TW202003555A - 用於純化重組多肽之方法 - Google Patents

Abstract

本發明是有關於一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點DKTHTCPP(SEQ ID NO：50)；該方法包含：(a)將包含該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以包含辛酸鹽與精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。亦提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法。

Description

用於純化重組多肽之方法 相關申請案的交叉引用

本申請案請求於2018年3月7日提申之美國申請案序號62/639,541之優先權。先前申請案的揭示內容被認為是本申請案之揭示內容的一部分(並且以引用的方式併入其中)。

序列表

本申請案含有序列表，序列表已呈ASCII格式以電子的方式呈交並且以全文引用的方式併入。在2019年2月11日產生的該份ASCII抄本被命名為PU66536 WO Seq Listing.txt且大小為11,606位元組。

本發明是有關於使用固定於固體撐體上之超級抗原(諸如蛋白A、蛋白G或蛋白L)的蛋白質純化的領域。具體而言，本發明是有關於洗滌緩衝液組份，以及在洗滌步驟期間使用該洗滌緩衝液來移除宿主細胞雜質之方法，使得所需蛋白質產物的損失降至最低。

在生物製藥下游步驟中，必須將依據FDA被分類為「製程相關」雜質的宿主細胞蛋白(HCP)雜質移除達到夠低的程度。在典型下游步驟期間，適當清除HCP對於一些單株抗體(mAb)產物來說可能特別有挑戰。大多數mAb下游步驟採用「平台」法；典型mAb下游平台是由蛋白A親和力層析捕捉，接著是一至三個非親和力精煉步驟。蛋白A親和力補捉步驟是平 台的主力，並提供大部份的HCP清除。後續的精煉步驟通常是離子交換、疏水性交互作用及/或多模式層析。

對於許多mAb產品來說，在第一個精煉層析步驟之後的HCP濃度是夠低的。但是，有特別要施行第二個精煉層析步驟以移除額外HCP的mAb；這可能需要明顯的程序開發努力並且導致更高的步驟複雜度。先前研究已鑑定出一個HPC雜質子群，其與mAb產物分子有引人注意的交互作用(Levy et al.,(2014)Biotechnol.Bioeng.111(5)：904-912；Aboulaich et al.,(2014)Biotechnol.Prog.30(5)：1114-1124)。大多數避開透過蛋白A步驟清除的HCP是與產物有關而非析出或吸附至蛋白A配體或基礎基質。與細胞培養物中所存在的各種HCP群相比，難以移除之HCP群相對小，且對於不同mAb產物來說都是相似的。

儘管就所有mAb產物來說，困難的HCP雜質群大部分都相同，但是不同程度的HCP-mAb交互作用可能會明顯影響HCP跨過蛋白A步驟的整體清除；mAb產物的胺基酸序列非常些微改變可能蛋白A與精煉步驟中衝擊到HCP-mAb交互作用。被充填至蛋白A管柱上的HCP群(其明顯影響到HCP-mAb締合的可能性)可能受到細胞年齡、收穫方法學以及條件所影響，還有在不同宿主細胞株之間觀察到少量差異。除了產品締合以外，對於大多數的蛋白A樹脂而言，存在著結合至基礎基質並且與產物一起共析出的低含量HCP雜質。可控孔徑玻璃樹脂有更高含量的HCP結合至基礎基質。

先前已鑑定出一種特有洗滌添加物辛酸鈉(sodium caprylate)是最為成功瓦解HCP-mAb締合並且在蛋白A析出液中產生低HCP濃度之一種添加物。辛酸鈉(也被稱為辛酸鈉(sodium octanoate))是一種八碳飽和脂肪酸，被發現到在大約360mM的關鍵微胞濃度下於小鼠體內是無毒性的。先前研究已使用50mM辛酸鈉(Aboulaich et al.,(2014)Biotechnol.Prog. 30(5)：1114-1124)、具有不同NaCl與pH的40mM辛酸鈉(Chollangi et al.,(2015)Biotechnol.Bioeng.112(11)：2292-2304)，以及至多80mM辛酸鈉(Herzer et al.,(2015)Biotechnol.Bioeng.112(7)：1417-1428)供增進HCP清除之用，而具有高pH與NaCl的50mM辛酸鈉則是供HCP整體清除以及移除蛋白分解HCP雜質之用(Bee et al.,(2015)Biotechnol.Prog.31(5)：1360-1369)。專利申請案先前已針對含有多達100mM辛酸鈉的蛋白A洗滌液提出申請(WO2014/141150；WO2014/186350)。此外，辛酸在蛋白A不或步驟之前與之後已被用來沉澱宿主細胞蛋白雜質(Brodsky et al.,(2012)Biotechnol.Bioeng.109(10)：2589-2598；Zheng et al.,(2015)Biotechnol.Prog.31(6)：1515-1525；Herzer et al.,(2015)Biotechnol.Bioeng.112(7)：1417-1428)。

提供由宿主細胞蛋白純化蛋白例如IgG1抗體之改良方法的需求存在於此技藝中。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含細胞自溶酶(cathepsin)L裂解位點(例如，其包含胺基酸序列DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))；該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有大於約50mM辛酸鹽與大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約75mM至約300mM辛酸鹽(例如，約75mM至約250mM、約75mM至約200mM、約100mM至約250 mM、約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM，或約300mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約200mM辛酸鹽(例如約100mM、約150mM，或約200mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.7M至約1.5M精胺酸(例如，約0.8M至約1.4M、約0.8M至約1.3M、約0.9M至約1.2M、約0.7M、約0.75M、約1M、約1.1M或約1.5M精胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.75M至約1.5M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液進一步包含約0.5M至約1M離胺酸(例如，約0.75M離胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris 鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，經析出重組多肽含有少於約2%片段化重組多肽。

在一些具體例中，HCP是衍生自哺乳動物細胞。

在一些具體例中，HCP為細胞自溶酶L。

在一些具體例中，重組多肽從細胞自溶酶L的純化是透過在步驟(c)的析出液中細胞自溶酶L活性降低所量測。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，重組多肽為單株抗體(mAb)。在一些具體例中，mAb為IgG1。

在一些具體例中，重組多肽為抗-OX40抗原結合多肽。

在一些具體例中，重組多肽包含：包含與SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含與SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及/或包含與SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3。

在一些具體例中，重組多肽包含包含與SEQ ID NO：7中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含與SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列具有至少至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及/或包含與SEQ ID NO：9中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在一些具體例中，重組多肽包含：(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在一些具體例中，重組多肽包含含有與SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區(「VL」)。

在一些具體例中，重組多肽包含含有與SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區(「VH」)。

在一些具體例中，重組多肽包含含有與SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區(「VL」)；並且包含含有與SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區(「VH」)。

在一些具體例中，重組多肽包含含有SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列的重鏈可變區以及含有SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一些具體例中，重組多肽包含含有與SEQ ID NO：48中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈；並且含有與SEQ ID NO：49中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈。

在一些具體例中，重組多肽包含SEQ ID NO：48中所示胺基酸序列的重鏈以及SEQ ID NO：49中所示胺基酸序列的輕鏈。

在一些具體例中，洗滌緩衝液不含有氯化鈉。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，HCP之量於步驟(c)之後少於約200ng HCP/mg產物。

在一些具體例中，該方法進一步包含(d)將析出液施加至陽離子交換層析管柱，以及(e)將抗-OX40抗原結合多肽從陽離子交換層析管柱析出，從而製備第二析出液。在一些具體例中，相較於在步驟(b)中以含有辛酸鹽(例如100mM辛酸鹽)以及無精胺酸之洗滌緩衝液的第二析出液中所觀 察到的片段化比率，抗-OX40抗原結合蛋白在第二析出液中的片段化比率降低達例如0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍(例如，如本文所述在十天內於25℃儲存下所量測)。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點DKTHTCPP(SEQ ID NO：50)；該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以含有大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以含有大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約75mM至約300mM辛酸鹽(例如，約75mM至約250mM、約75mM至約200mM、約100M至約250mM、約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM，或約300mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約200mM辛酸鹽(例如，約100mM、約150mM，或約200mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.7M至約1.5M精胺酸(例如，約0.8M至約1.4M、約0.8M至約1.3M、約0.9M至約1.2M、約0.7M、約0.75M、約1M、約1.1M或約1.5M精胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.75M至約1.5M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液進一步包含約0.5M至約1M離胺酸(例如，約0.75M離胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，經析出重組多肽含有少於約2%片段化重組多肽。

在一些具體例中，HCP是衍生自哺乳動物細胞。

在一些具體例中，HCP為細胞自溶酶L。

在一些具體例中，重組多肽從細胞自溶酶L的純化是透過在步驟(c)的析出液中細胞自溶酶L活性降低所量測。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，重組多肽為單株抗體(mAb)。在一些具體例中，mAb為IgG1。

在一些具體例中，重組多肽為抗-OX40抗原結合多肽。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點DKTHTCPP(SEQ ID NO：50)；該方法包含(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以含有大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以含有大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約75mM至約300mM辛酸鹽(例如，約75mM至約250mM、約75mM至約200mM、約100mM至約250mM、約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM，或約300mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約200mM辛酸鹽(例如約100mM、約150mM，或約200mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.7M至約1.5M精胺酸(例如，約0.8M至約1.4M、約0.8M至約1.3M、約0.9M至約1.2M、約0.7M、約0.75M、約1M、約1.1M或約1.5M精胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.75M至約1.5M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液進一步包含約0.5M至約1M離胺酸(例如，約0.75M離胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，經析出重組多肽含有少於約2%片段化重組多肽。

在一些具體例中，HCP是衍生自哺乳動物細胞。

在一些具體例中，HCP為細胞自溶酶L。

在一些具體例中，重組多肽從細胞自溶酶L的純化是透過在步驟(c)的析出液中細胞自溶酶L活性降低所量測。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，重組多肽為單株抗體(mAb)。在一些具體例中，mAb為IgG1。

在一些具體例中，重組多肽為抗-OX40抗原結合多肽。

在一些態樣中，本發明提供一種從細胞自溶酶L純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點DKTHTCPP(SEQ ID NO：50)；該方法包含：(a)將含有該重組多肽與細胞自溶酶L的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有約150mM辛酸鹽與約1.1M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，重組多肽為抗-OX40抗原結合多肽。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點DKTHTCPP(SEQ ID NO：50)；該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有濃度大於約250mM之辛酸 鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，重組多肽為抗-OX40抗原結合多肽。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含：(a)將含有該抗-OX40抗原結合多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有大於約50mM辛酸鹽以及大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約75mM至約300mM辛酸鹽(例如，約75mM至約250mM、約75mM至約200mM、約100mM至約250mM、約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM，或約300mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約200mM辛酸鹽(例如約100mM、約150mM，或約200mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.7M至約1.5M精胺酸(例如，約0.8M至約1.4M、約0.8M至約1.3M、約0.9M至約1.2M、約0.7M、約0.75M、約1.0M、約1.1M或約1.5M精胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.75M至約1.5M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液進一步包含約0.5M至約1M離胺酸(例如，約0.75M離胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，經析出抗-OX40抗原結合多肽含有少於約2%片段化抗-OX40抗原結合多肽。

在一些具體例中，HCP是衍生自哺乳動物細胞。

在一些具體例中，HCP為細胞自溶酶L。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽從細胞自溶酶L的純化是透過在步驟(c)的析出液中細胞自溶酶L活性降低所量測。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為單株抗體(mAb)。在一些具體例中，mAb為IgG1。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含：包含與SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含與SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及/或包含與SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含含有與SEQ ID NO：7中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；含有與SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列具有至少至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及/或含有與SEQ ID NO：9中所示之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含：(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含含有與SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區(「VL」)。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含含有與SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區(「VH」)。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含含有與SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區(「VL」)；並且包含含有與SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈可變區(「VH」)。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含含有SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列的重鏈可變區以及含有SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含含有與SEQ ID NO：48中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的重鏈；以及含有與SEQ ID NO：49中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列的輕鏈。

