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TW202130817A - 用於偵測複數個分析物之系統及方法 - Google Patents

用於偵測複數個分析物之系統及方法 Download PDF

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TW202130817A TW109135365A TW109135365A TW202130817A TW 202130817 A TW202130817 A TW 202130817A TW 109135365 A TW109135365 A TW 109135365A TW 109135365 A TW109135365 A TW 109135365A TW 202130817 A TW202130817 A TW 202130817A
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傑佛瑞 博羅汀
慇娜 張
蘇珊 羅貝克
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傑佛瑞 費雪兒
翔元 楊
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米沙 果林斯奇
曉琳 吳
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Abstract

本發明係關於一種用於偵測不同分析物之方法，該方法包括混合不同分析物與感測探針，其中至少一些感測探針對各別分析物具有特異性。該等分析物分別由對分析物具有特異性之感測探針捕捉。螢光團分別偶聯至捕捉各別分析物之感測探針。該等感測探針與珠粒混合，其中該等珠粒對各別感測探針具有特異性，且其中該等珠粒包括識別該等感測探針具有特異性之分析物之不同碼。該等感測探針分別偶聯至對感測探針具有特異性之珠粒。至少使用來自捕捉分析物之該等感測探針偶聯之螢光團的螢光來識別偶聯至該等感測探針之珠粒。識別經捕捉之分析物。

Description

用於偵測複數個分析物之系統及方法
舉例而言，已使用存在於生物樣品中之特異性核酸序列偵測作為用於識別且分類微生物、診斷感染性疾病、偵測且表徵基因異常、識別癌症相關基因變化、研究基因易患病性及量測各種類型之治療反應之方法。用於偵測生物樣品中之特異性核酸序列之常見技術為核酸定序。
核酸定序方法已自Maxam及Gilbert所使用之化學降解方法及Sanger所使用之股伸長方法發展而來。允許在單晶片上並行處理全部數千個核酸之若干種定序方法現處於使用中。一些平台包括基於珠粒及微陣列格式，其中視該等格式在包括定序、基因分型或基因表現譜分析之應用中之應用而定用探針功能化二氧化矽珠粒。
一些定序系統使用基於螢光之偵測，不論用於「合成定序」或用於基因分型均如此，其中用螢光標記來標記給定核苷酸，且基於偵測來自彼標記之螢光來識別核苷酸。
在一些實例中，本文提供用於偵測不同分析物之方法。該方法可包括混合不同分析物與感測探針，其中感測探針中之至少一些對分析物中之各別分析物具有特異性。該方法可包括分別由對彼等分析物具有特異性之感測探針捕捉分析物。該方法可包括使螢光團分別偶聯至捕捉各別分析物之感測探針。該方法可包括混合感測探針與珠粒，其中珠粒對感測探針中之各別感測探針具有特異性，且其中珠粒包括識別分析物之不同碼，彼等感測探針對該等分析物具有特異性。該方法可包括使感測探針分別偶聯至對彼等感測探針具有特異性之珠粒。該方法可包括至少使用來自偶聯至捕捉分析物之感測探針之螢光團之螢光識別偶聯至彼等感測探針的珠粒。該方法可包括至少使用經識別珠粒之碼來識別由偶聯至彼等珠粒之感測探針捕捉之分析物。
在一些實例中，珠粒中之各者包括具有對感測探針中之一者具有特異性之序列之第一寡核苷酸，且其中感測探針中之各者包括具有與第一寡核苷酸互補之序列之第二寡核苷酸。在一些實例中，不同碼包括具有彼此不同之序列之寡核苷酸。
在一些實例中，分析物中之至少一者包括核苷酸分析物。在一些實例中，感測探針包括特異性雜交至核苷酸分析物之寡核苷酸序列。在一些實例中，核苷酸分析物包括DNA分析物。在一些實例中，核苷酸分析物包括RNA分析物。
在一些實例中，分析物中之至少一者包括非核苷酸分析物。在一些實例中，非核苷酸分析物包括蛋白質。在一些實例中，非核苷酸分析物包括代謝物。在一些實例中，感測探針包括對非核苷酸分析物具有選擇性之抗體。在一些實例中，感測探針包括對非核苷酸分析物具有選擇性之適體。
在一些實例中，不同分析物包括複數個核苷酸分析物及複數個非核苷酸分析物。
在一些實例中，在感測探針捕捉分析物之後，螢光團偶聯至感測探針。在一些實例中，在感測探針偶聯至珠粒之前，螢光團偶聯至感測探針。在一些實例中，在感測探針偶聯至珠粒之後，螢光團偶聯至感測探針。在一些實例中，提供螢光團包括使複數個螢光團偶聯至分析物。在一些實例中，使複數個螢光團偶聯至分析物包括使用雜交鏈反應(HCR)。
在一些實例中，本文提供用於偵測複數個不同分析物之系統。系統可包括對不同分析物中之各別分析物具有特異性且可捕捉其之感測探針。系統可包括對感測探針中之各別感測探針具有特異性且可與其偶聯、且包括分別識別分析物之不同碼的珠粒，彼等感測探針對該等分析物具有特異性。系統可包括用於分別偶聯至捕捉分析物之感測探針之螢光團。系統可包括用於識別偶聯至捕捉分析物之感測探針之珠粒且用於至少使用彼等珠粒之碼識別由偶聯至彼等珠粒之感測探針捕捉之分析物的偵測電路。
在一些實例中，珠粒中之各者包括具有對感測探針中之一者具有特異性之序列之第一寡核苷酸，且感測探針中之各者包括具有與第一寡核苷酸互補之序列之第二寡核苷酸。在一些實例中，不同碼包括具有彼此不同之序列之寡核苷酸。
在一些實例中，分析物中之至少一者包括核苷酸分析物。在一些實例中，感測探針包括特異性雜交至核苷酸分析物之寡核苷酸序列。在一些實例中，核苷酸分析物包括DNA分析物。在一些實例中，核苷酸分析物包括RNA分析物。
在一些實例中，分析物中之至少一者包括非核苷酸分析物。在一些實例中，非核苷酸分析物包括蛋白質。在一些實例中，非核苷酸分析物包括代謝物。在一些實例中，感測探針包括對非核苷酸分析物具有選擇性之抗體。在一些實例中，感測探針包括對非核苷酸分析物具有選擇性之適體。
在一些實例中，不同分析物包括複數個核苷酸分析物及複數個非核苷酸分析物。
在一些實例中，在感測探針捕捉分析物之後，螢光團偶聯至感測探針。在一些實例中，在感測探針偶聯至珠粒之前，螢光團偶聯至感測探針。在一些實例中，在感測探針偶聯至珠粒之後，螢光團偶聯至感測探針。在一些實例中，複數個螢光團偶聯至分析物。
在一些實例中，使用雜交鏈反應(HCR)使複數個螢光團偶聯至分析物。
本文所提供之方法及組合物之一些實例包括用於識別目標核酸之方法，該方法包含：(a)使複數個探針雜交至複數個核酸，該複數個核酸包含目標核酸，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端；(b)用經阻斷核苷酸延長經雜交探針；(c)自經延長探針移除複數個核酸及非延長探針；及(d)使經延長探針雜交至固定在表面上之複數個捕捉探針。在一些實例中，(a)-(c)係在溶液中執行。
一些實例亦包括重複(a)及(b)。
在一些實例中，經阻斷核苷酸包含可偵測標記。在一些實例中，標記包含螢光團。
在一些實例中，(b)包含聚合酶延長。在一些實例中，(b)包含接合酶延長。
在一些實例中，(c)包含酶降解。在一些實例中，(c)包含使複數個核酸及非延長探針與3'至5'核酸外切酶接觸。在一些實例中，3'至5'核酸外切酶選自由以下組成之群：核酸外切酶I、不耐熱性核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶III及克列諾I片段(Klenow I fragment)。
在一些實例中，探針各自包含對酶降解具有抗性之5'端。在一些實例中，對酶降解具有抗性之5'端包含硫代磷酸酯鍵。在一些實例中，(c)包含使複數個核酸與5'至3'核酸外切酶接觸。在一些實例中，5'至3'核酸外切酶選自由以下組成之群：RecJf、T7核酸外切酶、經截短核酸外切酶VIII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、核酸外切酶VII、核酸外切酶V及核酸酶BAL-31。
在一些實例中，複數個珠粒包含表面。
在一些實例中，表面包含平面表面。
在一些實例中，流通槽包含表面。
在一些實例中，(d)進一步包含放大來自經雜交之經延長探針之信號。
在一些實例中，(d)進一步包含識別表面上之經雜交之經延長探針之位置。
在一些實例中，捕捉探針彼此不同。
在一些實例中，複數個捕捉探針包含經解碼之捕捉探針陣列。一些實例亦包括解碼表面上之捕捉探針之位置。在一些實例中，複數個捕捉探針各自包含引子結合位點及解碼多核苷酸。在一些實例中，解碼包含：使定序引子雜交至引子結合位點，延長經雜交引子，且識別解碼多核苷酸。
在一些實例中，複數個核酸包含基因體DNA。在一些實例中，目標核酸包含單核苷酸多型性(SNP)。
本文所提供之方法及組合物之一些實例包括用於識別目標核酸之系統，該系統包含：包含以下之延長溶液：包含目標核酸之複數個核酸、複數個探針、複數個經阻斷核苷酸、延長酶，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端；包含3'至5'核酸外切酶之降解溶液；固定在表面上之捕捉探針陣列；及用於識別表面上之雜交至捕捉探針之經延長探針之位置的偵測器。在一些實例中，流通槽包含固定在表面上之捕捉探針陣列。
本文所提供之方法及組合物之一些實例包括用於識別目標核酸之系統，該系統包含：包含表面、用於將溶液添加至表面之入口及用於自表面移除溶液之出口的流通槽，其中捕捉探針陣列係固定在表面上；與入口接觸之延長溶液，延長溶液包含：包含目標核酸之複數個核酸、複數個探針、複數個經阻斷核苷酸、延長酶，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端；包含3'至5'核酸外切酶之降解溶液；及用於識別表面上之雜交至捕捉探針之經延長探針之位置的偵測器。
在一些實例中，經阻斷核苷酸包含可偵測標記。在一些實例中，標記包含螢光團。
在一些實例中，延長酶包含聚合酶。在一些實例中，延長酶包含接合酶。
在一些實例中，3'至5'核酸外切酶選自由以下組成之群：核酸外切酶I、不耐熱性核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶III及克列諾I片段。
在一些實例中，探針各自包含對酶降解具有抗性之5'端。在一些實例中，對酶降解具有抗性之5'端包含硫代磷酸酯鍵。在一些實例中，降解溶液進一步包含5'至3'核酸外切酶。在一些實例中，5'至3'核酸外切酶選自由以下組成之群：RecJf、T7核酸外切酶、經截短核酸外切酶VIII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、核酸外切酶VII、核酸外切酶V及核酸酶BAL-31。
在一些實例中，表面包含複數個珠粒。
在一些實例中，捕捉探針彼此不同。
在一些實例中，複數個捕捉探針包含經解碼之捕捉探針陣列。在一些實例中，複數個捕捉探針各自包含引子結合位點及解碼多核苷酸。
在一些實例中，複數個核酸包含基因體DNA。在一些實例中，目標核酸包含單核苷酸多型性(SNP)。
在一些實例中，本文提供用於偵測元件之方法。該方法可包括使元件偶聯至受質。該方法可包括使複數個螢光團偶聯至元件。該方法可包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測元件。
在一些實例中，元件包括分析物。在一些實例中，分析物偶聯至感測探針。在一些實例中，分析物經由感測探針偶聯至受質。在一些實例中，複數個螢光團經由感測探針偶聯至元件。在一些實例中，複數個螢光團經由受質偶聯至元件。
在一些實例中，在元件偶聯至受質之前，複數個螢光團偶聯至元件。在一些實例中，在元件偶聯至受質之後，複數個螢光團偶聯至元件。
在一些實例中，受質包括珠粒。
在一些實例中，使用滾環擴增使複數個螢光團偶聯至元件。在一些實例中，滾環擴增生成經伸長之重複序列，且其中複數個螢光團偶聯至彼序列之各別重複部分。在一些實例中，螢光團偶聯至DNA嵌入劑，該等DNA嵌入劑偶聯至經伸長之重複序列。在一些實例中，包括螢光團及淬滅劑之寡核苷酸雜交至重複部分。
在一些實例中，元件偶聯至複數個經螢光標記之髮夾自裝配至之觸發寡核苷酸。在一些實例中，元件偶聯至包含第一觸發序列A'及第二觸發序列B'之觸發寡核苷酸，且其中使複數個螢光團偶聯至元件包括使觸發寡核苷酸與複數個第一寡核苷酸髮夾及複數個第二寡核苷酸髮夾接觸。第一寡核苷酸髮夾中之各者可包括第一螢光團、與第一觸發序列A'互補之單股立足點序列A、與第二觸發序列B'互補之第一莖序列B、暫時雜交至第一莖序列B之第二莖序列B'及安置於第一莖序列B與第二莖序列B'之間的單股環序列C'。第二寡核苷酸髮夾中之各者可包括第二螢光團、與單股環序列C'互補之單股立足點序列C、與第二觸發序列B'互補之第一莖序列B、暫時雜交至第一莖序列B之第二莖序列B'及安置於第一莖序列B與第二莖序列B'之間的單股環序列A'。
在一些實例中，以下對於第一寡核苷酸髮夾中之一者之單股立足點序列A與觸發寡核苷酸之第一觸發序列A'之雜交之反應：彼第一寡核苷酸髮夾之第二莖序列B'與彼第一寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交；第二寡核苷酸髮夾中之一者之單股立足點序列C雜交至彼第一寡核苷酸髮夾之單股環序列；及彼第二寡核苷酸髮夾之第二莖序列B'與彼第二寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交。
在一些實例中，以下對於第一寡核苷酸髮夾中之另一者之單股立足點序列A與彼第二寡核苷酸髮夾之單股環序列A'之雜交之反應：彼第一寡核苷酸髮夾之第二莖序列B'與彼第一寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交；第二寡核苷酸髮夾中之另一者之單股立足點序列C雜交至彼第一寡核苷酸髮夾之單股環序列；及彼第二寡核苷酸髮夾之第二莖序列B'與彼第二寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交。
在一些實例中，元件偶聯至寡核苷酸引子。使複數個螢光團偶聯至元件可包括使擴增模板雜交至寡核苷酸引子；及至少使用擴增模板，用複數個經螢光標記之核苷酸延長寡核苷酸引子以生成包括複數個螢光團之經延長股。在一些實例中，螢光團中之至少一者與螢光團中之至少另一者不同。在一些實例中，該方法進一步包括對擴增模板進行解雜交且使經延長股成形為髮夾結構。
在一些實例中，元件偶聯至寡核苷酸引子。使複數個螢光團偶聯至元件可包括使擴增模板雜交至寡核苷酸引子；至少使用擴增模板，用分別偶聯至另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長寡核苷酸引子；使另外擴增模板雜交至另外核苷酸引子；及至少使用另外擴增模板，用分別偶聯至螢光團或分別偶聯至其他另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長另外核苷酸引子。在一些實例中，該方法進一步包括使其他另外擴增模板雜交至另外的核苷酸引子；及至少使用另外擴增模板，用分別偶聯至螢光團或分別偶聯至其他另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長另外核苷酸引子。
在一些實例中，元件偶聯至包括複數個螢光團之DNA摺紙。在一些實例中，DNA摺紙包括不同螢光團之組合。在一些實例中，元件經由以下偶聯至DNA摺紙：銅(I)催化之點擊反應、應變促進之疊氮化物-炔烴環加成、寡核苷酸與互補寡核苷酸之雜交、生物素-抗生蛋白鏈菌素相互作用、NTA-His-Tag相互作用或Spytag-Spycatcher相互作用。
在一些實例中，元件偶聯至寡核苷酸，且寡核苷酸包括複數個螢光團。在一些實例中，寡核苷酸包括髮夾。在一些實例中，寡核苷酸進一步包括自由基清除劑。
在一些實例中，元件直接偶聯至第一寡核苷酸，且第一寡核苷酸雜交至包括複數個螢光團之第二寡核苷酸。
在一些實例中，本文提供用於偵測核苷酸之方法。該方法可包括使用第二多核苷酸之至少一序列將核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸包括第一部分。該方法可包括藉由使第一部分與標記之第二部分反應而使標記偶聯至所添加之核苷酸，其中標記包括複數個螢光團。該方法可包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測所添加之核苷酸。
在一些實例中，本文提供用於偵測核苷酸之另一方法。該方法可包括使用第二多核苷酸之至少一序列將核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸偶聯至包括複數個螢光團之標記。該方法可包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測所添加之核苷酸。
在一些實例中，本文提供用於偵測核苷酸之另一方法。該方法可包括使用第二多核苷酸之至少一序列將核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸包括第一部分。該方法可包括藉由使第一部分與標記之第二部分反應而使標記偶聯至所添加之核苷酸。該方法可包括使複數個螢光團偶聯至經偶聯之標記。該方法可包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測所添加之核苷酸。
在一些實例中，本文提供組合物。該組合物可包括受質；偶聯至受質之寡核苷酸；偶聯至寡核苷酸之核苷酸；及偶聯至核苷酸之部分。該組合物亦可包括偶聯至部分之標記，其中標記包括複數個螢光團。該組合物亦可包括經組態以至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測核苷酸之偵測電路。
應理解，如本文所描述之本發明態樣中之各者之任何各別特點/實例可以任何適當組合形式一起實施，且此等態樣中之任一者或多者之任何特點/實例可與如本文所描述之一或多個其他態樣之特點中之任一者一起以任何適當組合形式實施以達成如本文所描述的效益。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年10月16日申請且名為「Methods and Compositions for the Enrichment and Detection of Nucleic Acids」之美國臨時專利申請案第62/916,073號之權益，該案之全部內容以引用之方式併入本文中。
本申請案亦主張2020年4月24日申請且名為「Bead-Based System for Optically Detecting Multiple Analytes」之美國臨時專利申請案第63/014,913號之權益，該案之全部內容以引用之方式併入本文中。
本申請案亦主張2020年4月24日申請且名為「Amplifying Optical Detection of Analytes Using Multiple Fluorophores」之美國臨時專利申請案第63/014,905號之權益，該案之全部內容以引用之方式併入本文中。
本文提供用於光學偵測複數個分析物之基於珠粒之系統。本文亦提供使用複數個螢光團進行之分析物光學偵測之放大。
舉例而言，本申請案提供用於擴展基於珠粒之基因分型分析以支持複數個不同分析物偵測，亦即「多體學」偵測的方法。分析物可包括核酸，諸如DNA分析物或RNA分析物，以及除核酸以外之分析物，諸如蛋白質或代謝物。本發明方法可採用不同分析物之任何合適組合之例如藉由感測探針進行之溶液相捕捉。不同感測探針中之各者可包括例如對各別分析物具有特異性之核酸、抗體或適體。分析物可例如在各別感測探針捕捉分析物之前或之後偶聯至螢光團。在分析物經捕捉之後，不同感測探針可在來自螢光團之螢光可經偵測之處選擇性地偶聯至不同受質。受質可包括基於可讀出之所捕捉分析物之身分之碼。因此，珠粒池可生成用於分析物(包括核苷酸分析物及非核苷酸分析物之任何合適組合)之偵測及視情況選用之定量的常見信號。該偵測可藉由聯結分析物捕捉與螢光信號生成來提供高特異性。
另外，本申請案提供用於放大來自分析物之光信號之方法。對於使用螢光標記以偵測諸如核苷酸之分析物之技術，螢光之強度及均勻性可能會影響偵測之準確度。因此，可能需要提供可生成比單個螢光團可能夠生成之螢光顯著地更多之螢光(例如，超過30倍螢光)的標記。另外，可能需要提供可每個分析物，例如每個核苷酸生成相對一致量之螢光以便准許定量測定樣品內或樣品之間的分析物之相對豐度的標記。因此，需要生成相對高之信號及相對應地低之偵測極限、同時提供相對高之信號均勻性之信號放大策略。本文提供用於使用複數個螢光團以放大分析物之光學偵測之若干種例示性方法。該等方法視情況可結合諸如本文其他地方所描述之基於珠粒之系統及用於光學偵測複數個分析物之方法利用。然而，應瞭解，本發明之用於使用複數個螢光團放大光學偵測之方法不限於此，且合適地可適於使複數個螢光團偶聯至任何所需元件。
本文所使用之一些術語應加以簡要解釋。隨後，將描述一些例示性組合物及用於使用複數個螢光團放大核苷酸之光學偵測之例示性方法。 術語
除非另外定義，否則本文所使用之全部技術及科學術語皆具有與一般熟習此項技術者通常所理解之含義相同之含義。術語「包括(including)」以及諸如「包括(include/includes/included)」之其他形式之使用不具限制性。術語「具有(having)」以及諸如「具有(have/has/had)」之其他形式之使用不具限制性。如在本說明書中所使用，無論在技術方案之過渡片語或主體中，術語「包含(comprise(s)/comprising」將解釋為具有開放式含義。亦即，以上術語將與片語「至少具有」或「至少包括」同義地解釋。舉例而言，當在方法之情形下使用時，術語「包含」意指該方法至少包括所敍述步驟，但可包括另外步驟。當在化合物、組合物或裝置之情形下使用時，術語「包含」意指該化合物、組合物或裝置至少包括所敍述特點或組分，但亦可包括另外特點或組分。
本說明書通篇使用之術語「實質上」及「約(approximately/about)」係用於描述且解釋諸如因處理變化所致之小波動。舉例而言，其可指小於或等於±5%，諸如小於或等於±2%、諸如小於或等於±1%、諸如小於或等於±0.5%、諸如小於或等於±0.2%、諸如小於或等於±0.1%、諸如小於或等於±0.05%。
如本文所使用之「分析物」意欲意謂需要偵測之化學元件。分析物可稱為「目標」。分析物可包括核苷酸分析物及非核苷酸分析物。核苷酸分析物可包括一或多個核苷酸。非核苷酸分析物可包括不為核苷酸之化學實體。例示性核苷酸分析物為包括去氧核糖核苷酸或經修飾去氧核糖核苷酸之DNA分析物。DNA分析物可包括諸如單核苷酸多型性或DNA甲基化之可受偵測關注之任何DNA序列或特點。另一例示性核苷酸分析物為包括核糖核苷酸或經修飾核糖核苷酸之RNA分析物。RNA分析物可包括諸如mRNA或cDNA之存在或量之可受偵測關注之任何RNA序列或特點。例示性非核苷酸分析物為蛋白質分析物。蛋白質包括摺疊成一結構之多肽之序列。另一例示性非核苷酸分析物為代謝物分析物。代謝物分析物為在代謝期間形成或使用之化學元件。另外例示性分析物包括但不限於醣類、脂肪酸、糖(諸如葡萄糖)、胺基酸、核苷、神經傳遞質、磷脂及重金屬。在本發明中，分析物可在諸如分析疾病狀態、分析代謝健康、分析微生物體、分析藥物相互作用、分析藥物反應、分析毒性或分析感染性疾病之一或多個任何合適應用之情形下加以偵測。說明性地，代謝物可包括響應於疾病而上調或下調之化學元件。分析物之非限制性實例包括激酶、絲胺酸水解酶、金屬蛋白酶、諸如用於特異性疾病之抗原之疾病特異性生物標記物及葡萄糖。
