TW202033218A

TW202033218A - 多特異性蛋白分子

Info

Publication number: TW202033218A
Application number: TW108144714A
Authority: TW
Inventors: 應華; 張玲; 楊筱瑩; 葛虎; 陶維康
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2020-09-16
Also published as: CN112969476B; CN112969476A; WO2020114479A1

Abstract

本公開涉及多特異性蛋白分子。具體涉及一種具有新的結構形式多特異性抗體。多特異性抗體能夠同時與CD3和其他腫瘤相關抗原相結合，結合腫瘤相關抗原表達細胞的同時，結合並激活CD3陽性的T細胞，進而促進T細胞對表達腫瘤相關抗原的腫瘤細胞特異性的殺傷。同時，本公開還提供多特異性抗體的製備及應用。

Description

多特異性蛋白分子

本發明涉及多特異性抗體，如結合CD3和腫瘤相關抗原的多特異性抗體。

這裡的陳述僅提供與本發明有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

CD3是由四條不同的鏈組成的T細胞共受體(Wucherpfennig,K.W.等(2010)“Structural Biology Of The T cell Receptor：Insights Into Receptor Assembly,Ligand Recognition,And Initiation Of Signaling,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2(4)：a005140；1-14頁；Chetty,R.等(1994)“CD3：Structure,Function,And Role Of Immunostaining In Clinical Practice,”J.Pathol.173(4)：303-307；Guy,C.S.等(2009)“Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR：CD3 Complex,”Immunol.Rev.232(1)：7-21)。

在哺乳動物中，CD3多亞基形成的複合物與T細胞受體(TCR)的分子締合，以便在T淋巴細胞中產生激活信號(Smith-Garvin,J.E.等(2009)“T Cell Activation,”Annu.Rev.Immunol.27：591-619)。在沒有CD3的情況下，TCR不能適當組裝並且降解(Thomas,S.等(2010)“Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T cell Receptor Gene Transfer,”Immunology 129(2)：170-177)。研究發現CD3結合所有成熟的T細胞的膜，並且幾乎不與其他細胞類型結合(Janeway,C.A.等(2005)：Immunobiology：The Immune System In Health And Disease,”第六版，Garland Science Publishing,NY,pp.214-216；Sun,Z.J.等(2001)“Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε：γHeterodimer,”Cell 105(7)：913-923；Kuhns,M.S.等(2006)“Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,”Immunity.2006 Feb，24(2)：133-139)。

T細胞上T細胞受體(TCR)複合物的恆定的CD3ε信號傳導組分已經被用作靶，以促使在T細胞和腫瘤細胞之間形成免疫學突觸。CD3和腫瘤抗原的共接合(co-engagement)激活了T細胞，引起表達腫瘤抗原的腫瘤細胞的裂解(Baeuerle等(2011)“Bispecific T Cell Engager For Cancer Therapy,”In：Bispecific Antibodies,Kontermann,R.E.(Ed.)Springer-Verlag；2011：273-287)。該方法允許雙特異性抗體以對腫瘤細胞的高特異性與T細胞小室(compartment)全面相互作用並且廣泛適用於大量的細胞表面腫瘤抗原。

B7H3是B7家族的成員之一，屬於I型跨膜蛋白，包含胺基端的一個信號肽，一個細胞外的免疫球蛋白樣可變區(IgV)和恆定區(IgC)、一個跨膜區和一個含有45個胺基酸的胞質尾區(Tissue Antigens.2007 Aug；70(2)：96-104)。目前，B7H3主要存在2種剪切體，B7H3a和B7H3b。B7H3a胞外段由IgV-IgC 2個免疫球蛋白結構域組成，又稱為2IgB7H3，而B7H3b胞外段由IgV-IgC-IgV-IgC 4個免疫球蛋白結構域組成，又稱為4IgB7H3。

B7H3蛋白質在正常組織、細胞中不表達或極低表達，卻高表達於多種腫瘤組織，並與腫瘤的進展、患者的生存及預後密切相關。臨床上已經報道，B7H3在許多癌症類型中、特別是在非小細胞肺癌、腎癌、泌尿道上皮癌、結直腸癌、前列腺癌、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中過表達(Lung Cancer.2009 Nov；66(2)：245-249；Clin Cancer Res.2008 Aug 15；14(16)：5150-5157)。此外，也有文獻報道，在前列腺癌中，B7H3的表達強度與臨床病理學惡性(諸如腫瘤體積、前列腺外侵襲或Gleason評分)正相關，且也與癌症進展相關(Cancer Res.2007 Aug 15；67(16)：7893-7900)。類似地，在多形性膠質母細胞瘤中，B7H3的表達與無事件存活負相關，且在胰腺癌中，B7H3的表達與淋巴結轉移和病理學進展相關。因此，B7H3被認為是一種新的腫瘤標誌物和潛在的治療靶點。

現有技術中公開了一些CD3抗體分子，如OKT3、UCHT-1、SP34(Silvana Pessano et al.The EMBO Journal.1985,4(2)：337-344)，同時，如CN103703024、WO2017055389、CN102171248等也公開了一些CD3抗體分子。但在藥物研發時，仍需開發具有更加安全和有效的CD3抗體分子。

一方面，本公開提供一種多特異性蛋白分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：

該第一多肽鏈從胺基末端至羧基末端依次包含針對第一靶抗原的第一結合區、針對第二靶抗原的第二結合區和第一Fc區，

該第二多肽鏈從胺基末端至羧基末端依次包含針對第三靶抗原的第三結合區和第二Fc區，

該第二結合區和/或第三結合區不包含抗體的恆定區結構域，

該第一多肽鏈和該第二多肽鏈鏈內各區域由肽鍵和/或接頭連接。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的抗原結合區，具體是該第一結合區、和/或該第二結合區、和/或該第三結合區是單鏈抗體(scFv)。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的該第二靶抗原為CD3，且該第一靶抗原和第三靶抗原為相同或不同的腫瘤相關抗原(TAA)；或該第一靶抗原為CD3，且該第二靶抗原和第三靶抗原為相同或不同的腫瘤相關抗原(TAA)。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的該腫瘤相關抗原(TAA)選自AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白質、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-連環蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin 18.2、週期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、間皮素(mesothelin)、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白質、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG- 72、TGF-β、TMPRSS2、湯-諾氏抗原(Thompson-nouvelle antigen；Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶和尿溶蛋白-3和5T4(Trophoblast glycoprotein)。較佳地，該腫瘤相關抗原(TAA)選自B7H3、BCMA、CEA、CD19、CD20、CD38、CD138、Claudin18.2、PSMA和間皮素。更佳

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的該第一多肽鏈具有如下式I的結構：

V_a1-L1-V_b1-L2-V_c2-L2-V_d2-L4-Fc1 式I，該第二多肽鏈具有如下式II的結構：

V_e3-L5-V_f3-L6-Fc2 式II，該V_a1、V_b1、V_c2、V_d2、V_e3和V_f3為抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區，且該V_a1和V_b1，該V_c2和V_d2，與該V_e3和V_f3分別不同時為輕鏈可變區或不同時為重鏈可變區。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的第一多肽鏈具有如下所示的結構：

VH_TAA-L1-VL_TAA-L2-VH_CD3-L3-VL_CD3-L4-Fc1，

VH_TAA-L1-VL_TAA-L2-VL_CD3-L3-VH_CD3-L4-Fc1，

VL_TAA-L1-VH_TAA-L2-VH_CD3-L3-VL_CD3-L4-Fc1，

VL_TAA-L1-VH_TAA-L2-VL_CD3-L3-VH_CD3-L4-Fc1，

VH_CD3-L1-VL_CD3-L2-VH_TAA-L3-VL_TAA-L4-Fc1，

VH_CD3-L1-VL_CD3-L2-VL_TAA-L3-VH_TAA-L4-Fc1，

VL_CD3-L1-VH_CD3-L2-VH_TAA-L3-VL_TAA-L4-Fc1或

VL_CD3-L1-VH_CD3-L2-VL_TAA-L3-VH_TAA-L4-Fc1；且該第二多肽鏈具有如下所示的結構：

VL_TAA-L5-VH_TAA-L6-F_C2或VH_TAA-L5-VL_TAA-L6-F_C2。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的第一多肽鏈具有VL_TAA-L1-VH_TAA-L2-VH_CD3-L3-VL_CD3-L4-Fc1的結構，且該第二條鏈具有VL_TAA-L5-VH_TAA-L6-F_C2的結構。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的第一多肽鏈具有VH_CD3-L1-VL_CD3-L2-VL_TAA-L3-VH_TAA-L4-Fc1的結構，且該第二條鏈具有VH_TAA-L5-VL_TAA-L6-F_C2的結構。

在一些實施方式中，其中該TAA為B7H3。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的該第一Fc區和該第二Fc區是相同的Fc或不同的Fc。較佳地，該第一Fc區為knob-Fc，該第二Fc區為hole-Fc；或該第一Fc區為hole-Fc，該第二Fc區為knob-Fc。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子的該第一Fc區的羧基端連接His標簽(His tag)或第二Fc區的羧基端連接His tag。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子中針對CD3的抗原結合區包含抗體輕鏈可變區和重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：48、49和50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該重鏈可變區包含選自以下i)至v)任一項的HCDR1、HCDR2和HCDR3：

i)分別如SEQ ID NO：37、38和39所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

ii)分別如SEQ ID NO：37、40和41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

iii)分別如SEQ ID NO：37、40和42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

iv)分別如SEQ ID NO：37、40和43所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

v)分別如SEQ ID NO：37、47和45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子中針對CD3的抗原結合區包含如SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區和/或選自如SEQ ID NO：29、30、31、32和35中任一項所示的重鏈可變區。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子中針對CD3的抗原結合區包含如SEQ ID NO：55、56、57、58、61、62、63、64、65或68所示的scFv。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子中該腫瘤相關抗原為B7H3，針對B7H3的抗原結合區包含抗體輕鏈可變區和重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：12、13和14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：9、10和11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子中針對B7H3的抗原結合區包含：如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區和/或如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區；或如SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區和/或如SEQ ID NO：15所示的重鏈可變區。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子中針對B7H3的抗原結合區包含如SEQ ID NO：51、52、53或54所示的scFv。

在一些實施方式中，其中該多特異性蛋白分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈選自胺基酸序列如SEQ ID NO：72、73、74、75、 76、77、78、79、80、83、84、85、86或87所示的多肽，和/或該第二多肽鏈選自胺基酸序列如SEQ ID NO：71、88或70所示的多肽。

在一些實施方式中，其中多特異性蛋白分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：71、88或70所示，且：

