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TW202126327A - 新抗原組合物及其用途 - Google Patents

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TW202126327A
TW202126327A TW109119883A TW109119883A TW202126327A TW 202126327 A TW202126327 A TW 202126327A TW 109119883 A TW109119883 A TW 109119883A TW 109119883 A TW109119883 A TW 109119883A TW 202126327 A TW202126327 A TW 202126327A
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amino acid
epitope
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維克藍 朱內賈
正欣 董
羅賓 潔西卡 艾瑟特
瑪鮑貝 克拉巴蒂
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美商百歐恩泰美國公司
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Abstract

本發明揭示包含新抗原決定基之免疫治療多肽、包含該等免疫治療多肽之抗原呈現細胞，及包含該等免疫治療多肽之醫藥組合物。本文亦揭示該等免疫治療多肽治療疾病或病狀之用途。

Description

新抗原組合物及其用途
癌症免疫療法為使用免疫系統來治療癌症。免疫療法利用以下事實：癌細胞通常在其表面上具有可由免疫系統偵測到之分子，稱為腫瘤抗原，其通常為蛋白質或其他大分子(例如碳水化合物)。主動免疫療法藉由靶向腫瘤抗原引導免疫系統攻擊腫瘤細胞。被動免疫療法增強現有抗腫瘤反應且包括使用單株抗體、淋巴球及細胞介素。腫瘤疫苗通常由腫瘤抗原及免疫刺激分子(例如佐劑、細胞介素或鐸樣受體(TLR)配位體)構成，其一起起作用以誘導識別且溶解腫瘤細胞之抗原特異性細胞毒性T細胞(CTL)。由於惡性細胞內之基因改變(例如倒位、易位、缺失、錯義突變、剪接位點突變等)出現的腫瘤新抗原表示抗原的大部分腫瘤特異性類別且可為患者特異性的或共用的。腫瘤新抗原為腫瘤細胞特有的，因為突變及其對應蛋白質僅存在於腫瘤中。其亦避免中樞耐受性且因此更可能為免疫原性的。因此，腫瘤新抗原提供包括藉由體液及細胞免疫之免疫識別之極佳目標。
為了由疫苗接種引發T細胞反應，抗原呈現細胞(APC)必須處理含抗原決定基肽且在主要組織相容複合物(MHC) I或MHC II上呈現抗原決定基。研發治癒性及腫瘤特異性免疫療法之關鍵障礙中之一者為用於抗原呈現的最小抗原決定基的處理及釋放不充分而無法產生足夠的免疫反應。因此，需要研發額外癌症治療疫苗以確保有效且足夠的抗原決定基處理及呈現。
在一些態樣中，本文提供一種多肽，其包含由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現之抗原決定基，該多肽具有式(I)之結構： Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 式 (I) ， 或其醫藥學上可接受之鹽， (i)其中Xm 為抗原決定基，其中各X獨立地表示由個體之基因體中之核酸序列編碼之連續胺基酸序列之一個胺基酸， 且其中，(a)MHC為I類MHC且m為8至12之整數，或 (b) MHC為II類MHC且m為9至25之整數； (ii)其中各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中Ar 之變數r為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt -Ar -Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼， (B)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為1或更大時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt 之核酸序列上游之核酸序列編碼；及 進一步其中，n為0至1000之整數； (iii)其中各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中As 之變數s為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm -As -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼， (B)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游的核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為1或更大時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼；及 進一步其中，p為0至1000之整數； 且進一步其中， 當n為0時，p為1至1000之整數；及 當p為0時，n為1至1000之整數； (iv)其中Ar 為連接子，且r為0或1； (v)其中As 為連接子，且s為0或1； (vi)其中各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游， 且其中t為0至1000之整數；及 (vii)其中各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游， 且其中u為0至1000之整數； 且進一步其中， (a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成； (b)多肽包含至少兩種不同多肽分子； (c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或 (d)當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
在一些實施例中，抗原決定基由II類MHC呈現。在一些實施例中，m為9至25之整數。在一些實施例中，t為1、2、3、4或5或更大且r為0。在一些實施例中，u為1、2、3、4或5或更大且s為0。在一些實施例中，t為1或更大，r為0，且n為1至1000。在一些實施例中，u為1或更大，s為0，且p為1至1000。在一些實施例中，t為0。在一些實施例中，u為0。在一些實施例中，t為至少1且Bt 包含離胺酸。在一些實施例中，u為至少1且Cu 包含離胺酸。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，Bt 自抗原決定基裂解。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，Cu 自抗原決定基裂解。在一些實施例中，n為1至5或7至1000之整數。在一些實施例中，p為1至4或6至1000之整數。
在一些實施例中，多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成。在一些實施例中，多肽不包含由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基。在一些實施例中，多肽包含至少兩種不同多肽分子。在一些實施例中，抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係由個體之基因體中之核酸序列中的插入、缺失、框移、新ORF (neoORF)或點突變編碼。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。在一些實施例中，Xm 之m為至少8且Xm 為AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 AA8 AA9 AA10 AA11 AA12 AA13 AA14 AA15 AA16 AA17 AA18 AA19 AA20 AA21 AA22 AA23 AA24 AA25 ，其中各AA為胺基酸，且其中AA9 、AA10 、AA11 、AA12 、AA13 、AA14 、AA15 、AA16 、AA17 、AA18 、AA19 、AA20 、AA21 、AA22 、AA23 、AA24 及AA25 中之一或多者視情況存在，且進一步其中至少一個AA為突變型胺基酸。在一些實施例中，r為1。在一些實施例中，s為1。在一些實施例中，r為1且s為1。在一些實施例中，r為0。在一些實施例中，s為0。在一些實施例中，r為0且s為0。
在一些實施例中，Ar 及/或As 為非多肽連接子。在一些實施例中，Ar 及/或As 為化學連接子。在一些實施例中，Ar 及/或As 包含非天然胺基酸。在一些實施例中，Ar 及/或As 不包含胺基酸。在一些實施例中，Ar 及/或As 不包含天然胺基酸。在一些實施例中，Ar 及/或As 包含除肽鍵以外之鍵。在一些實施例中，Ar 及/或As 包含二硫鍵。在一些實施例中，Ar 與As 不同。在一些實施例中，Ar 及As 相同。
在一些實施例中，多肽包含親水性尾。在一些實施例中，相較於不含有Yn -Bt -Ar 及/或As -Zp 之對應肽，Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 增強多肽之溶解度。在一些實施例中，Xm 之各X為天然胺基酸。
在一些實施例中，當由APC處理多肽時，抗原決定基自Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 釋放。在一些實施例中，多肽在Ar 及/或As 處裂解。在一些實施例中，在n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解；及/或在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解。
在一些實施例中，在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
在一些實施例中，在n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽在Ar 處以更高的速率裂解；及/或在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽在As 處以更高的速率裂解。
在一些實施例中，當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強；及/或當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強。
在一些實施例中，在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
在一些實施例中，APC將抗原決定基呈現至免疫細胞。在一些實施例中，APC將抗原決定基呈現至吞噬細胞。在一些實施例中，APC將抗原決定基呈現至樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜中性白血球或單核球。在一些實施例中，APC優先或特異性地將抗原決定基呈現至免疫細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜中性白血球或單核球。
在一些實施例中，當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強；及/或當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強。
在一些實施例中，在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
在一些實施例中，當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強；及/或當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強。
在一些實施例中，在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含選自由聚-Lys (聚K)及聚-Arg (聚R)組成之群的序列。在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含選自由聚K-AA-AA及聚R-AA-AA組成之群的序列，其中各AA為胺基酸或其類似物或衍生物。在一些實施例中，聚K包含聚-L-Lys。在一些實施例中，聚R包含聚-L-Arg。在一些實施例中，聚K或聚R分別包含至少三個或四個連續離胺酸或精胺酸殘基。在一些實施例中，Ar 及/或As 選自由以下組成之群：二硫基；對胺基苯甲氧基羰基(PABC)；及AA-AA-PABC，其中各AA為胺基酸或其類似物或衍生物。在一些實施例中，AA-AA-PABC係選自由以下組成之群：Ala-Lys-PABC、Val-Cit-PABC及Phe-Lys-PABC。
在一些實施例中，Ar 及/或As 為
Figure 02_image001
式 (II) 。
在一些實施例中，Ar 及/或As 為
Figure 02_image003
式 (III) ，或
Figure 02_image005
式 (IV) 其中， R1 及R2 獨立地為H或(C1 -C6 )烷基；j為1或2；G1 為H或COOH；且i為1、2、3、4或5。
在一些實施例中，多肽為泛素化的。在一些實施例中，多肽在裂解之前經泛素化。在一些實施例中，多肽在離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在個體中由APC處理之前由APC內化之前不裂解。在一些實施例中，多肽在個體中由APC處理之前或由APC內化之前不在血液中裂解。在一些實施例中，多肽不由血液中之蛋白酶裂解。在一些實施例中，多肽不由纖維蛋白溶酶、血漿激肽釋放素、組織激肽釋放素、凝血酶或凝血因子裂解。在一些實施例中，多肽在人類血漿中為穩定的。在一些實施例中，多肽在人類血漿中具有1小時至5天之半衰期。在一些實施例中，多肽在溶酶體、內溶酶體(endolysosome)、內體或內質網(ER)中裂解。在一些實施例中，多肽藉由胺基肽酶裂解。在一些實施例中，胺基肽酶為胰島素調節之胺基肽酶(IRAP)或內質網胺基肽酶(ERAP)。在一些實施例中，多肽藉由蛋白酶體及/或免疫蛋白酶體之胰蛋白酶樣域處理。在一些實施例中，胰蛋白酶樣域包含胰蛋白酶樣活性、胰凝乳蛋白酶樣活性或肽基麩胺醯肽水解酶(PGPH)活性。在一些實施例中，多肽藉由蛋白酶裂解。在一些實施例中，蛋白酶為胰蛋白酶樣蛋白酶、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶或肽基麩胺醯肽水解酶(PGPH)。在一些實施例中，蛋白酶選自由以下組成之群：天冬醯胺肽解離酶、天冬胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、麩胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶及蘇胺酸蛋白酶。在一些實施例中，蛋白酶為選自由以下組成之群的半胱胺酸蛋白酶：鈣蛋白酶、凋亡蛋白酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶F、組織蛋白酶H、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L1、組織蛋白酶L2、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶W及組織蛋白酶Z。
在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，抗原決定基結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原決定基以0.1 nM至2000 nM之親和力結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原決定基結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，抗原決定基以0.1 nM至2000 nM、1 nM至1000 nM、10 nM至500 nM或小於1000 nM之親和力結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，n為1至20或5至12之整數。在一些實施例中，p為1至20或5至12之整數。在一些實施例中，抗原決定基包含腫瘤特異性抗原決定基。
在一些實施例中，多肽包含至少兩種多肽，其中至少兩種多肽中之兩者或更多者具有相同式Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 。在一些實施例中，多肽包含至少兩種多肽分子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Xm 相同。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Yn 相同。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Zp 相同。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Ar 及/或As 不同。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之第一者的r=0，且至少兩種多肽或多肽分子中之第二者的r=1。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之第一者的s=0，且至少兩種多肽或多肽分子中之第二者的s=1。在一些實施例中，多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種多肽或多肽分子。
在一些實施例中，抗原決定基為RAS抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基包含突變型RAS肽序列，其包含在G12、G13或Q61處包含突變之突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸及在G12、G13或Q61處之突變。在一些實施例中，包含G12、G13或Q61處之突變的突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，G12、G13或Q61處之突變包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含細胞巨大病毒(CMV)，諸如pp65、人類免疫缺乏病毒(HIV)或MART-1之蛋白質之胺基酸序列。在一些實施例中，n及/或p為1、2、3或大於3之整數。在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含離胺酸或聚-離胺酸。在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含K、KK、KKK、KKKK或KKKKK。
在一些實施例中，抗原決定基以小於10µM、小於1µM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM、小於250 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於100 nM或小於50 nM之親和力結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，抗原決定基以大於24小時、大於12小時、大於9小時、大於6小時、大於5小時、大於4小時、大於3小時、大於2小時、大於1小時、大於45分鐘、大於30分鐘、大於15分鐘或大於10分鐘的穩定性結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A02:01對偶基因、HLA-A03:01對偶基因、HLA-A11:01對偶基因、HLA-A03:02對偶基因、HLA-A30:01對偶基因、HLA-A31:01對偶基因、HLA-A33:01對偶基因、HLA-A33:03對偶基因、HLA-A68:01對偶基因、HLA-A74:01對偶基因及/或HLA-C08:02對偶基因及其任何組合。
在一些實施例中，抗原決定基包含以下之胺基酸序列：GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE。
在一些實施例中，Yn 包含以下之胺基酸序列：IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYKLV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV。在一些實施例中，Zp 包含以下之胺基酸序列：KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE。
在一些實施例中，抗原決定基不為RAS抗原決定基。在一些實施例中，多肽不為KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些實施例中，抗原決定基為GATA3抗原決定基。在一些實施例中，GATA3抗原決定基包含以下之胺基酸序列：MLTGPPARV、SMLTGPPARV、VLPEPHLAL、KPKRDGYMF、KPKRDGYMFL、ESKIMFATL、KRDGYMFL、PAVPFDLHF、AESKIMFATL、FATLQRSSL、ARVPAVPFD、IMKPKRDGY、DGYMFLKA、MFLKAESKIMF、LTGPPARV、ARVPAVPF、SMLTGPPAR、RVPAVPFDL或LTGPPARVP。
在一些態樣中，本文提供一種包含本文所述之多肽的細胞。在一些實施例中，細胞為抗原呈現細胞。在一些實施例中，細胞為樹突狀細胞。在一些實施例中，細胞為成熟抗原呈現細胞。
在一些態樣中，本文提供一種裂解多肽之方法，其包含使本文所述之多肽與抗原呈現細胞(APC)接觸。在一些實施例中，方法在活體內進行。在一些實施例中，方法離體進行。
在一些態樣中，本文提供一種製造多肽之方法，其包含將Yn -Ar 及/或As -Zp 連接至包含抗原決定基序列之序列，其中抗原決定基序列由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現；其中(i)各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游的核酸序列編碼且n為0至1000之整數；(ii)各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游的核酸序列編碼且p為0至1000之整數；及(iii) Ar 為連接子且As 為連接子，其中r及s中之至少一者為1；且進一步其中(a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成；(b)多肽包含至少兩種不同多肽分子；(c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或(d)當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
在一些態樣中，本文提供一種製造多肽之方法，其包含將Yn 連接至Bt -Xm 及/或Zp 連接至Xm -Cu ，其中Xm 為由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現之抗原決定基序列；且其中(i)各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游，且其中t為0至1000之整數；(ii)其中各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游，且其中u為0至1000之整數；(iii)各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt -Xm 之核酸序列上游的核酸序列編碼，且其中n為0至1000之整數；及(iv)各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼，且其中p為0至1000之整數；且進一步其中(a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成；(b)多肽包含至少兩種不同多肽分子；(c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或(d)當由APC處理多肽時，Yn -Bt 及/或Cu -Zp 自抗原決定基裂解。
在一些實施例中，當n為0時，p為1至1000之整數，且當p為0時，n為1至1000之整數。在一些實施例中，各X獨立地表示包含由個體之基因體中之核酸序列編碼之任何連續胺基酸序列的肽序列之胺基酸，且其中(a) MHC為I類MHC且m為8至12之整數，或(b) MHC為II類MHC且m為9至25之整數。
在一些態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之多肽及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含免疫調節劑或佐劑。在一些實施例中，免疫調節劑或佐劑係選自由以下組成之群：聚-ICLC、1018 ISS、鋁鹽、安利瓦(Amplivax)、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING促效劑、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS貼劑(IS Patch)、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、孟塔納(Montanide) IMS 1312、孟塔納ISA 206、孟塔納ISA 50V、孟塔納ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel®、載體系統、PLGA微粒、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒顆粒及其他病毒樣粒子、YF-17D、VEGF捕捉劑、R848、β-葡聚糖、Pam2Cys、Pam3Cys、Pam3CSK4及Aquila之QS21刺激子。在一些實施例中，免疫調節劑或佐劑包含聚-ICLC。在一些實施例中，醫藥組合物為疫苗組合物。在一些實施例中，醫藥組合物為水性或液體。
在一些實施例中，抗原決定基以1 ng至10 mg或5µg至1.5 mg之量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含DMSO。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑包含水。在一些實施例中，醫藥組合物包含以小於1 mM或大於1 mM之濃度存在之pH調節劑。在一些實施例中，pH調節劑為二羧酸鹽或三羧酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為丁二酸之二羧酸鹽，或二丁二酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為檸檬酸之三羧酸鹽或三檸檬酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為丁二酸二鈉。在一些實施例中，丁二酸之二羧酸鹽或二丁二酸鹽以0.1 mM至1 mM之濃度存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，丁二酸之二羧酸鹽或二丁二酸鹽以1 mM至5 mM之濃度存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，當向個體投與時，對抗原決定基之免疫反應增加。
在一些態樣中，本文提供一種治療疾病或病狀之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之醫藥組合物。在一些實施例中，疾病或病狀為癌症。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、子宮癌及肝癌。在一些實施例中，投與包含皮內注射、鼻內噴霧施加、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射。
在一些態樣中，本文提供一種個體防治之方法，其包含使個體之細胞與本文所述之多肽、細胞或醫藥組合物接觸。
在一些態樣中，本文提供一種方法，其包含鑑別由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基及產生包含抗原決定基之多肽，其中多肽具有式(I)之結構： Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 式 (I) ， 或其醫藥學上可接受之鹽， (i)其中Xm 為抗原決定基，其中各X獨立地表示由個體之基因體中之核酸序列編碼之連續胺基酸序列之一個胺基酸， 且其中，(a) MHC為I類MHC且m為8至12之整數，或 (b) MHC為II類MHC且m為9至25之整數； (ii)其中各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中Ar 之變數r為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt -Ar -Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼， (B)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為1或更大時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt 之核酸序列上游之核酸序列編碼；及 進一步其中，n為0至1000之整數； (iii)其中各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中As 之變數s為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm -As -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼， (B)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游的核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為1或更大時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼；及 進一步其中，p為0至1000之整數； 且進一步其中， 當n為0時，p為1至1000之整數；及 當p為0時，n為1至1000之整數； (iv)其中Ar 為連接子，且r為0或1； (v)其中As 為連接子，且s為0或1； (vi)其中各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游， 且其中t為0至1000之整數；及 (vii)其中各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游， 且其中u為0至1000之整數； 且進一步其中， (a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成； (b)多肽包含至少兩種不同多肽分子； (c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或 (d)當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
在一些實施例中，鑑別包含自個體之腫瘤細胞定序的核酸序列池中選擇複數個核酸序列，該等核酸序列編碼複數個候選肽序列，其包含不存在於自個體之非腫瘤細胞定序的核酸序列池中的一或多個不同突變，其中自個體之腫瘤細胞定序之核酸序列池及自個體之非腫瘤細胞定序之核酸序列池係藉由全基因體定序或全外顯子組定序來定序。在一些實施例中，鑑別進一步包含藉由HLA肽結合分析來預測或量測複數個候選肽序列中哪些候選肽序列與由相同個體之HLA對偶基因所編碼之蛋白質形成複合物。在一些實施例中，鑑別進一步包含基於HLA肽結合分析，選擇複數種所選腫瘤特異性肽或一或多種編碼來自候選肽序列之複數種所選腫瘤特異性肽的聚核苷酸。
在一些實施例中，方法進一步包含向個體投與多肽。在一些實施例中，投與包含皮內注射、鼻內噴霧施加、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射。在一些實施例中，在個體中引發免疫反應。在一些實施例中，由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基為新抗原、腫瘤相關抗原、突變型腫瘤相關抗原，及/或其中與抗原決定基在個體之正常細胞中之表現相比，抗原決定基之表現在個體之腫瘤細胞中更高。
本文提供一種多肽，其包含由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現之抗原決定基，該多肽具有式(I)之結構： Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 式 (I) ， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Xm 為抗原決定基，其中各X獨立地表示由個體之基因體中之核酸序列編碼之連續胺基酸序列之一個胺基酸，且其中，(a) MHC為I類MHC且m為8至12之整數，或(b) MHC為II類MHC且m為9至25之整數；其中各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中：當式(I)中Ar 之變數r為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt -Ar -Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼，當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼，或當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為1或更大時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt 之核酸序列上游之核酸序列編碼；且進一步其中，n為0至1000之整數；其中各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中：當式(I)中As 之變數s為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm -As -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼，當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游的核酸序列編碼，或當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為1或更大時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼；且進一步其中，p為0至1000之整數；且進一步其中，當n為0時，p為1至1000之整數；且當p為0時，n為1至1000之整數；其中Ar 為連接子，且r為0或1；其中As 為連接子，且s為0或1；其中各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游，且其中t為0至1000之整數；且其中各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游，且其中u為0至1000之整數；且進一步其中，多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成；多肽包含至少兩種不同多肽分子；抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
在一些實施例中，抗原決定基係由II類MHC呈現且m為9至25之整數。
在一些實施例中，相較於不含有Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 之對應肽，Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 增強多肽之溶解度。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，抗原決定基自Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 釋放。在一些實施例中，在n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解；及/或其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解。在一些實施例中，當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強；及/或其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強。在一些實施例中，APC將抗原決定基呈現至免疫細胞。
在一些實施例中，當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強；及/或其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強。
在一些實施例中，當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強；及/或其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強。
在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含選自由離胺酸(Lys)、聚-Lys (聚K)及聚-Arg (聚R)組成之群的序列。在一些實施例中，聚K包含聚-L-Lys。在一些實施例中，聚R包含聚-L-Arg。在一些實施例中，聚K或聚R分別包含至少兩個、三個或四個連續離胺酸或精胺酸殘基。
在一些實施例中，抗原決定基結合至II類MHC HLA。在一些實施例中，抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至II類MHC HLA。在一些實施例中，抗原決定基以0.1 nM至2000 nM、1 nM至1000 nM、10 nM至500 nM或小於1000 nM之親和力結合至II類MHC HLA。
在一些實施例中，多肽在個體中由APC處理之前或由APC內化之前不裂解。在一些實施例中，多肽在人類血漿中為穩定的。在一些實施例中，多肽在人類血漿中具有1小時至5天之半衰期。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，抗原決定基以小於10µM、小於1µM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM、小於250 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於100 nM或小於50 nM之親和力結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，抗原決定基以大於24小時、大於12小時、大於9小時、大於6小時、大於5小時、大於4小時、大於3小時、大於2小時、大於1小時、大於45分鐘、大於30分鐘、大於15分鐘或大於10分鐘的穩定性結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A02:01對偶基因、HLA-A03:01對偶基因、HLA-A11:01對偶基因、HLA-A03:02對偶基因、HLA-A30:01對偶基因、HLA-A31:01對偶基因、HLA-A33:01對偶基因、HLA-A33:03對偶基因、HLA-A68:01對偶基因、HLA-A74:01對偶基因及/或HLA-C08:02對偶基因及其任何組合。在一些實施例中，抗原決定基包含腫瘤特異性抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係由個體之基因體中之核酸序列中的插入、缺失、框移、新ORF或點突變編碼。
在一些實施例中，抗原決定基為RAS抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基包含突變型RAS肽序列，其包含在G12、G13或Q61處包含突變之突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸及在G12、G13或Q61處之突變。在一些實施例中，包含G12、G13或Q61處之突變的突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，G12、G13或Q61處之突變包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，RAS抗原決定基包含以下之胺基酸序列：VVVGAAGVGK、VVVGAAGVG、VVVGAAGV、VVGAAGVGK、VVGAAGVG、VGAAGVGK、VVVGACGVGK、VVVGACGVG、VVVGACGV、VVGACGVGK、VVGACGVG、VGACGVGK、VVVGADGVGK、VVVGADGVG、VVVGADGV、VVGADGVGK、VVGADGVG、VGADGVGK、VVVGARGVGK、VVVGARGVG、VVVGARGV、VVGARGVGK、VVGARGVG、VGARGVGK、VVVGASGVGK、VVVGASGVG、VVVGASGV、VVGASGVGK、VVGASGVG、VGASGVGK、VVVGAVGVGK、VVVGAVGVG、VVVGAVGV、VVGAVGVGK、VVGAVGVG或VGAVGVGK。在一些實施例中，Yn 包含以下之胺基酸序列：K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KTEY、KTEYK、KTEYKL、KTEYKLV、KTEYKLVV、KTEYKLVVV、KKTEY、KKTEYK、KKTEYKL、KKTEYKLV、KKTEYKLVV、KKTEYKLVVV、KKKTEY、KKKTEYK、KKKTEYKL、KKKTEYKLV、KKKTEYKLVV、KKKTEYKLVVV、KKKKTEY、KKKKTEYK、KKKKTEYKL、KKKKTEYKLV、KKKKTEYKLVV、KKKKTEYKLVVV、IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYK、TEYKL、TEYKLV、TEYKLVV、TEYKLVVV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV。在一些實施例中，Zp 包含以下之胺基酸序列：K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、SALTIK、SALTIQLK、GKSALTIQLK、GKSALTIK、SALTIKK、SALTIQLKK、GKSALTIQLKK、GKSALTIKK、SALTIKKK、SALTIQLKKK、GKSALTIQLKKK、GKSALTIKKK、SALTIKKKK、SALTIQLKKKK、GKSALTIQLKKKK、GKSALTI,KKKK、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE。在一些實施例中，多肽包含以下之胺基酸序列：KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK或TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK。在一些實施例中，抗原決定基不為RAS抗原決定基。在一些實施例中，多肽不為KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含與衍生抗原決定基之蛋白質不同的蛋白質之胺基酸序列。在一些實施例中，Yn 及/或Zp 包含諸如pp65、HIV或MART-1的CMV之蛋白質之胺基酸序列。在一些實施例中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大於20之整數。在一些實施例中，p為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大於20之整數。
在一些實施例中，抗原決定基為TMPRSS2:ERG抗原決定基。在一些實施例中，TMPRSS2:ERG抗原決定基包含ALNSEALSV之胺基酸序列。
本文亦提供一種聚核苷酸，其包含編碼本文所述之多肽的序列。在一些實施例中，聚核苷酸為mRNA。
本文亦提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之多肽或本文所描述之聚核苷酸；及醫藥學上可接受之賦形劑。
本文亦提供一種治療疾病或病狀之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之醫藥組合物。在一些實施例中，疾病或病狀為選自由以下組成之群的癌症：肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、子宮癌、前列腺癌、肝癌、膽道惡性腫瘤、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝癌、骨髓白血病及乳癌。在一些實施例中，投與包含皮內注射、鼻內噴霧施加、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射。
本文亦提供一種製備抗原特異性T細胞之方法，其包含用包含本文所述之多肽或編碼本文所述之多肽之聚核苷酸的抗原呈現細胞刺激T細胞。在一些實施例中，方法離體進行。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年6月12日申請之美國臨時申請案第62/860,493號之權利，其以全文引用之方式併入本文中。本申請案係關於2020年5月7日申請之國際申請案第PCT/US2020/031898號，其以全文引用的方式併入本文中。 以引用之方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經特定及個別地指示以引用之方式併入一般。
本文描述新穎免疫治療組合物，其包含個體之腫瘤特異性抗原或新抗原決定基，及其基於關於增強抗原決定基處理及呈現以刺激免疫反應之方法的發現的用途。因此，本文所述之本發明提供肽，其可用於例如刺激針對腫瘤相關抗原或新抗原決定基之免疫反應，以產生用於治療癌症、疾病或病狀之免疫原性組合物或癌症疫苗。
以下描述及實例詳細說明本發明之實施例。應理解，本發明不限於本文所描述之特定實施例且因而可改變。熟習此項技術者應認識到，本發明存在多種變化及修改，其涵蓋在本發明之範疇內。
所有術語均意欲理解為熟習此項技術者所理解之含義。除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。
本文所用之章節標題僅出於組織目的且不應被理解為限制所描述之主題。
儘管本發明之各種特徵可描述於單個實施例之上下文中，但該等特徵亦可分開或以任何適合組合形式提供。相反，儘管為了清楚起見，本發明在本文中可在分開的實施例之上下文中描述，但本發明亦可以單一實施例形式實施。
以下定義係對此項技術中該等定義之補充且係針對本申請案，而不應歸於任何相關或不相關情形，例如任何共同擁有之專利或申請案。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料之任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但本文描述較佳方法及材料。因此，本文所用之術語僅出於描述特定實施例的目的且並不意欲為限制性的。1. 定義
本文所使用之術語僅用於描述特定情況之目的且並不意欲為限制性的。在本申請案中，除非另外特定陳述，否則單數之使用包括複數。如本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」同樣意欲包括複數形式。
在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。如本文所用，術語「及/或」及「其任何組合」及其文法同義字可互換使用。此等術語可表達特異性涵蓋任何組合。僅出於說明之目的，以下片語「A、B及/或C」或「A、B、C或其任何組合」可意謂「個別地A；個別地B；個別地C；A及B；B及C；A及C；及A、B及C」。除非上下文特異性地指分開使用，否則術語「或」可結合或分開使用。
術語「約」或「大約」可意謂在如藉由一般熟習此項技術者所判定的特定值之可接受誤差範圍內，其將部分地視該值如何量測或測定(亦即，量測系統之限制)而定。舉例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意謂在1或大於1個標準差內。或者，「約」可意謂既定值之至多20%、至多10%、至多5%或至多1%之範圍。或者，尤其就生物系統或過程而言，該術語可意謂在某一值之一個數量級內，在5倍範圍內且更佳在2倍範圍內。若特定值描述於本申請案及申請專利範圍中，除非另有說明，否則應假設術語「約」意謂在特定值之可接受誤差範圍內。
如本說明書及申請專利範圍中所用，字組「包含(comprising)」(及包含之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)為包括性或開放的且不排除額外未列出之要素或方法步驟。預期在本說明書中論述之任何實施例可利用本發明之任何方法或組合物實施，且反之亦然。此外，本發明之組合物可用於實現本發明之方法。
在本說明書中提及「一些實施例」、「一實施例」、「一個實施例」或「其他實施例」意謂結合實施例描述之特定特點、結構或特徵包括於本發明之至少一些實施例，但不一定所有實施例中。為了促進對本發明的理解，在下文中定義多個術語及片語。
用於描述肽或蛋白質之命名法遵循習知慣例，其中胺基呈現至各胺基酸殘基左側(胺基或N端)且羧基呈現至各胺基酸殘基右側(羧基或C端)。當提及肽抗原決定基中之胺基酸殘基位置時，其在胺基至羧基方向上，用位於抗原決定基、或肽或肽可為其一部分之蛋白質的胺基端處之殘基的位置進行編號。在代表本發明之所選特定實施例之式中，除非另外說明，否則胺基及羧基端基(儘管未特定展示)呈其在生理學pH值下將呈現之形式。在胺基酸結構式中，各殘基一般由標準三個字母或單個字母名稱表示。胺基酸殘基之L-形式由單個大寫字母或三個字母符號首個字母大寫表示，且具有D-形式之彼等胺基酸殘基之D-形式由單個小寫字母或三個小寫字母符號表示。然而，當無大寫字母之情況下使用三個字母符號或全名時，其可指L胺基酸殘基。甘胺酸不具有不對稱碳原子且簡稱為「Gly」或「G」。本文所闡述之肽之胺基酸序列一般使用標準單個字母符號指定。(A，丙胺酸；C，半胱胺酸；D，天冬胺酸；E，麩胺酸；F，苯丙胺酸；G，甘胺酸；H，組胺酸；I，異白胺酸；K，離胺酸；L，白胺酸；M，甲硫胺酸；N，天冬醯胺；P，脯胺酸；Q，麩醯胺酸；R，精胺酸；S，絲胺酸；T，蘇胺酸；V，纈胺酸；W，色胺酸；及Y，酪胺酸)。
術語「殘基」係指藉由醯胺鍵或醯胺鍵模擬物或編碼胺基酸或胺基酸模擬物之核酸(DNA或RNA)併入肽或蛋白質中之胺基酸殘基或胺基酸模擬物殘基。
如本文所用，「多肽」、「肽」及其文法同義字係指胺基酸殘基之聚合物。「成熟蛋白」為全長且視情況包括給定細胞環境中蛋白質典型的糖基化或其他修飾之蛋白質。本文所揭示之多肽及蛋白質(包括其功能性部分及功能性變體)可包含合成胺基酸而非一或多種天然存在的胺基酸。此類合成胺基酸為此項技術中已知的，且包括例如胺基環己烷甲酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-羥脯胺酸及反式-4-羥脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、4-羧基苯丙胺酸、β-苯基絲胺酸β-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己丙胺酸、環己基甘胺酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-苯甲基-N'-甲基-離胺酸、N',N'-二苯甲基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷甲酸、α-胺基環己烷甲酸、α-胺基環庚烷甲酸、α-(2-胺基-2-降冰片烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸及α-第三丁基甘胺酸。本發明進一步涵蓋，本文所描述之多肽在工程改造細胞中之表現可能與多肽構築體之一或多個胺基酸之轉譯後修飾相關。轉譯後修飾之非限制性實例包括磷酸化、醯化(包括乙醯化及甲醯化)、糖基化(包括N-連接及O-連接)、醯胺化、羥基化、烷基化(包括甲基化及乙基化)、泛素化、添加吡咯啶酮甲酸、形成二硫橋鍵、硫酸化、豆蔻醯化、棕櫚醯化、異戊烯化、法呢基化、香葉基化、糖基磷脂醯肌醇化、脂化及碘化。
術語「肽」係指通常藉由α-胺基與相鄰胺基酸殘基之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列胺基酸殘基。
「合成肽」係指獲自非天然來源，例如人造的肽。此類肽可使用諸如化學合成或重組DNA技術之方法產生。「合成肽」包括「融合蛋白」。
