TW202035455A

TW202035455A - 抗ｏｘ４０抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

Info

Publication number: TW202035455A
Application number: TW108134634A
Authority: TW
Inventors: 廖成; 徐祖朋; 蔣家驊; 葉鑫; 張連山
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-10-01
Also published as: US20210355229A1; MX2021003168A; WO2020063660A1; CN112513088A; BR112021005169A2; EP3858857A1; KR20210069058A; AU2019347934A1; CN112513088B; US12227583B2; CA3113541A1; JP2022502417A

Abstract

本公開涉及抗OX40抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本公開涉及一種嵌合抗體、人源化抗體，其包含來自所述抗OX40抗體及其抗原結合片段的CDR區，以及還涉及包含所述抗OX40抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，及其作為治療癌症的藥物的用途。

Description

抗OX40抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

本申請要求2018年09月26日提交的201811128669.3和2018年11月26日提交的201811417666.1的優先權。

本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種抗OX40抗體、其抗原結合片段，包含所述抗OX40抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗OX40抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。

癌症是當今人類社會長期面臨的嚴峻健康挑戰。對於已擴散的實體腫瘤，傳統的手術、化療和放療等療法往往收效甚微。

腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域一個持續熱點。最近研究已證明，增強抗腫瘤T細胞功能可以用於抵抗癌症。有大量證據表明，腫瘤細胞藉由誘導主要由調節T淋巴細胞(Treg；Quezda et al.Immunol Rev 2011；241：104-118)介導的主動免疫耐受，而“逃避”免疫系統。因此，效應T淋巴細胞(Teff)與耐受原性(tolerogenic)Treg之間的平衡，對於有效抗腫瘤免疫治療至關重要。因此，可以藉由增強腫瘤特異性Teff的效應功能和/或藉由減弱腫瘤特異性Treg的抑制功能，獲得有效的抗腫瘤免疫應答。

CD134(OX40)受體已被證明是介導這些應答的一種關鍵受體(Sugamura,K,Ishii,N,Weinberg,A.Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40.Nature Rev Imm 2004；4：420-431)。

OX40是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的成員之一，是一種在細胞表面表達的分子量約50kDa的糖蛋白。OX40的胞外配體結合結構域由4個富含半胱胺酸的結構域(CRD)組成。OX40的天然配體是OX40L(CD252)，兩者形成OX40-OX40L複合物。

OX40主要表達在激活的T細胞上，OX40是次級共刺激分子，在激活後24-72小時後表達。OX40的配體OX40L主要表達在在激活的抗原遞呈細胞上。表達OX40的T淋巴細胞已被證實存在於各種人惡性腫瘤及癌症患者的引流淋巴結中。在嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠模型中，OX40與OX40L結合結構域相互作用可增強抗腫瘤免疫，導致各種人惡性腫瘤細胞系，如淋巴瘤、前列腺癌、結腸癌及乳腺癌的腫瘤生長抑制。

目前，有多家國際製藥公司在研發針對OX40的單株抗體。OX40抗體藉由特異性刺激，激活免疫，提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，達到對腫瘤細胞進行殺傷的目的。相關專利如WO2013038191、WO2015153513、WO2016179517、WO2017096182、CN110078825A、WO2016196228等。迄今為止，阿斯利康、BMS等公司各自開發的抗OX40 抗體已在II期臨床試驗之中，而基因泰克、GSK等公司的相關產品也已處在臨床試驗階段。

但是，上述藥物在治療效果方面仍有可提高的空間。因此，有必要繼續開發具有高選擇性、高親和力和良好藥效的抗OX40抗體。

本公開提供一種抗OX40抗體或其抗原結合片段，所述抗體與人OX40特異性結合，並包如下所示的CDR：(i)分別如SEQ ID NO：3、4、5所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3或與SEQ ID NO：3、4、5所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；和/或，分別如SEQ ID NO：6、7、8所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3或與SEQ ID NO：6、7、8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體；具體地，分別如SEQ ID NO：3、4、5所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3和分別如SEQ ID NO：6、7、8所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3；或(ii)分別如SEQ ID NO：11、12、13所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3或與SEQ ID NO：11、12、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；和/或，分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3或與SEQ ID NO：14、15、16所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體；具體地，分別如SEQ ID NO：11、12、13所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3和分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3；或(iii)分別如SEQ ID NO：11、33、13所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3或與SEQ ID NO：11、33、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；和/或，分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3或與SEQ ID NO：14、15、16所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體；具體地，分別如SEQ ID NO：11、33、13所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3和分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3；或(vi)分別如SEQ ID NO：11、34、13所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3或與SEQ ID NO：11、34、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；和/或，分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3或與SEQ ID NO：14、15、16所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體；具體地，分別如SEQ ID NO：11、34、13所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3和分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3。

在一些實施方案中，該抗OX40抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其片段，具體地，人源化抗體。

在一些實施方案中，該單株抗體或抗原結合片段的CDR(包括3個重鏈CDR和3個輕鏈CDR)允許包含3、2或1個胺基酸差異(即CDR變體)，CDR變體是藉由親和力成熟方法篩選獲得的。

在一些實施方案中，該單株抗體或抗原結合片段與OX40的親和力(KD)小於10^-8M、小於10^-9M或小於10^-10M。

在一些實施方案中，其中該鼠源抗體包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區：(i)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示；或與SEQ ID NO：1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性；和/或，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或與SEQ ID NO：2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性；(ii)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示；或與SEQ ID NO：9具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性；和/或，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示；或與SEQ ID NO：10具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。

在一些實施方案中，其中該人源化抗體包含來源於人種系的FR區或其突變序列。

在一些實施方案中，其中該人源化抗體包含選自：(i)重鏈可變區，其是SEQ ID NO：17、18、31、32中任一項所示；或與SEQ ID NO：17、18、31、32具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性；或(ii)重鏈可變區，其是SEQ ID NO：26、27、28、29、30中任一項所示；或與SEQ ID NO：26、27、28、29、30具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。

在一種實施方案中，其中該抗OX40抗體或其抗原結合片段包含：(i)輕鏈可變區，其是SEQ ID NO：19或20所示；或與SEQ ID NO：19或20具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性；或(ii)輕鏈可變區，其是SEQ ID NO：21、22、23、24、25中任一項所示；或與SEQ ID NO：21、22、23、24、25具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。

在一些具體實施方案中，抗OX40抗體或其抗原結合片段包含：(i)如SEQ ID NO：17、18、31、32中任一項所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：19或20所示的輕鏈可變區；或(ii)如SEQ ID NO：26、27、28、29、30中任一項所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：21、22、23、24、25中任一項所示的輕鏈可變區。

在一些具體實施方案中，抗OX40抗體或其抗原結合片包含如下所示的可變區：(1)重鏈可變區如SEQ ID NO：17所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：19所示；(2)重鏈可變區如SEQ ID NO：18所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：19所示；(3)重鏈可變區如SEQ ID NO：31所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：19所示；(4)重鏈可變區如SEQ ID NO：32所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：19所示；(5)重鏈可變區如SEQ ID NO：17所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：20所示；(6)重鏈可變區如SEQ ID NO：18所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：20所示；(7)重鏈可變區如SEQ ID NO：31所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：20所示；和(8)重鏈可變區如SEQ ID NO：32所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：20所示。