在一些具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含含有SEQ ID NO：48中所示胺基酸序列的重鏈以及含有SEQ ID NO：49中所示胺基酸序列的輕鏈。

在一些具體例中，洗滌緩衝液不含有氯化鈉。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，HCP之量於步驟(c)之後少於約200ng HCP/mg產物。

在一些具體例中，該方法進一步包含(d)將析出液施加至陽離子交換層析管柱，以及(e)將抗-OX40抗原結合多肽從陽離子交換層析管柱析出，從而製備第二析出液。在一些具體例中，例如如相較於在步驟(b)中以含有辛酸鹽(例如100mM辛酸鹽)以及無精胺酸之洗滌緩衝液的第二析出液中所觀察到的片段化比率(例如如在25℃儲存超過十天所量測，如本文所述)，在第二析出液中抗-OX40抗原結合蛋白的片段化比率降低達0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含(a)將含有該抗-OX40抗原結合多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以含有大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以含有大於約0.5M精 胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約75mM至約300mM辛酸鹽(例如，約75mM至約250mM、約75mM至約200mM、約100mM至約250mM、約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM，或約300mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約200mM辛酸鹽(例如約100mM、約150mM，或約200mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.7M至約1.5M精胺酸(例如，約0.8M至約1.4M、約0.8M至約1.3M、約0.9M至約1.2M、約0.7M、約0.75M、約1M、約1.1M或約1.5M精胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.75M至約1.5M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液進一步包含約0.5M至約1M離胺酸(例如，約0.75M離胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、 約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，經析出重組多肽含有少於約2%片段化重組多肽。

在一些具體例中，HCP是衍生自哺乳動物細胞。

在一些具體例中，HCP為細胞自溶酶L。

在一些具體例中，重組多肽從細胞自溶酶L的純化是透過在步驟(c)的析出液中細胞自溶酶L活性降低所量測。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含(a)將含有該抗-OX40抗原結合多肽 與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以含有大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以含有大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約75mM至約300mM辛酸鹽(例如，約75mM至約250mM、約75mM至約200mM、約100mM至約250mM、約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM，或約300mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約200mM辛酸鹽(例如約100mM、約150mM，或約200mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.7M至約1.5M精胺酸(例如，約0.8M至約1.4M、約0.8M至約1.3M、約0.9M至約1.2M、約0.7M、約0.75M、約1M、約1.1M或約1.5M精胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約0.75M至約1.5M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液進一步包含約0.5M至約1M離胺酸(例如，約0.75M離胺酸)。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，經析出重組多肽含有少於約2%片段化重組多肽。

在一些具體例中，HCP是衍生自哺乳動物細胞。

在一些具體例中，HCP為細胞自溶酶L。

在一些具體例中，重組多肽從細胞自溶酶L的純化是透過在步驟(c)的析出液中細胞自溶酶L活性降低所量測。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些態樣中，本發明提供一種從細胞自溶酶L純化抗-OX40結合多肽之方法，該方法包含(a)將含有該抗-OX40抗原結合多肽與細胞自溶酶L的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b)用含有約150mM辛酸鹽與約1.1M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽，例如從而製備析出液。在一些具體例中，該洗滌緩衝液包含Tris鹼。在一些具體例中，該洗滌緩衝液包含乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，重組多肽從細胞自溶酶L的純化是透過在步驟(c)的析出液中細胞自溶酶L活性降低所量測。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含(a)將含有該抗-OX40抗原結合多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b)以含有濃度大於約250mM之辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽，例如從而製備析出液。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。

在一些具體例中，超級抗原為蛋白A。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些態樣中，本發明提供一種緩衝液(例如洗滌緩衝液，例如供超級抗原(例如蛋白A)層析之洗滌步驟用)，其包含大於約50mM辛酸鹽以及大於約0.5M精胺酸。該洗滌緩衝液可用於本文提供之方法中。

在一些具體例中，辛酸鹽為辛酸鈉。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約75mM至約300mM辛酸鹽(例如，約75mM至約250mM、約75mM至約200mM、約100mM至約250mM、約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM，或約300mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約100mM至約200mM辛酸鹽(例如約100mM、約150mM，或約200mM辛酸鹽)。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約0.7M至約1.5M精胺酸(例如，約0.8M至約1.4M、約0.8M至約1.3M、約0.9M至約1.2M、約0.7M、約0.75M、約1.0M、約1.1M或約1.5M精胺酸)。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約0.75M至約1.5M精胺酸。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)進一步包含約0.5M至約1M離胺酸(例如，約0.75M離胺酸)。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約1.1M精胺酸。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鈉。

在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH介於pH 7至pH 9；介於pH 7至pH 8；或介於pH 7.5至pH 8.5。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含乙酸，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一些具體例中，洗滌緩衝液包含Tris鹼，例如約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一些具體例中，緩衝液(例如洗滌緩衝液)包含約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。在一些具體例中，洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。

在一些態樣中，本發明提供一種蛋白A洗滌緩衝液，其包含：約56.5mM Tris鹼、約45mM乙酸、約150mM辛酸鈉，以及約1.1M精胺酸。 在一些具體例中，蛋白A洗滌緩衝液的pH為pH 7.5。蛋白A洗滌緩衝液可用於本文提供之方法中。

圖1：使用mAb1作為模型，在洗滌液中有不同辛酸鈉濃度的情況下，蛋白A析出液中的百分產率(三角形，▲)以及HCP濃度(正方形，■)。

圖2：針對洗滌緩衝液中的5個辛酸鈉濃度，在析出液、層析條(strip)以及洗滌份中的經充填mAb1百分率。

圖3：於不同辛酸鈉濃度的溶液中，mAb1吸附MabSelect SuRe樹脂的朗謬(Langmuir)等溫線擬合。

圖4：5個mAb以100mM與250mM辛酸鈉洗滌緩衝液的蛋白A析出液HCP濃度。

圖5：mAb2利用含有不同濃度之辛酸鈉與精胺酸的洗滌緩衝液在不同pH下的蛋白A析出液HCP濃度。註解：所有洗滌緩衝液含有300mM乙酸鈉。

圖6：兩個不同mAb1進料流利用含有不同濃度之辛酸鈉與精胺酸的洗滌緩衝液在不同pH下的蛋白A析出液HCP濃度。註解：所有洗滌緩衝液含有300mM乙酸鈉。

圖7：關於含有辛酸鈉以及精胺酸或離胺酸的洗滌液，在mAb3蛋白A析出液中的細胞自溶酶L活性。

圖8：單株抗體處理中間物的抗體片段化百分率。

圖9：僅辛酸相對於辛酸加上精胺酸洗滌緩衝液的HCP濃度。

圖10：單株抗體原料藥在25℃下保持至多10天的抗體片段化百分率。

圖11：在使用特定洗滌液的蛋白A處理之後，CEX精煉之後所量測的細胞自溶酶L活性。實心槓是小規模研究，陰影槓是大規模研究。

應理解本發明並不限於特定方法、試劑、化合物、組成物或生物系統，它們當然可能改變。也應理解，本文使用的術語是僅為了說明特定具體例，且不希望具有限制性。除非上下文另有明確指示，否則如本說明書以及隨附申請專利範圍中所使用，單數型「一(a、an)」與「該(the)」包括複數個指示對象。因此，舉例來說，提到「多肽」包括兩個或更多個多肽的組合，以及類似者。

術語「包含」含括「包括」或「組成」，例如一個「包含」X的組成物可能只由X組成，或有時可能包括額外之物，例如X+Y。術語「大體上由…組成」將特徵的範圍限制於指定材料或步驟還有那些在實質上不影響請求特徵之基本特性者。術語「由…組成」排除了存在有任何額外組份。

「約」如本文所用，當意指可量測之值(諸如數量、短暫持續時間以及類似者)時，表示含括相對於指定值±20%或±10%的變化(包括±5%、±1%以及±0.1%)，因為這些變化對於實施所揭示之方法來說為適宜的。

除非另有指明，否則本文使用的所有技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技術者一般所理解的相同意思。儘管類似或相等於本文所述彼等的任何方法以及材料在實務上可用於測試本發明，本文說明較佳材料以及方法。在說明以及請求本發明時，將使用以下術語。

「多肽」、「肽」以及「蛋白質」在本文中交替用來意指胺基酸殘基的聚合物。多肽可以是天然(組織衍生)來源，由原核或真核細胞製備物 重組或天然表現而來，或經由合成方法以化學方式生產。該等術語適用於胺基酸聚合物)其中一或多個胺基酸殘基是對應天然胺基酸的人工化學擬似物)，也適用於天然胺基酸聚合物以及非天然胺基酸聚合物。胺基酸擬似物意指結構不同於胺基酸的一般化學結構，但功能上類似於天然胺基酸的化學化合物。非天然殘基充分描述於科學以及專利文獻中；可用作為天然胺基酸殘基之擬似物的一些例示性非天然組成物以及指導方針描述於下文。芳香族胺基酸的擬似物可以透過置換成以下而產生：例如D-或L-萘基丙胺酸(naphylalanine)；D-或L-苯基甘胺酸；D-或L-2噻吩基丙胺酸(thieneylalanine)；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙胺酸(pyreneylalanine)；D-或L-3噻吩基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯丙胺酸；D-p-氟-苯丙胺酸；D-或L-p-聯苯苯丙胺酸；K-或L-p-甲氧基-聯苯苯丙胺酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙胺酸；以及D-或L-烷基丙胺酸(alkylainine)，其中烷基可以是經取代或未經取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二異基(sec-isotyl)、異戊基或非酸性胺基酸。非天然胺基酸的芳香環包括，例如噻唑基、硫苯基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基，以及吡啶基芳香環。

「肽」如本文所用包括本文特別例示的那些肽的守恆性變異。「守恆性變異」如本文所用表示胺基酸殘基被另一個在生物學上相似的殘基取代。守恆性變異的實例包括，但不限於一個疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸、正白胺酸或甲硫胺酸)置換成另一者，或者是一個極性殘基置換成另一者，諸如精胺酸置換成離胺酸、麩胺酸置換成天冬胺酸，或麩醯胺酸 置換成天冬醯胺酸，以及類似者。可以被另一者置換的天然親水性胺基酸包括天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸以及硫胺酸。

「守恆性變異」也包括使用經取代胺基酸來取代未經取代之母胺基酸，前提是針對經取代多肽所產生的抗體也會與未經取代多肽免疫交互作用。此等守恆性置換落在本文所述蛋白質類別的定義內。

「陽離子」如本文所用意指任何在pH 7.4下具有淨正電荷的肽。肽的生物活性可以透過那些習於技藝者所熟知以及本文所述的標準方法進行測定。

當就蛋白質(或多肽)來使用時，「重組」象徵蛋白質已透過引入異質性核酸或蛋白質，或改變原有核酸或蛋白質而被修飾，例如以便容許在異源性細胞類型中表現。

如本文所用，「治療性蛋白」意指任一種蛋白質及/或多肽，其可以被投與給哺乳動物以引起例如研究人員或臨床醫師所尋求之組織、系統、動物或人類之生物或醫學反應。治療性蛋白可能引起超過一種生物或醫學反應。此外，術語「治療有效量」表示任一個數量，當與未接受此數量的對應個體相比時，致使(但不限於)治癒、預防或改善疾病、病症或副作用，或減少疾病或病症進展的速度。該術語也包括落在其範圍內且有效提高正常生理功能之量，以及有效引起在患者體內提高第二治療劑之治療效用或有助於第二治療劑之治療效用的生理功能之量。