「抗原決定基」為一起形成藉由例如免疫球蛋白、T細胞受體、HLA分子或嵌合抗原受體識別之位點的分子，諸如一級、二級及三級肽結構及電荷之集體特徵。或者，抗原決定基可定義為涉及藉由特定免疫球蛋白識別之一組胺基酸殘基，或在T細胞之上下文中，藉由T細胞受體蛋白質、嵌合抗原受體及/或主要組織相容複合物(MHC)受體識別所需的彼等殘基。「T細胞抗原決定基」應理解為意謂可由呈肽呈現MHC分子或MHC複合物形式且隨後以此形式由T細胞，諸如T淋巴球或T-輔助細胞識別且結合的I或II類MHC分子結合的肽序列。抗原決定基可藉由自天然來源分離製備，或其可根據此項技術中之標準方案合成。合成抗原決定基可包含人工胺基酸殘基、「胺基酸模擬物」，諸如天然存在的L胺基酸殘基或非天然存在的胺基酸殘基之D異構體，諸如環己丙胺酸。在整個本發明中，抗原決定基可在一些情況下稱作肽或肽抗原決定基。應瞭解，包含本文所描述之抗原決定基或類似物以及一或多個額外胺基酸之蛋白質或肽仍在本發明之界限內。在某些實施例中，肽包含抗原片段。在某些實施例中，對本發明之肽之長度存在限制。當包含本文所描述之抗原決定基之蛋白質或肽包含與原生序列具有100%一致性之區域(亦即，一系列連續胺基酸殘基)時，存在長度限制實施例。為了避免例如在整個天然分子上由讀取抗原決定基界定，與原生肽序列具有100%一致性之任何區域之長度存在限制。因此，對於包含本文所描述之抗原決定基之肽及與原生肽序列具有100%一致性之區域，與原生序列具有100%一致性之區域一般具有以下長度：小於或等於600個胺基酸殘基，小於或等於500個胺基酸殘基，小於或等於400個胺基酸殘基，小於或等於250個胺基酸殘基，小於或等於100個胺基酸殘基，小於或等於個85胺基酸殘基，小於或等於75個胺基酸殘基，小於或等於65個胺基酸殘基，及小於或等於50個胺基酸殘基。在某些實施例中，本文所述之「抗原決定基」以最少5個胺基酸殘基之任何增量，由具有小於51個胺基酸殘基之與原生肽序列具有100%一致性的區域的肽構成；例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基。
術語「衍生」及其文法同義字在用於論述抗原決定基時為「製備」及其文法同義字之同義詞。衍生抗原決定基可自天然來源分離，或其可根據此項技術中之標準方案合成。合成抗原決定基可包含人工胺基酸殘基「胺基酸模擬物」，諸如天然存在之L胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基之D異構體，諸如環己丙胺酸。衍生或製備的抗原決定基可為原生抗原決定基之類似物。
「免疫原性」肽或「免疫原性」抗原決定基或「肽抗原決定基」為包含對偶基因特異性模體以使得肽將結合HLA分子且誘導細胞介導或體液反應，例如細胞毒性T淋巴球(CTL(例如CD8+ ))、輔助T淋巴球(Th (例如CD4+ ))及/或B淋巴球反應的肽。因此，本文所描述之免疫原性肽能夠與適當的HLA分子結合且其後誘導對肽之CTL (細胞毒性)反應或HTL (及體液)反應。
「新抗原」意謂由蛋白質之腫瘤特異性變化產生之一類腫瘤抗原。新抗原涵蓋但不限於由例如蛋白質序列取代、框移突變、融合多肽、框內缺失、插入、內源性反轉錄病毒多肽表現及多肽之腫瘤特異性過度表現產生的腫瘤抗原。
在本說明書中，可與「肽」互換使用之術語「突變型肽」、「腫瘤特異性肽」、「新抗原肽」及「新抗原肽」係指通常藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，通常L-胺基酸。類似地，在本說明書中，術語「多肽」可與「突變多肽」、「新抗原多肽」及「新抗原多肽」互換使用以表示通常藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，例如L-胺基酸。多肽或肽可為多種長度，呈其中性(不帶電)形式或呈鹽形式，且不含修飾，諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化或含有此等修飾，經受不破壞如本文所描述之多肽之生物活性的修飾的條件。如本文所用，肽或多肽包含至少一個側接序列。如本文所用，術語「側接序列」係指不為新抗原決定基之一部分的新抗原肽之片段或區域。
「新抗原決定基」、「腫瘤特異性新抗原決定基」、「腫瘤特異性抗原決定基」或「腫瘤抗原」係指不存在於參考物，諸如非病變細胞，例如非癌細胞或生殖系細胞中，但於病變細胞，例如癌細胞中可見之抗原決定基或抗原決定子區域。此包括對應抗原決定基可見於正常非病變細胞或生殖系細胞中，但歸因於病變細胞，例如癌細胞中之一或多個突變，抗原決定基之序列改變以產生新抗原決定基的情境。如本文所用，術語「新抗原決定基」係指肽或新抗原肽內之抗原決定子區域。新抗原決定基可包含至少一個「錨殘基」及至少一個「錨殘基側接區域」。新抗原決定基可進一步包含「分隔區域」。術語「錨殘基」係指結合至HLA上之特異性袋，產生與HLA之相互作用之特異性之胺基酸殘基。在一些情況下，錨殘基可在典型錨位置處。在其他情況下，錨殘基可在非典型錨位置處。新抗原決定基可經由突出至肽結合槽中之袋中之一級及二次錨殘基與HLA分子結合。在肽結合槽中，特定胺基酸構成容納所呈現之新抗原決定基之錨殘基之對應側鏈的袋。肽結合偏好存在於HLA I及HLA II分子兩者之不同對偶基因當中。I類HLA分子結合短新抗原決定基，其N端及C端錨定至位於新抗原決定基結合槽之末端處的袋中。儘管大部分I類HLA結合新抗原決定基具有約9個胺基酸，但可藉由凸出其中心部分容納更長新抗原決定基，產生具有約8至12個胺基酸之結合新抗原決定基。結合至II類HLA蛋白質之新抗原決定基不受尺寸限制，且可在約16至25個胺基酸範圍內變化。II類HLA分子中之新抗原決定基結合槽在兩端敞開，其允許具有相對更長長度之肽之結合。儘管核心9個胺基酸殘基長的區段最有助於識別新抗原決定基，但錨殘基側接區域對於肽對II類HLA對偶基因之特異性亦為重要的。在一些情況下，錨殘基側接區域為N端殘基。在另一情況下，錨殘基側接區域為C端殘基。在又一情況下，錨殘基側接區域為N端殘基及C端殘基。在一些情況下，錨殘基側接區域由至少兩個錨殘基側接。由錨殘基側接之錨殘基側接區域為「分隔區域」。
「主要組織相容複合物」或「MHC」為在控制引起生理學免疫反應之細胞相互作用方面起作用之基因集群。在人類中，MHC複合物亦稱為人類白血球抗原(HLA)複合物。對於MHC及HLA複合物之詳細描述，參見Paul, Fundamental Immunology，第3版, Raven Press, New York (1993)。「主要組織相容複合物(MHC)之蛋白質或分子」、「MHC分子」、「MHC蛋白質」或「HLA蛋白質」應理解為意謂能夠結合由蛋白質抗原之蛋白水解裂解產生之肽且表示潛在淋巴球抗原決定基(例如T細胞抗原決定基及B細胞抗原決定基)、將其傳輸至細胞表面且在彼處向特定細胞，尤其細胞毒性T淋巴球、T-輔助細胞或B細胞呈現其之蛋白質。基因體中之主要組織相容複合物包含表現於細胞表面上之基因產物對於結合及呈現內源及/或外源抗原且因此用於調整免疫過程而言重要的基因區域。主要組織相容複合物分為編碼不同蛋白質，亦即，MHC I類分子及MHC II類分子之兩個基因體。兩個MHC類別之細胞生物學及表現模式適於此等不同作用。
「人類白血球抗原」或「HLA」為人類I類或II類主要組織相容複合物(MHC)蛋白(參見例如Stites等人, Immunology，第8版, Lange Publishing, Los Altos, Calif. (1994)。
「肽-MHC (pMHC)穩定性」係指在生物化學分析中特定肽之一半量自同源HLA解離所耗費之時間長度。
「抗原呈現細胞」(APC)為呈現與其細胞表面上之MHC分子結合的蛋白質抗原之肽片段的細胞。一些APC可活化抗原特異性T細胞。成熟專職抗原呈現細胞藉由吞噬作用或藉由受體介導之內飲作用，且隨後在其膜上呈現結合至II類MHC分子之抗原之片段而在內化抗原方面極其有效。T細胞識別且與抗原呈現細胞膜上之抗原-II類MHC分子複合物相互作用。額外協同刺激信號隨後藉由抗原呈現細胞產生，引起T細胞活化。協同刺激分子之表現為專職抗原呈現細胞之定義性特徵。專職抗原呈現細胞之主要類型為具有最寬抗原呈現範圍之樹突狀細胞且很可能為最重要的抗原呈現細胞、巨噬細胞、B細胞及某些活化上皮細胞。「樹突狀細胞(DC)」為經由MHC II及I類抗原呈現路徑將在周邊組織中捕獲之抗原呈現至T細胞的白血球群體。熟知樹突狀細胞為免疫反應之強效誘導劑，且此等細胞之活化為抗腫瘤免疫誘導之關鍵步驟。樹突狀細胞適宜地分成「不成熟」及「成熟」細胞，其可用作在兩種良好表徵表型之間辨別的簡單方式。然而，此命名法不應視為不包括所有可能的分化中間階段。不成熟樹突狀細胞表徵為具有抗原吸收及處理高容量之抗原呈現細胞，其與Fc受體(FcR)及甘露糖受體之較高表現相關。成熟表型之特徵通常在於此等標記物之較低表現，及引起T細胞活化之細胞表面分子，諸如I類及II類MHC、黏附分子(例如CD54及CD11)及協同刺激分子(例如CD40、CD80、CD86及4-1 BB)之高表現。
術語「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核酸」、「聚核酸」或「寡核苷酸」及其文法同義字在本文中可互換使用，且係指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA，例如mRNA。因此，此等術語包括雙股及單股DNA、三股螺旋DNA以及雙股及單股RNA。其亦包括例如藉由甲基化及/或藉由封端經修飾及未經修飾之聚核苷酸形式。術語亦意欲包括：包括非天然存在或合成核苷酸以及核苷酸類似物之分子。本文中所揭示或涵蓋之核酸序列及載體可藉由例如轉染、轉形或轉導引入至細胞中。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/或其類似物或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之受質。在一些實施例中，聚核苷酸及核酸可為活體外轉錄之mRNA。在一些實施例中，使用本發明之方法投與之聚核苷酸為mRNA。
「參考物」可用於與本發明之方法中自腫瘤樣本中所獲得之結果進行關聯及比較。通常，「參考物」可基於一或多種正常樣本，尤其不受癌症疾病影響之樣本(獲自患者或一或多個不同個體，例如健康個體，尤其相同物種之個體)獲得。「參考物」可憑經驗藉由測試足夠大數目之正常樣本測定。
術語「突變」或「突變型」係指與參考物相比核酸序列之變化或差異(核苷酸取代、添加、插入或缺失)。「體細胞突變」可出現在除胚細胞(精子及卵)外之任何身體細胞中且因此不傳給後代。此等改變可(但不總是)引起癌症或其他疾病。在一些實施例中，突變為非同義突變。術語「非同義突變」係指突變，例如核苷酸取代，其引起胺基酸改變，諸如轉譯產物中之胺基酸取代。「框移」在突變干擾基因密碼子週期性(亦稱為「閱讀框架」)之正相，從而引起非原生蛋白質序列之轉譯時發生。基因中之不同突變有可能達成相同改變的閱讀框架。當開放閱讀框架(ORF)經由基因體中之各種突變事件(諸如錯義突變、融合轉錄、框移及/或終止密碼子損失)改變時，可產生「新ORF」。新ORF可編碼不存在於正常基因體中之新穎胺基酸序列。
「保守胺基酸取代」為一個胺基酸殘基經具有類似側鏈之另一個胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例而言，用苯丙胺酸取代酪胺酸為保守性取代。鑑別不消除肽功能之核苷酸及胺基酸保守性取代的方法在此項技術中已熟知。
「原生」或「野生型」序列係指自然界中發現之序列。此類序列可包含自然界中之較長序列。
如本文所用，術語「親和力」係指結合對之兩個成員，例如HLA結合肽及I或II類HLA之間的結合強度之量度。KD 為解離常數且具有莫耳濃度之單位。親和力常數為解離常數之倒數。親和力常數有時用作描述此化學實體之通用術語。其為結合能量之直接量度。可以實驗方式，例如藉由表面電漿子共振(SPR)，使用市售Biacore SPR單元測定親和力。親和力亦可表示為置換50%肽所處之濃度的抑制性濃度50 (IC50 )。同樣地，ln(IC50 )係指IC50 之自然對數。Koff 係指解離速率常數，例如對於HLA結合肽及I或II類HLA之解離。在整個本發明中，「結合資料」或「結合分析」結果可用「IC50 」表示。IC50 為觀測到標記參考肽之結合之50%抑制所處的結合分析中的測試肽的濃度。給定進行分析之條件(亦即，限制HLA蛋白質及標記參考肽濃度)，此等值近似KD 值。用於測定結合之分析為此項技術中所熟知的且詳細描述於例如PCT公開案WO 94/20127及WO 94/03205及其他公開案中，諸如Sidney等人, Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998)；Sidney等人, J. Immunol. 154:247 (1995)；及Sette等人, Mol. Immunol. 31:813 (1994)。或者，結合可相對於藉由參考標準肽之結合表示。舉例而言，相對於參考標準肽之IC50 ，可基於其IC50 。亦可使用其他分析系統測定結合，該等分析系統包括使用以下之分析系統：活細胞(例如Ceppellini等人, Nature 339:392 (1989)；Christnick等人, Nature 352:67 (1991)；Busch等人, Int. Immunol. 2:443 (1990)；Hill等人, J. Immunol. 147:189 (1991)；del Guercio等人, J. Immunol. 154:685 (1995))、使用清潔劑溶解物之無細胞系統(例如Cerundolo等人, J. Immunol. 21:2069 (1991))、固定純化MHC (例如Hill等人, J. Immunol. 152, 2890 (1994)；Marshall等人, J. Immunol. 152:4946 (1994))、ELISA系統(例如Reay等人, EMBO J. 11:2829 (1992))、表面電漿子共振(例如Khilko等人, J. Biol. Chem. 268:15425 (1993))；高通量可溶相分析(Hammer等人, J. Exp. Med. 180:2353 (1994))，及I類MHC穩定化或組裝之量測(例如Ljunggren等人, Nature 346:476 (1990)；Schumacher等人, Cell 62:563 (1990)；Townsend等人, Cell 62:285 (1990)；Parker等人, J. Immunol. 149:1896 (1992))。「交叉反應結合」指示肽與多於一個HLA分子結合；同義詞為簡併結合(degenerate binding)。
如本文所用，術語「天然存在」及其文法同義字係指物體在自然界中可見之事實。舉例而言，存在於生物體(包括病毒)中且可自自然界中之來源分離且人類尚未在實驗室中有意修飾之肽或核酸為天然存在的。
「抗原處理」或「處理」及其文法同義字係指多肽或抗原降解成處理產物，其為該多肽或抗原之片段(例如多肽降解成肽)及此等片段中之一或多者與藉由細胞，例如抗原呈現細胞呈現至特定T細胞之MHC分子(例如經由結合)結合。
術語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限於人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒動物及其類似動物，其為特定治療之接受者。通常，術語「個體」及「患者」在本文中提及人類個體時可互換使用。
「細胞」及其文法同義字係指人類或非人類動物來源之細胞。
「T細胞」包括CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。術語T細胞亦包括T輔助1型T細胞及T輔助2型T細胞兩者。
根據本發明，術語「疫苗」係指在投與時誘發免疫反應，例如細胞或體液免疫反應(其識別且攻擊病原體或病變細胞，諸如癌細胞)之醫藥製劑(醫藥組合物)或產品。疫苗可用於預防或治療疾病。術語「個別化癌症疫苗」或「個體化癌症疫苗」涉及特定癌症患者且意謂癌症疫苗適於個別癌症患者之需求或特定情況。
術語「有效量」或「治療有效量」或「治療作用」係指可有效地「治療」個體或哺乳動物之疾病或病症之治療劑的量。藥物之治療有效量具有治療作用，且因此可預防疾病或病症發展；減緩疾病或病症發展；減緩疾病或病症進展；在一定程度上緩解與疾病或病症相關之症狀中之一或多者；降低發病率及死亡率；改良生活品質；或此類作用之組合。
術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」或「以治療」或「緩解」或「以緩解」係指以下兩者：(1)治癒、減緩、減輕診斷病理病狀或病症的症狀及/或中斷其進展之治療措施；及(2)預防或減緩靶向的病理病狀或病症之發展之防治或預防措施。因此，需要治療者包括已經患有病症者；易於患有病症者；及待預防病症者。
「醫藥學上可接受」係指一般無毒、惰性及/或生理相容組合物或組合物之組分。
「醫藥賦形劑」或「賦形劑」包含諸如佐劑、載劑、pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑、防腐劑及其類似物的材料。「醫藥賦形劑」為醫藥學上可接受之賦形劑。
如本文所用，「免疫調節劑」或其文法同義字可指可刺激或遏制免疫系統且可幫助個體身體來對抗例如感染、癌症等之疾病的物質。影響免疫系統之特定部分之特定免疫調節劑之實例包括但不限於單株抗體、細胞介素及疫苗。非特異性免疫調節劑以一般方式影響免疫系統，且非限制性實例包括卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)及左旋咪唑(levamisole)。
如本文所用，術語「癌症」及其文法同義字可指細胞過度增殖，其獨特特點-正常控制喪失-造成不受調控之生長、缺乏分化、局部組織侵襲，及轉移。關於本發明組合物及方法，癌症可為任何癌症，包括以下中之任一者：急性淋巴球性癌症、急性骨髓白血病、齒槽橫紋肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌、直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外陰癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、纖維肉瘤、腸胃類癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、喉咽癌、腎癌、喉癌、白血病、液體腫瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、惡性間皮瘤、肥胖細胞瘤、黑素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、腸網膜癌及腸系膜癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、實體腫瘤、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、尿管癌及/或膀胱癌。如本文所用，術語「腫瘤」係指例如惡性類型或良性類型之細胞或組織之異常生長。
術語「外顯子組」係指編碼功能蛋白的基因體部分，或基因體中編碼蛋白質之基因之涵蓋所有外顯子或編碼區之序列。其視物種而定，為整個基因體之約1%至2%。
「稀釋劑」包括無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。水亦為用於醫藥組合物之稀釋劑。例如可注射溶液中亦可使用生理食鹽水溶液及水性右旋糖及甘油溶液作為稀釋劑。
「受體」應理解為意謂能夠結合配位體的生物分子或分子群。受體可用於傳輸細胞、細胞形成物或生物體中之資訊。受體包含至少一個受體單元，例如其中各受體單元可由蛋白質分子組成。受體具有與配位體互補的結構且可作為結合搭配物與配位體複合。該資訊尤其藉由在細胞表面上之配位體複合之後受體之構形變化傳輸。在一些實施例中，受體應理解為尤其意謂能夠與配位體形成受體/配位體複合物之I及II類MHC之蛋白質，特定言之，適合長度之肽或肽片段。
「配位體」應理解為意謂具有與受體結構互補之結構且能夠與此受體形成複合物的分子。在一些實施例中，配位體應理解為意謂在其胺基酸序列中具有適合的長度及適合的結合模體，以使得肽或肽片段能夠與MHC I類或MHC II類之蛋白質形成複合物的肽或肽片段。
在一些實施例中，「受體/配位體複合物」亦應理解為意謂「受體/肽複合物」或「受體/肽片段複合物」，包括呈現肽或肽片段之I類或II類之MHC分子。
術語「模體」係指經界定長度之胺基酸序列中之殘基圖案，例如小於約15個胺基酸殘基長或小於約13個胺基酸殘基長，例如約8至約13個胺基酸殘基(例如8、9、10、11、12或13) (對於I類HLA模體)及約6至約25個胺基酸殘基(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25) (對於II類HLA模體)的肽，其由特定HLA分子識別。對於由給定人類HLA對偶基因編碼之各HLA蛋白，模體通常不同。此等模體不同之處在於其一級及二級錨殘基之圖案。在一些實施例中，MHC I類模體鑑別9、10或11個胺基酸殘基長之肽。
如本文所用，術語「一致」及其文法同義字或在多肽之兩個核酸序列或胺基酸序列之上下文中的「序列一致性」係指當經由指定比較窗比對最大對應性時相同的兩個序列中之殘基。如本文所用，「比較窗」係指具有至少約20個連續位置，通常約50至約200個，更通常約100至約150個連續位置之區段，其中在最佳比對兩個序列之後，序列可與具有相同數目個連續位置之參考序列相比較。用於比較之序列比對的方法為此項技術中熟知的。用於比較之最佳序列比對可藉由以下進行：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)之局部同源性演算法；藉由Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)之比對演算法；藉由Pearson及Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)之類似性檢索方法；藉由此等演算法之電腦化實施方案(包括但不限於Intelligentics, Mountain View Calif.之PC/Gene程式中之CLUSTAL；Wisconsin Genetics套裝軟體, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.中之GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA)；Higgins及Sharp, Gene, 73:237-244 (1988)及Higgins及Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)中充分描述之CLUSTAL程式；Corpet等人, Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988)；Huang等人, Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992)；及Pearson等人, Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)。比對亦通常藉由檢測及手動比對進行。在一類實施例中，本文中之多肽與參考多肽或其片段具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，例如使用預設參數如藉由BLASTP (或CLUSTAL或任何其他可用的比對軟體)所量測。類似地，核酸亦可參考起始核酸描述，例如其可與參考核酸或其片段具有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、98%、99%或100%序列一致性，例如使用預設參數如藉由BLASTN (或CLUSTAL或任何其他可用的比對軟體)所量測。當一個分子據稱與較大分子具有一定百分比之序列一致性時，其意謂當兩個分子最佳比對時，根據兩個分子最佳比對的順序，較小分子中該百分比之殘基與較大分子中之殘基匹配。
適用於核酸或胺基酸序列之術語「實質上一致」及其文法同義字意謂，核酸或胺基酸序列包含使用標準參數使用上文所描述之程式(例如BLAST)與參考序列相比具有至少90%或更多、至少95%、至少98%及至少99%序列一致性的序列。舉例而言，BLASTN程式(就核苷酸序列而言)使用如下預設值：字長(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N=-4及比較兩股。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長(W) 3、期望值(E) 10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))作為預設值。序列一致性百分比藉由在比較窗上比較兩個最佳比對的序列來確定，其中為了使兩個序列達成最佳比對，聚核苷酸序列在比較窗中之部分相較於參考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(亦即空隙)。藉由測定兩個序列中存在之一致核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數獲得匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100獲得序列一致性百分比，來計算序列一致性百分比。在實施例中，實質上一致性在至少約50個殘基長之序列區域上，在至少約100個殘基之區域上存在，且在實施例中，序列在至少約150個殘基上實質上一致。在實施例中，序列在編碼區之整個長度上實質上一致。
如本文所用，術語「載體」意謂能夠遞送且通常在宿主細胞中表現一或多個相關基因或序列的構築體。載體之實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體及囊封在脂質體中之DNA或RNA表現載體。
「經分離」之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為呈自然界中不存在之形式的多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物。經分離之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物包括已在一定程度上純化，使得其不再呈自然界中所發現之形式的彼等物。在一些實施例中，經分離之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物實質上為純的。在一些實施例中，「經分離之聚核苷酸」涵蓋PCR或定量PCR反應物，其包含在PCR或定量PCR反應中擴增之聚核苷酸。
術語「經分離」、「生物上純的」或其文法同義字係指實質上或基本上不含組分的材料，該等組分在該材料原生狀態下發現時通常伴隨該材料。因此，本文所描述之經分離之肽不含有通常與其原位環境中之肽相關之材料中之一些或全部。「經分離」的抗原決定基係指不包括衍生抗原決定基之抗原之完整序列的抗原決定基。通常，「經分離」的抗原決定基不具有附著於其上、產生在原生序列之整個長度上具有100%一致性之序列的額外胺基酸殘基。原生序列可為衍生抗原決定基的序列，諸如腫瘤相關抗原。因此，術語「經分離」意謂自其原始環境(例如若其為天然存在的，則為天然環境)移出該材料。「經分離」的核酸為自其天然環境移出之核酸。舉例而言，活動物中存在之天然存在的聚核苷酸或肽為未分離的，但與天然系統中之共存材料中之一些或全部分離的相同聚核苷酸或肽為經分離的。此類聚核苷酸可為載體之部分，及/或此類聚核苷酸或肽可為組合物之部分，且仍為「經分離」的，因為此類載體或組合物不為其天然環境之部分。經分離之RNA分子包括本文所描述之DNA分子之活體內或活體外RNA轉錄物，且進一步包括以合成方式產生之此類分子。
如本文所用，術語「實質上純的」係指至少50%純(亦即，不含污染物)、至少90%純、至少95%純、至少98%純或至少99%純的材料。
如本文所用，「轉染」、「轉形」或「轉導」係指藉由使用物理或化學方法將一或多種外源聚核苷酸引入至宿主細胞中。許多轉染技術為此項技術中已知的且包括例如磷酸鈣DNA共沈澱(參見例如Murray E.J. (編), Methods in Molecular Biology, 第7卷, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991))；DEAE-葡聚糖；電穿孔；陽離子脂質體介導之轉染；鎢粒子促進之微粒轟擊(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990))；及磷酸鍶DNA共沈澱(Brash等人, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))。在感染性粒子於適合的封裝細胞(其中許多為市售的)中生長之後，可將噬菌體或病毒載體引入至宿主細胞中。2. 增強之裂解及其用途
研發治癒性及腫瘤特異性免疫療法之關鍵障礙中之一者為用於抗原呈現的最小抗原決定基的處理及釋放不充分而無法產生足夠的免疫反應。抗原處理及呈現係指發生於細胞內之過程，其引起蛋白質之片段化或蛋白分解、蛋白質片段或肽與主要組織相容複合物(MHC)分子之結合及在細胞表面上肽-MHC (pMHC)分子之表現以由T細胞上之T細胞受體(TCR)識別。抗原呈現藉由在抗原呈現細胞(APC)及某些其他細胞之表面上發現的MHC I類分子及MHC II類分子介導。MHC I類及MHC II類分子將短肽遞送至細胞表面，從而允許此等肽分別由細胞毒性(CD8+ )及輔助(CD4+ ) T細胞識別。TCR可識別僅呈結合於細胞表面上之MHC分子之肽形式的抗原，且由T細胞識別之抗原為由大分子結構分解、個別蛋白質去摺疊及其經由抗原處理而裂解為短片段產生之肽。
細胞表面上之抗原呈現需要肽之正確處理以藉由蛋白酶體、細胞溶質及內質網(ER)胺基肽酶釋放最小抗原決定基、有效抗原處理相關轉運體(TAP)轉運及與MHC I類分子之充分結合。抗原決定基產生之效率不僅視抗原決定基自身而定，且亦視其側接區域或側接抗原決定基之胺基酸序列之胺基酸序列而定。未完全瞭解處理來自包含抗原決定基序列及側接抗原決定基序列之胺基酸序列之肽之最小抗原決定基的效率，但已知其受包括肽中之裂解位點及附近之其他競爭裂解位點之兩側上之特定胺基酸殘基的多個因子影響。
解決最小抗原決定基之不充分處理及釋放問題之一種方式為研究及設計可添加至抗原決定基序列之N端及/或C端以增強肽之裂解及處理及抗原決定基之呈現的特定胺基酸殘基或序列。舉例而言，可將已知處理有效之來自其他抗原決定基之胺基酸殘基或序列添加至抗原決定基序列中。另一實例為使用已知在抗原決定基周圍通常觀測到之胺基酸殘基(Abelin等人, 2017, Immunity 46, 315-326)。此方法可賦予額外益處，包括促進肽之製造(例如合成、純化及/或調配)或更容易的下游修飾(例如與其他分子結合)。
解決有效處理及釋放最小抗原決定基之當前障礙的另一方式為使用蛋白酶可裂解連接子靶向含抗原決定基肽以進行位點特異性蛋白酶處理以釋放抗原決定基。舉例而言，可容易地在樹突狀細胞(DC)內裂解以釋放最小抗原決定基序列之特定連接子可用於增強疫苗接種之後的CD8依賴性免疫反應。另外，此等肽將不非選擇性結合於非專職APC之表面上的MHC I類分子，且實際上將經由特定(例如內飲作用)路徑經適當處理且呈現至T細胞。又，促進充分抗原決定基處理及呈現之另一實例係組合兩個策略，亦即特定胺基酸殘基及特定連接子。
本文中提供多肽，其包含由個體之基因體編碼之抗原決定基序列、可或可不由緊接在個體基因體中編碼抗原決定基序列之核酸序列上游或下游的核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列、胺基酸或胺基酸序列及/或連接子。添加胺基酸、胺基酸序列及/或連接子至抗原決定基序列可增強藉由APC之抗原決定基處理及呈現以產生免疫反應。在一個態樣中，胺基酸或胺基酸序列為胺基酸序列或肽序列之胺基酸或胺基酸序列。在一個實施例中，胺基酸序列或肽序列不由緊接在個體之基因體中編碼抗原決定基序列之核酸序列上游或下游的核酸序列編碼。在另一個實施例中，胺基酸或胺基酸序列與抗原決定基序列鄰接且由編碼抗原決定基序列之個體之基因體編碼。舉例而言，與抗原決定基序列鄰接之胺基酸或胺基酸序列可包含一或多個增強多肽之裂解的胺基酸殘基(例如離胺酸)。在此類實施例中，多肽可包含與抗原決定基序列鄰接之胺基酸或胺基酸序列且可進一步包含不由緊接在個體基因體中編碼抗原決定基序列之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列。
在一些實施例中，抗原決定基由APC之I類MHC呈現。在一些實施例中，抗原決定基由APC之II類MHC呈現。在一些實施例中，抗原決定基之各胺基酸表示包含由個體之基因體中之核酸序列編碼之任何連續胺基酸序列的肽序列之胺基酸。在一些實施例中，抗原決定基包含8至12個連續胺基酸殘基且由APC之I類MHC呈現。在一些實施例中，抗原決定基包含8、9、10、11或12個連續胺基殘基且由APC之I類MHC呈現。在一些實施例中，抗原決定基包含9至25個連續胺基酸殘基且由APC之II類MHC呈現。在一些實施例中，抗原決定基包含9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續胺基酸殘基且由APC之II類MHC呈現。在一些實施例中，抗原決定基序列包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續胺基酸殘基，其中第13至第25個胺基酸中之一或多者視情況存在且至少一個胺基酸為突變型胺基酸。在一些實施例中，抗原決定基序列包含AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 AA8 AA9 AA10 AA11 AA12 AA13 AA14 AA15 AA16 AA17 AA18 AA19 AA20 AA21 AA22 AA23 AA24 AA25 ，其中各AA為胺基酸，且AA9 、AA10 、AA11 、AA12 、AA13 、AA14 、AA15 、AA16 、AA17 、AA18 、AA19 、AA20 、AA21 、AA22 、AA23 、AA24 及AA25 中之一或多者視情況存在，且至少一個AA為突變型胺基酸。
在一些實施例中，包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接，且由緊接在個體之基因體中之編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游的核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列的多肽可不包含連接子。在一些實施例中，包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接，且由緊接在個體之基因體中之編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游的核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列的多肽可包含連接子。在一些實施例中，包含抗原決定基序列及不由緊接在個體之基因體中編碼抗原決定基序列之核酸序列上游或下游的核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列的多肽可進一步包含連接子。在一些實施例中，包含抗原決定基序列及不由緊接在個體之基因體中編碼抗原決定基序列之核酸序列上游或下游的核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列的多肽可不包含連接子。
在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列之長度包含0至1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列長度包含0至1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列長度包含0至1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列長度包含多於0、多於1、多於2、多於3、多於4、多於5、多於6、多於7、多於8、多於9、多於10、多於15、多於20、多於25、多於30、多於35、多於40、多於45、多於50、多於55、多於60、多於65、多於70、多於75、多於80、多於85、多於90、多於95、多於100、多於150、多於200、多於250、多於300、多於350、多於400、多於450、多於500、多於550、多於600、多於650、多於700、多於750、多於800、多於850、多於900個或多於950個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列長度包含多於0、多於1、多於2、多於3、多於4、多於5、多於6、多於7、多於8、多於9、多於10、多於15、多於20、多於25、多於30、多於35、多於40、多於45、多於50、多於55、多於60、多於65、多於70、多於75、多於80、多於85、多於90、多於95、多於100、多於150、多於200、多於250、多於300、多於350、多於400、多於450、多於500、多於550、多於600、多於650、多於700、多於750、多於800、多於850、多於900個或多於950個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列長度包含多於0、多於1、多於2、多於3、多於4、多於5、多於6、多於7、多於8、多於9、多於10、多於15、多於20、多於25、多於30、多於35、多於40、多於45、多於50、多於55、多於60、多於65、多於70、多於75、多於80、多於85、多於90、多於95、多於100、多於150、多於200、多於250、多於300、多於350、多於400、多於450、多於500、多於550、多於600、多於650、多於700、多於750、多於800、多於850、多於900個或多於950個胺基酸殘基。
在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列之長度包含1至5個或7至1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列之長度不包含6個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列長度包含1至5個或7至1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列長度不包含6個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列長度包含1至4個或6至1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列長度不包含5個胺基酸殘基。
在一些實施例中，多肽進一步包含連接子。在一些實施例中，多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成。在一些實施例中，多肽不包含由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基。在一些實施例中，多肽包含至少兩種由I類MHC呈現之不同抗原決定基。在一些實施例中，多肽包含至少三種、至少五種或至少六種由I類MHC呈現之不同抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係由個體之基因體中之核酸序列中的插入、缺失、框移、新ORF或點突變編碼。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游或上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列自抗原決定基裂解。在一些實施例中，多肽包含至少兩種不同多肽分子。在一些實施例中，多肽包含至少三種、至少四種或至少五種不同多肽分子。
在一些實施例中，本發明包括包含不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游或上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列的多肽，及/或連接子。胺基酸或胺基酸序列及/或連接子可提供多肽所要特性，諸如溶解度、穩定性、免疫原性、抗原處理或抗原呈現的增加。在一些實施例中，多肽可包含增強APC之抗原決定基處理及呈現(例如，產生免疫反應)之胺基酸或胺基酸序列。在一些實施例中，多肽可包括位於抗原決定基序列之N端及/或C端上之胺基酸或胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列可包含聚-離胺酸(聚-Lys或聚K)或聚-精胺酸(聚-Arg或聚R)。在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列可為不在表現抗原決定基之個體中表現(例如不由編碼抗原決定基序列之個體的基因體編碼)之蛋白質的多肽序列。在另一實施例中，多肽可包含可由蛋白酶裂解之連接子。在一些實施例中，多肽可包含蛋白酶可裂解連接子及胺基酸或胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供式(I)、(II)、(III)及/或(IV)多肽或式(I)、(II)、(III)及/或(IV)多肽之醫藥學上可接受之鹽，其中立體化學為未定義的，例如外消旋體或非對映異構體之混合物或個別非對映異構體。熟習此項技術者將認識到，在製備式(I)、(II)、(III)及/或(IV)化合物之任何階段，可利用對應於式(I)、(II)、(III)及/或中之任一者之化合物之異構體(例如外消旋體)之混合物。在製備之任何階段，單一立體異構體可藉由利用例如對掌性層析分離使其自異構體混合物(例如外消旋體)分離而獲得。
在一些實施例中，連接子包含非多肽連接子。在一些實施例中，連接子包含化學連接子。在一些實施例中，連接子包含非天然胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸包含β-γ-δ-胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸包含L-α-胺基酸之衍生物。在一些實施例中，連接子不包含胺基酸。在一些實施例中，連接子不包含天然胺基酸。在一些實施例中，連接子包含除肽鍵以外之鍵。在一些實施例中，連接子包含二硫鍵。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含超過一個連接子。在一些實施例中，本文中所描述之多肽包含第一連接子及第二連接子，其中第一連接子係在抗原決定基之N端且第二連接子係在抗原決定基之C端。在一些實施例中，第一連接子及第二連接子不同。在一些實施例中，第一連接子及第二連接子相同。
在一些實施例中，多肽包含親水性尾。在一些實施例中，包含抗原決定基序列、不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游或上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列及/或連接子的多肽，相較於不具有胺基酸或胺基酸序列及/或連接子之包含相同抗原決定基序列的多肽，具有增強之溶解度。在一些實施例中，包含抗原決定基序列及由個體之基因體中之核酸序列編碼的與抗原決定基序列鄰接的胺基酸或胺基酸序列之多肽，相較於不具有胺基酸或胺基酸序列之包含相同抗原決定基序列的多肽，具有增強之溶解度。舉例而言，與抗原決定基序列鄰接的胺基酸或胺基酸序列可包含一或多個增強多肽之溶解度的胺基酸殘基(例如離胺酸)。在此類實施例中，多肽可包含與抗原決定基序列鄰接的胺基酸或胺基酸序列，且可進一步包含不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游或上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列。
在一些實施例中，當由APC處理多肽時，抗原決定基自包含抗原決定基序列之多肽釋放。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於包含相同抗原決定基，但不包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子的多肽，抗原決定基以更高速率釋放。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於包含相同抗原決定基，但不包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子的多肽，抗原決定基以更高速率釋放。在一些實施例中，當胺基酸或胺基酸序列不為在個體內表現之蛋白質之肽序列之胺基酸或胺基酸序列時，抗原決定基以較高速率釋放。在一些實施例中，當多肽包含連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含連接子之多肽，抗原決定基以更高速率釋放。在一些實施例中，當多肽包含可藉由蛋白酶裂解之連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含可藉由蛋白酶裂解之連接子的多肽，抗原決定基以更高速率釋放。
在一些實施例中，當包含抗原決定基及包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的額外胺基酸的胺基酸或胺基酸序列之多肽進一步包含不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於包含相同抗原決定基及包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的額外胺基酸的胺基酸或胺基酸序列，但不包含不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子之對應多肽，抗原決定基以更高速率釋放。
在一些實施例中，當多肽包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸的胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，多肽以更高的速率裂解。在一些實施例中，當多肽包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸的胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，多肽以更高的速率裂解。在一些實施例中，當胺基酸或胺基酸序列不為在個體內表現之蛋白質之肽序列之胺基酸或胺基酸序列時，多肽以較高速率裂解。在一些實施例中，當多肽包含連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含連接子之多肽，多肽以更高速率裂解。在一些實施例中，當多肽包含可藉由蛋白酶裂解之連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含可藉由蛋白酶裂解之連接子的多肽，多肽以更高速率裂解。
在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高速率裂解。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高速率裂解。
在一些實施例中，當多肽包含(i)由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及(ii)不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及/或(iii)連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，多肽以更高速率裂解。
在一些實施例中，當由APC處理多肽時，多肽在連接子區域處裂解。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，多肽以更高速率在連接子區域處裂解。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，多肽以更高速率在連接子區域處裂解。在一些實施例中，當胺基酸或胺基酸序列不為在個體內表現之蛋白質之肽序列之胺基酸或胺基酸序列時，多肽以更高速率在連接子區域處裂解。
在一些實施例中，當由APC處理多肽時，藉由APC之抗原決定基呈現增強。在一些實施例中，當包含抗原決定基之多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，藉由APC之抗原決定基呈現增強。在一些實施例中，當包含抗原決定基之多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，藉由APC之抗原決定基呈現增強。在一些實施例中，當胺基酸或胺基酸序列不為在個體內表現之蛋白質之肽序列之胺基酸或胺基酸序列時，藉由APC之抗原決定基呈現增強。在一些實施例中，當多肽包含連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含連接子之多肽，藉由APC之抗原決定基呈現增強。在一些實施例中，當多肽包含可藉由蛋白酶裂解之連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含可藉由蛋白酶裂解之連接子的多肽，藉由APC之抗原決定基呈現增強。
在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，藉由APC之抗原決定基呈現增強。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，藉由APC之抗原決定基呈現增強。
在一些實施例中，當多肽包含(i)由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及(ii)不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及/或(iii)連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，藉由APC之抗原決定基呈現增強。
在一些實施例中，當由APC處理多肽時，免疫原性增強。在一些實施例中，當包含抗原決定基之多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，免疫原性增強。在一些實施例中，當包含抗原決定基之多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，免疫原性增強。在一些實施例中，當胺基酸或胺基酸序列不為在個體內表現之蛋白質之肽序列之胺基酸或胺基酸序列時，免疫原性增強。在一些實施例中，當多肽包含連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含連接子之多肽，免疫原性增強。在一些實施例中，當多肽包含可藉由蛋白酶裂解之連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含可藉由蛋白酶裂解之連接子的多肽，免疫原性增強。
在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，免疫原性增強。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，免疫原性增強。
在一些實施例中，當多肽包含(i)由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及(ii)不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及/或(iii)連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，免疫原性增強。
在一些實施例中，當由APC處理多肽時，抗腫瘤活性增強。在一些實施例中，當包含抗原決定基之多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，APC之抗腫瘤活性增強。在一些實施例中，當包含抗原決定基之多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，抗腫瘤活性增強。在一些實施例中，當胺基酸或胺基酸序列不為在個體內表現之蛋白質之肽序列之胺基酸或胺基酸序列時，抗腫瘤活性增強。在一些實施例中，當多肽包含連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含連接子之多肽，抗腫瘤活性增強。在一些實施例中，當多肽包含可藉由蛋白酶裂解之連接子時，相較於包含相同抗原決定基但不包含可藉由蛋白酶裂解之連接子的多肽，抗腫瘤活性增強。
在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，抗腫瘤活性增強。在一些實施例中，當多肽進一步包含不包含至少一個由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的額外胺基酸之胺基酸或胺基酸序列時，相較於包含抗原決定基序列及與抗原決定基序列鄰接的由核酸序列編碼之胺基酸或胺基酸序列且不包含連接子之相同長度的對應多肽之裂解，抗腫瘤活性增強。
在一些實施例中，當多肽包含(i)由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及(ii)不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列，及/或(iii)連接子時，相較於具有相同長度及抗原決定基及由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的胺基酸或胺基酸序列之對應多肽，抗腫瘤活性增強。
在一些實施例中，當由APC處理多肽時，APC將抗原決定基呈現至免疫細胞。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，APC優先或特異性地將抗原決定基呈現至免疫細胞。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，APC將抗原決定基呈現至吞噬細胞。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，APC優先或特異性地將抗原決定基呈現至吞噬細胞。在一些實施例中，當由APC處理多肽時，APC將抗原決定基呈現至樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜中性白血球或單核球。在一些實施例中，APC優先或特異性地將抗原決定基呈現至樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜中性白血球或單核球。