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：73所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：76所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：83所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：84所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示；或者

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：87所示。

在一些實施方式中，其中多特異性蛋白分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：73所示，且該第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示。

在一些實施方式中，其中多特異性蛋白分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示，且該第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示。

在一些實施方式中，其中多特異性蛋白分子包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：76所示，且該第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示。

在另一方面，本公開涉及一種醫藥組成物，其含有治療有效量的根據如前所述的多特異性蛋白分子，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。較佳地，該治療有效量為單位劑量的組合物中含有0.1-3000mg(更佳為1-1000mg)的如前所述的多特異性蛋白分子。

在另一方面，本公開涉及一種分離的核酸分子，其編碼如前所述的多特異性蛋白分子。

在另一方面，本公開涉及一種重組載體，其包含如前所述的分離的核酸分子。

在另一方面，本公開涉及一種用如前所述的重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳哺乳動物細胞或昆蟲細胞。

在另一方面，本公開涉及用於生產如前所述的多特異性蛋白分子的方法，該方法包括將如前所述的宿主細胞在培養基中進行培養以形成並積累如前所述的多特異性蛋白分子，以及從培養物回收該多特異性蛋白分子的步驟。

在另一方面，本公開涉及作為藥物的如前所述的多特異性蛋白分子或如前所述的醫藥組成物，或如前所述的分離的核酸分子，較佳該藥物為激活 T細胞的藥物，更佳該藥物為治療癌症的藥物、或治療自身免疫性或炎性疾病的藥物。

在另一方面，本公開涉及如前所述的多特異性蛋白分子或如前所述的醫藥組成物，或如前所述的分離的核酸分子在製備激活T細胞的藥物中的用途。

在另一方面，本公開涉及如前所述的多特異性蛋白分子或如前所述的醫藥組成物，或如前所述的分離的核酸分子在製備治療癌症、或治療自身免疫性或炎性疾病的藥物中的用途。

在另一方面，本公開涉及一種激活T細胞的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的多特異性蛋白分子或如前所述的醫藥組成物，或如前所述的分離的核酸分子。

在另一方面，本公開涉及一種治療癌症或自身免疫性或炎性疾病的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的多特異性蛋白分子或如前所述的醫藥組成物，或如前所述的分離的核酸分子。較佳地，該方法包括向受試者施用包含單位劑量的組合物中含有0.1-3000mg的如前所述的多特異性蛋白分子，或如前所述的醫藥組成物，或如前所述的分離的核酸分子。

在一些實施方式中，前面任一所述癌症選自癌瘤，淋巴瘤，胚細胞瘤(blastoma)，肉瘤，和白血病或淋巴樣惡性。該癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性髓細胞樣白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合症(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合症、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌。在一些實施方案中，其中該癌症為B7-H3陽性細胞相關的癌症；較佳為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。

在一些實施方式中，前面任一所述自身免疫性疾病或炎性疾病選自：類風濕關節炎、牛皮癬、克羅恩病、強硬性脊柱炎、多發性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren綜合症、移植排斥後的自體免疫性溶血性貧血、水皰性類天皰瘡、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血。

[發明詳述]

術語

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“多特異性蛋白分子”指能夠與兩個或兩個以上的目標抗原或目標抗原表位特異性結合的蛋白分子。能夠對兩個目標抗原或目標抗原表位特異性結合的蛋白分子稱為雙特異性蛋白分子，包含抗體或抗體的抗原結合片段(如單鏈抗體)的“雙特異性蛋白分子”在本文中可以與“雙特異性抗體”互換。

術語針對抗原的“結合區”或“結合區域”是指在多特異性蛋白分子或在抗體分子中，能夠與抗原特異性結合的區域或部分(part)，抗原結合區可以是能直接與抗原結合的配體結合結構域部分、也可以是能直接與抗原結合的包含抗體可變區的結構域。

術語“抗體(antibody，Ab)”包含任何包括至少一個與具體抗原(例如CD3)特異性結合或相互作用的互補決定區(CDR)的抗原結合分子或分子複合物。術語“抗體”包含：包括藉由雙硫鍵相互連接的四條多肽鏈，二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區。這一重鏈恆定區包含三個區(結構域)，CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個區(結構域，CL1)。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(framework region,FR，也稱骨架區、構架區)。各VH和VL是由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本公開的不同實施例中，抗CD3抗體(或其抗原結合部分)、抗B7H3抗體(或其抗原結合部分)或抗其他目標抗原的FR可與人類生殖系序列相同，或可經自然或人工修飾。抗體可以是不同亞類(subclass)的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亞類)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

術語“抗體”還包含完全抗體分子的抗原結合片段。術語抗體的“抗原結合部分”、“抗原結合結構域”、“抗原結合片段”等，如文中所用，包含任何與抗原特異性結合形成複合物的天然生成、酶製得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗體的抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變區和(視需要)恆定區的DNA操作和表達的重組基因工程技術，來源於例如全抗體分子。這一DNA是已知的和/或可容易地從例如市售來源、DNA資料庫(包含，例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可經合成。這一DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來定序和操作，例如將一個或多個可變和/或恆定區排列成適合的配置，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基、修飾、增添或刪除胺基酸等。

抗原結合片段的非限定示例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段。其它工程改造分子，例如區域特異性抗體、單域抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-植入抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模塊免疫醫藥(SMIP)和鯊可變IgNAR區，也涵蓋在文中所用的“抗原結合片段”的詞語內。

抗體的抗原結合片段典型地將包含至少一個可變區。可變區可以是任何大小或胺基酸組成的區域且一般將包含與一個或多個框架序列相鄰或在其框架內的CDR。在具有VH區與VL區結合的抗原結合片段中，VH和VL區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH-VL或VL-VH二聚體。

在某些實施例中，抗體的抗原結合片段在任何可變區和恆定區的配置中，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈或連接子區相連接。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所組成，使其在單一多肽分子中於相鄰的可變和/或恆定區之間產生柔性和半柔性連結。再者，在本發明的抗體的抗原結合片段可包含以非共價彼此相互連結和/或與一個或多個單體VH或VL區相連結(例如以雙硫鍵)的任何上列的可變區和恆定區配置的同源二聚體或異源二聚體(或其它多聚體)。

“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的來源於小鼠的單株抗體。製備時用抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤，當所注射的試驗對象為小鼠時，所產生的抗體為鼠源抗體。

“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個較佳的實施方案中，該嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或 IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變，L234A和/或L235A突變，或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區變體。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，包括CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將動物來源抗體，例如鼠源抗體的CDR序列移植到人的抗體可變區框架區(或構架區，framework region)中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網http：//www.vbase2.org/獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少的反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。

由於抗原的接觸殘基，CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以可能是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查動物單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞類共有序列或具有高相似性百分數的動物抗體序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中發揮重要作用。

在本公開一個的實施方案中，該抗體或其抗原結合片段，可進一步包含人源或鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。

“人抗體”與“人源抗體”可以互換使用，可以是源於人的抗體或者是從一種轉基因生物體中獲得的抗體，該轉基因生物體經“改造”以響應於抗原刺激而產生特異性人抗體並且可以藉由本領域已知的任何方法產生。在某些技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元素元件引入到源於胚胎幹細胞系的生物體的細胞株中，這些細胞系中的內源性重鏈和輕鏈基因座被靶向破壞這些細胞系中包含靶向的內源性重鏈和輕鏈基因座破壞。轉基因生物可以合成對人抗原特異的人抗體，並且該生物可以用於產生人抗體-分泌融合瘤。人抗體還可以是一種抗體，其中重鏈和輕鏈是由源於一個或多個人DNA來源的核苷酸序列編碼的。完全人抗體還可以藉由基因或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建，或者由體外活化的B細胞構建，所有的這些都是本領域已知的。

“單株抗體”是指從基本上均質抗體的群體獲得的抗體，即除可能的變體抗體(例如含有天然存在的突變或在製造單株抗體製劑的期間產生的突變，這些變體通常以少量存在)之外，構成該群體的個別抗體相同和/或結合相同表位。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製備物不同，單株抗體製備物(製劑)的每個單株抗體是針對抗原上的單一決定簇的。因此，修飾語“單株”指示如從基本上均質抗體群體獲得的抗體的特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來製造抗體。例如，根據本公開使用的單株抗體可藉由各種技術製備，該技術包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，此類方法以及用於製備單株抗體的其他示例性方法在本文中進行描述。

術語“全長抗體”、“完整抗體”、“完全抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與下文定義的抗原結合片段相區分。該術語特別指重鏈包含Fc區的抗體。

此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選的片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。

抗原結合片段還可併入至包含一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，該對串聯Fv片段連同互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；及美國專利US5641870)。

Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000Da的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

F(ab')2是藉由用胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000Da並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。

Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000Da並具有抗原結合活性的抗體片段。Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理特異性識別並結合抗原的F(ab')2來生產。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個(包括1個、2個、3個或4個)重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc Natl Acad Sci USA.90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur J Immuno.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J Mol Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol Immunother.50：51-59.描述。

“多特異性抗體”是指包含兩個或更多個抗原結合結構域，能夠結合兩個或更多個不同的表位(例如，兩個、三個、四個或更多個不同的表位)，表位可以在相同或不同的抗原上的抗體。多特異性抗體的示例包括結合兩個不同表位的“雙特異性抗體”。

術語腫瘤相關抗原的“雙價雙特異性抗體”是指雙特異性抗體中針對某個腫瘤相關抗原靶點具有兩個抗原結合區，例如B7H3雙價雙特異性抗體指在該雙特異性抗體中包含兩個針對B7H3的抗原結合區。術語“單價雙特異性抗體”是指雙特異性抗體中針對某個靶點只有一個抗原結合區，例如B7H3單價雙特異性抗體指在該雙特異性抗體中包含一個針對B7H3的抗原結合區。

“Linker”或“接頭”或“連接子”或用於連接兩個蛋白質結構域中間的“L1”指用於連接蛋白質結構域的連接性多肽序列，通常具有一定的柔性，linker的使用不會使蛋白質結構域原有的功能喪失。

雙抗體(diabody)是指scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。

dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering.7：697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。

本公開一些實施例中抗原結合片段可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別並結合抗原的單株抗體的VH和/或VL及所需的其他結構域的編碼cDNA，構建編碼抗原結合片段的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達抗原結合片段。

"Fc區"可以是天然序列Fc區或變體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可能變化，但人IgG重鏈Fc區通常被定義成從位置Cys226上的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基端。Fc區中的殘基的編號為如Kabat中的EU索引的編號。Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc區通常具有兩個恆定區結構域CH2和CH3。文中“第一Fc”也稱作“Fc1”，第二Fc也稱作“Fc2”。

