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TW201917134A - 新穎的醯基化胰島素類似物及其用途 - Google Patents

新穎的醯基化胰島素類似物及其用途 Download PDF

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TW201917134A TW107128618A TW107128618A TW201917134A TW 201917134 A TW201917134 A TW 201917134A TW 107128618 A TW107128618 A TW 107128618A TW 107128618 A TW107128618 A TW 107128618A TW 201917134 A TW201917134 A TW 201917134A
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格瑞斯 史凱特 歐爾森
博 佛克 漢森
洛傑 史崔佛
英格爾德 佩特爾森
瑞塔 史拉比
賈克伯 布蘭德特
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丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司
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Abstract

本發明係關於新穎的胰島素類似物及其等之衍生物，諸如醯基化胰島素類似物、及其等之醫藥用途，特別係於與糖尿病、肥胖及心血管疾病有關的醫學病況之治療或預防中者。

Description

新穎的醯基化胰島素類似物及其用途
本發明係關於新穎的胰島素類似物及其等之衍生物，諸如醯基化胰島素類似物、及其等之醫藥用途，特別係於與糖尿病、肥胖及心血管疾病有關的醫學病況之治療或預防中者。
序列表之以引用方式併入
序列表(標題為「序列表」)係8,00KB，係於2018年7月13日創造且係以引用方式併入本文中。
糖尿病係一種代謝性病症，其中利用葡萄糖的能力係部分或完全喪失。全球超過5%的人口患有糖尿病，且另外數百萬人有發展出此疾病的風險。
目前雖有療法，但仍有約50%患有糖尿病的人由於心血管疾病而死亡，且因為患有糖尿病的人亦有發展出微細血管併發症(例如腎病變、視網膜病變及神經病變)的風險，存在有對於開發用於改善治療的新藥物的持續需求。特別是於第2型糖尿病的例子中，因為此等患者除了高血糖症外往往患有種種對其等而言目前的胰島素療法僅有有限的有益功效的代謝性官能不良(諸如例如異常血脂症、肥胖及心血管併發症)。
於肝臟中，胰島素抑制葡萄糖新生及肝醣分解並增加肝醣合 成，導致葡萄糖自肝臟的輸出量減低。此等過程被肝細胞胰島素抗性明顯地削弱，且此係於代謝症候群中的空腹高血糖症之主要原因。除了對葡萄糖代謝的功效之外，胰島素亦於肝臟中透過轉錄因子SREBP-1c之活化(其隨即增加包括乙醯基-輔酶A羧酶及脂肪酸合酶(FAS)的脂肪生成酵素之基因之轉錄)來增加脂肪酸及三酸甘油酯之合成。然而，於第II型糖尿病之胰島素抗性齧齒動物模型中以及於患有由脂質失養症或影響細胞內胰島素傳訊途徑中的特殊節點的突變引起的糖尿病的人類中，與對肝醣合成及葡萄糖製造的功效相反，脂質合成之胰島素誘發性增加完全不被影響，或至少較不被損害。因此，與代謝症候群相關連的高胰島素血症可直接造成肝臟脂質合成之增加且藉此加劇三酸甘油酯之循環水平之增加。此很可能係數個研究指出以下者的原因：肝臟胰島素抗性導致於患有第2型糖尿病的人中觀察到的人類異常血脂症、肝臟脂肪變性、心血管血管官能不良、及甚至是腎臟功能減低。與此相似，以高濃度的胰島素治療胰島素抗性對象以降低血液葡萄糖水平可能導致涉及例如從頭脂質生成的非抗性途徑之過度刺激。為了降低血液葡萄糖水平而不過度刺激非抗性途徑(例如脂肪生成途徑)，得到選擇性地活化葡萄糖降低性途徑的胰島素類似物會係所欲的。除了降低血液葡萄糖水平外，如此功能上選擇性的胰島素類似物會展現改善的對異常血脂症、肝臟脂肪變性、動脈粥樣硬化及心血管疾病(CVD)的功效。
WO 2005 054291宣稱性地描述具有B28K醯基化的單鏈胰島素。WO 2009 112583宣稱性地描述包含B28K的蛋白酶穩定化胰島素類似物。WO90/07511、WO96/15804、WO200043034、US2012241356、WO2012015692及WO9731022宣稱性地揭露包含B28K的胰島素類似物，其中之一些亦宣稱性地揭露於相同位置的醯基化。
各種各樣的胰島素類似物及衍生物已被報導。然而，其等皆以 頗相同的方式活化胰島素受體，即胰島素受體活化之下游功效相當類似，無論活化是否導因於結合高親和力類似物或低親和力類似物-僅僅效力有差別。
因此，對於對抗性及非抗性途徑(例如葡萄糖新生及脂質代謝途徑)具有功能上選擇性的特性的胰島素類似物及衍生物仍有需求。
於第一個方面，本發明係關於胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物包含B5Y及包含醯基的取代基。
於第二個方面，本發明係關於胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物包含B5F及包含醯基的取代基。
於另一個方面，本發明係關於胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物包含B5Y及B26G或B26A及包含接附至B28K、B26K或B29K的醯基的取代基。
於另一個方面，本發明係關於胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物包含B5F及B26G或B26A及包含接附至B28K、B26K或B29K的醯基的取代基。
於另一方面，本發明提供包含本發明之胰島素衍生物及一或多種醫藥上可接受的載體或稀釋劑的醫藥組成物。
於其他方面，本發明係關於根據本發明的胰島素衍生物之用途，其係用於製造用於以下者之治療或預防的醫藥品：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性不良、高血糖症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管病症、冠心病、中風、發炎性腸道症候群、消化不良、低血壓或胃潰瘍。
此外，或供選擇地，於第二個方面，本發明提供對與肥胖、異常血脂症或心血管併發症有關的程序具有諸如以下者的改善的功效的胰島素衍生物：較低的增重、較低的體脂肪質量之增加、較低的肝臟三酸甘油酯之增加或改善的內皮功能。
於一個方面，本發明之胰島素衍生物能夠降低血液葡萄糖而不負面地影響脂質代謝。
於另一個方面，當與人類胰島素比較時，本發明之胰島素衍生物誘發次最大胰島素受體磷酸化，及誘發選擇性傳訊，且因此誘發選擇性細胞反應，即相較於對葡萄糖降低性途徑對脂質代謝途徑給出較低的最大反應。
於又另一個方面，除了降低葡萄糖外，本發明之胰島素衍生物亦降低增重，特別是藉由降低脂肪質量之增加。
於一個方面，本發明提供對與以下者相關的程序具有改善的功效的胰島素衍生物：肝臟異常血脂症、肝臟脂肪變性或非酒精性脂肪肝(NAFLD)，特別是藉由相較於人類胰島素增加肝臟三酸甘油酯之降低。
於另一個方面，本發明提供對與心血管病症相關的程序具有改善的功效(諸如相較於人類胰島素改善的內皮功能)的胰島素衍生物。
於又另一個方面，本發明之胰島素衍生物於患有糖尿病的患者中提供較低的有害心血管事件之發生率。
於一個方面，本發明提供於調配物中具有改善的穩定性的胰島素衍生物。
本發明亦可解決基於例示性實施方式之揭露內容會係明顯的其他問題。
圖1顯示來自使用經溶解IR-A的競爭結合分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性受體結合曲線(CPM=每分鐘計數)；圖2顯示來自於過度表現IR-A的CHO-hIR細胞中的IRpY1158磷酸化分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量-反應曲線；圖3顯示來自於過度表現IR-A的CHO-hIR細胞中的AKT磷酸化分析(編號473的絲胺酸殘基之磷酸化)的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量-反應曲線；圖4顯示來自於過度表現IR-A的CHO-hIR細胞中的ERK磷酸化分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量-反應曲線；圖5顯示來自於大鼠初脂肪細胞中的脂質生成分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量-反應曲線(DPM=每分鐘分解)；圖6顯示來自於大鼠初肝細胞中的肝醣合成分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量-反應曲線；圖7顯示來自在從大鼠初肝細胞分離的cDNA上執行的針對fasn的定量性即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量-反應曲線；圖8顯示來自在從大鼠初肝細胞分離的cDNA上執行的針對g6pc的定量性即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量-反應曲線；圖9顯示來自於大鼠初肝細胞中的從頭脂質生成(de novo lipogenesis)分析的人類胰島素(●)及實施例15之化合物(▲)之代表性劑量 -反應曲線(CPM=每分鐘計數)；圖10顯示來自於以載體、PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物每日兩次皮下給藥六週的糖尿病STZ-DIO小鼠中的亞慢性活體內研究的HbA1c水平之代表性曲線。
圖11顯示來自於以載體、PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物每日兩次皮下給藥六週的糖尿病STZ-DIO小鼠中的亞慢性活體內研究的體重之代表性曲線。
圖12顯示來自於以載體、PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物每日兩次皮下給藥六週的糖尿病STZ-DIO小鼠中的亞慢性活體內研究的體脂肪質量之代表性曲線。
圖13顯示來自於以載體、PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物每日兩次皮下給藥六週的糖尿病STZ-DIO小鼠中的亞慢性活體內研究的肝臟TG之代表性曲線。
圖14顯示來自於以載體、PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物每日兩次皮下給藥六週的糖尿病STZ-DIO小鼠中的亞慢性活體內研究的腸繫膜動脈之ACh刺激性血管舒張之代表性曲線。
圖15顯示包括3 Zn/6ins、30mM酚、1.6%甘油及7mM三(羥基甲基)胺基甲烷的pH 7.6的0.6mM的比較化合物(即比較物9)之調配物之代表性SEC數據(黑線)。包括人類白蛋白、Co(III)胰島素六聚體及單體胰島素類似物(B9Asp,B27Glu)之SEC參考混合物(灰線)。
圖16顯示實施例3之化合物之類似調配物之代表性SEC數據(黑線)。
圖17顯示實施例11之化合物之類似調配物之代表性SEC數據(黑線)。
圖18顯示實施例12之化合物之類似調配物之代表性SEC數據(黑線)
圖19顯示實施例15之化合物之類似調配物之代表性SEC數據(黑線)。
本發明提供新穎的人類胰島素之類似物，其等經醯基化且對涉及葡萄糖新生及脂質代謝的途徑顯示功能上選擇性的特性。
本發明大體上係關於包含B5Y或B5F及包含醯基的取代基的胰島素衍生物。
於一個實施方式中，當相較於人類胰島素時，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於65%的胰島素受體之次最大磷酸化。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含包含醯基的取代基。
於一個實施方式中，該取代基係接附至B28K、B26K或B29K。
於一個實施方式中，該取代基係接附至B28K。
於一個實施方式中，該取代基係接附至B26K。
於一個實施方式中，該取代基係接附至B29K。
於另一個實施方式中，該胰島素衍生物包含B26G或B26A。
於另一個實施方式中，該胰島素衍生物包含A14E。
於另一個實施方式中，該胰島素衍生物包含desB30、desB29-30或desB27-30。
於另一個實施方式中，該胰島素衍生物包含desB30。
於另一個實施方式中，該胰島素衍生物包含desB29-30。
於另一個實施方式中，該胰島素衍生物包含desB27-30。
於另一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例1-46之化合物所組成的群組： Ex：實施例編號。
本發明係關於根據本發明的胰島素衍生物之用途，其係用於製 造用於糖尿病之治療或預防的醫藥品。
於動物模型中，已令人意外地發現本發明之胰島素衍生物能夠降低血液葡萄糖而對脂質代謝或內皮官能不良的負面影響較小。咸相信此導致較低的有害心血管事件之發生率，且此等動物實驗亦顯示葡萄糖降低係伴隨著較低的增重，且特別是藉由較低的脂肪質量之增加(當相較於習用的胰島素治療時)。
此可能會導致對肝臟疾病發展或進展的有益功效，因為動物實驗亦顯示葡萄糖降低伴隨著增加的肝臟三酸甘油酯之降低(當相較於習用的胰島素治療時)。
此外，當試管內檢視下游傳訊時，本發明之胰島素衍生物已顯示會誘發次最大胰島素受體磷酸化，且會誘發選擇性傳訊，且因此誘發選擇性細胞反應，即相較於對葡萄糖降低途徑對脂質代謝途徑給出較低的最大反應(當相較於人類胰島素時)。
最後，本發明之胰島素衍生物亦具有所欲的選擇性傳訊及改善的於調配物中的穩定性。
胰島素
術語「人類胰島素」用於本文中係意謂人類胰島素激素，其之結構及特性係廣為人知的。人類胰島素具有二個多肽鏈，即A-鏈及B-鏈。A-鏈係21個胺基酸的胜肽且B-鏈係30個胺基酸的胜肽，此二個鏈係藉由雙硫鍵連接：位於A-鏈之位置7的半胱胺酸及位於B-鏈之位置7的半胱胺酸之間的第一個雙硫鍵、及位於A-鏈之位置20的半胱胺酸及位於B-鏈之位置19的半胱胺酸之間的第二個雙硫鍵。第三個雙硫鍵存在於位於A-鏈之位置6及11的半胱胺酸之間。
人類胰島素A-鏈具有以下序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO：1)，而B-鏈具有以下序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：2)。
於人體內，此激素係以單鏈前驅物胰島素原(前胰島素原)的形式合成，該單鏈前驅物胰島素原係由24個胺基酸的前肽之後接著含有86個胺基酸的胰島素原所組成，呈以下構型：前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C係31個胺基酸的連接胜肽。Arg-Arg及Lys-Arg係供自A及B鏈的剪切連接胜肽的剪切位置。
於本文中根據本發明的「胰島素」應被理解成人類胰島素或來自另一物種的胰島素，諸如豬或牛胰島素。
術語「胰島素胜肽」用於本文中係意謂為人類胰島素或具有胰島素活性的其類似物或衍生物的胜肽。
胰島素類似物
術語「胰島素類似物」用於本文中係意謂單一經修飾人類胰島素分子，其中該胰島素之一或多個胺基酸殘基已被其他胺基酸殘基取代及/或其中一或多個胺基酸殘基已自該胰島素缺失及/或其中一或多個胺基酸殘基已被添加及/或插入至該胰島素。
於一個實施方式中，胰島素類似物相較於人類胰島素包含少於10個胺基酸修飾(取代、缺失、添加(包括插入)及其等之任何組合)，供選擇地相較於人類胰島素包含少於9、8、7、6、5、4、3、2或1個修飾。
於胰島素分子中的修飾係藉由說明取代天然胺基酸殘基的胺基酸殘基之鏈(A或B)、位置、及單字母或三字母碼來表示。
使用「連接胜肽」或「C-胜肽」意謂單鏈胰島素原-分子之B-C-A多肽序列之連接部分「C」。於人類胰島素鏈中，C-胜肽連接B鏈之位置30及A鏈之位置1且係35個胺基酸殘基長。此連接胜肽包括二個末端雙鹼性胺基酸序 列，例如Arg-Arg及Lys-Arg，其等作為將此連接胜肽從A及B鏈剪切掉以形成二-鏈胰島素分子的剪切位置。
使用「desB30」或「B(1-29)」意謂缺少B30胺基酸的天然胰島素B鏈或其類似物且及「A(1-21)」意謂天然胰島素A鏈。因此，例如，B5Y、B28K、desB29-desB30人類胰島素係人類胰島素之類似物，其中位於B鏈之位置5的胺基酸係以酪胺酸(Tyr或Y)取代，位於B鏈之位置28的胺基酸係以離胺酸(Lys或K)取代，且位於B鏈之位置29及30的胺基酸係缺失。
於本文中，類似「A1」、「A2」及「A3」等等的術語指出分別位於胰島素之A鏈之位置1、2及3等等的胺基酸(從N端算起)。類似地，類似B1、B2及B3等等的術語指出分別位於胰島素之B鏈之位置1、2及3等等的胺基酸(從N端算起)。
於本文中，術語「胺基酸殘基」係自其(形式上地)一羥基已自一羧基移除及/或自其(形式上地)一氫原子已經自一胺基移除的胺基酸。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含2-10個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含2-6個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含2-3個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含二個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含三個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含四個突變的 人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含五個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含六個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含七個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含八個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含九個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含10個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含少於10個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含少於7個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含少於5個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含少於4個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，本發明之胰島素類似物係包含少於3個突變的人類胰島素之類似物。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B5Y。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B5F。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B26A或B26G。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B26A。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B26G。
