啟動子包括但不限於CAG啟動子。
「轉譯修飾元件」使得能夠自單一轉錄物轉譯兩個或更多個基因。轉譯修飾元件包括內部核糖體進入位點(IRES)，其允許引發自mRNA之內部區域進行之轉譯；及來源於小核糖核酸病毒之2A肽，其使核糖體跳過在元件C端處之肽鍵合成。轉譯調節元件之併入引起由單一多順反子mRNA進行之兩種或更多種多肽之共表現。2A調節子包括但不限於P2A、T2A、E2A或F2A。2A調節子含有PG/P裂解位點。
「可操作鍵聯」或「可操作地連接」係指兩個或更多個組件(例如啟動子及另一序列元件)之併接以使得兩個組件均正常起作用且允許該等組件中之至少一個可介導對其他組件中之至少一個所施加的作用的可能性。舉例而言，若啟動子響應於一或多個轉錄調節因子之存在或不存在而控制編碼序列之轉錄位準，則啟動子可操作地連接至編碼序列。可操作鍵聯可包括彼此鄰接或反式作用之該等序列(例如調節序列可以一定距離起作用以控制編碼序列之轉錄)。
「分泌信號」(亦稱為信號序列或信號肽)為將新合成之蛋白質導引至分泌路徑之長度通常為10-35個胺基酸的胺基酸序列。信號肽通常位於多肽之N端處且藉由信號肽酶移除。分泌信號可為天然分泌信號或異源分泌信號。經編碼信號肽可操作地連接至編碼多肽之核酸序列之5'端。
「三聚域」為促進、輔助或穩定化多肽於三聚體中之裝配的胺基酸序列。裝配可經由與其他三聚域之締合發生。當連接至多肽時，三聚域可用於形成人工三聚體。三聚域可使用捲曲螺旋基序。該術語亦用於指編碼此類胺基酸序列之核酸序列。三聚域包括但不限於鹼性白胺酸拉鏈域、GCN4pII三聚七肽重複區、其之允許形成三聚捲曲螺旋之GCN4修飾物域及T4纖維蛋白C端域。T4纖維蛋白三聚域(亦稱為「摺疊子」)包含天然地三聚之胺基酸序列。在一些實施例中，T4纖維蛋白三聚域連接至冠狀病毒S蛋白抗原性多肽。T4纖維蛋白三聚域包括但不限於包含以下之肽：GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 29)、GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 30)或MQALQEAGYIPEAP- RDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSPA (SEQ ID NO: 31)。在一些實施例中，包含ADIVLNDLPFVDGPPAEGQSRISWIKNGEEILGADTQ- YGSEGSMNRPTVSVLRNVEVLDKNIGILKTSLETANSDIKTIQEAGYIPEAPRDGQAY-VRKDGEWVLLSTFLSPALVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 46)之微小纖維蛋白三聚域連接至冠狀病毒S蛋白抗原性多肽。
「Fc域」係指免疫球蛋白之重鏈之「片段可結晶」區。片段可結晶區(Fc域)為與稱為Fc受體之細胞表面受體及補體系統之一些蛋白質相互作用之抗體的尾區。此特性使抗體活化免疫系統。在IgG抗體同型中，Fc區由來源於抗體之兩個重鏈之第二恆定域及第三恆定域的兩個相同蛋白質片段構成。Fc域可為但不限於人類Fc域。Fc域可為但不限於IgG Fc域、IgG1 Fc域、IgG4 Fc域。與天然IgG1 Fc域相比，該Fc域可含有減少與Fc受體之結合親和力且/或減少效應功能之更多修飾(諸如胺基酸取代、缺失或插入)中之一者。
「異源」序列為在當前發現序列之基因情形下通常不存在於細胞、基因體或基因中的序列。異源序列可為來源於與參考基因或物種不同之基因或物種的序列。異源序列可來自不同物種之同源基因、來自相同物種中之不同基因或來自不同物種之不同基因。舉例而言，調節序列可為異源的，此係因為其相對於天然調節序列而言連接至不同編碼序列。
「免疫刺激性細胞介素」包括介導或增強針對包括病毒、細菌或腫瘤抗原之外來抗原之免疫反應的細胞介素。免疫刺激性細胞介素可包括但不限於TNFα、IL-1、IL-7、IL-10、IL-12、IL-12 p35、IL-12 p40、IL-15、IL-15Rα、IL-21IL-23、IL-27、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-21、TGFβ及CXCL9。
術語「電穿孔」係指用於輔助諸如質體、核酸或藥物之生物分子進入細胞中之電穿孔脈波之使用。
「可逆電穿孔」為使用低於目標細胞之電場臨限值之電脈波使通常不可滲透至細胞膜中之分子可逆地或暫時性滲透至細胞膜中。因為電脈波低於細胞之電臨限值，因此細胞可修復且不為電脈波殺滅。可逆電穿孔可用於在不殺滅細胞之情況下將諸如核酸之巨分子遞送至細胞中。可逆電穿孔為施加電脈波以輔助諸如核酸之巨分子吸收至細胞中之方法。除非另外指示，否則本文對電穿孔之提及包括可逆電穿孔。
「引流淋巴結」為過濾來自特定區域或器官之淋巴之淋巴結。在基於核酸之疫苗之情形下，引流淋巴結處於治療區域(例如皮內或肌內投與部位)下游。
「免疫檢查點」分子為誘發T細胞功能異常或細胞凋亡之一組免疫細胞表面受體/配位體中之任一者。此等免疫抑制性目標減少過度免疫反應且確保自身耐受性。腫瘤細胞利用此等檢查點分子之抑制作用。免疫檢查點目標分子包括但不限於細胞毒性T淋巴球抗原-4 (CTLA-4)、計劃性死亡1 (PD-1)、計劃性死亡配位體1 (PD-L1)、淋巴球活化基因-3 (LAG-3)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3 (TIM3)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(MR)、B-淋巴球及T-淋巴球衰減因子(BTLA)、腺苷A2a受體(A2aR)及疱疹病毒侵入介體(HVEM)。「免疫檢查點抑制劑」包括藉由阻斷免疫檢查點分子之作用來防止免疫抑制之分子。檢查點抑制劑包括但不限於抗體及抗體片段、奈米抗體、雙功能抗體、檢查點分子之可溶結合配偶體、小分子治療劑及肽拮抗劑。免疫檢查點抑制劑可為但不限於PD-1及/或PD-L1拮抗劑。PD-1及/或PD-L1拮抗劑可為但不限於抗PD-1或抗PD-L1抗體。抗PD-1/PD-L1抗體包括但不限於納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、皮立珠單抗(pidilizumab)及阿特珠單抗(atezolizumab)。
術語「癌症」包括特徵一般在於不當細胞增殖、異常或過度細胞增殖之多種疾病。癌症之實例包括但不限於乳癌、三陰性乳癌、結腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、腎癌、腦癌或肉瘤。
「治療難治性癌症」為對至少一種先前醫學治療無反應或尚未對其有反應之癌症。在一些實施例中，就治療而言，治療難治性指示對治療反應不足或對治療缺乏部分或完全反應。舉例而言，若患者在接受至少2次劑量之治療之後不顯示至少部分反應，則患者可視為難以用治療(例如檢查點抑制劑療法，諸如PD-1或PD-L1抑制劑療法)加以治療。
「腫瘤微環境」係指腫瘤周圍環境且包括諸如藉由向腫瘤提供氧氣、生長因子及營養素或抑制針對腫瘤之免疫反應來幫助腫瘤生長及/或存活的非惡性血管及基質組織。腫瘤微環境包括其中存在腫瘤之細胞環境，包括周圍血管、免疫細胞、纖維母細胞、骨髓源性發炎細胞、淋巴球、信號傳導分子及胞外基質。
「腫瘤邊緣」或「邊緣組織」為緊密地靠近腫瘤或在腫瘤周圍之視覺上正常之組織。通常而言，邊緣組織為在該組織0.1-2 cm內之視覺上正常之組織。當以手術方式切除腫瘤時，腫瘤邊緣組織常常經移除。 II.     疫苗組合物
描述適用於誘導個體之針對病原體之免疫反應之疫苗組合物，該組合物包含病原性抗原以及至少一種免疫刺激物。病原性抗原可為經分離之多肽或編碼病原體抗原性多肽之核酸。免疫刺激物可為經分離之多肽或編碼免疫刺激物之核酸。核酸可為但不限於RNA、mRNA、DNA、質體或表現載體。
在一些實施例中，病原體為冠狀病毒。所描述之冠狀病毒疫苗組合物可用於接種針對冠狀病毒感染之疫苗。冠狀病毒可為但不限於β冠狀病毒、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2或相關β冠狀病毒。所描述之冠狀病毒疫苗組合物組合至少一種冠狀病毒抗原性多肽與一或多種免疫刺激物。免疫刺激物可為免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。免疫刺激性細胞介素可選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/受體α、IL-21、IL-23、IL-27、IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β及C-X-C基序趨化介素配位體9 (CXCL9)。基因佐劑可選自由以下組成之群：Fms樣酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)、LAMP-1、鈣網伴護蛋白、人類熱休克蛋白96、GM-CSF及CSF受體1。
在一些實施例中，所描述之疫苗組合物包含基於核酸之疫苗。出於數種原因，基於核酸之疫苗組合物為有利的。核酸(例如質體或表現載體)可快速地適應(在數週或甚至數天內)於病毒中產生之新的突變。所描述之基於核酸之疫苗可誘導體液免疫，同時亦刺激偏向Th1之T細胞反應。大部分疫苗方法依賴於中和抗體(體液免疫)。然而，相對於SARS-CoV-2而言最近已知之SARS-CoV之分析已顯示，CD4效應細胞介素為重要疫苗組分且與偏向Th2之反應相關之嗜中性白血球過度豐富可能會限制疫苗功效。體液反應與偏向Th1之T細胞反應之協調可提供經改進之免疫保護性反應。
病原性抗原及/或免疫刺激物可藉由投與一或多種編碼病原性抗原及/或免疫刺激物之核酸來投與至個體。該一或多種核酸可藉由電穿孔或此項技術中可用之其他非病毒手段來投與，該等非病毒手段包括但不限於直接注射(伴隨或不伴隨可逆電穿孔)、無針注射(伴隨或不伴隨可逆電穿孔)、微彈轟擊(例如基因槍)、流體動力學注射、磁轉染(magneto-fection)、超音波穿孔(sono-poration) (例如超音波介導之遞送)、光穿孔(photo-poration)及水穿孔(hydro-poration)。核酸序列可處於奈米粒子、脂質體、脂複合體、聚合複合體、脂聚合複合體或其他非病毒粒子或複合體中。在一些實施例中，免疫原性組合物進一步包含一或多個電穿孔施加器。
基於核酸之疫苗代表負擔得起之安全且有效之習知疫苗替代物。與大部分其他疫苗平台相比，基於核酸之疫苗顯著地更快且更易於製造。另外，與活/減毒病毒疫苗相比，核酸顯著地更具有處置安全性(Ruprecht R. 「Live attenuated AIDS viruses as vaccines: promise or peril?」Immunol. Rev., 1999 170:135-149；及Sardesai NY等人「Electroporation delivery of DNA vaccines: prospects for success.」Curr Opin Immunol, 2011 23(3):421-429)。質體DNA疫苗亦具有室溫下穩定性及長存放期。 A)       病原體抗原性多肽
病原體可為造成疾病或病況之微生物。病原性微生物包括但不限於病毒、細菌、原蟲、寄生蟲及真菌。病毒可為但不限於：C型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、德國麻疹病毒、輪狀病毒、人類乳突狀瘤病毒、腸病毒、西尼羅河病毒、伊波拉病毒、茲卡病毒、人類免疫缺乏病毒、麗沙病毒、狂犬病病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、漢坦病毒及冠狀病毒。細菌病原體可為但不限於：白喉桿菌、b型流感嗜血桿菌、百日咳博德氏桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎雙球菌、破傷風梭菌、腦膜炎雙球菌、傷寒沙氏桿菌、霍亂弧菌及耶氏桿菌。寄生蟲病原體可為但不限於：瘧原蟲屬、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、布氏錐蟲及利什曼原蟲。
病原性抗原為能夠引發免疫反應(亦即具免疫原性)之來源於病原體之多肽。在一些實施例中，病原性抗原包含在病原體表面上經表現之多肽或其抗原片段。在一些實施例中，病原體為冠狀病毒。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
冠狀病毒抗原性多肽可為但不限於β冠狀病毒抗原性多肽、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、SARS-CoV抗原性多肽、MERS-CoV抗原性多肽、SARS-CoV-2抗原性多肽或相關β冠狀病毒抗原性多肽。在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽包含冠狀病毒棘狀醣蛋白(亦稱為S醣蛋白或S蛋白)或其抗原片段。冠狀病毒棘狀多肽或其抗原片段可為但不限於β冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)棘狀蛋白或其抗原片段、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)棘狀蛋白或其抗原片段、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)棘狀蛋白或其抗原片段、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)棘狀蛋白或其抗原片段、SARS-CoV棘狀蛋白或其抗原片段、MERS-CoV棘狀蛋白或其抗原片段、SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段、或相關β冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。
冠狀病毒棘狀醣蛋白(S蛋白)輔助與宿主細胞之相互作用。SARS-CoV及SARS-CoV-2棘狀醣蛋白(S蛋白)經由結合至ACE2受體來輔助與宿主細胞之相互作用(圖1A)。棘狀醣蛋白含有大胞外域、接著為跨膜序列及短胞內尾，其中所預測分子量為~141kDa (圖1B)。S醣蛋白S1次單元含有辨識針對SARS-CoV-2之宿主細胞受體，亦即血管收縮素轉化酶2 (ACE2)的受體結合域(RBD)。S2次單元含有融合肽、兩個七肽重複區及跨膜域，以上所有者皆為藉由經歷大構形重排來介導病毒與宿主細胞膜之融合所需。S1及S2次單元三聚以形成大融合前棘狀體。
譜系學分析已顯露，在所有來自冠狀病毒科之病毒株中，SARS-CoV-2與重度急性呼吸道症候群(SARS)病毒株共有最大類似性(Lu R等人「Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.」The Lancet 2020；及Wu F等人「A new coronavirus associated with human respiratory disease in China.」Nature . 2020)。三個SARS-CoV-2病毒株與兩個蝙蝠源性SARS樣病毒株一起形成冠狀病毒之不同分枝系。因此，SARS-CoV之相關免疫機制及相關抗原已應用於SARS-CoV-2冠狀病毒疫苗。冠狀病毒S醣蛋白已展現免疫原性，從而引發細胞免疫反應及體液免疫反應兩者(Li CK等人「T Cell Responses to Whole SARS Coronavirus in Humans.」Journal of Immunology , 2008 5490-5499；Muthumani K等人「A synthetic consensus anti-spike protein DNA vaccine induces protective immunity against Middle East respiratory syndrome coronavirus in nonhuman primates.」Science Translational Medicine, 2015 7(301):301；及Kong W等人「Modulation of the Immune Response to the Severe Acute Respiratory Syndrome Spike Glycoprotein by Gene-Based and Inactivated Virus Immunization.」Journal of Virology , 2005 13915-13923)。
編碼S醣蛋白之保守基因序列係藉由比較多個SARS-CoV-2分離株來加以識別(Lu等人2020)。S醣蛋白基因序列在病毒株之間具有有限同義突變，此種情況可有助於限制免疫逃避變異體。
S蛋白抗原性多肽可含有以下中之一或多者之任何組合：一或多個破壞內部弗林蛋白酶裂解位點之突變、一或多個使蛋白質穩定之突變、天然或異源分泌信號、天然或異源跨膜域、天然或異源三聚域、Fc標籤及經密碼子最佳化以用於人類表現之閱讀框架(圖7-8)。另外，S蛋白抗原性多肽可視情況包含HRV3C蛋白酶裂解位點及/或一或多個親和(抗原決定基)標籤。
S蛋白中破壞內部弗林蛋白酶裂解位點之突變可為但不限於對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置664-667之用GSAS進行之RRAR取代。在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽含有天然弗林蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽含有跨膜域及天然弗林蛋白酶裂解位點。
在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽含有一或多個使蛋白質穩定之突變。使S蛋白穩定之突變可包含使融合前構形中之棘狀蛋白穩定之突變。使融合前構形穩定可提高棘狀蛋白之免疫原性。使融合前構形穩定亦可增加由表現棘狀蛋白之核酸進行之棘狀蛋白表現。使融合前構形中之棘狀蛋白穩定之突變可為但不限於在中心螺旋及七肽重複區1之頂點處用脯胺酸(2P)進行之胺基酸取代(對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸K986 及V987 )。已顯示在包括MERS-CoV、SARS-CoV及HCoV-HKU1之各種β冠狀病毒中使融合前構形中之棘狀蛋白穩定之2P突變。
在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽含有分泌信號。分泌信號可為天然分泌信號或異源分泌信號。異源分泌信號可為但不限於酪胺酸蛋白磷酸酶α分泌信號或Ig-κ分泌信號。在一些實施例中，使用天然分泌信號。在一些實施例中，SARS-CoV-2 S蛋白抗原性多肽包含天然SARS-CoV-2 S蛋白分泌信號。在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽不含有分泌信號。
S蛋白抗原性多肽可含有或可不含有天然S蛋白跨膜及/或胞內域尾。S蛋白抗原性多肽可含有異源跨膜域。
三聚域輔助棘狀蛋白胞外域之三聚。異源三聚域可為但不限於C端噬菌體T4纖維蛋白三聚基序(摺疊子域)。在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽含有天然或異源三聚域。在一些實施例中，S蛋白抗原性多肽不含有天然/異源三聚域。
在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸包含哺乳動物經密碼子最佳化之編碼微小纖維蛋白摺疊子序列之核酸(SEQ ID NO: 46之胺基酸1-112)。摺疊子序列可進一步含有C端凝血酶裂解位點、6× His標籤及Strep-標籤II (ADIVLNDLPFVDGPPAEGQSRISWI-KNGEEILGADTQYGSEGSMNRPTVSVLRNVEVLDKNIGILKTSLETANSDIKTIQE-AGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSPALVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (SEQ D NO: 46))。
親和標籤可為但不限於STREP-TAG®II、TWIN-STREP-TAG®或His標籤(諸如但不限於6× His標籤或8× His標籤)。
在一些實施例中，SARS-CoV-2棘狀蛋白在核酸上經編碼，如Wrapp等人(「Cryo-EM structure of the SARS-CoV-2 spike in the prefusion conformation.」 Science 2020 367(6483):1260-1263)中所描述。此SARS-CoV-2抗原性多肽含有SARS-CoV-2 S蛋白之胞外域(ectodomain/extracellular domain)殘基1至1208且在使用證明為對其他β冠狀病毒S蛋白有效之穩定策略之C端S2融合機制中具有兩個穩定化脯胺酸突變(例如屬於SEQ ID NO: 1且對應於MERS S蛋白之殘基V1060及L1061之K986 P及V987 P) (Pallesen等人「Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen.」 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2017 114:E7348-E7357 (2017)；Kirchdoerfer等人「Stabilized coronavirus spikes are resistant to conformational changes induced by receptor recognition or proteolysis.」 Sci. Rep. 2018 8, 15701)。脯胺酸突變(KV986-987 PP，亦即2P)有助於使多肽中之原型融合前形態穩定(亦即融合前穩定化突變)。在一些實施例中，編碼S蛋白抗原性多肽之核酸包含引起經表現多肽分泌之分泌信號。
在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸包含DNA。DNA可為單股或雙股、線性或環形、鬆弛或超螺旋的。DNA可為表現載體或質體。在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸包含RNA。RNA可為mRNA。
基於核酸之疫苗可快速地適應於諸如SARS-CoV-2之靶向病毒中之新的突變。基於核酸之疫苗可在數週或甚至數天內適應於病毒基因體中之新的突變。對於新的冠狀病毒株或現存病毒株之突變體，使用此項技術中已知之方法對編碼S蛋白之核酸序列進行定序。隨後，製備對應於編碼本文所描述之S蛋白抗原性多肽之核酸的編碼新的S蛋白抗原性多肽之核酸，且與編碼免疫刺激物之核酸組合以形成疫苗組合物，來引發針對新的冠狀病毒株或突變之免疫反應。 B)       免疫刺激物
冠狀病毒抗原性多肽與一或多種免疫刺激物共同投與。免疫刺激物可為免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。一或多種免疫刺激物支持先天性效應細胞、冠狀病毒抗原性多肽之呈現及細胞抗病毒T細胞反應之激活。免疫刺激物可為經分離之多肽或編碼免疫刺激物之核酸。在一些實施例中，編碼免疫刺激物之核酸包含DNA。DNA可為單股或雙股、線性或環形、鬆弛或超螺旋的。DNA可為表現載體或質體。在一些實施例中，編碼免疫刺激物之核酸包含RNA。RNA可為mRNA。
在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽包含經分離之多肽且免疫刺激物包含編碼免疫刺激物之核酸。在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽包含編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸且免疫刺激物包含經分離之多肽。在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物包含經分離之多肽。在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽包含編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸且免疫刺激物包含編碼免疫刺激物之核酸。
