TW202014200A - 包含合成嵌合牛痘病毒之幹細胞及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明在各種態樣中係關於包含合成嵌合痘病毒(scPV)之幹細胞，其可用於治療癌症或其他傳染病。本發明亦關於用於遞送該scPV之方法，其包含用該scPV感染該等幹細胞且向個體投與該等經感染幹細胞。

Description

包含合成嵌合牛痘病毒之幹細胞及其使用方法

與本申請案相關之序列表以文本格式經由EFS網站以電子方式提交，且以全文引用之方式併入本說明書中。含有序列表之文本檔案之名稱為104545-0032-WO1-SL.txt。2019年4月22日創建之文本檔案大小為882,679位元組。

痘病毒(痘病毒科(Poxviridae )家族之成員)為可感染人類及動物兩者之雙股DNA病毒。基於宿主範圍將痘病毒分成兩個亞科。感染脊椎動物主體之脊索痘病毒科(Chordopoxviridae )亞科由八個屬組成，已知其中四個屬(正痘病毒(Orthopoxvirus) 、副痘病毒(Parapoxvirus) 、 軟疣痘病毒(Molluscipoxvirus) 及亞塔痘病毒(Yatapoxvirus ))感染人類。天花係由天花病毒(VARV) (感染正痘病毒(OPV)屬中之一員)引起。OPV屬包含多個基因相關且形態相同病毒，包括駱駝痘病毒(camelpox virus，CMLV)、牛痘病毒(cowpox virus，CPXV)、鼠痘病毒(ectromelia virus，ECTV，「鼠痘劑(mousepox agent)」)、馬痘病毒(horsepox virus，HPXV)、猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)、兔痘病毒(rabbitpox virus，RPXV)、浣熊痘病毒(raccoonpox virus)、臭鼬痘病毒(skunkpox virus)、沙鼠痘病毒(Taterapox virus)、瓦森伊修病病毒(Uasin Gishu disease virus)、牛痘病毒(vaccinia virus，VACV)，天花病毒(variola virus，VARV)以及田鼠痘病毒(volepox virus，VPV)。除VARV以外，已知至少三個其他OPV (包括VACV、MPXV及CPXV)感染人類。

在持續探索用於能夠消除或減少腫瘤細胞的療法方面，溶瘤病毒已在臨床前研究中展示極大潛能。此等病毒通常經基因工程改造或具有對腫瘤細胞之天然趨向性，以便僅複製及殺滅贅生性細胞。在治療性病毒中，溶瘤牛痘病毒為用於癌症療法之最有前景候選物中之一者。作為一實例，JX-594為具有TK基因缺失及GM-CSF (能夠刺激免疫系統殺滅腫瘤細胞之細胞介素)基因插入之牛痘病毒且目前正進行III期試驗(Park SH等人, Phase 1b trial of biweekly intravenous Pexa-Vec (JX-594), an oncolytic and immunotherapeutic vaccinia virus in colorectal cancer. Mol Ther (2015); 23(9):1532-40)。

為改良病毒療法之遞送且避開抗病毒免疫性，多個研究已探索使用感染細胞作為溶瘤病毒之遞送媒介的可能性(Garcia-Castro, J.,等人, Treatment of metastatic neuroblastoma with systemic oncolytic virotherapy delivered by autologous mesenchymal stem cells: an exploratory study. Cancer Gene Ther, 2010. 17(7): 476-83; Coukos, G.,等人, Use of carrier cells to deliver a replication-selective herpes simplex virus-1 mutant for the intraperitoneal therapy of epithelial ovarian cancer. Clin Cancer Res, 1999. 5(6): 1523-37; Komarova, S.,等人, Mesenchymal progenitor cells as cellular vehicles for delivery of oncolytic adenoviruses. Mol Cancer Ther, 2006. 5(3): 755-66)。間質幹細胞已在此方面展示極大前景。

儘管有前景，但此等研究已受其不能探究負載有溶瘤病毒之間質幹細胞之治療功效限制。另外，諸如投與幹細胞之細胞療法已與在接受幹細胞療法的個體之惡性癌症之形成相關聯。儘管細胞療法在治療疾病、病症及損傷中之潛能為明顯的，但由於此類治療而形成腫瘤(諸如畸胎瘤)係不可接受的結果。

因此，需要降低接受細胞療法之個體中之腫瘤形成之風險的遞送溶瘤病毒且安全地投與細胞組合物的方法。

在一個態樣中，本發明提供包含合成嵌合痘病毒(scPV)之幹細胞，其可用於治療癌症或其他傳染病。由於化學基因組合成並不視天然模板而定，因此病毒基因組之結構性及功能性修飾之多血症係可能的。當天然模板不可用於習知分子生物學方法之基因複製或修飾時，化學基因組合成係尤其適用的。

因此，在一個態樣中，本發明係關於一種經分離幹細胞或其群體，其包含合成嵌合痘病毒(scPV)，其中病毒由源自合成DNA之DNA複製且再活化，該病毒之病毒基因組與該病毒之野生型基因組不同之特徵在於一或多個修飾。

在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含本發明之經分離幹細胞及醫藥學上可接受之載劑。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於向個體遞送本發明之scPV之方法，其包含感染本發明之幹細胞且將經scPV感染之幹細胞投與至該個體中。

在另一態樣中，本發明係關於一種治療或預防個體之癌症之方法，其包含向該個體投與本發明之幹細胞或本發明之醫藥組合物，由此使個體之癌細胞與scPV接觸。

在另一態樣中，本發明係關於一種治療天花病毒感染之方法，其包含向對其有需要之個體投與本發明之幹細胞或本發明之醫藥組合物。

通用技術

除非本文中另外定義，否則本申請案中所用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所理解之含義。一般而言，與本文所描述之藥理學、細胞及組織培養、分子生物學、細胞及癌症生物學、神經生物學、神經化學、病毒學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學結合使用地命名法及其技術為此項技術中熟知且常用者。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。

除非另外指明，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其在此項技術之技能內。此類技術完整解釋於以下文獻中，諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(Sambrook等人, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編, 1993-1998) J. Wiley及Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編, 1987); PCR:  The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998)；Coligan等人, Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons, 1999)。

酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所實施或如本文所描述執行。本文所描述之與分析化學、生物化學、免疫學、分子生物學、合成有機化學及醫學及醫藥化學結合使用之命名法及其實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用者。使用標準技術進行化學合成及化學分析。

在整個本說明書及實施例中，字組「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變體應理解為意謂著包括所陳述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。

應理解，在本文中任何地方之實施例皆用語言「包含」描述，或亦提供用術語「由組成」及/或「基本上由組成」所描述之類似實施例。

術語「包括」用於意謂「包括(但不限於)」。「包括」及「包括(但不限於)」可互換使用。

在術語「例如(e.g.)」或「例如(for example)」之後的任何實例並不意謂窮盡性或限制性。

除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

本文中所用之冠詞「一(a/an)」及「該(the)」係指代一個或超過一個(亦即，至少一個)冠詞之文法目標。藉助於實例，「元素」意謂一種元素或超過一種元素。本文中，提及「約」一個值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍包括限定範圍之數字。

儘管闡述本申請案之廣泛範疇的數值範圍及參數為近似值，但儘可能精確地報導特定實例中所闡述之數值。然而，任何數值均固有地含有因其對應測試量測值中發現之標準差所必然引起的某些誤差。此外，本文中所揭示之所有範圍應理解為涵蓋其中所包含之任何及所有子範圍。舉例而言，1至10之陳述範圍應視為包括最小值1與最大值10之間(且包括其)之任何及所有子範圍；亦即，以最小值1或更大(例如1至6.1)開始且以最大值10或更小(例如5.5至10)結束之所有子範圍。

雖然本文中描述例示性方法及材料，但與本文所述之方法及材料類似或等效的方法及材料亦可用於實施或測試本發明。該等材料、方法及實例僅具說明性且不意欲具有限制性。 定義 除非另外指示，否則以下術語應理解為具有以下含義：

如本文所用，術語「野生型病毒」、「野生型基因組」、「野生型蛋白質」或「野生型核酸」係指天然存在於某一群體(例如，特定病毒物種等)內的胺基或核酸序列。

術語「嵌合」或「經工程改造」或「經修飾」(例如，嵌合痘病毒、經工程改造多肽、經修飾多肽、經工程改造核酸、經修飾核酸)或其語法變體在本文中可互換地使用以係指相對天然序列而經操控以具有一或多個變化的非天然序列。

如本文所用，「合成病毒」係指最初源自合成DNA (例如，化學合成DNA、PCR擴增DNA、經工程改造DNA、包含核苷類似物之聚核苷酸等或其組合)之病毒且包括其子代，且由於天然、意外或故意的突變，子代可未必與初始母代合成病毒完全一致(在形態或基因組DNA補體方面)。在一些實施例中，合成病毒係指大體上所有病毒基因組最初源自合成DNA (例如，化學合成DNA、PCR擴增DNA、經工程改造DNA、包含核苷類似物之聚核苷酸等或其組合)之病毒。在一較佳實施例中，合成病毒源自化學合成DNA。

如在本文中其他地方所概述，病毒基因組之某些位置可更改。本文所使用之「位置」意謂基因組序列中之位置。對應位置通常經由與其他親本序列比對來測定。

如本文所用，在多肽的情況下，術語「殘基」係指直鏈多肽鏈中之胺基酸單元。其為在由α-胺基酸(亦即，NH2-CHR-COOH)形成多肽時移除水後，各胺基酸(亦即，-NH-CHR-C-)之殘餘物。

如此項技術中已知，如在本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，可在組裝鏈之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合後，諸如藉由結合標記組分而進一步經修飾。其他類型之修飾包括例如「封端」，用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵者(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵者(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；含有諸如蛋白質之側接部分者(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)；具有嵌入劑者(例如，吖啶、補骨脂素等)；含有螯合劑者(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)；含有烷基化劑者；具有經修飾鍵者(例如，α變旋異構核酸等)；以及聚核苷酸之未經修飾形式。另外，一般存在於糖中之羥基中之任一者可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，由標準保護基保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵，或可結合至固體支撐物。5'及3'末端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基團取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知的類似形式之核糖或去氧核糖，包括(例如) 2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖(lyxoses))；哌喃醣、呋喃醣、景天庚酮糖(sedoheptuloses)、非環類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括(但不限於)其中磷酸經P(O)S (「硫代酸酯」)、P(S)S (「二硫代酸酯」)、(O)NR₂ (「醯胺」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂ (「甲縮醛」)置換的實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵的經取代或未經取代之烷基(1-20 C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳醛基。聚核苷酸中並非所有鍵需要一致。前述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。

術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以係指任何長度之胺基酸鏈。鏈可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾胺基酸，及/或可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋已經天然或干預修飾之胺基酸鏈；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或如結合標記組分的任何其他操作或修飾。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括(例如)非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應理解，多肽可作為單一鏈或相關鏈出現。

「同源」在所有其語法形式及拼寫變化下係指具有「共同進化起源」之兩個蛋白質之間的關係，包括來自相同生物物種中之超家族之蛋白質以及來自不同生物物種之同源蛋白質。如由其序列相似性反映，無論關於一致性百分比或藉由特定殘基或基元及保存位置之存在，此類蛋白質(及其編碼核酸)具有序列同源性。「同源」亦可係指對病毒而言為天然的核酸。

然而，在通常的用法及本申請案中，在經諸如「高度」之副詞修飾時，術語「同源」可指序列相似性，且可或可不與共同進化起源相關。

「異源」在所有其語法形式及拼寫變化下可係指對病毒而言為非天然的DNA。其意謂源自DNA經描述為相對於其為異源的與生物體之DNA不同的物種或病毒株。在一非限制性實例中，scPV之病毒基因組包含異源末端髮夾環。該等異源末端髮夾環可源自不同病毒物種或源自不同病毒株。

術語「序列相似性」在所有其語法形式下係指可能共用或可能不共用共同進化起源的核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性程度。

將關於參考多肽(或核苷酸)序列之「序列一致性百分比(%)」或「與…之序列一致%」定義為在比對序列且引入間隙後(視需要)以獲得最大序列一致性百分比且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分後與參考多肽(核苷酸)序列中之胺基酸殘基(或核酸)一致的候選序列中之胺基酸殘基(或核酸)之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以此項技術內之各種方式實現比對，例如使用公開可獲用的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內實現最大比對所需的任何演算法。

如本文所用，「宿主細胞」包括可為或已為用於併入聚核苷酸插入物之載體的接受體的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單個宿主細胞之子代，且子代可能歸因於自然、偶然或故意突變而不一定與原始母細胞完全一致(在形態或基因組DNA補體方面)。宿主細胞包括經本發明之核酸活體內轉染及/或轉化之細胞。

如本文所用，「載體」意謂能夠遞送且較佳地表現宿主細胞中之一或多個所關注基因或序列的構築體。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，以及某些真核細胞，諸如生產細胞。

如本文所用，「經分離分子」(其中分子為(例如)多肽、聚核苷酸或其片段)為以下分子，其藉助於其起源或來源(1)與在其原生狀態中伴隨其之一或多種天然相關組分不相關，(2)實質上不含來自相同物種之一或多種其他分子，(3)由來自不同物種之細胞表現，或(4)在自然界中不存在。因此，經化學合成或表現於與其天然起源之細胞不同的細胞系統中之分子將自一個或多種其天然相關組分「分離」。亦可藉由分離，使用此項技術中熟知之純化使分子實質上不含一個或多種天然相關組分。可藉由此項技術中熟知之多種方法分析分子純度或均勻性。舉例而言，多肽樣品之純度可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠染色以使用此項技術中熟知之技術使多肽顯現來分析。出於某些目的，可藉由使用HPLC或此項技術中用於純化之其他熟知方法提供更高解析度。

如本文所用，在病毒的情況下，術語「分離」係指源自單一親本病毒之病毒。可使用熟習此項技術者已知之常規方法分離病毒，包括(但不限於)基於斑純化及限制稀釋法之方法。

如本文所用，片語「感染倍率」或「MOI」為每種經感染細胞之平均病毒數。MOI係藉由用所添加病毒數(所添加毫升×斑形成單位(PFU))除以所添加細胞數(所添加毫升×細胞/毫升)來測定。

如本文所用，「純化」及其語法變體係指自含有多肽及一或多種雜質之混合物中移除(無論完全或部分)至少一種雜質，進而改良組合物中之多肽之純度水準(亦即，藉由減小組合物中之雜質量(ppm))。如本文所用，在病毒的情況下，「純化」係指實質上不含來自衍生病毒之細胞或組織來源的細胞材料及培養基的病毒。措辭「實質上不含細胞材料」包括病毒製劑，其中病毒自細胞之細胞組分分離，該病毒係自該細胞分離或以重組方式產生。因此，實質上不含細胞材料之病毒包括具有小於約30%、20%、10%或5% (乾重)細胞蛋白質(在本文中亦被稱作「污染蛋白質」)的蛋白質製劑。病毒亦實質上不含培養基，亦即培養基呈現小於約20%、10%或5%之病毒製劑體積。可使用熟習此項技術者已知之常規方法純化病毒，包括(但不限於)層析法及離心。

如本文所使用，「基本上純」係指至少50%純(亦即，無污染物)、更佳至少90%純、更佳至少95%純、又更佳至少98%純、且最佳至少99%純的材料。

術語「患者」、「個體(subject)」及「個體(individual)」在本文中可互換使用且係指人類或非人類動物。此等術語包括哺乳動物，諸如人類、靈長類動物、家畜動物(包括牛科動物、豬科動物、駱駝科動物等)、伴侶動物(例如，犬科動物、貓科動物等)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。

如本文所用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指由於投與療法(例如，預防劑或治療劑)延遲疾病之復發或發作或減輕個體之疾病(例如，痘病毒感染)之一或多種症狀。舉例而言，在針對感染向個體投與療法的情況下，「預防(prevent/preventing/prevention)」係指因投與療法(例如，預防劑或治療劑)或投與療法之組合(例如，預防劑或治療劑之組合)而抑制或減輕個體體內感染(例如，痘病毒感染或與其關聯的病況)之發展或發作，或預防個體體內感染(例如，痘病毒感染或與其關聯的病況)之一或多種症狀之復發、發作或發展。

如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指治療病況或患者且係指採取步驟以獲得有益或所需結果，包括臨床結果。關於感染(例如，痘病毒感染或天花病毒感染)，治療係指因投與一或多種療法(包括(但不限於)投與一或多種預防劑或治療劑)而根除或控制感染物(例如，痘病毒或天花病毒)之複製，減少感染物之數目(例如，減小病毒之效價)，降低或減輕感染(例如，痘病毒/痘瘡感染或與其關聯的病況或症狀)之發展、嚴重度及/或持續時間，或減輕一或多種症狀。就癌症而言，治療係指因投與一或多種本發明之治療劑而根除、移除、修飾或控制原生、局部或轉移性癌組織。在某些實施例中，此類術語係指因向患有此疾病之個體投與一或多種本發明之治療劑而最小化或延遲癌症擴散。在其他實施例中，此類術語係指消除致病細胞。

向個體「投與(Administering/administration)」物質、化合物或藥劑可使用熟習此項技術者已知之多種方法中之一者進行。舉例而言，可經舌下或經鼻內，藉由吸入至肺中或經直腸來投與化合物或藥劑。投與亦可例如執行一次、複數次及/或一或多個延長之週期。在一些態樣中，投與包括直接投與(包括自投與)及間接投與(包括開具藥物之處方的操作)兩者。舉例而言，如本文所用，指示患者自投與藥物或由他人投與藥物及/或向患者提供藥物處方之醫師係向患者投與藥物。