於另一個實施方式中，該胰島素類似物包含A14E。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B5Y及B26A。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B5Y及B26G。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B5F及B26A。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B5F及B26G。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B28K、B26K或B29K。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B28K。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B26K。
於一個實施方式中，該胰島素類似物包含B29K。
於另一個實施方式中，該胰島素類似物包含B26G或B26A。
於另一個實施方式中，該胰島素類似物包含desB30、desB29-30或desB27-30。
於另一個實施方式中，該胰島素類似物包含desB30。
於另一個實施方式中，該胰島素類似物包含desB29-30。
於另一個實施方式中，該胰島素類似物包含desB27-30。
於一個實施方式中，該胰島素類似物可除了B5Y之外進一步包含至多10個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含至多5個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含二個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含三個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含四個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含五個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含六個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含七個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含八個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5Y之外進一步包含九個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外可進一步包含至多10個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含至多5個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含二個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含三個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含四個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含五個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含六個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含七個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含八個取代。
於一個實施方式中，該胰島素類似物除了B5F之外進一步包含九個取代。
本發明之胰島素類似物之非限制性實例包括：A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及4)A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及5)B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及7)B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及8)B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及9)A14E、B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及10)B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及11)B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 1及12)B5Y、desB30(SEQ ID 1及13)B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 1及14)B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 1及15)
於一個實施方式中，該本發明之胰島素類似物包含：A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及4)A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及5)B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及7)B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及8)B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及9)A14E、B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及10)B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及11)B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 1及12)B5Y、desB30(SEQ ID 1及13)B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 1及14)B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 1及15)B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 1及6)B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及4)B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及5)B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及10)A14E、B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 3及6)A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及7)A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及8)A14E、B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及9)A14E、B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及11)A14E、B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 3及12)A14E、B5Y、desB30(SEQ ID 3及13)A14E、B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 3及14)及 A14E、B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 3及15)。
胰島素衍生物
術語「胰島素衍生物」用於本文中係意謂經化學修飾的親本胰島素或其類似物，其中一或多個側鏈已共價接附至該胜肽。術語「側鏈」用於本文中亦可以「取代基」或「白蛋白結合部分」稱之。側鏈之非限制性實例係醯胺、碳水化合物、烷基、醯基、酯、PEG化、及類似者，其等可進一步包含連接子。
術語「白蛋白結合部分」用於本文中係論及能夠非共價結合至白蛋白(即具有白蛋白結合親和力)的任何化學基團。於一些實施方式中，該白蛋白結合部分包含醯基。
於另一個特殊的實施方式中，該側鏈包含與白蛋白結合並藉此延長特別相關的部分，該部分可因此以「延長部分」或「延長子」或「醯基」稱之。該延長部分可靠近，且較佳係位於相對於該白蛋白結合部分至該胜肽的接附點的其末端(或遠端、或自由端)。
根據本發明的「取代基」、「側鏈」或「白蛋白結合部分」具有以下式(I)：Acy-L1-L2-L3
其中：
●Acy係醯基且係由石膽酸代表、由以下式的官能基代表：Chem.1：-CO-(CH2)x-COOH；或Chem.2：-CO-(CH2)x-四唑基；其中x代表範圍在12至20的整數；且該四唑基係1H-四唑-5-基或由以下式的脂肪酸代表：Chem.3：-CO-(CH2)x-CH3
其中x代表範圍在8至16的整數
●L1係不存在或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
●L2係不存在或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
●L3係不存在或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
其中：
●OEG代表[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醯基或胺基酸殘基8-胺基-3,6-二氧雜辛酸-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-且係由以下結構代表：
●gGlu代表由以下結構代表的γ麩胺酸殘基：
其中在該結構圖之右邊的羧基係γ-羧基，其與相鄰的胺基形成鍵
●DgGlu代表由以下結構代表的γ麩胺酸殘基：
其中在該結構圖之右邊的羧基係γ-羧基，其與相鄰的胺基形成鍵
●且磺醯亞胺C-4係由以下結構代表：
於一個實施方式中，式(I)之L1-L2-L3係獨立地由以下者代表：
●無
●gGlu
●OEG
●2xgGlu
●gGlu-OEG
●gGlu-2xOEG
●磺醯亞胺-C4
●2x磺醯亞胺-C4
●DgGlu
於一個實施方式中，該取代基具有式(I)Acy-L1-L2-L3且係獨立地由以下者代表：
●石膽酸
●石膽酸-gGlu
●C14
●C16二酸
●C16二酸-gGlu
●C18二酸
●C18二酸-gGlu
●C18二酸-2xgGlu
●C18二酸-DgGlu
●C18二酸-gGlu-OEG
●C18二酸-gGlu-2xOEG
●C18二酸-OEG
●C18二酸-磺醯亞胺-C4
●C20二酸
●C20二酸-gGlu
●C20二酸-gGlu-OEG
●C20二酸-gGlu-2xOEG
●四唑-C16
●四唑-C16-gGlu-OEG
●四唑-C16-gGlu-2xOEG
●四唑-C16-2x磺醯亞胺-C4
●四唑-C17
●四唑-C17-磺醯亞胺-C4
●四唑-C18；
●四唑-C18-磺醯亞胺-C4
●四唑-C18-2x磺醯亞胺-C4
於一個實施方式中，該取代基係實施例15之化合物之取代基，其中Acy-L1-L2-L3係由C18二酸-gGlu-OEG代表及由以下結構代表：
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例1-46之化合物所組成的群組。
於又另一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例1-36之化合物所組成的群組。
於又另一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例10-34之化合物所組成的群組。
於又另一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例3、4、12-16、18-20、22、23、25、26、28-30之化合物所組成的群組。
於又另一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例14-16、18、20及26之化合物所組成的群組。
於又另一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例37-39或46之化合物所組成的群組。
於又另一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係選自由實施例40-45之化合物所組成的群組。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物係實施例15之化合物：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
醯基
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物包含醯基。包含醯基的胰島素衍生物可因此稱為「醯基化胰島素類似物」。
於較佳的實施方式中，本發明之胰島素衍生物包含醯基(Acy)，其中該醯基代表石膽酸、或以下式之官能基：●Chem.1：-CO-(CH2)x-COOH；或●Chem.2：--CO-(CH2)x-四唑基-
其中x代表範圍在12至20的整數；且該四唑基係1H-四唑-5-基或以下式的脂肪酸：●Chem.3：-CO-(CH2)x-CH3
其中x代表範圍在8至16的整數。
於一個實施方式中，Acy係選自由以下者所組成的群組：石膽酸、1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸、1,20-二十烷二酸、四唑-C16、四唑-C17、四唑C18及十四酸。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含醯基，其包含二羧酸。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含Chem 1之式之醯基，其中x代表範圍在12至20的整數。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含Chem 1之式之式之醯基，其中x代表範圍在12至18的整數。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含Chem 1之式之式之醯基，其中x代表範圍在12至16的整數。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含Chem 1之式之式之醯基，其中x代表範圍在12至14的整數。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含Chem 1之式之式之醯基；其中x代表整數14、16或18，即，分別為脂肪二酸基團1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸、及1,20-二十烷二酸。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含式-CO-(CH2)12-COOH的醯基且係由以下結構代表：
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含式-CO-(CH2)14-COOH(亦稱為1,16-十六烷二酸)的醯基且係由以下結構代表：
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含式-CO-(CH2)16-COOH(亦稱為1,18-十八烷二酸)的醯基且係由以下結構代表：。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含式-CO-(CH2)18-COOH(亦稱為1,20-二十烷二酸)的醯基且係由以下結構代表：。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含式-CO-(CH2)20-COOH的醯基且係由以下結構代表：
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含包含石膽酸的醯基且係由以下結構代表：
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含包含式-CO-(CH2)12-CH3之脂肪酸的醯基且係由以下結構代表：
於另一個實施方式中，該胰島素衍生物包含包含至少一個官能基的醯基。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含包含選自由羧酸及四唑部分所組成的群組的官能基的醯基。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含包含選自以下式的官能基的醯基：Chem.1：-CO-(CH2)x-COOH；或Chem.2：--CO-(CH2)x-四唑基-
其中x代表範圍在12至20的整數；且該四唑基係1H-四唑-5-基。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含包含選自由四唑-C16、四唑-C17及四唑C18所組成的群組的四唑部分的官能基。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含為由以下結構代表的四唑-C16的官能基：
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含為由以下結構代表的四唑-C17的官能基：
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含為由以下結構代表的四唑-C18的官能基：
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含脂肪酸。
於一個實施方式中，該胰島素衍生物包含以下式的脂肪酸：Chem.3：-CO-(CH2)x-CH3
其中x代表範圍在8至16的整數。
連接子
術語「連接子」用於本文中包括適合的側鏈，其可將一部分(諸如醯基)連接至該胰島素或胰島素類似物。因此，該連接子及該醯基一起變成側鏈。被連接至該連接子的部分可為任何適合的部分。實例包括白蛋白結合部分。
該連接子可促成及/或增強該部分(例如該白蛋白結合部分)之結合功效，例如包含gGlu的連接子可增強胰島素或該胰島素類似物之白蛋白結合功效。
於一個實施方式中，該側鏈包含於該醯基及至該胰島素或胰島素類似物的接附點之間的部分，該部分可以「連接子」、「連接子部分」、「連接子基團」、「連接基團」、「間隔子」、或類似者稱之。該連接子可係視需要的，及因此於該例子中該側鏈可與該醯基完全相同。