在一些實施方案中，抗OX40抗體或其抗原結合片包含如下所示的可變區：(1)重鏈可變區如SEQ ID NO：26所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：21所示；(2)重鏈可變區如SEQ ID NO：26所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：22所示；(3)重鏈可變區如SEQ ID NO：26所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：23所示；(4)重鏈可變區如SEQ ID NO：26所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：24所示；(5)重鏈可變區如SEQ ID NO：26所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：25所示；(6)重鏈可變區如SEQ ID NO：27所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：21所示；(7)重鏈可變區如SEQ ID NO：27所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：22所示；(8)重鏈可變區如SEQ ID NO：27所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：23所示；(9)重鏈可變區如SEQ ID NO：27所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：24所示；(10)重鏈可變區如SEQ ID NO：27所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：25所示；(11)重鏈可變區如SEQ ID NO：28所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：21所示； (12)重鏈可變區如SEQ ID NO：28所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：22所示；(13)重鏈可變區如SEQ ID NO：28所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：23所示；(14)重鏈可變區如SEQ ID NO：28所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：24所示；(15)重鏈可變區如SEQ ID NO：28所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：25所示；(16)重鏈可變區如SEQ ID NO：29所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：21所示；(17)重鏈可變區如SEQ ID NO：29所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：22所示；(18)重鏈可變區如SEQ ID NO：29所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：23所示；(19)重鏈可變區如SEQ ID NO：29所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：24所示；(20)重鏈可變區如SEQ ID NO：29所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：25所示；(21)重鏈可變區如SEQ ID NO：30所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：21所示；(22)重鏈可變區如SEQ ID NO：30所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：22所示；(23)重鏈可變區如SEQ ID NO：30所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：23所示； (24)重鏈可變區如SEQ ID NO：30所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：24所示；和(25)重鏈可變區如SEQ ID NO：30所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO：25所示。

在一些實施方案中，其中該抗OX40抗體包含恆定區；在一些具體實施方案中，該抗體為嵌合抗體或人源化抗體，該抗體的重鏈恆定區源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突變序列，輕鏈恆定區源自人κ、λ鏈或其突變序列；在另一些具體實施方案中，該重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：35所示或與SEQ ID NO：35具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性，該輕鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：36所示或與SEQ ID NO：36具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。

在一些實施方案中，抗OX40抗體重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：39或37所示或與SEQ ID NO：39或37具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性，和/或，該抗OX40抗體輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：40或38所示或與SEQ ID NO：40或38具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。

在一種實施方案中，其中該抗OX40抗體包含：(i)重鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：37所示或與SEQ ID NO：37具有至少85%序列同一性，和輕鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：38所示或與SEQ ID NO：38具有至少85%序列同一性；或(ii)重鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：39所示與SEQ ID NO：39具有至少85%序列同一性，和輕鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：40或與SEQ ID NO：40具有至少85%序列同一性。

本公開還提供一種抗OX40抗體或其抗原結合片段，該抗OX40抗體或其抗原結合片段與前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段競爭性結合人OX40，或與前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段結合相同的OX40抗原表位。

本公開還提供一種醫藥組成物，其含有：- 治療/預防有效量的如上所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，以及- 一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。

在一些具體的實施方案中，該醫藥組成物可以製備成單位劑量形式，其單位劑量中可含有0.01至99重量%的抗OX40抗體或其抗原結合片段；或醫藥組成物單位劑量中含單株抗體或其抗原結合片段的量為0.1-2000mg，在一些具體實施方案中，單株抗體或其抗原結合片段的量為1-1000mg。

在一些具體的實施方案中，單株抗體或其抗原結合片段可以是組合物中的唯一活性成分；在另一些具體的實施方案中，單株抗體或其抗原結合片段和其它活性成分組合使用。

本公開還提供一種分離的核酸分子，其編碼如上所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。在此處的上下文中，這種核酸分子的互補序列，也包括在本申請範疇內。

本公開還提供一種載體，其包含上述的核酸分子，該載體可以是真核表達載體、原核表達載體或病毒載體。

本公開還提供一種用如上所述的載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。

在一些具體實施方案中，宿主細胞為真核細胞。在一些具體實施方案中，為哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞包括但不限於CHO、HEK293、NSO。應當理解，本公開的宿主細胞不涉及任何能夠發育成人類的細胞。

本公開還提供一種製備如上所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括：- 培養上述宿主細胞，- 然後回收抗體或其抗原結合片段；- 視需要地，對抗體或其抗原結合片段進行純化。

本公開還提供用於檢測或測定人OX40的方法，該方法包括： - 使用上述抗OX40抗體或其抗原結合片段與樣本(例如來源於人)相接觸；- 視需要地，確定樣本中OX40的量、或確定是否存在OX40。

本公開還提供用於檢測或測定人OX40的試劑，該試劑包含上述任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。

本公開還提供用於與人OX40相關的疾病的診斷劑，該診斷劑包含根據上述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。

本公開還提供用於診斷與人OX40相關的疾病的方法，該方法包括使用上述抗OX40抗體或其抗原結合片段檢測或測定人OX40或OX40陽性細胞。

本公開還提供上述抗OX40抗體或其抗原結合片段在製備與人OX40相關的疾病的診斷劑中的應用。

本公開還提供治療疾病或病症的方法，包括向受試者施用有效量的上述抗OX40抗體或其抗原結合片段，或包含上述OX40抗體或其片段的醫藥組成物。

在一些實施方案中，該疾病或病症可以為癌症或細胞增殖性疾病。在一些具體實施方案中，該癌症為肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症。

在一些具體實施方案中，該的血液系統癌症包括但不限於急性及慢性骨髓性白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、骨髓組織增殖性疾病、多發性骨髓瘤、何傑金氏(Hodgkin)疾病、非何傑金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、濾泡中心細胞淋巴瘤、慢性粒細胞白血病。

本公開還提供如上所述抗OX40抗體或其抗原結合片段，或包含上述OX40抗體或其片段的醫藥組成物在製備用於增強人類對象中的免疫應答的藥物中的用途。

本公開還提供如上所述抗OX40抗體或其抗原結合片段，或包含上述OX40抗體或其片段的醫藥組成物在製備用於治療/預防癌症的藥物中的用途。

本公開還提供如上所述抗OX40抗體或其抗原結合片段，或包含上述OX40抗體或其片段的醫藥組成物在製備試劑盒中的用途。

在一些實施方案中，該增強的免疫應答包括T效應細胞的免疫刺激/效應功能的增加，和/或T調節細胞的免疫抑制功能的下調。其中，該增加可以是細胞增殖的結果，該下調可以是細胞數量不增加(或細胞數量降低)的結果。

本公開中提供該抗人OX40抗體或片段用於下述一項或多項：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、殺死表達OX40的細胞(例如表達高水平OX40的細胞)、提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫、增強T細胞功能和/或消減表達OX40的細胞。

