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TW201927326A - 源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法以及源自綠茶萃取物之麴發酵物、以及含有源自綠茶萃取物之麴發酵物的組成物 - Google Patents

源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法以及源自綠茶萃取物之麴發酵物、以及含有源自綠茶萃取物之麴發酵物的組成物 Download PDF

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TW201927326A
TW201927326A TW107146797A TW107146797A TW201927326A TW 201927326 A TW201927326 A TW 201927326A TW 107146797 A TW107146797 A TW 107146797A TW 107146797 A TW107146797 A TW 107146797A TW 201927326 A TW201927326 A TW 201927326A
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TW
Taiwan
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fermented
green tea
tea extract
composition
mass
Prior art date
Application number
TW107146797A
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Inventor
吉田滋樹
宮崎均
小嶋誠
Original Assignee
日商森之茶工房有限公司
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Publication date
Application filed by 日商森之茶工房有限公司 filed Critical 日商森之茶工房有限公司
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Abstract

本發明提供一種源自綠茶之新物類及新用途。
本發明係一種源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法，係利用麴使綠茶萃取物發酵；一種源自綠茶萃取物之麴發酵物；一種包含源自綠茶萃取物之麴發酵物作為有效成分的組成物；而且，較佳為前述組成物為醫藥組成物、飲品、食品組成物。
另外，較佳為前述組成物為脂聯素產生促進用組成物，或者肥胖之預防、改善或治療用組成物，或者美膚用組成物，或者動脈硬化之預防、改善或治療用之組成物。

Description

源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法以及源自綠茶萃取物之麴發酵物、以及含有源自綠茶萃取物之麴發酵物的組成物
本發明係關於一種源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法、新穎的源自綠茶萃取物之麴發酵物、以及以該麴發酵物作為有效成分的脂聯素產生促進用組成物和肥胖之預防、改善或治療用之組成物等。
綠茶係自古以來被用作飲品、食品且安全性亦高，綠茶中含有綠茶兒茶素(catechin)，已知該綠茶兒茶素具有抗菌作用。為了於產業上利用抗菌作用，而正開發高濃度地含有綠茶兒茶素之綠茶萃取物，並將該綠茶萃取物作為原料而用於提高了抗菌作用之齲齒預防或口腔清洗等口腔衛生製品或抗菌口罩等。
而且，近年來進一步探求與綠茶萃取物有關之各種生理功能性，正進行靈活運用該生理功能性的新用途之研究、開發。
例如，專利文獻1中揭示有提供以茶多酚或茶萃取物作為有效成分的幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)去除劑、食物與飲料甚至食品添加物，其特徵在於與質子幫浦抑制劑(PPI)併用。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利特開2002-068992號公報。
因此，本發明之主要目的在於提供一種源自綠茶之新物類及新用途。
本發明者等人欲提供以綠茶作為起點之新物類及新用途而進行了試誤。當時，儘管綠茶萃取物具有抗菌作用，但本發明者等人也未侷限於該常識，而是添加種麴嘗試了發酵。而且，本發明者等人對麴發酵後之發酵物進行了HPLC(High Performance Liquid Chromatography；高效液相層析)分析，結果確認了於發酵前與發酵後，兩者之波峰圖案不同，表示良好地進行了麴發酵。如此，於高濃度地含有具有抗菌作用之兒茶素類的綠茶萃取物中良好地進行了麴發酵係完全出乎意料之外。
而且，本發明者等人對所得的源自綠茶萃取物之麴發酵物的HPLC分析之波峰圖案進行了研究，結果因抗肥胖作用而為人所知的兒茶素類之波峰幾乎消失。而且意外的是，該源自綠茶萃取物之麴發酵物與發酵前之綠茶萃取物相比，以低濃度具有脂聯素產生促進作用。而且，本發明者等人進行了各種生理活性試驗，結果發現：所得的源自綠茶萃取物之麴發酵物可用於肥胖之預防、改善或治療；美膚；動脈硬化之預防、改善或治療等。
本發明者等人認為，因抗肥胖作用而為人所知的兒茶素類及小分子發酵多酚(Teadenol)之波峰係未檢測出而確認不到，故應是所得的源自綠茶萃取物之麴發酵物中的某些成分發揮效能。由此，本發明者等人發現：藉由使用麴，可由綠茶萃取物獲得先前不存在的新穎之綠茶發酵物。
基於以上情事，本發明者等人完成了本發明。
亦即，本發明如以下所述。
[1]一種源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法，係利用麴使綠茶萃取物發酵。
[2]一種源自綠茶萃取物之麴發酵物。
[3]一種組成物，包含源自綠茶萃取物之麴發酵物作為有效成分。
[4]如前述[3]記載之組成物，其中前述組成物為脂聯素產生促進用組成物、或是肥胖之預防、改善或治療用組成物、或是美膚用組成物、或是動脈硬化之預防、改善或治療用之組成物。
根據本發明，可提供一種源自綠茶之新物類及新用途。
根據本發明，可提供一種新的源自綠茶萃取物之麴發酵物。根據本發明，可提供一種以新的源自綠茶萃取物之麴發酵物作為有效成分的脂聯素產生促進用組成物；一種肥胖之預防、改善或治療用之組成物；一種美膚用組成物；一種動脈硬化之預防、改善或治療用之組成物。
再者，不限定於此處所記載之功效，亦可為本說明書中記載之任一功效。