如本文所使用，元件「不同」意欲意謂元件中之一者相對於另一元件而言具有至少一個變化，使得元件可與彼此區分開。舉例而言，彼此不同之核苷酸分析物可具有相對於另一者而言至少一個核苷酸不同之核苷酸序列。作為另一實例，彼此不同之蛋白質可具有相對於彼此而言至少一個肽不同之肽序列。作為另一實例，代謝物相對於彼此之不同之處可在於至少一個化學基團。如本文所提供，不同分析物可使用本發明之系統及方法與彼此區分開。舉例而言，相對於彼此而言至少一個核苷酸不同之核苷酸分析物可經偵測且與彼此區分開。作為另一實例，具有相對於彼此而言至少一個肽不同之肽序列之蛋白質可經偵測且與彼此區分開。作為另一實例，相對於彼此而言至少一個化學基團不同之代謝物可經偵測且與彼此區分開。
如本文所使用之術語「核苷酸」意欲意謂包括糖及至少一個磷酸酯基且視情況亦包括核鹼基之分子。缺乏核鹼基之核苷酸可稱為「無鹼基」。核苷酸包括去氧核糖核苷酸、經修飾去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核糖核苷酸、肽核苷酸、經修飾肽核苷酸、經修飾磷酸酯糖骨幹核苷酸及其混合物。核苷酸之實例包括單磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、單磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、單磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、單磷酸鳥苷(GMP)、二磷酸鳥苷(GDP)、三磷酸鳥苷(GTP)、單磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、單磷酸去氧腺苷(dAMP)、二磷酸去氧腺苷(dADP)、三磷酸去氧腺苷(dATP)、單磷酸去氧胸苷(dTMP)、二磷酸去氧胸苷(dTDP)、三磷酸去氧胸苷(dTTP)、二磷酸去氧胞苷(dCDP)、三磷酸去氧胞苷(dCTP)、單磷酸去氧鳥苷(dGMP)、二磷酸去氧鳥苷(dGDP)、三磷酸去氧鳥苷(dGTP)、單磷酸去氧尿苷(dUMP)、二磷酸去氧尿苷(dUDP)及三磷酸去氧尿苷(dUTP)。
如本文所使用之術語「核苷酸」亦意欲涵蓋為相較於天然存在之核苷酸而言包括經修飾核鹼基、糖及/或磷酸酯部分之一類核苷酸之任何核苷酸類似物。例示性經修飾核鹼基包括肌苷、黃嘌呤(xathanine)、次黃嘌呤(hypoxathanine)、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、2-胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、2-胺基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-鹵尿嘧啶、15-鹵胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-鹵腺嘌呤或鳥嘌呤、8-胺基腺嘌呤或鳥嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鳥嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鳥嘌呤、8-羥基腺嘌呤或鳥嘌呤、5-經鹵基取代之尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、3-去氮雜鳥嘌呤、3-去氮雜腺嘌呤或其類似物。如此項技術中已知，某些核苷酸類似物無法變得併入多核苷酸，例如核苷酸類似物，諸如腺苷5'-磷醯硫酸中。
如本文所使用之術語「多核苷酸」係指包括彼此鍵結之核苷酸之序列之分子。多核苷酸為聚合物之一個非限制性實例。多核苷酸之實例包括去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其類似物。多核苷酸可為諸如RNA或單股DNA之核苷酸之單股序列、諸如雙股DNA或雙股RNA之核苷酸之雙股序列，或可包括核苷酸之單股序列及雙股序列之混合序列。雙股DNA (dsDNA)包括基因體DNA以及PCR及擴增產物。單股DNA (ssDNA)可轉化成dsDNA，且反之亦然。多核苷酸可包括諸如對映異構DNA之非天然存在之DNA。多核苷酸中之核苷酸之精確序列可為已知或未知的。以下為多核苷酸之例示性實例：基因或基因片段(例如探針、引子、經表現序列標籤(EST)或基因表現系列分析(SAGE)標籤)、基因體DNA、基因體DNA片段、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、合成多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、具有任何序列之經分離DNA、具有任何序列之經分離RNA、核酸探針、引子或前述任一者之經放大複本。
如本文所使用之「多核苷酸」及「核酸」可互換使用，且可指諸如核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之任何長度之核苷酸的聚合形式。因此，此術語包括單股、雙股或多股DNA或RNA。術語多核苷酸亦指雙股分子及單股分子。多核苷酸之實例包括基因或基因片段、基因體DNA、基因體DNA片段、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、諸如PIWI互動型RNA (piRNA)、短小干擾RNA (siRNA)及長非編碼RNA (lncRNA)之非編碼RNA (ncRNA)、短小髮夾(shRNA)、短小核RNA (snRNA)、微小RNA (miRNA)、短小核仁RNA (snoRNA)及病毒RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、具有任何序列之經分離DNA、具有任何序列之經分離RNA、核酸探針、引子或前述任一者之經放大複本。多核苷酸可包括諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物之經修飾核苷酸，該等核苷酸類似物包括具有非天然鹼基之核苷酸、具有諸如氮雜嘌呤或去氮雜嘌呤之經修飾天然鹼基之核苷酸。在一些實例中，多核苷酸可由以下四個核苷酸鹼基之特異性序列構成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；及胸腺嘧啶(T)。當多核苷酸為RNA時，尿嘧啶(U)亦可例如作為胸腺嘧啶之天然替代物存在。尿嘧啶亦可用於DNA中。因此，術語『序列』係指包括天然鹼基及非天然鹼基之多核苷酸或任何核酸分子之字母表示。
如本文所使用之「目標核酸」或其文法等效術語可指需要識別、定序、分析及/或進一步操縱之核酸分子或序列。在一些實例中，目標核酸可包括待識別之單核苷酸多型性(SNP)。在一些實例中，SNP可藉由使探針雜交至目標核酸且延長探針來加以識別。在一些實例中，經延長探針可藉由使經延長探針雜交至捕捉探針來加以偵測。
如本文所使用之術語「感測探針」意欲意謂可特異性地捕捉分析物且可結合至受質之元件。感測探針可為於溶液中之自由浮動元件，例如可在共同溶液中與不同分析物混合，且可在捕捉分析物之後結合至各別受質，彼等感測探針對該等分析物具有特異性。感測探針可包括意欲意謂可特異性地捕捉分析物之子組分之「捕捉探針」，且亦可包括對具有互補碼之受質具有特異性之「碼」。「捕捉」意謂變得偶聯至於溶液中之分析物。「碼」意謂特異性結合至另一部分(諸如互補寡核苷酸序列)之部分(諸如寡核苷酸序列)。因此，感測探針之捕捉探針可捕捉於溶液中之分析物，且隨後彼感測探針之碼可結合至具有特異性之受質之碼，因此使分析物結合至具有特異性之受質。
因此，在一些實例中，「捕捉探針」可指具有足以特異性雜交至目標核酸或諸如經延長探針之其他探針之互補性的多核苷酸。捕捉探針可充當用於在混合物中分離目標核酸或其他探針與其他核酸及/或組分之親和力結合分子。在一些實例中，目標核酸或諸如經延長探針之其他探針可經由介入分子由捕捉探針特異性結合。介入分子之實例包括具有足以特異性雜交至目標序列及捕捉探針之互補性之連接子、轉接子及其他橋接核酸。
如本文所使用之「雜交」意欲意謂經由核苷酸鹼基之特異性氫鍵結配對沿第一多核苷酸與第二多核苷酸之長度非共價連接彼等多核苷酸。第一多核苷酸與第二多核苷酸之間的連接強度隨彼等聚合物內之單體單元序列之間的長度及互補性而增加。舉例而言，第一多核苷酸與第二多核苷酸之間的連接強度隨彼等多核苷酸內之核苷酸序列之間的互補性且隨彼互補性之長度而增加。「暫時雜交」意指聚合物序列在第一時間與彼此雜交且在第二時間與彼此解雜交。
舉例而言，如本文所使用之「雜交(hybridization/hybridizing)」或其文法等效術語可指其中一或多個多核苷酸進行反應以形成至少部分經由核苷酸殘基之鹼基之間的氫鍵結形成之複合物的反應。氫鍵結可藉由沃森-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)、胡格斯坦結合(Hoogstein binding)或以任何其他序列特異性方式發生。複合物可具有形成雙螺旋結構之兩股、形成多股複合物之三股或更多股、單一自雜交股或其任何組合。股亦可交聯或另外藉由除氫鍵結之外之力接合。
如本文所使用之「聚合酶」意欲意謂具有藉由將核苷酸聚合成多核苷酸來裝配多核苷酸之活性位點的酶。聚合酶可結合經引發單股多核苷酸模板，且可將核苷酸依序添加至生長引子中以形成具有與模板之序列互補之序列的多核苷酸。
如本文所使用之術語「引子」定義為具有具備自由3' OH基團之單股之多核苷酸。引子亦可在5'端處具有修飾以允許偶聯反應或以使引子偶聯至另一部分。引子長度可為任何數目之鹼基長度且可包括各種非天然核苷酸。引子可在3'端處經阻斷以抑制聚合直至移除阻斷物為止。
如本文所使用之「延長(extending/extension)」或其任何文法等效術語可指藉由諸如聚合酶或接合酶之延長酶將dNTP添加至引子、多核苷酸或其他核酸分子中。
如本文所使用之「接合(ligation/ligating)」或其其他文法等效術語可指藉由磷酸二酯鍵接合兩個核苷酸股。此類反應可藉由接合酶加以催化。接合酶可包括在水解ATP或類似三磷酸酯之情況下催化此反應之酶。
如本文所使用之術語「標記」意欲意謂偶聯至元件且基於可偵測元件之存在之結構。標記可包括螢光團，或可包括可與螢光團直接地或間接地偶聯之部分。舉例而言，螢光團可直接地偶聯至分析物，或可藉由偶聯至感測探針或偶聯至與分析物偶聯或預先偶聯之珠粒來間接地偶聯至分析物。
如本文所使用之術語「受質」係指用作本文所描述之組合物之載體之材料。例示性受質材料可包括玻璃、二氧化矽、塑膠、石英、金屬、金屬氧化物、有機矽酸鹽(例如，多面體有機矽倍半氧烷(POSS))、聚丙烯酸酯、氧化鉭、互補金屬氧化物半導體(CMOS)或其組合。POSS之實例可為Kehagias等人, Microelectronic Engineering 86 (2009), 第776-778頁中所描述之POSS，該文獻以全文引用之方式併入。在一些實例中，本申請案中所使用之受質包括諸如玻璃、熔融二氧化矽或其他含二氧化矽材料之基於二氧化矽之受質。在一些實例中，基於二氧化矽之受質可包括矽、二氧化矽、氮化矽或氫化聚矽氧。在一些實例中，本申請案中所使用之受質包括諸如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、耐綸、聚酯、聚碳酸酯及聚(甲基丙烯酸甲酯)之塑膠材料或組分。例示性塑膠材料包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯及環烯烴聚合物受質。在一些實例中，受質為或包括基於二氧化矽之材料或塑膠材料或其組合。在特定實例中，受質具有包括玻璃或基於矽之聚合物之至少一個表面。在一些實例中，受質可包括金屬。在一些該等實例中，金屬為金。在一些實例中，受質具有包括金屬氧化物之至少一個表面。在一個實例中，表面包括氧化鉭或氧化錫。丙烯醯胺、烯酮或丙烯酸酯亦可用作受質材料或組分。其他受質材料可包括但不限於砷化鎵、磷化銦、鋁、陶瓷、聚醯亞胺、石英、樹脂、聚合物及共聚物。在一些實例中，受質及/或受質表面可為或包括石英。在一些其他實例中，受質及/或受質表面可為或包括諸如GaAs或ITO之半導體。前述清單意欲說明但不限制本申請案。受質可包括單種材料或複數種不同材料。受質可為複合材料或層合物。在一些實例中，受質包括有機矽酸鹽材料。
受質可為平坦、圓的、球面、棒狀或任何其他合適形狀。受質可為剛性或可撓性的。在一些實例中，受質為珠粒或流通槽或位於流通槽中之珠粒。
受質可在受質之一或多個表面上未經圖案化、經紋理化或經圖案化。在一些實例中，受質經圖案化。該等圖案可包括柱、墊、孔、脊、通道或其他三維凹面或凸面結構。受質表面上之圖案可為規則的或不規則的。舉例而言，圖案可藉由奈米壓印微影術或藉由使用金屬墊形成，該等金屬墊在例如非金屬表面上形成特點。
在一些實例中，本文所描述之受質形成流通槽之至少一部分或位於流通槽中或偶聯至流通槽。流通槽可包括分成複數個單工通道或複數個扇區之流量室。可用於本文所闡述之方法及組合物中之例示性流通槽及用於製造流通槽之受質包括但不限於可商購自Illumina, Inc. (San Diego, CA)之流通槽及受質。珠粒可位於流通槽中。
如本文所使用之「表面」可指可易於與試劑、珠粒或分析物接觸之受質或支撐結構之一部分。表面可為實質上平坦或平面的。可替代地，表面可為圓的或波狀的。可包括在表面上之例示性輪廓為孔、凹陷部分、支柱、脊、通道或其類似輪廓。可用作受質或支撐結構之例示性材料包括玻璃，諸如經改質或功能化玻璃；塑膠，諸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯與另一材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺基甲酸酯或TEFLON；多醣或交聯多醣，諸如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠；耐綸；硝化纖維素；樹脂；二氧化矽或基於二氧化矽之材料，其包括矽及經改質矽；碳纖維；金屬；無機玻璃；光纖束或各種其他聚合物。單種材料或若干種不同材料之混合物可形成適用於某些實例中之表面。在一些實例中，表面包含孔。在一些實例中，支撐結構可包括一或多個層。例示性支撐結構可包括晶片、膜、多孔盤及流通槽。
如本文所使用之「珠粒」可指由固體材料製成之小主體。珠粒材料可為剛性或半剛性的。主體可具有例如表徵為球體、橢圓形、微球體或其他經辨識粒子形狀之形狀，不論該其他經辨識粒子形狀具有規則或不規則尺寸。在一些實例中，珠粒或複數個珠粒可包含表面。適用於珠粒之例示性材料包括玻璃，諸如經改質或功能化玻璃；塑膠，諸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯與另一材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺基甲酸酯或TEFLON；多醣或交聯多醣，諸如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠；耐綸；硝化纖維素；樹脂；二氧化矽或基於二氧化矽之材料，其包括矽及經改質矽；碳纖維；金屬；無機玻璃；或各種其他聚合物。例示性珠粒包括可控孔徑玻璃珠粒、順磁珠粒、氧化釷溶膠、瓊脂糖凝膠珠粒、奈米晶體及此項技術中已知之其他珠粒。珠粒可由生物或非生物材料製成。磁珠由於在本文所描述之方法之各個過程使用磁體進行之磁珠操縱之容易性而為特別適用的。用於某些實例中之珠粒之直徑、寬度或長度可為約5.0 nm至約100 μm，例如約10 nm至約100 µm，例如約50 nm至約50 μm，例如約100 nm至約500 nm。在一些實例中，用於某些實例中之珠粒之直徑、寬度或長度可為小於約100 µm、50 µm、10 µm、5 µm、1 µm、0.5 µm、100 nm、50 nm、10 nm、5 nm、1 nm、0.5 nm、100 pm或在前述直徑、寬度或長度中之任兩者範圍內之任何直徑、寬度或長度。可選定珠粒尺寸以減小尺寸，且因此每單位面積得到更多特點，同時維持足夠信號(模板複本/個特點)以便分析特點。
在一些實例中，諸如捕捉探針或碼之多核苷酸可偶聯至珠粒。在一些實例中，珠粒可分佈至諸如流通槽之受質之表面上之孔中。可用於某些實例中之例示性珠粒陣列包括隨機排序BEADARRAY技術(Illumina Inc., San Diego CA)。該等珠粒陣列揭示於Michael等人, Anal Chem 70, 1242-8 (1998)；Walt, Science 287, 451-2 (2000)；Fan等人, Cold Spring Harb Symp Quant Biol 68:69-78 (2003)；Gunderson等人, Nat Genet 37:549-54 (2005)；Bibikova等人 Am J Pathol 165:1799-807 (2004)；Fan等人, Genome Res 14:878-85 (2004)；Kuhn等人, Genome Res 14:2347-56 (2004)；Yeakley等人, Nat Biotechnol 20:353-8 (2002)；及Bibikova等人, Genome Res 16:383-93 (2006)中，該等文獻中之各者以全文引用之方式併入。
如本文所使用之「聚合物」係指包括彼此偶聯且可稱為單體之一系列多個子單元之分子。子單元可重複或可與彼此不同。聚合物可為生物或合成聚合物。合適地可包括於橋或標記內之例示性生物聚合物包括多核苷酸、多肽、多醣、多核苷酸類似物及多肽類似物。適用於橋或標記中之例示性多核苷酸及多核苷酸類似物包括DNA、對映異構DNA、RNA、PNA (肽-核酸)、嗎啉核酸(morpholinos)及LNA (鎖核酸)。聚合物可包括諸如可商購自Glen Research (Sterling, VA)之可偶聯至多核苷酸、但缺乏核鹼基之間隔子胺基磷酸酯。例示性合成多肽可包括帶電或中性胺基酸以及親水性殘基及疏水性殘基。合適地可包括於橋或標記內之例示性合成聚合物包括PEG (聚乙二醇)、PPG (聚丙二醇)、PVA (聚乙烯醇)、PE (聚乙烯)、LDPE (低密度聚乙烯)、HDPE (高密度聚乙烯)、聚丙烯、PVC (聚氯乙烯)、PS (聚苯乙烯)、NYLON (脂族聚醯胺)、TEFLON® (四氟乙烯)、熱塑性聚胺基甲酸酯、聚醛、聚烯烴、聚(氧化乙烯)、聚(ω-烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸烷基酯)及諸如Hermanson, Bioconjugate Techniques, 第三版, Academic Press, London (2013)中所描述之其他聚合物化學及生物連接子。合成聚合物可為傳導性、半導性或絕緣的。
如本文所使用，具有「三級結構」之DNA意欲意謂摺疊成具有使摺疊處於適當位置之內部交聯之三維三級結構的DNA。相比而言，當使用該術語時，具有一級結構(例如，連接在一起之單體之特定序列)及二級結構(例如，局部結構)、但不具有使摺疊處於適當位置之內部交聯的DNA不應視為具有三級結構。 基於珠粒之系統及用於光學偵測複數個分析物之方法
本文提供基於珠粒之「通用」系統及用於偵測複數個分析物之方法，此舉亦可稱為提供多體學偵測。複數個不同分析物(例如，任何核苷酸分析物及非核苷酸分析物之任何合適組合)可藉由以下來加以偵測：使用對彼等分析物具有特異性之複數個不同感測探針捕捉彼等分析物，使螢光團偶聯至彼等感測探針，且隨後使彼等感測探針(及與其偶聯之螢光團)偶聯至全部與彼此類似地組態、同時對各別感測探針具有特異性之不同各別珠粒。舉例而言，感測探針中之各者可包括特異性結合分析物中之一者之捕捉探針及對珠粒中之一者具有特異性之碼(諸如寡核苷酸序列)。另外，珠粒中之各者可包括對感測探針中之一者具有特異性之碼(諸如寡核苷酸序列)。因此，已捕捉分析物之感測探針及與其偶聯之螢光團變得結合至可經解碼之指定珠粒。因此，珠粒自身不需要經特異性地功能化以結合分析物或螢光團，而實際上可經組態以偶聯至感測探針(例如，可包括與感測探針之寡核苷酸序列互補之寡核苷酸序列)。
實際上，本發明設計在可如何執行分析物增濃中提供實質性靈活性，此係因為分析物捕捉不依賴於分析物識別及定量。本發明設計可易於經延伸以偵測任何類型之分析物，該任何類型之分析物包括核苷酸分析物及非核苷酸分析物之任何合適組合。核苷酸分析物之實例包括可使用基於核苷酸之感測探針來加以偵測之複本數變異、基因表現、RNA剪接變異體及甲基化。非核苷酸分析物之實例包括可使用基於非核苷酸之感測探針(諸如抗體)或用基於核苷酸之感測探針(諸如適體)來加以偵測之蛋白質及代謝物。珠粒上螢光偵測及解碼係以相同方式對核苷酸分析物及非核苷酸分析物執行，允許在單一系統上在不同類型之分析物中進行常見讀出。除支持此類常見讀出之外，本發明系統亦提供完全可定製之靈活性內容設計。
圖1A-1B示意性地繪示用於偵測複數個分析物之基於珠粒之系統之例示組分。不同分析物可包括任何合適數目之核苷酸分析物及核苷酸分析物混合物(例如，零個、一個或複數個核苷酸分析物)及任何合適數目之非核苷酸分析物(例如，零個、一個或複數個非核苷酸分析物)。不同分析物可與彼此一起混合在共同溶液中，且可來源於諸如血液、組織、唾液、尿液或其類似物之任何合適之源或源組合。
如圖1A中所繪示，本發明系統包括對不同分析物中之各別分析物具有特異性且可捕捉其之不同感測探針100。亦即，各不同感測探針在與該等感測探針混合之溶液中選擇性捕捉一種特定類型之分析物。在一些實例中，可在溶液中提供之不同感測探針之數目與需要在彼溶液中偵測之不同類型之分析物之數目一樣多。舉例而言，若需要偵測10,000個不同類型之分析物，則可提供10,000個分別對彼等分析物具有特異性之不同感測探針。應瞭解，可提供例如超過100、超過1,000、超過10,000、超過100,000或超過1,000,000之任何合適數目之不同感測探針。亦應瞭解，任何給定溶液均可能未必包括可能需要偵測之全部可能性分析物。因此，一些感測探針可能未必在給定溶液中捕捉分析物。然而，感測探針中之至少一些可捕捉分析物，彼等感測探針對該等分析物具有特異性。