本公開提供該抗OX40抗體或片段用於以下的用途：治療癌症、刺激受試者中的免疫反應、刺激抗原特異性T細胞反應、激活或共刺激T細胞、增加T細胞中的細胞因子(例如IL-2及/或IFN-γ)產生、和/ 或T細胞的增殖、減少或耗竭腫瘤中T調控性細胞的數目、和/或抑制腫瘤細胞生長。

本公開亦提供該抗OX40抗體製備藥劑的用途，該藥劑用於：刺激受試者中的免疫反應、刺激抗原特異性T細胞反應、激活或共刺激T細胞、增加T細胞中的IL-2和/或IFN-γ產生和/或T細胞的增殖、減少或耗竭腫瘤中T調控性細胞的數目和/或抑制腫瘤細胞生長。

第1A圖至第1B圖：鼠源抗體和嵌合抗體與人OX40的親和力ELISA檢測結果。其中，第1A圖是鼠源抗體m2G3和嵌合抗體ch2G3的親和力結果，m2G3-NC和ch2G3-NC為陰性對照；第1B圖是鼠源抗體m4B5和嵌合抗體ch4B5的親和力結果，m4B5-NC和ch4B5-NC為陰性對照。

第2圖：抗OX40抗體刺激T細胞分泌IFN-γ的實驗。結果顯示，待測OX40抗體在10ng/mL抗體濃度時即可達到最大刺激效果。

第3A圖至第3B圖：抗OX40抗體小鼠體內抑瘤效果，第3A圖顯示給藥後不同小鼠體內腫瘤體積的變化；第3B圖顯示給藥後，不同抗OX40抗體對小鼠體內腫瘤質量的影響。結果顯示給藥治療後第20天，在給藥量為3mg/kg時，2G3抗體的腫瘤抑制率高達97%。

術語

為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本公開中的它處另有明確定義，否則本公開使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

術語“增強T細胞功能”意指誘導、引起或刺激效應或記憶T細胞，使其具有更新、持續或放大的生物學功能。增強T細胞功能的例子包括：相對於干預前的水平，來自CD8⁺效應T細胞的γ-干擾素分泌升高、來自CD4⁺記憶和/或效應T細胞的γ-干擾素分泌升高、CD4⁺效應和/或記憶T細胞增殖升高、CD8⁺效應T細胞增殖升高、抗原響應性(例如清除)增強。

術語“增強免疫應答”是指刺激、激起、增加、改善或增強哺乳動物免疫系統的應答。免疫應答可以是細胞應答(即細胞介導的，如細胞毒性T淋巴細胞介導的)或者體液應答(即抗體介導的應答)，並且可以是初次或再次免疫應答。增強免疫應答的例子包括增加的CD4⁺輔助T細胞活性及產生細胞毒性T細胞。免疫應答的增強可以用本領域技術人員已知的一些體外或體內測量進行評估，包括但不限於細胞毒性T淋巴細胞測定、細胞因子釋放(例如IL-2的產生)、腫瘤消退、攜帶腫瘤動物的存活、抗體產生、免疫細胞增殖、細胞表面標記表達及細胞毒性。在一個實施方案中，該方法增強細胞免疫應答，特別是細胞毒性T細胞應答。

“腫瘤免疫”指腫瘤逃避免疫識別和清除的過程。作為治療概念，腫瘤免疫在其逃避免疫識別和清除的能力被減弱時，腫瘤被免疫系統識別並攻擊，患者得到治療。腫瘤識別的例子包括腫瘤結合、腫瘤收縮和腫瘤清除。

“T效應細胞”(“Teff”)，指具有細胞溶解活性的T細胞(例如，CD4⁺及CD8⁺ T細胞)以及T輔助(Th)細胞，Teff分泌細胞因子、且激活並引導其他免疫細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。本公開所述抗OX40抗體可激活Teff細胞，例如CD4+及CD8+ Teff細胞。

“調節性T細胞”或“Treg細胞”意指專門化類型的CD4+T細胞，其能阻抑其它T細胞的應答。Treg細胞特徵在於表達CD4、IL-2受體的α亞基(CD25)、和轉錄因子forkhead box P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))，且在誘導和維持外周自體耐受中發揮至關重要作用，該耐受針對腫瘤表達的抗原。

“OX40”是指一種結合OX40配體(OX40-L)的受體，它是TNF-受體超家族的成員。OX40亦稱作腫瘤壞死因子受體超家族成員4(TNFRSF4)、ACT35、IMD16、TXGP1L及CD 134。術語“OX40”包括由細胞天然表達的任何OX40變體或同種型。因此，本公開所述OX40抗體或片段可與來自除人類外的物種的OX40(例如，食蟹猴OX40)交叉反應。或者，該OX40抗體或片段可對人OX40具有特異性，且不展現與其他物種的交叉反應性。

OX40或其變體及同種型從其天然表達的細胞或組織中分離，或使用本領域熟知的技術和/或本公開所述的技術以重組方式產生。除非另有說明，否則“OX40”可以來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物諸如靈長類(例如人)和齧齒類(例如小鼠和大鼠)的天然OX40。該術語涵蓋 “全長”，未加工的OX40以及因細胞中的加工所致的任何形式的OX40。該術語還涵蓋OX40的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。

“OX40激活”指OX40受體的激活。通常，OX40激活導致信號轉導。

“抗OX40抗體”或“結合OX40的抗體”指能夠以足夠親和力結合OX40，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用於靶向OX40的抗體。

術語“消減表達OX40的細胞”，是指抗OX40抗體或其片段殺死或消減表達OX40的細胞。消減表達OX40的細胞可以藉由多種機制來實現，諸如抗體依賴性細胞(ADCC)介導的細胞毒性和/或吞噬作用。

術語“細胞因子”是由一類蛋白質的通稱，其由細胞群釋放，並作為細胞間介質作用於另一細胞。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子；白介素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)和γ-干擾素。如本公開中使用的，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及其生物學活性等效物，包括藉由人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“抗體”不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，重組抗體、單株抗體和多株抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

抗體重鏈和輕鏈中靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR1-3)。

術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：(1)從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；(2)從經轉化以表達抗體的宿主細胞(如轉染瘤)中分離的抗體；(3)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及(4)藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。

本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。

一些實施方案中為人源化抗體。

術語“鼠源抗體”為根據本領域知識和技能製備的針對人OX40的單株抗體。製備時用OX40抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的脾細胞(B淋巴細胞)，再將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，獲得相應融合瘤細胞。

在一些實施方案中，該鼠源OX40抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。

術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本公開的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，是指將非人物種CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服由於嵌合抗體攜帶大量異源蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)中獲得，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示或酵母菌展示對CDR進行親和力成熟後獲得的人源化抗體。

在涉及CDR移植的情況中，由於與抗原接觸的構架殘基的變化而導致產生的OX40抗體(或其抗原結合片段)對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人OX40抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基，可藉由檢查非人單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中起著重要作用。在本公開一些實施方案中，該OX40人源化抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該OX40人源化抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，具體地，包含人源IgG1重鏈恆定區。

術語“回復突變”是指將人抗體來源的FR區胺基酸殘基突變成原始來源抗體對應位置的胺基酸殘基，通常是為了避免人源化抗體引起的免疫原性下降的同時，引起的活性下降，對該的人源化抗體可變區可進行最少的回復突變，以保持抗體的活性。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將非人抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕非人抗體誘發的免疫應答反應。例如，建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再要據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，具體地，包含人源IgG1重鏈恆定區。

