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TW201902934A - 拮抗性cd40單株抗體及其用途 - Google Patents

拮抗性cd40單株抗體及其用途 Download PDF

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TW201902934A
TW201902934A TW107117879A TW107117879A TW201902934A TW 201902934 A TW201902934 A TW 201902934A TW 107117879 A TW107117879 A TW 107117879A TW 107117879 A TW107117879 A TW 107117879A TW 201902934 A TW201902934 A TW 201902934A
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亞倫 亞尼克
瑪莉 史查特斯
蘇珊 J 蘇查德
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Abstract

本揭示提供結合CD40之抗體，包括具有不同Fc域之人類化抗體及嵌合抗體。該等抗體結合CD40且不展現CD40激動劑活性。該等抗體可包含經修飾之IgG1 Fc域，且展現對不成熟樹突細胞之最小活化作用。本揭示提供包含抗體之組合物、用於治療涉及CD40活性之疾病之方法，及製備用於治療涉及CD40活性之疾病之藥劑的用途。

Description

拮抗性CD40單株抗體及其用途
本揭示內容提供結合CD40之抗體，包括具有不同Fc域之人類化抗體及嵌合抗體。該等抗體多肽結合CD40且不展現CD40激動劑活性。該等抗體可包含經修飾之IgG1 Fc域，且展現對不成熟樹突細胞之最小活化。本揭示內容提供包含抗體之組合物、用於治療涉及CD40活性之疾病之方法及用於製備用於治療涉及CD40活性之疾病之藥劑的用途。
CD40係屬腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之共刺激分子，其存在於抗原呈遞細胞(APC)上，包括樹突細胞、B細胞及巨噬細胞。當CD40結合TH 細胞上之其配體CD154 (CD40L)時，APC被活化。CD40介導之APC活化涉及多種免疫反應，包括細胞介素產生、共刺激分子(例如CD86)之上調及增強之抗原呈遞及B細胞增殖。CD40亦可由內皮細胞、平滑肌細胞、纖維母細胞及上皮細胞表現。
CD40活化亦涉及多種不期望之與(例如)自體免疫性、移植排斥或過敏反應有關之T細胞反應。用於控制不期望之T細胞反應之一種策略係利用拮抗性抗體靶向CD40。舉例而言，單株抗體HCD122 (魯卡木單抗(Lucatumumab)，先前稱為Chiron 1212)目前正在用於治療某些CD40介導之發炎性疾病之臨床試驗中。參見 「Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40+ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma」, Clinical Trials Feeds，在網際網路上之超文件傳送協定：clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209 (最後更新於2011年1月11日)。然而，單株抗體可展示激動劑活性。舉例而言，抗CD40抗體Chi220之可用性受其弱刺激性潛能限制。參見 Adams等人，「Development of chimeric anti-CD40 monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival,」J. Immunol. 174: 542-50 (2005)。
在第一實施例中，本發明提供特異性結合至人類CD40之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含含有GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1)之CDR1、含有YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)之CDR2、含有LILQRGAY (SEQ ID NO: 3)之CDR3；且該輕鏈包含含有RASKNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4)之CDR1、含有RASNLES (SEQ ID NO: 5)之CDR2及含有QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6)之CDR3。
在第二實施例中，本發明提供特異性結合至人類CD40之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含含有GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17)之CDR1、含有VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18)之CDR2及含有SQLGRRFDY (SEQ ID NO: 19)之CDR3；且該輕鏈包含含有KASQDVRTGVA (SEQ ID NO: 20)之CDR1、含有SASYRNT (SEQ ID NO: 21)之CDR2及含有QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22)之CDR3。
經分離抗體或其抗原結合部分可拮抗CD40之活性。經分離抗體或其抗原結合部分可係嵌合抗體。經分離抗體或其抗原結合部分可係人類化抗體。經分離抗體或其抗原結合部分可包含人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區。
本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可包含人類IgG1 Fc域，其包含在Kabat位置238處之突變，該突變降低與Fc-γ-受體(FcgR)之結合，其中脯胺酸238 (P238)突變為選自由以下組成之群之殘基中之一者：離胺酸(K)、絲胺酸(S)、丙胺酸(A)、精胺酸(R)及色胺酸(W)，且其中該抗體或其抗原結合部分具有降低之FcgR結合。
在某些實施例中，本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可在人類IgG1 Fc域中使P238突變為離胺酸(P238K)。本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可包含Fc域，該Fc域包含選自以下之胺基酸序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-P238K (-C端Lys)；SEQ ID NO: 98)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-P238K；SEQ ID NO: 9)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-P238K(-C端Lys)；SEQ ID NO: 99)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-P238K；SEQ ID NO: 10)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-P238K(-C端Lys)；SEQ ID NO: 100)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-P238K；SEQ ID NO: 11)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-P238K(-C端Lys)；SEQ ID NO: 101)。 或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-P238K；SEQ ID NO: 12)。