在一些實施例中，免疫刺激物包含免疫刺激性細胞介素。免疫刺激性細胞介素包括但不限於IL-1、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/受體α、IL-21、IL-23、IL-27、IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β及CXCL9。 C)          IL-12
在一些實施例中，免疫刺激性細胞介素包含IL-12。IL-12為已知為有效地支持NK (自然殺手)細胞及巨噬細胞功能且亦極化偏向Th1之T細胞反應的促發炎性細胞介素。已報導IL-12在細胞免疫反應及體液免疫反應兩者中增加。介白素12 (IL-12)在偏向Th1之反應誘導中起作用，同時協調先天性免疫系統及適應性免疫系統兩者。IL-12亦可經由活化抗原呈現細胞來增強抗原性且藉由促進朝向更具功能性之抗體之同型轉換來幫助體液反應。
IL-12為具有IL-12A (p35)次單元及IL-12B (p40)次單元兩者之雜二聚細胞介素。編碼IL-12之核酸可包含編碼IL-12 p40-IL-12 p35融合蛋白(IL-12 p70)之核酸序列、編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白(IL-12 p70)之核酸序列或IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元。編碼IL-12 p35及IL-12 p40次單元之核酸序列可處於藉由轉譯修飾元件間隔開之鄰接核酸序列上，從而允許兩個次單元均由單一啟動子或單一mRNA表現。轉譯修飾元件可為內部核糖體進入位點(IRES)元件或核糖體跳躍調節子。核糖體跳躍調節子可為但不限於2A元件(亦稱為2A肽或2A自裂解肽)。2A元件可為但不限於P2A、T2A、E2A或F2A元件。IL-12 p35及p40編碼序列可由來自單一啟動子之多順反子表現載體表現且藉由IRES或2A元件間隔開。 D)       CXCL9
在一些實施例中，免疫刺激性細胞介素包含CXCL9。C-X-C基序趨化介素配位體9 (CXCL9)為屬於CXC趨化介素家族之小細胞介素。CXCL9亦稱為由γ干擾素誘導之單核球激素(MIG)。CXCL9為T細胞化學引誘劑，且輔助腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之趨化性募集。 E)       Flt3L
在一些實施例中，免疫刺激性細胞介素包含基因佐劑。「基因佐劑」為可由核酸編碼且充當佐劑，從而相較於在不存在基因佐劑之情況下生成之免疫反應而言增強抗原特異性免疫反應的多肽。基因佐劑可選自由以下組成之群：Fms樣酪胺酸激酶3配位體(亦稱為Flt3配位體或Flt3L)、LAMP-1、鈣網伴護蛋白、人類熱休克蛋白96、GM-CSF及CSF受體1。在一些實施例中，基因佐劑包含Flt3L。
Flt3L為支持樹突狀細胞分化及成熟之免疫調節生長因子，樹突狀細胞分化及成熟兩者均參與T細胞激活。臨床資料表明，Flt3L可增強針對抗原之體液及T細胞反應(Bhardwaj, 2016)。已顯示編碼IL-12細胞介素之質體及Flt3L免疫調節子增強由針對模型抗原OVA (SIINFEKL抗原決定基)之DNA-疫苗誘導之免疫反應(圖2A-C)。
在一些實施例中，基因佐劑連接至病原體抗原性多肽，藉此形成基因佐劑-病原性抗原融合多肽。在一些實施例中，基因佐劑-病原性抗原融合多肽包含基因佐劑-SARS-CoV-2抗原融合多肽。在一些實施例中，基因佐劑-SARS-CoV-2抗原融合多肽包含Flt3L-SARS-CoV-2抗原融合多肽。SARS-CoV-2抗原性多肽可為但不限於本文所描述之SARS-CoV-2抗原性多肽中之任一種。
在一些實施例中，病原體抗原之免疫原性係藉由與IL-12及/或Flt3配位體共同遞送來增強。病原體抗原可由與IL-12及/或Flt3配位體相同之質體或與IL-12及/或Flt3配位體不同之質體表現。 F)        抗CD3半BiTE
在一些實施例中，免疫刺激性細胞介素包含抗CD3半BiTE。抗CD3半BiTE包含與跨膜域(TM)稠合之抗CD3單鏈可變片段(scFv)。scFv包含與短連接子肽連接之免疫球蛋白之重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變區的融合蛋白。抗CD3 scFv可由噬菌體呈現來加以識別。抗CD3 scFv亦可藉由由已知抗CD3抗體，諸如由融合瘤次選殖VH及VL生成。已知抗CD3抗體已描述於例如US20180117152、US20140193399、US20100183554及US20060177896中。已知抗CD3抗體亦包括但不限於OKT3 (莫羅單抗(Muromonab)-CD3)、145-2C11、17A2、SP7及UCHT1。在一些實施例中，抗CD3 scFv之VH域及/或VL域可經人類化。人類化抗體(或抗體片段或域)為來自蛋白序列已經修飾以提高其與在人類中天然地產生之抗體變異體之類似性的非人類物種的抗體。在一些實施例中，人類化抗體可藉由將抗CD3抗體之相關互補決定區(CDR，亦稱為高變區(HVR))插入人類VH及VL域骨架中來製造。
抗CD3 scFv可藉由連接VH鏈之C端與VL之N端形成。可替代地，VL之C端可連接至VH之N端。肽連接子可為約10至約25個胺基酸。在一些實施例中，scFv肽連接子富含甘胺酸。scFv肽連接子可為但不限於(G4S)x ，其中x為2至5之整數(包括端值)。在一些實施例中，scFv肽連接子包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (亦即GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 34)；亦稱為[(Gly)4 Ser]3 、(G4 S)3 或G4S (×3))。在一些實施例中，scFv肽連接子由G4S (×3)組成。
跨膜域(TM)包含能夠插入生物脂質雙層(膜)中且使抗CD3半BiTE錨定至膜的多肽。TM為此項技術中已知的且通常主要由非極性胺基酸組成。跨膜域可為但不限於PDGFRβ跨膜域或PDGFRα跨膜域(PDGFR為血小板源性生長因子受體)。在一些實施例中，間隔子包括在抗CD3 scFv與跨膜域之間。在一些實施例中，TM域包含選自包含以下之群之胺基酸序列：VGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALV-VLTIISLIILIMLWQKKPR (SEQ ID NO: 35)、AVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILA-LVV LTIISLIILIMLWQKKPR (SEQ ID NO: 36)、VVISAILALVVLTVISLIILI (PDGFRβ) (SEQ ID NO: 37)、VVISAILALVVLTIISLIILI (PDGFRβ) (SEQ ID NO: 38)、AAVLVLLVI-VIISLIVLVVIW (PDGFRα) (SEQ ID NO: 39)及AAVLVLLVIVIVSLIVLVVIW (PDGFRα) (SEQ ID NO: 40)。在一些實施例中，TM域由選自包含以下之群之核酸序列編碼：gtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgc-cacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggt-gctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgct-ttggcagaagaagccacgt (SEQ ID NO: 41)、gctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgc-cctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaa-gccacgt (SEQ ID NO: 42)、tggtgatct cagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatc (PDGFRβ) (SEQ ID NO: 43)、gtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatca tcctcatc (PDGFRβ) (SEQ ID NO: 44)、gctgcagtcctggtgctgttggtg attgtgatcatctcacttattgtcctggttgtcatt-tggaa (PDGFRα) (SEQ ID NO: 45)。
在一些實施例中，經編碼之抗CD3半BiTE多肽包括諸如Igκ信號肽之信號肽。
在一些實施例中，一或多種免疫刺激物包含IL-12及CXCL9、Flt3L或抗CD3半BiTE中之任一者。在一些實施例中，一或多種免疫刺激物包含IL-12、CXCL9及抗CD3半BiTE。在一些實施例中，一或多種免疫刺激物包含CXCL9及抗CD3半BiTE。在一些實施例中，一或多種免疫刺激物包含IL-12及CXCL9。在一些實施例中，一或多種免疫刺激物包含IL-12及抗CD3半BiTE。在一些實施例中，一或多種免疫刺激物包含IL-12及Flt3L。Flt3L可連接至病原體抗原性多肽。連接至Flt3L之病原性抗原可為本文所描述之SARS-CoV-2抗原性多肽中之任一者。 G)       多順反子表現載體
編碼至少一種免疫刺激物之核酸可存在於單個質體或多個質體上。類似地，編碼病原性抗原之核酸可存在於含有編碼至少一種免疫刺激物之一或多個核酸序列的質體上，或編碼病原性抗原之核酸可存在於單獨核酸上。含有編碼超過一種多肽之核酸序列之核酸可含有多順反子表現載體。
在一些實施例中，編碼IL-12之核酸亦編碼Flt3配位體、Flt3L-病原性抗原融合多肽、CXCL9、抗CD3半BiTE或病原體抗原性多肽。在一些實施例中，IL-12及Flt3L、Flt3L-病原性抗原融合多肽、CXCL9、抗CD3半BiTE或病原性抗原係由來自單一啟動子之多順反子表現載體表現。在一些實施例中，編碼CXCL9之核酸亦編碼抗CD3半BiTE。CXCL9及抗CD3半BiTE可由來自單一啟動子之多順反子表現載體表現。多順反子表現載體中之編碼序列可藉由IRES或2A轉譯修飾元件間隔開。在一些實施例中，轉譯修飾元件包含IRES元件。在一些實施例中，轉譯修飾元件包含2A元件。在一些實施例中，2A元件為P2A元件。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
表現載體或質體可含有多順反子表現載體。多順反子表現載體自同一mRNA表現兩種或更多種單獨蛋白且含有一或多個轉譯修飾元件。在一些實施例中，編碼IL-12之表現載體表現兩種或三種由單一啟動子表現之多肽，其中一或多個轉譯修飾元件使兩種或三種多肽由單一mRNA表現。在一些實施例中，表現載體包含： (a) P-A-T1 -B， (b) P-B-T1 -A， (c) P-B-T1 -B'， (d) P-A-T1 -B-T2 -B'或 (e) P-B-T1 -B'-T2 -A 其中P為啟動子，A編碼病原體抗原性多肽、Flt3L、Flt3L-病原性抗原融合多肽、CXCL9或抗CD3半BiTE，B及B'編碼IL-12或IL-12次單元，且T1 及T2 均為轉譯修飾元件。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
在一些實施例中，T1 及T2 獨立地為內部核糖體進入位點(IRES)元件或核糖體跳躍調節子。核糖體跳躍調節子可為但不限於2A元件(亦稱為2A肽或2A自裂解肽)。2A元件可為但不限於P2A (SEQ ID NO: 28)、T2A、E2A或F2A元件。 H)       核酸調配物
編碼所描述之病原體抗原性多肽及/或免疫刺激物中之任一種之核酸可經調配用於活體內投與。在一些實施例中，核酸經調配用於藉由電穿孔進行活體內投與。核酸可使用包括但不限於形成重疊基因塊片段之此項技術中已知之方法來製造。片段可使用PCR或Gibson裝配拼接在一起且選殖至諸如但不限於pUMVC3之載體中。蛋白質表現及分泌可在模型細胞株中使用附抗原決定基標籤之變異體來加以分析。
mRNA可為經活體外轉錄之mRNA。經活體外轉錄之mRNA可使用RNA聚合酶由DNA模板產生。聚合酶可為但不限於T7、T3或Sp6噬菌體RNA聚合酶。DNA模板可為超螺旋質體、松環DNA或線性DNA模板。經轉錄之mRNA可含有以下中之一或多者：5' UTR、3' UTR、5'帽、polyA尾、經假尿苷修飾之核苷酸及經1-甲基假尿苷修飾之核苷酸。在一些實施例中，mRNA為自擴增mRNA。自擴增RNA編碼所關注之抗原或免疫刺激物及使得能夠進行RNA複製之RNA依賴性RNA聚合酶兩者。
在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之DNA模板與5'及3'非轉譯區及poly-A尾側接。5' UTR可為但不限於5'-GGGA AAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUA-UAAGAGCCACC-3' (SEQ ID NO: 47)。3' UTR可為但不限於5'- UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCC-CCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCC GUGGUCUUUGAAUAAA-GUCUGA-3' (SEQ ID NO: 48)。
在一些實施例中，將供體甲基S-腺苷甲硫胺酸(SAM)添加至甲基化加帽RNA中。 I)        多肽調配物
在一些實施例中，病原性抗原或免疫刺激物可藉由宿主細胞中之多肽生物合成來製備。對於宿主細胞中之生物合成，產生編碼病原性抗原或免疫刺激物之核酸，且將其轉型或轉染至宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞為工業上可大規模化之微生物或真核培養細胞。在一些實施例中，病原性抗原或免疫刺激物經分離且/或經純化。多肽可藉助於此項技術中已知之肽純化自合成反應混合物分離且純化。舉例而言，多肽可使用諸如逆相HPLC、凝膠滲透、離子交換、粒徑排阻、親和力、分割或對流分佈之已知層析程序來純化。 III.      調配物
所描述之疫苗組合物可經調配以皮內、肌內及/或瘤內投與至個體。皮內投與包含注射至真皮中或遞送至真皮。肌內投與包含注射至骨骼肌中或遞送至骨骼肌。瘤內投與包含注射至腫瘤中或遞送至腫瘤。皮內投與、肌內投與及瘤內投與可使用此項技術中已知之包括但不限於習知注射器及針之用於投與至真皮、骨骼肌或腫瘤之裝置執行。
編碼病原體抗原性多肽及免疫刺激物之核酸可經調配以投與至真皮中(皮內投與)、投與至骨骼肌中(肌內投與)或投與至腫瘤中(瘤內投與)。
核酸可以裸核酸形式投與，或核酸可與魚精蛋白、陽離子型奈米乳液、樹枝狀體奈米粒子、魚精蛋白脂質體、脂質體、陽離子型聚合物、多醣粒子、聚脂質體、陽離子型脂質奈米粒子、陽離子型脂質膽固醇粒子或陽離子型脂質膽固醇PEG奈米粒子組合。在一些實施例中，電穿孔用於增強核酸向細胞之遞送。
在一些實施例中，編碼病原體抗原性多肽及/或免疫刺激物之核酸經囊封於諸如脂質奈米粒子(LNP)之脂質體中。LNP形成可使用包括但不限於乙醇滴降奈米沈澱之此項技術中可用之方法來執行。在一些實施例中，LNP含有1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、膽固醇及PEG-脂質；或可離子化陽離子型脂質、磷脂、膽固醇及PEG-脂質。在一些實施例中，LNP含有呈50:10:38.5:1.5莫耳比(可離子化脂質:DSPC:膽固醇:PEG-脂質或可離子化陽離子型脂質、磷脂、膽固醇及PEG-脂質)之脂質、DSPC、膽固醇及PEG-脂質。在一些實施例中，核酸為mRNA。在一些實施例中，LNP之尺寸在80-100 nm之間。
在一些實施例中，編碼病原體抗原性多肽及免疫刺激物之核酸可經調配以藉由皮內電穿孔(ID-EP)、肌內電穿孔(IM-EP)及/或瘤內電穿孔(IT-EP)投與至真皮中。在編碼模型蛋白之核酸電穿孔之後於經分泌蛋白之血清中之偵測示於圖3中。在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸可經調配以藉由直接注射、無針注射、微彈轟擊、流體動力學注射、磁轉染、超音波穿孔、光穿孔或水穿孔投與至真皮、肌肉或腫瘤中。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
皮內電穿孔(ID-EP)包含將一或多種核酸注射至真皮中且在注射部位將至少一次電穿孔脈波投與至真皮。一或多種核酸可在電穿孔脈波投與之前注射或實質上在電穿孔脈波投與同時注射。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
肌內電穿孔(IM-EP)包含將一或多種核酸注射至骨骼肌中且在注射部位將至少一次電穿孔脈波投與至骨骼肌。一或多種核酸可在電穿孔脈波投與之前注射或實質上在電穿孔脈波投與同時注射。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
瘤內電穿孔(IT-EP)包含將一或多種核酸注射至腫瘤中且將至少一次電穿孔脈波投與至腫瘤。一或多種核酸可在電穿孔脈波投與之前注射或實質上在電穿孔脈波投與同時注射。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
為了投與經分離之病原體抗原性多肽或經分離之免疫刺激物多肽，經分離之多肽可與疫苗佐劑組合。在一些實施例中，經分離之病原體抗原性多肽或經分離之免疫刺激物多肽與疫苗佐劑一起投與。在一些實施例中，多肽在注射之前與佐劑組合。佐劑可為但不限於明礬、Sigma佐劑系統或弗氏佐劑(Freund's adjuvant)。明礬可為但不限於明礬水凝膠。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
所描述之疫苗組合物中之任一種可包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，將一或多種醫藥學上可接受之賦形劑(包括媒劑、載劑、稀釋劑及/或遞送聚合物)添加至編碼病原性抗原或免疫刺激物之核酸中之一或多者中。在一些實施例中，病原性抗原為冠狀病毒抗原性多肽。
醫藥學上可接受之賦形劑(「賦形劑」)為除活性醫藥成分(API，治療性產品；例如編碼冠狀病毒抗原性多肽或免疫刺激物之核酸)以外之有意包括於藥物遞送系統中的物質。賦形劑在預期劑量下不發揮或意欲不發揮治療作用。賦形劑可用以a)在製造期間輔助加工藥物遞送系統，b)保護、支持或增強API之穩定性、生物可用性或患者接受性，c)輔助產品識別，及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之總體安全性、有效性之任何其他屬性。醫藥學上可接受之賦形劑可為或可不為惰性物質。
賦形劑包括但不限於：轉染增強劑、吸收增強劑、抗黏劑、抗起泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、包衣劑、色料、遞送增強劑、遞送聚合物、聚葡萄糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、助滑劑、保濕劑、潤滑劑、油、聚合物、防腐劑、鹽水、鹽、溶劑、糖、懸浮劑、持續釋放型基質、增稠劑、張力劑、媒劑、驅水劑及潤濕劑。轉染增強劑包括但不限於脂質、陽離子型脂質、脂質、聚陽離子、細胞穿透肽及其組合。
疫苗組合物可含有通常存在於醫藥組合物中之其他額外組分。該等額外組分可包括但不限於止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑(例如抗組胺劑、苯海拉明(diphenhydramine)等)。如本文所使用之「藥理學有效量」、「治療有效量」或僅僅「有效劑量」係指產生預期藥理學、治療性或預防性結果之所描述之核酸的量。
適用於可注射用途之疫苗組合物包括無菌水溶液及用於臨時製備無菌可注射溶液之無菌散劑。對於包括ID-EP、IM-EP及IT-EP之皮內、肌內或瘤內注射，合適載劑包括但不限於生理鹽水及磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。 IV.       套組
所描述之經分離之多肽、核酸及/或包含本文所揭示之經分離之多肽及/或核酸之疫苗組合物中的任一種可封裝或包括於套組、容器、包裝或分配器中。所描述之經分離之多肽、核酸及/或包含經分離之多肽、核酸之疫苗組合物中的任一種可封裝於預填充注射器或小瓶中。經分離之多肽、核酸及/或疫苗組合物可以凍乾粉形式提供或其可以溶液形式提供。套組可包含用於執行本文所揭示之方法之試劑。套組亦可包含諸如但不限於電穿孔施加器之本文所揭示之組合物、工具或儀器。在一些實施例中，套組包含所描述之核酸及/或包含核酸之疫苗組合物及電穿孔裝置或施加器中之一或多者。在一些實施例中，套組包含所描述之核酸、一或多個電穿孔施加器、注射器及注射針中之一或多者。編碼冠狀病毒抗原性多肽(諸如SARS-CoV-2棘狀蛋白及其抗原片段)之核酸及編碼免疫刺激物(諸如IL-12)之核酸可在單獨容器(小瓶等)中提供或其可在單一容器中組合。經分離之冠狀病毒抗原性多肽及經分離之免疫刺激物可在單獨容器(小瓶等)中提供或其可在單一容器中組合。
在一些實施例中，疫苗組合物包含含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第一容器及含有編碼免疫刺激物之核酸的第二容器。在一些實施例中，疫苗組合物包含含有冠狀病毒抗原性多肽的第一容器及含有編碼免疫刺激物之核酸的第二容器。在一些實施例中，疫苗組合物包含含有冠狀病毒抗原性多肽的第一容器及含有免疫刺激物多肽的第二容器。在一些實施例中，疫苗組合物包含含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第一容器及含有免疫刺激物多肽的第二容器。
在一些實施例中，疫苗組合物包含含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第一容器、含有編碼免疫刺激物之核酸的第二容器及含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第三容器。在一些實施例中，疫苗組合物包含含有冠狀病毒抗原性多肽的第一容器、含有免疫刺激物多肽的第二容器及含有冠狀病毒抗原性多肽的第三容器。在一些實施例中，疫苗組合物包含含有冠狀病毒抗原性多肽的第一容器、含有編碼免疫刺激物之核酸的第二容器及含有冠狀病毒抗原性多肽的第三容器。在一些實施例中，疫苗組合物包含含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第一容器、含有免疫刺激物多肽的第二容器及含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第三容器。
在一些實施例中，疫苗組合物包含含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸的第一容器及含有編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的第二容器。在一些實施例中，疫苗組合物包含含有冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物多肽的第一容器及含有冠狀病毒抗原性多肽的第二容器。
容器可含有足量之多肽或核酸以提供單次有效劑量或多次有效劑量。多肽或編碼一或多種冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物之核酸可為所描述之冠狀病毒抗原性多肽、免疫刺激物或其組合中之任一種。
在一些實施例中，套組進一步含有以下中之一或多者：使用說明書或呈管理產品製造、使用或銷售之政府機構規定之形式的通告。 V.        疫苗接種
防治性抗病毒疫苗通常藉由觸發體液免疫反應而依賴於中和抗體。此抗體定向之免疫通常由Th2極化環境中之減毒或次單元疫苗生成。Th1型細胞介素傾向於產生負責殺滅胞內病原體之促發炎反應。過量Th2反應可能會抑制或抵消Th1型反應。Th1型免疫反應係藉由共同投與免疫刺激物來引發。Th1型免疫反應可限制有時與Th2特異性細胞介素相關之臨床病理學及相關免疫子集。引發Th1極化免疫反應可有助於驅動細胞T細胞反應，此種情況可對同型轉換及抗病毒效應細胞介素誘導至關重要。在一些實施例中，所描述之疫苗組合物及方法可引發偏向Th2之反應(體液免疫)及偏向Th1之T細胞反應兩者。