在諸如圖1A中所繪示之實例中，不同感測探針100 (具有珠粒-互補碼之感測探針)包括彼此不同之捕捉探針101及不同之碼102。各捕捉探針101可特異性捕捉特定分析物。分析物中之一些可為核苷酸分析物，且分析物中之一些可為非核苷酸分析物。在圖1A中之實例110 (SNP辨認)中，捕捉探針101中之一者對諸如特異性DNA序列111之第一核苷酸分析物具有特異性，對於該特異性DNA序列111，需要偵測SNP。在圖1A中之實例120 (mRNA定量)中，捕捉探針101中之一者對諸如特異性mRNA序列之第二核苷酸分析物具有特異性，對於該特異性mRNA序列，視情況可能需要偵測彼序列數量。在圖1A中之實例130 (甲基化)中，捕捉探針101中之一者對諸如特異性DNA序列之第三核苷酸分析物具有特異性，對於該特異性DNA序列，需要偵測特定核苷酸之甲基化。在圖1A中之實例140 (蛋白質定量)中，捕捉探針101中之一者對諸如蛋白質之第一非核苷酸分析物具有特異性，對於該蛋白質，視情況可能需要偵測彼蛋白質數量。在圖1A中之實例150 (代謝物定量)中，捕捉探針101中之一者對諸如代謝物之第二非核苷酸分析物具有特異性，對於該代謝物，視情況可能需要偵測彼代謝物數量。捕捉探針中之一或多者可包括寡核苷酸。寡核苷酸可與核苷酸分析物雜交，或可提供可捕捉非核苷酸分析物之適體。另外或可替代地，捕捉探針中之一或多者可包括諸如抗體之非寡核苷酸部分以捕捉非核苷酸分析物。螢光團可偶聯至捕捉不同分析物中之各別分析物之感測探針110。舉例而言，在實例110、120、130、140及150中之各者中，螢光團112偶聯至捕捉各別分析物之感測探針。下文參看圖2A-2F、3A-3B、4A-4B及5A-5C提供其中不同感測探針可分別捕捉不同分析物且可偶聯至螢光團之例示性方式之另外細節，且下文參看圖6A-6B提供其中可偵測分析物數量之方式之另外細節。
現參看圖1B，本發明系統亦包括對不同感測探針中之各別感測探針具有特異性且可偶聯之不同珠粒160 (一起提供通用珠粒陣列)。亦即，各不同珠粒在共同溶液中選擇性偶聯至一種特定類型之感測探針。在一些實例中，可在本發明系統中提供之通用珠粒陣列中之不同珠粒160的數目與需要偵測之不同類型之分析物的數目一樣多。舉例而言，若需要偵測10,000個不同類型之分析物，則可提供分別對感測探針具有特異性之10,000個不同珠粒，該等感測探針又對該等分析物具有特異性且可捕捉該等分析物。應瞭解，可提供任何合適數目之不同珠粒，例如超過100、超過1,000、超過10,000、超過100,000或超過1,000,000個。亦應瞭解，特定溶液可能未必包括可能需要偵測之所有可能分析物，但可包括感測探針之完整集合。因此，一些珠粒可偶聯至可能未必已捕捉分析物之感測探針。然而，至少一些珠粒可偶聯至已捕捉分析物之感測探針，該等感測探針對該等分析物具有特異性。
在一些實例中，通用珠粒陣列中之各珠粒160具有與各其他珠粒相同之組分，此與感測探針可捕捉之特定分析物無關。舉例而言，圖1B中所繪示之各珠粒160包括受質161以及包括碼162及引子163之寡核苷酸。不同珠粒160之碼162具有彼此不同之寡核苷酸序列，可選擇性偶聯至感測探針100之不同碼102中之各別碼。該等碼162分別識別該等感測探針具有特異性之分析物，且因此可用於識別自共同溶液捕捉之分析物，且視情況亦用於定量該等分析物。舉例而言，以諸如圖1B中所繪示之過程170 (雜交至經解碼陣列)處所指示之方式，各珠粒160包括具有對感測探針100中之一者具有特異性之序列之寡核苷酸162，且各感測探針100包括具有與寡核苷酸162互補之序列之寡核苷酸102。注意，感測探針100之捕捉探針101可能未必雜交至珠粒160之引子162，且替代地，捕捉探針101之末端可延長至溶液中。
如上文所指出，螢光團112僅偶聯至捕捉分析物之感測探針100，彼等感測探針對該分析物具有特異性。因此，螢光團112經由彼等感測探針110變得偶聯至珠粒160，彼等珠粒160對彼等感測探針110具有特異性。珠粒160可偶聯至表面，例如固定至流通槽內之表面。在一些實例中，珠粒160與表面之該偶聯可在感測探針100偶聯至珠粒之前執行；舉例而言，包括感測探針100之溶液可在偶聯至表面之珠粒上流動，且珠粒可自溶液捕捉感測探針，彼等珠粒對該等感測探針具有特異性。在其他實例中，珠粒160與表面之該偶聯可在感測探針100偶聯至珠粒之後執行；舉例而言，包括感測探針100之溶液可與包括珠粒160之溶液混合，在珠粒160與感測探針之間引起各別偶聯，彼等珠粒對該等感測探針具有特異性，且隨後珠粒可偶聯至表面，此係例如使用諸如銅(I)催化之點擊反應(在疊氮化物與炔烴之間)、應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(在疊氮化物與DBCO (二苯并環辛炔)之間)、寡核苷酸與互補寡核苷酸之雜交、生物素-抗生蛋白鏈菌素、NTA-His-Tag或Spytag-Spycatcher、基於電荷之固定(諸如胺基矽烷或多離胺酸)或非特異性生物正交結合化學反應(諸如利用經聚合物塗佈表面)之生物正交結合化學反應來進行。
如圖1B中所繪示之過程180 (在定序器上偵測且解碼)處所繪示，珠粒隨後可例如使用合適成像攝影機及偵測電路經由來自螢光團112之螢光來加以偵測。偶聯至已捕捉分析物之感測探針100之珠粒160可至少使用所偵測螢光識別到(偵測操作)；相比而言，偶聯至未捕捉分析物之感測探針100之珠粒160可不偶聯至螢光團且因此未經由螢光偵測到。隨後，可例如藉由解雜交來移除感測探針110及螢光團112，接著，使用合成定序或其他合適方法來解碼偶聯至珠粒160之引子區163之引子164及碼162。舉例而言，可將經螢光標記之核苷酸添加至於與碼162之序列互補之序列中之引子164中。分析物之身分可至少使用碼162之序列來加以確定。舉例而言，偵測電路可包括儲存不同碼162之記憶體及對應於彼等碼之分析物，且可經組態以比較碼162與所儲存碼之序列且以測定對應於珠粒160之碼之分析物(解碼操作)。
注意，螢光團112可在諸如圖1A-1B中所繪示之方法流程期間之任何合適時間偶聯至各別感測探針100。舉例而言，螢光團112可在感測探針捕捉分析物之後偶聯至感測探針，例如可至少使用核苷酸分析物111、121、131之序列偶聯至捕捉探針101。或，舉例而言，螢光團可在感測探針偶聯至珠粒之前偶聯至感測探針，例如可在抗體143捕捉蛋白質141之前偶聯至彼蛋白質，或可在感測探針偶聯至珠粒之前偶聯至代謝物151。或，舉例而言，螢光團112可在感測探針偶聯至珠粒之後例如以諸如參看圖7A-7B所描述之方式偶聯至感測探針。在一些實例中，例如使用雜交鏈反應(HCR)以諸如參看圖10A所描述之方式使複數個螢光團偶聯至分析物。本文其他地方提供使複數個螢光團偶聯至分析物之其他實例。
圖1C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於偵測複數個分析物之例示方法流程1000。圖1C中所繪示之方法流程1000包括混合不同分析物與感測探針，其中感測探針中之至少一些對分析物中之各別分析物具有特異性(過程1002)。例如參看圖3A-3B、4A-4B及5A-5C，本文其他地方提供對各別分析物具有特異性之感測探針之實例。相對於各別分析物而言，感測探針可過量提供以便增加各給定感測探針捕捉分析物之可能性，彼探針對該分析物具有特異性。舉例而言，可提供超過分析物大於10倍、大於100倍、大於1,000倍或大於10,000倍之過量之感測探針，彼等探針對該等分析物具有特異性。說明性地，給定分析物之濃度可為1-10 pM，且對彼分析物具有特異性之感測探針之濃度可為大於10 nM，例如10-100 nM。圖1C中所繪示之方法流程1000包括由對分析物具有特異性之感測探針分別捕捉彼等分析物(過程1004)。混合物中之感測探針中之一些可對未必存在於混合物中之分析物具有特異性，且因此不偶聯至該等分析物。方法流程1000包括使螢光團分別偶聯至捕捉各別分析物之感測探針(過程1006)。本文其他地方描述其中可使螢光團偶聯至感測探針之例示性方式。
圖1C中所繪示之方法流程1000包括混合感測探針與珠粒，其中珠粒對感測探針中之各別感測探針具有特異性，且其中珠粒包括識別分析物之不同碼，彼等感測探針對該等分析物具有特異性(過程1008)。該混合可藉由組合於溶液中之感測探針與於溶液中之珠粒而發生。可替代地，該混合可藉由使包括偶聯至表面之珠粒上之感測探針之溶液流動而發生。方法流程1000包括使感測探針分別偶聯至對彼等感測探針具有特異性之珠粒(過程1010)。舉例而言，各給定珠粒可包括與彼此相同且分別選擇性偶聯至給定感測探針之碼的複數個碼。因此，於溶液中之任何感測探針可變得選擇性偶聯至彼珠粒。方法流程1000包括至少使用來自偶聯至捕捉分析物之感測探針之螢光團之螢光識別偶聯至彼等感測探針的珠粒(過程1012)。舉例而言，珠粒可偶聯至表面(例如，在偶聯至各別感測探針之前或之後)，且彼表面上之螢光區可經成像。方法流程1000包括至少使用經識別珠粒之碼來識別由偶聯至彼等珠粒之感測探針捕捉之分析物(過程1014)。舉例而言，珠粒之碼可使用合成定序來進行解碼，且使用經解碼之碼以確定何種分析物對感測探針具有特異性，珠粒對該感測探針具有特異性。
現將描述分析物及用於特異性捕捉該等分析物之感測探針之一些非限制性實例。應瞭解，本發明之感測探針可合適地經修飾以分別捕捉任何合適之具有特異性之分析物。參看圖2A-2F及3A-3B描述例示性核苷酸分析物，且參看圖4A-4B及5A-5C描述例示性非核苷酸分析物。該等分析物之任何合適組合可使用本發明之系統及方法來加以偵測。舉例而言，與感測探針混合之溶液可包括一或多個非核苷酸分析物，或可包括一或多個核苷酸分析物。舉例而言，溶液可包括核苷酸分析物與非核苷酸分析物之混合物。在一些實例中，不同分析物在溶液中混合在一起，且彼溶液之部分與靶向各別類型之分析物之各別類型之感測探針混合。舉例而言，溶液之第一部分可與對一或多種類型之核苷酸分析物具有特異性之感測探針混合，且溶液之第二部分可與靶向一或多種其他類型之核苷酸分析物之感測探針混合。或，舉例而言，溶液之第一部分可與對一或多種類型之核苷酸分析物具有特異性之感測探針混合，且溶液之第二部分可與靶向一或多種類型之非核苷酸分析物之感測探針混合。或，舉例而言，溶液之第一部分可與對一或多種類型之非核苷酸分析物具有特異性之感測探針混合，且溶液之第二部分可與靶向一或多種其他類型之非核苷酸分析物之感測探針混合。
在一些實例中，感測探針可包括特異性雜交至諸如DNA分析物或RNA分析物之核苷酸分析物之寡核苷酸序列。舉例而言，圖2A-2C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於偵測DNA分析物之例示性基於雜交之方法流程。在圖2A中所繪示之實例中，DNA分析物211、211'包括彼此不同之處在於需要偵測之SNP之DNA序列。舉例而言，DNA分析物211包括在給定位置處具有A之序列214，而DNA分析物211'包括相同序列，但該序列在給定位置處具有代替A之G，且需要偵測彼序列214中之A及G之各別存在。如圖2A中所繪示，在過程210處感測探針200雜交至所關注之此等目標(使探針雜交至所關注之目標)。更具體言之，感測探針200之一個複本可雜交至DNA分析物211，且感測探針200之另一複本可雜交至DNA分析物211'。在此實例中，各感測探針200包括有包括與DNA分析物211、211'之序列214互補、但在緊接地在具有需要偵測之SNP (例如，A或G)之位置前之核苷酸處終止之序列的捕捉探針201。各感測探針200亦可包括可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式偶聯至特異性珠粒之彼此相同之碼202。在一些實例中，DNA分析物(例如，需要偵測之SNP)係經由因分析物之間的差異所引起之螢光差異來加以偵測。說明性地，在過程220處，感測探針200之各別捕捉探針201各自用經螢光標記之全功能核苷酸(ffN)進行單鹼基延長(用ffN進行單鹼基延長)。因為DNA分析物211、211'之序列彼此不同之處在於SNP (例如，A或G)，故至具有彼SNP之位置中之不同經螢光標記之ffN之添加產生可與彼此區分開之不同光信號。可使感測探針偶聯至一或多個珠粒，例如偶聯至各別珠粒，進行光學偵測，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼對應珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)。
本發明之系統及方法亦可用於以任何合適方式偵測且定量DNA甲基化。舉例而言，甲基化或未甲基化核苷酸成不同鹼基之生物化學轉化(例如，在亞硫酸氫鹽處理之情況下)可在用感測探針捕捉分析物之前執行。在捕捉之後，在潛在甲基化位點處用ffN執行單鹼基延長；甲基化狀態可藉由所併入之ffN-螢光團來測定。此類工作流可提供DNA甲基化之單鹼基解析。
舉例而言，如圖2B中所繪示，DNA分析物221、221'包括彼此不同之處在於需要偵測之核苷酸甲基化之DNA序列。在此非限制性實例中，DNA分析物221包括在給定位置處具有甲基化-C (Me-C)之序列224，而DNA分析物221'包括相同序列，但該序列在給定位置處具有未甲基化C，且需要偵測彼序列224中之甲基化之各別存在。在過程225處，例如在亞硫酸氫鹽處理之情況下使甲基化或未甲基化核苷酸選擇性轉化成不同鹼基(生物化學轉化甲基化或未甲基化鹼基)。此處，使未甲基化C選擇性轉化成T，而Me-C由於甲基化而未因處理變化。如圖2B中所繪示，在過程210''處感測探針200'雜交至所關注之此等目標(使探針雜交至所關注之目標)。更具體言之，感測探針200'之一個複本可雜交至DNA分析物221，且感測探針200'之另一複本可雜交至DNA分析物221'。在此實例中，各感測探針200'包括有包括與DNA分析物221、221'之序列224互補、但在緊接地在具有需要偵測之甲基化之位置前之核苷酸處終止之序列的捕捉探針201'。各感測探針200'亦可包括可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式偶聯至特異性珠粒之彼此相同之碼202'。在一些實例中，DNA分析物(例如，需要偵測之甲基化)係經由因分析物之間的差異所引起之螢光差異來加以偵測。說明性地，在過程220'處，感測探針200'之各別捕捉探針201'各自用經螢光標記之ffN 222、222'進行單鹼基延長(用ffN進行單鹼基延長)。因為DNA分析物221、221'之序列224由於甲基化及轉化(Me-C或T)而與彼此不同，故至具有彼甲基化之位置中之不同經螢光標記之ffN 222、222'之添加產生可與彼此區分開之不同光信號。可使感測探針偶聯至一或多個珠粒，例如偶聯至各別珠粒，進行光學偵測，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼對應珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)。
在甲基化偵測之另一實例中，目標DNA可在無先前處理之情況下雜交至捕捉探針，且隨後用ffN執行單鹼基延長。在延長之後，添加結合甲基化鹼基之針對甲基化目標核苷酸之螢光團結合抗體。總目標捕捉可藉由ffN之螢光強度來加以定量，且甲基化程度可藉由抗體-螢光團之螢光強度來加以量測。此方法可能未必允許單鹼基解析，此係因為抗體可結合接近捕捉位點之全部甲基化核苷酸。然而，該方法可在不對樣品DNA進行先行生物化學處理之情況下執行，且為評估具有多個甲基化事件之區域，複數個抗體結合事件可放大螢光信號。
舉例而言，如圖2C中所繪示，DNA分析物231、231'包括彼此不同之處在於需要偵測之一或多個核苷酸甲基化之DNA序列。在此非限制性實例中，DNA分析物231包括在一或多個給定位置處具有甲基化-C (Me-C)之序列234，而DNA分析物231'包括相同序列，但該序列在給定位置處具有未甲基化C，且需要偵測彼序列234中之一或多個甲基化之各別存在。如圖2C中所繪示，在過程235處感測探針200''雜交至所關注之此等目標(使探針雜交至所關注之目標)。更具體言之，感測探針200''之一個複本可雜交至DNA分析物231，且感測探針200''之另一複本可雜交至DNA分析物231'。在此實例中，各感測探針200''包括有包括與DNA分析物231、231'之序列234互補、但在緊接地在具有需要偵測之甲基化中之一者之位置前之核苷酸處終止之序列的捕捉探針201''。各感測探針200''亦可包括可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式偶聯至特異性珠粒之彼此相同之碼202''。在一些實例中，DNA分析物(例如，需要偵測之甲基化)係經由因分析物之間的差異所引起之螢光差異來加以偵測。說明性地，在過程236處，感測探針200''之各別捕捉探針201''各自用經螢光標記之ffN 232進行單鹼基延長(用ffN進行單鹼基延長)。因為DNA分析物231、231'之序列234與彼此相同，不同之處在於一或多個甲基化(Me-C)，故將相同經螢光標記之ffN 232添加至具有彼甲基化之末端位置中。在此實例中，在過程237處，添加經螢光標記之抗體232'以偵測序列234之甲基化狀態(用抗體偵測甲基化狀態)。舉例而言，經螢光標記之抗體232可選擇性結合至Me-C。隨後，感測探針可偶聯至一或多個珠粒，例如偶聯至各別珠粒，由不同經螢光標記之感測探針光學偵測螢光，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼對應珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)。
本文所提供之方法及系統之一些實例係關於亦可稱為DNA分析物之目標核酸之偵測。在一些實例中，目標核酸係藉由以下來加以偵測：使包含目標核酸之複數個核酸雜交至能夠與目標核酸雜交之探針(感測探針)；延長經雜交探針；及偵測經延長探針，藉此偵測目標核酸。在一些實例中，雜交及延長過程係在溶液中執行。在其他實例中，雜交及延長過程係結合諸如微流控裝置之固體載體執行。在一些實例中，經延長探針係藉由自經延長探針移除未經延長探針及視情況選用之複數個核酸來增濃。在一些實例中，經延長探針係藉由使經延長探針雜交至固定在表面上之捕捉探針陣列來加以偵測。在一些實例中，捕捉探針陣列為其中各捕捉探針具有獨特標誌或條碼且各捕捉探針之位置在使用之前經解碼的經解碼陣列。在一些實例中，捕捉探針陣列包含通用陣列。
本文所提供之一些實例包括用於增加基因分型分析之執行且賦能藉由使用可採用溶液相目標捕捉、探針延長及增濃之樣品製備策略、接著為基於珠粒之基因分型進行之經普遍地解碼之陣列之使用的方法。一些該等實例解決包括以下之已知挑戰：用於基因分型之DNA目標之低效捕捉；模板非依賴性探針延長及由於在固定在珠粒上之後探針之高局部濃度而增加之背景信號；及使用通用陣列以偵測目標核酸之能力。在一些實例中，該等挑戰係藉由在溶液中執行目標捕捉及探針延長、接著為所關注目標之酶增濃及至陣列中之引入；藉由在溶液中執行目標捕捉及第一鹼基延長；及藉由自固定寡核苷酸去偶聯探針序列來解決。
用於偵測目標核酸之特定方法中與低效雜交相關之挑戰包括在預裝配陣列上執行目標捕捉，例如使目標核酸雜交至固定在陣列上之目標特異性探針。在一個實例中，在預裝配陣列上執行目標捕捉可對探針:目標比加以限制，此係因為此實例中之目標特異性探針數目可最終因裝載至陣列中之珠粒數目而固定。另外，用於基因分型之樣品可含有過量非靶向DNA，可由於高DNA濃度而具黏性，且可潛在地受目標與其溶液相補體之再雜交影響。在一些實例中，此等挑戰係藉由在溶液中使目標特異性探針雜交至目標核酸來解決。在一些實例中，溶液中雜交可賦能大探針:目標比之使用，此舉可引起雜交動力學增加。在一些實例中，在引入陣列中之前所關注序列之生物化學增濃係藉由移除可不利地影響雜交之寡核苷酸來解決此等挑戰。
用於偵測目標核酸之特定方法中與樣品中之低效DNA濃度相關之挑戰可限制基因分型執行。在將DNA樣品引入陣列上之前，低DNA濃度可利用全基因體放大方法以獲得足夠濃度之樣品。在本文所提供之一些實例中，該等挑戰係藉由利用移除非靶向DNA提高雜交效率來解決。在一些實例中，經延長目標特異性探針之量可選擇性地最終增加經延長探針之基於珠粒之捕捉之速率。
在用於識別目標核酸之特定方法中，固定探針上之生物化學物質可因表面架構而複雜，舉例而言，特定商業陣列中所使用之珠粒可含有高局部濃度之探針，該等高局部濃度之探針促進間-寡相互作用且引起歸因於偏離目標併入之背景信號增加。探針表面密度之最佳化可防止此等相互作用達一定程度，但最終可在最佳化用於目標捕捉之珠粒架構與防止非靶向探針延長之間涉及取捨。另外，珠粒呈現可與核苷酸結合之表面，此種情況可引起噪音級升高。在本文所提供之一些實例中，該等挑戰係藉由在溶液中執行探針-目標雜交及延長反應以使得最小化目標濃度梯度及表面試劑吸附來解決。
在用於識別目標核酸之特定方法中，因為珠粒在裝載於陣列上之前大批彙集，故商業陣列格式可能不允許易於添加定製探針或設計定製基因分型面板。在本文所提供之一些實例中，該等挑戰係藉由在溶液中執行雜交以允許使用具有與溶液相探針之末端延長部分互補之解碼序列之通用陣列來解決。
一個實例包括在溶液中執行全部生物化學探針操縱以及另外樣品增濃過程、之後在陣列上執行基因分型。此實例所提供之一個優勢包括用經經解碼寡核苷酸功能化之珠粒而非目標特異性探針裝載陣列之能力。此種情況允許最終使用者更易於將定製SNP添加至用於使用陣列偵測目標核酸之方法及組合物中。
用於識別目標核酸之方法之實例描繪於包括以下過程之圖2D中：(1)在可具有相對於用於促進結合之陣列上之雜交而言增加之探針:目標比之溶液中使目標特異性探針(感測探針)雜交至目標核酸(DNA分析物，諸如包括SNP之基因體DNA片段)；及使用最終充當用於基因分型之信號之螢光團標記核苷酸對經雜交探針進行單鹼基延長(使探針雜交且用ffN進行延長)。基因體DNA片段包括目標核酸且含有單核苷酸多型性(SNP)，目標特異性探針在緊鄰SNP之位置處雜交。目標特異性探針含有或包括能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端。目標特異性探針雜交至目標核酸，且經具有3'螢光團之單個經修飾核苷酸延長，該3'螢光團藉由3'-5'核酸外切酶抑制經延長探針之降解(3'-螢光團防降解)。(2) (用一或多個核酸外切酶進行酶降解)及(3) (消化未經修飾DNA)增濃其中3'-OH特異性核酸外切酶降解未經延長探針及不意欲用於陣列上之捕捉及基因分型之任何寡核苷酸的螢光團標記探針。藉由3'-5'核酸外切酶降解未經延長探針及基因體DNA片段。(4)經由用於解碼多核苷酸之互補序列使螢光延長探針雜交至陣列(雜交至經解碼陣列)。各目標特異性探針在其5'端處含有與識別陣列內之特定珠粒類型之位置之經解碼序列互補的序列。此等序列使得螢光團標記探針能夠雜交至用於基因分型之陣列上之特定位點；珠粒包括引子結合位點及碼。(5)藉由直接偵測螢光核苷酸或必要時或適當時在另外信號放大之後執行基因分型。注意，儘管可在(4)處在雜交螢光延長探針之前以諸如圖2D中所示之方式解碼陣列，但替代地可使目標延長探針雜交至珠粒懸浮液，裝載至陣列上，且隨後解碼珠粒。