圖1A表示標準品兒茶素類(自左向右為EGC、EC、EGCG、GCG)之HPLC分析之結果，圖1B表示綠茶萃取物(發酵前)之HPLC分析之結果，圖1C表示標準品小分子發酵多酚A之HPLC分析之結果，圖1D表示麴發酵物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系))之HPLC分析之結果，圖1E表示麴發酵物(製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))之HPLC分析之結果。
圖2為表示對綠茶萃取物進行麴發酵所得之麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系))及其發酵前之綠茶萃取物對成熟脂肪細胞之脂聯素之表現造成的影響之圖。上段為脂聯素之西方墨點(Western blot)解析之結果，下段為將脂聯素之表現量定量化之結果。再者，Cont為對照組。
圖3表示將麴發酵產物投予至小鼠的投予群(右側)、非投予群(左側：Cont)中之脂聯素(上段：圖3A)及脂肪酸合成酵素(FAS)(下段：圖3B)之結果。再者，圖3A及圖3B之上段為脂聯素之西方墨點解析之結果，下段為將脂聯素之表現量定量化之結果。再者，Cont為對照組。*P<0.05 vs cont
以下對本發明之較佳實施形態進行說明。然而，本發明不限定於以下之較佳實施形態，可於本發明之範圍內自由變更。另外，本說明書中，百分率只要無特別說明，則為基於質量之表示。
1.源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法
本實施形態係一種源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法，其係以綠茶萃取物作為起始原料之發酵物的製造方法，其特徵在於利用麴使綠茶萃取物發酵。藉此，可獲得源自綠茶萃取物之麴發酵物。
本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法包含利用麴使綠茶萃取物發酵之步驟。
本實施形態之發酵物的製造方法除了麴發酵步驟以外，亦可適當包含於發酵前及發酵後進行之步驟。作為發酵前步驟，例如可列舉：對綠茶進行萃取之步驟、種麴調製步驟、麴發酵用培養基之調製步驟；作為發酵後步驟，例如可列舉：對麴進行處理之步驟(例如去除步驟)、麴發酵物之調製步驟(例如發酵成分之分離精製步驟)等。
另外，亦可將前述發酵物製造方法之步驟組入至組成物的製造方法(例如飲品、食品製造方法等)之步驟中。
<綠茶萃取物>
前述綠茶萃取物係藉由自茶葉進行萃取而獲得，可利用公知之製法而獲得，作為茶葉，例如可列舉製茶茶葉、生茶葉等。作為製法之一例，例如可藉由利用熱水(0℃至100℃)或水溶性有機溶媒自製茶茶葉及/或生茶葉進行萃取而獲得。作為前述水溶性有機溶媒，例如可列舉碳數1至4之低級醇類(乙醇、1,3-丁二醇等)等，可自該等中使用一種或組合兩種以上，亦可進而與水混合而製成水混合溶媒。另外，亦可使用超臨界萃取方法。另外，亦可添加萃取助劑(例如抗壞血酸鈉等有機酸或該等之有機酸鹽類)進行萃取。
前述製茶茶葉為從由山茶(Camellia)屬(例如中國茶(C.sinensis)、阿薩姆茶(C.assamica))或該等之雜種所得之茶葉進行製茶所得之茶葉。就高效率地獲得目標發酵物之方面而言，本實施形態中使用之茶葉較佳為例如對綠茶類(例如煎茶、番茶、玉露、甜茶、烘焙茶等)進行製茶所得的不發酵之綠茶類之茶葉。
另外，作為市售品之綠茶萃取物，例如可列舉：綠茶萃取物BL(Accessone(股份有限公司))、Polyphenon(三井農林(股份有限公司))、Teafuran(伊藤園(股份有限公司))、Sunphenon(太陽化學(股份有限公司))等。
前述綠茶萃取物中，就可進行良好之麴發酵之方面及獲得目標發酵物之方面而言，較佳為含有茶兒茶素。
關於茶兒茶素之主要成分，已知有表兒茶素(epicatechin，EC)及其羥基體之表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、及作為該等之沒食子酸酯的表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，沒食子酸表兒茶素，ECG)及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，沒食子酸表沒食子兒茶素，EGCG)四種，且含量依序為EGCG>EGC>ECG>EC。
本實施形態中之綠茶萃取物中之茶多酚量並無特別限定，以乾燥物換算計，該茶多酚量之下限值較佳為30質量%以上，更佳為40質量%以上，該茶多酚量之上限值較佳為60質量%以下，進而較佳為50質量%以下。
本實施形態中之綠茶萃取物中之茶咖啡因量並無特別限定，以乾燥物換算計，該茶咖啡因量之上限值較佳為10質量%以下，更佳為8質量%以下，進而較佳為6質量%以下，另外， 該茶咖啡因量之下限值較佳為1質量%以上，更佳為3質量%以上。
本實施形態中之綠茶萃取物中之總兒茶素量並無特別限定，以乾燥物換算計，該總兒茶素量之下限值較佳為20質量%以上，更佳為30質量%以上，該總兒茶素量之上限值較佳為60質量%以下。另外，該綠茶萃取物中之總兒茶素量並無特別限定，以乾燥物換算計，較佳為20質量%至60質量%，更佳為30質量%至50質量%，該範圍就可進行良好之麴發酵之方面及高效率地獲得目標發酵物之方面而言較佳。
另外，前述綠茶萃取物中之「EGCG」量並無特別限定，以乾燥物換算計，該「EGCG」量之下限值較佳為5質量%以上，更佳為10質量%以上，另外，該「EGCG」量之上限值較佳為30質量%以下，更佳為20質量%以下。另外，前述綠茶萃取物中之「EGCG」量較佳為10質量%至30質量%，更佳為10質量%至20質量%，該範圍就可進行良好之麴發酵之方面及高效率地獲得目標發酵物之方面而言較佳。
另外，EGCG於總兒茶素量中所佔之比率較佳為20質量%至60質量%，一般為30質量%至60質量%左右。
本實施形態中使用之綠茶萃取物之形態並無特別限定，可為固體(粉末狀或顆粒狀等)、半固體、液體之任一種。
<麴>
本實施形態中所用之麴並無特別限定，就高效率地獲得目標發酵物之方面而言，較佳為含有麹菌(例如米麴系、豆麴系、麥麴系等)之麴。
前述麴可於將米、大豆、小麥等穀物作為原料進行食品發酵，製造日本酒、味增、醬油、燒酒等製品時用作種麴。一般而言，種麴中所使用之麹菌係將穀物所含之澱粉或蛋白質分解，將生成之葡萄糖或胺基酸作為營養源而增殖。
就目標發酵物容易發揮各種作用效果之方面而言，前述麴較佳為包含可用作米麴及/或麥麴之麹菌(米麴系麹菌及/或麥麴系麹菌)。
作為前述麴，可使用市售品之種麴。作為市售品之種麴，例如可列舉：白麴雪Komachi(8043)(秋田今野商店)、黃色小粒狀(8143)(秋田今野商店)、麴種(白豆芽菜)(樋口松之助商店(股份有限公司))、麴種(黃豆芽菜)(樋口松之助商店(股份有限公司))、長白菌(菱六(股份有限公司)製造)、改良長白菌(菱六(股份有限公司)製造)、醬油用種麴(Bioc(股份有限公司))等，可自該等中選擇一種或兩種以上。