“V_a1-L1-V_b1-L2-V_c2-L2-V_d2-L4-Fc1”與“V_e3-L5-V_f3-L6-Fc2”中V_a1、V_b1、V_c2、V_d2、V_e3和V_f3為抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區，V_a1和V_b1結合第一抗原(第一靶抗原)表位，V_c2和V_d2結合第二抗原(第二靶抗原)表位，V_e3和V_f3結合第三抗原(第三靶抗原)表位，第一抗原表位、第二抗原表位和第三抗原表位可以相同或不同。

類似“VH_TAA-L1-VL_TAA-L2-VH_CD3-L3-VL_CD3-L4-Fc1”中，VH_TAA和VL_TAA表示抗體可變區結合腫瘤相關抗原的表位，VH_CD3和VL_CD3表示抗體可變區結合CD3的表位。

本公開“knob-Fc”指在抗體Fc區包含T366W的點突變，以形成類似knob(紐)的空間結構。相對應地，“hole-Fc”指在抗體Fc區包含T366S、L368A、Y407V的點突變，以形成類似hole(孔)的空間結構。Knob-Fc和hole-Fc由於空間位阻的原因，更易形成異二聚體。為進一步地促進異二聚體的形成，還可在knob-Fc和hole-Fc分別引入S354C和Y349C的點突變，藉由二硫鍵進一步促進異二聚體的形成。同時，為消除或減弱抗體Fc引起的ADCC效應，還可向Fc引入的234A和235A的取代突變。例如，本公開較佳的knob-Fc和hole-Fc分別如SEQ ID NO：69和70所示。在雙特異性抗體中，knob-Fc或hole-Fc既可以作為第一多肽鏈的Fc區域，也可以作為第二多肽鏈的Fc區域，在同一雙特異性抗體中，第一多肽鏈和第二多肽鏈的Fc區不同時為knob-Fc或hole-Fc。

術語“胺基酸差異”或“胺基酸突變”是指相較於原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變或突變，包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生1個或數個胺基酸的插入、缺失或替換。

抗體的“可變區”是指單獨的或組合的抗體輕鏈的可變區(VL)或抗體重鏈的可變區(VH)。如在本領域中已知的，重鏈和輕鏈的可變區各自由藉由3個互補決定區(CDR)(也稱為高變區)連接的4個框架區(FR)組成。每一條鏈中的CDR藉由FR緊密地保持在一起並且與來自另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結合部位的形成。存在至少2個用於確定CDR的技術：(1)基於跨種序列變異性的方法(即，Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；和(2)基於抗原-抗體複合物的晶體學研究的方法(Al-Lazikani等，J.Molec.Biol.273：927-948(1997))。如本文中所用，CDR可指由任一方法或由兩種方法的組合確定的CDR。

術語“抗體框架”或“FR區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中一些實施方式中使用的，CDR可以以Kabat規則(Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD)) 定義輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，以及重鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，例如在對本公開中CD3抗體CDR的定義。在另一些實施方式中，還可以採用IMGT等規則進行抗體的CDR的定義，例如在對B7H3抗體CDR即採用的是IMGT規則進行定義。

“抗體恆定區結構域”指來源於抗體的輕鏈和重鏈的恆定區的結構域，包括CL和來源於不同類抗體的CH1、CH2、CH3和CH4結構域。抗體中用於連接重鏈CH1和CH2結構域的鉸鏈區(hinge region)不屬於本公開所定義的“抗體恆定區結構域”的範疇。

術語“腫瘤抗原”是指由腫瘤細胞產生的物質，視需要是蛋白質，包括“腫瘤相關抗原”或“TAA”(其是指在腫瘤細胞中產生的且與相應的正常組織相比在癌症中差異表達的蛋白質)以及“腫瘤特異性抗原”或“TSA”(其是指在腫瘤細胞中產生的且與相應的正常組織相比在癌症中特異性表達或異常表達的腫瘤抗原)。

“腫瘤相關抗原”的非限定示例包含，例如AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白質、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-連環蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin 18.2、週期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE- A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、間皮素(mesothelin)、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白質、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、湯-諾氏抗原(Thompson-nouvelle antigen；Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶和尿溶蛋白-3、5T4(Trophoblast glycoprotein)。

“CD3”，指表達在T細胞上作為多分子T細胞受體(TCR)的部分的抗原，且其是由下列四條受體鏈中的二條鏈所形成的同源二聚體或異源二聚體所組成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人類CD3-ε(hCD3ε)包含UniProtKB/Swiss-Prot：P07766.2中所述的胺基酸序列。人類CD3-δ(hCD3δ包含UniProtKB/Swiss-Prot：P04234.1中所述的胺基酸序列。因此，除非明確地指出是來自非人類物種，例如“小鼠CD3”、“猴CD3”等，否則“CD3”一詞指人類CD3。

“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-8M，例如大約小於10^-9M、10^-10M、10^-11M或更小的親和力(KD)結合。

術語“親和力”是指在單一表位處，抗體與抗原之間相互作用的強度。在各抗原位點內，抗體“臂”的可變區藉由弱非共價力與抗原在多個胺基酸位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。如本文所用，抗體或其抗原結合片段(例如Fab片段)的術語“高親和力”通常是指具有1E^-9M或更小的K_D(例如1E^-10M或更小的K_D、1E^-11M或更小的K_D、1E^-12M或更小的K_D、1E^-13M或更小的K_D、1E^-14M或更小的K_D等)的抗體或抗原結合片段。

術語"KD"或“K_D”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，抗體以小於大約1E^-8M，例如小於大約1E^-9M、1E^-10M或1E^-11M或更小的解離平衡常數(KD)結合抗原，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。KD值越小，親和力越大。

術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

術語"載體"意指能夠遞送一個或多個目標基因或序列並且較佳地在宿主細胞中表達其的構建體。載體的示例包括，但不限於，病毒載體、裸露DNA或RNA表達載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑締合的DNA或RNA表達載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體和某些真核生物細胞諸如生產細胞。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用抗原或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。本公開所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從網站http：//www.imgt.org/得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、HEK293細胞(非限制性實施例如HEK293E細胞)和NS0細胞。

工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種可選的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的蛋白A或蛋白G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開實施例的任一種化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床有測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)可能無法在緩解每個目標疾病症狀方面都有效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra 檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“胺基酸保守修飾”或“胺基酸保守取代”指蛋白質或多肽中的胺基酸被具有相似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其他胺基酸取代，從而使得在不改變蛋白質或多肽的生物活性或其他所需特性(例如抗原親和力和/或特異性)的情況下，可以經常進行改變。本領域技術人員認識到，通常，多肽的非必需區域中的單個胺基酸取代基本上不改變生物活性(參見，例如，Watson等人，(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版))。此外，結構上或功能上相似的胺基酸的取代不太可能破壞生物活性。示例性保守取代於下表“示例性胺基酸保守取代”中陳述。

示例性胺基酸保守取代

“有效量”、“有效劑量”是指獲得任一種或多種有益的或所需的治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，諸如減少各種本公開靶抗原相關病症的發病率或改善該病症的一個或多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩患者的本公開靶抗原相關病症的進展。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”、“同一性”在本文中可以互換，是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。通常，當比對兩個序列時進行比較以給出最大百分比同源性。例如，可以藉由BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。

以下參考文獻涉及經常用於序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul,S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410； Gish,W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常規BLAST算法也為本領域技術人員所熟知。

“分離的”指純化狀態，並且在這種情況下意味著在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他材料，例如細胞碎片和生長培養基。通常，術語“分離的”並不意圖指完全不存在這些材料或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以顯著干擾如本文所述的化合物的實驗或治療用途的量存在。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本公開所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

術語“藥學上可接受的載體”指適合用於製劑中用於遞送抗體或抗原結合片段的任何無活性物質。載體可以是抗黏附劑、黏合劑、包衣、崩解劑、充填劑或稀釋劑、防腐劑(如抗氧化劑、抗菌劑或抗真菌劑)、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適的藥學上可接受的載體的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝液、緩衝的鹽水和等滲劑例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化鈉。

術語“癌症”、“癌的”或“惡性的”指或描述哺乳動物中一般以不受調節的細胞生長為特徵的生理狀況。癌症的例子包括但不限於癌瘤，淋巴瘤，胚細胞瘤(blastoma)，肉瘤，和白血病或淋巴樣惡性。這種癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性髓細胞樣白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合症(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合症、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌。

“炎性病症”是指其中過度或不受調節的炎症反應導致過度炎性症狀、宿主組織損傷或組織功能喪失的任何疾病、病症或綜合症。“炎性疾病”也是指由白細胞或嗜中性粒細胞趨化性的彙集而介導的病理狀態。

“炎症”是指由於組織損傷或破壞而引起的局部保護性反應，其用來破壞、削弱或杜絕(隔離)有害物質和受傷組織。炎症與白細胞或中性粒細胞趨化性的彙集顯著相關。炎症可以由病原生物體和病毒以及非感染性原因引起，該非感染性原因如創傷或心肌梗塞後的再灌注或中風、對外源性抗原的免疫應答和自身免疫應答。

“自身免疫性疾病”是指其中組織損傷與體液或細胞介導的對身體自身成分的反應相關的任何一組疾病。自身免疫疾病的非限制性示例包括類風濕關節炎、牛皮癬、克羅恩病、強硬性脊柱炎、多發性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren綜合症、移植排斥後的自體免疫性溶血性貧血、水皰性類天皰瘡、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血等。

此外，本公開另一方面涉及用於免疫檢測或測定目標抗原的方法、用於免疫檢測或測定目標抗原的試劑、用於免疫檢測或測定表達目標抗原的細胞的方法和用於診斷與目標抗原陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本公開的特異性識別並結合目標抗原的單株抗體或抗體片段作為活性成分。

在本公開中，用於檢測或測定目標抗原的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。

免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的示例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。

上述與目標抗原陽性細胞相關的疾病可以藉由用本公開的單株抗體或抗體片段檢測或測定表達目標抗原的細胞來診斷。

為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。

在本公開中，對用於檢測或測定目標抗原的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達目標抗原的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。

根據所需的診斷方法，含有本公開的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。

在以上說明書中提出了本發明一種或多種實施方式的細節。雖然可使用與本文所述類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本發明，但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍，本發明的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬領域普通技術人員所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入。提出以下實施例是為了更全面地說明本發明的較佳實施方式。這些實施例不應以任何方式理解為限制本發明的範圍，本發明的範圍由申請專利範圍限定。