該醯基或該連接子可藉由醯基化共價地接附至該胰島素胜肽之離胺酸殘基，即通過其(該醯基、該白蛋白結合部分、該延長部分、或該連接子)之羧酸基團及離胺酸殘基或位於N端之胺基酸殘基之胺基之間形成的醯胺鍵。其他的或可替代的結合化學包括烷基化、酯形成、醯胺形成、或偶合至半胱胺酸殘基，諸如藉由順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯胺(諸如溴基-/氯基-/碘基- )偶合。
於較佳的實施方式中，醯基(較佳包含延長部分及連接子)之活性酯係共價連接至離胺酸殘基之胺基，較佳係其ε胺基，於醯胺鍵之形成下，如於以上解釋的。
於另一個實施方式中，該連接子基團係不存在且代表共價鍵。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物包含式-L1-L2-L3之連接子基團，其中：
●L1係不存在或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
●L2係不存在或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
●L3係不存在或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
其中
●gGlu代表由以下結構代表的γ麩胺酸殘基：
其中在該結構圖之右邊的羧基係γ-羧基，其與相鄰的胺基形成鍵
●DgGlu代表由以下結構代表的γ麩胺酸殘基：
其中在該結構圖之右邊的羧基係γ-羧基，其與相鄰的胺基形成鍵
●OEG代表[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醯基且係由以下結構代表：
●磺醯亞胺C-4係由以下結構代表： ，且
●2x磺醯亞胺-C4或磺醯亞胺-C4-磺醯亞胺-C4，係由以下結構代表：
於一個實施方式中，本發明之胰島素胜肽包含代表選自以下者的二價連接基團的連接子基團：DgGlu、gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-OEG、gGlu-OEG-OEG、OEG、磺醯亞胺-C4、及2x磺醯亞胺-C4，其中
‧gGlu代表γ麩胺酸殘基；及
‧OEG代表具有式NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-COOH的胺基酸，其對應於基團或殘基-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-，亦稱為[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醯基。
‧磺醯亞胺-C4，其係由以下結構代表：
‧2x磺醯亞胺-C4或磺醯亞胺-C4-磺醯亞胺-C4，其係由以下結構代表：
連接子之非限制性實例係選自由以下者所組成的列表：DgGlu、gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-OEG、gGlu-OEG-OEG、OEG、磺醯亞胺-C4、2x磺醯亞胺-C4。
於一個實施方式中，該連接基團係不存在。
於一個實施方式中，該連接基團係DgGlu。
於一個實施方式中，該連接基團係gGlu。
於一個實施方式中，該連接基團係gGlu-gGlu。
於一個實施方式中，該連接基團係gGlu-OEG。
於一個實施方式中，該連接基團係gGlu-OEG-OEG。
於一個實施方式中，該連接基團係OEG。
於一個實施方式中，該連接基團係磺醯亞胺-C4。
於一個實施方式中，該連接基團係磺醯亞胺-C4-磺醯亞胺-C4或2x磺醯亞胺C-4。
中間產物
本發明進一步係關於呈新穎主鏈的形式的中間產物，其當接附至本發明之取代基時，產生本發明之胰島素衍生物胜肽。
本發明亦係關於呈本發明之胰島素胜肽之新穎主鏈的形式的中間產物，其係選自由以下者所組成的群組：
i. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及4)
ii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及5)
iii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及7)
iv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及8)
v. B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及9)
vi. A14E、B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及10)
vii. B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及11)
viii. B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 1及12)
ix. B5Y、desB30(SEQ ID 1及13)
x. B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 1及14)
xi. B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 1及15)
xii. B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 1及6)
xiii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及4)
xiv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及5)
xv. B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及10)
xvi. A14E、B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 3及6)
xvii. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及7)
xviii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及8)
xix. A14E、B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及9)
xx. A14E、B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及11)
xxi. A14E、B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 3及12)
xxii. A14E、B5Y、desB30(SEQ ID 3及13)
xxiii. A14E、B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 3及14)
xxiv. A14E、B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 3及15)
或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
醫藥上可接受的鹽、醯胺、或酯
本發明之中間產物、類似物及衍生物可呈醫藥上可接受的鹽、醯胺、或酯的形式。
鹽係例如藉由鹼及酸之間的化學反應形成，例如：2 NH3+H2SO4→(NH4)2SO4。
該鹽可係鹼鹽、酸鹽，或其可係二者皆非(即中性鹽)。於水中，鹼鹽產生氫氧離子且酸鹽產生鋞離子。
本發明之衍生物之鹽可利用添加分別與陰離子或陽離子基團反應的陽離子或陰離子來形成。此等基團可坐落於該胜肽部分、及/或坐落於本 發明之衍生物之側鏈。
本發明之衍生物之陰離子基團之非限制性實例包括側鏈中的自由羧基團(若有任何)以及該胜肽部分中的自由羧基團。該胜肽部分往往包括位於C端的自由羧酸基團，且其亦可包括位於內部酸性胺基酸殘基(諸如Asp及Glu)的自由羧基團。
該胜肽部分中的陽離子基團之非限制性實例包括位於N端的自由胺基(若存在)以及內部鹼性胺基酸殘基(諸如His、Arg、及Lys)之任何自由胺基。
本發明之衍生物之酯可(例如)藉由自由羧酸基團與醇或酚之反應(其導致至少一個羥基被烷氧基或芳氧基置換)形成。
酯形成可涉及位於該胜肽之C端的自由羧基團、及/或該側鏈中的任何自由羧基團。
本發明之衍生物之醯胺可(例如)藉由自由羧酸基團之活化形式與胺或經取代胺之反應或藉由自由或經取代胺基與羧酸之活化形式之反應來形成。
醯胺形成可涉及於該胜肽及/或該側鏈中位於該胜肽之C端的自由羧基團、該側鏈中的任何自由羧基團、位於該胜肽之N端的自由胺基、及/或該胜肽之任何自由或經取代胺基。
於特殊的實施方式中，該胜肽或衍生物係呈醫藥上可接受的鹽的形式。於另一個特殊的實施方式中，該衍生物係呈醫藥上可接受的醯胺的形式，較佳為具有位於該胜肽之C端的醯胺基團。於又進一步特殊的實施方式中，該胜肽或衍生物係呈醫藥上可接受的酯的形式。
穩定性
胰島素衍生物之穩定性係定義成維持三維結構的能力(物理穩 定性)以及承受其結構中的共價改變的能力(化學穩定性)。有利的穩定性可係導因於單單該胰島素衍生物之固有特性或導因於該胰島素衍生物及載體中所含的一或多種成分間的有利交互作用之結果。
令人滿意的胰島素衍生物之穩定性係定義成可與胰島素aspart相比或比其更佳的穩定性。
於一個方面，本發明提供於調配物中具有令人滿意的穩定性的胰島素衍生物。
於一個方面，本發明提供於調配物中具有改善的穩定性的胰島素衍生物。
發明人已發現根據本發明的胰島素衍生物於調配物中具有令人滿意的穩定性。發明人已令人意外地發現根據本發明的人類胰島素衍生物同時具有令人滿意的穩定性及保有胰島素受體之部分活化。
穩定性可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的習用方法及種種標準方法測定。
胰島素衍生物可例如針對於包括鋅及酚的調配物中的穩定性作篩選。於一個實施方式中，目標係獲得包括於儲存期間或於增高的溫度下不改變的單一胰島素自我締合狀態(例如六聚狀態)的調配物。
測量穩定性的方法之實例為示差掃描量熱法(DSC)，其係評估蛋白質穩定性的常見方法，其典型係藉由解折疊之開始溫度(T開始)評估或(更常地)藉由於胰島素衍生物自我締合之熱解折疊之中點(Tm)評估。文獻(Huus等人，Biochemistry(2005)44,11171-11177)中已描述胰島素之熱解折疊(透過DSC)如何對應於鋅-六聚體之穩定性且隨之對應於胰島素之調配物穩定性(Huus等人，Pharm Res(2006)23(11),2611-20)。低開始溫度可視為胰島素解離而較高的開始溫度指出穩定的胰島素衍生物複合體直到解折疊溫度。於類 似醫藥調配物的條件下，令人滿意的穩定性係於約或高於胰島素aspart(B28D人類胰島素)之T開始及Tm的T開始及Tm獲得。
如此方法之另一個實例係藉由使用似溶析液調配物條件添加酚及使離子強度表持低的粒徑篩析層析(SEC)的胰島素自我締合之評估。寬且曳尾的峰係於層析期間改變的數個自我締合狀態的象徵而單一尖銳的峰指出穩定的自我締合狀態。
於一個實施方式中，根據本發明的胰島素衍生物相較於胰島素aspart具有令人滿意的化學的及/或物理穩定性。
於另一個實施方式中，根據本發明的胰島素衍生物相較於無B5Y或B5F突變的相對應胰島素衍生物具有令人滿意的化學的及/或物理穩定性。
除非於說明書中另外指出，以單數形式呈現的術語包括其複數形式。
試管內生物學 胰島素結合及受體活化/磷酸化
藉由胰島素的胰島素受體之活化導致該受體之活化，即該受體上的數個殘基之磷酸化，而此活化造成細胞反應(包括促成血漿葡萄糖濃度降低的細胞程序、調節脂質代謝的細胞程序、及促進細胞生長及增殖的細胞程序)之級聯。
雖然本發明之胰島素衍生物完全能夠迫使人類胰島素離開胰島素受體，其等事實上誘發胰島素受體之次最大磷酸化。本發明之胰島素衍生物因此於胰島素受體磷酸化方面可被視為部分促效劑，且其等可被稱為「部分胰島素衍生物」。
於本發明之前後文中，「部分胰島素衍生物」被定義為誘發胰 島素受體磷酸化但所獲得的最大反應(即最大胰島素受體磷酸化水平)係低於由人類胰島素誘發的最大反應(且即低於由人類胰島素誘發的最大反應之65%)的胰島素類似物。
次最大反應或次最大功效可被定義為，低於由人類胰島素誘發的最大反應的由本發明之部分胰島素衍生物誘發的最大反應。為測定胰島素衍生物是否具有次最大功效，該衍生物之最大反應必須於分析中測定並與人類胰島素之最大反應比較。胰島素衍生物之最大反應可藉由測量於漸增量的該胰島素衍生物之存在下的反應以獲得劑量-反應曲線來測定。最大反應(頂端)可自劑量-反應曲線來計算並與由人類胰島素誘發的最大反應作比較。
胰島素結合及受體磷酸化可藉由習用方法測定，且種種標準分析係所屬技術領域中具有通常知識者已知的。用於試管內測定的如此標準分析包括(除其他者)胰島素放射性受體分析(其中胰島素衍生物之相對親和力被定義為置換專一性結合至胰島素受體(例如在完整細胞上、在細胞膜部分上、或在經純化受體上)的經標記125I-胰島素之50%所需的胰島素對比胰島素衍生物的比率)以及胰島素受體磷酸化分析(其中胰島素衍生物活化胰島素受體的能力係例如藉由使用例如酶結合免疫吸附分析(ELISA)或西方墨點轉漬技術測量在胰島素受體上的酪胺酸殘基之磷酸化來測定)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於65%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於60%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於50%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於40% 的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於30%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於20%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於15%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或低於12%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物誘發約或高於1%的胰島素受體之磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
於一個實施方式中，本發明之胰島素衍生物能夠誘發胰島素受體之磷酸化。
胰島素受體傳訊
胰島素受體之活化起始細胞內反應(諸如種種細胞內蛋白質(包括細胞外調節激酶(ERK)，亦以MAP激酶(MAPK)為人所知、及AKT，亦以蛋白質激酶B(PKB)為人所知)上的殘基之磷酸化、及該等蛋白質之活化)之級聯。AKT之活化對於誘發促成血液葡萄糖濃度之降低的細胞程序而言係重要的，而ERK之活化對於誘發促成生長中的細胞中的促進性細胞生長及增殖的細胞程序而言係重要的。
AKT傳訊途徑係對於葡萄糖降低途徑為重要的訊息傳導途徑(其中AKT係關鍵蛋白質)之實例。於患有第2型糖尿病的人中，AKT傳訊途徑之活化被大幅地削弱，此導致例如至骨骼肌肉及脂肪組織中的葡萄糖攝取之減低。然而，ERK傳訊途徑維持對胰島素為反應性且係於治療期間可能被過度 刺激的非抗性途徑之實例。ERK途徑藉由胰島素的活化亦促進VSMC之移動及增殖及膠原蛋白合成，其等對於動脈粥漾硬化病灶之進展係關鍵性步驟。於較佳的實施方式中，本發明之胰島素衍生物對ERK傳訊途徑誘發次最大功效。
用於測量胰島素活化性傳訊(例如試管內磷酸化傳訊分子(諸如ERK及AKT)的能力)的分析係所屬技術領域中具有通常知識者已知的，且包括(除其他者外)西方墨點轉漬技術、Surefire及/或ELISA技術。
本發明之胰島素衍生物相較於對AKT活化(磷酸化)對ERK活化(磷酸化)具有較低的次最大功效(當相較於人類胰島素之功效時)。
令人意外地，吾人已發現測試化合物能夠誘發的最大胰島素受體磷酸化(即胰島素受體偏好(partiality)之程度)與其活化葡萄糖降低途徑而不過度刺激非抗性途徑的能力之間有相關性。例如，本發明之化合物相較於對AKT活化(磷酸化)對ERK活化(磷酸化)具有較低的次最大功效(當相較於人類胰島素時)且其等能夠減低血液葡萄糖水平，但對與例如脂質代謝相關的程序具有改善的功效，諸如較低的增重、較低的體脂肪質量增加及增加的肝臟TG降低、及/或具有改善的內皮功能。
偏好(partiality)被定義為具有小於1的測試化合物之最大胰島素受體磷酸化/人類胰島素之最大胰島素受體磷酸化比率。
於一個實施方式中，本發明係關於用於測量胰島素受體偏好的方法，其包含以下步驟：
a)測量由測試化合物誘發的最大胰島素受體磷酸化
b)測量由人類胰島素誘發的最大胰島素受體磷酸化
其中a)/b)之比率係小於1。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.65。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.6。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.5。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.4。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.3。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.2。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.15。
於一個實施方式中，該胰島素受體偏好係小於0.12。
選擇性被定義為測試化合物活化葡萄糖降低途徑而不過度刺激非抗性途徑的能力，其中該比率係小於1。
於一個實施方式中，本發明係關於用於測量選擇性的方法，其包含獨立地測量相較於人類胰島素的葡萄糖降低途徑及非抗性途徑之最大磷酸化並測定葡萄糖降低途徑/非抗性途徑之間的比率是否係小於1。
於一個實施方式中，本發明係關於用於測量選擇性的方法，其包含獨立地測量相較於人類胰島素的ERK及AKT之最大磷酸化並測定ERK/AKT之間的比率是否係小於1。
於一個實施方式中，該比率係小於0.8。
於一個實施方式中，該比率係小於0.7。
於一個實施方式中，該比率係小於0.6。
於一個實施方式中，該比率係小於0.5。
於一個實施方式中，該比率係小於0.4。
脂質代謝/非抗性途徑
本發明之胰島素衍生物(當相較於人類胰島素時)能夠降低血液葡萄糖水平而不過度刺激非抗性途徑，例如對脂質代謝途徑展現次最大功效。
如於以上描述的，由胰島素透過胰島素受體起始的傳訊級聯導 致廣大範圍的細胞功效，包括對脂質代謝途徑的功效。如於本文中定義的，術語「脂質代謝途徑」涵蓋由胰島素誘發或抑制的生物作用，該等作用影響例如肝臟中的三酸甘油酯之合成。非抗性途徑之實例係ERK傳訊途徑。
於較佳的實施方式中，本發明之胰島素衍生物於初肝細胞中對與從頭脂質合成(DNL)相關的代謝性途徑誘發次最大功效(相較於人類胰島素之功效)。用於測量於肝臟中對脂肪酸合成的功效的標準分析係所屬技術領域中具有通常知識者已知的且包括(除其他者外)藉由測量初肝細胞中經14C標記的醋酸酯至有機可萃取物質(即脂質)的轉化來測定對從頭脂質生成的功效。
由胰島素透過胰島素受體起始的傳訊級聯導致對於調節脂質代謝所需的酵素之誘發。如此酵素之實例係脂肪酸合酶(FAS)。FAS係於用於調節脂質合成的細胞程序中的關鍵酵素。
本發明之胰島素衍生物亦對編碼涉及脂質合成的因子(例如FAS，其於初肝細胞中僅被本發明之胰島素衍生物次最大地誘發)的mRNA具有次最大功效(當相較於人類胰島素時)。