前述麴中包含屬於麹黴屬(Aspergillus)之微生物(所謂麹菌)，作為該麹菌，例如可列舉：泡盛麴菌(Aspergillus awamori)、Aspergillus awamori ver.fumeus、白麹菌(Aspergillus Kawachii)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、Aspergillus oryzae ver oryzae、醬油麴菌(Aspergillus sojae)、泡盛黑麹菌(Aspergillus luchuensis)、佐氏麹菌(Aspergillus saitoi)、及Aspergillus usami等，可自該等中選擇一種或兩種以上。
其中，就高效率地獲得目標發酵物之方面而言，較佳為可用作種麴之麹菌，作為該種麴中使用之麹菌，例如可列舉：白麹菌(Aspergillus kawachii)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、醬油麴菌(Aspergillus sojae)、及泡盛麴菌(Aspergillus awamori)等， 可自該等中選擇一種或兩種以上。
麴係自古以來用於日本之傳統製造產業中，麴中有液體麴及固體麴，於對穀物進行處理時一般使用固體麴。本實施形態中，如後述[實施例]所示，可將市售品般之固體麴之種麴用於液體培養，而且可藉由該液體培養而獲得本實施形態之麴發酵物係完全出乎意料之外。藉此，本實施形態之麴發酵物之大量生產亦藉由使用種麴之液體培養而變得更容易。
[麴發酵步驟]
就可進行良好之麴發酵之方面及高效率地獲得目標發酵物之方面而言，本實施形態之麴發酵步驟較佳為藉由利用含有綠茶萃取物之培養基對麴進行培養而進行。
本實施形態中使用之含有綠茶萃取物之培養基可藉由將前述基本培養基組成與綠茶萃取物混合而調製。
另外，本實施形態之含有綠茶萃取物之培養基較佳為液體培養基，就可進行良好之麴發酵之方面及可高效率地生產目標發酵物之方面而言，另外就可容易地回收發酵物之方面而言較佳。
前述基本培養基組成只要為麴可發酵之培養基組成，則並無特別限定，只要使用一般被用作麴之營養源的無機鹽類、碳源(較佳為糖類)、氮源等即可。
作為前述糖類，例如可列舉：蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇等，可自該等中選擇一種或兩種以上。 作為糖類，本實施形態之培養基中之糖類之含量並無特別限定，就可進行良好之麴發酵之方面及獲得目標發酵物之方面而 言，較佳為0.1質量%至2質量%。
作為前述無機鹽，例如可列舉：硝酸鈉、亞硝酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等，可自該等中選擇一種或兩種以上。
本實施形態中使用之培養基中之綠茶萃取物之含量並無特別限定，該含量之下限值較佳為0.1質量%以上，更佳為0.5質量%以上，該含量之上限值較佳為40質量%以下，更佳為30質量%以下。
本實施形態之培養基中之綠茶萃取物之含量較佳為1質量%至20質量%，更佳為1質量%至10質量%，該範圍就可進行良好之麴發酵之方面及獲得目標發酵物之方面而言較佳。
本實施形態之培養基中之綠茶兒茶素總量及EGCG含量並無特別限定，可利用培養基中使用之綠茶萃取物及其使用量來進行調整。
本實施形態之培養基中之綠茶兒茶素總量較佳為0.1質量%至5質量%，該範圍就可進行良好之麴發酵之方面及獲得目標發酵物之方面而言較佳。
本實施形態之培養基中之EGCG含量較佳為0.05質量%至2.5質量%，該範圍就可進行良好之麴發酵之方面及獲得目標發酵物之方面而言較佳。
於前述含有綠茶萃取物之培養基中添加麴，進行麴發酵，此時添加之麴之使用量並無特別限定，以該使用量之下限值較 佳為成為0.001質量%以上、該使用量之上限值較佳為成為1質量%以下之方式添加至培養基中。較佳為以成為0.005質量%至0.5質量%、更佳為以成為0.01質量%至0.1質量%之方式於培養基中添加麴。
作為本實施形態中之發酵條件，就可進行良好之麴發酵之方面及獲得目標發酵物之方面而言，較佳為好氧培養條件。較佳為將振盪、通氣、攪拌等方法單獨或組合使用而進行好氧培養。
進而，本實施形態中之培養溫度並無特別限定，較佳為10℃至40℃，更佳為20℃至30℃。
本實施形態中之培養時之培養基之pH較佳為4.0至8.0，更佳為5.0至7.0，進而較佳為5.5至6.5。
本實施形態中之培養期間並無特別限定，較佳為5天以上，更佳為10天至30天，進而較佳為10天至20天期間。
本實施形態中之培養形態並無特別限定，既可為連續培養(灌流培養等)，亦可為批次培養。本實施形態中之培養中之麴發酵物之生產狀況可藉由後述[實施例]所示般之HPLC分析而確認，藉此，亦可設定培養期間或培養基成分之追加、發酵物之回收之時機等。
如上所述，於培養培養基中生產本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物。
再者，進行麴發酵所得之麴發酵物之麴之處理方法可依照公知之真菌類等微生物之處理方法而進行。例如可列舉：藉由 加熱及/或過濾等而對麴進行殺菌或除菌等。於使用種麴等之情形時，該種麴係安全性高，故而亦可直接含有麴，但就風味等之變化之方面而言，較理想為進行殺菌或除菌。作為除菌，只要進行一般將真菌類去除般之過濾處理即可，例如可列舉利用過濾助劑(活性白土、矽藻土等)或膜等之處理。
另外，所得之麴發酵物中之發酵成分之調製方法可依照公知之分離精製方法而進行。
2.源自綠茶萃取物之麴發酵物
藉由本實施形態的製造方法，可獲得本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物。
本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物如後述[實施例]般，未檢測出兒茶素類及小分子發酵多酚，係先前之綠茶來源物中不存在的新穎之麴發酵物。
本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物所含之成分目前正在解析中，儘管未檢測出兒茶素類及小分子發酵多酚，但如後述般，該麴發酵物表現出各種效能，故而認為藉由麴發酵而產生並包含新穎之成分。
利用本實施形態的製造方法所製造之麴發酵物較佳為於後述[實施例]中測定之逆相管柱層析之HPLC分析中，具有位於相對保持時間13分鐘至14分鐘之間的1根波峰，更佳為該波峰係最高波峰。藉由將該波峰作為指標，可判斷麴發酵物的製造狀況，從而可提高目標波峰成分之回收效率。
進而，關於本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物中所 含的兒茶素類之含量，就能夠發揮並非由兒茶素類所引起的效能之方面而言，以較佳為0.1質量%以下、更佳為0.05質量%以下為宜。
進而，關於本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物中之小分子發酵多酚A及/或B之含量，就可發揮並非由小分子發酵多酚引起的效能之觀點而言，以較佳為0.1質量%以下、更佳為0.05質量%以下、進而較佳為0.001質量%以下為宜。