用於識別目標核酸之方法之實例描繪於圖2E中(針對信號生成及放大之一鍋附加分析)。圖2E之左側圖(分析輸入)描繪與通用珠粒池互補之具有5'突出物之探針(感測探針、包括探針及碼補體之使用者決定探針)與基因體DNA樣品(基因體dsDNA)及放大試劑的混合(過量與珠粒池互補之具有5'延長物之探針；經凍乾放大試劑—聚合酶、FFN、緩衝劑；賦能可撓性內容物及無剪切樣品製備物)。圖2E之中心圖(信號生成及放大)描繪用於增加經延長探針之濃度、最終增強所關注序列之基於珠粒之捕捉的混合物的熱循環。舉例而言，目標特異性探針雜交至目標核酸且經延長。經延長探針與目標核酸解雜交。更多目標特異性探針雜交至目標核酸且經延長。重複該等循環以放大經延長探針之數目，例如重複20個循環(例如以約30秒/個過程，20個循環持續總計約30分鐘)。該等過程可迅速地增加用於珠粒雜交之材料之量。在信號生成及放大之後，藉由基因體DNA及未經延長探針之核酸外切酶催化之降解(未經修飾DNA (未經延長探針)之核酸內切酶催化之水解)來增濃經延長探針。圖2E之右側圖(雜交至珠粒池)描繪經延長探針之基於珠粒之捕捉及基因分型。雜交時間之增加倍數可至少與信號放大相同。在不存在非特異性序列之情況下存在潛在更大的雜交效益。因此，如同通用珠粒池一般，提供更快的基於珠粒之雜交。
經延長探針增濃態樣之實例描繪於圖2F中。全基因體擴增產物可包括單股DNA、具有5'突出物之雙螺旋DNA及具有3'突出物之雙螺旋DNA之混合物。全基因體擴增產物中之單股DNA可在過程1)處雜交至感測探針，接著在過程2)處用3'-螢光團標記ffN進行單鹼基延長(SBE)以形成探針-目標複合物。用於基因分型之探針增濃係藉由選擇性降解未經3'-螢光團標記之寡核苷酸(經靶向以用於降解之寡核苷酸)來達成。此舉係由各自靶向特異性雜質之限制核酸外切酶之高度特異性性質賦能。以下核酸外切酶為可用於增濃經選擇寡核苷酸之類別之實例：(1)克列諾I片段靶向含有3'-突出物之3'雙螺旋DNA；(2)核酸外切酶III (ExoIII)靶向雙螺旋DNA之3'端；及(3)核酸外切酶I (ExoI)降解單股庫片段以及未反應引子。已經3'-螢光團ffN延長之探針-目標複合物可雜交至經解碼陣列(或未經解碼陣列)且執行基因分型過程。
在一些實例中，可有可能發生核苷酸至庫片段之3'端中之非特異性併入。在此情況下，探針可經設計成在其5'-端處具有例如硫代磷酸酯鍵。此種情況允許選擇性降解庫片段。一些實例包括對酶降解具有抗性之具有5'端之目標特異性探針之用途。
本文所提供之一些實例包括用於識別目標核酸之方法。一些該等實例包括(a)使複數個探針雜交至包含目標核酸之複數個核酸，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端；(b)用經阻斷核苷酸延長經雜交探針；(c)自經延長探針移除複數個核酸及未經延長探針；及(d)使經延長探針雜交至固定在表面上之複數個捕捉探針。
在一些實例中，捕捉探針各自包含能夠雜交至目標核酸之3'端。在一些實例中，捕捉探針能夠雜交至緊靠單核苷酸多型性(SNP)之目標核酸上之位置或目標核酸中待檢查之其他單核苷酸特點。在一些實例中，能夠雜交至目標核酸之3'端為探針之最3'端。在一些實例中，能夠雜交至目標核酸之3'端之長度為至少3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60個連續核苷酸或前述數目中之任兩者之間的任何數目之核苷酸。在一些實例中，捕捉探針各自包含能夠雜交至捕捉探針之5'端。在一些實例中，能夠雜交至目標核酸之5'端為探針之最5'端。在一些實例中，能夠雜交至目標核酸之5'端之長度為至少3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60個連續核苷酸或前述數目中之任兩者之間的任何數目之核苷酸。在一些實例中，探針之最5'端對酶降解具有抗性。舉例而言，探針之最5'端可包括硫代磷酸酯鍵。
在一些實例中，使複數個探針雜交至包含目標核酸之複數個核酸、用經阻斷核苷酸延長經雜交探針及自經延長探針移除複數個核酸及未經延長探針係在溶液中執行。舉例而言，探針、核酸及經延長探針不固定在表面上。
在一些實例中，經延長探針之量可藉由執行放大過程來增加。在一些此等實例中，使複數個探針雜交至包含目標核酸之複數個核酸，且用經阻斷核苷酸延長經雜交探針；且重複雜交及延長。舉例而言，循環包括第一雜交及延長，且隨後使經延長探針與目標核酸解雜交；使未經延長探針雜交至目標核酸，用經阻斷核苷酸延長經雜交探針。在一些實例中，循環重複超過2、5、10、20、30或50個循環或前述數目中之任兩者之間的任何數目之循環。
在一些實例中，用聚合酶或接合酶執行延長。在一些此等實例中，延長在探針之最3'端處添加經阻斷核苷酸以生成經延長探針。如本文所使用之「經阻斷核苷酸」可包括賦予經延長探針上之核酸外切酶降解抗性之核苷酸。舉例而言，經延長探針對藉由3'至5'核酸外切酶進行之酶降解具有抗性。在一些實例中，經阻斷核苷酸可包括諸如螢光團之可偵測標記。在一些此等實例中，螢光團可提供藉由3'至5'核酸外切酶進行之酶降解抗性。
一些實例包括自經延長探針移除未經延長探針。一些實例亦包括自經延長探針移除複數個核酸及未經延長探針。一些該等實例包括複數個核酸及未經延長探針之酶降解。在一些實例中，使複數個核酸及未經延長探針與3'至5'核酸外切酶接觸。3'至5'核酸外切酶之實例包括核酸外切酶I、不耐熱性核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶III及克列諾I片段。在一些實例中，自經延長探針實質上移除複數個核酸及未經延長探針，舉例而言，自經延長探針至少實質上移除複數個核酸及未經延長探針之量之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或任兩個前述百分比之間的任何百分比。
在一些實例中，探針各自包含對酶降解具有抗性之5'端，舉例而言，對酶降解具有抗性之5'端包含硫代磷酸酯鍵。在一些此等實例中，可藉由使複數個核酸與5'至3'核酸外切酶接觸來自經延長探針移除複數個核酸。5'至3'核酸外切酶之實例包括RecJf、T7核酸外切酶、經截短核酸外切酶VIII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、核酸外切酶VII、核酸外切酶V及核酸酶BAL-31。
一些實例包括使經延長探針雜交至捕捉探針。在一些實例中，捕捉探針固定在表面上。在一些實例中，珠粒包含表面。在一些實例中，複數個珠粒包含表面。在一些實例中，平面表面包含表面。在一些實例中，流通槽包含表面。在一些實例中，流通槽包含有包含表面之珠粒。
一些實例包括放大來自雜交至捕捉探針之經延長探針之信號。在一些此等實例中，使用針對諸如螢光團之經阻斷核苷酸之經標記初級抗體放大信號。一些實例亦包括使用對照初級抗體之二級抗體且進行進一步標記。
在一些實例中，捕捉探針彼此不同。舉例而言，不同捕捉探針可能夠雜交至經延長探針，該等經延長探針已藉由使探針雜交至不同目標核酸而生成。在一些實例中，複數個捕捉探針包含經解碼之捕捉探針陣列。舉例而言，陣列可在表面上包括複數個孔，各孔含有包含捕捉探針之珠粒。一些實例包括解碼表面上之捕捉探針之位置。在一些實例中，複數個捕捉探針各自包含引子結合位點及解碼多核苷酸。在一些實例中，解碼包含：使定序引子雜交至引子結合位點，延長經雜交引子，且識別解碼多核苷酸。在一些實例中，解碼多核苷酸能夠雜交至經延長探針。一些實例包括識別表面上之經雜交之經延長探針之位置，藉此識別目標核酸，該表面諸如為包含經解碼之捕捉探針陣列之表面。
本文所提供之一些實例包括套組及系統。在一些實例中，用於識別目標核酸之套組或系統包括：延長溶液，其包含有包含目標核酸之複數個核酸、複數個探針、複數個經阻斷核苷酸、延長酶，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端；降解溶液，其包含3'至5'核酸外切酶；固定在表面上之捕捉探針陣列；及用於識別(能夠識別)表面上之雜交至捕捉探針之經延長探針之位置的偵測器。在一些實例中，流通槽包含固定在表面上之捕捉探針陣列。
在一些實例中，用於識別目標核酸之套組或系統包括：流通槽，其包含表面、用於將溶液添加至表面之入口及用於自表面移除溶液之出口，其中捕捉探針陣列固定在表面上；與入口接觸之延長溶液，延長溶液包含有包含目標核酸之複數個核酸、複數個探針、複數個經阻斷核苷酸、延長酶，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端；降解溶液，其包含3'至5'核酸外切酶；及用於識別(能夠識別)表面上之雜交至捕捉探針之經延長探針之位置的偵測器。
在一些實例中，經阻斷核苷酸包含可偵測標記。在一些實例中，標記包含螢光團。在一些實例中，延長酶包含聚合酶。在一些實例中，延長酶包含接合酶。在一些實例中，3'至5'核酸外切酶選自由以下組成之群：核酸外切酶I、不耐熱性核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶III及克列諾I片段。在一些實例中，探針各自包含對酶降解具有抗性之5'端。在一些實例中，對酶降解具有抗性之5'端包含硫代磷酸酯鍵。在一些實例中，降解溶液進一步包含5'至3'核酸外切酶。在一些實例中，5'至3'核酸外切酶選自由以下組成之群：RecJf、T7核酸外切酶、經截短核酸外切酶VIII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、核酸外切酶VII、核酸外切酶V及核酸酶BAL-31。在一些實例中，表面包含複數個珠粒。在一些實例中，捕捉探針彼此不同。在一些實例中，複數個捕捉探針包含經解碼之捕捉探針陣列。在一些實例中，複數個捕捉探針各自包含引子結合位點及解碼多核苷酸。在一些實例中，複數個核酸包含基因體DNA。在一些實例中，目標核酸包含單核苷酸多型性(SNP)。
DNA僅為可使用本發明之系統及方法加以偵測之核苷酸分析物之一個實例。與對於DNA分析物而言類似地，感測探針可包括特異性雜交至RNA分析物之寡核苷酸序列。舉例而言，用於捕捉且偵測RNA之策略亦可適合於使用cDNA庫且可適於直接使用RNA。與對於DNA工作流而言類似地，可使用RNA (諸如cDNA)分子與包括目標識別碼之感測探針之溶液中雜交、接著為用ffN進行之單鹼基延長。舉例而言，圖3A-3B示意性地繪示基於珠粒之系統中用於偵測RNA分析物之例示性基於雜交之方法流程。
在圖3A中所繪示之實例中，RNA分析物311、311'包括彼此不同且需要針對其偵測相對豐度之RNA序列。舉例而言，RNA分析物311包括序列314，而RNA分析物311'包括序列314'，且需要偵測相對於RNA分析物311'之豐度而言之RNA分析物311之豐度。如圖3A中所繪示，在過程310處感測探針300、300'分別雜交至所關注之此等目標(使探針雜交至所關注之目標)。更具體言之，感測探針300之一個複本可雜交至RNA分析物311中之各者，且感測探針300'之一個複本可雜交至RNA分析物311'。在此實例中，各感測探針300包括有包括與RNA分析物311之序列314互補之序列的捕捉探針301，而各感測探針300'包括有包括與RNA分析物311'之序列314'互補之不同序列的捕捉探針301'。各感測探針300亦可包括可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式偶聯至特異性珠粒之彼此相同之碼302，而各感測探針300'亦可包括可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式偶聯至不同特異性珠粒之彼此相同之碼302'。在一些實例中，RNA分析物係經由感測探針之碼差異加以偵測。說明性地，在過程320 (用ffN進行單鹼基延長)處，感測探針300之捕捉探針301及感測探針300'之捕捉探針301'分別各自用經螢光標記之ffN進行單鹼基延長。可使感測探針偶聯至各別珠粒，進行光學偵測，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼對應珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)。
在其他實例中，本發明之系統及方法可用於定量替代性剪接事件且可用於獲得轉錄本同功異型物豐度之估值。說明性地，各類型之ffN可偶聯至不同螢光團，且螢光團身分可反映發生何種剪接事件。替代性剪接之資訊性量測可藉由提供緊鄰用於可能性外顯子中之各者之剪接位點之不同核苷酸來獲得。
在圖3B中所繪示之實例中，RNA分析物321、321'包括有包括不同剪接同功異型物且需要針對其偵測相對豐度之RNA序列。舉例而言，RNA分析物321包括剪接同功異型物324，而RNA分析物321'包括不同剪接同功異型物324'，且需要偵測相對於RNA分析物321'之豐度而言之RNA分析物321之豐度。如圖3B中所繪示，在過程310'處感測探針300''分別雜交至所關注之此等目標(使探針雜交至所關注之目標)。更具體言之，感測探針300''之一個複本可雜交至RNA分析物311、311'中之各者。在此實例中，各感測探針300''包括有包括與RNA分析物311、311'兩者中之一或多個外顯子互補且緊接地在需要偵測且定量之剪接同功異型物前終止之序列的捕捉探針301''。各感測探針300''亦可包括可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式偶聯至特異性珠粒之彼此相同之碼302''。在一些實例中，RNA分析物(例如，需要偵測之剪接同功異型物)係經由因分析物之間的差異所引起之螢光差異來加以偵測。說明性地，在過程320' (用ffN進行單鹼基延長)處，感測探針300之各別捕捉探針301''各自用經螢光標記之ffN進行單鹼基延長。因為RNA分析物311、311'之序列彼此不同之處在於剪接同功異型物(例如，外顯子3或外顯子5)，故至具有彼剪接同功異型物之位置中之不同經螢光標記之ffN之添加產生可與彼此區分開之不同光信號。可使感測探針偶聯至一或多個珠粒，例如偶聯至各別珠粒，進行光學偵測，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼對應珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)。
在諸如參看圖2A-2F及圖3A-3B所描述之實例中，注意，ffN視情況可在添加至捕捉探針中之後而非在添加至捕捉探針中之前經螢光標記。另外或可替代地，ffN可偶聯至複數個螢光團以便提供經放大光信號。下文參看圖7A-16E更詳細地描述用於將複數個螢光團添加至核苷酸中之例示性方法。
儘管核苷酸分析物之特定實例係參看圖2A-2F及圖3A-3B加以描述，但本發明之感測探針可合適地適於選擇性偶聯至諸如非核苷酸分析物之任何類型之分析物。非核苷酸分析物之實例包括蛋白質及代謝物。適用於選擇性偶聯至非核苷酸分析物之感測探針之實例包括諸如下文參看圖4A-4B所描述之抗體或諸如下文參看圖5A-5C所描述之適體。基於可藉由以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼珠粒而確定之分析物身分，該等感測探針可選擇性偶聯至珠粒。
舉例而言，圖4A-4B示意性地繪示基於珠粒之系統中用於偵測蛋白質分析物之例示性基於抗體之方法流程。在圖4A中所繪示之實例中，溶液可包括複數個不同蛋白質，且可能需要偵測彼此不同之蛋白質411、411'。在過程410 (一般蛋白質標記)處，可使用一般蛋白質染料(諸如胺反應性螢光團或半抗原)用螢光團412標記溶液中之蛋白質。蛋白質411、411'之非限制性實例包括激酶、絲胺酸水解酶、金屬蛋白酶及諸如用於特異性疾病之抗原之疾病特異性生物標記物。在過程420 (增濃所關注之目標)處，在此螢光標記之後，可在溶液中結合感測探針以增濃所關注之蛋白質。舉例而言，感測探針400可包括對蛋白質411具有特異性之抗原413及對特定珠粒具有特異性之碼402，且感測探針400'可包括對蛋白質411'具有特異性之抗原413'及對特定珠粒具有特異性之碼402'。抗原413可特異性結合蛋白質411，此舉可引起感測探針400經由偶聯至蛋白質411之螢光團412變得經螢光標記。抗原413'可特異性結合蛋白質411'，此舉可引起感測探針400'經由偶聯至蛋白質411'之螢光團412'變得經螢光標記。可使感測探針400、400'偶聯至各別珠粒，且可洗滌掉未經結合蛋白質。來自螢光團412、412'之螢光可分別經由成像來加以偵測。可自珠粒移除感測探針400、400'，使引子黏合至珠粒，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)以識別分別結合至感測探針之分析物。注意，溶液中之全部感測探針可變得偶聯至各別珠粒，但僅捕捉蛋白質之感測探針亦生成螢光信號。
在其他實例中，首先由感測探針捕捉蛋白質以選擇所關注之目標，之後進行螢光標記。在圖4B中所繪示之實例中，溶液可再次包括複數個不同蛋白質，且可能需要偵測彼此不同之蛋白質421、421'。在過程410' (增濃所關注之目標)處，執行用於增濃所關注之蛋白質之感測探針之溶液中結合。舉例而言，感測探針430可包括對蛋白質421具有特異性之抗原423及對特定珠粒具有特異性之碼432，且感測探針430'可包括對蛋白質421'具有特異性之抗原423'及對特定珠粒具有特異性之碼432'。抗原423可特異性結合蛋白質421，且抗原423'可特異性結合蛋白質421'。隨後，在過程420' (偵測與螢光抗體之結合)處，經結合蛋白質421、421'可經螢光標記。舉例而言，在感測探針430、430'偶聯至各別珠粒之前或之後，偶聯至螢光團442之抗體424、424'可分別偶聯至經結合蛋白質421、421'，且隨後可洗滌掉未經結合蛋白質。來自螢光團412、412'之螢光可分別經由成像來加以偵測。可自珠粒移除感測探針430、430'，使引子黏合至珠粒，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)以識別分別結合至感測探針之分析物。注意，溶液中之全部感測探針可變得偶聯至各別珠粒，但僅捕捉蛋白質之感測探針亦生成螢光信號。注意，抗體424、424'可靶向彼此不同之各別蛋白質之抗原決定基，使得兩個抗體423、424可同時結合至蛋白質411，且抗體423'、424'可同時結合至蛋白質411'。在諸如參看圖4B所描述之實例中，可藉由提供兩個獨立抗體結合事件抑制來自抗原與蛋白質之非特異性結合之背景螢光信號以生成螢光信號，實質上提高特異性。
注意，以諸如參看圖4A-4B所描述之方式偶聯至碼之抗原可為或包括諸如可商購自BioLegend, Inc. (San Diego, California)之帶條碼抗體。在該等帶條碼抗體中，用於樣品識別(經由諸如參看圖1A-1C所描述之珠粒結合及解碼)之核酸碼之5'端共價偶聯至抗體。可定製該等帶條碼抗體之內容物以提供諸如蛋白質之所需非核苷酸分析物之偵測。
其他例示性方法流程使用具有用於捕捉分析物之適體之感測探針。適體可視為由核酸序列製成之抗體，且可用於捕捉具有高特異性之蛋白質及小分子(諸如代謝物)。舉例而言，圖5A-5C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於偵測蛋白質或代謝物分析物之例示性基於適體之方法流程。
舉例而言，以諸如參看圖4A所描述之方式，可使用一般蛋白質螢光染料、接著為用釋出適體進行之目標蛋白之溶液中捕捉。在圖5A中所示之實例中，在過程510 (一般蛋白質標記)處，用諸如參看圖4A所描述之一般蛋白質標記來標記不同蛋白質511。蛋白質511之非限制性實例包括激酶、絲胺酸水解酶、金屬蛋白酶及諸如用於特異性疾病之抗原之疾病特異性生物標記物。在過程520 (增濃所關注之目標)處，經標記蛋白質與包括視情況經由鍵504偶聯至適體503之碼502的感測探針500混合。對蛋白質511具有特異性之適體503 (具有目標特異性之適體)捕捉彼蛋白質以及偶聯至彼蛋白質之螢光團512。因此，對蛋白質511具有特異性之感測探針500變得經螢光標記。感測探針500可特異性偶聯至珠粒，且可洗滌掉未經結合蛋白質。來自螢光團512之螢光可經由成像來加以偵測。可自珠粒移除感測探針500，使引子黏合至珠粒，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)以識別分別結合至感測探針之分析物。注意，可選擇適體503以便對給定蛋白質511及偶聯至彼蛋白質之螢光團512之各別組合具有特異性。可替代地，可選擇適體503以便結合至經螢光團512標記之不含有反應性胺基酸殘基之給定蛋白質511之一或多個各別區域，以使得螢光團512可不干擾適體與蛋白質之間的結合，彼等適體對該等蛋白質具有特異性。
在其他方法中，分析物捕捉之螢光讀出可藉由聯結目標分析物之適體結合與引入螢光信號之構形變化來獲得。充分記載包括菠菜適體及核糖開關之適體在目標結合時之構形變化。舉例而言，在結合時引起化合物3,5-二氟-4-羥亞苄基咪唑啉酮(DHFBI)發螢光之菠菜適體可結合至使得菠菜非活性直至其亦結合其各別配位體之另外核糖開關或適體。尚未結合其目標之適體不能夠發螢光。在圖5B中所示之實例中，在過程520' (增濃所關注之目標)處，諸如蛋白質或代謝物(或其混合物)之分析物與包括視情況經由鍵504'偶聯至適體503'之碼502'的感測探針500'混合。對蛋白質或代謝物511'具有特異性之適體503' (具有目標特異性之適體)捕捉活化螢光團512' (螢光轉導物)之彼蛋白質或代謝物。因此，對蛋白質或代謝物511'具有特異性之感測探針500'變得經螢光標記。感測探針500'可特異性偶聯至珠粒，且可洗滌掉未經結合蛋白質及代謝物。來自螢光團512'之螢光可經由成像來加以偵測。可自珠粒移除感測探針500'，使引子黏合至珠粒，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)以識別分別結合至感測探針之分析物。
在再其他方法中，分析物捕捉之螢光讀出可藉由聯結目標分析物之適體結合與顯露諸如寡核苷酸序列之可結合螢光團之部分之構形變化來獲得。僅已結合其目標之適體顯露該部分，因此特異性聯結目標結合與螢光信號。在圖5C中所示之實例中，在過程520'' (增濃所關注之目標)處，諸如蛋白質或代謝物(或其混合物)之分析物與包括視情況經由鍵504''偶聯至適體503''之碼502''的感測探針500'混合。對蛋白質或代謝物511''具有特異性之適體503'' (具有目標特異性之適體)捕捉顯露部分560 (用於螢光團之結合位點)之彼蛋白質或代謝物。在過程521處，螢光團512''可經由與螢光團偶聯之部分561偶聯至部分560。舉例而言，部分561可包括與部分560之寡核苷酸序列互補之寡核苷酸序列。因此，對蛋白質或代謝物511''具有特異性之感測探針500''變得經螢光標記。感測探針500''可特異性偶聯至珠粒，且可洗滌掉未經結合蛋白質及代謝物。來自螢光團512''之螢光可經由成像來加以偵測。可自珠粒移除感測探針500''，使引子黏合至珠粒，且以諸如參看圖1A-1C所描述之方式解碼珠粒(在通用珠粒陣列上偵測且解碼)以識別分別結合至感測探針之分析物。