在本文中所認明的全部「胺基酸」殘基呈天然L-構型。符合標準多肽命名法，胺基酸殘基的縮寫顯示於下表中。

應注意，所有胺基酸殘基序列在本文是以常規表示，其左往右方位是胺基端往羧基端的慣常方向。

純化方法

在一個態樣中，本發明是有關於一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽(例如含有一個細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽)的方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b)以含有辛酸鹽與精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在一個態樣中，本發明是有關於一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽(例如含有一個細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽)的方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b)以含有大於約50mM辛酸鹽與大於 約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在一個態樣中，本發明是有關於一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽(例如含有一個細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽)的方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b)以含有濃度大於250mM之辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在一個態樣中，本發明是有關於一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽(例如含有一個細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽)的方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有約150mM至約850mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在一些態樣中，本發明是有關於一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽(例如含有一個細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽)的方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以含有辛酸鹽的第一洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以含有精胺酸的第二洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在另一個態樣中，本發明是有關於一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽(例如含有一個細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽)的方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以含有精胺酸的第一洗滌緩衝液洗 滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以含有辛酸鹽的第二洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在步驟(a)中將溶液施加(充填)至超級抗原層析固體撐體之後，該重組多肽將被吸附至固定於固體撐體上的超級抗原。HCP雜質接而可以透過使含有吸附重組多肽之固定超級抗原與如本文所述的洗滌緩衝液接觸而被移除。

「超級抗原」意指與免疫球蛋白超家族成員在不同於這些蛋白質之目標配位體結合位點之位點處交互作用的總稱配位體。葡萄球菌腸毒素是超級抗原的實例，其與T細胞受體交互作用。結合抗體的超級抗原包括，但不限於蛋白G，其結合IgG恆定區(Bjorck and Kronvall(1984)J.Immunol.,133：969)；蛋白A，其結合IgG恆定區與VH域(Forsgren and Sjoquist,(1966)J.Immunol.,97：822)；以及蛋白L，其結合VL域(Bjorck,(1988)J.Immunol.,140：1194)。因此，在一個具體例中，超級抗原選自由蛋白A、蛋白G以及蛋白L組成之群。在一個具體例中，超級抗原為蛋白A。

當在本文中使用時，術語「蛋白A」含括自其天然來源(例如，金黃色葡萄球菌的細胞壁)回收而來的蛋白A、合成產生的蛋白A(例如透過肽合成或透過重組技術)，以及其保留結合至具有C_H2/C_H3區之蛋白質的能力的變異體。蛋白A可以在商業上購得，例如由Repligen或Pharmacia。

如本文所用，「親和力層析」是一種層析方法，其利用生物分子之間的特異性可逆交互作用而不是生物分子的一般特性(諸如等電點、疏水性或尺寸)來達到層析分離。「蛋白A親和力層析」或「蛋白A層析」意指一種特異性親和力層析法，其係利用蛋白A之IgG結合域對免疫球蛋白分子之Fc部分的親和力。這個Fc部分包含人類或動物免疫球蛋白恆定域C_H2與C_H3或與其等實質上相似的免疫球蛋白域。實務上，蛋白A層析涉及到使用 固定在一個固體撐體上的蛋白A。參見Gagnon,Protein A Affinity Chromatography,Purification Tools for Monoclonal Antibodies,pp.155-198,Validated Biosystems,(1996)。蛋白G以及蛋白L也可用於親和力層析。固體撐體是一種蛋白A可黏附其上的非水性基質(例如管柱、樹脂、基質、珠粒、凝膠等)。此等撐體包括瓊脂糖、瓊脂精、玻璃、矽石、聚苯乙烯、膠棉碳、沙、聚甲基丙烯酸酯、交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，以及帶有聚葡萄糖表面展劑的瓊脂糖與任何其他適當材料。此等材料為技藝中所熟知。可使用任何適當方法將超級抗原固定至固體撐體。關於將蛋白質固定至適當固體撐體的方法為技藝中所熟知。參見，例如Ostrove,in Guide to Protein Purification,Methods in Enzymology,(1990)182：357-371。帶有或不帶有固定蛋白A或蛋白L的此等固體撐體可容易地由許多商業來源取得，諸如Vector Laboratory(Burlingame,Calif.)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,Calif.)、BioRad(Hercules,Calif.)、Amersham Biosciences(GE Healthcare的一部分，Uppsala,Sweden)與Millipore(Billerica,Mass.)。

本文所述之方法可包含又一或多個純化步驟，諸如又一或多個層析步驟。在一個具體例中，該又一或多個層析步驟選自由以下組成之群：陰離子交換層析、陽離子交換層析以及混合型層析，尤其是陰離子交換層析。

在一個具體例中，該方法另外包含過濾藉由本文所述方法之步驟(c)所產生的析出液。

在一個具體例中，該方法在步驟(c)之後進一步包含下列步驟：(d)用30mM乙酸、100mM HCl滴定含有回收蛋白質的溶液達約pH 3.5；(e)容許步驟(d)的溶液維持在約pH 3.5下歷時約30至約60分鐘；以及(f)用1M Tris 將步驟(e)之溶液的pH調整至約pH 7.5。在一個具體例中，該方法進一步包含過濾由步驟(f)產生的溶液。

在一個具體例中，在步驟(a)中被施加至管柱的重組蛋白量(亦即充填率)為35mg/ml或更低，諸如30mg/ml或更低、20mg/ml或更低、15mg/ml或更低，或10mg/ml或更低。應理解，「充填率」意指每毫升(ml)樹脂的蛋白質(例如單株抗體)毫克。

洗滌緩衝液

「緩衝液」是一種經緩衝的溶液，其透過其酸-鹼共軛組分的作用來抵抗pH變化。「平衡緩衝液」意指一種用來製備層析用固相的溶液。「充填緩衝液」意指一種用來將蛋白質與雜質的混合物充填至固相(亦即層析基質)上的溶液。平衡緩衝液以及充填緩衝液可以是同一者。「洗滌緩衝液」意指一種用來在充填完成之後從固相移除剩餘雜質的溶液。「析出緩衝液」被用來從層析基質移除標靶蛋白質。

「鹽」是一種由酸與鹼的交互作用所形成的化合物。

在本發明的一個態樣中，洗滌緩衝液包含脂族羧酸鹽。脂族羧酸鹽可以是直鏈或分支鏈。在某些具體例中，脂族羧酸鹽是脂族羧酸或其鹽，或脂族羧酸鹽的來源是脂族羧酸或其鹽。在某些具體例中，脂族羧酸鹽為直鏈且選自由以下組成之群：甲(methanoic)(甲(formic))酸、乙(ethanoic)(乙(acetic))酸、丙(propanoic)(丙(propionic))酸、丁(butanoic)(丁(butyric))酸、戊(pentanoic)(戊(valeric))酸、己(hexanoic)(羊油(caproic))酸、庚(heptanoic)(庚(enanthic))酸、辛(octanoic)(辛(caprylic))酸、壬(nonanoic)(天竺葵(pelargonic))酸、癸(decanoic)(羊脂(capric))酸、十一(undecanoic)(十一(undecylic))酸、十二(dodecanoic)(月桂(lauric))酸、十三(tridecanoic)(十三(tridecylic))酸、十四(tetradecanoic)(肉豆蔻(myristic))酸、十五酸、十酸(棕櫚(palmitic))酸、十七 (heptadecanoic)(珠光子(margaric))酸、十八(octadecanoic)(硬脂(stearic))酸，與二十(icosanoic)(花生脂(arachididic))酸或其任何鹽。因此，脂族羧酸鹽可包含長度為1至20個碳的碳骨架。在一具體例中，脂族羧酸鹽包含6至12個碳骨架。在一個具體例中，脂族羧酸鹽選自由羊油酸鹽、庚酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽及十二酸鹽組成之群。在又一個具體例中，脂族羧酸鹽是辛酸鹽。

在一個具體例中，脂族羧酸鹽的來源選自由以下組成之群：脂族羧酸、脂族羧酸的鈉鹽、脂族羧酸的鉀鹽，以及脂族羧酸的銨鹽。在一個具體例中，脂族羧酸的來源是脂族羧酸的鈉鹽。在又一個具體例中，洗滌緩衝液包含辛酸鈉、癸酸鈉或十二酸鈉，尤其是辛酸鈉。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含大於約50mM辛酸鹽。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含大於約200mM辛酸鹽。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含大於約250mM辛酸鹽。在又一個具體例中，洗滌緩衝液包含至少約50mM辛酸鹽，諸如至少約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM或約300mM辛酸鹽。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含少於約850mM辛酸鹽，諸如少於約800mM、約750mM、約700mM、約650mM、約600mM、約550mM、約500mM、約450mM、約400mM、約350mM、約300mM辛酸鹽。在另一個具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM、約125mM、約150mM、約175mM、約200mM或約250mM辛酸鹽。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含大於約50mM辛酸鈉。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含大於約200mM辛酸鈉。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含大於約250mM辛酸鈉。在又一個具體例中，洗滌緩衝液包含至少約50mM辛酸鈉，諸如至少約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM或約300mM辛酸鈉。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含少於約850mM辛酸鈉，諸如少於約800mM、約750mM、約700mM、約650mM、 約600mM、約550mM、約500mM、約450mM、約400mM、約350mM、約300mM辛酸鈉。在另一個具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM、約125mM、約150mM、約175mM、約200mM或約250mM辛酸鈉。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約50mM至約750mM辛酸鹽；約50mM至約500mM辛酸鹽；約75mM至約400mM辛酸鹽；約75mM至約350mM辛酸鹽；約75mM至約300mM辛酸鹽；約75mM至約200mM辛酸鹽；大於約250mM至約750mM辛酸鹽；大於約250mM至約500mM辛酸鹽；大於約250mM至約400mM辛酸鹽；大於約250mM至約350mM辛酸鹽；或大於約250mM至約300mM辛酸鹽。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約50mM至約750mM辛酸鈉；約50mM至約500mM辛酸鈉；約75mM至約400mM辛酸鈉；約75mM至約350mM辛酸鈉；約75mM至約300mM辛酸鈉；約75mM至約200mM辛酸鈉；大於約250mM至約750mM辛酸鈉；大於約250mM至約500mM辛酸鈉；大於約250mM至約400mM辛酸鈉；大於約250mM至約350mM辛酸鈉；或大於約250mM至約300mM辛酸鈉。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含有機酸、有機酸之共軛鹼的鹼金屬鹽或銨鹽，以及有機鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液是在未添加NaCl的情況下製造。

在一個具體例中，有機酸的共軛鹼為有機酸之共軛鹼的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。在一個具體例中，有機酸是乙酸而乙酸的共軛鹼是鈉鹽(亦即乙酸鈉)。

在一個具體例中，洗滌緩衝液另外包含約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM 至約100mM、約25mM至約60mM，或約30mM至約50mM乙酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約45mM乙酸。

在一個具體例中，洗滌緩衝液另外包含約1mM至約500mM、約10mM至約400mM、約10mM至約300mM、約10mM至約200mM、約10mM至約100mM、約35mM至約60mM，或約45mM至約65mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約55mM Tris鹼。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約56.5mM Tris鹼。

在一個具體例中，洗滌緩衝液另外包含約1mM至約500mM乙酸鈉。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約300mM乙酸鈉。

在一個具體例中，洗滌緩衝液的pH介於約pH 7至約pH 9；例如約pH 7.5至約pH 8.5或約pH 7.0至約pH 8.0。在一些具體例中，pH為約7.5。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約0.25M至約1.5M精胺酸。在又一個具體例中，洗滌緩衝液包含約0.25M至約2M精胺酸。在又一個具體例中，洗滌緩衝液包含約0.5M至約2M精胺酸。在又另一個具體例中，洗滌緩衝液包含約0.75M至約1.5M精胺酸。在又另一個具體例中，洗滌緩衝液包含約1M、約1.1M、約1.2M、約1.3M、約1.4M、約1.5M、約1.6M、約1.7M、約1.8M、約1.9M或約2M精胺酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約0.5M至約2M精胺酸，尤其約0.75M至約2M精胺酸。在又一個具體例中，洗滌緩衝液包含大於約1M精胺酸。在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。

