TW202022109A

TW202022109A - 新穎乳酸菌株及包含新穎乳酸菌株之免疫賦活劑

Info

Publication number: TW202022109A
Application number: TW108100676A
Authority: TW
Inventors: 邱泰瑛; 須田亙; 大島健志朗; 服部正平; 松崎千秋; 山本憲二; 高橋知也
Original assignee: 日商奧碧慧央集團股份有限公司
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2020-06-16
Also published as: US20200179466A1; JP2020092704A; TWI689585B; JP7179343B2

Abstract

本發明的課題為提供判明在蔬菜黑糖發酵液的發酵過程中出現的乳酸菌的微生物學的、生物化學的特徵，更佳的免疫賦活劑及包含免疫賦活劑的健康食品以及醫藥品等。本發明的解決手段為提供以寄存編號NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H之被單離的菌株，及包含該被單離的菌株或其培養物之組成物。

Description

新穎乳酸菌株及包含新穎乳酸菌株之免疫賦活劑

本發明是關於新穎乳酸菌株(Lactobacillus strain)之乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H及包含新穎乳酸菌株之乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H之免疫賦活劑等。

以使蔬菜或水果、海藻類等的原料發酵、熟成而製作的酵素液為主原料的健康飲料已知有提高免疫力，調整身體狀況的效果。蔬菜黑糖發酵萃取物(例如商品名[Georina(註冊商標)酵素])為以含蜜糖、葉菜類、根菜類、黑糖、半乳寡醣(galactooligosaccharide)、莖菜類、薯類、蘑菇類、花菜類、海帶及裙帶菜等為原料，透過複雜的微生物的集團藉由自然發酵得到的酵素飲料。在該蔬菜黑糖發酵液的發酵過程出現、消失的微生物叢被報告藉由自然發酵而使乳酸菌在短期間成為優勢，每一批次的菌叢模式穩定，在乳酸菌之中也有菌種的替換等 (例如參照非專利文獻1)。

但是，關於乳酸菌的免疫調節功能到目前為止各式各樣的研究被進行。例如已知：源自植物的屬於乳酸菌屬 (Lactobacillus)的乳酸菌等具有腸管免疫活性化作用或派亞氏淋巴叢細胞(Peyer's patch cell)的IgA抗體產生促進作用(專利文獻1)，屬於白念珠球菌屬(Leuconostoc)的乳酸菌具有免疫(特別是腸管免疫)賦活作用(專利文獻2)，由竹筴魚魚販壽司分離的短毛乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)及酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei)的乳酸菌具有抗炎、抗過敏作用(專利文獻3)等。

如上述，某種乳酸菌雖然使宿主的後天性免疫系統(acquired immunity system)活性化而促進IgA分泌於腸管內，但另一方面，該等免疫賦活活性即使菌種同一若菌株弄錯，則其效果也大不相同。可考慮為其活性化機制雖然未完全明確，但被稱為GALT的腸管相關淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue)，特別是在派亞氏淋巴叢產生的IgA被分泌於腸管內，與有害的細菌或病毒結合而妨礙其運動，阻礙附著於小腸上皮細胞(small intestinal epithelial cell)。而且，也被提出腸內細菌叢透過存在於小腸上皮細胞之類鐸受體(TLR：Toll-like receptor)或樹狀細胞(DC：dendritic cell)分泌各式各樣的細胞介素(cytokine)，分化誘導存在於固有黏膜層(lamina propria mucosae)的IgA產生B細胞之機制(例如參照非專利文獻2、FIG1)。

[非專利文獻1] Chiou T-Y, Suda W, Oshima K, Hattori M, Takahashi T(2017) Changes in the bacterial community in the fermentation process of koso, a Japanese sugar-vegetable fermented beverage. Biosci Biotechnol Biochem 81(2):403–410 [非專利文獻2] Kamada, N. et al., Role of the gut microbiota in immunity and inflammatory disease. Nat Rev Immunol. 2013 May;13(5):321-35.

[專利文獻1] 日本國特開2007-308419號公報 [專利文獻2] WO2014/129599 [專利文獻3] 日本國特開2013-193996號公報

蔬菜黑糖發酵液已知藉由作為健康食品攝取而具有健康增進功能，惟關於其有效成分未必明確。本發明係在這種狀況下所進行的創作，其目的為提供判明在蔬菜黑糖發酵液的發酵過程中出現的乳酸菌的微生物學的、生物化學的特徵，更佳的免疫賦活劑及包含免疫賦活劑的健康食品以及醫藥品等。

根據使用次世代定序儀(sequencer)的16S rRNA基因序列(gene sequence)的讀取數解析蔬菜黑糖發酵液的發酵過程中的微生物叢的推移的結果，發現在發酵7日後的培養液中，屬於乳酸菌屬的新穎乳酸菌種成為優勢，佔細菌叢的50%以上，藉由單離該新穎乳酸菌而完成了本發明。

也就是說，在本發明的一實施形態中提供一種乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H之被單離的菌株，係以寄存編號(deposit number)NITE BP-02811寄存。本發明的其他實施形態為包含該被單離的菌株或其培養物之組成物。再者在其他實施形態中為包含以上述被單離的菌株或組成物作為有效成分之IgA產生促進劑(production promoter)或免疫賦活劑。該等組成物以飲食品、醫藥品、外用劑或飼料的形態被利用，為了使被給予該等組成物的對象者的黏膜免疫賦活而使用較佳。在本發明的其他側面中提供一種免疫賦活劑的製造方法，包含將上述被單離的菌株接種並培養於高糖濃度且包含D-果糖(D-fructose)的培養基之步驟。

本發明的新穎乳酸菌株與現存的乳酸菌或雙叉乳酸桿菌(Lactobacillus bifidus)比較具有優良的IgA產生促進效果，為了使腸管等的黏膜免疫賦活化有用。

以下就本發明的較佳的實施形態依照以下的順序進行說明。 (I)、新穎乳酸菌 (II)、免疫賦活作用 (III)、各種組成物及其用途 (IV)、免疫賦活劑的製造方法

(I)、新穎乳酸菌依照本發明的較佳的實施形態，提供由蔬菜黑糖發酵液單離的新穎乳酸菌株及其變異株(variant)。更佳為由商品名[Georina(註冊商標)酵素])的培養液得到的屬於乳酸菌屬的菌，最佳為乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株(寄存編號NITE BP-02811)或其變異株。[變異株]是指意味著包含對特定的菌株，在藉由對熟習該項技術者周知的方法熟習該項技術者不給予其主要的性質變化的範圍不使其變異者，或者若與其同等的話熟習該項技術者可確認者。

此外，乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株係以平成30年(2018年)11月7日(原寄存日)寄存於日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構、專利微生物寄存中心(292-0818 日本國千葉県木更津市上總鎌足2－5－8 122號室)。寄存編號為NITE BP-02811(以下稱本菌株為[10H株])。

(10H株的表現型(phenotype)的特徵) 10H株為革蘭氏陽性(gram positive)、過氧化氫酶陰性(catalase negative)的桿菌，顯示大約0.7~0.8×1.5~2.2μm的形態。本菌株具有好果糖增殖特性，如圖1所示，僅在未添加D-果糖的MRS培養基中無法生長。需要對10H株的生長至少5%的D-果糖，惟使其濃度上升至20%也能良好地生長。雖然在添加了5~10%的D-果糖的MRS洋菜培養基中形成菌落(colony)，但在4%以下的D-果糖濃度菌落形成幾乎不被認定。可考慮為該性質為本菌株作為難培養菌株，到目前為止無法以通常的方法單離的原因。菌落在有氧的、微氧的及厭氧的條件下形成，顯示直徑約1~3mm的白色或不透明的環狀形態。其他的菌學的特性如下所示。

生長pH：4.0~7.0(最適pH為6.5) 生長溫度：18~39℃(最適溫度為27℃) 氣體產生：有 NaCl耐性：在2%(w/v)以上抑制增殖

糖代謝：關於碳源的利用可能性，使用BioMérieux公司的API50CHL套件調查的結果，10H株不被認定為所有的碳源的利用。因此，將20種類的碳源分別添加於MRS培養基在27℃下培養48小時，以HPLC分析了培養上清的結果，僅D-果糖及蔗糖(sucrose)被利用。10H株將D-果糖代謝並產生了乳酸及醋酸，惟乙醇(ethanol)不產生。乳酸及醋酸的比率大約為3：2。

酵素活性：酵素活性為使用BioMérieux公司的酵素活性研究用系統[API ZYM]而進行調查。10H株被認定酸性磷酸酶(acid phosphatase)及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase)的產生，關於鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、脂酶(lipase)、白胺酸芳基醯胺酶(leucine arylamidase)及纈胺酸芳基醯胺酶(valine arylamidase)顯示弱的活性。

(化學分類學(chemotaxonomy)的特性) 10H株的細胞壁的胺基酸組成主要由天冬胺酸(Asp：aspartic acid)、麩胺酸(Glu：glutamic acid)、丙胺酸(Ala：alanine)及離胺酸(Lys：lysine)構成。內消旋二胺庚二酸(meso-diaminopimelic acid)及鳥胺酸(ornithine)的任一個都不存在於細胞壁的肽聚醣(peptide glycan)，上述胺基酸的莫耳比為Asp/Glu/Ala/Lys=1.0/1.9/4.1/1.1。此為暗示10H株的細胞壁肽聚醣為L-Lys-D-Asp(A4α)型。此外，被報告A4α型為構成乳酸菌屬的細胞壁的肽聚醣。

以10H株檢測的主要的脂肪酸為C_16:0 (37.6%)、C_19:0 環丙烷11, 12(28.7%)、C_19:0 環丙烷9, 10(14.3%)及C_18:1 _ω _9c (10.0%)。利用二維高效薄層層析法(two-dimensional high performance thin‐layer chromatography)得到的10H株中的極性脂質(polar lipid)的主要成分為溶血磷脂醯乙醇胺 (LPE：lysophosphatidylethanolamine)、磷脂醯乙醇胺(PE：phosphatidylethanolamine)及醣脂質(glycolipid)。據說一般在乳酸菌屬的同類中損失類異戊二烯醌(isoprenoidquinone)，而由10H株發現每1g乾燥重量0.0001~0.0004nmol之極少量的類異戊二烯醌。在10H株中被檢測出的主要的醌為甲萘醌(MK：menaquinone)，泛醌(ubiquinone)或色素體醌(plastoquinone)未被檢測出。在10H株中被檢測出的主要的類異戊二烯醌為MK-7、MK-8、MK-9及MK-10。

(系統發生分析) 10H株的16S rRNA基因序列為1474bp的連續的序列，以GenBank的寄存編號(accession number)LC318484登錄。藉由BLAST解析該16S rRNA基因序列的同源(homology)的結果，與10H株最相似的菌株為乳酸菌kunkeei(L. kunkeei)YH-15、乳酸菌ozensis (L. ozensis)Mizu2-1及乳酸菌apinorum(L. apinorum)Fhon13N，分別具有95.5%、95.4%及95.3%的序列一致性(sequence identity)。該等序列一致性顯著低於作為原核生物(prokaryote)的種的分化推薦的臨限值(threshold value)之98.65%。依照使用最大概似法(maximum likelihood method)構築的系統發生樹，10H株形成上述3種近緣種(related species)連同1個可區別的系統發生簇(phylogenetic cluster)(參照圖2)。

