TW201932098A - 咖啡果肉萃取物之應用 - Google Patents
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Abstract
咖啡果肉萃取物之應用，包括使用咖啡果肉萃取物於美白、改善膚質、
護膚、抗皮膚老化、或製備一醫藥組合物之應用。該醫藥組合物可用以修復皮膚組織、預防皮膚疾病、及/或治療皮膚疾病。
Description
本發明係關於咖啡果肉萃取物之應用，尤其是使用咖啡果肉萃取物於美白、改善膚質、護膚、抗皮膚老化、修復皮膚組織、預防皮膚疾病、及/或治療皮膚疾病。
醣化反應(glycosylation)係指葡萄糖附著到蛋白質的化學反應過程，此反應會產生最終醣化終產物(advanced glycation end product，AGEs)。堆積於皮膚細胞中的最終醣化終產物不僅容易引起蛋白質的變性，導致皮膚皺紋產生、鬆弛等老化現象，亦會引起活性氧化物的生成、造成氧化壓力，致使皮膚細胞DNA損傷、影響皮膚細胞DNA正常功能，甚至誘發皮膚疾病。
咖啡是屬於龍膽目茜草科(Rubiaceae,Gentianales)的一種，原產於非洲。咖啡樹的每一個果實中有兩顆咖啡豆，由羊皮層(Parchment；又稱果殼、內果皮或豆莢)包裹著，該羊皮層經過乾燥後外觀極似羊皮紙，因而得名。在羊皮層之外的構造，由內而外依序為果膠層(Mucilage；又稱黏膜或蜜)、果肉、及外果皮(Outer Skin)。在咖啡的製造過程中，只取咖啡豆的部分進行烘培，剩餘部分(例如果肉)通常被視為無用的廢棄物而直接丟棄。
本案發明人透過研究意外發現，咖啡果肉萃取物具有抵抗氧化壓力以及提升皮膚保濕基因表現的效果，且經由人體試驗發現，咖啡果肉萃取物具
有減少皮膚黑色素、淡化皮膚斑點、增加皮膚光澤與含水量、以及瞬效提升皮膚彈力的效果。前述發現，可將以往被視為廢棄物之咖啡果肉，運用於美白、改善膚質、護膚、抗皮膚老化、修復皮膚組織、預防皮膚疾病及治療皮膚疾病，深具經濟價值。
本發明之一目的，在於提供一種使用咖啡果肉萃取物於以下之一或多者的用途：美白、改善膚質、護膚、及抗皮膚老化。較佳地，該萃取物係以一極性溶劑萃取咖啡果肉所提供，且該極性溶劑係選自以下群組：水、C1-C4醇類、及前述之組合。較佳地，該萃取物係用於以下之一或多者：保濕、緊緻皮膚、減少皮膚細紋、改善皮膚乾燥、提升皮膚光澤、及幫助維持皮膚健康。較佳地，該萃取物係以塗抹或口服的方式使用。
本發明之另一目的，在於提供一種使用上述咖啡果肉萃取物於製備一醫藥組合物之用途，該醫藥組合物係用於以下之一或多者：修復皮膚組織、預防皮膚疾病、及治療皮膚疾病。較佳地，該醫藥組合物係用於抑制皮膚細胞之蛋白質的醣化及/或降低氧化壓力對皮膚細胞的傷害。較佳地，該皮膚疾病係皮膚乾燥相關疾病(例如：魚鱗癬)。較佳地，該醫藥組合物係呈一適於口服、經皮投藥或皮下注射之劑型。
本發明之再一目的，在於提供一種使用上述咖啡果肉萃取物於製備一醫藥組合物之用途，該醫藥組合物係用於提升以下基因之至少一者的表現：KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因。較佳地，該醫藥組合物係呈一適於口服、經皮投藥或皮下注射之劑型。
本發明之又一目的，在於提供一種美白、改善膚質、護膚、及/或抗皮膚老化的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之上述咖啡果肉萃取物。於根據本發明之方法中，該咖啡果肉萃取物係可以一保養品、保健食品、或美容飲品之形式投予至該有需要之個體。較佳地，該方法係用於保濕、緊緻皮膚、減少皮膚細紋、改善皮膚乾燥、提升皮膚光澤、及/或幫助維持皮膚健康。
本發明之又一目的，在於提供一種修復皮膚組織、預防皮膚疾病、及/或治療皮膚疾病的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之上述咖啡果肉萃取物。於根據本發明之方法中，該咖啡果肉萃取物係可以一醫藥組合物之形式投予至該有需要之個體。較佳地，該方法係用於抑制皮膚細胞之蛋白質的醣化及/或降低氧化壓力對皮膚細胞的傷害。舉例言之，該方法可用於預防或治療皮膚乾燥相關疾病(例如：魚鱗癬)。
本發明之又一目的，在於提供一種KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因表現的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之上述咖啡果肉萃取物。於根據本發明之方法中，該咖啡果肉萃取物係可以一醫藥組合物之形式投予至該有需要之個體。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬技術領域中具有通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