用於測量胰島素及其類似物及衍生物誘發或抑制涉及脂質代謝途徑的基因之mRNA表現的能力的標準分析係所屬技術領域中具有通常知識者已知的，且包括(除其他者外)使用定量性即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)測量mRNA表現。
葡萄糖降低途徑
雖然本發明之胰島素衍生物對與非抗性途徑(諸如脂質代謝)有關的途徑展現較低的次最大功效，其等對葡萄糖降低途徑能夠誘發與人類胰島素相同的最大反應。
於本發明之前後文中，術語「葡萄糖降低途徑」涵蓋造成血漿 葡萄糖濃度之降低的由胰島素誘發的生物作用，諸如促進肝臟中的葡萄糖之儲存，於肝臟中胰島素活化促進醣解及肝醣合成的酵素，並抑制該等涉及葡萄糖新生者，諸如促進脂肪細胞中的葡萄糖至脂質中的併入、及增加於(例如)肌肉中的葡萄糖之攝取。
如於以上描述的，由胰島素通過胰島素受體起始的傳訊級聯導致廣大範圍的細胞功效，包括對葡萄糖降低途徑的功效。用以降低血漿葡萄糖濃度的胰島素刺激性細胞程序之實例係促進葡萄糖至肌肉、脂肪及數種其他組織中的進入、及刺激肝臟以肝醣的形式儲存葡萄糖。AKT傳訊途徑係對於葡萄糖降低途徑而言為重要的訊息傳導途徑(其中AKT係關鍵蛋白質)之實例。
用於測量人類胰島素(或其類似物及衍生物)對葡萄糖降低途徑的功效的試管內分析係所屬技術領域中具有通常知識者已知的，且包括(除其他者外)使用經分離大鼠肝細胞的分析(其中肝醣合成可藉由測量肝醣堆積測定)及(例如)使用大鼠脂肪細胞執行的脂質生成分析(其中測量[3-3H]葡萄糖被轉化為有機可萃取物質(即脂質)的量)。
由胰島素通過胰島素受體起始的傳訊級聯亦導致調節葡萄糖降低途徑所需的酵素及轉錄因子之活化及/或誘發。如此酵素之實例係葡萄糖-6-磷酸酯酶(G6Pc)。G6Pc係導致葡萄糖自非碳水化合物碳受質(諸如丙酮酸酯、乳酸酯、甘油、生糖性胺基酸、及奇-鏈脂肪酸)產生的葡萄糖新生中的速率決定酵素。
本發明之胰島素衍生物於肝細胞及/或肌肉中對刺激葡萄糖以肝醣的形式儲存展現相同的最大功效。
本發明之胰島素衍生物於大鼠初肝細胞中對編碼涉及葡萄糖新生的因子的mRNA具有與人類胰島素相同的最大功效。
用於測量人類胰島素或其類似物及衍生物誘發或抑制涉及葡萄 糖降低途徑的基因之mRNA表現的能力的標準分析分析亦係所屬技術領域中具有通常知識者已知的，且包括即使用定量性RT-PCR測量mRNA表現。
本發明之胰島素衍生物於初細胞(例如肌肉、肝細胞及/或脂肪細胞)中對葡萄糖降低途徑(諸如編碼涉及葡萄糖新生的酵素之mRNA之表現、肝醣合成之刺激、葡萄糖至脂質中的併入)展現完全(最大)功效(當相較於人類胰島素之功效時)。
該等胰島素衍生物於大鼠初脂肪細胞中對刺激葡萄糖至脂質中的併入展現與人類胰島素相同的最大反應。
活體內生物學
於另一個特殊的實施方式中，本發明之胰島素衍生物能夠活體內減低血液葡萄糖水平，且相較於人類胰島素對與脂質代謝相關的程序具有改善的功效，諸如較低的增重、較低的體脂肪質量增加、增加的肝臟三酸甘油酯降低、或具有改善的內皮功能，其如所屬技術領域中已知道的可於任何適合的動物模型中以及於臨床試驗中測定。
C57BL/6J-飲食-誘發性肥胖(DIO)小鼠係適合的動物模型之一個實例，且血液葡萄糖及/或對與脂質代謝相關的程序的功效(諸如較低的增重、較低的體脂肪質量增加或增加的或肝臟三酸甘油酯之降低)可於如此小鼠中測定，例如如於分析(II)中描述的。
內皮之結構及功能完整性對於維持血管恒定及預防動脈粥樣硬化而言係關鍵性的。內皮官能不良包含一些於血管內皮的功能改變且動脈內皮功能之損害係動脈粥樣硬化中的早期事件且與心血管疾病之主要風險因子相關。因此，具有預防或減低內皮官能不良的胰島素衍生物會有重要的優勢，因為其等會對動脈粥樣硬化及/或CVD具有有益的功效。
於一個實施方式中，本發明提供胰島素衍生物，其等能夠減低 血液葡萄糖水平且相較於習用的胰島素療法對內皮功能具有改善的功效，例如預防或減低內皮官能不良。
於另一個實施方式中，本發明提供胰島素衍生物，其等於糖尿病對象中預防或減低心血管疾病及/或預防或減低動脈粥樣硬化之發生。
動脈內皮功能可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法(諸如對腸繫膜動脈中的乙醯基-膽鹼誘發性血管舒張的功效之測量)測量，例如如於分析(II)中描述的。
肝臟代謝於糖尿病中嚴重失調。正常地，低於5%的肝臟體積係脂肪，但於患有非酒精性脂性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝(NAFLD)的患者中，多達50%-80%的肝臟重量可由脂肪(大部分呈三酸甘油酯形式)組成，參見例如：Sanyal,A.J.於“AGA technical review on non-alcoholic fatty liver disease”,Gastroenterology 2002；123,1705-1725。
於較佳的實施方式中，本發明提供胰島素衍生物，其等能夠減低血液葡萄糖水平，但相較於習用胰島素療法導致較低的肝臟三酸甘油酯含量。
肝臟三酸甘油酯含量可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法測量，例如如於(分析II)中描述的。
胰島素胜肽之製造
多肽(例如胰島素)之製造於所屬技術領域中係廣為人知的。該胰島素可例如藉由典型的胜肽合成(例如固相胜肽合成使用t-Boc或Fmoc化學或其他已充分建立的技術)製造，參見(例如)Greene及Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley & Sons,1999。該胰島素亦可藉由包含培養含有編碼該類似物的DNA序列且能夠於適合的營養培養基中在允許該胰島素胜肽之表現的條件下表現該胰島素類似物的宿主細胞的方法製造。可將數種 重組方法使用於人類胰島素及人類胰島素類似物之製造中。可用於在諸如(例如)大腸桿菌及啤酒釀母菌的微生物中的胰島素之製造的方法之實例係(例如)於WO2008034881中揭露。
典型地，該胰島素類似物係藉由利用廣為人知的技術於適合的宿主細胞中表現編碼目標胰島素類似物或其前驅物的DNA序列來製造，如於例如EP1246845或WO2008034881中揭露的。
該胰島素類似物可被表現成具有N端延伸，如於EP 1,246,845中揭露的。於分泌至培養基中及回收後，該胰島素前驅物會接受種種試管內程序以移除可能的N端延伸序列及連接胜肽以給出該胰島素類似物。如此方法包括於L-蘇胺酸酯之存在下利用胰蛋白酶或水解無色桿菌(Achromobacter lyticus)蛋白酶的酵素性轉化接著係利用鹼或酸水解的該胰島素類似物之蘇胺酸酯成為該胰島素類似物的轉化，如於US4343898或US4916212中描述的
適用於本發明的N端延伸之類型之實例係於US5395922及EP765395中揭露。
對於包含非天然胺基酸殘基的胰島素類似物，該重組細胞應經修飾以使得該非天然胺基酸被併入至該類似物中，例如藉由使用tRNA突變體。因此，簡言之，根據本發明的胰島素胜肽係以類似於已知胰島素類似物之製備的方式製備。
蛋白質純化
用於製造本發明之胰島素衍生物的胰島素類似物係自細胞培養基回收。用於製造本發明之胰島素衍生物的胰島素類似物可藉由包括(但不限於)以下者的所屬技術領域中已知的各種各樣的程序純化：層析(例如，離子交換、親和力、疏水、層析聚焦、及粒徑篩析)、電泳程序(例如，製備性等電聚焦(IEF)、差異性溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、或萃取(參見(例 如)Protein Purification,J.-C.Janson及Lars Ryden，編者，VCH Publishers，紐約，1989)。較佳地，其等可藉由親和力層析在抗-「[胰島素/胰島素類似物/胰島素衍生物]」抗體管柱上純化。另外的純化可藉由習用的化學純化方法(諸如高效能液相層析)達成。其他純化方法(包括檸檬酸鋇沉澱)於所屬技術領域中係已知的，且可被應用在於本文中描述的新穎「[胰島素/胰島素類似物/胰島素衍生物]」之純化中(參見(例如)Scopes,R.,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。
醫藥調配物
含有本發明之胰島素衍生物的可注射組成物可使用習用的製藥工業之技術(其涉及在適當的情況下溶解及混合該等成分以給出所欲的終產物)製備。因此，根據一個程序，本發明之胰島素衍生物係溶解於稍微小於欲製備的組成物之最終體積的量的水中。等張劑、防腐劑及緩衝劑係按需要添加且若需要，溶液之pH值係按需要使用酸(例如氫氯酸)或鹼(例如水性氫氧化鈉)調整。最後，溶液之體積係以水調整以給出所欲的成分之濃度。
視需要地，本發明之胰島素製劑(例如溶液或懸浮液)可藉由使本發明之胰島素衍生物溶解於水性介質中(例如以範圍在約240至約6000nmol/ml的濃度)來製備。該水性介質係(例如)以氯化鈉、丙二醇或甘油使之等張。此外，該水性介質可含有緩衝劑，諸如醋酸鹽或檸檬酸鹽、防腐劑，諸如間甲苯酚或酚及鋅離子，例如於至高達約12 Zn/6ins的濃度。該溶液之pH值被向中性調整而不過於靠近本發明之化合物之等電點以避免潛在的沉澱。最終胰島素製劑之pH值取決於使用何種本發明之化合物、鋅離子之濃度及本發明之化合物之濃度。該胰島素製劑係(例如)藉由滅菌過濾使之無菌。
實施方式
本發明係藉由以下非限制性實施方式進一步描述：
1.一種胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物包含B5Y或B5F及包含醯基的取代基、或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
2.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素類似物，其中該胰島素衍生物進一步包含一或多個胺基酸取代及/或缺失。
3.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含至多5個另外的取代及/或缺失。
4.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含2、3或4個胺基酸取代。
5.如實施方式1-4中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B26G或B26A。
6.如實施方式5所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B26G。
7.如實施方式5所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B26A。
8.如實施方式1-7中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該取代基具有以下式(I)：Acy-L1-L2-L3
其中：Acy係醯基且係由石膽酸代表、或由以下式的官能基代表：Chem.1：-CO-(CH2)x-COOH；或Chem.2：-CO-(CH2)x-四唑基；其中x代表範圍在12至20的整數；且該四唑基係1H-四唑-5-基或由以下式的脂肪酸代表：Chem.3：-CO-(CH2)x-CH3
其中x代表範圍在8至16的整數
●L1係不存在且代表共價鍵或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
●L2係不存在且代表共價鍵或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
●L3係不存在且代表共價鍵或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4
其中gGlu代表γ麩胺酸殘基且OEG代表[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醯基。
9.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含A14E。
10.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B28K、B26K或B29K。
11.如實施方式10所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B28K。
12.如實施方式10所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B26K。
13.如實施方式10所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B29K。
14.如實施方式1-13中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該取代基係接附至B26K、B28K或B29K之離胺酸之ε胺基。
15.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含desB30、desB29-30或desB27-30。
16.如實施方式15所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含desB30。
17.如實施方式15所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含desB29-30。
18.如實施方式15所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進 一步包含desB27-30。
19.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該等取代係選自由以下者所組成的群組：
i. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及4)
ii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及5)
iii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及7)
iv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及8)
v. B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及9)
vi. A14E、B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及10)
vii. B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及11)
viii. B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 1及12)
ix. B5Y、desB30(SEQ ID 1及13)
x. B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 1及14)
xi. B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 1及15)
xii. B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 1及6)
xiii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及4)
xiv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及5)
xv. B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及10)
xvi. A14E、B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 3及6)
xvii. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及7)
xviii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及8)
xix. A14E、B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及9)
xx. A14E、B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及11)
xxi. A14E、B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 3及12)
xxii. A14E、B5Y、desB30(SEQ ID 3及13)
xxiii. A14E、B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 3及14)
●A14E、B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 3及15)
20.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該醯基係石膽酸，或包含以下式的官能基：Chem.1：-CO-(CH2)x-COOH；Chem.2：--CO-(CH2)x-四唑基，；其中x代表範圍在12至20的整數；且該四唑基係1H-四唑-5-基。
或係以下式的脂肪酸：Chem.3：-CO-(CH2)x-CH3
其中x代表範圍在8至16的整數。
21.如實施方式20所述之胰島素衍生物，其中Acy係選自由以下者所組成的群組：石膽酸、1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸、1,20-二十烷二酸、四唑-C16、四唑-C17、四唑C18及十四酸。
22.如實施方式21所述之胰島素衍生物，其中該取代基包含石膽酸。
23.如實施方式21所述之胰島素衍生物，其中該醯基包含選自1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸、及1,20-二十烷二酸的脂肪二酸基團。
24.如實施方式23所述之胰島素衍生物，其中該至少一個取代基包含脂肪二酸基團1,16-十六烷二酸。
25.如實施方式23所述之胰島素衍生物，其中該至少一個取代基包含脂肪二酸基團1,18-十八烷二酸。
26.如實施方式23所述之胰島素衍生物，其中該至少一個取代基包含脂肪二酸基團1,20-二十烷二酸。
27.如實施方式21所述之胰島素衍生物，其中該四唑部分係選自由四唑-C16、四唑-C17及四唑C18所組成的群組。
28.如實施方式27所述之胰島素衍生物，其中該四唑部分係四唑-C16。
29.如實施方式27所述之胰島素衍生物，其中該四唑部分係四唑-C17。
30.如實施方式27所述之胰島素衍生物，其中該四唑部分係四唑C18。
31.如實施方式20所述之胰島素衍生物，其中該脂肪酸係十四酸或C14。
32.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該取代基包含連接子基團。
33.如實施方式1-31所述之胰島素衍生物，其中該連接子基團係不存在係由共價鍵代表。
34.如實施方式1-32中之任一項所述之胰島素衍生物，其中-L1-L2-L3代表選自以下者的二價連接子基團：DgGlu、gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-OEG、gGlu-OEG-OEG、OEG、磺醯亞胺-C4及磺醯亞胺-C4-磺醯亞胺-C4，其中，gGlu代表γ麩胺酸殘基；且OEG代表[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醯基。
35.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係DgGlu。
36.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係gGlu。