本文所描述之各實施例可單獨地或與本文所描述之任何其他實施例組合使用。 概述

痘病毒為在經感染細胞之細胞質中複製的大(約200 kbp) DNA病毒。正痘病毒(OPV)屬包含在感染不同宿主之能力方面極不同的多種痘病毒。舉例而言，牛痘病毒(VACV)可感染廣泛的宿主群，而天花病毒(VARV) (天花病原體)僅感染人類。許多(若非全部)痘病毒之共同特徵為其在宿主內非遺傳地「再活化」之能力。非遺傳再活化係指其中經一種痘病毒感染之細胞可促進本身不具有傳染性的第二「死亡」病毒(例如藉由熱不活化之病毒)恢復的過程。

經純化痘病毒DNA不具傳染性，此係由於病毒生命週期需要經由封裝於病毒粒子中的經病毒編碼之RNA聚合酶來轉錄早期基因。然而，若將病毒DNA轉染至先前感染有輔助痘病毒之細胞中，從而提供反式轉錄、複製及封裝經轉染基因組所需的必需因子，則可克服此缺陷(Sam CK, Dumbell KR. Expression of poxvirus DNA in coinfected cells and marker rescue of thermosensitive mutants by subgenomic fragments of DNA. Ann Virol (Inst Past). 1981;132:135-50)。儘管此產生混合病毒子代，但可藉由在支持兩種病毒之傳播的細胞株中進行再活化反應，且接著藉由將病毒混合物接種於並不支持輔助病毒之生長的細胞上來消除輔助病毒而克服該問題(Scheiflinger F, Dorner F, Falkner FG. Construction of chimeric vaccinia viruses by molecular cloning and packaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992;89(21):9977-81)。

先前，Yao及Evans描述一種其中藉由野兔痘病毒(Leporipoxvirus ) (休普氏纖維瘤病毒(Shope fibroma virus,SFV))催化之高頻重組及複製反應可與經SFV催化之再活化反應物偶合以使用病毒DNA之多個重疊片段來迅速地組裝重組牛痘病毒株的方法(Yao XD, Evans DH. High-frequency genetic recombination and reactivation of orthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infected cells. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。 本發明之幹細胞

本發明之一個態樣提供包含合成嵌合痘病毒(scPV)之幹細胞，其可用於治療癌症及傳染病。包含於幹細胞內之功能性合成嵌合痘病毒(scPV)係由化學合成DNA初始複製及組裝。scPV可為基因組已經定序或可大部分定序或可獲得天然分離的任何痘病毒。可根據本發明之方法之各種實施例產生的病毒可為其基因組已大部分定序或可獲得天然分離物的任何痘病毒。在一些態樣中，本發明之scPV可基於天然存在之病毒株、變體或突變體、經突變誘變病毒或經基因工程改造病毒之基因組序列。在一些態樣中，本發明之scPV之病毒基因組相對於該病毒之野生型基因組或基礎基因組序列包含一或多種修飾。修飾可包括例如一或多種缺失、插入、取代或其組合。應理解，可以此項技術中通常已知之多種方式引入修飾。

如本文所用，「幹細胞」為具有區分成多個不同類型之細胞(例如，末端分化細胞)之能力的任何全能、多能(pluripotent)或多潛能(multipotent)細胞。如本文所用，術語「幹細胞」係指在特定情形下具有區分更特定或分化表現型之能力或潛能且在某些情形下保持增殖而不實質上分化之能力的祖細胞之子集。在一個實施例中，術語幹細胞通常係指天然存在之母體細胞，其後代(子代)通常在不同方向上藉由分化(例如，藉由完整地獲取個體特徵)而特異化，如在胚胎細胞及組織之漸進式多樣化中所發生。細胞分化為通常經由多個細胞分裂發生之複雜過程。經分化細胞可源自自身源自多潛能細胞的多潛能細胞，等等。當此等多潛能細胞中之每一者可視為幹細胞時，各自可產生之細胞類型範圍可顯著不同。一些經分化細胞亦能夠產生更大發育潛能之細胞。此能力可為天然的或可在經多種因子處理之後人工地誘導。在許多生物個例中，幹細胞亦由於其可產生超過一個獨立細胞類型之子代而為「多潛能」的，但此並非「幹細胞特性(stem-ness)」所需的。自我更新為幹細胞定義之另一典型部分且其必須用於本發明中。理論上，自我更新可藉由兩種主要機制中之任一者發生。幹細胞可不對稱地分裂，其中一種裂變產物保持幹狀態而另一種裂變產物表現一些獨立的其他特定功能及表現型。替代地，群體中之一些幹細胞可對稱地分裂成兩個幹，因此將一些幹細胞維持在整個群體中，而群體中之其他細胞僅產生經分化子代。形式上，有可能以幹細胞形式開始之細胞可能朝向分化表現型發展，但接著「逆轉」且再表現幹細胞表現型，術語通常被稱為「反分化」或「再程式化」或「逆分化」。

任何幹細胞類型可用於本發明之各種態樣中。幹細胞包括任何類型之幹細胞，包括胚胎幹(embryonic stem，ES)細胞、出生後幹細胞(例如來自臍帶及胎盤)、胎兒幹細胞及成體幹細胞(亦即體幹細胞)。諸如經誘導多能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)之其他類型係藉由再程式化成體細胞以表現ES特徵而在實驗室中產生。在一個實施例中，成體幹細胞為間質幹細胞。在一個實施例中，成體幹細胞為組織或器官特定幹細胞，諸如神經元幹細胞、血管幹細胞或表皮幹細胞。在一較佳實施例中，成體幹細胞為間質幹細胞(mesenchymal stem cells，MSC)。

間質幹細胞可獲自多種來源，諸如骨髓、臍帶血及脂肪組織(脂肪組織衍生之幹細胞)。幹細胞之共同來源為人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)及原生人類皮膚微血管內皮細胞( human cutaneous microvascular endothelial cells，HCMEC)。類似非人類幹細胞亦可獲自類似的非人類來源。用於本發明之一個態樣中之幹細胞可為原生細胞或已維持在細胞培養物中持續延長時段的細胞。幹細胞可獲自任何動物類型，包括人類。在一較佳實施例中，幹細胞為人類細胞。

如本文所用，「胚胎幹細胞」為獲自通常為六週大或更小之胚胎的幹細胞。全能人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cells，hESC)通常可獲自5至7天大的胚胎。多能性人類原生胚細胞(human primordial germ，hEG)通常可獲自六週大或更小的胚胎。如本文中所用，「胎兒幹細胞」係指產前獲自通常大於6週之胎兒的任何幹細胞。如本文所用，「成體幹細胞」係指獲自分娩後個體的任何幹細胞。通常，該個體為完全發育成人。例示性成體幹細胞包括(但不限於)自諸如脂肪、肌肉或骨髓之器官採集的細胞。

在一個實施例中，幹細胞為自體性的，亦即細胞獲自或源自個體自身的幹細胞。在一個實施例中，本發明之幹細胞獲自源自需要治療性治療細胞增殖性病症(腫瘤或癌症)之個體。個體可能已具有細胞增殖性病症或處於該病症的風險下。

在另一實施例中，幹細胞為同種異體的，亦即獲自或源自供體之細胞，該細供體之人類白血球抗原(human leukocyte antigens，HLA)可接受的匹配個體之人類白血球抗原。

在一個態樣中，本發明係關於一種經分離幹細胞或其群體，其包含合成嵌合痘病毒(scPV)，其中病毒由源自合成DNA之DNA複製且再活化，該病毒之病毒基因組與該病毒之野生型基因組不同之特徵在於一或多個修飾。

在另一態樣中，本發明係關於一種經分離幹細胞或其群體，其包含合成嵌合正痘病毒，其中病毒由源自合成DNA之DNA複製且再活化，該病毒之病毒基因組與該病毒之野生型基因組不同之特徵在於一或多個修飾。

在另一態樣中，本發明係關於一種經分離幹細胞或其群體，其包含合成嵌合牛痘病毒，其中病毒由源自合成DNA之DNA複製且再活化，該病毒之病毒基因組與該病毒之野生型基因組不同之特徵在於一或多個修飾。

在一個態樣中，本發明係關於一種經分離幹細胞或其群體，其包含合成嵌合馬痘病毒，其中病毒由源自合成DNA之DNA複製且再活化，該病毒之病毒基因組與該病毒之野生型基因組不同之特徵在於一或多個修飾。

在一個實施例中，本發明之幹細胞為非癌症幹細胞。 本發明之合成嵌合痘病毒

當天然模板不可用於藉由習知分子生物學方法基因修飾、擴增或複製時，化學基因組合為尤其適用的。舉例而言，馬痘病毒(HPXV)之天然分離物不容易獲得模板DNA，但已描述用於HPXV (病毒株MNR-76)之基因組序列。然而，HPXV基因組序列係不完整的。未測定末端髮夾環之序列。因此，可藉由使用末端髮夾環基於代替HPXV末端髮夾環序列之VACV端粒來產生功能性合成嵌合HPXV (scHPXV)。類似地，wtVACV (病毒株NYCBH，純系ACAM2000)之基因組序列已經描述並公佈，儘管其並不完整。未測定末端髮夾環之序列，鑑別僅四個54 bp重複序列。因此，可藉由使用基於不同VACV病毒株(諸如WR病毒株)之末端髮夾環代替VACV ACAM2000末端髮夾環序列來產生功能性合成嵌合VACV ACAM2000。在其他實施例中，末端髮夾環係基於VACV ACAM2000末端髮夾環序列。

在一些實施例中，痘病毒於脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae subfamily)。在一些實施例中，痘病毒於選自以下的脊椎動物痘病毒亞科屬：禽痘病毒 (Avipoxvirus) 、羊痘病毒(Capripoxvirus) 、鹿痘病毒(Cervidpoxvirus) 、鱷魚痘病毒(Crocodylipoxvirus) 、野兔痘病毒(野兔痘病毒)、軟疣痘病毒(Molluscipoxvirus) 、正痘病毒、副痘病毒、豬痘病毒(Suipoxvirus) 或亞塔痘病毒(Yatapoxvirus) 。在一些實施例中，痘病毒為正痘病毒。在一些實施例中，正痘病毒選自駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV，「鼠痘劑」)、HPXV、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒、牛痘病毒(VACV)、天花病毒(VARV)及田鼠痘病毒(VPV)。在一較佳實施例中，痘病毒為HPXV。在另一較佳實施例中，痘病毒為VACV。在一些實施例中，痘病毒為副痘病毒。在一些實施例中，副痘病毒選自羊痘(orf)病毒(ORFV)、偽牛痘病毒(PCPV)、牛丘疹性口炎病毒(bovine papular stomatitis virus，BPSV)、松鼠副痘病毒(squirrel parapoxvirus，SPPV)、紅鹿副痘病毒(red deer parapoxvirus)、Ausdyk病毒、羚羊傳染性紅斑病毒(Chamois contagious ecythema virus)、馴鹿副痘病毒(reindeer parapoxvirus)或海豹痘病毒(sealpox virus)。在一些實施例中，痘病毒為軟疣痘病毒。在一些實施例中，軟疣痘病毒為軟疣傳染性軟疣病毒(molluscum contagiousum virus，MCV)。在一些實施例中，痘病毒為亞塔痘病毒。在一些實施例中，亞塔痘病毒選自特納河痘病毒(Tanapox virus)或亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus，YMTV)。在一些實施例中，痘病毒為羊痘病毒。在一些實施例中，羊痘病毒選自綿羊痘病毒、山羊痘病毒或粗皮病(lumpy skin disease)病毒。在一些實施例中，痘病毒為豬痘病毒。在一些實施例中，豬痘病毒(Suipoxvirus)為豬痘病毒(swinepox virus)。在一些實施例中，痘病毒為野兔痘病毒。在一些實施例中，野兔痘病毒選自黏液瘤病毒、休普氏纖維瘤病毒(Shope fibroma virus，SFV)、松鼠纖維瘤病毒或野兔纖維瘤病毒。仍不斷發現新型痘病毒(例如，正痘病毒)。應理解，本發明之各種態樣之scPV可基於此新發現的痘病毒。

在一些態樣中，scPV為CMLV，其基因組係基於公佈之基因組序列(例如病毒株CMS (Genbank寄存號AY009089.1))。在一些態樣中，scPV為CPXV，其基因組係基於公佈之基因組序列(例如病毒株Brighton Red (Genbank寄存號AF482758)、病毒株GRI-90 (Genbank寄存號X94355))。在一些態樣中，scPV為ECTV，其基因組係基於公佈之基因組序列(例如病毒株Moscow (Genbank寄存號NC_004105))。在一些態樣中，scPV為MPXV，其基因組係基於公佈之基因組序列(例如病毒株Zaire-96-1-16 (Genbank寄存號AF380138))。在一些態樣中，scPV為RPXV，其基因組係基於公佈之基因組序列(例如病毒株Utrecht (Genbank寄存號AY484669))。在一些態樣中，scPV為沙鼠痘病毒，其基因組係基於公佈之基因組序列(例如病毒株Dahomey 1968 (Genbank寄存號NC_008291))。

化學病毒基因組合成亦開拓大量有用修飾引入所得基因組或其特定部分的可能性。該等修飾可改良選殖產生病毒的容易性、提供引入重組基因產物之位點、改良鑑別再活化病毒純系之容易性及/或賦予超多其他有用特徵(例如引入所需抗原、產生溶瘤病毒等)。在一些實施例中，修飾可包括一或多種毒性因子之減毒或缺失。在一些實施例中，修飾可包括添加或插入一或多種毒性調節基因或基因編碼調節因子。

在一個態樣中，本發明提供用於產生合成嵌合馬痘病毒(scHPXV)之聚核苷酸。在一個特定實施例中，scHPXV基因組可基於HPXV病毒株MNR-76描述之基因組序列(SEQ ID NO: 49) (Tulman ER, Delhon G, Afonso CL, Lu Z, Zsak L, Sandybaev NT等人. Genome of horsepox virus. Journal of Virology. 2006;80(18):9244-58)。此基因組序列不完整且似乎不包括末端髮夾環之序列。此處顯示，可使用本發明之方法將來自牛痘病毒(VACV)之末端髮夾環接合至HPXV基因組末端以產生功能性scHPXV粒子。可將HPXV基因組分成10個重疊片段，如本揭示之工作實例中所述及表1中所示。在一些實施例中，可將基因組分成2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個重疊片段。在一些實施例中，整個基因組可以一個片段提供。例示重疊片段之基因組位置及片段大小示於表1中。表2顯示可相對於鹼基序列而在此等片段中進行的一些修飾。本發明之一個態樣之聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 1至10至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核酸序列。在一些實施例中，本發明之經分離聚核苷酸包含此等序列之變體，其中此等變體可包括錯義突變、無義突變、重複、缺失及/或添加。SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12描繪VACV (WR病毒株)末端髮夾環之核苷酸序列。在一些實施例中，末端髮夾環包含與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核酸序列。

在另一態樣中，本發明提供用於產生合成嵌合牛痘病毒(scVACV)之聚核苷酸。在一特定實施例中，scVACV基因組可基於針對VACV病毒株NYCBH純系ACAM2000 (GenBank寄存號AY313847；Osborne JD等人. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)描述之公佈之基因組序列。此基因組序列係不完整的且似乎不包括末端髮夾環之序列且鑑別僅四個54bp重複序列。本申請案中展示，可使用本發明之方法將來自牛痘病毒(VACV)病毒株WR之末端髮夾環接合至VACV基因組病毒株NYCBH純系ACAM2000之端部上以產生功能性scVACV粒子。在一些實施例中，可使用本發明之方法將來自牛痘病毒(VACV)病毒株ACAM2000之末端髮夾環接合至VACV基因組病毒株NYCBH純系ACAM2000之端部上以產生功能性scVACV粒子。可將scVACV基因組分成9個重疊片段，該等片段如本揭示內容之工作實例中所描述且展示於表4中。在一些實施例中，可將VACV基因組分成2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個重疊片段。在一些實施例中，整個基因組可作為一個片段提供。片段大小展示於表4中。本發明之一個態樣之聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 54-62至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核酸序列。在一些實施例中，本發明之經分離聚核苷酸包含此等序列之變體，其中此等變體可包括錯義突變、無義突變、重複、缺失及/或添加。SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12描繪VACV (WR病毒株)末端髮夾環之核苷酸序列。SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 118描繪VACV (ACAM2000病毒株)末端髮夾環之核苷酸序列。在一些實施例中，末端髮夾環包含與SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 12至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核酸序列。在一些實施例中，末端髮夾環包含與SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 118至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核酸序列。

傳統上，痘病毒之末端髮夾痘病毒難以選殖及定序，因此，一些公佈的基因組序列(例如，VACV、ACAM 2000及HPXV MNR-76)不完整並不出人意料。已公佈之HPXV基因組之序列同樣係不完整的，可能在末端端部缺失約60 bp。因此，不能經精確地複製HPXV髮夾。在一例示性實施例中，129 nt ssDNA片段係使用已公佈之VACV末端髮夾之序列作為導引物而經化學合成且接合至包含HPXV基因組之左及右端部之dsDNA片段上。同樣地，wtVACV (病毒株NYCBH，純系ACAM2000)之基因組序列已經描述並公佈，儘管其並不完整。未測定末端髮夾環之序列，鑑別僅四個54 bp重複序列。由於已公佈之wtVACV病毒株NYCBH，純系ACAM2000基因組之序列係不完整的，因此不能經精確地複製髮夾。在一例示性實施例中，ssDNA片段係使用已公佈之wtVACV WR病毒株末端髮夾環之序列作為導引物而經化學合成且接合至包含VACV病毒株NYCBH之左及右端部之dsDNA片段上。

在另一實施例中，本發明之scPV之病毒基因組包含同源或異源末端髮夾環及位於髮夾環之下游的串聯重複區域(70 bp、125 bp及54 bp串聯重複)，其中串聯重複區域包含與wtVACV不同的重複數(亦即天然存在病毒)。VACV病毒(病毒株WR)中發現的70 bp、125 bp及54 bp串聯重複的重複數分別為22、2及8。在另一實施例中，串聯重複區域之數目在不同痘病毒、不同牛痘病毒或不同牛痘病毒株中不同。術語「同源末端髮夾環」意謂該等末端髮夾環來自相同病毒物種/相同病毒株，而術語「異源末端髮夾環」意謂該等末端髮夾環來自不同病毒物種/不同病毒株。

