TW202003038A - 特異性結合人ｈｅｒ２的細胞外結構域的亞結構域ｉｖ和ｉｉ的雙特異性抗體 - Google Patents

Abstract

本發明涉及生物技術領域，和提供特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的雙特異性抗體。本發明還涉及編碼所述抗體的DNA、相應的表達載體和其生產方法，以及使用所述抗體的治療方法。

Description

特異性結合人ＨＥＲ２的細胞外結構域的亞結構域ＩＶ和ＩＩ的雙特異性抗體

本發明涉及生物技術，具體地涉及抗體和其用途。更特別地，本發明涉及雙特異性抗體，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)。本發明還涉及編碼所述抗體的核酸、表達載體、製備所述抗體的方法和所述抗體在治療與HER2過度表達有關的疾病或病症中的用途。

人表皮因數受體(HER)家族，亦稱為ErbB-受體，涉及跨膜受體酪氨酸激酶的家族。該家族包括表皮生長因數受體(EGFR)，亦稱為ErbB-1或HER1，和同源受體ErbB-2 (HER2)、ErbB-3 (HER3)和ErbB-4 (HER4)。這些受體在正常細胞的表面上廣泛表達；它們控制增殖、分化、遷移和細胞凋亡，因此參與主要細胞過程的調節。HER受體或其配體例如調蛋白(HRG)或表皮生長因數(EGF)的過表達是人癌症中的頻繁事件(Wilson, Fridlyand等2012)。 ERBB受體(HER)由三個結構域組成：包含4個亞結構域的細胞外結構域、跨膜結構域和包含近膜亞結構域、酪氨酸激酶亞結構域和羧基末端(用於自磷酸化過程)的細胞內結構域。 配體與酪氨酸激酶的細胞外結構域的結合誘導在相同家族內的相同(同二聚化)受體和不同(異二聚化)受體之間的受體二聚化。二聚化可活化細胞內酪氨酸激酶結構域，和導致它們的自磷酸化。這進而可活化許多下游增殖信號轉導途徑，其包括由促分裂原活化蛋白激酶介導的那些，和促生存途徑Akt (綜述於Yarden和Pines, 2012)。 尚未鑒定出ErbB-2 (HER2)的特異性內源配體，但其細胞外結構域包含對配體和其它受體具有低親和力和廣泛特異性的結合位點；假定該受體通常通過異二聚化活化(Sergina, Rausch等2007)，而ErbB-3受體可通過接合其配體來活化。這些配體特別包括神經調節蛋白(NRG)和調蛋白(HRG)。 配體依賴性二聚化是HER1/3/4典型的，它通過配體與受體細胞外結構域的結合介導(1個配體分子足以維持穩定的二聚體構象；該唯一的配體分子從二聚體的解離導致瞬間二聚體解離)。 在達到HER2水準的臨界點時通常觀察到配體非依賴性二聚化，其中開始自發二聚化過程，即HER2過度表達本身導致受體從單體到聚集狀態的平衡改變。 所有三個受體結構域通常均參與二聚化過程；然而，細胞內或細胞外結構域單獨對於二聚化過程和激酶活性(特別是，細胞內結構域的組成型活性)是足夠的。 變構相互作用，即二聚化過程的基礎，在細胞外結構域的區域中開始。受體的細胞外結構域負責配體(與亞結構域I和III)的結合和通過亞結構域II的受體彼此結合。並且亞結構域II的“彎曲”構像是EGFR的配體非依賴性的無活性細胞外結構域典型的，而“筆直”構像是配體依賴性的活性二聚體典型的。 ErbB受體的失調導致癌症發生和生長(Yarden, Sliwkowski等2001)。眾所周知的實例是ErbB2 (HER2)受體的擴增和過度表達，其已在20-30%的乳腺癌和胃癌中被觀察到。 儘管缺少高親和力配體，ErbB2-受體(HER2)成功地參與集中在細胞存活的信號途徑。這是由於與來自ErbB家族的其它受體例如ErbB3受體(HER3)的異二聚化。 在癌細胞的表面上大量的HER2-HER3異二聚體的存在以及IGFR和c-Met (與侵襲性腫瘤表型、強烈轉移和抵抗單特異性抗-HER2靶向療法有關)的共表達與乳腺癌的最差預後相關。 HER2-HER2和HER2-HER3的高水準與HER2的擴增和過度表達相關。 應注意，HER2/HER3異二聚體存在兩種不同的形成，如下： 在配體非依賴性條件下，它們通過HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)形成。 在配體依賴性條件下，它們通過HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)形成。 ErbB2-受體(HER2)-靶向藥物(Baselga, Swain等2009)在許多具有與ErbB2 (HER2)過表達有關的癌症的患者中已顯著改善治療結果。 阻斷HER2介導的腫瘤生長機制的最流行的藥物是： 抗體曲妥珠單抗，其阻斷HER2受體的細胞外結構域的亞結構域IV (專利EP0590058 (B1)、WO9222653)； 抗體帕妥珠單抗，其阻斷HER2受體的細胞外結構域的亞結構域II (專利RU2270029、WO0100245)。 然而，這樣的治療在相當比例的患者中無效，而有治療反應的那些患者隨時間出現抵抗(Nahta, Yu等2006)。 涉及抵抗形成的主要機制是： 1. 空間效應 - HER2受體結構中的p95突變。該突變基於HER2的細胞外結構域的蛋白水解，形成p95截短形式，其具有組成型激酶活性，因此消除受體結合曲妥珠單抗和抑制信號轉導途徑的可能性；該類型的突變不是來自該家族的其它受體典型的。 2. 受來自EGF家族的其它受體/HER2-HER3、EGFR-HER3、EGFR-HER2異二聚化調節的信號轉導級聯的異常活化。 3. HER2-信號轉導的細胞內變化，特別是PTEN功能的缺乏/部分或完全丟失。 4. 在膜相關糖蛋白MUC4的存在下HER2細胞外結構域的“掩蔽”。 5. IGFR和с-Met的共表達。 6. HER2基因的T798M突變。 7. PIK3CA突變。 8. Src活化。 9. Hsp90的過表達(在結合Hsp90時，HER2受體不能結合抗體，在再迴圈期間內在化和回到細胞表面)。 10. miR200c抑制。 受來自EGF家族的其它受體、特別是HER2-HER3、EGFR/HER2和EGFR/HER3異二聚化調節的信號轉導級聯的異常活化是抵抗單-抗-HER2和EGFR抗體的主要機制之一。 已經開發Beyodime藥物(曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合)以解決抵抗的問題。其用於在以前尚未用抗-HER2療法治療的患者中治療轉移性乳腺癌；其也用作乳腺癌的新輔助療法的藥物(專利RU 2430739、WO 01/00245)。 該藥物的給予是不方便的，因為Beyodime在患者中以兩次單獨連續靜脈內輸注曲妥珠單抗和帕妥珠單抗來給予。 上述問題可通過開發雙特異性抗體解決，所述雙特異性抗體特異性結合人HER2的細胞外結構域的不同亞結構域，和在患者中以單次輸注給予來實現更短的住院期。 特異性結合人HER2的細胞外結構域的不同亞結構域的雙特異性抗體是現有技術已知的，例如描述於以下專利中的那些。 WO2015091738 (RU2016129517)提供了一種特異性結合HER2的雙特異性抗體，其包含對HER2的細胞外結構域II特異性的第一抗原結合位點和對HER2的細胞外結構域IV特異性的第二抗原結合位點，其中所述雙特異性抗體對於HER2的細胞外結構域II和IV二者是單價的，其中所述抗體誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)至比帕妥珠單抗或曲妥珠單抗的組合更高的程度。 本發明的雙特異性抗體(BCD-147-02-020)未顯示補體依賴性細胞毒性(CDC)。 WO2015157592提供了一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域和第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中(i) 第一和第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合不同的HER2抗體結合位點，(ii) 第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合第一HER2抗體結合位點，其包含HER2的結構域II內的表位，和(iii) 第一HER2抗體結合位點不同於帕妥珠單抗的抗體結合位點。所述抗體有效地抑制HER2介導的細胞信號轉導，其可用於治療表達HER2的癌症，包括其中HER2不以高水準表達的癌症(描述部分的第3頁，倒數第二段，WO2015157592)。WO2015157592指出，根據體外和體內測定，該抗體顯示針對表達HER2的細胞的高活性，而不管HER2受體的表達水準如何，特別是針對三陰性(ER- /PR-/HER2-1+)乳腺癌細胞。藥物的這種性質表現為潛在的優點，因為目前正開發的抗-HER2抗體針對具有過度表達的HER2受體的腫瘤(HER2 2+ FISH+, 3+)。然而，除了關於藥物的抗腫瘤活性的資料之外，作者沒有提供臨床前毒性研究的結果。考慮到藥物的作用機制，以及抗-HER2抗體的毒性機制(HER2信號轉導阻斷和HER2受體內在化)，應預期WO2015157592公開的抗體的毒性提高。這種預期基於如在申請中指示的抗體性質(HER2受體的內在化提高和針對表達HER2的細胞的ADCC活性提高)，以及基於關於其它抗-HER2抗體的安全性的資料。根據文獻，HER2受體是心肌細胞、內皮細胞、小腸上皮的基本結構元件。因此，根據WO2015157592的抗體很可能影響生物體的所有健康的表達HER2受體的細胞。這通過在1期臨床研究期間獲得的安全性的資料說明，其中腹瀉發生率高達44%，間接表明對腸上皮的毒性。 測定表達HER2的人血管內皮細胞以證明本發明的雙特異性抗-HER2抗體(BCD-147-02-020)對健康(非惡性)的表達HER2的細胞沒有影響(AGHAJANIAN H.等, Coronary vasculature patterning requires a novel endothelial ErbB2 holoreceptor, Nat Commun., 2016, no. 7:12038. doi: 10.1038/ncomms12038)。該體外測定表明針對該細胞系的最小活性，特別是抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性，因此，BCD-147-02-020具有潛在地低毒性和對過度表達HER2的惡性細胞的高選擇性。 WO2015077891 (RU2016125551)公開了一種抗原結合構建體，其包含單價和特異性結合HER2 (人表皮生長因數受體2) ECD2 (細胞外結構域2)抗原的第一抗原結合多肽構建體和單價和特異性結合HER2 ECD4 (細胞外結構域4)抗原的第二抗原結合多肽構建體，其中第一或第二抗原結合多肽的一者或二者是scFv。與每個相應的單特異性二價抗原結合構建體相比(即，與結合ECD2的單特異性二價抗原結合構建體或結合ECD4的單特異性二價抗原結合構建體相比)，和/或與兩種單特異性二價抗原結合構建體的組合相比，所述抗體顯示增加的效應子功能，包括補體依賴性細胞毒性(CDC) (WO2015077891的描述部分的第36頁，第[00147]段)。 本發明的雙特異性抗體(BCD-147-02-020)未顯示補體依賴性細胞毒性(CDC)。 從上文得出，對產生新的無毒雙特異性抗體存在需要，所述雙特異性抗體特異性結合過度表達HER2的惡性細胞中HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II，和顯示抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，而不顯示補體依賴性細胞毒性(CDC)。 雙特異性抗體BCD-147-02-020結合HER2的細胞外結構域的亞結構域4和2；因此，該抗體有效地共同空間阻斷配體依賴性和配體非依賴性二聚化二者。 雙特異性抗體BCD-147-02-020能夠不僅阻礙HER2/HER3二聚化，而且還阻礙HER2與EGFR和HER4的二聚化。 雙特異性抗體BCD-147-02-020顯示以下性質： 1. 刺激HER2的內在化和降解(通過c-Cbl遍在蛋白化)； 2. 阻斷HER2的配體-非依賴性二聚化； 3. 通過結合HER2細胞外結構域的亞結構域II，阻止HER2與來自該家族的其它受體HER1、HER3和HER4的配體依賴性異二聚化； 4. 阻斷PI3K/Akt信號轉導(阻止二聚化)； 5. 顯示抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)； 6. 不顯示補體依賴性細胞毒性(CDC)； 7. 在抗-HER2 (IV)抗體組分的存在下，HER2變得高度柔韌，特別是在亞結構域I和III的區域中；這刺激其增強的與抗-HER2 (II)抗體組分的締合。