在實施例3解析的10H株的基因組草圖(draft genome)無己醣激酶(hexokinase)(EC2.7.1.1)基因，3個推定果糖激酶(fructokinase)(EC2.7.1.4)基因被發現。其結果成為10H株相較於葡萄糖(glucose)在含有果糖MRS培養基中生長良好的理由的說明。而且，因在基因組草圖中存在蔗糖-6-磷酸水解酶(sucrose-6-phosphate hydrolase)(EC3.2.1.26)的基因，故推測為10H株能以蔗糖作為能源利用。該等結果說明即使是在存在40質量%以上的高濃度蔗糖的發酵液中，10H株也增殖良好，且成為優勢菌種。

再者，推定在10H株的基因組存在與CRISPR-Cas系統有關聯的至少4個基因。具體上為類型II-A CRISPR關聯蛋白質Csn2(序列編號(sequence number)1及2)、CRISPR關聯內核酸酶(endonuclease)Cas2(序列編號3及4)、類型II CRISPR關聯內核酸酶Cas1(序列編號5及6)及類型II CRISPR RNA衍生內核酸酶Cas9(序列編號7及8)等。在序列表的序列編號1~8顯示將該等蛋白質編碼之DNA序列及推定胺基酸序列。CRISPR-Cas系統當作細菌的免疫系統很重要，且具有可當作基因組編輯工具(genome editing tool)之利用可能性。而且，或許藉由該等系統合成的雙股RNA(double stranded RNA)在攝取了乳酸菌10H株之生物體內參與透過TLR3的自然免疫賦活作用。

根據如以上的特性解析及分類學的解析，賦予10H株為新穎的種之結論，作為乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株是根據日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構的生物技術中心所進行的生物遺傳資源寄存制度而進行寄存(寄存編號：NBRC113063)。然後，本菌株NBRC113063移交至專利生物寄存中心，以寄存編號NITE BP-02811寄存。而且，本說明書所記載的新穎乳酸菌的分類學的性質記載於藉由本發明人們發表的論文(Chiou T-Y et al, Antonie van Leeuwenhoek (2018), 111：1149-1156)，其全體係透過參照而合併於本說明書而構成。

(II)免疫賦活作用在本說明書中，[免疫賦活劑]是指意味著含有以乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株(寄存編號NITE BP-02811)的菌體或其培養物作為有效成分的組成物，且促進口腔、鼻腔、呼吸器官、消化管等的黏膜上皮中的IgA的分泌，為了使宿主的免疫系統(immune system)賦活而有效的組成物。本發明的免疫賦活劑如以下所詳述的，包含飲食品、醫藥品、外用劑或飼料的形態等。而且，該等之中以健康食品較佳，特別是以維持增進免疫力降低的對象者的健康用的食品組成物較佳。

而且，[IgA產生促進劑]是指含有以乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株(寄存編號NITE BP-02811)的菌體或其培養物作為有效成分的組成物，且添加於大量包含IgA產生細胞的派亞氏淋巴叢細胞的培養液培養規定期間，比未添加在培養後的培養液中所分泌的分泌型IgA量的情形還增加之具有IgA產生誘導能。IgA產生促進劑藉由與疫苗(vaccine)同時給藥，可增強對應疫苗中所包含的抗原的抗體的產生，可增強疫苗的效果，而且抑制疫苗的副作用的可能性高。也就是說，增強對疫苗所包含的抗原的抗體的產生，使保護性免疫(protective immunity)的誘導良好並增強疫苗的效果。

(III)各種組成物及其用途 [各種組成物] 以飲食品、醫藥品、外用劑(外用醫藥品、化妝品等)、飼料等的各種組成物的形態使用本實施形態的新穎乳酸菌的情形，依照乳酸菌培養的習用方法培養該乳酸菌的菌體，不僅原封不動地使用由所得到的培養物藉由離心分離等的集菌手段分離者，也能使用：該培養、發酵液(培養上清)、其培養物的粗精製品或精製品、該等的冷凍乾燥品或者使用酵素或物理的手段處理菌體之細胞質或細胞壁劃分。

而且，菌體不僅為活菌體，也可以為藉由通常的一般的加熱滅菌操作而被滅菌者。容易受到熱變性(thermal denaturation)的蛋白性成分或源自於核酸等的乳酸菌的免疫誘導活性藉由70℃、30分的加熱處理而降低，惟由後述的實施例4的結果，顯然10H株的IgA產生誘導活性即使因加熱處理也不衰減，故10H株所產生的免疫增強成分具有加熱耐性。因10H株在高糖濃度(高滲透壓)之過嚴的生長條件中生長，故被預想具有堅固的細胞表層構造。加熱處理較佳為75℃1分以上，更佳為85℃、1分以上。即使是被加熱處理過的菌體，不僅可期待因IgA產生誘導作用等造成的免疫賦活作用，活菌的情形也有在製品製造以後的配送時或陳列時引起形態變化的可能性，故不更進一步引起形態變化的加熱滅菌菌體可適合使用。此外，本實施形態的組成物以加熱滅菌菌體含有10H株的情形，在該組成物的製品化時採用加熱、加壓等的條件也可以。

上述培養液例如如實施例1所示，適合本發明乳酸菌的培養基例如可使用包含D-果糖的MRS培養基等，藉由以18~39℃培養16~28小時左右而得到。培養菌體在培養後可藉由例如對培養液進行3000轉/分、4℃、10分鐘離心分離並集菌而得到。該等可依照習用方法進行精製。進而該菌體也能進行冷凍乾燥或噴霧乾燥。如此得到的菌體可當作本發明組成物的有效成分利用。

在本實施形態的組成物中也能原封不動地使用10H株的菌體，惟適宜配合適當的可食性載體(食品原料)、製藥上容許的載體，調製成如後述的飲食品、醫藥品、外用劑、飼料等的形態較佳。

而且，在本實施形態的組成物中更依照需要也能含有適合10H株的維持、增殖等的營養成分的適量。作為該營養成分的具體例可舉出：微生物的培養用的培養基所利用之例如葡萄糖、澱粉、蔗糖、乳糖、糊精(dextrin)、山梨醇(sorbitol)、果糖等的碳源；例如酵母萃(yeast extract)、蛋白腖(peptone)等的氮源；維生素類、礦物類、微量金屬元素、其他的營養成分等的各成分。作為維生素類可舉例說明例如維生素B、維生素D、維生素C、維生素E、維生素K等。作為微量金屬元素可舉例說明例如鋅、硒等。作為其他的營養成分可舉例說明例如乳果寡醣(lactosucrose)、大豆寡醣(soybean oligosaccharide)、乳酮糖(lactulose)、乳糖醇(Lactitol) 、寡果醣(fructooligosaccharide)、半乳寡醣(galactooligosaccharide)等的各種寡醣(oligosaccharide)。該等寡醣的配合量未被特別限定，惟通常在本發明組成物中選自於成為1~30重量%左右的量範圍較佳。

給予本實施形態的組成物中的10H株的配合量一般在組成物100g中可由菌數成為10⁸ ~10¹¹ 個左右(無須為活菌數)的量適宜選擇。活菌數的測定藉由塗佈稀釋於菌培養用的洋菜培養基的試樣並以30℃進行培養，計測生長的菌落數而算出。因該活菌數與濁度相關，故若預先先求出活菌數與濁度的相關，則取代活菌數的測定可藉由測定濁度計算上述活菌數。上述10H株的配合量以上述量為大致的標準，可依照所調製的本實施形態的組成物的形態適宜變更。

本實施形態的組成物能與疫苗一起使用，或者組成物單獨使用。與疫苗一起使用的情形，該組成物在疫苗給藥的前後給藥，也能當作提高效果的疫苗的效果增強劑利用。該組成物的使用量依照使用的疫苗的種類及品質或年齡、症狀等而不同，惟例如為了使用於預防用，可舉出成人每一次以固體含量(solid content)換算為0.01~10g左右，在飯前30分左右1日服用3次較理想。而且，在當作健康食品使用時，對不給予食品的味道或外觀不良影響的量，例如成為對象的食品1kg，以固體含量換算在0.1~100g左右的範圍使用為適當。

以下就各組成物的形態具體地進行說明。 (飲食品) 本實施形態的組成物以飲食品的情形例如可舉出發酵乳、乳酸菌飲料、發酵蔬菜飲料、發酵水果飲料、發酵豆漿飲料等。[發酵乳]是指以乳酸菌、雙叉乳酸桿菌或酵母使乳或乳製品發酵之作成糊狀或液狀者。因此，在該發酵乳包含有飲料形態同時包含有酸酪乳(yogurt)形態。而且，[乳酸菌飲料]是指以如下當作主原料並使其稀釋於水之飲料：以乳酸菌、雙叉乳酸桿菌或酵母使乳或乳製品發酵之作成糊狀或液狀者。

作為其他的飲食品形態的例子可舉出：醃菜、味噌、發酵茶、麵包等的發酵食品；斷乳食品、奶粉、嬰幼兒食品等的嬰幼兒用食品；發泡製劑、口香糖、軟糖、布丁等的糕點類；麵類；膠囊(capsule)、顆粒、粉末、錠劑等的營養輔助食品等；前述發酵乳及乳酸菌飲料以外的乳製品等。特別是因包含即使因加熱也能保持功能性的免疫增強成分，故需要加熱程序的加工食品的形態較佳。作為特佳的形態可舉出衛生管理上需加熱調理的加工食品，例如照護食品等。本實施形態的飲食品可提供即使因對食物中毒預防有效的75℃的加熱也穩定的免疫增強劑，特別是IgA產生促進劑及免疫賦活劑。

而且，在本發明的飲食品包含有以感染防禦、下痢的預防等為概念，依照需要顯示其意旨之特定保健用食品、健康食品等的功能性食品。健康食品是指意味著比通常的食品還積極的意思，以保健、健康維持增進等的目的之食品，例如可舉出：液體或半固形、固形的製品，具體上可舉出：餅乾、仙貝、果凍、羊羹、酸酪乳、包子等的糕點類；清涼飲料、營養飲料、湯等。

(醫藥品) 本實施形態的組成物以醫藥品的情形係使用與10H株一起在製劑學上被容許的適當的製劑載體，被調製成一般的醫藥組成物的形態而被實用。作為該製劑載體通常可舉例說明在該領域被使用之已知的填充劑、增量劑、結合劑、保濕劑(moisturizer)、崩散劑(disintegrating agent)、表面活性劑、潤滑劑等的稀釋劑或賦形劑(excipient)。該等係依照所得到的製劑的給藥單位形態被適宜選擇使用。

作為醫藥組成物的給藥單位形態可選擇各種形態，惟較佳可舉出口服給藥用製劑、外用給藥製劑。作為口服給藥製劑的代表的製劑可舉出：錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸濁劑、乳劑、細粒劑、膠囊劑等。