將理解到，提到「精胺酸」不僅意指天然胺基酸，也含括精胺酸衍生物或其鹽，諸如精胺酸HCl、乙醯基精胺酸、精胺、精胺酸(arginic acid)、N-α-丁醯基-L-精胺酸，或N-α-特戊醯基-L-精胺酸。

或者，精胺酸可以被納入初始洗滌緩衝液中(亦即同時使用)。因此，在一個態樣中，本發明提供一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有約100mM至約850mM辛酸鹽與約0.25M至約1.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。如本文提供的實例中所示，包含辛酸鹽與精胺酸的組合的超級抗原層析洗滌具有出乎意料增進宿主細胞蛋白清除的協同效用，特別是移除細胞自溶酶L，其在純化特定重組多肽期間是一種特別難以清除的宿主細胞蛋白。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約750mM辛酸鹽；約100mM至約500mM辛酸鹽；約100mM至約400mM辛酸鹽；約100mM至約350mM辛酸鹽；或約100mM至約300mM辛酸鹽；及/或約0.25M至約2M精胺酸、約0.5M至約1.5M精胺酸、約0.7M至約1.5M精胺酸、約0.5M至約1M精胺酸，或約0.5M至約1.1M精胺酸。例如，洗滌緩衝液可含有約0.7M、約0.75M、約1.0M、約1.1M或約1.5M精胺酸。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約100mM至約750mM辛酸鈉；約100mM至約500mM辛酸鈉；約100mM至約400mM辛酸鈉；約100mM至約350mM辛酸鈉；約100mM至約200mM辛酸鈉或約100mM至約300mM辛酸鈉；及/或約0.25M至約2M精胺酸；約0.5M至約1.5M精胺酸；約0.5M至約1M精胺酸；或約0.5M至約1.1M精胺酸。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約0.5M至約2M精胺酸以及約50mM至約750mM辛酸鈉；約0.5M至約1.5M精胺酸以及約50mM至約500mM辛酸鈉；或約0.5M至約1.5M精胺酸以及約50mM至約250mM辛酸鈉。

在一個具體例中，洗滌緩衝液包含約0.5M至約1M離胺酸，諸如約0.75M離胺酸。在這個具體例中，離胺酸被納入初始洗滌緩衝液中(亦即同時使用)。在替代性具體例中，離胺酸被納入不同洗滌緩衝液中(亦即依序使用)。如本文提供的實例中所示，添加離胺酸證明會成功地降低析出體積。

重組多肽

細胞自溶酶L裂解位點(DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))存在於IgG1抗體中，例如在IgG1抗體的鉸鏈區。本文提供之方法可用於純化IgG1抗體，及/或純化抗體片段、含Fc的多肽，及/或含有細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))及/或含有IgG1鉸鏈區的融合蛋白。

本文提供之方法可用於純化含有細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的抗原結合多肽(ABP)。

本文提供之方法可用於純化含有細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽。

在一個具體例中，多肽為抗原結合多肽(ABP)，例如其含有細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))。在一個具體例中，抗原結合多肽選自由以下組成之群：抗體、抗體片段、免疫球蛋白單可變域(dAb)、mAbdAb、Fab、F(ab')₂、Fv、雙硫連接的Fv、scFv、封閉構形多特異性抗體、雙硫連接的scFv、雙功能抗體或可溶性受體。在又一個具體例中，抗原結合蛋白為抗體，例如單株抗體(mAb)。術語重組多肽、產物分子，以及mAb在本文中交替使用。抗體可以是例如嵌合、人類化或域抗體。抗原結合多肽可含有細胞自溶酶L裂解位點；抗原結合多肽可含有包括胺基酸序列DKTHTCPP(SEQ ID NO：50)的細胞自溶酶L裂解位點。

術語Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)₂可與其標準含意一起使用(參見例如Harlow et al.,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))。

「嵌合抗體」意指一種類型的經工程改造抗體，其含有衍生自供體抗體之天然可變區(輕鏈與重鏈)與衍生自受體抗體之輕鏈與重鏈恆定區締合。

「人類化抗體」意指一種類型的經工程改造抗體，其具有衍生自非人類供體免疫球蛋白的CDR，衍生自一(或多)個人類免疫球蛋白之分子的其餘免疫球蛋白衍生部分。此外，可改變骨架支撐殘基以保留結合親和力(參見例如Queen et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：10029-10032、Hodgson et al.,(1991)Bio/Technology,9：421)。適當的人類受體抗體可以是選自習知數據庫者，數據庫為諸如KABAT®數據庫、Los Alamos數據庫，以及Swiss Protein數據庫，依據相對於供體抗體的核苷酸與胺基酸序列的同源性。特徵在於與供體抗體之骨架區的同源性(以胺基酸為基礎)的人類抗體可能適於提供重鏈恆定區及/或重鏈可變骨架區，以便供體CDR插入。能夠捐出輕鏈恆定區或可變骨架區的適當受體抗體可以類似方式來選出。應注意到，受體抗體重鏈與輕鏈不必然源自相同的受體抗體。先前技藝說明數種產生此等人類化抗體之方法--參見例如EP-A-0239400和EP-A-054951。

術語「供體抗體」意指一種抗體(單株及/或重組)，其為第一免疫球蛋白夥伴貢獻其可變區、CDR或其他功能性片段或類似物的胺基酸序列，以提供改變的免疫球蛋白編碼區並產生表現抗原特異性且中和供體之活性特徵的經改變抗體。術語「受體抗體」意指一種與供體抗體異源的抗體(單株及/或重組)，其為第一免疫球蛋白夥伴貢獻全部(或任何部分，但在 一些具體例中為全部)編碼其重鏈及/或輕鏈骨架區及/或其重鏈及/或輕鏈恆定區的胺基酸序列。在某些具體例中，人類抗體為受體抗體。

「CDR」界定為抗體的互補決定區胺基酸序列，其為免疫球蛋白重鏈與輕鏈的超變區。參見，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可變部分中有三個重鏈CDR以及三個輕鏈CDR(或CDR區)。因此，「CDR」如本文所用意指所有三個重鏈CDR，或所有三個輕鏈CDR(或若有需要的話，所有重鏈與所有輕鏈CDR均有)。抗體的結構以及蛋白質折疊可能表示其他殘基被認為是抗原結合區的一部分且可為習於技藝者這麼理解(參見例如Chothia et al.,(1989)Nature 342：877-883)。

如本文所用，術語「域」意指折疊的蛋白質結構，其具有獨立於蛋白質其餘部分的三級結構。一般來說，域是蛋白質的離散功能特性的主因，且在許多實例中可以被添加、移除或轉移至其他蛋白質而不喪失蛋白質及/或域之其餘部分的功能。「抗體單可變域」是一個折疊的多肽域，其包含抗體可變域的序列特徵。因此，其包括完整抗體可變域以及經修飾的可變域，例如其中一或多個環可以被並非抗體可變域的特徵所取代，或者是被已截短或包含N或C端延伸的抗體可變域所取代，還有被至少保留全長域之結合活性與特異性之可變域的折疊片段所取代。

片語「免疫球蛋白單可變域」意指一種無關另外V區或結構域之特異性結合抗原或表位的抗體可變域(例如V_H或V_L)。免疫球蛋白單可變域可以與其他另外可變區或可變域的形式(例如同多聚體或雜多聚體)存在，其中其他區或結構域對於該單免疫球蛋白可變域結合抗原來說不是必要的(亦即免疫球蛋白單可變域結合抗原無關乎另外的可變域)。「域抗體」或 「dAb」與「免疫球蛋白單可變域」相同，其能夠結合至如本文使用之術語抗原。免疫球蛋白可變域可以是人類抗體可變域，但亦包括其他物種(諸如齧齒動物)的單抗體可變域(例如如WO 00/29004中所揭示)、鉸口鯊與駱駝VHH dAb(奈米抗體)。駱駝VHH是免疫球蛋白單可變域多肽，其衍生自包括駱駝、駱馬、羊駝、單峰駱駝以及原生馬鴕的物種，牠們天生產生沒有輕鏈的重鏈抗體。此等VHH域可以依據技藝中可供使用的標準技術進行人類化，且此等結構域依據本發明仍然可以被視為是「域抗體」。如本文所用，VH包括駱駝VHH域。NARV是另一類免疫球蛋白單可變域，其係在軟骨魚(包括鉸口鯊)中被首次鑑定出。這些結構域又叫做新穎抗原受體可變區(Novel Antigen Receptor variable region)(通常縮寫為V(NAR)或NARV)。關於更多詳細內容參見Mol.Immunol.(2006)44,656-665以及US2005/0043519。

術語「mAbdAb」與「dAbmAb」在本文用以意指包含一個單株抗體以及至少一個單域抗體的抗原結合多肽。兩個術語可互換使用，且意欲具有如本文所使用的相同意思。

通常，從宿主細胞蛋白純化重組多肽導致重組多肽的片段化。申請人已發現到，在使用本文所述的純化方法時，重組多肽片段化之量明顯減少。在一個具體例中，經析出重組多肽含有少於約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%片段化重組多肽。在另一個具體例中，重組多肽為抗體(例如IgG1抗體)而經析出抗體含有少於約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%片段化抗體。

抗-OX40 IgG1抗原結合多肽(ABP)

本文提供結合人類OX40(又稱為OX-40或OX40受體或OX40R)的抗原結合多肽(諸如抗體)(亦即抗-OX40抗原結合多肽或抗人類OX40受體(hOX-40R)抗原結合多肽，有時在本文被稱為「抗-OX抗原結合多肽」，諸如抗-OX40抗體或抗人類OX40受體(hOX-40R)抗體，有時在本文被稱為「抗-OX40抗體」)。這些抗原結合多肽用於治療或預防急性或慢性疾病或病狀(諸如癌症)，這些疾病或病狀的病理學涉及OX40信號傳導。在一個態樣中，描述結合至人類OX40R且有效作為癌症治療或對抗疾病之治療的抗原結合多肽或經分離人類抗體或此蛋白或抗體的功能性片段。本文所揭示之抗原結合蛋白(諸如抗體)中的任一者可用作為藥物。抗-OX40抗原結合多肽(諸如抗體)可以是促效性抗體，例如OX40(亦即OX40受體)的促效劑。

如本文所述的經分離抗原結合多肽結合至OX40，且可結合至由下列基因所編碼的OX40：NCBI登錄號NP_003317、GenPept登錄號P23510，或與其具有90%同源性或90%同一性的基因。本文提供的經分離抗體可進一步結合至具有下列GenBank登錄號之一的OX40(OX40受體)：AAB39944、CAE11757或AAI05071。

抗-OX40抗原結合多肽(例如IgG1抗體)可含有細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))，例如在抗-OX40 IgG1抗體的鉸鏈區中。本文提供之方法可用於純化抗-OX40抗原結合多肽，諸如抗體(例如IgG1抗體)，及/或純化抗-OX40抗體片段，例如其可含有這個裂解位點及/或含有一個IgG1鉸鏈區。本文提供抗-OX40 IgG1抗原結合多肽的實例。