發明簡述 本發明涉及雙特異性抗體BCD-147-02-020，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II和提供HER2介導的信號轉導途徑的增強阻斷。 這樣的抗體可用於治療由HER2介導的疾病或病症。 在一個方面，本發明涉及一種雙特異性抗體，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)，和包括： 1) 第一抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)，和代表包含由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列的曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)； 2) 第二抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)和代表包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)的抗原結合區(Fab)，所述重鏈可變結構域(VH)包含由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列，所述輕鏈可變結構域(VL)包含由SEQ ID NO: 6表示的氨基酸序列； 3) 片段可結晶區(Fc片段)。 在一些實施方案中，雙特異性抗體是IgG抗體。 在一些實施方案中，雙特異性IgG抗體具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。 在一些實施方案中，雙特異性抗體具有人IgG1同種型。 在一些實施方案中，雙特異性抗體包含片段可結晶區(Fc片段)，其包含分別由SEQ ID NO: 10-11表示的第二和第三恒定結構域(CH2-CH3)的兩個氨基酸序列。 在一些實施方案中，雙特異性抗體包含第二抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)和代表包含以下的抗原結合區(Fab)： a) 重鏈可變結構域(VH)和第一重鏈恒定結構域(CH1)，其包含由SEQ ID NO: 12表示的氨基酸序列； b) 輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恒定結構域(CK)，其包含由SEQ ID NO: 13表示的氨基酸序列。 在一個方面，本發明涉及一種雙特異性抗體，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)，和包含： 1) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含CH2和CH3恒定結構域和曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)，其包含由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列； 2) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的重鏈，所述重鏈包含重鏈可變結構域(VH)和第一、第二和第三重鏈恒定結構域(CH1-CH2-CH3)，其包含由SEQ ID NO: 15表示的氨基酸序列； 3) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的輕鏈，所述輕鏈包含輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恒定結構域(CK)，其包含由SEQ ID NO: 13表示的氨基酸序列， 其中部分1)-3)通過二硫鍵互相連接。 在一個方面，本發明涉及編碼上述抗體的核酸。 在一些實施方案中，核酸是DNA。 在一個方面，本發明涉及包含上述核酸的表達載體。 在一個方面，本發明涉及一種產生用於產生上述抗體的宿主細胞的方法，其包括用上述載體轉化細胞。 在一個方面，本發明涉及一種用於製備上述抗體的宿主細胞，所述宿主細胞包含上述核酸。 在一個方面，本發明涉及一種用於產生上述抗體的方法，其包括在生長培養基中在足以產生所述抗體的條件下培養上述宿主細胞，如果需要的話，接著分離和純化得到的抗體。 在一個方面，本發明涉及一種用於治療由HER2介導的疾病或病症的藥物組合物，其包含治療有效量的所述抗體或其抗原結合片段與一種或多種藥學上可接受的賦形劑的組合。 在一些實施方案中，藥物組合物預期用於治療由HER2介導的疾病或病症，所述疾病或病症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。 在一個方面，本發明涉及一種用於治療由HER2介導的疾病或病症的藥物組合物，其包含治療有效量的上述抗體或其抗原結合片段和治療有效量的至少一種治療活性抗腫瘤化合物。 在一些實施方案中，藥物組合物預期用於治療由HER2介導的疾病或病症，所述疾病或病症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。 在一些實施方案中，藥物組合物包含選自細胞毒素劑、化學治療劑、抗體或抗激素劑的治療活性抗腫瘤化合物。 在一個方面，本發明涉及一種用於抑制需要這樣的抑制的受試者的HER2的生物活性的方法，其包括給予受試者有效量的所述抗體。 在一個方面，本發明涉及一種用於治療由HER2介導的疾病或病症的方法，其包括給予需要這樣的治療的受試者治療有效量的所述抗體或所述藥物組合物。 在治療方法的一些實施方案中，疾病或病症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。 在一個方面，本發明涉及所述抗體或所述藥物組合物用於治療需要這樣的治療的受試者的由HER2介導的疾病或病症的用途。 在用途的一些實施方案中，疾病或病症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。 發明詳述 定義和通用方法 除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同含義。 此外，除非上下文另外要求，單數術語應包括複數，和複數術語應包括單數。通常，本文所述的細胞培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、有機合成化學、醫學和藥物化學以及蛋白和核酸的雜交和化學的分類和方法是本領域技術人員眾所周知和廣泛使用的。酶反應和純化方法根據製造商的說明書，如本領域通常的，或如本文描述的進行。 涉及抗體的定義 “HER受體”是受體蛋白酪氨酸激酶，其屬於HER受體家族和包括EGFR、HER2、HER3和HER4受體，和未來鑒定的其它家族代表。HER受體通常可含有能夠結合HER配體的細胞外結構域；親脂性跨膜結構域；保守的細胞內酪氨酸激酶結構域；羧基末端信號轉導結構域，其攜帶可被磷酸化的數個酪氨酸殘基。優選地，HER受體是天然序列人HER受體。 表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互換使用和是指例如在Semba等PNAS(USA) 82: 6497-6501 (1985) и Yamamoto等Nature 319: 230-234 (1986) (Genebank登錄號X03363)中描述的人HER2蛋白。術語“erbB2”是指編碼人ErbB2的基因。優選的HER2是天然序列人HER2受體。 HER2的細胞外結構域包含四個結構域：結構域I (約1至195的氨基酸殘基)、結構域II (約196至319的氨基酸殘基)、結構域III (約320至488的氨基酸殘基)和結構域IV (約489至630的氨基酸殘基) (沒有信號肽的殘基編號)。參見Garrett等Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho等Nature 421: 756-760 (2003), Franklin等Cancer Cell 5: 317-328 (2004)和Plowman等Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993)，也參見本文的圖1。 “HER配體”意指結合和/或活化HER受體的多肽。 如本文使用的，術語“結合人HER2”或“特異性結合人HER2”或“抗-HER2-抗體”是可互換的，和預期是指以具有25°С的KD值1×10^-8 mol/L或更小、在另一個實施方案中具有25°С的KD值1×10^-9 mol/L或更小的結合親和力特異性結合人HER2抗原的抗體。結合親和力在25°С在典型的結合測定中測量，例如表面等離子體共振測定(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)。測定結合親和力的KD值的方法描述於實施例2b)。因此，本文使用的術語“結合人HER2的抗體”是指以具有25°С的KD值1×10^-8 mol/L或更小(優選地1×10^-8 mol/L - 1,0×10^-12 mol/L)的結合親和力特異性結合人HER2-抗原的抗體。 該基因的擴增和/或其蛋白的過表達已在許多癌症中觀察到，包括乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。 術語“結合分子”包括抗體和免疫球蛋白。 如本文使用的術語“抗體”或“免疫球蛋白” (Ig)包括完整的抗體和其任何抗原結合片段(即，“抗原結合部分”)或單鏈。術語“抗體”是指包含通過二硫鍵互相連接的至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈的糖蛋白，或抗原結合部分。每個重鏈包含重鏈可變區(在本文中簡稱為VH)和重鏈恒定區。已知由希臘字母α、δ、ε、γ和μ表示的五種類型的哺乳動物抗體重鏈。存在的重鏈的類型定義了抗體的種類；這些鏈分別存在於IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗體中。不同的重鏈在大小和組成上不同；α和γ含有大約450個氨基酸，而μ和ε具有大約550個氨基酸。每個重鏈具有兩個區域，恒定區和可變區。恒定區在相同同種型的所有抗體中是相同的，但在不同同種型的抗體中不同。重鏈γ、α和δ具有由三個恒定結構域CH1、СН2和CH3 (呈直線)構成的恒定區，和用於加入柔韌性的鉸鏈區(Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99)；重鏈μ和ε具有由四個恒定結構域CH1、СН2、CH3和CH4構成的恒定區。在哺乳動物中，已知由lambda (λ)和kappa (κ)表示的僅兩種類型的輕鏈。每個輕鏈由輕鏈可變區(在本文中簡稱為VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈的近似長度為211-217個氨基酸。優選地，輕鏈是kappa (k)輕鏈，和恒定結構域CL優選地是C kappa (k)。 根據本發明的“抗體”可具有任何種類(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，優選地IgG)或亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，優選地IgG1)。 VL和VH區可進一步細分為超變區，稱為互補決定區(CDR)，其散佈在稱為框架區(FR)的比較保守的區域之間。每個VH和VL由三個CDR和四個FR構成，從氨基末端到羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因數的結合，所述宿主組織或因數包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。 如本文使用的術語抗體的“抗原結合部分”或“抗原結合片段” (或簡稱“抗體部分”或“抗體片段”)是指抗體保留特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。已表明抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段實現。術語抗體的“抗原結合部分”內包括的結合片段的實例包括(i) Fab-片段，其為單價片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成；(ii) F(ab’)2片段，其為二價片段，包含在鉸鏈區通過二硫橋連接的兩個Fab-片段；(iii) Fd-片段，其由VH和CH1結構域組成；(iv) Fv-片段，其由抗體的單臂的VL和VH結構域組成；(v) dAb-片段(Ward等, (1989) Nature 341:544-546)，其由VH/VHH結構域組成；和(vi) 提取的互補決定區(CDR)。此外，Fv-片段的兩個區域VL和VH由單獨的基因編碼，它們可使用重組方法使用合成接頭連接，所述接頭使它們能夠接受單一蛋白鏈，其中VL和VH區經配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如，Bird等(1988) Science 242:423-426;和Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。假定這樣的單鏈分子也包括在術語抗體的“抗原結合部分”內。這些抗體片段使用本領域技術人員已知的常規技術獲得，和片段以與完整抗體相同的方式進行篩選。 優選地，本發明的抗原結合部分的CDR或完整抗體抗原結合部分源自小鼠、駱駝或人供體庫或基本上具有人來源，其中某些氨基酸殘基改變，例如，被不同氨基酸殘基置換以優化特異性抗體的性質，例如，KD、koff、IC50、EC50、ED50。優選地，本發明的抗體的框架區具有人來源或基本上具有人來源(至少80、85、90、95、96、97、98或99%的人來源)。 在其它實施方案中，本發明的抗體的抗原結合區可源自其它非-人物種，包括但不限於小鼠、駱駝、兔、大鼠或倉鼠。或者，抗原結合區可源自人物種。 術語“可變結構域”是指在抗體之間可變結構域的某些部分的序列明顯不同的事實。V結構域介導抗原結合和決定每種特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性在可變結構域的110個氨基酸跨度內不是均勻分佈的。而是，V區由被稱為“超變區”或CDR的具有極度可變性的較短區域分隔的15-30個氨基酸的稱為框架區(FR)的不變片段組成。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR，其主要採取β-片構型，被三個超變區連接，所述超變區形成連接的環，和在一些情況下形成β-片結構的一部分。在每個鏈中超變區通過FR緊密靠近地保持在一起，並且與來自其它鏈的超變區一起促進抗體的抗原結合位點的形成。恒定結構域不直接參與抗體和抗原的結合，但顯示各種效應子功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。 如本文使用的術語“超變區”是指負責抗原結合的抗體的氨基酸殘基。超變區通常包含來自“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基和/或來自“超變環”的那些殘基。 在某些情況下，還可能需要改變一個或多個CDR氨基酸殘基，以改進與靶標表位的結合親和力。這稱為“親和力成熟”和可任選地結合人源化進行，例如在其中抗體的人源化導致結合特異性或親和力降低，和僅通過回復突變不可能足夠改進結合特異性或親和力的情況下。各種親和力成熟方法是本領域已知的，例如Burks等, Proc Natl Acad Sci USA, 94:412–417 (1997)描述的體外掃描飽和誘變方法和Wu等, Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)的逐步體外親和力成熟方法。 “框架區” (FR)是CDR殘基以外的那些可變結構域殘基。每個可變結構域通常具有四個FR，被稱為FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR根據Kabat來定義，輕鏈FR殘基約位於殘基1-23 (LCFR1)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)和98-107 (LCFR4)，和重鏈FR殘基約位於重鏈的殘基1-30 (HCFR1)、36-49 (HCFR2)、66-94 (HCFR3)和103-113 (HCFR4)。如果CDR包含來自超變環的氨基酸殘基，輕鏈FR殘基約位於輕鏈的殘基1-25 (LCFR1)、33-49 (LCFR2)、53-90 (LCFR3)和97-107 (LCFR4)，和重鏈FR殘基約位於重鏈殘基的殘基1-25 (HCFR1)、33-52 (HCFR2)、56-95 (HCFR3)和102-113 (HCFR4)。在一些情況下，當CDR包含來自通過Kabat定義的CDR的氨基酸和超變環的那些氨基酸時，FR殘基將相應地調整。例如，當CDRH1包括氨基酸H26-H35時，重鏈FR1殘基在位置1-25和FR2殘基在位置36-49。 免疫球蛋白的片段可結晶區(“Fc區、Fc”)是免疫球蛋白分子的“尾”區域，其與細胞表面Fc-受體以及補體系統的一些蛋白相互作用。這種性質允許抗體活化免疫系統。在IgG、IgA和IgD抗體同種型中，Fc區由分別來自兩個重鏈的第二和第三恒定結構域的兩個相同的蛋白片段構成；在IgM和IgE同種型中，Fc區在每個多肽鏈中含有三個重鏈恒定結構域(CH結構域2-4)。 “結合”靶抗原的本發明的抗體是指以下抗體，其能夠以足夠的親和力結合抗原，使得抗體可用作靶向蛋白或表達所述抗原的細胞的診斷和/或治療劑，和略微與其它蛋白交叉反應。根據分析方法：螢光活化細胞分選(FACS)、放射免疫測定(RIA)或ELISA，在這樣的實施方案中，抗體與非靶蛋白的結合程度小於抗體與特定靶蛋白結合的10%。關於抗體與靶分子的結合，術語“特異性結合”或“特異性結合至”特定多肽或特定多肽靶標上的表位或“對其有特異性”，意指顯著(可測量地)不同於非特異性相互作用的結合(例如，在bH1-44或bH1-81的情況下，非特異性相互作用是結合至牛血清白蛋白、酪蛋白、胎牛血清或中性抗生物素蛋白)。 特異性結合可例如通過與對照分子的結合相比，測定分子的結合來測量。例如，特異性結合可通過與類似於靶標的對照分子(例如過量的非標記靶標)競爭測定。在該情況下，如果標記靶標與探針的結合被過量的非標記靶標競爭性抑制，則指示特異性結合。如本文使用的，術語“特異性結合”或“特異性結合至”特定多肽或特定多肽靶標上的表位或“對其有特異性”可通過具有至少約200 nM、或至少約150 nM、或至少約100 nM、或至少約60 nM、或至少約50 nM、或至少約40 nM、或至少約30 nM、或至少約20 nM、或至少約10 nM、或至少約8 nM、或至少約6 nM、或至少約4 nM、或至少約2 nM、或至少約1 nM、或更大的對靶標的Kd的分子來描述。在一個實施方案中，術語“特異性結合”是指其中分子結合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不結合任何其它多肽或多肽表位的結合。 如本文使用的術語“Ka”是指特定抗體-抗原相互作用的締合(on)速率。 如本文使用的術語“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離(off)速率。 “結合親和力”通常是指在分子(例如，抗體)的單一結合位點和其結合配偶體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總和的強度。除非另外指明，“結合親和力”是指固有的(特徵性、真實的)結合親和力，其反映了結合對的成員(例如，抗體和抗原)之間的1:1相互作用。分子X對其結合配偶體Y的親和力通常可通過解離常數(Kd)表示。優選的Kd值為約200 nM、150 nM、100 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、8 nM、6 nM、4 nM、2 nM、1 nM或更小。親和力可通過本領域已知的常見方法測量，包括本文描述的那些。低親和力抗體通常緩慢結合抗原和趨於容易解離，而高親和力抗體通常更快結合抗原和趨於保持結合更久。各種測量結合親和力的方法是本領域已知的，其中任何方法可用于本發明的目的。 在一個實施方案中，本發明的“Kd”或“Kd值”通過使用表面等離子體共振測定，在25°С使用BIAcore™-2000或BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)，用固定抗原CM5晶片以~10個回應單位(RU)測量。簡言之，根據製造商的說明書，將羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5, BIAcore Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化。抗原用10 mM乙酸鈉pH 4.8稀釋至5 μg/ml (~0.2 μM)，然後以5 μl/分鐘的流速注射以實現大約10個回應單位(RU)的偶聯蛋白。在抗原注射後，注入1M乙醇胺溶液以封閉未反應基團。對於動力學測量，在25°C以大約25 μl/min的流速注入在含0.05% Tween 20的PBS (PBST)中2倍連續稀釋的Fab (例如，0.78 nM至500 nM)。締合速率(kon)和解離速率(koff)使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIAcore Evaluation Software版本3.2)，通過同時擬合締合和解離傳感圖計算。平衡解離常數(Kd)計算為比率koff/kon。參見例如，Chen, Y.,等, (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881。如果通過上述表面等離子體共振測定，締合速率超過106 M-1 s-1，則締合速率可通過使用螢光淬滅技術測定，該技術測量在25°C下在遞增濃度的抗原的存在下在PBS, pH 7.2中20 nM抗-抗原抗體溶液(Fab形式)的螢光發射強度的增加或降低(激發=295 nm; 發射=340 nm, 16 nm帶通)，如在分光計中測量，所述分光計例如停流裝備的分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic) (帶有攪拌比色皿)。 如本文使用的術語“koff”預期是指特定結合分子-抗原相互作用的解離速率常數。解離速率常數koff可使用生物層干涉測量法，例如使用Octet™系統測量。 根據本發明的“締合速率”或“kon”也可通過使用上述表面等離子體共振測定，在25°С下使用BIAcore™-2000或BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)，用固定抗原CM5晶片以~10個相對單位(回應單位, RU)測量。簡言之，根據製造商的說明書，將羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5, BIAcore Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化。抗原用10 mM乙酸鈉pH 4.8稀釋至5 μg/ml (~0.2 μM)，然後以5 μl/分鐘的流速注射以實現大約10個回應單位(RU)的偶聯蛋白。在抗原注射後，將1M乙醇胺溶液注入以封閉未反應基團。 除非另外指明，關於本發明的多肽的術語“生物活性的”和“生物活性”和“生物特性”是指具有結合生物分子的能力。 術語“生物分子”是指核酸、蛋白、碳水化合物、脂質和其組合。在一個實施方案中，生物分子天然存在。 抗體片段，例如Fab和F(ab’)2片段，可使用常規技術，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體，從完整抗體製備。此外，抗體、其部分和免疫粘附分子可使用標準重組DNA技術製備，例如，如本文所述。 術語“重組抗體”預期是指在包含編碼抗體的核苷酸序列的細胞或細胞系中表達的抗體，其中所述核苷酸序列與所述細胞不是天然關聯的。 如本文使用的，術語“變體抗體”預期是指因為與親本抗體的序列相比添加、缺失和/或置換一個或多個氨基酸殘基而具有不同於其“親本”抗體的氨基酸序列的氨基酸序列的抗體。在優選的實施方案中，與親本抗體相比，變體抗體包含至少一個或多個(例如，1-12個，例如，2、3、4、5、6、7、8或9、10、11或12個；在一些實施方案中，變體抗體包含1-約10個)氨基酸添加、缺失和/或置換。在一些實施方案中，這樣的添加、缺失和/或置換在變體抗體的CDR中進行。相對於變體抗體的序列的同一性或同源性在本文定義為在將序列對齊和引入空位(如果需要的話)以實現序列同一性的最大百分比後，在變體抗體序列中與親本抗體殘基相同的氨基酸殘基的百分比。變體抗體保留結合親本抗體所結合的相同抗原和優選表位的能力；和在一些實施方案中，至少一種性質或生物活性優於親本抗體的那些。例如，與親本抗體相比，變體抗體可具有例如更強的結合親和力、更長的半衰期、更低的IC50或抑制抗原生物活性的能力提高。本文特別感興趣的變體抗體是與親本抗體相比，顯示生物活性的至少2倍(優選地至少5倍、10倍或20倍)提高的變體抗體。 術語“雙特異性抗體”是指具有能夠特異性結合單一生物分子上的兩個不同的表位或能夠特異性結合兩個不同的生物分子上的表位元的抗原結合結構域的抗體。雙特異性抗體在本文亦稱為具有“雙重特異性”或稱為“雙重特異性”抗體或“雙互補位抗體”。 在廣義上，術語“嵌合抗體”預期是指包含一種抗體的一個或多個區域和一種或數種其它抗體的一個或多個區域的抗體，通常是部分人和部分非人抗體，即部分源自非人動物，例如小鼠、大鼠等害獸，或駱駝科，例如駱駝和羊駝。為了降低人抗抗體免疫反應，例如在鼠抗體的情況下人抗小鼠抗體免疫反應的風險，嵌合抗體通常優於非人抗體。典型的嵌合抗體的實例是其中可變區序列是鼠序列，而恒定區序列是人的嵌合抗體。在嵌合抗體的情況下，非人部分可經受進一步改變以將抗體人源化。 術語“人源化”預期是指以下事實，即當抗體具有完全或部分非人來源，例如，通過用目的抗原分別免疫小鼠或駱駝獲得的小鼠或駱駝抗體，或是基於這樣的小鼠或駱駝抗體的嵌合抗體時，有可能置換某些氨基酸(特別是在重鏈和輕鏈的框架區和恒定結構域中)，以避免或最小化在人中的免疫反應。抗體主要通過位於6個重鏈和輕鏈CDR的氨基酸殘基而與靶抗原相互作用。為此，在各個抗體之間，CDR內的氨基酸序列比CDR外的那些氨基酸序列更加可變。因為CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，有可能表達模擬天然存在的特定抗體、或更通常具有所述氨基酸序列的任何特定抗體的性質的重組抗體，例如，通過構建表達來自特定抗體的CDR序列和來自不同抗體的框架序列的表達載體進行。結果是，有可能“人源化”非人抗體，和在很大程度上保持初始抗體的結合特異性和親和力。儘管不可能精確預測特定抗體的免疫原性，從而精確預測特定抗體的人抗抗體反應，但非人抗體通常比人抗體具有更多的免疫原性。其中外源(例如害獸或駱駝科)恒定區已被人來源的序列置換的嵌合抗體，已表明通常比完全外源的那些具有更少的免疫原性，並且治療性抗體的趨勢是朝向人源化或全人抗體。因此，嵌合抗體或非人來源的其它抗體可被人源化以降低人抗抗體反應的風險。 對於嵌合抗體，人源化通常包括改變可變區序列的框架區。通過人源化，作為互補決定區(CDR)的一部分的氨基酸殘基最通常不被改變，但在一些情況下為了改變CDR的單個氨基酸殘基，例如為了刪除糖基化位點、脫醯胺位點、天冬氨酸異構化位元點或不需要的半胱氨酸或甲硫氨酸殘基，其可能是需要的。N-連接的糖基化通過將寡糖鏈連接至三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中的天冬醯胺殘基進行，其中X可以是除了Pro的任何氨基酸。N-糖基化位點的除去可通過突變Asn或Ser/Thr殘基為不同殘基，優選地通過保守置換來實現。天冬醯胺和穀氨醯胺殘基的脫醯胺可根據因素例如pH和表面暴露而發生。天冬醯胺殘基尤其易於脫醯胺，主要當存在于序列Asn-Gly中和較少程度地在其它二肽序列例如Asn-Ala中時。假如CDR序列包含這樣的脫醯胺位點，特別是Asn-Gly，可能需要除去該位元點，通常通過保守置換來刪除所涉及的殘基之一。 將抗體序列人源化的許多方法是本領域已知的。一種常用的方法是CDR移植。CDR移植可基於通過Kabat的CDR定義進行，儘管最後版本(Magdelaine-Beuzelin等, Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210 225 (2007))表明IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org)定義可改進人源化結果(參見Lefranc等, Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003))。在一些情況下，與CDR自其獲得的親本抗體相比，CDR移植可減少CDR移植的非人抗體的結合特異性和親和力，和因此減少其生物活性。回復突變(有時稱為“框架區修復”)可在CDR移植抗體的選擇的位置，通常在框架區中引入，以恢復親本抗體的結合特異性和親和力。可能的回復突變的位置的鑒定可使用在文獻中和在抗體資料庫中可獲得的資訊進行。作為回復突變的候選物的氨基酸殘基通常是位於抗體分子的表面的那些，而被埋沒或具有低程度的表面暴露的殘基通常不被改變。對於CDR移植和回復突變的一種可供選擇的人源化技術是表面重建，其中非人來源的非表面暴露殘基被保留，而表面殘基被改變為人殘基。 全人抗體可使用兩種技術產生：使用體外收集的噬菌體文庫或體內免疫人源化動物(小鼠、大鼠等)。 組合噬菌體抗體文庫的構建以選擇基因庫的來源開始，其取決於數個抗體文庫類型中的哪一個可被辨別：幼稚、免疫和合成的。幼稚和免疫文庫使用天然改組的基因構建，所述基因分別編碼健康供體或用某種抗原免疫的供體的可變免疫球蛋白結構域。來自產生抗體的淋巴細胞系的mRNA為此目的而分離。主要使用外周血淋巴細胞，但也已使用脾細胞[Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R等Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157-6162和de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P,等A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230.]、扁桃體細胞或骨髓淋巴細胞[Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard K, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC等Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 1996,14:309-314.]。然後根據mRNA合成cDNA，並可使用寡-dT引物和統計學設計的六核苷酸二者，其得到編碼抗體的可變結構域的基因的所有可能變體的cDNA拷貝[Ulitin AB, Kapralova MV, Laman AG, Shepelyakovskaya AO, Bulgakova EB, Fursova KK等The library of human miniantibodies in the phage display format: Designing and testing. DAN: Izd-vo “Nauka”; 2005.]。 目前在cDNA水準上，一種或數種引物可同時用於限制擴增的基因的範圍至一個或數個可變結構域基因家族或抗體同種型[Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]。用於擴增編碼免疫球蛋白的基因的引物與它們最保守的區域互補。它們的序列選自被組織到資料庫例如Kabat或V BASE資料庫中的基因集。引物設計還提供用於克隆PCR-產物到合適的載體中的內部限制位點。 合成文庫的構建基於天然CDR被一組隨機序列置換進行。在該情況下，有可能產生非常多樣的抗原結合位點。 噬菌體展示是用於抗體搜索的最有力和廣泛使用的體外技術之一。在1985年，Smith發現外源DNA序列可被克隆至絲狀噬菌體M13中和這樣的克隆序列可在噬菌體顆粒的表面上作為融合蛋白表達(Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317.)。因此，有可能根據其結合其它蛋白的能力來選擇目的融合蛋白。該發現與PCR擴增方法組合，這使得可能克隆免疫球蛋白基因的cDNA庫以產生各種含有可變結構域的噬菌體文庫，其可用於快速搜索靶標特異性的單克隆抗體。噬菌體文庫反映了血液用於產生文庫的每個人或動物的B-細胞抗體庫。在1995年，兩篇論文描述了能夠表達全人抗體的遺傳改造的小鼠的產生，該全人抗體的庫與通過雜交瘤技術獲得的那些相當(Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG等: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859)。在這些動物中，它們自身的內源重鏈和k輕鏈免疫球蛋白基因被有意破壞，接著引入轉基因，其是人重鏈和k輕鏈基因的區段。發現人基因庫可被鼠免疫系統利用以產生針對較多各種抗原的高特異性和高親和力抗體。儘管轉基因小鼠表達基本上是小鼠和人組分(人免疫球蛋白，小鼠Igα、Igβ和其它信號轉導分子)的雜合體的B-細胞受體這一事實，但它們的B-細胞正常發育和成熟。 術語“單克隆抗體”或“mAb”是指通過單獨的細胞克隆群合成和分離的抗體。克隆群可以是永生細胞的克隆群。在一些實施方案中，克隆群中的永生細胞是雜合細胞——雜交瘤，其通常通過來自免疫動物的單個B淋巴細胞與來自淋巴細胞瘤的單個細胞融合產生。雜交瘤是一類構建的細胞和天然不存在。 “天然抗體”通常是約150000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈構成。每個輕鏈與重鏈通過一個共價二硫鍵連接，而二硫鍵的數量在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間不同。每個重鏈和輕鏈還具有規律間隔的鏈內二硫橋。每個重鏈在一端具有可變結構域(VH)，接著許多恒定結構域。每個輕鏈在一端具有可變結構域(VL)和在其另一端具有恒定結構域。輕鏈的恒定結構域與重鏈的第一恒定結構域對齊，輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對齊。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結構域之間形成介面。 在本說明書中用於描述各種抗體的術語“分離的”是指從其中表達抗體的細胞或細胞培養物鑒定和分離和/或再生的抗體。來自其天然環境的雜質(污染物組分)是可干擾多肽的診斷或治療用途的材料，和可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶解物。在優選的實施方案中，抗體被純化至(1) 通過使用自旋杯測序儀(Edman測序儀)足以獲得N-端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(2) 使用考馬斯亮藍或優選地銀染色在非還原或還原條件下通過SDS-PAGE進行的同質性。分離的抗體包括在重組細胞內的原位抗體，因為多肽的自然環境的至少一種組分將不存在。分離的多肽通常通過至少一個純化步驟製備。 “分離的”核酸分子是從至少一種核酸分子雜質鑒定和分離的核酸分子，在抗體核酸的自然來源中核酸分子與所述雜質結合。分離的核酸分子不同于在自然條件下發現它的形式或設定(set0)。因此，分離的核酸分子不同于在自然條件下在細胞中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括位於其中正常表達抗體的細胞中的核酸分子，例如，如果核酸分子具有不同于其在自然條件下在細胞中的定位的染色體定位。 如本文使用的術語“表位”預期是指與結合分子(例如，抗體或相關分子，例如雙特異性結合分子)特異性結合的抗原的一部分(決定簇)。表位決定簇通常由分子例如氨基酸或碳水化合物或糖側鏈的化學活性表面組群組成，和通常包含特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。表位元可以是“線性的”或“構象的”。在線性表位元中，在蛋白(例如，抗原)和相互作用分子(例如，抗體)之間的所有相互作用點沿蛋白的一級氨基酸序列線性存在。在構象表位中，相互作用點在蛋白上跨越氨基酸殘基存在，所述氨基酸殘基在一級氨基酸序列中彼此分離。一旦確定了需要的抗原表位元，有可能使用本領域眾所周知的技術產生對該表位的抗體。此外，抗體或其它結合分子的產生和表徵可闡明關於需要的表位元的資訊。從該資訊，然後有可能競爭性篩選結合相同或同一表位的抗體，例如，通過進行競爭研究以發現彼此競爭結合該抗原的結合分子。 如本文使用的術語“肽接頭”預期意指具有聯合結構域的能力的任何肽，其長度取決於它彼此結合的結構域，和包含任何氨基酸序列。優選地，肽接頭具有超過5個氨基酸的長度和由任何組選自G、A、S、P、E、T、D、K的氨基酸組成。 術語“體外”是指在人工條件下在身體外部的生物學實體、生物學過程或生物學反應。例如，體外生長的細胞應理解為在身體外部的環境中，例如在試管、培養瓶或微量滴定板中生長的細胞。 如本文使用的術語“IC50” (抑制濃度50%)是指可測量的活性或反應例如細胞例如腫瘤細胞的生長/增殖被抑制50%的藥物的濃度。IС50值可使用合適的劑量反應曲線，使用用於曲線擬合的特定統計學軟體計算。 術語GI50 (生長抑制50%)是指細胞例如腫瘤細胞的增殖被抑制50%的藥物的濃度。術語“ED50” (EC50) (50%有效劑量/濃度)是指產生50%生物學作用(其可包括細胞毒性)的藥物的濃度。術語“抗增殖活性”預期是指停止或抑制細胞例如癌細胞的生長。 術語抗體“效應子功能”是指可歸因於抗體的Fc區(天然Fc區序列或Fc區氨基酸變體)的生物學活性，其隨抗體同種型改變。抗體效應子功能的實例包括：Clq結合和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下調細胞表面受體(例如，B-細胞受體，BCR)，和B-細胞活化。 “抗體依賴性細胞毒性”或“ADCC”是指細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別在靶細胞上結合的抗體和隨後引起靶細胞的溶解或吞噬作用。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達FcγRJII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達概述於Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)的第464頁的表3。為了評價目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定，例如描述於美國專利號5,500,362或5,821,337的體外ADCC測定。對於這樣的測定可用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者或另外地，目的分子的ADCC活性可在體內，例如在動物模型，例如公開於Clynes等PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)的動物模型中評價。 “人效應細胞”是表達一種或多種FcR和實現效應子功能的白細胞。優選地，該細胞至少表達FcγRIII和實現ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；其中PBMC和NK細胞是優選的。效應細胞可從其天然來源，例如，從血液或PBMC分離，如本文所述。 術語“Fc受體”或“FcR”用於描述結合抗體的Fc區的受體。優選的FcR是天然序列人FcR。此外，優選的FcR是結合IgG抗體的FcR (γ受體)和包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (“活化受體”)和FcγRIIB (“抑制受體”)，其具有類似的氨基酸序列，主要不同之處在於其胞質結構域。活化受體FcγRIIA在其胞質結構域中含有免疫受體酪氨酸基活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中含有免疫受體酪氨酸基抑制基序(ITIM) (見Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)中的綜述)。FcR綜述於Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)。在本文中術語“FcR”包括其它FcR，包括未來鑒定的那些。該術語還包括新生兒受體FcRn，其負責母體IgG轉移至胎兒。 術語“補體依賴性細胞毒性”和“CDC”是指在補體的存在下分子溶解靶標的能力。補體活化途徑通過補體系統的第一組分(C1q)結合至與同源抗原複合的分子(例如，抗體)開始。為了評價補體活化，CDC測定，例如，描述於Gazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)。 術語“同一性”或“同源性”被解釋為意指在對齊序列和引入空位(如果需要的話)以實現整個序列的最大百分比同一性和不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分後，候選物序列中與它所比較的相應序列的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。N-或C-末端延伸以及插入均不視為減少同一性或同源性。用於對齊的方法和電腦程式是本領域眾所周知的。序列同一性可使用序列分析軟體(例如，序列分析套裝軟體，Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705)測量。該軟體通過分配同源性程度至各種置換、缺失(消除)和其它修飾來匹配類似的序列。 關於抗體的多肽序列的術語“同源的”應解釋為相對於多肽序列，抗體顯示至少70%、優選地80%、更優選地90%和最優選地95%序列同一性。關於核酸序列，該術語應解釋為相對於核酸序列，核苷酸序列顯示至少85%、優選地90%、更優選地95%和最優選地97%序列同一性。 提供了本文所述的抗體的氨基酸序列的修飾。例如，可能需要改進抗體的結合親和力和/或其它生物學性質。抗體的氨基酸序列變體通過在抗體核酸中引入合適的核苷酸變化或通過肽合成來製備。這樣的修飾包括例如在抗體的氨基酸序列內殘基的缺失和/或插入和/或置換。進行缺失、插入和置換的任何組合以實現最終的構建體，條件是最終的構建體具有所需的特性。氨基酸變化也可改變抗體的翻譯後過程，例如改變糖基化位點的數量或位置。 抗體的氨基酸序列的修飾的變體使用氨基酸置換進行。這樣的變體是在抗體分子中至少一個氨基酸殘基置換為不同的殘基。對於置換誘變，最感興趣的位點包括超變區或CDR，但也預期FR或Fc改變。保守置換顯示於表A的“優選置換”下。如果這樣的置換導致生物活性改變，可進行其它實質變化，其表示為表A中提供的“示例性置換”，或下文當描述氨基酸類別時更詳細描述的變化，和也可進行產物篩選。