第1A圖和第1B圖：第1A圖為雙價雙特異性抗體示意圖，第1B圖為單價雙特異性抗體示意圖。

第2A圖至第2D圖：流式細胞術對抗體與表達或不表達相應抗原的細胞結合活性檢測。第2A圖為不同抗體與表達人B7H3的A498細胞的結合活性檢測，第2B圖為不同抗體與過表達人B7H3的CT26細胞的結合活性檢測，第2C圖為不同抗體與不表達人B7H3的CT26細胞的結合活性檢測，結果顯示各抗體均不與不表達人B7H3的CT26細胞結合，第2D圖為不同抗體與表達CD3的Jurkat重組細胞結合活性檢測。第2A圖至第2D圖中縱坐標表示螢光信號的幾何平均值。

第3A圖至第3B圖：含有不同CD3 scFv的雙特異性抗體對A498的殺傷活性檢測。第3A圖為B7H3單價雙特異性抗體的殺傷活性。第3B圖為B7H3雙價雙特異抗體的殺傷活性。除了155、156、185和186對A498的殺傷活性較弱之外，其餘雙特異抗體，無論B7H3單價還是雙價，均顯示出較明顯的殺傷活性。

第4A圖至第4B圖：含有相同CD3 scFv的B7H3單雙價雙特異性抗體對A498殺傷活性比較。第4A圖為含HRH1的B7H3單價(181)和雙價(131)雙特異抗體的殺傷活性比較。第4B圖為含HRH7的B7H3單價(187)和雙價(177)的殺傷活性比較。實驗結果均顯示B7H3雙價雙特異性抗體較B7H3單價雙特異性抗體都具有明顯的A498殺傷活性，同時，B7H3雙價雙特異性抗體較B7H3單價雙特異性抗體的殺傷活性顯著增強。

第5A圖至第5C圖：含有相同CD3重鏈可變區，不同結構順序的B7H3雙價雙特異性抗體對A498的殺傷活性檢測。第5A圖為含HRH2的第一多肽鏈排列順序不同的(AFF1、AFF2、AFF3、AFF4)B7H3雙價雙特異性抗體間的殺傷活性比較。第5B圖為含HRH2的第二多肽鏈排列順序不同的(AFF3、AFF3-B)B7H3雙價雙特異性抗體間的殺傷活性比較。結果顯示序列相同，VH和VL排列順序不同的B7H3雙價雙特異性抗體均具有顯著的A498細胞殺傷活性，並且不同結構順序的分子間殺傷活性相近。第5C圖為包含相同B7H3 scFv和CD3 scFv的不同結構的雙特異性抗體的殺傷活性比較，三個待測雙特異抗體127與201、202均可在體外殺傷A498腫瘤細胞活性，其中雙特異性抗體127的殺傷活性優於201和202。

第6A圖至第6B圖：不同抗體對Jurkat重組細胞的激活檢測。第6A圖是抗體在含A498細胞的情況下，抗體介導的B7H3靶點特異的Jurkat重組細胞激活；第6B圖是抗體在不含A498細胞的情況下，介導的非B7H3靶點特異的Jurkat重組細胞激活。第6A圖和第6B圖中的圖例所指示的抗體一致。

第7A圖至第7B圖：含有相同CD3scFv不同價雙特異性抗體對Jurkat重組細胞的激活檢測。第7A圖是B7H3單/雙價雙特異性抗體在含A498細胞的情況下，抗體介導的B7H3靶點特異的Jurkat重組細胞激活；第7B圖是B7H3單/雙價雙特異性抗體在不含A498細胞的情況下，介導的非B7H3靶點特異的Jurkat重組細胞激活。

第8A圖至第8C圖：不同抗體在有A498細胞存在時，刺激PBMC產生B7H3靶點特異的細胞因子分泌測試。第8A圖為不同抗體刺激PBMC的IFNγ分泌水平比較，第8B圖為不同抗體刺激PBMC的TNFα分泌水平比較，第8C圖為不同抗體刺激PBMC的IL-2分泌水平比較。第8A圖至第8C圖顯示118、127和132抗體能顯著刺激PBMC產生B7H3靶點特異的細胞因子分泌。第8A圖至第8C圖中的圖例所指示的抗體一致。

第9A圖至第9C圖：不同抗體在CHOK1細胞(不表達B7H3)存在時，刺激PBMC產生非B7H3靶點特異的細胞因子分泌測試。第9A圖為不同抗體刺激PBMC分泌的IFNγ水平比較，第9B圖為不同抗體刺激PBMC分泌的TNFα水平比較，第9C圖為不同抗體刺激PBMC分泌細胞的IL-2水平比較。第9A圖至第9C圖顯示118、127和132抗體不能刺激PBMC進行非B7H3靶點特異的細胞因子分泌，具有很強的安全性。第9A圖至第9C圖中的圖例所指示的抗體一致。

第10A圖至第10E圖10E：雙特異抗體在人PBMC重建的小鼠A498模型中的抗腫瘤療效檢測。第10A圖為低劑量B7H3雙價雙特異性抗體的抑瘤活性檢測，低劑量的118和119抗體仍顯示出一定的抑瘤活性，並且顯示出一定的劑量依賴性。第10B圖為0.3mpk和0.6mpk劑量B7H3雙價雙特異性抗體的抑瘤活性檢測，113抗體顯示出劑量依賴的腫瘤體內抑制活性。第10C圖為0.12mpk和0.36mpk劑量B7H3雙價雙特異性抗體的抑瘤活性檢測，兩劑量下118抗體顯示出顯著的抑瘤活性。第10D圖為0.36mpk劑量下B7H3雙價雙特異性抗體的抑瘤活性檢測，126、127和128抗體均顯示出顯著的抑瘤活性。第10E圖為127抗體在不同劑量和不同給藥頻次下的抑瘤活性。第10A圖至第10E圖中，Vehicle表示PBS給藥的陰性對照組。

第11A圖至第11B圖：雙特異抗體在hCD3 KI小鼠模型中的抗腫瘤療效。第11A圖和第11B圖分別為118和132在hCD3 KI小鼠模型中的抑瘤效果。

抗體的製備和篩選

製備單株抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler,G.等人，(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of PredefinedSpecificity,”Nature256：495-497的方法或其修改形式。典型地，單株抗體在非人物種，諸如小鼠中形成。通常，小鼠或大鼠被用於免疫，但其他動物，如兔、羊駝也可被使用。藉由用免疫原性量的包含人CD3或其他目標抗原(如人B7H3)的細胞、細胞提取物或蛋白製劑免疫小鼠來製備抗體。免疫原可以是但不限於，原代細胞、培養的細胞系、癌性細胞、核酸或組織。

在一個實施方案中，藉由使用過量表達目標抗原作為免疫原的宿主細胞獲得與目標抗原結合的單株抗體。此類細胞包括，例如且不限於，人T細胞、過表達人B7H3的細胞。

為了監測抗體應答，可從動物獲得小的生物樣品(例如，血液)並測試針對免疫原的抗體滴度。可移除脾和/或一些大的淋巴結並離解為單細胞。如需要，可藉由(在非特異性黏附細胞去除之後)將細胞懸液施加至抗原塗覆的平板或孔篩選脾細胞。表達膜結合的抗原特異性的免疫球蛋白的B細胞，將與平板結合，並不會被剩餘的懸液沖洗掉。隨後，可將所得B細胞或所有離解的脾細胞與骨髓瘤細胞(例如，X63-Ag8.653和來自SaIk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,CA的細胞)融合。聚乙二醇(PEG)可被用於融合脾或淋巴細胞與骨髓瘤細胞以形成融合瘤。隨後在選擇性培養基(例如，次黃嘌呤、胺喋呤、胸苷培養基，另外稱為“HAT培養基”)中培養融合瘤。隨後，藉由有限稀釋將所得融合瘤鋪板，並使用例如FACS(螢光激活細胞分選術)或免疫組織化學(IHC)篩選分析與免疫原特異性結合的抗體的產生。隨後，體外(例如，在組織培養瓶或中空纖維反應器)或體內(例如，在小鼠中作為腹水)培養選擇分泌單株抗體-的融合瘤。

作為細胞融合技術的另一個替代方式，可使用Epstein-Barr病毒(EBV)永生化的B細胞以製備本發明的單株抗體。如需要，增殖並亞選殖融合瘤，並藉由傳統的分析方法(例如，FACS、IHC、放射免疫分析、酶免疫分析、螢光免疫分析等)分析上清液的抗免疫原活性。

在另一個替代方式中，可藉由本領域已知的任何方法(例如，人源化、使用轉基因小鼠製備全人抗體、噬菌體展示技術，等)測序和重組製備抗目標抗原(如CD3、B7H3)單株抗體和任何其他等同抗體。在一個實施方案中，抗目標抗原(如CD3、B7H3)單株抗體被測序且隨後多核苷酸序列被選殖進入載體用於表達或增殖。編碼目的抗體的序列可被保持在宿主細胞中的載體中且隨後該宿主細胞可被增殖並冷凍用於以後使用。

抗CD3單株抗體和任何其他等同抗體的多核苷酸序列可被用於遺傳操作以產生“人源化”抗體，以改進抗體的親和力或其他特徵。人源化抗體的一般原理包括保留抗體的抗原結合部分的基本序列，同時將該抗體的非人剩餘部分置換為人抗體序列。存在人源化單株抗體的四個一般步驟。這些步驟為：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的胺基酸序列，(2)設計人源化抗體，即，決定在人源化過程中使用哪一個抗體構架區，(3)實際的人源化方法/技術和，(4)人源化抗體的轉染和表達。參見，例如，美國專利號US4816567、US5807715、US5866692和US6331415。

1. B7H3抗體的製備和篩選

利用人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，並提取RNA，構建天然單鏈噬菌體抗體庫。將構建的天然單鏈噬菌體抗體文庫經過包裝形成噬菌體顆粒後，採用液相法進行淘篩，噬菌體與生物素化的B7H3液相結合，再採用鏈黴親和素磁珠分離。為了獲得與人B7H3結合的陽性序列，採用生物素化的人B7H3進行淘篩，挑取若干個單株菌落包裝成噬菌體單鏈抗體，用於噬菌體ELISA測試。分別測試單株噬菌體與人B7H3和鼠B7H3的結合活性，經篩選獲得B7H3抗體。

檢測用B7H3相關抗原如下所示：

檢測用人B7H3抗原

商業化產品(SinoBiological cat# 11188-H08H)

序列如下：

SEQ ID NO：1

註釋：劃橫線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His標簽(His-tag)。

檢測用猴B7H3抗原

商業化產品(SinoBiological cat#90806-C08H)

