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TW201903144A - 具有降低之表面海藻糖基化之t細胞及其製備及使用方法 - Google Patents

具有降低之表面海藻糖基化之t細胞及其製備及使用方法 Download PDF

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TW201903144A
TW201903144A TW107119671A TW107119671A TW201903144A TW 201903144 A TW201903144 A TW 201903144A TW 107119671 A TW107119671 A TW 107119671A TW 107119671 A TW107119671 A TW 107119671A TW 201903144 A TW201903144 A TW 201903144A
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cell
trehalylation
reduced surface
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TW107119671A
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English (en)
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尼可 奧克利
潔西卡 菲爾德
席拉 佳黛
萊恩 海瑟
Original Assignee
美商西雅圖遺傳學公司
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Abstract

本發明提供產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法及其在授受細胞療法中，特定言之在癌症治療中之用途。

Description

具有降低之表面海藻糖基化之T細胞及其製備及使用方法
在癌症治療中通常採用三種方法：手術、化療及放射療法。另外，免疫療法作為相對新的且另外實驗性方法出現，其潛在地可單獨施用或與癌症治療中之任何現有方法組合施用。癌症免疫療法內之一種治療模式為使用腫瘤特異性T細胞之授受細胞療法。為了進行授受細胞療法，需要經改良策略，例如以提供對目標疾病具有特異性之T細胞同時避免對非病原性組織之脫靶效應，該目標疾病例如待在患者體內治療之特定類型之癌症。
在一個態樣中，提供用於產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法。在一些態樣中，方法包括在海藻糖類似物存在下在細胞培養基中培養T細胞；其中海藻糖類似物具有式(I )或(II )：或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式，其中式(I )或(II )中之每一者可為α或β變旋異構物或對應的醛醣形式； R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或 R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH；且 其中該等T細胞相對於在無該海藻糖類似物存在下培養之T細胞具有降低之表面海藻糖基化。
在另一態樣中，提供用於產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法。在一些態樣中，方法包括向動物提供海藻糖類似物且自該動物獲得具有降低之表面海藻糖基化的T細胞；其中該海藻糖類似物具有式(I )或(II )：或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式，其中式(I )或(II )中之每一者可為α或β變旋異構物或對應的醛醣形式； R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或 R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH；且 其中自該動物獲得之該等T細胞相對於存在於對照動物中或自該對照動物獲得之T細胞具有降低之表面海藻糖基化，該對照動物不提供該海藻糖類似物。
在再一態樣中，提供用於向個體提供授受細胞療法的方法。在一些態樣中，方法包括向需要細胞療法之個體投與具有具降低之表面海藻糖基化之T細胞的混合物。
在再一態樣中，提供用於治療癌症之方法。在一些態樣中，方法包括向需要癌症治療之個體投與具有具降低之表面海藻糖基化之T細胞的混合物。
在再一態樣中，提供用於治療癌症之方法。在一些態樣中，方法包括向需要癌症治療之個體投與具有具降低之表面海藻糖基化之T細胞的混合物，其中具有降低之表面海藻糖基化的該等T細胞根據用於產生此等T細胞之任何方法產生。
本文中所提供之揭示內容的此等及其他態樣可參照以下實施方式、特定實施例之非限制性實例以及附圖更充分理解。
相關申請案之交叉參考
本申請案為根據35 U.S.C. § 119(e)主張2017年6月7日申請之美國臨時申請案第62/516,536號之優先權的申請案，出於所有目的該申請案以全文引用的方式併入本文中。
儘管本文展示及描述了此揭示內容之各種實施例及態樣，但對熟習此項技術者顯而易見的是，僅藉助於實例提供此類實施例及態樣。熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例之各種替代方案可用於實踐本發明。
本文中所使用之各部分標題僅出於組織目的且不應理解為限制所描述之主題。出於任何目的，申請案中所引用之所有文獻或部分文獻(包括(但不限於)專利、專利申請案、文章、書籍、手冊及論文)係以全文引用的方式明確地併入本文中。
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用此項技術中的組織培養、免疫學、分子生物學及細胞生物學之習知技術。參見例如Sambrook及Russell編 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版；Ausubel等人編系列 (2007) Current Protocols in Molecular Biology; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)系列；MacPherson等人 (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人 (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow及Lane編 (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique，第5版；Gait編 (1984) Oligonucleotide Synthesis；美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編 (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編 (1984) Transcription and Translation；IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller及Calos編 (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides編(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer及Walker編(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg等人編(1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual，第3版 (2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)。 I. 定義
除非上下文另外明確指示，否則如在本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「所述(the)」包括複數個指示物。因此，例如，提及「一海藻糖類似物」包括一或多種海藻糖類似物。當意謂複數個海藻糖類似物時，複數個海藻糖類似物中之每一者可相同或不同。
術語「分離(isolate/isolating/isolated)」欲意謂一組分(例如，化合物或細胞)自自然界或實驗室混合物中伴隨其之所有或一些組分分開。
術語「富集(enrich/enriching/enriched)」欲意謂對具有組分(例如，化合物或細胞)之混合物進行處理以與處理之前相比增加該組分之濃度。舉例而言，自包括T細胞及其他類型之細胞之細胞混合物富集T細胞意謂細胞之混合物經處理，例如離心，使得富集之前的每單位體積之T細胞之濃度或數目(例如，105 個T細胞/毫升)在富集處理之後增加以超過105 個T細胞/毫升。
術語「培養」或「細胞培養」意謂在人造活體外環境中維持及/或生長細胞。本文中所使用之「細胞培養系統」係指可使一群細胞生長的培養條件。本文中所使用之「培養基」係指用於細胞之培養、生長或增殖的培養液。
本文中所使用之「組合物」係指任何化合物(包括任何化學化合物)及細胞，該等細胞可為活的或殺死的。舉例而言，在產生具有降低之表面海藻糖基化的T細胞之情形中，組合物可含有提供至所培養細胞之海藻糖類似物。在另一實例中，在提供授受細胞療法或治療癌症之情形中，組合物可含有一組細胞，例如具有降低之表面海藻糖基化的T細胞。用於任何情形中之組合物可具有一或多種組分。
術語「T淋巴球」或「T細胞」係指在細胞介導的免疫中起作用之一種類型的淋巴球。T細胞之類型包括(但不限於)效應T細胞、輔助T細胞、細胞毒性殺手T細胞、記憶T細胞、調節T細胞、自然殺手T細胞、黏膜相關恆定T細胞、α β T細胞及γ δ T細胞。同樣，T細胞可視其上之一或多種特定標記之存在或水準而定來進一步細分。
如本文中所使用之術語「個體(individual/subject)」係指人類、哺乳動物及本發明中之其他動物。在一些情況下，為人類之個體可為患者。
在疾病或病況之情形中，「治療」意謂至少實現與折磨個體之病況相關之症狀的改善，其中在廣義上改善用於係指至少與治療之病況(例如，癌症)相關之參數(例如，症狀)之量值的降低。由此，治療亦包括以下之情況：病理性病況或至少與其相關之症狀得到完全抑制，例如預防發生，或停止，例如終止，使得宿主不再罹患該病況或不再罹患至少表徵該病況之症狀。因此治療包括：(i)預防，亦即降低產生臨床症狀之風險，包括使臨床症狀不發展，例如預防至有害狀態之疾病進展；(ii)抑制，亦即遏制臨床症狀之發展或進一步發展，例如減少或完全抑制活動性疾病，例如以便減小腫瘤負載，該減小可包括消除可偵測的癌性細胞；及/或(iii)減輕，亦即使臨床症狀消退。
「投與(Administration/administering)」以及類似者係指直接投與，其可活體外投與至細胞、活體內投與至細胞、藉由醫療專業人士投與至個體；及/或間接投與兩者，其可為開出本發明之組成物處方的動作。當在本文中參看細胞使用時，係指將組合物引入該細胞。通常，投與有效量，該量可藉由熟習此項技術者來測定。舉例而言，當將一或多種海藻糖類似物投與至在培養基中培養之細胞時，海藻糖類似物的有效量定義為足以產生所需效果，例如產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的量。可使用任何投與方法。化合物(例如，一或多種海藻糖類似物)可藉由例如將化合物添加至細胞培養基或活體內投與(例如，饋料)而投與至細胞。向個體投與可藉由例如饋料、血管內注射、直接瘤內遞送以及類似者來達成。
投與可意謂向個體經口投與、以栓劑形式投與、局部接觸、靜脈內、腹膜內、肌肉內、病灶內、鞘內、鼻內或皮下投與或移植緩慢釋放裝置(例如，微滲透泵)。投與係藉由任何途徑，包括非經腸及經黏膜(例如，經頰、舌下、經齶、經牙齦、經鼻、經陰道、經直腸或經皮)投與。非經腸投與包括例如靜脈內、肌肉內、小動脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內及顱內投與。其他遞送模式包括(但不限於)使用脂質體調配物、靜脈內輸注、經皮貼片等。「共投與」意謂，在投與一或多種額外療法時、恰好其之前或恰好其之後投與本文所描述之組合物，該一或多種額外療法例如癌症療法，諸如化療、激素療法、放射療法或免疫療法。本發明化合物可單獨投與或可共投與至個體。共投與意欲包括同時或依序以個別或組合(超過一種組合物)形式投與組合物。因此，製劑亦可在需要時與其他活性物質組合(例如，以減少代謝降解)。
如本文中所使用之術語「癌症」係指涵蓋原發性癌症及轉移性癌症的泛稱。「原發性癌症」意謂一組腫瘤細胞，其獲得癌細胞之至少一種特性特徵，然而尚未侵入相鄰組織且一起保持在位於原發源位置處的腫瘤中。「轉移性癌症」意謂一組腫瘤細胞，其源於原發性癌症之細胞，其已侵入該原發性癌症周圍之組織，在身體中擴散，黏附在新的遙遠位置處且生長成新的腫瘤。本發明之原發性及轉移性癌症之實例包括(但不限於)乳房癌瘤、食道癌、結腸直腸癌、胰臟癌、胃癌瘤、(腸胃基質組織) GIST、肝細胞癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、小腸癌、大腸癌、胃癌、淋巴瘤、前列腺癌、睪丸癌、甲狀腺癌瘤、惡性黑色素瘤、葡萄膜黑素瘤、多發性骨髓瘤、間皮瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、神經膠母細胞瘤、肉瘤、神經膠瘤，或其他腦瘤、頭/頸及其他腸胃及生殖細胞腫瘤、血液惡性病、白血病、淋巴瘤，例如慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、急性骨髓白血病、多發性骨髓瘤、難治性濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、緩慢B細胞淋巴瘤、B細胞惡性病、皮膚癌症(包括黑素瘤)、骨骼癌症、上皮癌症、腎細胞癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、神經管胚細胞瘤、滑膜肉瘤及/或間皮瘤。