在本說明書中可互換使用的術語“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”是指修飾或未修飾的核苷酸的準確序列，其確定核酸的片段或區域，含有或不含非天然的核苷酸，和是雙鏈DNA或RNA、單鏈DNA或RNA或所述DNA的轉錄產物。 在此處還應包括本發明不涉及在其天然染色體環境中，即在天然狀態中的核苷酸序列。本發明的序列已被分離和/或純化，即，它們被直接或間接採樣，例如通過拷貝，它們的環境已至少部分地被改變。因此，也應在此處提及通過經由例如宿主細胞的重組遺傳學獲得的或通過化學合成獲得的分離的核酸。 對核苷酸序列的提及包括其互補序列，除非另外指明。因此，對具有特定序列的核酸的提及應該理解為包括具有其互補序列的其互補鏈的核酸。 術語“控制序列”是指在特定宿主生物中表達可操作連接的編碼序列所需的DNA序列。適合原核生物的控制序列例如包括啟動子、任選地操縱子序列和核糖體結合位點。已知真核生物細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號和增強子。 核酸當其與另一核酸序列處於功能關係中時，是“可操作連接的”。例如，如果它作為參與多肽分泌的前蛋白表達，前序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA是可操作連接的；如果它影響序列的轉錄，啟動子或增強子與編碼序列是可操作連接的；如果它的位置使得促進翻譯，核糖體結合位元點與編碼序列是可操作連接的。通常，“可操作連接的”是指連接的DNA序列是鄰接的，和在分泌前導序列的情況下，是鄰接的和在閱讀相中。然而，增強子不必然是鄰接的。 如本文使用的術語“載體”是指能夠運輸它已連接的另一種核酸的核酸分子。在一些實施方案中，載體是質粒，即，環狀雙鏈DNA片段，另外的DNA區段可連接到其中。在一些實施方案中，載體是病毒載體，其中另外的DNA區段可連接到病毒基因組中。在一些實施方案中，載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。在進一步的實施方案中，載體(例如，非附加體哺乳動物載體)在引入至宿主細胞時可整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因一起複製。此外，某些載體能夠指導它們可操作連接的基因的表達。這樣的載體在本文被稱為“重組表達載體” (或簡稱“表達載體”)。 如本文使用的術語“重組宿主細胞” (或簡稱“宿主細胞”)預期是指已引入重組表達載體的細胞。本發明涉及宿主細胞，其可包括例如上文所述的根據本發明的載體。本發明還涉及宿主細胞，其包含例如編碼本發明的結合分子的第一結合結構域和/或第二結合結構域的重鏈或其抗原結合部分、輕鏈或其抗原結合部分、或二者的核苷酸序列。應理解，“重組宿主細胞”和“宿主細胞”預期不僅是指特定的主題細胞，而且還指這樣的細胞的子代。因為修飾可在連續傳代中由於突變或環境影響而發生，這樣的子代事實上可能不同於親本細胞，然而這樣的細胞仍包括在如本文使用的術語“宿主細胞”的範圍內。 術語“由HER2介導的疾病或病症”是指與HER2直接或間接相關的任何疾病或病症，包括疾病或病症的病因學、發展、進展、持續或病理學。“治療(treat、treating和treatment)”是指減輕或廢除生物病症和/或其至少一種伴隨症狀的方法。如本文使用的，“減輕”疾病、病症或病況是指減少疾病、病症或病況的症狀的嚴重性和/或發生頻率。此外，本文提及“治療”包括提及治癒性、姑息性和預防性治療。 在一個方面，治療的受試者或患者是哺乳動物，優選地人受試者。所述受試者可以是任何年齡的雄性或雌性。 術語“病症”是指將受益于用本發明的化合物治療的任何病況。這包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳動物對所述病症易感的那些病理情況。 待治療的疾病的非限制性實例包括良性和惡性腫瘤，例如乳腺、卵巢、胃、宮頸、子宮內膜、子宮、唾液腺、肺、腎、結腸、中腸、甲狀腺、胰腺、前列腺、皮膚、頭和/或頸、咽喉、口腔或膀胱的癌症。根據本發明待治療的優選病症是癌症，特別是乳腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、頭和頸癌、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。 術語“癌症”和“癌性”是指在哺乳動物中的生理病況或描述了在哺乳動物中的生理病況，其通常特徵為不受調節的細胞生長/增殖。該定義包括良性和惡性癌性疾病二者。癌性疾病的實例包括但不限於癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病。這樣的癌性疾病的更具體的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀癌、腹腔癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、膠質母細胞瘤、膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟或腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝臟癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤和各種頭和頸癌。 “治療有效量”預期是指給予的治療劑的量，其將在一定程度上減輕治療的病症的一種或多種症狀。 術語“慢性”使用是指與急性(暫態)給予途徑相反，持續(不間斷)使用藥劑以長時間維持初始治療效果(活性)。 “間斷”使用是指不在沒有中斷的情況下一直進行，而更確切地在性質上是週期性的治療。 如本文使用的，詞語“包含(comprise)”、“具有(have)”、“包括(include)”或變化例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”或“包括(including)”和其所有語法變化應理解為意指包括所述整數或整數組，但不排除任何其它整數或整數組。 發明詳述 抗體 本發明涉及特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的雙特異性抗體。 在一個方面，本發明涉及雙特異性抗體，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)，和包括： 1) 第一抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和代表包含以下氨基酸序列的曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)