圖1係顯示在不同濃度之咖啡果肉萃取物存在的情形下，經由膠原蛋白醣化反應所產生的最終醣化終產物(AGEs)的量，結果說明本發明咖啡果肉萃取物具有抑制醣化反應(抗醣化)的效果；
圖2係顯示本發明咖啡果肉萃取物於抑制氧化壓力的效果，其中，「控制組」之細胞係於不含咖啡果肉萃取物之培養基中培養24小時，「AGEs組」之細胞係於不含咖啡果肉萃取物之培養基中培養24小時、再經醣化胎牛血清白蛋白處理3小時，「萃取物組」之細胞則係於含咖啡果肉萃取物之培養基中培養24小時、再經醣化胎牛血清白蛋白處理3小時(***表示與「AGEs組」之結果有顯著差異，p<0.001)；圖3A及圖3B係顯示本發明咖啡果肉萃取物於提升皮膚緊緻度的效果，其中，圖3A顯示「控制組」、「AGEs組」及「萃取物組」之凝膠懸浮於MEM培養基中6小時後的外觀，圖3B顯示「AGEs組」及「萃取物組」之凝膠的收縮能力，且其中，使用於「控制組」以製備凝膠之混合物並不含醣化胎牛血清白蛋白，且所獲得之凝膠係以不含咖啡果肉萃取物之培養基進行處理，使用於「AGEs組」以製備凝膠之混合物則含有醣化胎牛血清白蛋白，且所獲得之凝膠亦以不含咖啡果肉萃取物之培養基進行處理，使用於「萃取物組」以製備凝膠之混合物亦含有醣化胎牛血清白蛋白，但所獲得之凝膠係以含有咖啡果肉萃取物之培養基進行處理(*表示與「AGEs組」之結果有顯著差異，p<0.05)；圖4至圖8係顯示本發明咖啡果肉萃取物於提升KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表現的效益，其中，圖4係顯示各組細胞之KRT1基因及KRT14基因的表現量，圖5係顯示各組細胞之AQP3基因表現量，圖6係顯示各組細胞之GBA基因表現量，圖7係顯示各組細胞之FLG基因表現量，圖8則係顯示各組細胞之HAS2基因及HAS3基因的表現量，且其中，「控制組」之細胞係於不含咖啡果肉萃取物之培養基中培養，「萃取物組」之細胞則係於含有咖啡果肉萃取物之培養基中培養(*表示與「控
制組」之結果有顯著差異，p<0.05；**表示與「控制組」之結果有顯著差異，p<0.01；***表示與「控制組」之結果有顯著差異，p<0.001)；圖9至圖13係分別顯示以口服方式使用本發明咖啡果肉萃取物於降低皮膚黑色素、淡化皮膚褐斑、提升皮膚含水量、提升皮膚彈力、及提升皮膚光澤度的效果(*表示與「第0週」之結果有顯著差異，p<0.05)；以及圖14係顯示以塗抹方式使用本發明咖啡果肉萃取物於提升皮膚彈力的效果(*表示與「第0分鐘」之結果有顯著差異，p<0.05)。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「治療」，不應被解釋為治療一個體直至完全恢復，而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、或提高一患者之生命品質；所謂「預防」係指抑制或防止一具體病況的發作、或維持敏感個體之良好健康狀態或建立該個體對疾病的耐受性；所謂「個體」是指人類或非人的哺乳動物。
已知KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3等基因的表現量提升係有助於維持細胞構造、幫助水分調節、促進保濕因子NMF生成、提升透明質酸合成量、及提高細胞含水量。此外，前述基因表現低下或缺失則與皮膚老化、及/或皮膚疾病(例如魚鱗癬等皮膚乾燥相關疾病)的發生有關，此可
參見例如：A keratin scaffold regulates epidermal barrier formation,mitochondrial lipid composition,and activity.J.Cell Biol.211(5)：1057-1075(2015)、Hyaluronan Synthase 3 Regulates Hyaluronan Synthesis in Cultured Human Keratinocytes.The Journal of Investigative Dermatology.118：43-48(2002)、Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.J Invest Dermatol.135(2)：569-578(2015)、Expression of differential genes involved in the maintenance of water balance in human