在成形成錠劑的形態時，作為上述製劑載體例如可使用：乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、澱粉、碳酸鈣、高嶺土(kaolin)、結晶纖維素、矽酸、磷酸鉀等的賦形劑；水、乙醇、丙醇、單糖漿(simple syrup)、葡萄糖液、澱粉液、明膠(gelatin)溶液、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose)、甲基纖維素(methylcellulose)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)等的結合劑；羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium)、羧甲基纖維素鈣(carboxymethylcellulose calcium)、低取代度羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose with low degree of substitution)、乾燥澱粉、海藻酸鈉(sodium alginate)、洋菜粉末(agar powder)、昆布糖粉末(laminaran powder)、碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、碳酸鈣等的崩散劑；聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯類(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)、月桂硫酸鈉(sodium lauryl sulfate)、硬脂酸單甘油酯(monoglyceride stearate)等的界面活性劑；白糖、硬酯(stearin)、可可脂(cocoa butter)、氫化油(hydrogenated oil)等的崩散抑制劑、四級銨鹼(ammonium base)、月桂硫酸鈉等的吸收促進劑；甘油(glycerin)、澱粉等的保濕劑；澱粉、乳糖、高嶺土、膨土(bentonite)、膠體狀矽酸等的吸附劑(adsorbent)；精製滑石、硬脂酸鹽(stearate)、硼酸粉末、聚乙二醇(polyethylene glycol)等的潤滑劑等。進而錠劑依照需要能以施以通常的劑皮之錠劑，例如糖衣錠、明膠外包錠、腸溶被錠、膜衣錠或雙重錠、多層錠。

在成形成丸劑的形態時，作為製劑載體例如可使用：葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂(cacao butter)、硬化植物油、高嶺土、滑石等的賦形劑；阿拉伯膠(gum arabic)粉末、黃蓍膠(tragacanth)粉末、明膠、乙醇等的結合劑；昆布糖、洋菜等的崩散劑等。

再者，在醫藥組成物中依照需要也能含有：著色劑、保存劑(preservative)、香料、風味劑、甜味劑(edulcorant)等或其他的醫藥品。

上述醫藥組成物的給藥方法特別無限制，係依照各種製劑形態、患者的年齡、性別和其他的條件，疾病的程度等而決定。而且，雖然其給藥量依照用法、患者的年齡、性別和其他的條件、疾病的程度等而適宜選擇，但通常有效成分之10H株的菌體量以每一日體重每1kg約0.5~20mg左右較佳，該製劑可一日分成1~4次給藥給人。

(外用劑) 本實施形態的組成物以化妝品、外用醫藥品、準藥品(quasi drug)等的外用劑組成物的情形係使用與10H株一起在製劑學上被容許的適當的製劑載體，被調製成一般的外用劑組成物的形態而被實用。

作為如此的製劑載體，例如可舉出：甘油、凡士林(vaseline)、尿素、玻尿酸(hyaluronic acid)、肝素(heparin)等的保濕劑；PABA衍生物(對胺苯甲酸(p‐aminobenzoic acid)、Escalol 507等)、桂皮酸衍生物(Neo Heliopan、PARSOL MCX、SunGuardＢ等)、柳酸衍生物(水楊酸辛酯(octyl salicylate)等)、二苯甲酮(benzophenone)衍生物(ASL-24、ASL-24S等)、二苯甲醯甲烷(dibenzoylmethane) 衍生物(PARSOL A、PARSOL DAM等)、雜環衍生物(Tinuvin系等)、氧化鈦等的紫外線吸收劑/散射劑、依地酸二鈉(disodium edetate)、依地酸三鈉(trisodium edetate)、檸檬酸、檸檬酸鈉、酒石酸、酒石酸鈉、乳酸、蘋果酸、多磷酸鈉(sodium polyphosphate)、偏磷酸鈉(sodium metaphosphate)、葡萄糖酸(gluconic acid)等的螫合劑(sequestering agent)、柳酸、硫磺、咖啡因(caffeine)、單寧(tannin)等的皮脂抑制劑；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)、氯化本索寧(benzethonium chloride)、葡萄糖酸洛赫西定(chlorhexidine gluconate)等的殺菌/消毒劑；鹽酸二苯胺(diphenhydramine hydrochloride)、傳明酸(tranexamic acid)、瓜甘菊薁(guaiazulene)、薁(azulene)、尿囊素(allantoin)、扁柏醇(hinokitiol)、甘草酸(glycyrrhizic acid)及其鹽、甘草酸衍生物、甘草酸(glycyrrhetic acid)等的抗炎劑；維生素A、維生素B群(B1、B2、B6、B12、B15)、葉酸、菸鹼酸(nicotinic acid)類、泛酸(pantothenic acid)類、生物素(biotin)、維生素C、維生素D群(D2、D3)、維生素E、泛醌(ubiquinone)類、維生素K(K1、K2、K3、K4)等的維生素類；天冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、丙胺酸(alanine)、離胺酸(lysine)、甘胺酸(glycine)、麩醯胺酸(glutamine)、絲胺酸(serine)、半胱胺酸(cysteine)、胱胺酸(cysteine)、酪胺酸(tyrosine)、脯胺酸(proline)、精胺酸(arginine)、吡咯烷酮羧酸(pyrrolidone carboxylic acid)等的胺基酸及其衍生物；視網醇(retinol)、生育酚醋酸酯(tocopherol acetate)、抗壞血酸磷酸酯鎂(magnesium ascorbyl phosphate)、抗壞血酸葡萄糖苷(ascorbic acid glucoside)、熊果苷(arbutin)、麴酸(kojic acid)、土耳其鞣酸(ellagic acid)、胎盤萃取液等的美白劑；丁基羥基甲苯(butylhydroxytoluene)、丁基羥基甲氧苯(butylated hydroxyanisole)、五倍子酸丙酯(propyl gallate)等的抗氧化劑；氯化鋅、硫酸鋅、石炭酸鋅、氧化鋅、硫酸鉀鋁(aluminum potassium sulfate)等的收斂劑(astringent)；萄葡糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖(trehalose)、丁四醇(erythritol)、甘露醇(mannitol)、木糖醇(xylitol)、乳糖醇(Lactitol)等的糖類；甘草、洋甘菊(manzanilla)、歐洲七葉樹(marronnier)、虎耳草(Saxifrage)、芍藥、花梨木、黃芩(scutellariae radix)、黃蘗(phellodendron bark)、黃連、蕺菜、銀杏葉(ginkgo leaf)等的各種植物萃取物等之外，油性成分、界面活性劑、增稠劑(thickener)、醇(alcohol)類、粉末成分、色素等。

作為外用劑組成物的具體例可舉出：化妝用膏類、乳液、化妝水、面膜劑(pack agent)、護膚乳液(乳劑)、凝膠(gel)劑、香粉、唇膏、口紅、粉底(under makeup)、粉底(foundation)、防曬乳、浴用劑、沐浴乳(body shampoo)、沐浴露(body rinse)、香皂、洗面乳(cleansing foam)、軟膏、貼附劑、膠凍劑(jellies)、噴霧劑(aerosols)等。

(飼料) 本實施形態的組成物以飼料的情形例如當作雞的非抗生劑給藥時期、豬、牛等的斷乳期中的感染症預防用可舉出：口服給藥用製劑形態(水溶液、乳化液、顆粒、粉末、膠囊、錠劑等)。

(IV)免疫賦活劑的製造方法在本發明的其他的實施形態中提供一種免疫賦活劑的製造方法，包含將乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株接種並培養於高糖濃度且包含D-果糖的培養基之步驟。在本實施形態中[高糖濃度]是指意味著使用提高了糖濃度的培養基進行培養，例如可藉由萄葡糖、果糖、甘露糖等的單醣(monosaccharide)；蔗糖、乳糖(lactose)等的雙醣(disaccharide)；寡醣；多醣(polysaccharide)類；糖醇(sugar alcohol)類等的糖溶液的添加進行調整。高糖濃度培養基是指具有比通常的培養基的滲透壓高的滲透壓之培養基。高糖濃度培養基例如添加的糖類的最終濃度至少10質量%，較佳為10~40質量%，即使是40質量%以上的糖濃度也能生長。再者，作為10H株的碳源為包含5~20質量%的D-果糖，較佳為包含5~10質量%的D-果糖的培養基。D-果糖不僅當作單醣添加，當作蔗糖或寡醣或多醣類(包含蔬菜或蕈類等)添加的培養基成分分解於培養中而被供給也可以。因此，作為高糖濃度的培養基以包含D-果糖作為其構成成分之蔗糖，或源自黑砂糖或黑糖等的天然產物的糖類較佳。藉由以如此的高糖濃度且包含D-果糖的培養基進行培養，即使在其他的乳酸菌株等的存在下也能使10H株當作優勢菌株生長。

其次舉實施例，更詳細地說明本發明，但本發明絲毫不被該等實施例限制。

[實施例] [實施例1] 10H株的單離與培養條件乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株是由日本國長野縣佐久市的安露莎(ARSOA)佐久工廠製造的蔬菜黑糖發酵液得到。在該發酵液存在包含黑砂糖(10重量%)、半乳寡醣(7重量%)及紅糖(brown sugar)(33重量%)之以重量換算約50%以上的糖。參考限界稀釋法(Button et al. 1993, Simu and Hagstrom 2004)，改變成使用聚苯乙烯製96井微量滴定盤(96-well microtiter plate)的方法，將該菌株單離。

以使用具有以下的組成之Lactobacilli MRS培養基(Lactobacilli MRS Broth)(Difco Laboratories公司製)並將發酵液稀釋1000倍後之物當作起始試樣： Proteose Peptone N3 　　10g/L Beef extract 　　10g/L Yeast extract 　　5g/L Dextrose 20g/L Polysorbate 80 　1g/L 檸檬酸銨　 2g/L 醋酸鈉　5g/L 硫酸鎂 0.1g/L 硫酸錳 0.05g/L 磷酸氫二鉀 2g/L。以微量滴定盤進行2倍階段稀釋(2⁰ ~2¹⁸ 倍)後，以將各井滅菌後的50容量%的酵素液充滿。該微量滴定盤為了靜置培養而在30℃於大氣壓中靜置。5日後抽出存在於一個井的菌落，繼代培養於追加了10%(w/v)D-果糖的MRS培養基中。在使用追加了10%(w/v)D-果糖的Lactobacilli MRS洋菜(Difco Laboratories公司)的培養皿(petri dish)中觀察了菌落形成。確認了被單離的菌株純粹，懸濁於10%(w/v)甘油及10%(w/v)脫脂乳(skim milk)中以-80℃保存。

[實施例2] 10H株的增殖特性為了調查10H株的增殖特性，使用僅MRS培養基，或使用以5%、10%、15%或20%(w/v)的濃度將D-果糖添加於MRS培養基，或者使用以0.5容量%的濃度添加了丙酮酸(pyruvic acid)之MRS培養基，在30℃進行了培養。將在0~110小時之間使用JASCO公司製、V-730UV-可見光分光光度計(visible spectrophotometer)測定了660nm的波長中的培養液的吸光度(OD660)的結果顯示於圖1。如圖1所示，10H株在僅MRS培養基及添加了0.5%的丙酮酸之MRS培養基中幾乎不增殖，而在添加了5%~20%的D-果糖之MRS培養基中增殖很好。