在某些特定實施例中，本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可包含人類IgG1 Fc域，該人類IgG1 Fc域包含在Kabat位置297處取代之丙胺酸。本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可包含Fc域，其中該Fc域包含選自以下之胺基酸序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 102)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-N297A；SEQ ID NO: 13)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 103)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-N297A；SEQ ID NO: 14)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 104)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-N297A；SEQ ID NO: 15)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 105) 或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-N297A；SEQ ID NO: 16)。
在某些特定實施例中，經分離抗體或其抗原結合部分包含：(1) 具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之可變重鏈(VH )或(2) 具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之可變輕鏈(VL )。舉例而言，經分離抗體或抗原結合部分包含：(1) 具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之可變重鏈(VH )，及(2) 具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之可變輕鏈(VL )。在特定實施例中，經分離抗體或其抗原結合部分包含(1) 具有SEQ ID NO: 85之胺基酸序列之重鏈，及(2) 具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之輕鏈。在其他特定實施例中，經分離抗體或其抗原結合部分包含：(1) 具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列之重鏈及(2) 具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之輕鏈； (1) 具有SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之重鏈及(2) 具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之輕鏈； (1) 具有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之重鏈及(2) 具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之輕鏈；或 (1) 具有選自SEQ ID NO: 84、109、110或111之胺基酸序列之重鏈；及(2) 具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之5F11-45輕鏈。
在其他特定實施例中，經分離抗體或其抗原結合部分包含(1) 選自由以下組成之群之可變重鏈(VH )：hz-HC1 (SEQ ID NO: 23)、hz-HC2 (SEQ ID NO: 24)、hz-HC3 (SEQ ID NO: 25)、hz-HC4 (SEQ ID NO: 26)、hz-HC5 (SEQ ID NO: 27)、hz-HC6 (SEQ ID NO: 28)、hz-HC7 (SEQ ID NO: 29)、hz-HC8 (SEQ ID NO: 30)、hz-HC9 (SEQ ID NO: 31)、hz-HC10 (SEQ ID NO: 32)及hz-HC11 (SEQ ID NO: 33)；及/或(2) 選自由以下組成之群之可變輕鏈(VL )：hz-LC1 (SEQ ID NO: 34)、hz-LC2 (SEQ ID NO: 35)、hz-LC3 (SEQ ID NO: 36)、hz-LC4 (SEQ ID NO: 37)及hz-LC5 (SEQ ID NO: 38)。
在某些特定實施例中，經分離抗體或其抗原結合部分包含(1) 選自SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43之重鏈胺基酸序列，其中C端視情況進一步包含離胺酸；及/或(2)選自SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 44之可變輕鏈(VL )胺基酸序列。為了說明，經分離抗體或其抗原結合部分係選自由以下組成之群：a) Y1238-hz1-P238K，其具有SEQ ID NO: 39之重鏈及SEQ ID NO: 41之輕鏈； b) Y1238-hz1-N297A，其具有SEQ ID NO: 40之重鏈及SEQ ID NO: 41之輕鏈； c) Y1238-hz2-P238K，其具有SEQ ID NO: 42之重鏈及SEQ ID NO: 44之輕鏈；及 d) Y1238-hz2- N297A，其具有SEQ ID NO: 43之重鏈及SEQ ID NO: 44之輕鏈。
本文中揭示抗體或其抗原結合部分，其中該抗原結合部分係選自由以下組成之群：Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2、雙價抗體及scFv-Fc。
本文中揭示抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分連接至治療劑。
本文中揭示抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分連接至第二功能性部分，該第二功能性部分具有不同於該抗體或其抗原結合部分之結合特異性。
本文中揭示抗體或其抗原結合部分，其進一步包含另外部分。
本文中揭示編碼經分離抗體或其抗原結合部分之核酸。本文中揭示包含該核酸分子之表現載體。亦涵蓋經該表現載體轉化之細胞。
亦揭示製備抗人類CD40抗體或其抗原結合部分之方法，其包含：a) 在經表現載體轉化之細胞中表現該抗體或其抗原結合部分，該表現載體包含編碼本文中所揭示之經分離抗體或其抗原結合部分之核酸分子；及 b) 自該細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
亦提供醫藥組合物，其包含：a) 本文中所揭示之抗體或其抗原結合部分；及b) 醫藥上可接受之載劑。
提供治療或預防個體免疫反應之方法，其包含向該個體投與本文中所揭示之抗體或其抗原結合部分。在治療或預防個體免疫反應之此方法中，該個體患有選自由以下組成之群之疾病：艾迪森氏病(Addison’s disease)、過敏、過敏反應、關節黏連性脊椎炎、氣喘、動脈粥樣硬化、異位性過敏、耳之自體免疫疾病、眼之自體免疫疾病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、支氣管氣喘、冠狀動脈心臟病、克隆氏病(Crohn’s disease)、糖尿病、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷氏病(Graves’ disease)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏病(Hashimoto’s disease)、溶血性貧血、特發性血小板減少紫斑症、發炎性腸病、對重組藥物產品之免疫反應(例如，血友病患者中之因子VII)、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、重症肌無力、天疱瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮症、薛格連氏症候群(Sjogren’s syndrome)、脊椎關節病變、甲狀腺炎、移植排斥、血管炎及潰瘍性結腸炎。