37.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係gGlu-gGlu。
38.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係gGlu-OEG。
39.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係gGlu-OEG-OEG。
40.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係OEG。
41.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係磺醯亞胺-C4。
42.如實施方式34所述之胰島素衍生物，其中該二價連接基團係磺醯亞胺-C4-磺醯亞胺-C4。
43.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該取代基係實施例1-46之化合物之取代基，係獨立地由以下者代表：
●石膽酸
●石膽酸-gGlu
●C14
●C16二酸
●C16二酸-gGlu
●C18二酸
●C18二酸-gGlu
●C18二酸-2xgGlu
●C18二酸-DgGlu
●C18二酸-gGlu-OEG
●C18二酸-gGlu-2xOEG
●C18二酸-OEG
●C18二酸-磺醯亞胺-C4
●C20二酸
●C20二酸-gGlu
●C20二酸-gGlu-OEG
●C20二酸-gGlu-2xOEG
●四唑-C16
●四唑-C16-gGlu-OEG
●四唑-C16-gGlu-2xOEG
●四唑-C16-2x磺醯亞胺-C4
●四唑-C17
●四唑-C17-磺醯亞胺-C4
●四唑-C18
●四唑-C18-磺醯亞胺-C4
●四唑-C18-2x磺醯亞胺-C4
44.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係選自由實施例1-46之化合物所組成的群組。
45.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係選自由實施例1-36之化合物所組成的群組。
46.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係選自由實施例10-34之化合物所組成的群組。
47.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係選自由實施例3、4、12-16、18-20、22、23、25、26、28-30之化合物所組成的群組。
48.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係選自 由實施例14-16、18、20及26之化合物所組成的群組。
49.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係選自由實施例37-39及46之化合物所組成的群組。
50.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係選自由實施例40-45之化合物所組成的群組。
51.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係由實施例15之化合物代表：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
52.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物誘發約或低於65%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
53.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物誘發約或低於60%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
54.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰 島素衍生物誘發約或低於50%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
55.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物誘發約或低於40%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
56.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物誘發約或低於30%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
57.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物誘發約或低於20%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
58.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物誘發約或低於12%的胰島素受體之次最大磷酸化(當相較於人類胰島素時)。
59.如前述實施方式中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供用作為醫藥品。
60.如實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於治療之方法中使用。
61.如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於心血管疾病之預防或治療中使用。
62.如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於動脈粥樣硬化之預防或治療中使用。
63.如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於內皮官能不良之預防或減低中使用。
64.如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於改善脂質參數中使用。
65.如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於預防或減低肝臟三酸甘油酯含量中使用。
66.如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於用於預防或減少體重增加中使用。
67.如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於以下者之治療中使用：●改善脂質參數，諸如異常血脂症之預防及/或治療、降低總血清脂質、增加HDL-C、降低LDL-C、降低小型緻密LDL-C、降低VLDL-C、降低三酸甘油酯、降低膽固醇、降低脂蛋白a(Lp(a))之血漿水平或抑制脂蛋白元A(apo(A))之產生；●諸如以下者的心血管疾病之預防及/或治療：心臟症候群X、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病、再灌注損傷、中風、大腦局部缺血、早期心臟或早期心血管疾病、左心室肥大、冠狀動脈疾病、高血壓、本態性高血壓、急性高血壓危象、心肌病、心臟機能不足、運動耐受力缺乏、急性及/或慢性心臟衰竭、心律不整、心臟節律異常、暈厥、心絞痛、心臟繞道及/或支架再閉塞、間歇性跛行(閉塞性動脈粥樣硬化)、舒張性官能不良、及/或收縮性官能不良；及/或血壓之減低，諸如收縮壓之減低；心血管疾病之治療。
68.一種醫藥組成物，其包含如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物、及醫藥上可接受的賦形劑。
69.如實施方式68所述之醫藥組成物，其係供皮下投予。
70.一種用於在需要治療糖尿病的患者中治療糖尿病的醫藥組成物，其包含治療有效量的如實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物、以 及醫藥上可接受的載體。
71.如實施方式68-70所述之醫藥組成物，其係供用作為醫藥品。
72.如實施方式68-70所述之醫藥組成物，其係供於患有糖尿病且具有高心血管疾病風險的患者之治療中使用。
73.如實施方式68-70所述之醫藥組成物及/或預防或減低動脈粥樣硬化之發生。
74.一種如實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物之用途，其係用於製造用於以下者之治療或預防的醫藥品：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性不良、高血糖症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管病症、冠心病、中風、發炎性腸道症候群、消化不良、低血壓或胃潰瘍。
75.一種用於改善脂質參數的方法，其包含投予醫藥活性量的如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物的步驟。
76.一種用於改善脂質參數的方法，其包含投予醫藥活性量的如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物的步驟，其中改善脂質參數，係諸如異常血脂症之預防及/或治療、降低總血清脂質；增加HDL；降低LDL-C；降低小型緻密LDL-C；降低VLDL-C；非_HDL-C；降低三酸甘油酯；降低膽固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))之血漿水平；抑制脂蛋白元A(apo(A))之產生。
77.一種用於心血管疾病之預防及/或治療的方法，其包含投予醫藥活性量的如前述實施方式1-58中之任一項所述之胰島素衍生物的步驟。
78.一種用於以下者之治療或預防的方法：糖尿病、第1型糖尿 病、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性不良、高血糖症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管病症、冠心病、中風、發炎性腸道症候群、消化不良、或胃潰瘍，該方法包含將治療有效量的如實施方式1-58中之任一項所述之胰島素之衍生物投予至需要其的對象。
79.一種中間產物，其包含選自由以下者所組成的群組的主鏈：
i. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及4)
ii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及5)
iii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及7)
iv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及8)
v. B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及9)
vi. A14E、B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及10)
vii. B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及11)
viii. B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 1及12)
ix. B5Y、desB30(SEQ ID 1及13)
x. B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 1及14)
xi. B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 1及15)
xii. B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 1及6)
xiii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及4)
xiv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及5)
xv. B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及10)
xvi. A14E、B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 3及6)
xvii. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及7)
xviii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及8)
xix. A14E、B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及9)
xx. A14E、B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及11)
xxi. A14E、B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 3及12)
xxii. A14E、B5Y、desB30(SEQ ID 3及13)
xxiii. A14E、B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 3及14)
xxiv. A14E、B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 3及15)或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
80.一種用於測定化合物之選擇性的方法，其包含以下步驟：●測量相較於人類胰島素由該化合物誘發的最大AKT磷酸化●測量相較於人類胰島素由化合物A誘發的最大ERK活化，其中該ERK/AKT比率係小於1。
81.如實施方式80所述之方法，其中該化合物係胰島素化合物。
82.如實施方式81所述之方法，其中該胰島素化合物係實施方式1-58之化合物。
實施例 醫藥方法 分析(I)試管內生物學 胰島素受體結合
本發明之胰島素衍生物對人類胰島素受體(IR)的相對結合親和力係藉由競爭結合於鄰近閃爍分析(SPA)中測定(根據Glendorf T等人；Biochemistry 2008 47 4743-4751)。
簡言之，人類胰島素標準品及胰島素衍生物之稀釋系列係於96槽孔盤中執行，然後加入於結合緩衝液中的SPA珠粒(抗-小鼠聚乙烯甲苯SPA珠粒，GE Healthcare)、抗-IR小鼠抗體83-7(可從例如Thermo Fisher Scientific 購得)、可溶性人類IR-A(自過度表現IR-A的倉鼠嬰腎(BHK)細胞純化)、及[125I-TyrA14]-人類胰島素。於培養後，將盤子離心並在TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)上計數。
來自SPA的數據係根據四參數對數模式(Vlund A；Biometrics 1978 34 357-365)分析，及該等類似物之結合親和力係相對於在相同的盤子內測量的人類胰島素標準品之結合親和力計算。
對於本發明有代表性的胰島素衍生物之相對結合親和力係於以下表1中列出。圖1顯示來自使用可溶性IR-A的競爭結合分析的人類胰島素及實施例15之化合物之代表性受體結合曲線。
胰島素受體磷酸化(IRpY1158)
本發明之胰島素衍生物對胰島素受體(IR)之活化的功效係藉由該等胰島素衍生物磷酸化位於胰島素受體之位置1158的酪胺酸殘基的能力評估，如由Hansen BF等人；PLOS One May 2012 7 e34274描述的。
簡言之，CHO-hIR細胞(過度表現胰島素受體-A的中國倉鼠卵巢細胞)係以漸增濃度的胰島素類似物刺激30min，於冰冷磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌，急速冷凍並於溶胞緩衝液中溶胞。將等量的蛋白質裝載至Phospho-IR-ELISA槽孔(IRpY1158)中並根據製造商之方案(Invitrogen)測量磷酸化。
本發明之胰島素衍生物對胰島素受體磷酸化水平的最大反應係藉由測量於漸增量的該胰島素衍生物之存在下的胰島素受體磷酸化水平以獲得劑量-反應曲線來測定。標準劑量-反應曲線係以四個參數定義：基線反應(底部)、最大反應(頂部)、斜率、及引起位於基線及最大值中間的反應的藥物濃度(EC50)。
胰島素受體磷酸化數據劑量-反應曲線係藉由非線性迴歸(四參 數模式(Y=底部+(頂部-底部)/(1+10^((LogEC50-X)*坡斜率(HillSlope))))使用來自GraphPad Software Inc.的GraphPad Prism 7擬合。使用所估計的估計參數以(頂部(類似物)-底部(類似物))*100/(頂部(胰島素)-底部(胰島素))的形式計算各配體之%max值。
對於本發明有代表性的胰島素衍生物之所計算的%max值係於以下表1中列出。圖2顯示來自於過度表現IR-A的CHO-hIR細胞中的IRpY1158磷酸化分析的人類胰島素及實施例15之化合物之如此劑量-反應曲線之實例。
因此，基於圖1及2，可見到對於本發明有代表性的化合物(即實施例15之化合物)如何完全能夠使人類胰島素離開胰島素受體(圖1)，但僅誘發胰島素受體之次最大磷酸化(圖2.)。
胰島素受體傳訊
本發明之類似物透過AKT及ERK途徑的胰島素受體(IR)傳訊係藉由傳統西方墨點轉漬技術或藉由使用Surefire,alphascreen技術評估。
西方墨點轉漬
簡言之，CHO-hIR細胞係以漸增濃度的該胰島素類似物刺激10min，於冰冷PBS中洗滌，急速冷凍並於溶胞緩衝液(Biosource)中溶胞。將等量的蛋白質裝載在凝膠上並印漬至硝化纖維素膜。磷酸化AKT及ERK係分別以Phospho-AKT(Ser473)(Cell singalling #9271)及pMAPK 44/42 ERK1/2兔(Cell singalling # 4376)抗體顯像。條帶強度係使用LAS3000(Fuji)評估。
Surefire
將細胞塗盤於96槽孔組織培養盤上，並於第二日於37℃下以胰島素或胰島素衍生物刺激10min並根據製造方案(AKT1/2/3(p-Ser473)cat # TGRA4S10K及ERK1/2 p-T202/Y204 Cat # TGRESB10K)分析。
各個類似物之反應性值(跨度)係使用非線性迴歸於來自 GraphPad Software Inc的GraphPad Prism 7計算並以胰島素之反應性之百分比(%max AKT或%max ERK)的形式表現。
圖3及4顯示來自於過度表現IR-A的CHO-hIR細胞中的AKT磷酸化分析及ERK磷酸化分析的人類胰島素及實施例15之化合物之代表性劑量-反應曲線且顯示對於本發明有代表性的化合物(即實施例15之化合物)如何相較於人類胰島素誘發比AKT之次最大活化低的ERK之次最大活化。對於本發明有代表性的胰島素類似物及參考胰島素衍生物之計算(%max ERK/%max AKT)值係於表1中列出。
於表1中給出的結果顯示只有誘發低於由人類胰島素誘發的最大反應之65%的胰島素受體磷酸化的胰島素衍生物相較於對AKT活化(磷酸化)對ERK活化(磷酸化)具有較低的次最大功效(當相較於人類胰島素之功效時)。
於大鼠自由脂肪細胞分析中的效力(脂質生成)
本發明之胰島素衍生物之代謝效力係藉由脂質生成使用經分離大鼠脂肪細胞測定。該等分析大部分係如由Moody AJ等人；Horm Metab Res 1974 6 12-16(於Rodbell M；J Biol Chem 1964 239 375-380中描述的分析之修改版本)描述地實現。