在一些實施例中，本發明之scPV之末端髮夾源自VACV。在一些實施例中，末端髮夾源自CMLV、CPXV、ECTV、HPXV、MPXV、RPXV、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒或VPV。在一些實施例中，末端髮夾環係基於選自以下之群中之病毒株：Western Reserve、純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、絨毛膜尿囊牛痘病毒安卡拉株 (Chorioallantois Vaccinia virus Ankara，CVA)、經修飾牛痘病毒安卡拉株(Modified vaccinia Ankara，MVA)及MVA-BN。在一個實施例中，末端髮夾環係基於VACV之Western Reserve病毒株(WR病毒株)。在另一實施例中，末端髮夾環係基於ACAM2000病毒株。仍不斷地發現新型VACV病毒株。應理解，本發明之各種態樣之scPV可基於此新發現的痘病毒或新發現的病毒株。

在一些實施例中，修飾可包括一或多個限制性位點之缺失。在一些實施例中，修飾可包括一或多個限制性位點之引入。在一些實施例中，待自基因組缺失或添加至基因組的限制位點可選自一或多個限制位點，諸如(但不限於)AanI 、 AarI 、 AasI 、 AatI 、 AatII 、 AbaSI 、 AbsI 、 Acc65I 、 AccI 、 AccII 、 AccIII 、 AciI 、 AclI 、 AcuI 、 AfeI 、 AflII 、 AflIII 、 AgeI 、 AhdI 、 AleI 、 AluI 、 AlwI 、 AlwNI 、 ApaI 、 ApaLI 、 ApeKI 、 ApoI 、 AscI 、 AseI 、 AsiSI 、 AvaI 、 AvaII 、 AvrII 、 BaeGI 、 BaeI 、 BamHI BanI 、 BanII 、 BbsI 、 BbvCI 、 BbvI 、 BccI 、 BceAI 、 BcgI 、 BciVI 、 BclI 、 BcoDI 、 BfaI 、 BfuAI 、 BfuCI 、 BglI 、 BglII 、 BlpI 、 BmgBI 、 BmrI 、 BmtI 、 BpmI 、 Bpu10I 、 BpuEI 、 BsaAI 、 BsaBI 、 BsaHI 、 BsaI 、 BsaJI 、 BsaWI 、 BsaXI 、 BseRI 、 BseYI 、 BsgI 、 BsiEI 、 BsiHKAI 、 BsiWI 、 BslI 、 BsmAI 、 BsmBI 、 BsmFI 、 BsmI 、 BsoBI 、 Bsp1286I 、 BspCNI 、 BspDI 、 BspEI 、 BspHI 、 BspMI 、 BspQI 、 BsrBI 、 BsrDI 、 BsrFαI 、 BsrGI 、 BsrI 、 BssHII 、 BssSαI 、 BstAPI 、 BstBI 、 BstEII 、 BstNI 、 BstUI 、 BstXI 、 BstYI 、 BstZ17I 、 Bsu36I 、 BtgI 、 BtgZI 、 BtsαI 、 BtsCI 、 BtsIMutI 、 Cac8I 、 ClaI 、 CspCI 、 CviAII 、 CviKI-1 、 CviQI 、 DdeI 、 DpnI 、 DpnII 、 DraI 、 DrdI 、 EaeI 、 EagI 、 EarI 、 EciI 、 Eco53kI 、 EcoNI 、 EcoO109I 、 EcoP15I 、 EcoRI 、 EcoRV 、 FatI 、 FauI 、 Fnu4HI 、 FokI 、 FseI 、 FspEI 、 FspI 、 HaeII 、 HaeIII 、 HgaI 、 HhaI 、 HincII 、 HindIII 、 HinfI 、 HinP1I 、 HpaI 、 HpaII 、 HphI 、 Hpy166II 、 Hpy188I 、 Hpy188III 、 Hpy99I 、 HpyAV 、 HpyCH4III 、 HpyCH4IV 、 HpyCH4V 、 I-CeuI 、 I-SceI 、 KasI 、 KpnI 、 LpnPI 、 MboI 、 MboII 、 MfeI 、 MluCI 、 MluI 、 MlyI 、 MmeI 、 MnlI 、 MscI 、 MseI 、 MslI 、 MspA1I 、 MspI 、 MspJI 、 MwoI 、 NaeI 、 NarI 、 NciI 、 NcoI 、 NdeI 、 NgoMIV 、 NheI 、 NlaIII 、 NlaIV 、 NmeAIII 、 NotI 、 NruI 、 NsiI 、 NspI 、 PacI 、 PaeR7I 、 PciI 、 PflFI 、 PflMI 、 PleI 、 PluTI 、 PmeI 、 PmlI 、 PpuMI 、 PshAI 、 PsiI 、 PspGI 、 PspOMI 、 PspXI 、 PstI 、 PvuI 、 PvuII 、 RsaI 、 RsrII 、 SacI 、 SacII 、 SalI 、 SapI 、 Sau3AI 、 Sau96I 、 SbfI 、 ScrFI 、 SexAI 、 SfaNI 、 SfcI 、 SfiI 、 SfoI 、 SgrAI 、 SmaI 、 SmlI 、 SnaBI 、 SpeI 、 SphI 、 SrfI 、 SspI 、 StuI 、 StyD4I 、 StyI 、 SwaI 、 TaqαI 、 TfiI 、 TseI 、 Tsp45I 、 TspMI 、 TspRI 、 Tth111I 、 XbaI 、 XcmI 、 XhoI 、 XmaI 、 XmnI 或ZraI 。 應理解，可將任何所需限制性位點或限制性位點之組合插入至基因組中或自基因組中突變及/或消除。在一些實施例中，一或多個AarI 位點自病毒基因組缺失。在一些實施例中，一或多個Bsa I位點自病毒基因組缺失。在一些實施例中，自基因組完全消除一或多個限制位點(例如，可消除病毒基因組中之所有AarI 位點)。在一些實施例中，可將一或多個AvaI 限制位點引入病毒基因組中。在一些實施例中，可將一或多個StuI 位點引入病毒基因組中。在一些實施例中，一或多個修飾可包括重組工程改造靶標，包括(但不限於)lox P或FRT位點之併入。

在一些實施例中，修飾可包括以下之引入：螢光標記物，諸如(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、增強的GFP、黃色螢光蛋白(YFP)、青色/藍色螢光蛋白(BFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或其變體等；可選標記物，諸如(但不限於)抗藥性標記物(例如，大腸桿菌(E. coli )黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(gpt) 、 鏈黴菌(Streptomyces alboniger )嘌呤黴素乙醯基轉移酶基因(pac )、新黴素磷酸轉移酶I基因(nptI )、新黴素磷酸轉移酶基因II(nptII )、潮黴素磷酸轉移酶(hpt )、shble 基因等；蛋白質或肽標籤，諸如(但不限於)麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MBP)、纖維素結合結構域(cellulose-binding domain，CBD)、麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)、聚(His)、FLAG、V5、c-Myc、紅血球凝集素(hemagglutinin，HA)、NE-標籤、氯黴素乙醯基轉移酶(chloramphenicol acetyl transferase，CAT)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)、單純疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)、水泡性口炎病毒糖蛋白(Vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G)、螢光素酶、蛋白A、蛋白G、抗生蛋白鏈菌素、T7、硫化還原蛋白、酵母2-雜交標籤，諸如B42、GAL4、LexA或VP16；局部化標籤，諸如NLS-標籤、SNAP標籤、Myr標籤等。應理解，可使用此項技術中已知的其他可選標記物及/或標籤。在一些實施例中，修飾包括一或多個可選標記物來幫助選擇再活化純系(例如，螢光標記物，諸如YFP；藥物選擇標記物，諸如gpt等)，以幫助選擇再活化病毒純系。在一些實施例中，在選擇步驟之後，自再活化純系缺失一或多個可選標記物。 產生合成嵌合痘病毒之方法

在一些態樣中，本發明提供用於自病毒基因組之化學合成重疊雙股DNA片段合成、再活化且分離功能性合成嵌合痘病毒(scPV)之系統及方法。在先前感染有輔助病毒之細胞中進行病毒基因組之重疊DNA片段之重組及功能性scPV之再活化。簡言之，涵蓋scPV之全部或實質上全部病毒基因組的重疊DNA片段經化學合成且轉染至經輔助病毒感染之細胞中。培養經轉染細胞以產生包含輔助病毒且再活化scPV的混合病毒子代。接著，將混合的病毒子代接種於不支持輔助病毒生長但允許合成嵌合痘病毒生長的宿主細胞上，以消除輔助病毒且回收合成嵌合痘病毒。在一些實施例中，輔助病毒並不感染宿主細胞。在一些實施例中，輔助病毒可感染宿主細胞但在宿主細胞中生長不充分。在一些實施例中，輔助病毒相較於scPV在宿主細胞中生長更緩慢。

在一些實施例中，實質上所有合成嵌合痘病毒基因組源自化學合成之DNA。在一些實施例中，約40%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、超過99%或100%合成嵌合牛痘病毒基因組源自化學合成之DNA。在一些實施例中，痘病毒基因組源自經化學合成之DNA及天然存在之DNA的組合。在一些實施例中，包涵蓋牛痘病毒基因組之所有片段係化學合成的。在一些實施例中，片段中之一或多者係化學合成的且片段中之一或多者源自天然存在之DNA (例如，藉由PCR擴增或藉由公認重組DNA技術)。

用於本發明之方法之各種實施例的重疊DNA片段之數目將視痘病毒基因組(諸如馬痘病毒或牛痘病毒)之大小而定。諸如一方面重組效率隨片段數目增加而降低，及另一方面隨著片段數目減少的合成極大DNA片段的困難之實際考慮因素亦將告知本發明之方法中所使用的重疊片段之數目。在一些實施例中，可將合成嵌合牛痘病毒基因組合成為單一片段。在一些實施例中，合成嵌合牛痘病毒基因組由2-14個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合牛痘病毒基因組由4-12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合牛痘病毒基因組由6-12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合牛痘病毒基因組由8-11個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合牛痘病毒基因組由8-10個、10-12個或10-14個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合牛痘病毒基因組由2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、或15個重疊DNA片段組裝。在一例示性實施例中，合成嵌合牛痘病毒基因組由9個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合馬痘病毒基因組由2-14個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合馬痘病毒基因組由4-12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合馬痘病毒基因組由6-12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合馬痘病毒基因組由8-11個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合馬痘病毒基因組由8-10個、10-12個或10-14個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成嵌合馬痘病毒基因組由2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個重疊DNA片段組裝。在本發明之一例示性實施例中，合成嵌合牛痘病毒(scVACV)由9個化學合成之重疊雙股DNA片段再活化。在本發明之另一例示性實施例中，合成嵌合馬痘病毒(scHPXV)由10個化學合成之重疊雙股DNA片段再活化。在一些實施例中，末端髮夾環單獨地合成且接合至包含牛痘病毒基因組之左及右端部的片段上。在一些實施例中，末端髮夾環可源自天然存在之模板。在一些實施例中，本揭示內容之scPV之末端髮夾源自VACV。在一些實施例中，末端髮夾源自CMLV、CPXV、ECTV、HPXV、MPXV、RPXV、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒或VPV。在其他實施例中，本發明之scVACV之末端髮夾源自wtVACV。在一些實施例中，末端髮夾源自代替VACV自身末端髮夾環序列的不同病毒株之wtVACV末端髮夾。在一些實施例中，末端髮夾係基於任何wtVACV之末端髮夾，其基因組已經完全地定序或其天然分離物可用於基因組定序。在一較佳實施例中，末端髮夾源自VACV。

用於本發明之方法中之各種實施例的重疊片段之大小將視痘病毒基因組之大小而定。應理解，片段大小可廣泛變化，且諸如化學合成極大DNA片段之能力的各種實際考慮因素將告知片段大小之選擇。在一些實施例中，片段大小範圍為約2,000 bp至約50,000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約3,000 bp至約45,000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約4,000 bp至約40,000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約5,000 bp至約35,000 bp。在一些實施例中，最大片段為約18,000 bp、20,000 bp、21,000 bp、22,000 bp、23,000 bp、24, 000 bp、25,000 bp、26,000 bp、27,000 bp、28,000 bp、29,000 bp、30,000 bp、31,000 bp、32,000 bp、33,000 bp、34,000 bp、35,000 bp、36,000 bp、37,000 bp、38,000 bp、39,000 bp、40,000 bp、41,000 bp、42,000 bp、43,000 bp、44,000 bp、45,000 bp、46,000 bp、47,000 bp、48,000 bp、49,000 bp或50,000 bp。在本發明之一例示性實施例中，scVACV由大小介於約10,000 bp至約32,000 bp之範圍的9個化學合成之重疊雙股DNA片段再活化(表4)。在本發明之一例示性實施例中，scHPXV由大小介於約10,000 bp至約32,000 bp之範圍的9個化學合成之重疊雙股DNA片段再活化(表1)。

輔助病毒可為可提供再活化來自經轉染DNA之痘病毒所需之反式作用酶促機制的任何痘病毒。輔助病毒可具有與待產生之scPV (例如，相較於諸如牛痘病毒(VACV)或HPXV之正痘病毒，休普氏纖維瘤病毒(SFV)具有極窄宿主範圍)不同或更窄的宿主細胞範圍。相較於待產生之scPV，輔助病毒可具有不同的斑表現型。在一些實施例中，輔助病毒為野兔痘病毒。在一些實施例中，野兔痘病毒為SFV、野兔纖維瘤病毒、兔纖維瘤病毒、松鼠纖維瘤病毒或黏液瘤病毒在一較佳實施例中，輔助病毒為SFV。在一些實施例中，輔助病毒為正痘病毒。在一些實施例中，正痘病毒為駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV，「鼠痘劑」)、HPXV、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒、VACV及田鼠痘病毒(VPV)。在一些實施例中，輔助病毒為禽痘病毒、羊痘病毒、鹿痘病毒、鱷魚痘病毒、軟疣痘病毒、副痘病毒、豬痘病毒或亞塔痘病毒。在一些實施例中，輔助病毒為禽痘病毒。在一些實施例中，輔助病毒為α昆蟲痘病毒(Alphaentomopoxvirus )、β昆蟲痘病毒(Betaentomopoxvirus) 或γ昆蟲痘病毒(Gammaentomopoxvirus) 。在一些實施例中，輔助病毒為補骨脂素不活化輔助病毒。在本發明之一例示性實施例中，scPV由經轉染至經SFV感染之BGMK中之重疊DNA片段再活化。接著藉由將混合病毒子代接種於BSC-40細胞上來消除SFV。

熟習此項技術者應瞭解，用於再活化scPV且選擇及/或分離scPV之適合宿主細胞將視藉由本發明之方法產生的輔助病毒及嵌合痘病毒之特定組合而定。支持輔助病毒及scPV生長的任何宿主細胞均可用於再活化步驟，且不支持輔助病毒生長的任何宿主細胞可用於消除輔助病毒且選擇及/或分離scPV。在一些實施例中，輔助病毒為野兔痘病毒且用於再活化步驟之宿主細胞可選自兔腎細胞(例如，LLC-RK1、RK13等)、兔肺細胞(例如，R9ab)、兔皮膚細胞(例如，SF1Ep、DRS、RAB-9)、兔角膜細胞(例如，SIRC)、兔癌瘤細胞(例如，Oc4T/cc)、兔皮膚/癌瘤細胞(例如，CTPS)、猴細胞(例如，Vero、BGMK等)或倉鼠細胞(例如，BHK-21等)。在一些實施例中，輔助病毒為SFV。

在各個態樣中，本發明之scPV可在允許病毒生長至准許使用本文中描述之scPV的效價的任何受質中傳播。在一個實施例中，受質允許scPV生長至與針對相應野生型病毒測定之效價相當的效價。在一些實施例中，scPV可在易感染痘病毒之細胞(例如，鳥細胞、蝙蝠細胞、牛細胞、駱駝細胞、金絲雀細胞、貓細胞、鹿細胞、馬細胞、家禽細胞、沙鼠細胞、山羊細胞、人類細胞、猴細胞、豬細胞、兔細胞、浣熊細胞、海豹細胞、綿羊細胞、臭鼬細胞、田鼠細胞等)中生長。此類方法為熟習此項技術者所熟知的。代表性哺乳動物細胞包括(但不限於) BHK、BGMK、BRL3A、BSC-40、CEF、CEK、CHO、COS、CVI、HaCaT、HEL、HeLa細胞、HEK293、人類骨骼骨肉瘤細胞株143B、MDCK、NIH/3T3、Vero細胞等。對於病毒分離，通常地藉由熟知澄清程序(例如，諸如梯度離心及管柱層析)將scPV自細胞培養物中移除並與細胞組分分離，且可視需要使用熟習此項技術者熟知之程序(例如，斑分析)進一步純化。 本發明之醫藥組合物

在一個態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含本發明之經分離幹細胞或其群體及醫藥學上可接受之載劑。

術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出以供在動物，且更特定言之在人類中使用。術語「載劑」係指與醫藥組合物(例如，免疫原性或痘苗調配物)一起投與的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。亦可採用鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及類似物。適合醫藥載劑之實例由E. W. Martin描述於「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。調配物應適於投與模式。

在一些實施例中，可藉由標準投與途徑投與本發明之醫藥組合物。許多方法可用於將調配物引入個體中，此等方法包括(但不限於)鼻內、氣管內、經口、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、結膜及皮下途徑。 例示性用途 用於藉由本發明之幹細胞遞送 scPV 的 方法