亦涵蓋如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分或包含其之藥劑之用途，其用於治療有需要之個體。進一步涵蓋治療有效量之如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分，其用於治療或預防免疫反應，其中該抗體或其抗原結合部分係用於向有需要之患者投與。
本揭示內容係關於抗CD40抗體，且具體而言係關於拮抗性抗CD40抗體。對於治療性靶標(例如CD40)而言，FcgR介導之抗CD40抗體交聯可能導致不期望之激動劑信號傳導及潛在毒性。本揭示內容亦闡述拮抗性抗CD40抗體，其具有與「低親和力」FcgR hCD32a/FcgRIIa、hCD32b/FcgRIIb、hCD16a/FcgRIIIa及hCD16b/FcgRIIIb之降低接合。預期降低之低親和力FcgR之接合會降低不期望之激動劑信號傳導及不期望之潛在毒性之可能性。
定義及縮寫 下文提供其他縮寫及定義。 APC 抗原呈遞細胞 CD54 亦稱為ICAM-1 CDR 互補性決定區 CH 或CH恆定重鏈 CL 或CL恆定輕鏈 CHO細胞 中國倉鼠卵巢細胞 dAb 域抗體 FcgR 可與FcγR互換 FR 框架區 GM-CSF 顆粒球巨噬細胞群落刺激因子 HC 重鏈 iDC 不成熟樹突細胞 IFN 干擾素 IgG 免疫球蛋白G IL-6 介白素-6 LC 輕鏈 mAb 單株抗體 mg 毫克 ml或mL 毫升 ng 奈克 nM 奈莫耳 pI 等電點 SPR 表面電漿共振 TNF 腫瘤壞死因子 μg 微克 μM 微莫耳 VL 或VL 可變輕鏈域 VH 或VH 可變重鏈域 本文中提供其他縮寫及定義。
根據此詳細說明，以下縮寫及定義適用。必須注意，如本文中所使用，除非上下文另外明確地指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，對「抗體」之提及包括複數個此等抗體，且對「劑量」之提及包括提及熟習此項技術者已知之一或多個劑量及其等效物等等。
如本文所使用，術語「約」為熟習此項技術者所理解，且其將在使用其之上下文中在一定程度上有所變化。一般而言，除非本說明書中另有指示，否則「約」涵蓋參考值加/減10%之一系列值。
應理解，本文包括所述範圍之間的任何及所有全部或部分整數。
CD40亦已知且稱為B細胞表面抗原CD40、Bp50、CD40L受體、CDw40、CDW40、MGC9013、p50、TNFRSF5及腫瘤壞死因子受體超家族成員5。「人類CD40」係指包含以下胺基酸序列之CD40：MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ (SEQ ID NO: 45)。
如本文所使用，術語「可變域」係指免疫球蛋白可變域，如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest, 第5版, U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)所定義。可變域內CDR胺基酸殘基之編號及位置係根據眾所周知之Kabat編號慣例。VH 、「可變重鏈」及「可變重鏈域」係指重鏈之可變域。VL 、「可變輕鏈」及「可變輕鏈域」係指輕鏈之可變域。
當應用於抗體時，術語「人類」意指抗體具有源自人類免疫球蛋白之序列(例如，FR及/或CH域)。當序列為以下中之任一者時，則該序列係「源自」人類免疫球蛋白編碼序列：(a) 自人類個體或自來自人類個體之細胞或細胞系分離；(b) 自經選殖人類抗體基因序列或人類抗體可變域序列之庫分離；或(c) 藉由自以上多肽中之一或多者之突變及選擇而多樣化。
如本文所使用之「經分離」化合物意指該化合物係自至少一種該化合物在自然界中與其天然締合之組分移除。
本揭示內容之抗體可投與人類患者，同時在很大程度上避免由投與來自其他物種(例如，小鼠)之抗體所通常引發之抗抗體免疫反應。舉例而言，可根據業內已知之程序，藉由將鼠類CDR移植至人類可變域FR上來使鼠類抗體「人類化」。然而，如本文所揭示之人類抗體可無需對鼠類抗體序列進行遺傳操縱來產生。
可用於本揭示內容中之抗CD40抗體包含三個互補決定區(CDR)及四個框架區(FR)，其自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。該三個CDR含有與抗原形成特異性相互作用之殘基之大多數，且主要負責抗原識別。
在特定實施例中，本揭示內容之抗CD40抗體可包含人類化抗體5F11-45之CDR。5F11-45之胺基酸序列提供於表1中。表 1 ： 5F11-45 序列
在一個實施例中，本揭示內容之抗體可包含人類化5F11-45可變重鏈及輕鏈序列之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列(作為實例，例如分別參見 SEQ ID NO: 7及8)。單株抗體含有所有6個CDR (對於VH 為3個且對於VL 為3個)，例如，對於可變重鏈CDR 1-3分別為GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1)、YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)及LILQRGAY (SEQ ID NO: 3)，且對於可變輕鏈CDR 1-3分別為RASKNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4)、RASNLES (SEQ ID NO: 5)及QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6)。
在另一實施例中，本揭示內容之抗體可包含人類化Y1238可變重鏈及輕鏈序列之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列(作為實例，例如分別參見 SEQ ID NO: 23及34)。單株抗體含有所有6個CDR (對於VH 為3個且對於VL 為3個)，例如，對於可變重鏈CDR 1-3分別為GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17)、VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18)及SQLGRRFDY (SEQ ID NO: 19)，且對於可變輕鏈CDR 1-3分別為KASQDVRTGVA (SEQ ID NO: 20)、SASYRNT (SEQ ID NO: 21)及QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22)。
「抗體」 (Ab)應包括(但不限於)特異性結合至抗原且包含藉由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈或其抗原結合部分之免疫球蛋白。每一H鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為VH )及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域CH1 、CH2 及CH3 。每一輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL )及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域CL 。可將VH 及VL 區進一步細分為超變區(稱為互補性決定區(CDR))，其間散佈有更保守之區(稱為框架區(FR))。每一VH 及VL 包含3個CDR及4個FR，其自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。
Ab之「抗原結合部分」 (亦稱為「抗原結合片段」)或其抗原結合部分係指Ab (全長抗體之全長或片段)之一或多個序列，該(等)序列保留特異性結合至由完整Ab結合之抗原的能力。抗原結合片段之實例包括Fab、F(ab’)2 、scFv (單鏈可變片段)、Fab’、dsFv、sc(Fv)2及scFv-Fc。
「人類化」抗體係指其中非人類Ab之CDR域外之一些、大部分或所有胺基酸經源自人類免疫球蛋白之相應胺基酸替代之Ab。在Ab之人類化形式之一個實施例中，CDR域外之一些、大部分或所有胺基酸已經來自人類免疫球蛋白之胺基酸替代，而一或多個CDR區內之一些、大部分或所有胺基酸未發生變化。可容許存在胺基酸之小添加、缺失、插入、取代或修飾，只要其不消除Ab結合特定抗原之能力即可。「人類化」Ab保留與初始Ab之抗原特異性類似之抗原特異性。