在一些實施例中，多肽包含選自由聚-Lys (聚K)及聚-Arg (聚R)組成之群的胺基酸序列。在一較佳實施例中，多肽包含聚K序列。在一些實施例中，多肽包含選自由聚K-AA-AA及聚R-AA-AA組成之群的序列，其中各AA為胺基酸或其類似物或衍生物。在一較佳實施例中，多肽包含聚K-AA-AA。在一些實施例中，聚K包含聚-L-Lys。在一些實施例中，聚K包含至少兩個連續離胺酸殘基。在一些實施例中，聚K包含至少三個連續離胺酸殘基，例如Lys-Lys-Lys。在一較佳實施例中，聚K包含至少四個連續離胺酸殘基，例如，Lys-Lys-Lys-Lys，亦稱為K4。在一些實施例中，聚K包含至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少10個連續離胺酸殘基。在一些實施例中，聚R包含聚-L-Arg。在一些實施例中，聚R包含至少兩個連續精胺酸殘基。在一些實施例中，聚R包含至少三個連續精胺酸殘基，例如Arg-Arg-Arg。在一些實施例中，聚R包含至少四個、至少五個、至少六個或至少七個連續精胺酸殘基。在一些實施例中，聚R包含至少八個連續精胺酸殘基，例如Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg，亦稱為R8。在一些實施例中，聚R包含至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少10個連續精胺酸殘基。在一些實施例中，聚K中之離胺酸單元及/或聚R中之精胺酸單元各自可具有(L)立體化學組態、(D)立體化學組態或(L)與(D)立體化學組態之任何混合物。
在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群的連接子：二硫基、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)及AA-AA-PABC，其中AA為胺基酸或其類似物或衍生物。在一些實施例中，AA-AA-PABC係選自由以下組成之群：丙胺酸-離胺酸-PABC (Ala-Lys-PABC)、纈胺酸-瓜胺酸-PABC (Val-Cit-PABC)及苯丙胺酸-離胺酸-PABC (Phe-Lys-PABC)。在一些實施例中，AA-AA-PABC為Ala-Lys-PABC。在一些實施例中，AA-AA-PABC為Val-Cit-PABC。在一些實施例中，AA-AA-PABC為Phe-Lys-PABC。在一些實施例中，Val-Cit-PABC中之纈胺酸及瓜胺酸單元各自具有(L)立體化學組態。在一些實施例中，Phe-Lys-PABC中之苯丙胺酸及離胺酸單元各自具有(L)立體化學組態。在一些實施例中，Val-Cit-PABC中之纈胺酸及瓜胺酸單元各自具有(D)立體化學組態。在一些實施例中，Phe-Lys-PABC中之苯丙胺酸及離胺酸單元各自具有(D)立體化學組態。在一些實施例中，Val-Cit-PABC中之纈胺酸及瓜胺酸單元具有(L)與(D)立體化學組態之混合物。在一些實施例中，Phe-Lys-PABC中之苯丙胺酸及離胺酸單元具有(L)與(D)立體化學組態之混合物。
在一些實施例中，多肽包含具有以下結構之連接子：
Figure 02_image007
式 (II) 。
在一些實施例中，多肽包含連接子，其為：
Figure 02_image009
式 (III) 或
Figure 02_image011
式 (IV) ， 其中R1 及R2 獨立地為H或(C1 -C6 )烷基；j為1或2；G1 為H或COOH；且i為1、2、3、4或5。
在一些實施例中，Ar 及/或As 為式(III)或式(IV)，其中R1 及R2 獨立地為H或(C1 -C6 )烷基；j為1或2；G1 為H或COOH；且i為1、2、3、4或5。
在一些實施例中，多肽包含為式(III)或式(IV)之連接子。
式(IV)之二硫基連接子可根據Zhang, Donglu等人, ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 988-993；及Pillow, Thomas H.等人, Chem. Sci., 2017, 8, 366-370合成。含PABC肽可根據Laurent Ducry (編), Antibody-Drug Conju gates, Methods in Molecular Biology, 第1045卷, 數位物件識別碼(DOI) 10.1007/978-1-62703-541-5_5, Springer Science+Business Media, LLC 2013合成。在一些實施例中，可使用針對固相肽合成所製造之任何樹脂。 抗原處理路徑
本文所述之多肽可藉由不同路徑處理以釋放抗原決定基以呈現抗原決定基。為產生最佳肽抗原，兩個關鍵處理事件存在於抗原處理及呈現路徑內。細胞溶質蛋白質主要藉由蛋白酶體處理。接著藉由抗原處理相關轉運體(TAP)將短肽輸送至內質網(ER)中用於隨後與MHC I類分子組裝。外源性蛋白質主要由MHC II類分子呈現。抗原藉由若干路徑，包括吞噬作用、巨胞飲作用及內飲作用內化，且最終運輸至成熟或晚期內體隔室，在該隔室中該等抗原經處理且裝載至MHC II類分子上。細胞質/細胞核抗原亦可經由自體吞噬輸送至內體網路中，以隨後藉由MHC II類分子處理及呈現。
初始肽蛋白分解出現在細胞之細胞溶質內且藉由蛋白酶體或免疫蛋白酶體將較大蛋白質片段降解成較小肽。此處理事件通常負責產生結合至I類MHC之肽之最終C端殘基。蛋白酶體為含有多個次單元之大蛋白分解複合物，包括兩個次單元，大多功能蛋白酶(LMP) 2及LMP7。結合以降解之蛋白質藉由與泛素之共價鍵靶向蛋白酶體。LMP2及LMP7誘導蛋白分解複合物以產生與I類MHC I結合之肽。細胞溶質中產生的肽隨後經由TAP傳輸至ER中。由於TAP優先地傳輸11至14個胺基酸之肽，因此肽通常太長而無法進行穩定I類MHC結合且在進入ER時需要進一步處理。此處理包括藉由內質網胺基肽酶(ERAP) 1及ERAP2對抗原肽之N端區進行修整。此過程產生對於I類MHC結合具有高親和力之肽池。
在正常細胞環境中，經典II類MHC分子僅在專職APC，諸如樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞上表現。藉由吞噬作用、內飲作用或胞飲作用內化之外源性或細胞外抗原主要在II類MHC上呈現至CD4+ T細胞。然而，由於自體吞噬，細胞溶質抗原之小子集亦表現於II類MHC上。簡言之，內飲抗原在囊泡路徑中經處理，該囊泡路徑由被經典地描述為早期內體(pH 6.0至pH 6.5)、晚期內體或內溶酶體(pH 5.0至pH 6.0)及溶酶體(pH 4.5至pH 5.0)之漸進更具酸性及蛋白分解活性之隔室組成。藉由吞噬作用內化之抗原遵循類似路徑，終止於由吞噬體與溶酶體之融合形成之吞噬溶菌體中。溶酶體及吞噬溶菌體(pH 4.0-pH 4.5)含有多種酸性pH值最佳的蛋白酶，一般稱為組織蛋白酶。在高度降解細胞(諸如巨噬細胞)中，藉由此等酶連續裂解產生極短肽及游離胺基酸，其易位至細胞溶質中以補充用於新蛋白合成之tRNA。在具有較低蛋白分解活性之APC中，較大中間物形成用於II類MHC結合之肽之主要來源，且此等肽通常由13至18個胺基酸組成。
I類及II類MHC均可接近自內源性及外源性抗原處理之肽。舉例而言，II類MHC結合衍生自在溶酶體中降解之內源性膜蛋白質的肽。同樣，I類MHC可結合衍生自藉由內飲作用或吞噬作用內化之外源性蛋白質的肽，該現象稱為交叉呈現。DC之特定子集對於介導此過程尤其勝任，其對於初始CD8+ T細胞之初級反應之起始為極其重要的。
在一個態樣中，本文提供一種裂解多肽之方法，其包含使本文所述之多肽與APC接觸。在一些實施例中，該方法可在活體內進行。在一些實施例中，該方法可在活體外進行。
在一些實施例中，多肽為泛素化的。在一些實施例中，多肽在裂解之前經泛素化。在一些實施例中，多肽在蛋白酶體及/或免疫蛋白酶體處理之前經泛素化。在一些實施例中，多肽在離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在不位於抗原決定基序列之離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之第一離胺酸上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之第二離胺酸上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之第三離胺酸上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之第四離胺酸上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之第五、第六、第七、第八、第九或第十離胺酸上泛素化。在一些實施例中，多肽在至少一個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在超過一個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上超過一個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在各離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之各離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之兩個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之三個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之四個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之五個、六個、七個、八個、九個或十個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K上之各離胺酸殘基上依序泛素化。在一些實施例中，多肽不在聚K上之各離胺酸殘基上依序泛素化。
在一些實施例中，多肽在Ala-Lys-PABC上之離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在Phe-Lys-PABC上之離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽包含聚K及AA-AA-PABC，其中各AA為胺基酸或其類似物或衍生物。在一些實施例中，多肽在聚K及AA-AA-PABC上之至少一個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K及AA-AA-PABC上之一或多個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K及Ala-Lys-PABC上之一或多個離胺酸殘基上泛素化。在一些實施例中，多肽在聚K及Phe-Lys-PABC上之一或多個離胺酸殘基上泛素化。
在一些實施例中，多肽藉由APC內化。在一些實施例中，多肽經由內飲作用藉由APC內化。在一些實施例中，多肽經由吞噬作用藉由APC內化。在一些實施例中，多肽經由胞飲作用藉由APC內化。在一些實施例中，多肽在細胞質中裂解。在一些實施例中，多肽在內體中裂解。在一些實施例中，多肽在內溶酶體中裂解。在一些實施例中，多肽在溶酶體中裂解。在一些實施例中，多肽在ER中裂解。在一些實施例中，多肽藉由胺基肽酶裂解。在一些實施例中，胺基肽酶為胰島素調節之胺基肽酶(IRAP)。在一些實施例中，胺基肽酶為內質網胺基肽酶(ERAP)。在一些實施例中，多肽藉由蛋白酶體及/或免疫蛋白酶體之胰蛋白酶樣域處理。在一些實施例中，胰蛋白酶樣域包含胰蛋白酶樣活性。在一些實施例中，胰蛋白酶樣域包含胰凝乳蛋白酶樣活性。在一些實施例中，胰蛋白酶樣活性包含肽基麩胺醯肽水解酶(PGPH)活性。在一些實施例中，多肽藉由蛋白酶裂解。在一些實施例中，蛋白酶為胰蛋白酶樣蛋白酶。在一些實施例中，蛋白酶為胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶。在一些實施例中，蛋白酶為肽基麩胺醯肽水解酶(PGPH)。在一些實施例中，蛋白酶選自由以下組成之群：天冬醯胺肽解離酶、天冬胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、麩胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶及蘇胺酸蛋白酶。在一較佳實施例中，蛋白酶為半胱胺酸蛋白酶。在一些實施例中，半胱胺酸蛋白酶選自由以下組成之群：鈣蛋白酶、凋亡蛋白酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶F、組織蛋白酶H、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L1、組織蛋白酶L2、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶W及組織蛋白酶Z。在一些實施例中，蛋白酶為組織蛋白酶B。在一些實施例中，蛋白酶為組織蛋白酶C。在一些實施例中，蛋白酶為組織蛋白酶F。在一些實施例中，蛋白酶為組織蛋白酶Z。
在一些實施例中，多肽在離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之第一離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之第二離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之第三離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之第四離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之第五、第六、第七、第八、第九或第十離胺酸殘基上裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上超過一個離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之各離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在聚K上之各離胺酸殘基處依序裂解。在一些實施例中，多肽不在聚K上之各離胺酸殘基處依序裂解。
在一些實施例中，多肽在AA-AA-PABC處裂解，其中各AA為胺基酸或其類似物或衍生物。在一些實施例中，多肽在Ala-Lys-PABC處裂解。在一些實施例中，多肽在Ala-Lys-PABC中離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在Phe-Lys-PABC處裂解。在一些實施例中，多肽在Phe-Lys-PABC中離胺酸殘基處裂解。在一些實施例中，多肽在Val-Cit-PABC處裂解。在一些實施例中，多肽在Val-Cit-PABC中瓜胺酸(Cit)殘基處裂解。在一些實施例中，當多肽裂解時，抗原決定基釋放。
限制全身性治療應用之基於肽之藥物的一個主要弱點為肽之蛋白分解降解。藉由注射途徑投與之肽到達血流，該血流含有在止血、纖維蛋白溶解及組織轉化，亦即在損傷之情況下之重要過程中起作用之蛋白酶。因此，針對血液、血清或血漿中所存在之蛋白酶穩定肽為重要的。在一個態樣中，本文所述之多肽在血漿、血液及/或血清中穩定。在一些實施例中，多肽在個體中藉由APC內化之前不裂解。在一些實施例中，多肽在個體中藉由APC處理之前不裂解。在一些實施例中，多肽在個體中藉由APC內化之前不在血液中裂解。在一些實施例中，多肽在個體中由APC處理之前不在血液中裂解。在一些實施例中，多肽不由血液中之蛋白酶裂解。在一些實施例中，多肽不由纖維蛋白溶酶裂解。在一些實施例中，多肽不由血漿激肽釋放素裂解。在一些實施例中，多肽不由組織激肽釋放素裂解。在一些實施例中，多肽不由凝血酶裂解。在一些實施例中，多肽不由凝血因子裂解。在一些實施例中，多肽不由凝血因子XII裂解。在一些實施例中，多肽在人類血漿中為穩定的。在一些實施例中，多肽在人類血液中為穩定的。在一些實施例中，多肽在人類血清中為穩定的。
在一些實施例中，多肽在人類血漿中具有1小時至5天之半衰期。在一些實施例中，多肽之半衰期為約1小時至約120小時。在一些實施例中，多肽之半衰期為約1小時至約5小時、約1小時至約10小時、約1小時至約12小時、約1小時至約24小時、約1小時至約36小時、約1小時至約48小時、約1小時至約60小時、約1小時至約72小時、約1小時至約84小時、約1小時至約96小時、約1小時至約120小時、約5小時至約10小時、約5小時至約12小時、約5小時至約24小時、約5小時至約36小時、約5小時至約48小時、約5小時至約60小時、約5小時至約72小時、約5小時至約84小時、約5小時至約96小時、約5小時至約120小時、約10小時至約12小時、約10小時至約24小時、約10小時至約36小時、約10小時至約48小時、約10小時至約60小時、約10小時至約72小時、約10小時至約84小時、約10小時至約96小時、約10小時至約120小時、約12小時至約24小時、約12小時至約36小時、約12小時至約48小時、約12小時至約60小時、約12小時至約72小時、約12小時至約84小時、約12小時至約96小時、約12小時至約120小時、約24小時至約36小時、約24小時至約48小時、約24小時至約60小時、約24小時至約72小時、約24小時至約84小時、約24小時至約96小時、約24小時至約120小時、約36小時至約48小時、約36小時至約60小時、約36小時至約72小時、約36小時至約84小時、約36小時至約96小時、約36小時至約120小時、約48小時至約60小時、約48小時至約72小時、約48小時至約84小時、約48小時至約96小時、約48小時至約120小時、約60小時至約72小時、約60小時至約84小時、約60小時至約96小時、約60小時至約120小時、約72小時至約84小時、約72小時至約96小時、約72小時至約120小時、約84小時至約96小時、約84小時至約120小時或約96小時至約120小時。在一些實施例中，多肽之半衰期為約1小時、約5小時、約10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時或約120小時。在一些實施例中，多肽之半衰期為至少約1小時、約5小時、約10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時或約96小時。在一些實施例中，多肽之半衰期為至多約5小時、約10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時或約120小時。3. 新抗原及其用途
產生治癒性及腫瘤特異性免疫療法之關鍵障礙中之一者為鑑別及選擇可避開自體免疫的高度特異性及受限腫瘤抗原。由於惡性細胞內之基因改變(例如倒位、易位、缺失、錯義突變、剪接位點突變等)出現的腫瘤新抗原表示抗原的最具腫瘤特異性的類別。由於鑑別新抗原、選擇最佳化抗原及產生用於疫苗或免疫原性組合物中之新抗原的技術上的困難，癌症疫苗或免疫原性組合物中很少使用新抗原。此等問題可藉由以下解決：鑑別以DNA層級存在於腫瘤中但不存在於來自大比例患有癌症之個體之匹配生殖系樣品中之贅瘤/腫瘤中之突變；用一或多種肽-MHC結合預測演算法分析所鑑別之突變以產生複數個在贅瘤/腫瘤內表現且結合至大比例患者HLA對偶基因之新抗原T細胞抗原決定基；及合成選自用於適用於治療大比例患有癌症之個體之癌症疫苗或免疫原性組合物中之所有新抗原肽及預測結合肽之集合的複數個新抗原肽。
舉例而言，將肽定序資訊轉譯至治療疫苗中可包括預測可結合至大比例個體之HLA分子之突變型肽。有效選擇哪些特定突變用作免疫原需要預測哪些突變型肽將與大比例患者之HLA對偶基因有效結合的能力。最近，基於神經網路之學習方式配合驗證結合肽及非結合肽已使針對主要HLA-A及HLA-B對偶基因之預測演算法的準確度提高。然而，即使使用基於高級神經網路之演算法來編碼HLA-肽結合規則，但若干因素限制預測HLA對偶基因上呈現之肽的能力。
將肽定序資訊轉譯至治療疫苗中之另一實例可包括將藥物調配為長肽之多抗原決定基疫苗。在實際上靶向儘可能多的突變型抗原決定基利用免疫系統的巨大容量，藉由下調免疫靶向基因產物來阻止免疫逃避機會，且彌補抗原決定基預測方式的已知不準確性。合成肽為有效製備多種免疫原及將突變型抗原決定基的鑑別快速轉譯成有效疫苗提供適用的方式。使用不含污染性細菌或動物物質的試劑可容易地在化學上合成肽且易於純化肽。小尺寸允許清晰聚焦於蛋白質之突變區域且亦減少其他組分(非突變型蛋白質或病毒載體抗原)的不相關抗原競爭。
將肽定序資訊轉譯至治療疫苗中之又一實例可包括與強疫苗佐劑之組合。有效疫苗可能需要強佐劑來引發免疫反應。舉例而言，聚-ICLC (TLR3促效劑)及MDA5及RIG3之RNA解螺旋酶域已展示疫苗佐劑的若干所要特性。此等特性包括活體內誘導免疫細胞局部及全身性活化、產生刺激性趨化因子及細胞介素及刺激樹突狀細胞(DC)之抗原呈現。此外，聚-ICLC可在人類中誘導持久的CD4+ 及CD8+ 反應。重要的是，在接種聚-ICLC的個體中及在已接受高效複製勝任型黃熱病疫苗的自願者中發現在轉錄及信號轉導路徑之上調方面存在驚人的類似性。此外，在最新的1期研究中，用聚-ICLC與NYESO-1肽疫苗(除孟塔納之外)組合免疫接種之卵巢癌患者中＞90%展示CD4+ 及CD8+ T細胞之誘導，以及抗體對肽的反應。同時，迄今為止，聚-ICLC已在多於25次臨床試驗中進行充分測試且展現相對良性的毒性概況。 肽
在一些態樣中，本發明提供包含腫瘤特異性突變之經分離之肽。此等肽及多肽在本文中被稱作「新抗原肽」或「新抗原多肽」。在本說明書中，術語「肽」可與「突變型肽」、「新抗原肽(neoantigen peptide)」及「新抗原肽(neoantigenic peptide)」互換使用以表示通常藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，通常L-胺基酸。類似地，在本說明書中，術語「多肽」可與「突變多肽」、「新抗原多肽」及「新抗原多肽」互換使用以表示通常藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，例如L-胺基酸。多肽或肽可為多種長度，呈其中性(不帶電)形式或呈鹽形式，且不含修飾，諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化或含有此等修飾，經受不破壞如本文所描述之多肽之生物活性的修飾的條件。
在一些實施例中，使用基因體或外顯子組定序方法鑑別腫瘤特異性突變。可根據本發明使用任何適合的定序方法，例如下一代定序(NGS)技術。未來第三代定序方法可取代NGS技術以加速方法之定序步驟。出於澄清目的：在本發明之上下文中，術語「下一代定序」或「NGS」意謂與稱為桑格化學方法(Sanger chemistry)之「習知」定序方法對比的，藉由將整個基因體破碎成小片，並行地沿整個基因體任意讀取核酸模板之所有新穎高通量定序技術。此類NGS技術(亦稱為大規模並行定序技術)能夠在極短時間段內，例如在1至2週內，例如在1至7天內或在小於24小時內遞送全基因體、外顯子組、總轉錄本(transcriptome) (基因體之所有經轉錄序列)或甲基化組(基因體之所有甲基化序列)之核酸序列資訊且原則上允許單一細胞定序方法。市售或文獻中提及之多個NGS平台可用於本發明之上下文中，例如詳細描述於WO 2012/159643中者。
在某些實施例中，本文所述之多肽可包含但不限於約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約150、約200、約300、約350、約400、約450、約500、約600、約700、約800、約900、約1,000、約1,500、約2,000、約2,500、約3,000、約4,000、約5,000、約7,500、約10,000個胺基酸或更多胺基酸殘基，及可在其中導出之任何範圍。在特定實施例中，新抗原肽分子等於或小於100個胺基酸。
在一些實施例中，多肽之長度可為約8個及約50個胺基酸殘基，或長度為約8個及約30個、約8個及約20個、約8個及約18個、約8個及約15個或約8個及約12個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽之長度可為約8及約500個胺基酸殘基，或長度為約8及約450、約8及約400、約8及約350、約8及約300、約8及約250、約8及約200、約8及約150、約8及約100、約8及約50或約8及約30個胺基酸殘基。
在一些實施例中，多肽之長度可為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個胺基酸殘基。在一些實施例中，多肽之長度可為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500個或更多個胺基酸殘基。在一些實施例中，多肽之長度可為至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更少胺基酸殘基。在一些實施例中，多肽之長度可為至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500個或更少胺基酸殘基。
在一些實施例中，多肽全長為至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000或至少1500個胺基酸。
在一些實施例中，多肽全長為至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多40、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多350、至多400、至多450、至多500、至多1000或至多1500個胺基酸。
在某些實施例中，本文所述之多肽可包含抗原決定基。在某些實施例中，抗原決定基可包含但不限於約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約150、約200、約300、約350、約400、約450、約500、約600、約700、約800、約900、約1,000、約1,500、約2,000、約2,500、約3,000、約4,000、約5,000、約7,500、約10,000個胺基酸或更多胺基酸殘基，及可在其中導出之任何範圍。
在某些實施例中，抗原決定基之長度可為約8個及約50個胺基酸殘基，或長度為約8個及約30個、約8個及約20個、約8個及約18個、約8個及約15個或約8個及約12個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽之長度可為約8及約500個胺基酸殘基，或長度為約8及約450、約8及約400、約8及約350、約8及約300、約8及約250、約8及約200、約8及約150、約8及約100、約8及約50或約8及約30個胺基酸殘基。
在某些實施例中，抗原決定基之長度可為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個胺基酸殘基。在一些實施例中，抗原決定基之長度可為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500個或更多個胺基酸殘基。在一些實施例中，抗原決定基之長度可為至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更少胺基酸殘基。在一些實施例中，抗原決定基之長度可為至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500個或更少胺基酸殘基。
較長肽可以若干方法進行設計。在一些實施例中，當預測或已知HLA-結合肽時，較長肽包含(1)朝向各對應基因產物之N端及C端具有2-5個胺基酸之延伸部分的個別結合肽；或(2)各自具有延伸序列之結合肽中之一些或全部之序連(concatenation)。在其他實施例中，當定序揭露腫瘤中呈現之長(＞10個殘基)新抗原決定基序列(例如歸因於產生新穎肽序列之框移、通讀或包括內含子)時，較長肽可由呈單一較長肽或若干疊加較長肽形式之新穎腫瘤特異性胺基酸之全長組成。在一些實施例中，假定使用較長肽以允許藉由患者細胞進行內源性處理且可引起更有效的抗原呈現及T細胞反應誘導。在一些實施例中，可使用兩個或更多個肽，其中肽重疊且平鋪在長新抗原肽上。
在一些實施例中，用於MHC I類之免疫原性抗原、新抗原肽或其抗原決定基之長度為12個胺基酸殘基或更少，且通常由約8個與約12個胺基酸殘基之間組成。在一些實施例中，用於MHC I類之免疫原性抗原、新抗原肽或其抗原決定基為約8、約9、約10、約11或約12個胺基酸殘基。在一些實施例中，用於MHC II類之免疫原性抗原、新抗原肽或其抗原決定基之長度為25個胺基酸殘基或更少，且通常由約9個與約25個胺基酸殘基之間組成。在一些實施例中，用於MHC II類之免疫原性抗原、新抗原肽或其抗原決定基為約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個胺基酸殘基。
在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基結合HLA蛋白質(例如MHC I類HLA或MHC II類HLA)。在特定實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以比對應野生型肽更大的親和力結合HLA蛋白質。在特定實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基具有至少小於5000 nM、至少小於500 nM、至少小於100 nM、至少小於50 nM或更小之IC50 或KD 。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以0.1 nM至2000 nM之親和力結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000 nM之親和力結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以0.1 nM至2000 nM、1 nM至1000 nM、10 nM至500 nM或小於1000 nM之親和力結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000 nM之親和力結合至MHC II類HLA。
在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之穩定性結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之穩定性結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之穩定性結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，抗原、新抗原肽或抗原決定基以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之穩定性結合至MHC II類HLA。
在一些實施例中，多肽之pI值可為約0.5至約12、約2至約10，或約4至約8。在一些實施例中，肽之pI值可為至少4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5，或更大。在一些實施例中，多肽之pI值可為至多4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5，或較小。
在一些實施例中，本文中所描述之多肽包含不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之多肽包含不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列包含0至1000個、1至900個、5至800個、10至700個、20至600個、30至500個、40至400個、50至300個、60至200個或70至100個胺基酸殘基。在一較佳實施例中，胺基酸或胺基酸序列包含1至20個胺基酸殘基。在另一較佳實施例中，胺基酸或胺基酸序列包含5至12個胺基酸殘基。在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000或至少1500個胺基酸殘基。在一些實施例中，胺基酸或胺基酸序列包含約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約1000或約1500個胺基酸殘基。
在一個態樣中，本文提供一種製造多肽之方法，其包含將胺基酸或胺基酸序列及/或連接子連接至包含抗原決定基序列之序列的N端及/或C端。在一些實施例中，本文所述之多肽可呈溶液形式、凍乾形式或可呈晶體形式。在一些實施例中，本文所述之多肽可以合成方式，藉由重組DNA技術或化學合成製備，或可自天然來源(諸如原生腫瘤或病原性生物體)分離。抗原決定基或新抗原決定基可個別地合成或直接地或間接地接合於多肽中。儘管本文所述之多肽可實質上不含其他天然存在之宿主細胞蛋白質及其片段，但在一些實施例中，多肽可以合成方式結合以接合至原生片段或粒子。
在一些實施例中，本文所描述之多肽可以多種方式製備。在一些實施例中，多肽可在溶液中或在固體載體上根據習知技術合成。各種自動合成器為市售的且可根據已知方案使用。參見例如Stewart及Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 第2版, Pierce Chemical Co., 1984。另外，個別多肽可使用化學連接接合以產生仍在本發明之界限內之較大多肽。
或者，可採用重組DNA技術，其中將編碼多肽或多肽之一部分的核苷酸序列插入表現載體中，經轉形或轉染至適當宿主細胞中且在適合於表現之條件下培養。此等程序一般為此項技術中已知的，如Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中所一般地描述。因此，包含本文所描述之一或多種新抗原肽之重組肽可用於呈現適當的T細胞抗原決定基。
在一些實施例中，多肽包含至少一個突變型胺基酸。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係藉由將一或多個核苷酸插入個體之基因體中之核酸序列中來編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係藉由個體之基因體中之核酸序列中的一或多個核苷酸之缺失來編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係藉由個體之基因體中之核酸序列中的框移來編碼。框移在突變干擾基因密碼子週期性(亦稱為「閱讀框架」)之正相，從而引起轉譯非原生蛋白質序列時發生。基因中之不同突變有可能達成相同改變的閱讀框架。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係由個體之基因體中之核酸序列中的新ORF編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸係由個體之基因體中之核酸序列中的點突變編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸由具有引起融合多肽、框內缺失、插入、內源性反轉錄病毒多肽表現及多肽之腫瘤特異性過度表現之突變的基因編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸由個體之基因體中之第一基因與第二基因的融合物編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸由個體之基因體中之第一基因與第二基因的框內融合物編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸由個體之基因體中之第一基因與第一基因之剪接變異體之外顯子的融合物編碼。在一些實施例中，至少一個突變型胺基酸由個體之基因體中之第一基因與第一基因之隱藏外顯子的融合物編碼。
在一些態樣中，本發明提供一種多肽，其包含至少兩種多肽分子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含抗原決定基。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含相同抗原決定基。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含長度相同之相同抗原決定基。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含為不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列的胺基酸或胺基酸序列。在一些實施例中，為至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者之不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列的胺基酸或胺基酸序列相同。在一些實施例中，為至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者之不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列的胺基酸或胺基酸序列相同。
在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者在抗原決定基之N端及/或C端上包含連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含不同連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽或多肽分子不包含連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽或多肽分子包含連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽或多肽分子不包含抗原決定基之N端上之連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽或多肽分子包含抗原決定基之N端上之連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽或多肽分子不包含抗原決定基之C端上之連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽或多肽分子包含抗原決定基之C端上之連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽或多肽分子包含連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽或多肽分子不包含連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽或多肽分子包含抗原決定基之N端上之連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽或多肽分子不包含抗原決定基之N端上之連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽或多肽分子包含抗原決定基之C端上之連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽或多肽分子不包含抗原決定基之C端上之連接子。
二硫基連接子可使用此項技術中熟知之方法合成。舉例而言，二硫基連接子可根據Zhang, Donglu等人, ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 988-993；及Pillow, Thomas H.等人, Chem. Sci., 2017, 8, 366-370合成。二硫基連接子合成及含二硫基肽合成的實例展示於實例 3 及實例 4 中。含PABC肽可使用此項技術中熟知之方法合成。舉例而言，含PABC肽可根據Laurent Ducry (編), Antibody-Drug Conju gates, Methods in Molecular Biology，第1045卷，數位物件識別碼10.1007/978-1-62703-541-5_5, Springer Science+Business Media, LLC 2013合成。含PABC肽合成之實例展示於實例 5 中。在一些實施例中，可使用針對固相肽合成所製造之任何樹脂。
在一些實施例中，多肽包含至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或更多種多肽或多肽分子。舉例而言，多肽可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多種多肽或多肽分子。
在一些實施例中，包含抗原、新抗原肽或抗原決定基之多肽包含RAS抗原決定基。在一些實施例中，肽可衍生自具有取代突變，例如KRAS、G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突變或NRAS Q61K或Q61R突變之蛋白質。取代可沿著肽之長度位於任何地方。舉例而言，其可位於肽之N端三分之一、肽之中心三分之一或肽之C端三分之一中。在另一實施例中，經取代之殘基位置離N端2至5個殘基或離C端2至5個殘基。肽可類似地衍生自腫瘤特異性插入突變，其中肽包含插入殘基中之一或多者或所有。在一些實施例中，抗原決定基包含突變型RAS序列，其包含在G12、G13或Q61處包含突變之突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸及在G12、G13或Q61處之突變。在一些實施例中，包含G12、G13或Q61處之突變的突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，G12、G13或Q61處之突變包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。
在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽進一步包含胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列為細胞巨大病毒(CMV)，諸如pp65之蛋白質的胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列為人類免疫缺乏病毒(HIV)之蛋白質的胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列為MART-1之蛋白質的胺基酸序列。在一些實施例中，CMV (諸如pp65)之蛋白質之胺基酸序列包含1、2、3或超過3個胺基酸殘基。在一些實施例中，CMV (諸如pp65)之蛋白質之胺基酸序列包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸殘基。在一些實施例中，HIV之蛋白質之胺基酸序列包含1、2、3或超過3個胺基酸殘基。在一些實施例中，HIV之蛋白質之胺基酸序列包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸殘基。在一些實施例中，MART-1之蛋白質之胺基酸序列包含1、2、3或超過3個胺基酸殘基。在一些實施例中，MART-1之蛋白質之胺基酸序列包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸殘基。
在一些實施例中，RAS抗原決定基結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，RAS抗原決定基以小於10µM、小於9µM、小於8µM、小於7µM、小於6µM、小於5µM、小於4µM、小於3µM、小於2µM、小於1µM、小於950 nM、小於900 nM、小於850 nM、小於800 nM、小於750 nM、小於600 nM、小於550 nM、小於500 nM、小於450 nM、小於400 nM、小於350 nM、小於300 nM、小於250 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於30 nM、小於20 nM或小於10 nM之親和力結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，RAS抗原決定基以大於24小時、大於23小時、大於22小時、大於21小時、大於20小時、大於19小時、大於18小時、大於17小時、大於16小時、大於15小時、大於14小時、大於13小時、大於12小時、大於11小時、大於10小時、大於9小時、大於8小時、大於7小時、大於6小時、大於5小時、大於4小時、大於3小時、大於2小時、大於1小時、大於55分鐘、大於50分鐘、大於45分鐘、大於40分鐘、大於35分鐘、大於30分鐘、大於25分鐘、大於20分鐘、大於15分鐘、大於10分鐘、大於9分鐘、大於8分鐘、大於7分鐘、大於6分鐘、大於5分鐘、大於4分鐘、大於3分鐘、大於2分鐘或大於1分鐘之穩定性結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。
在一些實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A02:01對偶基因、HLA-A03:01對偶基因、HLA-A11:01對偶基因、HLA-A03:02對偶基因、HLA-A30:01對偶基因、HLA-A31:01對偶基因、HLA-A33:01對偶基因、HLA-A33:03對偶基因、HLA-A68:01對偶基因、HLA-A74:01對偶基因及/或HLA-C08:02對偶基因及其任何組合。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A02:01。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A03:01對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A11:01對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A03:02對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A30:01對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA- A31:01對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A33:01對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A33:03對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A68:01對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-A74:01對偶基因。在一些實施例中，HLA對偶基因為HLA-C08:02。
在一些態樣中，本發明提供一種組合物，其包含單一多肽，該單一多肽包含第一肽及第二肽；或編碼第一肽及第二肽之單一聚核苷酸。在一些實施例中，本文所提供之組合物包含一或多種額外肽，其中一或多種額外肽包含第三新抗原決定基。在一些實施例中，第一肽及第二肽由自相同轉錄起始位點轉錄之序列編碼。在一些實施例中，第一肽由自第一轉錄起始位點轉錄之序列編碼，且第二肽由自第二轉錄起始位點轉錄之序列編碼。在一些實施例中，其中多肽具有至少26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，多肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的第一序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的第二序列。在一些實施例中，多肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之至少8個或9個連續胺基酸的第一序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之至少16或17個連續胺基酸的第二序列。
在一些實施例中，第二肽比第一肽長。在一些實施例中，第一肽比第二肽長。在一些實施例中，第一肽具有至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽具有至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之至少9個連續胺基酸的序列。在一些實施例中，第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之至少17個連續胺基酸的序列。
在一些實施例中，第一肽、第二肽或兩者包含至少一個側接序列，其中至少一個側接序列在新抗原決定基之上游或下游。在一些實施例中，至少一個側接序列與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，至少一個側接序列包含非野生型序列。在一些實施例中，至少一個側接序列為N端側接序列。在一些實施例中，至少一個側接序列為C端側接序列。在一些實施例中，第一肽之至少一個側接序列與第二肽之至少一個側接序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，第一肽之至少一個側接區域與第二肽之至少一個側接區域不同。在一些實施例中，至少一個側接殘基包含突變。
在一些實施例中，肽包含包含至少一個突變型胺基酸之新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個突變型胺基酸。在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個非突變型胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個至少一個突變型胺基酸上游之非突變型胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個至少一個突變型胺基酸下游之非突變型胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含衍生自蛋白質之新抗原決定基序列，該蛋白質包含至少一個突變型胺基酸；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個至少一個突變型胺基酸上游之非突變型胺基酸；及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個至少一個突變型胺基酸下游之非突變型胺基酸。
在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸及在至少一個突變型胺基酸上游之序列的蛋白質的新抗原決定基序列，該序列與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸及在至少一個突變型胺基酸下游之序列的蛋白質的新抗原決定基序列，該序列與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸；與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的在至少一個突變型胺基酸上游之序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的在至少一個突變型胺基酸下游之序列的蛋白質之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸及在至少一個突變型胺基酸上游之序列的蛋白質的新抗原決定基序列，該序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個連續胺基酸，與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸及在至少一個突變型胺基酸下游之序列的蛋白質的新抗原決定基序列，該序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個連續胺基酸，與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，肽包含衍生自包含至少一個突變型胺基酸；包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個連續胺基酸，與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的在至少一個突變型胺基酸上游之序列；及包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個連續胺基酸，與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的在至少一個突變型胺基酸下游之序列的蛋白質的新抗原決定基序列。
在一些實施例中，抗原決定基為TMPRSS2:ERG抗原決定基。在一些實施例中，TMPRSS2:ERG抗原決定基包含ALNSEALSV之胺基酸序列。在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽包含以下之胺基酸序列：GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE。
在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽進一步包含，諸如在N端上，以下之胺基酸序列：K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KTEY、KTEYK、KTEYKL、KTEYKLV、KTEYKLVV、KTEYKLVVV、KKTEY、KKTEYK、KKTEYKL、KKTEYKLV、KKTEYKLVV、KKTEYKLVVV、KKKTEY、KKKTEYK、KKKTEYKL、KKKTEYKLV、KKKTEYKLVV、KKKTEYKLVVV、KKKKTEY、KKKKTEYK、KKKKTEYKL、KKKKTEYKLV、KKKKTEYKLVV、KKKKTEYKLVVV、IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYK、TEYKL、TEYKLV、TEYKLVV、TEYKLVVV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV。
在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽進一步包含，諸如在C端上，以下之胺基酸序列：K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、SALTIK、SALTIQLK、GKSALTIQLK、GKSALTIK、SALTIKK、SALTIQLKK、GKSALTIQLKK、GKSALTIKK、SALTIKKK、SALTIQLKKK、GKSALTIQLKKK、GKSALTIKKK、SALTIKKKK、SALTIQLKKKK、GKSALTIQLKKKK、GKSALTI,KKKK、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE。