序列如下：

SEQ ID NO：2

註釋：劃橫線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His標簽。

檢測用鼠B7H3抗原

商業化產品(SinoBiological cat# 50973-M08H)

序列如下：

SEQ ID NO：4

註釋：劃橫線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His標簽。

人B7H3全長胺基酸序列

SEQ ID NO：4

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；

劃橫線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-466)，其中29-139為Ig-like V-type 1 Domain，145-238為Ig-like C2-type 1 Domain；243-357為Ig-like V-type 2 Domain，363-456為Ig-like C2-type 2 Domain；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：467-487)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：488-534)。

猴B7H3全長胺基酸序列

SEQ ID NO：5

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：467-487)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：488-534)。

>鼠B7H3全長胺基酸序列

SEQ ID NO：6

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；

劃橫線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-248)；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：249-269)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：270-316)。

篩選獲得的B7H3抗體h1702序列及其經IMGT編號規則定義的CDR序列如下所示：

>h1702 VH

SEQ ID NO：7

>h1702 VL QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLS SGSVSTSHY PSWYQQTPGQAPRMLIY NTN TRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYC AIHVDRDIWV FGGGTKLTVL SEQ ID NO：8

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

為了進一步提高雙特異性抗體的性能，在B7H3抗體h1702的VH和VL中分別進行半胱胺酸取代突變，在輕鏈可變區中引入G103C(胺基酸自然順序編號，在SEQ ID NO：16的第103位)突變，在重鏈可變區中引入G44C(胺基酸自然順序編號，在SEQ ID NO：15的第44位)突變，以形成一對二硫鍵，突變後的抗B7H3單鏈抗體的重鏈和輕鏈可變區序列如下所示：

B7H3 VH44C：

SEQ ID NO：15

B7H3 VL103C：

SEQ ID NO：16

2. CD3抗體的製備和篩選

在鼠源CD3抗體基礎上，經突變、建庫、人源化改造及篩選等手段可獲得人源化的CD3抗體。

CD3抗原相關序列信息如下

檢測用人CD3抗原

商業化產品(SinoBiological cat#CT038-H2508H)

序列如下：

人CD3ε(Human CD3ε)

SEQ ID NO：17

註釋：

劃橫線部分為CD3ε胞外區(Extracellular domain：23-126)；斜體部分為His標簽

人CD3δ FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVA DYKDDDDK SEQ ID NO：18

註釋：

劃橫線部分為CD3δ胞外區(Extracellular domain：22-105)；斜體部分為Flag標簽。

檢測用猴CD3抗原

商業化產品(Acro biosystem cat# CDD-C52W4-100ug)

序列如下：

猴CD3ε QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQHNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVCENCMEMD-HHHHHHSEQ ID NO：19

註釋：

劃橫線部分為CD3ε胞外區(Extracellular domain：22-117)；斜體部分為His標簽

猴CD3δ FKIPVEELEDRVFVKCNTSVTWVEGTVGTLLTNNTRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESAVQVHYRMCQNCVELDPATLA-DYKDDDDK SEQ ID NO：20

註釋：

劃橫線部分為CD3δ胞外區(Extracellular domain：22-105)；斜體部分為Flag標簽

檢測用鼠CD3抗原

商業化產品(SinoBiological cat# CT033-M2508H)序列如下：

鼠CD3ε DDAENIEYKVSISGTSVELTCPLDSDENLKWEKNGQELPQKHDKHLVLQDFSEVEDSGYYVCYTPASNKNTYLYLKARVCEYCVEVD-HHHHHH SEQ ID NO：21

註釋：

劃橫線部分為CD3ε胞外區(Extracellular domain：22-108)；斜體部分為His標簽

鼠CD3δ FKIQVTEYEDKVFVTCNTSVMHLDGTVEGWFAKNKTLNLGKGVLDPRGIYLCNGTEQLAKVVSSVQVHYRMCQNCVELDSGTMA DYKDDDDK SEQ ID NO：22

註釋：

人CD3ε全長胺基酸序列

SEQ ID NO：23

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-22)；

劃橫線部分為CD3ε胞外區(Extracellular domain：23-126)，其中32-112為Ig-like Domain；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：127-152)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：153-207)。

人CD3δ全長胺基酸序列

SEQ ID NO：24

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-21)；

劃橫線部分為CD3δ胞外區(Extracellular domain：22-105)；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：106-126)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：127-171)。

猴CD3ε全長胺基酸序列

SEQ ID NO：25

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-21)；

劃橫線部分為CD3ε胞外區(Extracellular domain：22-117)；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：118-138)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：139-198)。

猴CD3δ全長胺基酸序列

SEQ ID NO：26

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-21)；

劃橫線部分為CD3δ胞外區(Extracellular domain：22-105)；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：106-126)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：127-171)。

鼠CD3ε全長胺基酸序列

SEQ ID NO：27

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-21)；

劃橫線部分為CD3ε胞外區(Extracellular domain：22-108)；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：109-134)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：135-189)。

鼠CD3δ全長胺基酸序列

SEQ ID NO：28

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-21)；

劃橫線部分為CD3δ胞外區(Extracellular domain：22-105)；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：106-126)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：127-173)。

經過重複分析和優化，獲得一系列抗CD3的人源化抗體序列，重鏈可變區序列如下：

輕鏈可變區序列如下：

>HRL

SEQ ID NO：36

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。此處和下表3中CD3人源化抗體的輕鏈和重鏈可變區中的CDR(LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)胺基酸殘基在數量和位置上符合已知的Kabat編號規則。

單鏈抗體的構建和製備

來源自上述B7H3抗體的輕重鏈可變區和來源於CD3抗體的輕重鏈可變區可分別經連接後形成針對B7H3的scFv和針對CD3的scFv，其中接頭(linker)可選自本領域內公知的接頭序列，示例性的接頭可選自：(GGGGS)n或(GGGGS)nGGG，其中n可為1、2、3或4。

示例性的抗B7H3的scFv如下：

示例性的抗CD3的scFv如下：

雙特異性抗體的構建和製備B7H3雙價雙特異性抗體和B7H3單價雙特異性抗體

本公開的一些實施方式中B7H3雙價雙特異抗體的結構如第1A圖所示，其C末端可以連接His標簽，也可以不連接His標簽。採用含Fc的兩條鏈非對稱結構設計，共有兩個B7H3抗原結合域和一個CD3抗原結合域，其中B7H3抗原結合域在兩條鏈上各一個，抗原結合域均為scFv的形式。Fc區能維持抗體正常半衰期和良好穩定性，兩條鏈的設計大大降低了錯配的幾率，提高了樣品的均一性和目的抗體的得率。具體的雙特異性抗體的分子結構(Format)見下表6，此外，本公開一些實施方式中使用的B7H3單價雙特異性抗體的分子結構在第二多肽鏈中僅有Fc結構域，不包含抗原結合結構域，結構示意見第1B圖。

其中n選自1、2、3或4；較佳的，L1中的n為2或3，更佳為3；L2中的n為1或2，更佳為1；L3或L5中的n為3。可選地，用於連接抗原結合結構域以及Fc區的接頭可選自其他任何可用於連接抗體功能結構域的接頭，而不僅限於上述序列所限制的接頭。

上述表6中的Fc1和Fc2可為相同序列的Fc，也可分別為knob-Fc和hole-Fc或分別為hole-Fc和knob-Fc，在本公開一些實施例中，knob-Fc和hole-Fc的序列較佳表8所示序列：

上述輕重鏈可變區、單鏈抗體、雙特異性抗體可藉由VH和/或VL及所需的其他結構域的編碼cDNA，構建編碼上述多肽或抗原結合片段的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達該多肽或抗原結合片段。

實施例1、雙特異性抗體分子及陽性對照分子、陰性對照分子的製備

根據本公開雙特異性抗體分子的設計方法，設計並製備具體雙特異性抗體分子，示例性分子胺基酸序列如下表9所示：

本公開中使用的陰性對照(NC1、NC2、NC3)及陽性對照(MGD009)的雙特異性抗體的胺基酸序列如下：

NC1：B7H3結合域被替換成非相關抗體(抗螢光素抗體，anti-fluorescein)，但保留CD3結合域)，其胺基酸序列參照文獻：The anti-fluoresceinantibody used to form the control DART diabody was antibody 4-4-20(Gruber.M.et al.(1994).

鏈1(VH_CD3-VL_CD3-VL_ctrl-VH_ctrl-knob-Fc)

SEQ ID NO：89

鏈2(VL_ctrl-VH_ctrl-hole-Fc)

SEQ ID NO：90

NC2：保留B7H3結合域，僅是CD3結合域被替換成抗fluorescein的非相關抗體

鏈1(VH_ctrl-VL_ctrl-VL_B7H3-VH_B7H3-knob-Fc)

SEQ ID NO：91

鏈2(VL_B7H3-linker-VH_B7H3-linker-Fc)

SEQ ID NO：92

註：順序為VL_B7H3-linker-VH_B7H3-linker-Fc。序列中下劃線部分為B7H3抗體序列，斜體部分為hole-Fc序列。

NC3

鏈1(VL_ctrl-VH_ctrl-VH_CD3-VL_CD3-knob-Fc-His tag)

SEQ ID NO：93

鏈2(VL_ctrl-VH_ctrl-hole-Fc)

SEQ ID NO：94

陽性對照MGD009包含三條鏈，製備及胺基酸序列參照已公開專利申請WO2017030926A1，其胺基酸序列如下：

鏈1(B7H3VL-CD3VH-Fc)

SEQ ID NO：95

鏈2(CD3VL-B7H3VH)

SEQ ID NO：96

鏈3(Fc)

SEQ ID NO：97

201(DART-Fc三鏈結構)201鏈1(B7H3VL-CD3VH-E-Fc)

SEQ ID NO：99

201鏈2(CD3VL-B7H3VH-K)

SEQ ID NO：100

201鏈3

SEQ ID NO：97

202(四鏈結構，其中四條鏈的物質的量比例關係是鏈1：鏈2：鏈3：鏈4=1：2：1：1)

202鏈1(B7H3VH-CH1-Fc)

SEQ ID NO：101

202鏈2(B7H3VL-CL)

SEQ ID NO：102

202鏈3(B7H3VH-CH1-CD3VH-CL)

SEQ ID NO：103

202鏈4(CD3VL-CH1)