「嵌合抗體」係指其中可變區源自一個物種且恆定區源自另一物種之Ab，例如其中可變區源自小鼠Ab且恆定區源自人類Ab之Ab。
如本文所使用，「特異性結合」係指抗體結合抗原之解離常數(Kd )為約1 μM或更低，如(例如)藉由表面電漿共振(SPR)所量測。適宜分析系統包括BIAcoreTM (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)表面電漿共振系統及BIAcoreTM 動力學評估軟體(例如，2.1版)。
本發明抗體與CD40之結合拮抗CD40活性。「CD40活性」包括(但不限於) T細胞活化(例如，誘導T細胞增殖或細胞介素分泌)、巨噬細胞活化(例如，誘導巨噬細胞中之活性含氧物及一氧化氮)及B細胞活化(例如，B細胞增殖、抗體同型轉換或分化為漿細胞)。CD40活性可藉由與其他分子之相互作用來調介。「CD40活性」包括CD40與以下分子之間之功能性相互作用，該等分子係由括號中之其Uniprot登錄號鑑別：CALR (P27797)； ERP44 (Q9BS26)； FBL (P22087)； POLR2H (P52434)； RFC5 (P40937)； SGK1 (O00141)； SLC30A7 (Q8NEW0)； SLC39A7 (Q92504)； TRAF2 (Q5T1L5)； TRAF3 (Q13114)； TRAF6 (Q9Y4K3)； TXN (Q5T937)； UGGT1 (Q9NYU2)；及 USP15 (Q9Y4E8)。
舉例而言，CD40 「活性」包括與TRAF2之相互作用。CD40/TRAF2相互作用使NF-κB及JNK活化。參見 Davies等人，Mol.Cell Biol. 25: 9806-19 (2005)。因此，相對於參考，此CD40活性可藉由CD40依賴性細胞NF-κB及JNK活化來測定。
如本文所使用，術語「活化(activate、activates及activated)」係指給定之可量測CD40活性相對於參考增加至少10%，例如至少10%、25%、50%、75%或甚至100%或更多。相對於不存在拮抗劑之情形下，若CD40活性降低至少10%，則該CD40活性受到「拮抗」，且在例示性實施例中，降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%或甚至100% (即，無可檢測之活性)。舉例而言，抗體可拮抗一些或全部CD40活性，而不使CD40活化。舉例而言，抗體可不活化B細胞增殖。抗體可不活化T細胞之細胞介素分泌，其中細胞介素係至少一種選自由以下組成之群之細胞介素：IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ。
可變域可包含一或多個框架區(FR)，其具有與由人類種系抗體基因區段編碼之相應框架區相同之胺基酸序列。用於本文所闡述抗體中之較佳框架序列係在結構上類似於本文所闡述抗體所用之框架序列之彼等。可將VH CDR1、2及3序列以及VL CDR1、2及3序列移植至具有與發現於衍生出框架序列之種系免疫球蛋白基因中之序列一致之序列的框架區上，或可將CDR序列移植至與種系序列相比含有至多20個、較佳保守胺基酸取代之框架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，有益地使框架區內之殘基突變以維持或增強抗體之抗原結合能力(例如，參見授予Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。
例示性框架區包括(但不限於)下表2及3中之彼等。序列係呈胺基至羧基末端格式。例示重鏈框架區示於表2中。人類化5F11-45 VH之較佳重鏈框架序列群組係：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS (FR1；SEQ ID NO: 46)、WVRQAPGQGLEWMG (FR2；SEQ ID NO: 49)、KTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (FR3；SEQ ID NO: 51)及WGQGTLVTVSS (FR4: SEQ ID NO: 60)。人類化Y1238 VH之較佳重鏈框架序列群組係：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (FR1；SEQ ID NO: 47)、WVRQAPGQGLEWMG (FR2；SEQ ID NO: 49)、RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR (FR3；SEQ ID NO: 52)及WGQGTLVTVSS (FW4；SEQ ID NO: 60)。表 2
例示輕鏈框架區示於表3中。人類化5F11-45 VL之較佳輕鏈框架區群組包括以下：DIVLTQSPDSLAVSLGERATINC (FR1；SEQ ID NO: 61)、WYQQKPGQPPKLLIY (FR2；SEQ ID NO: 63)、GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (FR3；SEQ ID NO: 66)及FGQGTKLEIK (FR4；SEQ ID NO: 71)。人類化Y1238 VL之較佳輕鏈框架區群組包括以下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (FR1；SEQ ID NO: 62)、WYQQKPGKAPKLLIY (FR2；SEQ ID NO: 64)、GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (FR3；SEQ ID NO: 67)、GVPSRFSGSR SGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (FR3；SEQ ID NO: 68)及FGGGTKVEIK (FR4；SEQ ID NO: 72)。表 3
變體可變域可與人類化5F11-45或Y1238序列之可變域具有至多10個胺基酸或其間任何整數值之差異，其中該變體可變域特異性結合CD40。或者，分別相對於人類化5F11-45或Y1238序列之序列，變體可變域可具有至少90%之序列一致性(例如，至少92%、95%、98%或99%之序列一致性)。兩個序列之間具有差異之非一致胺基酸殘基或胺基酸可表示胺基酸取代、添加或缺失。當兩個序列藉由任何適當之胺基酸序列比對算法(例如BLAST® (U.S. National Library of Medicine之注冊商標))進行比對時，該兩個序列之間具有差異之殘基呈現為非一致之位置。
本發明之例示性CD40抗體可包括特異性結合至人類CD40之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中：該重鏈包含含有GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1)之CDR1、含有YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)之CDR2、含有LILQRGAY (SEQ ID NO: 3)之CDR3；且 該輕鏈包含含有RASKNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4)之CDR1、含有RASNLES (SEQ ID NO: 5)之CDR2及含有QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6)之CDR3； 或 該重鏈包含含有GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17)之CDR1、含有VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18)之CDR2及含有SQLGRRFDY (SEQ ID NO: 19)之CDR3；且 該輕鏈包含含有KASQDVRTGVA (SEQ ID NO: 20)之CDR1、含有SASYRNT (SEQ ID NO: 21)之CDR2及含有QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22)之CDR3。