術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體中的一個或多個片段，其保持特異性結合抗原(例如，OX40)的能力。已顯示可利用全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，藉由鉸鏈區上的二硫橋連接兩個Fab片段形成的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature，341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地，藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。

此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)，在其中VL和VH區配對形成單價分子；參見，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性能篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

一些實施方案中，“抗原結合片段”指具有抗原結合活性的Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、納米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙抗體(diabody)、三抗(triabody)和四抗(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。

“Fab”是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。本公開的Fab可以藉由用木瓜蛋白酶處理本公開的特異性識別人OX40並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由將編碼該抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產該Fab。

“F(ab')2”是藉由用胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下游部分，而獲得的抗體片段，其分子量為約100,000，並具有抗原結合活性，並包含鉸鏈位置相連的兩個Fab區。

本公開的F(ab')2可以藉由用胃蛋白酶處理本公開的單株抗體來生產。此外，可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產該F(ab')2。

“Fab'”是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。本公開的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本公開的的F(ab')2來生產。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，並將載體導入到原核生物或真核生物中，以表達Fab'來生產該Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

本公開的scFv可以藉由以下步驟來生產：獲得編碼本公開單株抗體VH和VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。

“雙抗體”是其中scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。

本公開的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得編碼本公開單株抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。

“dsFv”是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。

本公開的dsFv可以藉由以下步驟來生產：獲得編碼本公開單株抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。

“包含CDR的肽”是藉由包含VH或VL的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。

本公開的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產：構建編碼本公開單株抗體的VH和VL的CDR的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達該肽。也可以藉由化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產該包含CDR的肽。

本公開中使用的術語“抗體框架(FR)”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“胺基酸差異”是指多肽與其變體之間，在多肽片段上某個或某些胺基酸位點之間的差異，其中變體可以由多肽上某個或某些位點經替換、插入或缺失胺基酸獲得。

術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定表位的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本公開所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。

本發明所用的術語“特異性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人OX40作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10^-7M或甚至更小的平衡解離常數(K_D)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原(或緊密相關的抗原)之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本公開中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。

術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本公開的抗體以小於大約10^-7M，例如小於大約10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合OX40，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。

當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如OX40抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及使用純化抗原，其能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合(該抗原在固態表面或細胞表面上)。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞表面的標記的量，來測量競爭性抑制。通常，待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定(競爭性抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括：與參考抗原結合蛋白相同的表位發生結合的抗原結合蛋白；以及，與參考抗原結合蛋白結合的表位所充分接近的表位發生結合的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙結合的發生。在本公開實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭性抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或更多。

術語“交叉反應”是指本發明的抗體與來自不同物種的OX40結合的能力。例如，結合人OX40的本發明的抗體也可以結合另一物種的OX40。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達OX40的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本公開所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。

術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。

術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。

術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的刺激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指刺激特定的直接細胞殺傷機制。

“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”指其中結合到某些細胞毒性細胞(例如NK細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型免疫球蛋白使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨後用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導ADCC的主要細胞(NK細胞)只表達FcγRIII，而單核細胞表達 FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5,500,362或5,821,337或美國專利No.6,737,056(Presta)中所記載的。可用於此類測定法的效應細胞包括PBMC和NK細胞。或者，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。此外，可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4嵌合體，IgG4的F235E、或L234A/E235A突變。

術語“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指存在補體時對靶細胞的溶解。經典補體途徑的激活是由補體系統第一組分(C1q)結合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結合至其關聯抗原。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區胺基酸序列(具有變異Fc區的多肽)及提高或降低的C1q結合能力的多肽變體記載於例如美國專利No.6,194,551B1和WO 1999/51642。還可參見例如Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

本公開中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但具體地，是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

術語“載體”是指能夠運輸與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本公開中的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人OX40或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本公開的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，將編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“單株抗體”(mAb)，指由單一的株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-grafting)，或其它現有技術進行重組得到。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括微生物(例如細菌)、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、NS0細胞、293細胞。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。

“內源性”指根據情況在生物、細胞或人體內產生的物質。

“突變序列”是指對本公開的核苷酸序列和胺基酸序列進行適當的替換、插入或缺失等突變修飾情況下，得到的與本公開的核苷酸序列和胺基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和胺基酸序列。該的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，非限制性實施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Institute網站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默認設置來進行。

本公開中“同源性”、“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的全部位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本公開使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

本公開使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引物；這些引物在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引物的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本公開使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本公開的抗體或其抗原結合片段與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體或賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

術語“癌症”指向或描述哺乳動物中特徵為細胞生長不受調節的生理疾患。癌症的例子包括但不限於癌，淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更具體例子包括但不限於鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌、及相關轉移。

在某些實施方案中，適合於藉由本公開的OX40抗體或片段來治療的癌症包括乳腺癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、非何傑金氏淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、類癌癌(carcinoid carcinoma)、頭頸癌、卵巢癌、間皮瘤、和多發性骨髓瘤。在一些實施方案中，癌症選自：非小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌(例如三重陰性乳腺癌)、胃癌、結腸直腸癌(CRC)、和肝細胞癌。還有，在一些實施方案中，癌症選自：非小細胞肺癌、結腸直腸癌、成膠質細胞瘤和乳腺癌(例如三重陰性乳腺癌)，包括那些癌症的轉移性形式。

術語“細胞增殖性病症”和“增殖性病症”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中，細胞增殖性病症指癌症。

術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。

術語“癌症”，“癌性”，“細胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“腫瘤”在本公開中提到時並不互相排斥。

“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、對象、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、對象、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究對象時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種抗體或其抗原結合片段的組合物或編碼抗體或其抗原結合片段的核酸分子，該患者具有一種或多種疾病或症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病或症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病或症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的對象中應當減輕目標疾病症狀。

術語“預防癌症”是指在哺乳動物中延遲、抑制或防止癌症發作，該哺乳動物中癌發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是藉由例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑒定其具有癌症易感性。該術語還包括治療具有癌變前病症的哺乳動物以終止該癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。

實施方式

以下結合實施例用於進一步描述本公開，但這些實施例並非限制著本公開的範圍。本公開實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1：抗體的製備

抗人OX40單抗庫藉由免疫小鼠產生。實驗用BalB/C和A/J品系小鼠(揚州大學比較醫學中心，動物生產許可證號；SCXK(蘇)2017-007)，雌性，10週齡。

免疫抗原為帶Fc標簽的人OX40重組蛋白(OX40-Fc：OX40 Leu 29-Ala 216(Accession # NP_003318)與Fc融合)，購自Acro Biosystems公司，貨號#OX40-H5255，使用HEK293表達後按常規方法純化。

將OX40-Fc用弗氏佐劑乳化：首次免疫用弗氏完全佐劑(sigma-aldrich，F5881-10ML)，其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑(sigma-aldrich，F5506-10ML)。抗原與佐劑比例為1：1，每次免疫注射25μg蛋白/200μl/隻小鼠。詳細見如下：第1天第一次免疫，完全弗氏佐劑