在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽係選自由以下組成之群：KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK及TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK。在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽係選自由以下組成之群：KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL及KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL。在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽為KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL。在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽為KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL。在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽為KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL。在一些實施例中，包含RAS抗原決定基之多肽為KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL。
在一些實施例中，包含KRAS G12C突變之肽包含MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETC LLDILDTAGQE之序列。在一些實施例中，包含KRAS G12 C突變之肽包含KLVVVGACGV之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12 C突變之肽包含LVVVGACGV之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12 C突變之肽包含VVGACGVGK之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12C突變之肽包含VVVGACGVGK之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE之序列。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含VVGADGVGK之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含VVVGADGVGK之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含KLVVVGADGV之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含LVVVGADGV之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE之序列。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含KLVVVGAVGV之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含LVVVGAVGV之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含VVGAVGVGK之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含VVVGAVGVGK之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，包含KRAS Q61H突變之肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM之序列。在一些實施例中，包含KRAS Q61H突變之肽包含ILDTAGHEEY之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，包含KRAS Q61L突變之肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM之序列。在一些實施例中，包含KRAS Q61L突變之肽包含ILDTAGLEEY之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS Q61L突變之肽包含LLDILDTAGL之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，包含NRAS Q61K突變之肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM之序列。在一些實施例中，包含NRAS Q61K突變之肽包含ILDTAGKEEY之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，包含NRAS Q61R突變之肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM之序列。在一些實施例中，包含NRAS Q61R突變之肽包含ILDTAGREEY之新抗原決定基序列。
在一些實施例中，包含RAS Q61H突變之肽包含TCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYM之序列。在一些實施例中，包含RAS Q61H突變之肽包含表 1 中提供之序列。在一些實施例中，表 1 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 1 中之肽序列旁的對應行中。表 1. 包含RAS Q61H突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
ILDTAGHEEY HLA-A36:01 1
ILDTAGHEEY HLA-A01:01 2
DTAGHEEYSAM HLA-A26:01 3
DTAGHEEYSAM HLA-A25:01 4
GHEEYSAM HLA-B15:09 4
DTAGHEEY HLA-A26:01 5
ILDTAGHEE HLA-C08:02 5
AGHEEYSAM HLA-C01:02 6
AGHEEYSAM HLA-B46:01 6
DTAGHEEY HLA-A25:01 6
DTAGHEEY HLA-A01:01 6
DTAGHEEY HLA-B18:01 7
DTAGHEEY HLA-A36:01 7
ILDTAGHEE HLA-C05:01 7
ILDTAGHEE HLA-A02:07 7
ILDTAGHEEY HLA-A29:02 7
ILDTAGHEEY HLA-C08:02 7
HEEYSAMRD HLA-B49:01 8
TAGHEEYSA HLA-B35:03 8
DTAGHEEYS HLA-A68:02 9
DTAGHEEYSAMR HLA-A68:01 9
GHEEYSAM HLA-B39:01 9
ILDTAGHEE HLA-A01:01 9
LDTAGHEEY HLA-B53:01 9
HEEYSAMRD HLA-B41:01 10
ILDTAGHEE HLA-A36:01 10
DTAGHEEY HLA-B58:01 11
LLDILDTAGH HLA-A01:01 12
TAGHEEYSAM HLA-B35:03 12
LDTAGHEEY HLA-B35:01 13
DILDTAGHE HLA-A26:01 14
DTAGHEEY HLA-C12:03 14
ILDTAGHEEY HLA-C05:01 14
AGHEEYSAM HLA-A30:02 15
DILDTAGHEEY HLA-A25:01 15
DTAGHEEY HLA-C02:02 15
ILDTAGHEE HLA-C04:01 15
DILDTAGH HLA-A26:01 16
ILDTAGHEE HLA-A02:01 16
LDTAGHEEY HLA-A29:02 16
ILDTAGHE HLA-A01:01 17
LDTAGHEEY HLA-B18:01 17
AGHEEYSAM HLA-C14:03 18
DILDTAGHEEY HLA-A29:02 18
DTAGHEEYS HLA-A26:01 18
ILDTAGHEEY HLA-B15:01 18
DTAGHEEYSA HLA-A68:02 19
ILDTAGHE HLA-C05:01 19
ILDTAGHEEY HLA-A02:07 19
ILDTAGHEEY HLA-A30:02 19
LDTAGHEEY HLA-A36:01 19
AGHEEYSAM HLA-C14:02 20
AGHEEYSAM HLA-B15:03 20
LLDILDTAGH HLA-A02:07 20
在一些實施例中，包含RAS Q61R突變之肽包含TCLLDILDTAGREEYSAMRDQYM之序列。在一些實施例中，包含RAS Q61R突變之肽包含表 2 中提供之序列。在一些實施例中，表 2 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 2 中之肽序列旁的對應行中。表 2. 包含RAS Q61R突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
ILDTAGREEY HLA-A36:01 1
ILDTAGREEY HLA-A01:01 2
DTAGREEYSAM HLA-A26:01 3
DILDTAGR HLA-A33:03 4
DILDTAGR HLA-A68:01 5
DTAGREEY HLA-A26:01 6
DTAGREEYSAM HLA-A25:01 6
CLLDILDTAGR HLA-A74:01 7
DTAGREEY HLA-A01:01 7
REEYSAMRD HLA-B41:01 7
GREEYSAMR HLA-B27:05 8
ILDTAGREE HLA-C08:02 8
ILDTAGREEY HLA-A29:02 8
REEYSAMRD HLA-B49:01 8
AGREEYSAM HLA-B46:01 9
DTAGREEY HLA-B18:01 9
DTAGREEY HLA-A25:01 9
DTAGREEY HLA-A36:01 9
DILDTAGR HLA-A74:01 10
DILDTAGRE HLA-A26:01 10
ILDTAGREE HLA-C05:01 10
DILDTAGR HLA-A26:01 11
GREEYSAM HLA-B39:01 11
AGREEYSAM HLA-B15:03 12
GREEYSAM HLA-C07:02 12
ILDTAGREE HLA-A01:01 12
TAGREEYSA HLA-B35:03 12
ILDTAGREEY HLA-A30:02 13
DTAGREEYS HLA-A68:02 14
ILDTAGRE HLA-A01:01 14
CLLDILDTAGR HLA-A31:01 15
DTAGREEYSAMR HLA-A68:01 15
LLDILDTAGR HLA-A01:01 15
DTAGREEY HLA-B58:01 16
ILDTAGREEY HLA-C08:02 16
DILDTAGR HLA-A31:01 17
ILDTAGREE HLA-C04:01 17
ILDTAGREEY HLA-A32:01 17
LLDILDTAGR HLA-A74:01 17
TAGREEYSAM HLA-B35:03 17
DILDTAGREEY HLA-A32:01 18
ILDTAGRE HLA-C05:01 18
ILDTAGREE HLA-A02:07 18
REEYSAMRD HLA-B40:01 18
AGREEYSAM HLA-B15:01 19
AGREEYSAMR HLA-A31:01 19
ILDTAGRE HLA-A36:01 19
LDILDTAGR HLA-A68:01 19
LDTAGREEY HLA-A29:02 19
LDTAGREEY HLA-B35:01 19
REEYSAMRD HLA-B45:01 19
REEYSAMRDQY HLA-A36:01 19
DTAGREEY HLA-C02:02 20
在一些實施例中，包含RAS Q61K突變之肽包含TCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYM之序列。在一些實施例中，包含RAS Q61K突變之肽包含表 3 中提供之序列。在一些實施例中，表 3 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 3 中之肽序列旁的對應行中。表 3. 包含RAS Q61K突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
ILDTAGKEEY HLA-A36:01 1
ILDTAGKEEY HLA-A01:01 2
DTAGKEEYSAM HLA-A26:01 3
CLLDILDTAGK HLA-A03:01 4
DTAGKEEY HLA-A01:01 5
DTAGKEEY HLA-A26:01 5
DTAGKEEYSAM HLA-A25:01 5
AGKEEYSAM HLA-B46:01 6
DILDTAGKE HLA-A26:01 7
KEEYSAMRD HLA-B41:01 7
DTAGKEEY HLA-B18:01 8
GKEEYSAM HLA-B15:03 8
ILDTAGKEE HLA-C08:02 8
ILDTAGKEEY HLA-A29:02 8
DTAGKEEYS HLA-A68:02 9
LDTAGKEEY HLA-B53:01 9
TAGKEEYSA HLA-B35:03 9
DILDTAGK HLA-A68:01 10
DTAGKEEY HLA-A36:01 10
KEEYSAMRD HLA-B49:01 10
LDTAGKEEY HLA-C07:01 10
DTAGKEEYSAMR HLA-A68:01 11
ILDTAGKEE HLA-C05:01 11
ILDTAGKEEY HLA-C08:02 11
LLDILDTAGK HLA-A01:01 12
AGKEEYSAM HLA-A30:02 13
DTAGKEEY HLA-A25:01 13
DTAGKEEYS HLA-A26:01 13
ILDTAGKE HLA-C05:01 13
LDTAGKEEY HLA-B35:01 13
AGKEEYSAMR HLA-A31:01 14
DILDTAGK HLA-A33:03 14
ILDTAGKE HLA-A01:01 14
ILDTAGKEE HLA-A01:01 14
ILDTAGKEE HLA-A02:07 14
TAGKEEYSAM HLA-B35:03 14
AGKEEYSAM HLA-B15:01 15
ILDTAGKEEY HLA-A30:02 15
LDTAGKEEY HLA-B46:01 15
DTAGKEEY HLA-B58:01 16
ILDTAGKEEY HLA-C05:01 17
AGKEEYSAM HLA-A30:01 18
AGKEEYSAM HLA-B15:03 18
DTAGKEEY HLA-C02:02 18
LDTAGKEEY HLA-A29:02 18
在一些實施例中，包含RAS Q61L突變之肽包含TCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYM之序列。在一些實施例中，包含RAS Q61L突變之肽包含表 4 中提供之序列。在一些實施例中，表 4 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 4 中之肽序列旁的對應行中。表 4. 包含RAS Q61L突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
ILDTAGLEEY HLA-A36:01 1
ILDTAGLEEY HLA-A01:01 2
LLDILDTAGL HLA-A02:07 3
GLEEYSAMRDQY HLA-A36:01 4
DTAGLEEY HLA-A25:01 5
DTAGLEEY HLA-A26:01 5
DTAGLEEYSAM HLA-A26:01 5
DTAGLEEY HLA-A01:01 6
ILDTAGLEE HLA-C08:02 6
ILDTAGLEE HLA-A01:01 6
CLLDILDTAGL HLA-A02:04 7
ILDTAGLEE HLA-A36:01 7
LLDILDTAGL HLA-A01:01 7
DILDTAGL HLA-B14:02 8
DILDTAGLEEY HLA-A25:01 8
DTAGLEEYS HLA-A68:02 8
DTAGLEEYSAM HLA-A25:01 8
GLEEYSAMR HLA-A74:01 8
ILDTAGLE HLA-A01:01 8
DILDTAGLEEY HLA-A26:01 9
DTAGLEEY HLA-A36:01 9
ILDTAGLEEY HLA-A29:02 9
DILDTAGL HLA-B08:01 10
DTAGLEEY HLA-B18:01 10
ILDTAGLEE HLA-A02:07 10
LDTAGLEEY HLA-B35:01 10
CLLDILDTAGL HLA-A02:01 11
DTAGLEEY HLA-C02:02 11
ILDTAGLEE HLA-C05:01 11
ILDTAGLEEY HLA-C08:02 11
ILDTAGLEEY HLA-A02:07 11
LLDILDTAGL HLA-C08:02 11
DILDTAGL HLA-A26:01 12
LDTAGLEEY HLA-B53:01 12
DTAGLEEY HLA-C03:02 13
DTAGLEEY HLA-B58:01 13
ILDTAGLEEY HLA-A30:02 13
LLDILDTAGL HLA-C05:01 13
LLDILDTAGL HLA-C04:01 13
DTAGLEEYSAMR HLA-A68:01 14
ILDTAGLE HLA-A36:01 15
LLDILDTAGL HLA-A02:01 15
AGLEEYSAM HLA-B15:03 16
DTAGLEEYSA HLA-A68:02 16
GLEEYSAMRDQY HLA-A01:01 16
ILDTAGLE HLA-C04:01 16
ILDTAGLEEY HLA-B15:01 16
LDILDTAGL HLA-B37:01 16
AGLEEYSAM HLA-A30:02 17
AGLEEYSAM HLA-B48:01 17
AGLEEYSAMR HLA-A31:01 17
ILDTAGLEE HLA-C04:01 17
LDTAGLEEY HLA-C03:02 17
AGLEEYSAM HLA-C14:02 18
GLEEYSAMR HLA-A31:01 18
LEEYSAMRD HLA-B41:01 18
LLDILDTAGLE HLA-A01:01 18
AGLEEYSAM HLA-C14:03 19
LDILDTAGL HLA-B40:02 19
LDTAGLEEY HLA-A29:02 19
DILDTAGLE HLA-A26:01 20
DTAGLEEY HLA-B15:01 20
ILDTAGLEEY HLA-A02:01 20
LDTAGLEEY HLA-A36:01 20
LDTAGLEEY HLA-B46:01 20
DTAGLEEY HLA-A68:02 21
DTAGLEEY HLA-C12:03 21
ILDTAGLE HLA-C05:01 21
LDTAGLEEY HLA-B18:01 21
LEEYSAMRD HLA-B49:01 21
TAGLEEYSA HLA-B54:01 21
DILDTAGLEEY HLA-A29:02 22
GLEEYSAM HLA-C05:01 22
在一些實施例中，包含RAS G12A突變之肽包含MTEYKLVVVGAAGVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G12A突變之肽包含表 5 中提供之序列。在一些實施例中，表 5 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 5 中之肽序列旁的對應行中。表 5. 包含RAS G12A突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
AAGVGKSAL HLA-C03:04 1
VVVGAAGVGK HLA-A11:01 1
VVGAAGVGK HLA-A11:01 2
TEYKLVVVGAA HLA-B50:01 3
VVGAAGVGK HLA-A03:01 3
VVVGAAGVGK HLA-A68:01 3
AAGVGKSAL HLA-C08:02 4
AAGVGKSAL HLA-C08:01 4
AAGVGKSAL HLA-B46:01 4
AAGVGKSAL HLA-B81:01 5
GAAGVGKSAL HLA-B48:01 5
LVVVGAAGV HLA-A68:02 5
AAGVGKSAL HLA-C03:04 1
VVVGAAGVGK HLA-A11:01 1
VVGAAGVGK HLA-A11:01 2
TEYKLVVVGAA HLA-B50:01 3
VVGAAGVGK HLA-A03:01 3
VVVGAAGVGK HLA-A68:01 3
AAGVGKSAL HLA-C08:02 4
AAGVGKSAL HLA-C08:01 4
AAGVGKSAL HLA-B46:01 4
AAGVGKSAL HLA-B81:01 5
AAGVGKSAL HLA-C03:02 5
AAGVGKSAL HLA-C01:02 5
GAAGVGKSAL HLA-B48:01 5
LVVVGAAGV HLA-A68:02 5
AAGVGKSAL HLA-C03:03 6
VVGAAGVGK HLA-A68:01 6
GAAGVGKSAL HLA-B81:01 7
VVVGAAGVGK HLA-A03:01 7
AAGVGKSAL HLA-C05:01 8
AAGVGKSAL HLA-C12:03 8
GAAGVGKSA HLA-B46:01 8
VVGAAGVGK HLA-A30:01 8
GAAGVGKSA HLA-B55:01 9
KLVVVGAAGV HLA-A02:01 9
AGVGKSAL HLA-B08:01 10
GAAGVGKSAL HLA-C03:04 10
AAGVGKSAL HLA-C17:01 11
GAAGVGKSAL HLA-C03:03 11
VVVGAAGV HLA-A68:02 11
YKLVVVGAA HLA-B54:01 11
AAGVGKSAL HLA-B48:01 12
AGVGKSAL HLA-C03:04 12
AGVGKSAL HLA-C07:01 12
VVVGAAGVGK HLA-A30:01 12
AAGVGKSA HLA-B46:01 13
KLVVVGAAGV HLA-A02:07 13
YKLVVVGAA HLA-B50:01 13
AAGVGKSAL HLA-B07:02 14
GAAGVGKSAL HLA-A68:02 14
VVGAAGVGK HLA-A74:01 14
AGVGKSAL HLA-C08:01 15
GAAGVGKSAL HLA-C17:01 15
GAAGVGKSAL HLA-C08:01 16
GAAGVGKSAL HLA-B35:03 16
AAGVGKSAL HLA-C02:02 17
AAGVGKSAL HLA-B35:03 17
AAGVGKSAL HLA-C12:02 17
AAGVGKSAL HLA-C14:03 17
GAAGVGKSA HLA-B50:01 17
AGVGKSAL HLA-C03:02 18
GAAGVGKSA HLA-C03:04 18
LVVVGAAGV HLA-B55:01 18
TEYKLVVVGAA HLA-B41:01 18
AGVGKSAL HLA-C01:02 19
GAAGVGKSA HLA-B54:01 19
GAAGVGKSAL HLA-B07:02 19
VGAAGVGKSA HLA-B55:01 19
AGVGKSAL HLA-B48:01 20
AGVGKSALTI HLA-B49:01 20
VVVGAAGV HLA-B55:01 20
在一些實施例中，包含RAS G12C突變之肽包含MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G12C突變之肽包含表 6 中提供之序列。在一些實施例中，表 6 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 6 中之肽序列旁的對應行中。表 6. 包含RAS G12C突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
VVVGACGVGK HLA-A11:01 1
VVGACGVGK HLA-A03:01 2
VVGACGVGK HLA-A11:01 3
VVVGACGVGK HLA-A68:01 4
VVGACGVGK HLA-A68:01 5
VVVGACGVGK HLA-A03:01 5
VVGACGVGK HLA-A30:01 6
ACGVGKSAL HLA-B81:01 7
ACGVGKSAL HLA-C01:02 7
ACGVGKSAL HLA-C14:03 8
ACGVGKSAL HLA-C03:04 9
VVVGACGVGK HLA-A30:01 9
ACGVGKSAL HLA-C14:02 10
CGVGKSAL HLA-B08:01 10
KLVVVGACGV HLA-A02:01 10
ACGVGKSAL HLA-B07:02 11
GACGVGKSAL HLA-B48:01 12
GACGVGKSAL HLA-C03:03 13
ACGVGKSAL HLA-B48:01 14
ACGVGKSAL HLA-B40:01 14
YKLVVVGAC HLA-B48:01 14
YKLVVVGAC HLA-B15:03 14
GACGVGKSA HLA-B46:01 15
GACGVGKSAL HLA-C03:04 15
GACGVGKSAL HLA-C01:02 15
LVVVGACGV HLA-A68:02 15
CGVGKSAL HLA-C03:04 16
GACGVGKSAL HLA-C08:02 16
VVGACGVGK HLA-A74:01 16
在一些實施例中，包含RAS G12D突變之肽包含MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G12D突變之肽包含表 7 中提供之序列。在一些實施例中，表 7 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 7 中之肽序列旁的對應行中。表 7. 包含RAS G12D突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
GADGVGKSAL HLA-C08:02 1
GADGVGKSAL HLA-C05:01 2
VVVGADGVGK HLA-A11:01 3
DGVGKSAL HLA-B14:02 4
VVGADGVGK HLA-A11:01 4
VVGADGVGK HLA-A03:01 5
DGVGKSAL HLA-B08:01 6
VVVGADGVGK HLA-A68:01 6
GADGVGKSAL HLA-C03:03 7
VVGADGVGK HLA-A30:01 7
ADGVGKSAL HLA-B37:01 8
GADGVGKSAL HLA-C08:01 8
VVGADGVGK HLA-A68:01 8
GADGVGKSA HLA-C08:02 9
GADGVGKSAL HLA-B35:03 9
GADGVGKS HLA-C05:01 10
GADGVGKSA HLA-C05:01 10
ADGVGKSAL HLA-C07:01 11
VVVGADGVGK HLA-A03:01 11
ADGVGKSAL HLA-B40:02 12
ADGVGKSAL HLA-B46:01 13
GADGVGKSAL HLA-C03:04 13
ADGVGKSAL HLA-B81:01 14
GADGVGKSAL HLA-C17:01 14
VVVGADGVGK HLA-A30:01 14
GADGVGKSA HLA-B35:03 15
GADGVGKSA HLA-B46:01 15
GADGVGKSAL HLA-B48:01 15
KLVVVGADGV HLA-A02:01 15
LVVVGADGV HLA-A68:02 15
VGADGVGKSA HLA-B55:01 15
VVGADGVGK HLA-A74:01 16
GADGVGKSA HLA-B53:01 17
KLVVVGADGV HLA-A02:07 17
VGADGVGK HLA-A68:01 17
YKLVVVGAD HLA-B48:01 17
ADGVGKSAL HLA-C14:03 18
DGVGKSALTI HLA-B51:01 18
VGADGVGK HLA-A11:01 18
在一些實施例中，包含RAS G12R突變之肽包含MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G12R突變之肽包含表 8 中提供之序列。在一些實施例中，表 8 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 8 中之肽序列旁的對應行中。表 8. 包含RAS G12R突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
VVGARGVGK HLA-A11:01 1
VVVGARGVGK HLA-A68:01 1
GARGVGKSA HLA-B46:01 2
ARGVGKSAL HLA-B27:05 3
GARGVGKSA HLA-B55:01 3
RGVGKSAL HLA-C07:01 4
VVGARGVGK HLA-A30:01 5
ARGVGKSAL HLA-B38:01 6
ARGVGKSAL HLA-B14:02 6
VVGARGVGK HLA-A68:01 6
VVVGARGVGK HLA-A03:01 7
GARGVGKSAL HLA-B48:01 8
RGVGKSAL HLA-B48:01 8
RGVGKSALTI HLA-A23:01 8
ARGVGKSAL HLA-C06:02 9
GARGVGKSA HLA-A30:01 9
GARGVGKSAL HLA-B81:01 9
VVVGARGVGK HLA-A30:01 9
GARGVGKSAL HLA-B07:02 10
LVVVGARGV HLA-C06:02 10
RGVGKSAL HLA-B81:01 10
VVGARGVGK HLA-A74:01 11
KLVVVGARGV HLA-A02:01 12
LVVVGARGV HLA-B55:01 12
YKLVVVGAR HLA-A33:03 12
KLVVVGAR HLA-A74:01 13
KLVVVGARGV HLA-B13:02 13
RGVGKSAL HLA-C01:02 13
LVVVGARGV HLA-A68:02 14
VVVGARGV HLA-B55:01 14
ARGVGKSAL HLA-B15:09 15
ARGVGKSAL HLA-C14:03 16
GARGVGKSA HLA-B54:01 16
VVVGARGV HLA-B52:01 16
在一些實施例中，包含RAS G12S突變之肽包含MTEYKLVVVGASGVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G12S突變之肽包含表 9 中提供之序列。在一些實施例中，表 9 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 9 中之肽序列旁的對應行中。表 9. 包含RAS G12S突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
VVVGASGVGK HLA-A11:01 1
VVGASGVGK HLA-A11:01 2
VVGASGVGK HLA-A03:01 3
VVVGASGVGK HLA-A68:01 4
ASGVGKSAL HLA-C03:04 5
ASGVGKSAL HLA-B46:01 5
VVGASGVGK HLA-A68:01 6
VVVGASGVGK HLA-A03:01 6
ASGVGKSAL HLA-C01:02 7
GASGVGKSAL HLA-B48:01 7
ASGVGKSAL HLA-C07:01 8
ASGVGKSAL HLA-C08:02 9
GASGVGKSAL HLA-B81:01 9
SGVGKSAL HLA-B08:01 9
ASGVGKSAL HLA-C03:03 10
ASGVGKSAL HLA-C03:02 10
SGVGKSAL HLA-B14:02 10
VVGASGVGK HLA-A30:01 10
ASGVGKSAL HLA-C08:01 11
VVVGASGVGK HLA-A30:01 11
GASGVGKSAL HLA-B35:03 12
SGVGKSAL HLA-C07:01 12
ASGVGKSAL HLA-B81:01 13
GASGVGKSA HLA-B55:01 13
GASGVGKSAL HLA-C03:03 13
KLVVVGASGV HLA-A02:01 13
LVVVGASGV HLA-A68:02 13
SGVGKSAL HLA-C01:02 13
ASGVGKSA HLA-B46:01 14
ASGVGKSAL HLA-C15:02 14
GASGVGKSAL HLA-C08:01 15
SGVGKSAL HLA-C03:04 15
ASGVGKSAL HLA-C05:01 16
GASGVGKSAL HLA-C03:04 16
VVGASGVGK HLA-A74:01 16
ASGVGKSAL HLA-B48:01 17
GASGVGKSAL HLA-C01:02 17
SGVGKSAL HLA-C03:02 17
SGVGKSALTI HLA-A23:01 17
VGASGVGKSA HLA-B55:01 18
ASGVGKSAL HLA-C12:03 19
ASGVGKSAL HLA-B57:03 19
KLVVVGASGV HLA-A02:07 19
SGVGKSAL HLA-B81:01 19
ASGVGKSAL HLA-C17:01 20
KLVVVGASG HLA-A32:01 20
在一些實施例中，包含RAS G12V突變之肽包含MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G12V突變之肽包含表 10 中提供之序列。在一些實施例中，表 10 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 10 中之肽序列旁的對應行中。表 10. 包含RAS G12V突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
VVGAVGVGK HLA-A03:01 1
VVGAVGVGK HLA-A11:01 2
VVVGAVGVGK HLA-A11:01 2
VVVGAVGVGK HLA-A68:01 3
VVGAVGVGK HLA-A68:01 4
LVVVGAVGV HLA-A68:02 5
VVGAVGVGK HLA-A30:01 5
AVGVGKSAL HLA-B81:01 6
KLVVVGAVGV HLA-A02:01 6
AVGVGKSAL HLA-B46:01 7
GAVGVGKSAL HLA-C03:03 7
GAVGVGKSAL HLA-B48:01 7
VVVGAVGVGK HLA-A03:01 7
AVGVGKSAL HLA-C03:04 8
GAVGVGKSAL HLA-C03:04 8
KLVVVGAVGV HLA-A02:07 9
VGVGKSAL HLA-B08:01 9
VVVGAVGV HLA-A68:02 9
AVGVGKSAL HLA-C08:02 10
AVGVGKSAL HLA-B07:02 10
GAVGVGKSAL HLA-B35:03 10
AVGVGKSAL HLA-C08:01 11
AVGVGKSAL HLA-C01:02 11
GAVGVGKSA HLA-B55:01 11
GAVGVGKSAL HLA-B81:01 11
GAVGVGKSAL HLA-C08:01 11
KLVVVGAVGV HLA-B13:02 11
VGVGKSAL HLA-C03:04 11
AVGVGKSAL HLA-A32:01 12
GAVGVGKSA HLA-B46:01 12
VGVGKSAL HLA-C03:02 12
VGVGKSALTI HLA-A23:01 12
GAVGVGKSA HLA-B54:01 13
VGVGKSAL HLA-C01:02 .3
AVGVGKSAL HLA-B48:01 14
AVGVGKSAL HLA-C03:03 14
AVGVGKSAL HLA-B42:01 14
LVVVGAVGV HLA-B55:01 14
VGVGKSAL HLA-C08:01 14
VVGAVGVGK HLA-A74:01 14
AVGVGKSAL HLA-C05:01 15
AVGVGKSAL HLA-C03:02 15
GAVGVGKSA HLA-C03:04 15
KLVVVGAVGV HLA-A02:04 15
LVVVGAVGV HLA-A02:07 15
VGVGKSAL HLA-B14:02 15
VVVGAVGVGK HLA-A30:01 15
VVGAVGVGK HLA-B81:01 16
VVVGAVGV HLA-B55:01 16
AVGVGKSAL HLA-C14:03 17
AVGVGKSAL HLA-B15:01 17
LVVVGAVGV HLA-B54:01 17
AVGVGKSA HLA-B55:01 18
AVGVGKSAL HLA-C17:01 18
GAVGVGKSA HLA-B50:01 19
GAVGVGKSAL HLA-C17:01 19
YKLVVVGAV HLA-A02:04 19
GAVGVGKSAL HLA-B35:01 20
VVGAVGVGK HLA-A31:01 20
YKLVVVGAV HLA-B51:01 20
在一些實施例中，包含RAS G13C突變之肽包含MTEYKLVVVGAGCVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G13C突變之肽包含表 11 中提供之序列。在一些實施例中，表 11 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 11 中之肽序列旁的對應行中。表 11. 包含RAS G13C突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
VVVGAGCVGK HLA-A11:01 1
VVGAGCVGK HLA-A11:01 2
AGCVGKSAL HLA-C01:02 3
VVGAGCVGK HLA-A03:01 4
VVVGAGCVGK HLA-A68:01 4
CVGKSALTI HLA-B13:02 5
VVGAGCVGK HLA-A68:01 5
VVGAGCVGK HLA-A30:01 6
AGCVGKSAL HLA-B48:01 7
AGCVGKSAL HLA-C03:04 8
GCVGKSALTI HLA-B49:01 8
AGCVGKSAL HLA-C08:02 9
VVVGAGCVGK HLA-A03:01 9
KLVVVGAGC HLA-A30:02 10
GCVGKSAL HLA-C07:01 11
VVGAGCVGK HLA-A74:01 12
AGCVGKSAL HLA-C14:03 13
KLVVVGAGC HLA-B15:01 14
在一些實施例中，包含RAS G13D突變之肽包含MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQL之序列。在一些實施例中，包含RAS G13D突變之肽包含表 12 中提供之序列。在一些實施例中，表 12 中提供之肽序列與由HLA對偶基因編碼之蛋白質結合或預測與其結合，該對偶基因提供於表 12 中之肽序列旁的對應行中。表 12. 包含RAS G13D突變的肽序列、對應HLA對偶基因及結合潛能排名
肽 對偶基因 結合潛能排名
AGDVGKSAL HLA-C08:02 1
AGDVGKSAL HLA-C05:01 2
VVGAGDVGK HLA-A11:01 3
VVVGAGDVGK HLA-A11:01 3
VVVGAGDVGK HLA-A68:01 4
GAGDVGKSA HLA-B46:01 5
GAGDVGKSAL HLA-B48:01 5
VVGAGDVGK HLA-A68:01 5
VVGAGDVGK HLA-A03:01 5
AGDVGKSAL HLA-C03:04 6
AGDVGKSAL HLA-C04:01 6
AGDVGKSAL HLA-C01:02 6
DVGKSALTI HLA-B13:02 6
DVGKSALTI HLA-A25:01 6
GDVGKSAL HLA-C07:01 6
GDVGKSAL HLA-B40:02 7
GDVGKSAL HLA-B37:01 8
AGDVGKSAL HLA-B48:01 9
DVGKSALTI HLA-B51:01 10
VVGAGDVGK HLA-A30:01 10
GAGDVGKSAL HLA-C08:01 11
GAGDVGKSAL HLA-B81:01 11
AGDVGKSAL HLA-C08:01 12
GAGDVGKSAL HLA-C03:04 12
DVGKSALTI HLA-B53:01 13
AGDVGKSAL HLA-B07:02 14
AGDVGKSAL HLA-B46:01 14
DVGKSALTI HLA-A26:01 14
VVGAGDVGK HLA-A74:01 14
GAGDVGKSA HLA-B54:01 15
DVGKSALTI HLA-B38:01 16
GAGDVGKSAL HLA-C03:03 16
VVVGAGDVGK HLA-A03:01 16
在一些實施例中，本文所述之多肽不包含RAS抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基不為RAS抗原決定基。在一些實施例中，多肽不包含KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些實施例中，包含抗原、新抗原肽或抗原決定基之多肽包含GATA3抗原決定基。在一些實施例中，GATA3抗原決定基包含以下之胺基酸序列：MLTGPPARV、SMLTGPPARV、VLPEPHLAL、KPKRDGYMF、KPKRDGYMFL、ESKIMFATL、KRDGYMFL、PAVPFDLHF、AESKIMFATL、FATLQRSSL、ARVPAVPFD、IMKPKRDGY、DGYMFLKA、MFLKAESKIMF、LTGPPARV、ARVPAVPF、SMLTGPPAR、RVPAVPFDL或LTGPPARVP。 肽修飾
在一些實施例中，本發明包括經修飾之肽。修飾可包括不改變抗原肽自身之一級胺基酸序列之共價化學修飾。修飾可產生具有所要特性之肽，所要特性例如延長活體內半衰期，增加穩定性，降低清除率，改變免疫原性或過敏原性，使得能夠增加特定抗體、細胞靶向、抗原吸收、抗原處理、HLA親和力、HLA穩定性或抗原呈現。在一些實施例中，肽可包含一或多個增強APC的抗原決定基之處理及呈現，例如以用於產生免疫反應之序列。
在一些實施例中，多肽可經修飾以提供所要屬性。舉例而言，肽誘導細胞毒性T淋巴球(CTL)活性之能力可藉由連接至含有至少一個能夠誘導T輔助細胞反應之抗原決定基的序列來增強。在一些實施例中，免疫原性肽/T輔助結合物藉由間隔子分子連接。在一些實施例中，間隔子包含相對較小的中性分子，諸如胺基酸或胺基酸模擬物，其在生理條件下實質上不帶電。間隔子可選自例如Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔子。應理解，視情況存在之間隔子不一定包含相同殘基，且因此可為雜寡聚物或均寡聚物。新抗原肽可直接或經由在肽之胺基或羧基端處的間隔子與T輔助肽連接。新抗原肽或T輔助肽之胺基端可經醯化。T輔助肽之實例包括破傷風類毒素殘基830-843、流感殘基307-319及瘧疾環子孢子殘基382-398及殘基378-389。
本發明之肽序列可視情況經由在DNA水準下之變化改變，尤其藉由使預選的鹼基處之編碼肽的DNA突變以使得產生將轉換成所要胺基酸的密碼子。
在一些實施例中，本文所描述之肽可含有取代以改變所得肽之物理特性(例如穩定性或溶解度)。舉例而言，肽可藉由用α-胺基丁酸(「B」)取代半胱胺酸(C)來進行修飾。歸因於其化學性質，半胱胺酸具有形成二硫橋鍵之傾向且充分在結構上改變肽以便減少結合力。用α-胺基丁酸取代C不僅緩解此問題，且實際上在某些情況下改良結合及交叉結合能力。用α-胺基丁酸取代半胱胺酸可在新抗原肽之任何殘基處，例如在肽內抗原決定基或類似物之錨或非錨位置處或在肽之其他位置處進行。
肽亦可藉由延長或減少化合物之胺基酸序列(例如藉由胺基酸之添加或缺失)來進行修飾。肽或類似物亦可藉由改變某些殘基之順序或組成而經修飾。熟習此項技術者應瞭解，生物活性必需之某些胺基酸殘基，例如關鍵接觸位點處之彼等胺基酸殘基或保守殘基一般不能改變，否則將對生物活性產生不良影響。非關鍵性胺基酸無需限於蛋白質中天然存在的胺基酸，諸如L-α-胺基酸或其D-異構體，但可同樣包括非天然胺基酸，諸如β-γ-δ-胺基酸以及L-α-胺基酸之許多衍生物。
在一些實施例中，肽可使用具有單胺基酸取代之一系列肽進行修飾以測定靜電電荷、疏水性等對HLA結合之作用。舉例而言，可沿著肽長度進行一系列帶正電(例如Lys或Arg)或帶負電(例如Glu)的胺基酸取代，揭露針對各種HLA分子及T細胞受體之不同的敏感性模式。另外，可採用使用較小相對中性部分，諸如Ala、Gly、Pro或類似殘基之多個取代。取代可為均寡聚物或雜寡聚物。取代或添加之殘基之數目及類型視必需接觸點及尋求之某些功能性屬性(例如疏水性與親水性)之間所需的間距而定。相較於母體肽之親和力，HLA分子或T細胞受體之增加的結合親和力亦可藉由此類取代來達成。在任何情況下，此類取代應採用所選胺基酸殘基或其他分子片段以避免例如可能破壞結合之空間及電荷干擾。胺基酸取代通常具有單個殘基。取代、缺失、插入或其任何組合可進行組合以獲得最終肽。
在一些實施例中，本文所描述之肽可包含胺基酸模擬物或非天然胺基酸殘基，例如D-或L-萘基丙胺酸；D-或L-苯基甘胺酸；D-或L-2-噻嗯基丙胺酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙胺酸；D-或L-3噻嗯基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯丙胺酸；D-ρ-氟苯丙胺酸；D-或L-ρ-聯二苯-苯丙胺酸；D-或L-ρ-甲氧基聯二苯苯基丙胺酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙胺酸；及D-或L-烷基丙胺酸，其中烷基可為經取代或未經取代之甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二異丁基、異戊基或非酸性胺基酸殘基。非天然胺基酸之芳族環包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基及吡啶基芳族環。具有各種胺基酸模擬物或非天然胺基酸殘基之經修飾之肽可具有活體內增加的穩定性。此類肽亦可具有改良的儲存壽命或製造特性。
在一些實施例中，本文所描述之肽可藉由末端-NH2 醯化，例如藉由烷醯基(C1 -C20 )或硫代羥乙醯基乙醯化、末端-羧基醯胺化，例如氨、甲胺等經修飾。在一些實施例中，此等修飾可提供用於連接至載體或其他分子之位點。在一些實施例中，本文所描述之肽可含有修飾，諸如但不限於糖基化、側鏈氧化、生物素標記、磷酸化、添加表面活性材料，例如脂質，或可經化學修飾，例如乙醯化等。另外，肽中之鍵可不為肽鍵，例如為共價鍵、酯或醚鍵、二硫鍵、氫鍵、離子鍵等。
在一些實施例中，本文所描述之肽可包含載體，諸如此項技術中熟知之載體，例如甲狀腺球蛋白；白蛋白，諸如人類血清白蛋白；破傷風類毒素；聚胺基酸殘基，諸如聚L-離胺酸及聚L-麩胺酸；流感病毒蛋白質；B型肝炎病毒核心蛋白及其類似物。
肽可進一步經修飾以含有不通常為蛋白質之一部分之額外化學部分。彼等衍生部分可改良蛋白質之溶解度、生物半衰期、吸收率或結合親和力。該等部分亦可減少或消除肽及其類似物之任何所要副作用。關於彼等部分之概述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第20版, Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)中。舉例而言，具有所要活性之新抗原肽可視需要經修飾以提供某些所要屬性，例如改良的藥理學特徵，同時增加或至少保留未經修飾之肽結合所要HLA分子及活化適當T細胞的實質上全部生物活性。舉例而言，肽可經受各種變化，諸如保守性或非保守性取代，其中此類變化可能在其使用中提供某些優勢，諸如改良的HLA結合。此類保守取代可涵蓋用生物及/或化學類似之另一胺基酸殘基置換胺基酸殘基，例如用一個疏水性殘基置換另一個，或用一個極性殘基置換另一個。單胺基酸取代之作用亦可使用D-胺基酸探測。此類修飾可使用熟知的肽合成程序進行，如例如Merrifield, Science 232:341-347 (1986)，Barany及Merrifield, The Peptides, Gross及Meienhofer編(N.Y., Academic Press), 第1-284頁(1979)；及Stewart及Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 第2版(1984)中所描述。
在一些實施例中，本文所描述之肽可結合於較大緩慢代謝大分子，諸如蛋白質；多醣，諸如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠粒；聚合胺基酸，諸如聚麩胺酸、聚離胺酸；胺基酸共聚物；不活化病毒粒子；不活化細菌毒素，諸如來自白喉、破傷風、霍亂、白血球毒素分子之類毒素；不活化細菌；及樹突狀細胞。
肽的變化可包括但不限於與載體蛋白結合、與配位體結合、與抗體結合、PEG化、聚唾液酸化HES化、重組PEG模擬物、Fc融合、白蛋白融合、奈米粒子附著、奈米顆粒包封、膽固醇融合、鐵融合、醯化、醯胺化、糖基化、側鏈氧化、磷酸化、生物素標記、添加表面活性材料、添加胺基酸模擬物或添加非天然胺基酸。
糖基化可影響蛋白質之物理特性，且亦可在蛋白質穩定性、分泌及次細胞定位方面為重要的。恰當糖基化對生物活性而言可為重要的。實際上，當在缺乏用於糖基化蛋白質之細胞過程之細菌(例如大腸桿菌(E. coli))中表現時，來自真核生物體之一些基因產生由於其缺乏糖基化以極小或沒有活性回收之蛋白質。添加糖基化位點可藉由改變胺基酸序列實現。可例如藉由添加一或多種絲胺酸或蘇胺酸殘基(或取代O -連接糖基化位點)或天冬醯胺殘基(或取代N -連接糖基化位點)進行肽或蛋白質改變。N -連接及O -連接寡醣及各類型中發現之糖殘基之結構可不同。兩者上通常發現之一種類型之糖為N -乙醯基神經胺糖酸(下文稱作唾液酸)。唾液酸通常為N -連接及O -連接寡醣之末端殘基，且由於其負電荷，可賦予糖蛋白酸性特性。本發明之實施例包含產生及使用N- 糖基化變異體。移除碳水化合物可以化學或酶促方式或藉由編碼經糖基化之胺基酸殘基之密碼子之取代實現。已知化學去糖基化技術，且可藉由使用多種內切及外切糖苷酶來達成多肽上碳水化合物部分之酶促裂解。
用於結合之額外適合的組分及分子包括例如用於靶向淋巴系統之分子、甲狀腺球蛋白；白蛋白，諸如人類血清白蛋白(HAS)；破傷風類毒素；白喉類毒素；聚胺基酸，諸如聚(D-離胺酸:D-麩胺酸)；輪狀病毒之VP6多肽；流感病毒血球凝集素、流感病毒核蛋白；匙孔螺血氰蛋白(KLH)；及B型肝炎病毒核心蛋白及表面抗原；或前述之任何組合。
另一類型之修飾為在多肽序列之N端及/或C端處結合(例如連接)一或多種額外組分或分子，諸如另一蛋白質(例如具有與個體蛋白質異源之胺基酸序列的蛋白質)或載體分子。因此，例示性多肽序列可以與另一組分或分子之結合物形式提供。在一些實施例中，白蛋白與本發明之肽或蛋白質之融合可例如藉由基因操控來達成，以使得編碼HSA或其片段之DNA與編碼一或多種多肽序列之DNA接合。其後，適合的宿主可用呈例如適合的質體形式之融合核苷酸序列轉形或轉染，以便表現融合多肽。表現可由例如原核或真核細胞活體外實現，或由例如轉殖基因生物體活體內實現。在本發明之一些實施例中，融合蛋白之表現在哺乳動物細胞株，例如CHO細胞株中進行。此外，白蛋白自身可經修飾以延長其循環半衰期。經修飾之白蛋白與一或多種多肽之融合可藉由上文所描述之基因操控技術或藉由化學結合獲得；所得融合分子之半衰期超過具有未經修飾之白蛋白之融合物之半衰期(參見例如WO2011/051489)。已開發出若干白蛋白結合策略作為直接融合之替代方案，包括經由結合脂肪酸鏈(醯化)之白蛋白結合。因為血清白蛋白為脂肪酸之轉運蛋白質，所以具有白蛋白結合活性之此等天然配位體已用於較小蛋白質治療劑之半衰期延長。
用於結合之額外候選組分及分子包括適用於分離或純化者。非限制性實例包括結合分子，諸如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對)、抗體、受體、配位體、凝集素或分子，其包含固體載體，包括例如塑膠或聚苯乙烯珠粒、盤或珠粒、磁珠、測試條及膜。諸如陽離子交換層析之純化方法可用於藉由電荷差分離結合物，其有效地將結合物分成其各種分子量。藉由陽離子交換層析獲得之溶離份之含量可藉由分子量，使用習知方法，例如質譜分析、SDS-PAGE或用於根據分子量分離分子實體之其他已知的方法鑑別。
在一些實施例中，本發明之肽或蛋白質序列之胺基端或羧基端可與免疫球蛋白Fc區(例如人類Fc)融合以形成融合結合物(或融合分子)。Fc融合結合物已展示增加生物藥劑之全身性半衰期，且因此生物藥劑產物可能需要的投與頻率較低。Fc結合至沿血管內部分佈之內皮細胞中之新生Fc受體(FcRn)，且在結合後，Fc融合分子受保護免受降解且再釋放至循環中，使分子在循環中持續時間更長。咸信此Fc結合為內源性IgG保持其長血漿半衰期之機制。最新的Fc-融合技術將生物藥劑之單一複本與抗體之Fc區連接以使生物藥劑相較於傳統的Fc-融合結合物之藥物動力學及藥力學特性最佳化。