在一個特定實施例中，特異性結合至人類CD40之抗體或其抗原結合部分包含(1)重鏈，其包含含有GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1)之CDR1、含有YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)之CDR2、含有LILQRGAY (SEQ ID NO: 3)之CDR3；及/或(2) 包含輕鏈，其包含含有RASKNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4)之CDR1、含有RASNLES (SEQ ID NO: 5)之CDR2及含有QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6)之CDR3。視情況，此抗體或其抗原結合部分包含(1) SEQ ID NO: 7之可變重鏈；及/或(2) SEQ ID NO: 8之可變輕鏈。為了說明，此抗體或其抗原結合部分包含(1)重鏈，其包含SEQ ID NO: 7之可變重鏈；及(2) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 8之可變輕鏈。
特異性結合至人類CD40之抗體或其抗原結合部分可包含含有SEQ ID NO: 7之可變重鏈之重鏈及含有SEQ ID NO: 8之可變輕鏈之輕鏈，其中該重鏈包含含有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之Fc域。特異性結合至人類CD40之抗體或其抗原結合部分可包含含有SEQ ID NO: 7之可變重鏈之重鏈及含有SEQ ID NO: 8之可變輕鏈之輕鏈，其中該重鏈包含含有SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之Fc域。
特異性結合至人類CD40之抗體或其抗原結合部分可包含(1)重鏈，其包含SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 106、107或108之胺基酸序列；及(2) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列。為了說明，此抗體或其抗原結合部分包含(1)重鏈，其包含SEQ ID NO: 85之胺基酸序列；及(2) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列。
經分離之抗體或其抗原結合部分可拮抗CD40之活性。經分離之抗體或其抗原結合部分可係嵌合抗體。經分離之抗體或其抗原結合部分可係人類化抗體。經分離之抗體或其抗原結合部分可包含人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區。
本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可包含人類IgG1 Fc域，其包含在Kabat位置238處之突變，該突變降低與Fc-γ-受體(FcgR)之結合，其中脯胺酸238 (P238)突變為選自由以下組成之群之殘基中之一者：離胺酸(K)、絲胺酸(S)、丙胺酸(A)、精胺酸(R)及色胺酸(W)，且其中該抗體或其抗原結合部分具有降低之FcgR結合。本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可在人類IgG1 Fc域中使P238突變為離胺酸。
經分離抗體或其抗原結合部分包含Fc域，該Fc域包含選自以下之胺基酸序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-P238K(-C端Lys)；SEQ ID NO: 98)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-P238K；SEQ ID NO: 9)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-P238K(-C端Lys)；SEQ ID NO: 99)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-P238K；SEQ ID NO: 10)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-P238K(-C端Lys)；SEQ ID NO: 100)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-P238K；SEQ ID NO: 11)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-P238K(-C端Lys)；SEQ ID NO: 101) 或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-P238K；SEQ ID NO: 12)
本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可包含人類IgG1 Fc域，該人類IgG1 Fc域包含在Kabat位置297處取代之丙胺酸。舉例而言，經分離抗體或其抗原結合部分包含Fc域，該Fc域包含選自以下之胺基酸序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 102)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-N297A；SEQ ID NO: 13)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 103)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-N297A；SEQ ID NO: 14)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 104)、 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-N297A；SEQ ID NO: 15)、 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-N297A(-C端Lys)；SEQ ID NO: 105) 或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-N297A；SEQ ID NO: 16)。
本文中闡述經分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體包含(1)選自由以下組成之群之可變重鏈(VH )：hz-HC1 (SEQ ID NO: 23)、hz-HC2 (SEQ ID NO: 24)、hz-HC3 (SEQ ID NO: 25)、hz-HC4 (SEQ ID NO: 26)、hz-HC5 (SEQ ID NO: 27)、hz-HC6 (SEQ ID NO: 28)、hz-HC7 (SEQ ID NO: 29)、hz-HC8 (SEQ ID NO: 30)、hz-HC9 (SEQ ID NO: 31)、hz-HC10 (SEQ ID NO: 32)及hz-HC11 (SEQ ID NO: 33)；及/或(2)選自由以下組成之群之可變輕鏈(VL )：hz-LC1 (SEQ ID NO: 34)、hz-LC2 (SEQ ID NO: 35)、hz-LC3 (SEQ ID NO: 36)、hz-LC4 (SEQ ID NO: 37)及hz-LC5 (SEQ ID NO: 38)。
本文中揭示經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含選自以下之重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43。
本文中揭示經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含選自SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 44之輕鏈胺基酸序列。
本文中揭示經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係選自由以下組成之群：a) Y1238-hz1-P238K，其具有SEQ ID NO: 39之重鏈及SEQ ID NO: 41之輕鏈； b) Y1238-hz1-N297A，其具有SEQ ID NO: 40之重鏈及SEQ ID NO: 41之輕鏈； c) Y1238-hz2-P238K，其具有SEQ ID NO: 42之重鏈及SEQ ID NO: 44之輕鏈；及 d) Y1238-hz2- N297A，其具有SEQ ID NO: 43之重鏈及SEQ ID NO: 44之輕鏈。