第21天第二次免疫，不完全弗氏佐劑

第35天第三次免疫，不完全弗氏佐劑

第42天採血和血清效價檢測

第49天第四次免疫，不完全弗氏佐劑

第56天採血和血清效價檢測。

用實施例2中的ELISA方法檢測小鼠血清，確定小鼠血清的抗體滴度和阻斷OX40/OX40L結合的中和活性。選擇血清效價、親和力和配體結合阻斷能力強的小鼠進行一次終免疫後處死小鼠。取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞(ATCC® CRL-1581^TM)融合後鋪板獲得融合瘤，藉由實施例2的間接ELISA，捕獲ELISA以及基於細胞的功能性篩選選擇目標融合瘤，並藉由有限稀釋法建株單株抗體。

把已建株的19株OX40小鼠單抗進行無血清表達生產，並用protein A親和層析技術得到純化的小鼠單抗。藉由間接ELISA，捕獲ELISA及細胞功能學活性篩選其中的分泌激活型抗OX40抗體的融合瘤細胞。功能性篩選的簡要步驟如下：培養GS-H2/OX40穩定細胞系(購自genscript，cat#M00608)。製備稀釋的待測抗體及OX40L(Sino Biological，13127-H04H)溶液添加到處於對數生長期的GS-H2/OX40細胞中，培養後收集細胞上清，測定上清中的IL-8含量(使用human IL-8 kit，cisbio，cat#62IL8PEB)。實驗中用抗體GPX4(參照專利WO2015153513專利中1A7.gr.1製備)做陽性參照，hIgG(實驗室製備)做陰性參照。

根據細胞功能性活性，選擇活性高的10株進行基因選殖和測序。藉由常規RNA抽提技術即可獲得細胞總RNA，然後藉由逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)獲得單株抗體可變區的PCR產物。PCR產物經瓊脂糖凝膠分離回收，然後株到基因載體，轉化大腸桿菌。隨機挑選數個轉化菌落，PCR擴增單株抗體可變區，用於基因測序。獲得的示例性的鼠源單株抗體的相應序列如下所示。

鼠單株抗體m4B5的重鏈和輕鏈可變區序列如下：

m4B5重鏈可變區：

SEQ ID NO：1

m4B5輕鏈可變區：

SEQ ID NO：2

鼠單株抗體m4B5的CDR區序列如表1：

鼠單株抗體m2G3的重鏈和輕鏈可變區序列如下：

m2G3重鏈可變區：

SEQ ID NO：9

m2G3輕鏈可變區：

SEQ ID NO：10

鼠單株抗體m2G3的CDR區序列如表2：

實施例2：抗體的ELISA鑒定與篩選方法

間接ELISA法：

將20×包被緩衝液用去離子水稀釋至1×，用1×包被液(碳酸鹽緩衝液)配製抗原人OX40-His(Acro biosytems,OXL-H52Q8)，使其終濃度為2μg/mL，每孔加液100μL，4℃過夜或37℃孵育2h。PBST洗板1次，每孔加入200μL封閉液(含5%脫脂牛奶的PBST)，37℃孵育2h，PBST洗板4次。每孔加入稀釋好的一抗100μL(待測抗體濃度從 10000ng/ml起5倍倍稀，7個梯度，即10000ng/ml，2000ng/ml，400ng/ml，80ng/ml，16ng/ml，3.2ng/ml，0.64ng/ml，空白孔為純稀釋液即2.5%脫脂牛奶的PBST)，37℃孵育40min。PBST洗板4次，用PBST緩衝液稀釋酶標二抗(HRP標記山羊抗小鼠IgG，購自Jackson Immunoresearch,Cat#115036071或HRP標記山羊抗人IgG，購自Jackson Immunoresearch,Cat#109036098)，每孔加100μL，37℃孵育40min。PBST洗板4次，每孔加100μL TMB顯色液，室溫避光孵育3-15分鐘，每孔加入50μl終止液(1M硫酸)。設置酶標儀參數，在450-630nm處讀取OD值，保存實驗數據。

捕獲ELISA：

將20×PBS緩衝液用去離子水稀釋至1×，用1×PBS配製GAM二抗(Jackson Immunoresearch,115-006-071)，使其終濃度為2μg/mL，每孔加入100μL，4℃過夜或37℃孵育2h；PBST洗板1次，每孔加入200μL封閉液(含5%脫脂牛奶的PBST)，37℃孵育2h，PBST洗板4次。每孔加入稀釋好的一抗100μL(待測抗體濃度從10000ng/ml起5倍倍稀，7個梯度，即10000ng/ml，2000ng/ml，400ng/ml，80ng/ml，16ng/ml，3.2ng/ml，0.64ng/ml，空白孔為純稀釋液即2.5%脫脂牛奶的PBST)，37℃孵育40min。PBST洗板4次，用2.5%脫脂牛奶的PBST稀釋人OX40-FC-生物素(Acro biosystem，OX0-H5255，標記生物素)，每孔加100μl，37℃孵育40min，PBST洗板4次。每孔加100μL TMB顯色液，室溫避光孵育3-15分鐘，每孔加入50μl終止液(1M硫酸)，設置酶標儀參數，在450-630nm處讀取OD值，保存實驗數據。

配體結合阻斷ELISA：

將20×包被緩衝液用去離子水稀釋至1×，用1×包被液(碳酸鹽緩衝液)配置抗原OX40L-His(Acro biosytems,OXL-H52Q8)，使其終濃度為2μg/mL，每孔加入100μL，4℃過夜或37℃孵育2h；PBST洗板1次；每孔加入200μL封閉液(含5%脫脂牛奶的PBST)，37℃孵育2h；PBST洗板4次；用預先配製好的200ng/ml的人OX40-Fc溶液(配製在2.5%的脫脂牛奶中)梯度稀釋小鼠血清/抗體，而後室溫預孵育40min後，加到已封閉好的OX40L板子上，100μL/孔，孵育40min；PBST洗板4次；用PBST緩衝液稀釋HRP標記的羊抗人二抗(GAH-HRP，Jackson Immunoresearch,109-035-006)，每孔加100μl，37℃孵育40min；PBST洗板4次；每孔加100μL TMB顯色液，室溫避光孵育3-15分鐘；每孔加入50μl終止液(1M硫酸)，設置酶標儀參數，450-630nm處讀取OD值，保存實驗數據。

實施例3：抗OX40重組嵌合抗體的構建表達

將鼠源抗體m2G3和m4B5的重鏈可變區(VH)加上人免疫球蛋白重鏈恆定區，輕鏈可變區(VL)加上人免疫球蛋白Kappa輕鏈恆定區，分別選殖到真核表達載體上，藉由轉染細胞生產出鼠-人嵌合抗體。

