TW201929877A - 地龍蛋白用於製造保護腦神經細胞醫藥組成物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種地龍蛋白的用途，提供地龍蛋白利用於製造保護腦神經細胞醫藥組成物之用途，藉由該醫藥組成物可提高神經細胞中抗氧化基因之表現，或是抑制β類澱粉質蛋白(β-amyloid protein,Aβ)與1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-phenylpyridinium,MPP+)對神經細胞的作用，而降低腦神經細胞的損害。
Description
本發明係關於一種地龍蛋白的用途，尤其是關於一種將地龍蛋白用於製造保護腦神經細胞醫藥組成物之用途。
根據2017年國際失智症協會(ADI)的預估，失智症於2017年將新增1千萬名案例，平均每3秒就有一人罹患失智症，而2017年全球失智症人口將高達近5千萬人，到2050年更會達到1億3150萬人。阿茲海默症(Alzheimer disease)是最常見的失智症，其早期最明顯的病徵為記憶力衰退，對時間、地點和人物的辨認出現問題，產生兩種以上認知功能的障礙，屬於進行性退化而且是不可逆。此外，病患腦部神經細胞會受到破壞，初期以侵犯海馬迴為主，往後則有異常老年斑及神經纖維糾結發生，不但深切影響病人的自主、自覺能力，也對家庭照護帶來重大衝擊，因此，若能發現具有預防或甚至治療效果的醫藥組成物，對於阿茲海默症患者將是一大福音。
同樣的，帕金森氏症亦是失智相關的嚴重疾病，2015年時全球患者約有620萬人，並導致11.7萬人死亡。據統計，60歲以上的老人約有1%會罹患此病，此病是一種慢性中樞神經系統的退化疾病，主要影響運動神經系統，其症狀隨時間緩慢出現，早期最明顯的病症為顫抖、肢體僵硬、運動功能減退和步態異常，在病情嚴重的患者中最常有失智症的發生。帕金森氏症的運動症狀主要導因於中腦黑質細胞死亡，使患者腦區的多巴胺不足。由於帕金森氏症目前無法治癒，因此僅能以藥物控制或以手術來減少運動症狀，因此，若也能發
現具有預防或甚至治療效果的醫藥組成物，對於帕金森氏症患者的減少或症狀的減輕，甚至是死亡率的降低，都有其迫切需求。
所謂地龍，又稱蚯蚓(Pheretima，環毛蚓屬)，傳統上可做為中藥材，一般認為具有活血化瘀、防治心血管疾病等作用；而地龍蛋白，則是蚯蚓之萃取物，其除了含有鐵、錳、銅、鋅、硒等微量元素外，也富含許多胜肽與酵素。目前已知地龍蛋白所含有的膠原酶、纖溶酶和蚓激酶，主要對於血栓的溶解具有一定的功效，因此可應用於心血管疾病的預防或是中風後遺症的改善，至於地龍蛋白其他成分具有何種具體功效，則多仍在研究中。
本發明目的之一在於提供一種地龍蛋白作為保護腦神經細胞醫藥組成物之成分的應用，藉由本發明所提供之實施例，地龍蛋白可利用於製造降低腦神經細胞受損的醫藥組成物。
為了達成前述的目的，本發明提供一種地龍蛋白用於製造保護腦神經細胞醫藥組成物之用途，該地龍蛋白中不含紅蚯蚓激酶，但利用該地龍蛋白所製造的保護腦神經細胞醫藥組成物，可藉由提高神經細胞中抗氧化基因之表現，或是抑制β類澱粉質蛋白(β-amyloid protein,Aβ)與1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-phenylpyridinium,MPP+)對神經細胞的作用，而降低腦神經細胞的損害。
在本發明的一實施例中，該保護腦神經細胞醫藥組成物可用以提高神經細胞抗氧化的能力。
在本發明的一實施例中，該保護腦神經細胞醫藥組成物可用以提高神經細胞中抗氧化基因之表現。
在本發明一實施例的一態樣中，該抗氧化基因可為超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)或穀胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)。
在本發明的一實施例中，該用以提高神經細胞中抗氧化基因之表現的醫藥組成物，其中所含地龍蛋白濃度可約為0.05-0.7mg/ml。
在本發明的另一實施例中，該保護腦神經細胞醫藥組成物可用以抑制β類澱粉質蛋白對腦神經細胞的損害。在一態樣中，該保護腦神經細胞醫藥組成物可用以預防阿茲海默症，而該醫藥組成物中所含地龍蛋白濃度可約為0.005-0.05mg/ml。
在本發明的另一實施例中，該保護腦神經細胞醫藥組成物可用以抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子對腦神經細胞的損害。在一態樣中，該保護腦神經細胞醫藥組成物可用以預防帕金森氏症，而該醫藥組成物中所含地龍蛋白濃度可約為0.04-0.08mg/ml。