如本文中所使用之「癌細胞」係指展現贅生性細胞表現型之細胞，其可藉由例如以下中之一或多者表徵：異常細胞生長、異常細胞增殖、失去密度依賴型生長抑制、非錨定依賴性生長潛能、在免疫功能不全的非人類動物模型中促進腫瘤生長及/或發展之能力及/或細胞轉化之任何合適指示。「癌細胞」可在本文中與「腫瘤細胞」或「癌性細胞」互換地使用，且涵蓋實體腫瘤、半實體腫瘤、原發性腫瘤、轉移性腫瘤以及類似者之癌細胞。
如本文中所使用之「抗腫瘤效應」或「抗癌效應」係指可表現為腫瘤體積減小、腫瘤生長抑制、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少、癌轉移數目減少、總存活期或無進展存活期增加、預期壽命增加或與腫瘤相關之各種生理症狀改善的生物效應。抗腫瘤效應亦可指預防腫瘤出現，例如疫苗。
如本文中所使用的可縮寫為PFS之術語「無進展存活期」係指根據經修訂國際工作組(International Working Group；IWG)對惡性淋巴瘤或任何原因死亡之反應標準，自治療日至疾病進展日的時間。
可縮寫為OS之術語「總存活期」定義為自治療日至死亡日的時間。
如本文中所使用之術語「授受細胞療法」或「授受細胞轉移」係指提供，例如將用於療法之細胞投與或移植至需要該療法之個體中。用於療法之細胞可源於相同個體或包括人類及非人類動物之另一個體。用於授受細胞療法或授受細胞轉移之細胞可包括T細胞。
根據本文所提供之方法，可向個體投與授受細胞療法。關於與授受細胞療法相關之方法及程序的一些實例可自例如WO2015120096、WO2015164675、WO2016011210、WO2016040441、WO2017070395及US20160158359找到，其之揭示內容以全文引用之方式明確地併入。授受細胞療法可向個體提供細胞混合物，該等細胞包括T細胞，尤其具有降低之表面海藻糖基化之T細胞。將向個體投與、可產生所需生理反應(例如，抑制或降低腫瘤生長)之T細胞的量定義為有效量。術語有效量及有效劑量可互換地使用。舉例而言，對於引起個體中之有利反應以治療疾病(例如，癌症)，有效量為減少、消除或減輕與病症相關之症狀的量，例如以便提供控制癌轉移、消除癌細胞及/或類似者。用於投與T細胞之有效量及時程可由熟習此項技術者憑經驗決定。投藥之劑量範圍為足夠大以產生所需效應之彼等劑量，其中疾病或病症之一或多種症狀受到影響(例如，降低或延遲)。劑量不應如此大以產生大量不利副作用，諸如非所需交叉反應、過敏性反應以及類似者。一般而言，劑量將隨年齡、病況、性別、疾病類型、疾病或病症之程度、投與途徑或其他藥物是否包括於療程中而變化，且可藉由熟習此項技術者來決定。在任何禁忌之情況下，可由個別醫師調整劑量。劑量可變化且可以每天一或多次劑量投藥來投與，持續一天或若干天。舉例而言，對於給定參數，相較於治療前，有效量將展示至少5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或至少100%之增加或減少。功效亦可表述為增加或減少「倍數(-fold)」。舉例而言，相比於對照或治療前，治療有效量可具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍效應。精確劑量及調配物將視療法目的而定且將使用已知技術由熟習此項技術者確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3卷, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第20版, Gennaro編(2003)；及Pickar, Dosage Calculations (1999))。
如本文中所使用之術語「降低之表面海藻糖基化」係指連接至細胞(例如T細胞)上之表面糖蛋白之海藻糖之抑制。此類「海藻糖之抑制」不同於其中海藻糖類似物置換表面糖蛋白上之海藻糖的海藻糖類似物之競爭性併入。
「對照」或「普通」樣本(例如，對照細胞或普通細胞)係指用作與測試樣本比較之參考物(通常已知的參考物)的樣本。舉例而言，測試樣本可為經修飾T細胞，特定言之，具有降低之表面海藻糖基化的T細胞。此類T細胞可藉由本文所揭示之方法產生，例如經由在海藻糖類似物存在下培養T細胞或自投與有海藻糖類似物之動物獲得T細胞。此等經修飾T細胞可與在無海藻糖類似物存在下培養或自未投與有海藻糖類似物之動物獲得的對照或普通T細胞相比以便確認降低。對照值亦可在暴露或投與海藻糖類似物之前自相同個體，例如自先前獲得之樣本獲得。
如本文中所使用之術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指任何適合物質，其提供醫藥學上可接受化合物以供向個體投與所關注化合物。「醫藥學上可接受之賦形劑」可涵蓋被稱作醫藥學上可接受之稀釋劑、醫藥學上可接受之添加劑及醫藥學上可接受之載劑的物質。術語「載劑」或「醫藥學上可接受之載劑」係指與海藻糖類似物一起投與的稀釋劑、佐劑或賦形劑。此類醫藥載劑可為液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。載劑可為鹽水、阿拉伯膠、明膠、澱粉糊、滑石、角蛋白、膠態二氧化矽、尿素以及類似物。另外，可使用助劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑及著色劑。在一個實施例中，當投與至動物時，海藻糖類似物或組合物及醫藥學上可接受之載劑為無菌的。當海藻糖類似物經靜脈內投與時，水為較佳載劑。亦可使用鹽水溶液及右旋糖水與甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合醫藥載波亦包括賦形劑，諸如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，本發明組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。
如本文中所使用，「可水解酯基」係指任何習知酯基，其可活體內水解得到羥基。例示性可水解酯基包括-OC(O)H、-OC(O)C1 -C10 烷基、-OC(O)C2 -C10 烯基、-OC(O)C2 -C10 炔基、-OC(O)芳基、-OC(O)雜環、-OC(O)C1 -C10 伸烷基(芳基)、-OC(O)C2 -C10 伸烯基(芳基)、-OC(O)C2 -C10 伸炔基(芳基)、-OC(O)C1 -C10 伸烷基(雜環)、-OC(O)C2 -C10 伸烯基(雜環)、-OC(O)C2 -C10 伸炔基(雜環)、-OC(O)CH2 O(CH2 CH2 O)n CH3 及-OC(O)CH2 CH2 O(CH2 CH2 O)n CH3 ，其中各n為獨立地選自0-5之整數。
如本文中所使用，除非上下文另外指示，否則「炔基海藻糖過乙酸酯」係指在位置R1 - 4 上具有乙酸酯基團的炔基海藻糖(5-乙炔基阿拉伯糖)之任何或所有形式(參見式I及II，見下文)，其包括四乙酸6-乙炔基-四氫-2H-哌喃-2,3,4,5-四基酯(包括(2S,3S,4R,5R,6S)及(2R,3S,4R,5R,6S)異構體)及四乙酸5-((S)-1-羥基丙-2-炔基)-四氫呋喃-2,3,4-三基酯(包括(2S,3S,4R,5R)及(2R,3S,4R,5R)異構體)；及醛醣形式。術語「炔基海藻糖三乙酸酯」、「炔基海藻糖二乙酸酯」及「炔基海藻糖單乙酸酯」分別係指所指示的炔基海藻糖之三乙酸酯、二乙酸酯及單乙酸酯形式。
除非上下文另外指示，除非另外規定，否則術語「烷基」係指具有1至20個碳原子(及其中碳原子之範圍及特定數目之所有組合及子組合)之未經取代之飽和直鏈或分支鏈烴。1至3、1至8或1至10個碳原子之烷基為較佳的。烷基之實例為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基及3,3-二甲基-2-丁基。
在取代時，烷基(無論單獨還是作為另一基團之一部分)可經一或多個基團，較佳1至3個基團(及選自鹵素之任何額外取代基)取代，該一或多個基團包括(但不限於)：鹵素、-O-(C1 -C8 烷基)、-O-(C2 -C8 烯基)、-O-(C2 -C8 炔基)、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、=O、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN；其中各R'獨立地選自-H、-C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基，或芳基。
除非上下文另外指示，否則術語「烯基」及「炔基」係指未經取代或視情況經取代之(經指示之)具有2至20個碳原子(及其中之碳原子之範圍及特定數目之所有組合及子組合)之直鏈及分支鏈碳鏈，其中2至3、2至4、2至8或2至10個碳原子為較佳的。烯基鏈在該鏈中具有至少一個雙鍵且炔基鏈在該鏈條中具有至少一個三鍵。烯基之實例包括(但不限於)乙烯(ethylene)或乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、及2,3-二甲基-2-丁烯基。炔基之實例包括(但不限於)炔系、炔丙基、乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基及3-甲基-1-丁炔基。
在經取代時，烯基及炔基(無論單獨還是作為另一基團之一部分)可經一或多個基團，較佳1至3基團(及選自鹵素之任何額外取代基)取代，該一或多個基團包括(但不限於)：鹵素、-O-(C1 -C8 烷基)、-O-(C2 -C8 烯基)、-O-(C2 -C8 炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、=O、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1 -C8 烷基、-C2 -C烯基、-C2 -C8 炔基或芳基。
除非上下文另外指示，否則術語「伸烷基」係指具有1至20個碳原子(及其中碳原子之範圍及特定數目之所有組合及子組合)的未經取代之飽和分支鏈或直鏈烴基，其中1至8或1至10個碳原子為較佳的，且具有藉由自親本烷烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而衍生之兩個單價基團中心。典型的伸烷基包括(但不限於)亞甲基、伸乙基、丙烯、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基、伸癸基、1,4-伸環己基以及類似基團。
在經取代時，伸烷基(無論單獨還是作為另一基團之一部分)可經一或多個基團，較佳1至3個基團(及選自鹵素之任何額外取代基)取代，該一或多個基團包括(但不限於)：鹵素、-O-(C1 -C8 烷基)、-O-(C2 -C8 烯基)、-O-(C2 -C8 炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、=O、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基或-芳基。
「伸烯基」係指烯基(如上文所描述)之不飽和、分支鏈或直鏈或環烴基團，且具有藉由自親本烯烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而衍生的兩個單價基團中心。「伸烯基」可為未經取代的或視情況經取代(經指示)，如上文針對烯基所描述。在一些實施例中，「伸烯基」為未經取代的。
「伸炔基」係指炔基(如上文所描述)之不飽和、分支鏈或直鏈或環烴基團，且具有藉由自親本炔之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而衍生的兩個單價基團中心。「伸炔基」可為未經取代的或視情況經取代(經指示)，如上文針對炔基所描述。在一些實施例中，「伸炔基」為未經取代的。
除非上下文另外指示，否則術語「芳基」係指藉由自親本芳環系統之單個碳原子移除一個氫原子而衍生的6-20個碳原子(及其中碳原子之範圍及特定數目之所有組合及子組合)之經取代或未經取代之單價芳族烴基團。一些芳基在例示性結構中表示為「Ar」。典型的芳基包括(但不限於)衍生自苯、經取代之苯、苯基、萘、蒽、聯二苯及其類似物之基團。
芳基(無論單獨還是作為另一基團之一部分)可視情況經一或多個，較佳1至5個或甚至1至2個基團取代，該等基團包括(但不限於)：鹵素、-C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基、-O-(C1 -C8 烷基)、-O-(C2 -C8 烯基)、-O-(C2 -C8 炔基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-NO2 、-NH2、-NH(R')、-N(R')2 及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基或芳基。
除非上下文另外指示，否則術語「雜環」係指具有3至7或3至10個環原子(亦稱為環成員) (及其中之雜原子及碳原子之範圍及特定數目之所有組合及子組合)的經取代或未經取代之單環環系統，其中至少一個環原子為選自N、O、P或S之雜原子。雜環可具有獨立地選自N、O、P或S之1至4個環雜原子。雜環中之一或多個N、C或S原子可經氧化。單環雜環較佳具有3至7個環成員(例如，2至6個碳原子及獨立地選自N、O、P或S之1至3個雜原子)。包括雜原子之環可為芳族環或非芳族環。除非另外說明，否則雜環在產生穩定結構之任何雜原子或碳原子處與其側基連接。
