TW202117326A - 尾部纖維蛋白作為預防鮑氏不動桿菌感染之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關一種尾部纖維蛋白作為預防鮑氏不動桿菌感染之用途，藉由於載體(醫院內之相關管路、器材)上塗佈或噴霧取自噬菌體之尾部纖維蛋白，來抑制其鮑氏不動桿菌之生物膜之生成，並以此來徹底預防鮑氏不動桿菌感染的發生。
Description
本發明係有關尾部纖維蛋白之用途，特別是作為預防鮑氏不動桿菌感染之用途。
鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii），簡稱AB菌。在革蘭氏染色下呈現陰性球桿狀。本身並不具鞭毛，因而移動性不高。但由於生命力強，則可廣泛地長久存在於土壤、水、食物等自然環境中，甚至是人類的皮膚或黏膜上。
且，鮑氏不動桿菌亦能和人體和平共存，通常存在於皮膚、腋下、結膜、會陰、口腔、上呼吸道及下腸胃道，有時也存於咽喉和唾液、黏膜之中。正常情況下，約有10﹪健康人之正常菌叢中都含有此菌。
再者，因為鮑氏不動桿菌極為親近水，特別喜歡溫暖潮濕的環境。除了在加護病房內與水有關的管路，包括呼吸器管路、導尿管、胸管、中央靜脈導管和手術引流管…等等外，在醫院中之推車、水槽、病床及床墊，甚至於空氣中等，都是鮑氏不動桿菌最常出現的地方。
在鮑氏不動桿菌為人類所發現之初，大多數科學家認為並不具致病力。隨著醫療科技的發達，為了救治重症患者而插入的各種侵入性管路，提供鮑氏不動桿菌絕佳的生存條件，再加上重症病患的免疫力降低，臨床上逐漸發生鮑氏不動桿菌感染的案例。
而重症病患是否受到鮑氏不動桿菌的感染，則可以從痰液、尿液、血液及傷口滲出液等進行培養來檢驗。如果在病患痰液中檢測出鮑氏不動桿菌，則有可能是單純受到汙染，並不一定需要治療。但若是從病患的尿液、血液或傷口滲出液等檢測出鮑氏不動桿菌，則表示病患已受到感染。尤其是當在血液中檢測出來的病患，其感染情況最為嚴重，甚至有引發敗血症致死的可能。
至於，會不會受到鮑氏不動桿菌的感染，則與患者的免疫力、疾病嚴重程度有關。所以當病情越重、長期臥床、住院時間越久、戴呼吸器以及使用的管子越多時，就越容易感染。因此，加護病房裡的重症病患往往就是院內感染的高危險群。
就，一般抵抗力正常者並不會感染鮑氏不動桿菌，但由於鮑氏不動桿菌是透過接觸來進行傳染。雖不像飛沫傳染那麼可怕，但仍會藉由抵抗力正常者或一般醫療器材來進行傳播。尤其醫護人員，如果忘了洗手就去照顧下一位病人，就更容易傳染鮑氏不動桿菌。
而，當感染鮑氏不動桿菌時，通常會引起菌血症、敗血症、肺炎、腦膜炎、腹膜炎、心內膜炎以及泌尿道和皮膚感染等，嚴重的話，甚至會造成死亡，其致死率高達20~50%。
再者，鮑氏不動桿菌因為抗生素的濫用，導致鮑氏不動桿菌產生抗藥性。在抗生素的使用上也必須斟酌，因過去大量使用抗生素已造成越來越多鮑氏不動桿菌抗藥性菌株產生，將會使後續的抗藥性鮑氏不動桿菌之治療越加困難。
因此，對於院內鮑氏不動桿菌的感染，其徹底預防的方式會遠勝於後續的治療方法。為此，院內鮑氏不動桿菌對於一般醫療器材的感染之預防方式，為本領域技術人員所欲解決的問題。
本發明之主要目的，係提供一種尾部纖維蛋白作為預防鮑氏不動桿菌感染之用途，藉由於載體(醫院內之相關管路、器材)上設置取自噬菌體(ϕAB6)之尾部纖維蛋白，來降解、減少以及防止鮑氏不動桿菌之生物膜，以此來預防鮑氏不動桿菌感染載體。
為了達到上述之目的，本發明揭示了一種尾部纖維蛋白作為預防鮑氏不動桿菌感染之用途，其中該尾部纖維蛋白之序列为SED ID NO：1所示的氨基酸序列，並設置於一載體上，以預防該鮑氏不動桿菌感染該載體。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該尾部纖維蛋白係取自一噬菌體。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該鮑氏不動桿菌係一鮑氏不動桿菌54149 菌株。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該尾部纖維蛋白係降解該鮑氏不動桿菌之一生物膜。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該尾部纖維蛋白係抑制該鮑氏不動桿菌之一生物膜之生成。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該尾部纖維蛋白係減少該鮑氏不動桿菌之一生物膜之厚度。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該尾部纖維蛋白係藉由一塗佈方式設置於該載體上。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該尾部纖維蛋白係藉由一噴霧方式設置於該載體上。