[實施例3] 系統發生分析由單離的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的培養菌體藉由習用方法萃取基因組DNA，藉由PCR放大排序(PCR amplification sequencing)，使用Applied Biosystems公司的3130遺傳分析儀(Genetic Analyzer)決定16S rRNA基因的序列。根據與近緣菌株的16S rRNA基因的鹼基序列(base sequence)的同源(homology)，使用最大概似法(maximum likelihood method)構築了系統發生樹。將其結果顯示於圖2。將50%以上的自舉值(bootstrap value)顯示於分岔點。而且，將GenBank的寄存編號顯示於括弧內。

10H株的基因組序列草圖(draft genome sequence)係藉由習用方法使用Ion Torrent PGM系統進行了解析。其結果基因組DNA的GC含量為30.5%，將67個片段重疊群(contig)排列並賦予1376個CDS、1個tmRNA、3個rRNA基因、56個tRNA基因及1個重複序列(repetitive sequence)區域注釋。10H株與乳酸菌kunkeei(L. kunkeei)YH-15株及乳酸菌apinorum(L. apinorum)Fhon13N株的ANI值(相同值)係使用由NCBI取得的基因組序列(genome sequence)與OrthoANIu進行推定。為了識別乳酸菌屬之不同的種，pheS及rpoA基因的部分序列(partial sequence)係作為16S rRNA基因序列的代替手段使用(Naser們、2007)。因此，由NCBI取得乳酸菌kunkeei(L. kunkeei)YH-15株及乳酸菌apinorum(L. apinorum)Fhon13N株的基因序列，分別比較了該等彼此及該等與10H株的鹼基序列的一致性。將其結果顯示於以下的表1。

[表1]

由該等結果得知，關於pheS及rpoA的任一個基因都是乳酸菌kunkeei(L. kunkeei)YH-15株與乳酸菌apinorum(L. apinorum)Fhon13N株的序列同源性(sequence homology)比10H株與該等的同源高。10H株與乳酸菌kunkeeiYH-15株的ANI值被計算為74.46%，另一方面，10H株與乳酸菌apinorumFhon13N株的ANI值被計算為73.31%。因該等的值比當作種的邊界被設定的ANI值(95~96%)低，故賦予10H株屬於與乳酸菌kunkeei(L. kunkeei)、乳酸菌apinorum(L. apinorum)及乳酸菌ozensis (L. ozensis)不同的種之結論。

[實施例4] 供試菌樣品的IgA產生誘導活性的測定 (派亞氏淋巴叢細胞的調製) 以AIN-76A DIET(自Research Diets購入)將6週歲公BALB/cA小鼠(自CREA Japan購入)飼育1星期後，以碳酸氣使其安樂死，摘出派亞氏淋巴叢。在RPMI10培養基[RPMI1640培養基(Gibco BRL)以100U/ml的青黴素(penicillin)、100μg/ml的鏈黴素(streptomycin)、55μmol/l的2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)及10%胎牛血清(FBS；GibcoBRL)]將派亞氏淋巴叢清洗後，以加入25mmol/l的HEPES、5mmol/l的EDTA(pH8.0)及1mmol/l的二硫蘇糖醇(dithiothreitol)之RPMI10培養基，在45分、37℃、5%CO₂ 條件下進行了培養。再度以RPMI10培養基清洗後，以加入400U/ml的類型I膠原酶(collagenase)(Sigma)與30U/ml的DNaseI(Takara)之RPMI10培養基，在50分、37℃、5%CO₂ 條件下進行了培養。以45μm過濾器(filter)將反應液過濾，置換成RPMI10培養基後，將細胞數調製成5.0×10⁶ cells/ml。

(供試菌液的調製) 以MRS培養基(Difco Laboratories)在一晚30℃下將供試菌靜置培養，置換成生理食鹽水後，將吸光度(OD600)調整成0.02。依照需要以70℃或100℃進行了30分鐘加熱處理。Lactobacillus kosoi sp. nov.使用研究室保管株。Bifidobacterium catenulatum(JCM1194)、Bifidobacterium breve(JCM1192)、Bifidobacterium animalis subsp. lactis(JCM10602)、Bifidobacterium adolescentis(JCM1275)、Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum(JCM1205)、Bifidobacterium pseudocatenulatum(JCM1200)、Bifidobacterium longum subsp. longum(JCM1217)、Bifidobacterium longum subsp. infantis(JCM1222)、Lactobacillus plantarum subsp. plantarum(JCM1149)、Lactobacillus johnsonii (JCM2012)、Lactobacillus casei(JCM1134)、Lactobacillus reuteri(JCM1112)、Lactobacillus gasseri(JCM1131)、Lactococcus lactis subsp. lactis(JCM5805)由RIKEN Japan Collection of Microorganisms(JCM)購入。Lactobacillus rhamnosus GG(ATCC53103)由American Type Culture Collection(ATCC)購入。

(IgA的測定) 在96-well T-cell activation plate(Becton Dickinson)中於5天、37℃、5%CO₂ 條件下對所調製的派亞氏淋巴叢細胞100μl與供試菌液100μl進行了共培養(cocultivation)。進行離心後，以mouse IgA ELISA kit (Bethyl Laboratories)測定了得到的培養上清中的IgA量。

將其結果顯示於表2及圖3。在10H株認定了非常高的IgA產生誘導活性。該活性比此次用於比較的其他的15種類的任一供試菌高。 [表2]

接著，將使用在70℃下進行了30分鐘加熱處理的供試菌樣品進行了同樣的試驗的結果顯示於以下的表3及圖4A。 [表3]

而且，將使用在100℃下進行了30分鐘加熱處理的供試菌樣品進行了同樣的試驗的結果顯示於以下的表4及圖4B。此外，顯著性檢定(significance test)是以saline作為對照組(control group)，藉由Dunnett的多重比較檢定(multiple comparison test)進行了與對照組的組間比較(comparison between groups)。將顯著性水準(level of significance)未滿5%表示為*，未滿1%表示為**，未滿0.1%表示為***當作顯著。

[表4]