雜環描述於Paquette,「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」 (W.A. Benjamin, New York, 1968), 尤其第1、3、4、6、7及9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」 (John Wiley & Sons, New York, 1950至今), 尤其第13、14、16、19及28卷；及J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566中。「雜環」基團之實例包括(藉助於實例而非限制性的)吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、海藻糖基、氮丙啶基、氮雜環丁基、環氧乙基、環氧丙烷基及四氫呋喃基。
在經取代時，雜環基(無論單獨還是作為另一基團之一部分)可經一或多個基團，較佳1至2個基團取代，該一或多個基團包括(但不限於)：-C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基、鹵素、-O-(C1 -C8 烷基)、-O-(C2 -C8 烯基)、-O-(C2 -C8 炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基或-芳基。
藉助於實例而非限制性的，碳鍵結之雜環可在以下位置處鍵結：吡啶之位置2、3、4、5或6；噠嗪之位置3、4、5或6；嘧啶之位置2、4、5或6；吡嗪之位置2、3、5或6；呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫化吡咯之位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5；異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5；氮丙啶之位置2或3；或氮雜環丁烷之位置2、3或4。例示性碳鍵結之雜環可包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
藉助於實例而非限制，氮鍵結之雜環可鍵結在氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉或1H-吲唑之位置1處；異吲哚或異吲哚啉之位置2處；以及嗎啉之位置4處。更通常，氮鍵結之雜環包括1-氮丙啶、1-吖丁啶基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。
除非另外指出，否則術語「碳環」係指具有3至6個環原子(及其中碳原子之範圍及特定數目之所有組合及子組合)的經取代或未經取代、飽和或不飽和非芳族單環環系統，其中所有環原子為碳原子。
在取代時，碳環基團(無論單獨還是作為另一基團之一部分)可經例如一或多個基團，較佳1或2個基團(及選自鹵素之任何額外取代基)取代，該一或多個基團包括(但不限於)：鹵素、C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基、-O-(C1 -C8 烷基)、-O-(C2 -C8 烯基)、-O-(C2 -C8 炔基)、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、=O、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1 -C8 烷基、-C2 -C8 烯基、-C2 -C8 炔基或芳基。
單環碳環取代基之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環庚基、環辛基、-1,3-環己二烯基、-1,4-環己二烯基、-1,3-環庚二烯基、-1,3,5-環庚三烯基及-環辛二烯基。
當任何變數在任何成分或任何式中出現超過一次時，其定義在每次出現時獨立於其各其他出現時的定義。取代基及/或變數之組合僅在此類組合產生穩定化合物時為容許的。
除非上下文另外指示，否則連字符(-)表示與側接分子之連接點。因此，術語「-(C1 -C10 伸烷基)芳基」或「-C1 -C10 伸烷基(芳基)」係指如本文所定義之C1 -C10 伸烷基，其中伸烷基連接至伸烷基之任一碳原子處的側接分子及且鍵結至伸烷基之碳原子之氫原子中之一者經如本文所定義之芳基置換。
當特定基團「經取代」時，該基團可具有一或多個取代基，較佳一至五個取代基，更佳一至三個取代基，最佳一至兩個取代基，該等取代基獨立地選自取代基之清單。然而，基團可通常具有選自鹵素之任何數目之取代基。
希望分子中之特定位置處之任何取代基或變數之定義獨立於其在該分子其他位置處之定義。應瞭解，關於本發明化合物之取代基及取代模式可由一般熟習此項技術者選擇，以提供活性且化學穩定並可易於藉由此項技術中已知之技術以及本文所闡述之彼等方法合成的化合物。
術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或洲政府之監管機構批准，或在美國藥典或適用於動物，且更特定言之適用於人類的其他一般公認之藥典中列出。術語「醫藥學上相容之成分」係指與海藻糖類似物一起投與之醫藥學上可接受之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。
海藻糖類似物通常基本上不含非所需雜質。此意謂該類似物通常至少約50% w/w (重量/重量)純，且基本上無干擾蛋白質及其他雜質。有時試劑至少約80% w/w純且更佳至少90%或約95% w/w純。使用習知純化技術，可獲得至少99% w/w之均相產品。 II. 海藻糖類似物
在本文中之各種實施例中之任一者中，海藻糖類似物可具有下式(I )或(II )：或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式，其中式(I )或(II )中之每一者可為α或β變旋異構物或對應的醛醣形式； 其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ， 或 其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為炔基。
在一些實施例中，R2 為-F。
在一些實施例中，R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，海藻糖類似物具有式(I )或(II )，其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，海藻糖類似物具有式(I )或(II )，其中R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，可水解酯基為-OC(O)C1 -C10 烷基。在一些所選實施例中，可水解酯基為-OC(O)CH3 。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為-F，R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R2 為-F，R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。在式(I )或(II )之一個特定實施例中，R2 為-F且R1 、R3 及R4 中之每一者為-OH。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R5 為-C≡CH，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R5 為-C≡CH，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。在式(I )或(II )之一個特定實施例中，R5 為-C≡CH且R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者為-OH。在式(I )或(II )之另一特定實施例中，R5 為-C≡CH且R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者為-OAc。
在一些所選實施例中，海藻糖類似物具有下式：， 或其醛醣形式，其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者如本文所定義及描述。
在一些所選實施例中，海藻糖類似物為2-去氧-2-氟-L-海藻糖。
在一些所選實施例中，海藻糖類似物為炔基海藻糖過乙酸酯。炔基海藻糖過乙酸酯可為炔基海藻糖四乙酸酯、炔基海藻糖三乙酸酯、炔基海藻糖二乙酸酯、炔基海藻糖單乙酸酯或其組合。在一個例示性實施例中，海藻糖類似物為四乙酸(3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基四氫-2H-哌喃-2,3,4,5-四基酯或三乙酸5-((S)-1-羥基丙-2-炔-1-基)四氫呋喃-2,3,4-三基酯。
在各種實施例中之任一者中，式(I )及(II )之海藻糖類似物之內環氧可經硫置換。
本文亦提供式I及II化合物之醫藥學上可接受之鹽及溶劑合物形式。因此，在本文中所提供之各種實施例中之任一者中，可使用所揭示化合物之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式。溶劑合物通常不顯著地更改化合物之生理活性且因此可充當藥理學等效物。一種類型之溶劑合物為水合物。
在一些態樣中，海藻糖類似物可以至少10 mM之濃度溶於調配物緩衝液(例如，水性調配物緩衝液)中。在一些實施例中，海藻糖類似物可以至少100 mM之濃度溶於調配物緩衝液中。在一些態樣中，海藻糖類似物可以至少100 µg/ml、至少1 mg/ml、至少50 mg/ml、至少約100 mg/ml、至少約200 mg/ml或至少約300 mg/ml之濃度溶於調配物緩衝液(例如，水性調配物緩衝液)中。 III. 產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法
在一些態樣中，本文提供產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法。III-1. 活體外或離體產生方法
在一些態樣中，提供產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的活體外或離體方法。方法可包括在本文中所揭示之海藻糖類似物存在下在細胞培養基中培養T細胞及收集具有降低之表面海藻糖基化之T細胞。相較於在無海藻糖類似物存在下培養之T細胞，由該方法產生之T細胞可具有降低之表面海藻糖基化。由本文中所揭示之方法產生之此類T細胞可用於治療目的，諸如授受細胞療法或癌症治療。因此，至少在一些實施例中，具有降低之表面海藻糖基化之T細胞被稱為「治療性T細胞」。
在一些實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物可為式(I )或(II )：或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式，其中式(I )或(II )中之每一者可為α或β變旋異構物或對應的醛醣形式； 其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ， 或 其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為炔基。
在一些實施例中，R2 為-F。
在一些實施例中，R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物具有式(I )或(II )，其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物具有式(I )或(II )，其中R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，可水解酯基為-OC(O)C1 -C10 烷基。在一些所選實施例中，可水解酯基為-OC(O)CH3 。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為-F，R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R2 為-F，R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。在式(I )或(II )之一個特定實施例中，R2 為-F且R1 、R3 及R4 中之每一者為-OH。
在式(I)或(II)之一些所選實施例中，其中R5 為-C≡CH，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R5 為-C≡CH，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。在式(I )或(II )之一個特定實施例中，R5 為-C≡CH且R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者為-OH。在式(I )或(II )之另一特定實施例中，R5 為-C≡CH且R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者為-OAc。