skin by Piptadenia colubrina extract.J Cosmet Dermatol.9(1)：35-43(2010)、New concept of the pathogenesis of atopic dermatitis：Interplay among the barrier,allergy,and pruritus as a trinity.J Dermatol Sci.70(1)：3-11(2013)、The filaggrin story：novel insights into skin-barrier function and disease.Trends Mol Med.14(1)：20-27(2008)及Filaggrin in the frontline：role in skin barrier function and disease.Journal of Cell Science.122(9)：1285-1294(2009)，該等文獻之全文併於此處以供參考。
因此，若可有效提升KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及/或HAS3基因的表現，即可達到幫助維持皮膚健康、保濕、緊緻皮膚、減少皮膚細紋、抗皮膚老化、改善皮膚乾燥、預防皮膚疾病、及/或治療皮膚疾病的效果。
本案發明人研究發現，咖啡果肉萃取物具有抗醣化、抑制氧化壓力、以及提升皮膚保濕基因(例如KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因)表現的效果。且經由人體試驗發現，
咖啡果肉萃取物具有減少皮膚黑色素、淡化皮膚斑點、增加皮膚光澤與含水量、以及瞬效提升皮膚彈力的效果。
因此，本發明係關於咖啡果肉萃取物之應用，尤其是使用咖啡果肉萃取物於美白、改善膚質、護膚、及/或抗皮膚老化、使用咖啡果肉萃取物於製備一醫藥組合物、以及對一有需要之個體投予一有效量之咖啡果萃取物的方法。其中，該根據本發明所提供之咖啡果肉萃取物尤其可用於保濕、緊緻皮膚、減少皮膚細紋、改善皮膚乾燥、提升皮膚光澤、幫助維持皮膚健康；該根據本發明所提供之醫藥組合物及方法係可用於修復皮膚組織、預防皮膚疾病、及/或治療皮膚疾病。舉例言之，該皮膚疾病係皮膚乾燥相關疾病(例如：魚鱗癬)。此外，該根據本發明所提供之醫藥組合物及方法亦可用於提升KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因之表現。
本發明所採用之咖啡果肉萃取物係可透過以極性溶劑萃取咖啡果肉原料而提供，其中該極性溶劑可以為水、C1-C4醇類、或其組合。其中，萃取溶劑的用量並無特殊限制，通常係採用可以分散原料之用量。舉例言之，可於萃取步驟中採用極性溶劑：咖啡果肉=1~30：1的重量比。於本發明一具體實施態樣中，係於容器中放入100克的咖啡果肉，再於其中加入2000毫升的水(此即，水與咖啡果肉之重量比為20：1)，以進行萃取。
於萃取步驟中，亦可視所採用之極性溶劑來選用合宜的萃取時間。以採用水作為極性溶劑，且水：咖啡果肉之重量比為約20：1為例，通常萃取歷時0.5至3小時。視需要地，可於進行萃取步驟時輔以例如加溫、冷卻、攪拌、超音波等其他操作，以提升萃取效果。舉例言之，可於50至100℃之溫度下進行該萃取步驟。於本發明一具體實施態樣中，係於85±5℃下進行萃取，歷時1小時。
此外，為儘可能達到最大的萃取效益，視需要地，可以相同或不同的極性溶劑對咖啡果肉原料進行重複萃取，並合併該多次萃取所得之萃取液。
於上述萃取步驟完成之後，可視需要進行例如固液分離(例如過濾、離心)、減壓濃縮、乾燥(例如：熱風乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥)、稀釋、及滅菌等操作，以提升萃取液之使用便利性。
根據本發明所提供之咖啡果肉萃取物係可以塗抹或口服的方式使用。舉例言之，該根據本發明所提供之咖啡果肉萃取物係可以例如乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、溶液(例如精華液、化妝水)等保養品之形式使用，亦可以例如保健食品、美容飲品等供吞食或飲用的形式使用，但不以此為限。此外，視使用形式及用途而定，可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率使用該根據本發明所提供之含有咖啡果肉萃取物的保養品、保健食品及美容飲品。亦可針對特定族群之需要，調整前述保養品、保健食品及美容飲品中咖啡果肉萃取物的含量。