IL-12在偏向Th1之反應誘導中起作用，同時協調先天性免疫系統及適應性免疫系統兩者。除觸發細胞免疫之外，IL-12亦可經由活化抗原呈現細胞來增強抗原性。IL-12亦可藉由促進朝向更具功能性之抗體之同型轉換來幫助體液反應。在包括諸如IL-12之免疫刺激物之情況下，所描述之疫苗組合物驅動能夠利用先天性、適應性體液組及適應性細胞組的經協調之免疫反應。
用於遞送基於核酸之疫苗之組織之位置及細胞架構可調節疫苗所生成之免疫反應的有效性及/或類型。在一些情況下，非病毒核酸疫苗之肌內投與已顯示為有效地生成抗體介導之(體液)免疫(Brown PA等人「Delivery of DNA into skeletal muscle in large animals.」 Methods Mol Bio, 2008 423:215-224.)。肌肉組織之諸如可接近性、大面積及大範圍血管形成之特性使得經表現蛋白能夠持久表現且有效循環(Brown PA等人2008)。靶向皮膚之電穿孔介導之遞送已得到描述(Hirao LA等人「Multivalent Smallpox DNA Vaccine Delivered by Intradermal Electroporation Drives Protective Immunity in Nonhuman Primates Against Lethal Monkeypox Challenge.」J Infect Dis, 2011 203(1):95-102)。皮膚含有諸如呈現抗原且激活細胞(T細胞介導)抗病毒反應之朗格罕氏細胞(Langerhans cell)及駐留皮膚之樹突狀細胞的抗原呈現細胞(APC) (Hirao LA等人2011；及Tobin D 「Biochemistry of human skin--our brain on the outside.」Chem Soc Rev, 2006 35(1):52-67)。
描述視情況在空間上不同之部位共同投與冠狀病毒抗原性多肽及一或多種免疫刺激物之方法。亦描述經由電穿孔來共同投與編碼冠狀病毒抗原性多肽及一或多種免疫刺激物之核酸之方法。編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸之肌內遞送引起可擴散之冠狀病毒抗原性多肽表現。編碼冠狀病毒抗原性多肽及/或所描述之免疫刺激物中之至少一種之核酸的皮內及/或瘤內遞送引起此等多肽於此等組織中表現。
冠狀病毒抗原性多肽及一或多種免疫刺激物之局部投與或表現可誘導局部偏向Th1之反應及細胞抗病毒T細胞反應。由於局部細胞激活不妨礙諸如引流淋巴結之二級淋巴組織中之體液免疫激活，因此所描述之疫苗接種方法能夠產生細胞抗冠狀病毒免疫及體液抗冠狀病毒免疫兩者。
在一些實施例中，所描述之疫苗組合物及方法能夠利用冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物向空間上不同之部位(例如真皮及骨骼肌)的遞送。一或多種抗原及免疫刺激物之離散模組布建在真皮中產生免疫原性細胞微環境，其中IL-12容易地支持先天性效應細胞以及諸如SARS-CoV-2 S抗原性多肽之抗原呈現，且隨後激活細胞抗病毒T細胞反應。
在一些實施例中，所描述之疫苗誘導涉及體液及細胞免疫反應路徑之經協調之免疫反應。在一些實施例中，所描述之疫苗誘導體液免疫反應及細胞免疫反應。
在一些實施例中，所描述之疫苗誘導體液免疫反應。在一些實施例中，所描述之疫苗介導中和抗體之產生。在一些實施例中，中和抗體防止肺病毒複製。
在一些實施例中，所描述之疫苗誘導細胞免疫反應。細胞免疫反應可包括先天性(NK)及適應性(CD4+ T細胞)組且引起諸如IFN-γ及TNF-α之Th1定向之細胞介素的產生(Chen J等人「The Immunobiology of SARS*」Annu Rev Immunol , 2007 25:443-472；及Li CK等人2008)。
在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼至少一種免疫刺激物之一或多個核酸序列係藉由ID-EP、IM-EP及/或IT-EP遞送至個體。
在一些實施例中，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼至少一種免疫刺激物之一或多個核酸序列係藉由IT-EP、ID-EP、IM-EP或其組合遞送至患有至少一種腫瘤之個體。
在一些實施例中，核酸之肌內電穿孔(IM-EP)投與包含向骨骼肌組織中注射含有核酸之溶液且在注射部位投與至少一次電穿孔脈波。肌肉可為但不限於三角肌、腿部肌肉或臀部中之肌肉。
在一些實施例中，將0.1-3 mg核酸注射至骨骼肌中以進行IM-EP。在一些實施例中，注射0.1±0.05 mg核酸。在一些實施例中，注射0.25±0.15 mg核酸。在一些實施例中，注射0.5±0.4 mg核酸。在一些實施例中，注射0.8±0.5 mg核酸。核酸可為DNA或RNA。核酸可為表現載體或質體。在一些實施例中，核酸為非病毒載體。
在一些實施例中，將核酸以20-1000 μL之體積注射至骨骼肌中。在一些實施例中，將核酸以250±10 μL、50±30 μL、250±50 μL、500±100 μL或750±250 μL之體積注射。一或多次注射可在單個位置中或在兩個或更多個位置中。對於在兩個或更多個位置中之注射，注射可彼此相鄰或在單獨位置中。舉例而言，個體可在兩次各250 μL之相鄰注射中接受500 μL。類似地，個體可在兩次各375 μL之相鄰注射中接受750 μL。對於兩次相鄰注射，注射可足夠接近以使得電穿孔施加器電極能夠橫跨兩個注射部位。
在一些實施例中，將核酸以0.5至1.5 cm或更大之深度注射至骨骼肌中。在一些實施例中，將核酸以0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 cm或大於1.5 cm之深度注射。在一些實施例中，將核酸以1.0±0.5 cm或1.5±0.5 cm之深度注射。
在一些實施例中，核酸之皮內電穿孔(ID-EP)投與包含向真皮中注射含有核酸之溶液且電穿孔注射部位。注射部位可為但不限於肩部、腿部或臀部。
在一些實施例中，將0.1-3 mg核酸多肽注射至真皮中。在一些實施例中，注射0.25±0.01 mg、0.25±0.05 mg、0.25±0.1 mg或0.25±0.15 mg核酸。在一些實施例中，注射0.1±0.05 mg、0.25±0.15 mg、0.5±0.4 mg或0.8±0.5 mg核酸。核酸可為DNA或RNA。核酸可為表現載體或質體。在一些實施例中，核酸為非病毒載體。
在一些實施例中，將核酸以20-1000 μL之體積注射至真皮中。在一些實施例中，將核酸以50±30 μL、100±50 μL、250±500 μL、500±100 μL或750±250 μL之體積注射。一或多次注射可在單個位置中或在兩個或更多個位置中。對於在兩個或更多個位置中之注射，注射可彼此相鄰或在單獨位置中。舉例而言，個體可在兩次各250 μL之相鄰注射中接受500 μL。類似地，個體可在兩次各375 μL之相鄰注射中接受750 μL。對於兩次相鄰注射，注射可足夠接近以使得電穿孔施加器電極能夠橫跨兩個注射部位。
在一些實施例中，將核酸以0.01至0.25 cm之深度注射至真皮中。在一些實施例中，將核酸以約0.1 cm之深度注射。在一些實施例中，將核酸以小於0.1 cm之深度注射。在一些實施例中，將核酸注射至最外活性組織層、顆粒層中。
在一些實施例中，核酸之瘤內電穿孔(ID-EP)投與包含向腫瘤中注射含有核酸之溶液且電穿孔注射部位。腫瘤可為但不限於實體腫瘤、皮膚腫瘤、皮下腫瘤或內臟腫瘤。
在一些實施例中，將0.01-3 mg核酸多肽注射至腫瘤中。在一些實施例中，注射0.1±0.05 mg、0.25±0.15 mg、0.5±0.4 mg、0.8±0.5 mg、1±0.5 mg或2±0.5 mg核酸。核酸可為DNA或RNA。核酸可為表現載體或質體。在一些實施例中，核酸為非病毒載體。
在一些實施例中，將核酸以20-1000 μL之體積注射至腫瘤中。在一些實施例中，將核酸以50±30 μL、250±50 μL、500±100 μL、750±250 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以對應於腫瘤之計算體積之25%±10%的體積注射至腫瘤中。在一些實施例中，將核酸以0.5-1.0 mg/ml之濃度以對應於腫瘤之計算體積之25%±10%的體積注射至腫瘤中。注射至腫瘤中可包括注射至腫瘤周圍之邊緣組織中。注射至腫瘤中可包括儘可能均一地注射腫瘤且視情況注射腫瘤周圍之邊緣組織(亦即將注射分散在整個腫瘤中且視情況分散在腫瘤周圍之整個邊緣組織中)。
對於ID-EP、IM-EP及IT-EP中之各者，插入EP施加器之電極以使得電極橫跨一或多個注射部位。電極通常設置在與注射大約相同之深度處。在一些實施例中，將EP施加器之電極設定成與注射相同之深度±0.3 cm。在一些實施例中，將EP施加器之電極設定成與注射相同之深度±0.2 cm。在一些實施例中，將EP施加器之電極設定成與注射相同之深度±0.1 cm。插入EP施加器之電極以使得在注射部位向細胞投與電穿孔脈波。
在一些實施例中，投與1-10次在100-1500 V/cm之場強(E+)及約0.1-20 ms之脈波寬度(持續時間)下之脈波。在一些實施例中，投與1-10次在400±100 V/cm之場強(E+)及約1-20 ms之脈波寬度下之脈波。在一些實施例中，以0.3-1秒間隔投與六至八次在約400 V/cm之場強(E+)及約10 ms之脈波寬度下之脈波。在一些實施例中，投與1-10次在1300-1500 V/cm之場強(E+)及約0.1 ms之脈波寬度下之脈波。
在一些實施例中，投與一或多次在約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550或約600 V/cm之場強下之脈波。在一些實施例中，投與一或多次在400 ±250 V/cm、400 ±100 V/cm、400 ±75 V/cm或400 ±50 V/cm之場強下之脈波。在一些實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次在100-1500 V/cm之場強下之脈波。在一些實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次在約400 V/cm之場強下之脈波。在一些實施例中，脈波寬度為約0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20毫秒。在一些實施例中，脈波寬度為約0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20毫秒且場強為約400 V/cm。
編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可存在於同一溶液或不同溶液中。若存在於單獨溶液中，則編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可並行地或依序地注射。編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可在注射之前組合。
經分離之冠狀病毒抗原性多肽及經分離之免疫刺激物多肽可存在於同一溶液或不同溶液中。若存在於單獨溶液中，則經分離之冠狀病毒抗原性多肽及經分離之免疫刺激物多肽可並行地或依序地注射。經分離之冠狀病毒抗原性多肽及經分離之免疫刺激物多肽可在注射之前組合。
編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可共同注射至真皮、肌肉及/或腫瘤中。編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可在注射至真皮、肌肉及/或腫瘤中之前組合。編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可存在於同一載體(例如質體或RNA)上。當存在於同一載體上時，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激物之核酸可由不同啟動子表現或由單一啟動子表現，如在多順反子載體中。
皮內投與包括但不限於注射至真皮(例如肩部、大腿或臀部之真皮)中。在一些實施例中，皮內投與包含ID-EP。
肌內投與包括但不限於注射至肌肉(例如肩部肌肉(例如三角肌)、腿部肌肉(例如前外側大腿肌肉、股外側肌或腓腸肌)或臀部肌肉(例如背側臀肌))中。在一些實施例中，肌內投與包含IM-EP。
瘤內投與包括但不限於注射至腫瘤中。在一些實施例中，瘤內投與包含IT-EP。
在一些實施例中，疫苗接種發生在包含以下之單一步驟中：皮內投與、肌內投與或瘤內投與。
在一些實施例中，疫苗接種發生在包含以下之兩個步驟中：(a)藉由皮內投與來投與第一劑量且藉由肌內投與來投與第二劑量；(b)藉由皮內投與來投與第一劑量且藉由瘤內投與來投與第二劑量；或(c)藉由肌內投與來投與第一劑量且藉由瘤內投與來投與第二劑量；其中第一劑量包含冠狀病毒抗原性多肽、免疫刺激物或冠狀病毒抗原性多肽與免疫刺激物之組合，且第二劑量包含冠狀病毒抗原性多肽、免疫刺激物或冠狀病毒抗原性多肽與免疫刺激物之組合。皮內投與可在肌內投與之前、在其之後或與其並行執行。皮內投與可在瘤內投與之前、在其之後或與其並行執行。肌內投與可在瘤內投與之前、在其之後或與其並行執行。在一些實施例中，第一劑量包含冠狀病毒抗原性多肽且第二劑量包含免疫刺激物。在一些實施例中，第一劑量包含冠狀病毒抗原性多肽且第二劑量包含冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量兩者均包含冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激物。兩個步驟可發生在彼此1小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘或5分鐘內。
在一些實施例中，第一劑量包含0.25-1 mg編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及0.25-1 mg編碼免疫刺激物之核酸，且第二劑量包含0.25-1 mg編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸。在一些實施例中，第一劑量包含0.25-1 mg編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸且第二劑量包含0.25-1 mg編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸。
冠狀病毒抗原性多肽可為包括編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸的本文所描述之冠狀病毒抗原性多肽中之任一種。在一些實施例中，冠狀病毒抗原性多肽包含SARS-CoV-2棘狀多肽或其抗原片段。免疫刺激物可為包括編碼免疫刺激物之核酸的本文所描述之免疫刺激物中之任一種。在一些實施例中，第二劑量包含編碼IL-12之核酸。在一些實施例中，第二劑量包含編碼IL-12及Flt3L、CXCL9或抗CD3半BiTE之核酸。
可給予個體單一疫苗接種或可給予個體初次疫苗接種及一或多次加強疫苗接種。在一些實施例中，可在個體上之同一位置中(例如在同一肢體中)或不同位置(例如不同肢體)中向個體投與初次及加強疫苗接種。
在一些實施例中，該等方法包含至少一種冠狀病毒抗原性多肽及至少一種免疫刺激物之至少兩輪投與(疫苗接種)，亦即初次疫苗接種及加強疫苗接種。各輪執行至少一種冠狀病毒抗原性多肽之投與及至少一種免疫刺激物之投與。第二輪投與(加強)可在第一輪投與(初次)之後2週至12個月執行。在一些實施例中，第二輪投與係在第一輪投與之後2週至6個月、在第一輪投與之後14-63天或在第一輪投與之後14-45天月執行。在一些實施例中，第二輪投與係在第一輪投與之後約14天、約21天、約28天、約30天、約35天、約42天、約49天、約56天或約63天執行。在一些實施例中，第一輪(初次)係在第1天投與，且第二輪(加強)係在第63天± 35天、第42天± 21天、第28天± 14天、第28天± 7天或第21天± 7天投與。在一些實施例中，額外輪係在先前投與之後約5年、約4年、約3年、約2年、約1年、約9個月、6個月、63 ± 35天、42 ± 21天、28 ± 14天或第28天± 7天或21天± 7天投與。
在一些實施例中，第一次及後續加強投與可以2-6週之間隔執行。在一些實施例中，間隔為2週± 5天。在一些實施例中，間隔為3週± 5天。在一些實施例中，間隔為4週± 5天。在一些實施例中，間隔為5週± 5天。在一些實施例中，間隔為6週± 5天。 VI.      免疫反應
在一些實施例中，所描述之疫苗誘導以下中之一或多者：中和抗體產生、經增加之CD8+ T細胞增殖及/或反應、經增加之CD4+ T細胞增殖及/或反應、經增加之記憶T細胞增殖及/或反應、經平衡之Th1/Th2抗體同型反應、S特異性IgG2a及IgG1反應、預防上氣道冠狀病毒感染、預防下氣道冠狀病毒感染、針對冠狀病毒感染之保護性免疫、預防症狀性COVID-19疾病、預防COVID-19疾病之至少一種症狀、降低COVID-19疾病之一或多種症狀之嚴重程度或減少其持續時間及預防重度COVID-19疾病。
在一些實施例中，所描述之方法可用於：在投與單次劑量之後誘導中和抗體產生、增加CD8+ T細胞增殖及/或反應、增加CD4+ T細胞增殖及/或反應、增加記憶T細胞增殖及/或反應、誘導經平衡之Th1/Th2抗體同型反應、誘導S特異性IgG2a及IgG1反應、預防上氣道冠狀病毒感染、預防下氣道冠狀病毒感染、誘導針對冠狀病毒感染之保護性免疫、預防症狀性COVID-19疾病、預防COVID-19疾病之至少一種症狀、降低COVID-19疾病之一或多種症狀之嚴重程度或減少其持續時間或預防重度COVID-19疾病。
在一些實施例中，所描述之方法可用於：在投與初次投與及至少一次加強投與之後誘導中和抗體產生、增加CD8+ T細胞增殖及/或反應、增加CD4+ T細胞增殖及/或反應、增加記憶T細胞增殖及/或反應、誘導經平衡之Th1/Th2抗體同型反應、誘導S特異性IgG2a及IgG1反應、預防上氣道冠狀病毒感染、預防下氣道冠狀病毒感染、誘導針對冠狀病毒感染之保護性免疫、預防症狀性COVID-19疾病、預防COVID-19疾病之至少一種症狀、降低COVID-19疾病之一或多種症狀之嚴重程度或減少其持續時間或預防重度COVID-19疾病。
在一些實施例中，所描述之疫苗之投與預防肺及/或鼻中之冠狀病毒感染。在一些實施例中，所描述之疫苗之投與引起攻擊之後的肺及鼻中之病毒複製減少。在一些實施例中，所描述之疫苗之投與引起攻擊之後的鼻甲骨中之病毒複製減少。 VII.     治療癌症之方法
病原性抗原及免疫刺激物可藉由投與一或多種編碼病原性抗原及免疫刺激物之核酸來投與至個體。在一些實施例中，免疫刺激物為免疫刺激性細胞介素。在一些實施例中，免疫刺激性細胞介素為IL-12。在一些實施例中，編碼免疫刺激物之核酸經投與至腫瘤，且編碼病原性抗原之核酸經投與至腫瘤、真皮或骨骼肌。
描述用於治療個體之腫瘤之方法，其包含向個體投與有效劑量之編碼免疫刺激性細胞介素(例如IL-12)之表現載體及有效劑量之編碼病原性抗原之表現載體。編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體係藉由將表現載體注射至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中且將電穿孔療法投與至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織(IT-EP治療)來投與至個體。編碼病原性抗原之表現載體係藉由以下投與至個體：(a)將表現載體注射至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中且將電穿孔療法投與至腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織(IT-EP治療)，(b)將表現載體注射至真皮中且在注射部位將電穿孔療法投與至真皮(ID-EP治療)，或(c)將表現載體注射至骨骼肌中且在注射部位將電穿孔療法投與至肌肉(IM-EP治療)。編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體可在投與編碼病原性抗原之表現載體之前、與其並行或在其之後投與。為了向腫瘤投與編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及編碼病原性抗原之表現載體兩者，該等表現載體可在注射之前組合，分開注射，或該等表現載體可存在於單一質體、RNA或病毒載體上。
經治療之腫瘤可為皮膚腫瘤、皮下腫瘤或內臟腫瘤。腫瘤可為癌性或非癌性的。腫瘤可為但不限於實體腫瘤、表面病灶、非表面病灶、在身體表面15 cm內之病灶或內臟病灶。在一些實施例中，所描述之方法及表現載體可用於治療原發性腫瘤以及遠端(亦即未經治療)腫瘤及轉移。在一些實施例中，所描述之組合物及方法提供腫瘤尺寸減小或腫瘤生長抑制、癌細胞生長抑制、轉移抑制或減少、轉移癌發展減少或抑制及/或患有癌症之個體之癌症復發減少。腫瘤不限於特定類型之腫瘤或癌症。
IT-EP病原性抗原(PA)療法或治療包含向腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織注射有效劑量之所描述之編碼病原性抗原之表現載體且向腫瘤投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
IT-EP S蛋白抗原療法或治療包含向腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織注射有效劑量之所描述之編碼SARS-CoV-2 S蛋白抗原之表現載體且向腫瘤投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
ID-EP病原性抗原(PA)療法或治療包含向真皮注射有效劑量之所描述之編碼病原性抗原之表現載體且在注射部位向真皮投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
ID-EP S蛋白抗原療法或治療包含向真皮注射有效劑量之所描述之編碼S蛋白抗原之表現載體且在注射部位向真皮投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
IM-EP病原性抗原(PA)療法或治療包含向骨骼肌注射有效劑量之所描述之編碼病原性抗原之表現載體且在注射部位向骨骼肌投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
ID-EP S蛋白抗原療法或治療包含向骨骼肌注射有效劑量之所描述之編碼S蛋白抗原之表現載體且在注射部位向骨骼肌投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
IT-EP免疫刺激性細胞介素療法或治療包含向腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織注射有效劑量之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體且向腫瘤投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
IT-EP IL-12療法或治療包含向腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織注射有效劑量之編碼IL-12之表現載體且向腫瘤投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
IT-EP免疫刺激性細胞介素-病原性抗原療法或治療包含向腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織注射有效劑量之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及有效劑量之編碼病原性抗原之表現載體且向腫瘤投與至少一次電穿孔脈波。電穿孔脈波可使用適用於哺乳動物個體之任何已知電穿孔裝置來執行。
所描述之表現載體及方法經考慮用於罹患癌症之個體。經本實施例之方法治療之腫瘤可為以下中之任一者：非侵入性腫瘤、侵入性腫瘤、表面腫瘤、乳頭狀腫瘤、扁平腫瘤、轉移性腫瘤、局部化腫瘤、單中心腫瘤、多中心腫瘤、低級腫瘤及高級腫瘤。此等生長自身可顯現為以下中之任一者：病灶、瘜肉、贅瘤(例如乳頭狀尿道上皮贅瘤)、乳頭狀瘤、惡性腫瘤、腫瘤(例如克拉斯金腫瘤(Klatskin tumor)、肺門腫瘤、非侵入性乳頭狀尿道上皮腫瘤、生殖細胞腫瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、阿金氏腫瘤(Askin's tumor)、原始神經外胚層瘤、萊迪希氏細胞腫瘤(Leydig cell tumor)、威耳姆士腫瘤(Wilms' tumor)、塞特利氏細胞腫瘤(Sertoli cell tumor))、肉瘤、癌瘤(例如鱗狀細胞癌、泄殖腔源性癌、腺癌、腺鱗癌、膽管癌、肝細胞癌、侵入性乳頭狀尿道上皮癌、扁平尿道上皮癌)、腫塊或任何其他類型之癌性或非癌性生長。該等表現載體及方法可用於治療晚期、轉移性或治療難治性癌症。