本發明涵蓋使用目前已知或處於開發中之肽之其他修飾以改良一或多種特性。用於延長本發明之肽之循環半衰期、增加其穩定性、降低其清除率或改變其免疫原性或過敏原性之一個此類方法涉及藉由羥乙基澱粉化修飾肽序列，其利用連接至其他分子以便改變分子之特徵之羥乙基澱粉衍生物。羥乙基澱粉化之各種態樣描述於例如美國專利申請案第2007/0134197號及第2006/0258607號中。
肽穩定性可以多種方式加以分析。舉例而言，肽酶及各種生物介質(諸如人類血漿及血清)已用於測試穩定性。參見例如Verhoef等人, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986)。本文所描述之肽之半衰期宜使用25%人類血清(v/v)分析來測定。方案如下：混合人類血清(AB型，非加熱不活化)藉由離心在使用之前破損。隨後，血清用RPMI-1640或另一適合的組織培養基稀釋至25%。在預定時間間隔下，將少量反應溶液移出且將其添加至6%三氯乙酸(TCA)或乙醇水溶液中。將混濁反應樣品冷卻(4℃) 15分鐘，且隨後旋轉以集結經沈澱之血清蛋白。隨後使用穩定性特異性層析條件藉由逆相HPLC來判定肽之存在。
與短血漿半衰期或對蛋白酶降解之易感性相關的問題可藉由各種修飾解決，包括將肽或蛋白質序列結合或連接至多種非蛋白質聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯(參見例如通常經由共價鍵結至蛋白質及非蛋白質聚合物兩者之連接部分，例如PEG)中之任一者。此類PEG結合生物分子已展示具有臨床上適用的特性，包括較佳的物理及熱穩定性、針對酶促降解易感性之保護措施、增加的溶解度、較長活體內循環半衰期及降低的清除率、降低的免疫原性及抗原性及降低的毒性。
適合於與多肽或蛋白質序列結合之PEG一般在室溫下可溶於水中，且具有通式R-(O-CH2 -CH2 )n -O-R，其中R為氫或保護基，諸如烷基或烷醇基，且其中n為1至1000之整數。當R為保護基時，其一般具有1至8個碳。與多肽序列結合之PEG可為直鏈或分支鏈的。本發明涵蓋分支鏈PEG衍生物、「星形PEG」及多臂PEG。本發明亦涵蓋結合物之組合物，其中PEG具有不同n值，且因此各種不同PEG以特定比率存在。舉例而言，一些組合物包含結合物之混合物，其中n=l、2、3及4。在一些組合物中，結合物(其中n=1)之百分比為18-25%，結合物(其中n=2)之百分比為50-66%，結合物(其中n=3)之百分比為12-16%，且結合物(其中n=4)之百分比高達5%。此類組合物可藉由此項技術中已知之反應條件及純化方法產生。舉例而言，陽離子交換層析可用於分離結合物，且隨後鑑別含有例如附接有所要數目之PEG的結合物，經純化不含未經修飾之蛋白質序列及不含附接有其他數目之PEG的結合物之分率。
PEG可經由末端反應性基團(「間隔子」)與本發明之肽或蛋白質結合。間隔子為例如末端反應性基團，其介導多肽序列中之一或多者之游離胺基或羧基與PEG之間的鍵。具有可結合至游離胺基之間隔子之PEG包括N-羥基丁二醯亞胺PEG，其可藉由用N-羥基丁二醯亞胺活化PEG之丁二酸酯製備。可結合至游離胺基之另一活化PEG為2,4-雙(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可藉由使PEG單甲醚與三聚氯化氰反應製備。與游離羧基結合之活化PEG包括聚氧基乙二胺。
本發明之肽或蛋白質序列中之一或多者與具有間隔子之PEG之結合可藉由各種習知方法進行。舉例而言，結合反應可在溶液中在5至10之pH值下，在4℃至室溫之溫度下，利用4:1至30:1之試劑與肽/蛋白質之莫耳比進行30分鐘至20小時。可選擇反應條件以引導反應朝向主要產生所要取代度。一般而言，低溫、低pH值(例如pH=5)及短反應時間傾向於減少附接PEG之數目，而高溫、中至高pH值(例如pH＞7)及更長反應時間傾向於增加附接PEG之數目。此項技術中已知之各種手段可用於終止反應。在一些實施例中，藉由酸化反應混合物且在例如-20℃下冷凍來終止反應。 新抗原決定基
新抗原決定基包含新抗原肽或新抗原多肽中由免疫系統識別之新抗原決定子部分。新抗原決定基係指參考物，諸如非病變細胞，例如非癌細胞或生殖系細胞中不存在，但病變細胞，例如癌細胞中可見之抗原決定基。此包括對應抗原決定基可見於正常非病變細胞或生殖系細胞中，但歸因於病變細胞，例如癌細胞中之一或多個突變，抗原決定基之序列改變以產生新抗原決定基的情境。在本說明書中，術語「新抗原決定基」可與「腫瘤特異性抗原決定基」或「腫瘤特異性新抗原決定基」互換使用以表示通常藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，通常L-胺基酸。新抗原決定基可為多種長度，呈其中性(不帶電)形式或呈鹽形式，且不含修飾，諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化或含有此等修飾，經受不破壞如本文所描述之多肽之生物活性的修飾的條件。本發明提供包含來自表 1 至表 12 之腫瘤特異性突變之經分離之新抗原決定基。
在一些實施例中，本文所描述之用於MHC I類HLA之新抗原決定基的長度為12個胺基酸殘基或更少且通常由約8個與約12個之間的胺基酸殘基組成。在一些實施例中，本文所描述之用於MHC I類HLA之新抗原決定基為約8、約9、約10、約11或約12個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所描述之用於MHC II類HLA之新抗原決定基的長度為25個胺基酸殘基或更少且通常由約9個與約25個之間的胺基酸殘基組成。在一些實施例中，本文中所描述之用於MHC II類HLA之新抗原決定基為約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個胺基酸殘基。
在一些實施例中，本文所描述之組合物包含：包含蛋白質之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含：包含蛋白質之第一區域之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二區域之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一區域包含第二區域之至少一個胺基酸，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。在一些實施例中，突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、框移突變、通讀突變、基因融合突變及其任何組合。
在一些實施例中，第一新抗原決定基與I類HLA蛋白結合以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基與II類HLA蛋白結合以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR與II類HLA-肽複合物結合。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR與II類HLA-肽複合物結合。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR與I類HLA-肽複合物結合。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR與I類HLA-肽複合物結合。
在一些實施例中，第二新抗原決定基比第一新抗原決定基長。在一些實施例中，第一新抗原決定基之長度為至少8個胺基酸。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有8至12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含至少8個連續胺基酸之序列，其中8個連續胺基酸中之至少1個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含至少8個連續胺基酸之序列，其中8個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第二新抗原決定基之長度為至少16個胺基酸。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有16至25個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含至少16個連續胺基酸之序列，其中16個連續胺基酸中之至少1個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含至少16個連續胺基酸之序列，其中16個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。
在一些實施例中，新抗原決定基包含至少一個錨殘基。在一些實施例中，第一新抗原決定基、第二新抗原決定基或兩者包含至少一個錨殘基。在一個實施例中，第一新抗原決定基之至少一個錨殘基在典型錨位置或非典型錨位置處。在另一實施例中，第二新抗原決定基之至少一個錨殘基在典型錨位置或非典型錨位置處。在又一實施例中，第一新抗原決定基之至少一個錨殘基與第二新抗原決定基之至少一個錨殘基不同。
在一些實施例中，至少一個錨殘基為野生型殘基。在一些實施例中，至少一個錨殘基為取代基。在一些實施例中，至少一個錨殘基不包含突變。
在一些實施例中，第二新抗原決定基或兩者包含至少一個錨殘基側接區域。在一些實施例中，新抗原決定基包含至少一個錨殘基。在一些實施例中，至少一個錨殘基包含至少兩個錨殘基。在一些實施例中，至少兩個錨殘基由包含至少1個胺基酸之分隔區域分隔開。在一些實施例中，至少一個錨殘基側接區域不在分隔區域內。在一些實施例中，至少一個錨殘基側接區域(a)在至少兩個錨殘基之N端錨殘基之上游；(b)在至少兩個錨殘基之C端錨殘基之下游；或(a)及(b)兩者。
在一些實施例中，新抗原決定基結合HLA蛋白質(例如，MHC I類HLA或MHC II類HLA)。在一些實施例中，新抗原決定基以比對應野生型肽更大之親和力結合HLA蛋白。在一些實施例中，新抗原決定基具有小於5,000 nM，小於1,000 nM，小於500 nM，小於100 nM，小於50 nM或更小之IC50 。在一些實施例中，新抗原決定基可具有約1 pM與約1 mM之間、約100 pM與約500µM之間、約500 pM與約10µM之間、約1 nM與約1µM之間，或約10 nM與約1µM之間的HLA結合親和力。在一些實施例中，新抗原決定基可具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1,000、1,500或2,000 nM或更大之HLA結合親和力。在一些實施例中，新抗原決定基可具有至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1,000、1,500或2,000 nM之HLA結合親和力。
在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基以與對應野生型新抗原決定基相比更大之親和力結合至HLA蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基以小於1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD 或IC50 結合至HLA蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基以小於1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD 或IC50 結合至I類HLA蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基以小於2,000 nM、1,500 nM、1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD 或IC50 結合至II類HLA蛋白質。
在一些實施例中，新抗原決定基結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以0.1 nM至2000 nM之親和力結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000 nM之親和力結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以0.1 nM至2000 nM、1 nM至1000 nM、10 nM至500 nM或小於1000 nM之親和力結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000 nM之親和力結合至MHC II類HLA。
在一些實施例中，新抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之穩定性結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之穩定性結合至MHC I類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之穩定性結合至MHC II類HLA。在一些實施例中，新抗原決定基以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之穩定性結合至MHC II類HLA。
在一態樣中，第一及/或第二新抗原決定基結合至由個體表現之HLA對偶基因編碼之蛋白質。在另一態樣中，突變不存在於個體之非癌細胞中。在又一態樣中，第一及/或第二新抗原決定基由個體癌細胞之基因或表現基因編碼。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含如表 1 至表 12 之行1中所描繪之突變。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含如表 1 至表 12 之行1中所描繪之突變。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ALNSEALSVV。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列MALNSEALSV。
在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自KRAS蛋白質。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自NRAS蛋白質。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自包含G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L取代之突變之KRAS蛋白質。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自包含Q61K或Q61R取代之突變之NRAS蛋白質。在一些實施例中，新抗原決定基包含取代突變，例如KRAS G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突變或NRAS Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE之KRAS或NRAS蛋白序列。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列KLVVVGACGV。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LVVVGACGV。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVGACGVGK。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVVGACGVGK。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEVVGADGVGK之KRAS或NRAS蛋白序列。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVVGADGVGK。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列KLVVVGADGV。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LVVVGADGV。
在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE之KRAS或NRAS蛋白序列。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列KLVVVGAVGV。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LVVVGAVGV。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVGAVGVGK。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVVGAVGVGK。
在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM之KRAS或NRAS蛋白序列。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGHEEY。
在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM之KRAS或NRAS蛋白序列。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGLEEY。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LLDILDTAGL。
在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM之KRAS或NRAS蛋白序列。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGKEEY。
在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM之KRAS或NRAS蛋白序列。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGREEY。
在一些實施例中，新抗原決定基包含選自由以下組成之群的序列：DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR及DILDTAGKE。
在一些實施例中，新抗原決定基包含RAS抗原決定基。在一些實施例中，新抗原決定基包含突變型RAS序列，其包含在G12、G13或Q61處包含突變之突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸及在G12、G13或Q61處之突變。在一些實施例中，包含G12、G13或Q61處之突變的突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，G12、G13或Q61處之突變包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。
在一些實施例中，包含突變型RAS序列之新抗原決定基包含以下之胺基酸序列：GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE。
在一些實施例中，包含突變型RAS序列之新抗原決定基結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，包含突變型RAS序列之新抗原決定基以小於10µM、小於9µM、小於8µM、小於7µM、小於6µM、小於5µM、小於4µM、小於3µM、小於2µM、小於1µM、小於950 nM、小於900 nM、小於850 nM、小於800 nM、小於750 nM、小於600 nM、小於550 nM、小於500 nM、小於450 nM、小於400 nM、小於350 nM、小於300 nM、小於250 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於30 nM、小於20 nM或小於10 nM之親和力結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，包含突變型RAS序列之新抗原決定基以大於24小時、大於23小時、大於22小時、大於21小時、大於20小時、大於19小時、大於18小時、大於17小時、大於16小時、大於15小時、大於14小時、大於13小時、大於12小時、大於11小時、大於10小時、大於9小時、大於8小時、大於7小時、大於6小時、大於5小時、大於4小時、大於3小時、大於2小時、大於1小時、大於55分鐘、大於50分鐘、大於45分鐘、大於40分鐘、大於35分鐘、大於30分鐘、大於25分鐘、大於20分鐘、大於15分鐘、大於10分鐘、大於9分鐘、大於8分鐘、大於7分鐘、大於6分鐘、大於5分鐘、大於4分鐘、大於3分鐘、大於2分鐘或大於1分鐘之穩定性結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。
取代可沿著新抗原決定基之長度位於任何地方。舉例而言，其可位於肽之N端三分之一、肽之中心三分之一或肽之C端三分之一中。在另一實施例中，經取代之殘基位置離N端2至5個殘基或離C端2至5個殘基。肽可類似地衍生自腫瘤特異性插入突變，其中肽包含插入殘基中之一或多者或所有。
在一些實施例中，如本文所描述之肽可利用不含污染性細菌或動物物質之試劑而容易地以化學方式合成(Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963)。在一些實施例中，肽如下製備：(1)使用均一合成及裂解條件在多通道儀器上進行並行固相合成；(2)在RP-HPLC管柱上用管柱汽提進行純化；及再洗滌，但肽之間無置換；隨後(3)用有限的一組提供最多資訊的分析進行分析。優良藥品製造規範(Good Manufacturing Practices；GMP)的覆蓋範圍可圍繞個別患者之肽集合來定義，因此用於不同患者之肽合成之間僅需要套件轉換程序。在一些實施例中，可使用針對固相肽合成所製造之任何樹脂。 聚核苷酸
或者，編碼本發明之肽之核酸(例如聚核苷酸)可用於活體外產生新抗原肽。聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、RNA、單股及/或雙股或原生或穩定化形式的聚核苷酸，諸如具有硫代磷酸酯主鏈的聚核苷酸，或其組合，且其可含有或可不含有內含子，只要其編碼肽即可。在一些實施例中，使用活體外轉譯來產生肽。
本文提供編碼本發明中描述之新抗原多肽中之每一者的新抗原聚核苷酸。本發明中術語「聚核苷酸」、「核苷酸」或「核酸」可與「突變型聚核苷酸」、「突變型核苷酸」、「突變型核酸」、「新抗原聚核苷酸」、「新抗原核苷酸」或「新抗原突變型核酸」互換使用。歸因於基因密碼之冗餘，各種核酸序列可編碼相同肽。此等核酸中之每一者屬於本發明之範疇內。編碼肽之核酸可為DNA或RNA，例如mRNA或DNA及RNA之組合。在一些實施例中，編碼肽之核酸為自擴增mRNA (Brito等人, Adv. Genet. 2015; 89:179-233)。編碼本文所描述之肽之任何適合的聚核苷酸屬於本發明之範疇內。
在一些實施例中，兩個連續抗原肽之編碼序列係藉由間隔子或連接子分隔。在一些實施例中，兩個連續抗原肽之編碼序列彼此相鄰。在一些實施例中，兩個連續抗原肽之編碼序列不藉由間隔子或連接子分隔。
在一些實施例中，間隔子或連接子包含至多5000個核苷酸殘基。例示性間隔子序列為GGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGC。另一例示性間隔子序列為GGCGGCAGCCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGC。另一例示性間隔子序列為GGCGTCGGCACC。另一例示性間隔子序列為CAGCTGGGCCTG。另一例示性間隔子為編碼離胺酸之序列，諸如AAA或AAG。另一例示性間隔子序列為CAACTGGGATTG。
在一些實施例中，mRNA包含一或多個增強APC之抗原決定基處理及呈現的額外結構。
在一些實施例中，連接子或間隔區可含有裂解位點。裂解位點確保包含抗原決定基序列串之蛋白質產物裂解成用於呈現之分開的抗原決定基序列。較佳裂解位點與某些抗原決定基相鄰置放以便避免序列內之抗原決定基之無意裂解。在一些實施例中，抗原決定基及編碼抗原決定基串之mRNA上的裂解區之設計為非隨機的。
術語「RNA」包括「mRNA」且在一些實施例中涉及「mRNA」。術語「mRNA」意謂「信使-RNA」且涉及藉由使用DNA模板產生且編碼肽或多肽之「轉錄物」。通常，mRNA包含5'-UTR，一種編碼區之蛋白質，及3'-UTR。mRNA僅在細胞中及活體外具有有限半衰期。在一些實施例中，mRNA為自擴增mRNA。在本發明之上下文中，mRNA可藉由自DNA模板進行活體外轉錄來產生。活體外轉錄方法為熟習此項技術者已知。舉例而言，存在多種市售活體外轉錄套組。
可視需要改變RNA之穩定性及轉譯效率。舉例而言，RNA可經穩定化且其轉譯藉由具有穩定化作用及/或增加RNA之轉譯效率的一或多種修飾增加。此類修飾描述於例如PCT/EP2006/009448中，其以引用之方式併入本文中。為了增加根據本發明使用之RNA之表現，其可在編碼區，亦即，編碼表現之肽或蛋白質之序列內經修飾，而不改變表現之肽或蛋白質之序列，以便增加GC含量以增加mRNA穩定性且實行密碼子最佳化且因此增強細胞中之轉譯。
在本發明中使用之RNA之上下文中，術語「修飾」包括RNA中不天然存在之該RNA之任何修飾。在一些實施例中，RNA不具有未封端5'-三磷酸酯。移除此類未封端5'-三磷酸酯可藉由用磷酸酶處理RNA來達成。在其他實施例中，RNA可具有經修飾之核糖核苷酸以便增大其穩定性及/或減少細胞毒性。在一些實施例中，胞嘧啶核苷在RNA中可部分或完全地用5-甲基胞嘧啶核苷取代。可替代地，尿苷部分或完全用假尿苷取代。
在一些實施例中，術語「修飾」涉及提供具有5'-封端或5'-封端類似物之RNA。術語「5'-封端」係指mRNA分子之5'-端上可見之封端結構且一般由經由不常見5'至5'三磷酸酯鍵與mRNA連接之鳥苷核苷酸組成。在一些實施例中，此鳥苷在7-位置處經甲基化。術語「習知5'-封端」係指7-甲基鳥苷封端(m G)之天然存在之RNA 5'-封端。在本發明之上下文中，術語「5'-封端」包括類似RNA封端結構之5'-封端類似物且經修飾以具有穩定化RNA及/或增強RNA轉譯(若附接於、活體內及/或細胞中)之能力。
在某些實施例中，向有需要之個體投與編碼本發明之新抗原肽之mRNA。在一些實施例中，本發明提供包含經修飾之核苷之RNA、寡核糖核苷酸及聚核糖核苷酸分子、包含其之基因療法載體、包含其之基因療法方法及基因轉錄靜默方法。在一些實施例中，待投與mRNA包含至少一種經修飾之核苷。
編碼本文所描述之肽的聚核苷酸可藉由化學技術，例如Matteucci等人, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)之磷酸三酯方法合成。編碼包含類似物或由類似物組成之肽之聚核苷酸可簡單地藉由用適當及所要一或多個核酸鹼基取代編碼原生抗原決定基之核酸鹼基製得。
在一些實施例中，聚核苷酸可包含在相同閱讀框架中與有助於例如肽或蛋白質自宿主細胞之表現及/或分泌之聚核苷酸融合的肽或蛋白質之編碼序列(例如充當用於控制多肽自細胞之轉運之分泌序列的前導序列)。具有前導序列之多肽為前蛋白且可具有由宿主細胞裂解以形成多肽之成熟形式的前導序列。
在一些實施例中，聚核苷酸可包含在相同閱讀框架中與允許例如純化經編碼之肽之標記物序列融合的肽或蛋白質之編碼序列(其可隨後併入個體化疾病疫苗或免疫原性組合物中)。舉例而言，在細菌宿主的情況下，標記物序列可為pQE-9載體所供應的六組胺酸標籤，以便對與標記物融合之成熟多肽進行純化，或當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時，標記物序列可為衍生自流感血球凝集素蛋白質的血球凝集素(HA)標籤。額外標籤包括但不限於鈣調蛋白標籤、FLAG標籤、Myc標籤、S標籤、SBP標籤、Softag 1、Softag 3、V5標籤、Xpress標籤、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基載體蛋白質(BCCP)標籤、GST標籤、螢光蛋白標籤(例如綠色螢光蛋白標籤)、麥芽糖結合蛋白標籤、Nus標籤、鏈黴素標籤、硫氧還蛋白標籤、TC標籤、Ty標籤及其類似物。
在一些實施例中，聚核苷酸可包含一或多種目前所描述之肽或蛋白質之編碼序列，其在相同閱讀框架中融合以產生能夠產生多種新抗原肽的單一串聯化新抗原肽構築體。
在一些實施例中，使用重組技術、藉由分離或合成編碼相關野生型蛋白質的DNA序列來構築DNA序列。視情況，可藉由位點特異性突變誘發使序列突變誘發以提供其功能類似物。參見例如Zoeller等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)及美國專利第4,588,585號。在另一實施例中，編碼相關肽或蛋白之DNA序列將藉由化學合成，使用寡核苷酸合成器構築。可基於所要肽之胺基酸序列且選擇有利於宿主細胞之彼等密碼子設計此類寡核苷酸，其中產生相關重組多肽。可應用標準方法合成編碼經分離相關多肽的經分離之聚核苷酸序列。舉例而言，可使用完整胺基酸序列構築回復轉譯之基因。此外，可合成含有編碼特定經分離之多肽之核苷酸序列的DNA寡聚物。舉例而言，可合成編碼所要多肽之部分的若干小寡核苷酸且接著接合。個別寡核苷酸通常含有5'或3'突出端以用於互補性組裝。
一經組裝(例如藉由合成、定點突變誘發或另一種方法)，編碼特定經分離相關多肽的聚核苷酸序列即插入表現載體中且視情況可操作地連接至適於在所要宿主中表現蛋白質的表現控制序列。恰當組裝可藉由核苷酸定序、限制酶圖譜及/或生物活性多肽在適合宿主中之表現來確認。如此項技術中所熟知，為獲得經轉染基因在宿主中之高表現量，基因可操作地連接於在所選表現宿主中具有功能性之轉錄及轉譯表現控制序列。因此，本發明亦關於適用於產生及投與本文所描述之新抗原多肽及新抗原決定基的載體及表現載體，且亦關於包含此類載體之宿主細胞。
在一些實施例中，亦可製備能夠表現如本文所描述之肽或蛋白質之表現載體。不同細胞類型的表現載體在此項技術中已熟知且無需過度實驗便可選擇。一般而言，將DNA以恰當取向插入至表現載體(諸如質體)中且校正閱讀框架以用於表現。必要時，可將DNA連接至由所要宿主(例如細菌)識別的適當轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，但此類控制一般可在表現載體中獲得。隨後將載體引入宿主細菌中以便使用標準技術進行選殖(參見例如Sambrook等人(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)。
適用於產生及投與本文所描述之新抗原多肽之大量載體及宿主系統為熟習此項技術者已知且為市售的。藉助於實例提供以下載體。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (Stratagene); ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)；pCR (Invitrogen)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL (Pharmacia)；p75.6 (Valentis)；pCEP (Invitrogen)；pCEI (Epimmune)。然而，可使用任何其他質體或載體，只要其在宿主中可複製且有成活力即可。
編碼本文所描述之新抗原肽的聚核苷酸亦可包含泛素化信號序列及/或靶向序列，諸如內質網(ER)信號序列以促進所得肽移動至內質網中。
在一些實施例中，本文所描述之新抗原肽亦可藉由病毒或細菌載體投與及/或表現。表現載體之實例包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或鳥痘。適用於免疫接種方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為卡介苗(Bacille Calmette Guerin，BCG)。Stover等人, Nature 351:456-460 (1991)描述BCG載體。根據本文中之描述，熟習此項技術者將顯而易知，適用於治療投與或免疫接種本文所描述之新抗原多肽之多種其他載體，例如腺及腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella Typhimurium)載體、解毒炭疽毒素載體、仙台病毒載體、痘病毒載體、金絲雀痘載體及其類似物。在一些實施例中，載體為改良型安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Ankara，VA) (例如Bavarian Noridic (MVA-BN))。
各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統亦有利地用於表現重組蛋白。由於重組蛋白質一般正確摺疊、經適當修飾且具有完全官能性，因此此類蛋白質可在哺乳動物細胞中表現。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括Gluzman (Cell 23:175, 1981)所述之猴腎COS-7細胞株，及能夠表現適當載體的其他細胞株，包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、293、HeLa及BHK細胞株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，諸如複製起點、連接至待表現基因之適合啟動子及增強子，及其他5'或3'側接非轉錄序列，及5'或3'非轉譯序列，諸如必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及接受體位點及轉錄終止序列。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質的桿狀病毒系統於Luckow及Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)中綜述。
宿主細胞用可例如為選殖載體或表現載體之載體進行基因工程改造(轉導或轉形或轉染)。載體可例如呈質體、病毒粒子、噬菌體等形式。經工程改造之宿主細胞可在經修飾而適於活化啟動子、選擇轉化子或擴增聚核苷酸之習知養分培養基中培養。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。
可提及以下作為適當的宿主之代表性實例：細菌細胞，諸如大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門桿菌及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)及葡萄球菌屬(Staphylococcus)內之各種物種；真菌細胞，諸如酵母；昆蟲細胞，諸如果蠅及Sf9；動物細胞，諸如猴腎COS-7纖維母細胞株，其由Gluzman, Cell 23:175 (1981)所描述；及能夠表現可相容載體之其他細胞株，例如C127、3T3、CHO、HeLa及BHK細胞株或Bowes黑素瘤；植物細胞等。根據本文中之教示內容選擇適當的宿主被認為在熟習此項技術者之能力範疇內。
本文所描述之聚核苷酸可在人類細胞中投與及表現(例如免疫細胞，包括樹突狀細胞)。可使用人類密碼子使用表來指導各胺基酸的密碼子選擇。此類聚核苷酸包含抗原決定基及/或類似物(諸如上文所描述者)之間的間隔子胺基酸殘基，或可包含鄰近於抗原決定基及/或類似物(及/或CTL (例如CD8+ )、Th (例如CD4+ )及B細胞抗原決定基)之天然存在的側接序列。
載體中可包括熟習此項技術者熟知的標準調節序列以確保在人類目標細胞中表現。需要若干載體元件：具有用於聚核苷酸之下游選殖位點，例如小型基因插入之啟動子；用於有效轉錄終止之聚腺苷酸化信號；大腸桿菌複製起點；及大腸桿菌可選標記物(例如安比西林(ampicillin)或康黴素(kanamycin)抗性)。多種啟動子可用於此目的，例如人類細胞巨大病毒(hCMV)啟動子。關於其他適合的啟動子序列，參見例如美國專利第5,580,859號及第5,589,466號。在一些實施例中，啟動子為CMV-IE啟動子。
可藉由多種不同方法將載體引入動物組織中。兩種最流行方法為使用標準皮下注射針注射含DNA之生理鹽水及基因槍遞送。藉由此等兩種方法構築DNA疫苗質體及隨後遞送其至宿主中的示意性概述說明於Scientific American (Weiner等人, (1999)Scientific American 281(1): 34-41)中。以生理鹽水形式注射通常在骨胳肌肉中肌肉內(IM)進行，或皮內(ID)進行，其中DNA遞送至細胞外空間。此可藉由電穿孔、藉由肌肉毒素(諸如布比卡因(bupivacaine))暫時性損傷肌纖維；或藉由使用高滲生理鹽水或蔗糖溶液來輔助(Alarcon等人, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410)。此遞送方法之免疫反應可能受多種因素影響，包括針頭類型、針頭排列、注射速度、注射體積、肌肉類型及進行注射之動物之年齡、性別及生理條件(Alarcon等人, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410)。
基因槍遞送(另一常用遞送方法)以彈道形式加快已吸附於金或鎢微粒上之質體DNA (pDNA)進入目標細胞中，使用壓縮氦氣作為加速劑(Alarcon等人, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410；Lewis等人, (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)。
替代遞送方法可包括以氣溶膠將裸DNA滴入黏膜表面(諸如鼻及肺黏膜)上(Lewis等人, (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)及局部投與pDNA至眼及陰道黏膜(Lewis等人, (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)。黏膜表面遞送亦已使用以下達成：陽離子脂質體-DNA製劑、生物可降解微球體、減毒志賀桿菌(Shigella)或李氏菌(Listeria)載體用於經口投與至腸黏膜，及重組腺病毒載體。DNA或RNA亦可在暫時滲透細胞之細胞膜之輕度機械破壞之後遞送至細胞。膜之此類輕度機械破壞可藉由輕輕地迫使細胞通過較小孔隙實現(Sharei等人, Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, PLOS ONE (2015))。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米囊劑、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。適用作活體外及活體內遞送媒劑之例示性膠態系統為脂質體(例如人工膜泡)。在利用非病毒遞送系統之情況下，例示性遞送媒劑為脂質體。「脂質體」為通用術語，其涵蓋藉由產生封閉之脂質雙層或聚集物而形成的多種單層及多層脂質媒劑。脂質體之特徵可為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有由水性介質分隔開之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水性溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前進行自重組且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶解物(Ghosh等人, Glycobiology 5: 505-10 (1991))。然而，亦涵蓋在溶液中具有與普通囊泡結構不同之結構的組合物。舉例而言，脂質可呈現膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋脂染胺-核酸複合物。
涵蓋使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質結合。與脂質結合之核酸可囊封於脂質體之水性內部中，穿插於脂質體之脂質雙層內，經與脂質體及寡核苷酸有關之連接分子連接至脂質體、包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質結合。與脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合的組合物不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可存在於雙層結構中，呈微胞形式或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地穿插於溶液中，可能形成尺寸或形狀上不均勻的聚集物。脂質為可天然存在之脂肪物質或合成脂質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。適用之脂質可獲自商業來源。氯仿或氯仿/甲醇中之脂質儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿用作唯一溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。4. 抗原呈現細胞 (APC)
抗原呈現細胞(APC)在其細胞表面上呈現與MHC分子結合之蛋白質抗原之肽片段。所呈現之肽與MHC分子結合，作為APC細胞表面上之肽-MHC複合物(pMHC)。肽-MHC複合物之處理及呈現可涉及一系列連續階段，其包含：蛋白酶介導之蛋白質消化；肽由抗原處理相關轉運體(TAP)介導轉運至內質網(ER)中；使用新合成之MHC分子形成肽-MHC I分子；及肽-MHC分子轉運至細胞表面。
一些APC可活化抗原特異性T細胞。舉例而言，包含與pMHC相互作用之T細胞受體(TCR)的T細胞可在TCR-pMHC之形成下活化、刺激、誘導或擴增。在一些實施例中，APC之MHC (例如I類MHC或II類MHC)可負載有肽且藉由將編碼包含待呈現之肽序列之抗原肽或多肽的核酸(例如RNA)引入APC中，藉由APC呈現。
自生物學觀點出發，為使體細胞突變產生免疫反應，需要滿足若干準則：含有突變之對偶基因應由細胞表現，突變應在蛋白質編碼區中，且為非同義的，經轉譯之蛋白質應藉由蛋白酶體或其他細胞蛋白質降解路徑裂解且含有突變之抗原決定基應由MHC複合物呈現，所呈現之抗原決定基應由TCR識別，且最後，TCR-pMHC複合物應啟動活化T細胞之信號級聯。
單核球可在血流中循環且隨後移動至組織中，其中該等單核球可分化成巨噬細胞及樹突狀細胞。經典單核球通常特徵在於CD14細胞表面受體之高表現量。單核球及B細胞可為勝任APC，但其抗原呈現能力似乎限於先前敏化T細胞之再活化。此等細胞類型可能不能夠直接活化功能上初始或未預致敏(unprimed)之T細胞群體。專職抗原呈現細胞藉由吞噬作用或藉由受體介導之內飲作用，且隨後在其膜上呈現結合至MHC分子之抗原之片段而在內化抗原方面極其有效。T細胞識別APC之膜上之抗原-MHC分子複合物且與其相互作用。額外協同刺激信號隨後藉由APC產生，引起T細胞活化。協同刺激分子之表現為專職APC之典型特徵。
專職APC藉由吞噬作用或藉由受體介導之內飲作用，且隨後在其膜上呈現結合至MHC分子之抗原之片段而在內化抗原方面可極其有效。T細胞可識別APC之膜上之抗原-MHC分子複合物且與其相互作用。額外協同刺激信號隨後可藉由APC產生，引起T細胞活化。協同刺激分子之表現可為專職抗原呈現細胞之定義性特徵。專職APC之實例可包括但不限於樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞及B細胞。專職APC可表現高含量之MHC II類、ICAM-1及B7-2。
專職APC之主要類型中之一者為DC，其具有最廣泛範圍之抗原呈現。其他主要類型之專職APC包括巨噬細胞、B細胞及某些活化之上皮細胞。DC為經由MHC II及I類抗原呈現路徑將抗原(例如在周邊組織中捕獲之抗原)呈現至T細胞的白血球群體。DC能夠活化初始及此前預致敏之T細胞(例如，記憶T細胞)。DC可為經由II及I類MHC抗原呈現路徑將在周邊組織中捕獲之抗原呈現至T細胞的白血球群體。DC可為免疫反應之強效誘導劑且此等細胞之活化可為誘導抗腫瘤免疫之關鍵步驟。
DC可分類為「不成熟」及「成熟」細胞，其可用作在兩種良好表徵表型之間辨別的簡單方式。然而，此命名法不應視為不包括所有可能的分化中間階段。不成熟DC之特徵可為對抗原吸收及處理具有高容量之APC，其與Fcγ受體及甘露糖受體之高表現相關。成熟表型之特徵通常可在於此等標記物之較低表現，及引起T細胞活化之細胞表面分子，諸如I類及II類MHC、黏附分子(例如CD54及CD11)及協同刺激分子(例如CD40、CD80、CD86及4-1BB)之高表現。成熟DC可為CD11b+ 、CD11c+ 、HLA-DR+ 、CD80+ 、CD86+ 、CD54+ 、CD3− 、CD19− 、CD14− 、CD141+ (BDCA-3)及/或CD1a+ 。DC成熟可稱為DC活化狀態，在該狀態下此類抗原呈現DC引起T細胞預致敏，而由不成熟DC呈現導致耐受性。DC成熟可由具有藉由先天性受體(例如細菌DNA、病毒RNA、內毒素等)、促炎性細胞介素(例如TNF、介白素及干擾素)、藉由CD40L接合DC表面上之CD40，及由經歷細胞死亡之細胞釋放的物質偵測之微生物特徵的生物分子引起。可誘導DC成熟之細胞介素之其他非限制性實例包括IL-4、GM-CSF、TNF-α、IL-1β、PGE1及IL-6。舉例而言，DC可藉由將骨髓細胞活體外與細胞介素(諸如顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及腫瘤壞死因子α(TNF-α))一起培養來衍生。舉例而言，DC可衍生自自PBMC分離之CD14+ 單核球。可用於將單核球衍生為DC之細胞介素或生長因子包括但不限於GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40及聚I:C。
通常，非專職抗原呈現細胞不組成性表現MHC II類蛋白質。MHC II類蛋白質通常僅在非專職APC藉由某些細胞介素(諸如IFN-γ)刺激下表現。
APC之來源可通常為包含能夠活體外表現及呈現抗原肽之APC或APC前驅體之組織來源。在一些實施例中，當負載有目標RNA及/或用必需的細胞介素或因子處理時，APC能夠增殖且變為專職APC。
在一個態樣中，抗原性多肽或蛋白質可以含有如本文所描述之此類多肽、肽、蛋白質或聚核苷酸的細胞形式提供。在一些實施例中，細胞為抗原呈現細胞(APC)。在一些實施例中，細胞為樹突狀細胞(DC)。在一些實施例中，細胞為成熟抗原呈現細胞。在一些實施例中，新抗原肽或蛋白質可以含有如本文所描述之此類多肽、肽、蛋白質或聚核苷酸之APC (例如樹突狀細胞)形式提供。在其他實施例中，此類APC用於刺激T細胞供用於患者中。因此，本發明之一個實施例為含有至少一種經脈衝或負載有一或多個本文所述新抗原肽或聚核苷酸之APC (例如樹突狀細胞)的組合物。在一些實施例中，此類APC為自體的(例如自體樹突狀細胞)。或者，自患者分離之周邊血液單核細胞(PBMC)可離體負載有新抗原肽或聚核苷酸。在相關實施例中，此類APC或PBMC注射回患者體內。在一些實施例中，APC為樹突狀細胞。在相關實施例中，樹突狀細胞為用新抗原肽或核酸脈衝之自體樹突狀細胞。新抗原肽可為產生適當的T細胞反應之任何適合的肽。使用經來自腫瘤相關抗原之肽脈衝之自體樹突狀細胞的T細胞療法揭示於Murphy等人(1996) The Prostate 29, 371-380及Tjua等人(1997) The Prostate 32, 272-278中。在一些實施例中，T細胞為CTL (例如CD8+ )。在一些實施例中，T細胞為輔助T淋巴球(Th (例如CD4+ ))。
在一些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含亦可向個體投與之基於細胞之免疫原性醫藥組合物。舉例而言，適當時且如此項技術中所理解，可使用熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者調配基於APC之免疫原性醫藥組合物。APC包括單核球、單核球衍生細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞。有時，基於APC之免疫原性醫藥組合物可為基於樹突狀細胞之免疫原性醫藥組合物。
基於樹突狀細胞之免疫原性醫藥組合物可藉由此項技術中熟知之任何方法製備。在一些情況下，基於樹突狀細胞之免疫原性醫藥組合物可經由離體或活體內方法製備。離體方法可包含使用經本文所描述之多肽離體脈衝之自體DC以在向患者投與之前活化或裝載DC。活體內方法可包含使用與本文所描述之多肽偶合之抗體靶向特定DC受體。基於DC之免疫原性醫藥組合物可進一步包含DC活化劑，諸如TLR3、TLR-7-8及CD40促效劑。基於DC之免疫原性醫藥組合物可進一步包含佐劑及醫藥學上可接受之載劑。
抗原呈現細胞(APC)可由包括人類及非人類靈長類動物、其他哺乳動物及脊椎動物之多種來源製備。在某些實施例中，APC可由人類或非人類脊椎動物之血液製備。APC亦可自白血球之富集群體分離。白血球群體可藉由熟習此項技術者已知之方法製備。此類方法通常包括收集肝素化血液、血球分離術或白血球去除、製備白血球層、玫瑰花簇(rosetting)、離心、密度梯度離心(例如使用聚蔗糖(Ficoll)、膠態二氧化矽粒子及蔗糖)、差異溶解非白血球及過濾。白血球群體亦可藉由自個體收集血液、去纖維顫動以移除血小板及使紅血球溶解來製備。白血球群體可視情況富集單核球性樹突狀細胞前驅體。
血球群體可根據白血球之富集群體之所要用途獲自多種個體。個體可為健康個體。或者，血球可獲自需要免疫刺激之個體，諸如癌症患者或將受益於免疫刺激之其他患者。同樣地，血球可獲自需要免疫抑制之個體，諸如患有自體免疫病症(例如類風濕性關節炎、糖尿病、狼瘡、多發性硬化及其類似病症)之患者。白血球群體亦可獲自HLA匹配的健康個體。
當血液用作APC之來源時，血液白血球可使用維持其成活力之習知方法獲得。根據本發明之一個態樣，血液可稀釋至可含有或可不含有肝素或其他適合的抗凝血劑之介質中。血液與介質之體積可為約1比1。可藉由在4℃下以約1,000 rpm (150 g)離心含血液之介質來濃縮細胞。可藉由使細胞再懸浮於將溶解紅血球之此項技術中已知之任何數目之溶液(例如氯化銨)中來耗乏血小板及紅血球。舉例而言，混合物可為按體積計約1:1之介質及氯化銨。可藉由離心及在所要溶液中洗滌直至獲得實質上不含血小板及紅血球之白血球群體來濃縮細胞。組織培養中常用之任何等張溶液可用作用於將血液白血球與血小板及紅血球分離之介質。此類等張溶液之實例可為磷酸鹽緩衝鹽水、漢克斯平衡鹽溶液(Hanks balanced salt solution)及完全生長培養基。APC及/或APC前驅體細胞亦可藉由淘析純化。
在一個實施例中，在發炎性或以其他方式活化之條件下，APC可為非標稱APC。舉例而言，非標稱APC可包括用藉由誘導APC活性之因子或條件活化之干擾素-γ、T細胞、B細胞及/或單核球刺激之上皮細胞。此類非標稱APC可根據此項技術中已知之方法製備。
APC可按需要根據APC之類型培養、擴增、分化及/或成熟化。可在任何適合的培養容器，諸如培養盤、燒瓶、培養袋及生物反應器中培養APC。
在某些實施例中，可在適合的培養或生長培養基中培養APC以維持及/或擴增製備物中之APC之數目。可根據分離之APC之類型選擇培養基。舉例而言，可在適合於成熟APC維持及擴增之生長培養基中培養成熟APC，諸如成熟樹突狀細胞。培養基可補充有胺基酸、維生素、抗生素、二價陽離子及其類似物。另外，生長培養基中可包括細胞介素、生長因子及/或激素。舉例而言，為了維持及/或擴增成熟樹突狀細胞，可添加細胞介素，諸如顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及/或介白素4 (IL-4)。在其他實施例中，可培養及/或擴增不成熟APC。不成熟樹突狀細胞可因此保留其吸收目標mRNA及處理新抗原之能力。在一些實施例中，可在適合於不成熟樹突狀細胞之維持及培養之培養基中培養不成熟樹突狀細胞。培養基可補充有胺基酸、維生素、抗生素、二價陽離子及其類似物。另外，生長培養基中可包括細胞介素、生長因子及/或激素。
可類似地培養或擴增其他不成熟APC。不成熟APC製備物可成熟化以形成成熟APC。APC之成熟可在暴露於新抗原肽期間或之後發生。在某些實施例中，不成熟樹突狀細胞製備物可成熟化。適合的成熟因子包括例如細胞介素TNF-α、細菌產物(例如BCG)及其類似因子。在另一態樣中，經分離之APC前驅體可用於製備不成熟APC製備物。可培養、分化及/或成熟化APC前驅體。在某些實施例中，單核球性樹突狀細胞前驅體可在補充有胺基酸、維生素、細胞介素及/或二價陽離子之適合的培養基存在下培養以促進單核球性樹突狀細胞前驅體分化成不成熟樹突狀細胞。在一些實施例中，自PBMC分離APC前驅體。PBMC可獲自供體，例如人類供體，且可新鮮使用或冷凍以供未來使用。在一些實施例中，APC由一或多種APC製備物製備。在一些實施例中，APC包含：負載有包含第一及第二新抗原決定基之第一及第二新抗原肽或編碼包含第一及第二新抗原決定基之第一及第二新抗原肽之聚核苷酸的APC。在一些實施例中，APC為自體APC、同種異體APC或人工APC。5. 佐劑
佐劑可用於增強接受如本文所提供之組合物之患者中引發之免疫反應(體液及/或細胞免疫反應)。有時，佐劑可引發Th1型反應。其他時候，佐劑可引發Th2型反應。Th1型反應之特徵可在於產生諸如IFN-γ之細胞介素，相對於Th2型反應之特徵可在於產生諸如IL-4、IL-5及IL-10之細胞介素。
在一些態樣中，基於脂質之佐劑，諸如MPLA及MDP可與本文所揭示之免疫原性醫藥組合物一起使用。舉例而言，單磷醯基脂質A (MPLA)為使得向特定T淋巴球呈現脂質體抗原增加的佐劑。另外，胞壁醯二肽(MDP)亦可與本文所描述之免疫原性醫藥調配物一起用作適合的佐劑。