根據本發明所提供之醫藥組合物可經由全身或局部投藥，且可透過各種藥物傳遞系統(drug delivery system，DDS)進行傳遞，包括口服藥物傳遞系統(oral drug delivery system)、經皮藥物傳遞系統(transdermal drug delivery system)、注射傳遞系統(injection delivery system)等。舉例言之，但不以此為限，該根據本發明所提供之醫藥組合物可以藉由微脂體(liposome)、微膠囊(microcapsule)、奈米微粒(nanoparticle)、微針(microneedle)等系統進行傳遞，以達到提高生物利用率、控制藥物釋放速度、針對病灶精準投藥、減少藥物副作用等效果。
該根據本發明所提供之醫藥組合物係可呈任何合宜的型式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組合物可以口服或非經口服(例如：經皮投藥、皮下注射)之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該醫藥組合物，其中，該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以適於口服之劑型為例，可於根據本發明所提供之醫藥組合物中含有任何不會不利影響活性成分(即，咖啡果肉萃取物)之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、油(例如橄欖油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油)、聚乙二醇、澱粉、高嶺土(kaolinite)、膨潤土(bentonite)、檸檬酸鈉、明膠、瓊脂、羧甲基纖維素、阿拉伯膠、海藻酸及其鹽、單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)、硬脂酸鈣(calcium stearate)、及前述之組合。可利用任何合宜的方法，使該醫藥組合物以適於口服投藥的劑型提供，例如：錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。
以適於經皮投予之劑型為例，亦可於根據本發明所提供之醫藥組合物中含有任何不會不利影響活性成分(即，咖啡果肉萃取物)之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、礦物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液體石蠟脂、去水山梨醇單硬脂酸酯、及聚山梨醇酯60。可利用任何合宜的方法，使該醫藥組合物以適於經皮投藥的劑型提供，例如供直接外用之貼布、乳液、乳霜、凝膠(例
如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如懸浮液)等形式，但不以此為限。
至於適於皮下注射之針劑或點滴劑型，則可於根據本發明所提供之醫藥組合物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組合物。或者，將該醫藥組合物製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，以提供所欲之注射劑。
視需要地，可於根據本發明所提供之醫藥組合物中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該醫藥組合物於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該醫藥組合物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該醫藥組合物可視需要另含一或多種其他活性成分，以進一步加強該醫藥組合物之功效或增加製劑配方之運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分(即，咖啡果肉萃取物)之效益沒有不利的影響即可。
根據本發明之應用所提供的醫藥組合物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用，端視投予個體之需求、年齡、體重、及健康狀況而異。於根據本發明所提供之醫藥組合物中，可視實際應用需求，調整咖啡果肉萃取物於組合物中的含量。
本發明亦提供一種美白、改善膚質、護膚、及/或抗皮膚老化的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之咖啡果肉萃取物。前述該有需要之個體係指，需要改善膚質及/或皮膚狀況、或預防膚質及/或皮膚狀況變差之個體；特定言之，該個體係一有皮膚角質增厚、皮膚皺紋產生、皮膚斑點產生、皮膚暗沉、皮膚乾燥脫屑、皮膚鬆弛、及/或皮膚老化、或一長期於戶外工作之個體，但不以此為限。於前述方法中，所採用之咖啡果肉萃取物係可以一保養品、保健食品、或美容飲品之形式投予至該有需要之個體。有關該保養品、保健食品、及美容飲品之投予形式、施用頻率、以及相關應用，係如上述之說明。