術語「癌症」包括特徵一般在於不當細胞增殖、異常或過度細胞增殖之多種疾病。癌症可為但不限於實體癌症、肉瘤、癌瘤及淋巴瘤。癌症亦可為但不限於胰臟癌、皮膚癌、腦癌、肝癌、膽囊癌、胃癌、淋巴結癌、乳癌、肺癌、頭頸癌、喉癌、咽癌、唇癌、咽喉癌、心臟癌、腎癌、肌肉癌、結腸癌、前列腺癌、胸腺癌、睾丸癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌及皮下癌。皮膚癌可為但不限於黑色素瘤及基底細胞癌。乳癌可為但不限於ER陽性乳癌、ER陰性乳癌及三陰性乳癌。在一些實施例中，所描述之方法可用於治療細胞增生性病症。術語「細胞增生性病症」指示常常似乎在形態上及基因型上不同於周圍組織之惡性以及非惡性細胞群體。在一些實施例中，所描述之方法可用於治療人類。在一些實施例中，所描述之方法可用於治療非人類動物或哺乳動物。非人類哺乳動物可為但不限於小鼠、大鼠、兔、狗、貓、豬、母牛、綿羊及馬。
本文所描述之表現載體及方法經考慮用於例如腎上腺皮層癌、肛門癌、膽管癌(例如肝門膽管癌、遠側膽管癌、肝內膽管癌)、膀胱癌、良性及癌性骨癌(例如骨瘤、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤、骨軟骨瘤、血管瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、骨巨細胞瘤、脊索瘤、淋巴瘤、多發性骨髓瘤)、腦及中樞神經系統癌(例如脊膜瘤、星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、室管膜瘤、神經膠質瘤、神經管胚細胞瘤、神經節膠質細胞瘤、神經鞘瘤、胚細胞瘤、顱咽管瘤)、乳癌(例如乳腺管原位癌、浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、小葉原位癌、男性女乳症)、卡斯特萊曼疾病(Castleman disease) (例如巨大淋巴結增生、血管濾泡性淋巴結增生)、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌(例如子宮內膜腺癌、腺棘皮癌、乳頭狀漿液性腺癌、透明細胞)、食道癌、膽囊癌、(黏液性腺癌、小細胞癌)、胃腸類癌(例如絨毛膜癌、破壞性絨毛膜腺瘤)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、腎癌(例如腎細胞癌)、喉部及下咽癌、肝癌(例如血管瘤、肝腺瘤、局灶性結節性增生、肝細胞癌)、肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、間皮瘤、漿細胞瘤、鼻腔及鼻竇癌(例如敏感性神經胚細胞瘤、中線肉芽腫)、鼻咽癌、神經母細胞瘤、口腔及口咽癌、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、  腦下垂體癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤(例如胚胎性橫紋肌肉瘤、齒槽橫紋肌肉瘤、多形態橫紋肌肉瘤)、唾液腺癌、皮膚癌、黑色素瘤及非黑色素瘤皮膚癌兩者)、胃癌、睾丸癌(例如精原細胞瘤、非精原細胞瘤生殖細胞癌)、胸腺癌、甲狀腺癌(例如濾泡性癌、未分化癌、分化不良癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺淋巴瘤)、陰道癌、外陰癌及子宮癌(例如子宮平滑肌肉瘤)中。
所描述之方法可用於引起以下中之一或多者：使腫瘤惡化、誘導T細胞浸潤至腫瘤或腫瘤微環境中(增加腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之數目)、增強全身性T細胞反應、誘導T細胞活化、誘導腫瘤特異性T細胞活化、增強T細胞反應、增強抗原特異性T細胞反應、增加T細胞增殖、增加抗原特異性T細胞增殖、增強多株T細胞反應、增加腫瘤或腫瘤微環境中之NK及/或NKT細胞、增強針對經治療及/或未經治療之腫瘤之免疫反應、減少T細胞衰竭、增加一或多種經治療或未經治療之腫瘤中之淋巴球及單核球細胞表面標記、增加一或多種經治療或未經治療之腫瘤中之經INFγ調節之基因的瘤內含量、增加個體血液中之增殖效應記憶T細胞、增加個體血液中之短壽命效應細胞、增加癌性腫瘤中活化自然殺手細胞中存在之基因表現、增加癌性腫瘤中在抗原呈現中起作用之基因表現、增加癌性腫瘤中在T細胞存活及T細胞介導之細胞毒性中起作用之基因表現、誘導經治療及/或未經治療之腫瘤消退、誘導經治療及/或未經治療之腫瘤減積及改進對諸如但不限於免疫檢查點抑制劑療法之第二療法之反應。在一些實施例中，癌症治療包括以下中之一或多者：增強對腫瘤之免疫反應、腫瘤消退、轉移性腫瘤消退、延長個體存活及增加無腫瘤存活。
在一些實施例中，ID-EP或IT-EP病原性抗原療法增強IL-12影響，從而引起腫瘤特異性淋巴球之有效運輸增加、腫瘤消退增加、腫瘤體積減小及/或存活或無腫瘤存活延長。 A)治療方案/循環
所描述之癌症療法可視諸如以下之因素而以各種時間間隔投與：腫瘤性質、個體病況、分子尺寸及化學特徵以及分子半衰期。
在一些實施例中，且在一循環之第1天(± 2天)、第5天(± 2天)及第8天(± 2天)給予腫瘤IT-EP IL-12-病原性抗原療法。在一些實施例中，且在一循環之第1天(± 2天)及第5天(± 2天)給予腫瘤IT-EP IL-12-病原性抗原療法。在一些實施例中，且在一循環之第1天(± 2天)及第8天(± 2天)給予腫瘤IT-EP IL-12-病原性抗原療法。
治療循環可包含1-6次IT-EP治療。在一些實施例中，治療循環包含1、2或3次IT-EP治療。循環可為約1週至約6週。在一些實施例中，循環為2週。在一些實施例中，循環為3週。在一些實施例中，循環為4週。在一些實施例中，循環為5週。在一些實施例中，循環為6週。
在一些實施例中，循環包含1-3次IT-EP治療。治療可發生在第1天(± 2天)、第5天(± 2天)及/或第8天(± 2天)(亦即第0天(± 2天)、第4天(± 2天)及/或第7天(± 2天))。各治療可包含以下中之一或多者：IT-EP IL-12療法、IT-EP IL-12-病原性抗原療法、IT-EP IL-12療法加上IT-EP病原性抗原療法及IT-EP IL-12療法加上ID-EP或IM-EP病原性抗原療法。
在一些實施例中，可每一個循環或每隔一個循環投與治療。循環可重複以使得將2個或更多個循環投與至個體。重複循環可連續地投與，與一或多個不同治療循環交替，或與一或多個不同治療循環並行地運作。以上所描述之治療中之任一者可與其他癌症療法組合。舉例而言，IT-EP循環可與檢查點抑制劑療法組合。 B)組合療法
在一些實施例中，治療方法包括組合療法。組合療法包含治療性分子或治療之組合。治療性治療包括但不限於電脈波(亦即電穿孔)、輻射、抗體療法、檢查點抑制劑療法及化學療法。治療性電穿孔可與一或多種額外治療性治療組合或與其一起投與。一或多種額外治療劑可藉由全身遞送、瘤內注射、伴隨電穿孔之瘤內注射及/或輻射來遞送。一或多種額外治療劑可在IT-EP IL12-病原性抗原療法之前、與其並行或在其之後投與。 VIII.   電穿孔(EP)：
所描述之編碼病原性抗原及/或免疫刺激物之核酸可藉由電穿孔來遞送。基於核酸之疫苗可與病毒及細菌載體一起遞送，但常常受不良轉染速率限制且/或由中和抗體迅速清除(MacGregor RR等人「First human trial of a DNA-based vaccine for treatment of human immunodeficiency virus type 1 infection: safety and host response.」J Infect Dis, 1998 178(1):91-100；及Lin F等人「Optimization of electroporation-enhanced intradermal delivery of DNA vaccine using a minimally invasive surface device.」Hum Gene Ther Methods, 2012 23(3), 157-68)。電穿孔(EP)為施加電脈波以暫時滲透細胞膜，從而促進諸如核酸之巨分子吸收至細胞中的技術。活體內EP已用於數項臨床試驗中以將DNA疫苗及藥物遞送至各種組織(Draghia-Akli R等人「 Gene and cell therapy: Therapeutic mechanisms and strategies. 」 2009)。已顯示電穿孔大大改進基因遞送(100-1000倍；Sardesai等人2011及Livingston BD等人「Comparative performance of a licensed anthrax vaccine versus electroporation based delivery of a PA encoding DNA vaccine in rhesus macaques.」Vaccine , 2010 28(4):1056-61)。
Apollo C-System (ACS)係醫學電穿孔裝置系統，由以下三個主要組件組成：生成電脈波之電穿孔生成器、含有2針陣列之無菌施加器及在近端處連接至電穿孔生成器且在遠端處連接至施加器之施加器纜線總成。APOLLO-C生成器遞送具有比電壓及持續時間之電脈波。該生成器以方波脈波模式遞送受控電穿孔(EP)脈波，從而產生發生電穿孔之跨膜潛在性。施加器電穿孔參數經由記憶體晶片預程式化至施加器纜線總成中，該記憶體晶片決定所施加之脈波寬度、脈波間隔、脈波次數及所施加之各電穿孔序列之電位。ACS施加器為由具有兩個不鏽鋼Trocar針之塑性模製總成及具有連接至APOLLO-C生成器之近端連接器之可再使用之纜線總成組成的無菌(經γ照射)、單次用拋棄式裝置。可再使用之纜線總成含有記憶體晶片，該記憶體晶片儲存以下特定脈波參數：所施加之脈波寬度、脈波間隔、脈波次數及所施加之各電穿孔療法之電位。不鏽鋼Trocar針空間上相隔0.5 cm。針長度為1.5 cm，且針插入深度可由使用者調節至在0 cm與1.5 cm之間。
適合於與所描述之化合物、組合物及方法一起使用之額外電穿孔裝置包括但不限於以下中所描述之電穿孔裝置：美國專利第7245963號、第5439440號、第6055453號、第6009347號、第9020605號及第9037230號以及美國專利公開案第2005/0052630號、第2019/0117964號及專利申請案PCT/US2019/030437及美國專利申請案第16/269,022號。
在一些實施例中，電穿孔療法包含一或多次電壓脈波之投與。待生成之電場之性質係藉由組織性質、所選組織之尺寸及其位置決定。可遞送至腫瘤之電壓脈波可為約100 V/cm至約1500 V/cm。在一些實施例中，電壓脈波為約700 V/cm至1500 V/cm。在一些實施例中，電壓脈波可為約600 V/cm、650 V/cm、700 V/cm、750 V/cm、800 V/cm、850 V/cm、900 V/cm、950 V/cm、1000 V/cm、1050 V/cm、1100 V/cm、1150 V/cm、1200 V/cm、1250 V/cm、1300 V/cm、1350 V/cm、1400 V/cm、1450 V/cm或1500 V/cm。在一些實施例中，電壓脈波為約10 V/cm至700 V/cm。在一些實施例中，電為約100 V/cm、150 V/cm、200 V/cm、250 V/cm、300 V/cm、350 V/cm或400 V/cm、450 V/cm、500 V/cm、550 V/cm、600 V/cm、650 V/cm或700 V/cm。
電穿孔脈波之脈波持續時間可為10微秒至1秒。在一些實施例中，脈波持續時間為約10微秒至約100毫秒(ms)。在一些實施例中，脈波持續時間為100微秒、1 ms、10 ms或100 ms。脈波集合之間的時間間隔可為諸如一秒之任何所需時間。波形、電場強度及脈波持續時間亦可視細胞類型及經由電穿孔進入細胞之分子類型而定。
由脈波生成器提供之波形電信號可為以指數方式衰減之脈波、方形脈波、單極性振動脈波列、雙極性振動脈波列或此等形式中之任一者之組合。方波電穿孔系統遞送快速地升高至設定電壓、保持在彼位準下達設定時長(脈波長度)且隨後快速地下降至零之受控電脈波。
可投與1至100次脈波。在一些實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次脈波。在一些實施例中，投與6次脈波。在一些實施例中，投與6×0.1毫秒脈波。在一些實施例中，投與6次脈波。在一些實施例中，投與在1300-1500 V/cm下之6×0.1毫秒脈波。在一些實施例中，投與8次脈波。在一些實施例中，投與8×10毫秒脈波。在一些實施例中，投與在300-500 V/cm下之8×10毫秒脈波。
在一些實施例中，插入EP施加器以使得電極橫跨核酸注射部位。
電穿孔裝置可包含單一針狀電極、一對針狀電極或多個針狀電極或針狀電極陣列。在一些實施例中，電穿孔裝置包含皮下注射針或等效裝置。在一些實施例中，電穿孔裝置可包含能夠基於使用者控制及脈波參數輸入而在陣列中之電極之間產生一系列可程式化定電流脈波模式之電動力學裝置(「EKD裝置」)。 IX.      實施例清單
1.  一種引發個體之針對病原體之免疫反應之方法，其包含：向該個體投與有效劑量之病原性抗原及有效劑量之免疫刺激物，其中該免疫刺激物包含免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。
2.  如實施例1之方法，其中該病原體為選自由以下組成之群之冠狀病毒：β冠狀病毒、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)、SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2。
3.  如實施例2之方法，其中該病原性抗原為包含冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段之冠狀病毒抗原性多肽。
4.  如實施例3之方法，其中該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含該冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段之胞外域。
5.  如實施例3或4之方法，其中該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段。
6.  如實施例5之方法，其中該SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1-1208、14-1208或21-1208或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1至1208、14-1208或21-1208具有至少90%一致性之多肽。
7.  如實施例3至6中任一例之方法，其中該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。
8.  如實施例7之方法，其中該經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含以下中之一或多者：異源分泌信號、異源三聚域、異源跨膜域及親和標籤。
9.  如實施例7或8之方法，其中經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含一或多個破壞內部肽酶裂解位點之突變及/或一或多個使融合前構形中之蛋白質穩定之突變。
10.      如實施例9之方法，其中該經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段在對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置986及987之胺基酸處包含脯胺酸取代。
11.      如實施例1至10中任一例之方法，其中向該個體投與該有效劑量之該病原性抗原包含向該個體投與經分離之病原體抗原性多肽，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
12.      如實施例1至10中任一例之方法，其中向該個體投與該有效劑量之該病原性抗原包含向該個體投與編碼該病原性抗原之核酸及/或向該個體投與該有效劑量之該免疫刺激物包含向該個體投與編碼該免疫刺激物之核酸，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
13.      如實施例1至12中任一例之方法，其中該免疫刺激物包含介白素-12 (IL-12)。
14.      如實施例13之方法，其中向該個體投與該有效劑量之該免疫刺激物包含向該個體投與經分離之IL-12多肽。
15.      如實施例13之方法，其中向該個體投與該有效劑量之該免疫刺激物包含向該個體投與編碼IL-12之核酸。
16.      如實施例12或15之方法，其中該核酸包含質體或mRNA。
17.      如實施例15或實施例16之方法，其中該編碼IL-12之核酸包含：編碼IL-12 p40-IL-12 p35融合蛋白之核酸序列、編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白之核酸序列或編碼藉由內部核糖體進入位點(IRES)元件或2A肽跳躍基序間隔開之IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元的核酸序列。
18.      如17之方法，其中該編碼IL-12之核酸包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4。
19.      如實施例17之方法，其中該編碼IL-12之核酸進一步編碼Fms樣酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)、C-X-C模體趨化介素配位體9 (CXCL9)或抗CD3半BiTE。
20.      如實施例19之方法，其中該編碼IL-12之核酸包含： (a)   編碼具有SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之多肽之核酸序列； (b)   編碼與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽之核酸序列； (c)   SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 21之核酸序列；或 (d)   與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 21之核酸序列具有至少90%一致性之核酸序列。
21.      如實施例20之方法，其中該編碼IL-12之核酸包含： (a)   編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9之多肽之核酸序列； (b)   編碼與SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽之核酸序列； (c)   SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8之核酸序列；或 (d)   與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8之核酸序列具有至少90%一致性之核酸序列。
22.      如實施例15至21中任一例之方法，其中向該個體投與該有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽及該有效劑量之該免疫刺激物包含： (a)   藉由皮內投與向該個體投與第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸及第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸；或 (b)   藉由皮內投與向該個體投與第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸且視情況投與第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸；且藉由肌內投與向該個體投與第二有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸。
23.      如實施例22之方法，其中將該第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸及該第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸注射至同一部位中。
24.      如實施例23之方法，其中第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸與該第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸在皮內投與之前組合。
25.      如實施例15至21中任一例之方法，其中向該個體投與該有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽及該有效劑量之該免疫刺激物包含： (a)   藉由瘤內投與向該個體投與第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸及第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸； (b)   藉由皮內或肌內投與向該個體投與第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸且藉由瘤內投與向該個體投與第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸；或 (c)   藉由瘤內投與向該個體投與第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸及第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸且藉由皮內或肌內投與向該個體投與第二第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸； 其中該個體患有癌性腫瘤。
26.      如實施例22至25中任一例之方法，其中該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含該SARS-CoV-2棘狀蛋白或該其抗原片段。
27.      如實施例22至26中任一例之方法，其中該皮內投與包含皮內電穿孔(ID-EP)，該肌內投與包含肌內電穿孔(IM-EP)，且該瘤內投與包含瘤內電穿孔(IT-EP)。
28.      如實施例27之方法，其中ID-EP、IM-EP及IT-EP包含場強為約100-1500 V/cm之至少一次電壓脈波的投與。
29.      如實施例28之方法，其中ID-EP、IM-EP及IT-EP包含場強為約400 V/cm且持續時間為約10毫秒之至少一次電壓脈波的投與。
30.      如實施例1至29中任一例之方法，其進一步包含在投與該有效劑量之該病原性抗原及該有效劑量之該免疫刺激物之後約14天至6個月向該個體投與第二有效劑量之該病原性抗原及第二有效劑量之該免疫刺激物，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
31.      如實施例1至30中任一例之方法，其中該免疫反應包含細胞免疫反應、體液免疫反應或細胞免疫反應及體液免疫反應兩者。
32.      如實施例1至31中任一例之方法，其中該免疫反應包含以下中之一或多者：中和抗體產生、經增加之CD8+ T細胞增殖及/或反應、經增加之CD4+ T細胞增殖及/或反應、經增加之記憶T細胞增殖及/或反應、經平衡之Th1/Th2抗體同型反應、S特異性IgG2a及IgG1反應、預防上氣道冠狀病毒感染、預防下氣道冠狀病毒感染、針對冠狀病毒感染之保護性免疫、預防症狀性COVID-19疾病、預防COVID-19疾病之至少一種症狀、降低COVID-19疾病之一或多種症狀之嚴重程度或減少其持續時間及預防重度COVID-19疾病。