再者，本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物可期待藉由與已知效能成分(例如兒茶素類及/或小分子發酵多酚等)或將來發現之效能成分併用，而進一步提高各種效能。
而且，如後述[實施例]所示，本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物具有：脂聯素產生增加作用；脂聯素表現促進作用；脂肪細胞分解酵素ATGL表現促進作用；向脂肪堆積少之脂肪細胞之分化誘導作用；轉錄因子C/EBPα(CAAT/enhancer-binding proteinα；CAAT增強子結合蛋白α)及PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ；過氧化物酶體增殖物活化受體γ)之表現降低作用；由脂肪細胞肥大化所致的脂肪堆積增加之抑制作用；血管內皮創傷治癒作用；脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制作用。
進而，一般已知藉由增加脂聯素之產生而確認到下述作用：(1)不經由胰島素受體之糖攝取促進作用；(2)減少細胞內之脂肪酸而提高胰島素受體之感受性(敏感性)的作用；(3)藉由使肝臟之AMP(Adenosine 5’-monophosphate；單磷酸腺苷)激酶活 化所得的胰島素感受性之亢進作用；(4)脂肪酸之燃燒作用；(5)動脈硬化抑制作用；(6)抗發炎作用；(7)真皮中之玻尿酸合成促進作用。
因此，本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物具有脂聯素產生增加作用，故而可發揮血糖值抑制作用、抗糖尿病作用、脂肪減少作用、抗肥胖作用、痩身作用、抗高脂血症作用、抗發炎作用、美膚作用。
另外，本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物具有脂肪細胞分解酵素ATGL表現促進作用及脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制作用，故而可發揮脂肪分解促進作用、脂肪減少作用、抗肥胖作用(特別是體內脂肪之分解作用)。
本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物具有：向脂肪堆積少之脂肪細胞之分化誘導作用；轉錄因子C/EBPα及PPARγ之表現降低作用；由脂肪細胞肥大化所致的脂肪堆積增加之抑制作用，故而可發揮脂肪堆積減少作用、脂肪減少作用、抗肥胖作用(特別是體內脂肪堆積之抑制作用)。
另外，本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物具有血管內皮創傷治癒作用，故而可發揮抗動脈硬化作用。
另外，本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物具有作為抗氧化酵素之過氧化氫酶(Catalase)及作為抗氧化酵素之HO-1(Hemeoxygenase-1；血紅素加氧酶-1)之表現量減少抑制作用、以及與活性氧產生有關之酵素NOX4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4；菸醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4)與發炎因子TNFα(Tumor Necrosis Factor α；腫瘤壞死因 子α)之表現量抑制作用。這可於體內發揮不良氧化壓力之減輕作用。
如此，本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物具有上述般之各種作用(以下亦稱為「脂聯素產生增加作用等」或「麴發酵物之作用」)，故而可用於肥胖、糖尿病、動脈硬化症、高脂血症(脂質異常症)、高血壓之預防、改善或治療，另外，可用於以美膚為目的之膚質改善或維持之護膚、氧化壓力之改善或降低。進而，針對具有這些疾病或症狀之患者或其潛在患者，本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物有效。
另外，如後述實施例所示，本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物具有即便為口服攝取或口服投予等簡單的投予形態亦可獲得優異效果之優點。進而，本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物可適當選擇粉末狀或液體狀等狀態，故而對於飲品、食品、醫藥品、飼料等而言亦能以攝取用或口服投予用之形式簡便地使用，另外，亦容易將含有本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物的飲品、食品等製成液體、固體、片劑或果凍狀等而提供。本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物具有對成人或成年動物容易發揮作用之優點。
另外，本實施形態既可為治療目的使用，亦可為非治療目的使用。
所謂「非治療目的」，係不包括醫療行為(亦即藉由治療而進行的對人體之處置行為)的概念。例如可列舉健康增進、美容行為等。
所謂「改善」係指：疾病、症狀或狀態之好轉；疾病、症 狀或狀態之惡化的防止、延遲；疾病或症狀之進行的逆轉、防止或延遲。
所謂「預防」係指應用對象之疾病或症狀之發病的防止或延遲、或者應用對象之疾病或症狀之危險性的降低。
因此，本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物可用作脂聯素產生增加劑或脂聯素產生增加用組成物等以上述作用為使用目的之製劑或組成物(以下亦稱為「本實施形態之製劑或組成物」)，進而亦可用於製造該等製劑或組成物。
前述本實施形態之製劑或組成物係於使包括人之動物(例如寵物等)攝取該製劑或組成物本身，或對包括人之動物(例如寵物等)投予該製劑或組成物本身之情形時，發揮上述脂聯素產生增加作用等各種效果。另外，前述製劑或組成物亦可為以人或人以外之動物為目的之醫藥品用、準藥品用、飲品、食品用或飼料用，或者亦可為調配至該醫藥品、準藥品、飲品、食品或飼料中而使用之素材或製劑。
另外，該飲品、食品中包含以上述抗肥胖等為理念而視需要標示有該宗旨的飲品、食品、機能性食品、病患用食品、特定保健用食品。該等飲品、食品可藉由機能標示而與一般之飲品、食品相區隔。
進而，藉由將本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物調配至先前之飲品、食品中，亦可與先前飲品、食品相區隔，例如可列舉添加有本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物的茶系製品(例如茶葉、茶包、速溶茶、茶飲、加入有茶萃取物之製品(糕點、麵類等)等。