由該等的結果，未認定10H株因70℃、30分鐘的加熱造成了免疫誘導活性的降低。即使是100℃、30分鐘的加熱也保持了約75%的活性。而且，70℃、100℃都比此次用於比較的任一菌還具有高的活性。乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株可期待作為耐熱性高的免疫賦活劑。 [序列表] SEQUENCE LISTING ＜110＞ AOB KEIOH GROUP CORPORATION ＜120＞ Novel strain of Lactobacillus and immunostimulator comrising the same ＜130＞ P1937ARS ＜160＞ 8 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 669 ＜212＞ DNA ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜220＞＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(669) ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1)..(669) ＜223＞ type II-A CRISPR-associated protein Csn2 ＜400＞ 1 atg ata att agt tat aag aca cat aaa aaa ata aat ata cag caa ggt 48 Met Ile Ile Ser Tyr Lys Thr His Lys Lys Ile Asn Ile Gln Gln Gly 1 5 10 15 aaa atc aat gtt atc gca acc aat aat caa gct gta tat tta gat ttc 96 Lys Ile Asn Val Ile Ala Thr Asn Asn Gln Ala Val Tyr Leu Asp Phe 20 25 30 att gat gga ttt aag ggt aat atg gac tta gtt aat ata ttt gat gat 144 Ile Asp Gly Phe Lys Gly Asn Met Asp Leu Val Asn Ile Phe Asp Asp 35 40 45 aat tac aat agg cta gat aat att gaa tgt att aat tgg ata ggt gat 192 Asn Tyr Asn Arg Leu Asp Asn Ile Glu Cys Ile Asn Trp Ile Gly Asp 50 55 60 cta att gaa tcg att gat att aat aaa tat tat aaa aat aaa ttg att 240 Leu Ile Glu Ser Ile Asp Ile Asn Lys Tyr Tyr Lys Asn Lys Leu Ile 65 70 75 80 aat agt att gat aat aat ttt agt gaa aaa gaa att aac tcc att cat 288 Asn Ser Ile Asp Asn Asn Phe Ser Glu Lys Glu Ile Asn Ser Ile His 85 90 95 aat gct aat cga gaa ttg gtt aat aca att caa aag cat tta ttt atg 336 Asn Ala Asn Arg Glu Leu Val Asn Thr Ile Gln Lys His Leu Phe Met 100 105 110 tac gat cta cca att gaa gtt gat tat gat aat gat tta aaa aga att 384 Tyr Asp Leu Pro Ile Glu Val Asp Tyr Asp Asn Asp Leu Lys Arg Ile 115 120 125 ctt aat tat tca aaa atc cat ttt gat aat tat gct atc aat aat cct 432 Leu Asn Tyr Ser Lys Ile His Phe Asp Asn Tyr Ala Ile Asn Asn Pro 130 135 140 tat gat aaa ata agt atg tta ata aaa tta cat cta gaa ctc gaa gat 480 Tyr Asp Lys Ile Ser Met Leu Ile Lys Leu His Leu Glu Leu Glu Asp 145 150 155 160 tca tca gtt ttg gtt gtt act aat gta gct cat tat tta acc cca aaa 528 Ser Ser Val Leu Val Val Thr Asn Val Ala His Tyr Leu Thr Pro Lys 165 170 175 caa att gat ggg att gca gat tta tgt aaa agt tct tca att cca ttg 576 Gln Ile Asp Gly Ile Ala Asp Leu Cys Lys Ser Ser Ser Ile Pro Leu 180 185 190 ata atg att gaa ttt aca gat tta aaa tct aag gac aat tat aag cat 624 Ile Met Ile Glu Phe Thr Asp Leu Lys Ser Lys Asp Asn Tyr Lys His 195 200 205 tgt aat ttt gca tat ata gac caa gat ttc gtt gat tgg tat taa 669 Cys Asn Phe Ala Tyr Ile Asp Gln Asp Phe Val Asp Trp Tyr 210 215 220 ＜210＞ 2 ＜211＞ 222 ＜212＞ PRT ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜400＞ 2 Met Ile Ile Ser Tyr Lys Thr His Lys Lys Ile Asn Ile Gln Gln Gly 1 5 10 15 Lys Ile Asn Val Ile Ala Thr Asn Asn Gln Ala Val Tyr Leu Asp Phe 20 25 30 Ile Asp Gly Phe Lys Gly Asn Met Asp Leu Val Asn Ile Phe Asp Asp 35 40 45 Asn Tyr Asn Arg Leu Asp Asn Ile Glu Cys Ile Asn Trp Ile Gly Asp 50 55 60 Leu Ile Glu Ser Ile Asp Ile Asn Lys Tyr Tyr Lys Asn Lys Leu Ile 65 70 75 80 Asn Ser Ile Asp Asn Asn Phe Ser Glu Lys Glu Ile Asn Ser Ile His 85 90 95 Asn Ala Asn Arg Glu Leu Val Asn Thr Ile Gln Lys His Leu Phe Met 100 105 110 Tyr Asp Leu Pro Ile Glu Val Asp Tyr Asp Asn Asp Leu Lys Arg Ile 115 120 125 Leu Asn Tyr Ser Lys Ile His Phe Asp Asn Tyr Ala Ile Asn Asn Pro 130 135 140 Tyr Asp Lys Ile Ser Met Leu Ile Lys Leu His Leu Glu Leu Glu Asp 145 150 155 160 Ser Ser Val Leu Val Val Thr Asn Val Ala His Tyr Leu Thr Pro Lys 165 170 175 Gln Ile Asp Gly Ile Ala Asp Leu Cys Lys Ser Ser Ser Ile Pro Leu 180 185 190 Ile Met Ile Glu Phe Thr Asp Leu Lys Ser Lys Asp Asn Tyr Lys His 195 200 205 Cys Asn Phe Ala Tyr Ile Asp Gln Asp Phe Val Asp Trp Tyr 210 215 220 ＜210＞ 3 ＜211＞ 306 ＜212＞ DNA ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜220＞＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(306) ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1)..(306) ＜223＞ CRISPR-associated endonuclease Cas2 ＜400＞ 3 atg cgc tta ata gta atg ttt gat tta cca act gat act agt gaa gat 48 Met Arg Leu Ile Val Met Phe Asp Leu Pro Thr Asp Thr Ser Glu Asp 1 5 10 15 cga aga aat tat cgt cat ttt cgt aaa aaa tta att aat gaa ggt ttt 96 Arg Arg Asn Tyr Arg His Phe Arg Lys Lys Leu Ile Asn Glu Gly Phe 20 25 30 atg atg tta cag tat tct gtt tat gaa aga gtt tgt gtt aac agg aag 144 Met Met Leu Gln Tyr Ser Val Tyr Glu Arg Val Cys Val Asn Arg Lys 35 40 45 tca gct aga ttt ttg gaa aat aga att gct gcg atg gca cca gat aaa 192 Ser Ala Arg Phe Leu Glu Asn Arg Ile Ala Ala Met Ala Pro Asp Lys 50 55 60 ggc ctt att caa agc ttt atg att act gaa aag caa tat aat gat att 240 Gly Leu Ile Gln Ser Phe Met Ile Thr Glu Lys Gln Tyr Asn Asp Ile 65 70 75 80 cat ttt att acc ggg aag ccg att gaa gac gtc cgt aat tca tca gaa 288 His Phe Ile Thr Gly Lys Pro Ile Glu Asp Val Arg Asn Ser Ser Glu 85 90 95 agg acc att att cta tga 306 Arg Thr Ile Ile Leu 100 ＜210＞ 4 ＜211＞ 101 ＜212＞ PRT ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜400＞ 4 Met Arg Leu Ile Val Met Phe Asp Leu Pro Thr Asp Thr Ser Glu Asp 1 5 10 15 Arg Arg Asn Tyr Arg His Phe Arg Lys Lys Leu Ile Asn Glu Gly Phe 20 25 30 Met Met Leu Gln Tyr Ser Val Tyr Glu Arg Val Cys Val Asn Arg Lys 35 40 45 Ser Ala Arg Phe Leu Glu Asn Arg Ile Ala Ala Met Ala Pro Asp Lys 50 55 60 Gly Leu Ile Gln Ser Phe Met Ile Thr Glu Lys Gln Tyr Asn Asp Ile 65 70 75 80 His Phe Ile Thr Gly Lys Pro Ile Glu Asp Val Arg Asn Ser Ser Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Ile Leu 100 ＜210＞ 5 ＜211＞ 903 ＜212＞ DNA ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜220＞＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(903) ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1)..(903) ＜223＞ type II CRISPR-associated endonuclease Cas1 ＜400＞ 5 atg gga tgg cga aat gta att att tct cag cat gct aag tta tct tat 48 Met Gly Trp Arg Asn Val Ile Ile Ser Gln His Ala Lys Leu Ser Tyr 1 5 10 15 tca gct aat aat atg att gtc caa act ttt gaa ggt att aat cag ata 96 Ser Ala Asn Asn Met Ile Val Gln Thr Phe Glu Gly Ile Asn Gln Ile 20 25 30 cct att tct gat atg tat att ttg att att gaa agt aat caa gca gtt 144 Pro Ile Ser Asp Met Tyr Ile Leu Ile Ile Glu Ser Asn Gln Ala Val 35 40 45 ata aca act gag tta ata agc cag tta aat ttt cat gat gta aaa att 192 Ile Thr Thr Glu Leu Ile Ser Gln Leu Asn Phe His Asp Val Lys Ile 50 55 60 gtt ttt tca gat gac aat cac aat cct tgt tgt gag aca gta aac tat 240 Val Phe Ser Asp Asp Asn His Asn Pro Cys Cys Glu Thr Val Asn Tyr 65 70 75 80 tat cca aat aat cgt tcg ctt gat aaa tta gaa aaa caa tac aat tgg 288 Tyr Pro Asn Asn Arg Ser Leu Asp Lys Leu Glu Lys Gln Tyr Asn Trp 85 90 95 tca agc aat cgt gta aat att tta tgg aca aaa ata att aat aat aaa 336 Ser Ser Asn Arg Val Asn Ile Leu Trp Thr Lys Ile Ile Asn Asn Lys 100 105 110 att ata aat cag att aat gtt tta aaa ttt tat aat cat aat act gaa 384 Ile Ile Asn Gln Ile Asn Val Leu Lys Phe Tyr Asn His Asn Thr Glu 115 120 125 act tta gaa aat gaa tta agt aag tta gaa ctt ggt gat gtt agt aat 432 Thr Leu Glu Asn Glu Leu Ser Lys Leu Glu Leu Gly Asp Val Ser Asn 130 135 140 cgc gaa gca gta gtg gca aga aaa tat ttt atg ctg tta ttt gat aaa 480 Arg Glu Ala Val Val Ala Arg Lys Tyr Phe Met Leu Leu Phe Asp Lys 145 150 155 160 aaa ttc tca cga cgt gat ttt tca cca atg aat gct gct tta aat tat 528 Lys Phe Ser Arg Arg Asp Phe Ser Pro Met Asn Ala Ala Leu Asn Tyr 165 170 175 ggt tat tct att tta tta tca acc ttt aat cgc tca att gtc ttg aat 576 Gly Tyr Ser Ile Leu Leu Ser Thr Phe Asn Arg Ser Ile Val Leu Asn 180 185 190 gga tat tta act gag att gga att cat cac cat agt gat gaa aat aat 624 Gly Tyr Leu Thr Glu Ile Gly Ile His His His Ser Asp Glu Asn Asn 195 200 205 ttt aat tta gga tca gat ttt atg gag ccc ttt aga cca att gtt gat 672 Phe Asn Leu Gly Ser Asp Phe Met Glu Pro Phe Arg Pro Ile Val Asp 210 215 220 tat tgg tta gct aat aag aaa ttt aat caa ctg aca cca gat ata aaa 720 Tyr Trp Leu Ala Asn Lys Lys Phe Asn Gln Leu Thr Pro Asp Ile Lys 225 230 235 240 ttt agt tta gta gaa tta tta aat gtt gaa ata aaa tat aat ggc aaa 768 Phe Ser Leu Val Glu Leu Leu Asn Val Glu Ile Lys Tyr Asn Gly Lys 245 250 255 aat atg gtt tta aat aat gca ata gat aaa tat aca gat gat tgt ttg 816 Asn Met Val Leu Asn Asn Ala Ile Asp Lys Tyr Thr Asp Asp Cys Leu 260 265 270 aat tac tta act acc gga aaa tct ata aag ata gag gtt gaa ttg ata 864 Asn Tyr Leu Thr Thr Gly Lys Ser Ile Lys Ile Glu Val Glu Leu Ile 275 280 285 aat gag gta ccg aat aat gcg ctt aat agt aat gtt tga 903 Asn Glu Val Pro Asn Asn Ala Leu Asn Ser Asn Val 290 295 300 ＜210＞ 6 ＜211＞ 300 ＜212＞ PRT ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜400＞ 6 Met Gly Trp Arg Asn Val Ile Ile Ser Gln His Ala Lys Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Asn Asn Met Ile Val Gln Thr Phe Glu Gly Ile Asn Gln Ile 20 25 30 Pro Ile Ser Asp Met Tyr Ile Leu Ile Ile Glu Ser Asn Gln Ala Val 35 40 45 Ile Thr Thr Glu Leu Ile Ser Gln Leu Asn Phe His Asp Val Lys Ile 50 55 60 Val Phe Ser Asp Asp Asn His Asn Pro Cys Cys Glu Thr Val Asn Tyr 65 70 75 80 Tyr Pro Asn Asn Arg Ser Leu Asp Lys Leu Glu Lys Gln Tyr Asn Trp 85 90 95 Ser Ser Asn Arg Val Asn Ile Leu Trp Thr Lys Ile Ile Asn Asn Lys 100 105 110 Ile Ile Asn Gln Ile Asn Val Leu Lys Phe Tyr Asn His Asn Thr Glu 115 120 125 Thr Leu Glu Asn Glu Leu Ser Lys Leu Glu Leu Gly Asp Val Ser Asn 130 135 140 Arg Glu Ala Val Val Ala Arg Lys Tyr Phe Met Leu Leu Phe Asp Lys 145 150 155 160 Lys Phe Ser Arg Arg Asp Phe Ser Pro Met Asn Ala Ala Leu Asn Tyr 165 170 175 Gly Tyr Ser Ile Leu Leu Ser Thr Phe Asn Arg Ser Ile Val Leu Asn 180 185 190 Gly Tyr Leu Thr Glu Ile Gly Ile His His His Ser Asp Glu Asn Asn 195 200 205 Phe Asn Leu Gly Ser Asp Phe Met Glu Pro Phe Arg Pro Ile Val Asp 210 215 220 Tyr Trp Leu Ala Asn Lys Lys Phe Asn Gln Leu Thr Pro Asp Ile Lys 225 230 235 240 Phe Ser Leu Val Glu Leu Leu Asn Val Glu Ile Lys Tyr Asn Gly Lys 245 250 255 Asn Met Val Leu Asn Asn Ala Ile Asp Lys Tyr Thr Asp Asp Cys Leu 260 265 270 Asn Tyr Leu Thr Thr Gly Lys Ser Ile Lys Ile Glu Val Glu Leu Ile 275 280 285 Asn Glu Val Pro Asn Asn Ala Leu Asn Ser Asn Val 290 295 300 ＜210＞ 7 ＜211＞ 4377 ＜212＞ DNA ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜220＞＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(4377) ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1)..