在一些所選實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物具有下式：， 或其醛醣形式，其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者如本文所定義及描述。
在一些所選實施例中，海藻糖類似物為2-去氧-2-氟-L-海藻糖。
在一些所選實施例中，海藻糖類似物為炔基海藻糖過乙酸酯。炔基海藻糖過乙酸酯可為炔基海藻糖四乙酸酯、炔基海藻糖三乙酸酯、炔基海藻糖二乙酸酯、炔基海藻糖單乙酸酯或其組合。在一個例示性實施例中，海藻糖類似物為四乙酸(3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基四氫-2H-哌喃-2,3,4,5-四基酯或三乙酸5-((S)-1-羥基丙-2-炔-1-基)四氫呋喃-2,3,4-三基酯。
在各種實施例中之任一者中，式(I )及(II )之海藻糖類似物之內環氧可經硫置換。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法可包括在海藻糖類似物存在下在細胞培養基中培養T細胞的步驟。在一些實施例中，存在其他類型的細胞，例如存在於培養基中之紅血球。待培養之T細胞可自個體(例如，人類或非人類動物)獲得。替代地，待培養之T細胞可來自先前培養及/或儲存的細胞群。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞，其可用於需要此類療法之個體的授受細胞療法中。在T細胞及細胞群自樣本(諸如生物樣本，例如獲自或源於個體之樣本)分離的實施例中，個體可為需要細胞療法或將投與細胞療法之患者，亦即自體來源。替代地，T細胞及細胞群可自不需要授受性細胞療法之患者的供體分離(亦即同種異體來源)。供體可為健康人類或患有與需要細胞療法或將向其投與細胞療法之患者相同的病況或疾病之另一個患者。
在一些實施例中，獲自個體之細胞可為原代細胞(例如原代人類細胞)之混合物。樣本包括直接地獲自個體之組織、流體及其他樣本以及由一或多個處理步驟產生之樣本，該一或多個處理步驟諸如分離、離心、洗滌、培育及/或培養。生物樣本可為直接獲自生物學來源的樣本或經處理樣本。生物樣本包括(但不限於)體液，諸如血液、血漿、血清、組織及器官(諸如脾)樣本，其包括源於其之經處理樣本。例示性樣本包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織生檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸道相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎臟、胰臟、乳房、骨骼、前列腺、子宮頸、睪丸、卵巢、扁桃體或其他器官，及/或來源於其的細胞。在細胞療法(例如，授受細胞療法)之情形中，樣本包括自體及同種異體來源的樣本。在一些實施例中，細胞可獲自異種來源，例如小鼠、大鼠、非人類靈長類動物及豬。
在一些實施例中，根據本文中所揭示之方法所培養之細胞可源於現有細胞株，例如T細胞株。
在一些實施例中，用於培養之細胞或群體之分離可包括一或多個製備及分離步驟。在一些實例中，細胞可經洗滌、離心及/或在一或多種試劑存在下培育，以例如移除非所需組分、富集所需組分、溶解或移除對特定試劑敏感之細胞。在一些實施例中，基於一或多個特性，諸如密度、黏著性特性、大小、敏感性、表面標記物表現概況及/或對特定組分之抗性來分離細胞。
在自個體收集血球之一些實施例中，所收集血球可經洗滌，例如以移除血漿部分且將該等細胞置放於合適緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施例中，在洗滌之後，可將該等細胞再懸浮於此項技術中已知之各種生物相容緩衝液中。在某些實施例中，可移除血球樣本之組分，且可將該等細胞再懸浮於培養基中。在一些實施例中，方法可包括基於密度之細胞分離方法，諸如藉由裂解紅血球及離心由周邊血液製備白血球。
在一些實施例中，方法可包括基於在細胞中之表現或存在一或多種特定分子(諸如表面標記物，例如表面蛋白質)來分離不同細胞類型的步驟。在一些實施例中，可使用用於基於此類標記物分離之任何已知方法。在一些實施例中，分離可為基於親和力或免疫親和力之分離。舉例而言，在一些態樣中，分離包括基於一或多種標記物(典型地為細胞表面標記物)之細胞表現或表現量來分離細胞及細胞群，例如藉由與特異性結合至此類標記物的抗體或結合搭配物一起培育，隨後通常進行洗滌步驟且將已結合抗體或結合搭配物的細胞與尚未結合至抗體或結合搭配物的彼等細胞分離。
在一些實施例中，可進一步富集T細胞亞型中之一或多者。在一些實施例中，T細胞亞型可藉由一或多種特定標記物(諸如T細胞上之表面標記物)之存在或含量來測定。在一些情況下，此類標記物為在T細胞之某些群體(諸如非記憶細胞)上不存在或以相對較低含量表現但在T細胞之某些其他群體(諸如記憶細胞)上存在或以相對較高含量表現的彼等物。在一個實施例中，對細胞(諸如CD8+ 細胞或T細胞，例如CD3+ 細胞)富集對於CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及/或CD62L呈陽性或表現高表面水準之該等物的細胞(亦即，陽性選擇)，及/或耗盡對於CD45RA呈陽性或表現高表面水準之該物的細胞(例如，陰性選擇)。在一些實施例中，對細胞富集或耗盡對於CD122、CD95、CD25、CD27及/或IL7-Ra (CD127)呈陽性或表現高表面水準之該等物的細胞。在一些實例中，對CD8+ T細胞富集對於CD45RO呈陽性(或對CD45RA為陰性)且對於CD62L呈陽性的細胞。
在一些實施例中，本文中所描述之所需細胞群可經由流式細胞測量術收集及富集(或耗盡)，其中對多個細胞表面標記物染色之細胞攜載於一流體流中。在一些實施例中，原代T細胞群或所產生之T細胞可經由製備型規模(FACS)分選收集及富集(或耗盡)。在一些實施例中，抗體或結合搭配物經一或多種可偵測標記物標記，以促進針對陽性及/或陰性選擇進行的分離。舉例而言，分離可基於與經螢光標記之抗體的結合。在一些實例中，基於對一或多種細胞表面標記物具有特異性之抗體或其他結合搭配物之結合的細胞分離攜載於一流體流中，諸如藉由螢光活化細胞分選(FACS)，包括製備型規模(FACS)及/或微機電系統(MEMS)晶片，該等方法例如與流式細胞學偵測系統組合。此類方法允許基於多種標記物同時進行陽性及陰性選擇。
分離無需使得對特定細胞群或表現特定標記物之細胞100%富集或移除。舉例而言，特定類型之細胞(諸如表現標記物之彼等細胞)的選擇或富集係指增加此類細胞之數目或百分比，但無需使得不表現該標記物之細胞完全不存在。舉例而言，在一些實施例中，CD3+ T細胞群的選擇針對該群富集，但亦可含有一些剩餘或較小百分比之其他非選擇細胞，在一些情況下其可包括仍存在於富集群體中之其他非CD3+ T細胞及/或非T細胞群。在一些實施例中，具有降低之表面海藻糖基化的T細胞可具有人類周邊T細胞。
在一些實施例中，特定類型之細胞的分離或富集可在培養基中培養細胞群的步驟之前或之後執行。因此，在一些實例中，自樣本分離之原代細胞的混合物可經處理以分離或富集T細胞且移除(例如，減少數目)其他類型之細胞或組分(例如，血小板及紅血球)。接著，經富集T細胞群可繼續培養。替代地，在其他實例中，可將如自樣本分離之含有T細胞及其他類型之細胞或組分的細胞混合物在培養基中培養，而無需實質上分離或富集T細胞。在細胞群達到所需數目或實質上完成培養步驟之後，所培養細胞可經處理以分離或富集T細胞以供稍後使用，例如授受細胞療法或癌症治療。
在一些實施例中，所提供之方法可包括用於培養細胞及細胞群之各種步驟中之一或多者。在一些實施例中，方法可包括培養自樣本分離或獲自現有細胞株之細胞群的一或多個步驟。在一些替代實施例中，方法可包括培養自細胞混合物分離之細胞群的一或多個步驟，該細胞混合物如自樣本獲得及分離或自現有細胞株獲得。在此類實施例中之一些中，待培養之大部分細胞群(例如，總細胞群之至少20%或更多)可包括自先前細胞群分離或富集的T細胞。
在一些實施例中，待培養之複數個細胞通常可在容器中培養，諸如相同單元、腔室、孔、管柱、試管、試管組、管、小瓶、培養盤、袋，或用於培養或培育細胞的其他容器。
培養步驟可包括以下中之至少一或多者：培養、培育、刺激、活化、繁殖，包括藉由在刺激條件存在下培育，例如經設計以誘導群體中之細胞增殖、擴增、活化及/或存活的條件。
條件可包括以下中之一或多者：特定培養基、溫度、氧氣含量、二氧化碳含量、時間、試劑，該等試劑例如營養物、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，該等刺激因子諸如細胞介素、趨化激素、抗原、結合搭配物、融合蛋白質、重組可溶性受體及經設計以活化細胞的任何其他試劑。在一些實施例中，可將經設計以改變細胞特性的一或多種試劑添加至培養基。舉例而言，可將一或多種海藻糖類似物添加至培養基，以便改變細胞(特定而言，T細胞)之表面上的海藻糖基化之水準。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法包括藉由在海藻糖類似物存在下培養T細胞來修飾T細胞。可將海藻糖類似物添加至細胞培養基中。在某些實施例中，細胞培養基可含有濃度為約1 ng/mL至數mg/mL培養基的海藻糖類似物。在一些實施例中，培養基可含有以下濃度的海藻糖類似物：約1 ng/mL、約10 ng/mL、約50 ng/mL、約100 ng/mL、約150 ng/mL、約200 ng/mL、約250 ng/mL、約300 ng/mL、約350 ng/mL、約400 ng/mL、約450 ng/mL、約500 ng/mL、約550 ng/mL、約600 ng/mL、約650 ng/mL、約700 ng/mL、約750 ng/mL、約800 ng/mL、約950 ng/mL、約1 µg/mL、約10 µg/mL、約50 µg/mL、約100 µg/mL、約150 µg/mL、約200 µg/mL、約250 µg/mL、約300 µg/mL、約350 µg/mL、約400 µg/mL、約450 µg/mL、約500 µg/mL、約550 µg/mL、約600 µg/mL、約650 µg/mL、約700 µg/mL、約750 µg/mL、約800 µg/mL、約950 µg/mL、約1 mg/mL、約2 mg/mL、約3 mg/mL、約4 mg/mL、約5 mg/mL培養基或更大，或前述之任何中間值。在一些其他實施例中，細胞培養基在細胞培養基中可含有最終濃度為約1 nM至數mM之海藻糖類似物。在一些實施例中，培養基在細胞培養基中可含有最終濃度為以下之海藻糖類似物：約1 nM、約10 nM、約50 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約250 nM、約300 nM、約350 nM、約400 nM、約450 nM、約500 nM、約550 nM、約600 nM、約650 nM、約700 nM、約750 nM、約800 nM、約950 nM、約1 µM、約10 µM、約50 µM、約100 µM、約150 µM、約200 µM、約250 µM、約300 µM、約350 µM、約400 µM、約450 µM、約500 µM、約550 µM、約600 µM、約650 µM、約700 µM、約750 µM、約800 µM、約950 µM、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約4 mM、約5 mM或更大，或前述之任何中間值。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法包括用一或多種T細胞活化試劑活化T細胞，以產生經活化T細胞群。一或多種適合T細胞活化試劑之任何組合可用於產生經活化T細胞群，該等試劑包括(但不限於)抗體或其功能片段，其靶向T細胞刺激或共刺激分子(例如，抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD28抗體或其功能片段，濃度為約1 ng/mL至約100 ng/mL)、T細胞細胞介素(例如，任何經分離、野生型或重組細胞介素，諸如：介白素1 (IL-1)、介白素2 (IL-2)、介白素4 (IL-4)、介白素5 (IL-5)、介白素7 (IL-7)、介白素15 (IL-15)、腫瘤壞死因子α (TNFα)，濃度為約1 ng/mL至約100 ng/mL)，或任何其他適合有絲分裂促進劑(例如，十四醯基佛波醇乙酸酯(TPA)、植物凝血素(PHA)、伴刀豆球蛋白A (conA)、脂多糖(LPS)、美洲商陸有絲分裂促進劑(PWM)，其呈任何所需濃度)或呈任何所需濃度的T細胞刺激或共刺激分子之天然配體。在一些較佳實施例中，抗CD3抗體(或其功能片段)、抗CD28抗體(或其功能片段)或抗CD3及抗CD28抗體之組合可根據刺激T淋巴球群體的步驟使用。
在一些實施例中，在完成培養時或之前約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天或更多天，將細胞進行培養。在一些實施例中，可將細胞繼代培養一或多次，亦即在完成培養之前，將所培養細胞中之至少一些自先前培養基轉移至新培養基。在一些其他實施例中，可在完成培養之前培養細胞一次。在整個培養時段期間，可一次或多次向細胞提供添加至培養基之任何試劑。