在一個態樣中，本發明係關於一種用於將合成嵌合痘病毒(scPV)遞送至個體中之方法，該方法包含使本發明之幹細胞感染有合成嵌合痘病毒且將經scPV感染之幹細胞投與至個體中。

使本發明之幹細胞感染有合成嵌合痘病毒之方法為此項技術中已知的。熟習此項技術者可測定合適參數，諸如幹細胞之數目及感染倍率。

在一個實施例中，幹細胞為自體性的且本發明係關於一種用於將scPV遞送至個體中之方法，該方法包含(a)自該個體獲得幹細胞；(b)使幹細胞感染有溶瘤scPV，及(c)將經scPV感染之幹細胞投與回至個體中。在另一實施例中，幹細胞為間質幹細胞(MSC)。在另一實施例中，MSC源自個體之脂肪組織。

在另一實施例中，幹細胞為同種異體的且本發明係關於一種用於將scPV遞送至個體中之方法，該方法包含(a)自該個體獲得幹細胞；(b)使幹細胞感染有溶瘤scPV，及(c)將經scPV感染之幹細胞投與回至個體中。

在一些實施例中，以單次投與或以多次投與來投與本發明之幹細胞。

可將幹細胞局域地移植於細胞損傷或功能不全之部位處或全身性地移植。幹細胞組合物之例示性投與途徑包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、冠狀動脈內、心肌內、經心內膜、經心外膜、脊椎內、動脈內、紋狀體內、瘤內、局部、透皮、經直腸或經表皮下途徑。用於投與之最適合途徑將視待治療之病症或病況，諸如細胞損傷或功能不全之位置而變化。舉例而言，可在損傷部位處動脈內或脊椎內投與幹細胞以供治療脊髓損傷。在其他實例中，可藉由冠狀動脈內、心肌內、經心內膜或經心外膜途徑投與幹細胞組合物以供治療心血管疾病。在一較佳實施例中，投與為靜脈內投與。

在一個實施例中，用於幹細胞感染之scPV量為1×10⁵ 或約1×10⁵ 個斑形成單位(plaque forming units，PFU)、5×10⁵ 或約5×10⁵ 個PFU、至少1×10⁶ 或約1×10⁶ 個PFU、5×10⁶ 或約5×10⁶ 個PFU、1×10⁷ 或約1×10⁷ 個PFU、5×10⁷ 或約5×10⁷ 個PFU、1×10⁸ 或約1×10⁸ 個PFU、5×10⁸ 或約5×10⁸ 個PFU、1×10⁹ 或約1×10⁹ 個PFU、5×10⁹ 或約5×10⁹ 個PFU、1×10¹⁰ 或約1×10¹⁰ 個PFU或5×10¹⁰ 或約5×10¹⁰ 個PFU。

在一個實施例中，用於幹細胞感染之scPV感染倍率為約0.5個PFU/細胞、或約1個PFU/細胞、或約2個PFU/細胞、或約3個PFU/細胞、或約4個PFU/細胞、或約5個PFU/細胞、或約6個PFU/細胞、或約7個PFU/細胞、或約8個PFU/細胞、或約9個PFU/細胞、或約10個PFU/細胞。 易受本發明之例示性幹細胞治療之病況

適合於幹細胞療法之病況包括其中一或多個細胞群體為缺陷的或已經耗盡或破壞的任何病況。此類病況包括退化性病症或病況及急性或慢性損傷。一旦將幹細胞注入或移植至患者體內，諸如在細胞或組織損傷或功能不全之位置處，幹細胞可基於局部胞外微環境中之物理及化學信號而分化成所需細胞或組織類型，由此用功能性健康細胞置換破壞或缺陷細胞。例示性病況包括(但不限於)癌症、心血管疾病、糖尿病、脊髓損傷、神經變性疾病、創傷性腦損傷、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、多發性硬化(multiple sclerosis，MS)、肌肉萎縮性側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、杜氏肌營養不良(Duchenne Muscular Dystrophy)、肌肉損傷或萎縮、中風、燒傷、肺病、視網膜疾病、腎病、骨關節炎及類風濕性關節炎。 治療癌症之方法

如本文所用，一種用於治療或預防癌症之方法意謂將症狀，諸如腫瘤、其癌轉移、腫瘤之血管形成或疾病表徵之其他參數中之任一者減弱、改善、預防、置於緩解狀態或維持處於緩解狀態。亦意謂可藉由治療來消除、減弱或預防癌症及癌轉移之跡象。跡象之非限制性實例包括基底膜及近端胞外基質之不受控降解、內皮細胞遷移、分裂及組織成新的功能毛細管以及此類功能毛細管之持久性。

本發明之各種態樣之合成嵌合痘病毒(scPV)可用作在癌細胞中選擇性複製且殺滅癌細胞之溶瘤劑。快速分裂之細胞(諸如癌細胞)通常比未分裂細胞更容易感染痘病毒。諸如人體內之安全性、容易製造高效價儲備液、病毒製劑之穩定性以及在腫瘤細胞中複製之後之誘導抗腫瘤免疫性之能力的痘病毒之許多特徵使得痘病毒成為所需溶瘤劑。根據本發明之方法製造的scPV可包含使其適用於癌症治療之一或多種修飾。因此，在一個態樣中，本揭示內容提供一種誘導癌細胞死亡的方法，該方法包含使癌細胞與經分離scPV或包含本發明之scPV或本發明之幹細胞的醫藥組合物接觸。在一個態樣中，本揭示內容提供一種治療癌症之方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量的本發明之幹細胞或本發明之醫藥組合物。另一態樣包括使用本發明之幹細胞或本文中描述之醫藥組合物來誘導贅生性病細胞(諸如癌細胞)死亡或治療贅生性病(諸如癌症)。在一些實施例中，痘病毒溶瘤療法與一或多種習知癌症療法(例如，手術、化療、放射療法、溫熱療法及生物/免疫療法)組合投與。在特定實施例中，溶瘤病毒為本發明之合成嵌合VACV (scVACV)。在一些實施例中，溶瘤病毒為本發明之合成嵌合黏液瘤病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒為本發明之合成嵌合HPXV (scHPXV)。在一些實施例中，溶瘤病毒為本發明之合成嵌合浣熊痘病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒為本發明之合成嵌合亞巴類(yaba-like)病毒。

在各種態樣中，使用本發明之癌症治療方法，可容易地引入一或多個所需基因，且可容易地使一或多個非所需基因自合成嵌合痘病毒基因組缺失。在一些實施例中，用作溶瘤劑的本發明之scPV經設計以表現轉殖基因來增強其免疫反應性、抗腫瘤靶向及/或效能、細胞至細胞擴散及/或癌症特異性。在一些實施例中，本發明之scPV經設計或工程改造以表現免疫調節基因(例如，GM-CSF，或阻斷TNF功能之病毒基因)。在一些實施例中，本揭示內容之scPV經設計以包括表現減弱毒性之因子的基因。在一些實施例中，本發明之scPV經設計或工程改造以表現治療劑(例如，hEPO、BMP-4、針對特定腫瘤抗原或其部分之抗體等)。在一些實施例中，本發明之scPV已針對減毒而經修飾。在一些實施例中，本發明之scPV設經計或工程改造以缺乏病毒TK基因。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或工程改造以缺乏牛痘生長因子基因。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或工程改造以缺乏紅血球凝集素基因。

本發明之各種實施例之幹細胞適用於治療多種贅生性病症及/或癌症。在一些實施例中，癌症類型包括(但不限於)骨癌、乳癌、膀胱癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食管癌、神經膠質瘤、胃癌、胃腸癌、頭頸癌、肝癌(諸如肝細胞癌)、白血病、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、皮膚癌(諸如黑素瘤)、睾丸癌等，或可治療之任何其他腫瘤或贅生前病變。

在另一實施例中，該方法進一步包含偵測所投與scPV在贅生性病症或癌細胞中及/或在來自投與本文所描述之經分離或重組病毒或組合物之個體的樣品中之存在。舉例而言，可在投與本文所描述之scPV或組合物之前及/或投與之後對個體進行測試，以評定例如感染之進展。在一些實施例中，本揭示內容之scPV包含偵測匣，且偵測所投與之嵌合痘病毒的存在包含對偵測匣編碼之蛋白質進行偵測。舉例而言，當偵測匣編碼螢光蛋白時，使用用於觀察螢光之方法使個體或樣品成像。

在一些實施例中，以單次投與或以多次投與來投與本發明之各種實施例之幹細胞。

在其他實施例中，可將本發明之幹細胞局域地移植於細胞損傷或功能不全之部位處，或全身性移植，以便用於治療癌症之方法中。幹細胞組合物之例示性投與途徑包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、冠狀動脈內、心肌內、經心內膜、經心外膜、脊椎內、動脈內、紋狀體內、瘤內、局部、透皮、經直腸或經表皮下途徑。用於投與之最適合途徑將視待治療之病症或病況，諸如細胞損傷或功能不全之位置而變化。舉例而言，可在損傷部位處動脈內或脊椎內投與幹細胞以供治療脊髓損傷。在其他實例中，可藉由冠狀動脈內、心肌內、經心內膜或經心外膜途徑投與幹細胞組合物以供治療心血管疾病。在一較佳實施例中，投與為靜脈內投與。

用於癌症治療方法中之scPV可編碼治療性基因產物。在一些實例中，治療性基因產物為抗癌劑或抗血管生成劑。在一個實施例中，治療性基因產物可在以下中選擇：細胞介素、趨化介素、免疫調節分子、抗原、抗體或其片段、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、血管生成抑制劑、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、轉運體蛋白及組織因子。

包括本發明之幹細胞之用於癌症治療之方法亦可包括投與抗癌劑。例示性抗癌劑包括(但不限於)細胞介素、趨化介素、生長因子、光敏劑、毒素、抗癌抗生素、化學療法化合物、放射性核素、血管生成抑制劑、信號傳導調節劑、抗代謝產物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素、免疫治療劑、高溫或高溫療法、細菌、輻射治療及此類藥劑之組合。在一些實例中，抗癌劑為順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)、抗EGFR抗體或抗VEGF抗體。在一些實例中，抗癌劑與病毒同步、依序或間歇地投藥。

在用於向個體投與溶瘤病毒的本文提供之方法中，該方法亦可包括投與抗病毒藥劑以在療法期間或療法之後自個體減少病毒之複製或消除該病毒。例示性抗病毒劑包括(但不限於)西多福韋(cidofovir)、西多福韋之烷氧基烷基酯、格列維克(Gleevec)、更昔洛韋(gancyclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)及ST-26。

在用於癌症治療之方法之一個態樣中，scPV含有基因缺失。基因缺失應理解為丟失或缺失基因之DNA序列，或彼基因之缺陷或缺失突變，其中在DNA複製期間，染色體或DNA序列之部分丟失。在一個實施例中，所缺失基因選自以下：編碼蛋白質或其片段之基因、調節轉錄之基因區段、調節病毒複製之基因區段、影響細胞有絲分裂之基因區段、影響細胞代謝之基因區段、編碼反義RNA之基因區段、編碼siRNA之基因區段、調節血管生成之基因區段、調節一或多個轉運體蛋白之基因區段或調節一或多個組織因子之基因區段。在另一實施例中，基因缺失加強病毒之抗癌或抗血管生成效果。如本文所用，術語「增強效果」意謂在基因缺失後抗癌或抗血管生成化合物更有效或更具活性，其意謂在對scPV執行基因缺失後，化合物之活性增強。 治療天花病毒感染之方法

本發明之各種態樣之幹細胞可用於治療天花病毒感染。關於感染(例如，痘病毒感染或天花病毒感染)，治療係指因投與一或多種療法(包括(但不限於)投與一或多種預防劑或治療劑)而根除或控制感染物(例如，痘病毒或天花病毒)之複製，減少感染物之數目(例如，減小病毒之效價)，降低或減輕感染(例如，痘病毒/痘瘡感染或與其關聯的病況或症狀)之發展、嚴重度及/或持續時間，或減輕一或多種症狀。

在一些實施例中，以單次投與或以多次投與來投與本發明之幹細胞以治療痘瘡感染。

幹細胞組合物之例示性投與途徑包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、冠狀動脈內、心肌內、經心內膜、經心外膜、脊椎內、動脈內、紋狀體內、瘤內、局部、透皮、經直腸或經表皮下途徑。實例 實例 1. 合成嵌合 HPXV (scHPXV) 病毒基因組之重疊片段之選擇及設計

scHPXV基因組之設計係基於針對HPXV (病毒株MNR-76；圖 1A ) [GenBank寄存號DQ792504]之先前所描述基因組序列(Tulman ER, Delhon G, Afonso CL, Lu Z, Zsak L, Sandybaev NT等人. Genome of horsepox virus. Journal of Virology. 2006;80(18):9244-58)。212,633 bp基因組分成10個重疊片段(圖 1B )。此等片段經設計以使得其與各鄰接片段共用至少1.0 kbp重疊序列(亦即同源性)，以提供同源重組將驅動全長基因組之組裝的位點(表 1 )。此等重疊序列將提供足夠同源性以在共轉染片段之間精確地實行重組(Yao XD, Evans DH. High-frequency genetic recombination and reactivation of orthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infected cells. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。來自HPXV基因組序列(5'- TTTATTAAATTTTACTATTTATTTAGTGTCTAGAAAAAAA-3') (SEQ ID NO: 50)之末端40bp未包括於經合成反向末端重複(ITR)片段中。替代地，將Sap I限制位點添加於ITR片段之5'末端(GA_LITR)及3'末端(GA_RITR)處，隨後為TGT序列。此等Sap I限制位點係用於將VACV末端髮夾接合至ITR片段上(下文描述)。

各片段經化學合成且使用各片段上之末端Sfi I限制位點次選殖至質體中。為輔助次選殖此等片段，Aar I及Bsa I限制位點在所有片段(除兩個ITR編碼片段以外)中靜默地突變(表 2 )。兩個ITR編碼片段中之Bsa I限制位點未突變，以防此等區域含有對於有效DNA複製及多聯體解析度至關重要的核苷酸序列特異性識別位點。

將在痘病毒早期晚期啟動子控制下的yfp/gpt卡匣引入GA_片段_3內的HPXV095/J2R基因座中，使得在螢光顯微鏡下容易觀察到HPXV (scHPXV YFP-gpt::095)之再活化。gpt基因座亦提供使用藥物選擇來選擇再活化病毒之可能工具。HPXV095編碼非必需VACV J2R基因之HPXV同源物且藉由將片段_3及其他HPXV純系連同VACV DNA一起轉染至經SFV感染之BGMK細胞中，回收多種雜交體病毒，從而驗證選擇策略(圖 10A 及圖 10B )。亦將靜默突變引入HPXV044 (VACV^WR F4L)序列(GA_片段_2)中以在GA_片段_2內產生兩個特有限制位點(表 3 )。在一些實施例中，此等特有限制性位點可用於在再活化HPXV之前將重組基因產物(諸如(但不限於)可選標記物、螢光蛋白、抗原等)快速引入GA_片段_2中。表 1 ： 用於此研究中之HPXV基因組片段。指示HPXV基因組內的各片段之大小及位置。

表 2 ： 形成於scHPXV YFP-gpt::095片段中以自HPXV基因組移除Aar I及Bsa I限制位點的靜默突變。

表 3 ： 將靜默核苷酸突變引入HPXV044 (VACV F4L)基因中以在GA_片段_2中形成特有限制性核酸內切酶位點。

來自 VACV ( 病毒株 WR) 之 末端髮夾環之緩慢 (S) 及快速 (F) 形式之合成

將來自VACV (病毒株WR)之末端髮夾環之緩慢(S)及快速(F)形式合成為157nt ssDNA片段(Integrated DNA Technologies；圖 2B )。經由DNA合成，由三個核苷酸構成之5'懸垂物保留在各髮夾(5'-ACA；圖 2C )之端部處。來自HPXV序列[DQ792504]之多聯體解析位點亦合成於末端髮夾環中(圖 2B )。 scHPXV YFP-gpt::095 片段之 消化及純化

在50℃下用Sfi I消化合成HPXV片段隔夜。在50℃下用Sfi I消化隔夜之前，scHPXV ITR片段單獨用Sap I (ThermoFisher Scientific)消化1 h，在65℃下不活化保持10分鐘。將大約1U FastAP鹼性磷酸酶添加至scHPXV YFP-gpt::095 ITR消化物且在37℃下培育額外1 h。隨後使用QiaexII DNA清除套組(Qiagen)純化所有scHPXV YFP-gpt::095片段。將所有scHPXV YFP-gpt::095片段自含QiaexII懸浮液之10mM Tris-HCl溶離。使用NanoDrop (ThermoFisher Scientific)估計DNA濃度。

痘病毒催化與病毒複製過程密切相關之極高頻率的同源重組反應。本文中，證實化學合成之HPXV雙螺旋DNA之大片段可使用經病毒催化之重組及複製反應接合以形成功能性scHPXV基因組。

使用所公佈之HPXV基因組(病毒株WNR-76)之序列將212,633 bp基因組分成10個重疊片段(圖 2 )。除ITR之外的每個片段中之所有Bsa I及Aar I位點經突變，以防此區域內之序列特異性位點為高效基因組複製及多聯體解析度無意中所需的。如上文所描述，為便於將來自VACV之末端髮夾環結構添加至ITR之端部上，Sap I識別位點分別包括在LITR及RITR片段兩者之左末端端部及右末端端部附近(圖 2A )。此等Sap I位點嵌入側接載體序列內，且Sap I酶在位點之下游、識別序列之外部且在HPXV DNA中切割。因此，當用SapI切割DNA時，其在自HPXV序列複製之DNA內留下黏性端部且因此准許組裝精確序列複本(經由後續接合)，從而不含額外限制位點。LITR及RITR片段之其他端部(關於基因組映射之內部端部)各自由Sfi I識別位點限定，如同剩餘HPXV片段之兩個端部。所有此等DNA係以質體形式供應以易於傳播。為製備用於轉染至經SFV感染之細胞的內部片段，用Sfi I消化此等質體以自各scHPXV YFP-gpt::095片段釋放質體(關於如何處理LITR及RITR片段，參看下文)。在消化之後，各反應物經純化以移除任何污染性酶，但質體未自消化物移除且與各scHPXV YFP-gpt::095片段一起共轉染。此不會干擾反應，且經完成以最小化此等大DNA片段之DNA操作及可能的分段之量。