本發明另提供一種修復皮膚組織、預防皮膚疾病、及/或治療皮膚疾病的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之咖啡果肉萃取物。前述該有需要之個體係指，有皮膚病變現象者、患有皮膚疾病者、及/或罹患皮膚疾病之高風險群；舉例言之，該個體係一患有皮膚乾燥相關疾病者、及/或罹患皮膚乾燥相關疾病之高風險群。於前述方法中，所採用之咖啡果肉萃取物係可以一醫藥組合物之形式投予至該有需要之個體。有關該醫藥組合物之投予態樣、投予途徑、投予形式、施用頻率、以及相關應用，亦如上述之說明。
本發明亦關於一種用於提升KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因表現的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之咖啡果肉萃取物。前述該有需要之個體係指，KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因有缺失、突變或表現低下之個體。於前述方法中，所採用之咖啡果肉萃取物係可以一醫藥組合物之形式投予至該有需要之個體。有關該醫藥組合物之投予態樣、投予途徑、投予形式、施用頻率、以及相關應用，亦如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[製備實施例]
A.咖啡果肉萃取物之製備
將咖啡果實(阿拉比卡品種；提供自嘉義縣大阿里山品咖啡生產合作社)，脫殼後，將咖啡果肉取下並蒐集。接著，對咖啡果肉進行以下操作處理，以提供咖啡果肉萃取物：
1.於容器中放入100克的咖啡果肉，再於其中加入2000毫升的水，均勻混合，並將該混合物置於85±5℃下進行萃取，歷時1小時，以提供一萃取液；
2.待該萃取液冷卻至室溫，以400網目之濾網進行過濾，以提供一濾液；以及
3.於45至70℃下，對該濾液進行減壓濃縮，以提供一濃縮萃取液(即，本發明之咖啡果肉萃取物；下稱為「咖啡果肉萃取原液」)。
4.以超高溫商業滅菌法(ultra-high temperature processing，UHT)對該濃縮萃取液進行滅菌，其後進行噴霧乾燥，以提供一乾燥粉末(下稱為「咖啡果肉萃取物粉末」)。
B.咖啡果肉萃取物之稀釋
取[製備實施例A]提供之咖啡果肉萃取原液，分別進行2倍、10倍及100倍之稀釋，以分別提供50%、10%及1%濃度之咖啡果肉萃取稀釋液。
C.膠原蛋白溶液與果糖溶液之製備
以200mM的磷酸緩衝液(pH為7.4)作為溶劑，分別配製濃度為60毫克/毫升(mg/mL)之膠原蛋白溶液(含有0.06%疊氮化鈉(NaN3))以及濃度為1.5M之果糖溶液。
D.胺基胍(aminoguanidine，AG)溶液之製備
以200mM的磷酸緩衝液(pH為7.4)作為溶劑，配置一濃度為3mM的胺基胍(aminoguanidine，AG)溶液。
E.醣化胎牛血清白蛋白之製備
以PBS作為溶劑，將購自Sigma公司之葡萄糖配置成濃度為0.5M之葡萄糖溶液後，以該0.5M之葡萄糖溶液作為溶劑，將購自Bio Basic Inc.之胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA；產品編號：AD0023)配置成濃度為50毫克/毫升之胎牛血清白蛋白溶液，並將該50毫克/毫升之胎牛血清白蛋白溶液置於70℃的烘箱中反應四天，使胎牛血清白蛋白發生醣化反應，以獲得醣化胎牛血清白蛋白。
實施例1：咖啡果肉萃取物於抑制醣化反應(抗醣化)的效益
為了解本發明咖啡果肉萃取物是否可抑制皮膚細胞中蛋白質之醣化反應，係進行以下之最終醣化終產物(advanced glycation end products，AGEs)生成測試。
A.實驗組：I.各取0.2毫升[製備實施例A]提供之咖啡果肉萃取原液、[製備實施例B]提供之50%濃度之咖啡果肉萃取稀釋液、[製備實施例B]提供之10%濃度之咖啡果肉萃取稀釋液及[製備實施例B]提供之1%濃度之咖啡果肉萃取稀釋液，分別與[製備實施例C]所提供之膠原蛋白溶液(0.2毫升)及果糖溶液(0.2毫升)
均勻混合，以提供五種混合溶液；II.將步驟I提供之混合溶液置於50℃下反應24小時，使溶液中的膠原蛋白發生醣化反應，以提供五種醣化反應溶液；以及III.分別取步驟I及II提供之混合溶液及醣化反應溶液(各取0.1毫升)，並分別測量在激發光波長360nm、放射光波長460nm下的螢光值(其中，將混合溶液之螢光值稱為「實驗組0小時之螢光值」，醣化反應溶液之螢光值則稱為「實驗組24小時之螢光值」)。