適合的佐劑為此項技術中已知的(參見WO 2015/095811)且包括但不限於聚(I:C)、聚-ICLC、希托洛(Hiltonol)、STING促效劑、1018 ISS、鋁鹽、安利瓦、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS貼劑、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、孟塔納IMS 1312、孟塔納ISA 206、孟塔納ISA 50V、孟塔納ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel®、載體系統、PLG微粒、雷西莫特、SRL172、病毒顆粒及其他病毒樣粒子、YF-17D、VEGF捕獲劑、R848、β-葡聚糖、Pam2Cys、Pam3Cys、Pam3CSK4、Aquila之QS21刺激子(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)，其衍生自皂素、分支桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物；及其他專用佐劑，諸如Ribi之Detox. Quil或Superfos。佐劑亦包括不完全傳氏(Freund's)或GM-CSF。先前已描述對樹突狀細胞具有特異性的若干免疫學佐劑(例如MF59)及其製備(Dupuis M,等人, Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27；Allison A C; Dev. Biol. Stand. 1998; 92:3-11) (Mosca等人Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060) (Gamvrellis等人Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516)。亦可使用細胞介素。若干細胞介素已與以下直接有關：影響樹突狀細胞遷移至淋巴組織(例如TNF-α)、加快樹突狀細胞成熟變為T-淋巴球之有效抗原呈現細胞(例如GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-1b、IL-4、IL-6及CD40L) (美國專利第5,849,589號，其以全文引用之方式併入本文中)及充當免疫佐劑(例如IL-12) (Gabrilovich D I等人, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)。
佐劑亦可包含刺激分子，諸如細胞介素。細胞介素之非限制性實例包括：CCL20、a-干擾素(IFN-a)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ(淋巴毒素α(LTα))、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞吸引趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表現趨化因子(TECK)、黏膜相關上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1-、IL-8、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18之突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、纖維母細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干擾素反應基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配位體(RANK LIGAND)、Ox40、Ox40配位體(Ox40 LIGAND)、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI及TAP2。
額外佐劑包括：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18之突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、纖維母細胞生長因子、IL-7、IL-22、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配位體、Ox40、Ox40配位體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
在一些態樣中，佐劑可為鐸樣受體(TLR)之調節劑。TLR之調節劑之實例包括TLR-9促效劑且不限於TLR之小分子調節劑，諸如咪喹莫特。與本文所描述之免疫原性醫藥組合物組合使用之佐劑之其他實例可包括且不限於皂素、CpG ODN及其類似物。有時，佐劑係選自細菌類毒素、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段聚合物、鋁鹽、脂質體、CpG聚合物、水包油乳液或其組合。有時，佐劑為水包油乳液。水包油乳液可包括至少一種油及至少一種界面活性劑，其中一或多種油及一或多種界面活性劑為生物可降解(可代謝)及生物相容的。乳液中之小油滴直徑可小於5μm，且可甚至具有亞微米直徑，用微流化器達成之此等較小尺寸，以提供穩定乳液。尺寸小於220 nm之液滴可經受過濾滅菌。6. 治療方法及醫藥組合物
本文中所描述之新抗原治療劑(例如，多肽或聚核苷酸、含有多肽或聚核苷酸之APC或樹突狀細胞)適用於多種應用，包括但不限於治療性治療方法，諸如治療癌症。在一些實施例中，治療性治療方法包含免疫療法。在某些實施例中，新抗原肽適用於活化、促進、增加及/或增強免疫反應，再引導針對新目標之現有免疫反應，增加腫瘤免疫原性，抑制腫瘤生長，減小腫瘤體積，增加腫瘤細胞凋亡及/或降低腫瘤致瘤性。使用方法可為活體外、離體或活體內方法。
在一些態樣中，本發明提供用於使用多肽、細胞或包含本文所述之新抗原肽或蛋白質的醫藥組合物活化個體之免疫反應的方法。在一些實施例中，本發明提供個體防治之方法，其包含使個體之細胞與包含本文所述之新抗原肽或蛋白質的多肽、細胞或醫藥組合物接觸。在一些實施例中，本發明提供使用包含本文所述之新抗原肽或蛋白質的多肽、細胞或醫藥組合物促進個體之免疫反應的方法。在一些實施例中，本發明提供使用包含本文所述之新抗原肽或蛋白質的多肽、細胞或醫藥組合物來增加個體之免疫反應的方法。在一些實施例中，本發明提供使用包含本文所述之新抗原肽或蛋白質的多肽、細胞或醫藥組合物來增強免疫反應的方法。
在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加細胞介導之免疫。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加T細胞活性或體液免疫。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加細胞毒性T淋巴球(CTL)或輔助T淋巴球(Th)活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加自然殺手(NK)細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加T細胞活性及增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加CTL活性及增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含抑制或降低T調節(Treg)細胞之抑制活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加抗腫瘤活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加免疫原性。在一些實施例中，免疫反應為抗原刺激之結果。在一些實施例中，抗原刺激為腫瘤細胞。在一些實施例中，抗原刺激為癌症。
在一些實施例中，本發明提供使用包含本文所述之新抗原肽或蛋白質的多肽、細胞或醫藥組合物活化、促進、增加及/或增強免疫反應的方法。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之多肽，將新抗原肽或聚核苷酸遞送至腫瘤細胞。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之由腫瘤細胞內化的新抗原多肽。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原多肽，其由腫瘤細胞內化，且該新抗原肽由該細胞處理。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原多肽，其由腫瘤細胞內化，且新抗原決定基呈現於腫瘤細胞表面上。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原多肽，其由腫瘤細胞內化，由該細胞處理，且抗原肽呈現於腫瘤細胞表面上。
在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述的新抗原多肽或聚核苷酸，其將包含至少一種新抗原肽之外源多肽遞送至腫瘤細胞，其中衍生自該新抗原肽之至少一種新抗原決定基呈現在腫瘤細胞表面上。在一些實施例中，該抗原肽與MHC I類分子複合呈現在腫瘤細胞之表面上。在一些實施例中，該抗原肽與MHC II類分子複合呈現在腫瘤細胞之表面上。
在一些實施例中，方法包含使腫瘤細胞與本文中所描述之新抗原多肽或聚核苷酸接觸，將包含至少一種新抗原多肽之外源多肽遞送至腫瘤細胞，其中衍生自至少一種新抗原多肽之至少一種新抗原決定基呈現在腫瘤細胞表面上。在一些實施例中，該新抗原決定基與MHC I類分子複合呈現在腫瘤細胞之表面上。在一些實施例中，該新抗原決定基與MHC II類分子複合呈現在腫瘤細胞之表面上。
在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述的新抗原多肽或聚核苷酸，其將包含至少一種抗原肽之外源多肽遞送至腫瘤細胞，其中該抗原決定基或新抗原決定基呈現在腫瘤細胞之表面上，且誘導針對腫瘤細胞之免疫反應。在一些實施例中，對該抗原決定基或新抗原決定基之免疫反應增加。在一些實施例中，針對腫瘤細胞之免疫反應增加。在一些實施例中，該新抗原多肽或聚核苷酸將包含至少一種新抗原肽之外源多肽遞送至腫瘤細胞，其中該抗原決定基或新抗原決定基呈現在腫瘤細胞之表面上，且抑制腫瘤生長。
在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原多肽或聚核苷酸，其將包含至少一種新抗原肽之外源多肽遞送至腫瘤細胞，其中衍生自至少一種新抗原肽之新抗原決定基呈現在腫瘤細胞之表面上，且誘導針對腫瘤細胞之T細胞殺滅。在一些實施例中，針對腫瘤細胞之T細胞殺滅增強。在一些實施例中，針對腫瘤細胞之T細胞殺滅增加。
在一些實施例中，增加個體之免疫反應的方法包含向個體投與治療有效量之本文所述新抗原治療劑，其中該試劑為特異性結合本文所述之新抗原的抗體。在一些實施例中，增加個體之免疫反應的方法包含向個體投與治療有效量之抗體。
本發明提供再引導對腫瘤之現有免疫反應的方法。在一些實施例中，再引導對腫瘤之現有免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑。在一些實施例中，現有免疫反應係針對病毒。在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：麻疹病毒、水痘-帶狀疱疹病毒(VZV；水痘病毒)、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、德國麻疹病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)及細胞巨大病毒(CMV)。在一些實施例中，病毒為水痘-帶狀疱疹病毒。在一些實施例中，病毒為細胞巨大病毒。在一些實施例中，病毒為麻疹病毒。在一些實施例中，在天然病毒感染之後獲得現有免疫反應。在一些實施例中，在針對病毒之疫苗接種之後獲得現有免疫反應。在一些實施例中，現有免疫反應為細胞介導之反應。在一些實施例中，現有免疫反應包含CTL或Th細胞。
在一些實施例中，再引導對個體中之腫瘤之現有免疫反應的方法包含投與融合蛋白，其包含(i)特異性結合新抗原之抗體及(ii)本文所描述之至少一種新抗原肽，其中(a)在結合至腫瘤相關抗原或新抗原決定基之後，融合蛋白由腫瘤細胞內化；(b)新抗原肽經處理且呈現於與MHC I類分子結合之腫瘤細胞表面上；及(c)新抗原肽/MHC I類複合物由CTL識別。在一些實施例中，CTL為記憶T細胞。在一些實施例中，記憶T細胞為用新抗原肽疫苗接種之結果。
本發明提供增加腫瘤之免疫原性之方法。在一些實施例中，增加腫瘤免疫原性之方法包含使腫瘤或腫瘤細胞與有效量之本文所述之新抗原治療劑接觸。在一些實施例中，增加腫瘤免疫原性之方法包含向個體投與治療有效量之本文所述之新抗原治療劑。
本發明亦提供使用本文所述之新抗原治療劑抑制腫瘤生長之方法。在某些實施例中，抑制腫瘤生長之方法包含使細胞混合物與新抗原治療劑活體外接觸。舉例而言，在添加新抗原肽之培養基中培養與免疫細胞(例如T細胞)混合之永生化細胞株或癌細胞株。在一些實施例中，腫瘤細胞自患者樣品，例如組織切片、肋膜積液或血液樣品分離，與免疫細胞(例如T細胞)混合，且在添加新抗原治療劑之培養基中培養。在一些實施例中，新抗原治療劑增加、促進及/或增強免疫細胞之活性。在一些實施例中，新抗原治療劑抑制腫瘤細胞生長。在一些實施例中，新抗原治療劑活化腫瘤細胞之殺滅。
在一些實施例中，個體為哺乳動物。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，個體具有腫瘤或個體具有至少部分移除之腫瘤。
在一些實施例中，抑制腫瘤生長之方法包含再引導針對新目標之現有免疫反應，其包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑，其中現有免疫反應係針對藉由新抗原肽遞送至腫瘤細胞之抗原肽。
在某些實施例中，腫瘤包含癌症幹細胞。在某些實施例中，腫瘤中癌症幹細胞之頻率藉由投與新抗原治療劑降低。在一些實施例中，提供一種降低個體之腫瘤中之癌症幹細胞之頻率的方法，其包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑。
另外，在一些態樣中，本發明提供一種降低個體之腫瘤之致瘤性的方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑。在某些實施例中，腫瘤包含癌症幹細胞。在一些實施例中，腫瘤之致瘤性藉由降低腫瘤中癌症幹細胞之頻率而降低。在一些實施例中，方法包含使用本文所述之新抗原治療劑。在某些實施例中，腫瘤中癌症幹細胞之頻率藉由投與本文所描述之新抗原治療劑而降低。
在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為選自由以下組成之群的腫瘤：結腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、神經內分泌腫瘤、胃腸腫瘤、黑素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤及頭頸部腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為結腸直腸腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為卵巢腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為乳房腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為肺腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為胰腺腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為黑素瘤腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。
本發明進一步提供用於治療個體之癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑。在一些實施例中，治療癌症之方法包含再引導針對新目標之現有免疫反應，該方法包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑，其中現有免疫反應係針對藉由新抗原肽遞送至癌細胞之抗原肽。
本發明提供治療癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑(例如需要治療之個體)。在一些實施例中，個體為哺乳動物。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，個體患有癌性腫瘤。在某些實施例中，個體具有至少部分移除之腫瘤。
個體可為例如哺乳動物、人類、妊娠期婦女、老年人、成人、青少年、少年、兒童、幼童、嬰兒、新生兒或初生兒。個體可為患者。在一些情況下，個體可為人類。在一些情況下，個體可為兒童(亦即，低於青春期年齡之年輕人類)。在一些情況下，個體可為嬰兒。在一些情況下，個體可為嬰兒奶粉餵養的嬰兒。在一些情況下，個體可為參與臨床研究之個體。在一些情況下，個體可為實驗室動物，例如哺乳動物或嚙齒動物。在一些情況下，個體可為小鼠。在一些情況下，個體可為肥胖或超重個體。
在一些實施例中，個體先前已用一或多種不同癌症治療模式加以治療。在一些實施例中，個體先前已用放射線療法、化學療法或免疫療法中之一或多者加以治療。在一些實施例中，個體已用一、兩、三、四或五線之先前療法加以治療。在一些實施例中，先前療法為細胞毒性療法。
在某些實施例中，癌症為選自由以下組成之群的癌症：結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、神經內分泌癌、膀胱癌、子宮癌、神經膠母細胞瘤及頭頸癌。在某些實施例中，癌症為胰臟癌。在某些實施例中，癌症為卵巢癌。在某些實施例中，癌症為結腸直腸癌。在某些實施例中，癌症為乳癌。在某些實施例中，癌症為前列腺癌。在某些實施例中，癌症為肺癌。在某些實施例中，癌症為非小細胞肺癌。在某些實施例中，癌症為子宮癌。在某些實施例中，癌症為肝癌。在某些實施例中，癌症為黑素瘤。在一些實施例中，癌症為實體癌症。在一些實施例中，癌症包含實體腫瘤。
在一些實施例中，癌症為血液癌。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞急性淋巴母細胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)及皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。
在一些實施例中，新抗原治療劑以組合療法形式投與。具有兩種或更多種治療劑之組合療法使用藉由不同作用機制起作用之試劑，儘管此不為所需的。使用具有不同作用機制之試劑之組合療法可引起加成或協同作用。組合療法可允許比單一療法中所用之劑量低的各試劑劑量，從而降低一或多種試劑的毒副作用及/或增加其治療指數。組合療法可降低產生抗性癌細胞之可能性。在一些實施例中，組合療法包含影響免疫反應(例如增強或活化反應)之治療劑及影響(例如抑制或殺滅)腫瘤/癌細胞之治療劑。
在一些情況下，免疫原性醫藥組合物可與額外試劑一起投與。選擇額外試劑可至少部分地視所治療之病狀而定。額外試劑可包括例如檢查點抑制劑，諸如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3劑(例如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3抗體)；或具有對病原體感染(例如病毒感染)之治療作用之任何試劑，包括例如用於治療發炎病狀之藥物，諸如NSAID，例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、乙醯胺苯酚、酮基布洛芬或阿司匹林(aspirin)。舉例而言，檢查點抑制劑可為選自由以下組成之群的PD-1/PD-L1拮抗劑：納武單抗(nivolumab) (ONO-4538/BMS-936558、MDX1 106、OPDIVO)、派立珠單抗(pembrolizumab) (MK-3475、KEYTRUDA)、皮立珠單抗(pidilizumab) (CT-011)及MPDL328OA (ROCHE)。作為另一實例，調配物可額外含有一或多種補充劑，諸如維生素C、E或其他抗氧化劑。
本發明之方法可用於治療此項技術中已知之任何類型的癌症。待藉由本發明之方法治療之癌症之非限制性實例可包括黑素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌瘤)、前列腺癌(例如激素頑抗性前列腺癌)、胰腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、白血病、淋巴瘤及其他贅生性惡性疾病。
另外，本文所提供之疾病或病狀包括頑抗性或復發性惡性疾病，其生長可使用本發明之治療方法抑制。在一些實施例中，待藉由本發明之治療方法治療之癌症係選自由以下組成之群：癌瘤、鱗狀癌瘤、腺癌、肉瘤、子宮內膜癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門與生殖器區域之鱗狀細胞癌、黑素瘤、腎細胞癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺鱗狀細胞癌、胃癌、膀胱癌、膽囊癌、肝癌、甲狀腺癌、喉癌、唾液腺癌、食道癌、頭頸癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、胰臟癌、間皮瘤、肉瘤、血液癌、白血病、淋巴瘤、神經瘤及其組合。在一些實施例中，待藉由本發明之方法治療之癌症包括例如癌瘤、鱗狀癌瘤(例如子宮頸管、眼瞼、結膜、陰道、肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉及食道)及腺癌(例如前列腺、小腸、子宮內膜、子宮頸管、大腸、肺、胰腺、食道、直腸、子宮、胃、乳腺及卵巢)。在一些實施例中，待藉由本發明之方法治療之癌症進一步包括肉瘤(例如肌原性肉瘤)、白血病、神經瘤、黑素瘤及淋巴瘤。在一些實施例中，待藉由本發明之方法治療之癌症為乳癌。在一些實施例中，待藉由本發明之治療方法治療之癌症為三陰性乳癌(TNBC)。在一些實施例中，待藉由本發明之治療方法治療之癌症為卵巢癌。在一些實施例中，待藉由本發明之治療方法治療之癌症為結腸直腸癌。
在一些實施例中，待用本發明之醫藥組合物治療之患者或患者群體患有實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤為黑素瘤、腎細胞癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、膽囊癌、喉癌、肝癌、甲狀腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰臟癌或梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)。在一些實施例中，待用本發明之醫藥組合物治療之患者或患者群體患有血液癌。在一些實施例中，患者患有血液癌，諸如彌漫性大B細胞淋巴瘤(「DLBCL」)、霍奇金氏淋巴瘤(「HL」)、非霍奇金氏淋巴瘤(「NHL」)、濾泡性淋巴瘤(「FL」)、急性骨髓白血病(「AML」)或多發性骨髓瘤(「MM」)。在一些實施例中，待治療之患者或患者群體患有選自由卵巢癌、肺癌及黑素瘤組成之群的癌症。
根據本發明可預防及/或治療之癌症的特定實例包括但不限於以下：腎癌(renal cancer)、腎癌(kidney cancer)、多形性膠質母細胞瘤、轉移性乳癌；乳癌；乳肉瘤；神經纖維瘤(neurofibroma)；神經纖維瘤(neurofibromatosis)；小兒腫瘤；神經母細胞瘤；惡性黑素瘤；表皮癌瘤；白血病，諸如但不限於急性白血病，急性淋巴球性白血病，急性骨髓細胞性白血病(諸如骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性、紅白血病白血病及骨髓增生異常症候群)，慢性白血病(諸如但不限於慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病、慢性淋巴球性白血病、毛細胞白血病)；真性紅血球增多症；淋巴瘤，諸如但不限於霍奇金氏病、非霍奇金氏病；多發性骨髓瘤，諸如但不限於鬱積型多發性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、漿細胞白血病、孤立性漿細胞瘤及髓外漿細胞瘤；瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；未確定顯著性單株球蛋白症；良性單株球蛋白症；重鏈病；骨癌及結締組織肉瘤，諸如但不限於骨肉瘤、骨髓瘤骨病、多發性骨髓瘤、膽脂瘤誘發之骨骼骨肉瘤、佩吉特氏骨病(Paget's disease of bone)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、惡性巨細胞瘤、骨纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(angiosarcoma/hemangiosarcoma)、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神經鞘瘤、橫紋肌肉瘤及滑膜肉瘤；腦瘤，諸如但不限於神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、室管膜瘤、少突神經膠質瘤、非神經膠質腫瘤(nonglial tumor)、聽覺神經鞘瘤、顱咽管瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、松果體細胞瘤、松果體母細胞瘤及原發性腦淋巴瘤；乳癌，包括但不限於腺癌、小葉(小細胞)癌瘤、管內癌瘤、髓質乳癌、黏液性乳癌、管狀乳癌、乳頭狀乳癌、佩吉特氏病(包括幼年型佩吉特氏病)及炎性乳癌；腎上腺癌，諸如但不限於嗜鉻細胞瘤及腎上腺皮質癌；甲狀腺癌，諸如但不限於乳頭狀或濾泡甲狀腺癌、髓質甲狀腺癌及未分化甲狀腺癌；胰臟癌，諸如但不限於胰島素瘤、胃泌素瘤、升糖素瘤、血管活性腸肽瘤、生長抑素分泌腫瘤及類癌或胰島細胞腫瘤；垂體癌，諸如但限於庫欣氏病(Cushing's disease)、促乳素分泌腫瘤、肢端肥大症及糖尿病尿崩症；眼癌，諸如但不限於眼部黑素瘤(諸如虹膜黑素瘤、脈絡膜黑素瘤及睫狀體黑素瘤)及視網膜母細胞瘤；陰道癌，諸如鱗狀細胞癌、腺癌及黑素瘤；外陰癌，諸如鱗狀細胞癌、黑素瘤、腺癌、基底細胞癌、肉瘤及佩吉特氏病；子宮頸癌，諸如但不限於鱗狀細胞癌及腺癌；子宮癌，諸如但不限於子宮內膜癌及子宮肉瘤；卵巢癌，諸如但不限於卵巢上皮癌、交界性腫瘤、生殖細胞腫瘤及基質腫瘤；子宮頸癌瘤；食管癌，諸如但不限於鱗狀癌、腺癌、腺樣囊性癌瘤、黏液表皮樣癌瘤、腺鱗癌、肉瘤、黑素瘤、漿細胞瘤、疣狀癌及燕麥細胞(小細胞)癌瘤；胃癌，諸如但不限於腺癌、蕈樣(瘜肉樣)癌、潰瘍型癌、表面擴散性癌、彌漫性擴散性癌、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤及癌肉瘤；結腸癌；結腸直腸癌、KRAS突變型結腸直腸癌；結腸癌；直腸癌；肝癌，諸如但不限於肝細胞癌及肝母細胞瘤；膽囊癌，諸如腺癌；膽管癌，諸如但不限於乳頭狀、結節性及彌漫性膽管癌；肺癌，諸如KRAS突變型非小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌瘤(表皮樣癌瘤)、腺癌、大細胞癌瘤及小細胞肺癌；肺癌瘤；睾丸癌，諸如但不限於胚胎腫瘤、精原細胞瘤、未分化、經典(典型)、精母細胞型、非精原細胞瘤、胚胎性癌、畸胎癌瘤、絨膜癌瘤(卵黃囊腫瘤)；前列腺癌，諸如但不限於雄激素非依賴性前列腺癌、雄激素依賴性前列腺癌、腺癌、平滑肌肉瘤及橫紋肌肉瘤；陰莖癌；口腔癌，諸如但不限於鱗狀細胞癌；基底癌；唾液腺癌，諸如但不限於腺癌、黏液表皮樣癌瘤及腺樣囊性癌瘤；咽癌，諸如但不限於鱗狀細胞癌及疣狀癌；皮膚癌，諸如但不限於基底細胞癌瘤、鱗狀細胞癌瘤及黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、結節性黑素瘤、雀斑惡性黑素瘤、肢端雀斑痣性黑素瘤；腎癌，諸如但不限於腎細胞癌、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細胞癌(腎盂及/或輸尿管)；腎癌瘤；威爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)；膀胱癌，諸如但不限於移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括黏液肉瘤、骨原性肉瘤、內皮肉瘤、淋巴內皮肉瘤、間皮瘤、滑膜瘤、血管母細胞瘤、上皮癌瘤、囊腺癌瘤、支氣管癌瘤、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌瘤及乳頭狀腺癌瘤。
癌症包括但不限於B細胞癌症，例如多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症；重鏈病，諸如α鏈疾病、γ鏈疾病及μ鏈疾病；良性單株球蛋白症；及免疫細胞澱粉樣變性病、黑素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結腸直腸癌、前列腺癌(例如轉移性、激素頑抗性前列腺癌)、胰臟癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦部或中樞神經系統癌症、周邊神經系統癌症、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織癌症及其類似癌症。適用於本發明所涵蓋之方法之癌症類型之其他非限制性實例包括人類肉瘤及癌瘤，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌瘤、肝癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎性瘤、威爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、骨癌、腦瘤、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤；白血病，例如急性淋巴球性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅白血病)；慢性白血病(慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴球性白血病)；及真性紅細胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病及非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症及重鏈病。在一些實施例中，表型藉由本發明之方法測定之癌症為上皮癌症，諸如但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦科癌、腎癌、喉癌、肺癌、口腔癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌或皮膚癌。在其他實施例中，癌症為乳癌、前列腺癌、肺癌或結腸癌。在另其他實施例中，上皮癌症為非小細胞肺癌、非乳頭狀腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌瘤(例如漿液性卵巢癌瘤)或乳癌。上皮癌症可以各種其他方法表徵，包括但不限於漿液性、子宮內膜樣、黏液性、透明細胞、布倫納氏(brenner)或未分化。在一些實施例中，本發明用於淋巴瘤或其亞型(包括但不限於套細胞淋巴瘤)之治療、診斷及/或預後。淋巴增生病症亦視為增生性疾病。
在一些實施例中，本文所描述之試劑與至少一種額外治療劑之組合產生加成或協同結果。在一些實施例中，組合療法使得試劑之治療指數增大。在一些實施例中，組合療法引起一或多種額外治療劑之治療指數增大。在一些實施例中，組合療法使得試劑之毒性及/或副作用降低。在一些實施例中，組合療法使得一或多種額外治療劑之毒性及/或副作用降低。
在某些實施例中，除了投與本文所描述之新抗原治療劑之外，方法或治療進一步包含投與至少一種額外治療劑。額外治療劑可在投與試劑之前、同時及/或之後投與。在一些實施例中，至少一種額外治療劑包含1種、2種、3種或更多種額外治療劑。
可與本文所描述之新抗原治療劑組合投與之治療劑包括化學治療劑。因此，在一些實施例中，方法或治療涉及與化學治療劑組合或與化學治療劑混合物組合投與本文所描述之試劑。用試劑治療可在投與化學療法之前、同時或之後進行。組合投藥可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共投與，或以任一次序但一般在一段時間內連續投與以使得所有活性劑可同時發揮其生物活性。此類治療劑之製備及給藥排程可根據製造商說明書使用或由熟習此項技術者憑經驗確定。此類化學療法之製備及給藥排程亦描述於The Chemotherapy Source Book, 第4版, 2008, M. C. Perry, 編者, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA中。
適用類別之化學治療劑包括例如抗微管蛋白劑、奧瑞他汀(auristatin)、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷基化劑(例如鉑複合物，諸如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)及三核鉑複合物及卡鉑)、蒽環黴素、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學治療增感劑、倍癌黴素、依讬泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊希普辛(lexitropsin)、亞硝基脲、順氯氨鉑(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素、輻射增感劑、類固醇、紫杉烷、拓樸異構酶抑制劑、長春花生物鹼或其類似物。在某些實施例中，第二治療劑為烷基化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓樸異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。
適用於本發明中之化學治療劑包括但不限於烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；氮芥，諸如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、氧化甲基二(氯乙基)胺鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如醛葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL)及多烯紫杉醇(docetaxel) (TAXOTERE))；氯芥苯丁酸；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波黴素(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine) (XELODA)；及以上中的任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷諾昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene) (FARESTON)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，額外治療劑為順鉑。在某些實施例中，額外治療劑為卡鉑。
在某些實施例中，化學治療劑為拓樸異構酶抑制劑。拓樸異構酶抑制劑為干擾拓樸異構酶(例如拓樸異構酶I或II)之作用之化療劑。拓樸異構酶抑制劑包括但不限於小紅莓HCl、檸檬酸道諾黴素、米托蒽醌HCl、放線菌素D、依託泊苷、拓朴替康(topotecan) HCl、替尼泊甙(VM-26)及伊立替康(irinotecan)以及此等中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，額外治療劑為伊立替康。
在某些實施例中，化學治療劑為抗代謝物。抗代謝物為具有與正常生物化學反應所需之代謝物類似的結構，但不同程度足以干擾細胞之一或多種正常功能，諸如細胞分裂之化學物質。抗代謝物包括但不限於吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、喃氟啶(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達拉濱及克拉屈濱(cladribine)以及此等中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，額外治療劑為吉西他濱。
在某些實施例中，化學治療劑為抗有絲分裂劑，包括但不限於結合微管蛋白之試劑。在一些實施例中，試劑為紫杉烷。在某些實施例中，試劑為太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇或太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，試劑為太平洋紫杉醇(TAXOL)、多烯紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代實施例中，抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，諸如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱或長春地辛或其醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，抗有絲分裂劑為驅動蛋白Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶之抑制劑，諸如奧洛拉(Aurora) A或Plk1。在某些實施例中，額外治療劑為太平洋紫杉醇。在一些實施例中，額外治療劑為白蛋白結合型太平洋紫杉醇。
在一些實施例中，額外治療劑包含試劑，諸如小分子。舉例而言，治療可涉及本發明之試劑與充當針對腫瘤相關抗原之抑制劑之小分子之組合投與，該小分子包括但不限於EGFR、HER2 (ErbB2)及/或VEGF。在一些實施例中，本發明之試劑與選自由以下組成之群的蛋白激酶抑制劑組合投與：吉非替尼(gefitinib) (IRESSA)、埃羅替尼(erlotinib) (TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib) (ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib) (RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib) (NEXAVAR)及帕唑帕尼(pazopanib) (GW786034B)。在一些實施例中，額外治療劑包含mTOR抑制劑。在另一實施例中，額外治療劑為減少Treg細胞之數目之化學療法或其他抑制劑。在某些實施例中，治療劑為環磷醯胺或抗CTLA4抗體。在另一實施例中，額外治療劑減少骨髓衍生之抑制細胞之存在。在另一實施例中，額外治療劑為卡鉑紫杉酚(carbotaxol)。在另一實施例中，額外治療劑將細胞移向T輔助1反應。在另一實施例中，額外治療劑為依魯替尼(ibrutinib)。
在一些實施例中，額外治療劑包含生物分子，諸如抗體。舉例而言，治療可涉及本發明之試劑與針對腫瘤相關抗原之抗體之組合投與，該等抗體包括但不限於結合EGFR、HER2/ErbB2及/或VEGF之抗體。在某些實施例中，額外治療劑為對癌症幹細胞標記物具有特異性之抗體。在某些實施例中，額外治療劑為血管生成抑制劑之抗體(例如抗VEGF或VEGF受體抗體)。在某些實施例中，額外治療劑為貝伐單抗(bevacizumab) (AVASTIN)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN)、帕妥珠單抗(pertuzumab) (OMNITARG)、帕尼單抗(panitumumab) (VECTIBIX)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)或西妥昔單抗(cetuximab) (ERBITUX)。
本文所提供之試劑及組合物可單獨或與習知治療方案組合使用，該等方案諸如手術、照射、化學療法及/或骨髓移植(自體、同基因型、同種異體或不相關)。一組腫瘤抗原可例如適用於大部分癌症患者。
在一些實施例中，除了包含免疫原性疫苗之組合物之外，可投與至少一或多種化學治療劑。在一些實施例中，一或多種化學治療劑可屬於不同類別之化學治療劑。
化療劑之實例包括但不限於烷基化劑，諸如氮芥(例如甲基二(氯乙基)胺(氮芥)、氯芥苯丁酸、環磷醯胺(Cytoxan®)、異環磷醯胺及美法侖)；亞硝基脲(例如N-亞硝基-N-甲基脲、鏈脲菌素、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀及司莫司汀)；磺酸烷基酯(例如白消安)；四嗪(例如達卡巴嗪(DTIC)、米托唑胺(mitozolomide)及替莫唑胺(temozolomide) (Temodar®))；氮丙啶(例如噻替派、絲裂黴素及地吖醌)；及鉑藥物(例如順鉑、卡鉑及奧沙利鉑(oxaliplatin))；非經典烷基化劑，諸如丙卡巴肼及六甲蜜胺(六甲三聚氰胺)；抗代謝劑，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、卡培他濱(Xeloda®)、克拉屈濱、氯法拉濱(clofarabine)、阿糖胞苷(Ara-C®)、地西他濱(decitabine)、氟尿苷、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱(nelarabine)、吉西他濱(Gemzar®)、羥基脲、甲胺喋呤、培美曲塞(Alimta®)、噴司他丁、硫鳥嘌呤、維達紮(Vidaza)；抗微管劑，諸如長春花生物鹼(例如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱、長春地辛及長春氟寧)；紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(Taxol®)、多烯紫杉醇(Taxotere®))；鬼臼毒素(podophyllotoxin) (例如依託泊苷及替尼泊甙)；埃博黴素(epothilone) (例如伊沙匹隆(ixabepilone) (Ixempra®))；雌莫司汀(Emcyt®)；抗腫瘤抗生素，諸如蒽環黴素(例如道諾黴素、小紅莓(Adriamycin®、表柔比星、艾達黴素)；放射菌素-D；及博萊黴素(bleomycin)；拓樸異構酶I抑制劑，諸如拓朴替康及伊立替康(CPT-11)；拓樸異構酶II抑制劑，諸如依託泊苷(VP-16)、替尼泊苷(teniposide)、米托蒽醌、新生黴素、麥爾巴隆(merbarone)及阿克拉黴素(aclarubicin)；皮質類固醇，諸如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼龍(Solumedrol®)及地塞米松(dexamethasone) (Decadron®)；L-天冬醯胺酶；硼替佐米(bortezomib) (Velcade®)；免疫治療劑，諸如利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan®)、阿倫珠單抗(alemtuzumab) (Campath®)、沙立度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide) (Revlimid®)、BCG、介白素-2、干擾素-α；及癌症疫苗，諸如Provenge®；激素治療劑，諸如氟維司群(fulvestrant) (Faslodex®)、他莫昔芬、托瑞米芬(Fareston®)、阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex®)、依西美坦(exemestan) (Aromasin®)、來曲唑(letrozole) (Femara®)、乙酸甲地孕酮(Megace®)、雌激素、比卡魯胺(bicalutamide) (Casodex®)、氟他胺(flutamide) (Eulexin®)、尼魯胺(nilutamide) (Nilandron®)、亮丙立德(Lupron®)及戈舍瑞林(Zoladex®)；分化劑，諸如類視黃素、維甲酸(ATRA或Atralin®)、貝瑟羅汀(bexarotene) (Targretin®)及三氧化二砷(Arsenox®)；及靶向治療劑，諸如伊馬替尼(imatinib) (Gleevec®)、吉非替尼(Iressa®)及舒尼替尼(Sutent®)。在一些實施例中，化學療法為混合物療法。混合物療法之實例包括但不限於美羅華(rituxan)、環磷醯胺、羥基小紅莓、長春新鹼及潑尼松(CHOP/R-CHOP)；依託泊苷、潑尼松、長春新鹼、環磷醯胺、羥基小紅莓(EPOCH)；環磷醯胺、長春新鹼、羥基小紅莓、地塞米松(Hyper-CVAD)；氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸、奧沙利鉑(FOLFOX)；異環磷醯胺、卡鉑、依託泊苷(ICE)；高劑量阿糖胞苷[ara-C]、地塞米松、順鉑(DHAP)；依託泊苷、甲基潑尼龍、阿糖胞苷[ara-C]、順鉑(ESHAP)及環磷醯胺、甲胺喋呤、氟尿嘧啶(CMF)。
在某些實施例中，額外治療劑包含第二免疫治療劑。在一些實施例中，額外免疫治療劑包括但不限於群落刺激因子、介白素、阻斷免疫抑制功能之抗體(例如抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗CD3抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體)、增強免疫細胞功能之抗體(例如抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗CD40抗體或抗4-1BB抗體)、鐸樣受體(例如TLR4、TLR7、TLR9)、可溶性配位體(例如GITRL、GITRL-Fc、OX-40L、OX-40L-Fc、CD40L、CD40L-Fc、4-1BB配位體或4-1BB配位體-Fc)或B7家族成員(例如CD80、CD86)。在一些實施例中，額外免疫治療劑靶向CTLA-4、CD28、CD3、PD-1、PD-L1、TIGIT、GITR、OX-40、CD-40或4-1BB。
在一些實施例中，額外治療劑為免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗TIGIT抗體、抗LAG3抗體、抗TIM3抗體、抗GITR抗體、抗4-1BB抗體或抗OX-40抗體。在一些實施例中，額外治療劑為抗TIGIT抗體。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗PD-1抗體：納武單抗(OPDIVO)、帕博利珠單抗(KEYTRUDA)、皮立珠單抗、MEDI0680、REGN2810、BGB-A317及PDR001。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗PD-L1抗體：BMS935559 (MDX-1105)、阿特力單抗(atexolizumab) (MPDL3280A)、德瓦魯單抗(durvalumab) (MEDI4736)及阿維魯單抗(avelumab) (MSB0010718C)。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗CTLA-4抗體：伊派利單抗(ipilimumab) (YERVOY)及曲美單抗(tremelimumab)。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗LAG-3抗體：BMS-986016及LAG525。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗OX-40抗體：MEDI6469、MEDI0562及MOXR0916。在一些實施例中，額外治療劑為選自由PF-05082566組成之群的抗4-1BB抗體。
在一些實施例中，新抗原治療劑可與選自由以下組成之群的生物分子組合投與：腎上腺髓素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、紅血球生成素(EPO)、FGF、GDNF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、遷移刺激因子、肌肉抑制素(GDF-8)、NGF、神經營養素、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15及IL-18。
在一些實施例中，本文所描述之新抗原治療劑治療可伴隨手術移除腫瘤、移除癌細胞或治療醫師認為必需的任何其他手術療法。
在某些實施例中，治療涉及與輻射療法組合投與本文所描述之新抗原治療劑。試劑治療可在投與輻射療法之前、同時或之後進行。此類輻射療法之給藥排程可藉由熟練醫師確定。
組合投藥可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共投與，或以任一次序但一般在一段時間內連續投與以使得所有活性劑可同時發揮其生物活性。
應瞭解，本文所描述之新抗原治療劑與至少一種額外治療劑之組合可按任何次序投與或同時投與。在一些實施例中，將向此前經受第二治療劑治療之患者投與試劑。在某些其他實施例中，新抗原治療劑及第二治療劑將實質上同時或並行投與。舉例而言，個體可給與試劑，同時經受第二治療劑(例如化學療法)療程。在某些實施例中，將在第二治療劑治療1年內投與新抗原治療劑。將進一步瞭解，可在約數小時或分鐘(亦即，實質上同時)內向個體投與兩種(或更多種)試劑或治療。
為了治療疾病，適當劑量之本文所描述之新抗原治療劑視待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、疾病反應性、是出於治療或是預防目的投與試劑、先前療法、患者之臨床病史等而定，全部由治療醫師酌情處理。新抗原治療劑可一次性投與或在持續數日至數月的一系列治療期間投與，或直至實現治癒或達成疾病病況之減弱(例如腫瘤尺寸減小)。最佳給藥排程可由患者體內藥物積聚之量測結果來計算且將視個別試劑之相關效能而變化。投與醫師可確定最佳劑量、給藥方法及重複率。
在一些實施例中，新抗原治療劑可以初始較高「起始」劑量，接著一或多個較低劑量投與。在一些實施例中，投與頻率亦可變化。在一些實施例中，給藥方案可包含一週一次、每兩週一次、每三週一次或每月一次投與初始劑量，接著額外劑量(或「維持」劑量)。舉例而言，給藥方案可包含投與初始起始劑量，接著例如初始劑量之二分之一的每週維持劑量；給藥方案可包含投與初始起始劑量，接著例如每隔一週初始劑量之二分之一的維持劑量；或給藥方案可包含3週投與三次初始劑量，接著例如每隔一週相同量的維持劑量。
如熟習此項技術者已知，投與任何治療劑可引起副作用及/或毒性。在一些情況下，副作用及/或毒性過於嚴重以至於無法以治療學上有效劑量投與特定試劑。在一些情況下，療法必須中斷，且可嘗試其他試劑。然而，相同治療劑類別中之多種試劑呈現類似副作用及/或毒性，意謂患者必須中止療法，否則若可能，遭受與治療劑相關之不適副作用。
在一些實施例中，給藥排程可限於特定數目之投與或「循環」。在一些實施例中，試劑投與3、4、5、6、7、8或更多個循環。舉例而言，每2週投與試劑6個循環、每3週投與試劑6個循環、每2週投與試劑4個循環、每3週投與試劑4個循環等。給藥排程可由熟習此項技術者決定且隨後修改。
本發明提供向個體投與本文所描述之新抗原治療劑之方法，其包含使用間歇性給藥策略以用於投與一或多種試劑，其可減少與投與試劑、化學治療劑等相關之副作用及/或毒性。在一些實施例中，用於治療人類個體之癌症的方法包含向個體投與治療有效劑量之新抗原治療劑與治療有效劑量之化學治療劑的組合，其中試劑中之一或兩者根據間歇性給藥策略投與。在一些實施例中，用於治療人類個體之癌症之方法包含向個體投與治療學上有效劑量之新抗原治療劑與治療學上有效劑量之第二免疫治療劑的組合，其中試劑中之一或兩者根據間歇性給藥策略投與。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑及約每2週一次投與後續劑量之試劑。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑，及約每3週一次投與後續劑量之試劑。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑，及約每4週一次投與後續劑量之試劑。在一些實施例中，使用間歇性給藥策略投與試劑且每週投與額外治療劑。
本發明提供包含本文所描述之新抗原治療劑之組合物。本發明亦提供包含本文所描述之新抗原治療劑及醫藥學上可接受之媒劑的醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物可用於免疫療法。在一些實施例中，組合物可用於抑制腫瘤生長。在一些實施例中，醫藥組合物可用於抑制個體(例如人類患者)之腫瘤生長。在一些實施例中，組合物可用於治療癌症。在一些實施例中，醫藥組合物可用於治療個體(例如人類患者)之癌症。
藉由將本發明之新抗原治療劑與醫藥學上可接受之媒劑(例如載劑或賦形劑)組合來製備用於儲存及使用之調配物。熟習此項技術者一般將醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑視為調配物或醫藥組合物之非活性成分。例示性調配物在WO 2015/095811中列出。
適合的醫藥學上可接受之媒劑包括但不限於無毒性緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯化六羥季銨、苯紮氯銨、苄索氯銨、苯酚、丁醇或苯甲醇、對羥苯甲酸烷酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如小於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物，諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物，諸如Zn-蛋白質錯合物；及非離子界面活性劑，諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, 2012, Pharmaceutical Press, London.)。在一些實施例中，媒劑為含5%右旋糖之水。