儘管反應效率可受經轉染片段之數目影響，但大於或小於10個重疊片段可用於本發明之方法中。不受理論束縛，在未進一步最佳化再活化反應之情況中，約15個片段可代表實際上限。理想下限將為單個基因組片段，但實際上端粒最容易操作為更適當大小的片段(例如約10 kb)。 將 VACV F 末端髮夾環及 VACV S 末端髮夾環接合至 scHPXV YFP-gpt::095 左 ITR 片段 及右 ITR 片段上

使大約一微克末端VACV髮夾環中之每一者在95℃下培育5分鐘，隨後在冰上「快速」冷卻以形成髮夾結構。接著髮夾環在接合之前在其5'末端處經磷酸化。簡言之，將含有1 μg VACV F-髮夾或VACV S-髮夾、2 μl 10×T4聚核苷酸激酶緩衝液(ThermoFisher Scientific)、1 mM ATP以及10單位T4聚核苷酸激酶(ThermoFisher Scientific)之單獨20 μl反應物在37℃下培育1小時。在75℃下藉由熱不活化終止反應。

在16℃下，在5% PEG-4000及5單位T4 DNA接合酶之存在下，使大約一微克左ITR或右ITR單獨與20倍莫耳過量之各末端髮夾一起培育隔夜。使各接合反應在65℃下熱不活化保持10分鐘，隨後在冰上培育直至準備好轉染至細胞中為止。

正痘病毒編碼在基因組之各端部處攜帶不同長度反向末端重複(ITR)之直鏈dsDNA基因組。雙螺旋基因組之兩股由髮夾環連接以形成共價連續的聚核苷酸鏈。環為富含A+T的，不能形成完全鹼基配對結構，且以依序倒置及互補之兩種形式存在(Baroudy BM, Venkatesan S, Moss B)。不完全鹼基配對正反末端環將牛痘病毒基因組之兩個DNA股連接至一個不間斷的聚核苷酸鏈中。(Cell. 1982;28(2):315-24) (圖 2B )。其基於其電泳特性而被稱作緩慢[S]形式及快速[F]形式且很可能摺疊成封端直鏈dsDNA基因組之端部的部分雙螺旋髮夾結構(圖 2C )。所公佈之HPXV基因組之序列係不完整的，可能自末端端部缺失約60bp，使得無法精確複製HPXV髮夾。替代地，使用所公佈之VACV端粒之序列作為導引物且使由三個核苷酸構成之5'懸垂物留在各髮夾(5'-ACA；圖 2C )之端部來化學合成157 nt ssDNA片段(Baroudy BM, Venkatesan S, Moss B)。不完全鹼基配對正反末端環將牛痘病毒基因組之兩個DNA股連接至一個不間斷的聚核苷酸鏈中。(Cell. 1982;28(2):315-24)。此懸垂物與藉由用Sap I切割經選殖LITR及RITR片段產生的端部互補。

基於表明HPXV與VACV之間的近親性(close common ancestry)的資料來使用源自VACV之序列。有可能使用來自其他痘病毒之其他末端髮夾，因為不同脊索痘病毒之髮夾端部之間的序列特徵通常保守。舉例而言，髮夾末端中之解析位點在序列及官能基兩者中高度保守(其類似於晚期啟動子)。

將此等單股寡核苷酸加熱至95℃，且接著在冰上快速冷卻以形成不完全鹼基配對之末端髮夾(圖 2C )。接著，各寡核苷酸經磷酸化且以20倍莫耳過量分別地接合先前用Sap I及Sfi I兩者消化之左ITR片段或右ITR片段。用此等酶消化ITR在各ITR之5'末端處產生5'-TGT懸垂物，該懸垂物與末端髮夾環結構中之5'-ACA懸垂物互補。此產生各ITR之經髮夾封端之複本。

為證實經髮夾封端之結構添加至兩個ITR片段，執行用Pvu II來限制消化ITR片段。由於不可能藉由凝膠電泳來觀測將約70bp末端髮夾添加至約10kb ITR之末端上，因此用Pvu II消化少量的各接合。若無末端髮夾接合至ITR，則用PvuII消化產生了1472bp產物(圖 3 ，泳道 2 及 泳道 5 )。然而，若末端髮夾環成功添加至HPXV ITR，則在瓊脂糖凝膠上看到ITR片段之大小的增加(圖 3 ，將泳道2與泳道3及泳道4進行比較；將泳道5與泳道6及泳道7進行比較)。此等資料表明，在此等條件下，幾乎所有HPXV ITR在片段之一端處含有末端髮夾環。 由化學合成之 dsDNA 片段再活化 scHPXV YFP-gpt::095

SFV病毒株Kasza及BSC-40最初獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)。水牛綠猴腎臟(Buffalo green monkey kidney，BGMK)細胞獲自G. McFadden (University of Florida)。BSC-40及BGMK細胞在37℃下在補充有L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、丙酮酸鈉、抗生素及抗黴劑以及5%胎牛血清(FCS；ThermoFisher Scientific)的含5% CO₂ 之最少必須培養基(MEM)中傳播。

水牛綠猴腎臟(BGMK)細胞在含有MEM之60 mm組織培養皿中生長直至其達至大約80%滿度(confluency)為止。在37℃細胞以0.5之MOI經含休普氏纖維瘤病毒(SFV)之無血清MEM感染1 h。接種物經含有5% FCS之3 ml溫熱MEM置換，且返回至培育箱再一小時。同時，如下設置轉染反應。藉由大約5 μg總合成HPXV DNA片段於1 ml Opti-MEM中與在1 ml Opti-MEM中稀釋之Lipofectamine2000以3:1 (Lipofectamine2000比總DNA)之比率混合，以製備Lipofectamine複合物。 使複合物在室溫培育10分鐘，接著逐滴添加至先前感染SFV之BGMK細胞。感染後大約16 h，培養基經含有5% FCS之新鮮MEM置換。將細胞在37℃培養再4天(總計5天)。藉由將經感染細胞刮至細胞培養基中並進行三次冷凍及解凍循環來回收病毒粒子。粗提取物在無血清MEM中10^-2 稀釋且將4 ml接種物接種於BSC-40細胞之9至16個150 mm組織培養盤上，以回收再活化scHPXV YFP-gpt::095。感染後一小時，接種物經含有5% FCS及0.9%貴重瓊脂(Noble Agar)之MEM置換。在倒置顯微鏡下觀測到黃色螢光斑，且選取個別斑用於進一步分析。ScHPXV YFP-gpt::095斑為用黃色螢光選擇純化三次之斑。

SFV催化重組且再活化正痘病毒DNA以組裝重組牛痘病毒先前已描述(Yao XD, Evans DH. High-frequency genetic recombination and reactivation of orthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infected cells. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90; Construction of recombinant vaccinia viruses using leporipoxvirus-catalyzed recombination and reactivation of orthopoxvirus DNA. Methods Mol Biol. 2004;269:51-64)。若干生物學特徵使其成為引人注目的模型系統。首先，SFV具有較窄宿主範圍，高效地感染兔細胞及某些猴細胞株，如BGMK。其可在如BSC-40之細胞上感染，但生長極差。其次，相較於正痘病毒，其生長得更慢，耗時大約4-5天在單層細胞中形成轉化「病灶」，此為與在培養1-2天內產生斑之正痘病毒極不同的特性。野兔痘病毒與正痘病毒之間的生長差異允許藉由在BGMK細胞中進行再活化分析及將子代接種於BSC-40細胞上來區分此等病毒。在一些實施例中，可使用其他輔助病毒(諸如(但不限於)禽痘病毒)。在一些實施例中，可使用不同細胞組合。

BGMK細胞以0.5之MOI經SFV感染，且接著在2小時後用5 μg經消化GA_HPXV片段轉染。轉染後五天，所有感染性粒子藉由細胞裂解回收且再接種於BSC-40細胞上，其僅高效地支持HPXV (或其他正痘病毒)之生長。在螢光顯微鏡下觀測到所得再活化scHPXV YFP-gpt::095斑。觀測係藉由Frag_3內之HPXV095/J2R基因座中之yfp/gpt可選標記實現(圖 2A )。在轉染48小時內，在BSC-40單層中偵測到病毒斑。回收scHPXV YFP-gpt::095之效率視多種因素而定，包括DNA轉染效率，但範圍高達幾個PFU/μg之所轉染DNA。 藉由 PCR 及限制性片段分析確認 scHPXV YFP-gpt::095 基因組序列 scHPXV 之 PCR 及限制性消化分析

為迅速確認scHPXV YFP-gpt::095於再活化斑挑選中之存在，PCR引子經設計以側接在scHPXV中突變之個別Bsa I位點(表 5 )。基因組scHPXV YFP-gpt::095 DNA自感染有scHPXV YFP-gpt::095之BSC-40細胞分離且用作模板。來自經VACV感染之BSC-40細胞之基因組DNA用作對照以確認Bsa I位點於各PCR產物內之存在。在PCR擴增之後，接著在37℃下用Bsa I消化反應物1 h。在含有SYBR®安全染色劑之1%瓊脂糖凝膠上分離PCR反應物以觀測DNA條帶。

在使用蔗糖梯度純化分離之基因組DNA上實行藉由限制消化隨後脈衝場凝膠電泳(PFGE)進一步分析scHPXV YFP-gpt::095基因組(Yao XD, Evans DH. Construction of recombinant vaccinia viruses using leporipoxvirus-catalyzed recombination and reactivation of orthopoxvirus DNA. Methods Mol Biol. 2004;269:51-64)。簡言之，在37℃下用5UBsa I或Hind III消化100 ng經純化病毒基因組DNA持續2 h。經消化DNA在1% Seakem Gold瓊脂糖凝膠鑄模上運行且在0.5×三硼酸鹽-EDTA電泳(TBE)緩衝液[110 mM參；90 mM硼酸鹽；2.5 mM EDTA]中運行。在14℃下，使用1至10秒之轉換時間梯度、線性漸升式因數及120˚角在CHEF DR-III設備(BioRad)上以5.7 V/cm解析DNA持續9.5 h。此程式允許1 kbp至＞ 200 kbp之DNA物種解析度。為解析75 bp至5 kbp的片段，實行在1.5%瓊脂糖凝膠鑄模上電泳且在室溫下在115V下在1.0× TBE中運行2小時。藉由SYBR®金色染色劑觀測到DNA。將經消化scHPXV YFP-gpt::095 DNA片段之大小與對照VACV基因組DNA進行比較。 表5：此研究中用於擴增GA_片段_1A、GA_片段_1B、GA_片段_2、GA_片段_3、GA_片段_4、GA_片段_5、GA_片段_6及GA_片段_7中發現之Bsa I限制性位點周圍的VACV及HPXV內之區域的引子。

藉由PCR、限制性消化及全基因組定序來確認自再活化分析生長之斑分離的病毒之基因組序列。PCR分析係基於除ITR HPXV片段之外的所有突變Bsa I位點。引子組經設計以側接scHPXV YFP-gpt::095中之各Bsa I位點(表5)。確認此等引子組亦將擴增VACV WR內之類似區域。在PCR擴增scHPXV YFP-gpt::095內之此等突變Bsa I位點周圍的約1 kb區域之後，用Bsa I消化各反應物，且藉由凝膠電泳分析所得DNA片段。由於無Bsa I位點在VACV (wt)中突變，因此酶促消化成功地消化各PCR產物，從而產生更小DNA片段。由scHPXV YFP-gpt::095基因組DNA產生之PCR產物對Bsa I消化具有抵抗性，從而表明Bsa I識別位點在此等基因組中成功地突變。引子組7C之引子產物不會導致scHPXV YFP-gpt::095 PP1及PP3樣品中的任何DNA擴增。為確認此引子組是否為非功能性或此片段7之區域是否未組裝成所得scHPXV YFP-gpt::095基因組，對初始GA_Frag_7質體DNA進行PCR，且此反應在擴增產物時亦不成功。

接著基因組DNA自蔗糖梯度純化之scHPXV YFP-gpt::095基因組分離，用Bsa I或Hind III消化且由瓊脂糖凝膠電泳間隔以確認scHPXV YFP-gpt::095中之大部分Bsa I位點成功地突變。引起關注地，相較於VACV，來自3個不同scHPXV YFP-gpt::095純系之未消化基因組DNA在凝膠上明顯更慢的運行，從而確認scHPXV YFP-gpt::095 (213,305bp)之基因組大於VACV-WR (194,711bp) (圖 4A ，將泳道 2-4 與泳道 5 進行比較 )。scHPXV YFP-gpt::095純系對Bsa I消化具有抵抗性，從而在藉由PFGE分離後產生一個較大DNA片段(約198000bp)及約4000 bp之更小DNA片段。此與VACV-WR基因組相反，其在用Bsa I消化時，產生在凝膠上分離的多個DNA片段。由於在用Bsa I消化scHPXV YFP-gpt::095基因組後之預期DNA大小相對較小，此等消化產物係由習知瓊脂糖凝膠電泳分離且確認scHPXV YFP-gpt::095產生合適大小的片段(圖 4B ，泳道 2-4 )。亦確認在Hind III消化之後，scHPXV YFP-gpt::095產生恰當大小的DNA片段，從而表明在合成較大DNA片段期間保持維持識別(圖 4A ，泳道 12-14 ； 圖 4B ，泳道 6-8 )。總體而言，scHPXV YFP-gpt::095基因組之活體外分析表明利用化學合成之DNA片段再活化HPXV係成功的。

由於HPXV095藉由將片段_3及其他HPXV純系連同VACV DNA一起轉染至經SFV感染之BGMK細胞中編碼非必需VACV J2R基因之HPXV同源物，回收多種雜交體病毒，從而驗證選擇策略(圖 10A 及圖 10B )。藉由將VACV DNA以及HPXV Frag_3共轉染至經SFV感染之細胞中獲得第一雜交病毒(「VACV/HPXV + 片段3」)。綠色標記插入編碼YPF-gpt選擇標記物。藉由純化來自此第一雜交基因組之DNA且將其連同HPXV片段2、4、5及7再次轉染至中經SFV感染之細胞中以獲得純系1-3。經設計以靶向HPXV及VACV兩者之PCR引子(表5)用於擴增跨越在scHPXV純系中突變之Bsa I位點的DNA區段。在PCR擴增之後，產物經Bsa I消化以區分VACV序列(切割)與HPXV (未切割)。VACV/HPXV雜合體展現Bsa I敏感性及抗性位點之混合，然而經再活化scHPXV YFP-gpt::095純系係完全抗Bsa I的。 藉由全基因組序列分析證實 scHPXV YFP-gpt::095 基因組序列

HPXV YFP-gpt::095純系(斑選取[PP] 1.1、PP 2.1及PP 3.1)之儲備液經製備且經蔗糖梯度純化。使用蛋白酶K消化隨後酚氯仿提取自各經純化病毒製劑中提取病毒DNA。使用Qubit dsDNA HS分析套組(ThermoFisher Scientific)測定dsDNA之量。各病毒基因組係在阿爾伯塔大學(University of Alberta)的分子生物學實驗室(Molecular Biology Facility，MBSU)進行定序。使用Nextera標籤化系統(Epicentre Biotechnologies)產生定序文庫。各樣品剪切大約50 ng，且使用Illumina MiSeq平台對文庫進行配對末端定序(2 × 300 bp)，其中平均讀取深度在整個基因組上為3100個讀數·nt^-1 ，且在F髮夾及S髮夾中為約190個讀數·nt^-1 。 序列組裝、分析及註釋

原始定序讀數調整低品質序列得分且使用CLC基因組學工作台8.5軟體初始地映射至HPXV參考序列[GenBank寄存號DQ792504]。針對HPXV參考序列驗證scHPXV YFP-gpt::095序列內之所有核苷酸插入、缺失及取代。基因組註釋轉移設施(Genome Annotation Transfer Utility，GATU) (Tcherepanov V, Ehlers A, Upton C. Genome Annotation Transfer Utility (GATU): rapid annotation of viral genomes using a closely related reference genome. BMC Genomics. 2006;7:150. Epub 2006/06/15)用於將參考註釋轉移至scHPXV基因組序列。

使用多工方法及Illumina MiSeq定序器對經純化scHPXV YFP-gpt::095基因組進行定序。序列讀數映射至野生型HPXV (DQ792504)及scHPXV YFP-gpt::095參考序列上，以確認特定修飾於scHPXV YFP-gpt::095基因組中之存在。為確認VACV末端重複序列正確接合至左側ITR之末端端部，分析基因組之此區域中之定序讀數。將一串C添加至scHPXV YFP-gpt::095基因組參考序列之開頭以捕獲此區域中映射之所有序列讀數。完成此操作，此係由於用於組裝序列讀數之程式將在scHPXV YFP-gpt::095基因組參考序列結束時點處以其他方式截斷序列之顯示。

自映射之讀數清楚可見，儘管Sap I識別位點存在於scHPXV YFP-gpt::095參考基因組中，但所有定序讀數缺乏此序列。此確認本文中描述之方法在合成髮夾接合至ITR之端部之位點處產生可靠的HPXV序列。亦成功地獲得VACV WR末端髮夾環之完整序列，其經證明與接合至TIR端部上之合成ssDNA之序列一致。總體而言，此等數據表明VACV-WR末端髮夾環成功地接合至HPXV ITR序列上且於傳染性病毒中回收。此外，五個病毒中之每一者中之F讀數及S讀數之1:1分佈表明需要兩個端部來產生病毒。