B.控制組：i.取0.2毫升的水，與[製備實施例C]提供之膠原蛋白溶液(0.2毫升)及果糖溶液(0.2毫升)均勻混合，以提供一混合溶液；ii.將步驟i提供之混合溶液置於50℃下反應24小時，使溶液中的膠原蛋白發生醣化反應，以提供一醣化反應溶液；以及iii.取步驟i及ii提供之混合溶液及醣化反應溶液(各取0.1毫升)，測量在激發光波長360nm與放射光波長460nm下的螢光值(其中，混合溶液之螢光值稱為「控制組0小時之螢光值」，醣化反應溶液之螢光值則稱為「控制組24小時之螢光值」)。
C.正對照組：比照實驗組進行，但以[製備實施例D]提供之胺基胍(AG)溶液取代咖啡果肉萃取原液及咖啡果肉萃取稀釋液。
其後，經由下式計算各實驗組之AGEs生成量(%)，結果示於圖1。
由圖1可知，咖啡果肉萃取原液、50%濃度之咖啡果肉萃取稀釋液、及10%濃度之咖啡果肉萃取稀釋液皆具有抑制AGEs生成的效果，此說明本發明咖啡果肉萃取物確實可有效抑制蛋白質的醣化反應(抗醣化)。
實施例2：咖啡果肉萃取物於抑制氧化壓力的效益
進行以下試驗以了解咖啡果肉萃取物是否具有抑制氧化壓力的效果。首先，以MEM培養基(Minimum essential medium，購自Gibco，產品編號：61100-061)培養人類皮膚纖維母細胞(CCD-966sk；購自BCRC，產品編號：60153)，歷時24小時，其後，將細胞分為三組，並進行以下處理：
(1)控制組：將細胞繼續培養於MEM培養基中24小時。
(2)AGEs組：將細胞繼續培養於MEM培養基中24小時後，於培養基中加入0.4毫升[製備實施例E]提供之醣化胎牛血清白蛋白，繼續培養3小時。
(3)萃取物組：將細胞培養於每毫升含有0.25毫克[製備實施例A]提供之咖啡果肉萃取原液的MEM培養基中，歷時24小時，接著，於培養基中加入0.4毫升[製備實施例E]提供之醣化胎牛血清白蛋白，繼續培養3小時。
其後，以DCFH-DA染劑(購自Sigma公司，產品編號：SI-D6883-50MG)分別處理上述各組細胞15分鐘，以PBS清洗細胞兩次後，將細胞懸浮於PBS中以提供一細胞溶液。接著，於前述細胞溶液中加入200微升(μL)的胰蛋白酶並置於避光的環境下反應5分鐘後，將細胞溶液置於一15毫升(mL)離心管中，並以400g之轉速離心10分鐘。移除上清液後，以PBS清洗細胞一次，再以400g之轉速離心10分鐘。最後，以PBS重新懸浮所得之細胞沉澱物，並以流式細胞儀偵測各組細胞於激發光波長450-490nm及放射光波長510-550nm下之螢光值。其中，由於ROS可將DCFH-DA(不具螢光)轉變為DCF(具有螢光)，故所測
得之螢光值可代表細胞中的ROS含量，螢光值越高表示細胞中的ROS含量越高。最後，以Excel中的學生t檢驗(Student t-test)進行統計分析，並以控制組的結果為基準，計算其他各組細胞中的ROS含量。結果示於圖2。
由圖2可知，相較於「控制組」，「AGEs組」細胞的ROS含量係顯著增加。然而，相較於「AGEs組」，「萃取物組」的ROS含量則明顯減少。前述結果顯示，醣化反應會導致細胞內的氧化壓力提高，而咖啡果肉萃取物可有效抑制醣化反應所導致的氧化壓力，具有抗氧化的效果。
實施例3：咖啡果肉萃取物於提升皮膚緊緻度的效果
為了解咖啡果肉萃取物是否具有提升皮膚緊緻度的效果，係以MEM培養基培養人類皮膚纖維母細胞(CCD-996sk；購自BCRC，產品編號：60153)，歷時24小時，接著，將細胞分成三組，並進行以下處理：
A.控制組：1.以500微升(μL)體積計，將0.66倍體積的細胞置於一滅菌管中，加入0.33倍體積的3毫克/毫升之第一型膠原蛋白(Collagen I；購自Gibco公司，產品編號：A10483-01)溶液，接著快速加入適量的1莫耳濃度(M)的氫氧化鈉溶液(該氫氧化鈉溶液的量需至少為可將酚紅指示劑(phenol red medium indicator)轉為淺粉色所需的用量)，上下混合溶液三次，以提供一混合物；2.取500微升上述步驟1提供之混合物置入一24孔培養盤中，於室溫下靜置20分鐘，使其固化為一凝膠；以及3.加入500微升的MEM培養基，並小心地將凝膠的周圍與培養盤分離，使凝膠懸浮於MEM培養基中，再將培養盤置於37℃、5% CO2的培養箱中培養，
歷時6小時。