技藝中已知結合及/或調節OX40(OX-40受體)的抗原結合多肽。揭示例示性抗-OX40抗原結合多肽，例如在PCT公開號WO2013/028231(PCT/US2012/024570)(國際申請日2012年2月9日)，以及WO2012/027328 (PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中，其各自以其整體併入本文作為參考資料(若有任何定義相衝突，由本申請案決定)。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為抗體106-222(SEQ ID NO：48的HC以及SEQ ID NO：49的LC)。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含抗體106-222的CDR(SEQ ID NO：1-3以及7-9)，或與其CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含一個VH(SEQ ID NO：5)、一個VL(SEQ ID NO：11)，或抗體106-222(亦即人類化106-222)的兩者，或與其VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為MEDI6383；MEDI0562；MOXR0916(RG7888)；BMS986178；或INCAGN01949。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含下列的CDR：MEDI6469；MEDI6383；MEDI0562；MOXR0916(RG7888)；BMS986178；或INCAGN01949，或與其CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含下列的一個VH、一個VL或兩者：MEDI6469；MEDI6383；MEDI0562；MOXR0916(RG7888)；BMS986178，或INCAGN01949，或與其VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為MEDI6383。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含MEDI6383的CDR，或與其CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含MEDI6383的一個VH、一個VL或兩者，或與其VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為MEDI0562。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含MEDI0562的CDR，或與其CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含MEDI0562的一個VH、一個VL或兩者，或與其VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為MOXR0916(RG7888)。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含MOXR0916(RG7888)的CDR，或與其CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含MOXR0916(RG7888)的一個VH、一個VL或兩者，或與其VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為BMS986178。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含BMS986178的CDR，或與其CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含BMS986178的一個VH、一個VL或兩者，或與其VH或VL序列具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為INCAGN01949。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含INCAGN01949的CDR，或與其CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含INCAGN01949的一個VH、一個VL或兩者，或與其VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽揭示於WO2015/153513中。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含揭示於WO2015/153513中之抗體的CDR，或與所揭示CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含揭示於WO2015/153513中之抗體的一個VH、一個VL或兩者，或與所揭示VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽揭示於WO2013/038191中。在另一個具體例中，抗體包含揭示於WO2013/038191中之抗原結合多肽的CDR，或與所揭示CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含揭示於WO2013/038191中之抗體的一個VH、一個VL或兩者，或與所揭示VH或VL序列具有至少90%(例如90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX抗原結合多肽係於WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中所揭示者。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含揭示於WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中之抗體的CDR，或與所揭示CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含揭示於WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中之抗體的一個VH、一個VL或兩者，或與所揭示VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在另一個具體例中，抗-OX抗原結合多肽係於WO2013/028231(PCT/US2012/024570)(國際申請日2012年2月9日)中所揭示者。在另一個具體例中，抗原結合多肽包含揭示於WO2013/028231(PCT/US2012/024570)(國際申請日2012年2月9日)中之抗體的CDR，或與所揭示CDR序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含揭示於WO2013/028231(PCT/US2012/024570)(國際申請日2012年2月9日)中之抗體的一個VH、一個VL或兩者，或與所揭示VH或VL序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的一個VH或一個VL。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽分別包含106-222抗體的CDR，例如CDRH1、CDRH2與CDRH3(其具有如SEQ ID NO：1、2與3中 所示的胺基酸序列)，以及例如CDRL1、CDRL2與CDRL3(其具有如SEQ ID NO：7、8與9中所示的胺基酸序列)。在一個具體例中，抗原結合多肽包含如WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中所揭示之106-222、Hu106或Hu106-222抗體的CDR。

如本文所述，抗體106-222為如WO2012/027328中所揭示的人類化單株抗體，其結合至人類OX40，且在本文中描述為一個包含分別具有SEQ ID NO：1、2與3中所示胺基酸序列之CDRH1、CDRH2與CDRH3，以及例如具有SEQ ID NO：7、8與9中所示序列之CDRL1、CDRL2與CDRL3的抗體，以及一個包含具有如SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列之VH與具有如SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列之VL的抗體。

在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含如WO2012/027328之SEQ ID NO：4中所示的VH與VL區，以及具有如WO2012/027328之SEQ ID NO：10中所示胺基酸序列的VL。在另一個具體例中，該抗原結合多肽包含具有如WO2012/027328之SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列的VH，以及具有如WO2012/027328之SEQ ID NO：11中所示胺基酸序列的VL。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含如WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中所揭示之106-222抗體或Hu106抗體的VH與VL區。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽是如WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中所揭示之Hu106-222或Hu106。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含與本段落中之序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR或VH或VL或抗體序列。

在另一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含119-22抗體的CDR，例如分別具有於WO2012/027328中之SEQ ID NO：13、14與15所示之 胺基酸序列的CDRH1、CDRH2與CDRH3。在另一個具體例，抗-OX40抗原結合多肽包含如WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)所揭示之鼠類119-122或Hu119或Hu119-222抗體的CDR。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含具有WO2012/027328之SEQ ID NO：16中所示胺基酸序列的VH，以及具有WO2012/027328之SEQ ID NO：22中所示胺基酸序列的VL。在又一個具體例中，抗-OX40抗體包含具有如WO2012/027328之SEQ ID NO：17中所示胺基酸序列的VH，以及具有如WO2012/027328之SEQ ID NO：23中所示胺基酸序列的VL。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含如WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)所揭示之鼠類119-122或Hu119或Hu119-222抗體的VH與VL區。在又一個具體例中，抗原結合多肽為Hu119或Hu119-222抗體，例如如WO2012/027328(PCT/US2011/048752)(國際申請日2011年8月23日)中所揭示。在又一個具體例中，抗原結合多肽包含與本段落之序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR或VH或VL或抗體序列。

在另一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含如WO2013/028231(PCT/US2012/024570)(國際申請日2012年2月9日)中所揭示之119-43-1抗體的CDR。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含119-43-1抗體之VH區中之一者以及VL區中之一者。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含如WO2013/028231(PCT/US2012/024570)(國際申請日2012年2月9日)中所揭示之119-43-1抗體的VH區與VL區。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽為119-43-1嵌合。在又一個具體例中，本段落中所述之抗-OX40抗原結合多肽中的任一者經人類化。在又一個具體例中，本段落中所述之抗原結合多肽中的任一者的任一者經工程改造以製造 出人類化抗體。在又一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含與本段落之序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的CDR或VH或VL或抗體序列。

在另一個具體例，又一個具體例中，任一抗-OX40抗原結合多肽的任何鼠類或嵌合序列經工程改造以製造出人類化抗體。

在一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含：(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在另一個具體例中，本發明之組合的抗-OX40抗原結合多肽，或其方法或用途包含：包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及/或包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3，或與其具有90%同一性之重鏈可變區CDR。

在另一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含：包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及/或包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3，或與其具有90%同一性之重鏈可變區。

在另一個具體例中，抗-OX40抗原結合多肽包含：含有SEQ ID NO：11之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區(「VL」)。在另一個具體例中，抗-OX40 抗體包含含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：5之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區(「VH」)。在另一個具體例中，抗-OX40抗體包含SEQ ID NO：5之可變重序列以及SEQ ID NO：11的可變輕序列，或與其具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。

進一步提供單株抗體(例如可含有SED ID NO：50之細胞自溶酶L裂解位點的IgG1抗體或抗體)，其包含含有SEQ ID NO：11之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：5之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區。

在一個具體例中，單株抗體(例如可含有SED ID NO：50之細胞自溶酶L裂解位點的IgG1抗體或抗體)包含含有SEQ ID NO：49之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的輕鏈。進一步提供單株抗體，其包含含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的重鏈。

進一步提供單株抗體(例如可含有SED ID NO：50之細胞自溶酶L裂解位點之IgG1抗體或抗體)，其包含含有SEQ ID NO：49之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的輕鏈，以及含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的胺基酸序列的重鏈。

抗體106-222的重鏈：

(SEQ ID NO：48)

抗體106-222的輕鏈：

(SEQ ID NO：49)

抗體106-222的重鏈可變區：

(SEQ ID NO：5)

抗體106-222的輕鏈可變區：

(SEQ ID NO：11)

抗體106-222的CDR序列：

HC CDR1：Asp Tyr Ser Met His(SEQ ID NO：1)

HC CDR2：Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly(SEQ ID NO：2)

HC CDR3：Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr(SEQ ID NO：3)

LC CDR1：Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala(SEQ ID NO：7)

LC CDR2：Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr(SEQ ID NO：8)

LC CDR3：Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr(SEQ ID NO：9)

關於核苷酸以及胺基酸序列，術語「同一」或「同一性」表示兩個核酸或兩個胺基酸序列當經最佳對準並且在有適當插入或刪除的情況下相比較時的同一性程度。

兩個序列之間的序列同一性百分率是序列所共有的相同位置數(意即，同一性%=相同位置數/位置總數乘以100)，將空位數以及各個空位的長度納入考慮(必須納入空位以供兩個序列的最佳對準用)。兩個序列之間的序列比較以及同一性百分率決定可以使用如下文所述的數學演算法來達成。

查詢核酸序列以及實驗核酸序列之間的同一性百分率為「同一性」值，表示為百分率，其是由BLASTN演算法所計算出，當實驗核酸序列與查詢核酸序列在進行逐對BLASTN演算法之後具有100%查詢覆蓋率。查詢核酸序列以及實驗核酸序列之間的此等逐對BLASTN比對是透過使用國家生技中心網頁上可取得之BLASTN演算法的預設並關閉低複雜性區的篩選器來進行。重要的是，查詢核酸序列可在本文之一或多個申請專利範圍中所確認的核酸序列來說明。

查詢胺基酸序列以及實驗胺基酸序列之間的同一性百分率為「同一性」值，表示為百分率，其是由BLASTP演算法所計算出，當實驗核酸序列與查詢胺基酸序列在進行逐對BLASTP演算法之後具有100%查詢覆蓋率。查詢胺基酸序列以及實驗胺基酸序列之間的此等逐對BLASTP比對是透過使用國家生技中心網頁上可取得之BLASTP演算法的預設並關閉低複雜性區的篩選器來進行。重要的是，查詢胺基酸序列可在本文之一或多個申請專利範圍中所確認的胺基酸序列來說明。

在其中的任一具體例中，ABP可具有與所示或所參照序列(例如本文揭示之SEQ ID NO所確認)具有99、98、97、96、95、94、93、92、91或90、或85、或80、或75、或70同一性百分率的任一個或所有CDR、VH、VL、重鏈(HC)、輕鏈(LC)。

關於抗體，同一性百分率可以是整個VL或LC序列，或同一性百分率可以限定為非CDR區(例如骨架區)，而對應於CDR的序列與VL或LC中揭示的CDR具有100%同一性。

關於抗體，同一性百分率可以是整個VH或HC序列，或同一性百分率可以限定為非CDR區(例如骨架區)，而對應於CDR的序列與VH或HC中揭示的CDR具有100%同一性。

宿主細胞蛋白

「雜質」意指在超級抗原層析之前存在於充填樣品中或在超級抗原層析之後存在於析出液中的任何外來或非所需分子。可能存在有「處理雜質」。這些是因為產生感興趣蛋白質(多肽)的處理所致而存在的雜質。例如，這些包括宿主細胞蛋白(HCP)、RNA以及DNA。「HCP」意指與感興趣蛋白質(例如重組多肽)無關的蛋白質，其係宿主細胞在細胞培養或發酵期間所產生，包括細胞內及/或分泌型蛋白質。宿主細胞蛋白的一個實例為蛋白酶，其在純化期間以及純化之後若仍存在的話可能導致感興趣蛋白質受壞。例如，若蛋白酶存在於含有感興趣蛋白質的樣品中，則其可能產生原先不存在的產物相關物質或雜質。蛋白酶的存在可能導致感興趣蛋白質隨著時間而在純化處理期間及/或在最終調配物中腐壞(例如片段化)。

在一個具體例中，宿主細胞蛋白是由產生/表現感興趣蛋白質之哺乳動物細胞或細菌細胞所生產/衍生。在又一個具體例中，哺乳動物細胞是選自人類或齧齒動物(諸如倉鼠或小鼠)細胞。在又一個具體例中，哺乳動物細胞為人類細胞而人類細胞為HEK細胞。在又一個具體例中，哺乳動物細胞為倉鼠細胞而倉鼠細胞為CHO細胞。在又一個具體例中，哺乳動物細胞為小鼠細胞而小鼠細胞為NS0細胞。