接著，驗證使Bsa I位點靜默地突變之各核苷酸取代已正確地併入scHPXV YFP-gpt::095基因組中。定序讀數映射至HPXV (DQ792504)參考序列。圖 5A 中展示scHPXV YFP-gpt::095中自區域96,050至96,500之總體Illumina定序讀數覆蓋度。由此可明顯看出，不與參考HPXV正確對齊之此區域中存在兩個衝突(圖 5A ，藍色及黃色豎直線 )。在放大此等區域之後，明顯可見在scHPXV YFP-gpt::095基因組中，在位置96,239處存在T至C取代(圖 5B )，且在位置96,437處存在A至G取代(圖 5C )。驗證經引入以使選定BsaI 及 AarI 識別位點突變之所有核苷酸取代產生於scHPXV YFP-gpt::095基因組中(表 2 )。

最後，判定經設計以在GA_Frag_2中產生特有限制位點之HPXV044中之核苷酸取代亦併入scHPXV YFP-gpt::095基因組中。映射至HPXV044之定序讀數(區域44,400至45,100)展示，此區域內存在定序讀數與HPXV YFP-gpt::095參考序列中之序列之定序讀數衝突的兩個區域。在放大此等區域之後，明顯可見兩個T至G取代引入至位置44,512及45,061處之非編碼HPXV044股中，因此在Frag_2中產生Ava I及Stu I限制位點。總體而言，定序資料證實活體外基因組分析資料且確認scHPXV YFP-gpt::095在經SFV感染之細胞中成功地再活化。 相較於其他痘病毒 ， scHPXV YFP-gpt::095 在 HeLa 細胞 中複製更緩慢

BSC-40、HeLa及HEL成纖維細胞最初獲自美國典型培養物保藏中心。BSC-40細胞在37℃下在補充有L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、丙酮酸鈉、抗生素及抗黴劑以及5%胎牛血清(FCS；ThermoFisher Scientific)的含5% CO₂ 之最少必須培養基(MEM)中傳播。HeLa及HEL細胞係在37℃下在補充有L-麩醯胺酸、抗生素及抗黴劑以及10%FCS的含5% CO₂ 之杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)中傳播。

多步驟生長曲線及斑大小量測用於評估scHPXV YFP-gpt::095是否類似於其他正痘病毒活體外複製及擴散。由於天然HPXV分離物不可用，因此將scHPXV YFP-gpt::095之生長與原型痘病毒、VACV (病毒株WR)、牛痘病毒(CPX)、與HPXV密切相關之痘病毒以及Dryvax病毒純系DPP15進行比較。用VACV WR、CPX、DPP15或scHPXV YFP-gpt::095以較低MOI感染猴腎臟上皮細胞(BSC-40)、Vero細胞、人類癌瘤細胞株(HeLa)及原生人類纖維母細胞(HEL)且在72 h時程內採集經感染細胞。在BSC-40細胞中，病毒複製及擴散之速率在所有所測試病毒中相當(圖 8A )。重要地，scHPXV YFP-gpt::095以及其他所測試痘病毒中之任一者經複製。病毒在HEL細胞及Vero細胞上生長至略微較低之效價且在HeLa細胞上生長最差。在HeLa細胞中，相較於其他正痘病毒，發現病毒產量減小至多1.5個對數。

接著，量測BSC-40細胞中生長的scHPXV YFP-gpt::095之斑大小。觀測到scHPXV YFP-gpt::095之斑大小相較於VACV WR及平均牛痘病毒(圖 6B )的統計上顯著之減小。引起關注地，在BSC-40細胞中，當相較於所有其他所測試正痘病毒時，scHPXV YFP-gpt::095產生最小斑(圖 6C )。同樣，當不同VACV病毒株產生形成更小二級斑之胞外病毒時，此等斑不由scHPXV YFP-gpt::095產生(圖 6C )。總體而言，此等資料表明，當相較於其他正痘病毒時，使用本文中描述之系統再活化scHPXV YFP-gpt::095並不將任何明顯缺陷引入活體外病毒複製及擴散中。此外，scHPXV YFP-gpt::095之斑大小類似於牛痘病毒(CPXV)之斑大小，從而表明合成病毒再活化對先前藉由其他HPXV類純系觀測到之較小斑表現型並不具有任何不利影響(Medaglia ML, Moussatche N, Nitsche A, Dabrowski PW, Li Y, Damon IK等人. Genomic Analysis, Phenotype, and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC: Implications for the Origins and Evolutionary Relationships of Vaccinia Virus. Journal of Virology. 2015;89(23):11909-25)。 yfp/gpt 選擇標記物之移除

在再活化scHPXV YFP-gpt::095之後，移除HPXV095基因座中之yfp/gpt選擇標記物。為此，合成對應於HPXV (DQ792504)中之核苷酸位置91573至92921的1349 bp序列區域(ThermoFisher Scientific) (SEQ IDNO: 51)。此片段包括側接wt HPXV095/J2R基因之任一側的約400 bp同源性。此DNA序列選殖至由GeneArt提供之商業載體中。為藉由HPXV095基因序列置換yfp/gpt卡匣，BSC-40細胞以MOI 0.5經scHPXV YFP-gpt::095感染，且2 h後，接著使用Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific)經含wtHPXV095序列之2 μg線性化質體轉染。在感染後48 h採集病毒重組體且在瓊脂下使用三輪非螢光斑純化來分離重組病毒(scHPXV(wt))。PCR用於使用側接HPXV095基因座之引子確認scHPXV (wt)之屬性。用於確認HPXV095基因之正確置換的引子為HPXV095_ check -FWD 5'-CCTATTAGATACATAGATCCTCGTCG-3' (SEQ ID NO: 52)及HPXV095_check-REV 5'-CGGTTTATCTAACGACACAACATC-3' (SEQ ID NO: 53)。 scHPXV (wt) 對比於 scHPXV YFP-gpt::095 之生長特性

在如上文所描述進行之實驗中，scHPXV (wt)展示生長特性並非明顯不同於活體外scHPXV YFP-gpt::095 (圖 11A 至圖 11C )。觀測到相較於VACV WR的scHPXV (wt)之斑大小的統計上顯著減小(圖 11A )。類似於scHPXV YFP-gpt::095，scHPXV (wt)並不產生胞外病毒(圖 11B )，且scHPXV (wt)及scHPXV YFP-gpt::095在BSC-40細胞、HEL細胞、HeLA細胞及Vero細胞上之生長無顯著差異(圖 11C )。鑒於此特性影響毒性，scHPXV (wt)不產生胞外病毒之發現係相關的。 測定鼠類鼻內模型中之 scHPXV (wt) 毒性

在此研究中測定scHPXV (wt)之毒性效果。對於此實驗，6組Balb/c小鼠經投與3個不同劑量之實例中所描述之scHPXV (ΔHPXV_095/J2R)或scHPXV (wt)且與PBS對照組以及VACV (WR)對照組及VACV (Dryvax病毒株DPP15)對照組進行比較(總共9個治療組)。此實驗中包括在研究期間未接受任何治療的3隻額外小鼠。在整個實驗中，所有小鼠在預定點處進行血液取樣，且額外小鼠充當血清分析之基線。

在接種Balb/c小鼠之前，所有病毒株在BSC-40細胞(非洲綠猴腎臟)中生長、藉由胰蛋白酶消化採集、在PBS中洗滌、藉由杜恩斯均質化(dounce homogenization)自細胞提取、藉由超速離心經由36%蔗糖襯墊純化、再懸浮於PBS中且經滴定，使得最終濃度為：1) VACV (WR) - 5×10⁵ PFU/ml；2) VACV (DPP15) - 10⁹ PFU/ml；3) scHPXV (ΔHPXV_095/J2R) - 10⁷ PFU/ml、10⁸ PFU/ml及10⁹ PFU/ml；以及4) scHPXV (wt) - 10⁷ PFU/ml、10⁸ PFU/ml及10⁹ PFU/ml。

針對此研究之scHPXV劑量選擇(10⁵ 個PFU/劑量、10⁶ 個PFU/劑量及10⁷ 個PFU/劑量)係基於使用VACV之已知疫苗病毒株(包括Dryvax及IOC)之先前研究(Medaglia ML, Moussatche N, Nitsche A, Dabrowski PW, Li Y, Damon IK等人. Genomic Analysis, Phenotype, and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC: Implications for the Origins and Evolutionary Relationships of Vaccinia Virus. Journal of Virology. 2015;89(23):11909-25; Qin L, Favis N, Famulski J, Evans DH. Evolution of and evolutionary relationships between extant vaccinia virus strains. Journal of Virology. 2015;89(3):1809-24)。

由於體重損失用作小鼠體內之毒性之量測值，因此以5×10³ 個PFU之劑量經鼻內投與VACV (病毒株WR)，其產生大約20-30%體重損失。亦以10⁷ 個PFU/劑量經鼻內投與VACV Dryvax純系DPP15，使得此熟知天花疫苗之毒性可直接地與scHPXV (wt)進行比較。小鼠係購自Charles River實驗室，且一旦接收，在病毒投與之前使小鼠適應其環境至少一週。

各小鼠在麻醉下接受經由鼻內注射投與之單一劑量病毒(約10 ul)。每日監測小鼠之感染跡象，諸如腫脹、排泄或其他異常持續30天之時段。在病毒投與後，每日特定地監測各小鼠之體重損失。根據阿爾伯塔大學(University of Alberta)之動物衛生保健設施協定，對除其他發病因素之外的體重損失超過25%的小鼠實施安樂死。

即使在最高劑量之所測試scHPXV下，Balb/c小鼠中可能亦無明顯疾病跡象。在一些情況下，與scHPXV (舊南美洲病毒)最密切相關的VACV病毒株在10⁷ 個PFU下不產生疾病(Medaglia ML, Moussatche N, Nitsche A, Dabrowski PW, Li Y, Damon IK等人 Genomic Analysis, Phenotype, and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC: Implications for the Origins and Evolutionary Relationships of Vaccinia Virus. Journal of Virology. 2015;89(23):11909-25)。由於以超過10⁹ 個PFU/mL之效價製得純化儲備液之困難，因此測試比此高得多之劑量為不切實際的。 測定 scHPXV 是否賦予對致死性 VACV-WR 挑戰之免疫保護

在整個實驗中，似乎已不受實例中所描述之初始病毒投與影響的小鼠繼續正常增重。病毒接種三十天後，小鼠經由鼻內接種相繼地挑戰致死劑量之VACV-WR (10⁶ 個PFU/劑量)。如上文所描述，密切監測小鼠之感染跡象。每天對小鼠進行稱重，且對除其他發病因素之外體重損失超過25%的小鼠實施安樂死。吾人預期，在投與致死劑量之VACV-WR之前，接種有PBS之小鼠在接種後7-10天內展示明顯的體重損失及其他發病因素之跡象。致死性挑戰VACV-WR後大約14天，對所有小鼠實施安樂死且收集血液以藉由標準斑降低分析確認VACV特異性中和抗體於血清中之存在。實例 2. 合成嵌合 VACV (scVACV) 含有 VACV WR 病毒株髮夾及雙螺旋序列 (scVACV ACAM2000-WR DUP/HP) 之 合成嵌合 VACV ACAM2000

scVACV 基因組之設計係基於VACV ACAM2000 [GenBank寄存號AY313847]之先前所描述基因組序列(Osborne JD等人. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)。基因組分成9個重疊片段(圖 12 )。此等片段經設計以使得其與各鄰接片段共用至少1.0 kbp重疊序列(亦即同源性)，以提供其中同源重組將驅動全長基因組之組裝的位點(表4)。此等重疊序列提供足夠同源性以在共轉染片段之間精確地實行重組(Yao XD, Evans DH. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。表 4 ： 用於此研究中之VACV ACAM2000基因組片段。描述VACV ACAM2000基因組[GenBank寄存號AY313847]中之大小及序列。

為輔助次選殖此等片段，Aar I及Bsa I限制位點在所有片段(除兩個ITR編碼片段以外)中靜默地突變。兩個ITR編碼片段中之Bsa I限制位點未突變，以防此等區域含有對於有效DNA複製及多聯體解析度至關重要的核苷酸序列特異性識別位點。

將在痘病毒早期晚期啟動子控制下的YFP/gpt卡匣引入胸苷激酶基因座中，使得在螢光顯微鏡下容易觀測到VACV ACAM2000 (VACV ACAM2000 YFP-gpt::105)之再活化。gpt基因座亦提供使用藥物選擇來選擇再活化病毒之可能工具。

傳統上，末端髮夾已難以選殖及定序，因此，所公佈之VACV ACAM2000基因組之序列並不完整係不出乎意料的。在檢測所公佈之VACV ACAM2000病毒株之極末端區域之後，ACAM2000與極佳表徵之VACV WR病毒株(GenBank寄存號AY243312)之間似乎存在一些差異(圖 12 )。在WR病毒株中，緊接位於VACV基因組之末端5'末端及3'末端處的共價封閉髮夾環之下游存在70 bp串聯重複序列。此等為隨後兩個125 bp重複序列及八個54 bp重複序列(圖 13A )。然而，在所公佈之VACV ACAM2000序列中，鑑別僅四個54bp重複序列。在定序(使用Illumina)後，在VACV ACAM2000之野生型分離為中確認70 bp、125 bp及54 bp重複序列之存在，從而指示當前所公佈之ACAM2000之序列係不完整的。由於Illumina讀數之較短讀數長度(＜300個核苷酸)，因此本發明人不能精確判定哪一實際ACAM2000基因組序列呈此約3 kbp形式。替代地，本發明人決定由末端髮夾重建具有與VACV WR類似序列之VACV ACAM2000病毒以僅在C23L基因之終止密碼子之前(圖 12 )。此包括125 bp及54 bp串聯重複序列兩者，儘管該等序列不包括於所公佈之ACAM2000序列中，但在進行wtVACV ACAM2000之新一代Illumina定序時偵測到該等序列。在經修飾VACV ACAM2000左ITR片段及右ITR片段之5'末端處，亦包括NheI限制位點，其將允許將70 bp串聯重複序列直接地附接至ITR端部(如上文所描述)。wtVACV WR病毒株之F末端髮夾環序列及S末端髮夾環序列分別展示於SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12中。 含有 VACV ACAM2000 病毒株髮夾及雙螺旋序列 (scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP) 之 合成嵌合 VACV ACAM2000

scVACV基因組之設計係基於VACV ACAM2000 [GenBank寄存號AY313847]之先前所描述基因組序列(Osborne JD等人. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)。基因組分成9個重疊片段(圖 12 )。此等片段經設計以使得其與各鄰接片段共用至少1.0 kbp重疊序列(亦即同源性)，以提供其中同源重組將驅動全長基因組之組裝的位點(表4)。此等重疊序列提供足夠同源性以在共轉染片段之間精確地實行重組(Yao XD, Evans DH. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。

為輔助次選殖此等片段，Aar I及Bsa I限制位點在所有片段(除兩個ITR編碼片段以外)中靜默地突變。兩個ITR編碼片段中之Bsa I限制位點未突變，以防此等區域含有對於有效DNA複製及多聯體解析度至關重要的核苷酸序列特異性識別位點。

將在痘病毒早期晚期啟動子控制下的YFP/gpt卡匣引入胸苷激酶基因座中，使得在螢光顯微鏡下容易觀測到VACV ACAM2000 (VACV ACAM2000 YFP-gpt::105)之再活化。gpt基因座亦提供使用藥物選擇來選擇再活化病毒之可能工具。

wtVACV ACAM2000病毒株之F末端髮夾環序列及S末端髮夾環序列分別展示於SEQ ID NO: 118及SEQ ID NO: 117中。 將 VACV WR F 末端髮夾環 及 S 末端髮夾環接合至 VACV ACAM2000 右 ITR 片段及左 ITR 片段上

合成與VACV WR病毒株一致的70 bp重複片段(圖 13A ；SEQ ID NO: 63)。Sap I及Nhe I限制位點包括於70 bp串聯重複片段之5'末端及3'末端處以便於分別接合至VACV WR髮夾序列及VACV ACAM2000右ITR片段及左ITR片段上。在VACV WR末端髮夾環可能接合至70 bp串聯重複片段上之前，必須使用由IDT合成之雙螺旋序列將環延長額外58 bp。此係由於在VACV病毒株WR中發現第一70 bp重複序列之前，額外序列緊接多聯體解析位點之下游。雙螺旋序列係藉由合成兩個單股DNA分子產生，該兩個單股DNA分子在黏接在一起時將產生具有5'末端處之5'-TGT懸垂物及3'末端處之5'-GGT懸垂物(SEQ ID NO: 64及SEQ ID NO: 65)之雙螺旋DNA分子。由於VACV WR F末端髮夾環及S末端髮夾環在其末端環處產生3'-ACA懸垂物，因此將58 bp雙螺旋接合至髮夾以產生與VACV WR病毒株中發現之序列看起來一致的約130 bp末端髮夾環直至70 bp重複序列之開頭。此髮夾/雙螺旋片段經凝膠純化且接著相繼地接合至70 bp重複片段之經Sap I消化之端部上。用Sap I消化70 bp串聯重複片段形成三種基底懸垂物(5'-CCA)，其與末端髮夾/雙螺旋結構中之5'GGT懸垂物互補。在DNA接合酶之存在下，70 bp串聯重複相對於70 bp串聯重複片段以約5倍莫耳過量與F末端髮夾/雙螺旋結構或S末端髮夾/雙螺旋結構混合。相較於僅70 bp反應，此在DNA電泳凝膠中產生上移，從而指示末端髮夾/雙螺旋成功地接合至70 bp串聯重複片段上。