33.      一種引發個體之針對SARS-CoV-2病毒之免疫反應之方法，其包含： (a)   藉由ID-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸及第一有效劑量之編碼IL-12之核酸； (b)   藉由IM-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸且藉由ID-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼IL-12之核酸；或 (c)   藉由ID-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸及第一有效劑量之編碼IL-12之核酸；且藉由IM-EP向該個體投與第二有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸。
34.      一種引發患有癌症之個體之針對SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其包含： (a)   藉由IT-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸及第一有效劑量之編碼IL-12之核酸； (b)   藉由ID-EP或IM-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸且藉由IT-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼IL-12之核酸；或 (c)   藉由IT-EP向該個體投與第一有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸及第一有效劑量之編碼IL-12之核酸且藉由ID-EP或IM-EP向該個體投與第二有效劑量之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段之核酸。
35.      一種疫苗，其用於生成個體之針對病原體之免疫反應，該疫苗包含：有效劑量之病原性抗原或編碼該病原性抗原之核酸及有效劑量之免疫刺激物或編碼該免疫刺激物之核酸，其中該免疫刺激物包含免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE或其組合。
36.      如實施例35之疫苗，其中該病原體為選自由以下組成之群之冠狀病毒：β冠狀病毒、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2。
37.      如實施例35或實施例36之疫苗，其中該病原性抗原為包含冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段之冠狀病毒抗原性多肽。
38.      如實施例37之疫苗，其中該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含該冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段之胞外域。
39.      如實施例37或38之疫苗，其中該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段。
40.      如實施例39之疫苗，其中該SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1-1208、14-1208或21-1208或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1至1208、14-1208或21-1208具有至少90%一致性之多肽。
41.      如實施例37至40中任一例之疫苗，其中該冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段。
42.      如實施例41之疫苗，其中該經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含以下中之一或多者：異源分泌信號、異源三聚域、異源跨膜域及親和標籤。
43.      如實施例41或實施例42之疫苗，其中經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段包含一或多個破壞內部肽酶裂解位點之突變及/或一或多個使融合前構形中之蛋白質穩定之突變。
44.      如實施例43之疫苗，其中經修飾之冠狀病毒棘狀蛋白或該其抗原片段在對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置986及987之胺基酸處包含脯胺酸取代。
45.      如實施例35至43中任一例之疫苗，該冠狀病毒抗原性多肽包含經分離之冠狀病毒抗原性多肽。
46.      如實施例35至43中任一例之疫苗，該冠狀病毒抗原性多肽包含編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸。
47.      如實施例35至46中任一例之疫苗，該免疫刺激物包含經分離之免疫刺激物多肽。
48.      如實施例35至47中任一例之疫苗，其中該免疫刺激物包含介白素-12 (IL-12)。
49.      如實施例48之疫苗，其中該IL-12包含編碼IL-12之核酸。
50.      如實施例46或49之疫苗，其中該核酸包含質體或mRNA。
51.      如實施例49之疫苗，其中該編碼IL-12之核酸包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4。
52.      如實施例49之疫苗，其中該編碼IL-12之核酸包含：編碼IL-12 p40-IL-12 p35融合蛋白之核酸序列、編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白之核酸序列或編碼藉由內部核糖體進入位點(IRES)元件或2A肽跳躍基序間隔開之IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元的核酸序列。
53.      如實施例52之疫苗，其中該編碼IL-12之核酸進一步編碼Fms樣酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)、C-X-C基序趨化介素配位體9 (CXCL9)或抗CD3半BiTE。
54.      如實施例53之疫苗，其中該編碼IL-12之核酸包含： (a)   編碼具有SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之多肽之核酸序列； (b)   編碼與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽之核酸序列； (c)   SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 21之核酸序列；或 (d)   與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 21之核酸序列具有至少90%一致性之核酸序列。
55.      如實施例54之疫苗，其中該編碼IL-12之核酸包含： (a)   編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9之多肽之核酸序列； (b)   編碼與SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽之核酸序列； (c)   SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8之核酸序列；或 (d)   與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8之核酸序列具有至少90%一致性之核酸序列。
56.      如實施例35至54中任一例之疫苗，其中該病原性抗原或該編碼該病原性抗原之核酸及該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸經調配用於皮內、肌內及/或瘤內投與，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
57.      如實施例35至56中任一例之疫苗，其中該病原性抗原或該編碼該病原性抗原之核酸與該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸組合，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
58.      如實施例35至57中任一例之疫苗，其中該疫苗包含該編碼該病原性抗原之核酸及該編碼該免疫刺激物之核酸，其中該編碼該病原性抗原之核酸及該編碼該免疫刺激物之核酸經調配用於ID-EP、IM-EP及/或IT-EP，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
59.      如實施例58之疫苗，其中該編碼該病原性抗原之核酸在第一表現載體上經編碼且該編碼該免疫刺激物之核酸在第二表現載體上經編碼。
60.      如實施例59之疫苗，其中該編碼該病原性抗原之核酸及該編碼免疫刺激物之核酸在單一表現載體上經編碼。
61.      如實施例35至60中任一例之疫苗，其中該疫苗包含 (a)   經調配用於藉由ID-EP投與的第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸； (b)   經調配用於藉由IT-EP投與的第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸； (c)   經調配用於藉由ID-EP投與的第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸以及經調配用於藉由IM-EP投與的第二有效劑量之該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸； (d)   經調配用於藉由ID-EP投與的第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸以及經調配用於藉由IM-EP投與的第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸； (e)   經調配用於藉由ID-EP或IM-EP投與的第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸以及經調配用於藉由IT-EP投與的第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸； (f)   經調配用於藉由IT-EP投與的第一有效劑量之該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸以及經調配用於藉由ID-EP或IM-EP投與的第二有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽。
62.      如實施例35至61中任一例之疫苗，其中 (a)   該有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽或該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸及該有效劑量之該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸係在單獨容器中以溶液形式或以凍乾粉形式提供； (b)   該有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽或該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸及該有效劑量之該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸係在容器中以溶液形式或以凍乾粉形式提供提供在一起；或 (c)   該第一有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽或該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸及該第一有效劑量之該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸係在第一容器中以溶液形式或以凍乾粉形式提供提供在一起，且該第二有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽或該編碼該冠狀病毒抗原性多肽之核酸係在第二容器中以溶液形式或以凍乾粉形式提供。
63.      如實施例35至62中任一例之疫苗，其中該有效劑量之該病原性抗原或該編碼該病原性抗原之核酸及該有效劑量之該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸獨立地與一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑一起提供。
64.      如實施例35至63中任一例之疫苗，其中該編碼該病原性抗原之核酸包含編碼該SARS-CoV-2棘狀蛋白或該其抗原片段之核酸且該免疫刺激物包含該編碼IL-12之核酸。
65.      一種減少患者之病原體感染之可能性或降低其嚴重程度之方法，該方法包含向該患者投與包含如實施例35至64中任一例之疫苗的免疫原性組合物。
66.      一種減少患者之病原體感染之可能性或降低其嚴重程度之方法，其包含以下步驟：(a)向該患者投與包含如實施例35至64中任一例之疫苗的第一免疫原性組合物；(b)在步驟(a)之後等待預定量之時間以通過；及(c)向該患者投與包含如實施例35至63中任一例之疫苗的第二免疫原性組合物。
67.      一種引發經診斷患有癌症之個體之針對病原體之免疫反應的方法，其包含：藉由瘤內電穿孔向該個體投與有效劑量之編碼病原性抗原之核酸及有效劑量之編碼免疫刺激物之核酸，其中該免疫刺激物包含免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
68.      如實施例67之方法，其中該冠狀病毒抗原性多肽包含SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段且該免疫刺激物包含IL-12。
69.      一種表現載體，其包含：編碼免疫刺激性細胞介素之第一核苷酸序列及編碼病原性抗原之第二核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列可操作地連接至轉譯修飾元件。
70.      如實施例69之表現載體，其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列可操作地連接至啟動子。
71.      如實施例70之表現載體，其中該啟動子選自由以下組成之群：CMV啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子、SRα啟動子、疱疹胸苷激酶啟動子、單純疱疹病毒(HSV)啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus，RSV)啟動子及EF1α啟動子。
72.      如實施例69至71中任一例之表現載體，其中該免疫刺激性細胞介素包含介白素。
73.      如實施例72之表現載體，其中該介白素包含IL-12。
74.      如實施例73之表現載體，其中編碼IL-12之核苷酸序列包含可操作地連接至轉譯修飾元件之IL-12 p35編碼序列及IL-12 p40編碼序列。
75.      如實施例69至74中任一例之表現載體，其中該病原性抗原包含病毒抗原。
76.      如實施例75之表現載體，其中該病毒抗原包含冠狀病毒棘狀蛋白抗原。
77.      如實施例76之表現載體，其中該冠狀病毒棘狀蛋白抗原包含SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段。
78.      如實施例69至77中任一例之表現載體，其中該表現載體包含由以下表示之式： P-A-T1 -B-T2 -B' 或 P-T1 -B-T2 -B'-A 其中P為該啟動子，A編碼該病原性抗原，T1 及T2 為轉譯修飾元件，B編碼IL-12 p35，且B'編碼IL-12 p40。
79.      如實施例78之表現載體，其中T1 及T2 編碼選自由以下組成之群之2A肽：P2A肽、T2A肽、E2A肽及F2A肽。
80.      一種用於表現免疫刺激性細胞介素及病原性抗原之質體，其包含如實施例69至79中任一例之表現載體。
81.      如實施例69至79中任一例之表現載體或如實施例80之質體，其用於治療個體之癌症。
82.      如實施例69至79中任一例之表現載體或如實施例80之質體，其中該表現載體或該質體經調配用於瘤內電穿孔療法。
83.      一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含向該腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織注射有效劑量之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體且向該腫瘤、腫瘤微環境及/或該腫瘤邊緣組織投與電穿孔療法，且 (a)將有效劑量之編碼病原性抗原之表現載體注射至該腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中且向該腫瘤、腫瘤微環境及/或該腫瘤邊緣組織投與電穿孔療法； (b)將有效劑量之編碼病原性抗原之表現載體注射至真皮中且在注射部位向該真皮投與電穿孔療法；或 (c)將有效劑量之編碼病原性抗原之表現載體注射至骨胳肌中且在注射部位向該肌肉投與電穿孔療法， 藉此在該個體中減小腫瘤尺寸或抑制腫瘤生長、抑制癌細胞生長、抑制或減少轉移、減少或抑制轉移癌發展及/或減少癌症復發。
84.      如實施例83之方法，其中該編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及該編碼該病原性抗原之表現載體可操作地連接至轉譯修飾元件。
85.      如實施例84之方法，其中該編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及該編碼該病原性抗原之表現載體可操作地連接至啟動子。
86.      如實施例85之方法，其中該啟動子選自由以下組成之群：CMV啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子、SRα啟動子、疱疹胸苷激酶啟動子、單純疱疹病毒(HSV)啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子及EF1α啟動子。
87.      如實施例83至86中任一例之方法，其中該免疫刺激性細胞介素包含介白素。
88.      如實施例87之方法，其中該介白素包含IL-12。
89.      如實施例88之方法，其中該編碼IL-12之核苷酸序列包含可操作地連接至轉譯修飾元件之IL-12 p35編碼序列及IL-12 p40編碼序列。
90.      如實施例83至89中任一例之方法，其中該病原性抗原包含病毒抗原。
91.      如實施例90之方法，其中該病毒抗原包含冠狀病毒棘狀蛋白抗原。
92.      如實施例91之方法，其中該冠狀病毒棘狀蛋白抗原包含SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段。
93.      如實施例83至92中任一例之方法，其中該表現載體包含由以下表示之式： P-A-T1 -B-T2 -B' 或 P-T1 -B-T2 -B'-A 其中P為該啟動子，A編碼該病原性抗原，T1 及T2 為轉譯修飾元件，B編碼IL-12 p35，且B'編碼IL-12 p40。
94.      如實施例93之方法，其中T1 及T2 編碼選自由以下組成之群之2A肽：P2A肽、T2A肽、E2A肽及F2A肽。
95.      如實施例83至94中任一例之方法，其中該電穿孔療法包含經約100微秒至約1毫秒之持續時間之至少一次電壓脈波的投與。
96.      如實施例95之方法，其中該至少一次電壓脈波包含1-10次電壓脈波。
97.      如實施例96之方法，其中該至少一次電壓脈波包含6-8次電壓脈波。
98.      如實施例95至97中任一例之方法，其中該至少一次電壓脈波之場強為約200 V/cm至約1500 V/cm。
99.      如實施例83至98中任一例之方法，其中將第一核酸及第二核酸注射至腫瘤中至腫瘤中，且在一循環之第1天± 2天、第5天± 2天及/或第8天± 2天投與電穿孔療法。
100.    如實施例99之方法，其中該循環為3-6週。
101.    如實施例83至100中任一例之方法，其進一步包含向該個體投與至少一種額外治療劑。
102.    如實施例83至101中任一例之方法，其中該方法引起以下中之一或多者：腫瘤浸潤性淋巴球增加、T細胞活化及/或增殖增加、經治療之腫瘤消退及一或多種未經治療之腫瘤消退。
103.    如實施例83至102中任一例之方法，其中該方法包含將該編碼該免疫刺激性細胞介素之表現載體及該編碼病原性抗原之表現載體注射至該腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，且向該腫瘤、腫瘤微環境及/或該腫瘤邊緣組織投與電穿孔療法。
104.    如實施例83至102中任一例之方法，其中該方法包含將該編碼該免疫刺激性細胞介素之表現載體注射至該腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，且向該腫瘤、腫瘤微環境及/或該腫瘤邊緣組織投與電穿孔療法，且將該編碼該病原性抗原之表現載體注射至真皮中且在注射部位向該真皮投與電穿孔療法。
105.    如實施例83至102中任一例之方法，其中該方法包含將該編碼該免疫刺激性細胞介素之表現載體注射至該腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，且向該腫瘤、腫瘤微環境及/或該腫瘤邊緣組織投與電穿孔療法，且將該編碼該病原性抗原之表現載體注射至骨胳肌中且在注射部位向該骨胳肌投與電穿孔療法。
106.    如實施例83至105中任一例之方法，其中該方法進一步包含向該個體投與免疫檢查點抑制劑。 實例實例 1 . 序列比對
評估美國SARS-CoV-2 (重度急性呼吸道症候群冠狀病毒2)病例之約一百個DNA序列(全球共享所有流感資料倡議(GISAID))。將編碼棘狀醣蛋白之『S』基因之所有序列與參考基因ID 43740568 (NC_045512.2鹼基21563-25384)進行比對。此等~100個基因序列之多序列比對不產生比對間隙(亦即不產生插入或缺失或重大結構性更改)。將經比對之DNA序列轉譯成胺基酸且評估其與參考蛋白質序列之一致性百分比。棘狀醣蛋白之所有位置皆與參考序列具有100%一致性，胺基酸H49 (99%)、F157 (99%)、G181 (99%)、V483 (96%)、D614 (97%)及H655 (99%)除外。值得注意地，V483處於與血管收縮素轉化酶2 (ACE2)之受體結合域(RBD)中。V483不為接觸殘基，且作為丙胺酸取代存在，且在同源冠狀病毒株當中具有低保守性。實例 2. 人類個體中 SARS-CoV-2 棘狀蛋白 (S 蛋白 ) 及 pIL-12 核酸疫苗之 I 期試驗
描述用於評估藉由電穿孔投與之S蛋白以及IL-12核酸疫苗之安全性及概況的1期研究。編碼S蛋白及IL-12之核酸係藉由ID-EP及/或IM-EP投與。給予個體初次疫苗接種，且在初次疫苗接種之後3-4週給予加強疫苗接種。將個體分成18-50歲及＞ 50歲之年齡組。 表1.組合SARS-CoV-2 S蛋白與IL-12之疫苗及年齡為18-50歲及50歲之健康個體.