SEQ ID NO：104

實施例2、CD3-B7H3雙特異性抗體的表達與純化

表達雙特異性抗體的質粒(鏈1：鏈2為1：1)轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質。澄清的上清用Ni Sepharose excel管柱(GE Healthcare)進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線，再用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液，最後用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。沖提樣品適當濃縮後，利用550緩衝液(10mM乙酸，pH5.5,135mM NaCl)平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，收集目的峰。樣品經脫鹽管柱或超濾離心管換液至559緩衝液中(10mM乙酸，pH5.5,9%蔗糖)，分裝後於-80度凍存。

測試例1、BIAcore檢測雙特異抗體對B7H3和CD3的親和力實驗

抗體對B7H3和CD3親和力的檢測，採用捕獲(capture)抗體的形式。用偶聯有Anti-Human IgG Antibody(Cat.#BR-1008-39,Lot.# 10260416,GE)的CM5生物傳感芯片(Cat.# BR-1005-30,GE)或Protein A(Cat.# 29127556,GE)生物傳感芯片親和捕獲BsAb，然後於芯片表面流經各抗原，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用再生緩衝液Glycine1.5(Cat# BR100354，GE)或3M MgCl₂(來自Human antibody capture kit，Cat.#BR100839,GE)將芯片洗淨再生。實驗結束後用GE Biacore T200 Evaluation version 3.0軟件以(1：1)Langmuir模型擬合數據，得出親和力數值。

固定不同V區的排列順序，採用不同CD3抗體VH序列時，雙特異抗體對CD3的親和力略有不同，當採用HRH-6和HRH-5序列時，抗體與CD3的親和力最弱，在Biacore上無法檢測到與CD3的結合。

示例性的選擇包含HRH3作為CD3抗原結合結構域的重鏈可變區的抗體進行測試，其中測試抗體118，127，132與人(human)B7H3和human CD3的親和力分別為10^-9和10^-8M水平，與MGD009的親和力相當，且與猴(cyno)B7H3和human CD3均具有很強的交叉結合活性。

測試例2、細胞水平抗體結合能力測定

採用FACS的方法對雙特異抗體與細胞表面抗原結合能力進行檢測。對細胞表面抗原B7H3和CD3的結合，分別用A498(ATCC，HTB-44)，CT26/hB7H3(在鼠細胞CT26中過表達人B7H3的重組細胞系，內部構建，CT26來源於中科院細胞庫，TCM37)和Jurkat重組細胞系(Jurkat細胞來源於ATCC，PTS-TIB-152，重組細胞系是在Jurkat細胞基礎上過表達螢光素酶(luciferase)基因，在基因上游插入NFAT的應答元件)。

在96孔U型底板(corning,3795)中加入FACS緩衝液(buffer)(98% PBS,2% FBS)重新懸浮的細胞，並加入梯度稀釋的抗體，4℃孵育1h，FACS緩衝液清洗2次，隨後每孔加入APC anti-human IgG Fc Antibody(biolegend，Cat# 409306,1：50稀釋)，4℃孵育30min，清洗2次後用FACS緩衝液重新懸浮細胞，最後用FACS CantoII(BD)讀取螢光信號值。

結果顯示，B7H3雙價的雙特異抗體118、127和132以及陰性對照抗體NC2(保留B7H3結合域，僅是CD3結合域被替換成非相關抗體)均能與高表達B7H3的A498細胞系結合(見第2A圖)，呈梯度依賴效應，結合能力強於MGD009，且是B7H3靶點特異的，陰性對照抗體NC1(B7H3結合域被替換成非相關抗體，但保留CD3結合域)不與A498結合。同樣地，雙特異抗體118、127和132，MGD009以及NC2與CT26/hB7H3有強結合(見第2B圖)，而不與未表達B7H3的CT26細胞系(見第2C圖)結合，也充分說明測試的雙特異抗體特異地與細胞膜表面B7H3靶點結合。抗體118、127和132與MGD009結合能力的差別，在B7H3過表達細胞系CT26/hB7H3上比A498細胞系上更加明顯，預示著B7H3雙價的雙特異抗體，相比起B7H3單價的雙特異抗體MGD009，在高表達B7H3細胞上的結合優勢更為顯著，會有更好的安全窗口。

雙特異抗體118、127和132以及陰性對照抗體NC1均能與Jurkat重組細胞系結合(見第2D圖)，呈梯度依賴效應。其中118和NC1與Jurkat重組細胞結合能力與MGD009相當，而127和132的結合能力略弱，可能由於CD3結合域在B7H3結合域和FC之間，與Jurkat重組細胞結合受到一定空間位阻的影響。不含CD3結合域的陰性對照抗體NC2不與Jurkat重組細胞結合，說明雙特異抗體與Jurkat的結合是CD3靶點特異的。

測試例3、體外PBMC殺傷實驗

雙特異抗體介導的PBMC對腫瘤細胞的殺傷實驗藉由定量檢測細胞增殖情況來實現的。利用Cell Titer-glo檢測細胞中ATP的含量，而ATP是活細胞新陳代謝的一個指標，直接與培養物中的細胞數量成正比。

共用了四種不同的靶細胞(target cell，T)，包括三種不同B7H3表達水平的腫瘤細胞系(A498，U87(中科院細胞庫，TCHu138)，Detroit562(ATCC，CCL-138))，和一種不表達B7H3的陰性對照細胞系CHOK1(ATCC,CCL-61)。效應細胞(effector cell,E)是來自健康志願者的PBMC。將靶細胞接種在96孔板中，過夜培養，次日，每孔加入等量的新鮮抽提的PBMC和梯度稀釋的待測雙特異抗體(最高終濃度為300nM，1：3稀釋)，或PBS(對照(control)，有效應細胞和靶細胞，無抗體)。設置空白對照(blank，只有培養基，沒有細胞或抗體)，E：T的比例，對於A498，U87，Detroit562和CHOK1細胞，分別為10：1，5：1，5：1，5：1。培養48小時，用Cell Titer-glo檢測(參照說明書)，酶標儀讀取信號值，並最終換算成抑制率，用Graphpad Prism 5對數據進行處理分析。

抑制率%(Inhibition %)=100%-(信號值_樣本-信號值_空白)/(信號值_對照-信號值_空白)

(Inhibition %=100%-(Signal_sample-Signal_blank)/(Signal_control-Signal_blank))

3.1 含不同親和力CD3抗原結合結構域的抗體比較

使用不同親和力的CD3 scFv，構建的不同雙特異抗體，呈現出不同的體外靶細胞殺傷療效(見第3A圖和第3B圖)，以分別含有HRH5和HRH6的雙特異性抗體155、156、185和186的殺傷療效最弱，這點與Biacore親和力的檢測結果一致。

3.2 B7H3單價和雙價雙特異性抗體的比較

對於含有不同抗CD3抗體重鏈可變區的scFv構建成的雙特異性抗體，以AFF3(該結構示例性抗體為131和177)和AF3(該結構示例性抗體為181和187)結構比較為例(見第4A圖和第4B圖)，CD3-B7H3的AFF3結構B7H3雙價雙特異性抗體，比AF3結構的B7H3單價雙特異性抗體，在體外細胞殺傷活性上明顯增強。這一點適用於所有含不同CD3 VH的雙特異性抗體。

3.3 B7H3雙價雙特異性抗體不同結構排序分子結構對腫瘤殺傷活性的影響

對具有相同抗原結合結構域組件不同結構順序的B7H3雙價雙特異性抗體分子161、162、113和126(見第5A圖)，以及113與143(見第5B圖)的腫瘤細胞殺傷活性進行平行試驗，上述分子都使用HRH2作為CD3抗原結合結構域中的重鏈可變區。結果顯示，不同結構順序的B7H3雙價特異性抗體分子對A498細胞均有顯著的殺傷作用。其中161、162、113和126的殺傷活性與MGD009的殺傷活性相當或略優於MGD009。不同結構排列順序對B7H3雙價雙特異性抗體的腫瘤細胞殺傷活性影響不大。

3.4 雙特異抗體對不同B7H3表達水平的腫瘤細胞系均有殺傷療效

測試了三個待測雙特異抗體118、127和132在A498、U87和Detroit562腫瘤細胞系上的體外殺傷效果。殺傷療效與B7H3表達水平呈正相關，例如118在A498、U87和Detroit562上的EC50分別為0.34、2.4和14.5nM。三個抗體分子均顯示出這一趨勢。所有雙特異抗體對B7H3陰性的對照細胞系CHOK1均沒有殺傷，且陰性對照雙特異抗體NC1在所有靶細胞系上也沒有殺傷效果，這兩點共同說明細胞殺傷需要藉由雙特異抗體將效應細胞重定向到B7H3陽性的靶細胞，進行靶點特異性殺傷。

3.5 不同結構雙特異性抗體對A498細胞的殺傷比較

測試了三個待測雙特異抗體127與201、202在A498腫瘤細胞系上的體外殺傷效果。結果顯示(見第5C圖)三個結構的雙特異性抗體均有腫瘤的殺傷活性，其中雙特異性抗體127的殺傷活性優於201和202。

測試例4、體外T細胞活化實驗

雙特異抗體對T細胞的活化功能的檢測，是利用Jurkat重組細胞系，在有或沒有A498腫瘤細胞系存在的情況下，檢測Jurkat被激活後NFAT驅動的螢光素酶報告基因(luciferase)的表達。

接種A498細胞於96孔細胞培養板上(1×10⁵/ml，100μL/孔)，放置於37℃，5%CO₂培養箱培養20-24h。次日，移除細胞培養上清後，向每孔加入90μl的Jurkat重組細胞懸液(5.5×10⁵/ml)，和10μl梯度稀釋的待測雙特異抗體(最高500nM的終濃度，1：3梯度稀釋)，並設置陰性對照(對照(control)，有A498和Jurkat重組細胞，無抗體)和空白對照(blank，只有培養基，沒有細胞或抗體)，置於37℃，5%CO₂培養箱培養5-6h。非腫瘤細胞特異的Jurkat重組細胞活化，則是直接向空白96孔培養板中加入Jurkat重組細胞和待測抗體。共培養結束後，每孔中加入100μl的Bright-Glo Reagent(Bright-Glo^TM Luciferase Assay System，Promega,Cat#：E2620)，置於室溫放置5-10min，使用多功能酶標儀讀取化學發光信號值，螢光增強倍數(Fold increase)的計算公式為：增強倍數=((信號值_樣本-信號值_空白)/(信號值_對照-信號值_空白)

(Fold increase=(Signal_sample-Signal_blank)/(Signal_control-Signal_blank))