2) 第二抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)和代表抗原結合區(Fab)，其包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，所述VH包含氨基酸序列

，和所述VL包含氨基酸序列

3) 片段可結晶區(Fc片段)。 包含氨基酸序列

的重鏈可變結構域(VH)包括HCDR1-3： HCDR1: GFTFTDYTMD (SEQ ID NO: 3); HCDR2: DVNPNSGESIYNQRFKG (SEQ ID NO: 4); HCDR3: NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 5)。 包含氨基酸序列

的輕鏈可變結構域(VL)包括LCDR1-3： LCDR1: KALQDVSRGVA (SEQ ID NO: 7); LCDR2: SAHYRYT (SEQ ID NO: 8); LCDR3: QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 9)。 在一些實施方案中，雙特異性抗體是IgG抗體。 在一些實施方案中，雙特異性IgG抗體具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。 在一些實施方案中，雙特異性抗體具有人IgG1同種型。 在一些實施方案中，雙特異性抗體包括免疫球蛋白的可結晶片段(Fc片段)，其包含分別由氨基酸序列

和氨基酸序列

表示的第二和第三恒定結構域(CH2-CH3)的兩個氨基酸序列。 在一些實施方案中，雙特異性抗體包含第二抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)和代表包含以下的抗原結合區(Fab)： a) 重鏈可變結構域(VH)和第一重鏈恒定結構域(CH1)，它們包含氨基酸序列

b) 輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恒定結構域(CK)，它們包含氨基酸序列

在一個方面，本發明涉及雙特異性抗體，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)，包含： 1) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含CH2和CH3恒定結構域和曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)，它們包含氨基酸序列

2) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的重鏈，所述重鏈包含重鏈可變結構域(VH)和第一、第二和第三重鏈恒定結構域(CH1-CH2-CH3)，它們包含氨基酸序列

3) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的輕鏈，所述輕鏈包含輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恒定結構域(CK)，它們包含氨基酸序列

其中部分1)-3)通過二硫鍵互相連接。 在一些實施方案中，雙特異性抗體是雙特異性抗體BCD147-02-020，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)。雙特異性抗體BCD147-02-020是不對稱抗體，即它包含1) 第一抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和代表曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)；和2) 第二抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)和代表抗原結合區(Fab)。雙特異性抗體BCD147-02-020是雙互補位抗體，即結合兩個互補位(人HER2的細胞外結構域的亞結構域II和IV)的抗體。 在一些實施方案中，雙特異性抗體是雙特異性不對稱抗體BCD147-02-020，其特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II。 雙特異性抗體BCD147-02-020包含： 1) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含CH2和CH3恒定結構域和曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)，它們包含氨基酸序列

- “Fc-節 - scFv-曲妥珠單抗”； 2) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的重鏈，所述重鏈包含重鏈可變結構域(VH)和第一、第二和第三重鏈恒定結構域(CH1-CH2-CH3)，它們包含氨基酸序列

- “HC-孔 - aHER2-候選物020-VH”； 3) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的輕鏈，所述輕鏈包含輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恒定結構域(CK)，它們包含氨基酸序列

- “Ck - aHER2-候選物020 VL”， 其中部分1)-3)通過二硫鍵互相連接。 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)的SEQ ID NO: 14的氨基酸序列包含： 1) 恒定結構域CH2和CH3，其包含氨基酸序列

2) 曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)，其包含氨基酸序列

3) 接頭，其包含氨基酸序列ASGDKTHTCP。 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的重鏈(SEQ ID NO: 15)包含： 1) 重鏈可變結構域(VH)和第一重鏈恒定結構域(CH1)，它們包含氨基酸序列

，其包含 a) 重鏈可變結構域(VH)，其包含氨基酸序列

，和 b) 第一重鏈恒定結構域(CH1)，其包含氨基酸序列

2) 第二和第三恒定結構域(CH2和CH3)，它們包含氨基酸序列

3) 接頭，其包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCP。 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的輕鏈(SEQ ID NO: 13)包含： 1) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含氨基酸序列