本發明提供一實施例，其內容在於用途，其中該載體係選自一呼吸器管路、一導尿管、一胸管、一中央靜脈導管或一手術引流管。
為使貴審查委員對本發明之特徵及所達成之功效有更進一步之瞭解與認識，謹佐以實施例及配合說明，說明如後：
有鑑於醫院中經常爆發鮑氏不動桿菌的感染，進而危及重症病患之生命的影響。據此，本發明遂提出一種尾部纖維蛋白作為預防鮑氏不動桿菌感染之用途，以解決習知技術所造成之問題。
以下將進一步說明本發明之其包含之特性、所搭配之結構及方法：
首先，本發明所使用之一尾部纖維蛋白(簡稱為TFP)取自一噬菌體(為ϕAB6)，其序列为SED ID NO：1所示的氨基酸序列，其本發明之SED ID NO：1所示的氨基酸序列如下：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSEAAQEAANAAEVAASQTQYYLKYFNPEIVYPKNARIMLDNGDIVRSTVVNNTSNPNVDMTGWVKVSSVSQIFDETYNITQSVINGNLITVDNFGAKGDGVTDDSAAFQAYCDSALTGQNLYLGAKGRYILKNQVDLKGKGLVGNGCGKVSEFYYNLGCIDVDGSSPDLQGKTAFINCGPTIQNLTARCSNGAGKQVSFIEIDGYLANIDHITLINFYNQIVVKQALVGFNFTNAWLYYSQNAGIYCEDPLNRVSTTGTFHNIYFQLGDGHAMIFDRDVHGCDFDNIIFESMNGGIKARTVAHCGFGKFWCENLKTATSKDWLEVTGANSCYGNSFTGYVKLLGGWTSKTSPTLDSLPTNNYGGVSVSAEGISIVNAGNKAKMLMLPSGFKTGNATIDETHISSSTVTPLVKRRVIGADSSGAQYLASDTYTKLSRKWGTYNHGSNNAGAFYAPMMLTYDQSFSTPQNNNGWKIVKESTGVYRVERVSGNTSVITNGHIVVGSPLMGSRLGTGTGATHGIQMIETYAGSWTSYTEAAGFKVFWRDSSNALVDPHRFTVAFTATS。
且，本發明之該尾部纖維蛋白並進一步設置於一載體上，以預防一鮑氏不動桿菌(本發明之實施例為一鮑氏不動桿菌54149菌株，其具有一定抗藥性)感染該載體。而其該尾部纖維蛋白則是透過使用聚合酶連鎖反應(PCR)技術(使用的引子為XhoI_ABTF6_R (5´-CTCGAG
TTAACTCGTTGCTGTAAATGC
-3´)以及NdeI_ABTF6_F (5´-CATATG
AGTGAAGCTGCTGCTCAAGAGGCTGC-3´)對純化之該噬菌體 (ϕAB6)之orf40片段(多醣解聚酶)來進行擴增並提取。接續，將由XhoI以及NdeI所切下之片段插入至pET-28a載體中後，再移入大腸桿菌BL21(DE3)中，最後再進行分析、純化。
接續請參考第1圖，其係本發明之一實施例之生物膜之降解結果圖。本發明之生物膜之降解檢測，係使用無菌之96孔洞之聚苯乙烯微量滴定板。先於微量滴定板中對該鮑氏不動桿菌54149菌株以培養基進行48小時之培養，再移除細菌懸浮液(該鮑氏不動桿菌54149菌株+培養基)後，加入不同濃度之該噬菌體(ϕAB6，濃度：106
、107
、108
PFU)、該尾部纖維蛋白(TFP，濃度：10、50、100 µg)以及DspB(濃度：10、50、100 µg)後於37℃、150rpm下培養4小時。其中DspB全名為Dispersin B，為一種可與抗生素結合用於治療細菌感染的抗生物膜劑。最後用1X 磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)輕輕清洗，再於室溫下用200µl之0.1％的結晶紫溶液染色30分鐘，之後再用1X PBS去除多餘的結晶紫溶液，並在55°C下乾燥30分鐘。接續再使用95％乙醇溶解並搖動10分鐘。並通過測量黏附的和非黏附的細胞之對應吸光度(使用ELISA，在OD 570nm下)來檢測之生物膜降解。並透過將處理過(該噬菌體、該尾部纖維蛋白、DspB)之平均吸光度除以對照孔的平均吸光度乘以100來計算其生物膜降解功效。