B.AGEs組：(1)以500微升(μL)體積計，將0.66倍體積的細胞置於一滅菌管中，加入0.33倍體積的3毫克/毫升之第一型膠原蛋白溶液，接著快速加入適量的1莫耳濃度(M)的氫氧化鈉溶液(該氫氧化鈉溶液的量需至少為可將酚紅指示劑(phenol red medium indicator)轉為淺粉色所需的用量)，並添加[製備實施例E]提供之醣化胎牛血清白蛋白，上下混合溶液三次，以提供一混合物；(2)取500微升上述步驟(1)提供之混合物置入一24孔培養盤中，於室溫下靜置20分鐘，使其固化為一凝膠；以及(3)加入500微升的MEM培養基，並小心地將凝膠的周圍與培養盤分離，使凝膠懸浮於MEM培養基中，再將培養盤置於37℃、5% CO2的培養箱中培養，歷時6小時。
C.萃取物組：比照「AGEs組」的步驟進行配製，但於步驟(3)中，在將培養盤放置於培養箱之前，進一步添加[製備實施例A]提供之咖啡果肉萃取原液，使其於所加入的MEM培養基中的濃度達到0.25毫克/毫升。
最後，每隔3小時觀察凝膠的輪廓變化，並以數位相機拍攝凝膠，持續觀察6小時。其後，將第6小時所拍攝之圖像以Image J軟體進行分析，記錄各組凝膠的輪廓並計算其表面積(凝膠的表面積越小代表收縮能力越強)。最後，以學生t檢驗(Student t-test)進行統計分析，並以「控制組」之結果作為基準(即，將「控制組」設定為100%)計算「AGEs組」及「萃取物組」的凝膠的收縮能力。結果示於圖3A及圖3B。
如圖3A及圖3B所示，相較於「控制組」，「AGEs組」的凝膠輪廓及表面積明顯較大，此說明醣化胎牛血清白蛋白的刺激會使凝膠中膠原蛋白的硬化及斷裂而導致鬆弛的現象。然而，相較於「AGEs組」，「萃取物組」的凝膠輪廓及表面積明顯較小，甚至與「控制組」相當，前述結果顯示咖啡果肉萃取物確實具有提升皮膚緊緻度的效果，可用於緊緻皮膚、減少皮膚細紋。
實施例4：咖啡果肉萃取物於提升KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因之表現的效益
如上述，若可提升皮膚細胞之KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3基因的表現，即可達到幫助維持皮膚健康、保濕、緊緻皮膚、減少皮膚細紋、抗皮膚老化、改善皮膚乾燥、預防皮膚疾病、及/或治療皮膚疾病的效果。為了解咖啡果肉萃取物是否具有提升皮膚細胞之KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3基因表現的效果，係將人類表皮主要角質細胞(HPEK-50；購自CELLnTEC，產品編號：CNT-PR-3D)培養於角質細胞專用之無血清培養基(SFM medium；購自Gibco，產品編號：17005042)中，歷時24小時，接著，將細胞分成兩組，並進行以下處理：
(1)控制組：將細胞置於SFM培養基中培養6小時。
(2)萃取物組：將細胞置於每毫升含有0.25毫克[製備實施例A]提供之咖啡果肉萃取原液的SFM培養基中培養6小時。
其後，分別收集上述各組細胞，以RNA萃取套組(RNA Extraction Kit，購自Geneaid公司)進行RNA萃取，再以反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase，購自Invitrogrn公司)將該RNA反轉錄為cDNA。接著，使用ABI Step One Plus儀器及KAPA SYBR FAST qPCR套組對前述之cDNA進行qPCR，以檢測
各組細胞之KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3的基因表現量。最後，以Excel中的T.TEST進行單尾學生t檢驗(single-tailed student-t-test)進行統計分析，並以「控制組」作為基準(即，將「控制組」的基因表現設定為1倍)計算其餘各組的相對基因表現量。結果示於圖4至圖8。
由圖4至圖8可知，相較於「控制組」，「萃取物組」之細胞的KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3基因表現量皆明顯提升。前述結果顯示，咖啡果肉萃取物確實可提升KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3基因的表現量，故可用於幫助維持細胞構造、幫助形成皮膚屏障、提升透明質酸合成量、及提高細胞含水量，達到幫助維持皮膚健康、保濕、緊緻皮膚、減少皮膚細紋、抗皮膚老化、及改善皮膚乾燥的效果，且可用預防皮膚乾燥相關疾病、及/或治療皮膚乾燥相關疾病。
實施例5：人體試驗
(5-1)食用咖啡果肉萃取物之長期試驗