在一些實施例中，適用於本文中之方法的所培養T細胞之濃度可為約1.0-10.0×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，所培養T細胞之濃度可為約1.0-2.0×106 個細胞/毫升、約1.0-3.0×106 個細胞/毫升、約1.0-4.0×106 個細胞/毫升、約1.0-5.0×106 個細胞/毫升、約1.0-6.0×106 個細胞/毫升、約1.0-7.0×106 個細胞/毫升、約1.0-8.0×106 個細胞/毫升、約1.0-9.0×106 個細胞/毫升或約1.0-10.0×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，所培養T細胞之濃度可為約1.0-2.0×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，所培養T細胞之濃度可為約1.0-1.2×106 個細胞/毫升、約1.0-1.4×106 個細胞/毫升、約1.0-1.6×106 個細胞/毫升、約1.0-1.8×106 個細胞/毫升或約1.0-2.0×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，淋巴球之濃度可為至少約1.0×106 個細胞/毫升、至少約1.1×106 個細胞/毫升、至少約1.2×106 個細胞/毫升、至少約1.3×106 個細胞/毫升、至少約1.4×106 個細胞/毫升、至少約1.5×106 個細胞/毫升、至少約1.6×106 個細胞/毫升、至少約1.7×106 個細胞/毫升、至少約1.8×106 個細胞/毫升、至少約1.9×106 個細胞/毫升、至少約2.0×106 個細胞/毫升、至少約4.0×106 個細胞/毫升、至少約6.0×106 個細胞/毫升、至少約8.0×106 個細胞/毫升或至少約10.0×106 個細胞/毫升。
藉由上文所描述之方法培養之T細胞可具有降低之表面海藻糖基化。在一些態樣中，降低之表面海藻糖基化可指降低或抑制天然地存在於普通T細胞表面上之海藻糖基化的水準。在一些實施例中，T細胞上之表面海藻糖基化之降低不包括T細胞表面上之天然存在之海藻糖經人為提供至T細胞之海藻糖類似物取代。
藉由上文所描述之方法培養之T細胞可具有降低之表面海藻糖基化。在一些實施例中，藉由所提供方法培養及產生之T細胞上之平均表面海藻糖基化相較於在無海藻糖類似物存在下培養之T細胞(亦即對照T細胞)之平均表面海藻糖基化可具有至少約5%降低。在一些實施例中，藉由所提供方法培養及產生之T細胞上之平均表面海藻糖基化相對於在無海藻糖類似物存在下培養之對照T細胞之平均表面海藻糖基化可具有至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約99%、約100%降低。T細胞上之表面海藻糖基化之水準可藉由此項技術中可用之技術(例如流式細胞測量術)來測定。
在一些實施例中，可完成培養步驟且所培養細胞可繼續進行收集(或採集)至少一些所培養細胞的步驟。當所培養細胞之數目達到所需數目時，一旦經過培養之計劃時段，及/或培養T細胞上之平均表面海藻糖基化達到所需水準(例如，相對於對照T細胞之平均表面海藻糖基化至少降低5%或更多)時，可完成培養步驟。
在完成培養之後，可藉由此項技術中可用之技術來採集細胞。採集步驟可包括一或多個步驟，諸如離心、洗滌、移除非所需細胞或組分及分離所需類型之細胞，如此文中其他地方所描述。
在一些實施例中，由本文所描述之方法產生之細胞群(其包括具有降低之表面海藻糖基化之T細胞)可視情況經冷凍保存，使得細胞可在稍後日期使用，例如以供在授受細胞療法或癌症治療中投藥，或用於療法或治療之醫藥組合物之調配。此方法可包括用稀釋劑溶液洗滌及濃縮所需T細胞群(亦即具有降低之表面海藻糖基化的T細胞)之步驟。在一些實施例中，稀釋劑溶液可含有標準生理鹽水(0.9%鹽水)、PlasmaLyte A、5%右旋糖/0.45% NaCI鹽水溶液、人類血清白蛋白(HSA)，或其一組合。在一些實施例中，在解凍之後，可將HSA添加至經洗滌及濃縮之細胞以供改良細胞存活率及細胞回收率。在另一實施例中，洗滌溶液可為標準生理鹽水，且經洗滌及濃縮之細胞可補充有HSA (5%)。在一些實施例中，可產生冷凍保存混合物。冷凍保存混合物可包括含經稀釋細胞群之稀釋劑溶液及適合冷凍保存溶液。在一些態樣中，冷凍保存溶液可為與所產生T細胞之稀釋劑溶液混合的此項技術中可用之任何適合冷凍保存溶液。在一些實施例中，該方法亦包括冷凍該冷凍保存混合物之步驟。在一個態樣中，使用已限定冷凍週期在任何所需細胞濃度(例如，在約106 至108 個/毫升冷凍保存混合物之間)下在受控速率冷凍機中冷凍該冷凍保存混合物。方法亦可包括將冷凍保存混合物儲存於氣相液氮中之步驟。
在一些實施例中，由本文所提供之方法產生之T細胞(例如，具有降低之表面海藻糖基化之T細胞)可用於授受細胞療法或癌症治療中。舉例而言，可向需要療法或治療之個體投與所產生之T細胞。在一些實施例中，由本文所提供之方法產生之T細胞(例如，具有降低之表面海藻糖基化之T細胞)可用於調配可用於授受細胞療法或癌症治療中之醫藥組合物。III-2. 活體內產生方法
在一些態樣中，本文提供活體內產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法。方法可包括向動物提供海藻糖類似物及自動物獲得具有降低之表面海藻糖基化之T細胞。由此等方法產生之T細胞相對於存在於不提供海藻糖類似物之動物中或自該動物獲得之T細胞可具有降低之表面海藻糖基化。由本文中所揭示之方法產生之此類T細胞可用於治療目的，諸如授受細胞療法或癌症治療。因此，至少在一些實施例中，具有降低之表面海藻糖基化之T細胞被稱為「治療性T細胞」。
在一些實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物可為式(I )或(II )：或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式，其中式(I )或(II )中之每一者可為α或β變旋異構物或對應的醛醣形式； 其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ， 或 其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為炔基。
在一些實施例中，R2 為-F。
在一些實施例中，R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物具有式(I )或(II )，其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物具有式(I )或(II )，其中R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
在一些實施例中，可水解酯基為-OC(O)C1 -C10 烷基。在一些所選實施例中，可水解酯基為-OC(O)CH3 。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，R2 為-F，R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R2 為-F，R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。在式(I )或(II )之一個特定實施例中，R2 為-F且R1 、R3 及R4 中之每一者為-OH。
在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R5 為-C≡CH，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。在式(I )或(II )之一些所選實施例中，其中R5 為-C≡CH，R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。在式(I )或(II )之一個特定實施例中，R5 為-C≡CH且R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者為-OH。在式(I )或(II )之另一特定實施例中，R5 為-C≡CH且R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者為-OAc。
在一些所選實施例中，用於該方法中之海藻糖類似物具有下式：， 或其醛醣形式，其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者如本文所定義及描述。
在一些所選實施例中，海藻糖類似物為2-去氧-2-氟-L-海藻糖。
在一些所選實施例中，海藻糖類似物為炔基海藻糖過乙酸酯。炔基海藻糖過乙酸酯可為炔基海藻糖四乙酸酯、炔基海藻糖三乙酸酯、炔基海藻糖二乙酸酯、炔基海藻糖單乙酸酯或其組合。在一個例示性實施例中，海藻糖類似物為四乙酸(3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基四氫-2H-哌喃-2,3,4,5-四基酯或三乙酸5-((S)-1-羥基丙-2-炔-1-基)四氫呋喃-2,3,4-三基酯。
在各種實施例中之任一者中，式(I )及(II )之海藻糖類似物之內環氧可經硫置換。
本文所提供之方法可含有向動物提供海藻糖類似物之步驟。向動物提供海藻糖類似物可經由各種投藥方式進行。在一些實施例中，海藻糖類似物可使用標準投與技術來投與至哺乳動物，該等技術包括經口、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、經皮、肌肉內、鼻內、經頰、舌下或栓劑投與。在一些實施例中，非經腸投與細胞群。如本文中所使用，術語「非經腸」包括靜脈內、肌內、皮下、經直腸、經陰道及腹膜內投與。在一些實施例中，藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射，使用周邊全身性遞送將細胞群投與至個體。在一些實施例中，海藻糖類似物可經口投與至動物。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞，其可用於需要此類療法或治療之個體的授受細胞療法或癌症治療中。
在一些實施例中，細胞療法(例如使用T細胞之授受細胞療法或癌症治療)可藉由自體轉移來進行，其中自將接受該細胞療法或治療之個體或自源於此個體之樣本分離及/或以其他方式製備該等細胞。因此，在一些態樣中，海藻糖類似物可提供或投與至需要治療之個體(例如，患者)，且將分離及處理後具有降低之表面海藻糖基化之所得T細胞投與至同一個體。
在一些實施例中，細胞療法(例如使用T細胞之授受細胞療法或癌症治療)可藉由同種異體轉移來進行，其中自除將接受或最終接受細胞療法或治療之個體(例如，第一個體)以外的個體分離且/或以其他方式製備該等細胞。在此類實施例中，接著將細胞投與至相同物種之不同個體，例如第二個體。在一些實施例中，第一及第二個體在基因上相同。在一些實施例中，第一及第二個體在基因上類似。在一些實施例中，第一及第二個體在基因上不同。在一些實施例中，第一及第二個體不屬於相同物種，例如第一個體為人類且第二個體為非人類動物。自第二個體獲得之T細胞可經分離及處理以用於第一個體之療法或治療。
可向動物提供有效量的海藻糖類似物。有效量可指足以提供所需結果，亦即產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的海藻糖類似物之量。在一些實施例中，海藻糖類似物之有效量可在約1至約500 mg/kg體重之海藻糖類似物的範圍內。在經口提供或投與(例如經由饋入食物或水)海藻糖類似物之一些實施例中，投與至動物之海藻糖類似物之口服劑量可為約1 mg/kg至約1 g/kg動物體重，更典型地約5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg或50 mg/kg至約1 g/kg動物體重。在一些態樣中，投與至動物之劑量為約1 g、約5 g或約10 g至約150 g/天，或約1g、約5 g、約10 g、約15 g或約20 g至約60 g/天。在一些實施例中，海藻糖類似物可與適合於誘導饋入海藻糖類似物之動物中之表面海藻糖基化降低的呈任何所需量之食物或水一起提供。
在一些實施例中，用於本文所描述之方法中之海藻糖類似物可與一或多種額外的醫藥學上可接受之賦形劑或載劑一起同時或以任何次序依序共投與至動物。
在一些實施例中，海藻糖類似物或其組合物可在有或無中斷之情況下投與某一時段，例如一天至數天、一週至數週、一個月至數月或更長。在一些實施例中，海藻糖類似物或其組合物可以每天一次、每週一次、兩週一次或每月一次時程投與。
在一些實施例中，在達成所需結果時，可完成將海藻糖類似物提供或投與至動物，例如自動物獲得之T細胞之平均表面海藻糖基化相對於對照T細胞降低了任何數目的百分比，例如在約5%至約95%之間。
本文所提供之方法可包括自提供海藻糖類似物之動物獲得細胞(例如T細胞)之混合物的步驟。所獲得細胞可包括具有降低之表面海藻糖基化之T細胞。
藉由上文所描述之方法培養之T細胞可具有降低之表面海藻糖基化。在一些態樣中，降低之表面海藻糖基化可指降低或抑制天然地存在於普通T細胞表面上之海藻糖基化的水準。在一些實施例中，T細胞上之表面海藻糖基化之降低不包括T細胞表面上之天然存在之海藻糖經人為提供至T細胞之海藻糖類似物取代。
藉由上文所描述之方法產生之T細胞可具有降低之表面海藻糖基化。在一些實施例中，自提供海藻糖類似物之動物獲得的T細胞上之平均表面海藻糖基化相較於存在於不提供海藻糖類似物之動物或自該動物獲得的T細胞(亦即對照T細胞)之平均表面海藻糖基化可具有至少約5%降低。在一些其他實施例中，自提供海藻糖類似物之動物獲得的T細胞上之平均表面海藻糖基化，相對於存在於在測試或獲得對照T細胞之前的至少數小時、數天、數週、數月或更久不提供海藻糖類似物之動物或自該動物獲得的對照T細胞之平均表面海藻糖基化可具有至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約99%、約100%降低。T細胞上之表面海藻糖基化之水準可藉由此項技術中可用之技術(例如流式細胞測量術)來測定。