注意，以諸如參看圖5A-5C所描述之方式偶聯至碼之適體可為或包括諸如可商購自SomaLogic, Inc. (Boulder, Colorado)之用於蛋白質及小分子之帶條碼適體。在該等帶條碼適體中，用於樣品識別(經由諸如參看圖1A-1C所描述之珠粒結合及解碼)之核酸碼之5'端共價偶聯至適體。可定製該等帶條碼適體之內容物以提供諸如蛋白質之所需非核苷酸分析物之偵測。至於關於適體設計之另外細節，參見Stojanovic等人, 「Modular aptameric sensors」, J. Am. Chem. Soc. 126: 9266-9270 (2004)，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。用於生成待結合菠菜用以產生感測複合物之適體之方案描述於Litke等人, 「Developing fluorogenic riboswitches for imaging metabolite concentration dynamics in bacterial cells」, Methods in Enzymology, 第527卷, 第14章: 315-333 (2016)中，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。至於對小分子具有特異性之適體之實例，參見Pfeiffer等人, 「Selection and biosensor application of aptamers for small molecules」, Frontiers in Chemistry 4: 25 (2016)，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。至於用於心臟生物標記物偵測之適體之實例，參見Grabowska等人, 「Electrochemical aptamers-based biosensors for the detection of cardiac biomarkers」, ACS Omega 3(9): 12010-12018 (2018)，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。
注意，本發明之感測探針可包括用於捕捉具有特異性之分析物之任何合適功能，且不限於諸如本文其他地方例示之適體、抗原或寡核苷酸。舉例而言，本發明之感測探針可包括可用於捕捉具有特異性之蛋白質分析物之肽或蛋白質配位體。用於捕捉人類血清白蛋白之例示性經工程改造肽描述於Ogata等人, 「Virus-enabled biosensor for human serum albumin」, Analytical Chemistry 89(2): 1373-1381 (2017)中，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。用於捕捉前列腺特異性膜抗原之例示性經工程改造肽描述於Arter等人, 「Virus-polymer hybrid nanowires tailored to detect prostate-specific membrane antigen」, Analytical Chemistry 84: 2776-2783 (2012)中，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。用於偵測癌症生物標記物之例示性肽配位體庫描述於Boschetti等人, 「Protein biomarkers for early detection of diseases: The decisive contribution of combinatorial peptide ligand libraries」, Journal of Proteomics 188: 1-14 (2018)中，該文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。
在一些情況下，除偵測不同分析物之外，定量該等分析物之相對或絕對量亦可為有用的。用於解決此種情況之一個例示性方法為併入總可用結合位點之量測。舉例而言，圖6A-6C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於定量分析物濃度之例示性流程。圖6A中所示之實例與圖4A中所繪示之實例類似之處在於可使用一般蛋白質用螢光團612標記蛋白質611且由包括對蛋白質611具有特異性之抗原613及對特定珠粒具有特異性之碼602的感測探針600將其捕捉。抗原613結合蛋白質611使得感測探針600變得經由偶聯至蛋白質611之螢光團612得以螢光標記。另外，各感測探針600包括螢光團614。感測探針600可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式特異性偶聯至珠粒，且來自螢光團612、614之螢光可分別經由成像來加以偵測。來自螢光團614之螢光(表示全部可能的結合位點之信號)指示偶聯至各珠粒之總可用抗體，且來自螢光團612之螢光(表示分析物結合之信號)指示捕捉蛋白質611之抗體。來自螢光團612之螢光可至少使用(例如，除以)來自螢光團614之螢光以計算或估計經捕捉之蛋白質611之相對或絕對量來按比例調整。或可替代地，來自螢光團612之螢光亦可用於幫助在珠粒類型中進行標準化，例如在一個捕捉珠粒碰巧具有較高捕捉效率之情況下如此。
圖6B中所示之實例與圖5A中所繪示之實例類似之處在於可使用一般蛋白質用螢光團612'標記蛋白質611'且由包括對蛋白質611'具有特異性之適體603及對特定珠粒具有特異性之碼602'的感測探針600'將其捕捉。適體603結合蛋白質611'使得感測探針600'變得經由偶聯至蛋白質611'之螢光團612'得以螢光標記。另外，各感測探針600'包括螢光團614'。感測探針600'可以諸如參看圖1A-1C所描述之方式特異性偶聯至珠粒，且來自螢光團612'、614'之螢光可分別經由成像來加以偵測。來自螢光團614'之螢光(表示全部可能的結合位點之信號)指示偶聯至各珠粒之總可用抗體，且來自螢光團612'之螢光(表示分析物結合之信號)指示捕捉蛋白質611'之抗體。來自螢光團612'之螢光可至少使用(例如，除以)來自螢光團614'之螢光以計算或估計經捕捉之蛋白質611'之相對或絕對量來按比例調整。或可替代地，來自螢光團612'之螢光亦可用於幫助在珠粒類型中進行標準化，例如在一個捕捉珠粒碰巧具有較高捕捉效率之情況下如此。
作為分析物之偵測豐度之替代方案或除分析物之偵測豐度之外，分析物之活性可藉由使用分子代替適體或抗體(其辨識視情況呈活性形式及非活性形式之蛋白質上之抗原決定基)來偵測。彼分子可為用於酶之受質模擬物，其中分子在活性位點中結合且形成共價鍵。舉例而言，分子可以諸如Liu等人, 「Activity-based protein profiling: The serine hydrolases」, PNAS 96(26): 14694-14699 (1999)中針對絲胺酸水解酶或Saghatelian等人, 「Activity-based probes for the proteomic profiling of metalloproteases」, PNAS 101(27): 10000-10005 (2004)中針對金屬蛋白酶所描述之方式為天然酶受質之不可水解類似物，該兩個文獻之全部內容以引用之方式併入本文中。因此，儘管酶之活性形式及非活性形式均使用適體/抗體來加以偵測及定量，但僅活性形式可用基於活性之探針來加以偵測。或可替代地，此等探針亦可用於提供用以與適體/抗體或諸如抗生蛋白鏈菌素之分子一起使用之把手。
在一些實例中，可期望複數個感測探針最終偶聯至彼此相同之珠粒，即使彼等感測探針捕捉彼此不同之分析物亦如此。舉例而言，不同核苷酸分析物(SNP，諸如圖2A中之A及G；甲基化，諸如圖2B中之Me-C及C；甲基化，諸如圖2C中之Me-C及C；或RNA剪接同功異型物，諸如圖3B中之外顯子3及外顯子5)可由彼此相同之類型之感測探針捕捉，且可由於分析物之間的差異而與彼此不同地經螢光標記。或，舉例而言，不同非核苷酸分析物可由彼此相同之類型之感測探針捕捉，且可由於分析物之間的差異而與彼此不同地經螢光標記。可使用來自偶聯至給定珠粒之不同螢光團之螢光位準之間的差異以獲得關於已由偶聯至彼珠粒之感測探針捕捉之不同分析物之相對量的定量資訊。舉例而言，信號之相對位準可反映樣品之總體生物學。
在圖6C中所示之實例(感測每個珠粒之複數個螢光團信號強度允許比例量測資料類型之定量)中，給定珠粒經組態以雜交至可捕捉不同分析物之單種類型之感測探針(雜交至捕捉探針之用於單個目標之珠粒)。在圖6C之圖(A)中，由彼珠粒量測來自僅單種類型之螢光團之螢光(例如，「藍色」) (所量測之信號)。對於諸如參看圖2A所描述之對DNA SNP分析之例示性解釋，來自珠粒之100%藍色信號可解釋為意指對於藍色螢光團變得偶聯之處之基因座處之基因型而言，樣品為同型組合的。對於諸如參看圖2B或圖2C所描述之對DNA甲基化分析之例示性解釋，來自珠粒之100%藍色信號可解釋為意指在藍色螢光團變得偶聯之處之基因座處，樣品經100%甲基化。對於諸如參看圖3B所描述之對RNA剪接接點分析之例示性解釋，來自珠粒之100%藍色信號可解釋為意指在藍色螢光團變得偶聯之處之基因座處，樣品含有100%剪接接點1。
相比而言，在圖6C之圖(B)中，由給定珠粒量測來自複數種類型之螢光團之螢光(例如，「紅色」及「藍色」) (所量測之信號)。對於諸如參看圖2A所描述之對DNA SNP分析之例示性解釋，來自珠粒之50%藍色信號及50%紅色信號可解釋為意指對於紅色及藍色螢光團變得偶聯之處之基因座處之基因型而言，樣品為異型組合的。對於諸如參看圖2B或圖2C所描述之對DNA甲基化分析之例示性解釋，來自珠粒之50%藍色信號及50%紅色信號可解釋為意指在藍色及紅色螢光團變得偶聯之處之基因座處，樣品經50%甲基化。對於諸如參看圖3B所描述之對RNA剪接接點分析之例示性解釋，來自珠粒之50%藍色信號及50%紅色信號可解釋為意指在變得與藍色及紅色螢光團偶聯之位置處，樣品含有50%剪接接點1及50%剪接接點2。應瞭解，任何合適之數目及顏色之螢光團可變得偶聯至任何合適之珠粒，只要來自彼等螢光團之各別螢光可與彼此區分開即可，且來自彼等螢光團之螢光之相對位準可用於定量樣品中例如核苷酸分析物或非核苷酸分析物之分析物的相對量。
另外，增加分析物偵測之敏感度可為有益的。舉例而言，與使用包括複數個螢光團之標記相比，使用僅包括單個螢光團之標記偵測相對稀少之分析物可能更具挑戰性。下文參看圖7A-16E進一步提供例示性標記及使具有複數個螢光團之標記偶聯至核苷酸、分析物、感測探針或其他化學實體之例示性方法。 使用複數個螢光團放大分析物之光學偵測
使用螢光標記以偵測諸如核苷酸之分析物之技術可能受信號強度、均勻性及線性動態範圍限制。此等技術包括定序應用，在該等定序應用中低信號強度可能成為問題，特別地在流通槽中之特點尺寸變得較小，引起每個簇之定序模板之數目減少時如此。另一實例為基因分型陣列平台，在該等基因分型陣列平台中每個珠粒之低數目之經捕捉分子之偵測受益於相對於單個螢光標記事件而言的信號增強。對於諸如偵測甲基化、識別複本數變異或量測RNA豐度之某些應用(例如，如上文參看圖2A-3B所描述)，大線性動態範圍可為適用的。其他實例包括諸如單分子定序、空間轉錄體學或多體學之流通槽上應用(例如，如上文參看圖2A-6B所描述)，其中相對高位準之信號放大或相對大動態範圍或兩者可為適用的。本文提供用於使用複數個螢光團以放大分析物之光學偵測之若干種例示性方法。該等方法視情況可結合諸如本文其他地方所描述之基於珠粒之系統及用於光學偵測複數個分析物之方法利用。然而，應瞭解，本發明之用於使用複數個螢光團放大光學偵測之方法不限於此，且合適地可適於使複數個螢光團偶聯至任何所需元件。
圖7A-7D示意性地繪示基於珠粒之系統中用於用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。在一些實例中，圖7A-7D中所繪示之基於珠粒之系統可與參看圖1A-6B所描述之基於珠粒之系統類似。舉例而言，圖7A繪示包括可以諸如參看圖1B所描述之方式包括碼及引子區之受質761及寡核苷酸762的珠粒760。感測探針700可包括有可以諸如參看圖1A或圖2A-6B所描述之方式包括捕捉探針及碼區的寡核苷酸。捕捉探針可例如由於以諸如參看圖1A或圖2A-6B所描述之方式捕捉分析物而偶聯至複數個螢光團712。在圖7A中所繪示之過程710處，感測探針700可以諸如參看圖1B所描述之方式偶聯至珠粒760。複數個螢光團712可放大感測探針700之光學偵測，例如在結合至珠粒760時如此，且因此增強由感測探針捕捉之分析物之偵測。
儘管例如圖7A中所示，螢光團可在寡核苷酸偶聯至珠粒之前偶聯至該等寡核苷酸或其他感測探針，但螢光團亦可在寡核苷酸偶聯至珠粒之後偶聯至該等寡核苷酸。舉例而言，圖7B繪示珠粒760包括受質761及寡核苷酸762，其可以諸如參考圖1B所描述之方式包括碼及引子區。感測探針700'可包括寡核苷酸，其可以諸如參考圖1A或圖2A-6B所描述之方式包括捕捉探針及碼區。捕捉探針可偶聯至部分711，例如由於以諸如參考圖1A或圖2A-6B所描述之方式捕捉分析物之結果。在圖7B中所繪示之過程710'處，感測探針700'可以諸如參考圖1B所描述之方式偶聯至珠粒760。在圖7B中所繪示之過程720處，複數個螢光團712'可偶聯至部分711。複數個螢光團712'可放大感測探針700'之光學偵測，例如在結合至珠粒760時，且因此增強感測探針所捕捉之分析物之偵測。
在其他實例中，螢光團可偶聯至珠粒而非偶聯至寡核苷酸或其他感測探針。舉例而言，圖7C繪示珠粒760包括受質761及寡核苷酸762，其可以諸如參考圖1B所描述之方式包括碼及引子區。感測探針700''可包括寡核苷酸，其可以諸如參考圖1A或圖2A-6B所描述之方式包括捕捉探針及碼區。捕捉探針視情況可以諸如參考圖1A或圖2A-6B所描述之方式偶聯至分析物。在圖7C中所繪示之過程710''處，感測探針700''可以諸如參考圖1B所描述之方式偶聯至珠粒760。在圖7C中所繪示之過程720'處，偶聯至複數個螢光團712''之核苷酸730可偶聯至寡核苷酸762，例如至少使用感測探針700''之寡核苷酸之序列。複數個螢光團712''可放大珠粒760之光學偵測。
儘管例如圖7C中所示，螢光團可在核苷酸偶聯至珠粒之前偶聯至該等核苷酸，但螢光團亦可在核苷酸偶聯至珠粒之後偶聯至該等核苷酸。舉例而言，圖7D繪示珠粒760包括受質761及寡核苷酸762，其可以諸如參考圖1B所描述之方式包括碼及引子區之。感測探針700''可包括寡核苷酸，其可以諸如參考圖1A或圖2A-6B所描述之方式包括捕捉探針及碼區。捕捉探針視情況可以諸如參考圖1A或圖2A-6B所描述之方式偶聯至分析物。在圖7D中所繪示之過程710''處，感測探針700''可以諸如參考圖1B所描述之方式偶聯至珠粒760。在圖7D中所繪示之過程720''處，偶聯至部分711'之核苷酸730'可偶聯至寡核苷酸762，例如至少使用感測探針700''之寡核苷酸之序列。在圖7D中所繪示之過程740處，感測探針700''可與珠粒760解雜交。在圖7D中所繪示之過程750處，複數個螢光團712''可偶聯至部分711'。複數個螢光團712''可放大珠粒760之光學偵測。
應瞭解，在諸如參看圖7A-7D所描述之實例中，任何合適之核苷酸或寡核苷酸可偶聯至複數個螢光團且隨後偶聯至珠粒。另外，寡核苷酸不限於為感測探針且不需要已捕捉分析物。
可使用各種方法中之任一者將複數個螢光團添加至核苷酸、寡核苷酸、感測探針、珠粒或任何其他合適元件中。參看圖8A-16E提供此等方法之實例，但應瞭解，可易於設想其他合適方法。
圖8A-8C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於使用滾環擴增(RCA)以用複數個螢光團標記諸如核苷酸之分析物之例示性方法流程。在圖8A中，偶聯至部分811之核苷酸830以與關於圖7D所描述之方式類似之方式偶聯至珠粒之受質861。部分811可為或包括寡核苷酸引子。持續性聚合酶801經組態以結合寡核苷酸引子及圓形DNA模板802，且經組態以使用RCA、至少使用圓形DNA模板之序列延長引子。舉例而言，在過程810 (滾環擴增)處，RCA至少使用圓形DNA模板802之序列生成經伸長之重複序列803。重複序列可包括可分別偶聯至螢光團之複數個重複部分。該偶聯可對重複部分具有非特異性。舉例而言，如圖8B中所繪示，複數個經螢光標記之DNA嵌入劑可偶聯至經伸長之重複序列803。舉例而言，非特異性嵌入劑之使用可包括用於量測四個不同核苷酸之併入、接著為過量物之洗滌、接著為RCA試劑之添加及生成產物之物之比較的四個孔。可替代地，該偶聯可對重複部分具有特異性。舉例而言，如圖8C中所繪示，各自包括螢光團811'及淬滅劑(Q) 812之複數個寡核苷酸804可雜交至重複部分且可充當分子信標。視情況而言，該等寡核苷酸804可作為髮夾引入，該等髮夾在充分接近序列803之各別部分時展開。應瞭解，任何合適元件可偶聯至例如分析物、感測探針、寡核苷酸、珠粒或除核苷酸以外之其他元件之寡核苷酸引子811以便以使得放大彼元件之光學偵測之方式用複數個螢光團標記該元件。
在諸如參看圖8A-8C所描述之實例中，可藉由提供彼此不同之寡核苷酸引子以及彼此不同之圓形DNA模板而使不同核苷酸803與彼此以光學方式區分開。視特定核苷酸830 (及因此與其偶聯之特定寡核苷酸801)而定，持續性聚合酶801可結合圓形DNA模板802中之一特定者且因此生成基於可獨特地識別之特定核苷酸種類之特定經伸長之重複序列803。舉例而言，對應於不同核苷酸之經伸長之重複序列803可彼此不同之經螢光標記之DNA嵌入劑相互作用，或RCA產物(對模板具有特異性)內可存在螢光核苷酸併入，因此以與參看圖8B所描述之方式類似之方式提供不同螢光標記。或，舉例而言，對應於不同核苷酸之經伸長之重複序列803可彼此不同之寡核苷酸804 (例如，分子信標)相互作用，以與參看圖8C所描述之方式類似之方式提供不同螢光標記。至於關於螢光團與RCA產物之偶聯之另外細節，參見以下參考文獻，該等參考文獻中之各者之全部內容以引用之方式併入本文中：Krieg等人, 「G-quadruplex formation in doubles trand DNA probed by NMM and CV fluorescence」, Nucleic Acids Research 43(16): 7961-7970 (2015)；Li等人, 「Dual functional Phi29 DNA polymerase-triggered exponential rolling circle amplification of target DNA embedded in long-stranded genomic DNA」, Scientific Reports 7: 6263 (2017)；Le等人, 「Direct incorporation and extension of a fluorescent nucleotide through rolling circle DNA amplification for the detection of microRNA 24-3P」, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 28(11): 2035-2038 (2018)；及Ali等人, 「Rolling circle amplification: a versatile tool for chemical biology, materials science and medicine」, Chem. Soc. Rev. 43(10): 3324-41 (2014)。
在再其他實例中，使用雜交鏈反應(HCR)以使複數個螢光團偶聯至諸如核苷酸之分析物。此方法可利用諸如「觸發」寡核苷酸之部分以引發用互補序列進行之介穩髮夾寡核苷酸裝配。此類方法可應用於諸如核苷酸偵測流程之一系列分析物偵測流程。舉例而言，圖9A-9C示意性地繪示用於使用雜交鏈反應(HCR)以用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。
在圖9A中，偶聯至部分911之核苷酸930以與關於圖7D所描述之方式類似之方式偶聯至珠粒之受質961。舉例而言，可使例如感測探針之寡核苷酸900偶聯至珠粒之寡核苷酸962，且可至少使用寡核苷酸900之序列將核苷酸930添加至寡核苷酸962中。部分911可為或包括可稱為「觸發」寡核苷酸之寡核苷酸引子。隨後，可對寡核苷酸900進行解雜交(對目標進行解雜交)且使用一組動力學上穩定之髮夾「A」及「B」執行HCR (雜交鏈反應)，該等髮夾中之任一者或兩者經螢光標記，以藉由形成可顯著地長於圖9A中之建議序列之經伸長序列903來使複數個螢光團偶聯至核苷酸930。舉例而言，核苷酸930可以諸如圖9B中所詳述之方式偶聯至可包括第一觸發序列A'及第二觸發序列B'之觸發寡核苷酸911。可藉由使觸發寡核苷酸911與例如複數個第一寡核苷酸髮夾914及複數個第二寡核苷酸髮夾915之複數個動力學上穩定之髮夾接觸來使複數個螢光團偶聯至核苷酸930。第一寡核苷酸髮夾914中之各者包括第一螢光團912、與第一觸發序列A'互補之單股立足點序列A、與第二觸發序列B'互補之第一莖序列B、暫時雜交至第一莖序列B之第二莖序列B'及安置於第一莖序列B與第二莖序列B'之間的單股環序列C'。第二寡核苷酸髮夾中之各者包括第二螢光團913、與單股環序列C'互補之單股立足點序列C、與第二觸發序列B'互補之第一莖序列B、暫時雜交至第一莖序列B之第二莖序列B'及安置於第一莖序列B與第二莖序列B'之間的單股環序列A'。
如在圖9B中之過程920 (擊中目標路徑立足點雜交)處所繪示，響應於第一寡核苷酸髮夾914中之一者之單股立足點序列A與觸發寡核苷酸911之第一觸發序列A'之雜交，且在過程930 (偏離目標路徑立足點雜交)處，彼第一寡核苷酸髮夾之第二莖序列B'與彼第一寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交。隨後，在股侵入過程940中，第二寡核苷酸髮夾915中之一者之單股立足點序列C雜交至彼第一寡核苷酸髮夾之單股環序列C'；且彼第二寡核苷酸髮夾之第二莖序列B'與彼第二寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交。在後續聚合物生長過程中，以下響應於第一寡核苷酸髮夾914中之另一者之單股立足點序列A與彼第二寡核苷酸髮夾915之單股環序列A'之雜交：彼第一寡核苷酸髮夾914之第二莖序列B'與彼第一寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交；第二寡核苷酸髮夾915中之另一者之單股立足點序列C雜交至彼第一寡核苷酸髮夾之單股環序列；及彼第二寡核苷酸髮夾915之第二莖序列B'與彼第二寡核苷酸髮夾之第一莖序列B解雜交。複數個第一髮夾及第二髮夾914、915可以此方式變得偶聯至觸發寡核苷酸911且因此偶聯至珠粒受質961，該等髮夾中之各者中之一或兩者可包括螢光團。相比而言，在偏離目標路徑過程930處，第一髮夾914之立足點A與第二髮夾915之單股環序列A'之雜交、之後為由觸發核苷酸911引發之第一髮夾莖序列B、B'與彼此之解雜交產生動力學上不利之雜交過程。
在諸如參看圖9A-9B所描述之方法中，信號生成之特異性可部分基於DNA髮夾之動力學穩定性。觸發寡核苷酸與髮夾中之一者之立足點之雜交、接著為股侵入(第一髮夾及第二髮夾之重複添加)產生具有與彼此互補之單股區之雙螺旋體。使用該HCR以使複數個螢光團偶聯至核苷酸(或其他合適元件)之例示性效益為易用性。舉例而言，藉由HCR進行之信號放大可使用包括髮夾序列之混合序列之單一試劑溶液，可在室溫下執行，且不需要諸如定製產生且經共價修飾之抗體之特殊試劑。經螢光標記之髮夾序列可易於獲自複數個商業來源且藉由常規方法產生。另外，HCR為具有聚合酶鏈反應樣敏感度位準之無酶技術。使用該HCR以使複數個螢光團偶聯至核苷酸(或其他合適元件)之另一例示性效益為有限背景。舉例而言，HCR可由具有特異性之單成核點(觸發寡核苷酸)裝配亮複數個螢光團結構，而非特異性結合事件可產生相對於諸如參看圖9A-9B所描述之自裝配結構而言低之背景螢光。此意指相對高之螢光強度可在無顯著背景增加之情況下達成。