在某些具體例中，宿主細胞選自由以下組成之群：CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞，以及HEK細胞(亦即宿主細胞蛋白是衍生自這些宿主細胞)。另外，宿主細胞可以選自由以下組成之群的細菌細胞：大腸桿菌(例如W3110、BL21)、枯草桿菌(B.subtilis)及/或其他適宜細菌；或真核細胞，諸如真菌或酵母細胞(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、麴菌屬(Aspergillus sp.)、啤酒酵母 菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、紅麵包麴(Neurospora crassa))。

「溶液」可以是細胞培養基，例如細胞培養進料流。進料流可以經過濾。溶液可以是經澄清未處理培養液(CUB)(或經澄清發酵培養液/上清液)。CUB也稱為透過澄清移除任何細胞及/或細胞碎片的細胞培養上清液。溶液可以是表現該蛋白質之細胞的溶解製備物(例如溶液是溶解產物)。

處理雜質也包括用來培養細胞或確保感興趣蛋白質表現的組份，例如溶劑(例如用來培養酵母細胞的甲醇)、抗生素、胺甲喋呤(MTX)、培養基組份、凝聚劑等。也包括超級抗原固相之部分的分子，其在步驟之前被溶濾至樣品中(例如蛋白A、蛋白G或蛋白L)。

雜質也包括「產物相關變異體」，其包括保有其活性但其結構有所不同的蛋白質，還有因為其結構差異而喪失其活性的蛋白質。這些產物相關變異體包括(例如)高分子量物質(HMW)、低分子量物質(LMW)、聚集蛋白質、降解蛋白質、錯疊蛋白質、雙硫連接不充分的蛋白質、片段，以及去醯胺化物質。

在析出液中，這些雜質中之任一者的存在可以被量測以確立洗滌步驟是否已經成功。例如，申請人已證明，HCP含量降低，如每mg產物的ng HCP所表示(參見實例)。或者，所偵測到的HCP可以表示為「百萬分之份」或「ppm」(其等於ng/mg)，或「ppb」(「十億分之份」)(其等於pg/mg)。

在一個具體例中，在步驟(c)之後，HCP之量少於約200ng HCP/mg產物(亦即ng/mg)；少於約150ng/mg；少於約100ng/mg；少於約50ng/mg；或少於約20ng/mg。這意味著宿主細胞蛋白總量(例如不必然為一個特定HCP)，例如如透過ELISA、OCTET或其他方法所量測以確認一或多種雜質的含量，例如針對總HCP透過非特異性ELISA，如實例中所提供。

當與沒有精胺酸及/或脂族羧酸(例如辛酸)的對照洗滌步驟，及/或與純化前的溶液(例如經澄清未處理培養液)比較時，也證明減少。

在一個具體例中，在步驟(c)之後，HCP的相對降低係數(相較於先前確立的100mM辛酸鹽洗滌(例如參見WO2014/141150))為約2倍至約50倍。因此，在一個具體例中，在步驟(c)之後，HCP的相對降低係數相較於基本上由100mM辛酸鹽組成之洗滌緩衝液為約2倍至約50倍。在又一個具體例中，相對降低係數為至少約2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。為免疑問，提到「基本上由100mM辛酸鹽組成之洗滌緩衝液」不排除存在額外組份，其實質上並不影響100mM辛酸洗滌液的基本特徵，例如緩衝鹽及/或乙酸鈉。

在一個具體例中，在本發明的洗滌步驟之後，感興趣蛋白質自析出液的回收為100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更少，包括100%至50%之範圍內的任何不連續值，或在這個範圍內的任何成對不連續值所定義的任一子範圍。在一個具體例中，感興趣蛋白質自析出液的回收為大於70%，諸如大於75%、80%、85%、90%、95%或99%。析出液的回收百分率(%)是依據下式透過確定析出液中的感興趣蛋白質量當做被施加至管柱之感興趣蛋白質量的百分率而算出：回收百分率=析出液中的產物量÷被施加至管柱之產物量X 100

析出液中所存在的雜質量(亦即宿主細胞蛋白的總量)可以透過ELISA、OCTET或其他方法來測定以確定上文所述之一或多種雜質的含量。在本文所述的實例中，使用ELISA方法來測定樣品中的總HCP含量。

細胞自溶酶L(又稱為細胞自溶酶L1)蛋白酶是在CHO細胞培養期間所生產，且其可能會降解抗體，諸如抗-OX40 IgG1抗體(在本文又稱為 mAb3)產物分子(參見實例)。因此，在一個具體例中，重組多肽為抗體，諸如IgG抗體，尤其是IgG1抗體。

在一個具體例中，宿主細胞蛋白為細胞自溶酶L。在一個具體例中，由細胞自溶酶L純化重組多肽是在步驟(c)的析出液中透過細胞自溶酶L活性降低來進行量測(例如使用PromoKine PK-CA577-K142)。

在一個具體例中，透過在步驟(b)中使用含有辛酸鹽加上精胺酸的洗滌緩衝液，步驟(c)中析出液的細胞自溶酶L活性相較於在步驟(b)中用含有辛酸鹽(例如100mM辛酸)(且無精胺酸)的洗滌緩衝液的細胞自溶酶L活性降低約2.5倍、約5倍或約10倍，例如如透過本文所述方法量測，例如例用PromoKine PK-CA577-K142。

在一個具體例中，由細胞自溶酶L純化重組多肽是在精煉步驟(例如陽離子交換層析(CEX)精煉步驟，其是在步驟(c)之後進行)後析出液中透過細胞自溶酶L活性降低來進行量測(例如使用PromoKine PK-CA577-K142)。在一些具體例中，透過在步驟(b)中使用含有辛酸鹽加上精胺酸的洗滌緩衝液，在於步驟(c)之後進行的精煉步驟(例如CEX)後，析出液中的細胞自溶酶L活性降低約2.5倍、約5倍或約10倍，如相較於當在步驟(b)中使用含有辛酸鹽(例如100mM辛酸鹽)(且無精胺酸)的洗滌緩衝液，在步驟(c)之後進行之精煉步驟(例如CEX)後的細胞自溶酶L活性，例如如透過本文所述方法所量測，例如使用PromoKine PK-CA577-K142。

在本發明的一個態樣中，提供一種由細胞自溶酶L純化重組多肽(例如含有細胞自溶酶L裂解位點的重組多肽，細胞自溶酶L裂解位點為諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))之方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與細胞自溶酶L的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有約150mM 至約850mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在本發明的另一個態樣中，提供一種由細胞自溶酶L純化重組多肽(例如含有細胞自溶酶L裂解位點的重組多肽，細胞自溶酶L裂解位點為諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))之方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與細胞自溶酶L的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有約55mM至約850mM辛酸鹽以及約0.25M至約1.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在本發明的另一個態樣中，提供一種由細胞自溶酶L純化重組多肽(例如含有細胞自溶酶L裂解位點的重組多肽，細胞自溶酶L裂解位點為諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))之方法，該方法包含：(a)將含有該重組多肽與細胞自溶酶L的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以含有約150mM辛酸鹽以及約1.1M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。

在本發明的一個態樣中，提供一種經純化重組多肽(例如含有細胞自溶酶L裂解位點的重組多肽，細胞自溶酶L裂解位點為諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))，其是藉由本文所定義的任一種純化方法所獲得。

聚山梨醇酯降解

在最終調配產物中，聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20以及聚山梨醇酯80)是被廣泛用來穩定蛋白質藥品的非離子性界面活性劑。聚山梨醇酯可以在調配產物中被殘餘酵素所降解，這衝擊產物的最終架儲期(shelf-life)。在不受理論囿限的情況下，本文所述方法透過在最終產物中降低殘餘宿主細胞蛋白之量來降低受到降解的聚山梨醇酯量。在一個具體例 中，受到降解的聚山梨醇酯量少於約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%。

細胞自溶酶L裂解位點

受到細胞自溶酶L所辨識且裂解的胺基酸序列為：DKTH/TCPP(SEQ ID NO：50)(其中「/」表示裂解位點)。

本文提供之方法可用於純化含有細胞自溶酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的重組多肽。

細胞自溶酶L裂解位點(DKTHTCPP(SEQ ID NO：50)存在於IgG1抗體中，例如在IgG1抗體的鉸鏈區。本文提供之方法可用於純化含有這個裂解位點及/或含有IgG1鉸鏈區的抗體(例如IgG1抗體)，及/或純化含有這個裂解位點及/或含有IgG1鉸鏈區的抗體片段。本文提供之方法可用於純化含有這個裂解位點及/或含有IgG1鉸鏈區的抗原結合多肽(ABP)。

細胞自溶酶L裂解位點(DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))存在於某些抗-OX40抗體(例如IgG1抗體)中，例如在抗-OX40 IgG1抗體的鉸鏈區中。本文提供之方法可用於純化含有細胞自溶酶L裂解位點及/或含有IgG1鉸鏈區的抗-OX40抗體(例如IgG1抗體)，及/或純化含有細胞自溶酶L裂解位點及/或含有IgG1鉸鏈區的抗-OX40抗體片段。本文提供抗-OX40 IgG1抗體的實例。

細胞自溶酶L裂解位點(DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))可能存在於抗體片段(例如經修飾抗體片段)、含Fc的多肽、融合蛋白中，及/或在被引入多肽的連接子(例如被引入融合蛋白的連接子)中。參見例如已公開的PCT申請案第WO 2007/062037號；已公開的專利申請案第EP 3194585號；US2007-0059301；US 2007-0014802；US 2012-0207753；US 2013-0202596；及US 2016-0146806。本文提供之方法可用於純化這樣的一種多肽，及/或純 化含有細胞自融酶L裂解位點(諸如DKTHTCPP(SEQ ID NO：50))的這樣一種多肽。

將參照以下非限制性實例來說明本發明。

實例 實例1：篩選以及優化蛋白A洗滌液中的pH與辛酸鈉濃度 引言

在本文所述的操作中，蛋白A洗滌液經優化以在mAb產物的雙管柱處理(蛋白A之後為陰離子交換)或三管柱處理(蛋白A之後為陰離子交換與陽離子交換)中達到充分HCP移除。現有的平台處理經常需要第二個精煉步驟來達到所需要的HCP含量。有關於洗滌液優化的策略是要透過瓦解HCP-mAb交互作用來增進HCP清除。篩選各種洗滌液添加物與洗滌液pH並且針對整個蛋白A處理的總HCP移除來進行優化。

材料與方法

正辛酸鈉、冰醋酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、苯甲醇以及三羥甲基胺基甲烷(trizma base)是購自於Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis,MO)。使用進一步利用Millipore Milli-Q®系統來予以純化的水來製備溶液。使用3M tris鹼或3M乙酸來完成任何的pH調整。

關於mAb生產的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養

經澄清未過濾培養液(CUB)含有數種GSK mAb產物中之一者，諸如mAb1(IgG1、pI=8.7、MW=149kDa)、mAb2(IgG1、pI=8.3、MW=149kDa)、mAb3(IgG1、pI=7.9、MW=149kDa)、mAb4(IgG1、pI=8.6、MW=148kDa)，或mAb5(IgG4、pI=7.1、MW=145kDa)。使用類似方法來生產並收取在本研究中使用的所有mAb。例如，為了製備mAb3，藉由以0.7 x 10^6細胞/mL的目標起始活細胞密度還有

95%的生存力將生產生物反應器 接種表現mAb的GS-CHO細胞株來製備抗體。生產處理是以批式培養至多17天的方式來操作。生產培養被控制在37℃以及pH 6.95目標設定點下，而進料葡萄糖視需要維持葡萄糖濃度