(4377) ＜223＞ type II CRISPR-associated endonuclease Cas9 ＜400＞ 7 atg aaa aaa tat cat att ggt tta gat ata gga aca tca tca gta gga 48 Met Lys Lys Tyr His Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Ser Ser Val Gly 1 5 10 15 ttt gct gct aag cat gat gat ggt agt ttg gtt cat gta aag ggt aaa 96 Phe Ala Ala Lys His Asp Asp Gly Ser Leu Val His Val Lys Gly Lys 20 25 30 aat gtt att ggt gct cgt tta ttt aat gaa ggc caa act gca gaa gaa 144 Asn Val Ile Gly Ala Arg Leu Phe Asn Glu Gly Gln Thr Ala Glu Glu 35 40 45 cgc cgt aca tat aga gct gct aga aga aga tat agt cgc aga aga tgg 192 Arg Arg Thr Tyr Arg Ala Ala Arg Arg Arg Tyr Ser Arg Arg Arg Trp 50 55 60 aga tta aac tta tta aat caa att ttt aaa gat tct tta gat gca gta 240 Arg Leu Asn Leu Leu Asn Gln Ile Phe Lys Asp Ser Leu Asp Ala Val 65 70 75 80 gat gct act ttt cta aaa agg ctt aaa gaa tct agc tta tct aat caa 288 Asp Ala Thr Phe Leu Lys Arg Leu Lys Glu Ser Ser Leu Ser Asn Gln 85 90 95 gat caa aat aaa aaa tat ttt ggt gaa cta tta ttc ccc aaa gat aat 336 Asp Gln Asn Lys Lys Tyr Phe Gly Glu Leu Leu Phe Pro Lys Asp Asn 100 105 110 gat aaa cat ttt cat aca aac aat att caa gaa aat aaa cgt ggt aat 384 Asp Lys His Phe His Thr Asn Asn Ile Gln Glu Asn Lys Arg Gly Asn 115 120 125 gat act att ttt cat tta cgt gat cga tta atg aaa tca aat gaa aaa 432 Asp Thr Ile Phe His Leu Arg Asp Arg Leu Met Lys Ser Asn Glu Lys 130 135 140 gca gat att agg gag att tat tta gct ttt cat tcg atg gta aaa aat 480 Ala Asp Ile Arg Glu Ile Tyr Leu Ala Phe His Ser Met Val Lys Asn 145 150 155 160 cgt ggt aac ttt ttg gat aat acc cca gca tct tct ttt gaa gca tcg 528 Arg Gly Asn Phe Leu Asp Asn Thr Pro Ala Ser Ser Phe Glu Ala Ser 165 170 175 gat atg cat tta gta gat gtg tta cat aat ata aat aat ctt tat gaa 576 Asp Met His Leu Val Asp Val Leu His Asn Ile Asn Asn Leu Tyr Glu 180 185 190 caa atg aat att act ttt ggt ctt aat gat gta aat gct gaa aaa att 624 Gln Met Asn Ile Thr Phe Gly Leu Asn Asp Val Asn Ala Glu Lys Ile 195 200 205 gaa gat att tta ttg gac aat aaa gtg cgt aat att gat aag aaa aaa 672 Glu Asp Ile Leu Leu Asp Asn Lys Val Arg Asn Ile Asp Lys Lys Lys 210 215 220 aca tta att aat tta tta caa act aaa gaa agt aat aaa gaa tct aaa 720 Thr Leu Ile Asn Leu Leu Gln Thr Lys Glu Ser Asn Lys Glu Ser Lys 225 230 235 240 acc att att act gaa att gtg aaa ttg att tta gga tat aat agc aaa 768 Thr Ile Ile Thr Glu Ile Val Lys Leu Ile Leu Gly Tyr Asn Ser Lys 245 250 255 aaa att aat gcc att tta gaa gta gaa gaa cta gaa aat aat gaa tta 816 Lys Ile Asn Ala Ile Leu Glu Val Glu Glu Leu Glu Asn Asn Glu Leu 260 265 270 tgt tta tct aat gct aat agc gat gat caa att aat gca atc ttt gct 864 Cys Leu Ser Asn Ala Asn Ser Asp Asp Gln Ile Asn Ala Ile Phe Ala 275 280 285 gaa aca aat gaa gtt caa caa aat att att act gaa att aag act tta 912 Glu Thr Asn Glu Val Gln Gln Asn Ile Ile Thr Glu Ile Lys Thr Leu 290 295 300 tat tca aga acc aag tta aat caa att atc cct aat ggt aaa act tat 960 Tyr Ser Arg Thr Lys Leu Asn Gln Ile Ile Pro Asn Gly Lys Thr Tyr 305 310 315 320 tct gaa tcg atg att gat aag tat aat tta cat cat gat caa tta cgt 1008 Ser Glu Ser Met Ile Asp Lys Tyr Asn Leu His His Asp Gln Leu Arg 325 330 335 aat tta aaa ctg aat att tta gac cat tta aac ttt gat aaa aac aga 1056 Asn Leu Lys Leu Asn Ile Leu Asp His Leu Asn Phe Asp Lys Asn Arg 340 345 350 aag aat aat tta aaa ata gct tat gct gcc tat gtt ggt aat tta gat 1104 Lys Asn Asn Leu Lys Ile Ala Tyr Ala Ala Tyr Val Gly Asn Leu Asp 355 360 365 aaa gaa aat ttt tca tct gat gat ttg aat tta ttt ata gac agt att 1152 Lys Glu Asn Phe Ser Ser Asp Asp Leu Asn Leu Phe Ile Asp Ser Ile 370 375 380 aat aac aaa gac ggt aaa ggt gct att aaa aaa gtt ata aat ggc cat 1200 Asn Asn Lys Asp Gly Lys Gly Ala Ile Lys Lys Val Ile Asn Gly His 385 390 395 400 aag aag aaa att aca caa agt gat tta ttt act att ttt cat gat cta 1248 Lys Lys Lys Ile Thr Gln Ser Asp Leu Phe Thr Ile Phe His Asp Leu 405 410 415 ctt gga aat cct gaa cta act gat act tta agt aat tta tta tcg tct 1296 Leu Gly Asn Pro Glu Leu Thr Asp Thr Leu Ser Asn Leu Leu Ser Ser 420 425 430 gtt cct atg tct tta aaa gat ttt gaa aat gaa acg aaa gaa tta atg 1344 Val Pro Met Ser Leu Lys Asp Phe Glu Asn Glu Thr Lys Glu Leu Met 435 440 445 aac aat gat agt tat tct gta gtt caa aaa gat att aaa gca tta aaa 1392 Asn Asn Asp Ser Tyr Ser Val Val Gln Lys Asp Ile Lys Ala Leu Lys 450 455 460 aag ggt aaa aag aaa gat gat ctt att gta aaa gat gat att caa caa 1440 Lys Gly Lys Lys Lys Asp Asp Leu Ile Val Lys Asp Asp Ile Gln Gln 465 470 475 480 att tta aat aat aac cca cta aaa gac ttg ttc aat cat gaa act atc 1488 Ile Leu Asn Asn Asn Pro Leu Lys Asp Leu Phe Asn His Glu Thr Ile 485 490 495 aaa aaa gaa att att aaa att aat aaa tca att caa ttg tgc aat tat 1536 Lys Lys Glu Ile Ile Lys Ile Asn Lys Ser Ile Gln Leu Cys Asn Tyr 500 505 510 tta cca aaa ctt aga act tca gat aat gcc agc att cca cat caa att 1584 Leu Pro Lys Leu Arg Thr Ser Asp Asn Ala Ser Ile Pro His Gln Ile 515 520 525 aat caa aat gaa atg aat caa att att gaa aag caa aag caa tat tat 1632 Asn Gln Asn Glu Met Asn Gln Ile Ile Glu Lys Gln Lys Gln Tyr Tyr 530 535 540 cct tgg ttg tcg gaa cca aat cct aat tca aat cgc aaa aat att gcc 1680 Pro Trp Leu Ser Glu Pro Asn Pro Asn Ser Asn Arg Lys Asn Ile Ala 545 550 555 560 aag tat aaa cta gat gaa tta att gct ttt aga att cca tat tat gtt 1728 Lys Tyr Lys Leu Asp Glu Leu Ile Ala Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val 565 570 575 gga cca atg att acg tct gat gat caa caa aat agt tct aat gct aat 1776 Gly Pro Met Ile Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asn Ser Ser Asn Ala Asn 580 585 590 ttt gca tgg atg aag aga aaa gct agt ggc gtg att aca cca tgg aat 1824 Phe Ala Trp Met Lys Arg Lys Ala Ser Gly Val Ile Thr Pro Trp Asn 595 600 605 ttt gaa gat aag gtt gat gta aaa tct act gct acc gaa ttt att aag 1872 Phe Glu Asp Lys Val Asp Val Lys Ser Thr Ala Thr Glu Phe Ile Lys 610 615 620 cga atg act gtt aaa gat act tat tta att aat gaa gat gta tta cca 1920 Arg Met Thr Val Lys Asp Thr Tyr Leu Ile Asn Glu Asp Val Leu Pro 625 630 635 640 gat aat agt ttg tta tat caa gaa ttt aag gta tta aac gaa cta aat 1968 Asp Asn Ser Leu Leu Tyr Gln Glu Phe Lys Val Leu Asn Glu Leu Asn 645 650 655 atc gta aaa gcg aat gga aaa cac tta aca gtc gaa caa aaa caa tcc 2016 Ile Val Lys Ala Asn Gly Lys His Leu Thr Val Glu Gln Lys Gln Ser 660 665 670 gtt ttt aat gat tta ttt aaa aag caa aaa acg gtg act gct aag aaa 2064 Val Phe Asn Asp Leu Phe Lys Lys Gln Lys Thr Val Thr Ala Lys Lys 675 680 685 tta agt aat tat tta gct aat gac tat gta aca cca ccc gaa ata act 2112 Leu Ser Asn Tyr Leu Ala Asn Asp Tyr Val Thr Pro Pro Glu Ile Thr 690 695 700 gga ctt tca gat aaa gaa aag ttt aat aat aat tat ggt tca tat att 2160 Gly Leu Ser Asp Lys Glu Lys Phe Asn Asn Asn Tyr Gly Ser Tyr Ile 705 710 715 720 gat atg aag aaa ata ttt ggt gat aag att gat gat ttg agc ttg cgt 2208 Asp Met Lys Lys Ile Phe Gly Asp Lys Ile Asp Asp Leu Ser Leu Arg 725 730 735 gat gat ttt gaa aag atg att gaa tgg tca act ata ttt gaa gat cga 2256 Asp Asp Phe Glu Lys Met Ile Glu Trp Ser Thr Ile Phe Glu Asp Arg 740 745 750 gat att tta aga tta caa ctt aaa gat gtt aag tgg tta aat aaa aat 2304 Asp Ile Leu Arg Leu Gln Leu Lys Asp Val Lys Trp Leu Asn Lys Asn 755 760 765 cag att aac caa tta att agt aag cgt tat agt ggt tgg ggt cga tta 2352 Gln Ile Asn Gln Leu Ile Ser Lys Arg Tyr Ser Gly Trp Gly Arg Leu 770 775 780 tca aaa aga tta ttg atg ggg tta tta aat gac aat ggt gaa aga att 2400 Ser Lys Arg Leu Leu Met Gly Leu Leu Asn Asp Asn Gly Glu Arg Ile 785 790 795 800 att gac gtt cta tgg aat act cca gct aat ttt atg caa gca gta aat 2448 Ile Asp Val Leu Trp Asn Thr Pro Ala Asn Phe Met Gln Ala Val Asn 805 810 815 aat cca gat att aaa aca caa att gca aaa att aat tcg aaa cag gta 2496 Asn Pro Asp Ile Lys Thr Gln Ile Ala Lys Ile Asn Ser Lys Gln Val 820 825 830 aat aac tta ggt atg gaa gca att tta gat aat gcc tac acc tca cca 2544 Asn Asn Leu Gly Met Glu Ala Ile Leu Asp Asn Ala Tyr Thr Ser Pro 835 840 845 caa aat aaa aaa gca att aga caa gca atc aaa gta gtt aat gat att 2592 Gln Asn Lys Lys Ala Ile Arg Gln Ala Ile Lys Val Val Asn Asp Ile 850 855 860 caa aga gct atg aag ggt caa gca cca gca tcc ata tca att gaa ttc 2640 Gln Arg Ala Met Lys Gly Gln Ala Pro Ala Ser Ile Ser Ile Glu Phe 865 870 875 880 act cga aaa cct gaa aac aat tcc gat att act aaa agt cgt ggt aaa 2688 Thr Arg Lys Pro Glu Asn Asn Ser Asp Ile Thr Lys Ser Arg Gly Lys 885 890 895 cag ata gat aaa ata tat aag gaa tta tct aat aac ata tct aaa gat 2736 Gln Ile Asp Lys Ile Tyr Lys Glu Leu Ser Asn Asn Ile Ser Lys Asp 900 905 910 tta aaa gat gaa tta aaa act aac aag aag aat cta tct gat aaa tta 2784 Leu Lys Asp Glu Leu Lys Thr Asn Lys Lys Asn Leu Ser Asp Lys Leu 915 920 925 tat cta tat ttc atg caa aaa gga cga gat att tat acc ggt gaa tct 2832 Tyr Leu Tyr Phe Met Gln Lys Gly Arg Asp Ile Tyr Thr Gly Glu Ser 930 935 940 ata gat att gat aat ttg att aat tat gat att gac cat att att cca 2880 Ile Asp Ile Asp Asn Leu Ile Asn Tyr Asp Ile Asp His Ile Ile Pro 945 950 955 960 aga agt tat atg aag gat gat tca ttt aat aat cgt gtt ctt act aac 2928 Arg Ser Tyr Met Lys Asp Asp Ser Phe Asn Asn Arg Val Leu Thr Asn 965 970 975 cat caa act aat gat gat aag ggt gat aaa aca cca tta gat gga cta 2976 His Gln Thr Asn Asp Asp Lys Gly Asp Lys Thr Pro Leu Asp Gly Leu 980 985 990 tca tcg att aat att aat aat caa att cca gaa tgg aaa aaa tta tta 3024 Ser Ser Ile Asn Ile Asn Asn Gln Ile Pro Glu Trp Lys Lys Leu Leu 995 1000 1005 aaa cag gga ctt att agt gtt cgt aaa ttc cgt aat tta act act 3069 Lys Gln Gly Leu Ile Ser Val Arg Lys Phe Arg Asn Leu Thr Thr 1010 1015 1020 aag ata gat gca att agt aag tat act aaa aat gga ttt gta cat 3114 Lys Ile Asp Ala Ile Ser Lys Tyr Thr Lys Asn Gly Phe Val His 1025 1030 1035 cgt caa tta gtt gaa acc agt cag gtt att aaa tta gtt gct aat 3159 Arg Gln Leu Val Glu Thr Ser Gln Val Ile Lys Leu Val Ala Asn 1040 1045 1050 att cta aat aat aaa tac caa aat agt gat acc aat att att gaa 3204 Ile Leu Asn Asn Lys Tyr Gln Asn Ser Asp Thr Asn Ile Ile Glu 1055 1060 1065 gtt aaa gct tat atg aat act caa tta aga gaa aca ttt gac tta 3249 Val Lys Ala Tyr Met Asn Thr Gln Leu Arg Glu Thr Phe Asp Leu 1070 1075 1080 ttt aag tcc aga gaa ttg aat gat tat cat cat gct tta gat gca 3294 Phe Lys Ser Arg Glu Leu Asn Asp Tyr His His Ala Leu Asp Ala 1085 1090 1095 tat tta aca act ttt gca gga act tat tta tat gat cgt tat cct 3339 Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Asp Arg Tyr Pro 1100 1105 1110 aaa tta aga cat tat ttt gta tat ggt aat ttt aaa aag ttc gat 3384 Lys Leu Arg His Tyr Phe Val Tyr Gly Asn Phe Lys Lys Phe Asp 1115 1120 1125 gat tca aaa act att