使用該HCR以使複數個螢光團偶聯至核苷酸(或其他合適元件)之其他例示性效益為特異性及可調諧性。舉例而言，使用寡核苷酸作為信號生成部分提供易定製性。說明性地，髮夾寡核苷酸之序列可經修飾以增加其動力學穩定性或聚合速率。髮夾寡核苷酸之螢光特性可易於藉由包括廣泛範圍之市售螢光鹼基修飾、諸如生物素或二硝基苯酚之引入親和力把手以用於另外信號生成流程之替代性鹼基修飾或諸如胺或疊氮化物之可用於合成後修飾之反應性位點中的任一者來加以修飾。由於DNA雙螺旋之經界定結構，故此等修飾中之各者之安置為已知的且可用於防止分子間自淬滅或可用於有意地引入相互作用以用於FRET對或經淬滅染料。
使用該HCR以使複數個螢光團偶聯至核苷酸(或其他合適元件)之另一例示性效益為用於經增加或經界定信號生成之策略延伸。舉例而言，HCR之替代性實施方案可用於產生具有相對均勻數目之螢光團之經界定超分子結構。當需要相對定量時，此類方法可為特別適用的。舉例而言，圖9C示意性地繪示用於使用HCR以用複數個螢光團標記諸如核苷酸之分析物之另一例示性方法流程。在圖9C中所示之實例中，觸發寡核苷酸911'包括例如可與髮夾915'之對應序列雜交之結合位點1 901、結合位點2 902、結合位點3 903及結合位點4 904之複數個結合位點。以與參看圖9B所描述之方式類似之方式，寡核苷酸髮夾915'包括螢光團913'、與觸發911'之單股序列A'互補之單股立足點序列A、與觸發911'之單股序列B'互補之第一莖序列B、暫時雜交至第一莖序列B之第二莖序列B'、安置於第一莖序列B與第二莖序列B'之間的單股環序列A' (髮夾立足點結合至觸發A'且觸發B'侵入髮夾主幹)。在觸發911'之結合位點1、2、3或4中之任一者處立足點序列A與單股序列A'之雜交引起觸發單股序列B'之股侵入及與莖序列B之雜交，置換莖序列B'。隨後，此過程在結合位點1、2、3、4中之其他結合位點處重複，形成包括複數個髮夾(髮夾1-4)之層，以及在已雜交至觸發寡核苷酸911'之髮夾處生成三個另外髮夾(髮夾5-7、髮夾8-9及髮夾10)層。
應瞭解，任何合適元件可偶聯至例如分析物、感測探針、寡核苷酸、珠粒或除核苷酸以外之其他元件之用於HCR中之觸發寡核苷酸以便以使得放大彼元件之光學偵測之方式用複數個螢光團標記該元件。說明性地，複數個螢光團可經由HRC經由其偶聯之觸發寡核苷酸可共價偶聯至諸如參看圖4A-5C所描述之蛋白質目標、偵測主體或適體。作為一個非限制性實例，圖10A示意性地繪示用於使用雜交鏈反應(HCR)以用複數個螢光團標記分析物之另一例示性方法流程。舉例而言，以與參看圖4A所描述之方式類似之方式，感測探針1000'可包括特異性捕捉蛋白質1011'之抗原1013'及對特定珠粒具有特異性之碼1002'。然而，蛋白質1011'經可為或包括諸如參看圖9A-9C所描述之觸發寡核苷酸之部分1012'標記，而非蛋白質1011'在由感測探針1000'捕捉之前偶聯至螢光團。另外或可替代地，以與參看圖4B所描述之方式類似之方式，感測探針1000''可包括特異性捕捉蛋白質1011''之抗原1013''及對特定珠粒具有特異性之碼1002''。另外，偶聯至可為或包括諸如參看圖9A-9C所描述之觸發寡核苷酸之部分1012''之抗體1014''可分別偶聯至經結合蛋白質1011''。在過程1020' (雜交鏈反應)處，藉由使複數個經螢光標記之髮夾依序偶聯至觸發寡核苷酸1012'以形成具有可經由其偵測感測探針1000'或蛋白質1011'之複數個螢光團1012'的經伸長序列來執行HCR。類似地，在過程1020'' (雜交鏈反應)處，藉由使複數個經螢光標記之髮夾依序偶聯至觸發寡核苷酸1012''以形成具有可經由其偵測感測探針1000''或蛋白質1011''之複數個螢光團1012''的經伸長序列來執行HCR。過程1020'及1020''視情況可在彼此相同之混合物中進行。
應瞭解，可使用任何合適配位體以使諸如觸發寡核苷酸之部分偶聯至需要與複數個螢光團偶聯之元件。舉例而言，諸如觸發寡核苷酸之部分可經由反應性蛋白質配位體結合至蛋白質。圖10B示意性地繪示可用於圖10A之方法流程中之例示性組分。在圖10B中所示之實例中，部分1012' (HCR觸發)可包括反應性蛋白質配位體1050、連接子1052及信號元件1054。在圖10B中所繪示之一個特定實例中，反應性蛋白質配位體1050'可包括His-Tag、Spytag、麥芽糖結合蛋白(MBP)，連接子1052'可包括各種長度之PEG基團(PEG 4、8、12、24等)或諸如甘胺酸之胺基酸殘基，且信號元件1054'可包括用於信號放大之觸發寡核苷酸(trigger oligonucleotide/oligo trigger)。應瞭解，蛋白質結合可經由諸如以下之經典方法來達成：在蛋白質上之Lys殘基處之醯胺形成、尿素及硫脲形成以及還原性胺化；或經由蛋白質上之Cys殘基進行之雙硫鍵交換、烷基化及與順丁烯二醯亞胺之結合加成。另外，存在更多現代結合方法，諸如可為溶劑可接近Lys殘基提供更快反應動力學之經由Lys殘基進行之6π-氮雜-電環化反應。類似地，諸如觸發寡核苷酸之部分可併入適體中，且視情況可變得可用於響應於目標分析物之結合，此後可使用HCR以使複數個螢光團偶聯至彼觸發寡核苷酸。與所用特定反應化學物質無關，蛋白質、分析物或其他元件可共價偶聯至可經由其偶聯複數個螢光團之部分，提供用於偵測彼元件之光學放大。
在諸如參看圖9A-9C及圖10A-10B所描述之實例中，可藉由提供彼此不同之寡核苷酸目標以及彼此不同之髮夾寡核苷酸來使諸如核苷酸之不同分析物以光學方式與彼此區分開。舉例而言，視例如核苷酸之特定分析物(及因此與其偶聯之特定觸發寡核苷酸)而定，不同經螢光標記之髮夾可與其偶聯，向不同分析物提供不同螢光標記。
在其他例示性方法中，基於珠粒之系統中之信號放大可利用經寡核苷酸引子標記之分析物、核苷酸、珠粒、感測探針或所關注之其他元件，該等寡核苷酸引子可用於以經空間上定義之方式原位合成具有複數個螢光團之標記。舉例而言，信號強度可藉由使寡核苷酸引子雜交至各別擴增模板且以使得複數個螢光團偶聯至引子且因此偶聯至所關注之元件之方式以酶方式延長擴增模板(例如，使用合適聚合酶)來增加。在一些實例中，螢光團之間距及類型可使用擴增模板來加以控制。該受控間距可用於抑制分子內淬滅。該受控類型可用於例如藉由使不同螢光團偶聯至不同擴增模板來使所關注之元件與彼此區分開。另外，在一些實例中，強度量測之精確度可藉由提供預界定可與其偶聯之螢光團之數目的擴增模板來增加。因此，包括複數個螢光團之經伸長標記可由單體組分建構，此舉可增加信號，同時保留與來自經單個螢光團標記之標準ffN之噪音級類似之噪音級(背景)。
在一些實例中，諸如ddNTP或3'-阻斷NTP之核苷酸以諸如下文在工作實例部分中所描述之方式經修飾以包括各別寡核苷酸標記，且此等寡核苷酸標記用作分別與擴增模板雜交之引子。舉例而言，圖11A-11B示意性地繪示用於使用擴增模板以用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。在圖11A中，擴增模板1113雜交至核苷酸1130之寡核苷酸引子1111 (使擴增模板雜交)。核苷酸1130可為諸如圖11A中所指示之ffN，或可偶聯至任何合適元件，例如可併入多核苷酸股之末端中或處，例如偶聯至珠粒或偶聯至感測探針。在過程1110 (延長擴增模板)處，使用擴增模板1113以使得合成包括偶聯至各別螢光團1112之複數個核苷酸之經伸長股1103的方式來延長寡核苷酸引子1111。舉例而言，具有與擴增模板1113雜交之寡核苷酸引子1111之核苷酸1130可與ffN溶液混合，ffN中之一些經單個螢光團標記。舉例而言，於溶液中之一種類型之ffN可經一種類型之螢光團標記，且於溶液中之另一類型之ffN可經另一類型之螢光團標記。當將不同ffN添加至經伸長股1103中時，至少使用擴增模板1113之序列併入經螢光標記之ffN。經伸長股1103之特定序列及因此經伸長股1103中之螢光團之數目、序列、間距及類型可由擴增模板1113之序列界定。不同螢光位準及顏色可藉由調諧擴增模板1113之長度及序列以便影響與其偶聯之經螢光標記之核苷酸之數目、密度及顏色來提供。
應瞭解，需要進行光學偵測之不同核苷酸(或其他元件)可具有彼此不同之寡核苷酸引子1111，且因此可以使得准許使核苷酸或其他元件與彼此以光學方式區分開之方式雜交至可與不同數目及類型之螢光團偶聯的不同擴增模板1113。另外，寡核苷酸引子1111中之一或多者可經選擇性阻斷以便進一步准許使核苷酸(或其他元件)與彼此區分開。舉例而言，在圖11B中，在過程1120 (延長A/G)處，使用雜交至核苷酸A及G之寡核苷酸引子之擴增模板以生成具有相對於彼此而言不同類型之螢光團1114、1115之經伸長股，但在1116、1117處以化學方式阻斷核苷酸T及C之寡核苷酸引子。隨後，可使核苷酸成像以便偵測A及G核苷酸。舉例而言，如上文所指出，可使核苷酸偶聯至諸如珠粒之受質(例如，在過程1120之前或之後)，使珠粒偶聯至表面，且使珠粒成像以偵測來自經伸長股之螢光。因為A及G核苷酸具有彼此不同之螢光團1114、1115，故可以歸因於偶聯至彼等核苷酸中之各者之螢光團之相對大數目的高信賴度使偶聯至A之珠粒與偶聯至G之珠粒以光學方式區分開。
在過程1130處，去阻斷/裂解過程自T及C移除化學阻斷物1116、1117，且亦自偶聯至A及G之經伸長股裂解螢光團1114、1115，同時以其他方式將經伸長股保留在適當位置。在過程1140 (延長T/C)處，使用雜交至核苷酸T及C之寡核苷酸引子之擴增模板以生成具有相對於彼此而言不同類型之螢光團1118、1119 (此等螢光團可與用於標記A及G之螢光團相同或不同)之經伸長股，但在過程1120處預先偶聯至核苷酸A及G之經伸長股抑制螢光團至彼等核苷酸中的任何另外添加。隨後，可使核苷酸成像以便偵測T及C核苷酸。舉例而言，如上文所指出，可使核苷酸偶聯至諸如珠粒之受質(例如，在過程1140之前)，使珠粒偶聯至表面，且使珠粒成像以偵測來自經伸長股之螢光。因為T及C核苷酸具有彼此不同之螢光團1118、1119，偶聯至T之珠粒與偶聯至C之珠粒可以光學方式區分，其高信賴度歸因於相當大數目之螢光團各偶聯至該等核苷酸。因此，可經由諸如1120、1130、1140之過程使用本發明之擴增模板及兩個或更多個不同螢光團使四個不同核苷酸(或其他元件)與彼此以光學方式區分開。可易於設想使用一個螢光團、兩個不同螢光團、三個不同螢光團或四個不同螢光團之其他過程。作為一個實例，可裂解連接子可設置於各核苷酸(或其他元件)與其寡核苷酸引子之間或寡核苷酸引子內以便准許自彼核苷酸進行之整個經伸長股之選擇性裂解代替參看圖11B所描述之螢光團裂解過程1130。
圖11C示意性地繪示用於例如四個鹼基之四個元件鑑別之例示性流程，該流程用複數個螢光團標記元件且使用擴增模板。在圖11C中，使用諸如參看圖11B所描述之過程對不同元件(例如，核苷酸A、T、C及G)進行螢光標記。圖11C中之圖(A)對應於A/T鑑別，圖(B)對應於C/G鑑別，圖(C)對應於A/G鑑別且圖(D)對應於C/G鑑別。A/C及G/T鑑別可至少使用顏色及影像差異來加以確定。舉例而言，諸如G/T之另外SNP可至少使用彼此不同之經著色螢光團(例如，i1-紅色相對於i2-綠色)來進行區分，且C/A亦可至少使用彼此不同之經著色螢光團(例如，i2-紅色相對於i1-綠色)來進行區分。
可使用用於使諸如分析物(例如，核苷酸)之元件與彼此區分開之任何另一合適策略。舉例而言，圖11D-11F示意性地繪示使用擴增模板(amplification template/amp template)用替代性複數個螢光團加以標記之例示性分析物。在圖11D (單個模板上之混合染料)中，可至少使用各別擴增模板之序列將螢光團之不同組合添加至用於不同元件之經伸長股中，准許彼等元件與彼此以光學方式區分開。在圖11E (多級單染料)中，可至少使用各別擴增模板之序列將不同數目之螢光團添加至用於不同元件之經伸長股中，再次准許彼等元件與彼此以光學方式區分開。在圖11F中，經伸長股1103'可包括至少使用擴增模板之序列之不同標記「A」及「B」。隨後，可對模板進行解雜交，響應於哪一經伸長股1103'可形成具有至少使用擴增模板之序列之結構的髮夾1103''。髮夾1103''可使標記A及B彼此充分接近以便產生光學上可偵測之信號。在圖11F中所示之標記選項之各個實例中，標記A可為螢光團且可為髮夾中之唯一螢光團(僅螢光團A)；標記B可為不同螢光團且可為髮夾中之唯一螢光團(僅螢光團B)；標記A及B均可為彼此相同之螢光團(2×螢光團A)；標記A及B均可為不同螢光團、但為彼此相同之螢光團(2×螢光團B)；標記A及B均可在髮夾中且可與彼此不同(螢光團A +螢光團B)；標記A及B均可在髮夾中且可形成FRET對(螢光團A +螢光團B - FRET)；標記A可為螢光團且標記B可為用於彼螢光團之淬滅劑(螢光團A +淬滅劑A)；或標記A可為不同螢光團且標記B可為用於彼螢光團之淬滅劑(螢光團B +淬滅劑B)。
圖11G繪示用於用以使用擴增模板來用複數個螢光團標記分析物之方法流程中之例示性序列。在非限制性、純說明性實例中，寡核苷酸引子(其亦可稱為辨識序列) 1111' (SEQ ID NO: 1)、1111'' (SEQ ID NO: 2)可具有彼此不同之序列且可以諸如本文其他地方所描述之方式偶聯至諸如分析物(例如，核苷酸)之不同各別元件。擴增模板1113'、1113'' (擴增模板+辨識序列之互補序列)亦可具有彼此不同之序列，例如可包括分別與寡核苷酸引子1111'、1111''互補且與其雜交之加下劃線部分。另外，擴增模板1113' (SEQ ID NO: 3)、1113'' (SEQ ID NO: 4)可具有經設計成偶聯至彼此不同之經螢光標記之核苷酸的序列。舉例而言，擴增模板1113'可包括重複序列ATCT，且經螢光標記之T可與A以重複方式偶聯以便提供包括複數個螢光團之經伸長股；而擴增模板1113''可包括重複序列GTCT，且經螢光標記之C可與G以重複方式偶聯以便提供包括與用於至少使用模板1113'之股之螢光團不同的複數個螢光團的經伸長股。
在一些情況下，可能需要提供在較大動態範圍內之可調諧感測增量。舉例而言，對於諸如豐度可變化複數個數量級之偵測分析物，諸如RNA、蛋白質或代謝物之應用，高敏感度光學系統組可經歷具有相對高豐度之目標飽和，而低敏感度光學系統組可不充分地偵測具有相對低豐度之目標。藉由實施如本文所提供之擴增模板雜交及延長之多個循環，可以指數方式且以經定義方式放大信號，使得能夠在較大動態範圍內進行偵測。舉例而言，圖11H示意性地繪示用於使用擴增模板以用複數個螢光團標記核苷酸之替代性例示性方法流程。在圖11H中，在過程1110'處，擴增模板(amplification template/amp template)以諸如參看圖11A所描述之方式雜交至例如分析物，諸如核苷酸(具有視情況選用之間隔子之FFN)的元件的寡核苷酸引子。擴增模板可包括螢光團1101'以提供初始低信號(例如，用於偵測高豐度分析物)，且可使用後續過程添加另外螢光團以偵測愈來愈低豐度分析物。
舉例而言，在圖11H之過程1120' (用寡核苷酸-NTP延長模板)處，至少使用擴增模板之序列延長寡核苷酸引子。然而，在過程1120'期間可併入包括其自身寡核苷酸引子之核苷酸而非併入經螢光標記之核苷酸，生成分支點。在過程1130' (雜交經螢光團修飾之擴增模板)處，另外擴增模板可雜交至此等寡核苷酸引子中之各者。此等擴增模板中之各者可包括螢光團1102'以提供相對於在過程1110'處添加之信號而言增加之信號(例如，用於偵測較低豐度分析物)，且可使用後續過程添加另外螢光團以偵測仍較低豐度分析物。在過程1140' (用寡核苷酸-NTP延長模板)處，例如藉由併入經螢光標記之核苷酸或藉由併入包括其自身寡核苷酸引子之核苷酸，至少使用擴增模板之序列延長寡核苷酸引子以生成另外分支點。另外分支點可進行以下生成：藉由使另外擴增模板(其可經螢光標記)雜交至該等寡核苷酸引子、接著藉由併入經螢光標記之核苷酸或藉由併入包括其自身寡核苷酸引子之核苷酸以生成另外分支點。因此，相對大數目之螢光團可偶聯至例如分析物，諸如核苷酸之元件。圖11I-11J為繪示可使用圖11H之方法流程獲得之例示性放大之圖。在圖11I (具有5個分支點之模板)中，繪示作為循環(重複過程1120'-1140')數目之函數之可藉由使用具有五個分支點之模板提供之放大的例示性量，且在圖11J (具有2個分支點之模板)中，繪示作為循環(重複過程1120'-1140')數目之函數之可藉由使用具有兩個分支點之模板提供之放大的例示性量。
因此，諸如參看圖11A-11J所描述之方法可提供利用寡核苷酸之序列及結構可調諧性以及其高保真度分子內及分子間相互作用的信號放大。由於此等系統之組分之分子純度，故此等方法可達成相對高程度之信號放大，同時生成每個引發事件之類似或一致強度之信號及相對大之強度量測動態範圍。另外，此等方法可提供用於標記元件之相對大數目之螢光團、淬滅劑及FRET對之可能性組合，該等組合可提供多循環併入、接著為可減少SBS中之流體及成像循環數目之掃描。相比而言，預先已知之基於抗體或抗生蛋白鏈菌素之感測方法可具有某一程度之標記效率不均一性，且每個信號放大循環之結合事件數目可能受不良控制。
在再其他實例中，複數個螢光團可偶聯至預形成之單式結構，該預形成之單式結構可偶聯至需要進行光學偵測之元件，例如分析物，諸如核苷酸。在一些實例中，複數個螢光團設置於「DNA摺紙」中，該「DNA摺紙」係指具有亦可稱為超分子結構之預期三級結構之DNA。圖12示意性地繪示用於使用DNA摺紙以用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。DNA摺紙可藉由混合可稱為「模板」之單個長DNA分子1270與可稱為「訂書針」或「訂書針股(staple strand)」之短互補序列1281來建構。各訂書針可結合至長DNA分子內之特異性區域且將長DNA分子拉成所需形狀1290，以上為圖12中所繪示過程(黏合)之非限制性實例。各訂書針可具有獨特序列且可最終在最終三級結構1290中之明確界定位置中。因為每一訂書針視情況且獨立地可經個別地功能化，故此種情況允許在三級結構1290上準確地置放諸如螢光團1282之特異性功能元件。三級結構1290可包括化學上可定址把手1271，該化學上可定址把手可偶聯至需要進行光學偵測之元件，例如分析物，諸如核苷酸。相對大之DNA摺紙結構可由複數個較小DNA摺紙結構形成。至於關於DNA摺紙設計及製備之另外細節，參見以下參考文獻，該參考文獻之全部內容以引用之方式併入本文中：Wang等人, 「The Beauty and Utility of DNA Origami」, Chem 2: 359-382 (2017)。
在一些實例中，藉由諸如銅(I)催化之點擊反應(在疊氮化物與炔烴之間)、應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(在疊氮化物與DBCO (二苯并環辛炔)之間)或寡核苷酸與互補寡核苷酸之雜交的雙正交結合化學反應使DNA摺紙1290經由化學上可定址把手1271直接偶聯至例如分析物，諸如ffN之元件。彼元件可以諸如圖7A或圖7C中所繪示之方式偶聯至諸如珠粒之受質。在其他實例中，使用二級標記流程使DNA摺紙1290偶聯至元件。舉例而言，核苷酸可併入多核苷酸(諸如偶聯至珠粒或形成感測探針之一部分之寡核苷酸)中，且隨後DNA摺紙例如以諸如圖7B或圖7D中所繪示之方式偶聯至彼核苷酸。在其中在將核苷酸併入多核苷酸中之前偶聯DNA摺紙與核苷酸可例如經由立體效應來抑制該併入之情形下，此類佈置可為適用的。在各個實例中，使用任何合適之蛋白質、標籤或諸如生物素-抗生蛋白鏈菌素、NTA-His-Tag、Spytag-Spycatcher之其他特異性相互作用或寡核苷酸與互補寡核苷酸之雜交使DNA摺紙1290經由化學上可定址把手1271偶聯至已併入之核苷酸。諸如不同核苷酸之元件之間的區分可藉由以與參看圖11A-11F所描述之方式類似之方式使可具有彼此不同之數目、類型或組合之螢光團的不同DNA摺紙選擇性偶聯至該等元件來達成。
應瞭解，DNA摺紙可出於各種原因而適用於信號放大。舉例而言，DNA摺紙可相對易於使用。更具體言之，DNA摺紙可經預裝配且可易於定製以改變超分子尺寸、螢光團身分以及螢光團之位置及數目。作為另一實例，DNA摺紙可提供相對高之信號均勻性。由於DNA摺紙之經界定結構，故螢光團之安置可受控制且因此可用於最小化分子內自淬滅或可用於促進FRET相互作用。DNA摺紙之受控裝配可在使用之間提供相對高之信號均勻性及可再現強度。另外，DNA摺紙可提供特異性及可調諧性。舉例而言，DNA摺紙之螢光特性可經由廣泛範圍之市售螢光團加以修改，且諸如胺、疊氮化物、TCO、四𠯤、DBCO、親和力把手(諸如生物素)或寡核苷酸之單一化學上可定址把手可易於在DNA骨架合成期間引入。
如本文其他地方所指出，增加諸如用於定序之基於螢光之系統中之總體信號位準可為有用的。舉例而言，當用於在簇上執行定序之奈米孔之尺寸減小時，該等簇中之股之數目亦如此。信號之量可藉由使用相對高強度雷射以誘導更大螢光來增加。然而，來自該等雷射之能量可能會損傷DNA。本文所提供之實例可併有減少DNA損傷且可增加螢光、同時潛在地簡化經螢光標記之核苷酸至多核苷酸中之併入的特點。因此，可獲得經改善之定序品質及經改善之ffN合成模組性。
在一些實例中，核苷酸可以與參看圖7D、圖8A、圖9A及圖11A所描述之方式類似之方式經寡核苷酸標記。寡核苷酸自身可包括複數個螢光團。舉例而言，圖13A示意性地繪示用於將經具有複數個螢光團之髮夾標記之DNA分析物併入多核苷酸中之例示性方法流程。ffN (例如，ffC) 1303可經由視情況選用之連接子1304偶聯至寡核苷酸髮夾1311。髮夾1311 (經標記髮夾(DNA或PNA或LNA))可包括複數個螢光團(染料) 1312及視情況選用之諸如除氧劑(自由基清除劑)之一或多個另外部分1313。視情況選用之連接子1304可用於增加ffN 1303與髮夾1311之間的距離，例如可為30聚體或更大聚體。可在獨立反應中將螢光團1312添加至髮夾1311中，且隨後偶聯至連接子1304。PNA或LNA可用作髮夾1311中之DNA替代物以例如更改穩定性及併入特性。在過程1310處，至少使用第二寡核苷酸1351之序列將偶聯至經多重地螢光標記之髮夾1311之ffN 1303併入第一寡核苷酸1350中。第二寡核苷酸1351可偶聯至可位於流通槽中之諸如珠粒之受質，或另外位於流通槽中。因此，複數個螢光團1312變得偶聯至受質。