此末端髮夾/雙螺旋/70 bp串聯重複片段相繼地接合至先前在其末端端部處經修飾以包括Nhe I限制位點的70 bp ACAM2000左ITR片段或右ITR片段上。當此片段經消化時，5'-CTAG懸垂物保留在其5'末端處。在70 bp串聯重複片段之3'末端處，Nhe I位點用於將此片段直接地接合至VACV ACAM2000DNA片段之LITR區域及RITR區域。在消化VACV ACAM2000左ITR片段及右ITR片段之後，在16℃下，以1:1莫耳比使用DNA接合酶將S末端髮夾/雙螺旋/70 bp串聯重複片段或F末端髮夾/雙螺旋/70 bp串聯重複片段分別地接合至左ITR片段或右ITR片段隔夜。在轉染至經休普氏纖維瘤病毒(SFV)感染之BGMK細胞中之前，DNA接合酶隨後在65℃下熱不活化。 將 VACV ACAM2000 F 末端髮夾環 及 S 末端髮夾環接合至 VACV ACAM2000 右 ITR 片段及左 ITR 片段上

合成與VACV ACAM2000一致之70 bp重複片段。Sap I及Nhe I限制位點包括於70 bp串聯重複片段之5'末端及3'末端處以便於分別地接合至VACV ACAM2000髮夾序列及VACV ACAM2000右ITR片段及左ITR片段上。在VACV ACAM2000末端髮夾環可能接合至70 bp串聯重複片段上之前，必須使用由IDT合成之雙螺旋序列將環延長額外58 bp。此係由於在VACV病毒株ACAM2000中發現第一70 bp重複序列之前，額外序列緊接多聯體解析位點之下游。雙螺旋序列係藉由合成兩個單股DNA分子產生，該兩個單股DNA分子在黏接在一起時將產生具有5'末端處之5'-TGT懸垂物及3'末端處之5'-GGT懸垂物(SEQ ID NO: 119及SEQ ID NO: 120)之雙螺旋DNA分子。由於VACV ACAM2000 F末端髮夾環及S末端髮夾環在其末端環處產生3'-ACA懸垂物，因此58 bp雙螺旋接合至髮夾以產生約130 bp末端髮夾環。此髮夾/雙螺旋片段經凝膠純化且接著相繼地接合至70 bp重複片段之經SapI消化之端部上。用SapI消化70 bp串聯重複片段形成三種基底懸垂物(5'-CCA)，其與末端髮夾/雙螺旋結構中之5'GGT懸垂物互補。在DNA接合酶之存在下，70 bp串聯重複相對於70 bp串聯重複片段以約5倍莫耳過量與F末端髮夾/雙螺旋結構或S末端髮夾/雙螺旋結構混合。相較於僅70 bp反應，此在DNA電泳凝膠中產生上移，從而指示末端髮夾/雙螺旋成功地接合至70 bp串聯重複片段上。

此末端髮夾/雙螺旋/70 bp串聯重複片段相繼地接合至先前在其末端端部處經修飾以包括Nhe I限制位點之ACAM2000左ITR片段或右ITR片段上。當此左ITR片段或右ITR片段經消化時，5'-CTAG懸垂物保留在其5'末端處。在70 bp串聯重複片段之3'末端處，Nhe I位點用於將此片段直接地接合至VACV ACAM2000DNA片段之LITR區域及RITR區域。在消化VACV ACAM2000左ITR片段及右ITR片段之後，在16℃下，以1:1莫耳比使用DNA接合酶將S末端髮夾/雙螺旋/70 bp串聯重複片段或F末端髮夾/雙螺旋/70 bp串聯重複片段分別地接合至左ITR片段或右ITR片段隔夜。在轉染至經休普氏纖維瘤病毒(SFV)感染之BGMK細胞中之前，DNA接合酶隨後在65℃下熱不活化。 製備 VACV ACAM2000 重疊 DNA 片段

使用限制酶I-Sce I將表4中之VACV ACAM2000重疊DNA片段中之每一者選殖至由GeneArt提供之質體中。在將此等合成DNA片段轉染至BGMK細胞中之前，用I-Sce I消化質體且產物在凝膠上運行以確認DNA片段成功地線性化。在37℃下消化2 h之後，反應隨後在65℃下熱不活化。將樣品儲存於冰上4℃下直至形成末端髮夾/雙螺旋/70 bp串聯重複/ITR片段(如上文所描述)。 scVACV ACAM2000-WR DUP/HP 或 scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP 在 經休普氏纖維瘤病毒感染之細胞中之 之 再活化

SFV病毒株Kasza及BSC-40最初獲自美國典型培養物保藏中心。水牛綠猴腎臟(BGMK)細胞獲自G. McFadden (University of Florida)。BSC-40及BGMK細胞在37℃下在補充有L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、丙酮酸鈉、抗生素及抗黴劑以及5%胎牛血清(FCS；ThermoFisher Scientific)的含5% CO₂ 之最少必須培養基(MEM)中傳播。

水牛綠猴腎臟(BGMK)細胞在含有MEM之60 mm組織培養皿中生長直至其達至大約80%滿度為止。在37℃下細胞以0.5之MOI經含休普氏纖維瘤病毒(SFV)之無血清MEM感染1 h。接種物經含有5% FCS之3 ml溫熱MEM置換，且返回至培育箱持續額外一小時。同時，如下設置轉染反應。在37℃下大約2 h後，基於包含VACV ACAM2000基因組之各片段之長度以莫耳當量將線性化VACV ACAM2000片段轉染(使用Lipofectamine 2000)至經SFV感染之BGMK細胞中。嘗試不同量之總DNA且5、6及7.5 µg DNA能夠成功地再活化來自此等重疊DNA片段之ACAM2000。使複合物在室溫下培育10分鐘，接著逐滴添加至先前感染有SFV之BGMK細胞。感染後大約24 h，培養基經含有5% FCS之新鮮MEM置換。在37℃下，將細胞培養額外4天(總計5天)。

藉由將經感染細胞刮削至細胞培養基中並進行三次冷凍及解凍循環來回收病毒粒子。粗提取物在無血清MEM中10^-2 稀釋且將4 ml接種體接種於BSC-40細胞之9-16個150 mm組織培養盤上，以回收再活化之scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105。感染後一小時，接種體經含有5% FCS及0.9%貴重瓊脂之MEM置換。在倒置顯微鏡下觀測到黃色螢光斑，且選取個別斑以用於進一步分析。scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105斑為用黃色螢光選擇純化三次之斑。

4天後，含有SFV及VACV ACAM2000純系兩者之感染盤經採集，隨後為三次凍融循環以釋放病毒，且接著連續稀釋並接種至BSC-40細胞上，其相較於SFV病毒較佳地促進VACV ACAM2000病毒之生長。進行三輪斑純化，隨後在10-150 mm組織培養盤中擴增(bulkup)病毒儲備液。病毒隨後自此等細胞裂解且在36%蔗糖襯墊上分離，隨後以24%-40%蔗糖密度梯度進一步純化。基因組DNA自此等純化基因組分離且進行新一代Illumina定序以確認合成病毒基因組之序列。 相較於野生型 ACAM2000 病毒之生長特性

在猴腎臟上皮(BSC-40)細胞中執行經分離合成嵌合VACV ACAM2000-WR DUP/HP、scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP及野生型VACV ACAM2000病毒之活體外多步驟生長曲線。細胞以0.03之感染倍率經感染，在指示時間(3 h、6 h、12 h、21 h、48 h及72 h)處採集病毒，且將病毒滴定於BSC-40細胞上。圖16上展示之資料代表三個獨立實驗。如圖16上所展示，scVACV ACAM2000及wtVACV ACAM2000-WR DUP/HP病毒在72 h時段內以不可區分生長動力生長。

scVACV ACAM2000-WR DUP/HP (YFP-gpt標記物)、scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP (YFP-gpt標記物)、scVACV ACAM2000-WR DUP/HP (無標記物) (經J2R基因序列置換之YFP-gpt標記物)、scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP (無標記物) (經J2R基因序列置換之YFP-gpt標記物)及wtVACV ACAM2000之生長曲線之間的比較展示此等病毒之生長特性與wtACAM2000 VACV相比較在統計學上無差異(圖 16 )。 藉由 PCR 及 限制性片段分析確認 scVACV ACAM2000 -WR DUP/HP YFP-gpt::105 基因組序列

在使用蔗糖梯度純化分離之基因組DNA上實行藉由限制消化隨後脈衝場凝膠電泳(PFGE)進一步分析scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105基因組(Yao XD, Evans DH. Methods Mol Biol. 2004;269:51-64)。兩個獨立scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系加VACV_WRΔJ2R對照(其中J2R基因序列已經YFP-gpt標記物置換)及wtVACV ACAM2000對照(VAC_ACAM2000)經純化且接著保持不經消化，或用Bsa I、Hind III或Not I及Pvu I消化。來自scVACV ACAM2000-WR DUP/HP及wtVACV ACAM2000兩者之經分離基因組DNA用Bsa I及Hind III消化。由於scVACV ACAM2000基因組中之大部分Bsa I位點已靜默地突變，因此在BsaI 消化之後觀測到大部分完整的約200 kbp片段(圖 17 ，泳道8及泳道9)。此不同於wtVACV ACAM2000及wtVACV WR對照(VAC_WRΔJ2R)基因組，當用Bsa I處理時，該等基因組已經充分消化(圖 17 ，泳道6及泳道7)。為確認scVACV ACAM2000-WR DUP/HP基因組仍可用另一種酶消化，用Hind III消化此等基因組，其產生來自scVACV ACAM2000 WR DUP/HP純系之眾多條帶(圖 17 ，泳道12及泳道13)。為確認70bp串聯重複元素於ITR區域內之存在，用Not I及Pvu I消化基因組DNA (圖 17 ，泳道14至泳道17)。

在wtVACV WR對照(VAC_WRΔJ2R)樣品中，偵測到約3.6 kbp之條帶(用星號標記)，其涵蓋VAC之WR病毒株中之所有70 bp串聯重複。鑒於VACV WR病毒株用作設計ITR重複元素之合成的模板，因此期望在經Not I/Pvu I處理之scVACV ACAM2000-WR/HP純系中偵測到一些條帶，其大小與病毒株WR中見到的幾乎相同。當比較兩個scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系，在此區域之大小方面觀測到差異，從而表明並非所有70 bp重複併入各重構築基因組中(圖 17 ，泳道16及泳道17)。鑒於其他已展示此等重複元素可在細胞培養物中在選擇性壓力下擴增及收縮，因此此並非出人意料的(Paez及Esteban 1988)。

總體而言，scVACV-WR DUP/HP ACAM2000 YFP-gpt::105基因組之活體外分析表明由化學合成之DNA片段再活化VACV-WR DUP/HP ACAM2000係成功的且scVACV-WR DUP/HP ACAM2000病毒如同wtVACV ACAM2000病毒活體外表現。 藉由全基因組序列分析確認 scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105 基因組序列

將兩個scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系及兩個scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP純系定序。使用具有35或61之字長的CLC基因組學工作台(版本11)重新組裝Illumina讀數。接著經組裝片段重疊組(contig)導入Snapgene軟體中且基於由GeneArt提供之合成片段接合至預期scACAM2000序列之參考序列上。

對於scVACV ACAM2000-WR DUP/HP之純系1，片段重疊組1為16,317 bp，且對應於大部分ITR區域(除串聯重複序列以外)。片段重疊組2為167,020 bp，且與基因組之中心保守區域(核苷酸位置19,467至186,486)對齊。對於scVACV ACAM2000-WR DUP/HP之純系2，片段重疊組3為16,322 bp，且對應於大部分ITR區域(除串聯重複序列以外)。片段重疊組1為167,020 bp，且與基因組之中心保守區域(核苷酸位置19,467至186,486)對齊。在純系2之片段重疊組之核苷酸位置136791處存在單核苷酸取代(C至A)。此對應於scACAM2000基因組序列中之核苷酸位置156,256且在VAC_ACAM2000_177 (A41L)中自Asp至Tyr產生胺基酸變化。

對於scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP之純系1，片段重疊組1為167,020 bp，且與基因組之中心保守區域(核苷酸位置19,469至186,488)對齊。片段重疊組2為16,150 bp且對應於大部分ITR區域(除串聯重複序列以外)。當此片段重疊組映射至Snap基因中之參考基因組時，在位置2633至3417處及核苷酸位置15,175至15220處觀測到序列之間隙。第一間隙區域對應於54bp重複區域且最可能係由於不能使用重新組裝工具精確地組裝此等區域。將原始Illumina讀數直接地映射至參考基因組並不在任一區域內產生任何間隙。對於scVACV ACAM2000-ACAM2000DUP/HP之純系2，片段重疊組1為16,075 bp，且對應於大部分ITR區域(除串聯重複序列以外)。片段重疊組2為167,078 bp，且與基因組之中心保守區域(核苷酸位置19,469至186,546)對齊。在來自核苷酸位置15,176至15,220之片段重疊組2中觀測到間隙。然而，將原始Illumina讀數直接地映射至參考基因組並不在此區域內產生任何間隙。無scVACV A CAM2000-ACAM2000 DUP/HP之經定序純系在基因組內之任何位置處展現任何其他核苷酸突變。

Illumina讀數亦映射至CLC基因組學中之參考圖譜。Illumina讀數覆蓋對於scVACV ACAM2000-WR DUP/HP之純系1及2分別具有1925及2533之平均覆蓋度，以及對於scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP之純系1及2分別具有2195及1602之平均覆蓋度的全長參考序列。

總體而言，定序資料證實活體外基因組分析資料且確認scVACV ACAM20000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP在經SFV感染之細胞中成功地再活化。 YFP/gpt 選擇標記物之移除

在再活化scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105之後，可移除胸苷激酶基因座中之yfp/gpt選擇標記物。實例 3. 裝載有合成嵌合痘病毒之人類間質幹細胞 (MSC)

原生人類MSC自健康供體之骨髓分離、培養且如Apel A等人, Exp Cell Res 2009;315:498-507中所描述表徵。

人類MSC感染有合成嵌合痘病毒，諸如scHPXV、scVACV ACAM2000-WR DUP/HP或scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP。細胞在37℃下在無血清培養基中感染2小時同時持續旋轉以防止細胞靜置。細胞以2或4之感染倍率(MOI)經感染。在培育後，MSC逐漸集結且移除上清液。細胞經接種且使其在37℃下培育48小時。藉由流式細胞量測術測定感染細胞之百分比。

藉由使用特異性高度或中間增殖細胞株或活體內測定裝載有合成嵌合痘病毒的MSC之溶瘤活性。實例 4. 裝載有合成嵌合痘病毒之脂肪衍生之幹細胞 (ADSC)

脂肪組織為理想間質幹細胞之來源。人類脂肪組織作為門診臨床中之脂肪活檢體獲自健康供體。在切開筋膜之前，切除2立方公分之皮下脂肪。藉由手術解剖刀絞碎脂肪組織且在37℃下在0.075%膠原蛋白酶I型(Worthington Biochemical, Lakewood, NJ)中培育90 min。經消化組織在400 g下離心5 min，在PBS中洗滌丸粒，穿過70 μm細胞過濾器(BD Biosciences, San Jose, CA)且在紅細胞裂解緩衝液(154 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA)中培育。細胞在37℃ 5% CO₂ 培育箱中以1.0-2.5 × 10³ 個細胞/平方公分之濃度在具有5% PLTmax (Mill Creek Life Sciences, Rochester, MN)、100 U/ml青黴素、100 g/ml鏈黴素及2 mM L-麩醯胺酸(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)之高級MEM中在T-175 cm2燒瓶中生長3-4天。當細胞為60-80%融合時，其使用TrypLE (胰蛋白酶類酶，Invitrogen)繼代。

細胞以等分試樣冷凍於液氮並儲存直至使用。

ADSC感染有合成嵌合痘病毒，諸如scHPXV、scVACV ACAM2000-WR DUP/HP或scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP。細胞在37℃下在無血清培養基中感染2小時同時持續旋轉以防止細胞靜置。細胞以2或4之感染倍率(MOI)經感染。在培育後，ADSC逐漸集結且移除上清液。細胞經接種且使其在37℃下培育48小時。藉由流式細胞量測術測定感染細胞之百分比。

藉由使用特異性高度或中間增殖細胞株或活體內測定裝載有合成嵌合痘病毒之ADSC之溶瘤活性。

本專利申請案含有至少一幅彩色繪圖。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色繪圖的本專利申請案之複本。

當結合隨附圖式閱讀時，將更好地理解本發明之前述發明內容以及以下實施方式。出於說明本發明之各種態樣之目的，在圖式中展示當前較佳的實施例。然而，應理解本發明並不限於所示精確配置及手段。

圖 1A 及圖 1B .直鏈dsDNA HPXV基因組(病毒株MNR；Genbank寄存號DQ792504)之示意圖。A. 圖 1A 說明具有所指示個別HPXV基因(紫色)及天然存在之Aar I及Bsa I位點的HPXV基因組之未經修飾基因組序列。B. 圖 1B 描繪使用重疊基因組DNA片段(以紅色展示)化學上合成的經修飾合成嵌合HPXV (scHPXV)基因組。亦展示用於將VACV末端髮夾環接合至ITR上之經工程改造Sap I限制性位點，以及左ITR片段及右ITR片段中的未經修飾Bsa I位點。Sap I位點分別位於緊靠左反向末端重複序列(Left Inverted Terminal Repeat，LITR)及右反向末端重複序列(Right Inverted Terminal Repeat，RITR)之左端及右端的質體載體位點。

圖 2A 至 圖 2C .經修飾scHPXV YFP-gpt::095基因組及VACV (WR病毒株)末端髮夾環之詳細示意圖。A. 圖 2A 描繪經修飾scHPXV YFP-gpt::095基因組。未經修飾Bsa I位點在基因組上展示為藍線。亦標記在HPXV044 (VACV F4L同源物)中形成之新穎Ava I及Stu I限制性位點(綠線)。亦展示可選標記黃色螢光蛋白/鳥苷磷酸核糖基轉移酶(yfp/gpt)在Frag_3之HPXV095基因座(VACV J2R同源物)中之位置(黃色)。B. 圖 2B 描繪末端髮夾環之S (SEQ ID NO: 11)及F (SEQ ID NO: 12)形式之核苷酸序列，且顏色編碼解釋於(C)中。C. 圖 2C 描繪共價連接至VACV之直鏈dsDNA基因組之末端端部的末端髮夾環之F形式及S形式(分別為SEQ ID NO 12及11)之二級結構預測。末端環序列以綠色突出展示。多聯體解析度序列以紅色框起來。