aat cat tta aaa act ttt aat ttt cta cgt 3429 Asp Ser Lys Thr Ile Asn His Leu Lys Thr Phe Asn Phe Leu Arg 1130 1135 1140 gat att acc agt cca agt aaa gaa cat gaa gat aaa ata ttt gat 3474 Asp Ile Thr Ser Pro Ser Lys Glu His Glu Asp Lys Ile Phe Asp 1145 1150 1155 aaa gct agt ggt gaa tta att tta aat cgt aaa aaa gcc att aat 3519 Lys Ala Ser Gly Glu Leu Ile Leu Asn Arg Lys Lys Ala Ile Asn 1160 1165 1170 cga att aag caa att tat aat tat aaa tat atg tta gtt act cat 3564 Arg Ile Lys Gln Ile Tyr Asn Tyr Lys Tyr Met Leu Val Thr His 1175 1180 1185 gaa gtt tct act aga aaa aac gct tta tat aat caa agt att tat 3609 Glu Val Ser Thr Arg Lys Asn Ala Leu Tyr Asn Gln Ser Ile Tyr 1190 1195 1200 cct gct aaa aat gtt aag aag agt ttt att aac att aaa aat gat 3654 Pro Ala Lys Asn Val Lys Lys Ser Phe Ile Asn Ile Lys Asn Asp 1205 1210 1215 aaa cca gtt gaa tta tac ggt gga cat act ggt aac aat aat gct 3699 Lys Pro Val Glu Leu Tyr Gly Gly His Thr Gly Asn Asn Asn Ala 1220 1225 1230 tat atg gct tta gtc aaa atc att ggt aag aat gga aat gaa tat 3744 Tyr Met Ala Leu Val Lys Ile Ile Gly Lys Asn Gly Asn Glu Tyr 1235 1240 1245 aaa tta gtt ggc gtg cca att aga ttc ttg tct gac tta aat agg 3789 Lys Leu Val Gly Val Pro Ile Arg Phe Leu Ser Asp Leu Asn Arg 1250 1255 1260 gct aaa aag gat aac ttg tct gct tat caa aat aag tta cat gaa 3834 Ala Lys Lys Asp Asn Leu Ser Ala Tyr Gln Asn Lys Leu His Glu 1265 1270 1275 atg att agt gca caa ctg cct aat aaa aag ttt aca gtt ctt tta 3879 Met Ile Ser Ala Gln Leu Pro Asn Lys Lys Phe Thr Val Leu Leu 1280 1285 1290 gat aaa gtt atg tat cgc caa tta gtt gtt gat ggg gat gaa aaa 3924 Asp Lys Val Met Tyr Arg Gln Leu Val Val Asp Gly Asp Glu Lys 1295 1300 1305 tat aca gtt ggc agt gct act tat aaa tat aat gct aag caa ctg 3969 Tyr Thr Val Gly Ser Ala Thr Tyr Lys Tyr Asn Ala Lys Gln Leu 1310 1315 1320 gtt att tct cca aaa tca gtt aga att ttg aaa gat aaa gaa tta 4014 Val Ile Ser Pro Lys Ser Val Arg Ile Leu Lys Asp Lys Glu Leu 1325 1330 1335 aga aat agt cta tca tcc aaa caa tta agt gag aaa tta aat ttt 4059 Arg Asn Ser Leu Ser Ser Lys Gln Leu Ser Glu Lys Leu Asn Phe 1340 1345 1350 gta tat aat gat ata ttg aaa caa gtt aat aga tat tta cca ctg 4104 Val Tyr Asn Asp Ile Leu Lys Gln Val Asn Arg Tyr Leu Pro Leu 1355 1360 1365 tat gat att aat tca ttt agg aat aaa tta aat gct ggt ttt gat 4149 Tyr Asp Ile Asn Ser Phe Arg Asn Lys Leu Asn Ala Gly Phe Asp 1370 1375 1380 aag ttt aaa aat att agt gat aat ttt gaa aaa acg caa att tta 4194 Lys Phe Lys Asn Ile Ser Asp Asn Phe Glu Lys Thr Gln Ile Leu 1385 1390 1395 aat aat att ttg gaa gga ctt cac gat aat cca aga caa att gca 4239 Asn Asn Ile Leu Glu Gly Leu His Asp Asn Pro Arg Gln Ile Ala 1400 1405 1410 att aag aaa ata gga ttt aca acg cct ttt gga atg atg caa tta 4284 Ile Lys Lys Ile Gly Phe Thr Thr Pro Phe Gly Met Met Gln Leu 1415 1420 1425 aat aat gga att aaa cta tct aaa aat tca tat att att tat caa 4329 Asn Asn Gly Ile Lys Leu Ser Lys Asn Ser Tyr Ile Ile Tyr Gln 1430 1435 1440 tct cca acc gga tta ttt gaa cga aaa gtt aga att aaa gac tta 4374 Ser Pro Thr Gly Leu Phe Glu Arg Lys Val Arg Ile Lys Asp Leu 1445 1450 1455 taa 4377 ＜210＞ 8 ＜211＞ 1458 ＜212＞ PRT ＜213＞ Lactobacillus kosoi ＜400＞ 8 Met Lys Lys Tyr His Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Ser Ser Val Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ala Lys His Asp Asp Gly Ser Leu Val His Val Lys Gly Lys 20 25 30 Asn Val Ile Gly Ala Arg Leu Phe Asn Glu Gly Gln Thr Ala Glu Glu 35 40 45 Arg Arg Thr Tyr Arg Ala Ala Arg Arg Arg Tyr Ser Arg Arg Arg Trp 50 55 60 Arg Leu Asn Leu Leu Asn Gln Ile Phe Lys Asp Ser Leu Asp Ala Val 65 70 75 80 Asp Ala Thr Phe Leu Lys Arg Leu Lys Glu Ser Ser Leu Ser Asn Gln 85 90 95 Asp Gln Asn Lys Lys Tyr Phe Gly Glu Leu Leu Phe Pro Lys Asp Asn 100 105 110 Asp Lys His Phe His Thr Asn Asn Ile Gln Glu Asn Lys Arg Gly Asn 115 120 125 Asp Thr Ile Phe His Leu Arg Asp Arg Leu Met Lys Ser Asn Glu Lys 130 135 140 Ala Asp Ile Arg Glu Ile Tyr Leu Ala Phe His Ser Met Val Lys Asn 145 150 155 160 Arg Gly Asn Phe Leu Asp Asn Thr Pro Ala Ser Ser Phe Glu Ala Ser 165 170 175 Asp Met His Leu Val Asp Val Leu His Asn Ile Asn Asn Leu Tyr Glu 180 185 190 Gln Met Asn Ile Thr Phe Gly Leu Asn Asp Val Asn Ala Glu Lys Ile 195 200 205 Glu Asp Ile Leu Leu Asp Asn Lys Val Arg Asn Ile Asp Lys Lys Lys 210 215 220 Thr Leu Ile Asn Leu Leu Gln Thr Lys Glu Ser Asn Lys Glu Ser Lys 225 230 235 240 Thr Ile Ile Thr Glu Ile Val Lys Leu Ile Leu Gly Tyr Asn Ser Lys 245 250 255 Lys Ile Asn Ala Ile Leu Glu Val Glu Glu Leu Glu Asn Asn Glu Leu 260 265 270 Cys Leu Ser Asn Ala Asn Ser Asp Asp Gln Ile Asn Ala Ile Phe Ala 275 280 285 Glu Thr Asn Glu Val Gln Gln Asn Ile Ile Thr Glu Ile Lys Thr Leu 290 295 300 Tyr Ser Arg Thr Lys Leu Asn Gln Ile Ile Pro Asn Gly Lys Thr Tyr 305 310 315 320 Ser Glu Ser Met Ile Asp Lys Tyr Asn Leu His His Asp Gln Leu Arg 325 330 335 Asn Leu Lys Leu Asn Ile Leu Asp His Leu Asn Phe Asp Lys Asn Arg 340 345 350 Lys Asn Asn Leu Lys Ile Ala Tyr Ala Ala Tyr Val Gly Asn Leu Asp 355 360 365 Lys Glu Asn Phe Ser Ser Asp Asp Leu Asn Leu Phe Ile Asp Ser Ile 370 375 380 Asn Asn Lys Asp Gly Lys Gly Ala Ile Lys Lys Val Ile Asn Gly His 385 390 395 400 Lys Lys Lys Ile Thr Gln Ser Asp Leu Phe Thr Ile Phe His Asp Leu 405 410 415 Leu Gly Asn Pro Glu Leu Thr Asp Thr Leu Ser Asn Leu Leu Ser Ser 420 425 430 Val Pro Met Ser Leu Lys Asp Phe Glu Asn Glu Thr Lys Glu Leu Met 435 440 445 Asn Asn Asp Ser Tyr Ser Val Val Gln Lys Asp Ile Lys Ala Leu Lys 450 455 460 Lys Gly Lys Lys Lys Asp Asp Leu Ile Val Lys Asp Asp Ile Gln Gln 465 470 475 480 Ile Leu Asn Asn Asn Pro Leu Lys Asp Leu Phe Asn His Glu Thr Ile 485 490 495 Lys Lys Glu Ile Ile Lys Ile Asn Lys Ser Ile Gln Leu Cys Asn Tyr 500 505 510 Leu Pro Lys Leu Arg Thr Ser Asp Asn Ala Ser Ile Pro His Gln Ile 515 520 525 Asn Gln Asn Glu Met Asn Gln Ile Ile Glu Lys Gln Lys Gln Tyr Tyr 530 535 540 Pro Trp Leu Ser Glu Pro Asn Pro Asn Ser Asn Arg Lys Asn Ile Ala 545 550 555 560 Lys Tyr Lys Leu Asp Glu Leu Ile Ala Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val 565 570 575 Gly Pro Met Ile Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asn Ser Ser Asn Ala Asn 580 585 590 Phe Ala Trp Met Lys Arg Lys Ala Ser Gly Val Ile Thr Pro Trp Asn 595 600 605 Phe Glu Asp Lys Val Asp Val Lys Ser Thr Ala Thr Glu Phe Ile Lys 610 615 620 Arg Met Thr Val Lys Asp Thr Tyr Leu Ile Asn Glu Asp Val Leu Pro 625 630 635 640 Asp Asn Ser Leu Leu Tyr Gln Glu Phe Lys Val Leu Asn Glu Leu Asn 645 650 655 Ile Val Lys Ala Asn Gly Lys His Leu Thr Val Glu Gln Lys Gln Ser 660 665 670 Val Phe Asn Asp Leu Phe Lys Lys Gln Lys Thr Val Thr Ala Lys Lys 675 680 685 Leu Ser Asn Tyr Leu Ala Asn Asp Tyr Val Thr Pro Pro Glu Ile Thr 690 695 700 Gly Leu Ser Asp Lys Glu Lys Phe Asn Asn Asn Tyr Gly Ser Tyr Ile 705 710 715 720 Asp Met Lys Lys Ile Phe Gly Asp Lys Ile Asp Asp Leu Ser Leu Arg 725 730 735 Asp Asp Phe Glu Lys Met Ile Glu Trp Ser Thr Ile Phe Glu Asp Arg 740 745 750 Asp Ile Leu Arg Leu Gln Leu Lys Asp Val Lys Trp Leu Asn Lys Asn 755 760 765 Gln Ile Asn Gln Leu Ile Ser Lys Arg Tyr Ser Gly Trp Gly Arg Leu 770 775 780 Ser Lys Arg Leu Leu Met Gly Leu Leu Asn Asp Asn Gly Glu Arg Ile 785 790 795 800 Ile Asp Val Leu Trp Asn Thr Pro Ala Asn Phe Met Gln Ala Val Asn 805 810 815 Asn Pro Asp Ile Lys Thr Gln Ile Ala Lys Ile Asn Ser Lys Gln Val 820 825 830 Asn Asn Leu Gly Met Glu Ala Ile Leu Asp Asn Ala Tyr Thr Ser Pro 835 840 845 Gln Asn Lys Lys Ala Ile Arg Gln Ala Ile Lys Val Val Asn Asp Ile 850 855 860 Gln Arg Ala Met Lys Gly Gln Ala Pro Ala Ser Ile Ser Ile Glu Phe 865 870 875 880 Thr Arg Lys Pro Glu Asn Asn Ser Asp Ile Thr Lys Ser Arg Gly Lys 885 890 895 Gln Ile Asp Lys Ile Tyr Lys Glu Leu Ser Asn Asn Ile Ser Lys Asp 900 905 910 Leu Lys Asp Glu Leu Lys Thr Asn Lys Lys Asn Leu Ser Asp Lys Leu 915 920 925 Tyr Leu Tyr Phe Met Gln Lys Gly Arg Asp Ile Tyr Thr Gly Glu Ser 930 935 940 Ile Asp Ile Asp Asn Leu Ile Asn Tyr Asp Ile Asp His Ile Ile Pro 945 950 955 960 Arg Ser Tyr Met Lys Asp Asp Ser Phe Asn Asn Arg Val Leu Thr Asn 965 970 975 His Gln Thr Asn Asp Asp Lys Gly Asp Lys Thr Pro Leu Asp Gly Leu 980 985 990 Ser Ser Ile Asn Ile Asn Asn Gln Ile Pro Glu Trp Lys Lys Leu Leu 995 1000 1005 Lys Gln Gly Leu Ile Ser Val Arg Lys Phe Arg Asn Leu Thr Thr 1010 1015 1020 Lys Ile Asp Ala Ile Ser Lys Tyr Thr Lys Asn Gly Phe Val His 1025 1030 1035 Arg Gln Leu Val Glu Thr Ser Gln Val Ile Lys Leu Val Ala Asn 1040 1045 1050 Ile Leu Asn Asn Lys Tyr Gln Asn Ser Asp Thr Asn Ile Ile Glu 1055 1060 1065 Val Lys Ala Tyr Met Asn Thr Gln Leu Arg Glu Thr Phe Asp Leu 1070 1075 1080 Phe Lys Ser Arg Glu Leu Asn Asp Tyr His His Ala Leu Asp Ala 1085 1090 1095 Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Asp Arg Tyr Pro 1100 1105 1110 Lys Leu Arg His Tyr Phe Val Tyr Gly Asn Phe Lys Lys Phe Asp 1115 1120 1125 Asp Ser Lys Thr Ile Asn His Leu Lys Thr Phe Asn Phe Leu Arg 1130 1135 1140 Asp Ile Thr Ser Pro Ser Lys Glu His Glu Asp Lys Ile Phe Asp 1145 1150 1155 Lys Ala Ser Gly Glu Leu Ile Leu Asn Arg Lys Lys Ala Ile Asn 1160 1165 1170 Arg Ile Lys Gln Ile Tyr Asn Tyr Lys Tyr Met Leu Val Thr His 1175 1180 1185 Glu Val Ser Thr Arg Lys Asn Ala Leu Tyr Asn Gln Ser Ile Tyr 1190 1195 1200 Pro Ala Lys Asn Val Lys Lys Ser Phe Ile Asn Ile Lys Asn Asp 1205 1210 1215 Lys Pro Val Glu Leu Tyr Gly Gly His Thr Gly Asn Asn Asn Ala 1220 1225 1230 Tyr Met Ala Leu Val Lys Ile Ile Gly Lys Asn Gly Asn Glu Tyr 1235 1240 1245 Lys Leu Val Gly Val Pro Ile Arg Phe Leu Ser Asp Leu Asn Arg 1250 1255 1260 Ala Lys Lys Asp Asn Leu Ser Ala Tyr Gln Asn Lys Leu His Glu 1265 1270 1275 Met Ile Ser Ala Gln Leu Pro Asn Lys Lys Phe Thr Val Leu Leu 1280 1285 1290 Asp Lys Val Met Tyr Arg Gln Leu Val Val Asp Gly Asp Glu Lys 1295 1300 1305 Tyr Thr Val Gly Ser Ala Thr Tyr Lys Tyr Asn Ala Lys Gln Leu 1310 1315 1320 Val Ile Ser Pro Lys Ser Val Arg Ile Leu Lys Asp Lys Glu Leu 1325 1330 1335 Arg Asn Ser Leu Ser Ser Lys Gln Leu Ser Glu Lys Leu Asn Phe 1340 1345 1350 Val Tyr Asn Asp Ile Leu Lys Gln Val Asn Arg Tyr Leu Pro Leu 1355 1360 1365 Tyr Asp Ile Asn Ser Phe Arg Asn Lys Leu Asn Ala Gly Phe Asp 1370 1375 1380 Lys Phe Lys Asn Ile Ser Asp Asn Phe Glu Lys Thr Gln Ile Leu 1385 1390 1395 Asn Asn Ile Leu Glu Gly Leu His Asp Asn Pro Arg Gln Ile Ala 1400 1405 1410 Ile Lys Lys Ile Gly Phe Thr Thr Pro Phe Gly Met Met Gln Leu 1415 1420 1425 Asn Asn Gly Ile Lys Leu Ser Lys Asn Ser Tyr Ile Ile Tyr Gln 1430 1435 1440 Ser Pro Thr Gly Leu Phe Glu Arg Lys Val Arg Ile Lys Asp Leu 1445 1450 1455