在其他實例中，與核苷酸偶聯(例如，以與參看圖7D、圖8A、圖9A及圖11A所描述之方式類似之方式)之寡核苷酸未經螢光標記，但可在將核苷酸併入多核苷酸中之後經螢光標記。舉例而言，圖13B示意性地繪示用於將偶聯至第一寡核苷酸之DNA分析物併入多核苷酸中、接著使第一寡核苷酸雜交至具有複數個螢光團之第二寡核苷酸之例示性方法流程。在圖13B中，ffN (例如，ffC) 1303'可經由視情況選用之連接子1304偶聯至未經標記寡核苷酸1311' (未經標記DNA寡核苷酸)。視情況選用之連接子1304可用於增加ffN 1303'與寡核苷酸1311'之間的距離，例如可為30聚體或更大聚體。在過程1310'處，至少使用第二寡核苷酸1351'之序列將偶聯至寡核苷酸1311'之ffN 1303'併入第一寡核苷酸1350'中。第二寡核苷酸1351'可偶聯至可位於流通槽中之諸如珠粒之受質，或另外位於流通槽中。在過程1320'處，經複數個螢光團1312'標記之寡核苷酸1311''可與寡核苷酸1311'雜交以便使彼等螢光團偶聯至ffN 1303'且偶聯至受質。視情況而言，寡核苷酸1311''可以諸如參看圖13A所描述之方式包括諸如除氧劑之一或多個另外部分。諸如圖13B中所繪示之模組方法可提供螢光團及其位置易改性及光學特性。在一個特定實施方案中，圖13B中所繪示之流程可經修改以使用雜二聚體蛋白質雙重螺旋體(coiled-coil)模體而非DNA寡核苷酸。舉例而言，在圖13B中所繪示之組態中，寡核苷酸1311'可經第一雙重螺旋體置換，且寡核苷酸1311''可經包括複數個螢光團1312'及視情況選用之諸如除氧劑之一或多個另外部分之第二雙重螺旋體置換。第二雙重螺旋體可與第一雙重螺旋體相互作用以便使複數個螢光團偶聯至DNA分析物。至於關於雙重螺旋體及其與彼此之相互作用之另外細節，參見Thomas等人, 「A set of de novo designed parallel heterodimeric coiled coils with quantified dissociation constants in the micromolar to sub-nanomolar regime」, J. Am. Chem. Soc. 135(13): 5161-5166 (2013)，及Crick,「The packing of α-helices: Simple coiled-coils」, Acta Cryst. 6: 689-697 (1953)。
應瞭解，諸如參看圖13A-13B所描述之ffN設計可由於每個ffN之螢光團數目增加而提供信號放大。商業寡核苷酸合成經良好確立且適合於在寡核苷酸內在特定位置處且以特定數量安裝經螢光修飾之鹼基。不同寡核苷酸或髮夾長度之選擇可控制螢光團之間的距離以便進一步增強ffN偵測。
另外，可期望諸如參看圖13A-13B所描述之ffN設計減少或抑制雷射誘發之DNA損傷。舉例而言，雷射誘發之DNA損傷可能歸因於攻擊近端DNA之局部生成之自由基物種。經延長連接子1304、1304'及經標記寡核苷酸1311、1311''之使用可增加DNA與最有可能生成自由基之位點之間的距離。繼而，此距離增加可減少或抑制自由基物種到達且損壞受質表面上之DNA。另外，可期望髮夾寡核苷酸1311或經雜交寡核苷酸1311''充當自由基物種之屏蔽物或清除劑，抑制此等自由基到達受質表面上之DNA。可將諸如除氧(自由基)基團(例如，COT (環辛四烯)或甲基紫精)之另外官能基併入髮夾寡核苷酸1311或經雜交寡核苷酸1311''中以進一步抑制DNA損傷。應瞭解，可將該等除氧或自由基基團併入本文所描述之任何其他合適元件中。
因此，應瞭解，本文提供廣泛多種之用於使複數個螢光團偶聯至元件之方法，經由該等方法可放大彼元件之光學偵測。舉例而言，圖14示意性地繪示用於使用至少複數個螢光團偵測分析物之例示性方法流程1400。圖14中所繪示之方法流程1400包括使元件偶聯至受質(過程1402)。元件可包括諸如核苷酸分析物(諸如SNP、甲基化核苷酸或RNA)或非核苷酸分析物(諸如蛋白質或代謝物)之分析物，或可包括感測探針、核苷酸或任何其他合適元件。可藉由使元件偶聯至受質形成之例示性結構係參看圖7A-7D加以描述。在一些實例中，諸如參看圖1A-6B所描述，分析物可偶聯至感測探針，且分析物可經由感測探針偶聯至受質。在其他實例中，諸如參看圖8A-8C及圖9A所描述，分析物可偶聯至寡核苷酸，該寡核苷酸偶聯至受質。例示性受質為在過程1402之前或之後可在溶液中自由浮動或可固定於流通槽中之珠粒。
圖14中所繪示之方法流程1400包括使複數個螢光團偶聯至元件(過程1404)。在一些實例中，複數個螢光團可經由感測探針偶聯至元件。說明性地，複數個螢光團可偶聯至感測探針，此係基於彼感測探針已例如以諸如參看圖10A所描述之方式捕捉彼元件來進行。在其他實例中，複數個螢光團可經由受質偶聯至元件。說明性地，複數個螢光團可偶聯至與受質偶聯之寡核苷酸，此係基於彼受質已例如以諸如參看圖8A-8C及圖9A所描述之方式偶聯至彼元件來進行。
例如如參看圖7A及圖7C所描述，在元件偶聯至受質之前，複數個螢光團可偶聯至元件。可替代地，例如如參看圖7B及圖7D所描述，在元件偶聯至受質之後，複數個螢光團可偶聯至元件。
圖14中所繪示之方法流程1400進一步包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測元件(過程1406)。複數個螢光團提供相較於單個螢光團而言增強之螢光。
本申請案通篇提供執行過程1404之實例。舉例而言，可以諸如參看圖8A-8C所描述之方式使用滾環擴增使複數個螢光團偶聯至元件。滾環擴增可生成經伸長之重複序列，且複數個螢光團可偶聯至彼序列之各別重複部分。螢光團可以諸如參看圖8B所描述之方式偶聯至與經伸長之重複序列偶聯之DNA嵌入劑。可替代地，寡核苷酸可包括以諸如參看圖8C所描述之方式雜交至重複部分之螢光團及淬滅劑。
可替代地，元件可以諸如參看圖9A-9C或圖10A-10B所描述之方式偶聯至複數個經螢光標記之髮夾自裝配至之觸發寡核苷酸。以諸如參看圖9A-9C或圖10A-10B所描述之方式，觸發寡核苷酸及髮夾可具有序列且可與彼此相互作用。
在其他實例中，以諸如參看圖11A-11J所描述之方式，元件可偶聯至寡核苷酸引子，且使複數個螢光團偶聯至元件可包括使擴增模板雜交至寡核苷酸引子；及至少使用擴增模板，用複數個經螢光標記之核苷酸延長寡核苷酸引子以生成包括複數個螢光團之經延長股。視情況而言，例如如參看圖11D所描述，螢光團中之至少一者與螢光團中之至少另一者不同。例如如參看圖11F所描述，該方法可進一步包括對擴增模板進行解雜交且使經延長股成形為髮夾結構。
在再其他實例中，以諸如參看圖11H-11J所描述之方式，元件可偶聯至寡核苷酸引子，且使複數個螢光團偶聯至元件可包括使擴增模板雜交至寡核苷酸引子；至少使用擴增模板，用分別偶聯至另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長寡核苷酸引子；使另外擴增模板雜交至另外核苷酸引子；及至少使用另外擴增模板，用分別偶聯至螢光團或分別偶聯至其他另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長另外核苷酸引子。該方法視情況進一步包括以諸如參看圖11H-11J所描述之方式使其他另外擴增模板雜交至另外的核苷酸引子；及至少使用另外擴增模板，用分別偶聯至螢光團或分別偶聯至其他另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長另外核苷酸引子。
在又其他實例中，例如如參看圖12所描述，元件偶聯至包括複數個螢光團之DNA摺紙。視情況而言，DNA摺紙可包括不同螢光團之組合。在一些實例中，元件可經由以下偶聯至DNA摺紙：銅(I)催化之點擊反應、應變促進之疊氮化物-炔烴環加成、寡核苷酸與互補寡核苷酸之雜交、生物素-抗生蛋白鏈菌素相互作用、NTA-His-Tag相互作用或Spytag-Spycatcher相互作用。
在再另外實例中，元件以諸如參看圖13A-13B所描述之方式偶聯至寡核苷酸，其中寡核苷酸包括複數個螢光團。視情況而言，寡核苷酸進一步包括自由基清除劑。例如如參看圖13A所描述，寡核苷酸可包括髮夾。可替代地，例如如參看圖13B所描述，元件可直接偶聯至第一寡核苷酸，且第一寡核苷酸可雜交至包括複數個螢光團之第二寡核苷酸。
儘管本發明方法可用於用複數個螢光團標記任何合適元件以便放大元件之光學偵測，但特別適用於用複數個螢光團進行標記之例示性元件為核苷酸。圖15A-15C示意性地繪示用於使用至少複數個螢光團偵測核苷酸之例示性方法流程。圖15A中所繪示之例示性方法流程1500包括使用第二多核苷酸之至少一序列將核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸包括第一部分(過程1502)。本文其他地方描述例示性部分。圖15A中所繪示之方法流程1500包括藉由使第一部分與標記之第二部分反應而使標記偶聯至所添加之核苷酸，其中標記包括複數個螢光團(過程1502)。圖15A中所繪示之方法流程1500包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測所添加之核苷酸(過程1504)。可使用過程1502-1506形成之元件之特定佈置之非限制性實例係參看圖7D、圖12及圖13B來提供。
圖15B中所繪示之例示性方法流程1510包括使用第二多核苷酸之至少一序列將核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸偶聯至包括複數個螢光團之標記(過程1512)。方法流程1510亦包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測所添加之核苷酸(過程1514)。可使用過程1512-1514形成之元件之特定佈置之非限制性實例係參看圖7C及圖13A來提供。
圖15B中所繪示之例示性方法流程1530包括使用第二多核苷酸之至少一序列將核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸包括第一部分(過程1522)。方法流程1530亦包括藉由使第一部分與標記之第二部分反應而使標記偶聯至所添加之核苷酸(過程1524)。方法流程1530亦包括使複數個螢光團偶聯至經偶聯標記(過程1526)。方法流程1530亦包括至少使用來自複數個螢光團之螢光偵測所添加之核苷酸(過程1528)。可使用過程1522-1528形成之元件之特定佈置之非限制性實例係參看圖8A-8C、圖9A-9C、圖10A-10B及圖11A-11J來提供。 非限制性工作實例
以下實例為純說明性的且不意欲為限制性的。
雜交鏈反應(HCR)係用於放大基於珠粒之基因分型中之光信號，例如在該基於珠粒之基因分型中所關注之分析物為SNP。如下文所描述，發現在無任何對應背景增加之情況下視樣品輸入而定，HCR增加信號8-30倍，且發現相同策略對標準全基因體放大DNA樣品及1萬重珠粒池上之四個獨特觸發序列及髮夾對起作用。
為在Illumina流通槽上使用SBS聚合酶實施HCR，使用下文所示之反應流程1及2合成經30聚體觸發寡核苷酸修飾之ddNTP：反應流程 1 — 經 30 聚體觸發寡核苷酸修飾之 ddCTP ：
Figure 02_image001
反應流程 2 — 經 30 聚體觸發寡核苷酸修飾之 ddCTP ：
Figure 02_image003
各ddNTP-寡核苷酸結合物係藉由將DBCO-寡核苷酸(1 eq，5 mM)水溶液添加至含ddNTP-PEG4-疊氮化物(1 eq，5 mM)之2× PBS (pH 7.4)中且在室溫下攪拌4小時來製備。將反應混合物在逆相C18上純化且用乙腈與50 mM TEAA緩衝液(pH 7.4)之混合物溶離。用LCMS確認產物身分。為純實例且不應解釋為具有限制性之觸發寡核苷酸之序列示於表1中。亦應瞭解，DBCO-疊氮化物點擊反應之使用僅為可用於使觸發寡核苷酸偶聯至核苷酸、分析物或其他元件之反應之一個實例。表 1 - 用於 ddNTP 之 寡核苷酸序列
ddNTP 寡核苷酸序列 SEQ ID NO:
A AAAGTCTAATCCGTCCCTGCCTCTATATCTCCACTC 5
U GCATTCTTTCTTGAGGAGGGCAGCAAACGGGAAGAG 6
C CACTTCATATCACTCACTCCCAATCTCTATCTACCC 7
G CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC 8
經確認，SBS聚合酶能夠在37℃下在pH為9.9之1×乙醇胺、0.02% CHAPS、9 mM MgSO4 、1 μM聚合酶、200 nM P/T及10 μM dNTP/ddNTP之溶液中將經修飾ddNTP併入多核苷酸中，用經修飾ddNTP延長引子，達5分鐘培育期。舉例而言，圖16F為顯示以SBS聚合酶之兩個變異體所期望之尺寸進行之引子之單鹼基延長(ddNTP-DNA第1鹼基)的凝膠影像。圖16G為繪示經由凝膠密度測定法計算之ddNTP之轉換百分比與其天然對應體之轉換百分比類似的圖。
在利用與參看圖1B所描述之具有寡核苷酸之珠粒類似之具有寡核苷酸之珠粒的基因分型分析中採用經修飾ddNTP作為初始概念驗證。測試裝載至流通槽中之332個不同珠粒類型之池。各珠粒之寡核苷酸包括可使用SBS化學物質以識別珠粒來解碼之碼、用於移動碼充分地遠離珠粒表面以避免立體問題之間隔子區、引子結合位點及經設計成捕捉DNA分析物之捕捉探針。更具體言之，DNA分析物為其中用ffN進行之捕捉探針之單鹼基延長以與參看圖2A所描述之方式類似之方式識別SNP的序列。然而，此處不使用獨立感測探針，且因此以諸如參看圖7D所描述之方式執行單鹼基延長。在第一組實驗中，用經單個螢光團標記之核苷酸，更具體言之，經單個綠色螢光團標記之ffG及經一紅色螢光團標記之ffC執行單鹼基延長，且量測來自各別珠粒之螢光。在第二組實驗中，用經修飾ddNTP，更具體言之，具有第一觸發寡核苷酸「A」之ddUTP及具有第二觸發寡核苷酸「B」之ddCTP執行單鹼基延長。使用四個不同髮夾之HCR —用於添加至觸發寡核苷酸A中且經紅色螢光團標記之一組A1及A2及用於添加至觸發寡核苷酸B中且經綠色螢光團標記之一組B1及B2，且量測來自各別珠粒之螢光。圖16A (單核苷酸延長之直接偵測)為繪示來自分別經單個螢光團標記之DNA分析物之所量測紅色螢光及綠色螢光的圖(平均值(A)相對於平均值(G))，且圖16B (雜交鏈反應)為繪示來自使用HCR分別用複數個螢光團加以標記之DNA分析物之所量測紅色螢光及綠色螢光的圖(平均值(A)相對於平均值(G))。各點為實驗中所包括之332個不同珠粒類型中之一者之平均強度。比較圖16A與圖16B表明，與單個螢光團併入相比，HCR提供平均8倍之強度增加。
在另一組實驗中，使珠粒雜交至DNA分析物且在定序器上進行基因分型。更具體言之，圖16C示意性地繪示用於使用HCR分別用複數個螢光團標記複數個DNA分析物之例示性方法流程。在過程1610處將片段化全基因體放大(WGA) DNA樣品在溶液中與1萬重珠粒池混合，引起樣品雜交至珠粒。隨後，在過程1620處將珠粒裝載至流通槽中，且藉由單鹼基，更具體言之，經單個綠色螢光團標記之ffG、經一紅色螢光團標記之ffA、經第一觸發寡核苷酸「A」標記之ddUTP及具有第二觸發寡核苷酸「B」之ddCTP延長探針。每個各NTP提供一個辨識序列。在過程1640處使用四個不同髮夾執行HCR -用於添加至觸發寡核苷酸A中且經紅色螢光團標記之一組A1及A2及用於添加至觸發寡核苷酸B中且經綠色螢光團標記之一組B1及B2，且量測來自各別珠粒之螢光。在過程1650處在Illumina HiSeq機器上掃描珠粒，且在操作1660處解碼珠粒。圖16D-16E為繪示至少使用來自使用HCR分別用複數個螢光團加以標記之DNA分析物之所量測螢光執行之基因分型的圖。各點為來自單個珠粒類型之紅色及綠色通道中之平均信號強度。對於所併入之各核苷酸，使用不同觸發及一組髮夾以生成信號。根據圖16D-16E可理解，對於大部分珠粒類型，維持恰當之基因分型辨認，同時增加信號及信號/背景約8倍。
因此，可理解，複數個螢光團之使用可顯著地增加獲自經標記元件之信號。應瞭解，複數個螢光團可合適地偶聯至包括但不限於諸如本文所描述之元件之任何元件。 其他實例
儘管上文描述各種說明性實例，但熟習此項技術者應顯而易知，可在不背離本發明之情況下於其中作出各種改變及修改。所附申請專利範圍意欲覆蓋落入本發明之真實精神及範疇內之全部該等改變及修改。
100:感測探針 101:捕捉探針 102:碼/寡核苷酸 110:實例/感測探針 111:特異性DNA序列 112:螢光團 120:實例 121:核苷酸分析物 130:實例 131:核苷酸分析物 140:實例 141:蛋白質 143:抗體 150:實例 151:代謝物 160:珠粒 161:受質 162:碼/寡核苷酸/引子 163:引子/引子區 164:引子 170:過程 180:過程 200:感測探針 200':感測探針 200'':感測探針 201:捕捉探針 201':捕捉探針 201'':捕捉探針 202:碼 202'':碼 210:過程 210'':過程 211:DNA分析物 211':DNA分析物 214:序列 220:過程 220':過程 221:DNA分析物 221':DNA分析物 222:ffN 222':ffN 224:序列 225:過程 231:DNA分析物 231':DNA分析物 232:ffN/經螢光標記之抗體 232':經螢光標記之抗體 234:序列 235:過程 236:過程 237:過程 300:感測探針 300':感測探針 301':捕捉探針 301'':捕捉探針 302:碼 302':碼 302'':碼 310:過程 310':過程 311:RNA分析物 311':RNA分析物 314:序列 314':序列 320:過程 320':過程 321:RNA分析物 321':RNA分析物 324:剪接同功異型物 324':剪接同功異型物 400:感測探針 400':感測探針 402:碼 402':碼 410:過程 410':過程 411:蛋白質 411':蛋白質 412:螢光團 413':抗原 420:過程 420':過程 421:蛋白質/經結合蛋白質 421':蛋白質/經結合蛋白質 423:抗原 423':抗原 424:抗體 424':抗體 430:感測探針 430':感測探針 432:碼 432':碼 442:螢光團 500:感測探針 500':感測探針 502:碼 502':碼 503:適體 503':適體 503'':適體 504:鍵 504':鍵 510:過程 511:蛋白質/給定蛋白質 511':蛋白質或代謝物 511'':蛋白質或代謝物 512:螢光團 512':螢光團 512'':螢光團 520:過程 520':過程 520'':過程 521:過程 560:部分 561:部分 600:感測探針 600':感測探針 602:碼 603:適體 611:蛋白質 612:螢光團 612':螢光團 613:抗原 614:螢光團 614':螢光團 700:感測探針 700':感測探針 700'':感測探針 710:過程 710':過程 710'':過程 711:部分 711':部分 712:螢光團 712':螢光團 712'':螢光團 720:過程 720':過程 720'':過程 730:核苷酸 730':核苷酸 740:過程 750:過程 760:珠粒 761:受質 762:寡核苷酸 801:持續性聚合酶 802:圓形DNA模板 803:經伸長之重複序列/序列/核苷酸 804:寡核苷酸 810:過程 811:部分/寡核苷酸引子 811':螢光團 812:淬滅劑 830:核苷酸 861:受質 900:寡核苷酸 901:結合位點1 902:結合位點2 903:結合位點3/經伸長序列 904:結合位點4 911:部分/觸發寡核苷酸/觸發核苷酸 911':觸發寡核苷酸/觸發 912:第一螢光團 913:第二螢光團 913':螢光團 914:第一寡核苷酸髮夾/第一髮夾 915:第二寡核苷酸髮夾/第二髮夾 915':髮夾/寡核苷酸髮夾 920:過程 930:核苷酸/過程/偏離目標路徑過程 940:股侵入過程 961:受質/珠粒受質 962:寡核苷酸 1000:方法流程 1000':感測探針 1000'':感測探針 1002:過程 1002':碼 1004:過程 1006:過程 1008:過程 1010:過程 1011':蛋白質 1011'':蛋白質/經結合蛋白質 1012:過程 1012':部分/觸發寡核苷酸/螢光團 1012'':部分/觸發寡核苷酸/螢光團 1013':抗原 1014:過程 1014'':抗體 1020':過程 1020'':過程 1050:反應性蛋白質配位體 1050':反應性蛋白質配位體 1052:連接子 1052':連接子 1054:信號元件 1054':信號元件 1101':螢光團 1102':螢光團 1103:經伸長股 1103':經伸長股 1103'':髮夾 1110:過程 1110':過程 1111:寡核苷酸引子 1111':寡核苷酸引子 1111'':寡核苷酸引子 1112:螢光團 1113:擴增模板 1113':擴增模板 1113'':擴增模板 1114:螢光團 1115:螢光團 1116:化學阻斷物 1117:化學阻斷物 1118:螢光團 1119:螢光團 1120:過程 1120':過程 1130:核苷酸/過程/螢光團裂解過程 1130':過程 1140:過程 1140':過程 1270:單個長DNA分子 1271:化學上可定址把手 1281:短互補序列 1282:螢光團 1290:所需形狀/最終三級結構/三級結構/DNA摺紙 1303:ffN 1303':ffN 1304:視情況選用之連接子/連接子/經延長連接子 1304':經延長連接子 1310:過程 1310':過程 1311:寡核苷酸髮夾/髮夾/經標記寡核苷酸/髮夾寡核苷酸 1311':未經標記寡核苷酸/寡核苷酸 1312:螢光團(染料) 1312':螢光團 1313:另外部分 1320':過程 1350:第一寡核苷酸 1350':第一寡核苷酸 1351:第二寡核苷酸 1351':第二寡核苷酸 1400:方法流程 1402:過程 1404:過程 1406:過程 1500:方法流程 1502:過程 1504:過程 1506:過程 1510:方法流程 1512:過程 1514:過程 1522:過程 1524:過程 1526:過程 1528:過程 1610:過程 1620:過程 1640:過程 1650:過程 1660:操作
圖1A-1B示意性地繪示用於光學偵測複數個分析物之基於珠粒之系統之例示性組分。
圖1C繪示基於珠粒之系統中用於偵測複數個分析物之例示性方法流程。
圖2A-2C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於光學偵測DNA分析物之例示性基於雜交之方法流程。
圖2D描繪用於識別目標核酸之實例，該實例包括目標特異性探針與含有單核苷酸多型性(SNP)之目標基因體DNA片段之雜交、用具有3'螢光團之經修飾核苷酸進行之經雜交探針之單鹼基延長、未經延長探針及基因體DNA之酶降解及經延長探針與固定在經解碼之捕捉探針陣列中之珠粒上之捕捉探針之雜交。
圖2E描繪用於識別目標核酸之實例，該實例包括藉由執行複數個探針雜交及延長循環進行之線性信號放大。
圖2F描繪非延長目標特異性探針及基因體DNA之酶降解之實例，該等實例包括核酸外切酶I、克列諾I片段及核酸外切酶III之用途。
圖3A-3B示意性地繪示基於珠粒之系統中用於光學偵測RNA分析物之例示性基於雜交之方法流程。
圖4A-4B示意性地繪示基於珠粒之系統中用於光學偵測蛋白質分析物之例示性基於抗體之方法流程。