其生物膜之降解功效結果，如第1圖所示，其該尾部纖維蛋白(TFP)在濃度100µg下的生物膜之降解率達百分比36％(p ＜0.05)。
接著，請參閱第2圖，其係本發明之一實施例之生物膜之抑制結果圖。本發明之生物膜之抑制檢測，一樣使用無菌之96孔洞之聚苯乙烯微量滴定板。將該噬菌體(ϕAB6，濃度：106
、107
、108
PFU)、該尾部纖維蛋白(TFP，濃度：10、50、100 µg)以及DspB(濃度：10、50、100 µg)與該鮑氏不動桿菌54149菌株(簡稱Ab-54149)於微量滴定板中共培養。在培養24小時後，通過測量非黏附細胞之對應吸光度來量測生物膜之抑制功效，透過ELISA在OD 570nm下進行測量。並透過將處理過(該噬菌體、該尾部纖維蛋白、DspB)之平均吸光度除以對照孔的平均吸光度乘以100來計算其生物膜抑制生成之功效。
其生物膜之抑制功效結果，如第2圖所示，其該尾部纖維蛋白(TFP)顯著的（p ＜0.01）抑制該鮑氏不動桿菌54149菌株之生物膜。並在濃度100µg下的其生物膜之抑制率高達百分比60％(p ＜0.05)。且，生物膜之抑制功效與TFP之劑量濃度成正比，顯示其該尾部纖維蛋白(TFP)抑制生物膜生成之能力顯著。
接著，請參閱第3圖，其係本發明之一實施例之生物膜之厚度結果圖。本發明之生物膜之厚度減少之檢測，使用共聚焦激光掃描顯微鏡來觀察其生物膜之三維結構。先在24孔微量滴定板中之圓形塑料蓋玻片上培養該鮑氏不動桿菌54149菌株之生物膜。再用1X PBS洗滌兩次此圓形塑料蓋玻片後，加入該噬菌體(ϕAB6，108
PFU於PBS中)，該尾部纖維蛋白(TFP，濃度100 µg於PBS中)和DspB(濃度100 µg於PBS中)，並於37℃、150rpm下培養4小時。之後，用1X PBS進行清洗後，再用小麥胚芽凝集素-Alexa Fluro(WGA-AF，會與細菌胞外聚合物(EPS)結合，並發出綠色螢光)於暗室中進行染色2小時。最後，用PBS清洗完後，使用共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。
其生物膜之厚度減少之功效結果，如第3圖所示，用該尾部纖維蛋白(B組)處理過後之生物膜之厚度相較於對照組(A組，其將該尾部纖維蛋白失活)明顯降低。且，相較於本發明之該尾部纖維蛋白，DspB(C組)並未能成功減少蓋玻片上該鮑氏不動桿菌54149菌株之生物膜厚度。
又，本發明之該尾部纖維蛋白係藉由一塗佈方式設置於該載體上。該載體係選自一呼吸器管路、一導尿管、一胸管、一中央靜脈導管或一手術引流管，但不以此為限。舉凡於醫院中使用之管路皆可使用。且，本發明之該尾部纖維蛋白亦可藉由一噴霧方式設置於該載體上。該載體除上述之管路外，可包含於醫院中使用之醫療器材，舉凡輪椅、病床、推車、門把等。皆可藉由該噴霧方式將該尾部纖維蛋白設置於上方，以防止該鮑氏不動桿菌54149菌株之生物膜生成，進而造成該鮑氏不動桿菌54149菌株之感染。
最後，為本發明之實際運用於之實驗結果，請參閱第4A、4B圖，其係本發明之一實施例之實驗結果圖。使用掃描電子顯微鏡來觀察其導管(有矽塗層的Foley導管)上之生物膜。先將有矽塗層的Foley導管於4℃下分別在1ml之1X PBS(A，作為對照組)、1mg之該尾部纖維蛋白(TFP ，作為B組)、以及108
PFU之該噬菌體(ϕAB6，作為C組)下浸泡16小時，後續再將有矽塗層的Foley導管浸泡於細菌懸浮液(該鮑氏不動桿菌54149菌株+培養基)中。結束後，用1X PBS清洗2次。再使用2.5％(w / v)戊二醛(於01.M之二甲基胂酸鹽緩衝液中)以及1%氧化鋨水溶液中進行固定。並再用1X PBS清洗2次後，使用分級之乙醇(50％、70％和95％)進行脫水，再用100％六甲基二矽氮烷(HMDS)中進行化學乾燥。之後，便使用掃描電子顯微鏡觀察該尾部纖維蛋白(TFP)預防該鮑氏不動桿菌54149菌株於有矽塗層的Foley導管上形成生物膜之實驗結果。