   第1天及第30天(初次及加強)
群組 年齡 多肽 投與 劑量 (mg) 體積 (μL)
1A 18-50 S蛋白 S蛋白 ID-EP IM-EP 0.25 0.5 50 100
1B 18-50 S蛋白/IL-12 S蛋白 ID-EP IM-EP 0.25/0.5 0.5 100 100
2A ＞ 50 S蛋白 S蛋白 ID-EP IM-EP 0.25 0.5 50 100
2B ＞ 50 S蛋白/IL-12 S蛋白 ID-EP IM-EP 0.25/0.5 0.5 100 100
pIL-12 (TAVO；pIL-12)：編碼介白素-12 (IL-12)之質體可為GLP級的且在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中經調配用於直接皮內注射、接著進行活體內電穿孔(EP)。質體係以3.3 mg/mL之濃度以0.225 mL之填充體積供應。
SARS-CoV-2棘狀蛋白(S蛋白)：編碼S蛋白之質體可為GLP級的且在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中經調配用於直接皮內及/或肌內注射、接著進行活體內電穿孔(EP)。質體係以1.67 mg/mL之濃度以0.7 mL之填充體積供應。
電穿孔可使用例如Apollo C-System (ACS)電穿孔設備或IGEA Cliniporator電穿孔系統來執行。
電穿孔(EP)共定位在各注射部位。電穿孔可與質體注射並行投與或在其1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分鐘內投與。在一些實施例中，電穿孔(EP)包含6至8次在400 V/cm之場強下之10毫秒脈波。
投與：在質體注射之前，可在計劃注射部位周圍注射諸如1%利多卡因(lidocaine)之局部麻醉劑以獲得局部麻醉。可如臨床上所指示使用替代局部麻醉劑且將其視為臨床上合適的。另外，可給予患者鎮痛劑、抗焦慮劑或清醒鎮靜。使一區域冷卻且失去知覺之冰袋亦為可接受的。
在一些實施例中，選擇容易地允許進行0.5至1.5 cm深度(諸如但限於肩部)肌內(IM)遞送及離IM注射部位2-3 cm之相鄰皮內(ID)遞送的合適部位。在一些實施例中，ID-EP部位可距IM-EP部位超過10 cm。在一些實施例中，ID-EP部位係在IM-EP之對側部位。在一些實施例中，疫苗接種係以兩個步驟發生：皮內注射+ EP (例如右肩)；接著為肌內注射+ EP至所匹配之對側部位(例如左肩三角肌)。在一些實施例中，ID-EP係在IM-EP之前投與。
肌內投與(例如IM-EP)可與皮內投與(例如ID-EP)並行、在皮內投與之前或在皮內投與之後執行。肌內投與可在皮內投與1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25或30分鐘內執行。在一些實施例中，皮內投與係在肌內投與之後約5分鐘執行。
皮內投與可在肌內投與部位之約2、3、4、5、6、7、8、9或10 cm內之部位執行。在一些實施例中，皮內投與係在肌內投與部位之約2、3、4、5、6、7、8、9或10 cm內之部位執行。
疫苗可在門診環境中向個體投與。實例 3. 編碼冠狀病毒 S 蛋白抗原性多肽 及 IL-12 之核酸之肌內、皮內及瘤內推出及電穿孔 . A.          編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽、IL12或冠狀病毒S蛋白抗原性多肽與IL12之組合的核酸的肌內電穿孔(IM-EP)投與。
編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸之IM-EP投與包含向骨胳肌組織中注射含有編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸的溶液且對注射部位進行電穿孔。
在一些實施例中，注射0.1-3 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL12之核酸。在一些實施例中，注射0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或3 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.1 mg、0.1 ± 0.01 mg或0.1 ± 0.05 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.25 mg、0.25 ± 0.01 mg、0.25 ± 0.05 mg、0.25 ± 0.1 mg或0.25 ± 0.15 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.5 mg、0.5 ± 0.1 mg、0.5 ± 0.2 mg、0.5 ± 0.3 mg或0.5 ± 0.4 mg冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.8 mg、0.8 ± 0.1 mg、0.8 ± 0.2 mg、0.8 ± 0.3 mg或0.8 ± 0.4 mg或0.8 ± 0.5 mg冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。冠狀病毒S蛋白抗原性多肽可為但不限於SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段。核酸可為DNA或RNA。核酸可為表現載體或質體。在一些實施例中，核酸為非病毒載體。上文指示之量可為用於編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸中之各者的量，或用於編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸兩者合在一起的量(不論在單獨載體或同一載體上)。
在一些實施例中，將核酸以20-1000 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、900或1000 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以50 μL、50 ± 10 μL、100 μL、100 ± 10 μL、100 ± 25 μL或100 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以250 μL、250 ± 10 μL、250 ± 25 μL或250 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以500 μL、500 ± 10 μL、500 ± 25 μL或500 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以750 μL、750 ± 10 μL、750 ± 20 μL、750 ± 30 μL、750 ± 40 μL、750 ± 50 μL之體積注射。
在一些實施例中，將核酸以0.5至1.5 cm之深度注射。在一些實施例中，將核酸以0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 cm或大於1.5 cm之深度注射。在一些實施例中，將核酸以1.0 cm、1.0 ± 0.1 cm、1.0 ± 0.2 cm、1.0 ± 0.3 cm、1.0 ± 0.4 cm、1.0 ± 0.5 cm、1.5 cm、1.5 ± 0.1 cm、1.5 ± 0.2 cm、1.5 ± 0.3 cm、1.5 ± 0.4 cm或1.5 ± 0.5 cm之深度注射。EP施加器設定為與注射相同之深度± 0.1 cm。插入EP施加器以使得電極橫跨核酸注射部位。在一些實施例中，以約1秒間隔投與1-10次在400 ± 100 V/cm之場強(E+)及約1-20 ms之脈波寬度下之脈波。在一些實施例中，以1秒間隔投與八次在400 V/cm之場強(E+)及約10 ms之脈波寬度下之脈波。在一些實施例中，IM-EP部位為三角肌。 B.          編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽、IL12或冠狀病毒S蛋白抗原性多肽與IL12之組合的核酸的皮內電穿孔(ID-EP)投與。
編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸之ID-EP投與包含向真皮中注射含有編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸的溶液且對注射部位進行電穿孔。
在一些實施例中，注射0.1-3 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或3 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.1 mg、0.1 ± 0.01 mg或0.1 ± 0.05 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.25 mg、0.25 ± 0.01 mg、0.25 ± 0.05 mg、0.25 ± 0.1 mg或0.25 ± 0.15 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.5 mg、0.5 ± 0.1 mg、0.5 ± 0.2 mg、0.5 ± 0.3 mg或0.5 ± 0.4 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.8 mg、0.8 ± 0.1 mg、0.8 ± 0.2 mg、0.8 ± 0.3 mg或0.8 ± 0.4 mg或0.8 ± 0.5 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。冠狀病毒S蛋白抗原性多肽可為但不限於SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段。核酸可為DNA或RNA。核酸可為表現載體或質體。在一些實施例中，核酸為非病毒載體。上文指示之量可為用於編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸中之各者的量，或用於編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸兩者合在一起的量(不論在單獨載體或同一載體上)。
在一些實施例中，將核酸以20-1000 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、600、650、700、750、800、900或1000 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以50 μL、50 ± 10 μL、100 μL、100 ± 10 μL、100 ± 25 μL或100 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以250 μL、250 ± 10 μL、250 ± 25 μL或250 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以500 μL、500 ± 10 μL、500 ± 25 μL或500 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以750 μL、750 ± 10 μL、750 ± 20 μL、750 ± 30 μL、750 ± 40 μL、750 ± 50 μL之體積注射。
在一些實施例中，將核酸以0.1至0.25 cm之深度注射。在一些實施例中，將核酸以0.1、0.15、0.2或0.25 cm之深度注射。在一些實施例中，將核酸以0.1 cm之深度注射。EP施加器設定為與注射相同之深度± 0.1 cm。插入EP施加器以使得電極橫跨核酸注射部位。在一些實施例中，以約1秒間隔投與1-10次在400 ± 100 V/cm之場強(E+)及約1-20 ms之脈波寬度下之脈波。在一些實施例中，以1秒間隔投與八次在400 V/cm之場強(E+)及約10 ms之脈波寬度下之脈波。 C.          編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽、IL12或冠狀病毒S蛋白抗原性多肽與IL12之組合的核酸的瘤內電穿孔(ID-EP)投與。
編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸之IT-EP投與包含向腫瘤中注射一或多種含有編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸的溶液且對注射部位進行電穿孔。
在一些實施例中，注射0.1-3 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或3 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL12之核酸。在一些實施例中，注射0.1 mg、0.1 ± 0.01 mg或0.1 ± 0.05 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.25 mg、0.25 ± 0.01 mg、0.25 ± 0.05 mg、0.25 ± 0.1 mg或0.25 ± 0.15 mg編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.5 mg、0.5 ± 0.1 mg、0.5 ± 0.2 mg、0.5 ± 0.3 mg或0.5 ± 0.4 mg冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。在一些實施例中，注射0.8 mg、0.8 ± 0.1 mg、0.8 ± 0.2 mg、0.8 ± 0.3 mg或0.8 ± 0.4 mg或0.8 ± 0.5 mg冠狀病毒S蛋白抗原性多肽及/或IL-12之核酸。冠狀病毒S蛋白抗原性多肽可為但不限於SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段。核酸可為DNA或RNA。核酸可為表現載體或質體。在一些實施例中，核酸為非病毒載體。上文指示之量可為用於編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸中之各者的量，或用於編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸兩者合在一起的量(不論在單獨載體或同一載體上)。
在一些實施例中，將核酸以20-1000 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、900或1000 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以50 μL、50 ± 10 μL、100 μL、100 ± 10 μL、100 ± 25 μL或100 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以250 μL、250 ± 10 μL、250 ± 25 μL或250 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以500 μL、500 ± 10 μL、500 ± 25 μL或500 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以750 μL、750 ± 10 μL、750 ± 20 μL、750 ± 30 μL、750 ± 40 μL、750 ± 50 μL之體積注射。在一些實施例中，將核酸以對應於腫瘤體積之約1/4之體積注射。在一些實施例中，將核酸以對應於腫瘤之計算體積之25% ± 10%、25% ± 5%、25% ± 2.5%的體積注射至腫瘤中。在一些實施例中，將核酸以0.5-1.0 mg/ml之濃度以對應於腫瘤之計算體積之25% ± 10%、25% ± 5%、25% ± 2.5%的體積注射至腫瘤中。注射至腫瘤中可包括注射至腫瘤周圍之邊緣組織中。注射至腫瘤中可包括儘可能均一地注射腫瘤且視情況注射腫瘤周圍之邊緣組織(亦即將注射分散在整個腫瘤中且視情況分散在腫瘤周圍之整個邊緣組織中)。
編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸可存在於同一溶液或不同溶液中。若存在於單獨溶液中，則編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸可並行地或依序地注射。編碼冠狀病毒S蛋白抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸可在注射之前組合。編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸可存在於同一載體(例如質體或RNA)上。當存在於同一載體上時，編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼IL-12之核酸可由不同啟動子表現或由單一啟動子表現，如在多順反子載體中。
在一些實施例中，ID-EP部位可距IM-EP部位0.5至10 cm。在一些實施例中，ID-EP部位距IM-EP部位0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.25、4.5、4.75、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10 cm。在一些實施例中，ID-EP部位距IM-EP部位1-5 cm或2-3 cm。在一些實施例中，ID-EP部位距IM-EP部位2.5 ± 0.1、2.5 ± 0.2、2.5 ± 0.3、2.5 ± 0.4、2.5 ± 0.5、2.5 ± 0.6、2.5 ± 0.7、2.5 ± 0.8、2.5 ± 0.9、2.5 ± 1 cm。在一些實施例中，ID-EP部位距IM-EP部位2-3 cm。實例 4. 免疫反應分析 .
免疫學監測 。可在研究之第1天、第2天、第3天、第15天、第30天、第31天、第32天、第45天、第60天及第90天中之一或多者執行用於質體表現量及免疫反應量測之血液取樣。分析樣品之針對疫苗之抗體及細胞免疫反應。用包括CD4、CD8、NK、B細胞及單核球/DC組之一組標記執行流動式細胞量測術。此等標記包括CD4 T習知、Treg、T記憶、Ki-67、CD38、HLA-DR、CD40、ICOS、顆粒酶B、PD-1、TIM-3、LAG-3、4-1BB、CTLA-4、OX40R、NKG2A、CD94、NKp46、NKG2D、NKp30、CD158e1、KIRc、CD158b、CD11b、CD15、CD33、CD54、CD80、CD83、CD86、PD-L1、PD-L2。藉由目標捕獲DNA庫製備及Illumina定序對經分選之免疫細胞子集進行處理以用於RNA/DNA萃取及全基因體CpG甲基化。
免疫反應基因表現分析 ：藉由基因表現或蛋白質表現分析對Ki-67、CD38、HLA-DR、CD40、ICOS、顆粒酶B、PD-1、TIM-3、LAG-3、4-1BB、CTLA-4、OX40R、NKG2A、CD94、NKp46、NKG2D、NKp30、CD158e1、KIRc、CD158b、CD11b、CD15、CD33、CD54、CD80、CD83、CD86、PD-L1及PD-L2中之一或多者進行分析。
中和分析 。使用表現SARS-CoV-2 S蛋白及螢光素酶之假模式化慢病毒評估SARS-CoV-2之抗體中和。來自已接種疫苗之個體之血清防止易感目標細胞感染之能力指示對個體之抗SARS-CoV-2免疫反應的誘導。讀數為來自已接種疫苗之個體之血清防止易感目標細胞感染之能力。可替代地，執行血清阻斷hACE2R與棘狀體之結合之能力。
細胞介素分析 。使用Quanterix Simoa平台評估血清細胞介素剖析。分析全身性IL-12 (p70)及包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A及TGF-β之高達35種額外細胞介素。
T 細胞反應 。SARS-CoV-2 S蛋白特異性細胞免疫反應係藉由用於I型、2型及IL-17細胞介素反應之細胞介素釋放分析，使用細胞介素珠粒陣列來量測。IFN-γ陽性反應係藉由IFN-γ ELISPOT分析，使用視為由特定個體表現之HLA之顯性抗原決定基之抗原決定基的未經分級PBMC及肽池來評估。亦研究含有由11個胺基酸重疊之15聚體肽的肽池。預測針對全蛋白之ELISPOT反應由CD4+ T細胞反應主導。進一步預期針對重疊肽之反應包含CD4+ T細胞反應及CD8+ T細胞反應兩者。可替代地，針對CD4+ T細胞反應及CD8+ T細胞反應，藉由胞內細胞介素染色(ICS)測試經分級之PBMC。
B 細胞反應 。使用微親和力蛋白質體(MAP)珠粒技術評估針對SARS-CoV-2棘狀S醣蛋白之抗體反應。使用含有SARS-CoV-2蛋白之珠粒陣列以評估在疫苗接種之後發展之IgM及IgG同型反應。體液反應係藉由B細胞ELISPOT，評估PBMC之針對COVID-19 S棘狀體之IgA、IgM及IgG反應以測定B細胞反應來加以監測。
經協調之體液 / 細胞反應 。單細胞RNA定序係在第0天、第15天、第30天、第45天、第60天及第90天中之一或多者執行。使用Archer Immunoverse平台進行之成對αβ TCRseq及串聯BCRseq允許追蹤T細胞及B細胞殖株。評估由顯性殖株進行之SARS-CoV-2棘狀蛋白之抗原決定基的辨識。預測持續中和Ab反應將由經協調之針對SARS-CoV-2棘狀體(S)醣蛋白之CD4、CD8及B細胞反應產生。
全基因體定序 。執行全基因體定序以評估免疫反應相關基因中之多型性且提供HLA單倍型。針對與對疫苗接種之免疫反應之幅度的關係評估此資訊。亦分析與對疫苗接種之反應之深度及幅度的相關性。
針對變異體之免疫反應 。除了分析針對具有用於疫苗中之特定抗原性多肽之病毒的免疫反應之外，上文分析亦可用於分析針對病原體變異體之免疫反應。舉例而言，就SARS-CoV-2而言，亦可分析針對英國(UK)變異體(稱為20I/501Y.V1、VOC 202012/01或B.1.1.7)、南非變異體(稱為20H/501Y.V2或B.1.351)、巴西變異體(稱為P.1或B11248)及加利福尼亞變異體(稱為CAL.20C或20C/S:452R;/B1429)之免疫反應。對針對變異體之免疫反應之誘導指示疫苗有效地抵抗變異體。實例 5. 接種編碼 SARS-CoV-2 棘狀醣蛋白 (S 蛋白 ) 及 IL-12 之 核酸之健康個體中之免疫反應的 I 期研究 .
此研究將評估編碼冠狀病毒棘狀醣蛋白(S蛋白)及IL-12兩者之質體之組合電穿孔的安全性及抗病毒免疫刺激功效。分析除S蛋白以外之IL-12接種對中和抗體產生、細胞免疫誘導、Th1反應誘導及SARS-CoV-2感染預防之影響。
最新報導表明，已死於COVID-19之患者已耗竭T細胞。由於IL-12可支持T細胞反應且減少T細胞衰竭，因此預期接受S蛋白以及IL-12之個體將發展更加持續之針對SARS-CoV-2之T細胞反應。持續T細胞反應將支持抗棘狀蛋白之中和抗體之較高力價。預期疫苗接種使得防止暴露於SARS-CoV-2且可提供針對其他冠狀病毒之交叉保護。
抗體依賴性增強(ADE，其中非中和抗病毒蛋白輔助病毒進入宿主細胞中)現象已針對登革熱(dengue) (Boonnak, K.等人Role of dendritic cells in antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J. Virol. 82, 3939-3951 (2008))、HIV-1 (Willey, S.等人Extensive complement-dependent enhancement of HIV-1 by autologous non-neutralising antibodies at early stages of infection. Retrovirology 8, 16 (2011))及流感(Gotoff, R.等人Primary influenza A virus infection induces cross-reactive antibodies that enhance uptake of virus into Fc receptor-bearing cells. J. Infect. Dis. 169, 200-203 (1994))加以報導。Wang等人以實驗方式表明，抗SARS-CoV棘狀蛋白單株抗體引起ADE (Wang, S. F.等人Antibody-dependent SARS coronavirus infection is mediated by antibodies against spike proteins. Biochemical and biophysical research communications 451, 208-214 (2014))，然而多株、未經稀釋抗血清中和SARS-CoV感染。在所研究之疫苗平台中包括IL-12可防止ADE，從而充當用於觸發效應CD8+ T細胞反應以及互補CD4+ T細胞反應兩者、可加強體液反應之佐劑。
此方案中之所有個體皆將經由ID-EP及/或IM-EP接受編碼S蛋白之質體。一半個體亦將經由ID-EP接受編碼IL-12之質體。在第1天向個體投與初始輪之S蛋白及IL-12 (初次疫苗接種)且約3-4週之後投與第二輪之S蛋白及IL-12 (加強)。各種劑量之編碼S蛋白之核酸及編碼IL-12之核酸兩者均使免疫反應最佳化。
編碼S蛋白之質體編碼來自SARS-CoV-2之棘狀蛋白，且由巨細胞病毒(CMV)啟動子或雞β肌動蛋白啟動子驅動。S蛋白已藉由添加兩個脯胺酸來穩定化且由報導)。S蛋白為融合前棘狀胞外域，在殘基986及987處具有脯胺酸取代(Wrapp D等人「Cryo-EM Structure of the SARS-CoV-2 Spike in the Prefusion Conformation.」 Science. 2020 367(6483):1260-1263)、在弗林蛋白酶裂解位點(殘基682-685)、C端T4纖維蛋白三聚基序、HRV3C蛋白酶裂解位點、TwinStrep標籤及8× His標籤處具有「GSAS」取代的編碼SARS-CoV-2 S之殘基1-1208之基因(GenBank: MN908947)經合成且選殖至哺乳動物表現載體pαH中。SARS-CoV-2 S-2P_去弗林蛋白酶_F3CH2S之質體圖譜處於圖4中。編碼SARS-CoV-2 S蛋白之SARS-CoV-2 S-2P_去弗林蛋白酶_F3CH2S質體係來源於疫苗研究中心NIAID (21MAR2020)。His8及StrepII標籤係藉由用BamHI及XhoI進行限制酶消化且用122 bp編碼僅摺疊子域之PCR產物置換來自SARS-CoV-2 S-2P_去弗林蛋白酶_F3CH2S質體移除。SARS-CoV-2 S-2P_去弗林蛋白酶_F3CH2S質體用作用於PCR之模板。所得質體命名為SARS-CoV-2 S-2P_去弗林蛋白酶_摺疊子。編碼融合前混合S-2P ECD及摺疊子融合蛋白之CMV啟動子、嵌合內含子及S-2P摺疊子片段係藉由用SpeI及XhoI進行限制消化來切離且選殖至經SpeI及NotI消化之IL-12 p35_p40 pUMVC3臨床載體(OncoSec)以及60 bp自pSE280載體(Invitrogen)切離之XhoI及NotI連接子中。所得質體命名為pUMVC3.SARS-CoV-2-2_S-2P.摺疊子.去標籤.且示於圖5中。將編碼S蛋白之質體以1.67 mg/ml裝小瓶。
編碼IL-12之質體含有用於藉由內部核糖體進入位點(IRES)間隔開且處於單一巨細胞病毒(CMV)啟動子控制下之人類IL-12 p35及p40次單元的基因。將編碼IL-12之質體以3.33 mg/ml裝小瓶。
接種S蛋白及IL-12包含經由電穿孔遞送基因。S蛋白核酸之IM-EP將提供可循環且呈現給B細胞以生成抗棘狀抗體反應的經表現之可擴散S蛋白。S蛋白及IL-12之ID-EP將提供真皮內之受限局部表現，從而引起於引流淋巴結中之抗原呈現，引起抗病毒免疫反應之激活。IL-12於真皮中之表現亦將使此局部區朝向偏向Th1之環境極化。此抗原及免疫活化細胞介素之離散模組布建在真皮中產生免疫原性細胞微環境，其中IL-12支持先天性效應細胞以及一或多種膜結合(膜錨定)或經分泌(可溶)醣蛋白之呈現，且隨後激活細胞抗病毒T細胞反應。由於此局部細胞激活不妨礙其他二級淋巴組織中體液免疫之激活，因此預期疫苗產生細胞及體液抗SARS-CoV-2免疫。
如實例4中所描述執行免疫監測 。實例 6. 接種冠狀病毒 S 蛋白以及 IL-12.
在接種冠狀病毒抗原性多肽(例如編碼SARS-CoV-2 S蛋白之核酸)加上IL-12 (例如編碼IL-12之核酸)之後，S蛋白與IL-12之組合誘導中和抗體產生且增加細胞免疫(T細胞反應)。人類個體經表2中所列之組合免疫。 表2.組合SARS-CoV-2 S蛋白與IL-12之疫苗.