；和 2) 輕鏈恒定結構域(CK)，其包含氨基酸序列

核酸分子 本發明還涉及核酸分子，特別是編碼在本文中描述的本發明的雙特異性抗體的序列(任選地包括與其連接的任何肽接頭序列)，所述雙特異性抗體特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)。 對核苷酸序列的提及包括其互補序列，除非另外指明。因此，對具有特定序列的核酸的提及應理解為包括具有其互補序列的其互補鏈的核酸。如本文使用的術語“多核苷酸”是指長度為至少10個堿基的核苷酸、或核糖核苷酸、或去氧核糖核苷酸、或任一類型的核苷酸的修飾形式的多聚體形式。該術語包括單鏈和雙鏈形式。 本發明還涉及編碼選自SEQ ID NO: 1-15或其任何組合的氨基酸序列的核苷酸序列。 在一個方面，本發明涉及核酸分子，其包含編碼選自SEQ ID NO: 1-15的氨基酸序列的核苷酸序列。核酸分子還可包含所述核苷酸序列的任何組合。 在一個實施方案中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 1、2和6的核苷酸序列。在另一個實施方案中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 1、2、6、10-11的核苷酸序列。在一個實施方案中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 1、12和13的核苷酸序列。在一個實施方案中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 1、10-13的核苷酸序列。 在一個方面，本發明涉及核酸分子，其包含編碼SEQ ID NO: 13-15的氨基酸序列的核苷酸序列。 在一個方面，本發明涉及核酸分子，其包含上述核酸序列的任何組合。 在任何上述實施方案中，核酸分子可以是分離的。 本發明的核酸分子可從產生特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體的任何來源分離。在某些實施方案中，本發明的核酸分子可以是合成的，而不是分離的。 在一些實施方案中，本發明的核酸分子可包含編碼本發明的抗體的第一或第二結構域的VH結構域的核苷酸序列，其框內連接至編碼任何來源的重鏈恒定結構域的核苷酸序列。類似地，本發明的核酸分子可包含編碼本發明的抗體的第一或第二區域的VL結構域的核苷酸序列，其框內連接至編碼任何來源的輕鏈恒定結構域的核苷酸序列。 在本發明的另一方面，編碼第一或第二結合結構域的重鏈(VH)和/或輕鏈(VL)的可變結構域的核酸分子在抗體基因的整個長度上可被“轉換”。在一個實施方案中，編碼VH或VL結構域的核酸分子通過分別插入已經編碼重鏈恒定(CH)或輕鏈恒定(CL)結構域的表達載體，在整個長度上轉換為抗體基因，使得VH區段可操作連接至載體內的CH區段，和/或VL區段可操作連接至載體內的CL區段。在另一個實施方案中，編碼VH和/或VL結構域的核酸分子使用標準分子生物學技術，通過連接(例如連結)編碼VH和/或VL結構域的核酸分子至編碼CH和/或CL結構域的核酸分子，在整個抗體長度上轉換為基因。完全編碼重鏈和/或輕鏈的核酸分子然後可從已引入它們的細胞表達。 核酸分子可用于表達大量的重組雙特異性抗體，其特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II。核酸分子可用于產生本文所述的雙特異性抗體。 載體 在另一方面，本發明涉及適合表達本文所述的任何核苷酸序列的載體。 本發明涉及包含編碼本文所述的雙特異性抗體或其部分(例如，第一結合結構域的重鏈序列和/或第二結合結構域的重鏈和/或輕鏈序列)的任何氨基酸序列的核酸分子的載體，所述雙特異性抗體特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II。本發明還涉及包含編碼雙特異性抗體或其部分的核酸分子的載體。 在一些實施方案中，特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體通過將如上所述獲得的部分或完全編碼第一或第二結合結構域的序列(例如，輕鏈和重鏈序列，其中結合結構域包含輕鏈和重鏈序列)的DNA插入表達載體中，使得基因可操作連接至必需的表達控制序列例如轉錄和翻譯控制序列來表達。表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、植物病毒例如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒、粘粒、YAC、EBV來源的附加體等。DNA分子可連接至載體，使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮其調節DNA的轉錄和翻譯的預期功能。表達載體和表達控制序列可經選擇以與使用的表達宿主細胞相容。部分或完全編碼第一和第二結合結構域的序列(例如，重鏈和輕鏈序列，其中結合結構域包含重鏈和輕鏈序列)的DNA分子可被引入單獨的載體。在一個實施方案中，所述DNA分子的任何組合被引入相同的表達載體。DNA分子可通過標準方法(例如，抗體基因片段和載體上的互補限制位點的連接，或如果不存在限制位點的話，平端連接)而被引入表達載體。 合適的載體是編碼功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的載體，具有合適的限制位點改造，使得任何VH或VL序列可容易地插入和表達，如上所述。這樣的載體中的HC-和LC-編碼基因可含有內含子序列，其通過穩定相應的mRNA而導致總體抗體蛋白產量提高。內含子序列側接剪接供體和剪接受體位點，其決定發生RNA剪接的位置。內含子序列的位置可在抗體鏈的可變區或恒定區中，或在可變區和恒定區二者中(當使用多個內含子時)。多腺苷酸化和轉錄終止可發生在編碼區下游的天然染色體位點。重組表達載體還可編碼信號肽，其利於抗體鏈從宿主細胞分泌。抗體鏈基因可被克隆至載體中，使得信號肽在框內連接至免疫球蛋白鏈的氨基末端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白的信號肽)。 除了抗體鏈基因外，本發明的重組表達載體還可攜帶調節序列，其控制抗體鏈基因在宿主細胞中的表達。本領域技術人員將理解，表達載體的設計(包括調節序列的選擇)可取決於因素例如待轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白的表達水準等。用於哺乳動物的表達宿主細胞的優選的控制序列包括確保在哺乳動物細胞中高水準的蛋白表達的病毒元件，例如源自逆轉錄病毒LTR、巨細胞病毒(CMV) (例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40 (SV40) (例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒的主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤病毒的啟動子和/或增強子，和強哺乳動物啟動子例如天然免疫球蛋白啟動子或肌動蛋白啟動子。對於病毒控制元件和其序列的進一步描述，參見例如，美國專利號5,168,062、4,510,245和4,968,615。用於在植物中表達結合分子例如抗體的方法(包括啟動子和載體的描述以及植物轉化)是本領域已知的。參見例如美國專利號6,517,529。用於在細菌細胞或真菌細胞例如酵母細胞中表達多肽的方法也是本領域眾所周知的。 除了抗體鏈基因和調節序列外，本發明的重組表達載體還可攜帶另外的序列，例如調節在宿主細胞中載體複製的序列(例如複製起點)和選擇標記基因。選擇標記基因有利於已引入載體的宿主細胞的選擇(參見例如，美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，選擇標記基因通常賦予已引入載體的宿主細胞對藥劑例如G418、潮黴素或甲氨蝶呤的抗性。例如，選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在甲氨蝶呤選擇/擴增期間用於dhfr-宿主細胞)、neo基因(用於G418選擇)和谷氨酸合成酶基因。 如本文使用的術語“表達控制序列”預期是指為實現它們連接的編碼序列的表達和加工所需要的多核苷酸序列。表達控制序列包括合適的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；高效RNA加工信號例如剪接和多腺苷酸化信號；穩定胞質mRNA的序列；提高翻譯效率的序列(即，Kozak共有序列)；提高蛋白穩定性的序列；和需要時，提高蛋白分泌的序列。這樣的控制序列的性質根據宿主生物而不同；在原核生物中，這樣的控制序列通常包括核糖體結合位點的啟動子，和轉錄終止序列；在真核生物中，通常這樣的控制序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語“控制序列”預期至少包括其存在對於表達和加工是必需的所有組分，和還可包括其存在是有利的另外的組分，例如前導序列和融合配偶體序列。 宿主細胞 本發明的另一方面涉及產生特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體的方法。本發明的一個實施方案涉及產生本文所定義的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體的方法，其包括製備能夠表達特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體的重組宿主細胞，在適合表達/產生特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體的條件下培養所述宿主細胞，和分離所述抗體。通過在所述重組宿主細胞中這樣的表達產生的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體在本文稱為“特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的重組雙特異性抗體”。本發明還涉及來自這樣的宿主細胞的細胞子代和類似獲得的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體。 編碼特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體的核酸分子和包含這些核酸分子的載體可用於轉染合適的哺乳動物或其細胞、植物或其細胞、細菌或酵母宿主細胞。轉化可通過將多核苷酸引入宿主細胞的任何已知的技術進行。將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞的方法是本領域眾所周知的和包括葡聚糖介導的轉染、陽離子聚合物-核酸複合物轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、多核苷酸封裝在脂質體中和直接顯微注射DNA至細胞核。此外，核酸分子可通過病毒載體引入哺乳動物細胞。用於轉染細胞的方法是本領域眾所周知的。參見例如，美國專利號4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。用於轉化植物細胞的方法是本領域眾所周知的，包括例如農桿菌屬介導的轉化、基因槍轉化、直接注射、電穿孔和病毒轉化。轉化細菌和酵母細胞的方法也是本領域眾所周知的。 用作轉化宿主的哺乳動物細胞系是本領域眾所周知的和包括多種可獲得的永生細胞系。這些包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、FreeStyle 293細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞和許多其它細胞系。細胞系通過確定那些細胞系具有高表達水準和提供產生的蛋白的所需特徵而進行選擇。可使用的其它細胞系是昆蟲細胞系，例如Sf9或Sf21細胞。當編碼特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體的重組表達載體被引入哺乳動物宿主細胞時，通過培養宿主細胞足以允許在宿主細胞中表達抗體，或者更優選地，分泌抗體到生長宿主細胞的培養基中的一段時間產生抗體。特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體可使用標準蛋白純化技術從培養基重構。植物宿主細胞包括例如煙草、擬南芥、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括埃希氏菌屬和鏈黴菌屬物種。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖酵母、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母。 此外，特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體從生產細胞系的產生水準可使用許多已知的技術提高。例如，谷氨醯胺合成酶基因表達系統(GS系統)是一種在某些條件下提高表達的常用方法。GS系統結合ЕР號0216846、0256055、0323997和0338841整體或部分地論述。 可能的是，由各種細胞系或在轉基因動物中表達的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體彼此具有不同糖基化概況。然而，由本文所述的核酸分子編碼或包含本文提供的氨基酸序列的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體是本發明的一部分，而不管結合分子的糖基化狀態如何，和一般而言，不管是否存在翻譯後修飾。 抗體的製備 本發明還涉及用於產生特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體的方法和過程。 單克隆抗體 單克隆抗體可使用最初由Kohler等Nature 256,1975, p. 495描述的雜交瘤方法製備，或可使用重組DNA方法(US 4816567)製備。 在雜交瘤方法中，小鼠或其它合適的宿主動物例如倉鼠，根據上述方法免疫以誘發產生或能夠產生抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合用於免疫的蛋白。根據另一個實施方案，淋巴細胞可通過體外免疫產生。在免疫後，分離淋巴細胞，然後使用合適的融合劑例如聚乙二醇與骨髓瘤細胞系融合，以產生雜交瘤細胞。 以上述方式產生的雜交瘤細胞可在合適的培養基中培養，所述培養基優選地含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，用於雜交瘤的培養基通常將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養基)，即阻止HGPRT-缺陷細胞的生長的物質。 用作骨髓瘤細胞融合的組分的優選細胞是高效融合，支持選擇的抗體產生細胞穩定高水準產生抗體，和對選擇未融合的親本細胞的培養基敏感的那些細胞。優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，例如源自MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的那些，其可獲自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA；和SP-2或X63-Ag8-653細胞，其可獲自the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA。還已經描述了人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞系用於產生單克隆抗體(Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, p. 3001)。 優選地，通過雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉澱或通過體外結合測定法，例如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定。 單克隆抗體的結合親和力可例如通過Munson等Anal. Biochem., 107:220 (1980)中描述的Scatchard分析測定。 一旦產生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞被鑒定，可通過有限稀釋程式將克隆進行亞克隆和通過標準方法生長。為此目的，合適的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水腫瘤體內生長，例如通過腹膜內(i.p.)注射細胞到小鼠中。 由亞克隆分泌的單克隆抗體可通過常規的抗體純化技術，例如親和色譜(例如，使用蛋白A-或蛋白G-Sepharose)或離子交換色譜、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析等，從培養基、腹水液或血清分離。 編碼單克隆抗體的DNA使用常規程式容易地分離和測序(例如，通過使用能夠特異性結合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞用作這樣的DNA的優選來源。一旦分離，DNA可置於表達載體中，其然後轉染至宿主細胞(其在沒有轉染時不產生抗體蛋白)，例如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以獲得單克隆抗體在重組宿主細胞中的合成。 在進一步的實施方案中，單克隆抗體或抗體片段可從使用McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)中描述的技術產生的抗體噬菌體文庫分離。Clackson等, Nature, 352: 624-628 (1991)和Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)分別描述了使用噬菌體文庫的鼠和人抗體的分離。隨後的出版物描述了通過鏈改組(Marks等，Bio/ Technology, 10:779-783 (1992)以及組合感染和體內重組作為構建極大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等, Nucl. Acids. Res. 21:2265-2266 (1991)產生高親和力(nM範圍)人抗體。因此，這些技術是用於分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方案。 編碼抗體的DNA可經修飾，例如以產生嵌合或融合抗體多肽，例如通過用重鏈和輕鏈(CH和CL)恒定區序列置換同源的鼠序列(US 4816567和Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81:6851 (1984)，或通過共價融合免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的所有或部分編碼序列進行。非免疫球蛋白多肽序列可置換抗體的恒定區，或它們可置換抗體的抗原結合中心的可變結構域以產生嵌合二價抗體，其包含具有對抗原的特異性的一個抗原結合位點和具有對不同抗原的特異性的另一個抗原結合位點。 人抗體和基於噬菌體展示文庫的方法 現在有可能產生能夠在免疫後產生全範圍的人抗體而沒有內源免疫球蛋白產生的轉基因動物(例如，小鼠)。例如，已描述了在嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合缺失導致完全抑制內源抗體產生。人種系免疫球蛋白基因群轉移到這樣的種系突變小鼠中導致在抗原攻擊後產生人抗體(US 5545806、5569825、5591669 (全部GenPharm)；5545807；和WO 97/17852)。 或者，噬菌體展示技術(McCafferty等，Nature, 348: 552-553 (1990))可用於從來自免疫供體身體的免疫球蛋白可變(V)區基因庫體外產生人抗體和抗體片段。根據該技術，抗體V-區基因與絲狀噬菌體例如M13或fd的主要或次要包膜蛋白基因框內克隆，和作為功能抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基於抗體的功能性質的選擇還導致選擇編碼顯示所述性質的抗體的基因。因此，噬菌體模擬一些B-細胞性質。噬菌體展示可以各種形式進行。V-基因區段的數種來源可用於噬菌體展示。Clackson等，Nature, 352:624-628 (1991)從源自免疫小鼠的脾的V基因的小隨機組合文庫分離了各種抗-噁唑酮抗體。可構建來自未免疫人供體的V基因的庫，和針對各種抗原(包括自身抗原)的抗體可基本上按照Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)描述的技術分離。 如上所述，人抗體也可通過體外活化B細胞產生(參見US 5567610和5229275)。 雙特異性抗體 雙特異性抗體是對至少兩個不同的表位具有結合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可以是特異性結合蛋白的兩個不同的表位、特別是人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體。雙特異性抗體可作為全長抗體或抗體片段(例如，雙特異性抗體的F(ab’)2片段)製備。 用於產生雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統產生基於兩對免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達進行，其中兩個鏈具有不同的特異性。因為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadromas))產生10種不同的抗體分子的潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。正確分子的純化(其通常通過數個步驟的親和色譜進行)相當麻煩，並且產物產量低。類似的程式公開於WO 93/08829。 根據不同方法，具有所需結合特異性(結合的抗原結合位點)的抗體可變結構域與免疫球蛋白恒定結構域序列融合。優選地，融合用至少包含鉸鏈CH2和CH3區的一部分的Ig重鏈恒定區進行。優選地，含有輕鏈結合所需的位點的第一重鏈恒定區(CH1)在至少一種融合物中存在。編碼免疫球蛋白重鏈融合物和如果需要的話免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入各種表達載體，和共轉染至合適的宿主細胞。在當構建中使用不等比率的三個多肽鏈以提供最佳產量的實施方案中，在選擇三個多肽片段的相互比例方面，這提供較大的靈活性。然而，當相等比率的至少兩個多肽鏈的表達導致高產量時，或當比率沒有顯著影響時，有可能在單一表達載體中將編碼序列插入兩個或所有三個多肽鏈。 在該方法的優選的實施方案中，雙特異性抗體是在第一臂中的提供第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和在第二臂中的雜合免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(提供第二結合特異性)。已發現，這種不對稱結構有利於從不需要的免疫球蛋白鏈組合分離所需的雙特異性分子，因為在僅一半雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈有利於分離。該方法公開於WO 94/04690。對於關於產生雙特異性抗體的更多細節，參見例如Suresh等，Methods in Enzymology 121:210 (1986)。 根據描述於US 5731168的另一種方法，可構建一對抗體分子之間的介面以最大化從重組細胞培養物中獲得的異二聚體的百分比。優選的介面包含至少一部分的CH3區。根據該方法，來自第一抗體分子的介面的一個或多個具有側鏈的小氨基酸被置換為較大側鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)。與大側鏈相同或相似大小的補償“洞”在第二抗體分子的介面上通過置換含有大側鏈的氨基酸為含有較小側鏈的氨基酸(例如，丙氨酸或蘇氨酸)產生。這提供與其它不需要的終產物相比增加異二聚體產量的機制。 雙特異性抗體包括交聯的或“異綴合物”抗體。例如，異綴合物中的一種抗體可與抗生物素蛋白偶聯，和另一種與生物素偶聯。這樣的抗體可例如用於使免疫系統細胞靶向不需要的細胞(US 4676980)，和用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。異綴合物抗體可使用任何方便的交聯方法製備。合適的交聯劑以及各種交聯技術是本領域眾所周知的，和公開於US 4676980。 用於從抗體片段產生雙特異性抗體的技術也已在文獻中描述。例如，雙特異性抗體可使用化學結合製備。Brennan等Science 229:81 (1985)已描述了一種程式，根據該程式，完整抗體經蛋白水解裂解以產生F(ab’)2。這些片段在二硫醇絡合劑(例如亞砷酸鈉)的存在下被還原以穩定鄰近的二硫醇和防止形成分子間二硫鍵。產生的Fab’片段然後轉變為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。Fab’-TNB衍生物之一然後通過用巰乙胺還原再轉變為Fab’-硫醇，和與等摩爾量的另一種Fab’-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定的試劑。 最近的進展已促進從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，其可經化學偶聯以產生雙特異性抗體。Shalaby等J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)描述了產生全人源化的雙特異性抗體分子的F(ab’)2。每個Fab’從大腸桿菌單獨分泌和進行體外直接化學偶聯以形成雙特異性抗體。由此獲得的雙特異性抗體能夠結合過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶標的溶解活性。 也已描述用於直接從重組細胞培養物產生和分離雙特異性抗體片段的各種技術。例如，雙特異性抗體已使用亮氨酸拉鍊產生(Kostelny等, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鍊肽通過基因融合被連接至兩個不同抗體的Fab’。