在一個態樣中，本文提供醫藥學上可接受或生理上可接受之組合物，包括與醫藥投與相容之溶劑(水性或非水性)、溶液、乳液、分散介質、包衣、等張及吸收促進劑或延遲劑。因此，醫藥組合物或醫藥調配物係指適合用於個體之醫藥用途的組合物。組合物可經調配以與特定投與途徑(亦即，全身性或局部)相容。因此，組合物包括適用於藉由各種途徑投與之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施例中，組合物可進一步包含可接受添加劑以便改良組合物中免疫細胞之穩定性。可接受添加劑可不改變免疫細胞之比活性。可接受添加劑之實例包括但不限於糖，諸如甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、聚葡萄糖、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。可接受添加劑可與可接受載劑及/或賦形劑(諸如右旋糖)組合。或者，可接受添加劑之實例包括但不限於諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80之界面活性劑，以增加肽之穩定性且減少溶液之膠凝。界面活性劑可以溶液0.01%至5%之量添加至組合物中。此類可接受添加劑之添加增加組合物在儲存中之穩定性及半衰期。
本文所描述之醫藥組合物可以任何數目的方式投與以用於局部或全身性治療。投與可為局部的，藉由表皮或經皮貼片、軟膏、乳劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及散劑；經肺的，藉由吸入或吹入粉劑或氣霧劑，包括藉由噴霧器；氣管內及鼻內；經口；或非經腸，包括靜脈內、動脈內、瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內(例如注射或輸注)或顱內(例如鞘內或室內)。
醫藥組合物可例如藉由注射投與。投與可為皮內注射、鼻內噴霧施加、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射。用於注射之組合物包括水性溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於即用型製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投與，適合之載劑包括生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)之溶劑或分散介質及其適合混合物。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持流動性。抗細菌劑及抗真菌劑包括例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸及硫柳汞。等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇及氯化鈉)可包括於組合物中。所得溶液可封裝按原樣使用或凍乾；凍乾製劑可稍後在投與之前與無菌溶液組合。對於靜脈內注射或在病痛位點注射，活性成分將呈非經腸可接受之水性溶液形式，其無熱原質且具有適合之pH值、等張性及穩定性。熟習此項技術者充分能夠使用例如等張媒劑製備適合之溶液，諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's Injection)、乳酸林格氏注射液。視需要可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性成分視需要與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌來製備。一般而言，藉由將活性成分併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，較佳製備方法可為真空乾燥及冷凍乾燥，其由其先前經滅菌過濾之溶液產生活性成分加上任何額外所要成分之散劑。
組合物可諸如藉由注射例如單位劑量來習知地靜脈內投與。對於注射，活性成分可呈非經腸可接受之水性溶液形式，其實質上無熱原質且具有適合之pH值、等張性及穩定性。可使用例如等張媒劑製備適合溶液，諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液。視需要可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。另外，組合物可經由氣溶膠化投與。
當考慮組合物用於本文所提供之藥劑或方法中之任一者時，預期組合物可實質上不含熱原質，使得當投與人類患者時組合物將不會引起發炎性反應或不安全過敏性反應。測試組合物之熱原質及製備實質上不含熱原質的組合物為一般熟習此項技術者所熟知，且可使用市售套組來實現。
可接受之載劑可含有穩定、增加或延遲吸收或增加或延遲清除之化合物。此類化合物包括例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖；低分子量蛋白質；減少肽清除或水解之組合物；或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。延遲吸收之試劑包括例如單硬脂酸鋁及明膠。清潔劑亦可用以穩定或增加或減少醫藥組合物(包括脂質體載劑)之吸收。為防止消化，化合物可與組合物複合以使得其對酸及酶水解具有抗性，或化合物可在具有適當抗性之載劑(諸如脂質體)中複合。保護化合物免於消化之手段為此項技術中已知的(例如Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764；Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135；及美國專利第5,391,377號)。
組合物可以與劑型相容之方式且以治療有效量投與。待投與之數量取決於待治療之個體、個體免疫系統利用活性成分之能力及所要結合力程度。需要投與之活性成分之精確量取決於從業者之判斷且為各個體所特有的。用於初始投藥及加強注射之適合方案亦為可變的，但代表為初始投藥，隨後以一或多個小時間隔藉由後續注射或其他投藥重複給藥。或者，涵蓋足以維持血液中之濃度的連續靜脈內輸注。
在一些情況下，當局部投藥或在特定感染位點處或其附近注射時，包含一或多種試劑之醫藥組合物發揮局部及區域性作用。例如黏性液體、溶液、懸浮液、基於二甲亞碸(DMSO)之溶液、脂質體調配物、凝膠、膠凍、乳膏、乳劑、軟膏、栓劑、泡沫或氣溶膠噴霧之直接局部施用可用於局部投藥，以產生例如局部及/或區域性作用。用於此類調配物之醫藥學上適當之媒劑包括例如低碳數脂族醇、聚二醇(例如，甘油或聚乙二醇)、脂肪酸酯、油、脂肪、聚矽氧及其類似物。此類製劑亦可包括防腐劑(例如，對羥基苯甲酸酯)及/或抗氧化劑(例如，抗壞血酸及生育酚)。亦參見Dermatological Formulations: Percutaneous absorption, Barry (編), Marcel Dekker Incl, 1983。在另一實施例中，包含轉運體、載劑或離子通道抑制劑之局部/區域性調配物用於治療表皮或黏膜病毒感染。
在一些情況下，免疫原性醫藥組合物可包括載劑及賦形劑(包括但不限於緩衝劑、碳水化合物、甘露糖醇、蛋白質、多肽或胺基酸，諸如甘胺酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、懸浮劑、增稠劑及/或防腐劑)、水、油(包括石油、動物、植物或合成來源之油)，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物，生理鹽水溶液、水性右旋糖及甘油溶液、調味劑、著色劑、防黏劑及其他可接受添加劑、佐劑或結合劑，視大致生理條件需要之其他醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH緩衝劑、張力調節劑、乳化劑、濕潤劑及其類似物。賦形劑之實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。在另一情況下，醫藥製劑實質上不含防腐劑。在其他情況下，醫藥製劑可含有至少一種防腐劑。應認識到，儘管一般熟習此項技術者已知之任何適合的載劑可用於投與本文中所描述之醫藥組合物，但載劑類型將視投與模式而變化。
免疫原性醫藥組合物可包括防腐劑，諸如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。在一些情況下，免疫原性醫藥組合物實質上不含(例如＜10μg/mL)汞材料，例如無硫柳汞。α-生育酚丁二酸鹽可用作汞化合物之替代物。
為控制張力，免疫原性醫藥組合物中可包括生理鹽，諸如鈉鹽。其他鹽可包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二鈉及/或氯化鎂或其類似物。
免疫原性醫藥組合物可具有在200 mOsm/kg與400 mOsm/kg之間、在240-360 mOsm/kg之間或在290-310 mOsm/kg範圍內的重量莫耳滲透濃度。
免疫原性醫藥組合物可包含一或多種緩衝劑，諸如Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；丁二酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑(尤其具有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩衝劑。緩衝劑在一些情況下包括於5至20或10至50 mM範圍中。
免疫原性醫藥組合物可包含pH調節劑。在一些實施例中，pH調節劑以小於1 mM或大於1 mM之濃度存在。在一些實施例中，pH調節劑以小於10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 nM或1 mM之濃度存在。在一些實施例中，pH調節劑以大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900 mM之濃度存在。在一些實施例中，pH調節劑為二羧酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為三羧酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為丁二酸之二羧酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為二丁二酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為檸檬酸之三羧酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為三檸檬酸鹽。在一些實施例中，pH調節劑為丁二酸二鈉。在一些實施例中，丁二酸之二羧酸鹽以0.1 mM至1 mM之濃度存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，二丁二酸鹽以0.1 mM至1 mM之濃度存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，丁二酸之二羧酸鹽以1 mM至5 mM之濃度存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，二丁二酸鹽以1 mM至5 mM之濃度存在於醫藥組合物中。免疫原性醫藥組合物之pH值可以在約5.0與約8.5之間、在約6.0與約8.0之間、在約6.5與約7.5之間或在約7.0與約7.8之間。
免疫原性醫藥組合物可為無菌的。免疫原性醫藥組合物可為非熱解的，例如每劑量含有＜1 EU (內毒素單位，標準量度)，且可為每劑量＜0.1 EU。組合物可不含麩質。
免疫原性醫藥組合物可包括清潔劑，例如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑(稱為『Tweens』)或辛苯聚醇(諸如辛苯聚醇-9 (Triton X-100)或第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。清潔劑可僅以痕量存在。免疫原性醫藥組合物可包括小於1 mg/mL辛苯聚醇-10及聚山梨醇酯80中之每一者。痕量之其他殘餘組分可為抗生素(例如新黴素、康黴素、多黏菌素B)。
免疫原性醫藥組合物可在此項技術中熟知之適合媒劑中調配為無菌溶液或懸浮液。醫藥組合物可藉由習知的熟知滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。所得水性溶液可封裝按原樣使用或凍乾，凍乾之製劑在投與之前與無菌溶液組合。
包含例如活性劑(諸如本文所揭示之免疫細胞)與一或多種佐劑之組合的醫藥組合物可經調配以包含某些莫耳比。舉例而言，可使用約99:1至約1:99之活性劑(諸如本文所述之免疫細胞)與一或多種佐劑之組合的莫耳比。在一些情況下，活性劑(諸如本文所述之免疫細胞)與一或多種佐劑之組合之莫耳比範圍可選自約80:20至約20:80；約75:25至約25:75、約70:30至約30:70、約66:33至約33:66、約60:40至約40:60；約50:50；及約90:10至約10:90。活性劑(諸如本文所述之免疫細胞)與一或多種佐劑之組合之莫耳比可為約1:9，且在一些情況下可為約1:1。與一或多種佐劑組合之活性劑(諸如本文所描述之免疫細胞)可一起調配於相同劑量單元中，例如在一個小瓶、栓劑、錠劑、膠囊、氣溶膠噴霧中；或各試劑、形式及/或化合物可調配於獨立單元中，例如兩個小瓶、栓劑、錠劑、兩個膠囊、錠劑及小瓶、氣溶膠噴霧及其類似物。
治療調配物可呈單位劑型。此類調配物包括錠劑、丸劑、膠囊、散劑、顆粒、於水或非水性介質中之溶液或懸浮液或栓劑。
本文所述之新抗原肽亦可包覆於微膠囊中。此類微膠囊例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備，例如分別在膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或巨乳液中之羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, 2012, Pharmaceutical Press, London中所描述。
在某些實施例中，醫藥調配物包括與脂質體複合之本文所描述之新抗原治療劑。用於產生脂質體之方法為熟習此項技術者已知。舉例而言，一些脂質體可藉由逆相蒸發，用包含膽鹼磷脂、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體可經具有經定義孔隙尺寸之過濾器擠出，以產生具有所要直徑之脂質體。
在某些實施例中，可產生包含本文所述之新抗原肽的持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有試劑之固體疏水性聚合物之半可滲透基質，其中基質呈成形物品(例如膜或微膠囊)形式。持續釋放基質之實例包括聚酯；水凝膠，諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚乳酸交酯；L-麩胺酸及7-L-麩胺酸乙酯之共聚物；不可降解乙烯-乙酸乙烯酯；可降解乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOT™(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙立德構成之可注射微球體)；蔗糖乙酸酯異丁酸鹽；及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
本發明提供包含免疫原性疫苗之治療方法。提供治療疾病(諸如癌症或病毒感染)之方法。方法可包含向個體投與有效量之包含免疫原性抗原之組合物。在一些實施例中，抗原包含病毒抗原。在一些實施例中，抗原包含腫瘤抗原。
可製備之疫苗之非限制性實例包括基於肽之疫苗、基於核酸之疫苗、基於抗體之疫苗及基於抗原呈現細胞之疫苗。
可使用一或多種生理學上可接受之載劑，包括有助於將活性劑處理成可在醫藥學上使用之製劑的賦形劑及助劑來調配疫苗組合物。適當調配物可視所選投與途徑而定。適合時且如此項技術中所理解，可使用熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者。
在一些情況下，將疫苗組合物調配為基於肽之疫苗、基於核酸之疫苗、基於抗體之疫苗或基於細胞之疫苗。舉例而言，疫苗組合物可包括陽離子脂質調配物中之裸cDNA；脂肽(例如Vitiello, A.等人, J. Clin. Invest. 95:341, 1995)；例如囊封於聚(DL-丙交酯-共-乙交酯) (「PLG」)微球體中之裸cDNA或肽(參見例如Eldridge,等人, Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso等人, Vaccine 12:299-306, 1994；Jones等人, Vaccine 13:675-681, 1995)；免疫刺激複合物(ISCOMS)中所含之肽組合物(例如Takahashi等人, Nature 344:873-875, 1990；Hu等人, Clin. Exp. Immunol. 113:235-243, 1998)；或多個抗原肽系統(MAP) (參見例如Tam, J. P., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988；Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996)。有時，將疫苗調配為基於肽之疫苗或基於核酸之疫苗，其中核酸編碼多肽。有時，將疫苗調配為基於抗體之疫苗。有時，將疫苗調配為基於細胞之疫苗。
可使用所鑑別之疾病特異性免疫原性新抗原肽之胺基酸序列來產生醫藥學上可接受之組合物。抗原來源可為但不限於天然或合成蛋白質，包括醣蛋白、肽及超抗原；抗體/抗原複合物；脂蛋白；RNA或其轉譯產物；及DNA或由DNA編碼之多肽。抗原來源亦可包含未轉形、經轉形、經轉染或經轉導之細胞或細胞株。可使用可用於表現重組抗原之一般熟習此項技術者已知的多種表現或反轉錄病毒載體中之任一者轉形、轉染或轉導細胞。亦可在已用含有編碼一或多種重組抗原之DNA分子之表現或反轉錄病毒載體轉形、轉染或轉導之任何適當宿主細胞中達成表現。可使用此項技術中已知之任何數目之轉染、轉形及轉導方案。重組牛痘載體及用牛痘載體感染之細胞可用作抗原來源。
醫藥組合物可包含合成疾病特異性免疫原性新抗原肽。醫藥組合物可包含兩種或更多種疾病特異性免疫原性新抗原肽。醫藥組合物可包含疾病特異性免疫原性肽之前驅體(諸如蛋白質、肽、DNA及RNA)。可產生疾病特異性免疫原性肽之前驅體或針對所鑑別疾病特異性免疫原性新抗原肽產生。在一些實施例中，治療性組合物包含免疫原性肽之前驅體。疾病特異性免疫原性肽之前驅體可為前藥。在一些實施例中，包含疾病特異性免疫原性新抗原肽之醫藥組合物可進一步包含佐劑。舉例而言，新抗原肽可用作疫苗。在一些實施例中，免疫原性疫苗可包含醫藥學上可接受之免疫原性新抗原肽。在一些實施例中，免疫原性疫苗可包含免疫原性新抗原肽之醫藥學上可接受之前驅體(諸如蛋白質、肽、DNA及RNA)。在一些實施例中，治療方法包含向個體投與有效量之特異性識別免疫原性新抗原肽之抗體。
本文所描述之方法適用於個體化用藥情境，其中免疫原性新抗原肽用於針對相同個體研發治療劑(諸如疫苗或治療抗體)。因此，治療個體之疾病之方法可包含根據本文所描述之方法鑑別個體之免疫原性新抗原肽；及合成肽(或其前驅體)；及向個體投與肽或特異性識別肽之抗體。
在一些實施例中，鑑別由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基或免疫原性新抗原肽包含自個體之腫瘤細胞定序的核酸序列池中選擇複數個核酸序列，該等核酸序列編碼複數個候選肽序列，其包含不存在於自個體之非腫瘤細胞定序的核酸序列池中的一或多個不同突變，其中自個體之腫瘤細胞定序之核酸序列池及自個體之非腫瘤細胞定序之核酸序列池係藉由全基因體定序或全外顯子組定序來定序。在一些實施例中，鑑別由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基或免疫原性新抗原肽進一步包含藉由HLA肽結合分析來預測或量測複數個候選肽序列中哪些候選肽序列與由相同個體之HLA對偶基因所編碼之蛋白質形成複合物。在一些實施例中，鑑別由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基或免疫原性新抗原肽進一步包含基於HLA肽結合分析，選擇複數種所選腫瘤特異性肽或一或多種編碼來自候選肽序列之複數種所選腫瘤特異性肽的聚核苷酸。在一些實施例中，由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基為新抗原、腫瘤相關抗原、突變型腫瘤相關抗原，及/或其中與抗原決定基在個體之正常細胞中之表現相比，抗原決定基之表現在個體之腫瘤細胞中更高。
在一些實施例中，免疫原性新抗原之表現模式可充當用於產生患者特異性疫苗之必需基礎。在一些實施例中，免疫原性新抗原之表現模式可充當用於產生患有特定疾病之患者群組之疫苗之必需基礎。因此，可在患者群組中選擇性地治療特定疾病，例如特定腫瘤類型。
在一些實施例中，本文所述之肽為結構上正常之抗原，其可由較大患者群組中之自體抗疾病T細胞識別。在一些實施例中，測定疾病表現結構上正常新抗原的患病個體群組之抗原表現模式。
在一些實施例中，本文中所描述之醫藥組合物包含至少兩種多肽包含至少兩種多肽分子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含長度相同之相同抗原決定基。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含相同胺基酸或胺基酸序列，其為不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游或下游之核酸序列編碼的肽序列之胺基酸或胺基酸序列。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者包含不同連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽不包含連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽包含連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽不包含抗原決定基之N端上之連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽包含抗原決定基之N端上之連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽不包含抗原決定基之C端上之連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽包含抗原決定基之C端上之連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽包含連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽不包含連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽包含抗原決定基之N端上之連接子且至少兩種多肽或多肽分子之第二多肽不包含抗原決定基之N端上之連接子。在一些實施例中，至少兩種多肽或多肽分子之第一多肽包含抗原決定基之C端上之連接子且至少兩種多肽之第二多肽或多肽分子不包含抗原決定基之C端上之連接子。
在一些實施例中，抗原決定基以1 ng至10 mg或5µg至1.5 mg之量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，抗原決定基以1 ng至10 mg之量存在。在一些實施例中，抗原決定基以以下量存在：1 ng至100 ng、10 ng至200 ng、20 ng至300 ng、30 ng至400 ng、40 ng至500 ng、50 ng至600 ng、60 ng至700 ng、70 ng至800 ng、80 ng至900 ng、90 ng至1µg、100 ng至2µg、200 ng至3µg、300 ng至4µg、400 ng至5µg、500 ng至6µg、600 ng至7µg、700 ng至8µg、800 ng至9µg、900 ng至10µg、1µg至100µg、20µg至200µg、30µg至300µg、40µg至400µg、50µg至500µg、60µg至600µg、70µg至700µg、80µg至800µg、90µg至900µg、100µg至1 mg、200µg至1.1 mg、300µg至1.2 mg、400µg至1.3 mg、500µg至1.4 mg、600µg至1.5 mg、700µg至2 mg、800µg至3 mg、900µg至4 mg、1 mg至5 mg、1.3 mg至6 mg、1.5 mg至7 mg、2 mg至8 mg、3 mg至9 mg或4 mg至10 mg。在一些實施例中，抗原決定基以約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950 ng的量存在。在一些實施例中，抗原決定基以約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950µg的量存在。在一些實施例中，抗原決定基以約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10 mg之量存在。
存在多種產生免疫原性新抗原之方式。蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知的任何技術製得，包括經由標準分子生物技術表現蛋白質、多肽或肽；自天然來源中分離蛋白質或肽；活體外轉譯；或化學合成蛋白質或肽。一般而言，此類疾病特異性新抗原可在活體外或活體內產生。免疫原性新抗原可在活體外作為肽或多肽產生，其可隨後調配成個體化疫苗或免疫原性組合物且向個體投與。免疫原性新抗原之活體外產生可包含肽合成或自多種細菌、真核或病毒重組表現系統中之任一者中之DNA或RNA分子表現肽/多肽，隨後純化所表現之肽/多肽。或者，免疫原性新抗原可藉由引入將免疫原性新抗原編碼至個體中之分子(例如DNA、RNA及病毒表現系統)活體內產生，之後表現經編碼之免疫原性新抗原。在一些實施例中，編碼免疫原性新抗原肽之聚核苷酸可用於活體外產生新抗原肽。
在一些實施例中，聚核苷酸包含與編碼免疫原性新抗原之聚核苷酸具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、單股及/或雙股、原生或穩定形式之聚核苷酸或其組合。編碼免疫原性新抗原肽之核酸可含有或可不含有內含子，只要其編碼肽即可。在一些實施例中，使用活體外轉譯來產生肽。
亦涵蓋包含編碼新抗原之序列之表現載體以及含有表現載體之宿主細胞。適用於本發明中之表現載體可包含與核酸序列可操作地連接之至少一種表現控制元件。將表現控制元件插入於載體中以控制及調節核酸序列之表現。表現控制元件之實例為此項技術中熟知的，且包括例如lac系統、噬菌體λ之操縱子及啟動子區域、酵母啟動子及衍生自多瘤病毒、腺病毒、反轉錄病毒或SV40之啟動子。額外操作元件包括但不限於前導序列、終止密碼子、聚腺苷酸化信號及宿主系統中之核酸序列之適當轉錄及後續轉譯所需或較佳的任何其他序列。熟習此項技術者應理解，表現控制元件之正確組合將視所選宿主系統而定。應進一步理解，表現載體應含有轉移及後續複製含有宿主系統中核酸序列之表現載體所需的額外元件。此類元件之實例包括但不限於複製起點及可選標記物。
新抗原肽可以編碼所要新抗原肽的RNA或cDNA分子形式提供。本發明之一或多種新抗原肽可由單一表現載體編碼。一般而言，將DNA以適當取向插入表現載體，諸如質體中，且必要時校正閱讀框架以用於表現，DNA可連接至所要宿主(例如細菌)識別之適當的轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，但此類控制一般可用於表現載體中。隨後使用標準技術將載體引入用於選殖之宿主細菌中。適用於真核宿主，尤其哺乳動物或人類的表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及細胞巨大病毒之表現控制序列的載體。適用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物；較寬宿主範圍質體，諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。用於表現多肽之適合宿主細胞論述於聚核苷酸部分[0250]中。適用於與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用的適當選殖及表現載體為此項技術中所熟知。
經轉形之宿主所產生的蛋白質可根據任何適合方法純化。此類標準方法包括層析(例如離子交換、親和力及篩分管柱層析及其類似層析)、離心、差異溶解度或用於蛋白質純化的任何其他標準技術。可使親和力標籤(諸如六組胺酸、麥芽糖結合域、流感外殼序列、麩胱甘肽-S-轉移酶及其類似物)附接至蛋白質，以藉由通過適當親和力管柱而允許容易純化。經分離之蛋白質亦可使用諸如蛋白分解、核磁共振及x射線結晶學之技術進行物理表徵。
疫苗可包含結合本文所描述之多肽序列之實體。實體可為抗體。適合時且如此項技術中所理解，可使用熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者調配基於抗體之疫苗。在一些實施例中，本文所描述之肽可用於製造新抗原特異性治療劑，諸如抗體療法。舉例而言，新抗原可用於提高及/或鑑別特異性識別新抗原之抗體。此等抗體可用作治療劑。抗體可為天然抗體、嵌合抗體、人類化抗體或可為抗體片段。抗體可識別本文所描述之多肽中之一或多者。在一些實施例中，抗體可識別具有與本文所描述之多肽具有至多40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列的多肽。在一些實施例中，抗體可識別具有與本文所描述之多肽具有至少40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的多肽。在一些實施例中，抗體可識別長度為本文所描述之多肽之至少30%、40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的多肽序列。在一些實施例中，抗體可識別長度為本文所描述之多肽的至多30%、40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之多肽序列。
本發明亦涵蓋使用核酸分子作為用於以例如DNA疫苗形式向有需要之個體活體內遞送新抗原肽/多肽之媒劑。
在一些實施例中，疫苗為核酸疫苗。在一些實施例中，核酸編碼免疫原性肽或肽前驅體。在一些實施例中，核酸疫苗包含側接編碼免疫原性肽或肽前驅體之序列的序列。在一些實施例中，核酸疫苗包含多於一種免疫原性抗原決定基。在一些實施例中，核酸疫苗為基於DNA之疫苗。遞送方法論述於聚核苷酸部分[0250]中。
聚核苷酸可為實質上純的或含於適合的載體或遞送系統中。適合的載體及遞送系統包括病毒，諸如基於腺病毒、牛痘病毒、反轉錄病毒、疱疹病毒、腺相關病毒之系統或含有多於一種病毒元件之雜合體。非病毒遞送系統包括陽離子脂質及陽離子聚合物(例如陽離子脂質體)。
一或多種新抗原肽可使用基於病毒之系統來活體內編碼及表現。病毒載體可用作本發明中之重組載體，其中病毒基因體之一部分缺失以引入新基因，而不破壞病毒感染力。本發明之病毒載體為非病原病毒。在一些實施例中，病毒載體具有針對哺乳動物中之特定細胞類型之向性。在另一實施例中，本發明之病毒載體能夠感染專職抗原呈現細胞，諸如樹突狀細胞及巨噬細胞。在本發明之又一實施例中，病毒載體能夠感染哺乳動物中之任何細胞。病毒載體亦可感染腫瘤細胞。本發明中使用之病毒載體包括但不限於痘病毒，諸如牛痘病毒、禽痘病毒、鳥痘病毒及高度減毒牛痘病毒(安卡拉或MVA)、反轉錄病毒、腺病毒、桿狀病毒及其類似物。
疫苗可經由多種途徑遞送。遞送途徑可包括經口(包括頰內及舌下)、經直腸、經鼻、局部、經皮貼片、經肺、經陰道、栓劑或非經腸(包括肌肉內、動脈內、鞘內、皮內、腹膜內、皮下及靜脈內)投與或呈適合於藉由氣溶膠化、吸入或吹入投與之形式。關於藥物遞送系統之總體資訊可見於Ansel等人, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999)中。本文所描述之疫苗可投與至肌肉，或可經由皮內或皮下注射或經皮，諸如藉由離子導入投與。可採用疫苗之表皮投與。本文所述之疫苗可經由皮內注射、鼻內噴霧施加、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射投與。
在一些情況下，亦可調配疫苗以用於經由鼻腔投與。適合於經鼻投與之調配物(其中載劑為固體)可包括粗散劑，其具有例如約10至約500微米範圍內之粒度，其以鼻吸方式投與，亦即，通過鼻腔自保持靠近鼻之散劑容器快速吸入。調配物可為鼻用噴霧、鼻滴劑或藉由噴霧器之氣溶膠投與。調配物可包括疫苗之水性或油性溶液。
疫苗可為液體製劑，諸如懸浮液、糖漿或酏劑。疫苗亦可為用於非經腸、皮下、皮內、肌肉內或靜脈內投與(例如可注射投與)之製劑，諸如無菌懸浮液或乳液。
疫苗可包括用於單次免疫接種之材料，或可包括用於多次免疫接種之材料(亦即，『多劑量』套組)。在多次劑量配置中較佳包括防腐劑。作為在多劑量組合物中包括防腐劑之替代方案(或另外)，組合物可含於具有用於移除材料之無菌轉接器之容器中。
疫苗可以約0.5 mL之劑量體積投與，但可向兒童投與一半劑量(亦即，約0.25 mL)。有時，疫苗可以較高劑量，例如約1 ml投與。
疫苗可以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次劑量療程方案投與。有時，疫苗以1、2、3或4次劑量療程方案投與。有時，疫苗以1次劑量療程方案投與。有時，疫苗以2次劑量療程方案投與。
第一劑量及第二劑量之投與可間隔約0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2個月、4個月、6個月、9個月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更久。
本文所描述之疫苗可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更長投與。有時，本文所描述之疫苗每2、3、4、5、6、7年或更長投與。有時，本文所描述之疫苗每4、5、6、7年或更長投與。有時，本文所描述之疫苗投與一次。
劑量實例不受限制且僅用於例證投與本文所描述之疫苗之特定給藥方案。用於人類之有效量可自動物模型測定。舉例而言，可調配人類劑量以達成已發現在動物中有效之循環、肝、局部及/或胃腸濃度。基於動物資料及其他類型之類似資料，熟習此項技術者可測定適合於人類之疫苗組合物之有效量。
當提及試劑或試劑組合時，有效量將一般意謂醫療或醫藥技術的各種監管或諮詢組織(例如FDA、AMA)中之任一者或製造商或供應商建議或批准的劑量範圍、投與模式、調配物等。
在一些態樣中，本文所描述之疫苗及套組可儲存於2℃至8℃下。在一些情況下，疫苗不冷凍儲存。在一些情況下，疫苗儲存於諸如-20℃或-80℃之溫度下。在一些情況下，疫苗避開日光儲存。7. 套組
本文所描述之新抗原治療劑可與投與說明書一起提供於套組形式中。通常，套組將包括在容器中、呈單位劑型之所要新抗原治療劑及投與說明書。在套組中亦可包括額外治療劑，例如細胞介素、淋巴介質、檢查點抑制劑、抗體。亦可能需要的其他套組組分包括例如無菌注射器、加強劑量及其他所要賦形劑。
本文亦提供與本文所描述之一或多種方法一起使用的套組及製品。套組可含有包含一或多種新抗原決定基之一或多種新抗原多肽。套組亦可含有編碼本文所描述之肽或蛋白質中之一或多者的核酸、識別本文所描述之肽中之一或多者的抗體或用本文所描述之肽中之一或多者活化的基於APC之細胞。套組可進一步含有構成及遞送疫苗所需之佐劑、試劑及緩衝劑。
套組亦可包括經分隔以收容一或多個容器(諸如小瓶、管及其類似物)之載體、封裝或容器，一或多個容器中之每一者包含待用於本文所描述之方法中之分開的成分(諸如肽及佐劑)中之一者。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。
本文所提供之製品含有封裝材料。醫藥封裝材料之實例包括但不限於泡殼包裝、瓶子、管、袋、容器、瓶子及適於所選配方及預期投與及治療模式之任何封裝材料。套組通常包括列出內容物之標籤及/或使用說明書，及具有使用說明書之仿單(package insert)。通常亦將包括一組說明。
將藉助於特定實例更詳細地描述本發明。出於說明之目的提供以下實例，且該等實例不意欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將容易地識別可改變或修改以產生根據本發明之替代實施例的多種非關鍵參數。本文中所列出之所有專利、專利申請案及印刷出版物均以全文引用之方式併入本文中。實例
此等實例僅出於說明之目的提供且不限制本文所提供之申請專利範圍之範疇。實例 1- 多肽增強的裂解及處理之評定
使用T細胞受體(TCR)轉導之細胞活體外篩選多肽以進行抗原決定基處理及呈現。將表現CD8之經工程改造之Jurkat細胞以及經驗證之TCR製備為效應細胞。對於目標細胞，具有特定HLA對偶基因之周邊血液單核細胞(PBMC)用FLT3-配位體刺激隔夜，在不同情形下負載含有相關抗原決定基之多肽一小時，且用細胞介素成熟化。將經工程改造之Jurkat細胞及PBMC共培養48小時且由經工程改造之Jurkat細胞分泌之IL-2之含量經量測為藉由TCR識別肽之讀數。實驗設計展示於圖 3 中且結果展示於圖 4 及圖 5 中。實例 2- 新抗原多肽免疫原性
研究圍繞特定抗原決定基設計之多種多肽之免疫原性以及針對此等多肽之T細胞反應之品質。八十四隻8-12週齡雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)在到達時隨機地且前瞻性地(prospectively)分配至處理組。在研究開始之前使動物適應三天。以LabDiet™ 5053無菌嚙齒動物食料飼養動物且隨意提供無菌水。第1組中之12隻動物充當未接種疫苗之對照組。第2組至第7組各組中之12隻動物接受50μg聚IC:LC及10μg各多肽(定義於表13中；加粗序列表示最小抗原決定基)或具有替代性肽設計之莫耳濃度匹配之等效物(定義於表14中)。Kif18b用作CD4輔助肽且未經修飾用於第2組至第7組中之所有小鼠中。在第7天、第14天及第21天藉由眼眶後抽血採集血液。動物每天稱重且監測一般健康狀況。若動物體重相較於第0天其重量損失＞30%；或若發現動物瀕死，則在研究完成之第21天藉由CO2 過度劑量使動物安樂死。
表 13 .研究中使用之肽
抗原 序列 限制 對偶基因 源模型
Alg8 AVGITYTWTRLYASVLTGSLVSKTKK MHCI H-2Kb T3
Lama4 IQKISFFDGFEVGFNFRTL QPNGLLFYYT MHCI H-2Kb T3
Adpgk GIPVHLELASMTNMELM SSIVHQQVFPT MHCI H-2Db MC38
Reps1 GRVLELFRAAQLANDVVL QIMELCGATR MHCI H-2Db MC38
Irgq KARDETAALLNSAVL GAAPLFVPPAD MHCI H-2Db MC38
Obsl1 REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD MHCI H-2Db B16F10
Kif18b PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL MHCII I-Ab B16F10
表 14 .實驗設計(亦參見圖 6 )
組別 小鼠數目 處理 抗原( 尾根左側) 抗原 ( 後頸 ) 疫苗劑量 疫苗處理 組織收集
1 12 未處理 N/A N/A N/A N/A N/A
2 12 強SLP+CD4+希托洛 Kif18b* Alg8，Lama4，Obsl1 各10µg SLP 或 等莫耳SSP 50µg希托洛 途徑 ： 以100µL/注射，皮下，尾根左側   排程 ： 第-21天、第-14天、第-7天 眼眶後抽血 ： 第-14天、第-7天、第0天
3 12 SLP+CD4+希托洛 Reps1， Adpgk，Irgq，Kif18b* Alg8，Lama4，Obsl1
4 12 SSP+CD4+希托洛
5 12 K4-SSP+CD4+希托洛
6 12 K4-Val-Cit-PABC-SSP+CD4+希托洛
7 12 K4-二硫基-SSP+CD4+希托洛
MHC四聚體現場製造且用於量測免疫原性分析中之肽特異性T細胞擴增。為評定，將四聚體添加至含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉之PBS (FACS緩衝劑)中的1×105 個細胞中。細胞在暗處在37℃下培育15分鐘。接著將對T細胞標記物(諸如CD8)及對不相關細胞類型(諸如CD4/CD11b/CD11c/CD19)具有特異性之抗體添加至製造商所建議之最終濃度，且在暗處在4℃下培育細胞20分鐘。用冷FACS緩衝劑洗滌細胞，緊接著在LSR2 (Becton Dickinson)儀器上分析，且藉由使用FacsDiva軟體(Becton Dickinson)分析。為了分析四聚體陽性細胞，淋巴球門取自前向及側向散佈圖。資料報導為細胞之百分比，該等細胞為CD4- CD11b- CD11c- CD19- CD8+ /四聚物+ 。
用K4-抗原決定基免疫接種使對所評定之6個抗原決定基中之5個的免疫反應顯著增加。對Alg8、Lama4、Reps1、Adpgk及Obsl1are之免疫反應顯著增加。用K4-抗原決定基免疫接種增加免疫原性不足之抗原決定基(例如Obsl1)之免疫原性。K4-Val-Cit-PABC-抗原決定基免疫接種增加Alg8特異性免疫反應。結果展示於圖 7 至圖 9 中。實例 3- 合成二硫基連接子 ( 化合物 5)
步驟 1
Figure 02_image013
將2,2'-雙(5-硝基吡啶基)二硫化物2 (2 mmol)懸浮於10 mL二氯甲烷中且將對應的含巰基醇1 (1 mmol，其中R1 及R2 如本文所定義)之二氯甲烷(4 mL)添加至懸浮液中。在室溫下攪拌所得懸浮液16小時。在減壓下移除溶劑。將所得殘餘物再溶解於5 mL二甲基甲醯胺中且使用C18-逆相管柱用含有0.05% TFA之乙腈及水之梯度純化。合併所要級分且凍乾，得到(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基醇3 (約65至82%產率，＞90%純度，UPLC-MS/UV分析，在220 nm下)。
步驟 2
Figure 02_image015
向(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基醇3 (0.5 mmol，其中R1 及R2 如本文所定義)於二甲基甲醯胺(2 mL)中之溶液中添加N,N'-二異丙基乙胺(1.5 mmol)，隨後添加氯甲酸4-硝基苯酯4 (0.55 mmol)。在室溫下攪拌此溶液16小時，接著使用C18-逆相管柱用含有0.05% TFA之乙腈及水之梯度純化。合併所要級分且凍乾，得到碳酸4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷酯5 (約90至98%產率，＞90%純度，UPLC-MS/UV分析，在220 nm下)。實例 4- 合成含二硫基肽
步驟 1 ： 形成4-硝基-2-吡啶基硫基活化之二硫基肽8
Figure 02_image017
根據以上流程，肽結合樹脂6 (可使用固相肽合成製得之任何樹脂)之N端使用連接子5 (其中R1 及R2 如本文所定義)手動醯基化，或相應地在自動肽合成器上程式化。更特定言之，樹脂6 (0.05 mmol)在二甲基甲醯胺中膨脹5分鐘，且瀝乾。將對應的碳酸4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷酯5 (0.2 mmol)及Oxyma Pure Novabiochem®(亦稱為Oxyma Pure，0.3 mmol)溶解於1 mL二甲基甲醯胺中，添加至膨脹樹脂6 中，且隨後添加N,N'-二異丙基乙胺(0.3 mmol)。攪拌所得樹脂懸浮液3小時，瀝乾，且隨後用二甲基甲醯胺(5×，5 mL)、二氯甲烷(5×，5 mL)及甲醇(2×，5 mL)沖洗所得肽結合樹脂7 。肽結合樹脂7 在減壓下乾燥1小時，且在室溫下使用3 mL 95%三氟乙酸(TFA)、2.5%水、2.5%三異丙基矽烷(TIPS)裂解3小時以形成含有未結合肽8 及來自7 之裂解樹脂的裂解溶液(「A 」)。隨後過濾此裂解溶液A 且在50 mL錐形管中瀝乾，用95:5 TFA:水溶液(1 mL)洗滌來自7 之裂解樹脂，過濾，瀝乾，且合併，以得到經過濾之肽溶液(「B 」)。藉由用冰冷乙醚沈澱使未結合肽8 自經過濾之肽溶液B 分離，以3600 rpm離心5分鐘，且傾析乙醚。隨後用20 mL冰冷乙醚沖洗所得肽集結粒，產生懸浮液，隨後將其渦旋且以3600 rpm再次離心3分鐘。此重複總共3次洗滌以充分沖洗集結粒以產生胺基甲酸4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷酯肽8 ，其未經進一步純化即用於下一個合成步驟中。
步驟 2 ： 形成含二硫基肽10 的二硫基交換反應
Figure 02_image019
如以上流程中所描述，粗胺基甲酸4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷酯肽8 (其中R1 及R2 如本文所定義)經歷與所要含有硫醇之分子9 (其中G1 及j如本文所定義)的二硫基交換。更特定言之，將胺基甲酸4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷酯肽8 (0.05 mmol)溶解於二甲基甲醯胺(1 mL)中，隨後添加所要含有硫醇之化合物9 (0.05 mmol)於1:1二甲基甲醯胺-1 M Tris緩衝劑中之溶液。攪拌所得黃色溶液2小時，使用C18-逆相管柱用含有0.05% TFA之乙腈及水之梯度純化。合併所要級分且凍乾，得到含二硫基肽10 (約10至30%產率，＞95%純度，UPLC-MS/UV分析，在220 nm下，始於固相肽合成)。實例 5- 合成含 PABC 肽 (13)
Figure 02_image021
如以上流程中所描述，肽結合樹脂6 的N端使用Fmoc-AA-AA-PAB-PNP11 手動醯基化，或相應地在自動肽合成器上程式化。更特定言之，樹脂6 (0.05 mmol)在二甲基甲醯胺中膨脹5分鐘，且瀝乾。將對應Fmoc-AA-AA-PAB-PNP11 (0.2 mmol)及Oxyma Pure Novabiochem®(亦稱為Oxyma Pure，0.3 mmol)溶解於1 mL二甲基甲醯胺中，向樹脂6 中添加，且隨後添加N,N'-二異丙基乙胺(0.3 mmol)。攪拌所得樹脂懸浮液3小時，瀝乾且所得Fmoc保護之樹脂12 接著用二甲基甲醯胺(5×，5 mL)沖洗。最終N端α-Fmoc用含20%哌啶之二甲基甲醯胺(2×，5分鐘)移除。此時，脫除保護基之中間物12 可視情況在12 之N端處使用標準Fmoc固相肽合成與額外胺基酸殘基反應，隨後使用如上文剛剛所論述之類似程序一或多次脫除N端α-Fmoc保護基。在完成所要一或多次脫除Fmoc保護基後，隨後用二甲基甲醯胺(5×，5 mL)、二氯甲烷(5×，5 mL)且隨後甲醇(2×，5 mL)沖洗樹脂12 (或具有延伸胺基酸之類似物)。肽結合樹脂12 在減壓下乾燥1小時，且在室溫下使用3 mL 70%三氟乙酸(TFA)、10%苯酚、10%三異丙基矽烷(TIPS)及10%硫代苯甲醚裂解30分鐘，以形成含有未結合肽13 及來自12 之裂解樹脂之裂解溶液(「A 」)。隨後過濾此裂解溶液A 且瀝乾，以得到50 mL錐形管中之經過濾之肽溶液(「B 」)。將來自12 之裂解樹脂用95:5 TFA:水溶液(1 mL)洗滌，過濾，瀝乾，且與經過濾之肽溶液B 合併。藉由用冰冷乙醚沈澱使未結合肽13 自經過濾之肽溶液B 分離，以3600 rpm離心5分鐘，且傾析乙醚。隨後用20 mL冰冷乙醚沖洗所得肽集結粒，產生懸浮液，隨後將其渦旋且以3600 rpm再次離心3分鐘。此重複總共3次洗滌以充分沖洗集結粒，得到化合物13 (約10至30%產率，＞95%純度，UPLC-MS/UV分析，在220 nm下，始於固相肽合成)。實例 6- 評定 TMPRSS2::ERG 抗原決定基 處理
使用T細胞受體(TCR)轉導之細胞評定TMPRSS2::ERG抗原決定基在活體外HLA-A02:01上之處理及呈現。將表現CD8之經工程改造之Jurkat細胞以及經驗證之TCR製備為效應細胞。對於目標細胞，天然表現HLA-A02:01之293T細胞，其i)負載僅含有TMPRSS2::ERG抗原決定基之肽24小時，或ii)在不同情形下(天然情形下之抗原決定基，亦即肽額外包含天然側接N端及/或C端上之抗原決定基序列之胺基酸或胺基酸序列；非天然情形下之抗原決定基，亦即肽額外包含非天然側接抗原決定基序列，例如CMVpp65序列之胺基酸或胺基酸序列)用編碼含有TMPRSS2::ERG抗原決定基之肽的質體，或在非天然情形下編碼含有不相關抗原決定基之肽的質體(作為對照組)穩定轉導。將經工程改造之Jurkat細胞及293T細胞共培養24小時且由經工程改造之Jurkat細胞分泌之IL-2之含量經量測為藉由TCR識別肽之讀數。結果展示於圖 10 中。實例 7- 比較多肽增強的裂解及處理及免疫原性
關於抗原決定基處理及呈現，T細胞受體(TCR)轉導之細胞用於活體外比較來自含有僅RAS-G12V抗原決定基、僅RAS-G12V抗原決定基及側接N端上之抗原決定基之額外胺基酸序列，或RAS-G12V抗原決定基及側接N端及C端上之抗原決定基的額外胺基酸序列之肽的RAS-G12V-HLA-A11:01抗原決定基之處理。將表現CD8之經工程改造之Jurkat細胞以及經驗證之TCR製備為效應細胞。對於目標細胞，具有特定HLA對偶基因之周邊血液單核細胞(PBMC)用FLT3-配位體刺激隔夜，在不同情形下負載含有RAS-G12V抗原決定基之多肽一小時，且用細胞介素成熟化。將經工程改造之Jurkat細胞及PBMC共培養48小時且由經工程改造之Jurkat細胞分泌之IL-2之含量經量測為藉由TCR識別肽之讀數。結果展示於圖 11 中。實例 8- 具有抗原決定基周圍不同情形之 RAS 突變型肽的免疫原性評估
材料： AIM V培養基(Invitrogen) 人類FLT3L，臨床前CellGenix編號1415-050儲備液50 ng/μL TNF-α，臨床前CellGenix編號1406-050儲備液10 ng/μL IL-1β，臨床前CellGenix編號1411-050儲備液10 ng/μL 來自Czech republic之PGE1或Alprostadil-Cayman，儲備液0.5μg/μL R10培養基-RPMI 1640格魯塔瑪(glutamax)+10%人類血清+1%青黴素鏈黴素(PenStrep) 20/80培養基-18% AIM V+72% RPMI 1640格魯塔瑪+10%人類血清+1%青黴素鏈黴素 IL7儲備液5 ng/μL IL15儲備液5 ng/μL程序 ： 步驟1：將5百萬個PBMC (或相關細胞)塗於具有含FLT3L之2 mL AIM V培養基的24孔盤之各孔中 步驟2：AIMV中之肽負載及成熟 1.在各別孔中混合相關肽池(除無肽條件以外)與PBMC (或相關細胞)。 2.培育1小時。 3.培育之後將成熟混合物(包括TNF-α、IL-1β、PGE1及IL-7)混合至各孔中。 步驟3：以10體積%之最終濃度將人類血清添加至各孔並混合。 步驟4：用補充有IL7+IL15之新鮮RPMI+10% HS培養基替換培養基。 步驟5：在培育期期間每1至6天用補充有IL7+IL15之新鮮20/80培養基替換培養基。 步驟6：將5百萬個PBMC (或相關細胞)塗於具有含FLT3L之2 ml AIM V培養基的新6孔盤之各孔中 步驟7：用於再刺激(新盤)之肽負載及成熟 1.在各別孔中混合相關肽池(除無肽條件以外)與PBMC (或相關細胞) 2.培育1小時。 3.培育之後將成熟混合物混合至各孔中 步驟8：再刺激： 1.對第一刺激FLT3L培養物進行計數，且添加5百萬個經培養細胞至新的再刺激盤中。 2.將培養物體積增至5 mL (AIM V)且添加500µL人類血清(10體積%) 步驟9：移除3 ml培養基且添加補充有IL7+IL15之6 ml RPMI+10% HS培養基。 步驟10：用補充有IL7+IL15之新鮮20/80培養基替換75%之培養基。 步驟11：若需要，則重複進行再刺激。 抗原特異性誘導之分析
購買MHC四聚體或現場製造，且在免疫原性分析中用於量測肽特異性T細胞擴增。為評定，根據製造商的說明書，將四聚體添加至含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉之PBS (FACS緩衝劑)中的1×105 個細胞中。細胞在暗處在室溫下培育20分鐘。接著將對T細胞標記物(諸如CD8)具有特異性之抗體添加至製造商所建議之最終濃度，且在暗處在4℃下培育細胞20分鐘。細胞用冷FACS緩衝劑洗滌且再懸浮於含有1%甲醛之緩衝劑中。在LSR Fortessa (Becton Dickinson)儀器上獲得細胞，且藉由使用FlowJo軟體(Becton Dickinson)進行分析。為了分析四聚體陽性細胞，淋巴球門取自前向及側向散佈圖。資料報導為細胞之百分比，該等細胞為CD8+/四聚物+。
肽免疫原性工作流程(亦即T細胞誘導及四聚體分析)用於評估圖 11 中所述之三個肽設計之相對免疫原性。基於3個供體之命中率，相對於中間具有抗原決定基之肽，c端具有抗原決定基的肽之免疫原性展示增加之例示性資料展示於圖 12 頂部 中。亦使用如實例2中所述之活體內小鼠疫苗接種策略評估相同的三個肽設計。相對於中間具有抗原決定基之肽，c端具有抗原決定基的肽之免疫原性展示增加之例示性資料展示於圖 12 底部 中。實例 9- 當 APC 用編碼肽之 mRNA 刺激時的高 CD8 命中率
如圖 13A 中以圖形方式展示，以串接新抗原串形式構築短聚體(9至10個胺基酸)或長聚體(25個胺基酸)。抗原序列由彩色框表示。在如藉由NetChop (一種預測人類蛋白質組之裂解的演算法)所預測之抗原序列之間添加連接子序列(K、QLGL或GVGT-表示為藍色圓圈)。若預測序列在抗原序列內裂解，則添加裂解位點以促進抗原序列之間的裂解。隨後用前述編碼多抗原之mRNA構築體核轉染PBMC且用於刺激T細胞。用疊合肽池進行並排比較，且其長度及序列與RNA串內編碼之肽相同。短及長RNA序列提高類似CD8+ T細胞對多聚體之反應(表 15 )。值得注意的是，使用編碼長聚體及短聚體之mRNA觀測到強CD8反應。表 15 -肽及RNA長聚體及短聚體介導之活化之比較
      CD8 命中率 (%) 平均新抗原 + 頻率 (CD8 細胞 %) 反應多樣性 (6 個中 ) CD4 反應
供體1 短肽 7 0.03% 1 N.A.