圖5A-5C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於光學偵測蛋白質或代謝物分析物之例示性基於適體之方法流程。
圖6A-6C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於光學定量分析物濃度之例示性流程。
圖7A-7D示意性地繪示基於珠粒之系統中用於用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。
圖8A-8C示意性地繪示基於珠粒之系統中用於使用滾環擴增(RCA)以用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。
圖9A-9C示意性地繪示用於使用雜交鏈反應(HCR)以用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。
圖10A示意性地繪示用於使用雜交鏈反應(HCR)以用複數個螢光團標記分析物之另一例示性方法流程。
圖10B示意性地繪示可用於圖10A之方法流程中之例示性組分。
圖11A-11B示意性地繪示用於使用擴增模板以用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。
圖11C示意性地繪示用於四個分析物鑑別之例示性流程，該流程用複數個螢光團標記元件且使用擴增模板。
圖11D-11F示意性地繪示使用擴增模板用替代性複數個螢光團加以標記之例示性分析物。
圖11G繪示用於用以使用擴增模板來用複數個螢光團標記分析物之方法流程中之例示性序列。
圖11H示意性地繪示用於使用擴增模板以用複數個螢光團標記核苷酸之替代性例示性方法流程。
圖11I-11J為繪示可使用圖11H之方法流程獲得之例示性放大之圖。
圖12示意性地繪示用於使用DNA摺紙以用複數個螢光團標記分析物之例示性方法流程。
圖13A示意性地繪示用於將經具有複數個螢光團之髮夾標記之DNA分析物併入多核苷酸中之例示性方法流程。
圖13B示意性地繪示用於將偶聯至第一寡核苷酸之DNA分析物併入多核苷酸中、接著使第一寡核苷酸雜交至具有複數個螢光團之第二寡核苷酸之例示性方法流程。
圖14繪示用於使用至少複數個螢光團偵測分析物之例示性方法流程。
圖15A-15C示意性地繪示用於使用至少複數個螢光團偵測核苷酸之例示性方法流程。
圖16A為繪示來自分別經單個螢光團標記之DNA分析物之所量測螢光之圖。
圖16B為繪示來自使用HCR分別用複數個螢光團加以標記之DNA分析物之所量測螢光之圖。
圖16C示意性地繪示用於使用HCR分別用複數個螢光團標記複數個DNA分析物之例示性方法流程。
圖16D-16E為繪示至少使用來自使用HCR分別用複數個螢光團加以標記之DNA分析物之所量測螢光執行之基因分型的圖。
圖16F為顯示以SBS聚合酶之變異體所期望之尺寸進行之引子之單鹼基延長(ddNTP-DNA第1鹼基)的凝膠影像。
圖16G為繪示經由凝膠密度測定法計算之ddNTP之轉換百分比與其天然對應體之轉換百分比類似的圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
100:感測探針
101:捕捉探針
102:碼/寡核苷酸
110:實例/感測探針
111:特異性DNA序列
112:螢光團
120:實例
121:核苷酸分析物
130:實例
131:核苷酸分析物
140:實例
141:蛋白質
143:抗體
150:實例
151:代謝物

Claims (113)

  1. 一種用於偵測不同分析物之方法，該方法包含： 混合不同分析物與感測探針，其中至少一些感測探針對各別分析物具有特異性； 分別由對分析物具有特異性之感測探針捕捉該等分析物； 使螢光團分別偶聯至捕捉各別分析物之感測探針； 混合該等感測探針與珠粒，其中該等珠粒對各別感測探針具有特異性，且其中該等珠粒包括識別該等感測探針具有特異性之分析物之不同碼； 使該等感測探針分別偶聯至對感測探針具有特異性之珠粒； 至少使用來自捕捉分析物之該等感測探針偶聯之螢光團的螢光來識別偶聯至該等感測探針之珠粒；及 至少使用識別珠粒之該等碼來識別偶聯至該等珠粒之感測探針捕捉之分析物。
  2. 如請求項1之方法，其中該等珠粒各包括具有對該等感測探針中之一者具有特異性之序列之第一寡核苷酸，且其中該等感測探針各包含具有與該第一寡核苷酸互補之序列之第二寡核苷酸。
  3. 如請求項1或請求項2之方法，其中該等不同碼包含具有彼此不同序列之寡核苷酸。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該等分析物中之至少一者包含核苷酸分析物。
  5. 如請求項4之方法，其中該感測探針包含特異性雜交至該核苷酸分析物之寡核苷酸序列。
  6. 如請求項4或請求項5之方法，其中該核苷酸分析物包含DNA分析物。
  7. 如請求項4或請求項5之方法，其中該核苷酸分析物包含RNA分析物。
  8. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該等分析物中之至少一者包含非核苷酸分析物。
  9. 如請求項8之方法，其中該非核苷酸分析物包含蛋白質。
  10. 如請求項8之方法，其中該非核苷酸分析物包含代謝物。
  11. 如請求項8或請求項9之方法，其中該感測探針包含對該非核苷酸分析物具有選擇性之抗體。
  12. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該感測探針包含對該非核苷酸分析物具有選擇性之適體。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該等不同分析物包含複數個核苷酸分析物及複數個非核苷酸分析物。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中在該等分析物經該等感測探針捕捉之後，該等螢光團偶聯至該等感測探針。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中在該等感測探針偶聯至該等珠粒之前，該等螢光團偶聯至該等感測探針。
  16. 如請求項1至14中任一項之方法，其中在該等感測探針偶聯至該等珠粒之後，該等螢光團偶聯至該等感測探針。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中提供該等螢光團包含使複數個螢光團偶聯至該等分析物。
  18. 如請求項17之方法，其中使複數個螢光團偶聯至該等分析物包含使用雜交鏈反應(HCR)。
  19. 一種用於偵測複數個不同分析物之系統，該系統包含： 對各別不同分析物具有特異性之感測探針； 對各別感測探針具有特異性且包括分別識別該等感測探針具有特異性之分析物之不同碼的珠粒； 用於分別偶聯至捕捉分析物之感測探針之螢光團；及 用於識別偶聯至捕捉分析物之該等感測探針之珠粒且用於至少使用該等珠粒之該等碼來識別偶聯至該等珠粒之感測探針捕捉之分析物的偵測電路。
  20. 如請求項19之系統，其中該等珠粒各包括具有對該等感測探針中之一者具有特異性之序列之第一寡核苷酸，且其中該等感測探針各包含具有與該第一寡核苷酸互補之序列之第二寡核苷酸。
  21. 如請求項19或請求項20之系統，其中該等不同碼包含具有彼此不同序列之寡核苷酸。
  22. 如請求項19至21中任一項之系統，其中該等分析物中之至少一者包含核苷酸分析物。
  23. 如請求項22之系統，其中該感測探針包含特異性雜交至該核苷酸分析物之寡核苷酸序列。
  24. 如請求項22或請求項23之系統，其中該核苷酸分析物包含DNA分析物。
  25. 如請求項22或請求項23之系統，其中該核苷酸分析物包含RNA分析物。
  26. 如請求項19至22中任一項之系統，其中該等分析物中之至少一者包含非核苷酸分析物。
  27. 如請求項26之系統，其中該非核苷酸分析物包含蛋白質。
  28. 如請求項26之系統，其中該非核苷酸分析物包含代謝物。
  29. 如請求項26或請求項27之系統，其中該感測探針包含對該非核苷酸分析物具有選擇性之抗體。
  30. 如請求項26至28中任一項之系統，其中該感測探針包含對該非核苷酸分析物具有選擇性之適體。
  31. 如請求項19至30中任一項之系統，其中該等不同分析物包含複數個核苷酸分析物及複數個非核苷酸分析物。
  32. 如請求項19至31中任一項之系統，其中在該等分析物經該等感測探針捕捉之後，該等螢光團偶聯至該等感測探針。
  33. 如請求項19至32中任一項之系統，其中在該等感測探針偶聯至該等珠粒之前，該等螢光團偶聯至該等感測探針。
  34. 如請求項19至32中任一項之系統，其中在該等感測探針偶聯至該等珠粒之後，該等螢光團偶聯至該等感測探針。
  35. 如請求項19至34中任一項之系統，其中複數個螢光團偶聯至該等分析物。
  36. 如請求項35之系統，其中使用雜交鏈反應(HCR)使該等複數個螢光團偶聯至該等分析物。
  37. 一種用於識別目標核酸之方法，其包含： (a)使複數個探針雜交至複數個核酸，該等複數個核酸包含該等目標核酸，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端； (b)用經阻斷核苷酸延長經雜交探針； (c)自經延長探針移除該等複數個核酸及非延長探針；及 (d)使該等經延長探針雜交至固定在表面上之複數個捕捉探針。
  38. 如請求項37之方法，其中(a)-(c)係在溶液中執行。
  39. 如請求項37或請求項38之方法，其進一步包含重複(a)及(b)。
  40. 如請求項37至39中任一項之方法，其中該經阻斷核苷酸包含可偵測標記。
  41. 如請求項40之方法，其中該標記包含螢光團。
  42. 如請求項37至41中任一項之方法，其中(b)包含聚合酶延長。
  43. 如請求項37至42中任一項之方法，其中(b)包含接合酶延長。
  44. 如請求項37至43中任一項之方法，其中(c)包含酶降解。
  45. 如請求項37至44中任一項之方法，其中(c)包含使該等複數個核酸及該等非延長探針與3'至5'核酸外切酶接觸。
  46. 如請求項45之方法，其中該3'至5'核酸外切酶選自由以下組成之群：核酸外切酶I、不耐熱性核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶III及克列諾I片段(Klenow I fragment)。
  47. 如請求項37至46中任一項之方法，其中該等探針各自包含對酶降解具有抗性之5'端。
  48. 如請求項47之方法，其中該對酶降解具有抗性之5'端包含硫代磷酸酯鍵。
  49. 如請求項47或請求項48之方法，其中(c)包含使該等複數個核酸與5'至3'核酸外切酶接觸。
  50. 如請求項49之方法，其中該5'至3'核酸外切酶選自由以下組成之群：RecJf、T7核酸外切酶、經截短核酸外切酶VIII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、核酸外切酶VII、核酸外切酶V及核酸酶BAL-31。
  51. 如請求項37至50中任一項之方法，其中複數個珠粒包含該表面。
  52. 如請求項37至51中任一項之方法，其中該表面包含平面表面。
  53. 如請求項37至52中任一項之方法，其中流通槽包含該表面。
  54. 如請求項37至53中任一項之方法，其中(d)進一步包含放大來自經雜交之延長探針之信號。
  55. 如請求項37至54中任一項之方法，其中(d)進一步包含識別該表面上之該等經雜交之延長探針之位置。
  56. 如請求項37至55中任一項之方法，其中該等捕捉探針彼此不同。
  57. 如請求項37至56中任一項之方法，其中該等複數個捕捉探針包含經解碼之捕捉探針陣列。
  58. 如請求項37至57中任一項之方法，其進一步包含解碼該表面上之該等捕捉探針之位置。
  59. 如請求項37至58中任一項之方法，其中該等複數個捕捉探針各自包含引子結合位點及解碼多核苷酸。
  60. 如請求項59之方法，其中解碼包含：使定序引子雜交至該引子結合位點，延長經雜交引子，及識別該解碼多核苷酸。
  61. 如請求項37至60中任一項之方法，其中該等複數個核酸包含基因體DNA。
  62. 如請求項37至61中任一項之方法，其中該等目標核酸包含單核苷酸多型性(SNP)。
  63. 一種用於識別目標核酸之系統，其包含： 延長溶液，該延長溶液包含： 包含該等目標核酸之複數個核酸， 複數個探針，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端， 複數個經阻斷核苷酸， 延長酶； 包含3'至5'核酸外切酶之降解溶液； 固定在表面上之捕捉探針陣列；及 用於識別該表面上雜交至捕捉探針之經延長探針之位置的偵測器。
  64. 如請求項63之系統，其中流通槽包含該固定在表面上之捕捉探針陣列。
  65. 一種用於識別目標核酸之系統，其包含： 流通槽，其包含表面、用於將溶液添加至該表面之入口及用於自該表面移除溶液之出口，其中捕捉探針陣列經固定在該表面上； 與該入口接觸之延長溶液，該延長溶液包含： 包含該等目標核酸之複數個核酸， 複數個探針，其中各探針包含能夠雜交至目標核酸之3'端及能夠雜交至捕捉探針之5'端， 複數個經阻斷核苷酸， 延長酶； 包含3'至5'核酸外切酶之降解溶液；及 用於識別該表面上雜交至捕捉探針之經延長探針之位置的偵測器。
  66. 如請求項63至65中任一項之系統，其中該經阻斷核苷酸包含可偵測標記。
  67. 如請求項66之系統，其中該標記包含螢光團。
  68. 如請求項63至67中任一項之系統，其中該延長酶包含聚合酶。
  69. 如請求項63至68中任一項之系統，其中該延長酶包含接合酶。
  70. 如請求項63至69中任一項之系統，其中該3'至5'核酸外切酶選自由以下組成之群：核酸外切酶I、不耐熱性核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶III及克列諾I片段。
  71. 如請求項63至70中任一項之系統，其中該等探針各自包含對酶降解具有抗性之5'端。
  72. 如請求項71之系統，其中該對酶降解具有抗性之5'端包含硫代磷酸酯鍵。
  73. 如請求項71或請求項72之系統，其中該降解溶液進一步包含5'至3'核酸外切酶。
  74. 如請求項73之系統，其中該5'至3'核酸外切酶選自由以下組成之群：RecJf、T7核酸外切酶、經截短核酸外切酶VIII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、核酸外切酶VII、核酸外切酶V及核酸酶BAL-31。
  75. 如請求項63至74中任一項之系統，其中該表面包含複數個珠粒。
  76. 如請求項63至75中任一項之系統，其中該等捕捉探針彼此不同。
  77. 如請求項63至76中任一項之系統，其中該等複數個捕捉探針包含經解碼之捕捉探針陣列。
  78. 如請求項63至77中任一項之系統，其中該等複數個捕捉探針各自包含引子結合位點及解碼多核苷酸。
  79. 如請求項63至78中任一項之系統，其中該等複數個核酸包含基因體DNA。
  80. 如請求項63至79中任一項之系統，其中該等目標核酸包含單核苷酸多型性(SNP)。
  81. 一種用於偵測元件之方法，該方法包含： 使元件偶聯至受質； 使複數個螢光團偶聯至該元件；及 至少使用來自該等複數個螢光團之螢光偵測該元件。
  82. 如請求項81之方法，其中該元件包含分析物。
  83. 如請求項82之方法，其中該分析物偶聯至感測探針。
  84. 如請求項83之方法，其中該分析物經由該感測探針偶聯至該受質。
  85. 如請求項83或請求項84之方法，其中該等複數個螢光團經由該感測探針偶聯至該元件。
  86. 如請求項83或請求項84之方法，其中該等複數個螢光團經由該受質偶聯至該元件。
  87. 如請求項81至86中任一項之方法，其中在該元件偶聯至該受質之前，該等複數個螢光團偶聯至該元件。
  88. 如請求項81至87中任一項之方法，其中在該元件偶聯至該受質之後，該等複數個螢光團偶聯至該元件。
  89. 如請求項81至88中任一項之方法，其中該受質包含珠粒。
  90. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該等複數個螢光團係使用滾環擴增偶聯至該元件。
  91. 如請求項90之方法，其中該滾環擴增生成經伸長之重複序列，且其中該等複數個螢光團偶聯至該序列之各別重複部分。
  92. 如請求項91之方法，其中該等螢光團偶聯至DNA嵌入劑，其中該等DNA嵌入劑偶聯至該經伸長之重複序列。
  93. 如請求項91之方法，其中包含螢光團及淬滅劑之寡核苷酸雜交至該等重複部分。
  94. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該元件偶聯至自裝配複數個經螢光標記之髮夾之觸發寡核苷酸。
  95. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該元件偶聯至包含第一觸發序列A'及第二觸發序列B'之觸發寡核苷酸，且其中使該等複數個螢光團偶聯至該元件包含使該觸發寡核苷酸與複數個第一寡核苷酸髮夾及複數個第二寡核苷酸髮夾接觸， 其中該等第一寡核苷酸髮夾各包括第一螢光團、與第一觸發序列A'互補之單股立足點序列(toehold sequence) A、與第二觸發序列B'互補之第一莖序列(stem sequence) B、暫時雜交至第一莖序列B之第二莖序列B'，及安置於該第一莖序列B與該第二莖序列B'之間的單股環序列C'；及 其中該等第二寡核苷酸髮夾各包含第二螢光團、與單股環序列C'互補之單股立足點序列C、與第二觸發序列B'互補之第一莖序列B、暫時雜交至第一莖序列B之第二莖序列B'，及安置於該第一莖序列B與該第二莖序列B'之間的單股環序列A'。
  96. 如請求項95之方法，其中對於該等第一寡核苷酸髮夾中之一者之該單股立足點序列A與該觸發寡核苷酸之第一觸發序列A'的雜交之反應： 該第一寡核苷酸髮夾之該第二莖序列B'與該第一寡核苷酸髮夾之該第一莖序列B解雜交； 該等第二寡核苷酸髮夾中之一者之該單股立足點序列C雜交至該第一寡核苷酸髮夾之該單股環序列；且 該第二寡核苷酸髮夾之該第二莖序列B'與該第二寡核苷酸髮夾之該第一莖序列B解雜交。
  97. 如請求項96之方法，其中對於該等第一寡核苷酸髮夾中之另一者之該單股立足點序列A與該第二寡核苷酸髮夾之單股環序列A'的雜交之反應： 該第一寡核苷酸髮夾之該第二莖序列B'與該第一寡核苷酸髮夾之該第一莖序列B解雜交； 該等第二寡核苷酸髮夾中之另一者之該單股立足點序列C雜交至該第一寡核苷酸髮夾之該單股環序列；且 該第二寡核苷酸髮夾之該第二莖序列B'與該第二寡核苷酸髮夾之該第一莖序列B解雜交。
  98. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該元件偶聯至寡核苷酸引子，且其中使該等複數個螢光團偶聯至該元件包含： 使擴增模板雜交至該寡核苷酸引子；及 至少使用該擴增模板，用複數個經螢光標記之核苷酸延長該寡核苷酸引子以生成包含該等複數個螢光團之經延長股。
  99. 如請求項98之方法，其中該等螢光團中之至少一者與該等螢光團中之至少另一者不同。
  100. 如請求項98或請求項99之方法，其進一步包含使該擴增模板解雜交且使該經延長股形成髮夾結構。
  101. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該元件偶聯至寡核苷酸引子，且其中使該等複數個螢光團偶聯至該元件包含： 使擴增模板雜交至該寡核苷酸引子； 至少使用該擴增模板，用分別偶聯至另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長該寡核苷酸引子； 使另外擴增模板雜交至該等另外核苷酸引子；及 至少使用該等另外擴增模板，用分別偶聯至螢光團或分別偶聯至其他另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長該等另外核苷酸引子。
  102. 如請求項101之方法，其進一步包含使其他另外擴增模板雜交至該等另外的核苷酸引子；及 至少使用該等另外擴增模板，用分別偶聯至螢光團或分別偶聯至其他另外寡核苷酸引子之複數個核苷酸延長該等另外核苷酸引子。
  103. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該元件偶聯至包含該等複數個螢光團之DNA摺紙(origami)。
  104. 如請求項103之方法，其中該DNA摺紙包含不同螢光團之組合。
  105. 如請求項103或請求項104之方法，其中該元件經由以下偶聯至該DNA摺紙：銅(I)催化之點擊反應、應變(strain)促進之疊氮化物-炔烴環加成、寡核苷酸與互補寡核苷酸之雜交、生物素-抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)相互作用、NTA-His-Tag相互作用，或Spytag-Spycatcher相互作用。
  106. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該元件偶聯至寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含該等複數個螢光團。
  107. 如請求項106之方法，其中該寡核苷酸包含髮夾。
  108. 如請求項106或請求項107之方法，其中該寡核苷酸進一步包含自由基清除劑。
  109. 如請求項81至89中任一項之方法，其中該元件直接偶聯至第一寡核苷酸，且該第一寡核苷酸雜交至包含該等複數個螢光團之第二寡核苷酸。
  110. 一種用於偵測核苷酸之方法，該方法包含： 使用第二多核苷酸之至少一序列將該核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸包括第一部分； 藉由使該第一部分與標記之第二部分反應而使該標記偶聯至該添加之核苷酸，其中該標記包含複數個螢光團；及 至少使用來自該等複數個螢光團之螢光偵測該添加之核苷酸。
  111. 一種用於偵測核苷酸之方法，該方法包含： 使用第二多核苷酸之至少一序列將該核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸偶聯至包含複數個螢光團之標記；及 至少使用來自該等複數個螢光團之螢光偵測該添加之核苷酸。
  112. 一種用於偵測核苷酸之方法，該方法包含： 使用第二多核苷酸之至少一序列將該核苷酸添加至第一多核苷酸中，其中所添加之核苷酸包括第一部分； 藉由使該第一部分與標記之第二部分反應而使該標記偶聯至該添加之核苷酸； 使複數個螢光團偶聯至該經偶聯之標記；及 至少使用來自該等複數個螢光團之螢光偵測該添加之核苷酸。
  113. 一種組合物，其包含： 受質； 偶聯至該受質之寡核苷酸； 偶聯至該寡核苷酸之核苷酸； 偶聯至該核苷酸之部分； 偶聯至該部分之標記，其中該標記包含複數個螢光團；及 經組態以至少使用來自該等複數個螢光團之螢光偵測該核苷酸之偵測電路。
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