另外，含有本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物的上述醫藥品(亦包含準藥品)之劑型可為錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、靜脈內注射劑、肌肉注射劑、栓劑、吸入劑、皮下吸收劑、滴眼劑、滴鼻劑、濕敷劑、貼布劑、軟膏、乳液、乳霜、口腔用製劑(刷牙劑、液狀刷牙劑、漱口水、牙齦按摩霜、口腔用軟膏、漱口用錠劑、口含錠、潤喉糖等)等之任一種。投予形態亦可為口服投予(內用)、非口服投予(外用、注射)之任一種。
另外，於調製所述各種劑型之醫藥製劑時，可將本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物分別單獨調製，或適當組合其他藥學上可容許之賦形劑、結合劑、增量劑、崩解劑、界面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩衝劑、保存劑、矯味劑、香料、被膜劑、擔體、稀釋劑、本發明以外之藥效成分等而調製。另外，該等投予形態中，較佳形態為口服投予，口服用液體製劑可添加矯味劑、緩衝劑、穩定劑等而藉由慣用方法來調製。
關於口服投予用製劑中的本實施形態之源自綠茶萃取物之麴發酵物之含量，一般而言以固體含量濃度計，較佳為0.01質量%以上，更佳為0.1質量%以上，另外，較佳為20質量%以下，更佳為10質量%以下。另外，較佳為0.1質量%至10質量%，更佳為0.5質量%至5質量%。
作為含有本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物的上述食品之形態，除了清涼飲料水、茶系飲料、茶葉製品、速溶茶、 咖啡飲料、果汁飲料、汽水、果汁、果凍、威化餅、餅乾、麵包、麵、香腸等飲品、食品或營養食品等各種食品以外，進而可列舉與上述口服投予製劑相同之形態(錠劑、膠囊劑、糖漿等)之營養補給用組成物。
各種形態之食品可將上述植物或其萃取物單獨調製，或可適當組合其他食品材料或溶劑、軟化劑、油、乳化劑、防腐劑、香科、穩定劑、著色劑、抗氧化劑、保濕劑、增黏劑、本發明以外之有效成分等而調製。
關於該飲品、食品或飼料中的本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物之含量，一般而言以固體含量濃度計，較佳為0.01質量%以上，更佳為0.1質量%以上，另外，較佳為10質量%以下，更佳為5質量%以下。另外，較佳為0.01質量%至10質量%，更佳為0.5質量%至5質量%。
另外，作為飼料，可列舉：用於家兔、大鼠、小鼠等之小動物用飼料，用於狗、貓等之寵物食品等飼料等，可調製成與上述食品相同之形態。
本實施形態之源自綠茶萃取物之發酵物之攝取量可根據對象之種類、體重、性別、年齢、狀態或其他因素等而變動。投予之用量、路徑、間隔及攝取之量或間隔可由業者適當決定，針對成人，每1天以乾燥物換算計，一般而言較佳為1mg/60kg體重以上，更佳為2mg/60kg體重以上，另外，較佳為1000mg/60kg體重以下，更佳為500mg/60kg體重以下，進而較佳為 200mg/60kg體重以下。另外，較佳為1mg/60kg體重至2000mg/60kg體重，更佳為2mg/60kg體重至1000mg/60kg體重，進而較佳為2mg/60kg體重至5000mg/60kg體重。
本實施形態中，作為投予或攝取對象者，無論是病人或健康者，只要有需要或希望投予或攝取的人，則並無特別限定，例如較佳為運動不足者、擔心肥胖或糖尿病等之中老年人、重視膚質之男女老幼等。
另外，本實施形態不僅可適用於肥胖患者，而且可應用於容易發胖之體質者、或期望維持適當體重者等。
另外，本實施形態不僅可適用於糖尿病或胰島素抗性之患者，而且可適用於未罹患糖尿病或胰島素抵抗性之對象者，例如餐後高血糖高但空腹時血糖無異常之對象者、不降低空腹時血糖亦無妨但期望降低餐後高血糖之對象者等。
另外，本實施形態可適用於高血壓患者、或者期望預防高血壓或降低該發病之風險之對象者等。
進而，可適用於需要血管保護強化之對象者、或期望血管保護強化之對象者。
本實施形態亦可採用以下之態樣。
[1]一種源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法，係利用麴使綠茶萃取物發酵。
較佳為前述麴中包含屬於麹黴屬(Aspergillus)之微生物，進而較佳為米麴系麹菌及/或麥麴系麹菌。
較佳為前述綠茶萃取物於液體培養基中為1質量%至30質量%。進而較佳為於液體培養基中，綠茶兒茶素總量為0.1質量 %至5質量%及/或EGCG含量為0.05質量%至2.5質量%。
[2]一種源自綠茶萃取物之麴發酵物。較佳為該麴發酵物係藉由前述[1]記載的製造方法所得的源自綠茶萃取物之發酵物。該麴發酵物之對象者較佳為健壯者或健壯動物、成人或成年動物。
[3]一種含有前述[2]記載之麴發酵物作為有效成分的組成物或製劑。較佳為醫藥品組成物、飲品、食品組成物、飼料組成物或製劑。
[4]如前述[3]記載之組成物或製劑，其中前述組成物為下述組成物：脂聯素產生促進用組成物；或者肥胖之預防、改善或治療用組成物；或者美膚用組成物；或者動脈硬化之預防、改善或治療用之組成物；或者脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制作用組成物。
[5]如前述[4]記載之組成物或製劑，其中前述組成物為下述作用之組成物：脂聯素產生增加用；脂聯素表現促進用；脂肪細胞分解酵素ATGL表現促進用；向脂肪堆積少之脂肪細胞之分化誘導用；轉錄因子C/EBPα及PPARγ之表現降低用；由脂肪細胞肥大化所致的脂肪堆積增加之抑制用；血管內皮創傷治癒用；或脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制作用。
[6]一種源自綠茶萃取物之麴發酵物，係脂聯素產生促進用；肥胖之預防、改善或治療用；美膚用；或者動脈硬化之預防、改善或治療用；或者脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制作用。較佳為藉由前述[1]記載的製造方法所得的源自綠茶萃取物之麴發酵物。
[7]一種源自綠茶萃取物之麴發酵物，係脂聯素產生增加 用；脂聯素表現促進用；脂肪細胞分解酵素ATGL表現促進用；向脂肪堆積少之脂肪細胞之分化誘導用；轉錄因子C/EBPα及PPARγ之表現降低用；由脂肪細胞肥大化所致的脂肪堆積增加之抑制用；或血管內皮創傷治癒用；或者脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制作用。
[8]一種前述[2]記載之源自綠茶萃取物之麴發酵物的針對以下任一用途之醫療目的使用或非醫療目的使用。
脂聯素產生促進；肥胖之預防、改善或治療；美膚；或者動脈硬化之預防、改善或治療；脂聯素表現促進；脂肪細胞分解酵素ATGL表現促進；向脂肪堆積少之脂肪細胞的分化誘導；轉錄因子C/EBPα及PPARγ之表現降低；由脂肪細胞肥大化所致的脂肪堆積增加之抑制；血管內皮創傷治癒；或者脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制。