圖 3. 約70bp VACV末端髮夾接合至左及右HPXV ITR片段。圖3描述將約70bp末端髮夾接合至由Sap I切割之1472bp ITR片段後的左及右ITR片段之瓊脂糖凝膠電泳。隨後藉由Pvu II切割經接合DNA以有助於偵測由添加髮夾所引起的大小之較小變化。

圖 4A 至圖 4B .scHPXV YFP-gpt::095基因組之PCR分析及限制性消化證實scHPXV YFP-gpt::095之成功再活化。A. 圖 4A 描述VACV-WR及scHPXV YFP-gpt::095基因組DNA之脈衝場凝膠電泳(PFGE)。病毒DNA經Bsa I、Hind III消化或保持未經處理，且接著在14℃下以5.7V/cm以及1至10秒之切換時間在1% Seakem金瓊脂糖凝膠上分離14 h。觀測到完整VACV與scHPXV YFP-gpt::095基因組之間的大小之微小差異。用星號(*)標記之模糊帶為不完整DNA消化產物或可為通常污染VACV病毒粒子製劑的切割線粒體DNA片段。B. 圖 4B 描繪經BsaI 或HindIII 消化之VACV-WR及scHPXV YFP-gpt::095基因組DNA之習知瓊脂糖凝膠電泳。藉由用SybrGold DNA染色劑染色凝膠觀測到DNA片段。

圖 5A 至圖 5C .scHPXV YFP-gpt::095區域96,050至96,500中之Bsa I位點正確地突變。圖 5A 描繪映射至HPXV (DQ792504)基因組之一個區域的Illumina序列讀數。僅展示小部分讀數。位置96,239及位置96437處之定序讀數之衝突分別以藍色及黃色突出展示。圖 5B 描繪來自映射至靠近位置96239之HPXV (DQ792504)之scHPXV YFP-gpt::095之Illumina定序讀數的放大倍數。偵測到核苷酸取代(T96239C) (指表2)。圖式按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 68-70、69、71、72、69、73-76、69、77-79、69、69、80、81、69、82、69、83、69、84、69、84、85、69、69、86、69、69、87、69、69、69、69、88、69、69、69、89及90。圖 5C 描繪來自映射至位置96437處之HPXV (DQ792504)之scHPXV YFP-gpt::095之Illumina定序讀數的放大倍數。偵測到核苷酸取代(A96437C) (參照表2)。將此等突變引入用於組裝scHPXV YFP-gpt::095之純系中，從而使非所需BsaI 識別位點(GGTCTC)缺失。圖式按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 91-94、92、95、92、92、92、96、92、97、98、92、92、92、92、92、99-101、92、102、103、92、104-109、92、110、92、92、111、103、112、92、113、114、92、92、115及116。

圖 6A 至圖 6C .ScHPXV YFP-gpt::095如其他正痘病毒一樣生長，但在BSC-40細胞中展現較小斑表現型。A.圖 6A 說明VACV-WR、DPP15、CPXV及scHPXV YFP-gpt::095在BSC-40 (左上圖)、HeLa (中上圖)、原生HEL (右上圖)及Vero (左下圖)細胞株中之多步驟生長。B. 圖 6B 說明VACV-WR、DPP15、CPXV與scHPXV YFP-gpt::095之間的斑大小比較。BSC-40細胞感染有所指示病毒且在感染後48 h，固定且染色細胞。針對各病毒量測歷經三個獨立實驗之24個斑之面積(以任意單位[A.U.]計)。資料表示為平均斑直徑。**，P ＜ 0.01；****，P ＜ 0.0001。C. 圖 6C 描繪感染有所指示病毒72 h的BSC-40細胞之斑形態。固定、染色及掃描細胞以用於觀測。

圖 7 .向小鼠投與多種組合物及劑量之後隨時間推移的體重損失%之圖式。所描繪資料由5個雌性BALB/c小鼠群產生，該等小鼠接種有所指示劑量之scHPXV YFP-gpt::095 (亦稱為scHPXV(ΔHPXV_095/J2R)或scHPXV (yfp/gpt))、scHPXV (wt)、Dryvax DPP15或含VACV WR之10 µl PBS。每天對小鼠進行稱重持續28天，且對損失＞25%其初始體重之任何小鼠實施安樂死。資料點代表平均得分，且誤差條代表標準差。

圖 8A 及圖 8B .向小鼠投與多種組合物及劑量之後隨時間推移的體重損失%之圖式。所描繪資料由先前接種(圖10)且接著藉由致死性劑量之VACV WR (10⁶ 個PFU)經鼻內攻擊的小鼠產生。圖 8A 展示體重變化，且圖 8B 展示每天記錄持續13天的小鼠的臨床得分。對損失＞25%其初始體重之任何小鼠實施安樂死。基於皮毛色毛躁外觀(appearance of ruffled fur)、駝背姿勢、呼吸困難及活動性下降而對小鼠指配臨床得分。資料點表示體重或得分之平均差，且誤差條表示標準差。†指示在給定日死於VACV感染的小鼠之數目。

圖 9 .向小鼠投與多種組合物及劑量之後隨時間推移的存活率%之圖式。所描繪資料由先前接種(圖7)且接著經鼻內由致死性劑量之VACV WR (10⁶ 個PFU)攻擊的小鼠產生。圖 9 展示經致死劑量之VACV WR (10⁶ 個PFU)經鼻內攻擊的小鼠之存活率曲線。†指示在指定日死於VACV感染的小鼠之數目。

圖 10A 及圖 10B .VACV-HPXV 雜交病毒之特徵。 圖 10A .HPXV插入VACV病毒株WR中。病毒基因組使用Illumina平台定序、組裝且LAGAN及「Base-by-Base」軟體用於比對及產生所展示之映射。VACV序列(白色)已經HPXV序列置換之位置係根據不同經顏色編碼。圖 10B . 用於鑑別雜交及再活化病毒的基於PCR之篩選方法。在PCR擴增之後，產物經Bsa I消化以區分VACV序列(切割)與HPXV (未切割)。VACV/HPXV雜交體展現Bsa I敏感性及抗性位點之混合，而再活化scHPXV YFP-gpt::095純系為完全Bsa I抗性的。

圖 11A 至圖 11C.scHPXV 對比於 scHPXV YFP-gpt::095 之 生長特性 。圖 11A .斑大小量測。同源重組用於藉由胸苷激酶基因序列置換scHPXV YFP-gpt::095中之YFP-gpt基因座。此產生具有HPXV基因(scHPXV)之完整野生型補體的病毒。BSC-40細胞感染有所指示病毒且培養三天。培養皿經染色且使用掃描數位影像來量測斑面積。統計上顯顯著差異(****P ＜ 0.0001)。圖 11B .斑影像。圖 11C .培養物中之多步驟病毒生長。所指示細胞株以0.01感染倍率感染有scHPXV或scHPXV YFP-gpt::095，在所指示時間處採集病毒，且一式三份地滴定於BSC-40細胞上。在此等活體外分析中未偵測到此等病毒生長之顯著差異。

圖 12 .直鏈dsDNA VACV基因組病毒株ACAM2000；Genbank寄存號AY313847之示意圖。圖 12 描繪用於化學合成較大dsDNA片段之經修飾VACV ACAM2000基因組。重疊scVACV ACAM2000基因組片段以藍色描繪。亦展示未在左側反向末端重複(LITR)及右側反向末端重複(RITR)中靜默突變之經工程改造Bsa I限制位點。

圖 13A 至圖 13C .(A) VACV WR病毒株及(B) VACV ACAM2000之所公佈基因組之第一約1500-3000 bp之詳細示意圖。串聯重複區域以紅色(70 bp重複)框、藍色(125 bp重複)框及綠色(54 bp重複)框清晰地指示。亦在基因組中之每一者中指示對應於基因C23L之ORF。(C) 含有VACV WR中之70 bp重複序列的直接重複區域之示意圖。此序列經合成以含有5'末端處之Sap I限制位點及3'末端處之Nhe I限制位點，以分別接合髮夾/雙螺旋片段及VACV ACAM2000 ITR片段。

圖 14 .將牛痘病毒末端髮夾環與第一70 bp重複序列之雙螺旋DNA組裝。描繪雙螺旋DNA (泳道2)及髮夾DNA單獨(泳道3)及接合後(泳道4)之凝膠電泳。接合產物(箭頭)隨後自凝膠切除且純化，使得其可接合至70 bp重複序列以模擬wtVACV ACAM2000序列之序列。

圖 15 .活體外scVACV ACAM2000-WR DUP/HP之生長特性。在猴腎臟上皮細胞(BSC-40)中量測多步驟生長動力學。細胞以感染倍率0.03經感染，在所指示時間處採集病毒，且將病毒滴定在BSC-40細胞上。資料代表三個獨立實驗。誤差條指示平均值之標準誤差(SEM)。

圖 16 .相較於其中YFP-gpt標記物已經J2R基因序列(VAC_WRΔJ2R)及wtVACV ACAM2000置換之scVACV ACAM2000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP，活體外scVACV ACAM2000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP之生長特性。在猴腎臟上皮細胞(BSC-40)中量測多步驟生長動力學。細胞以感染倍率0.03經感染，在所指示時間處採集病毒，且將病毒滴定在BSC-40細胞上。誤差條指示平均值之標準誤差(SEM)。

圖 17 .再活化scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系之限制性核酸內切酶映射。脈衝場凝膠電泳分析。兩個單獨scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系加VACV WR對照(其中YFP-gpt標記物已經J2R基因序列(VAC_WRΔJ2R)置換)及wtVACV ACAM2000對照(VAC_ACAM2000)經純化且接著保持不消化，或經Bsa I、Hind III或Not I及Pvu I消化。scVACV ACAM2000純系中之近似全部Bsa I位點之所預期缺失為明顯的。觀測到經Hind III消化之scVACV ACAM2000基因組DNA相較於VACV_WRΔJ2R及VACV_ACAM2000之較小差異。經Not I及Pvu I消化之基因組DNA切割在左及右ITR序列處發現的70 bp串聯重複片段。在VACV_WRΔJ2R中，約70 bp重複之大小接近3.6 kbp。引起關注地，在兩個單獨scVACV ACAM2000純系中，觀測到對應於70 bp串聯重複之兩個不同大小的條帶(藉由*標記)，即使全長70 bp串聯重複元素接合至ITR片段。當ACAM2000基因組DNA經Not I及Pvu I消化時，觀測到約4.7 kbp之條帶，其可指示ACAM2000中之70bp重複之大小。

Claims (39)

1. 一種經分離之幹細胞或其群體，其包含合成嵌合痘病毒(scPV)，其中該病毒由源自合成DNA之DNA複製且再活化，該病毒之病毒基因組與該病毒之野生型基因組不同之特徵在於一或多個修飾。
2. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中該痘病毒為正痘病毒(orthopoxvirus)。
3. 如請求項2之經分離之幹細胞或其群體，其中該正痘病毒係選自：駱駝痘病毒(camelpox virus，CMLV)、牛痘病毒(cowpox virus，CPXV)、鼠痘病毒(ectromelia virus，ECTV)、馬痘病毒(horsepox virus，HPXV)、猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)、兔痘病毒(rabbitpox virus，RPXV)、浣熊痘病毒(raccoonpox virus)、臭鼬痘病毒(skunkpox virus)、沙鼠痘病毒(Taterapox virus)、瓦森伊修病病毒(Uasin Gishu disease virus)、牛痘病毒(vaccinia virus，VACV)、天花病毒(variola virus，VARV)或田鼠痘病毒(volepox virus，VPV)。
4. 如請求項3之經分離之幹細胞或其群體，其中該牛痘病毒株係選自：Western Reserve、純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、絨毛膜尿囊牛痘病毒安卡拉株(Chorioallantois Vaccinia virus Ankara，CVA)、經修飾牛痘病毒安卡拉株(Modified vaccinia Ankara，MVA)，以及MVA-BN。
5. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其為非癌症幹細胞。
6. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其為人類細胞。
7. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其選自間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)、神經元幹細胞、血管幹細胞、表皮幹細胞或經誘導多能幹細胞。
8. 如請求項7之經分離之幹細胞或其群體，其中該MSC源自骨髓、臍帶血或脂肪組織。
9. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其選自自體或同種異體細胞。
10. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中該一或多個修飾包含一或多個缺失、插入、取代，或其組合。
11. 如請求項10之經分離之幹細胞或其群體，其中該一或多個修飾包含一或多個引入或缺失一或多個獨特限制位點之修飾。
12. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中該病毒基因組包含異源末端髮夾環。
13. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中該病毒基因組包含源自牛痘病毒(VACV)之末端髮夾環。
14. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中該scPV之病毒基因組包含同源或異源末端髮夾環，且其中該等串聯重複區域包含與該wtPV不同數目的重複。
15. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中該等左及右末端髮夾環a)分別包含該等牛痘病毒末端髮夾環之緩慢形式及快速形式，b)分別包含該等牛痘病毒末端髮夾環之快速形式及緩慢形式，c)均包含該等牛痘病毒末端髮夾環之緩慢形式，或d)均包含該等牛痘病毒末端環之快速形式。
16. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中該病毒由對應於實質上所有該scPV之病毒基因組的重疊化學合成DNA片段複製且再活化。
17. 如請求項1之經分離之幹細胞或其群體，其中使用兔痘病毒(leporipox virus)催化之重組及再活化而再活化該病毒。
18. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至17中任一項之經分離之幹細胞或其群體，及醫藥學上可接受之載劑。
19. 如請求項18之醫藥組合物，其中該scPV不活化。
20. 如請求項19之醫藥組合物，其中藉由加熱、UV或福馬林執行該不活化。
21. 一種用於將scPV遞送至個體之方法，其包含以該scPV感染如請求項1至17中任一項之幹細胞或其群體且將該等經scPV感染之幹細胞投與至該個體中。
22. 一種如請求項1至17中任一項之幹細胞或其群體或如請求項18至20中任一項之醫藥組合物製造藥劑之用途，其中該藥劑用於治療或預防個體之癌症。
23. 如請求項22之用途，其中以單次投與或多次投與來投與該等幹細胞或其群體或該醫藥組合物。
24. 如請求項22之用途，其中該等幹細胞或其群體或該醫藥組合物係經靜脈內、動脈內、瘤內、經內視鏡、病灶內、肌肉內、皮內、腹膜內、囊泡內、關節內、胸膜內、經皮、皮下、經口、非經腸、經鼻內、氣管內、藉由吸入、顱內、前列腺內、玻璃體內、經眼、經陰道、冠狀動脈內、心肌內、經心內膜、經心外膜、脊椎內、紋狀體內、透皮、經直腸或經表皮下投與。
25. 如請求項21之方法，其中該病毒編碼治療性基因產物。
26. 如請求項25之方法，其中該治療性基因產物為抗癌劑或抗血管生成劑。
27. 如請求項25之方法，其中該治療性基因產物係選自：細胞介素、趨化介素、免疫調節分子、抗原、抗體或其片段、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、血管生成抑制劑、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、轉運體蛋白及組織因子。
28. 如請求項21之方法，其中該scPV含有基因缺失。
29. 如請求項28之方法，其中該缺失基因選自編碼蛋白質或其片段之基因、調節轉錄之基因區段、調節病毒複製之基因區段、影響細胞有絲分裂之基因區段、影響細胞代謝之基因區段、編碼反義RNA之基因區段、編碼siRNA之基因區段、調節血管生成之基因區段、調節一或多個轉運體蛋白質基因區段，或調節一或多個組織因子之基因區段。
30. 如請求項28之方法，其中該基因缺失增強該病毒之抗癌或抗血管生成效果。
31. 如請求項22之用途，其中該病毒編碼治療性基因產物。
32. 如請求項31之用途，其中該治療性基因產物為抗癌劑或抗血管生成劑。
33. 如請求項31之用途，其中該治療性基因產物係選自：細胞介素、趨化介素、免疫調節分子、抗原、抗體或其片段、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、血管生成抑制劑、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、轉運體蛋白或組織因子。
34. 如請求項22之用途，其中該scPV含有基因缺失。
35. 如請求項34之用途，其中該缺失基因選自編碼蛋白質或其片段之基因、調節轉錄之基因區段、調節病毒複製之基因區段、影響細胞有絲分裂之基因區段、影響細胞代謝之基因區段、編碼反義RNA之基因區段、編碼siRNA之基因區段、調節血管生成之基因區段、調節一或多個轉運體蛋白之基因區段，或調節一或多個組織因子之基因區段。
36. 如請求項34之用途，其中該基因缺失增強該病毒之抗癌或抗血管生成效果。
37. 一種如請求項1至17中任一項之幹細胞或其群體或如請求項18至20中任一項之醫藥組合物製造藥劑之用途，其中該藥劑用於治療天花病毒感染。
38. 如請求項37之用途，其中以單次投與或多次投與來投與該等幹細胞或其群體或該醫藥組合物。
39. 如請求項37之用途，其中該等幹細胞或其群體或該醫藥組合物係經靜脈內、動脈內、瘤內、經內視鏡、病灶內、肌肉內、皮內、腹膜內、囊泡內、關節內、胸膜內、經皮、皮下、經口、非經腸、經鼻內、氣管內、藉由吸入、顱內、前列腺內、玻璃體內、經眼、經陰道、冠狀動脈內、心肌內、經心內膜、經心外膜、脊椎內、紋狀體內、透皮、經直腸或經表皮下投與。

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