圖1是顯示使用包含種種的濃度的添加物的MRS培養基(MRS broth)培養的10H株的增殖特性。圖2是表示依照16S rRNA的基因組鹼基序列(genome base sequence)的系統發生樹(phylogenetic tree)。圖3是顯示測定了包含10H株的16種類的乳酸菌及雙叉乳酸桿菌樣品(sample)的IgA產生誘導活性(production-inducing activity)的結果。圖4A是顯示就進行了70℃、30分鐘處理的乳酸菌及雙叉乳酸桿菌樣品進行測定之IgA產生誘導活性。圖4B是顯示就進行了100℃、30分鐘處理的乳酸菌及雙叉乳酸桿菌樣品進行測定之IgA產生誘導活性。

：

Claims

一種乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H之被單離的菌株，係以寄存編號NITE BP-02811寄存。
一種組成物，包含申請專利範圍第1項之被單離的菌株或其培養物。
一種IgA產生促進劑，包含以申請專利範圍第1項之被單離的菌株或申請專利範圍第2項之組成物作為有效成分。
一種免疫賦活劑，包含以申請專利範圍第1項之被單離的菌株或申請專利範圍第2項之組成物作為有效成分。
如申請專利範圍第2項之組成物，其係飲食品、醫藥品、外用劑或飼料的形態。
如申請專利範圍第2項或第5項之組成物，其係用以使所給藥的對象者的黏膜免疫賦活。
一種免疫賦活劑的製造方法，包含將申請專利範圍第1項之被單離的菌株接種並培養於高糖濃度且包含D-果糖的培養基之步驟。