重鏈載體設計如下：信號肽+重鏈可變區序列+人的IgG1恆定區序列。

輕鏈載體設計如下：信號肽+輕鏈可變區序列+人的Kappa恆定區序列。

分別將上述序列插入pCEP4載體(Thermofisher，V04450)。得到載體質粒後，提取質粒，將質粒送測序驗證。將驗證合格的質粒用PEI轉染至人293F細胞中，連續培養，將293F細胞用無血清培養液(上海奧浦邁生物，OPM-293 CD03)培養至對數生長期用於細胞轉染。將21.4μg嵌合抗體輕鏈質粒和23.6μg嵌合抗體重鏈質粒溶解在10ml Opti-MEM® I Reduced Serum Medium(GIBCO，31985-070)中混勻，然後加入200μg PEI，混勻，室溫孵育15min，加入50mL細胞中。細胞培養條件：5% CO₂，37℃，125rpm/min。培養期間，第1天和第3天加補料，直到細胞活率低於70%，收取細胞上清，離心過濾。將離心過濾後的細胞培養液上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.70.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，最終獲得純化的嵌合抗體Ch2G3和Ch4B5。

實施例4：體外結合親和力和動力學實驗

對鼠源抗體和嵌合抗體進行人OX40的親和力進行檢測(方法步驟同實施例2)，結果見第1A圖和第1B圖。其中，m2G3-NC(-NC表示negative control)、Ch2G3-NC、m4B5-NC、Ch4B5-NC為陰性對照，其分別與m2G3、Ch2G3、m4B5、Ch4B5使用的相同的恆定區，但可變區不識別OX40。

結果顯示，嵌合抗體Ch2G3和Ch4B5與人OX40具有很高的親和力。

實施例5：抗OX40抗體的體外細胞報告基因實驗

用抗CD3抗體(Chempartner,A05-001)包被孔板，4度放置過夜，PBS洗3次；收穫Jurkat-NF-Kb luc-hOX40細胞(ATCC,TIB-152穩定細胞系由上海睿智化學構建)和Raji細胞(ATCC,CCL-86)，重新懸浮然後混合兩種細胞。添加50μl/孔稀釋的待測抗體和50μl/孔已混合的兩種細胞到細胞板中，細胞板放在37度5% CO₂孵育箱中孵育5小時。添加100μl one-Glo TM luciferase reagent(Promega,Cat#E6120)到每一孔中，室溫孵育3min以上。上機檢測發光信號，記錄RLU讀值，結果見表3。

結果顯示，嵌合抗體Ch2G3和Ch4B5能有效的激活報告基因。

實施例6：小鼠抗體人源化實驗

為了降低可能的免疫原性，將鼠源抗體進行人源化改造。將嵌合抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)分別在FR(framework region)區域進行定點胺基酸突變。根據不同的胺基酸突變組合，設計不同的人源化抗體重鏈和輕鏈，將編碼不同輕/重鏈組合的質粒轉染細胞可以生產出人源化抗體。簡述如下：

首先設計表達載體：

重鏈載體設計如下：信號肽+突變的重鏈可變區序列+人的IgG1恆定區序列。

輕鏈載體設計如下：信號肽+突變的輕鏈可變區序列+人的Kappa恆定區序列。

分別將上述序列插入pCEP4載體(Thermofisher，V04450)。請第三方基因合成公司按照上述設計合成表達載體，得到載體質粒後，提取質粒，將質粒送測序驗證。將驗證合格的質粒用PEI轉染至人293F細胞中，連續培養，將293F細胞用無血清培養液(上海奧浦邁生物，OPM-293 CD03)培養至對數生長期用於細胞轉染。將21.4μg編碼人源化抗體輕鏈的質粒和23.6μl編碼人源化抗體重鏈的質粒溶解在10mlOpti-MEM® I Reduced Serum Medium(GIBCO,31985-070)中混勻，然後加入200μg PEI，混勻，室溫孵育15min，加入50mL細胞中。

細胞培養條件：5% CO₂，37℃，125rpm/min。培養期間，第1天和第3天加補料，直到細胞活率低於70%，收取細胞上清，離心過濾。將離心過濾後的細胞培養液上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，最終獲得純化的人源化抗體。

人源化可變區序列如下：

>hu2G3 VH1

SEQ ID NO：17

>hu2G3 VH2

SEQ ID NO：18

>hu2G3 VL1

SEQ ID NO：19

>hu2G3 VL2

SEQ ID NO：20

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

將設計的人源化抗體的可變區按下表組合成不同的抗體：

註：2G3-hu1表示，人源化的抗體2G3-hu1的重鏈可變區為hu2G3 VH1，輕鏈可變區為hu2G3 VL1，其他類推。

m4B5的人源化可變區序列如下：

hu4B5 VL0：

SEQ ID NO：21

hu4B5 VL1：

SEQ ID NO：22

hu4B5 VL2：

SEQ ID NO：23

hu4B5 VL3：

SEQ ID NO：24

hu4B5 VL4：

SEQ ID NO：25

hu4B5 VH0：

SEQ ID NO：26

hu4B5 VH1：

SEQ ID NO：27

hu4B5 VH2：

SEQ ID NO：28

hu4B5 VH3：

SEQ ID NO：29

hu4B5 VH4：

SEQ ID NO：30

將設計的人源化抗體的可變區按下表組合成不同的抗體：

為了獲得更好的m2G3的人源化改造抗體，對hu2G3 VH1的胺基酸序列進行突變，突變後的重鏈可變區序列如下：

hu2G3 VH1.1

SEQ ID NO：31

>hu2G3 VH1.2

SEQ ID NO：32

突變後獲得的HCDR2序列如下：

將重鏈可變區hu2G3 VH1.1、hu2G3 VH1.2與輕鏈可變區hu2G3 VL組合形成新的優化的人源化抗體，見表7。

將上述人源化抗體進行親和力測評(參照實施例2中的捕獲ELISA)，實驗結果表明人源化後的分子可同OX40結合。

示例性m2G3及其人源化抗體親和力測評(捕獲ELISA)結果如表8所示：

示例性的m4B5及其改造抗體的捕獲ELISA檢測結果如表9所示：

將上述序列中的輕鏈可變區與輕鏈恆定區序列組合形成最終的輕鏈序列，將上述序列中的重鏈可變區與重鏈恆定區組合形成最終的重鏈序列。具體輕、重鏈恆定區並非作為本公開抗體恆定區的限制，也可選用本領域其它已知的輕、重鏈恆定區及其突變體來增加抗體的性能。

示例性的恆定區如下所示：

IgG1重鏈恆定區：

SEQ ID NO：35

kappa輕鏈恆定區：

SEQ ID NO：36

示例性的2G3、hu4B5-V7(又稱4B5)抗體全長胺基酸序列如下：

2G3重鏈：

SEQ ID NO：37

2G3輕鏈：

SEQ ID NO：38

4B5重鏈：

SEQ ID NO：39

4B5輕鏈：

SEQ ID NO：40

陽性參照GPX4的製備參照專利WO2015153513專利中1A7.gr.1製備，其重輕鏈胺基酸序列如下所示：

GPX4重鏈：

SEQ ID NO：41

GPX4輕鏈：

SEQ ID NO：42

實施例7：人源化抗體體外結合親和力和動力學試驗

Biacore方法是公認的客觀檢測蛋白相互間親和力和動力學的檢測方法。我們藉由Biacore T200(GE)分析本發明待測OX40抗體表徵親和力及結合動力學。

利用由Biacore提供的試劑盒，採用NHS標準胺基偶聯法將本發明待測重組抗OX40抗體共價連接至CM5(GE)芯片上。然後將稀釋於同樣緩衝液中的一系列濃度梯度的人OX40-His蛋白(義翹神州#10481-H08H)於前後各個循環進樣，流速30μL/min，進樣後均以試劑盒內配再生試劑再生。追蹤抗原-抗體結合動力學3分鐘並追蹤解離動力學10分鐘。使用GE的BIAevaluation軟件以1：1(Langmuir)結合模型分析所得數據，以此法測定的嵌合抗體ka(k_on)、kd(k_off)和K_D值顯示於下表。