較佳為藉由前述[1]記載的製造方法所得的源自綠茶萃取物之麴發酵物。
[9]一種用於製造前述[3]或[4]之組成物或製劑的源自綠茶萃取物之麴發酵物之使用。
[實施例]
以下，基於實施例對本發明更詳細說明。再者，以下說明之實施例表示本發明之代表性實施例之一例，本發明不限定於以下之實施例。
<源自綠茶萃取物之麴發酵物的製造方法>
1.綠茶萃取物
作為綠茶萃取物，使用綠茶萃取物BL(商品名：股份有限公司Accessone)(綠茶多酚為46.5質量%，綠茶兒茶素總量為40.11質量%，EGCG含量為13.6質量%，綠茶咖啡因為5.2質量%)。
另外，綠茶萃取物BL之規格中，水分含量根據卡爾費歇爾法而成為5%以下。另外，茶多酚可利用酒石酸鐵比色定量法來測定，另外，綠茶兒茶素總量、EGCG含量及綠茶咖啡因可利用HPLC法來測定。
2.培養方法
將表1所示之培養基組成之液體培養基100mL分注至預先加上矽膠塞並經乾熱殺菌的500mL容量之坂口燒瓶中，按照慣用方法進行高壓釜滅菌。放置冷卻至室溫後，利用刮勺將1杯之各種種麴(表2，20mg至60mg)直接植菌。植菌後，於25℃藉由120振/分鐘(oscillation/min)之振盪來培養17天。
培養後，利用濾紙(Advantec No.2)藉由抽氣過濾將菌體去除，以培養上清液之形式用於後續之生理活性試驗之實驗。
3.HPLC分析條件
培養上清液係利用0.22μm之盤式過濾器進行過濾後，藉由逆相管柱層析之HPLC分析而供於成分分析。分析條件係如以下所述。
<分析條件>
管柱：逆相管柱：TSK gel ODS-80Ts(5μm.4.6×250mm)
移動相：(A)1.0%乙酸
(B)乙腈
梯度：A：B=90：10(0min)→20：80(45min)
流速：0.6ml/min
檢測：UV(Ultraviolet；紫外線)280nm
注入量：20μL
標準品1：兒茶素標準品混合物 表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)各0.025mg/mL
標準品2：小分子發酵多酚A 0.025mg/mL
無論使用何種種麴，於培養初期在培養基中可見之兒茶素類或其他綠茶成分均因培養而幾乎消失，僅檢測出於相對保持時間13分鐘至14分鐘可見波峰之化合物。關於該波峰，是存在單獨的化合物還是存在多種化合物係尚不明確，目前正在解析中。無論使用何種種麴，於麴發酵後之培養液中，兒茶素類及小分子發酵多酚之波峰均為0.01mg/mL以下而未檢測出，於將該13分鐘至14分鐘之波峰之高度設為1.00時，兒茶素類及小分子發酵多酚為0.005以下。
另外，關於未植菌培養基及培養後之各上清液之多酚量，使用沒食子酸(gallic acid)作為標準品，以由福林-西奥卡特(Folin-Ciocalteu)法所得之多酚量之形式進行測定。培養後之各上清液中，與HPLC分析之結果同樣地，經麴同化而多酚量明顯降低，於將未植菌培養基之多酚量設為100%時，至少成為13%以下。
再者，圖1中表示代表性之培養上清液的製造例3(白豆芽菜)(圖1D)及製造例5(長白菌)(圖1E)之分析結果(層析圖之縱軸為同一尺度)。
製造例3(白豆芽菜)及製造例5(長白菌)係用作米麴、麥麴系之種麴。
另外，圖1A中表示標準品1之兒茶素類之分析結果，圖1B中表示綠茶萃取物(發酵前)之分析結果，圖1C中表示標準品2之小分子發酵多酚A之分析結果。
<生理活性之實驗方法>
1.創傷治癒實驗
將源自於豬之血管內皮細胞以3×105細胞/皿(cells/dish) 接種於3.5cm皿，附著7小時。於包含1%FBS(Fetal Bovine Serum；胎牛血清)之培養基中同步培養17小時後，添加最終濃度為50μM之羥基酪醇(Hydroxytyrosol)及最終濃度為1/1000稀釋之發酵產物。添加化合物後，使用200μL晶片之前端於皿之底部製造出模擬性損傷，於顯微鏡下觀察、拍攝。24小時後再次拍攝，對存在於最初製作之損傷之範圍內的細胞數進行計數，由此評價損傷之修復程度。拍攝係對每一個皿進行3視野拍攝。
2.3T3-L1細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)之培養及化合物之添加
於3T3-L1細胞之培養中使用高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium；Dulbecco改良的Eagle培養基)，於37℃、5%CO2環境下培養。利用包含10%胎牛血清之DMEM進行培養直至達到融合(confluent)，2天後更換為分化誘導培養基(包含胰島素(Insulin)、DEX(dextran；葡聚糖)、IBMX(3-Isobutyl-1-Methylxanthine；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、10%FBS之DMEM)培養2天。然後，於胰島素及10%FBS存在下，一邊每2天反覆更換培養基一邊培養。將從分化誘導開始起算第12天左右之細胞作為成熟脂肪細胞之模型，將第18天左右之細胞作為肥大化脂肪細胞之模型。於評價化合物對於從3T3-L1細胞朝向成熟脂肪細胞之分化的效果之實驗中，化合物係從更換為分化誘導培養基之2天後來與胰島素一併添加。於觀察化合物對於成熟脂肪細胞的效果之實驗中，於12天後之成熟脂肪細胞中添加化合物並培養24小時。進而，於檢討對變化為肥大化脂肪細胞之效果之實驗中，於12天後之細胞中添加化 合物，於化合物存在下一邊反覆更換培養基一邊培養6天。以上之處理後，進行油紅O染色及西方墨點解析。
3.油紅O染色
油紅O係以1g/200mL(99%異丙醇)之濃度溶解而製成保存液，並於使用時以水稀釋至60%。利用PBS(Phosphate Buffered Saline；磷酸鹽緩衝液)(-)將各刺激後之細胞清洗3次，添加10%福馬林液並固定30分鐘。以水清洗3次後添加60%異丙醇並靜置5分鐘後，添加油紅O溶液將脂質染色。20分鐘後再次以水清洗3次，添加DMSO(Dimethyl sulfoxide；二甲基亞碸)萃取油紅O色素，回收至1.5mL管中。以10,000rpm離心分離10分鐘後採集上清液，測定540nm之吸光度而定量化。
4.總溶解產物(total lysate)之調製
於各細胞培養後，利用PBS(-)清洗2次，立即於-80℃保存。然後將細胞於冰上溶解，添加Lysis緩衝液(50mM之HEPES(hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid；羥乙基哌嗪乙磺酸)pH7.5、50mM之NaCl、1mM之EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid；乙二胺四乙酸)、50%之甘油(Glycerol)、100mM之NaF、10mM之焦磷酸鈉(Sodium pyrophosphate)、1%之Triton(曲拉通)X-100、1mM之NaVO4、1mM之PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride；苯甲基磺醯氟)、10μg/mL之抗痛素(Antipain)、10μg/mL之亮肽素(Leupeptin)、10μg/mL之抑肽酶(Aprotinin))150μL並靜置5分鐘，利用刮刀剝取細胞並回收至1.5mL管中。將該等細胞於冰上靜置15分鐘，以14,000rpm離心15分鐘後，回收上清液。