在一些實施例中，T細胞及細胞群可自樣本分離，該樣本諸如來自或源於提供海藻糖類似物之動物的生物樣本。樣本可包括直接地獲自動物之組織、流體及其他樣本。生物樣本可為直接獲自生物學來源的樣本或經處理樣本。生物樣本包括(但不限於)體液，諸如血液、血漿、血清、組織及器官(諸如脾)樣本，其包括源於其之經處理樣本。例示性樣本包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織生檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸道相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎臟、胰臟、乳房、骨骼、前列腺、子宮頸、睪丸、卵巢、扁桃體或其他器官，及/或源於其的細胞。
在一些實施例中，在自動物獲得T細胞及細胞群之後，可存在一或多個沖洗步驟，諸如分離、離心、洗滌、培育及/或培養所獲得細胞。在一些實施例中，含有T細胞之所獲得細胞群可經處理以分離或富集T細胞且移除(或減少)其他類型之細胞(例如，紅血球)及/或組分(例如，血小板)之數目。在一些實施例中，可使用此項技術中可用之技術在細胞培養基中培養所獲得細胞群或進一步富集之T細胞，以便維持細胞及/或增加細胞數以足夠稍後使用，例如授受細胞療法或癌症治療，或醫藥組合物之調配物。在一些實施例中，如自動物獲得或在自動物分離之後進一步培養的具有降低之表面海藻糖基化的T細胞可經儲存以供稍後使用，例如藉由此項技術中可用或如此文中其他地方所描述之冷凍保存技術。
在一些實施例中，藉由在此描述之活體內產生方法產生的具有降低之表面海藻糖基化的T細胞可用於授受細胞療法或癌症治療中。在一些實施例中，可將如自動物獲得或在自動物分離之後進一步培養的所產生T細胞投與至需要此類療法或治療的個體。在一些實施例中，如自動物獲得或在自動物分離之後進一步培養的所產生T細胞可用於調配可用於授受細胞療法或癌症治療中之醫藥組合物。在一些實施例中，動物為人類。
本文中所描述的產生方法可進一步包含修飾T細胞群之步驟。舉例而言，T細胞群可經包含編碼細胞表面受體之核酸分子的病毒載體轉導，以產生經轉導T細胞群。若干重組病毒已用作將基因物質遞送至細胞的病毒載體。可根據轉導步驟使用之病毒載體可為任何親嗜性或雙嗜性病毒載體，其包括(但不限於)重組逆轉錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體及重組腺相關病毒(AAV)載體。用於生長病毒載體之任何適合生長培養基及/或補充劑可根據此項技術中已知之方法用於病毒載體接種物中。在一個實施例中，病毒載體包含編碼細胞表面受體之異源基因。在一個特定實施例中，細胞表面受體能夠結合靶細胞表面上，例如腫瘤細胞表面上的抗原。 IV. 用於授受細胞療法或癌症治療之醫藥組合物
由上文所描述之產生方法產生的具有降低之表面海藻糖基化之細胞群或T細胞可經調配以供用於授受細胞療法或癌症治療中。所需T細胞(或治療性T細胞) (亦即具有降低之表面海藻糖基化之T細胞或具有此類T細胞之細胞混合物)可調配為醫藥組合物，該等醫藥組合物包含治療或預防有效量之所需T細胞及一或多種醫藥學上相容的(可接受的)成分。在一些態樣中，可提供治療性T細胞及醫藥賦形劑之醫藥組合物，其中有效量的T細胞與適用於投與至個體之賦形劑摻合。在較佳態樣中，T治療性細胞及其醫藥組合物經調配以用於投與至人類。因此，本發明提供一種醫藥組合物，其包含經調配以供投與至人類的具有降低之表面海藻糖基化之T細胞。所調配組合物通常可包含一或多種醫藥學上相容的(可接受的)賦形劑或載劑。
用於製備醫藥組合物之材料在所用量下可為無毒的。對一般熟習此項技術者將顯而易見的是，醫藥組合物中之活性成分之最佳劑量將視各種因素而定。相關因數包括(但不限於)動物之類型(例如人類)、投與方式、所採用之組合物及所治療之疾病或病況的嚴重程度。
根據本文中之揭示內容的醫藥組合物可呈液體之形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。在一些實施例中，液體可適用於藉由注射遞送。在用於藉由注射(如上文所描述)投與之組合物中，亦可包括界面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩衝液、安定劑及等張劑中之一或多者。
本文中所描述之醫藥組合物可呈允許將組合物投與至動物(例如人類)的任何形式。典型的投與途徑包括(但不限於)經口、非經腸及舌下投與。非經腸投與包括皮下注射、腹膜內注射、靜脈內、肌內、胸骨內注射或輸注技術。此等醫藥組合物可經調配以便允許具有降低之表面海藻糖基化之T細胞在將組合物投與至需要療法或治療之個體時有效。 V. 治療方法
在一些態樣中，本文提供向個體提供授受細胞療法的方法。方法可包括向需要細胞療法之個體投與具有降低之表面海藻糖基化的T細胞。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法向個體提供授受細胞療法。向個體提供授受細胞療法可包括向個體投與細胞混合物之步驟，該細胞混合物包括具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)。在一些實施例中，個體可能需要此類療法。在一些實施例中，向個體提供授受細胞療法亦可包括根據此文中其他地方所描述之活體外及活體內方法中之任一者產生用於療法之治療性T細胞的步驟。
在一些實施例中，授受細胞療法可選自由以下組成之群：腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)免疫療法、自體細胞療法、工程改造自體細胞療法(eACT™)、同種異體T細胞移植、非T細胞移植，及其任何組合。在一些實施例中，授受細胞療法可概括地包括選擇、活體外富集及向患者投與識別且能夠結合腫瘤細胞之自體或同種異體T細胞之任何方法。TIL免疫療法為一種授受性T細胞療法之類型，其中能夠浸潤腫瘤組織之淋巴球經分離、活體外富集及投與至患者。TIL細胞可為自體的或同種異體的。自體細胞療法為授受性T細胞療法，其涉及自患者分離能夠靶向腫瘤細胞之T細胞、活體外富集T細胞及將T細胞投與回至相同患者。同種異體T細胞移植可包括移植離體擴增之天然存在之T細胞或經基因工程改造之T細胞。工程改造自體細胞療法為授受性T細胞療法，其中患者自身淋巴球經分離、經基因修飾以表現腫瘤靶向分子、活體外擴增及投與回至患者。非T細胞移植可包括用非T細胞進行的自體或同種異體療法，該等非T細胞諸如(但不限於)自然殺手(NK)細胞。
在一些態樣中，本文所提供治療癌症之方法。方法可包括向需要此治療之個體投與具有降低之表面海藻糖基化的T細胞。在一些實施例中，方法亦可包括根據此文中其他地方所描述之活體外及活體內方法中之任一者產生用於治療之治療性T細胞的步驟。
在一些態樣中，根據本文中所揭示之方法用於授受細胞療法或癌症治療中之T細胞為相對於對照T細胞具有降低之表面海藻糖基化的治療性T細胞。在一些態樣中，降低之表面海藻糖基化可指降低或抑制天然地存在於普通T細胞表面上之海藻糖基化的水準。在一些實施例中，T細胞上之表面海藻糖基化之降低不包括T細胞表面上之天然存在之海藻糖經人為提供至T細胞之海藻糖類似物取代。
如早先所描述，在一些實施例中，用於授受細胞療法或癌症治療中的具有降低之表面海藻糖基化之T細胞可源於將接受療法或治療的相同個體(亦即自體療法或治療)或源於不同於將接受療法或治療之個體的個體(亦即同種異體療法或治療)。
在一些態樣中，根據本文中所揭示之方法用於授受細胞療法或癌症治療中之T細胞為相對於對照T細胞具有降低之表面海藻糖基化的治療性T細胞。在特定而言向人類患者投與自體療法或治療之一些實施例中，可根據本文中所揭示之活體外或活體內方法處理源於相同患者之T細胞以產生治療性T細胞。在此等實施例中，對照T細胞可指(1)存在於普通、健康人類或自其獲得之T細胞群，或(2)在產生治療性T細胞之前存在於相同患者或自其獲得之T細胞群。在特定而言在向人類患者投與同種異體療法或治療之一些其他實施例中，可根據本文中所揭示之活體外或活體內方法處理源於不為患者之供體的T細胞以產生治療性T細胞。在此等實施例中，對照T細胞可指在產生治療性T細胞之前存在於供體或自其獲得的T細胞群。在向人類患者投與同種異體療法或治療且用於療法或治療之治療性T細胞源於非人類動物(亦即供體動物)之一些其他實施例中，對照T細胞可指(1)存在於普通、健康非人類動物或自其獲得的T細胞群，或(2)在產生治療性T細胞之前存在於供體動物或自其獲得的T細胞群。
在一些實施例中，根據本文中所揭示之方法用於授受細胞療法或癌症治療中之T治療性細胞上之平均表面海藻糖基化相較於對照T細胞之平均表面海藻糖基化可具有至少約5%降低。在一些其他實施例中，自提供海藻糖類似物之動物獲得的T細胞上之平均表面海藻糖基化相對於對照T細胞之平均表面海藻糖基化可具有至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約99%、約100%降低。T細胞上之表面海藻糖基化之水準可藉由此項技術中可用之技術(例如流式細胞測量術)來測定。
在一些態樣中，用於提供授受細胞療法或治療癌症的本文中所揭示之方法意欲治療包括(但不限於)以下之任何疾病、病況及病症：乳房癌瘤、食道癌、結腸直腸癌、胰臟癌、胃癌瘤、GIST、肝細胞癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、小腸癌、大腸癌、胃癌、淋巴瘤、前列腺癌、睪丸癌、甲狀腺癌瘤、惡性黑色素瘤、葡萄膜黑素瘤、多發性骨髓瘤、間皮瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、神經膠母細胞瘤、肉瘤、神經膠瘤，或其他腦瘤、頭/頸及其他腸胃及生殖細胞腫瘤、血液惡性病、白血病、淋巴瘤，例如慢性淋巴球性白血病(CLL)、ALL、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓白血病、多發性骨髓瘤、難治性濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、緩慢B細胞淋巴瘤、B細胞惡性病、皮膚癌症(包括黑素瘤)、骨骼癌症、上皮癌症、腎細胞癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、尤文氏肉瘤、神經管胚細胞瘤、滑膜肉瘤及/或間皮瘤。
在一些態樣中，用於提供授受細胞療法或治療癌症的本文所揭示之方法具有向個體投與具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)的步驟。在一些實施例中，治療性T細胞可視情況用一或多種醫藥學上可接受之成分調配，呈待投與至動物(例如人類)的如本文中所描述之醫藥組合物形式。在一些態樣中，治療性T細胞或其醫藥組合物可(但不限於)經口、非經腸及舌下投與。非經腸投與包括皮下注射、腹膜內注射、靜脈內、肌內、胸骨內注射或輸注技術。此等醫藥組合物可經調配以便允許具有降低之表面海藻糖基化的T細胞在將組合物投與至動物後有效。
在一些實施例中，治療性T細胞或含有治療性T細胞之醫藥組合物可在癌細胞之位點或附近處投與(例如注射)，亦即局部投與。舉例而言，若在器官(例如肝)中發現癌症，則可將醫藥組合物注射至在肝中發現之癌細胞或癌細胞之附近(例如，距癌細胞之邊界數毫米至數公分之間)。在替代實施例中，可將治療性T細胞或醫藥組合物投與(例如注射)至患者的循環系統(例如，血管)，亦即全身性投與，使得治療性T細胞可經由患者的循環系統到達病理性細胞存在之靶位點處。在一些實施例中，治療性T細胞可進一步具有特異性結合所靶向之細胞或疾病(諸如腫瘤細胞或癌細胞)之細胞表面抗原的組分。因此，治療性T細胞在經由循環系統遞送之後可到達具有特異性之靶細胞處，且展現對該等靶細胞的治療效果。
在一些實施例中，具有降低之表面海藻糖基化的T細胞(亦即，治療性T細胞)或其醫藥組合物可以可有效地獲得所需結果或效果，例如治療疾病或病況的量(諸如醫藥學上有效量)投與。因此，在一些實施例中，投與方法包括以有效量向需要授受細胞療法或癌症治療之個體投與治療性T細胞或其醫藥組合物。在一些實施例中，治療功效可藉由定期評估所治療之個體來監測。對於經數天或更長時間之重複投與，視病況而定，重複治療直至出現所需的疾病症狀之抑止為止。在一些實施例中，其他給藥方案可為適用的且可經測定。可藉由單次投與治療性T細胞或其醫藥組合物，藉由多次投與或藉由連續投與來遞送所需劑量。