本文中揭示抗體或其抗原結合部分，其中該抗原結合部分係選自由以下組成之群：Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2、雙價抗體及scFv-Fc。
本文中所揭示之抗體或其抗原結合部分可係免疫偶聯物，其中該抗體或其抗原結合部分連接至治療劑。
本文中所揭示之抗體或其抗原結合部分可係雙特異性抗體，其中該抗體或其抗原結合部分連接至第二功能性部分，該第二功能性部分具有不同於該抗體或其抗原結合部分之結合特異性。
本文中所揭示之抗體或其抗原結合部分進一步包含另外部分。
Fc 域 重鏈之羧基末端「一半(half)」界定恆定區(Fc)且其主要負責效應物功能。如本文所使用，術語「Fc域」係指包含CH2及CH3恆定域之恆定區抗體序列，如根據Kabat等人，Sequences of Immunological Interest, 第5版, U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)所定界。Fc區可源自人類IgG。舉例而言，Fc區可源自人類IgG1或人類IgG4 Fc區。重鏈可變域可融合至Fc域。可變域之羧基末端可連接或融合至Fc CH2域之胺基末端。或者，可變域之羧基末端可連接或融合至連接體胺基酸序列之胺基末端，該連接體胺基酸序列本身融合至Fc域之胺基末端。或者，可變域之羧基末端可連接或融合至CH1域之胺基末端，該CH1域本身融合至Fc CH2域。視情況，蛋白質可在CH1域之後全部或部分地包含鉸鏈區。視情況，胺基酸連接體序列在可變域與Fc域之間呈現。輕鏈可變域之羧基末端可連接或融合至CL域之胺基末端。
重鏈CH1之例示性序列係SEQ ID NO: 85之胺基酸118-215。輕鏈CL之例示性序列係SEQ ID NO: 88之胺基酸112-218。
抗體可係融合抗體，其包含特異性結合人類CD40之第一可變域及包含Fc域之第二域。
融合蛋白中所用之例示性Fc域可包括人類IgG域。例示性人類IgG Fc域包括IgG4 Fc域及IgG1 Fc域。雖然人類IgG重鏈基因編碼C端離胺酸，但由於在血液循環中裂解，故離胺酸通常不存在於內源性抗體中。當在哺乳動物細胞培養物中表現時，具有IgG重鏈(包括C端離胺酸)之抗體亦可存在可變含量之C端離胺酸(Cai等人，2011,Biotechnol Bioeng . 108(2):404-12)。因此，可省略本文所揭示之任何IgG重鏈Fc域之C端離胺酸。
本文所闡述之經分離抗體或其抗原結合部分可包含含有以下胺基酸序列之Fc域：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(P/K)SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY(N/A)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR(D/E)E(L/M)TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K/不存在) (Fc共有；SEQ ID NO: 112)。
Fc域可包含選自表4中序列之胺基酸序列。SEQ ID NO: 10、12、14、16、99、101、103及105在N端包含CH1域(殘基1-98)。表 4
本發明抗體之可變區可視情況藉由「胺基酸連接體」或「連接體」連接至Fc域。舉例而言，可變重鏈域之C端可融合至胺基酸連接體之N端，且Fc域可融合至該連接體之C端。儘管胺基酸連接體可為任何長度且可由任何胺基酸組合組成，但連接體長度可相對較短(例如，五個或更少之胺基酸)以降低經連接域之間之相互作用。亦可調整連接體之胺基酸組成以降低具有巨大側鏈之胺基酸有可能引入二級結構之胺基酸之數目。適宜胺基酸連接體包括(但不限於)長度為至多3、4、5、6、7、10、15、20或25個胺基酸之彼等。代表性胺基酸連接體序列包括GGGGS (SEQ ID NO: 73)及包含GGGGS之2個、3個、4個或5個拷貝之連接體(分別SEQ ID NO: 74-77)。表5列示用於本揭示內容中之適宜連接體序列。表 5 代表性連接體序列
抗體製備 可使用普通技術在適宜哺乳動物宿主細胞系(例如CHO、293、COS、NSO及諸如此類)中產生並純化抗體，之後使用一種方法或方法組合進行純化，該(等)方法包括蛋白質A親和層析、離子交換、反相技術或諸如此類。
如業內所熟知，多個密碼子可編碼相同胺基酸。因此，編碼蛋白質序列之核酸包括具有密碼子簡併性之核酸。本文所揭示之多肽序列可由多種核酸編碼。遺傳密碼係通用的且眾所周知。編碼本文所揭示之任何多肽序列之核酸可容易地基於業內之習用知識構想並經最佳化用於生產。雖然編碼給定多肽之核酸序列之可能數目較大，但給予遺傳密碼之標準表且由電腦輔助，熟習此項技術者可容易地生成編碼給定多肽之核酸序列之每種可能組合。
編碼5F11-45重鏈可變域之代表性核酸序列為：caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcactgacttatcgatgcac tgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtggatatactgcgtacaatcagaagttcaagggc aagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttac tggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca (SEQ ID NO: 113)。在此序列中，核苷酸76-10編碼重鏈之5F11-45可變域之CDR1，核苷酸148-196編碼CDR2，且核苷酸295-318編碼CDR3。
編碼5F11-45輕鏈可變域之代表性核酸序列為：gacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactgg taccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctagaatct ggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggatcctctcacg tttggccaggggaccaagctggagatcaaa (SEQ ID NO: 114)。在此序列中，核苷酸70-117編碼輕鏈之5F11-45可變域之CDR1，核苷酸160-180編碼CDR2，且核苷酸277-303編碼CDR3。
編碼包含P238K Fc域之5F11-45重鏈之代表性核酸序列為：caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtggatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaaagtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 115)。在此序列中，核苷酸1-351編碼重鏈之可變域。核苷酸352-645編碼CH1域，且核苷酸646-1338編碼Fc域。視情況，可將離胺酸之密碼子添加至Fc域序列之3’端。
編碼5F11-45輕鏈之代表性核酸序列為：gacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactgg taccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctagaatct ggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggatcctctcacg tttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 116)。在此序列中，核苷酸1-333編碼輕鏈之可變域，且核苷酸334-654編碼CL。