抗體同二聚體在鉸鏈區被還原以形成單體，然後再氧化以形成抗體異二聚體。該方法也可用於產生抗體同二聚體。Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)描述的“雙鏈抗體(diabody)”技術是一種用於產生雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭連接至VL區的VH區，所述接頭太短而不允許在同一鏈上的兩個結構域之間配對。因此，一個片段的VH和VL區必須與另一個片段的互補VL和VH區配對，從而形成兩個抗原結合位點。也已描述使用單鏈(Fv)-(sFv)二聚體產生雙特異性抗體片段的另一個策略(參見Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)。 藥物組合物 在另一方面，本發明提供包含作為活性成分(或作為僅有的活性成分)的雙特異性抗體的藥物組合物，所述雙特異性抗體特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II。藥物組合物可包括至少一種如本文所述的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體和一種或多種靶向一種或多種相應的表面受體的另外的結合分子(例如，抗體)。在一些實施方案中，組合物預期改善、預防或治療可能與HER2有關的病症。 “藥物組合物”是指包含特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體和至少一種選自藥學上可接受的和藥理學上相容的賦形劑的組分的組合物，所述賦形劑例如填充劑、溶劑、稀釋劑、載體、輔助劑、分散劑、遞送劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、助懸劑、增稠劑、延長遞送控制劑，其選擇和比例取決於給藥類型和途徑以及劑量。本發明的藥物組合物和其製備方法無疑對本領域技術人員而言是顯而易見的。藥物組合物應優選地按照GMP (良好生產規範)要求製備。該組合物可包含緩衝液組合物、張度劑、穩定劑和增溶劑。組合物的長期作用可通過減慢活性藥物成分的吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現。合適的載體、溶劑、稀釋劑和遞送劑的實例包括水、乙醇、多元醇和它們的混合物、油和有機酯(用於注射的)。 “藥劑(藥物)”是化合物或化合物的混合物，其作為呈片劑、膠囊劑、粉劑、凍幹物、注射劑、輸注劑、軟膏劑和其它現用形式的形式的藥物組合物，意圖用於恢復、改進或改變人和動物的生理功能，和用於治療和預防疾病，用於診斷、麻醉、避孕、美容等。本領域認可的用於給予肽、蛋白或抗體的任何方法可適合用於特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體。 術語“藥學上可接受的”是指一種或多種相容性液體或固體組分，其適合給予哺乳動物，優選地人。 術語“賦形劑”在本文用於描述本發明的上述成分以外的任何成分。這些是無機或有機性質的物質，其用於藥學生產，以提供具有必需的物理化學性質的藥物產品。 如本文使用的，“緩衝液”、“緩衝液組合物”、“緩衝劑”是指能夠通過其酸-堿共軛組分的作用抵抗pH變化，並允許特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體的藥物抵抗pH變化的溶液。通常，藥物組合物優選地具有4.0-8.0的範圍的pH。使用的緩衝液的實例包括但不限於乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸、琥珀酸鹽等緩衝液溶液。 如本文使用的術語“張度劑”、“滲透物”或“滲透劑”是指可增加液體抗體製劑的滲透壓的賦形劑。“等滲”藥物是具有等於人血液的滲透壓的藥物。等滲藥物通常具有約250-350 mOsm/kg的滲透壓。使用的等滲劑包括但不限於多元醇、糖類和蔗糖、氨基酸、金屬鹽例如氯化鈉等。 “穩定劑”是指一種賦形劑或兩種或更多種賦形劑的混合物，其提供活性劑的物理和/或化學穩定性。穩定劑包括氨基酸，例如但不限於精氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、穀氨醯胺、脯氨酸；表面活性劑，例如但不限於，聚山梨醇酯20 (商品名：Tween 20)、聚山梨醇酯80 (商品名：Tween 80)、聚乙二醇-聚丙二醇和其共聚物(商品名：Poloxamer、Pluronic)、十二烷基硫酸鈉(SDS)；抗氧化劑，例如但不限於甲硫氨酸、乙醯半胱氨酸、抗壞血酸、單硫代甘油、亞硫酸鹽等；螯合劑，例如但不限於，乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙三胺五乙酸(DTPA)、檸檬酸鈉等。 如果活性劑在貯存溫度例如2–8°C在指定的保質期中保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物活性，藥物組合物是“穩定的”。優選地，活性劑保持物理和化學穩定性二者，以及生物活性。貯存期根據在加速或自然老化條件下的穩定性試驗的結果進行調整。 本發明的藥物組合物可以現成製劑的形式，以單一單位劑量或多個單一單位劑量的形式生產、包裝或廣泛出售。如本文使用的術語“單一單位劑量”是指離散量的含有預定量的活性成分的藥物組合物。活性成分的量通常等於在受試者中要給予的活性成分的劑量，或這樣的劑量的適宜部分，例如這樣的劑量的一半或三分之一。 根據本發明的藥物組合物通常適合於作為無菌製劑進行胃腸外給予，其意圖用於通過注射、輸注和植入，繞過胃腸道，通過皮膚或粘膜屏障中的裂口給予人體。例如，胃腸外給予特別包括皮下、腹膜內、肌內、胸骨內、靜脈內、動脈內、鞘內、心室內、尿道內、顱內、滑膜內、經皮注射或輸注；和腎透析輸注技術。也可使用腫瘤內遞送，例如腫瘤內注射。還提供局部灌注。優選的實施方案包括靜脈內和皮下途徑。本領域認可的給予肽或蛋白的任何方法可適合用於特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體。 在不受限制的情況下，注射製劑可以單位劑型，例如在安瓿、小瓶、塑膠容器、預填充注射器、自動注射裝置中生產、包裝或出售。用於胃腸外給予的製劑特別包括混懸劑、溶液劑、乳劑(在油性或水性基質中)、糊劑等。 在另一個實施方案中，本發明提供用於胃腸外給予的組合物，其包含以乾燥(即粉末或顆粒)形式提供以在給予前用合適的基質(例如，無菌無熱源水)重構的藥物組合物。這樣的製劑可通過例如凍幹過程製備，凍幹過程在本領域中稱為冷凍乾燥，和包括將產物冷凍，接著從冷凍材料中除去溶劑。 特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體也可單獨，作為與合適的藥學上可接受的賦形劑的混合物從吸入器、例如加壓氣霧劑容器、泵、噴霧器、霧化器或噴射器(其中使用或不使用合適的拋射劑)，或作為滴鼻劑或噴霧劑，經鼻內或通過吸入給予。 用於胃腸外給予的劑型可經配製以直接釋放或改進釋放。改進釋放製劑包括延緩、持續、脈衝、受控、靶向和程式化釋放。 特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體的治療用途 在一個方面，特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體用於治療與HER2活性相關的病症。 在一個方面，治療的受試者或患者是哺乳動物，優選地人受試者。所述受試者可以是任何年齡的雄性或雌性。 在腫瘤(例如癌症)的情況下，治療有效量的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體可減少癌細胞數量；減少初始腫瘤大小；抑制(即，在一定程度上減慢和優選地停止)癌細胞侵潤至周圍器官；抑制(即，在一定程度上減慢和優選地停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與該病症有關的症狀。抗體或其片段可在一定程度上防止已有的癌細胞生長和/或殺死已有的癌細胞，其可以是細胞抑制性和/或細胞毒性的。對於癌症療法，體內功效可例如通過評價存活率、至腫瘤進展的時間(TTP)、腫瘤對治療的反應率(RR)、反應持續時間和/或生活品質來測量。 如本文使用的，提及特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體和一種或多種不同治療劑的術語“共給藥”、“共給予”和“與……組合”預期意指、是指或包括以下內容： 1) 當所述組分一起配製為基本上同時釋放所述組分給需要治療的患者的單一劑型時，同時給予所述患者特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體和治療劑的這樣的組合， 2) 當所述組分彼此分開配製為基本上同時被需要治療的患者攝取(其後所述組分基本上同時釋放給所述患者)的單獨劑型時，同時給予所述患者特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體和治療劑的這樣的組合， 3) 當所述組分彼此分開配製為在連續時間(在各給予之間有顯著時間間隔)被需要治療的患者攝取(其後所述組分基本上不同時間釋放給所述患者)的單獨劑型時，序貫給予所述患者特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體和治療劑的這樣的組合；和 4) 當所述組分一起配製為以受控方式釋放所述組分(其後它們在相同和/或不同的時間同時、連續或共同釋放給需要治療的患者)的單一劑型時，序貫給予所述患者特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體和治療劑的這樣的組合，其中各部分可通過相同或不同的途徑給予。 特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體可在無需進一步治療性治療的情況下，即，作為非依賴性療法給予。此外，通過特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體的治療可包括至少一種另外的治療性治療(組合療法)。在一些實施方案中，特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體可與不同癌症藥劑/藥物組合給予，或與其一起配製。 如本文使用的術語“細胞毒素劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語預期包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化學治療劑和細菌、真菌、植物或動物來源的毒素例如小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。 “化學治療劑”是用於治療癌症的化學化合物。化學治療劑的實例包括烷化劑例如塞替派和環磷醯胺(CYTOXAN®)；烷基磺酸酯例如白消安、英丙舒凡和呱泊舒凡；氮丙啶類例如苯並多巴、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲基蜜胺；番荔枝內酯類(acetogenins)(例如，布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚MARINOL®)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素；樺木酸；喜樹堿(包括合成類似物托泊替康(HYCAMTIN®)、CPT-11 (伊立替康、CAMPTOSAR®)、乙醯喜樹堿、東莨菪素和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素；callystatin；CC-1065 (包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；鬼臼毒素; 鬼臼酸; 替尼泊苷；隱藻素類(cryptophycins)(例如，隱藻素類1和隱藻素類8)；朵拉司他汀；duocarmycin (包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、環磷醯胺、雌莫司汀、異環磷醯胺、氮芥、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素例如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素, 例如，卡奇黴素γII和卡奇黴素ωII (參見例如，Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994))；蒽環類抗生素(dynemicin), 包括dynemicin A；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新制癌菌素髮色團和相關的色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素、放線菌素、安麯黴素、氮絲氨酸、博來黴素、放線菌素C、carabicin、去甲柔紅黴素、嗜癌黴素、色黴素、放線菌素D、柔紅黴素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN®、嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星、多柔比星HCl脂質體注射液(DOXOL®)、脂質體多柔比星TLC D-99 (MYOCET®)、聚乙二醇化脂質體多柔比星(CAELYX®)和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素例如絲裂黴素C、黴酚酸、諾拉黴素、橄欖黴素、培洛黴素、potfiromycin、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗-代謝物例如甲氨蝶呤、吉西他濱(GEMZAR®)、替加氟(UFTORAL®)、卡培他濱(XELODA®)、epothilone和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物例如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物例如氟達拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物例如安西他濱、阿紮胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；抗-腎上腺素例如氨基格魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補償物例如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；氨基乙醯丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；依託格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達；美登素類化合物例如美登素和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星;洛索蒽醌；2-乙基醯肼；丙卡巴肼；PSK®多糖複合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生；根黴素；西佐喃；鍺螺胺；細格孢氮雜酸;三亞胺醌；2,2’,2”-三氯三乙基胺；單端孢黴烯(例如，T-2毒素、疣孢菌素(verracurin) A、杆孢菌素A和蛇行菌素(anguidine))；烏拉坦；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇;呱泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷例如，紫杉醇(TAXOL®)、紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒製劑(ABRAXANE®)和多西他賽(TAXOTERE®)；苯丁酸氮芥；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨蝶呤；鉑劑例如順鉑、奧沙利鉑和卡鉑；長春花生物鹼，其阻止微管蛋白聚合免于形成微管，包括長春堿(VELBAN®)、長春新堿(ONCOVIN®)、長春地辛(ELDISINE®)、FILDESIN®)和長春瑞濱(NAVELBINE®)；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；亞葉酸；諾消靈；依達曲沙；柔紅黴素；氨基蝶呤；伊班膦酸鹽；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視色素例如視黃酸，包括貝沙羅汀(TARGRETIN®)；二膦酸鹽例如氯膦酸鹽(例如BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸鹽(DIDROCAL®)、NE- 58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽(FOSAMAJX®)、帕米膦酸鹽(AREDIA®)、替魯膦酸鹽(SKELID®)或利塞膦酸鹽(ACTONEL®)；曲沙他濱(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細胞增殖的信號轉導途徑的基因的表達(例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因數受體(EGF-R))的那些；疫苗例如THERATOPE®疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗和VAXID®疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如，LURTOTECAN®)；rmRH (例如，ABARELIX®)；BAY439006 (索拉非尼；Bayer)；SU-11248(Pfizer)；呱立福辛、COX-2抑制劑(例如，塞來考昔或艾托考昔)、蛋白體抑制劑(例如，PS341)；硼替佐米(VELCADE®)；CCI-779；tipifarnib (811577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制劑例如oblimersen sodium (GENASENSE®)；pixantrone；EGFR抑制劑(參見下文的定義)；酪氨酸激酶抑制劑(參見下文的定義)；和任何上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多種上述的組合，例如CHOP，即環磷醯胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍的組合療法的縮寫，和FOLFOX，即奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU和亞葉酸組合的治療方案的縮寫。 該定義中還包括抗激素劑，其用於調節或抑制對腫瘤的激素作用，例如具有混合的激動劑/拮抗劑特徵的抗雌激素，包括他莫昔芬(NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(FARESTON®)、艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬(EVTSTA®)、曲沃昔芬、keoxifene和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，例如SERM3；沒有激動劑性質的純的抗雌激素，例如氟維司群(FASLODEX®)和EM800 (這樣的藥劑可阻斷雌激素受體(ER)二聚化，抑制DNA結合，增加ER周轉和/或抑制ER水準)；芳香酶抑制劑，包括甾體芳香酶抑制劑，例如福美坦和依西美坦(AROMASIN®)和非甾體芳香酶抑制劑，例如anastrazole (AREVIIDEX®)、來曲唑(FEMARA®)和氨基格魯米特，和其它芳香酶抑制劑，包括伏氯唑(RIVISOR®)、醋酸甲地孕酮(MEGASE®)、法倔唑、咪唑；促黃體激素釋放激素激動劑，包括亮丙瑞林(LUPRON®和ELIGARD®)、戈舍瑞林、布舍瑞林和tripterelin；性甾體，包括妊娠素，例如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羥孕酮，雌激素例如己烯雌酚和馬雌激素，和雄激素/類視色素例如氟甲睾酮、全反式維甲酸和芬維A胺；奧那司酮；抗-黃體酮；雌激素受體下調劑(ERD)；抗雄激素，例如氟他胺、尼魯米特和比卡魯胺；睾內酯;和任何上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多種上述的組合。 給藥劑量和途徑 特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體以有效治療所述病況的量，即以實現理想結果所需的劑量和時間給予。治療有效量可根據因素例如治療的特定病況，患者的年齡、性別和重量，和特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體作為獨立治療還是與一種或多種另外的藥物或治療組合給予而改變。 可調整劑量方案以提供最佳反應。例如，可給予單次推注，可隨時間給予數個分開劑量，或按治療情況的緊急性所指示的，劑量可按比例減少或增加。特別有利的是以單位劑型配製胃腸外組合物以易於給藥和劑量的均勻性。如本文使用的單位劑型預期是指適合作為待治療的患者/受試者的單一劑量的物理離散單位；每個單位含有經計算以產生所需治療效果的預定量的活性化合物與所需的藥物載體的組合。本發明的單位劑型的規格通常通過以下方面規定和直接依賴於以下方面：(a) 化學治療劑的獨特性質和要實現的特定治療性或預防性效果，和(b) 本領域中為治療受試者的敏感性配製這樣的活性化合物的固有限制。 因此，根據本文提供的公開內容，技術人員將理解，劑量和劑量方案根據治療領域眾所周知的方法進行調整。即是說，可容易建立最大耐受劑量，並且也可測定向患者提供可檢測的治療效果的有效量，也可測定對於給予每種藥劑以向患者提供可檢測的治療效果的暫時需要。因此，儘管本文例舉了某些劑量和給藥方案，但這些實例絕不限制在實施本發明的實施方案中可提供給患者的劑量和給藥方案。 應注意，劑量值可隨待減輕的病況的類型和嚴重性改變，和可包括單劑量或多個劑量。此外，應理解，對於任何特定的受試者，具體的劑量方案應隨時間根據個體需要和給予或監督給予組合物的醫學專業人員的判斷調整，和本文提供的劑量範圍僅是示例性的，並不預期限制要求保護的組合物的範圍或實踐。此外，本發明的組合物的劑量方案可基於各種因素，其包括疾病的類型，患者的年齡、重量、性別、醫學情況，病況的嚴重性，給予途徑和使用的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的具體的雙特異性抗體。因此，劑量方案可廣泛改變，但可使用標準方法常規測定。例如，劑量可根據藥代動力學或藥效學參數調整，所述參數可包括臨床效果，例如毒性效果和/或實驗室值。因此，本發明包括患者內劑量逐步增加，如通過本領域技術人員測定的。用於測定合適的劑量和方案的方法是本領域眾所周知的，和一旦提供本文公開的想法後將為技術人員所理解。 上文提供了合適的給予方法的實例。 認為特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體的合適劑量範圍將為0.1-200 mg/kg，優選地0.1-100 mg/kg，包括約0.5-50 mg/kg，例如約1-20 mg/kg。特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體可例如，以至少0.25 mg/kg，例如至少0.5 mg/kg，包括至少1 mg/kg，例如至少1.5 mg/kg，例如至少2 mg/kg，例如至少3 mg/kg，包括至少4 mg/kg，例如至少5 mg/kg；和例如至多最大50 mg/kg，包括至多最大30 mg/kg，例如，至多最大20 mg/kg，包括至多最大15 mg/kg的劑量給予。給予通常將以合適的時間間隔重複，例如一週一次、每兩週一次、每三週一次或每四周一次，和持續由責任醫師認為合適的時間，如果需要的話，責任醫師可在一些情況下增加或減少劑量。 製品(產品)和試劑盒 根據另一個實施方案，本發明提供製品，其包含預期用於治療癌症的產品，所述癌症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。產品是具有標籤和包裝插頁的容器，其可以在泡罩和/或包裝中。合適的容器包括例如小瓶、安瓿、注射器等。容器可由各種材料例如玻璃或聚合物材料製成。容器包含有效治療某種病況的組合物和可具有無菌存取口。組合物中至少一種活性成分是根據本發明的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體。標籤和包裝插頁指明藥物預期用於治療某種病況。標籤和/或包裝插頁另外含有在患者中給予抗體組合物的說明書，包括這樣的治療產品的適應症、頻率、劑量、給予途徑、禁忌徵候和/或注意事項。在一個實施方案中，包裝插頁指明組合物預期用於治療由HER2介導的疾病或病症，特別是選自以下的癌症：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。 此外，製品可包含但不限於商業目的所需的或消費者所需的其它產品，例如溶劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。 診斷用途和組合物 特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的本發明的雙特異性抗體還用於診斷過程(例如，體外、離體)。例如，該雙特異性抗體可用於檢測或測量從患者獲得的樣品(例如，組織樣品或體液樣品，例如炎性滲出物、血液、血清、腸液、唾液或尿液)中的HER2水準。用於檢測和測量的合適方法包括免疫測定法，例如流式細胞術、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、化學發光測定法、放射免疫測定法和免疫組織學。本發明還包括試劑盒，例如診斷試劑盒，其包含本文所述的特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性抗體。