在一些實施例中，具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)或其醫藥組合物可以可有效地獲得所需結果或效果，例如治療疾病或病況的量投與至需要此類療法或治療的個體。旨在根據本文所描述之方法藉由投與治療性T細胞或其醫藥組合物實現的所需結果或效果與投與之前相比可包括以下結果中之一個或多個： (i)如藉由對明顯病變之CT掃描或身體檢查所量測，病變(靶標及/或非靶標病變)降低至少約99%、至少約95%、至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約45%、至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%、至少約20%、至少約15%、至少約10%或至少約5%，例如約30%至約99%、約80%至約90%、約70%至約90%、約60%至約90%、約50%至約90%、約40%至約90%、約35%至約90%、約30%至約90%、約25%至約90%、約5%至約85%或約10%至約80% (與投與治療性T細胞或其醫藥組合物之前相比的實際變化%或中值變化%)； (ii)如藉由生檢、磁共振成像或其他適合方法所量測，癌症轉移消散(亦即降低)至少約99%、至少約95%、至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約45%、至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%、至少約20%、至少約15%、至少約10%或至少約5%，例如約30%至約99%、約80%至約90%、約70%至約90%、約60%至約90%、約50%至約90%、約40%至約90%、約35%至約90%、約30%至約90%、約25%至約90%、約5%至約85%或約10%至約80% (與投與治療性T細胞或其醫藥組合物之前相比的實際變化%或中值變化%)； (iii) 腫瘤負荷(例如，體內癌細胞數目、腫瘤之大小或癌症之量)降低至少約99%、至少約95%、至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約45%、至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%、至少約20%、至少約15%、至少約10%或至少約5%，例如約30%至約99%、約80%至約90%、約70%至約90%、約60%至約90%、約50%至約90%、約40%至約90%、約35%至約90%、約30%至約90%、約25%至約90%、約5%至約85%或約10%至約80% (與投與治療性T細胞或其醫藥組合物之前相比的實際變化%或中值變化%)； (iv)無進展存活期(PFS)增加至少約99%、至少約95%、至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約45%、至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%、至少約20%、至少約15%、至少約10%或至少約5%，例如約30%至約99%、約80%至約90%、約70%至約90%、約60%至約90%、約50%至約90%、約40%至約90%、約35%至約90%、約30%至約90%、約25%至約90%、約5%至約85%或約10%至約80% (與投與治療性T細胞或其醫藥組合物之前相比的實際變化%或中值變化%)；及/或 (v) 總存活期(OS)增加至少約99%、至少約95%、至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約45%、至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%、至少約20%、至少約15%、至少約10%或至少約5%，例如約30%至約99%、約80%至約90%、約70%至約90%、約60%至約90%、約50%至約90%、約40%至約90%、約35%至約90%、約30%至約90%、約25%至約90%、約5%至約85%或約10%至約80% (與預期總存活率相比的實際變化%或中值變化%)。
在一些實施例中，具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)或其醫藥組合物可以醫藥學上有效量(亦即可有效地獲得所需結果或效果，例如治療疾病或病況之量)投與。在一些態樣中，醫藥學上有效量可包括所需劑量或數目之治療性T細胞及/或所需比率之此類T細胞與其他類型之細胞。因此，在一些實施例中，細胞之劑量係基於細胞之總數目(或每公斤體重之數目)及個別群體或子類型之所需比率，諸如CD3+ 與非CD3+ 比率。在一些實施例中，細胞之劑量係基於個別群體中之細胞或含於醫藥組合物中之個別細胞類型的所需總數目(或每公斤體重之數目)。在一些實施例中，劑量係基於此類特徵之組合，諸如個別群體中的總細胞之所需數目、所需比率及治療性T細胞之所需總數目。
在一些實施例中，所需劑量或量為投與細胞的個體之每單位體重的治療性T細胞之所需數目或治療性T細胞之所需數目(例如細胞/公斤)。在一些態樣中，所需劑量或量等於或大於每單位體重的治療性T細胞之最小數或治療性T細胞之最小數。
在某些實施例中，治療性T細胞可以以下範圍投與至個體：約一百至約1000億個細胞，諸如約幾百至約幾千個細胞、約幾千至約1百萬個細胞、約1百萬至約500億個細胞(例如，約1百個細胞、約5百個細胞、約1千個細胞、約5千個細胞、約1百萬個細胞、約5百萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞，或由前述值中之任何兩者限定的範圍)，諸如約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞，或由前述值中之任何兩者限定的範圍)，且在一些情況中，約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或在此等範圍之間的任何值。治療性T細胞之前述有效劑量或量可為每次單獨投藥或每次療法或治療之整個持續時間。
在一些實施例中，治療性T細胞之劑量或量可在104 或約104 與109 或約109 個細胞/公斤(kg)體重之間的範圍內，諸如在105 與106 個細胞/公斤體重之間，例如1×105 個細胞/公斤、1.5×105 個細胞/公斤、2×105 個細胞/公斤或1×106 個細胞/公斤或約1×105 個細胞/公斤、1.5×105 個細胞/公斤、2×105 個細胞/公斤或1×106 個細胞/公斤。舉例而言，在一些實施例中，治療性T細胞以以下劑量或在其之一定誤差範圍內投與：104 或約104 與109 或約109 個T細胞/公斤(kg)體重之間，諸如105 與106 個T細胞/公斤體重之間，例如1×105 個T細胞/公斤、1.5×105 個T細胞/公斤、2×105 個T細胞/公斤或1×106 個T細胞/公斤或約1×105 個T細胞/公斤、1.5×105 個T細胞/公斤、2×105 個T細胞/公斤或1×106 個T細胞/公斤。治療性T細胞之前述有效劑量或量可為每次單獨投藥或每次療法或治療之整個持續時間。
在一些實施例中，具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)或其醫藥組合物可根據所需效果按每天一次、每週一次、兩週一次或每月一次時程投與。在一些態樣中，治療性T細胞或其醫藥組合物可投與約1至5、約1至約10、約1至約15或更多個週期，其中各週期為一個月持續時間。各週期內之劑量可以每天(包括每天一次、每天兩次或超過每天兩次)、每隔一日、每週兩次、每週一次、每兩週一次、每三週一次或每月一次基礎上給予。週期可視情況包括停置時段。替代地，停置時段可包括在週期之間。在一些態樣中，投藥將持續疾病之持續時間。
在一些態樣中，本文中所揭示之方法可進一步包含投與具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)或其醫藥組合物及額外治療劑或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。治療性T細胞或其醫藥組合物及治療劑可相加地或更佳地協同作用。在一較佳實施例中，治療性T細胞或其醫藥組合物可與一或多種治療劑之投與同時投與，該一或多種治療劑可為相同組合物之部分或在與包含治療性T細胞之組合物不同的組合物中。在另一實施例中，治療性T細胞或其醫藥組合物可在投與治療劑之前或之後投與。
在一些態樣中，在本文所描述之方法中有效的具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)或其醫藥組合物的量將視病症或病況之性質而定，且可藉由標準臨床技術來測定。另外，可視情況採用活體外或活體內分析來幫助鑑別最佳劑量範圍。組合物中所採用之精確劑量亦將視投與途徑及疾病或病症之嚴重性而定，且應根據醫師之判斷及各患者之情況來決定。 VI. 用於醫療用途之套組
在一些態樣中，提供用於授受細胞療法或癌症治療中之套組。此類套組可包括包含具有降低之表面海藻糖基化之T細胞(亦即治療性T細胞)的醫藥組合物及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，套組可包括用於本文中所描述之治療方法中之任一者中的說明書。所包括的說明書可提供將醫藥組合物投與至個體以在個體中達成預期活性，例如治療疾病或病況(諸如癌症)的描述。在一些實施例中，與本文中所描述之醫藥組合物之用途相關的說明書可包括關於預期治療的劑量、給藥時程及投與途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中提供之說明書通常為標籤或包裝插頁上之書面說明。標籤或包裝插頁指示醫藥組合物用於治療、延遲發病及/或緩解個體之疾病或病症。
在一些實施例中，本文提供之套組在適合包裝中。適合包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、廣口瓶、可撓性包裝以及類似物。同樣涵蓋的為與特定裝置組合使用之包裝，該特定裝置諸如吸入器、經鼻投藥裝置或輸注裝置。在一些實施例中，套組可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。 VII. 實例
以下實例說明本發明之某些特定實施例且不欲限制本發明之範疇。
本文中之實施例進一步由以下實例及具體方案說明。然而，實例僅意欲說明實施例且不應理解為限制本文之範疇。在整個本申請案中所引用之所有參考文獻及公開專利及專利申請案之內容由此以引用的方式併入。
實例 1 - 利用脾細胞之授受性轉移進行的 A20 小鼠淋巴瘤研究
如下產生免疫原KLH-A20 Id Fab。A20腫瘤Ig重鏈及輕鏈可變區由PCR擴增來選殖且接合至小鼠IgG表現載體中以供在HEK293F17細胞中產生A20 Id。A20 Id鼠類抗體藉由蛋白質A純化。濃縮之抗體(20 mM KPO4 ，10 mM EDTA，pH 7.0)在37℃用四體積之固定木瓜酶樹脂(具有20 mM半胱胺酸)處理隔夜。移除樹脂且將清液層與蛋白質A樹脂一起培育隔夜(4℃)，隨後過濾以移除樹脂結合的抗體Fc。收集含Fab流過物、滲析且在PBS溶液pH 7.4中濃縮。Fab結合藉由使用海水培養KLH (mcKLH)及NHS-PEG12-順丁烯二醯亞胺來實現。將含mcKLH之PBS溶液pH 8.0 (10 mg/mL)與NHS-PEG12-順丁烯二醯亞胺(最終125 mM，37℃，20 min)混合且一起培育。將產物mcKLHPEG12-順丁烯二醯亞胺在PD10管柱(PBS溶液，pH 7.4)上進行緩衝液交換且濃縮至5 mg/mL。A20 Id Fab (4 mg/mL)用含(參(2-羧基乙基)膦(5 mM)之2 mM含EDTA緩衝液(30 min，37℃)還原。經由PD10管柱(PBS溶液，pH 7.4，5 mM EDTA)移除還原劑，且將經還原Fab濃縮至5 mg/mL，與KLH-PEG12-順丁烯二醯亞胺混合(3:1莫耳比，Fab:KLH)，並在室溫下培育(1 h)。過量順丁烯二醯亞胺交聯劑用N-乙醯半胱胺酸淬滅且藉由PD10管柱(PBS溶液，pH 7.4)移除。
如下文所描述產生用於脾細胞之授受性轉移的供體小鼠。在具有10% FBS、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、50 µM 2-巰基乙醇及青黴素(100 U/ml)/鏈黴素(100 µg/ml) (PS)之RPMI 1640中培養A20細胞(ATCC)。小鼠(BALB/c，Harlan)在第-21天皮下注射KLH-A20 Id Fab結合物(50 µg)與佐劑(1:1)，其中在第-7天增強。2FF處理組在第-14天開始接受含有20 mM 2FF之飲用水，而未經處理組接受淡水。在第二次接種疫苗(第0天)後一週，所有小鼠接受經輻照A20腫瘤細胞(RS2000輻照器水準4，17 min，2.5×106 個/細胞/小鼠，靜脈內)。繼續2FF處理直至第14天。將自每組供體小鼠(第14天)採集之脾細胞授受性轉移(一次)至原生小鼠(50×106 個細胞/小鼠)。一個組接受來自已接受2FF之供體小鼠之細胞，且一組小鼠接受來自不經2FF處理之供體小鼠之細胞(n=7隻/組)。接著，二者在轉移後那天用活A20細胞(2.5×106 個細胞)進行攻擊。對照組不接受處理。自不接受2FF之供體小鼠轉移之脾細胞與原生動物相比提供了增加的存活期(中值存活期自27天增加至35天)，而自接受2FF之供體小鼠轉移之脾細胞提供了進一步增加達到43天的中值存活期。此表明來自經2FF處理之動物的細胞之授受性轉移可提供優於來自不接受2FF之動物的細胞之授受性轉移的增強的抗腫瘤活性。
實例 2 - 利用 CD3 + T 細胞之授受性轉移進行的 A20 小鼠淋巴瘤研究
對20隻Balb/c小鼠植入A20細胞(0.2 mL之5×106 個細胞/小鼠，皮下)，由10隻動物組成之一組小鼠自研究之第0天至結束接受2FF (20 mM於飲用水中)。使A20淋巴瘤長大且在20天之後處死小鼠。如先前所展示，接受20 mM 2FF之小鼠與對照組中之動物相比在腫瘤進展上具有顯著延遲(圖2)。在 2FF 之處理後 CD3 + T 細胞上之表面海藻糖基化之降低
將來自未經處理及經2FF處理組的小鼠處死，且獲取脾以用於CD3 T細胞富集。簡言之，將脾收集在含有2% FBS之RPMI中且使細胞懸浮液穿過用2% RPMI洗滌之70 μm篩目尼龍濾網。將細胞懸浮於10 ml ACK裂解緩衝液中且在此緩衝液中培育5 min以去除RBC。將細胞以300×g離心5分鐘且再懸浮於含有2% FBS及1 mM EDTA之PBS中。根據製造商的建議使用EasySep小鼠T細胞分離套組分離T細胞。簡言之，以108 個細胞/毫升再懸浮細胞，向其中添加50 µL/mL大鼠血清。接著將細胞轉移至5 mL聚苯乙烯試管中且將50 µL分離混合物添加至樣本，隨後室溫培育10分鐘。快速球體經渦動且添加75 µL/ml，隨後室溫培育2.5分鐘。樣本體積加滿至2.5 mL且與細胞分離磁體一起培育2.5分鐘。反轉磁體，且收集CD3+ T細胞，並在RPMI中洗滌兩次且以21.2×106 個細胞/毫升再懸浮。藉由流式細胞測量術檢查細胞之海藻糖基化狀態且自經2FF處理之動物分離的細胞顯示表面海藻糖基化之顯著降低(圖3)。具有降低之表面海藻糖基化之 T 細胞的抗腫瘤活性