重鏈及/或輕鏈之編碼序列可在編碼序列之5’端編碼信號肽，例如MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 119)。5F11-45重鏈及輕鏈之例示性編碼序列(各自包括信號肽編碼序列)為：atgagggcttggatcttctttctgctctgcctggccgggagagcgctcgcacaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtggatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaaagtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 117)，及 atgagggcttggatcttctttctgctctgcctggccgggcgcgccttggccgacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctagaatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggatcctctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 118)。
因此，亦涵蓋編碼本文所揭示抗體之核酸。此一核酸可插入至載體(例如適宜表現載體，例如pHEN-1)中(Hoogenboom等人，(1991)Nucleic Acids Res. 19:4133-4137)。進一步提供包含載體及/或核酸之經分離宿主細胞。
可僅使用普通技術，在任何適宜哺乳動物宿主細胞系(例如CHO (中國倉鼠卵巢細胞)、293 (人類胚腎293細胞)、COS細胞、NSO細胞及諸如此類)中產生並純化本揭示內容之抗體，之後使用一種方法或方法組合進行純化，該(等)方法包括蛋白質A親和層析、離子交換、反相技術或諸如此類。
醫藥組合物及治療方法 醫藥組合物包含治療有效量之一或多種抗體及視情況醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑包括(例如)水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及諸如此類以及其組合。醫藥上可接受之載劑可進一步包含極少量之輔助性物質，例如增強融合蛋白之儲放壽命或有效性之潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑。組合物可經調配以在投與後提供一或多種活性成分之快速、持續或延長釋放。適宜醫藥組合物及其製備方法為業內所已知。例如，參見 Remington，THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，A. Gennaro等人編輯, 第21版, Mack Publishing Co. (2005)。
醫藥組合物進一步可包含免疫抑制劑/免疫調節劑及/或抗發炎劑。
治療需要此治療之患者之免疫疾病的方法可包含向該患者投與治療有效量之抗體。舉例而言，拮抗CD40介導之T細胞活化可抑制在自體免疫、移植排斥或過敏反應期間發生之不期望之T細胞反應。抑制CD40介導之T細胞活化可緩和該等疾病之進展及/或嚴重程度。
亦提供本揭示內容之抗體或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製備用於治療需要此治療之患者之免疫疾病的藥劑。該藥劑可(例如)與免疫抑制劑/免疫調節劑及/或抗發炎劑組合投與。
如本文所使用，「患者」意指動物，例如哺乳動物(包括人類)。該患者可診斷為患有免疫疾病。「治療(treatment或treat或treating)」係指涉及使症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重程度緩和之過程。「免疫疾病」係指與個體之免疫反應(包括細胞性及/或體液性免疫反應)之發展相關之任何疾病。免疫疾病之實例包括(但不限於)發炎、過敏、自體免疫疾病或移植相關疾病。「自體免疫疾病」係指與個體之自體免疫反應(包括細胞性及/或體液性免疫反應)之發展相關之任何疾病。自體免疫疾病之實例係發炎性腸病(IBD)，包括(但不限於)潰瘍性結腸炎及克隆氏病。其他自體免疫疾病包括全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、類風濕性關節炎、糖尿病、牛皮癬、硬皮症及動脈粥樣硬化。移植相關疾病包括移植物抗宿主病(GVHD)、急性移植排斥及慢性移植排斥。
可藉由投與本揭示內容之抗體治療之疾病可選自由以下組成之群：艾迪森氏病、過敏、過敏反應、關節黏連性脊椎炎、氣喘、動脈粥樣硬化、異位性過敏、耳之自體免疫疾病、眼之自體免疫疾病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、支氣管氣喘、冠狀動脈心臟病、克隆氏病、糖尿病、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷氏病、格林-巴利症候群、橋本氏病、溶血性貧血、特發性血小板減少紫斑症、發炎性腸病、對重組藥物產品之免疫反應(例如，血友病患者中之因子VII)、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、重症肌無力、天疱瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮症、薛格連氏症候群、脊椎關節病變、甲狀腺炎、移植排斥、血管炎及潰瘍性結腸炎。
醫藥組合物可單獨投與或與免疫抑制劑/免疫調節劑及/或抗發炎劑一起作為組合療法(即，同時或依序)投與。不同之免疫疾病可需要使用可用於治療免疫疾病之特定輔助化合物，其可基於患者來確定。舉例而言，醫藥組合物可與一或多種適宜佐劑(例如，細胞介素(例如IL-10及IL-13))或其他免疫刺激物(例如，趨化介素、腫瘤相關抗原及肽)組合投與。適宜佐劑為業內所已知。
可使用任何適宜方法或途徑來投與抗體或醫藥組合物。投與途徑包括(例如)靜脈內、腹膜內、皮下或肌內投與。投與抗體之治療有效劑量取決於多種因素，包括(例如)所治療免疫疾病之類型及嚴重程度、組合療法之使用、抗體或醫藥組合物之投與途徑及患者之體重。域抗體之治療有效量之非限制性範圍為相對於患者之體重0.1-20毫克/公斤(mg/kg)，且在一態樣中為1-10 mg/kg。
套組 提供可用於治療人類患者之免疫疾病之套組。該套組可包含(a) 一定劑量之本揭示內容之抗體及(b) 在治療患者免疫疾病之方法中使用該抗體之說明性材料。
如本文所使用之術語「說明性材料」包括出版物、記錄、圖表或任何其他表達媒介，其可用於在套組中傳達本發明之組合物及/或化合物之可用性。套組之說明性材料可(例如)貼附至含有本發明之化合物及/或組合物之容器或與含有該化合物及/或組合物之容器一起運輸。或者，說明性材料可與容器分開運輸，意圖在於使接收者協作地使用說明性材料及化合物。說明性材料之遞送可(例如)藉由物理遞送傳遞套組可用性之出版物或其他表達媒介來實施，或可替代地藉由電子傳輸(例如藉助電腦，例如藉由電子郵件或自網站下載)來達成。
實例 實例 1 ：抗 CD40 抗體之 Fc- 格式化影響不成熟樹突細胞之活化。 可藉由使重鏈恆定區(例如在鉸鏈及Fc域中)突變，將抗體改造為對FcgR (FcγR)具有不同的親和力及選擇性。可引入突變以增強或降低FcgR結合。該等突變可增加或減少FcgR介導之交聯及/或信號傳導。對於治療靶標(例如CD40)而言，FcgR介導之抗CD40抗體交聯可具有導致不期望之激動劑信號傳導及潛在毒性之可能性。重要的是鑑別展示降低之FcgR結合以及潛在交聯及/或信號傳導、特定而言降低之「低親和力」 FcgRs hCD32a/FcgRIIa、hCD32b/FcgRIIb、hCD16a/FcgRIIIa及hCD16b/ FcgRIIIb之接合的抗CD40拮抗劑抗體。一般認為「高親和力」受體CD64/FcgRI之接合受到較少關注係因為此受體被血清IgG飽和。
抗體5F11-45揭示於美國專利公開案20160376371(以引用的方式併入本文中)中作為對人類CD40具有高親和力之人類化抗體，其經改造具有激動劑活性及優先結合至CD32a-R131及CD32b之能力。下表6提供5F11-45之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。在重鏈可變區中，CDR1係胺基酸26-35，CDR2係胺基酸50-66且CDR3係胺基酸99-106。在輕鏈可變區中，CDR1係胺基酸24-38，CDR2係胺基酸54-60且CDR3係胺基酸93-101。在每一可變區中CDR下劃線。