其實驗結果如第4A圖所示，該鮑氏不動桿菌54149菌株不能在已使用該尾部纖維蛋白(TFP)和該噬菌體(ϕAB6)浸泡過之導管上生長。顯示，該尾部纖維蛋白(TFP)具有防止該鮑氏不動桿菌54149菌株生長以及形成生物膜之能力。
又第4B圖，為該尾部纖維蛋白(TFP)於導管上對於該鮑氏不動桿菌54149菌株之生物膜之降解能力結果。在將有矽塗層的Foley導管於37℃浸泡於細菌懸浮液(該鮑氏不動桿菌54149菌株+培養基)48小時後，再用1ml之1X PBS(A，作為對照組)、1mg之該尾部纖維蛋白(TFP ，作為B組)、以及108
PFU之該噬菌體(ϕAB6，作為C組)進行處理4小時，後續同第4A圖一樣使用掃描電子顯微鏡來觀察。其結果如第4B圖所示，該尾部纖維蛋白(TFP)可以降解該鮑氏不動桿菌54149菌株之生物膜，以防止該鮑氏不動桿菌54149菌株繼續生長。
由上述實驗可知，本發明之該尾部纖維蛋白(TFP)不僅可用於預防該鮑氏不動桿菌54149菌株於導管或其他醫療器械上形成生物膜，以防止該鮑氏不動桿菌54149菌株進而引起感染。還可用於降解已形成生物膜(由該鮑氏不動桿菌54149菌株形成)，以防止該鮑氏不動桿菌54149菌株繼續生長。
故，本發明之尾部纖維蛋白(TFP)可藉由防止鮑氏不動桿菌54149菌株於載體上形成生物膜之方式，來避免鮑氏不動桿菌54149菌株的感染。且，不同於以往的直接使用噬菌體(ϕAB6)之方式，以往直接使用噬菌體的方式會在裂解鮑氏不動桿菌54149菌株的同時釋放內毒素，使內毒素透過載體進入人體中進而造成危害。
然，本發明之尾部纖維蛋白(TFP)藉由防止生物膜之方式，除可減少鮑氏不動桿菌54149菌株於載體上的聚集，還可降低菌株對抗生素的耐受性。並可改善在殺死鮑氏不動桿菌54149菌株時，內毒素釋放之問題。
故本發明實為一具有新穎性、進步性及可供產業上利用者，應符合我國專利法專利申請要件無疑，爰依法提出發明專利申請，祈 鈞局早日賜准專利，至感為禱。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，並非用來限定本發明實施之範圍，舉凡依本發明申請專利範圍所述之形狀、構造、特徵及精神所為之均等變化與修飾，均應包括於本發明之申請專利範圍內。
無
第1圖：其係本發明之一實施例之生物膜之降解結果圖；
第2圖：其係本發明之一實施例之生物膜之抑制結果圖；
第3圖：其係本發明之一實施例之生物膜之厚度結果圖；以及
第4A-4B圖：其係本發明之一實施例之實驗結果圖。
Claims (9)
- 一種尾部纖維蛋白作為預防鮑氏不動桿菌感染之用途，其中該尾部纖維蛋白之序列为SED ID NO：1所示的氨基酸序列，並設置於一載體上，以預防該鮑氏不動桿菌感染該載體。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該尾部纖維蛋白係取自一噬菌體。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該鮑氏不動桿菌係一鮑氏不動桿菌54149 菌株。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該尾部纖維蛋白係降解該鮑氏不動桿菌之一生物膜。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該尾部纖維蛋白係抑制該鮑氏不動桿菌之一生物膜之生成。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該尾部纖維蛋白係減少該鮑氏不動桿菌之一生物膜之厚度。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該尾部纖維蛋白係藉由一塗佈方式設置於該載體上。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該尾部纖維蛋白係藉由一噴霧方式設置於該載體上。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該載體係選自一呼吸器管路、一導尿管、一胸管、一中央靜脈導管或一手術引流管。
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2019
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