結果顯示，2G3和4B5可有效結合OX40。

實施例8：抗體阻斷OX40與OX40L結合ELISA試驗

用配體OX40配體(Acrobiosystem，OXL-H52Q8)包被孔板，封閉後，加入梯度稀釋待測抗體(抗體稀釋在含人Bio-OX40-FC(Acrobiosystem，OX40-H5255，標記生物素)的溶液中預孵育40min後加板)，孵育40min後，洗板。再加入SA-HRP(Jackson Immunoresearch, 016-030-084)，孵育40min後，加入顯色液和終止液，測OD值，結果見下表。

結果顯示，2G3和4B5均可阻斷OX40同OX40L的結合。

實施例9：人源化抗體活性數據

用抗CD3抗體(Chempartner,A05-001)包被孔板，4℃放置過夜，PBS洗3次；收穫Jurkat-NF-Kb luc-hOX40細胞(ATCC,TIB-152(穩定細胞系由睿智化學公司構建)和Raji細胞(ATCC,CCL-86)，重新懸浮然後混合兩種細胞。添加50μl/孔稀釋的待測抗體，和50μl/孔已混合的兩種細胞到孔板，細胞板放在37℃ 5% CO₂孵育箱中孵育5小時。添加one-Glo TM螢光素酶試劑(Promega,Cat#E6120)到每一孔中，室溫孵育3min以上。上機檢測發光信號，記錄RLU讀值。結果見表12，結果表明2G3和4B5可有效激活報告基因。

實施例10：體外細胞功能試驗

分離CD4+記憶T細胞，同待測抗體加入到抗CD3抗體(Chempartner,A05-001)包被的96孔板中，37℃共孵育72h，取上清檢測IFN-γ，結果如第2圖和表13所示。結果顯示，GPX4，4B5及2G3可顯著增強IFN-γ的釋放，其中2G3在10ng/mL即可達到最大刺激效果。

實施例11：抗OX40抗體對腫瘤細胞生長的抑制

B-hTNFRSF4(OX40)人源化小鼠(B-hTNFRSF4(OX40)人源化小鼠，百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司)，雌性，17至20g，6至7週。

收集對數生長期MC38腫瘤細胞7(購買於南京銀河生物醫藥有限公司)，用PBS緩衝液調整細胞濃度為5×10⁶/mL，接種0.1mL細胞懸液至OX40小鼠脅腹部。觀察接種後小鼠並監測腫瘤的生長，在接種後第7天時荷瘤小鼠脅腹部平均腫瘤體積達到102.5mm³，按照腫瘤體積大小進行分組和給藥觀察，分組信息見表14。

檢測OX40人源化抗體對小鼠MC38結腸癌細胞移植瘤的生長抑制作用。

腫瘤體積和荷瘤鼠體重測量：使用遊標卡尺每週兩次測量，腫瘤體積計算公式為V=0.5 a×b²，a，b分別代表腫瘤的長徑和寬徑；腫瘤生長移植瘤TGI(%)=[1-T/C]×100。所有荷瘤鼠體重每週測量兩次。

給藥治療後第20天，IgG1對照組的平均腫瘤體積達到了1732.593mm³，受試化合物2G3低劑量給藥組(0.3mg/kg)小鼠平均腫瘤體積達到了930.37mm³，中劑量給藥組(2G3，1mg/kg)和高劑量給藥組(2G，3mg/kg)組內荷瘤鼠平均腫瘤體積分別為303.49mm³和155.79mm³，中高劑量組抑制腫瘤生長與對照組差異明顯(**P<0.01)，並表現出初步的劑量依賴關係，其腫瘤生長抑制率分別達到了49%、88%和97.0%。3mg/kg GPX4組中平均腫瘤體積分別為362.47mm³，與對照組比較差異顯著，也表現有明顯的抑制腫瘤生長的作用(*P<0.05)，其腫瘤生長抑制率分別達到了84%。

給藥後第20天結束實驗，結果見表15和第3A圖和第3B圖。所有治療小鼠被安樂死處理，剝離荷瘤鼠皮下移植瘤塊並進行稱量。其中對照組平均腫瘤塊重量為1.568g，受試化合物2G3在低劑量組(0.3mg/kg)、中劑量組(1mg/kg)和高劑量組(3mg/kg)，平均腫瘤重量分別為0.926g、0.251g和0.181g，其中中高劑量組與對照組比較差異顯著，抑制腫瘤生長作用明顯(**P<0.01)。在同一時間，給藥組GPX4 3mg/kg中，平均腫瘤重量為0.372g，與對照組比較差異明顯，也表現出明顯的抑制MC38腫瘤細胞生長的作用(**P<0.01)。

在實驗過程中，所有治療荷瘤小鼠體重變化無明顯異常，同時在藥物治療過程中未見明顯異常行為和其他表現。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司

<120> 抗OX40抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(113)

<223> 鼠單株抗體m4B5的重鏈可變區

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 鼠單株抗體m4B5的輕鏈可變區

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(5)

<223> 鼠單株抗體m4B5的HCDR1

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(16)

<223> 鼠單株抗體m4B5的HCDR2

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(5)

<223> 鼠單株抗體m4B5的HCDR3

<400> 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(11)

<223> 鼠單株抗體m4B5的LCDR1

<400> 6

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(7)

<223> 鼠單株抗體m4B5的LCDR2

<400> 7

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(9)

<223> 鼠單株抗體m4B5的LCDR3

<400> 8

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 鼠單株抗體m2G3的重鏈可變區

<400> 9

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 鼠單株抗體m2G3的輕鏈可變區

<400> 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(5)

<223> 鼠單株抗體m2G3的HCDR1

<400> 11

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(16)

<223> 鼠單株抗體m2G3的HCDR2

<400> 12

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(11)

<223> 鼠單株抗體m2G3的HCDR3

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(11)

<223> 鼠單株抗體m2G3的LCDR1

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(7)

<223> 鼠單株抗體m2G3的LCDR2

<400> 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(9)

<223> 鼠單株抗體m2G3的LCDR3

<400> 16

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 人源化單株抗體hu2G3的重鏈可變區VH1

<400> 17

<210> 18

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 人源化單株抗體hu2G3的重鏈可變區VH2

<400> 18

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 人源化單株抗體hu2G3的輕鏈可變區VL1

<400> 19

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 人源化單株抗體hu2G3的輕鏈可變區VL2

<400> 20

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的輕鏈可變區VL0

<400> 21

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的輕鏈可變區VL1

<400> 22

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的輕鏈可變區VL2

<400> 23

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的輕鏈可變區VL3

<400> 24

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的輕鏈可變區VL4

<400> 25

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(113)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的重鏈可變區VH0