簡言之，將附睪脂肪墊從已殺死的史-道二氏大鼠移出並放置於具有膠原蛋白酶(Worthington)的降解緩衝液中以將該等脂肪墊降解成單一細胞的懸浮液。將此細胞懸浮液係以PBS洗滌並將細胞再懸浮於補充有0.1或1% HSA(A-1887,Sigma)及HEPES的Krebs緩衝液中。將細胞懸浮液等分試樣以含有D-[3-3H]葡萄糖(PerkinElmer)及漸增濃度的人類胰島素標準品或胰島素衍生物的葡萄糖溶液培養。培養係藉由添加MicroScint-E(PerkinElmer)停止，且盤子係於TopCount NXT(PerkinElmer)中計數。
數據係根據四參數對數模式分析(Vlund A；Biometrics 1978 34 357-365)且該等類似物之代謝效力係相對於在相同的盤子內測量的人類胰島素標準品之代謝效力作計算。
對於本發明有代表性的胰島素衍生物之代謝效力係於以下表1中列出。圖5顯示對於本發明有代表性的化合物(即實施例15之化合物)於大鼠初脂肪細胞中對於刺激脂質生成具有與人類胰島素相同的最大功效。
大鼠肝細胞之分離
大鼠肝細胞係從雄性史-道二氏大鼠藉由以膠原蛋白酶(Sigma)使用Berry M N及Friend D S；J Cell Biol 1969 43 506-520之修改版本逆行灌注肝臟來分離。
肝細胞係於補充有人類胰島素、地塞米松及胎牛血清(Gibco)的Media 199(Gibco)中洗滌，接種在經塗覆膠原蛋白的盤子(BD BioCoat,BD Biosciences)上並允許其等附著1-4小時。
大鼠初肝細胞中的肝醣合成之刺激
本發明之胰島素類似物對肝醣堆積之刺激的功效係於初肝細胞(參見以上分離程序)中使用修改自M.Kilcoyne等人，Analytical Biochemistry 416(2011)18-26的稱為PAS(過碘酸-Schiff)分析的專一性及簡單酵素方法測定。此方法係用於微滴定盤比色分析的PAS試劑染色之修改方法。大鼠初肝細胞係於96槽孔盤中使用不同的人類胰島素或胰島素衍生物濃度培養18-24小時。為測定細胞肝醣含量，將肝細胞於室溫下於搖動器中於1% Triton中溶胞30分鐘。將過碘酸溶液(0.1%過碘酸+7%醋酸，於MQ水中)(過碘酸3951,Sigma)加至各個槽孔並以搖動器混合一min。接著將盤子於37℃下培養90min.以允許葡萄糖之羥基氧化成醛。接著添加Schiff氏溶液並自光保護盤子，搖動5min.，之後於室溫下將其等靜置25min.。接著使用SpectraMax分光光度計 測量於550nm的吸收。數據係於GraphPad Prism 7分析且胰島素類似物之相對代謝效力係以人類胰島素及胰島素類似物之估計EC50值間的比率的形式計算。
對於本發明有代表性的胰島素衍生物於肝細胞中對肝醣堆積的效力係於以下表1中列出。圖6對於本發明有代表性的化合物(即實施例15之化合物)於大鼠初肝細胞中對肝醣堆積之刺激具有與人類胰島素相同的最大功效。
基因表現
本發明之胰島素衍生物對基因表現的功效係藉由定量性即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)對從大鼠初肝細胞分離的cDNA(參見以上的分離程序)測定。
於分離後一日，將肝細胞以於補充有1μM地塞米松及0.1% HSA(A-1887,Sigma)的分析Media 199(Gibco)中的升糖素處理二個小時。於預培養後，將細胞以於分析培養基中的人類胰島素或胰島素衍生物處理16小時，於2、4及6小時後換成新鮮的培養基。
RNA係使用RNeasy Mini套組(Qiagen)自肝細胞萃取及純化。cDNA係自RNA使用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad)製造。基因表現係使用TagMan Fast Advanced Master混合物及隨選引子/探針(Applied BioSystems；Ppib #Rn03302274_m1 rFAS #Rn00565347_m1；rG6Pc #Rn00565347_m1)測定。將基因表現針對Ppip(cycB，cyclophilin b)表現作正規化及並使用來自GraphPad Software Inc GraphPad Prism 7擬合至S形劑量-反應曲線。
圖7及8顯示人類胰島素及實施例15之化合物之代表性劑量-反應曲線，其等係來自針對fasn及g6pc在從大鼠初肝細胞分離的cDNA上執行的定量性RT-PCR分析。圖7中給出的結果顯示對於本發明有代表性的化合物(即實施例15之化合物)如何誘發FAS mRNA之次最大誘發(當相較於人類胰島素 時)。
圖8顯示對於本發明有代表性的化合物(即實施例15之化合物)於大鼠初肝細胞中將G6Pc RNA之表現抑制至與人類胰島素相同的水平。
從頭脂質生成
本發明之胰島素衍生物對脂質之從頭合成(DNL)的功效係於初肝細胞(參見以上分離程序)中使用經標記的醋酸酯測定。
於分離後一日，將肝細胞預培養於補充有葡萄糖(Sigma)及人類胰島素或胰島素衍生物的分析培養基(Media 199(Gibco)，HSA(Sigma))中24小時。於預培養後，將肝細胞於分析培養基中以人類胰島素或胰島素衍生物及經14C-標記的醋酸酯(PerkinElmer)處理24h小時。於培養後，將細胞於PBS中洗滌並以MicroScint-E(PerkinElmer)溶胞。
放射性醋酸酯至脂質中的併入(DNL)係使用TopCount NXT(PerkinElmer Life Sciences)測定且結果係使用來自GraphPad Software Inc.的GraphPad Prism 7擬合至S形劑量-反應曲線。
圖9顯示來自於大鼠初肝細胞中的從頭脂質生成分析的人類胰島素及實施例15之化合物之代表性劑量-反應曲線且顯示對於本發明有代表性的化合物(即實施例15之化合物)於大鼠初肝細胞中如何展現對從頭脂質生成的次最大反應。
ND：未測定
分析(II)使用糖尿病小鼠的亞慢性活體內研究 動物及化合物
使來自Jackson Laboratory的12週大的雄性C57BL/6J-飲食誘發性肥胖(DIO)小鼠(於Research Diet D12492高脂肪食物)於設施內適應二週，並接著於短暫異氟烷(isoflurane)氣體麻醉下藉由皮下(s.c.)注射150mg/kg鏈佐黴素(STZ)(Sigma)使其等得到糖尿病。允許動物二週以發展出穩定的糖尿病，之後基於體重、血液葡萄糖水平、及血液醣苷化血紅素(HbA1c)水平之測量將其等分配至治療組。將動物安置在標準光照及溫度條件下且其等隨時可隨意獲得D12492飼料及水。
將動物分配至載體治療(n=16)或不同劑量的PK比較物(比較物no.5)或實施例15之化合物(n=26每劑量組)。
測試化合物(即PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物)係於5mM磷酸鹽、140mM氯化鈉、及70ppm聚山梨糖醇酯-20中調配。
PK比較物(比較物no.5)係經醯基化但非部分胰島素衍生物。
治療方案
動物係使用以其等被分配的治療每日s.c.注射兩次治療六週。注射係每日於時段07：30-08：30及19：30-20：30分開12小時給予。給藥體積係2mL/kg，且注射係以NovoPen®注射裝置投予。
於整個研究期間，動物係有規律地針對體重及血液葡萄糖水平作測量，且血液HbA1c水平及體組成係於研究開始時及於研究完成時測量。此外，評估PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物之血漿暴露水平。
分析方法
血液葡萄糖濃度係藉由於EBIO緩衝溶液中稀釋全血接著在EKF Diagnostic Biosen自動分析儀上測量來測定。
血液HbA1c水平係藉由於溶血緩衝液中稀釋全血接著於Hitachi Cobas 6000自動分析儀上測量及藉由使用Roche Diagnostics HbA1c套組來測定。
體組成係藉由針對脂肪質量及瘦肉質量掃描未經麻醉的小鼠藉由定量性磁共振(EchoMRI-100TM,Echo Medical Systems)來測定。
肝臟TG含量係於肝臟組織之樣本(於安樂死後立即收集)中測定。於肝臟樣本之均質化、皂化及離心後，TG濃度係於上清液中在Hitachi Cobas 6000分析儀(Roche)上測量。接著將TG含量除以原始均質化肝臟樣本之質量並以μmol TG每mg肝臟組織表現。
內皮功能係於HbA1c匹配組(載體n=12、PK比較物(比較物no.5)n=15及實施例15之化合物(n=15)離體評估，其使用安裝在絲線肌肉張力儀(wire myograph)中的腸繫膜動脈中的ACh誘發性血管舒張。動脈係以脫羥腎上腺素預收縮至最大緊張力之70%接著以累積漸增劑量的ACh刺激。
PK比較物(比較物no.5)及實施例15之化合物之血漿暴露水平係藉由血漿樣本之分析使用自製的發光氧通道免疫分析(LOCI)測定。
圖10-14顯示來自以載體、PK比較物(比較物no.5)、及對本發明有代表性的胰島素類似物(即實施例15之化合物)每日兩次皮下給藥六週的糖尿病STZ-DIO小鼠中的亞慢性活體內研究的HbA1c水平、體重、體脂肪質量、肝臟TG及腸繫膜動脈之ACh刺激性血管舒張之代表性曲線。
動物實驗顯示以本發明之胰島素衍生物治療以高脂肪餵食的糖尿病小鼠可降低血液葡萄糖水平至與藥動學(PK)比較物(比較物no.5)類似的程度。PK比較物(比較物no.5)係醯基化胰島素類似物，其並非對胰島素受體磷酸化的部分促效劑，但於小鼠中具有與本發明之實施例15之化合物之PK輪廓類似的PK輪廓。
使用對本發明有代表性的胰島素衍生物(即實施例15之化合物)對比PK比較物(比較物no.5)(經給藥以達到相同水平的糖血控制(藉由 HbA1c水平測量))的以高脂肪餵食的糖尿病小鼠之亞慢性治療(6週)導致顯著較低的增重較低的體脂肪質量增加、增加的肝臟三酸甘油酯降低(TG)及改善的離體乙醯基膽鹼(Ach)刺激性血管舒張。
因此，本發明提供胰島素衍生物，其等能夠減低血液葡萄糖水平，但相較於PK匹配的比較物對與脂質代謝相關的程序(諸如較低的增重、較低的體脂肪質量增加及增加的肝臟TG之降低)具有改善的功效以及具有改善的內皮功能。
縮寫表
ACh-乙醯基膽鹼
AKT-蛋白質激酶B(PKB)
BHK-倉鼠嬰腎
CHO-中國倉鼠卵巢
CPM-每分鐘計數
CVD-心血管疾病
DIO-飲食誘發性肥胖
DNL-從頭脂質生成
DPM-每分鐘的分解
ELISA-酶結合免疫吸附分析
ERK-細胞外調節激酶(亦以MAPK為人所知)
FAS-脂肪酸合酶
G6Pc-葡萄糖-6-磷酸酯酶
HbA1c-醣苷化血紅素
HEPES-4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸
HI-人類胰島素
HSA-人類血清白蛋白
IR-胰島素受體
IR-A-胰島素受體同功型A
LOCI-發光氧通道免疫分析
MAPK-有絲分裂誘致劑活化性蛋白質激酶(亦以ERK為人所知)
NAFLD-非酒精性脂肪肝
PAS-過碘酸溶液
PBS-磷酸鹽緩衝鹽水
PK-藥動學
PKB-蛋白質激酶B(亦以AKT為人所知)
Ppip-Cyclophilin b(cycB)
RT-PCR-即時聚合酶鏈鎖反應
SPA-鄰近閃爍分析
SREPB1c-固醇調節性元件結合性轉錄因子1c
STZ-鏈佐黴素
STZ-DIO-經鏈佐黴素處理的飲食誘發性肥胖
TG-三酸甘油酯
穩定性
本發明之胰島素衍生物之穩定性係使用示差掃描量熱法(DSC)及粒徑篩析層析(SEC)評估
藉由示差掃描量熱法(DSC)的胰島素衍生物自我締合及穩定性之評估 調配
將該等胰島素衍生物溶解至約0.2mM並將pH以氫氧化鈉及氫氯酸調整至大約7.6。濃度係藉由SEC Waters PROTEIN PAK 125(250*8mm)使 用含有2.5M醋酸、4mM L-精胺酸及20%(V/V)乙腈的溶析液以1ml/min.的流率於室溫下測定。使用根據Pace的吸收係數校正的對人類胰島素參考物於280nm下的偵測。
將16mM酚、7mM磷酸鹽、10mM NaCl及0.1mM醋酸鋅加至0.1mM的最終胰島素衍生物濃度。pH係以氫氯酸及氫氧化鈉調整至7.4。
數據收集係使用MicroCal VP-Capillary DSC(Malvern Instrumeuts Ltd)執行。所有的掃描皆使用於參考格子中的載體(與胰島素樣本相同但無胰島素及醋酸鋅的組成物)從20℃至110℃於4℃/min之掃描速率執行。儀器回饋模式被設為「低」且數據過濾週期被設為2秒。緩衝液-緩衝液參考掃描(使用前述的載體執行)係於濃度正規化及基線創建前自各樣本掃描減去。應注意胰島素鋅複合物於胰島素方面可處於六聚體以外的其他締合態，但為了簡化將鋅穩定化胰島素複合物稱為六聚體。
對於不同的胰島素衍生物比較(T開始)及六聚體解折疊峰(Tm,六聚體)之中點且T,開始及Tm,六聚體之值係於表2中顯示。結果顯示B5Tyr及B5Phe突變如何對胰島素鋅六聚體具有高度穩定性功效。
ND：未測定
藉由粒徑篩析層析(SEC)的胰島素衍生物自我締合之評估
粒徑篩析層析(SEC)係用於評估胰島素衍生物自我締合的常見方法。
調配
將該等胰島素類似物溶解至約2mM並將pH以氫氧化鈉及氫氯酸調整至7.6。濃度係藉由SEC Waters PROTEIN PAK 125(250*8mm)使用含有2.5M醋酸、0.065% L-精胺酸及20%(V/V)乙腈的溶析液以1ml/min.的流率及於室溫下測定。使用根據Pace CN,[Pace CN,Protein Science(1995)4,2411- 2433]的吸收係數校正的對人類胰島素參考物於280nm下的偵測。
將1.6%甘油、30mM酚、7mM三(羥基甲基)胺基甲烷及0.3mM醋酸鋅加至0.6mM的最終胰島素衍生物濃度。將pH以氫氯酸及氫氧化鈉調整至pH 7.6。
為了模擬胰島素衍生物調配條件，包括16mM酚、20mM氯化鈉、及10mM三(羥基甲基)胺基甲烷的溶析液係藉由氫氯酸調整至pH 7.3。所使用的管柱係來自Waters Corporation，密爾福，MA,USA的ACQUITY UPLC® BEH200(150*4.6mm，d=1.7μm)。流動係0.3mL/min，注射體積係20μL且紫外線偵測係於286nm下。管柱溫度被維持於23℃下。
圖15-19顯示來自SEC實驗的代表性層析圖。圖15顯示比較化合物(即比較物9)如何於調配物中不穩定，因為其種種峰係寬且曳尾的，顯示數個重疊的自我締合態。相反地，圖16-19中給出的結果顯示對本發明有代表性的化合物(即實施例no.3、11、12及15之化合物)如何於調配物中穩定，因為層析圖顯示顯著的單一銳利峰。
雖然本發明之某些特徵已於本文中闡明及描述，所屬技術領域中具有通常知識者現會想到許多修改、取代、改變、及同等物。因此，應瞭解所附實施方式係意欲涵蓋落入本發明之真正精神內的所有如此修改及改變。
製備之一般方法
以下實施例及一般程序提及於說明書中及於合成流程圖中鑑認的中間化合物及終產物。本發明之化合物之製備係使用以下實施例詳細描述，但所描述的化學反應係就其等對本發明之化合物之製備的普遍適用性方面揭露。
偶爾，反應可能不如所描述地適用於本發明之揭露範圍內包括個每一化合物。對其等而言此情況發生的化合物會被所屬技術領域中具有通常 知識者輕易地認識出。於此等例子中，該等反應可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的習用修改版本(即藉由干擾性基團之適當保護、藉由改成其他習用試劑、或藉由反應條件之例行修改)成功地執行。
供選擇地，本文中揭露的或否則習用的其他反應會適用於本發明之相對應化合物之製備。於所有製備性方法中，所有起始材料皆係已知的或可從已知的起始材料輕易地製備。所有的溫度皆以攝氏溫度闡述，且除非另外指出，所有部分及百分比當提及固體時係以重量計，且所有部分當提及溶劑及溶析液時係以體積計。
本發明之化合物可藉由利用所屬技術領域中典型的以下程序之一或多者純化。若需要，此等程序可於梯度、pH、鹽、濃度、流動、管柱、等等方面根據個人偏好作修改。取決於諸如雜質輪廓、目標胰島素之溶解度等等的因子，此等修改可被所屬技術領域中具有通常知識輕易地認識到並修改。
(方法1)製備性實施例-主鏈表現及純化 主鏈表現
供根據本發明使用的胰島素胜肽主鏈(即雙-鏈非醯基化胰島素類似物)係藉由於適合的宿主細胞中藉由廣為人知的技術(例如如於US 6500645中揭露的)表現編碼目標胰島素主鏈的DNA序列來重組製造。該胰島素胜肽主鏈係直接地表現或呈可具有在B-鏈上的N端延伸及/或在B-鏈及A-鏈間的連接胜肽(C-胜肽)的前驅分子的形式表現。此N端延伸及C-胜肽係藉由適合的蛋白酶(例如水解無色桿菌蛋白酶(ALP)或胰蛋白酶)試管內切下，及因此會於位置B1及A1旁分別具有剪切位置。適合供根據本發明使用的類型的N端延伸及C-胜肽係於例如US 5395922、EP 765395及WO 9828429 A1中揭露。
編碼供根據本發明使用的胰島素類似物胜肽主鏈前驅物的多核苷酸序列可藉由已建立的方法(例如由Beaucage等人；Tetrahedron Letters 1981 22 1859-1869描述的亞磷醯胺(phosphoamidite)方法；或由Matthes等人；EMBO Journal 1984 3 801-805描述的方法)合成地製備。根據亞磷醯胺方法，寡核苷酸係於例如自動DNA合成儀合成、純化、形成雙螺旋、及結合以形成合成性DNA構築體。製備DNA構築體之目前偏好的方式係藉由聚合酶鏈鎖反應(PCR)。
重組方法典型會使用能夠於所選微生物或宿主細胞中複製且帶有編碼供根據本發明使用的胰島素胜肽主鏈前驅物的多核苷酸序列的載體。該重組載體可係自主複製載體，即以染色體外實體的形式存在且其複製獨立於染色體複製的載體，例如質體、染色體外元件、袖珍染色體、或人工染色體。該載體可含有任何用於確保自我複製的手段。供選擇地，該載體可係當導入至宿主細胞中時被併入至基因組中且與其已併入至其中的染色體一起複製者。此外，可使用單一載體或質體或一起含有欲導入至宿主細胞之基因組中的總DNA二或更多個載體或質體、或轉位子。該載體可係線性或封閉環狀質體及較佳會含有允許載體至宿主細胞之基因組的穩定併入或載體於細胞中獨立於基因組的自主複製的元件。
該重組表現載體可係能夠於酵母菌中複製者。使載體能夠於酵母菌中複製的序列之實例係酵母菌質體2μm複製基因REP 1-3及複製起點。
該載體可含有一或多個可篩選標記，其等允許經轉形細胞之輕易篩選。可篩選標記係一種基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、原始營養(給營養缺陷型生物)、及類似者。細菌可篩選標記之實例係來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因、或賦予抗生素抗性(諸如胺苄青黴素、康黴素、氯黴素或四環素抗性)的標記。供於絲狀真菌宿主細胞中使用的可篩選標記包括amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥胺酸胺甲醯基轉移酶)、pyrG(血苷-5’-磷酸酯脫羧酶)及trpC(鄰胺苯甲酸酯合酶)。用於酵母菌宿主 細胞的適合標記係ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及URA3。一種很適用於酵母菌的可篩選標記係粟酒裂殖酵母菌TPI基因(Russell；Gene 1985 40 125-130)。
於該載體中，該多核苷酸序列係可操作地連接至適合的啟動子序列。該啟動子可係於所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變體、經截短、及雜合啟動子，且可獲得自對宿主細胞而言為同源或異源的編碼細胞外或細胞內多肽的基因。