治療 例示性劑量 (mg) 例示性體積 (μL) 第1天± 3天 第30天± 7天
ID-EP S蛋白(對照) 0.8 ± 0.15 mg 500 + +
ID-EP S蛋白 ID-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
ID-EP S蛋白 IM-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
ID-EP S蛋白 IT-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
IM-EP S蛋白(對照) 0.8 ± 0.15 mg 500 + +
IM-EP S蛋白 ID-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
IM-EP S蛋白 IM-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
IM-EP S蛋白 IT-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
IT-EP S蛋白(對照) 0.8 ± 0.15 mg 500 + +
IT-EP S蛋白 ID-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
IT-EP S蛋白 IM-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
IT-EP S蛋白 IT-EP pIL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 500 250 + + + +
ID-EP S蛋白 IT-EP S蛋白 IT-EP IL-12 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 0.8 ± 0.15 mg 250-500 250-500 250 + + + + + +
對於皮內及肌內投與，一或多次注射可在單一位置中或在兩個或更多個位置中。對於在兩個或更多個位置中之注射，注射可彼此相鄰或在單獨位置中。舉例而言，個體可在兩次各250 μL之相鄰注射中接受500 μL。類似地，個體可在兩次各375 μL之相鄰注射中接受750 μL。對於兩次相鄰注射，注射可足夠接近以使得電穿孔施加器電極能夠橫跨兩個注射部位。為了向真皮或肌肉投與S蛋白及IL-12兩者，編碼S蛋白及IL-12之核酸可在相同部位分開注射，分開注射至不同部位，或在注射之前組合。為了向腫瘤投與S蛋白及IL-12兩者，編碼S蛋白及IL-12之核酸可分開注射至腫瘤中或在注射之前組合。
在一些實施例中，一或多種編碼冠狀病毒抗原及/或免疫刺激物之質體在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中經調配用於注射、接著進行活體內電穿孔。
在一些實施例中，電穿孔脈波係由具有IGEA施加器之IGEA Cliniporator®提供。IGEA施加器模型可為但不限於含有8針陣列之模型L-30-ST施加器，該陣列具有2列，各列中有4針，其中兩列之針之間的距離為4.7 mm且各列中之針之間的距離為3.2 mm。將施加器電極插入適當深度以用於皮內電穿孔、肌內電穿孔或瘤內電穿孔以使得電極橫跨質體注射部位。在一些實施例中，電穿孔包含2-10次(例如八次)間隔300毫秒之在400 V/cm之場強及10 ms之脈波寬度下之脈波。
各疫苗接種由以下兩個步驟組成：肌內或瘤內注射、接著為至少一次電穿孔脈波之投與。電穿孔(EP)在各注射部位共定位，且在注射之後盡合理可能快地直接執行。對於皮內投與，電穿孔脈波之注射及投與可例如在大腿中在股外側肌上方或在臀部中在背側臀肌上方進行。諸如肩部之其他位置亦為合適的。
如實例4中所描述監測免疫反應。實例 7. SARS-CoV-2 棘狀質體及 IL-12 質體之電穿孔 (EP) 生成抗棘狀體免疫反應 .
在兩個不同小鼠品系(Balb/C或C57bl/6)上進行實驗。簡言之，小鼠接受初次劑量(「初次EP」)及加強劑量(「加強EP」)，相隔14天。加強EP後10天(第24天)，收集血清及脾細胞以用於端點分析。
小鼠在第0天(初次)及第14天(加強)經以下治療： (a)無治療 (b)利用IM-ED之50 μg編碼棘狀蛋白之質體及100 μg編碼IL-12之質體； (c)利用IM-ED之50 μg編碼棘狀蛋白之質體及利用ID-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體加上100 μg編碼IL-12之質體，或 (d)利用IM-ED之50 μg編碼棘狀蛋白之質體及利用ID-EP之125 μg編碼棘狀蛋白之質體。
在第24天採集樣品以藉由ELISA針對棘狀蛋白或IL-12蛋白產生對其進行分析。
在第24天，收集脾細胞且將其與棘狀肽一起培養1-3天。24小時後採集樣品且藉由ELISA針對細胞介素產生對其進行分析。
在第24天，收集血清且藉由ELISA針對SARS-CoV-2特異性IgG2a、IgG1及ACE結合抑制對其進行分析。
經由皮內或肌內治療投與之pIL12及棘狀質體之組合電穿孔誘導Balb/C及C57bl/6小鼠中之抗棘狀IgG1抗體及抗棘狀IgG2a抗體(圖9-10)。另外，在假中和分析中，抗體能夠活體外抑制棘狀體與ACE2之結合(抑制SARS-CoV-2假病毒與ACE2之結合) (圖11)。實例 8. 棘狀蛋白以及 IL-12.
經由不同投與途徑(皮內，ID；肌內，IM)投與pIL-12及棘狀質體。初次劑量及加強劑量相隔21天。在兩個小鼠品系(Balb/C及C57bl/6)中進行實驗。在不同時間點(D31、42、92)收集血清樣品以用於抗棘狀抗體量測(ELISA)。
小鼠在第0天(初次)及第21天(加強)經以下治療： (a)利用IM-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體及利用ID-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體； (b)利用IM-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體及利用ID-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體加上100 μg編碼IL-12之質體； (c)利用IM-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體加上100 μg編碼IL-12之質體及利用ID-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體； (d)利用IM-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體加上100 μg編碼IL-12之質體及利用ID-EP之對照質體； (e)利用IM-EP之對照質體及利用ID-EP之50 μg編碼棘狀蛋白之質體加上100 μg編碼IL-12之質體； (f)利用IM-EP之對照質體及利用ID-EP之對照質體；或 (g)無治療對照。
在第31、42及92天，收集血清且藉由ELISA針對SARS-CoV-2特異性IgG2a、IgG1及ACE結合抑制對其進行分析。
在第31天樣品中，經由並行ID及IM注射進行之棘狀質體EP表明測試組當中的最佳抗棘狀體免疫反應。以100 μg/ml IL-12質體劑量位準向棘狀質體中ID-EP添加pIL-12並不增強免疫反應(圖12A-B、13A-B)。藉由IM-EP投與100 μg IL-12會降低功效。在第42天及第92天之血清中注意到類似結果。儘管藉由ID-EP及IM-EM進行之棘狀蛋白投與在第92天產生大部分中和抗體，但疫苗接種時程中之各者產生可偵測含量之中和抗體(圖14A-B)。實例 9. 比較 pIL12-IRES 與 pIL12-P2A .
比較使用編碼IL12-P2A之核酸(編碼IL-12 p35-P2A-IL-12 p40之質體)與編碼棘狀蛋白之質體之組合或編碼IL12-IRES之質體(編碼IL-12 p35-P2A-IL-12 p40之質體)與編碼棘狀蛋白之質體之組合進行的ID-EP疫苗接種以判定經增加之由IL12-P2A表現載體進行之IL-12表現是否將增強抗棘狀體免疫反應。吾等先前已表明，當與IL12-IRES相比時，IL12-P2A一致地誘導較高之IL-12表現量。
根據以下時程對小鼠進行疫苗接種，其中初次注射係在第0天且加強注射係在第21天。 (a) 50 μg棘狀體IM-EP及50 μg棘狀體ID-EP (b) 50 μg棘狀體ID-EP (c) 50 μg棘狀體+ 100 μg IL12-IRES ID-EP (d) 50 μg棘狀體+ 100 μg IL12-P2A ID-EP (e)空質體ID-EP
在第31天及第42天收集血清且針對SAR-CoV-2特異性IGg1及IgG2a抗體且針對中和抗體對其進行分析。當與接種IL12-IRES載體之動物相比時，使用IL12-P2A載體進行之動物疫苗接種已減少抗棘狀體免疫反應。因此，結果指示較高含量之藉由ID-EP投與之IL-12可抑制針對共同投與之抗原的免疫反應(圖15A-B)。然而，相較於空載體對照而言，棘狀體與IL-12之組合引起對免疫反應之誘導。基於此等觀測結果，分析較低劑量之IL-12質體。實例 10. 較低劑量 pIL-12 及空間共定位之分析 .
如上文所描述，使用較低劑量之IL12-IRES表現載體對小鼠進行疫苗接種。將兩次較低劑量之pIL12 (50 μg或10 μg)與棘狀質體共同投與以使C57bl/6小鼠免疫。向一些小鼠注射含有pIL-12 +棘狀質體(混合物)之溶液。向其他小鼠投與IL-12及棘狀質體之單獨注射。對於單獨注射，IL12及棘狀質體注射係在相鄰位置(在注射部位相隔~2 mm)投與，且對各部位進行電穿孔分離。
根據以下時程對小鼠進行疫苗接種，其中初次注射係在第0天且加強注射係在第21天。 (a) 50 μg棘狀體IM-EP及50 μg棘狀體ID-EP (b) 50 μg棘狀體ID-EP (c) 50 μg棘狀體ID-EP及50 μg IL12-IRES ID-EP (d) 50 μg棘狀體ID-EP及10 μg IL12-P2A ID-EP (e) 50 μg棘狀體+ 10 μg IL12-P2A (混合物) ID-EP (f)空質體ID-EP
在第30、44及61天收集血清且針對SAR-CoV-2特異性IGg1及IgG2a抗體且針對中和抗體對其進行分析。與單獨50 μg棘狀質體ID-EP相比，50 μg棘狀質體及10 μg pIL12 (「棘狀體(50)/IL12(10)，混合_ID」)之皮內共同注射展現優越免疫反應，指示IL-12在增強針對棘狀蛋白之免疫反應中之功效(圖16A-B、17B-B、18A-B)。經由IM-EP及ID-EP進行之棘狀質體之免疫接種用作陽性對照標準。相較於其他治療組，陽性對照標準治療組接受兩倍劑量之棘狀質體，50 μg經由IM及ID途徑中之各者，總體上引起更多棘狀蛋白表現。實例 11. pIL12 之 劑量或時程依賴性作用 .
如上文所描述，使用在不同時程中投與之不同劑量之IL12-IRES表現載體對小鼠進行疫苗接種。將兩次較低劑量之pIL12 (10 μg或1 μg)與棘狀質體共同投與以使C57bl/6小鼠免疫。
根據以下時程對小鼠進行疫苗接種，其中初次注射係在第0天且加強注射係在第21天(除非另外指出)。 (a)陽性對照、棘狀體IM-EP及棘狀體ID-EP (b)棘狀體ID-EP (c)棘狀體ID-EP + 10 μg IL12 ID-EP (IL12僅在初次時) (d)棘狀體ID-EP + 1 μg IL12 ID-EP (IL12僅在初次時) (e)棘狀體ID-EP + 10 μg IL12 ID-EP (f)棘狀體ID-EP + 1 μg IL12 ID-EP (g)棘狀體ID-EP + 10 μg IL12 ID-EP (IL12僅在加強時) (h)棘狀體ID-EP + 1 μg IL12, ID-EP (IL12僅在加強時) (i)空載體陰性對照
相較於藉由ID-EP投與之棘狀質體而言，10 μg或1 μg IL-12質體之使用在第31及42天增強抗棘狀IgG1及中和抗體反應(圖19A-C、20)。對於IL-12投與，增強發生在初次及加強、僅初次或僅加強時。相較於藉由ID-EP投與之棘狀質體而言，10 μg或1 μg IL-12質體之使用在第90天亦增加CD19+ B細胞、CD3+ CD4+ T細胞、CD3+ CD8+ T細胞、效應記憶(CD3+ CD4+ CD127+ CD62L- ) T細胞(Tem 細胞)及CD3+ CD4+ CD127- CD62L- T細胞(胸腺上皮細胞(Tec )細胞)。當與藉由ID-EP投與之棘狀質體(圖21A-D)或藉由IM-EP及ID-EP兩者投與之棘狀質體相比時，在初次及加強時投與之10 μg或1 μg IL-12質體之使用在第90天亦增加記憶B細胞。結果指示向病原性抗原中添加IL-12可誘導免疫記憶反應及更持久之免疫。實例 12 . 棘狀質體之劑量分析
在投與或不投與pIL12之情況下，向小鼠投與多次劑量位準之棘狀質體。pIL12與待共同投與或分開投與之棘狀質體混合。在利用兩種不同投與途徑之兩項獨立實驗中，基於棘狀質體劑量，抗棘狀體反應位準無顯著差異(圖22A-B、23A-B)。如在上文所示之實驗中，與以50 μg投與之IL-12質體相比，以10 μg投與之IL-12質體誘導更強之針對病原體抗原之免疫反應。實例 13. 患有癌症之個體之疫苗接種、編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸及編碼免疫刺激性細胞介素之核酸之瘤內電穿孔 ( IT-EP ) .
對小鼠進行麻醉且將腫瘤細胞皮下注射至其右側腹及/或左側腹。藉由數位卡尺量測監測腫瘤生長直至腫瘤出現。隨後，如表3中所示治療腫瘤。監測腫瘤體積及存活。另外，收集樣品以測定針對SARS-CoV-2之免疫反應。在第15及25天執行PBMC免疫剖析及IgG及ACE2抑制分析(參見實例4)。 表3.癌症個體之疫苗接種.
群 第0天 第15天
1 IT-EP 10 μg IL-12 IT-EP 10 μg IL-12
2 IT-EP 10 μg IL-12 ID-EP 115 μg S蛋白 IT-EP 10 μg IL-12右側腹 ID-EP 115 μg S蛋白右側腹
3 IT-EP 10 μg IL-12 + 115 μg S蛋白 IT-EP 10 μg IL-12 + 115 μg S蛋白
4 IT-EP 115 μg S蛋白 IT-EP 115 μg S蛋白
5 IT-EP 10 μg EV ID-EP 115 μg S蛋白 IT-EP 10 μg EV ID-EP 115 μg S蛋白
6 IT-EP 10 μg EV IT-EP 10 μg EV
7 ID-EP 115 μg S蛋白+ 1 μg IL-12 ID-EP 115 μg S蛋白+ 1 μg IL-12
8 未經治療   
周邊血液B細胞之分析：IL-12以及S蛋白之瘤內電穿孔在周邊血液中誘導高百分比B細胞。
周邊血液記憶B細胞之分析：IL-12以及S蛋白之瘤內電穿孔在周邊血液中誘導高百分比記憶B細胞。
腫瘤引流淋巴結B細胞子集之分析：IL-12以及S蛋白之瘤內電穿孔在腫瘤引流淋巴結中誘導高百分比生髮中心B細胞及類別轉換B細胞(其中抗體已產生)。
腫瘤引流淋巴結T細胞子集之分析：IL-12以及S蛋白之瘤內電穿孔在腫瘤引流淋巴結中誘導高百分比CD4+ 及CD8+ T細胞。
抗棘狀IgG1及IgG2a之分析：1:500稀釋血清。在存在或不存在IL-12之情況下之S蛋白之瘤內電穿孔產生高含量抗棘狀IgG1。一次治療(初次，第15天)或兩次治療(初次+加強，第25天)產生類似之抗棘狀IgG含量。接種IT-EP IL-12加上S蛋白之動物已顯著地增加抗棘狀IgG2a抗體之產生。
假中和分析：在存在或不存在IL-12之情況下之S蛋白之瘤內電穿孔產生高位準對棘狀體與ACE2之結合的抑制。在加強注射之後觀測到中和抗體含量增加。接種IL-12 +棘狀體之動物在加強疫苗接種之後顯示較高中和抗體增加。
結論：IL-12與S蛋白之組合之瘤內電穿孔在周邊血液中產生高含量B細胞及記憶B細胞，且腫瘤引流淋巴結中產生高含量生髮中心B細胞、類別轉換B細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。IL-12與S蛋白之組合之IT-EP亦在血清中產生高含量包括中和抗體之抗棘狀IgG1及IgG2a。觀測到強烈抗病毒反應，指示冠狀病毒抗原性多肽及免疫刺激性細胞介素之IT-EP有效地誘導針對冠狀病毒之免疫反應。實例 14. 經 IL-12 及 SARS-CoV-2 S 蛋白抗原治療之小鼠中之腫瘤消退 .
向小鼠植入腫瘤細胞。向經麻醉小鼠之右側腹及/或左側腹皮下注射細胞。藉由數位卡尺量測監測腫瘤生長直至達到~100 mm3 之平均腫瘤體積。
在第1、5及8天用IT-EP對照載體、IT-EP IL-12或IT-EP IL12-2 + SARS-CoV-2 S蛋白抗原治療腫瘤。監測腫瘤體積及存活。若原發性腫瘤及對側腫瘤之總腫瘤負荷達到2000 mm3 ，則對小鼠進行安樂死。實例 15. 病原性抗原以及 IL-12 之瘤內表現增強針對腫瘤之免疫反應 .
在第-7天將腫瘤細胞植入小鼠中。將腫瘤植入右側腹中。各小鼠中之單一腫瘤在第0及15天經以下治療： (a)     未經治療， (b)     IT-EP對照載體， (c)     IT-EP 10 μg IL-12質體， (d)     IT-EP 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體， (e)     IT-EP 10 μg IL12質體+ 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體， (f)     IT-EP 10 μg IL-12質體+ ID-EP 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體， (g)     ID-EP 1 μg IL-12質體+ 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體， (h)     IT-EP 10 μg對照質體+ ID-EP 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體。 對於ID-EP SARS-CoV-2 S蛋白，編碼SARS-CoV-2 S蛋白之質體係在與腫瘤相同之側腹中投與。
經以下治療之動物在第一次注射之後第15天展現實質腫瘤生長：(a)無治療；(b) IT-EP對照載體；(g) ID-EP IL-12質體+ SARS-CoV-2 S蛋白；(h) IT-EP對照質體+ ID-EP SARS-CoV-2 S蛋白；或(d) IT-EP SARS-CoV-2 S蛋白。經(c) IT-EP IL-w12治療之動物截至第23天展現實質上減少之腫瘤生長。經(e) IT-EP IL12 + SARS-CoV-2 S蛋白抗原或(f) IT-EP IL-12 + ID-EP SARS-CoV-2 S蛋白抗原治療之動物截至第23天顯示極少至不顯示腫瘤生長。如所預期，瘤內IL-12治療引起腫瘤生長減少。組合瘤內IL-12治療與皮內或瘤內病原體抗原治療增強IL-12治療之治療功效(圖24-25)。
相較於單獨IL12質體而言，pIL12與病原性抗原質體之組合之瘤內電穿孔增強抗腫瘤反應。在第一次治療後第25天，相較於經單獨IL12治療之小鼠之60%而言，經pIL12 + SARS-CoV-2 S蛋白治療之小鼠之85%無腫瘤(圖26)。實例 16. 病原性抗原以及 IL-12 之瘤內表現增強針對腫瘤之免疫反應 .
在第-7天將腫瘤細胞植入小鼠中。將腫瘤植入右側腹及左側腹中。各小鼠中之單一腫瘤係在第1天、第5天± 2天及第8天± 2天、第1天及第5天± 2天或第1天及第8天± 2天經IT-EP對照載體、IT-EP 10 μg IL-12質體、IT-EP 10 μg IL12質體+ 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體或IT-EP 10 μg IL-12質體+ ID-EP 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體治療。隨後，監測原發性(經治療)腫瘤及繼發性(未經治療)腫瘤中之腫瘤及免疫反應。在一些實施例中，每三至六週重複治療(循環)。在一些實施例中，每三週重複循環。在一些實施例中，每四週重複循環。在一些實施例中，每六週重複循環。
在一些小鼠中，在最後一次EP之後2天(亦即第10天)收取腫瘤及脾細胞以用於NanoString及基於流動之分析。可替代地，一週三次量測腫瘤體積以用於消退/存活研究。經電穿孔之CT26病灶中之基因表現變化係藉由NanoString nCounter®技術評估。病原性抗原之瘤內表現係在電穿孔後48小時在來自攜帶腫瘤之小鼠之腫瘤溶解物中使用ELISA來確認。
展示各種免疫反應基因之p值及log2變化倍數之火山圖係在小鼠中生成。
使用流動式細胞量測分析以分析經治療小鼠中之脾細胞。經由四聚體分析(Immudex)量測抗原特異性AH1+ CD8+ T細胞。測定AH1+ CD8+ T細胞相較於空載體對照而言之數目增加倍數。實例 17. 病原性抗原以及 IL-12 之瘤內表現增強針對腫瘤之免疫反應 .