5.電泳及抗原抗體反應
使用BCA(Bicinchoninic Acid；二辛可寧酸)Protein assay kit(蛋白分析套組)(Pierce)測定所回收之樣本之蛋白質濃度，將相當於20μg之蛋白質供於7.5%、10%、12.5%、15%丙烯醯胺凝膠SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis；十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)。電泳後，轉印至PVDF(Polyvinylidene fluoride；聚偏二氟乙烯)薄膜(Millipore)，以5%BSA(Bovine Serum Albumin；牛血清白蛋白)/TBS(Tris-buffered saline；Tris緩衝鹽液)-T(10mM之Tris-HCl、150mM之NaCl、0.1%之Tween20)進行阻斷，使各種一級抗體反應。利用TBS-T將薄膜清洗15分鐘後，使用識別各一級抗體之二級抗體進行抗原抗體反應。再次利用TBS-T將薄膜清洗15分鐘，於譜帶之檢測中使用Chemi-lumi one(Nacalai Tesque)或Clarity Max Western ECL Substrate(BIO-RAD)，藉由C-DiGit Blot Scanner(LI-COR公司)而檢測HRP(Horse radish peroxidase；辣根過氧化物酶)所引起之化學發光。抗體之稀釋中使用5%BSA/TBS-T。稀釋倍率及反應溫度、時間係依據各抗體之附屬使用說明書(protocol)。
<生理活性試驗之結果>
<脂聯素表現量增加確認試驗>
使用如上述般利用表2所示之各種麴進行麴發酵的源自綠茶萃取物之各麴發酵物所得的結果顯示如下。
於成熟脂肪細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加製造例1至製造例6之麴發酵產物，培養24小時後，調製 細胞溶解產物，藉由西方墨點法對脂聯素之蛋白表現量進行定量。Cont表示未添加化合物之對照組。作為西方墨點解析之內部標準，使用α-微管蛋白(α-Tubulin)。
利用麴種使綠茶萃取物進行麴發酵而成的源自綠茶萃取物之麴發酵物(製造例1至製造例6)係全部使成熟脂肪細胞中之脂聯素之表現量增加。
<血管內皮細胞之創傷治癒促進效果確認試驗>
於源自於豬之血管內皮細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加製造例5：長白菌(米麴、麥麴系)之麴發酵產物，於24小時後評價創傷治癒效果。Cont表示未添加化合物之對照組。
麴發酵產物(製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))顯示血管內皮細胞之創傷治癒促進效果。
<脂聯素表現量增加確認試驗：發酵前後>
於成熟脂肪細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式 添加發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系))及其發酵前之物，培養24小時後，調製細胞溶解產物，藉由西方墨點法對脂聯素之蛋白表現量進行定量。Cont表示未添加化合物之對照組。作為西方墨點解析之內部標準，使用α-微管蛋白。將分析結果示於圖2。
麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系))使脂聯素之表現量增加，相對於此，發酵前之茶葉萃取物於相同條件下(1/1000稀釋)未顯示脂聯素之表現量之增加效果。這意味著藉由微生物控制發酵而由兒茶素類新生成之化合物具有較兒茶素類更強之脂聯素產生作用。
<酵素ATGL表現量增加確認試驗>
於成熟脂肪細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))，培養24小時後，調製細胞溶解產物，藉由西方墨點法對與脂肪分解有關之酵素ATGL之蛋白表現量進行定量。Cont表示未添加化合物之對照組。作為西方墨點解析之內部標準，使用α-微管蛋白。
麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))顯示使脂肪細胞之與脂肪分解有關之酵 素ATGL之表現增加的傾向，相對於此，小分子發酵多酚A(0.3μM)未顯示該作用。
<向脂肪堆積少之脂肪細胞之分化誘導作用確認試驗>
於脂肪前驅細胞中，自分化誘導初期開始8天內以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))，以最終濃度為0.3μM而添加小分子發酵多酚A，使用油紅O將細胞內堆積之脂肪染色並定量化。Cont表示未添加化合物之對照組。
麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))抑制由3T3-L1細胞朝成熟脂肪細胞分化時之脂肪堆積。該結果意味著脂肪前驅細胞於體內分化成脂肪細胞時，該發酵產物產出脂肪堆積少之脂肪細胞的可能性。
<轉錄因子C/EBPα與PPARγ之表現增加確認試驗>
於脂肪前驅細胞中，於分化誘導開始2天後，以最終濃度 稀釋成為1/1000的方式添加麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))，培養8天後，調製細胞溶解產物，藉由西方墨點法對與脂肪分化有關之轉錄因子C/EBPα與PPARγ之蛋白表現量進行定量。Cont表示未添加化合物之對照組。作為西方墨點解析之內部標準，使用α-微管蛋白。
麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))係使與由3T3-L1細胞朝成熟脂肪細胞之分化有關的轉錄因子C/EBPα與PPARγ之表現降低。該結果係證實發酵產物局部地抑制由3T3-L1細胞朝成熟脂肪細胞之分化過程中的脂肪堆積的結果。
<由脂肪細胞肥大化所致的脂肪堆積增加之抑制確認試驗>
於分化開始12天後之成熟脂肪細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))，培養6天後，使 用油紅O將細胞內堆積之脂肪染色並定量化。12天及18天之各Cont表示未添加化合物之對照組。
細胞內之脂肪量因持續培養成熟脂肪細胞而大幅增加。該增加係由麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))局部地抑制。該結果顯示發酵產物於體內抑制脂肪細胞肥大化所致的脂肪堆積之進一步增加的可能性。