用於指揮於細菌宿主細胞中的轉錄的適合啟動子之實例，係獲自以下者的啟動子：大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂酶(agarase)基因(dagA)、枯草芽孢桿菌聚果糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-澱粉酶基因(amyL)、脂肪嗜熱芽孢桿菌產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-澱粉酶基因(amyQ)、及地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)。用於指揮於絲狀真菌宿主細胞中的轉錄的適合啟動子之實例係獲自對於以下者之基因的啟動子：米麴菌TAKA澱粉酶、米氏假根毛黴(Rhizomucor miehei)天門冬胺酸蛋白酶、黑麴菌中性α-澱粉酶、及黑麴菌酸穩定性α-澱粉酶。於酵母菌宿主中，有用的啟動子係啤酒釀母菌Ma1、TPI、ADH、TDH3或PGK啟動子。
編碼供根據本發明使用的胰島素胜肽主鏈的多核苷酸序列典型亦會可操作地連接至適合的終止子。於酵母菌中，適合的終止子係TPI終止子(Alber等人；J.Mol.Appl.Genet.1982 1 419-434)。
用於分別組合編碼供根據本發明使用的胰島素胜肽主鏈的多核苷酸序列、啟動子及終止子及將其等插入至含有對於在所選宿主中複製所需的訊息的適合載體中的程序，對所屬技術領域中具有通常知識者而言係廣為人知 的。應瞭解該載體可藉由首先製備含有編碼供根據本發明使用的胰島素主鏈的完整DNA序列的DNA構築體、及隨後將此片段插入至適合的表現載體中來構築，或藉由依序插入含有針對個別元件(諸如訊號及原肽(B-鏈之N端延伸)、C-胜肽、A-及B-鏈)的遺傳訊息的DNA片段接著結合來構築。
包含編碼供根據本發明使用的胰島素主鏈的多核苷酸序列的載體被導入至宿主細胞中，以使得該載體被以染色體併入物的形式維持，或以自我複製性染色體外載體的形式維持。術語「宿主細胞」涵蓋由於在複製期間發生的突變而與親本細胞不完全相同的該親本細胞之任何子代。該宿主細胞可係單細胞微生物，例如原核生物、或非單細胞微生物，例如真核生物。有用的單細胞係細菌細胞，諸如革蘭氏陽性細菌，包括(但不限於)芽孢桿菌細胞、鏈黴菌細胞、或革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌及假單胞菌屬物種。真核生物細胞可係哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。
該宿主細胞可特別係酵母菌細胞。該酵母菌生物可係任何適合的酵母菌生物，其於培養時將該胰島素胜肽主鏈或其前驅物分泌至培養基中。適合的酵母菌生物之實例係包括選自以下者的品系：啤酒釀母菌、克魯維氏酵母菌(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、葡萄酵母菌(Sacchoromyces uvarum)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、多形漢遜氏酵母菌(Hansenula polymorpha)、巴斯德氏畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)、克魯維氏畢赤酵母菌(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、假絲酵母菌屬物種、高蛋白假絲酵母菌屬、可可假絲酵母菌(Candida cacaoi)、地絲菌屬物種、及發酵地絲菌(Geotrichum fermentans)。
酵母菌細胞之轉形可例如藉由原生質體形成接著藉由已知的方 法轉形實現。用於培養細胞的培養基可係適用於生長酵母菌生物的任何習用培養基。
主鏈純化
所分泌的胰島素胜肽主鏈或其前驅物可自培養基藉由包括以下者的習用程序回收：藉由離心自培養基分離酵母菌細胞、藉由過濾或藉由在離子交換基質上或在逆相吸收基質上捕捉胰島素胜肽主鏈或其前驅物、沈澱上清液之蛋白質組份、或藉由過濾藉由鹽(例如硫酸銨)接著藉由各種各樣的層析程序(例如離子交換層析、親和力層析、等等)純化。
本發明之胰島素胜肽主鏈之純化及消化係如下實現：該單鏈胰島素胜肽主鏈前驅物(其可含有B-鏈之N端延伸及於B-鏈及A-鏈之間的經修飾C-胜肽)係自酵母菌培養上清液藉由陽離子交換純化及濃縮(Kjeldsen等人；Prot.Expr.Pur.1998 14 309-316)。藉由以離胺酸專一性固定化ALP消化(Kristensen等人；J.Biol.Chem.1997 20 12978-12983)或藉由使用胰蛋白酶以切下B-鏈之N端延伸(若存在)及C-胜肽來使該單鏈胰島素胜肽主鏈前驅物成熟成雙-鏈胰島素胜肽主鏈。
ALP消化
來自陽離子交換層析步驟含有胰島素胜肽主鏈前驅物的析出液係以水稀釋至15-20%的乙醇濃度。添加麩胺酸鈉至15mM的濃度並將pH藉由NaOH調整至9.7。固定化ALP(4gram/L)係以1：100(體積：體積)的比率添加且允許消化於室溫下伴隨溫和的攪拌繼續進行過夜。
消化反應係藉由分析性LC在Waters Acquity超高效能液相層析系統上使用C18管柱分析且分子量係藉由基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜法(MS)(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)確認。
固定化ALP係藉由過濾使用0.2μm過濾器移除。雙-鏈胰島素胜肽主鏈係藉由逆相HPLC(Waters 600系統)於C18管柱上使用乙腈梯度純化。所欲的胰島素胜肽主鏈(即B28K desB29-B30人類胰島素)係藉由冷凍乾燥回收。
胰蛋白酶消化
來自陽離子交換層析步驟含有胰島素胜肽主鏈前驅物的析出液係以水稀釋至15-20%的乙醇濃度。添加甘胺酸至50mM的濃度並藉由NaOH將pH調整至9.0-9.5。以1：300(w：w)的比率添加胰蛋白酶且允許消化於4度下繼續進行。每20分鐘分析地監視消化直到消化完成。消化係藉由以3：100(體積：體積)的比率添加1M檸檬酸來終止。
消化反應係藉由分析性LC於Waters Acquity超高效能液相層析系統上使用C18管柱分析且分子量係藉由MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)確認。
雙-鏈胰島素胜肽主鏈係藉由逆相HPLC(Waters 600系統)在C18管柱上使用乙腈梯度純化。所欲的胰島素胜肽主鏈，係藉由冷凍乾燥回收。
純度係藉由分析性LC於Waters Acquity超高效能液相層析系統上使用C18管柱測定，且分子量係藉由MALDI-TOF MS確認。
(方法2)製備性實施例-醯基化及純化程序 純化程序
純化方法1
管柱：Waters xBridge PrepC18-30x250mm
流動：20ml/min
緩衝液A：0.1% TFA，於水中
緩衝液B：0.1% TFA，於乙腈中
梯度：20-45%B或30-40%B或20-60%B或20-40%B或25-50%B或20-55%B或30-45%B，於40min期間
純化方法2
管柱：Phenomenex，5u，C18，110Å，30x250mm
流動：20ml/min
緩衝液A：0.1% TFA，於水中
緩衝液B：0.1% TFA，於乙腈中
梯度：10-60%B，於80min期間或0-60%B，於95min期間或25-55%B，於60min期間
用於醯基化試劑之製備的一般程序
簡單二酸：經NHS活化的一元酸係藉由於NMP中以TSTU及DIPEA活化二酸-單-三級丁基酯製備並直接使用或製備及分離該二酸-單-NHS酯。當使用經三級丁基保護的醯基化試劑時，藉由以TFA處理去保護所得的胰島素衍生物。
具有OEG連接子的二酸：此試劑係藉由逐步固相合成在氯基三苯甲基樹脂上使用Fmoc-化學製造並使用HFIP、TFA、HFIP/DCM混合物、或TFA/DCM混合物自該樹脂切下。
一些醯基化劑係呈無任何保護基的NHS-酯製備、分離及使用。
一般醯基化程序1
將100mg的適當胰島素類似物溶解於1.2ml 0.1M Na2CO3及0.6ml NMP中並將pH調整至10.7±0.3. 0.03mmol於藉由添加4M NaOH(若需要)而維持於10.7±0.3的pH下添加於0.3ml NMP中的醯基化試劑。於30至60分鐘後，反應完成，並將產物藉由添加40ml異丙醇沈澱，離心，以乙醚洗滌並乾 燥。供選擇地，產物可藉由以30ml水稀釋並將pH調整至4.5-5.0而導致等電位沉澱來分離。供選擇地，將反應混合物以醋酸或TFA酸化並立即純化。
隨後，將產物藉由逆相高效能液相層析(RP-HPLC)於TFA-乙腈中純化(如於以上描述的)並將純流份冷凍乾燥。產物為何係藉由基質輔助雷射脫附游離質譜法(MALDI-MS或超高效能液相層析(UPLC)/電灑-MS確認。
於一些例子中，改變合成規模以製造更大量或更小量。於該例子中，所有的起始材料、試劑及溶劑之量係以相同的因數改量
修改1
當醯基化試劑含有三級丁基保護基時，將異丙醇或等電位沉澱後的產物溶解於5ml TFA或TFA：水(95：5)中5分鐘，以35ml乙醚沈澱，以乙醚洗滌兩次並乾燥。
修改2
當醯基化試劑含有三級丁基保護基時，將粗等-沈澱產物溶解於5ml的TFA或TFA：水95：5或TFA：三異丙基矽烷99：1中。將溶液攪拌20-30min，接著以水(於一些例子中，另外以DMSO或NMF)稀釋並立即藉由製備性HPLC純化。
修改3
於一些例子中，當醯基化試劑似乎於反應混合物中溶解度很差時，添加更多的NMP(至多1ml)並將反應混合物短暫加熱至37℃。
一般醯基化程序2
將100mg的適當胰島素溶解於2ml DMSO中並添加40ul Barton氏鹼(2-三級丁基-1,1,3,3-四甲基脈)。添加20umol的醯基化劑，且於一分鐘後反應完成。將反應混合物酸化並稀釋至水中並立即純化。
(方法3)胰島素衍生物之化學合成
胰島素A-鏈係藉由標準Fmoc胜肽合成例如在Prelude或Liberty合成儀上合成。去保護係以於DMF中的10%或20%哌啶執行。所有的保護基皆係標準的，除了Cys 6、11及20具有Trt保護基且Cys 7具有Acm。若C端殘基係Asn，該胜肽係於PAL或Rink樹脂上以Fmoc-Asp-OBut作為第一個胺基酸來合成。
於合成後，將樹脂以DCM洗滌，以於DCM/HFIP(4：1)中的1%碘處理1分鐘，並於DCM/HFIP(4：1)中培養15分鐘，此導致A6-A11二硫化物之形成。於以DCM洗滌及乾燥後，將胜肽以TFA/水/DPDS(93：5：2)切下，此提供在Cys20上具有硫化吡啶的胰島素A-鏈。乙醚沉澱、洗滌、及乾燥產生粗產物A-鏈，其係於隨後的鏈組合中使用。
胰島素B-鏈係藉由標準Fmoc胜肽合成例如在Liberty或Prelude合成儀上合成。樹脂係例如預裝載Wang樹脂。所有的保護基皆係標準的，除了Cys7具有Acm且Cys19具有Trt。剪切係使用TFA/水/TIPS(93：4：3)執行。乙醚沉澱、洗滌、及乾燥產生粗產物B-鏈，其係於隨後的鏈組合中使用。
當胰島素衍生物具有側鏈經修飾離胺酸係所欲的時，該修飾係於胜肽合成期間導入。欲修飾的離胺酸係以Fmoc-離胺酸(Mtt)-OH的形式導入且該胜肽之N端係以Boc保護(藉由於最後的偶合步驟中的經Boc保護的胺基酸之偶合或藉由使用於DMF中的5當量的Boc-酐的與樹脂結合的胜肽之反應)。Mtt基團係藉由以DMF/HFIP(1：4)處理樹脂30分鐘來移除且側鏈係藉由如針對胜肽主鏈描述的標準Fmoc化學來合成。
將粗產物A-鏈及B-鏈(各0.14mmol)溶解於40ml DMSO中。添加2ml 2M Tris緩衝液pH 8.5且鏈組合係於約10分鐘內完成。溶液係以40ml DMSO及200ml 40%乙腈、1% TFA稀釋。添加N-氯基琥珀醯亞胺至5mM的最 終濃度。此於少於10分鐘內形成第三個雙硫鍵。將溶液稀釋並以600ml 0.2M Tris pH 7.8中和並藉由RP-HPLC在C18管柱上運用乙腈之梯度於20mM磷酸鹽pH 7.2中純化。
組合含有所欲化合物的流份並於相同的管柱上以乙腈梯度於0.1% TFA中再純化。組合純流份並冷凍乾燥之。產率通常係20-50mg的所欲胰島素衍生物，其隨後係藉由UPLC及LC-MS界定特徵。
本發明之胰島素衍生物之實施例
實施例1：N{ε-B28}-15-羧基十五醯基-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素]
藉由合成方法3合成。
計算質量=5903.8；找到的LC-MS m/4=1476.66
實施例2：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成。
計算質量=6032.9；找到的LC-MS m/4=1509.07
實施例3：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成。
計算質量=5931.8；找到的LC-MS m/4=1484
實施例4：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6060.9；找到的LC-MS m/4=1516.73
實施例5：N{ε-B28}-[2-[2-[2-(17-羧基十七醯基胺基)乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6077.0；找到的LC-MS m/5=1216.34
實施例6：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6190.0；找到的LC-MS m/4=1548.37
實施例7：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6206.1；找到的LC-MS m/4=1552.37
實施例8：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-[[(4R)-4-[(3R,10S,13R,17R)-3-羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊[a]菲-17-基]戊醯基]胺基]丁醯基]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6123.1；找到的LC-MS m/4=1531.7
實施例9：N{ε-B28}-[(4R)-4-[(3R,10S,13R,17R)-3-羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊[a]菲-17-基]戊醯基]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5993.9；找到的LC-MS m/4=1499.16
實施例10：N{ε-B28}-15-羧基十五醯基-[TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5797.7；找到的LC-MS m/4=1449.93
實施例11：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基- [TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5825.7；找到的MALDI-MS=5825.7
實施例12：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5791.6；找到的LC-MS m/3=1931.44
實施例13：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5920.8；找到的LC-MS m/5=1185.04
實施例14：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6049.9；找到的LC-MS m/4=1513.32
實施例15：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6065.9；找到的LC-MS m/4=1517.34
實施例16：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6094.0；找到的LC-MS m/4=1524.36
實施例17：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6239.1；找到的LC-MS m/4=1560.4
實施例18：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九醯基胺基)丁醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5948.8；找到的LC-MS m/5=1190.69
實施例19：N{ε-B28}-19-羧基十九醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5819.7；找到的LC-MS m/4=1455.67
實施例20：N{ε-B28}-15-(1H-四唑-5-基)十五醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5787.6；找到的LC-MS m/4=1448.14
實施例21：N{ε-B28}-17-(1H-四唑-5-基)十七醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5815.7；找到的LC-MS m/4=1455.19
實施例22：N{ε-B28}-16-(1H-四唑-5-基)十六醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5801.7；找到的LC-MS m/4=1451.6
實施例23：N{ε-B28}-4-[16-(1H-四唑-5-基)十六醯基胺磺醯基]丁醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5950.8；找到的LC-MS m/4=1488.81
實施例24：N{ε-B28}-4-[4-[15-(1H-四唑-5-基)十五醯基胺磺醯基]丁醯基胺磺醯基]丁醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=6086.0；找到的LC-MS m/4=1522.65
實施例25：N{ε-B28}-4-[17-(1H-四唑-5-基)十七醯基胺磺醯基]丁醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5964.8；找到的LC-MS m/4=1492.41
實施例26：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[15-(1H-四唑-5-基)十五醯基胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=6207.0；找到的LC-MS m/4=1552.95
實施例27：N{ε-B28}-4-[4-[17-(1H-四唑-5-基)十七醯基胺磺醯 基]丁醯基胺磺醯基]丁醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=6114.0；找到的LC-MS m/4=1529.62
實施例28：N{ε-B28}-4-(17-羧基十七醯基胺磺醯基)丁醯基-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5940.8；找到的LC-MS m/4=1486.34
實施例29：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[15-(1H-四唑-5-基)十五醯基胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=6061.9；找到的LC-MS m/4=1516.63