4.1 不同排列順序的B7H3雙價分子均能有效激活T細胞

將B7H3雙價雙特異性抗體118、127和132分別在A498存在或或不存在的情況下檢測Jurkat重組細胞的激活情況，以驗證雙特異性抗體對T細胞的特異性和非特異性激活效果。結果顯示，不同排列順序的B7H3雙價雙特異抗體118、127和132在腫瘤細胞系A498存在的情況下(見第6A圖)，都能有效地激活Jurkat重組細胞系，顯著地誘導螢光素酶的表達，因為陰性對照抗體NC1不能誘導螢光素酶的表達，可以證明Jurkat重組細胞的激活是B7H3靶點特異的。Jurkat重組細胞的激活，需要藉由雙特異抗體共募集表達CD3的Jurkat重組細胞和表達B7H3的腫瘤細胞才能實現，在只有Jurkat重組細胞，沒有A498細胞時(見第6B圖)，螢光素酶的表達非常低，只有在最高的幾個抗體濃度點能檢測到一些弱信號。

4.2 B7H3單價和雙價雙特異性抗體的比較

雙價CD3-B7H3雙特異性抗體較B7H3單價的雙特異抗體，在靶點特異的T細胞激活明顯增強，這與測試例3中，B7H3雙價比B7H3單價分子的體外腫瘤殺傷能力增強相一致。與此同時，非靶點特異的T細胞激活保持不變。因此，B7H3雙價分子(131)比B7H3單價分子(181)具有更強的藥效(見第7A圖)，但因T細胞非特異激活而帶來的副作用並沒有增強(見第7B圖)。

測試例5、體外細胞因子分泌實驗

效應細胞在雙特異抗體的介導下重定向靶細胞，在殺傷靶細胞的同時，釋放細胞因子。其中細胞因子分泌是藉由ELISA的方法定量檢測細胞培養上清中的細胞因子含量，包括IL2、IFNγ、TNFα。

實驗設計和所用抗體與測試例4所描述相同，在體外殺傷實驗的終點收集細胞培養上清，至96孔板中(Corning#3795)，放置-20℃保存備用。ELISA實驗時，取出凍存的培養上清，室溫融化，3500rpm，離心10mins，收集上清用於ELISA實驗。ELISA步驟詳見試劑盒中的說明書(Human IL-2 ELISA kit、Human IFN-γ ELISA Kit、Human TNF-α ELISA kit、欣博盛，Cat # EHC003.96、EHC102g.96,EHC103a.96)。

結果表明，測試雙特異抗體在PBMC和B7H3陽性的靶細胞A498共存在時(參見第8A圖至第8C圖)，均能有效誘導PBMC分泌IL2、IFNγ和TNFα，其中以MGD009和118所誘導的細胞因子分泌水平最高，其次為127和132，而陰性對照抗體NC1所誘導的細胞因子分泌不在檢測靈敏度範圍內。在PBMC和B7H3陰性細胞CHOK1共存在時(參見第9A圖至第9C圖)，MGD009在最高的三個濃度點能明顯地誘導IFNγ和TNFα的釋放，而待測的三個雙特異抗體，118、127和132則不能誘導IFNγ和TNFα的釋放，預示著三個待測雙特異抗體相比起MGD009，在非靶點特異的細胞因子分泌上具有更好的安全性。

測試例6、人PBMC重建的小鼠A498模型的藥效實驗

本測試例利用人PBMC重建的NOG小鼠(北京維通利華實驗動物有限公司)A498模型(ATCC)來評價本發明測試CD3-B7H3雙特異性抗體在小鼠體內的抗腫瘤療效。

將A498細胞5×10⁶個細胞/小鼠/100μl(含50% matrigel)接種於NOG小鼠右肋部皮下，當荷瘤小鼠腫瘤體積達到130-150mm³左右時將小鼠隨機分組，每組5-6隻，並將分組當天定義為該實驗第0天。於第0天或第1天將新鮮抽提的2名志願者的PBMC以1：1比例混合，以5×10⁶個細胞/100μl注射到NOG小鼠腹腔，並開始腹腔注射各抗體，每週2次，共給藥6次，每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。Vehicle是以PBS緩衝液代替抗體給藥的陰性對照組。

抗體118和119在較低的劑量下(第10A圖)已經呈現出一定的抑瘤療效，且呈劑量依賴效應。其中抗體118在實驗終點時(第20天)，0.01mpk和0.03mpk劑量下的抑瘤率(TGI)分別為22.17%和60.39%。

抗體113在第14天時，已經顯示出一定的抑瘤效果，0.6mpk和0.3mpk劑量組(第10B圖)抑瘤率分別達到70.05%(p<0.05)和60.78%(p<0.05)，至第20天時，抑瘤效果繼續增強且呈劑量依賴性，抑瘤率分別為大於100%(p<0.001)和77.92%(p<0.05)。

在0.12mpk和0.36mpk劑量條件下(第10C圖)，抗體118在第12天時，0.12mpk和0.36mpk的劑量已經分別可以達到39.18%和57.44%(p<0.001)，至第21天時的抑瘤率分別增至81.72%(p<0.01)和大於100%(p<0.001)，其中0.36mpk劑量下，甚至有一隻小鼠的腫瘤完全消退(1/6)。

在0.36mpk劑量條件下(第10D圖)，抗體126在第21天時抑瘤率達到47.78%(p<0.01)。抗體128在第19天已經顯示出顯著抑瘤效果(TGI=56.37%)，至Day21時，抑瘤率升至69.28%(p<0.001)。抗體127mpk，在第12天抑瘤率達到76.20%(p<0.001)，至第21天時，抑瘤效果繼續增強，抑瘤率大於100%(p<0.001)，5隻動物中，有3隻的腫瘤體積與分組時相比，發生了回縮，另外2隻的腫瘤完全消退。

抗體127的抗腫瘤活性，在另一次實驗中得到了重複(第10E圖)，第14天時的抑瘤率達到90.6%(p<0.001)，至第17天時抑瘤率增到95.80%(p<0.001)。127在較低劑量(0.12mpk)以及較低頻率給藥(每週1次，127-0.36mpk-qw)時仍舊有效，在第17天的抑瘤率分別達到51.37%(p<0.001)和96.20%(p<0.001)。

測試例7、hCD3 KI小鼠模型的藥效實驗

本實驗在Balb/c-hCD3小鼠皮下接種CT26-hB7H3腫瘤細胞系(CT26細胞來源於中科院細胞庫，TCM37，經過表達hB7H3，獲得CT26-hB7H3細胞)，來評價本發明CD3-B7H3雙特異性抗體在小鼠體內對腫瘤生長的抑制作用。

雌性hCD3E Balb/c轉基因小鼠，購自南大模式所(合格證編號201801374/5/6，許可證SCXK(蘇)2015-0001)。

將CT26-hB7H3細胞8×10⁵個細胞/小鼠/100μl接種於hCD3小鼠右肋部皮下。當荷瘤小鼠腫瘤體積達到約80-120mm³左右時將小鼠隨機分組，每組7隻。將分組當天定義為該實驗第0天，並開始腹腔註射各抗體，每週2次，共給藥5次，每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。Vehicle是以PBS緩衝液代替抗體給藥的陰性對照組。

結果顯示，抗體118在1mpk劑量下在初次給藥後即顯示出較強藥效(第11A圖)，第13天抑瘤率為38.34%(p<0.05)。

抗體132在3.6mpk劑量下具有抑制腫瘤生長的趨勢(第11B圖)，第13天抑瘤率達到26.35%。

測試例8、大鼠體內PK實驗

本實驗在SD大鼠尾靜脈注射CD3-B7H3雙特異性抗體，檢測不同時間點大鼠血清中的抗體濃度，以此來評價CD3-B7H3雙特異性抗體在SD大鼠體內的代謝。

大鼠尾靜脈注射受試藥物3mg/kg，給藥體積為5mL/kg。於給藥前及給藥後5min、8h、1d、2d、4d、7d、10d、14d、21d、28d各時間點采血。採用ELISA方法檢測血清中的抗體濃度，分別使用兩種不同的ELISA方法，B7H3抗原(1μg/mL)或者CD3抗原(1μg/mL)鋪板，anti-human Fc-HRP(abcam,ab98624)作為二抗。採用Winnolin軟體計算受試藥物的藥動學參數，所得主要藥動學參數見表17。

抗體118、127和132在B7H3抗原結合區域的半衰期在4.9-8.1天，略長於MGD009，達到普通IgG抗體水平，CD3抗原結合區域的半衰期為3.2-5.6天。其中，抗體118在B7H3和CD3兩個不同抗原結合區域的動力學參數相差不大，說明該分子在體內的完整性較好，半衰期分別為4.9和4.4天。抗體127在B7H3和CD3兩個不同抗原結合區域的半衰期分別為4.9和3.2天，在暴露量和清除速率上相差較為明顯，以CD3部分較差，由於CD3部分在該分子結構的內部，更可能由於CD3部分結合功能變弱而不是分子斷裂造成。抗體132是在抗體127分子序列的基礎上，在B7H3 scFv內部加入了一對二硫鍵，此改造大大提高了分子的半衰期(65-75%)，在暴露量和清除速率上也有較大的改善。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司上海恆瑞醫藥有限公司

<120> 多特異性蛋白分子

<150> 201811491691.4

<151> 2018-12-7

<160> 104

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 檢測用人B7H3抗原

<400> 1

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 檢測用猴B7H3抗原

<400> 2

<210> 3

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 檢測用鼠B7H3抗原

<400> 3

<210> 4

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 人B7H3全長胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 猴B7H3全長胺基酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 鼠B7H3全長胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 VH