在第-7天將腫瘤細胞植入小鼠中。將腫瘤植入右側腹及左側腹中。各小鼠中之單一腫瘤係在第1天經IT-EP對照載體、IT-EP 10 μg IL-12質體、IT-EP 10 μg IL12質體+ 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體或IT-EP 10 μg IL-12質體+ ID-EP 115 μg SARS-CoV-2 S蛋白抗原質體治療。在一些實施例中，各腫瘤再次在第5天± 2天經IT-EP對照載體或IT-EP 10 μg IL-12質體治療。在一些實施例中，各腫瘤再次在第8天± 2天經IT-EP對照載體或IT-EP 10 μg IL-12質體治療。在一些實施例中，各腫瘤再次在第5天± 2天及第8天± 2天經IT-EP對照載體或IT-EP 10 μg IL-12質體治療。隨後，監測原發性(經治療)腫瘤及繼發性(未經治療)腫瘤中之腫瘤及免疫反應。
在一些實施例中，每三至六週重複以上治療(循環)。在一些實施例中，每三週重複循環。在一些實施例中，每四週重複循環。在一些實施例中，每六週重複循環。
在一些小鼠中，在最後一次EP之後2天(亦即第10天)收取腫瘤及脾細胞以用於NanoString及基於流動之分析。可替代地，一週三次量測腫瘤體積以用於消退/存活研究。經電穿孔之CT26病灶中之基因表現變化係藉由NanoString nCounter®技術評估。病原性抗原之瘤內表現係在電穿孔後48小時在來自攜帶腫瘤之小鼠之腫瘤溶解物中使用ELISA來確認。
展示各種免疫反應基因之p值及log2變化倍數之火山圖係在小鼠中生成。
使用流動式細胞量測分析以分析經治療小鼠中之脾細胞。經由四聚體分析(Immudex)量測抗原特異性AH1+ CD8+ T細胞。測定AH1+ CD8+ T細胞相較於空載體對照而言之數目增加倍數。
應理解，上文已僅藉助於實例描述本發明。實例並不意欲限制本發明之範疇。可在不背離本發明之範疇及精神之情況下作出各種修改及實施例。
圖1A-B. (A)冠狀病毒模型，其顯示冠狀病毒棘狀醣蛋白之膜呈現。(B)冠狀病毒棘狀醣蛋白域圖解(SS =信號序列(分泌信號)、胞外域、TM =跨膜域、ICD -胞內域)。
圖2A-C. (A)編碼IL-12及Flt3L融合蛋白以及抗原之核酸之示意性圖示。(B)繪示在投與PIIM-OVA (IL-12 p35-P2A-IL-12 p40-Flt3L-OVA241-270aa (SIINFEKL))後OVA特異性CD8+ T細胞百分比的流動式細胞量測圖。(C)繪示在投與PIIM-OVA後CD8+細胞(n = 5)百分比之圖式。
圖3.繪示EP後7天經分泌人類模型蛋白之差異系統表現之圖式。
圖4. SARS-CoV-2 S-2P_去弗林蛋白酶_F3CH2S之質體圖譜。
圖5. pUMVC3.SARS-CoV-2-2_S-2P.摺疊子.去標籤之質體圖譜。
圖6.編碼冠狀病毒抗原性多肽(例如CoV抗原)、IL-12、CXCL9、抗CD3半BiTE、Flt3L及其組合之核酸構築體之示意性圖示(T1、T2 =轉譯修飾元件，P2A = P2A元件，IRES =內部核糖體進入位點，ECD =胞外域，IL-12 p35 = IL-12之35 kDa次單元，IL-12 p40 = IL-12之40 kDa次單元)。
圖7.編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸構築體之示意性圖示(三聚體=三聚域，SS =分泌信號，• =裂解位點突變，* =穩定突變)。
圖8.編碼冠狀病毒抗原性多肽之核酸構築體之示意性圖示(ECD =胞外域，三聚體=三聚域，SS =分泌信號)。
圖9.繪示在IM-EP S蛋白及ID-EP S蛋白加上IL-12或IM-EP S蛋白加上IL-12之後Balb/C (A)或C57bl/6 (B)小鼠對比對照小鼠中之周邊血液中之抗S蛋白IgG1抗體含量的圖式。
圖10.繪示在IM-EP S蛋白及ID-EP S蛋白加上IL-12或IM-EP S蛋白加上IL-12之後Balb/C (A)或C57bl/6 (B)小鼠對比對照小鼠中之周邊血液中之抗S蛋白IgG2a抗體含量的圖式。
圖11.繪示在IM-EP S蛋白及ID-EP S蛋白加上IL-12或IM-EP S蛋白加上IL-12之後Balb/C (A)或C57bl/6 (B)小鼠對比對照小鼠中之周邊血液中之抗S蛋白中和抗體含量的存在的圖式。
圖12A.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第31天之抗S蛋白IgG1 (上圖)及IgG2a (下圖)連續稀釋分析的圖式(圖例示於圖12B中)。
圖12B.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第31天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖13A.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第42天之抗S蛋白IgG1 (上圖)及IgG2a (下圖)連續稀釋分析的圖式(圖例示於圖13B中)。
圖13B.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第42天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖14A.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第92天之血清中抗S蛋白IgG1含量的存在的圖式(圖例示於圖14B中)。
圖14B.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第92天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖15A.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第31天之抗S蛋白IgG2a (上圖)及IgG1 (下圖)連續稀釋分析的圖式(圖例示於圖15B中)。
圖15B.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第31天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖16A.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第31天之血清中抗S蛋白IgG1 (上圖)或IgG2a (下圖)抗體含量的圖式。
圖16B.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第31天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖17A.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第42天之血清中抗S蛋白IgG1 (上圖)或IgG2a (下圖)抗體含量的圖式。
圖17B.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第42天之中和抗體分析的圖式。
圖18A.繪示接種質體蛋白與IL-12之所指示組合之小鼠中第61天之血清中抗S蛋白IgG1 (上圖)或IgG2a (下圖)抗體含量的圖式。
圖18B.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第61天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖19A.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第31天之血清中抗S蛋白IgG1抗體含量的圖式。
圖19B.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第31天之血清中抗S蛋白IgG2a抗體含量的圖式。
圖19C.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第32天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖20.繪示接種棘狀質體與IL-12之各種組合之小鼠中第42天之抗S蛋白IgG1 (上圖)及IgG2a (中間圖)連續稀釋分析或抗S蛋白中和抗體分析(底部圖)的圖式。
圖21A.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第90天之(CD19+ ) B細胞含量的圖式。
圖21B.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第90天之(CD3+ CD4+ ) T細胞含量的圖式。
圖21C.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第90天之(CD3+ CD8+ ) T細胞含量的圖式。
圖21D.繪示接種棘狀質體與IL-12之所指示組合之小鼠中第90天之記憶B細胞含量的圖式。
圖22A.繪示接種各種量之棘狀質體及IL-12之小鼠中第31天之抗S蛋白IgG1 (上圖)及IgG2a (下圖)抗體含量的圖式。
圖22B.繪示接種各種量之棘狀質體及IL-12之小鼠中第31天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖23A.繪示接種各種量之棘狀質體及IL-12之小鼠中第31天之血清中抗S蛋白IgG1 (上圖)或IgG2a (下圖)抗體含量的圖式。
圖23B.繪示接種各種量之棘狀質體及IL-12之小鼠中第31天之抗S蛋白中和抗體分析的圖式。
圖24.繪示經IT-EP IL-12及IT-EP或ID-EP SARS-CoV-2棘狀蛋白治療之小鼠或對照小鼠之腫瘤生長的圖式。
圖25.繪示經IT-EP IL-12及IT-EP或ID-EP SARS-CoV-2棘狀蛋白治療之小鼠或對照小鼠之腫瘤生長的圖式。
圖26.繪示經IT-EP IL-12及IT-EP或ID-EP SARS-CoV-2棘狀蛋白治療之小鼠或對照小鼠中之無腫瘤小鼠百分比的圖式。
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Claims (34)

  1. 一種病原性抗原及免疫刺激物之用途，其用於製造用以引發個體之針對病原體之免疫反應的藥劑，其中該免疫刺激物包含免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE。
  2. 如請求項1之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中該病原性抗原選自由以下組成之群：細菌抗原性多肽、病毒抗原性多肽、原蟲抗原性多肽、寄生蟲抗原性多肽、真菌抗原性多肽、β冠狀病毒抗原性多肽、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬(subgenusEmbecovirus ))抗原性多肽、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬(subgenusSarbecovirus ))抗原性多肽、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬(subgenusMerbecovirus ))抗原性多肽、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬(subgenusNobecovirus ))抗原性多肽、SARS-CoV抗原性多肽、MERS-CoV抗原性多肽、SARS-CoV-2抗原性多肽、冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段、SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段、在對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置986及987之胺基酸處包含脯胺酸取代的SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段、包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1-1208、14-1208或21-1208之多肽或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1至1208、14-1208或21-1208具有至少90%一致性之多肽。
  3. 如請求項2之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中該病原性抗原包含以下中之一或多者：異源分泌信號、異源三聚域、異源跨膜域、親和標籤、一或多個破壞內部肽酶裂解位點之突變及一或多個使融合前構形中之蛋白質穩定之突變。
  4. 如請求項1之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中該病原性抗原為經分離之病原性抗原或編碼該病原性抗原之核酸，且該免疫刺激物為編碼該免疫刺激物之核酸。
  5. 如請求項4之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中該編碼該免疫刺激物之核酸包含：編碼IL-12之核酸、編碼IL-12 p40-IL-12 p35融合蛋白之核酸序列、編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白之核酸序列、編碼藉由內部核糖體進入位點(IRES)元件或2A肽跳躍基序間隔開之IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元的核酸序列、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4。
  6. 如請求項4之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中： (a)     該編碼該病原性抗原之核酸及該編碼IL-12之核酸經調配用於皮內投與； (b)     該編碼IL-12之核酸及視情況選用之第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸經調配用於皮內投與；且第二有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸經調配用於肌內投與； (c)     該編碼該病原性抗原之核酸及第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸經調配用於瘤內投與； (d)     第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸經調配用於皮內或肌內投與，且第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸經調配用於瘤內投與；或 (e)     第一有效劑量之該編碼病原性抗原之核酸及第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸經調配藉由瘤內投與，且第二第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸經調配用於皮內或肌內投與。
  7. 如請求項6之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中步驟(a)、(b)、(c)或(d)之該第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸及該第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸經調配用於注射至同一位點中，視情況而言，其中該第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸與該第一有效劑量之該編碼IL-12之核酸在投與之前組合。
  8. 如請求項6之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中該皮內投與包含皮內電穿孔(ID-EP)，該肌內投與包含肌內電穿孔(IM-EP)，且該瘤內投與包含瘤內電穿孔(IT-EP)，視情況而言，其中該ID-EP、IM-EP及IT-EP包含至少一次場強為約100-1500 V/cm之電壓脈波的投與或至少一次場強為約400 V/cm且持續時間為約10毫秒之電壓脈波的投與。
  9. 如請求項1至8中任一項之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中該病原性抗原及該免疫刺激物經調配用於在第一時間及第二時間投與至個體，其中該第二時間係在該第一時間之後14天至6個月，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽。
  10. 如請求項1之病原性抗原及免疫刺激物之用途，其中該免疫反應包含以下中之一或多者：細胞免疫反應、體液免疫反應、細胞及體液免疫反應兩者、中和抗體產生、經增加之CD8+ T細胞增殖及/或反應、經增加之CD4+ T細胞增殖及/或反應、經增加之記憶T細胞增殖及/或反應、經平衡之Th1/Th2抗體同型反應、抗原特異性IgG2a及IgG1反應、針對該病原體之保護性免疫、對與該病原體相關之症狀性疾病之預防、對與該病原體感染相關之至少一種症狀之預防、與該病原體感染相關之一或多種症狀之嚴重程度降低或持續時間減少以及對與該病原體感染相關之重度疾病之預防。
  11. 一種病原性抗原及免疫刺激物之用途，其用於製造用以引發個體之針對SARS-CoV-2病毒之免疫反應的藥劑，該病原性抗原及該免疫刺激物之特徵在於： (a)     該病原性抗原為經調配用於藉由ID-EP投與之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白之核酸或其抗原片段，且該免疫刺激物為經調配用於藉由ID-EP投與之編碼IL-12之核酸； (b)     該病原性抗原為經調配用於藉由IM-EP投與之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白之核酸或其抗原片段，且該免疫刺激物為經調配用於藉由ID-EP投與之編碼IL-12之核酸；或 (c)     該病原性抗原為經調配用於藉由ID-EP及IM_EP投與之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白之核酸或其抗原片段，且該免疫刺激物為經調配用於藉由ID-EP投與之編碼IL-12之核酸。
  12. 一種病原性抗原及免疫刺激物之用途，其用於製造用以引發患有癌症之個體之針對SARS-CoV-2病毒之免疫反應的藥劑，該病原性抗原及該免疫刺激物之特徵在於： (a)     該病原性抗原為經調配用於藉由IT-EP投與之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白之核酸或其抗原片段，且該免疫刺激物為經調配用於藉由IT-EP投與之編碼IL-12之核酸； (b)     該病原性抗原為經調配藉由ID-EP或IM-EP投與之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白之核酸或其抗原片段，且該免疫刺激物為經調配用於藉由IT-EP投與之編碼IL-12之核酸；或 (c)     該病原性抗原為經調配用於藉由IT-EP及ID-EP或IM-EP投與之編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白之核酸或其抗原片段，且該免疫刺激物為經調配用於藉由IT-EP投與之編碼IL-12之核酸。
  13. 一種疫苗，其用於生成個體之針對病原體之免疫反應，該疫苗包含：有效劑量之病原性抗原或編碼該病原性抗原之核酸及有效劑量之免疫刺激物或編碼該免疫刺激物之核酸，其中該免疫刺激物包含免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE或其組合。
  14. 如請求項13之疫苗，其中該病原體為選自由以下組成之群之冠狀病毒：細菌抗原性多肽、病毒抗原性多肽、原蟲抗原性多肽、寄生蟲抗原性多肽、真菌抗原性多肽、β冠狀病毒抗原性多肽、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、SARS-CoV抗原性多肽、MERS-CoV抗原性多肽、SARS-CoV-2抗原性多肽、冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段、SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段、在對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置986及987之胺基酸處包含脯胺酸取代的SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段、包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1-1208、14-1208或21-1208之多肽或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1至1208、14-1208或21-1208具有至少90%一致性之多肽。
  15. 如請求項14之疫苗，其中該病原性抗原包含以下中之一或多者：異源分泌信號、異源三聚域、異源跨膜域、親和標籤、一或多個破壞內部肽酶裂解位點之突變及一或多個使融合前構形中之蛋白質穩定之突變。
  16. 如請求項13至15中任一項之疫苗，其中該病原性抗原及該免疫刺激物經調配用於皮內、肌內及/或瘤內投與。
  17. 如請求項16之疫苗，其中該疫苗包含該編碼該病原性抗原之核酸及該編碼該免疫刺激物之核酸。
  18. 如請求項17之疫苗，其中該編碼該免疫刺激物之核酸包含：編碼IL-12之核酸、編碼IL-12 p40-IL-12 p35融合蛋白之核酸序列、編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白之核酸序列、編碼藉由內部核糖體進入位點(IRES)元件或2A肽跳躍基序間隔開之IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元的核酸序列、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4。
  19. 如請求項17之疫苗，其中編碼該病原性抗原之核酸及該編碼該免疫刺激物之核酸經調配用於ID-EP、IM-EP及/或IT-EP。
  20. 如請求項13之疫苗，其中該病原性抗原或該編碼該病原性抗原之核酸與該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸組合。
  21. 如請求項17之疫苗，其中該編碼該病原性抗原之核酸在第一表現載體上經編碼，且該編碼該免疫刺激物之核酸在第二表現載體上經編碼，視情況而言，其中該第一表現載體及該第二表現載體在單一質體上經編碼。
  22. 如請求項13至21中任一項之疫苗，其中該疫苗包含 (a)     經調配用於藉由ID-EP投與的第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸； (b)     經調配用於藉由IT-EP投與的第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸； (c)     經調配用於藉由ID-EP投與的第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸以及經調配用於藉由IM-EP投與的第二有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸； (d)     經調配用於藉由ID-EP投與的第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸以及經調配用於藉由IM-EP投與的第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸； (e)     經調配用於藉由ID-EP或IM-EP投與的第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸以及經調配用於藉由IT-EP投與的第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸； (f)     經調配用於藉由IT-EP投與的第一有效劑量之該編碼該病原性抗原之核酸及第一有效劑量之該編碼該免疫刺激物之核酸以及經調配用於藉由ID-EP或IM-EP投與的第二有效劑量之該冠狀病毒抗原性多肽。
  23. 如請求項13之疫苗，其中該有效劑量之該病原性抗原或該編碼該病原性抗原之核酸及該有效劑量之該免疫刺激物或該編碼該免疫刺激物之核酸獨立地與一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑一起提供，且視情況以溶液或凍乾粉形式提供。
  24. 一種編碼病原性抗原之核酸及編碼免疫刺激物之核酸的用途，其用於製造用以引發經診斷患有癌症之個體之針對病原體之免疫反應的藥劑，其中編碼該病原性抗原之該核酸經調配用於藉由IT-EP、ID-EP或IM-EP投與至該個體，且編碼該免疫刺激物之該核酸經調配用於藉由IT-EP投與至該個體，其中該免疫刺激物包含免疫刺激性細胞介素、基因佐劑或抗CD3半BiTE，視情況而言，其中該病原性抗原包含冠狀病毒抗原性多肽，視情況而言，其中該病原性抗原包含SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段，且該免疫刺激物包含IL-12。
  25. 一種表現載體，其包含：編碼免疫刺激性細胞介素之第一核苷酸序列及編碼病原性抗原之第二核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列可操作地連接至轉譯修飾元件，視情況而言，其中
  26. 如請求項25之表現載體，其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列可操作地連接至啟動子，視情況而言，其中該啟動子選自由以下組成之群：CMV啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子、SRα啟動子、疱疹胸苷激酶啟動子、單純疱疹病毒(HSV)啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus，RSV)啟動子及EF1α啟動子。
  27. 如請求項25之表現載體，其中該免疫刺激性細胞介素包含IL-12，視情況而言，其中編碼IL-12之核苷酸序列包含可操作地連接至轉譯修飾元件之IL-12 p35編碼序列及IL-12 p40編碼序列。
  28. 如請求項25之表現載體，其中該病原性抗原包含細菌抗原性多肽、病毒抗原性多肽、原蟲抗原性多肽、寄生蟲抗原性多肽、真菌抗原性多肽、β冠狀病毒抗原性多肽、A系β冠狀病毒(埃貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、B系β冠狀病毒(薩貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、C系β冠狀病毒(莫貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、D系β冠狀病毒(諾貝冠狀病毒亞屬)抗原性多肽、SARS-CoV抗原性多肽、MERS-CoV抗原性多肽、SARS-CoV-2抗原性多肽、冠狀病毒棘狀蛋白或其抗原片段、SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段、在對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置986及987之胺基酸處包含脯胺酸取代的SARS-CoV-2棘狀蛋白或其抗原片段、包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1-1208、14-1208或21-1208之多肽或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33之胺基酸1至1208、14-1208或21-1208具有至少90%一致性之多肽。
  29. 如請求項25至28中任一項之表現載體，其中該表現載體包含由以下表示之式： P-A-T1 -B-T2 -B' 或 P-T1 -B-T2 -B'-A 其中P為該啟動子，A編碼該病原性抗原，T1 及T2 為轉譯修飾元件，B編碼IL-12 p35，且B'編碼IL-12 p40，視情況而言，其中T1 及T2 為內部核糖體進入位點或選自由P2A肽、T2A肽、E2A肽及F2A肽組成之群之2A肽。
  30. 如請求項25之表現載體，其用於治療個體之癌症。
  31. 一種編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及編碼病原性抗原之表現載體的用途，其用於製造用以治療患有腫瘤之個體之藥劑，編碼該免疫刺激性細胞介素之該表現載體經調配用於注射至該腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，其中向該腫瘤、該腫瘤微環境及/或該腫瘤邊緣組織施行電穿孔療法，且 (a)     編碼該病原性抗原之該表現載體經調配用於注射至該腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，其中向該腫瘤、該腫瘤微環境及/或該腫瘤邊緣組織電穿孔療法； (b)     編碼該病原性抗原之該表現載體經調配用於注射至真皮中，其中在該注射部位處向該真皮施行電穿孔療法；或 (c)     編碼該病原性抗原之該表現載體經調配用於注射至骨骼肌中，其中在該注射部位處向該肌肉施行電穿孔療法， 其中治療該個體包含在該個體中減小腫瘤尺寸或抑制腫瘤生長、抑制癌細胞生長、抑制或減少轉移、減少或抑制轉移癌發展及/或減少癌症復發。
  32. 如請求項31之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及編碼病原性抗原之表現載體的用途，其中該免疫刺激性細胞介素包含IL-12。
  33. 如請求項31之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及編碼病原性抗原之表現載體的用途，其中該電穿孔療法包含經約100微秒至約1毫秒之持續時間投與至少一次電壓脈波，視情況而言，其中該至少一次電壓脈波之場強為約200 V/cm至約1500 V/cm，視情況而言，其中該至少一次電壓脈波包含1-10次電壓脈波。
  34. 如請求項31至33中任一項之編碼免疫刺激性細胞介素之表現載體及編碼病原性抗原之表現載體的用途，其進一步包含向該個體投與免疫檢查點抑制劑。
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