2g/L。在生產處理結束時，含有mAb的細胞培養物透過深度過濾接著0.2μM無菌過濾予以澄清。舉例來說，透過以1.23-1.24MM/mL的活細胞計數以及~93.8%的生存力，將2公升反應器接種表現mAb1的DG44細胞來製備mAb1。接著將培養物維持在~34℃、pH~6.9以及6g/L葡萄糖下歷時16天。攪拌速率維持在~300rpm。於培養之後，未澄清細胞以及含mAb培養液以10,000g批式離心歷時20分鐘。培養液接著通過Nalgene的0.45μM和0.2μM SFCA過濾器予以真空過濾。

蛋白A純化

GE Healthcare的MabSelect SuRe^TM(MSS)蛋白A樹脂被充填至直徑0.5cm的管柱中，達到25cm的最終柱床高度。在比重設定之後，使用ÄKTA Avant 25在0.4M NaCl中以475cm/hr的線性流率循環充填樹脂歷時2小時。利用100μL的2M NaCl注射液來評估充填品質，以確認不對稱性為1.0 +/-0.2且每公尺至少1000個板數(plate)。所有蛋白A實驗使用35mg mAb/mL樹脂的充填率，且所有處理流率等於300cm/hr的線性速度。蛋白A層析方法以及緩衝液描述於表2中。CV=管柱體積。

洗滌優化

先前研究已證實，許多難以移除的HCP雜質與mAb直接相關(Levy et al.,(2014)Biotechnol.Bioeng.111(5)：904-912；Aboulaich et al.,(2014)Biotechnol.Prog.30(5)：1114-1124)；瓦解HCP-mAb交互作用的溶液條件有可能在蛋白A洗滌步驟期間增進HCP清除，並在本作業中篩選不同洗滌溶液且針對這個目的進行優化。具體來說，在樣品充填之後於不同pH下使用含有各種辛酸鈉濃度的洗滌溶液，以便在析出之前從被蛋白吸附的mAb清除HCP。為了要評估且量化每個洗滌液的HCP移除效能，如在下面ELISA方法段落中所述開發出一種內部HCP ELISA。先前發現辛酸鈉在使用於蛋白A洗滌液中時提供可靠的HCP清除。但是，先前研究限定在辛酸鈉濃度低於100mM以及pH 7.5；初步觀察研究之後是表徵辛酸鈉蛋白A洗滌液在整個濃度與pH範圍的行為的球面中央合成設計研究。這些設計顯示於下面表3與表4中。依據下面統計分析分法段落完成統計建模。

分析 蛋白A產率

蛋白A產率是透過使用Nanodrop 2000c(Thermo Scientific)來量測析出液中的mAb濃度而確定。平均每個析出液樣品的三個Nanodrop讀數以確定蛋白質濃度；蛋白A析出液中的mAb總含量是透過將mAb濃度乘以析出液體積(由層析圖測定)算出。充填的mAb濃度是使用POROS^® A 20μM管柱在Agilent 1100 series HPLC上測定。每個CUB樣品在分析型蛋白A上的原始數據與具有已知濃度的各個特定mAb標準品相比較，以便計算出滴定 量。總充填體積乘上測量出的滴定量以算出充填mAb的總質量，並且透過將析出液中的總mAb除以充填的總mAb算出產率。

宿主細胞蛋白(HCP)濃度量測：HCP ELISA

內部開發出使用HCP ELISA的宿主細胞蛋白分析，以便量化CHO衍生產物樣品中的免疫性HCP總量(Mihara et al.,(2015)J.Pharm.Sci.104：3991-3996)。使用訂製山羊抗-CHO HCP多株抗體以及針對整個CHO衍生產物之多種產物用途的內部產製HCP參考標準品開發出這個HCP ELISA。

統計分析

為了分析HCP清除的洗滌性能以及產率，進行一個觀察實驗以及中央組成設計研究。係數均按比例排列為-1、1並且將一般線性模型擬合至數據。將一個個別模型擬合至每個反應。在選出最終模型之後，評估針對剩餘的模型假設，且適合的話進行轉換。所有的模型項是針對5%顯著性程度來進行評估並進行向後消除(backwards elimination)，從完整模型開始，包括所有二次因數項。

MabSelect SuRe平衡等溫線量測

MabSelect SuRe^TM樹脂經緩衝交換至DI水中而產生~50%漿料。漿料被添加至ResiQuot，用儲存真空線(house vaccum line)乾燥，並且將20.8μL樹脂塞(resin plugs)分配至96深孔盤中。在個別的96孔盤中，產生帶有100、250與500mM辛酸鈉之介於0和10mg/mL的蛋白質溶液。量測每個溶液的蛋白質濃度並且向每個樹脂塞添加1mL。利用攪拌過夜來平衡樹脂-蛋白質混合物。經由過濾將樹脂直接移除至UV 96孔盤中，並量測最終濃度。利用下式計算吸附的蛋白質濃度(q)：

結果與討論

這個段落中所呈現的結果證實，高濃度辛酸鈉(>100mM)在蛋白A層析期間比先前確立之以辛酸鈉為基礎的蛋白A洗滌緩衝液移除明顯更多的宿主細胞蛋白(HCP)。這是使用數個mAb與相對高HCP含量作為模型獲得證實，並受到統計實驗設計所確認；關於所測試之mAb的CUB(蛋白A充填)的HCP濃度介於10⁶與10⁷ng/mg之間。

這個作業的主要目的是要評估洗滌緩衝液的辛酸鈉濃度與pH在整個蛋白A層析步驟期間對HCP清除的影響。主要目的有兩部分。第一個是要了解在辛酸鈉濃度與pH的整個作業範圍內對HCP的影響。使用觀察設計來探究兩個參數的完整範圍(表3)；最高辛酸鈉濃度為1M，而pH範圍為7-9。第二個目的是要針對HCP清除來優化辛酸鈉濃度以及pH，同時維持可接受的步驟產率。球面中央合成設計(CCD，表4)使用於這個優化中。觀察以及CCD研究使用mAb1作為模型mAb。對其他mAb測試這些初步研究的實驗結果。觀察以及CCD的結果均呈現在下。

表4：在蛋白A洗滌液中優化辛酸鈉濃度以及pH的球面中央合成實驗設計。

由CCD研究所得到的結果呈現於表5中。總體來說，蛋白A洗滌緩衝液的pH對於HCP清除的影響最小。含有500mM或750mM辛酸鈉的洗滌液在整個pH測試範圍中具有幾乎相同的HCP含量。如方法段落中所述進行統計分析。簡言之，將個別模型擬合至每一個反應(產率以及HCP)，並且針對5%顯著性使用F-檢定來評估模型項。F-檢定確認洗滌液pH對於HCP濃度並沒有統計學上顯著影響。類似的分析也確認pH對於百分產率並不是一個顯著因子。

CCD結果的統計分析確認，就HCP清除及百分產率來說，辛酸鈉濃度是顯著因子-具有線性以及二次項。當辛酸鈉濃度從0增加至1M時，HCP濃度(ng/mg)降低兩級量值(圖1-百分產率(三角形，▲)和HCP濃度(正方形，■))。但是，當辛酸鈉濃度增加超過250mM，則產率從超過90%掉至70%(圖1)。在步驟產率方面，超過250mM辛酸鈉的這個大幅減少可能是因為形成辛酸微胞。蛋白A洗滌緩衝液中的辛酸關鍵微胞濃度(CMC)在實驗上經測定為340mM。當辛酸鈉濃度從250mM增加到500mM，產率降低15%而HCP僅降低2.8%。這可能表明，游離形式的辛酸鈉是用於HCP移除的活性形式，而超過CMC的任何濃度顯示會減少產率(returns)，因為辛酸微胞可能造成產率損失。

實例2：產率損失以及可能減緩策略的研究

高於CMC的百分產率降低暗示著，辛酸鹽微胞(而非游離形式的辛酸鹽)可能會在整個蛋白A步驟中降低產率。為了確定產率損失的本質，於使用不同辛酸鈉洗滌液的蛋白A處理中，測量析出液、層析條(strip)以及洗滌部分的mAb濃度(圖2)。這個結果證明，在高辛酸鈉濃度下的產率損失是因為在洗滌步驟期間的脫附作用。

為了進一步表徵在高辛酸鈉洗滌期間的產率損失，量測平衡結合等溫線來確定在高辛酸鈉濃度下的mAb能力損失(圖3)。當用朗謬等溫線擬合時，先前建立的辛酸鹽洗滌液(含有100mM辛酸鈉)的最大結合力為57g/L。在250mM辛酸鈉下的吸附等溫線類似，但在500mM辛酸鈉下，朗謬等溫線擬合不佳。這個結果確認，高濃度辛酸鈉洗滌液降低蛋白A樹脂的結合力並且導致產率損失。

在確定產率損失的根源之後，探究用於降低產率損失之方法。所探究的兩個策略是減少洗滌液體積以及降低充填率。以4、6與8個CV測試 250mM辛酸鈉洗滌液。將洗滌長度從8個CV降低至4個CV，產率僅增加2%(表6)，而HCP濃度僅由31.0增加至35.8ng/mg。這指出高辛酸鈉洗滌液在類似體積下比在初步觀察與CCD研究中所測試者更能達到可接受的HCP含量，且亦證實較少的洗滌液體積在高辛酸鈉濃度下不會抵銷降低的結合力。

也在蛋白A捕獲期間探究降低充填率於高濃度辛酸鈉洗滌期間當作產率損失的減緩法(表7)。當充填率從30mg/ml降低至10mg/ml，就250mM與500mM辛酸鈉洗滌液來說，產率分別增加4.7%與7.7%。充填率在蛋白A析出液中對HCP濃度的影響最小。

實例3：經改善洗滌在其他mAb下的性能

僅使用mAb1作為模型產物來完成先前的蛋白A洗滌液優化研究。CCD研究證實，pH對於HCP移除並不是一個顯著因子。統計分析以及隨後的產率探究指出，辛酸鈉濃度最佳為至高400mM。為了確認250mM辛酸鈉洗滌液的HCP移除增進勝過先前開發的100mM辛酸鈉洗滌液，在這個段落中研究額外的mAb。針對含有100或250mM辛酸鈉的洗滌液，比較五個mAb在蛋白A析出液中的HCP濃度(圖4)。一個mAb(mAb3)是源自兩個不同的上游處理：該處理與其他研究分子相當之具有高含量HCP的高細胞密度處理。

除了mAb2以外，當使用250mM辛酸鈉洗滌液時，在此測試的所有mAb於蛋白A析出液中具有少於100ng/mg HCP。在大多數的情況下，HCP濃度因為增加洗滌液中的辛酸鈉濃度而輕易地增進約達一級量值。此外，在辛酸鈉濃度升高的情況下，這些mAb具有可接受的步驟產率以及產物品質。

實例4：對以辛酸鈉為基礎的蛋白A洗滌液添加精胺酸

與辛酸鈉(一種脂肪酸)相比，精胺酸(一種胺基酸)具有非常不同的生理以及化學特性。假設這兩種添加物之間的結構差異可能導致正交HCP移除機制，亦即精胺酸與辛酸的混合物可能具有比僅含單一組份之洗滌液更好的HCP移除。完成下面的研究以評估辛酸/精胺酸混合物的總HCP移除以及特異性HCP移除。

使用辛酸鹽/精胺酸蛋白A洗滌緩衝液的總HCP清除

含有辛酸鈉與精胺酸之組合的蛋白A洗滌緩衝液是使用mAb1以及mAb2來進行測試。mAb2的結果呈現於圖5中。僅含有100mM辛酸鈉或750mM精胺酸的蛋白A洗滌緩衝液產生介於700與1300ng/mg之間的HCP 濃度。將辛酸鈉濃度增加至250mM會使得HCP清除大大增進，與前文所探討的「高辛酸鈉」結果相符。含有250mM辛酸鈉的洗滌液在pH 8.5下於蛋白A析出液中產生273ng/mg HCP。向以辛酸為基礎的蛋白A洗滌液添加精胺酸進一步增進HCP移除：250mM辛酸鈉加上750mM精胺酸在pH 7.5或8.5下分別產生209與144ng/mg的HCP濃度。