以下實施例為更好理解本發明而提供。這些實施例僅為說明目的，和不應解釋為以任何方式限制本發明的範圍。 本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請通過參考併入本文。儘管為清楚理解的目的，前述發明已通過舉例說明和實例相當詳細地進行了描述，但根據本發明的教導，本領域普通技術人員將顯而易見的是，在不脫離隨附實施方案的精神或範圍的情況下可對其進行某些變化和改變。 材料和通用方法 關於人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般資訊在以下中給出：Kabat, E.A.,等Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗體鏈的氨基酸根據EU編號(Edelman, G.M.,等, Proc. Natl. Acad. Sci. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A.,等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))進行編號和提及。 重組DNA技術 標準方法用於操縱DNA，如Sambrook, J.等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述。分子生物學試劑根據生產商的說明書使用。 基因合成 所需的基因區段從通過化學合成製備的寡核苷酸製備。側接有單一限制位點的300-4000 kb長的基因區段，通過包括PCR擴增在內的寡核苷酸的退火和連接裝配，隨後通過指定的限制位點克隆。亞克隆的基因片段的DNA序列通過DNA測序證實。 DNA序列測定 DNA序列通過Sanger測序測定。 DNA和蛋白序列分析和序列資料管理 Infomax的Vector NT1 Advance套裝版本8.0用於序列產生、作圖、分析、注釋和說明。 表達載體 對於所述抗體和抗原的表達，應用意圖用於在原核生物細胞(大腸桿菌)中表達、在真核生物細胞(例如，CHO細胞)中暫態表達的表達質粒的變體。除了抗體表達盒之外，載體還含有：允許所述質粒在大腸桿菌中複製的複製起點、賦予大腸桿菌對各種抗生素(例如，氨苄西林和卡那黴素)的抗性的基因。 包含如下文描述的所述抗體鏈的融合基因通過PCR和/或基因合成產生，和用已知的重組方法和技術，通過連接相應的核酸區段，例如，使用在相應的載體中獨特的限制位點進行裝配。亞克隆的核酸序列通過DNA測序驗證。對於暫態轉染，通過從轉化的大腸桿菌培養物中製備質粒，製備較大量的質粒。 實施例1 在哺乳動物細胞的懸浮培養物中產生重組抗原和對照抗體 合成人Her2和動物Her2的細胞外結構域的序列和克隆至用於在哺乳動物細胞中產生Fc-標記蛋白的載體的SalI/ NotI限制位點(圖1)。 具有公佈的序列的抗體帕妥珠單抗、曲妥珠單抗用作對照。合成抗體的重鏈/輕鏈可變結構域的基因和分別克隆至意圖用於在哺乳動物細胞中產生蛋白的載體pEE-HC、pEE-CK的SalI/NotI限制位點(圖2、3)。 將需要數量的質粒在大腸桿菌細胞中培養和使用Qiagen試劑盒純化。 抗原和對照抗體在從中國倉鼠卵巢細胞獲得的建立的細胞系(CHO-T)中產生。在培養瓶中在軌道孵育振盪器上使用補充有8 mM L-穀氨醯胺和1 g/l pluronic 68的無血清培養基(HyCell TransFx-C)進行懸浮液培養。對於暫態表達，細胞(2-2.2×10⁶ 個細胞/ml)通過線性聚乙烯亞胺(PEI MAX, Polysciences)轉染。DNA/PEI比率是1:3/1:10。在轉染後9天，通過0.5/0.22 µm深床濾器過濾，從細胞分離培養液。目標蛋白通過親和HPLC從培養液分離。 重組Fc蛋白在用於親和HPLC的蛋白A柱上從培養液分離和純化。將澄清的培養液通過用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS, pH 7.4)平衡的5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF柱(GE Healthcare)。然後柱用5倍體積的PBS洗滌以除去非特異性結合的組分。結合的抗原用0.1 M甘氨酸緩衝液(pH 3)洗脫。收集主要蛋白洗脫峰和用1 M Tris緩衝液(pH 8)達到中性pH。所有階段在110 cm/h流速下進行。然後使用SnakeSkin Dialysis Tubing技術將蛋白透析到PBS (pH 7.4)中，過濾(0.22 µm)，轉移至管中和在-70°С下貯存。 獲得的蛋白溶液的純度通過還原型和非還原型SDS-PAGE評價。 實施例2 合成的優化組合Fab文庫的改造 為了改造突變體Her2-特異性抗體，使用Schrodinger Suite (Schrodinger)和YLab (BIOCAD)軟體進行選擇的天然結合物的3D結構分析。作為目標晶體結構，我們選擇PDB 1S78，其包含目標結構，和具有類似結合表位的對照抗體帕妥珠單抗的結構。使用BioLuminate (來自Schrodinger Suite (Schrodinger))和BENDER (來自YLab包(BIOCAD))進行天然結合物的同源折疊。使用HEDGE蛋白-蛋白停靠工具(來自YLab包(BIOCAD))獲得相互作用複合物的模型。對於以各種類比間隔捕獲的動態幀，使用MM-GBSA方法(用OPLS_2005力場)，通過以50納秒間隔的分子動力學測量中值結合能量(來自Schrodinger Suite的Desmond工具)，選擇最佳劑量。獲得的結構使用PyMOL (Schrodinger)工具顯現。 我們鑒定和修正了翻譯後修飾的潛在位點，以及提議了置換點，提高了提議的序列的人源化和潛在地增強了結合。這些點使用在選擇位置的氨基酸的結構置換和通過MM-GBSA (用OPLS_2005力場)計算測量結合能量的變化來評價。我們使用OligoDesigner包(來自YLab包(BIOCAD))來設計用於合成的寡核苷酸。 文庫包含335種不同的Fab-候選物：1) 基於親和力的組的135種候選物(在6個CDR中至多10個置換)；2) 基於穩定性的組的211種候選物(來自該組的每個CDR中1個突變)，其從196種不同的重鏈和37種輕鏈組合(圖4-5)。 Fab抗體基因使用簡並寡核苷酸合成和在NcoI、NheI位點克隆至意圖用於在大腸桿菌細胞中培養Fab-片段的pBL載體(圖6)。 實施例3 從合成文庫選擇特異性結合人Her2的高親和力克隆 Fab根據標準技術產生：大腸桿菌BL21Gold細菌細胞用含有Fab基因的表達載體轉化，隨後添加誘導物觸發lac操縱子的轉錄，從而當培養產生的轉化子時，導致Fab的表達，Fab排出到周質空間中。然後在0.1 M NaHCO₃ (pH 9.0)中在板(介質結合，來自Greiner bio one)上在0.2 μg/ml的濃度下進行ELISA以驗證Fab與基質固定的Her2-Fc抗原的結合(抗原在4°C固定過夜)。對照抗體帕妥珠單抗(Roche)的Fab用作陽性對照。所有進一步的步驟根據標準ELISA方案，使用基於機器人系統Genetix Qpix2xt (Molecular Devices)和Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)的高性能自動化平臺，在室溫下進行。在每一步驟後用300 μl/孔1x PBST以三次重複進行洗滌。板上的非特異性結合位點用1%脫脂乳/1x PBST封閉，與由大腸桿菌上清液表示的分析物(60 μl/孔)的結合在洗滌後進行。免疫複合物使用過氧化物酶綴合的山羊抗-Fab抗體(Pierce-ThermoScientific) (1:7500)檢測。底物發色混合物通過添加50 μl的底物溶液(H₂ O₂ -0.02%和TMB/CH₃ COONa pH 5.5)持續15分鐘染色。25 μl的1% H2SO4用於停止反應。使用合適的Tecan-Sunrise讀板器(Tecan)測量450 nm的顏色信號。抗體結合與顏色信號強度成比例。針對非特異性結合通過ELISA測試其中顏色信號強度超過來自對照抗體的信號的克隆。 結果，選擇了348個克隆用於進一步研究。 實施例4 選擇的Fab與不同抗原的非特異性結合的分析 ELISA也用於分析所述Fab與不同抗原的非特異性結合。分析按上所述進行，不同之處在於以下事實：在0.1 M NaHCO3, pH 9.0中的Angiopoetin2-H6F、Cmet-Fс、GM-CSFl-Fc、INFα2b用作固定的抗原(抗原在4°C固定過夜)。Her2-Fc用作特異性結合對照(抗原在4°C固定過夜)。所有進一步的階段根據標準ELISA方案，使用基於機器人系統例如Genetix Qpix2xt (Molecular Devices)和Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)的高性能自動化平臺進行。將其中在對照孔(非特異性結合)中的光密度值不超過陰性對照的光密度值的克隆通過競爭性ELISA測試，以鑒定阻斷IgG形式的帕妥珠單抗和Her2-Fc抗原之間的相互作用的Fab。 陽性克隆的可變結構域的序列根據標準方案測序和分析。 實施例5 通過解離速率選擇高親和力Fab Koff篩選使用Pall Forte Bio Octet Red 394進行。抗-FAB2G CH1 生物感測器在包含10 mM PBS, pH 7.2-7.4, 0.1% Tween 20和0.1% BSA的工作緩衝液中再水合30 min。加入工作緩衝液以測試大腸桿菌上清液樣品，直至10%終濃度。然後在4 °С將抗-和FABCH1-生物感測器浸入包含抗體候選物的Fab-片段的大腸桿菌上清液12小時。具有表面固定的Fab-片段的感測器轉移至具有工作緩衝液的孔中，其中設定基線(60 sec)。然後將感測器轉移至具有分析物溶液(Her2-Fc, 30 µg/ml)的孔以實現抗原-抗體締合(300 sec)。然後，將感測器轉移至包含運行緩衝液的孔，用於進一步解離階段(600 sec)。使用的感測器在每次測試後進行再生：它們置於再生緩衝液(10 mM Gly-HCl, рH 1.7)中三次，然後用於進一步的實驗。獲得的曲線使用Octet Data Analysis (版本8.2)根據標準程式，以1:1局部相互作用模型分析。8個顯示抗原相互作用的克隆在附錄中顯示(圖7)。 實施例6 產生IgG1形式的全長抗體和不對稱形式的雙特異性抗體 對於獲得的8種候選物(實施例5)，使用來自Ylab套裝軟體(BIOCAD)的OligoDesigner工具，將CHO密碼子優化(2次密碼子優化/克隆)。將重鏈/輕鏈可變結構域的優化序列重新合成和分別在Sal1/Nhe1和Sal1/BsiW1限制位點克隆至載體pEE-HC、pEE-CK (IgG1形式)或載體pEE-HChole、pEE-CK (不對稱形式)中。 不對稱形式的示意圖在圖8中提供。所述形式是在其重鏈恒定結構域中具有突變(孔=Y352C, T369S, L371A, Y419V; 節=S390C, T402W)以提供異二聚化的抗體。具有“節”的重鏈包含以下結構域：scFv形式的曲妥珠單抗、柔性接頭、Fc-節(圖9)。具有“孔”的重鏈包含以下結構域：VH優化的候選物、CH1、IgG1鉸鏈區、Fc-孔。為了配對具有“孔”的重鏈，產生包含優化的候選物的VL結構域和CK結構域的輕鏈。 獲得的基因構建體用於轉化CHO-T-HC細胞系。如實施例1所述，通過在細菌蛋白A上的親和色譜，按照標準方法，分離和純化蛋白。在變性7.5% PAGE中進行電泳(圖10)。候選物BCD147-02-004、-006、-011、-015、-016、 -018、-025的生產性能低於閾值水準(50 mg/l)；因此，它們不被分離和純化。 實施例7 在Forte Bio Octert RED 384上測定全長抗體的親和力 抗體與人Her2抗原的結合親和力的實驗研究在Forte Bio Octert RED 384上進行。關於AR2G感測器的製備和固定，根據製造商的手冊中描述的標準方案，將濃度為20 μg/ml的人Her-2Fc固定在胺反應性第二代感測器(ForteBio, AR2G)的表面上。在30°C使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作為工作緩衝液進行分析。在緩衝液溶液中基線記錄後，將感測器浸入含有超過10倍提議的解離常數的濃度的抗體溶液的孔中600秒，在其中複合物解離。然後檢測在緩衝液溶液中的複合物解離600秒。 減去參考信號後，根據標準程式使用Octet Data Analysis軟體(版本8.2)和使用1:1相互作用模型分析結合曲線。抗-Her2抗體特異性和高親和力地以圖11顯示的常數結合人抗原。 實施例8.1 測定候選物的表位特異性 針對人Her2抗原的抗體的表位特異性的實驗研究在Forte Bio Octert RED 384上以“串聯”和“夾心”形式進行。 “串聯”形式 - 與曲妥珠單抗的競爭：關於AR2G感測器的製備和固定，根據製造商的手冊中描述的標準方案，將濃度為20 μg/ml的人Her-2Fc固定在胺反應性第二代感測器(ForteBio, AR2G)的表面上。在30°C使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作為工作緩衝液進行分析。基線記錄後，將感測器浸入含有濃度為60 μg/ml的對照抗體曲妥珠單抗的溶液的孔中，其中複合物解離。然後，在飽和抗原後，將感測器浸入包含濃度為15 μg/ml的分析樣本的溶液中。對於與曲妥珠單抗不同的表位元，所有候選物顯示與抗原結合(圖12)。 與帕妥珠單抗的“串聯”競爭：關於AR2G感測器的製備和固定，根據製造商的手冊中描述的標準方案，將濃度為20 μg/ml的人Her-2Fc固定在胺反應性第二代感測器(ForteBio, AR2G)的表面上。在30°C使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作為工作緩衝液進行分析。基線記錄後，將感測器浸入含有濃度為60 μg/ml的對照抗體帕妥珠單抗的溶液的孔中，在其中複合物解離。然後，在飽和抗原後，將感測器浸入包含濃度為15 μg/ml的分析樣本的溶液。對於與帕妥珠單抗不同的表位元，所有候選物顯示與抗原結合(圖13)。 “夾心”形式：關於AR2G感測器的製備和固定，根據製造商的手冊中描述的標準方案，將濃度為30 μg/ml的曲妥珠單抗固定在胺反應性第二代感測器(ForteBio, AR2G)的表面上。在30°C使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作為工作緩衝液進行分析。基線記錄後，將感測器浸入含有濃度為15 μg/ml的人Her2-Fc的孔中。然後將感測器浸入含有濃度為30 μg/ml的帕妥珠單抗溶液的孔中。然後，將感測器浸入包含濃度為30 μg/ml的分析樣本的孔中。對於與帕妥珠單抗和曲妥珠單抗不同的表位，所有候選物未顯示與抗原結合(圖14)。 實施例8.2 抗體與非靶抗原的非特異性結合的分析 抗體與人非-靶抗原的非特異性結合的實驗研究在Forte Bio Octert RED 384上進行。 將抗人Fc感測器(ForteBio, AHC)浸入濃度為30 μg/ml的抗體溶液中300秒，用於其固定。然後將載入抗體的感測器浸入含有濃度為30 μg/ml的非靶抗原的孔中150秒。然後檢測複合物解離150秒。 然後，以類似于上文描述的那些的參數，將其它未載入抗體的AHC感測器浸入含有非靶抗原的孔中以讀出參考信號。在資料處理期間，從獲自含有固定抗體的感測器的信號減去參考信號。 在30°C使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作為工作緩衝液進行分析。非特異性抗原組包含：Ang2、IL23、GMCSF Fe、IL6R、IL5R、IL4R、DLL4、PDL1、LAG3、FGF2、Her3、CD3 ED、CD137、PCSK9、PD1。這些抗原不含有Fc-標籤。 在減去參考信號後，根據標準程式使用Octet Data Analysis軟體(版本8.2)和使用1:1相互作用模型分析結合曲線。候選物BCD147-02-002、-007、-008、-009、-012、 -013、-014、-017、-019、-021、-022、-026、-030、 -033、-034、-035顯示與非靶抗原結合，並不被考慮用於進一步研究。 實施例9 製備穩定產生不對稱形式的雙特異性抗體的細胞系 根據上文測定結果，BCD147-02-020顯示最佳性能。在HindIII、XbaI位點將候選物重鏈和輕鏈的序列以及scFv形式的曲妥珠單抗序列克隆至pSX載體。獲得的質粒在大腸桿菌細胞中培養，使用BenchPro分離600-700 μg。通過PvuI內切核酸酶將質粒線性化過夜，然後用乙醇再沉澱和達到900-1100 ng/μl的終濃度。 CHO-K1-S細胞系在S.3.87 MM培養基(無FBS的合成培養基，由BIOCAD開發) + 6 mM穀氨醯胺中培養。用包含BCD147-02-020候選物鏈的編碼序列的基因構建體進行的轉染根據製造商的方案，使用Nucleofector™ (Lonza)通過電穿孔進行。 轉染後當天，通過向培養基加入嘌呤黴素(終濃度7.2 μg/ml)、潮黴素B (終濃度640 μg/ml)和殺稻瘟菌素(終濃度2.62 μg/ml)，對轉染的培養物進行選擇達24天。克隆選擇後獲得的細胞群。考慮生長速率、群體同質性和缺少形態學變化，根據靶蛋白水準/其結構的同質性的分析結果選擇表達BCD147-02-020的細胞克隆。 實施例10 在對BT-474細胞培養物的基於細胞的抗增殖試驗中抗-HER2-HER2抗體候選物BCD147-02-020和單克隆抗體曲妥珠單抗、單克隆抗體帕妥珠單抗以及曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合的比較 抗增殖活性使用過度表達HER2的BT-474乳腺癌細胞系(HER2+++系)測量。 在補充有2 mM穀氨醯胺、10% FBS (胎牛血清)、10 μg/ml胰島素的DMEM/F12培養基中在37 °C和5% CO2下培養細胞。使用胰蛋白酶將細胞從培養瓶中移出。使用台盼藍染料評價成活力和細胞數量。將細胞(1*10⁵ 個細胞/ml)懸浮於補充有2 mM穀氨醯胺、10% FBS、10 μg/ml慶大黴素抗生素的DMEM/F12培養基中。50 μl/孔的獲得的細胞懸浮液加入96-孔板的孔中，將板在37 °C和5% CO₂ 下孵育1小時。將曲妥珠單抗、帕妥珠單抗抗體、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗和BCD147-02-020從100 μg/ml的濃度連續稀釋和加入(10 μl/孔)含細胞的板中。為了獲得曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合，2倍稀釋的兩種抗體以比率1:1混合。將板在37 °C, 5% CO₂ 下孵育5天。孵育後，使用alamarBlue®染料進行細胞成活力測定。將11 μl/孔的染料加入板孔，將板在37°C, 5% CO₂ 下孵育，直至見到梯度染色。螢光使用Infinite M200Pro讀板器在544/590 nm的激發/發射波長處測量。Magellan 7.2軟體用於繪製邏輯斯諦曲線(螢光強度vs.蛋白濃度)；使用根據Levenberg-Marquardt演算法優化係數的四參數邏輯斯諦曲線模型。 最大濃度的BCD147-02-020候選物的增殖抑制水準是曲妥珠單抗和帕妥珠單抗單克隆抗體的組合的1.43倍。 結果顯示在圖16中。 實施例11 在對BT-474細胞培養物的添加hrEGF的基於細胞的抗增殖試驗中抗-HER2-HER2抗體候選物BCD147-02-020和單克隆抗體曲妥珠單抗、單克隆抗體帕妥珠單抗以及曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合的比較 添加人重組表皮生長因數(hrEGF)的抗增殖活性按實施例10所述測量，不同之處在於以下內容：將細胞(2*10⁵ 個細胞/ml)懸浮於補充有2 mM穀氨醯胺、1% FBS、10 μg/ml慶大黴素抗生素的DMEM/F12培養基中。將50 μl/孔的細胞懸浮液加入孔中。將50 μl/孔的hrEGF溶液加入至最終hrEGF濃度1 nM。抗體從500 µg/ml濃度連續稀釋。 最大濃度的BCD147-02-020候選物的增殖抑制水準是單克隆抗體曲妥珠單抗和單克隆抗體帕妥珠單抗的組合的1.44倍。 結果顯示在圖17中。 實施例12 在對BT-474克隆5細胞培養物的基於細胞的抗增殖試驗中抗-HER2-HER2抗體候選物BCD147-02-020和單克隆抗體曲妥珠單抗和曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合的比較 在增殖試驗中對曲妥珠單抗抗性BT-474克隆5細胞的抗增殖測定按實施例10所述進行。 候選物BCD147-02-020的增殖抑制的最大水準與0點的比率等於1.5倍。與抗體曲妥珠單抗和曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合相比，在增殖試驗中候選物BCD147-02-020對曲妥珠單抗抗性細胞系具有抗增殖作用。 結果顯示在圖18中。 實施例13 在對BT-474細胞系的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)測定中使用Jurkat ADCC報告物高和Jurkat ADCC報告物低細胞系進行的抗-HER2-HER2抗體候選物BCD147-02-020和單克隆抗體曲妥珠單抗和單克隆抗體帕妥珠單抗的組合的比較 我們使用Jurkat報告物系作為效應細胞進行ADCC測定，所述Jurkat報告物系在其表面上穩定表達FcγRIIIa (СD16a)受體和攜帶回應在FcγRIIIa受體和抗體的Fc-部分之間相互作用後發生的NFAT-途徑活化(條件是抗體結合在靶細胞的表面上的抗原)而表達的螢光素酶編碼基因。我們在測定中使用2種Jurkat報告物細胞系，其穩定表達FcγRIIIa受體V158變體(對Fc具有高親和力 - Jurkat報物告ADCC高)和穩定表達FcγRIIIa受體F158變體(對Fc具有低親和力 - Jurkat報物告ADCC低)。 將BT-474細胞系(5*10⁴ 個細胞/ml)懸浮於補充有2 mM穀氨醯胺、10% FBS的DMEM/F12培養基，將100 μl/孔的懸浮液加入白色壁的96-孔板。含有細胞的板在37 °C, 5% CO₂ 孵育過夜。Jurkat報告物ADCC高和Jurkat報告物ADCC低細胞系然後以1*10⁶ 個細胞/ml轉移至補充有2 mM穀氨醯胺、10% FBS的RPMI-1640培養基。未添加選擇性抗生素。再次，將板在37 °C, 5% CO₂ 孵育。 孵育後，我們從含有BT-474細胞的孔收集上清液，我們加入40 μl/孔的製備的連續稀釋的抗體BCD147-02-020和曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合至補充有2 mM穀氨醯胺、4% FBS超低IgG的RPMI-1640培養基。加入40 μl/孔的Jurkat報告物ADCC高或Jurkat報告物ADCC低細胞懸浮液(1,875*10⁶ 個細胞/ml)。將板在37 °С, 5% СО₂ 孵育5小時。我們加入80 μl/孔的Bio-Glo螢光素酶底物(Promega)和使用Infinite M200Pro (8 min孵育)測量發光，我們以100 ms積分時間讀出發光。Magellan 7.2軟體用於繪製邏輯斯諦曲線(發光強度vs.蛋白濃度)；使用根據Levenberg-Marquardt演算法優化係數的四參數邏輯斯諦曲線模型。 候選物BCD147-02-020的活性是曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合的99.2% (使用具有高親和力FcγRIIIa受體的報告物細胞系)和121.2% (使用具有低親和力FcγRIIIa受體的報告物細胞系)。 結果顯示在圖19和圖20中。 實施例14 在對BT-474和SK-BR-3細胞系的補體依賴性細胞毒性(CDC)測定中抗-HER2-HER2抗體候選物BCD147-02-020與單克隆抗體曲妥珠單抗和曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的組合的比較 補體依賴性細胞毒性使用如下2種乳腺癌細胞系測量：過表達HER2的BT-474和SK-BR-3。我們使用單克隆抗體利妥昔單抗(50 μl/ml)和WIL2-S細胞系作為補體依賴性細胞毒性的陽性對照。 在補充有2 mM穀氨醯胺、0.1%牛血清白蛋白、50 μg/ ml慶大黴素的RPMI-1640中進行測定。抗體曲妥珠單抗、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗和BCD147-02-020從50 μg/ml的濃度連續稀釋。將50 μl/孔加入96-孔板。加入50 μl/孔的BT-474或SK-BR-3細胞懸浮液(0.4*10⁶ 個細胞/ml)。對於補體依賴性細胞毒性的陽性對照，我們加入WIL2-S細胞懸浮液(1*10⁶ 個細胞/ml)。我們通過將人補體的液體製備物稀釋4倍，製備補體的工作溶液。加入50 μl/孔的補體工作溶液。將板在37 °C, 5% CO₂ 孵育2小時。15 μl/孔的Alamar藍染料加入板孔中，將板在37°C, 5% CO₂ 孵育，直到見到梯度染色。螢光使用Infinite M200Pro讀板器在激發/發射波長544/590 nm處測量。 候選物BCD147-02-020以及曲妥珠單抗和曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合未顯示針對BT-474和SK-BR-3細胞系的補體依賴性細胞毒性。 結果顯示在圖21中。 實施例15 在對HUVEC細胞系的抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)測定中使用Jurkat ADCC報告物高細胞系進行的抗-HER2-HER2抗體候選物BCD147-02-020和單克隆抗體曲妥珠單抗和單克隆抗體帕妥珠單抗的組合的比較 ADCC測定以實施例13所述的類似方式進行，不同之處在於以下內容：HUVEC細胞用作靶細胞系。HUVEC細胞在測定當天解凍，從DMSO洗滌；細胞懸浮液(2*10⁵ 個細胞/ml)在補充有與Medium200混合(1:1)的1x LSGS (Gibco)、5%附著因數(Gibco)、4 μg/ml慶大黴素的Medium200中製備，將50 μl/孔加入白色壁的96-孔板。含有細胞的板在37 °C, 5% CO₂ 孵育1.5-2小時。我們加入滴定量的抗體：曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合、BCD147-02-020和DLL4-結合抗體(作為對HUVEC的ADCC的陽性對照)，25 μl/孔。抗體從400 µg/ml的濃度稀釋，間隔為2。加入25 μl/孔的Jurkat報告ADCC高懸浮液(3.75*10⁶ 個細胞/ml)。將板在37 °C, 5% CO₂ 孵育5小時。我們加入100 μl/孔的Bio-Glo試劑(Promega)和使用Infinite M200Pro測量發光(8 min孵育)，我們以100 ms積分時間讀出發光。 曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合在試驗中顯示無意義的活性，候選物BCD147-02-020在試驗中未顯示任何活性。 結果顯示在圖22中。 實施例16 使用皮下異種移植物模型評價BCD-147-02-20產品的功效 使用皮下注射黑素瘤細胞系ZR-75-1的免疫缺陷裸小鼠評價功效。組中的每只動物接受2.5x10⁶ /小鼠腫瘤細胞。細胞在給予前與Matrigel®混合(1:1)。皮下給予得到的混合物。使用4個劑量的BCD-147-02-20產品、參考產品 - 曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合(陽性對照)和安慰劑(陰性對照)評價功效。