本實驗採自身對照方式進行，招集八位年齡介於30至55歲之受試者，每日飲用一瓶咖啡果肉飲料(以飲料之總重計，係含有0.14%[製備實施例A]提供之咖啡果肉萃取原液)，持續4週。分別於第0週(飲用含有本發明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉飲料前)及第4週(飲用含有本發明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉飲料後)以VISIA Complexion Analysis System檢測儀(購自Canfield公司，美國)進行皮膚褐斑測定並記錄，並以C+K Cutometer® dual MPA580多探頭膚質分析儀(購自C+K electronic公司，德國)進行皮膚黑色素、皮膚含水量、皮膚彈力及皮膚光澤度測定並記錄。另外，以高解析單眼相機搭配三種光源(全光域波長、紫外光及偏光波域的光源)，拍攝臉部皮膚，觀察皮膚狀況。接著，以學生t檢
驗(Student t-test)進行統計分析，並以第0週之結果作為基準(即，將第0週設定為100%)計算飲用含有本發明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉飲料4週後的皮膚黑色素、皮膚褐斑、皮膚含水量、皮膚彈力及皮膚光澤度。結果示於圖9至圖13。
由圖9至圖13可知，在連續飲用含有本發明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉飲料4週後，受試者的皮膚黑色素及皮膚褐斑明顯減少，且皮膚含水量、皮膚彈力及皮膚光澤度明顯提升。前述結果顯示，本發明之咖啡果肉萃取物確實具有減少皮膚黑色素與淡化皮膚斑點、保濕、及提升皮膚彈力與光澤的效果。
(5-2)使用咖啡果肉面膜之短期試驗
本實驗採自身對照方式進行，招集五位受試者以咖啡果肉面膜(以面膜中精華液之總重計，係含有2%[製備實施例A]提供之咖啡果肉萃取原液)塗抹半臉，並以安慰劑面膜(與咖啡果肉面膜之差異僅在於不含本發明咖啡果肉萃取原液)塗抹另半臉，以指腹稍加按摩促進吸收，持續15分鐘，並於第0分鐘(使用前)及第15分鐘(使用後)，以C+K Cutometer® dual MPA580多探頭膚質分析儀(購自C+K electronic公司，德國)進行皮膚彈力測定並記錄。接著，以學生t檢驗(Student t-test)進行統計分析，並以第0分鐘之結果作為基準(即，將第0分鐘設定為100%)計算15分鐘後的皮膚彈力。結果示於圖14。
由圖14可知，相較於使用安慰劑面膜，在使用咖啡果肉面膜15分鐘後，受試者的皮膚彈力係明顯提升。前述結果顯示，本發明之咖啡果肉萃取物具有在短時間內提升皮膚彈力的效果。
Claims (10)
- 一種使用咖啡果肉萃取物於以下之一或多者的用途：美白、改善膚質、護膚、及抗皮膚老化。
- 如請求項1之用途，其中該萃取物係以一極性溶劑萃取咖啡果肉所提供，該極性溶劑係選自以下群組：水、C1-C4醇類、及前述之組合。
- 如請求項1之用途，其中該萃取物係用於以下之一或多者：保濕、緊緻皮膚、減少皮膚細紋、改善皮膚乾燥、提升皮膚光澤、及幫助維持皮膚健康。
- 如請求項1至3中任一項之用途，其中該萃取物係以塗抹或口服的方式使用。
- 一種使用咖啡果肉萃取物於製備一醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物係用於以下之一或多者：修復皮膚組織、預防皮膚疾病、及治療皮膚疾病。
- 如請求項5之用途，其中該醫藥組合物係用於抑制皮膚細胞之蛋白質的醣化及/或降低氧化壓力對皮膚細胞的傷害。
- 如請求項5之用途，其中該醫藥組合物係用於預防或治療皮膚乾燥相關疾病。
- 如請求項5至7中任一項之用途，其中該醫藥組合物係呈一適於口服、經皮投藥或皮下注射之劑型。
- 一種使用咖啡果肉萃取物於製備一醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物係用於提升以下基因之至少一者的表現：KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因。
- 如請求項9之用途，其中該醫藥組合物係呈一適於口服、經皮投藥或皮下注射之劑型。
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- 2018-12-27 TW TW107147475A patent/TWI754121B/zh active
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| TWI754121B (zh) | 2022-02-01 |
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