長肽 19 0.09% 2 0
短RNA 11 1.50% 2 N.A.
長RNA 8 0.36% 2 0
供體2 短肽 11 0.03% 2 N.A.
長肽 17 0.21% 3 1
短RNA 19 0.39% 2 N.A.
長RNA 20 0.05% 2 0
如圖 13B 中所示，Gli3抗原決定基良好地由肽以及mRNA表示及呈現，然而，負載有mRNA編碼之Gli3短聚體抗原決定基的PBMC產生更高的Gli3特異性CD8+ T細胞(如藉由多聚體分析所偵測)。多聚體分析之代表性流式細胞量測術結果展示於圖 13C 中。在此串中，Gli3序列之前的序列來自非天然情形。此可與肽相比，增強來自多肽串之Gli3之處理及呈現，且增加反應。另外，mRNA短聚體串提高ME-1 T細胞反應，此情況不存在於疊合短肽池中。在吾人之串中，ME-1在抗原決定基序列之前及之後具有裂解位點，且抗原決定基上之此增強之處理及呈現可引起優異的T細胞反應。實施例段落
一種多肽，其包含由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現之抗原決定基，該多肽具有式(I)之結構： Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 式 (I) ， 或其醫藥學上可接受之鹽， (i)其中Xm 為抗原決定基，其中各X獨立地表示由個體之基因體中之核酸序列編碼之連續胺基酸序列之一個胺基酸， 且其中，(a) MHC為I類MHC且m為8至12之整數，或 (b) MHC為II類MHC且m為9至25之整數； (ii)其中各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中Ar 之變數r為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt -Ar -Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼， (B)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為1或更大時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt 之核酸序列上游之核酸序列編碼；及 進一步其中，n為0至1000之整數； (iii)其中各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中As 之變數s為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm -As -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼， (B)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游的核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為1或更大時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼；及 進一步其中，p為0至1000之整數； 且進一步其中， 當n為0時，p為1至1000之整數；及 當p為0時，n為1至1000之整數； (iv)其中Ar 為連接子，且r為0或1； (v)其中As 為連接子，且s為0或1； (vi)其中各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游， 且其中t為0至1000之整數；及 (vii)其中各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游， 且其中u為0至1000之整數； 且進一步其中， (a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成； (b)多肽包含至少兩種不同多肽分子； (c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或 (d)當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
如段落[0487]之多肽，其中抗原決定基由II類MHC呈現。
如段落[0487]或[0488]之多肽，其中m為9至25之整數。
如段落[0487]-[0489]中之任一者之多肽，其中t為1、2、3、4或5或更大，且r為0。
如段落[0487]-[0490]中之任一者之多肽，其中u為1、2、3、4或5或更大，且s為0。
如段落[0487]-[0491]中之任一者之多肽，其中t為1或更大，r為0，且n為1至1000。
如段落[0487]-[0492]中之任一者之多肽，其中u為1或更大，s為0，且p為1至1000。
如段落[0487]-[0493]中之任一者之多肽，其中t為0。
如段落[0487]-[0494]中之任一者之多肽，其中u為0。
如段落[0487]-[0495]中之任一者之多肽，其中t至少為1且Bt 包含離胺酸。
如段落[0487]-[0496]中之任一者之多肽，其中u至少為1且Cu 包含離胺酸。
如段落[0487]-[0497]中之任一者之多肽，其中當由APC處理多肽時，Bt 自抗原決定基裂解。
如段落[0487]-[0498]中之任一者之多肽，其中當由APC處理多肽時，Cu 自抗原決定基裂解。
如段落[0487]-[0499]中之任一者之多肽，其中n為1至5或7至1000之整數。
如段落[0487]-[0500]中之任一者之多肽，其中p為1至4或6至1000之整數。
如段落[0487]-[0501]中之任一者之多肽，其中多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成。
如段落[0487]-[0502]中之任一者之多肽，其中多肽不包含由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基。
如段落[0487]-[0503]中之任一者之多肽，其中多肽包含至少兩種不同多肽分子。
如段落[0487]-[0504]中之任一者之多肽，其中抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸。
如段落[0505]之多肽，其中至少一個突變型胺基酸係由個體之基因體中之核酸序列中的插入、缺失、框移、新ORF或點突變編碼。
如段落[0487]-[0506]中之任一者之多肽，其中當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
如段落[0487]-[0507]中之任一者之多肽，其中Xm 之m為至少8且其中Xm 為AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 AA8 AA9 AA10 AA11 AA12 AA13 AA14 AA15 AA16 AA17 AA18 AA19 AA20 AA21 AA22 AA23 AA24 AA25 ，其中各AA為胺基酸，且其中AA9 、AA10 、AA11 、AA12 、AA13 、AA14 、AA15 、AA16 、AA17 、AA18 、AA19 、AA20 、AA21 、AA22 、AA23 、AA24 及AA25 中之一或多者視情況存在，且進一步其中至少一個AA為突變型胺基酸。
如段落[0487]-[0508]中之任一者之多肽，其中r為1。
如段落[0487]-[0509]中之任一者之多肽，其中s為1。
如段落[0487]-[0510]中之任一者之多肽，其中r為1且s為1。
如段落[0487]-[0511]中之任一者之多肽，其中r為0。
如段落[0487]-[0512]中之任一者之多肽，其中s為0。
如段落[0487]-[0513]中之任一者之多肽，其中r為0且s為0。
如段落[0487]-[0514]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 為非多肽連接子。
如段落[0487]-[0515]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 為化學連接子。
如段落[0487]-[0516]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 包含非天然胺基酸。
如段落[0487]-[0517]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 不包含胺基酸。
如段落[0487]-[0518]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 不包含天然胺基酸。
如段落[0487]-[0519]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 包含除肽鍵以外之鍵。
如段落[0487]-[0520]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 包含二硫鍵。
如段落[0487]-[0521]中之任一者之多肽，其中Ar 及As 不同。
如段落[0487]-[0522]中之任一者之多肽，其中Ar 及As 相同。
如段落[0487]-[0523]中之任一者之多肽，其中多肽包含親水性尾。
如段落[0487]-[0524]中之任一者之多肽，其中相較於不含有Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 之對應肽，Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 增強多肽之溶解度。
如段落[0487]-[0525]中之任一者之多肽，其中Xm 中之各X為天然胺基酸。
如段落[0487]-[0526]中之任一者之多肽，其中當由APC處理多肽時，抗原決定基自Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 釋放。
如段落[0487]-[0527]中之任一者之多肽，其中多肽在Ar 及/或As 處裂解。
如段落[0487]-[0528]中之任一者之多肽，其中在n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解；及/或 其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解。
如段落[0487]-[0528]中之任一者之多肽，其中在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或 其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之裂解，多肽以更高的速率裂解，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
如段落[0487]-[0530]中之任一者之多肽，其中在n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽在Ar 處以更高的速率裂解；及/或 其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，多肽在As 處以更高的速率裂解。
如段落[0487]-[0531]中之任一者之多肽，其中當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強；及/或 其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強。
如段落[0487]-[0531]中之任一者之多肽，其中在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或 其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，APC之抗原決定基呈現增強，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
如段落[0487]-[0533]中之任一者之多肽，其中APC將抗原決定基呈現至免疫細胞。
如段落[0487]-[0534]中之任一者之多肽，其中APC將抗原決定基呈現至吞噬細胞。
如段落[0487]-[0535]中之任一者之多肽，其中APC將抗原決定基呈現至樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜中性白血球或單核球。
如段落[0487]-[0536]中之任一者之多肽，其中APC優先或特異性地將抗原決定基呈現至免疫細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜中性白血球或單核球。
如段落[0487]-[0537]中之任一者之多肽，其中當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強；及/或 其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強。
如段落[0487]-[0537]中之任一者之多肽，其中在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或 其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
如段落[0487]-[0539]中之任一者之多肽，其中當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強；及/或 其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少一個由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之額外胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強。
如段落[0487]-[0539]中之任一者之多肽，其中在n為1至1000之整數時，相較於包含Bt -Xm 之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強，其中t為至少一且式(I)中變數Ar 之r為0；及/或 其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm -Cu 之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強，其中u為至少一且式(I)中變數As 之s為0。
如段落[0487]-[0541]中之任一者之多肽，其中Yn 及/或Zp 包含選自由聚-Lys (聚K)及聚-Arg (聚R)組成之群的序列。
如段落[0542]之多肽，其中Yn 及/或Zp 包含選自由聚K-AA-AA及聚R-AA-AA組成之群的序列，其中各AA為胺基酸或其類似物或衍生物。
如段落[0542]或[0543]之多肽，其中聚K包含聚-L-Lys。
如段落[0542]或[0543]之多肽，其中聚R包含聚-L-Arg。
如段落[0542]-[0545]中之任一者之多肽，其中聚K或聚R分別包含至少三個或四個連續離胺酸或精胺酸殘基。
如段落[0487]-[0546]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 選自由以下組成之群：二硫基；對胺基苯甲氧基羰基(PABC)；及AA-AA-PABC，其中各AA為胺基酸或其類似物或衍生物。
如段落[0547]之多肽，其中AA-AA-PABC係選自由以下組成之群：Ala-Lys-PABC、Val-Cit-PABC及Phe-Lys-PABC。
如段落[0487]-[0546]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 為
Figure 02_image023
式 (II) 。
如段落[0487]-[0546]中之任一者之多肽，其中Ar 及/或As 為
Figure 02_image025
式 (III) 或
Figure 02_image027
式 (IV) ， 其中， R1 及R2 獨立地為H或(C1 -C6 )烷基； j為1或2； G1 為H或COOH；及 i為1、2、3、4或5。
如段落[0487]-[0550]中之任一者之多肽，其中多肽為泛素化的。
如段落[0551]之多肽，其中多肽在裂解之前經泛素化。
如段落[0551]或[0552]之多肽，其中多肽在離胺酸殘基上泛素化。
如段落[0487]-[0553]中之任一者之多肽，其中多肽在個體中由APC處理之前或由APC內化之前不裂解。
如段落[0487]-[0554]中之任一者之多肽，其中多肽在個體中由APC處理之前或由APC內化之前不在血液中裂解。
如段落[0487]-[0555]中之任一者之多肽，其中多肽不由血液中之蛋白酶裂解。
如段落[0487]-[0556]中之任一者之多肽，其中多肽不由纖維蛋白溶酶、血漿激肽釋放素、組織激肽釋放素、凝血酶或凝血因子裂解。
如段落[0487]-[0557]中之任一者之多肽，其中多肽在人類血漿中為穩定的。
如段落[0487]-[0558]中之任一者之多肽，其中多肽在人類血漿中具有1小時至5天之半衰期。
如段落[0487]-[0559]中之任一者之多肽，其中多肽在溶酶體、內溶酶體、內體或內質網(ER)中裂解。
如段落[0487]-[0560]中之任一者之多肽，其中多肽藉由胺基肽酶裂解。
如段落[0561]之多肽，其中胺基肽酶為胰島素調節之胺基肽酶(IRAP)或內質網胺基肽酶(ERAP)。
如段落[0487]-[0560]中之任一者之多肽，其中多肽藉由蛋白酶體及/或免疫蛋白酶體之胰蛋白酶樣域處理。
如段落[0563]之多肽，其中胰蛋白酶樣域包含胰蛋白酶樣活性、胰凝乳蛋白酶樣活性或肽基麩胺醯肽水解酶(PGPH)活性。
如段落[0487]-[0560]中之任一者之多肽，其中多肽藉由蛋白酶裂解。
如段落[0565]之多肽，其中蛋白酶為胰蛋白酶樣蛋白酶、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶或肽基麩胺醯肽水解酶(PGPH)。
如段落[0565]之多肽，其中蛋白酶選自由以下組成之群：天冬醯胺肽解離酶、天冬胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、麩胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶及蘇胺酸蛋白酶。
如段落[0567]之多肽，其中蛋白酶為選自由以下組成之群的半胱胺酸蛋白酶：鈣蛋白酶、凋亡蛋白酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶F、組織蛋白酶H、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L1、組織蛋白酶L2、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶W及組織蛋白酶Z。
如段落[0487]-[0568]中之任一者之多肽，其中個體為哺乳動物。
如段落[0487]-[0569]中之任一者之多肽，其中個體為人類。
如段落[0487]-[0570]中之任一者之多肽，其中抗原決定基結合至I類MHC HLA。
如段落[0571]之多肽，其中抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至I類MHC HLA。
如段落[0571]之多肽，其中抗原決定基以0.1 nM至2000 nM之親和力結合至I類MHC HLA。
如段落[0487]-[0570]中之任一者之多肽，其中抗原決定基結合至II類MHC HLA。
如段落[0574]之多肽，其中抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至II類MHC HLA。
如段落[0574]之多肽，其中抗原決定基以0.1 nM至2000 nM、1 nM至1000 nM、10 nM至500 nM或小於1000 nM之親和力結合至II類MHC HLA。
如段落[0487]-[0576]中之任一者之多肽，其中n為1至20或5至12之整數。
如段落[0487]-[0577]中之任一者之多肽，其中p為1至20或5至12之整數。
如段落[0487]-[0578]中之任一者之多肽，其中抗原決定基包含腫瘤特異性抗原決定基。
如段落[0487]-[0579]中之任一者之多肽，其中多肽包含至少兩種多肽，其中至少兩種多肽中之兩者或更多者具有相同式Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 。
如段落[0580]之多肽，其中多肽包含至少兩種多肽分子。
如段落[0580]或[0581]之多肽，其中至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Xm 相同。
如段落[0580]-[0582]中之任一者之多肽，其中至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Yn 相同。
如段落[0580]-[0583]中之任一者之多肽，其中至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Zp 相同。
如段落[0580]-[0584]中之任一者之多肽，其中至少兩種多肽或多肽分子中之兩者或更多者的Ar 及/或As 不同。
如段落[0580]-[0585]中之任一者之多肽，其中至少兩種多肽或多肽分子中之第一者的r=0，且至少兩種多肽或多肽分子中之第二者的r=1。
如段落[0580]-[0586]中之任一者之多肽，其中至少兩種多肽或多肽分子中之第一者的s=0，且至少兩種多肽或多肽分子中之第二者的s=1。
如段落[0487]-[0587]中之任一者之多肽，其中多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種多肽或多肽分子。
如段落[0487]-[0588]中之任一者之多肽，其中抗原決定基為RAS抗原決定基。
如段落[0589]之多肽，其中抗原決定基包含突變型RAS肽序列，其包含在G12、G13或Q61處包含突變之突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸及在G12、G13或Q61處之突變。
如段落[0590]之多肽，其中包含G12、G13或Q61處之突變的突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。
如段落[0590]或[0591]之多肽，其中G12、G13或Q61處之突變包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。
如段落[0487]-[0592]中之任一者之多肽，其中Yn 及/或Zp 包含諸如pp65、HIV或MART-1的CMV之蛋白質之胺基酸序列。
如段落[0487]-[0593]中之任一者之多肽，其中n及/或p為1、2、3或大於3之整數。
如段落[0487]-[0594]中之任一者之多肽，其中抗原決定基以小於10µM、小於1µM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM、小於250 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於100 nM或小於50 nM之親和力結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。
如段落[0487]-[0595]中之任一者之多肽，其中抗原決定基以大於24小時、大於12小時、大於9小時、大於6小時、大於5小時、大於4小時、大於3小時、大於2小時、大於1小時、大於45分鐘、大於30分鐘、大於15分鐘或大於10分鐘的穩定性結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。
如段落[0595]或[0596]之多肽，其中HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A02:01對偶基因、HLA-A03:01對偶基因、HLA-A11:01對偶基因、HLA-A03:02對偶基因、HLA-A30:01對偶基因、HLA-A31:01對偶基因、HLA-A33:01對偶基因、HLA-A33:03對偶基因、HLA-A68:01對偶基因、HLA-A74:01對偶基因及/或HLA-C08:02對偶基因及其任何組合。
如段落[0487]-[0597]中之任一者之多肽，其中抗原決定基包含以下之胺基酸序列：GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE。
如段落[0487]-[0598]中之任一者之多肽，其中Yn 包含以下之胺基酸序列：IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYKLV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV。
如段落[0487]-[0599]中之任一者之多肽，其中Zp 包含以下之胺基酸序列：KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE。
如段落[0487]-[0588]中之任一者之多肽，其中抗原決定基不為RAS抗原決定基。
如段落[0487]-[0601]中之任一者之多肽，其中多肽不為KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
如段落[0487]-[0588]中之任一者之多肽，其中抗原決定基為GATA3抗原決定基。
如段落[0603]之多肽，其中GATA3抗原決定基包含以下之胺基酸序列：MLTGPPARV、SMLTGPPARV、VLPEPHLAL、KPKRDGYMF、KPKRDGYMFL、ESKIMFATL、KRDGYMFL、PAVPFDLHF、AESKIMFATL、FATLQRSSL、ARVPAVPFD、IMKPKRDGY、DGYMFLKA、MFLKAESKIMF、LTGPPARV、ARVPAVPF、SMLTGPPAR、RVPAVPFDL或LTGPPARVP。
一種細胞，其包含如段落[0487]-[0604]中之任一者之多肽。
如段落[0605]之細胞，其中細胞為抗原呈現細胞。
如段落[0606]之細胞，其中細胞為樹突狀細胞。
如段落[0605]之細胞，其中細胞為成熟抗原呈現細胞。
一種裂解多肽之方法，其包含使如段落[0487]至[0604]中之任一者之多肽與APC接觸。
如段落[0609]之方法，其中方法在活體內進行。
如段落[0609]之方法，其中方法離體進行。
一種製造多肽之方法，該方法包含將Yn -Ar 及/或As -Zp 連接至包含抗原決定基序列之序列，其中抗原決定基序列由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現；且其中 (i)各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列上游的核酸序列編碼， 且其中，n為0至1000之整數； (ii)各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼抗原決定基之核酸序列下游的核酸序列編碼， 且其中，p為0至1000之整數；及 (iii) Ar 為連接子且As 為連接子，其中r及s中之至少一者為1； 且進一步其中， (a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成； (b)多肽包含至少兩種不同多肽分子； (c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或(d)當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
一種製造多肽之方法，其包含將Yn 連接至Bt -Xm 及/或Zp 連接至Xm -Cu ，其中Xm 為由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現之抗原決定基序列；且其中 (i)各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游， 且其中t為0至1000之整數； (ii)各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游， 且其中u為0至1000之整數； (iii)各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt -Xm 之核酸序列上游的核酸序列編碼， 且其中，n為0至1000之整數；及 (iv)各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼， 且其中，p為0至1000之整數； 且進一步其中， (a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成； (b)多肽包含至少兩種不同多肽分子； (c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或 (d)當由APC處理多肽時，Yn -Bt 及/或Cu -Zp 自抗原決定基裂解。
如段落[0612]或[0613]之方法，其中當n為0時，p為1至1000之整數，且當p為0時，n為1至1000之整數。
如段落[0612]-[0614]中之任一者之方法，其中各X獨立地表示包含由個體之基因體中之核酸序列編碼之任何連續胺基酸序列的肽序列之胺基酸，且其中(a) MHC為I類MHC且m為8至12之整數或(b) MHC為II類MHC且m為9至25之整數。
一種醫藥組合物，其包含如段落[0487]-[0604]中任一者之多肽及醫藥學上可接受之賦形劑。
如段落[0616]之醫藥組合物，其進一步包含免疫調節劑或佐劑。
如段落[0617]之醫藥組合物，其中免疫調節劑或佐劑係選自由以下組成之群：聚-ICLC、1018 ISS、鋁鹽、安利瓦、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING促效劑、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS貼劑、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、孟塔納IMS 1312、孟塔納ISA 206、孟塔納ISA 50V、孟塔納ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel®、載體系統、PLGA微粒、雷西莫特、SRL172、病毒顆粒及其他病毒樣粒子、YF-17D、VEGF捕捉劑、R848、β-葡聚糖、Pam2Cys、Pam3Cys、Pam3C-SK4及Aquila之QS21刺激子。
如段落[0617]或[0618]之醫藥組合物，其中免疫調節劑或佐劑包含聚-ICLC。
如段落[0616]-[0619]中之任一者之醫藥組合物，其中醫藥組合物為疫苗組合物。
如段落[0616]-[0620]中之任一者之醫藥組合物，其中醫藥組合物為水性或液體。
如段落[0616]-[0621]中之任一者之醫藥組合物，其中抗原決定基以1 ng至10 mg或5µg至1.5 mg之量存在於醫藥組合物中。
如段落[0616]-[0622]中之任一者之醫藥組合物，其進一步包含DMSO。
如段落[0616]-[0623]中之任一者之醫藥組合物，其中醫藥學上可接受之賦形劑包含水。
如段落[0616]-[0624]中之任一者之醫藥組合物，其中醫藥組合物包含以小於1 mM或大於1 mM之濃度存在之pH調節劑。
如段落[0625]之醫藥組合物，其中pH調節劑為二羧酸鹽或三羧酸鹽。
如段落[0625]之醫藥組合物，其中pH調節劑為丁二酸之二羧酸鹽，或二丁二酸鹽。
如段落[0625]之醫藥組合物，其中pH調節劑為檸檬酸之三羧酸鹽或三檸檬酸鹽。
如段落[0625]之醫藥組合物，其中pH調節劑為丁二酸二鈉。
如段落[0627]之醫藥組合物，其中丁二酸之二羧酸鹽或二丁二酸鹽以0.1 mM至1 mM之濃度存在於醫藥組合物中。
如段落[0627]之醫藥組合物，其中丁二酸之二羧酸鹽或二丁二酸鹽以1 mM至5 mM之濃度存在於醫藥組合物中。
如段落[0616]-[0631]中之任一者之醫藥組合物，其中當向個體投與時，對抗原決定基之免疫反應增加。
一種治療疾病或病狀之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如段落[0616]-[0632]中之任一者之醫藥組合物。
如段落[0633]之方法，其中疾病或病狀為癌症。
如段落[0634]之方法，其中癌症係選自由以下組成之群：肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、子宮癌及肝癌。
如段落[0633]-[0635]中之任一者之方法，其中投與包含皮內注射、鼻內噴霧施加、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射。
一種個體防治之方法，其包含使個體之細胞與如段落[0487]-[0608]或[0616]-[0632]中之任一者之多肽、細胞或醫藥組合物接觸。
一種方法，其包含鑑別由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基及產生包含抗原決定基之多肽，其中多肽具有式(I)之結構： Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 式 (I) ， 或其醫藥學上可接受之鹽， (i)其中Xm 為抗原決定基，其中各X獨立地表示由個體之基因體中之核酸序列編碼之連續胺基酸序列之一個胺基酸， 且其中，(a) MHC為I類MHC且m為8至12之整數，或 (b) MHC為II類MHC且m為9至25之整數； (ii)其中各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中Ar 之變數r為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt -Ar -Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼， (B)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為0時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為1或更大時，Yn 不由個體之基因體中緊接在編碼Bt 之核酸序列上游之核酸序列編碼；及 進一步其中，n為0至1000之整數； (iii)其中各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中As 之變數s為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm -As -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼， (B)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為0時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游的核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為1或更大時，Zp 不由個體之基因體中緊接在編碼Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼；及 進一步其中，p為0至1000之整數； 且進一步其中， 當n為0時，p為1至1000之整數；及 當p為0時，n為1至1000之整數； (iv)其中Ar 為連接子，且r為0或1； (v)其中As 為連接子，且s為0或1； (vi)其中各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游， 且其中t為0至1000之整數；及 (vii)其中各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游， 且其中u為0至1000之整數； 且進一步其中， (a)多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成； (b)多肽包含至少兩種不同多肽分子； (c)抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或 (d)當由APC處理多肽時，Yn 及/或Zp 自抗原決定基裂解。
如段落[0638]之方法，其中鑑別包含自個體之腫瘤細胞定序的核酸序列池中選擇複數個核酸序列，該等核酸序列編碼複數個候選肽序列，其包含不存在於自個體之非腫瘤細胞定序的核酸序列池中的一或多個不同突變，其中自個體之腫瘤細胞定序之核酸序列池及自個體之非腫瘤細胞定序之核酸序列池係藉由全基因體定序或全外顯子組定序來定序。
如段落[0638]或[0639]之方法，其中鑑別進一步包含藉由HLA肽結合分析來預測或量測複數個候選肽序列中哪些候選肽序列與由相同個體之HLA對偶基因所編碼之蛋白質形成複合物。
如段落[0638]-[0640]中之任一者之方法，其中鑑別進一步包含基於HLA肽結合分析，選擇複數種所選腫瘤特異性肽或一或多種編碼來自候選肽序列之複數種所選腫瘤特異性肽的聚核苷酸。
如段落[0638]-[0641]中之任一者之方法，其進一步包含向個體投與多肽。
如段落[0642]之方法，其中投與包含皮內注射、鼻內噴霧施加、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射。
如段落[0638]-[0643]中之任一者之方法，其中在個體中引發免疫反應。
如段落[0638]-[0644]中之任一者之方法，其中由個體之腫瘤細胞表現之抗原決定基為新抗原、腫瘤相關抗原、突變型腫瘤相關抗原，及/或其中與抗原決定基在個體之正常細胞中之表現相比，抗原決定基之表現在個體之腫瘤細胞中更高。
本發明之特徵在隨附申請專利範圍中細緻闡述。將參考闡述利用本發明之原理的說明性實施例及其隨附圖式之以下詳細描述，獲得對本發明之特徵及優勢的較佳理解：
圖 1 描繪藉由抗原呈現細胞(APC)的HLA對偶基因X上之抗原決定基X之簡化例示性抗原決定基處理及呈現。在天然情形下，肽包含天然側接抗原決定基序列之胺基酸或胺基酸序列。在合理情形下，肽在抗原決定基序列之N端及/或C端包含不由編碼抗原決定基序列之基因體編碼之胺基酸或胺基酸序列，及/或連接子。
圖 2 說明含有組織蛋白酶B可裂解連接子之多肽的例示性組織蛋白酶B裂解。
圖 3 描繪活體外篩選多肽以用於使用T細胞受體(TCR)轉導之細胞處理及呈現抗原決定基的實驗設計之圖式(結果展示於圖 4 及圖 5 中)。
圖 4 描繪展現在與等量負載有僅含有KRAS-G12V抗原決定基之肽或含有KRAS-G12V抗原決定基及N端及C端上天然側接KRAS-G12V抗原決定基之額外胺基酸序列之肽的周邊血液單核細胞(PBMC)一起共培養48小時之後，KRAS特異性Jurkat細胞分泌之IL-2含量(pg/mL)的圖式。
圖 5 描繪展現在與等量負載有僅含有KRAS-G12V抗原決定基之肽，含有KRAS-G12V抗原決定基及N端及C端上天然側接KRAS-G12V抗原決定基之額外胺基酸序列之肽，或含有KRAS-G12V抗原決定基及合理設計為N端及/或C端上非天然側接KRAS-G12V抗原決定基(合理情形)的額外胺基酸序列之肽的周邊血液單核細胞(PBMC)一起共培養48小時之後，KRAS特異性Jurkat細胞分泌之IL-2含量(pg/mL)的圖式。
圖 6 描繪免疫原性研究之實驗設計之圖式。在第0、7及14天用各種多肽設計對小鼠免疫接種，且在第7、14及21天抽血以評估抗原特異性CD8+ T細胞反應(結果展示於圖 7 至圖 9 中)。
圖 7 描繪展現總免疫反應之圖式(7A ：H-2Kb ，7B ：H-2Db ，7C ：總)。
圖 8 描繪展現用K4-抗原決定基免疫接種增強對呈現H-2Kb 抗原決定基之免疫反應的圖式(8A ：Alg8，8B ：Lama4)。
圖 9 描繪展現用K4-抗原決定基免疫接種增加對呈現H-2Db 抗原決定基之免疫反應的圖式(9A ：Reps1，9B ：Adpgk，9C ：Irgq，9D ：Obsl1)。
圖 10 描繪展現在與負載有僅含有TMPRSS2::ERG抗原決定基之肽，或經編碼天然情形下含有TMPRSS2::ERG抗原決定基之肽(亦即肽額外包含N端及/或C端上天然側接抗原決定基序列之胺基酸或胺基酸序列)之質體，編碼非天然情形下含有TMPRSS2::ERG抗原決定基之肽(亦即肽額外包含非天然側接抗原決定基序列之胺基酸或胺基酸序列)之質體，或編碼非天然情形下不相關抗原決定基之質體(作為對照組)轉導的293T細胞一起共培養(Jurkat與293T細胞比率5:1) 24小時之後，Jurkat細胞分泌之IL-2含量(pg/mL)的圖式。
圖 11 描繪在與經結合至結合於由HLA-A11:01對偶基因編碼之MHC之帶下劃線的RAS-G12V抗原決定基的TCR轉導之Jurkat細胞一起共培養之後，與增加量之指定RAS-G12V突變型肽接觸之FLT3L處理之PBMC中之IL-2濃度(pg/mL)相對於肽濃度(nM)的圖式。
圖 12 描繪活體外使用來自健康供體之PBMC (頂部)及活體內使用經肽免疫接種之HLA-A11:01轉殖基因小鼠(底部)說明來自圖 11 之指定RAS-G12V突變型肽之免疫原性的資料。
圖 13A 描繪使用用於在細胞中表現之短聚體(9至10個胺基酸，頂部)及長聚體(25個胺基酸，底部)的mRNA構築體之例示性示意圖。
圖 13B 描繪作為總CD8+細胞之百分比的多聚體特異性CD8+細胞之例示性圖式。展示用於多聚體分析之抗原。
圖 13C 描繪多聚體陽性CD8+ T細胞之偵測之例示性流式細胞量測術分析，其比較短聚體(9至10個胺基酸)及長聚體(25個胺基酸)肽刺激之APC及含有編碼相同短聚體(9至10個胺基酸)及長聚體(25個胺基酸)肽之RNA的APC。
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Claims (48)

  1. 一種多肽，其包含由抗原呈現細胞(APC)之I類MHC或II類MHC呈現之抗原決定基，該多肽具有式(I)之結構： Yn -Bt -Ar -Xm -As -Cu -Zp 式 (I) ， 或其醫藥學上可接受之鹽， (i)其中Xm 為該抗原決定基，其中各X獨立地表示由個體之基因體中之核酸序列編碼之連續胺基酸序列之一個胺基酸， 且其中，(a)該MHC為I類MHC且m為8至12之整數，或 (b)該MHC為II類MHC且m為9至25之整數； (ii)其中各Y獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中Ar 之變數r為0時，Yn 不由該個體之基因體中緊接在編碼Bt -Ar -Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼， (B)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為0時，Yn 不由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中Ar 之變數r為1且式(I)中Bt 之變數t為1或更大時，Yn 不由該個體之基因體中緊接在編碼Bt 之核酸序列上游之核酸序列編碼；及 進一步其中n為0至1000之整數； (iii)其中各Z獨立地為胺基酸、其類似物或衍生物，且其中： (A)當式(I)中As 之變數s為0時，Zp 不由該個體之基因體中緊接在編碼Xm -As -Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼， (B)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為0時，Zp 不由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游的核酸序列編碼，或 (C)當式(I)中As 之變數s為1且式(I)中Cu 之變數u為1或更大時，Zp 不由該個體之基因體中緊接在編碼Cu 之核酸序列下游的核酸序列編碼；及 進一步其中p為0至1000之整數； 且進一步其中， 當n為0時，p為1至1000之整數；及 當p為0時，n為1至1000之整數； (iv)其中Ar 為連接子，且r為0或1； (v)其中As 為連接子，且s為0或1； (vi)其中各B獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游， 且其中t為0至1000之整數；及 (vii)其中各C獨立地表示由該個體之基因體中之核酸序列編碼的一個胺基酸，該核酸序列在該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游， 且其中u為0至1000之整數； 且進一步其中， (a)該多肽不由I類MHC呈現之四種不同抗原決定基組成； (b)該多肽包含至少兩種不同多肽分子； (c)該抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸；及/或 (d)當由該APC處理該多肽時，Yn 及/或Zp 自該抗原決定基裂解。
  2. 如請求項1之多肽，其中該抗原決定基係由II類MHC呈現且m為9至25之整數。
  3. 如請求項1或2之多肽，其中相較於不含Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 之對應肽，Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 增強該多肽之溶解度。
  4. 如請求項1至3中任一項之多肽，其中當該多肽由該APC處理時，該抗原決定基自Yn -Bt -Ar 及/或As -Cu -Zp 釋放。
  5. 如請求項1至4中任一項之多肽，其中在n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，該多肽以更高的速率裂解；及/或 其中在p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之裂解，該多肽以更高的速率裂解。
  6. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，該APC之抗原決定基呈現增強；及/或 其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之抗原決定基呈現，該APC之抗原決定基呈現增強。
  7. 如請求項1至6中任一項之多肽，其中該APC將該抗原決定基呈現至免疫細胞。
  8. 如請求項1至7中任一項之多肽，其中當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強；及/或 其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之免疫原性，免疫原性增強。
  9. 如請求項1至8中任一項之多肽，其中當n為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列上游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強；及/或 其中當p為1至1000之整數時，相較於包含Xm 及至少另一個由該個體之基因體中緊接在編碼Xm 之核酸序列下游之核酸序列編碼之胺基酸之相同長度的對應多肽之抗腫瘤活性，抗腫瘤活性增強。
  10. 如請求項1至9中任一項之多肽，其中Yn 及/或Zp 包含選自由以下組成之群的序列：離胺酸(Lys)、聚-Lys (聚K)及聚-Arg (聚R)。
  11. 如請求項10之多肽，其中該聚K包含聚-L-Lys。
  12. 如請求項10之多肽，其中該聚R包含聚-L-Arg。
  13. 如請求項10至12中任一項之多肽，其中該聚K或聚R分別包含至少兩個、三個或四個連續離胺酸或精胺酸殘基。
  14. 如請求項1至13中任一項之多肽，其中該抗原決定基結合至MHC II類HLA。
  15. 如請求項14之多肽，其中該抗原決定基以10分鐘至24小時之穩定性結合至該MHC　II類HLA。
  16. 如請求項14之多肽，其中該抗原決定基以0.1 nM至2000 nM、1 nM至1000 nM、10 nM至500 nM或小於1000 nM之親和力結合至該MHC　II類HLA。
  17. 如請求項1至16中任一項之多肽，其中該多肽在個體中由APC處理之前或由APC內化之前不裂解。
  18. 如請求項1至17中任一項之多肽，其中該多肽在人類血漿中穩定。
  19. 如請求項1至18中任一項之多肽，其中該多肽在人類血漿中具有1小時至5天之半衰期。
  20. 如請求項1至19中任一項之多肽，其中該個體為人類。
  21. 如請求項1至20中任一項之多肽，其中該抗原決定基以小於10µM、小於1µM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM、小於250 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於100 nM或小於50 nM之親和力結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。
  22. 如請求項1至21中任一項之多肽，其中該抗原決定基以大於24小時、大於12小時、大於9小時、大於6小時、大於5小時、大於4小時、大於3小時、大於2小時、大於1小時、大於45分鐘、大於30分鐘、大於15分鐘或大於10分鐘的穩定性結合至由HLA對偶基因編碼之蛋白質。
  23. 如請求項21或22之多肽，其中該HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A02:01對偶基因、HLA-A03:01對偶基因、HLA-A11:01對偶基因、HLA-A03:02對偶基因、HLA-A30:01對偶基因、HLA-A31:01對偶基因、HLA-A33:01對偶基因、HLA-A33:03對偶基因、HLA-A68:01對偶基因、HLA-A74:01對偶基因，及/或HLA-C08:02對偶基因，及其任何組合。
  24. 如請求項1至23中任一項之多肽，其中該抗原決定基包含腫瘤特異性抗原決定基。
  25. 如請求項1至24中任一項之多肽，其中該抗原決定基包含至少一個突變型胺基酸。
  26. 如請求項25之多肽，其中該至少一個突變型胺基酸係由該個體之基因體中之該核酸序列中的插入、缺失、框移、新ORF (neoORF)或點突變編碼。
  27. 如請求項1至26中任一項之多肽，其中該抗原決定基為RAS抗原決定基。
  28. 如請求項27之多肽，其中該抗原決定基包含突變型RAS肽序列，其包含在G12、G13或Q61包含突變之突變型RAS蛋白質之至少8個連續胺基酸及在G12、G13或Q61之該突變。
  29. 如請求項28之多肽，其中包含在G12、G13或Q61突變的突變型RAS蛋白質之該至少8個連續胺基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。
  30. 如請求項28或29之多肽，其中G12、G13或Q61之該突變包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突變。
  31. 如請求項27至30中任一項之多肽，其中該RAS抗原決定基包含以下之胺基酸序列：VVVGAAGVGK、VVVGAAGVG、VVVGAAGV、 VVGAAGVGK、VVGAAGVG、VGAAGVGK、VVVGACGVGK、VVVGACGVG、VVVGACGV、VVGACGVGK、VVGACGVG、VGACGVGK、VVVGADGVGK、VVVGADGVG、VVVGADGV、VVGADGVGK、VVGADGVG、VGADGVGK、VVVGARGVGK、VVVGARGVG、VVVGARGV、VVGARGVGK、VVGARGVG、VGARGVGK、VVVGASGVGK、VVVGASGVG、VVVGASGV、VVGASGVGK、VVGASGVG、VGASGVGK、VVVGAVGVGK、VVVGAVGVG、VVVGAVGV、VVGAVGVGK、VVGAVGVG或VGAVGVGK。
  32. 如請求項1至31中任一項之多肽，其中Yn 包含以下之胺基酸序列：K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KTEY、KTEYK、KTEYKL、KTEYKLV、KTEYKLVV、KTEYKLVVV、KKTEY、KKTEYK、KKTEYKL、KKTEYKLV、KKTEYKLVV、KKTEYKLVVV、KKKTEY、KKKTEYK、KKKTEYKL、KKKTEYKLV、KKKTEYKLVV、KKKTEYKLVVV、KKKKTEY、KKKKTEYK、KKKKTEYKL、KKKKTEYKLV、KKKKTEYKLVV、KKKKTEYKLVVV、IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYK、TEYKL、TEYKLV、TEYKLVV、TEYKLVVV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV。
  33. 如請求項1至32中任一項之多肽，其中Zp 包含以下之胺基酸序列：K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、SALTIK、SALTIQLK、GKSALTIQLK、GKSALTIK、SALTIKK、SALTIQLKK、GKSALTIQLKK、GKSALTIKK、SALTIKKK、SALTIQLKKK、GKSALTIQLKKK、GKSALTIKKK、SALTIKKKK、SALTIQLKKKK、GKSALTIQLKKKK、GKSALTI、KKKK、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE。
  34. 如請求項1至33中任一項之多肽，其中該多肽包含以下之胺基酸序列：KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK或TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK。
  35. 如請求項1至26中任一項之多肽，其中該抗原決定基不為RAS抗原決定基。
  36. 如請求項1至35中任一項之多肽，其中該多肽不為 KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
  37. 如請求項1至36中任一項之多肽，其中Yn 及/或Zp 包含與衍生該抗原決定基之蛋白質不同的蛋白質之胺基酸序列。
  38. 如請求項1至37中任一項之多肽，其中Yn 及/或Zp 包含諸如pp65、HIV或MART-1的CMV之蛋白質之胺基酸序列。
  39. 如請求項1至38中任一項之多肽，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大於20之整數。
  40. 如請求項1至39中任一項之多肽，其中p為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大於20之整數。
  41. 一種聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至40中任一項之多肽的序列。
  42. 如請求項41之聚核苷酸，其中該聚核苷酸為mRNA。
  43. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至40中任一項之多肽或如請求項41或42之聚核苷酸；及醫藥學上可接受之賦形劑。
  44. 一種治療疾病或病狀之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如請求項43之醫藥組合物。
  45. 如請求項44之方法，其中該疾病或病狀為選自由以下組成之群的癌症：肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、子宮癌、前列腺癌、肝癌、膽道惡性腫瘤、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝癌、骨髓性白血病及乳癌。
  46. 如請求項44或45之方法，其中投與包含皮內注射、鼻內噴霧施用、肌肉內注射、腹膜內注射、靜脈內注射、經口投與或皮下注射。
  47. 一種製備抗原特異性T細胞之方法，其包含用包含如請求項1至40中任一項之多肽或如請求項41或42之聚核苷酸的抗原呈現細胞刺激T細胞。
  48. 如請求項47之方法，其中該方法離體(ex vivo)進行。
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