<脂聯素與脂肪分解酵素ATGL之表現量確認試驗>
於分化開始12天後之成熟脂肪細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))，培養6天後，使用油紅O將細胞內堆積之脂肪染色並定量化。12天與18天之各Cont表示未添加化合物之對照組。
細胞內之脂聯素與脂肪分解酵素ATGL之表現量因持續培養成熟脂肪細胞而大幅降低。該降低係由麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))局部地抑制。該結果顯示：麴發酵產物可改善與肥胖聯動之脂肪細胞肥大化所致的超優激素即脂聯素之產生減少、以及ATGL產生減少所致的脂肪分解能力之降低。
<抗氧化酵素過氧化氫酶與血紅素加氧酶-1(HO-1)之表現量減少抑制確認試驗>
於分化開始12天後之成熟脂肪細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))，培養6天後，調製細胞溶解產物，藉由西方墨點法對抗氧化酵素過氧化氫酶與血紅素加氧酶-1(HO-1)之蛋白表現量進行定量。12天與18天之各Cont表示未添加化合物之對照組。作為西方墨點解析之內部標準，使用α-微管蛋白。
細胞內之抗氧化酵素過氧化氫酶與血紅素加氧酶-1(HO-1)之表現量因持續培養成熟脂肪細胞而大幅降低。該降低係由麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))顯著改善。脂肪細胞之肥大化為發炎反應而產生活性氧種。肥大化所致的抗氧化酵素之表現降低意味著產 生之活性氧種之進一步增加。麴發酵產物可改善抗氧化酵素之表現降低係與於體內可減輕該不良氧化壓力循環有關。
<與活性氧產生有關之酵素NOX4與發炎因子TNFα之表現量增加抑制確認試驗>
於分化開始12天後之成熟脂肪細胞中，以最終濃度稀釋成為1/1000的方式添加麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))，培養6天後，調製細胞溶解產物，藉由西方墨點法對活性氧產生酵素NOX4與發炎因子TNFα之蛋白表現量進行定量。12天與18天之各Cont表示未添加化合物之對照組。作為西方墨點解析之內部標準，使用α-微管蛋白。
與細胞內之活性氧產生有關之酵素NOX4與發炎因子TNFα之表現量因持續培養成熟脂肪細胞而大幅增加。TNFα之增加係由麴發酵產物(製造例3：白豆芽菜(米麴、麥麴系)、製 造例5：長白菌(米麴、麥麴系))抑制。另外，NOX4之增加係由製造例2：白豆芽菜(米麴系)之發酵產物抑制，但製造例5：長白菌(米麴、麥麴系))之麴發酵物未見該效果。由肥大化所致的TNFα與NOX4之表現增加直接導致活性氧種增加，抑制該活性氧種之表現意味著減輕因與肥胖聯動之脂肪細胞之肥大化而產生的體內之氧化壓力。
<發酵產物之小鼠投予：脂肪組織之脂聯素表現促進作用及脂肪酸合成酵素(FAS)表現抑制作用>
動物實驗：
將成熟雌ICR(Institute of Cancer Research；美國癌症研究所)小鼠(日本SLG股份有限公司)分為發酵產物投予群(6隻)與非投予群(6隻)。對投予群以10mg/kg體重/天以10天投予使用長白菌(菱六)所調製之發酵培養上清液之冷凍乾燥品(製造例5)。投予係於通常食用之粉末飼料MF粉末(日本SLG股份有限 公司)中混合上述乾燥品之粉末並藉由自由攝取而進行。10天後摘出脂肪組織，於-80℃保存。
．由組織調製蛋白質：
將於-80℃保存之脂肪組織於冰上溶解後，將一部分切出，於組織用Lysis緩衝液(50mM之HEPES pH7.5、50mM之NaCl、1mM之EDTA、50mM之NaF、1mM之NaVO4、25mM之β-甘油磷酸酯(β-glycerophosphate)、200μM之二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、0.02%之Triton X-100)中均質化，以14,000rpm離心分離30分鐘並回收上清液。進而，以14,000rpm離心分離15分鐘，將所回收之上清液作為最終之樣本。
．電泳及抗原抗體反應：
使用BCA Protein assay kit(Pierce)來測定所回收之樣本之蛋白質濃度，將相當於20μg之蛋白質供於10%丙烯醯胺凝膠SDS-PAGE。電泳後，轉印至PVDF薄膜(Millipore)，利用5%BSA/TBS-T(10mM之Tris-HCl、150mM之NaCl、0.1%之Tween20)進行阻斷，使各種一級抗體反應。利用TBS-T將薄膜清洗15分鐘後，使用識別各一級抗體之二級抗體進行抗原抗體反應。再次利用TBS-T將薄膜清洗15分鐘，於譜帶之檢測中使用Chemi-lumi one(Nacalai Tesque)或Clarity Max Western ECL Substrate(BIO-RAD)，藉由C-DiGit Blot Scanner(LI-COR公司)來檢測辣根過氧化物酶(HRP)所引起之化學發光。抗體之稀釋中使用5%BSA/TBS-T。稀釋倍率及反應溫度、時間係依據各抗體之附屬使用說明書。
．結果：
將西方墨點之脂聯素與脂肪酸合成酵素(FAS)之譜帶、以及將該等定量化者示於圖3。定量化中，使用β-肌動蛋白作為內部標準。如譜帶之強度所表明，發酵產物投予群之脂聯素之表現與非投予群相比，顯示明顯之高值。相對於此，FAS之表現係發酵產物投予群顯示低值。由該結果表示，發酵產物不僅於培養脂肪細胞中具有使脂聯素之表現增加的效果，而且亦以個體水平具有該效果。進而可認為，發酵產物具有藉由使FAS之表現降低而抑制脂質合成之能力。
此為源自綠茶萃取物之麴發酵物具有促進小鼠脂肪組織之脂聯素之表現的作用、及抑制脂肪酸合成酵素(FAS)之表現的作用。而且，源自綠茶萃取物之麴發酵物係藉由口服投予而獲得脂聯素表現促進作用及脂肪酸合成酵素之表現抑制作用，於飲料或飲品、食品等之攝取中或醫藥品等之口服投予中，亦可預防、改善或治療肥胖、糖尿病、高脂血症、高血壓等各種症狀、疾病或狀態。另外，源自綠茶萃取物之麴發酵物對於所謂老年病或其潛在患者多之成人非常有效。

Claims (4)

  1. 一種源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法，係利用麴使綠茶萃取物發酵。
  2. 一種源自綠茶萃取物之麴發酵物。
  3. 一種包含源自綠茶萃取物之麴發酵物作為有效成分的組成物。
  4. 如請求項3所記載之組成物，其中前述組成物為脂聯素產生促進用組成物，或者肥胖之預防、改善或治療用組成物，或者美膚用組成物，或者動脈硬化之預防、改善或治療用之組成物。
TW107146797A 2017-12-26 2018-12-24 源自綠茶萃取物之發酵物的製造方法以及源自綠茶萃取物之麴發酵物、以及含有源自綠茶萃取物之麴發酵物的組成物 TW201927326A (zh)

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