實施例30：N{ε-B28}-[(4R)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5920.8；找到的LC-MS m/4=1481.13
實施例31：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=6100.0；找到的LC-MS m/4=1525.8
實施例32：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,AlaB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=6079.9；找到的LC-MS m/4=1520.77
實施例33：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[TyrB5,AlaB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=6114.0；找到的LC-MS m/4=1529.2
實施例34：N{ε-B28}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]-[GluA14,TyrB5,AlaB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法2合成
計算質量=5934.8；找到的LC-MS m/4=1484.5
實施例35：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基-[PheB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5915.8；找到的MALDI-MS=5916
實施例36：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基- [GluA14,PheB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5775.6；找到的LC-MS m/4=1444.8
實施例37：N{ε-B26}-17-羧基十七醯基-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5667.6；找到的LC-MS m/3=1889.9
實施例38：N{ε-B26}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5796.7；找到的LC-MS m/3=1933.1
實施例39：N{ε-B26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6087.0；找到的LC-MS m/4=1522.5
實施例40：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁 醯基]-[TyrB5],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6130.0；找到的LC-MS m/3=2044.3
實施例41：N{ε-B29}-十四醯基-[TyrB5],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5942.9；找到的LC-MS m/3=1982
實施例42：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]-[TyrB5,GlyB26],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6023.9；找到的MALDI-MS=6026
實施例43：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]-[TyrB5,AlaB26],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6037.9；找到的LC-MS m/4=1510.5
實施例44：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]-[TyrB5,GlyB26],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6051.9；找到的MALDI-MS=6052
實施例45：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]-[TyrB5,AlaB26],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=6066.0；找到的MALDI-MS=6065
實施例46：N{ε-B26}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5941.8；找到的LC-MS m/4=1486
比較物
比較物1：[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法1合成
計算質量=5635.4；找到的MALDI-MS 5635
比較物2：[TyrB5,GlyB26],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法1合成
計算質量=5626.4；找到的MALDI-MS=5626
比較物3：[TyrB5,AlaB26],des-ThrB30-胰島素
藉由合成方法1合成
計算質量=5640.4；找到的MALDI-MS=5641
比較物4：[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法1合成
計算質量=5495.2；找到的LC-MS m/4=1374.83
比較物5：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]-胰島素
比較物6：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基-[LeuB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5881.8；找到的MALDI-MS=5882
比較物7：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基-[SerB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5875.7；找到的MALDI-MS=5876
比較物8：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基-[AlaB5,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5839.7；找到的MALDI-MS=5840
比較物9：N{ε-B28}-17-羧基十七醯基-[GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
藉由合成方法3合成
計算質量=5799.7；找到的MALDI-MS=5800
<110> 諾佛．儂迪克股份有限公司
<120> 新穎的醯基化胰島素類似物及其用途
<130> 170001WO01
<160> 15
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
<210> 10
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
<210> 11
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
<210> 12
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 12
<210> 13
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
<210> 14
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
<210> 15
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15

Claims (15)

  1. 一種胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物包含B5Y或B5F及包含醯基的取代基，或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
  2. 如請求項1所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含B26G或B26A。
  3. 如請求項1或2中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該包含醯基的取代基係接附至B28K、B26K或B29K。
  4. 如請求項1或2中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該取代基具有以下式(I)：Acy-L1-L2-L3其中：●Acy係醯基及係由石膽酸代表或包含至少一個以下式的官能基：Chem.1：-CO-(CH 2) x-COOH；或Chem.2：-CO-(CH 2) x-四唑基；其中x代表範圍在12至20的整數；且該四唑基係1 H-四唑-5-基。或係以下式的脂肪酸：Chem.3：-CO-(CH 2) x-CH 3其中x代表範圍在8至16的整數，●L1係不存在且代表共價鍵或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4●L2係不存在且代表共價鍵或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4●L3係不存在且代表共價鍵或代表OEG、gGlu、DgGlu或磺醯亞胺C-4其中gGlu代表γ麩胺酸殘基且OEG代表[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醯基。
  5. 如請求項1或2中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物進一步包含A14E及/或desB30及/或desB29-30及/或desB27-30。
  6. 如請求項1或2中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該等取代係選自由以下者所組成的群組：i. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及4)ii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及5)iii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及7)iv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及8)v. B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及9)vi. A14E、B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及10)vii. B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及11)viii. B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 1及12)ix. B5Y、desB30(SEQ ID 1及13)x. B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 1及14)xi. B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 1及15)xii. B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 1及6)xiii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及4)xiv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及5)xv. B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及10)xvi. A14E、B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 3及6)xvii. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及7)xviii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及8)xix. A14E、B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及9)xx. A14E、B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及11)xxi. A14E、B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 3及12)xxii. A14E、B5Y、desB30(SEQ ID 3及13) xxiii. A14E、B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 3及14)xxiv. A14E、B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 3及15)。
  7. 如請求項6所述之胰島素衍生物，其中Acy係選自由以下者所組成的群組：石膽酸、1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸、1,20-二十烷二酸、四唑-C16、四唑-C17、四唑C18及十四酸。
  8. 如請求項6所述之胰島素衍生物，其中-L1-L2-L3代表選自以下者的二價連接基團：DgGlu、gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-OEG、gGlu-OEG-OEG、OEG、磺醯亞胺-C4、及磺醯亞胺-C4-磺醯亞胺-C4。
  9. 如請求項1或2中之任一項所述之胰島素衍生物，其中該胰島素衍生物係實施例15之化合物：N{ε-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-胰島素
  10. 一種中間產物，其包含選自由以下者所組成的群組的主鏈：i. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及4)ii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及5)iii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及7) iv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及8)v. B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及9)vi. A14E、B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及10)vii. B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及11)viii. B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 1及12)ix. B5Y、desB30(SEQ ID 1及13)x. B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 1及14)xi. B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 1及15)xii. B5F、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 1及6)xiii. B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及4)xiv. B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及5)xv. B5F、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：1及10)xvi. A14E、B5E、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID 3及6)xvii. A14E、B5Y、B26A、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及7)xviii. A14E、B5Y、B26G、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及8)xix. A14E、B5Y、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及9)xx. A14E、B5F、B28K、desB29-30(SEQ ID NO：3及11)xxi. A14E、B5Y、B26K、desB27-desB30(SEQ ID 3及12)xxii. A14E、B5Y、desB30(SEQ ID 3及13)xxiii. A14E、B5Y、B26G、desB30(SEQ ID 3及14)xxiv. A14E、B5Y、B26A、desB30(SEQ ID 3及15)或其醫藥上可接受的鹽、醯胺或酯。
  11. 一種用作為醫藥品的如請求項1-9中之任一項所述之胰島素衍生物。
  12. 一種用於以下用途的如請求項1-9中之任一項所述之胰島素衍生物，其係供於糖尿病、心血管疾病、動脈粥樣硬化及/或內皮官能不良之預防或治療中使用及/或用於預防或減低肝臟三酸甘油酯含量及/或用於預防或減少體重增加。
  13. 一種如請求項1-9中之任一項所述之胰島素衍生物的用途，其係用於製造用於以下者之治療或預防的醫藥品：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性不良、高血糖症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管病症、冠心病、中風、發炎性腸道症候群、消化不良、低血壓或胃潰瘍。
  14. 一種如請求項10所述之中間產物的用途，其係用於製造用於以下者之治療或預防的醫藥品：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性不良、高血糖症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管病症、冠心病、中風、發炎性腸道症候群、消化不良、低血壓或胃潰瘍。
  15. 一種用於測定胰島素化合物之選擇性的方法，其包含以下步驟：●測量相較於人類胰島素的由該胰島素化合物誘發的最大AKT磷酸化●測量相較於人類胰島素的由該胰島素化合物誘發的最大ERK活化，其中該ERK/AKT比率係小於1。
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