<400> 7

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 VL

<400> 8

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 HCDR1

<400> 9

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 HCDR2

<400> 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 HCDR3

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 LCDR1

<400> 12

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 LCDR2

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> h1702 LCDR3

<400> 14

<210> 15

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> B7H3 VH44C

<400> 15

<210> 16

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> B7H3 VL103C

<400> 16

<210> 17

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 人CD3 ε

<400> 17

<210> 18

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 人CD3 δ

<400> 18

<210> 19

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 猴CD3 ε

<400> 19

<210> 20

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 猴CD3 δ

<400> 20

<210> 21

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 鼠CD3 ε

<400> 21

<210> 22

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 鼠CD3 δ

<400> 22

<210> 23

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 人CD3 ε全長胺基酸序列

<400> 23

<210> 24

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 人CD3 δ全長胺基酸序列

<400> 24

<210> 25

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 猴CD3 ε全長胺基酸序列

<400> 25

<210> 26

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 猴CD3 δ全長胺基酸序列

<400> 26

<210> 27

<211> 189

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 鼠CD3 ε全長胺基酸序列

<400> 27

<210> 28

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 鼠CD3 δ全長胺基酸序列

<400> 28

<210> 29

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-1

<400> 29

<210> 30

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-2

<400> 30

<210> 31

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-3

<400> 31

<210> 32

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-4

<400> 32

<210> 33

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-5

<400> 33

<210> 34

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-6

<400> 34

<210> 35

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-7

<400> 35

<210> 36

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRL

<400> 36

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-1 HCDR1

<400> 37

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-1 HCDR2

<400> 38

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-1 HCDR3

<400> 39

<210> 40

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-2 HCDR2

<400> 40

<210> 41

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-2 HCDR3

<400> 41

<210> 42

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-3 HCDR3

<400> 42

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-4 HCDR3

<400> 43

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-5 HCDR1

<400> 44

<210> 45

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-5 HCDR3

<400> 45

<210> 46

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-6 HCDR2

<400> 46

<210> 47

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRH-7 HCDR2

<400> 47

<210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRL LCDR1

<400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRL LCDR2

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HRL LCDR3

<400> 50

<210> 51

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> B7H3-scFv1

<400> 51

<210> 52

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> B7H3-scFv2

<400> 52

<210> 53

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> B7H3-scFv3

<400> 53

<210> 54

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> B7H3-scFv4

<400> 54

<210> 55

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv1H

<400> 55

<210> 56

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv2H

<400> 56

<210> 57

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv3H

<400> 57

<210> 58

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv4H

<400> 58

<210> 59

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv5H

<400> 59

<210> 60

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv6H

<400> 60

<210> 61

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv7H

<400> 61

<210> 62

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv1L

<400> 62

<210> 63

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv2L

<400> 63

<210> 64

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv3L

<400> 64

<210> 65

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv4L

<400> 65

<210> 66

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv5L

<400> 66

<210> 67

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv6L

<400> 67

<210> 68

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CD3-scFv7L

<400> 68

<210> 69

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> knob-Fc

<400> 69

<210> 70

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> hole-Fc

<400> 70

<210> 71

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 113第二多肽鏈

<400> 71

<210> 72

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 113第一多肽鏈

<400> 72

<210> 73

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 118第一條多肽鏈

<400> 73

<210> 74

<211> 732

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 119第一多肽鏈

<400> 74

<210> 75

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 126第一多肽

<400> 75

<210> 76

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 127第一多肽

<400> 76

<210> 77

<211> 739

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 128第一多肽

<400> 77

<210> 78

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 132第一多肽

<400> 78

<210> 79

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 131第一多肽

<400> 79

<210> 80

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 154第一多肽

<400> 80

<210> 81

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 156第一多肽

<400> 81

<210> 82

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 155第一多肽

<400> 82

<210> 83

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 177第一多肽

<400> 83

<210> 84

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 172第一多肽

<400> 84

<210> 85

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 171第一多肽

<400> 85

<210> 86

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 161第一多肽

<400> 86

<210> 87

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 162第一多肽

<400> 87

<210> 88

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 142第二多肽

<400> 88

<210> 89

<211> 730

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> NC1鏈1

<400> 89

<210> 90

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> NC1鏈2

<400> 90

<210> 91

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> NC2鏈1

<400> 91

<210> 92

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> NC2鏈2

<400> 92

<210> 93

<211> 730

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> NC3鏈1

<400> 93

<210> 94

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> NC3鏈2

<400> 94

<210> 95

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> MGD009鏈1

<400> 95

<210> 96

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> MGD009鏈2

<400> 96

<210> 97

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> MGD009鏈3

<400> 97

<210> 98

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 連接子

<400> 98

<210> 99

<211> 513

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> 201鏈1

<400> 99

<210> 100

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> 201鏈2

<400> 100

<210> 101

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> 202鏈1

<400> 101

<210> 102

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> 202鏈2

<400> 102

<210> 103

<211> 692

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> 202鏈3

<400> 103

<210> 104

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> 202鏈4

<400> 104

Claims

一種多特異性蛋白分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：

該第一多肽鏈從胺基末端至羧基末端依次包含針對第一靶抗原的第一結合區、針對第二靶抗原的第二結合區和第一Fc區，

該第二多肽鏈從胺基末端至羧基末端依次包含針對第三靶抗原的第三結合區和第二Fc區，

該第二結合區和/或第三結合區不包含抗體的恆定區結構域，

該第一多肽鏈和所述第二多肽鏈鏈內各區域由肽鍵和/或接頭連接。
如申請專利範圍第1項所述的多特異性蛋白分子，其中，該第一結合區、和/或該第二結合區、和/或該第三結合區是單鏈抗體。
如申請專利範圍第1或2項所述的多特異性蛋白分子，其中，該第二靶抗原為CD3，且該第一靶抗原和第三靶抗原為相同或不同的腫瘤相關抗原；或

該第一靶抗原為CD3，且該第二靶抗原和第三靶抗原為相同或不同的腫瘤相關抗原。
如申請專利範圍第1至3項任一項所述的多特異性蛋白分子，其中，該腫瘤相關抗原選自AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白質、BCMA、BIRC5、BIRC7、β-連環蛋白、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8、CALR、CCR5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin 18.2、週期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白、GD2、GD3、GloboH、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、GM3、 gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE蛋白、MART-1、間皮素、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、CA-125、MUM1、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA、RAGE蛋白質、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、湯-諾氏抗原、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶、尿溶蛋白-3和5T4。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的多特異性蛋白分子，其中，該第一多肽鏈具有如下式I的結構：

V_a1-L1-V_b1-L2-V_c2-L2-V_d2-L4-Fc1 式I，

該第二多肽鏈具有如下式II的結構：

V_e3-L5-V_f3-L6-Fc2 式II，

該V_a1、V_b1、V_c2、V_d2、V_e3和V_f3為抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區，且該V_a1和V_b1，該V_c2和V_d2，與該V_e3和V_f3分別不同時為輕鏈可變區或不同時為重鏈可變區。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的多特異性蛋白分子，其中，該第一多肽鏈具有如下所示的結構：

VH_TAA-L1-VL_TAA-L2-VH_CD3-L3-VL_CD3-L4-Fc1，

VH_TAA-L1-VL_TAA-L2-VL_CD3-L3-VH_CD3-L4-Fc1，

VL_TAA-L1-VH_TAA-L2-VH_CD3-L3-VL_CD3-L4-Fc1，

VL_TAA-L1-VH_TAA-L2-VL_CD3-L3-VH_CD3-L4-Fc1，

VH_CD3-L1-VL_CD3-L2-VH_TAA-L3-VL_TAA-L4-Fc1，

VH_CD3-L1-VL_CD3-L2-VL_TAA-L3-VH_TAA-L4-Fc1，

VL_CD3-L1-VH_CD3-L2-VH_TAA-L3-VL_TAA-L4-Fc1或

VL_CD3-L1-VH_CD3-L2-VL_TAA-L3-VH_TAA-L4-Fc1；

且該第二多肽鏈具有如下所示的結構：

VL_TAA-L5-VH_TAA-L6-F_C2或VH_TAA-L5-VL_TAA-L6-F_C2。
如申請專利範圍第1至6項任一項所述的多特異性蛋白分子，其中，該第一Fc區和所述第二Fc區是相同的Fc或不同的Fc。
如申請專利範圍第7項所述的多特異性蛋白分子，其中，該第一Fc區為knob-Fc，該第二Fc區為hole-Fc；或

該第一Fc區為hole-Fc，該第二Fc區為knob-Fc。
如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的多特異性蛋白分子，其中，該第一Fc區的羧基端連接His標簽或第二Fc區的羧基端連接His標簽。
如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的多特異性蛋白分子，其中，針對CD3的抗原結合區包含抗體輕鏈可變區和重鏈可變區，其中，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：48、49和50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和該重鏈可變區為選自以下i)至v)任一項的重鏈可變區：

i)包含分別如SEQ ID NO：37、38和39所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈可變區；

ii)包含分別如SEQ ID NO：37、40和41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈可變區；

iii)包含分別如SEQ ID NO：37、40和42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈可變區；

iv)包含分別如SEQ ID NO：37、40和43所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈可變區；或

v)包含分別如SEQ ID NO：37、47和45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重鏈可變區。
如申請專利範圍第10項所述的多特異性蛋白分子，其中，針對CD3的抗原結合區包含如SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區，和/或選自如SEQ ID NO：29、30、31、32和35中任一項所示的重鏈可變區。
如申請專利範圍第11項所述的多特異性蛋白分子，其中，針對CD3的抗原結合區包含如SEQ ID NO：55、56、57、58、61、62、63、64、65或68所示的單鏈抗體。
如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的多特異性蛋白分子，其中，該腫瘤相關抗原為B7H3，針對B7H3的抗原結合區包含抗體輕鏈可變區和重鏈可變區，其中：

該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：12、13和14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：9、10和11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第13項所述的多特異性蛋白分子，其中，針對B7H3的抗原結合區包含：

如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區和/或如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區；

或如SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區和/或如SEQ ID NO：15所示的重鏈可變區。
如申請專利範圍第14項所述的多特異性蛋白分子，其中，針對B7H3的抗原結合區包含如SEQ ID NO：51、52、53或54所示的單鏈抗體。
如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的多特異性蛋白分子，包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈選自胺基酸序列如SEQ ID NO：72、73、74、75、76、77、78、79、80、83、84、85、86或87所示的多肽，和/或該第二多肽鏈選自胺基酸序列如SEQ ID NO：71、88或70所示的多肽。
一種多特異性蛋白分子，包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：71、88或70所示，和：

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：73所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：76所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：83所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：84所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示；

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示；或者

該第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：87所示。
一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的多特異性蛋白分子，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
一種分離的核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至17項中任一項所述的多特異性蛋白分子。
一種重組載體，其包含申請專利範圍第19項所述的分離的核酸分子。
一種用如申請專利範圍第20項所述的重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
如申請專利範圍第21項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為真核細胞。
如申請專利範圍第22項所述的宿主細胞，其中，該真核細胞為哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
一種用於生產如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的多特異性蛋白分子的方法，該方法包括將申請專利範圍第21項所述的宿主細胞在培養基中進行培養以形成並積累申請專利範圍第1至17項中任一項所述的多特異性蛋白分子，以及從培養物回收所述多特異性蛋白分子的步驟。
一種申請專利範圍第1至17項中任一項所述的多特異性蛋白分子或申請專利範圍第18項所述的醫藥組成物，或申請專利範圍第19項所述的分離的核酸分子的作為藥物的用途。
如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該藥物為激活T細胞的藥物。
如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該藥物為治療癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病的藥物。