<400> 26

<210> 27

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(113)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的重鏈可變區VH1

<400> 27

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(113)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的重鏈可變區VH2

<400> 28

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(113)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的重鏈可變區VH3

<400> 29

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(113)

<223> 人源化單株抗體hu4B5的重鏈可變區VH4

<400> 30

<210> 31

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 人源化單株抗體hu2G3的重鏈可變區VH1.1

<400> 31

<210> 32

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 人源化單株抗體hu2G3的重鏈可變區VH1.2

<400> 32

<210> 33

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(16)

<223> 單株抗體hu2G3的HCDR2V1

<400> 33

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(16)

<223> 單株抗體hu2G3的HCDR2V2

<400> 34

<210> 35

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(330)

<223> IgG1重鏈恆定區

<400> 35

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> kappa輕鏈恆定區

<400> 36

<210> 37

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(449)

<223> 抗體2G3的重鏈

<400> 37

<210> 38

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(214)

<223> 抗體2G3的輕鏈

<400> 38

<210> 39

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(443)

<223> 抗體4B5的重鏈

<400> 39

<210> 40

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 域

<222> (1)..(214)

<223> 抗體4B5的輕鏈

<400> 40

<210> 41

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(447)

<223> 對照抗體GPX4的重鏈

<400> 41

<210> 42

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (1)..(214)

<223> 對照抗體GPX4的輕鏈

<400> 42

Claims

一種抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中：重鏈可變區，包含：(I)分別如SEQ ID NO：3、4、5所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；或與SEQ ID NO：3、4、5所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；(II)分別如SEQ ID NO：11、12、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；或與SEQ ID NO：11、12、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；(III)分別如SEQ ID NO：11、33、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；或與SEQ ID NO：11、33、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；或(IV)分別如SEQ ID NO：11、34、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；或與SEQ ID NO：11、34、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；和/或，輕鏈可變區，包含：(I)分別如SEQ ID NO：6、7、8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或與SEQ ID NO：6、7、8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體；或(II)分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或與SEQ ID NO：14、15、16所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體。
如申請專利範圍第1項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中，該抗OX40抗體或其抗原結合片段包含：(i)分別如SEQ ID NO：3、4、5所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和分別如SEQ ID NO：6、7、8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；(ii)分別如SEQ ID NO：11、12、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3；(iii)分別如SEQ ID NO：11、33、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3；或(iv)分別如SEQ ID NO：11、34、13所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和分別如SEQ ID NO：14、15、16所示的輕鏈LCDR1、LCDR2、LCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其為鼠源抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或其片段。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中：該抗原結合片段選自：Fab、Fab’、Fv、scFv、F(ab')2片段；該抗體的重鏈可變區還包含重鏈框架區，該重鏈框架區源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體包含恆定區。
如申請專利範圍第5項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中，重鏈恆定區源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突變序列。
如申請專利範圍第5項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中，輕鏈恆定區源自人κ、λ鏈或其突變序列。
如申請專利範圍第6項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：35所示或與SEQ ID NO：35具有至少90%的序列同一性。
如申請專利範圍第7項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中，該輕鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：36所示或與SEQ ID NO：36具有至少90%的序列同一性。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中：重鏈可變區，包含：(I)如SEQ ID NO：1所示或與SEQ ID NO：1具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；(II)如SEQ ID NO：9所示或與SEQ ID NO：9具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；(III)如SEQ ID NO：17、18、31、32任一所示；或與SEQ ID NO：17、18、31、32具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；或(IV)如SEQ ID NO：26、27、28、29、30任一所示；或與SEQ ID NO：26、27、28、29、30具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；和/或，輕鏈可變區，包含： (I)如SEQ ID NO：2所示或與SEQ ID NO：2具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；(II)如SEQ ID NO：10所示或與SEQ ID NO：10具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；(III)如SEQ ID NO：19、20任一所示或與SEQ ID NO：19、20具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；(IV)如SEQ ID NO：21、22、23、24、25任一所示或與SEQ ID NO：21、22、23、24、25具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
如申請專利範圍第10項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中，該抗OX40抗體或其抗原結合片段包含：(i)如SEQ ID NO：1所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區；(ii)如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；(iii)如SEQ ID NO：17或18所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：19所示的輕鏈可變區；(iv)如SEQ ID NO：17或18所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區；(v)如SEQ ID NO：26、27、28、29、30任一所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：21、22、23、24、25任一所示的輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，包含：(i) 如SEQ ID NO：37所示或與SEQ ID NO：37具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性的重鏈，和/或，如SEQ ID NO：38所示或與SEQ ID NO：38具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性的輕鏈；或(ii)如SEQ ID NO：39所示或與SEQ ID NO：39具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性的重鏈，和/或，如SEQ ID NO：40所示或與SEQ ID NO：40具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性的輕鏈。
一種抗OX40抗體或其抗原結合片段，其與申請專利範圍第1至12項中任一項所述抗OX40抗體或其抗原結合片段競爭性結合人OX40。
一種多核苷酸，其編碼申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其包含申請專利範圍第14項所述的多核苷酸。
如申請專利範圍第15項所述的載體，其中該載體為真核表達載體、原核表達載體或病毒載體。
一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第15或16項所述的載體。
如申請專利範圍第17項所述的載體，其中，該宿主細胞選自：細菌、酵母、哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第17項所述的載體，其中，該宿主細胞選自：大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢細胞、人胚腎293細胞。
一種製備申請專利範圍第1至13項中任一項所述抗OX40抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括：培養申請專利範圍第17至19項中任一項所述的宿主細胞；回收該抗OX40抗體或其抗原結合片段；視需要地，純化該抗OX40抗體或其抗原結合片段。
一種檢測或測定OX40的方法，包括：使申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段與樣本相接觸的步驟。
一種試劑，包含申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。
一種醫藥組成物，其含有：治療有效量或預防治療有效量的申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段；以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
一種治療或預防疾病或病症的方法，包括：向對象施用治療有效量或預防治療有效量的申請專利範圍第1至13項中中任一項的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物。
如申請專利範圍第24項所述的方法，其中，該疾病或病症為癌症。
如申請專利範圍第25項所述的方法，其中，該癌症選自：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症。
一種增強人對象中的免疫應答的方法，包括：向對象施用治療有效量或預防治療有效量的申請專利範圍第1至13項中任一項的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物。
如申請專利範圍第27項所述的方法，其中，該增強的免疫應答包括T效應細胞的免疫刺激/效應功能的增加，和/或T調節細胞的免疫抑制功能的下調。
一種選自以下的任一項在製備藥物中的用途：- 申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段、- 申請專利範圍第14項所述的多核苷酸、- 申請專利範圍第15或16項所述的載體、- 申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物；該藥物用於治療或預防癌症，或用於增強人對象中的免疫應答。
如申請專利範圍第29項所述的用途，其中，該癌症選自：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症。
一種申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合在製備試劑盒中的用途，該試劑盒用於檢測或診斷與OX40表達相關的疾病或病症。
如申請專利範圍第31項所述的用途，其中，該疾病或病症為癌症。
如申請專利範圍第32項所述的用途，其中，該癌症選自：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症。