在本發明的一實施例中，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物中所含地龍蛋白係將蚯蚓以水萃取所獲得。在一態樣中，所含地龍蛋白係將蚯蚓以約40~50℃溫水萃取所獲得。
在本發明的另一實施例中，該蚯蚓可為參環毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))、通俗環毛蚓(Pheretima vulgaris Clen)、紅色愛勝蚓(Eisenia rosea savigny)、赤子愛勝蚓(Eisenia Foetida)、節盲環毛蚓(Pheretima pectinifera)或威廉環毛蚓(Phererima guillelmi)。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係本發明實施例之地龍蛋白萃取物的抗氧化試驗之結果圖。
圖2係本發明實施例之地龍蛋白萃取物對SOD1基因表現影響之結果圖。
圖3係本發明實施例之地龍蛋白萃取物對SOD2基因表現影響之結果圖。
圖4係本發明實施例之地龍蛋白萃取物對GPX基因表現影響之結果圖。
圖5係本發明實施例之地龍蛋白萃取物對Aβ所產生神經細胞的損害之抑制結果圖。
圖6係本發明實施例之地龍蛋白萃取物對MPP+所產生神經細胞的損害之抑制結果圖。
關於地龍蛋白，其係將蚯蚓處理後所萃取之萃取物，可以藉由以下方法獲得。由於地龍蛋白之萃取方法已為所屬技術領域具有通常知識者所熟知，因此下述萃取方法僅為示例，並不僅限於此。其中最適濃度如下所示：]
將蚯蚓放入水中，攪拌加以清洗，去除其身上的泥沙、雜質或粘膜等，直到清洗後的水為清澈為止。清洗之前，亦可對蚯蚓進行催吐，使排出其體內未消化之食物或雜質。之後，將清洗乾淨之蚯蚓放入臭氧溶液中進行殺菌消毒，取出後再次清洗，然後將其浸泡40~50℃溫水中，蚯蚓與水的比例約為1：20~1：5，較佳為1：12~1：8。持續在40-50℃下作用約12~16小時後，以磨碎機將其磨碎，將磨碎後的漿液先以50~100目篩網過濾，收集濾液後，於6000~14000rpm下離心8~28分鐘(依溶液體積調整)，取其上清液再一次過濾後，再進行一次前述條件的離心，取得上清液後即為蚯蚓萃取物，亦即所謂的地龍蛋白。經檢測該地龍蛋白中並不含紅蚯蚓激酶。前述蚯蚓萃取物之溶液可進一步利用超濾膜進行濃縮，或再經冷凍乾燥形成粉末狀以為後續之試驗或利用。
前述的蚯蚓可為參環毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))、通俗環毛蚓(Pheretima vulgaris Clen)、紅色愛勝蚓(Eisenia rosea savigny)、赤子愛勝蚓(Eisenia Foetida)、節盲環毛蚓(Pheretima pectinifera)或威廉環毛蚓(Phererima guillelmi)等環節動物門寡毛綱的動物，但並不僅限於此。
首先將實施例1所製備之地龍蛋白以純水配製為0.05-0.7mg/ml濃度的溶液，較佳為0.5mg/ml濃度。
準備小鼠腦神經瘤細胞株(Neuro-2a，ATCC，CCL-131)，培養於細胞培養液[Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin，Gibco)、10%胎牛血清(Gibco)]中。準備6孔盤，於每孔中植入2ml細胞培養液，使每孔具有1.5 x 105個細胞，之後於37℃下，培養24小時。
之後在不影響黏附細胞之情況下移除每孔中的培養液，分成三組(每組2孔)準備試驗，A組為空白對照組，B組為加入500μM H2O2(Sigma)，C組則加入500μM H2O2與由前述實施例1所製備的地龍蛋白萃取液0.5mg/ml，前述各組與培養液一同加入後，於37℃下培養1小時。之後，再於每孔中加入5μg/ml DCFH-DA(Sigma/SI-D6883-50MG)，於37℃下反應15分鐘。接著，使H2O2於37℃下反應1小時。之後，每孔以1ml 1x PBS(Gibco)清洗細胞兩次。清洗後，分別加入200μl胰蛋白酶(trypsin)，於黑暗中反應5分鐘。之後將細胞溶液取出移至1.5ml離心管中，以400 xg離心10分鐘。移去上清液，以1x PBS清洗一次，再次以400 xg離心10分鐘。再移除上清液，將細胞沉澱懸浮於1ml 1x PBS中。之後以流式細胞儀，分別於激發波長(450~490nm)與發射波長(510~550nm)下偵測DCFH-DA的螢光訊號。偵測出之數值以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定分析二數值間的統計顯著性，其結果如圖1所示。其中，相較於H2O2，*之P值<0.05。