在實驗過程中，動物的重量(注射前，然後一周兩次)，腫瘤結節體積使用下式評價：

其中W是腫瘤結節的寬度，L是腫瘤結節的長度。 測試產品的功效通過腫瘤生長抑制(TGI)指數對比腫瘤生長指數(I)評價。指數通過下式計算： TGI (%)= (Vo-Vk)/Vk *100, 其中Vk和Vo分別是對照和治療組的中值腫瘤體積(mm³ )。 I_i = Vi/Vo, 其中I是腫瘤生長指數，i是實驗日，Vo是實驗第一天的腫瘤體積。 結果顯示在圖23和24中。 實施例17 使用皮下異種移植物模型評價BCD-147-02-20產品的功效 通過皮下注射黑素瘤細胞系SKBR3的免疫缺陷裸小鼠評價功效。組中的每只動物接受5.0x10⁶ /小鼠腫瘤細胞。細胞在給予前與Matrigel®混合(1:1)。皮下給予得到的混合物。使用4個劑量的BCD-147-02-20產品、參考產品 - 曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合(陽性對照)和安慰劑(陰性對照)評價功效。

在實驗過程中，動物的重量(注射前，然後一周兩次)，腫瘤結節體積使用下式評價：

其中W是腫瘤結節的寬度，L是腫瘤結節的長度。 測試產品的功效通過腫瘤生長抑制(TGI)指數對比腫瘤生長指數(I)評價。指數通過下式計算： TGI (%)= (Vo-Vk)/Vk *100, 其中Vk和Vo分別是對照和治療組的中值腫瘤體積(mm³ )。 I_i = Vi/Vo, 其中I是腫瘤生長指數，i是實驗日，Vo是實驗第一天的腫瘤體積。 結果顯示在圖25和26中。 實施例18 使用皮下異種移植物模型評價BCD-147-02-20產品的功效 通過皮下注射黑素瘤細胞系BT-474的免疫-缺陷裸小鼠評價功效。組中的每只動物接受5.0x10⁶ /小鼠腫瘤細胞。細胞在給予前與Matrigel®混合(1:1)。皮下給予得到的混合物。使用4個劑量的BCD-147-02-20產品、參考產品 - 曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合(陽性對照)和安慰劑(陰性對照)評價功效。

在實驗過程中，動物的重量(注射前，然後一周兩次)，腫瘤結節體積使用下式評價：

其中W是腫瘤結節的寬度，L是腫瘤結節的長度。 測試產品的功效通過腫瘤生長抑制(TGI)指數對比腫瘤生長指數(I)評價。指數通過下式計算： TGI (%)= (Vo-Vk)/Vk *100, 其中Vk和Vo分別是對照和治療組的中值腫瘤體積(mm³ )。 I_i = Vi/Vo, 其中I是腫瘤生長指數，i是實驗日，Vo是實驗第一天的腫瘤體積。 結果顯示在圖27和28中。 實施例19 在食蟹猴(Macaca fascicularis)中單次皮下給予後BCD-147-02-20產品的毒物代謝動力學研究的結果 在12只雄性食蟹猴(Macaca fascicularis)中進行研究。動物分為4組。組名稱顯示在表4中。

在研究期限內每日進行臨床檢查；此外，我們檢查以下內容： - 動物重量； - 體溫； - 尿分析； - 關於以下參數的全血分析：紅細胞數、白細胞數、血紅蛋白濃度； - 關於以下參數的血清生物化學分析：乳酸脫氫酶、總膽紅素、總蛋白、葡萄糖、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶； - 血清中製劑的濃度檢查。 相對於檢查的參數(在缺少的情況下，以其它方式指示)，產品未顯示對整體毒性指示物以及對器官/器官系統的功能的任何影響。 實施例20 在食蟹猴中重複靜脈內給予13周接著30天的恢復期後的毒性研究 多次靜脈內給予13周接著30天的停藥期後的毒性研究在相關的動物物種——食蟹猴中進行。三個劑量水準用於實驗。實驗組的方案顯示在表5中。

在實驗期間檢查以下參數： - 臨床檢查的結果； - 動物重量(給予前，然後每週) - 體溫(給予前，然後每週直至終止實驗)； - 根據通過多譜心動圖評價的心臟生物電活性，對心血管系統的影響； - 尿分析； - 關於以下參數的全血分析：紅細胞數、白細胞數、血紅蛋白濃度、淋巴細胞數、單核細胞數、嗜中性粒細胞數、嗜酸性細胞數、嗜鹼性細胞數； - 針對以下參數，對凝血系統的影響的評價：活化的部分凝血致活酶時間、纖維蛋白原濃度、凝血酶原時間； - 關於以下參數的血清的生物化學分析：鈉、鉀、肌酸酐、尿素、鹼性磷酸酶、乳糖脫氫酶、總膽紅素、總蛋白、葡萄糖、甘油三酯、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、總膽固醇； - 在給予期結束時，將最大劑量的主組的動物安樂死，接著進行其病理形態學檢查；在最大劑量的衛星組和對照組的動物的研究結束時； - 作為毒性研究的一部分，還評價了製劑的局部刺激作用，因此選擇和組織學檢查了位於注射區域附近的軟組織。測試劑量無一顯示產品毒性。

圖1：意圖用於在哺乳動物細胞中產生人Her2蛋白的細胞外結構域的質粒pEE-Fc的環狀圖。AmpR是提供氨苄西林抗性的β-內醯胺酶基因，CMV啟動子是巨細胞病毒早期基因的啟動子，oriP是複製起點，START是起始密碼子，前導序列是鼠IgGk前導肽，hHer2是人Her2抗原的合成序列，Fс是人IgG1的Fc片段，His是多組氨酸-標籤，STOP是終止密碼子。 圖2：意圖用於在哺乳動物細胞中產生抗體的輕鏈的質粒pEE-CK的環狀圖。AmpR是提供氨苄西林抗性的β-內醯胺酶基因，CMV啟動子是巨細胞病毒早期基因的啟動子，oriP是複製起點，START是起始密碼子，前導序列是鼠IgGk前導肽，VL是抗體輕鏈可變結構域的序列，CK是人IgG1同種型輕鏈恒定結構域，STOP是終止密碼子，polyA是多腺苷酸化位點。 圖3：意圖用於在哺乳動物細胞中產生抗體的重鏈的質粒pEE-НС (A)、pEE-HChole (B)的環狀圖。AmpR是提供氨苄西林抗性的β-內醯胺酶基因，CMV啟動子是巨細胞病毒早期基因的啟動子，oriP是複製起點，START是起始密碼子，前導序列是鼠IgGk前導肽，VH是抗體重鏈可變結構域的序列，HC是指人IgG1同種型重鏈恒定結構域(СН1、СН2、СН3)，Fc-孔是指具有引入的“孔”突變的人IgG1 CH2、CH3結構域。STOP是終止密碼子，polyA是多腺苷酸化位點。 圖4：穩定性分選的文庫的設計。А是輕鏈序列的設計，В是重鏈序列的設計。 圖5：親和力分選的文庫的設計。А是輕鏈序列的設計，В是重鏈序列的設計。 圖6：意圖用於在大腸桿菌細胞中表達蛋白的質粒pBL的環狀圖。AmpR是提供氨苄西林抗性的β-內醯胺酶基因，pBR322_ori是來自pBR322質粒的複製起點，lacI是乳糖操縱子阻抑基因，KmR是提供卡那黴素抗性的氨基糖苷磷酸轉移酶基因，前導序列是在大腸桿菌中提供周質表達的前導肽，VL是抗體輕鏈可變結構域的序列，VH是抗體重鏈可變結構域的序列，CH1是人IgG1恒定結構域，Myc-標籤、His-標籤是標籤。 圖7：合成文庫的8個Fab-片段的動力學分析的結果(締合-解離曲線)，其顯示在ELISA中的結合。 圖8：不對稱形式的示意圖。特異性結合人HER2的細胞外結構域的亞結構域IV和II的雙特異性不對稱抗體由以下組成：1) Fc-節(knob) - scFv-曲妥珠單抗，2) HC-孔 - aHER2-候選物020-VH，3) Ck - aHER2-候選物020 VL。 圖9：質粒pEE-scFvTrast-Fc_knob的環狀圖。AmpR是提供氨苄西林抗性的β-內醯胺酶基因，CMV啟動子是巨細胞病毒早期基因的啟動子，oriP是複製起點，scFv-曲妥珠單抗是scFv形式的對照抗體的可變結構域的序列，S-接頭是ASGDKTHT接頭，Fc節是指具有引入的“節”突變的人IgG1 CH2、CH3結構域，His-標籤是多組氨酸-標籤，STOP是終止密碼子，polyA是多腺苷酸化位點。 圖10A-D：以下抗體候選物的非還原型聚丙烯醯胺凝膠電泳：IgG1形式的候選物001 - 017 (146 kDa)、不對稱形式的候選物019 - 035 (125.5 kDa)。候選物BCD147-02-004、-006、-011、-015、016、-018、-025的生產性能非常低；因此，它們未被分離和純化。 圖10A 1- Bio-Rad蛋白標準標記物 2- BCD147-02-001 10 μg 3- BCD147-02-002 10 μg 4- BCD147-02-003 10 μg 5- BCD147-02-005 10 μg 6- BCD147-02-007 10 μg 7- BCD147-02-008 10 μg 8- BCD147-02-009 10 μg 9- BCD147-02-010 10 μg 10- BCD147-02-012 10 μg 圖10B 1- Bio-Rad蛋白標準標記物 2- BCD147-02-013 10 μg 3- BCD147-02-014 10 μg 4- BCD147-02-017 10 μg 5- BCD147-02-019 10 μg 6- BCD147-02-020 10 μg 7- BCD147-02-021 10 μg 8- BCD147-02-022 10 μg 9- BCD147-02-023 10 μg 10- BCD147-02-024 10 μg 圖10С 1- Bio-Rad蛋白標準標記物 2- BCD147-02-026 10 μg 3- BCD147-02-027 10 μg 4- BCD147-02-028 10 μg 5- BCD147-02-029 10 μg 6- BCD147-02-030 10 μg 7- BCD147-02-031 10 μg 8- BCD147-02-032 10 μg 9- BCD147-02-033 10 μg 圖10D 1- Bio-Rad蛋白標準標記物 2- BCD147-02-034 10 μg 3- BCD147-02-035 10 μg 圖11：呈IgG1(候選物001-017)和不對稱(候選物019 - 035)形式的全長抗體的動力學分析的結果。 圖12：候選物017 - 035與呈“串聯”形式的曲妥珠單抗的競爭的締合-解離曲線。曲線上方的文字說明表示在感測器上放置抗原、對照抗體和候選物的順序。不同候選物的曲線彼此重疊。 圖13：候選物017 - 035與呈“串聯”形式的帕妥珠單抗的競爭的締合-解離曲線。曲線上方的文字說明表示在感測器上放置抗原、對照抗體和候選物的順序。不同候選物的曲線彼此重疊。 圖14：候選物017 - 035與呈“夾心”形式的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的競爭的締合-解離曲線。曲線上方的文字說明表示在感測器上放置抗原、對照抗體和候選物的順序。不同候選物的曲線彼此重疊。 圖15：載體pSХ的環狀圖。p-CMVe/EF1alpha是包含CMV增強子和EF-1α啟動子的合成啟動子，START是起始密碼子，前導序列是IgGk前導肽，INSERT是插入序列(抗體的重鏈或輕鏈)，STOP是終止密碼子，polyA是多腺苷酸化位點，增強子SV-40是猿猴病毒SV-40的增強子，β珠蛋白MAR是人β-珠蛋白基因的MAR (基質附著區)，Rep起點1是pUC複製起點，AmpR是提供氨苄西林抗性的β-內醯胺酶基因，F1起點允許具有這樣的複製起點的質粒隨輔助噬菌體VCSM13和M13K07的共轉化而包裝到噬菌體顆粒中，SV40啟動子是猿猴病毒SV-40的真核啟動子，抗生素_R是提供轉染的哺乳動物細胞培養物的選擇的抗生素抗性基因(嘌呤黴素、殺稻瘟菌素、潮黴素B抗性)。 圖16：在BT-474細胞系的基於細胞的抗增殖試驗中螢光強度隨抗體濃度的對數的變化。該圖顯示引入的11-倍抗體濃度。 圖17：使用添加hrEGF的BT-474細胞系在基於細胞的抗增殖試驗中螢光強度隨抗體濃度的對數的變化。該圖顯示引入的11-倍抗體濃度。 圖18：在曲妥珠單抗-抗性BT-474克隆5細胞系的基於細胞的抗增殖試驗中螢光強度隨抗體濃度的對數的變化。該圖顯示引入的11-倍抗體濃度。 圖19：使用具有高親和力FcγRIIIa受體的報告細胞系對BT-474細胞系的ADCC測定。該圖顯示引入的2-倍抗體濃度。 圖20：使用具有低親和力FcγRIIIa受體的報告細胞系對BT-474細胞系的ADCC測定。該圖顯示引入的2-倍抗體濃度。 圖21：對BT-474和SK-BR-3細胞系的CDC測定。抗體以50 μg/ml (引入3-倍抗體濃度)顯示，“0點”是未引入抗體的點，“PC”是CDC測定的陽性對照(利妥昔單抗和WIL2-S)。 圖22：使用具有高親和力FcγRIIIa受體的報告細胞系對HUVEC細胞系的ADCC測定。該圖顯示引入的4-倍抗體濃度。 圖23：腫瘤生長的指數值的變化(ZR-75-1腫瘤系)。 圖24：腫瘤生長抑制(TGI)的指數值(ZR-75-1腫瘤系)。 圖25：腫瘤生長的指數值的變化(SKBR3腫瘤系)。 圖26：腫瘤生長抑制(TGI)的指數值(SKBR3腫瘤系)。 圖27：腫瘤生長的指數值的變化(BT-474腫瘤系)。 圖28：腫瘤生長抑制(TGI)的指數值(BT-474腫瘤系)。

Claims (20)

1. 一種雙特異性抗體，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)，所述雙特異性抗體包含： 1) 第一抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和代表包含由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列的曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)； 2) 第二抗原結合部分，其特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)和代表包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)的抗原結合區(Fab)，所述重鏈可變結構域(VH)包含由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列，所述輕鏈可變結構域(VL)包含由SEQ ID NO: 6表示的氨基酸序列； 3) 片段可結晶區(Fc片段)。
2. 根據請求項1的雙特異性抗體，其中所述抗體是IgG抗體。
3. 根據請求項2的雙特異性抗體，其中所述抗體具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。
4. 根據請求項3的雙特異性抗體，其中所述IgG抗體具有人IgG1同種型。
5. 根據請求項1的雙特異性抗體，其中所述片段可結晶區(Fc片段)包含分別由SEQ ID NO: 10-11表示的第二和第三恒定結構域(CH2-CH3)的兩個氨基酸序列。
6. 根據請求項1的雙特異性抗體，其中特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的第二抗原結合部分代表包含以下的抗原結合區(Fab)： a) 重鏈可變結構域(VH)和第一重鏈恒定結構域(CH1)，它們包含由SEQ ID NO: 12表示的氨基酸序列； b) 輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恒定結構域(CK)，它們包含由SEQ ID NO: 13表示的氨基酸序列。
7. 一種雙特異性抗體，其特異性結合人HER2 (表皮生長因數受體2)的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)和人HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)，所述雙特異性抗體包含： 1) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域IV (ECD4)的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含CH2和CH3恒定結構域和曲妥珠單抗的單鏈可變片段(scFv)，它們包含由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列； 2) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的重鏈，所述重鏈包含重鏈可變結構域(VH)和第一、第二和第三重鏈恒定結構域(CH1-CH2-CH3)，它們包含由SEQ ID NO: 15表示的氨基酸序列； 3) 特異性結合HER2的細胞外結構域的亞結構域II (ECD2)的抗體的輕鏈，所述輕鏈包含輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恒定結構域(CK)，它們包含由SEQ ID NO: 13表示的氨基酸序列， 其中部分1)-3)通過二硫鍵互相連接。
8. 一種編碼根據請求項1-7中任一項的抗體的核酸。
9. 根據請求項8的核酸，其中所述核酸是DNA。
10. 一種包含根據請求項8-9中任一項的核酸的表達載體。
11. 一種產生用於製備根據請求項1-7中任一項的抗體的宿主細胞的方法，所述方法包括用根據請求項10的載體轉化細胞。
12. 一種用於製備根據請求項1-7中任一項的抗體的宿主細胞，所述宿主細胞包含根據請求項8-9中任一項的核酸。
13. 一種產生根據請求項1-7中任一項的抗體的方法，其包括在生長培養基中在足以產生所述抗體的條件下培養根據請求項12的宿主細胞，如果需要的話，接著分離和純化得到的抗體。
14. 一種用於治療由HER2介導的疾病或病症的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的根據請求項1-7中任一項的抗體或其抗原結合片段與一種或多種藥學上可接受的賦形劑的組合。
15. 根據請求項14的藥物組合物，其預期用於治療由HER2介導的疾病或病症，所述疾病或病症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。
16. 一種用於治療由HER2介導的疾病或病症的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的根據請求項1-7中任一項的抗體和治療有效量的至少一種治療活性抗腫瘤化合物。
17. 根據請求項16的藥物組合物，其預期用於治療由HER2介導的疾病或病症，所述疾病或病症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。
18. 根據請求項16或17的藥物組合物，其中所述治療活性抗腫瘤化合物選自細胞毒素劑、化學治療劑、抗體或抗激素劑。
19. 一種根據請求項1-7中任一項的抗體或根據請求項14的藥物組合物在制备用於治療需要這樣的治療的受試者的由HER2介導的疾病或病症的藥物的用途。
20. 根據請求項19的用途，其中所述疾病或病症選自：乳腺癌、胃的惡性腫瘤、非小細胞肺癌、頭和頸的惡性腫瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌(HNSCC)、結腸直腸癌(CRC)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮癌、黑素瘤細胞、咽喉癌、口腔癌或皮膚癌。

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