為了分析經純化T細胞之抗腫瘤活性，對4組Balb/c小鼠植入A20細胞(0.2 mL 5×106 細胞/小鼠，皮下)。一個組不接受處理，其他三個組在A20細胞達到100 mm3 時進行處理且用含20 mM 2FF之飲用水、自IP注射之對照腫瘤攜帶小鼠分離之2×106 個T細胞或自IP注射之2FF腫瘤攜帶小鼠分離之2×106 個T細胞每天一次進行處理。監測動物之後續腫瘤進展。當與未經處理動物或接受來自未經處理腫瘤攜帶小鼠之T細胞之彼等動物相比時，每天一次接受含2FF之其水或自攜帶腫瘤的經2FF處理之動物分離之CD3+ T細胞的動物展示顯著延遲的腫瘤生長，且在一些情況中，腫瘤消退。
此等資料指示，A20淋巴瘤模型中之2FF抗腫瘤活性不僅經由T細胞反應介導，且來自經2FF處理之腫瘤攜帶小鼠的T細胞出人意料地足以驅動抗腫瘤反應且此反應與全身性2FF處理相當。此等發現開闢了在治療性情況中使用2FF來增加T細胞活性的可能性，在該等治療性情況中，來自癌症病患的自體T細胞離體擴增且重置於患者中，或用特定腫瘤抗原之TCR或CAR構築體轉化。
實例 3 - 針對活體內抗腫瘤功效的利用 2FF 進行的人類周邊 T 細胞之離體擴增
首先以1200 rpm (300×g)將10 mL全血離心10 min(無煞車)，自其分離T細胞。小心地移除含有血小板之上層且不破壞白血球層。接著將RosetteSep™人類T細胞富集混合液(來自StemCell technologies之Pan T細胞)添加至剩餘血液(500 µL/10 mL血液)。將此培育20 min且接著添加1 mL FBS與10 mL PBS。將Histopaque (20-25 mL)置放於50 mL Falcon中，所製備血液/PBS溶液極緩慢地重疊。此在無煞車之情況下離心(25℃，1500 rpm，25 min)。移除上層且接著將血沉棕黃層中之T細胞移至新的50 mL試管。T細胞用PBS洗滌，再懸浮於1 mL AKT裂解緩衝液中且補滿至25 mL，培育5 min，用PBS加至50 mL，且接著集結(pelleted)。重複此紅血球裂解步驟二次。
對於原代人類T細胞培養物之活體外培養，將經分離T細胞再懸浮於T細胞培養基(補充有10%胎牛血清(FCS)、1%青黴素之RPMI培養基)且移至兩個T25燒瓶中，一個具有100 µM 2-去氧-2-氟-L-海藻糖且另一個不具有其。添加經CD3/CD28抗體塗佈之珠粒(20 µL/燒瓶)以活化T細胞。在24小時之後，添加介白素2 (IL2) (100 ng/µL)。每當細胞傳代時，添加新的IL2及2-去氧-2-氟-L-海藻糖。培養10天之後，藉由流式細胞測量術評估在2FF中培養之經擴增T細胞的表面海藻糖基化之變化(圖4)。用2FF處理原代人類T細胞使得表面海藻糖基化降低約85%，如藉由兵豆凝集素(LCA)表面染色所監測，且指示細胞已準備好進行活體內轉移。
實例 4 - 利 用 2FF 離體成熟及分化之自體 T 細胞可賦予抗腫瘤活性
使用histopaque (Sigma)密度梯度自自願的健康志願者之靜脈血之血沉棕黃層分離周邊血液單核細胞(Astarte Biologics)。隨後按照製造商說明書使用EasySep人類T細胞富集混合液(STEMCELL)分離T細胞。以1:8珠粒:細胞比率使用的經αCD3/αCD28抗體塗佈之珠粒(Miltenyi Biotec)在第0天用於活化T細胞。T細胞在RPMI 10% FCS + IL-2 (100 ng/µL，R&D Systems) +/- 100 µM 2FF中活化。每當細胞傳代時，添加新的IL-2及2FF。
將埃-巴二氏病毒(EBV)轉化之類淋巴母細胞株(LCL)皮下植入至NSG小鼠中。當LCL腫瘤體積達到300 mm3 時，小鼠經由尾部靜脈注射接受2.0×106 個自體周邊T細胞，該等細胞在2FF之存在或不存在下擴增及成熟。自體T細胞對LCL進展的抗腫瘤活性藉由每兩週一次卡尺量測來監測。一旦腫瘤大小縮小或完全消退超過1週，將小鼠處死。
自體T細胞之轉移產生抗腫瘤活性，且當T細胞在轉移之前用2FF成熟時，此活性顯著地增強(參看圖5A)，存活率亦顯著提高(參看圖5B)。
圖1展示顯示在原生BALB/c小鼠中，來自經2FF處理或未處理之KLH-A20 Id Fab接種之供體小鼠之脾細胞的授受性轉移，對IV移植之A20小鼠淋巴瘤細胞之生長之活體內影響的圖式。
圖2展示顯示在用於產生經分離Cd3+ T細胞的原生BALB/c小鼠中，2FF對SQ移植之A20小鼠淋巴瘤細胞之生長之活體內影響的圖式。
圖3展示顯示如藉由表面LCA染色所測定，自用20 mM 2FF處理之A20腫瘤攜帶小鼠分離之CD3+ T細胞之降低之表面海藻糖基化的圖式。
圖4展示顯示如藉由表面LCA染色所測定，自用100 mM 2FF離體處理之後的人類供體分離之CD3+ T細胞之降低之表面海藻糖基化的圖式。
圖5A至圖5B展示顯示在2FF之存在或不存在下成熟的自體人類T細胞轉移至攜帶所匹配經LCL EBV轉化之B細胞腫瘤之NSG小鼠中之後的腫瘤進展的圖式。圖5A展示經由卡尺量測顯示腫瘤進展的圖式，且圖5B展示經由存活率顯示腫瘤進展的圖式。

Claims (50)

  1. 一種產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法，該方法包含： 在海藻糖類似物存在下在細胞培養基中培養T細胞；其中 該海藻糖類似物選自由式(I )或(II )組成之群：或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式，其中式(I )或(II )中之每一者可為α或β變旋異構物或對應的醛醣形式； R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或 R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH；且 其中該等T細胞相對於在無該海藻糖類似物存在下培養之T細胞具有降低之表面海藻糖基化。
  2. 如請求項1 之方法，其進一步包含分離具有降低之表面海藻糖基化之該等T細胞的步驟。
  3. 如請求項1 或2 之方法，其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。
  4. 如請求項1 至3 中任一項之方法，其中R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。
  5. 如請求項1 至4 中任一項之方法，其中R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。
  6. 如請求項1 至5 中任一項之方法，其中R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。
  7. 如請求項1 或2 之方法，其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
  8. 如請求項1 之方法，其中該海藻糖類似物為2-去氧-2-氟-L-海藻糖。
  9. 如請求項1 之方法，其中該海藻糖類似物為炔基海藻糖過乙酸酯。
  10. 如請求項1 至9 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化之該等T細胞為相對於在無該海藻糖類似物存在下培養之T細胞包含表面海藻糖基化至少降低5%的T細胞。
  11. 如請求項1 至10 中任一項之方法，其中該培養基包含CD3及CD28抗體。
  12. 如請求項11 之方法，其中該培養基進一步包含介白素2 (IL2)。
  13. 如請求項1 至12 中任一項之方法，其中該等T細胞包含人類周邊T細胞。
  14. 如請求項1 至13 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化的該等產生之T細胞經設計以用於授受細胞療法中。
  15. 一種產生具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的方法，該方法包含： 向動物提供海藻糖類似物；以及 自該動物獲得具有降低之表面海藻糖基化的T細胞， 該海藻糖類似物選自由式(I )或(II )組成之群：或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式，其中式(I )或(II )中之每一者可為α或β變旋異構物或對應的醛醣形式； R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 ，或 R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH；且 其中自該動物獲得之該等T細胞相對於存在於對照動物中或自該對照動物獲得之T細胞具有降低之表面海藻糖基化，該對照動物不提供該海藻糖類似物。
  16. 如請求項15 之方法，其中R2 為鹵素；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。
  17. 如請求項15 或16 之方法，其中R2 為-F；R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-CH3 。
  18. 如請求項15 至17 中任一項之方法，其中R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)C1 -C10 烷基組成之群。
  19. 如請求項15 至18 中任一項之方法，其中R1 、R3 及R4 中之每一者獨立地選自由-OH及-OC(O)CH3 組成之群。
  20. 如請求項15 之方法，其中R1 、R2 、R3 及R4 中之每一者獨立地為-OH或可水解酯基；且R5 為-C≡CH。
  21. 如請求項15 之方法，其中該海藻糖類似物為2-去氧-2-氟-L-海藻糖。
  22. 如請求項15 之方法，其中該海藻糖類似物為炔基海藻糖過乙酸酯。
  23. 如請求項15 至22 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化之該等T細胞為相對於在無該海藻糖類似物存在下培養之T細胞包含表面海藻糖基化至少降低5%的T細胞。
  24. 如請求項15 至23 中任一項之方法，其中該等T細胞自該動物之脾獲得。
  25. 如請求項15 至24 中任一項之方法，其中經由饋料將海藻糖類似物提供至該動物。
  26. 如請求項15 至25 中任一項之方法，其進一步包含自獲自該動物之該等T細胞富集T細胞。
  27. 如請求項15 至26 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化的該等產生之T細胞經設計以用於授受細胞療法中。
  28. 如請求項15 至27 中任一項之方法，其中該動物為人類。
  29. 一種向個體提供授受細胞療法的方法，該方法包含： 向需要該細胞療法之該個體投與包含具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的混合物。
  30. 如請求項29 之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化之該等T細胞根據請求項1 至28 中任一項之方法產生。
  31. 如請求項29 之方法，其中該等T細胞相對於普通T細胞包含表面海藻糖基化至少降低5%。
  32. 如請求項29 至31 中任一項之方法，其中該個體為人類。
  33. 如請求項29 至32 中任一項之方法，其中該等T細胞包含人類周邊T細胞。
  34. 如請求項29 至33 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化的該等T細胞源於該個體。
  35. 如請求項29 至33 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化的該等T細胞源於不同於該個體之動物。
  36. 如請求項29 至35 中任一項之方法，其中該混合物大體上不含紅血球。
  37. 如請求項29 至36 中任一項之方法，其中該細胞療法經設計以治療癌症。
  38. 如請求項29 至37 中任一項之方法，其中該混合物局部地(在癌細胞處或在該等癌細胞附近)投藥。
  39. 如請求項29 至38 中任一項之方法，其中該混合物全身性地(投藥途徑)投藥。
  40. 一種治療癌症之方法，該方法包含： 向需要該癌症治療之個體投與包含具有降低之表面海藻糖基化之T細胞的混合物。
  41. 如請求項40 之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化之該等T細胞根據請求項1 至28 中任一項之方法產生。
  42. 如請求項40 之方法，其中該等T細胞相對於普通T細胞包含表面海藻糖基化至少降低5%。
  43. 如請求項40 至42 中任一項之方法，其中該個體為人類。
  44. 如請求項40 至43 中任一項之方法，其中該等T細胞包含人類周邊T細胞。
  45. 如請求項40 至44 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化的該等T細胞源於該個體。
  46. 如請求項40 至44 中任一項之方法，其中具有降低之表面海藻糖基化的該等T細胞源於不同於該個體之動物。
  47. 如請求項40 至46 中任一項之方法，其中該混合物大體上不含紅血球。
  48. 如請求項40 至47 中任一項之方法，其中該細胞療法經設計以治療癌症。
  49. 如請求項40 至48 中任一項之方法，其中該混合物局部地投藥。
  50. 如請求項40 至49 中任一項之方法，其中該混合物全身性地投藥。
TW107119671A 2017-06-07 2018-06-07 具有降低之表面海藻糖基化之t細胞及其製備及使用方法 TW201903144A (zh)

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