由圖1之結果可知，在含有本發明之地龍蛋白萃取物的情況下，活性氧化物質大幅降低了近25%，確認本發明之地龍蛋白萃取物可降低活性氧化物質等自由基的產生，而減輕其對腦神經細胞的傷害。
同樣的，將實施例1所製備之地龍蛋白以生理食鹽水配製為0.05-0.7mg/ml濃度的溶液，較佳為0.5mg/ml濃度。同時，準備人類皮膚纖維母細胞(CCD-966sk，BCRC No.60153)，再於6孔盤每孔中植入2ml細胞培養液，使每孔具有1.5 x 105個細胞，之後於37℃下，培養24小時。之後在不影響黏附細胞之情況下移除每孔中的培養液，分成以下組別進行試驗，其分別包括：空白對照組、僅加入H2O2組(僅H2O2)，以及加入H2O2與0.5mg/ml實施例1所製備的地龍蛋白萃取液組(地龍蛋白)，於37℃下培養24小時，再進行特定基因表現的分析。
將上述各組細胞回收，以RNA萃取套組(Geneaid)萃取其RNA，並以反轉錄酶(Invitrogen)將該些RNA反轉錄為cDNA。之後利用即時聚合酶鏈鎖反應系統(ABI Step One Plus Real-Time PCR system)，分別利用表1所列引子進行qPCR(KAPA CYBRFAST qPCR Kits，KAPA Biosystems)，以定量以下基因的表現：SOD1、SOD2與GPX。基因表現相對定量分析係採用2-△△Ct法。關於基因表現之結果如圖2至4所示。其中，*之P值<0.05，***之P值<0.001。
由圖2~4之結果可知，在含有本發明之地龍蛋白萃取物的情況下，於作用24小時後，可將SOD1基因表現之相對值由0.66提升到1.99，SOD2基因表現之相對值由0.28提升到1.61，而GPX基因表現之相對值則由0.17提升到1.35。因此，本發明實施例之地龍蛋白萃取物確實能夠誘發使諸如SOD1、SOD2與GPX等抗氧化基因的表現增加。
將實施例1所製備之地龍蛋白以生理食鹽水配製為0.005-0.05mg/ml濃度的溶液，較佳為0.008mg/ml濃度。同時，準備人類神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y，ATCC CRL-2266)，再於6孔盤每孔中植入2ml細胞培養液，使每孔具有2 x 104個細胞，並分成以下組別進行試驗，其分別包括：空白對照組、β-amyloid胜肽(Lifetein)組(僅Aβ)、甲基牛扁定(Methyllycaconitine，MLA)控制組與Aβ(PC+Aβ)，以及0.008mg/ml實施例1所製備的地龍蛋白萃取液與Aβ組(地龍蛋白+Aβ)，於37℃下培養24小時，再進行腦神經細胞存活率的分析。
首先於每孔中加入15μl的MTT(thiazoyl blue tetrazolium bromide,AMRESCO/0793-5G)溶液，於37℃下培養4小時。之後將溶液移除，加入50μl
的DMSO(ECHO/DA1101-000000-72EC)溶液以將反應所形成的甲臢(formazan)溶解。將6孔盤置於搖動器上搖晃10分鐘後，以ELISA分析儀(BioTek)測量570nm波長下的吸光值，並以以下公式計算細胞存活率(%)：(試驗組之吸光值/控制組之吸光值)x 100%。最後將數值以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定分析數值間的統計顯著性，其結果如圖5所示。其中，相較於僅Aβ組，*之P值<0.05，**之P值<0.01；相較於空白對照組，###之P值<0.001。
由圖5之結果可知，在含有本發明實施例之地龍蛋白萃取物的情況下，細胞存活率由51.2%提升至58.2%，提升幅度約7%，證實本發明實施例之地龍蛋白萃取物可抑制Aβ對腦神經細胞的作用，減少其損傷，因而也可應用於阿茲海默症的預防。
將實施例1所製備之地龍蛋白以生理食鹽水配製為0.04-0.08mg/ml濃度的溶液，較佳為0.06mg/ml濃度。同時，準備人類神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y，ATCC CRL-2266)，再於6孔盤每孔中植入2ml細胞培養液，使每孔具有2 x 104個細胞，並分成以下組別進行試驗，其分別包括空白對照組、MPP+組(僅MPP+)以及0.06mg/ml實施例1所製備的地龍蛋白萃取液與MPP+組(地龍蛋白+MPP+)，於37℃下培養24小時，再進行腦神經細胞存活率的分析。