使用mAb1完成類似的辛酸/精胺酸研究。mAb1是源自兩個不同的上游處理：「標準」進料批式生物反應器以及高細胞密度處理。高細胞密度處理產生較高的產物滴定濃度以及HCP濃度。納入這個研究中作為「最不利情況」進料材料。結果呈現於圖6中。

整體來說，mAb1結果類似於呈現在圖5中的mAb2研究結果。就標準品mAb1進料流以及高密度材料來說，透過將辛酸鈉從100增加至250mM，HCP清除獲得改善。此外，500mM精胺酸具有比僅辛酸鈉洗滌液更好的HCP清除。然而，具有辛酸鈉以及精胺酸兩者的洗滌液不論是作為混合物或藉由施加依序洗滌，均顯示出HCP清除增進勝過單獨個別組份。最佳性能是含有250mM辛酸鈉以及750mM精胺酸在pH 8.5下的洗滌液。高辛酸鈉與精胺酸的這個組合分別針對高密度與標準品mAb1產生113與67ng/mg的蛋白A析出液。

實例5：用於細胞自溶酶L活性降低的辛酸鹽/精胺酸洗滌液

使用mAb3測試含有辛酸鈉以及精胺酸的蛋白A洗滌液的細胞自溶酶L清除力。細胞自溶酶L蛋白酶是在CHO細胞培養期間所產生且其可能降解mAb3產物分子。已證實細胞自溶酶L無法在蛋白A處理期間從mAb3被移除。測試含有100mM辛酸鈉、250mM辛酸鈉、100mM辛酸鈉加上1000mM精胺酸以及100mM辛酸鈉加上750mM離胺酸的洗滌液。

關於這個特定產物之含有250mM辛酸鈉的洗滌液導致出乎預期的蛋白A析出行為：低pH析出延長超過10個管柱體積(通常在約~2個管柱體積內完成)。此外，在測試250mM辛酸鈉洗滌液時，mAb3蛋白A析出液具有非常高的聚集物(依據SEC測量)。這個行為沒有在使用高辛酸鈉洗滌液進行測試的任何其他產物下被觀察到。

含有精胺酸或離胺酸的蛋白A洗滌液不具有在單獨250mM辛酸鈉下所觀察到的析出行為延長。針對三種不同洗滌液(100mM辛酸(「平台部分析出液」)；250mM辛酸鹽、1M精胺酸(「cap/arg部分析出液」)；250mM辛酸、750mM離胺酸(「cap/lys部分析出液」))，在蛋白A析出液中量測到的細胞自溶酶L活性報導於圖7中；蛋白A析出體積列於表8中。在100mM辛酸鈉、1000mM精胺酸洗滌液下所量測到的活性明顯降低，且後續的穩定性研究證明，相較於100mM辛酸鈉洗滌液，使用這個洗滌液所製備之材料的片段化降低。添加750mM離胺酸(而不是精胺酸)成功地降低了大量析出體積，但並不會顯著降低細胞自溶酶L活性。辛酸鈉與1000mM精胺酸的組合提供增進的細胞自溶酶L與總HCP清除，同時維持合理的析出體積以及可接受的產品品質特性。

實例6：辛酸/精胺酸蛋白A洗滌以移除HCP

使用mAb3測試含有辛酸鈉以及精胺酸的蛋白A洗滌液的HCP清除力。洗滌緩衝液濃度以及所得HCP濃度列於下表9中。針對mAb3，精胺酸/辛酸鹽洗滌液與僅有辛酸的洗滌液相比較。

150mM辛酸鹽洗滌液提供比100mM辛酸洗滌液明顯更高的HCP清除。1.1M精胺酸與150mM辛酸鹽的組合進一步增進HCP清除達到一個顯著係數。在蛋白A步驟期間的HCP清除有增進，使得最終精煉層析步驟(在僅辛酸鹽處理中為必須))的移除變得可行。

實例7：mAb3片段化降低

在純化期間，使用含辛酸鈉以及精胺酸之洗滌液針對抗體片段化測試mAb3的蛋白A純化。產生數據(圖8-10)，包括3個批次之含有100mM辛酸洗滌液，以及2個批次之含有150mM辛酸加上1.1M精胺酸的洗滌緩衝液。

圖8顯示在整個下游處理的抗體片段化百分率(使用SEC HPLC量測)。圖9證明整個處理的HCP濃度。辛酸鹽/精胺酸批次在處理期間不具有顯著抗體片段化形成，而僅辛酸鹽批次在第三精煉步驟(結合與析出陽離子交換層析(CEX)步驟(使用辛酸鹽/精胺酸洗滌液時不需要))之後有顯著抗體片段化生成。

此外，比較透過處理(僅辛酸以及辛酸鹽+精胺酸)所產生的原料藥(Bulk Drug Substanc)的穩定性。來自辛酸鹽+精胺酸處理的原料藥於25℃ 下在10天內未產生抗體片段化；僅有辛酸鹽處理的原料藥於25℃下在10天期間產生明顯抗體片段化(圖10)。

在洗滌緩衝液中辛酸鹽與胺基酸的組合於整個下游處理明顯降低抗體片段化產生是因為細胞自溶酶L清除得以增進。

實例8：mAb3(抗-OX40)蛋白A洗滌液穩健性研究

mAb3是抗體106-222。

mAb3的蛋白A洗滌緩衝液在pH 7.5下含有150mM辛酸鈉以及1.1M精胺酸。關於在這個實例中提供的結果，洗滌緩衝液也含有300mM乙酸鈉。(在後續純化中，乙酸鈉未被納入洗滌緩衝液中)。這個洗滌緩衝液經優化以提供最大HCP清除並且移除細胞自溶酶L。

若存在的話，細胞自溶酶L、HCP雜質在精煉步驟2(結合與析出CEX層析)之後造成mAb3片段化；精煉步驟1涉及陰離子交換層析。完成具有3個中心點的2-全因子實驗DOE以證明辛酸鹽-精胺酸洗滌液在整個辛酸鹽與精胺酸濃度範圍內的性能。

在每個蛋白A析出液中測量到的HCP濃度，以及CEX後SEC片段化%呈現於下表10中。統計分析推論，辛酸鹽濃度、精胺酸濃度以及辛酸鹽*精胺酸濃度全都對HCP濃度具有統計上顯著效用(p值<0.05)。在所測試的範圍內，辛酸鹽濃度與HCP濃度為負相關；精胺酸以及精胺酸*辛酸鹽與HCP濃度為正相關。

在所測試的範圍內，辛酸鹽以及精胺酸濃度對CEX後SEC片段化%沒有統計上顯著效用。結果指出，就mAb3處理來說，所有測試的洗滌液移除細胞自溶酶L達到可接受的程度。

實例9：CEX精煉步驟之後的細胞自溶酶L活性

完成另一個研究以測量在CEX精煉步驟後的細胞自溶酶L活性。在這個研究中，使用蛋白A親和力層析以三種不同洗滌緩衝液純化mAb3：(1)100mM辛酸鈉、(2)1.1M精胺酸、150mM辛酸鈉、300mM乙酸鈉，以及(3)1.1M精胺酸、150mM辛酸鈉。在蛋白A純化之後，藉由結合與析出陽離子交換層析(CEX)進一步純化mAb3。在CEX析出液中測量細胞自溶酶L活性。使用小規模蛋白A純化來測試所有三種蛋白A洗滌緩衝液，並且亦以大規模處理測試含有精胺酸、辛酸鹽與乙酸鈉的緩衝液。

CEX析出液的細胞自溶酶L活性歸納於圖11中。相較於100mM辛酸鈉洗滌液，辛酸鹽/精胺酸蛋白A洗滌液(有或沒有乙酸鈉)在小規模或大規模下降低CEX後細胞自溶酶L活性達4-5倍。如圖10中所證明，這個降低的活性導致mAb3片段化減少，以及藥物的架儲期穩定性增加。

結論

在整個蛋白A步驟的HCP清除是藉由調整洗滌緩衝液將HCP-mAb交互作用降至最低而被優化。初步篩選研究推斷，蛋白A洗滌緩衝液的pH(從7變至9)不會明顯衝擊到HCP清除或步驟產率。辛酸鈉濃度對步驟產率以及HCP移除均有強烈影響。在非常高的辛酸鈉濃度(超過CMC)下，HCP為最優，但步驟產率相當低。這個研究發現到，相較於先前使用的100mM辛酸鈉洗滌液，採用含有250mM辛酸鈉的蛋白A洗滌液提供大幅度增進HCP清除，同時維持可接受的步驟產率。這個研究也發現到，相較 僅含有辛酸鈉的洗滌液，含有250mM辛酸鈉以及500-1000mM精胺酸組合的蛋白A洗滌液具有更大幅的HCP清除。含有辛酸鈉與精胺酸的蛋白A洗滌液被發現到成功地從mAb3移除細胞自溶酶L。

實例10：例示性蛋白A洗滌緩衝液

例示性蛋白A洗滌緩衝液為如下：56.5mM Tris、45mM乙酸、150mM辛酸鈉、1.1M精胺酸，pH 7.5

應理解，本文所述的具體例可應用於本發明的所有態樣。此外，本說明書中引用的全部公開資料(包括，但不限於專利案以及專利申請案)就如同全部所示併入本文作為參考資料。

<110> GLAXOSMITHKLINE INTELLECTUAL PROPERTY DEVELOPMENT LIMITED

<120> 用於純化重組多肽之方法

<130> PU66536

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Claims (18)

1. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點；該方法包含：(a)將包含該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以包含大於約50mM辛酸鹽與大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。
2. 如請求項1之方法，其中辛酸鹽為辛酸鈉。
3. 如請求項1或2之方法，其中該洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸。
4. 如前述請求項中任一項之方法，其中該洗滌緩衝液包含約150mM辛酸鹽。
5. 如前述請求項中任一項之方法，其中該洗滌緩衝液包含約1.1M精胺酸以及約150mM辛酸鹽。
6. 如前述請求項中任一項之方法，其中該HCP為細胞自溶酶L。
7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該重組多肽為IgG1。
8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該重組多肽為抗-OX40抗原結合多肽。
9. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點；該方法包含(a)將包含該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以包含大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以包含大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。
10. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點；該方法包含(a)將包含該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以包含大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以包含大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。
11. 一種從細胞自溶酶L純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點；該方法包含：(a)將包含該重組多肽與細胞自溶酶L的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以包含約150mM辛酸鹽與約1.1M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。
12. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，其中該重組多肽的胺基酸序列包含一個細胞自溶酶L裂解位點；該方法包含：(a)將包含該重組多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b)以包含濃度大於約250mM之辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該重組多肽。
13. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含：(a)將包含該抗-OX40抗原結合多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以包含大於約50mM辛酸鹽與大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽。
14. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含：(a)將包含該抗-OX40抗原結合多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以包含有大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層 析固體撐體；(b2)以包含大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽。
15. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含：(a)將包含該抗-OX40抗原結合多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b1)以包含大於約0.5M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；(b2)以包含大於約50mM辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽。
16. 一種從細胞自溶酶L純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含：(a)將包含該抗-OX40抗原結合多肽與細胞自溶酶L的溶液施加至超級抗原層析固體撐體、(b)以包含約150mM辛酸鹽與約1.1M精胺酸的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽。
17. 一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化抗-OX40抗原結合多肽之方法，該方法包含：(a)將包含該抗-OX40抗原結合多肽與HCP的溶液施加至超級抗原層析固體撐體；(b)以包含濃度大於約250mM之辛酸鹽的洗滌緩衝液洗滌該超級抗原層析固體撐體；以及(c)從該超級抗原層析固體撐體析出該抗-OX40抗原結合多肽。
18. 一種包含大於約50mM辛酸鹽以及大於約0.5M精胺酸的緩衝液。

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