首先於每孔中加入15μl的MTT(AMRESCO/0793-5G)溶液，於37℃下培養4小時。之後將溶液移除，加入50μl的DMSO(ECHO/DA1101-000000-72EC)溶液以將反應所形成的甲臢(formazan)溶解。將6孔盤置於搖動器上搖晃10分鐘後，以ELISA分析儀(BioTek)測量570nm波長下的吸光值，並以以下公式計算細胞存活率(%)：(試驗組之吸光值/控制組之吸光值)x 100%。最後將數值以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定分析數值間的統計顯著性，其結果如圖6所示。其中，相較於僅MPP+組，***之P值<0.001；相較於空白對照組，##之P值<0.01。
由圖6之結果可知，在含有本發明實施例之地龍蛋白萃取物的情況下，細胞存活率由74.1%提升至97.21%，顯著提升約23.11%，證實本發明實施
例之地龍蛋白萃取物可抑制MPP+對腦神經細胞的作用，減少其損傷，因而也可應用於帕金森氏症的預防。
本發明實施例之保護腦神經細胞醫藥組成物亦可進一步加入所屬技術領域所熟知之載劑或其他輔劑。而其劑型，可為但不限於溶液、膠囊、或錠劑。
藉由上述結果，可證明本發明實施例所製備的醫藥組成物中的地龍蛋白對腦神經細胞具有極佳的抗氧化效果，且能提高其抗氧化基因表現，並能抑制β類澱粉質蛋白或1-甲基-4-苯基吡啶離子對腦神經細胞的作用以降低腦神經細胞的損害，因此可進一步為預防阿茲海默症或帕金森氏症之醫藥組成物。
<110> 大江生醫股份有限公司
<120> 地龍蛋白用於製造保護腦神經細胞醫藥組成物之用途
<130> 106B0168-I1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
Claims (13)
- 一種地龍蛋白用於製造保護腦神經細胞醫藥組成物之用途，其中該地龍蛋白中不含紅蚯蚓激酶，並可降低腦神經細胞的損害。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物係用以提高神經細胞中一抗氧化基因之表現。
- 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該抗氧化基因係SOD1、SOD2或GPX。
- 如申請專利範圍第2項或第3項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物中所含地龍蛋白濃度係約0.05-0.7mg/ml。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物係用以抑制β類澱粉質蛋白(Aβ)對神經細胞的損害。
- 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物係用以預防阿茲海默症。
- 如申請專利範圍第5項或第6項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物中所含地龍蛋白濃度係約0.005-0.05mg/ml。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物係抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)對神經細胞的損害。
- 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物係用以預防帕金森氏症。
- 如申請專利範圍第8項或第9項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物中所含地龍蛋白濃度係約0.04-0.08mg/ml。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物中所含地龍蛋白係將一蚯蚓以水萃取所獲得。
- 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該保護腦神經細胞醫藥組成物中所含地龍蛋白係將該蚯蚓以約40~50℃溫水萃取所獲得。
- 如申請專利範圍第11項或第12項所述之用途，其中該蚯蚓係參環毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))、通俗環毛蚓(Pheretima vulgaris Clen)、紅色愛勝蚓(Eisenia rosea savigny)、赤子愛勝蚓(Eisenia Foetida)、節盲環毛蚓(Pheretima pectinifera)或威廉環毛蚓(Phererima guillelmi)。
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