為探索Fc格式化對不成熟樹突細胞(iDC)活化之影響，將人類化抗CD40抗體5F11-45用野生型人類IgG1f同型格式化(5F11-45-IgG1f)以及用四個具有經設計降低FcgR結合之突變的同型格式化(即5F11-45-IgG1.3f、5F11-45-CTza、5F11-45-P238K、5F11-45-N297A)。參見表6中之SEQ ID NO: 81-85。表6進一步列示每一5F11-45抗體之重鏈及輕鏈恆定區。Fc域在表6中劃下線。重鏈可變區(胺基酸1- 117)及輕鏈可變區(胺基酸1- 111)係呈粗體字體。可變區(呈粗體字體)與Fc域(劃下線)之間的序列(重鏈之胺基酸118-215)包含重鏈中之CH1域。輕鏈中之非粗體序列(胺基酸112-218)包含CL域。表 6
作為對照，改造相同之5F11-45抗體用於增強與人類CD32a及CD32b蛋白(5F11-45-SE；重鏈(HC)及輕鏈(LC)分別繪示為SEQ ID NO: 86及88)之結合或增強對hCD32b超過hCD32a (5F11-45-V11；重鏈及輕鏈分別繪示為SEQ ID NO: 87及88)之選擇性。
藉由表面電漿共振(SPR)，所有5G11-45 Fc變體均展示與CD40靶標之高親和力結合，表7。表7 ： 在蛋白質A感測器晶片表面上捕獲之人類-CD40單體與5F11-45抗體結合之SPR動力學及親和力數據。
藉由SPR來表徵Fc改造之5F11-45抗體之FcgR結合譜，以確定Fc突變是否對FcgR結合及選擇性具有期望影響。FcgR結合之SPR數據示於表8中。表8 ： 1 μM或10 μM 5F11-45抗體與抗his Fab捕獲之hFcgR-his蛋白結合之Rmax%數據。
如表8中所示，5F11-45-IgG1f結合至所有FcgR，尤其強烈地結合至CD64、CD16a-V158及CD32a-H131。S267E變體(5F11-45-SE) (對照)展示與CD32a及CD32b蛋白之預期增強結合。5F11-45-V11之IgG1 V11同型中存在之五個突變提供對CD32b之增強選擇性。
其他四個5F11-45 Fc變體顯示降低之FcgR結合。5F11-45-IgG1.3f展示與所有FcgR之結合降低，包括與CD64之最弱結合。在極高抗體濃度(即，10 μM)下，觀察到5F11-45-IgG1.3f與CD32a-R131之一些較弱結合。相比之下，其他三種變體(5F11-45-CTza、5F11-45-P238K及5F11-45-N297A)展示幾乎檢測不到之與任何低親和力FcgR之結合，即使在10 μM抗體濃度下亦如此。參見 上表7。在CD64結合、尤其解離速率方面亦觀察到差異，與5F11-45-CTza或5F11-45-IgG1f相比，5F11-45-P238K及5F11-45-N297A之解離速率顯著更快，圖1。
不成熟樹突細胞(iDC)藉助聚集/交聯對CD40之間接活化敏感，其可導致不成熟DC之活化，從而導致細胞介素釋放(例如，介白素-6 (Il-6))及細胞表面活化信號上調(例如，CD86及CD54)。使用高度過表現CD32a且對FcgR具有低親和力之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞來展示FcgR介導之聚集/交聯之可能性。CHO細胞對iDC之比率係1:6，此表示增大之聚集/交聯程度。
BMS-986090係融合至IgG4 Fc域之抗CD40拮抗劑域抗體且具有以下胺基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSS AST ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK, (SEQ ID NO: 89) (其為WO 2012/145673中之SEQ ID NO: 1287)。BMS-986090序列之加實體下劃線之部分對應於BMS3h-56-269域抗體(其為WO 2012/145673中之SEQ ID NO: 417)。虛線下劃線「AST」係連接體且其餘部分為稱為IgG4.1之Fc域。2141 (mAb 134-2141)係CD40激動劑抗體(參見 Robert Vonderheide等人，「Clinical Activity and Immune Modulation in Cancer Patients Treated with CP-870,893, a Novel CD40 Agonist Monoclonal Antibody,」 25(7): 876-883 (2007))。BMS-986090及2141用作交聯介導之抗CD40 iDC活化之陽性對照。無CD40結合能力之融合蛋白L6-IgG4用作陰性對照。如圖2中可見，5F11-45-CTza、5F11-45-P238K及5F11-45-N297A在可溶或由細胞表面CD32交聯/聚集時均不顯示交聯介導之抗CD40 iDC活化，如藉由增加之細胞介素(介白素-6；Il-6；圖2A)或活化標記物增加(CD86 MFI；圖2C及CD54 MFI；圖2B)所量測。5F11-45-IgG1.3f僅在與CD32 CHO細胞一起共培育時展示適度iDC活化，如CD54及CD86細胞表面染色增加所指示。展示與低親和力FcgR結合之所有變體(即，5F11-45-IgG1f、5F11-45-SE及5F11-45-V11)展示隨著CD32 CHO細胞之添加，iDC活化顯著增加，圖2。用CTza、P238K及N297A格式化之5F11-45抗體未展示任何可檢測之iDC活化。該等數據支持用CTza、P238K或N297A格式化之5F11-45抗體拮抗CD40活性。
為進一步評價其他抗體中之該等觀察，將強效小鼠抗人類-CD40抗體Y1238格式化為具有該等同型之嵌合抗體及IgG1.3f (對於重鏈EQ ID NO: 90-93且對於輕鏈EQ ID NO: 94)。參見表9。重鏈可變區為胺基酸1- 118 (粗體字體)。在重鏈可變區中，CDR1為胺基酸26-36，CDR2為胺基酸50-66，且CDR3為胺基酸99-107。Fc域為胺基酸217-448。可變區(呈粗體字體)與Fc域(劃下線)之間的序列(重鏈之胺基酸119-216)構成重鏈中之CH1域。輕鏈可變區為胺基酸1- 107。在輕鏈可變區中，CDR1為胺基酸24-34，CDR2為胺基酸50-56，且CDR3為胺基酸89-97。輕鏈中之胺基酸108-214構成CL域。表 9
藉由SPR測試該等嵌合抗體之CD40及FcgR結合，以及iDC活化。所有Fc變體Y1238嵌合抗體均展示對人類-CD40之高親和力，表10。表10 ：在蛋白質A感測器晶片表面上捕獲之人類-CD40單體與嵌合Y1238抗體結合之SPR動力學及親和力數據。
與IgG1f同型對照相比，如同5F11-45，具有經改造Fc域之嵌合Y1238抗體展示顯著更弱之FcgR結合。Y1238-IgG1.3f分子展示出對低親和力FcgR、尤其CD32a-R131及CD32b之一些弱但可量測之結合反應。相比之下，CTza、P238K及N297A變體與該等FcgR具有極弱或不可檢測之結合，即使在10 μM抗體濃度下亦如此，表11。表 11 ：1 μM或10 μM嵌合Y1238抗體與抗His Fab捕獲之hFcgR-his蛋白結合之Rmax%數據。
嵌合Y1238抗體之CD64結合與5F11-45變體類似，其中IgG1.3f展示最弱之CD64結合。無論係呈Y1238嵌合抗體形式或呈5F11-45，P238K及N297A變體二者均具有顯著快於CTza之解離速率。
當用CTza、P238K或N297A同型格式化時，如同5F11-45，嵌合Y1238在單獨或在添加FcgR (CD32)過表現之CHO細胞之情形下均不展示iDC之活化，圖3。具有IgG1.3f Fc序列之嵌合Y1238觀察到最小活化。然而，隨著與表現CD32之CHO細胞一起共培育，iDC細胞介素釋放(圖3A)且活化標記物上調(圖3B及3C)增加。
在來自其他供體之iDC中進一步測試嵌合Y1238-P238K及Y1238-N297A，證實該等分子在單獨或在添加CD32 CHO細胞之情形下均不使不成熟樹突細胞活化，圖4。該等研究中之陽性對照係BMS-986090及2141；當在溶液中使用時，兩種抗體均導致來自供體子組之細胞中之iDC活化(圖3及4)。然而，iDC活化隨著CD32 CHO細胞聚集/交聯顯著增加，此在來自在該等條件下測試之每個供體之細胞中觀察到。
實例 2 ：當用含有 P238K 或 N297A 突變 之同型進行格式化時，人類化 CD40 拮抗劑抗體 Y1238 展示對 CD40 信號傳導之強效抑制且無激動劑信號 。 人類化背景/程序係如WO2017004006中之部分「II. Engineered and Modified Antibodies」所論述，其係以全文引用的方式併入本文中。基於此分析，選擇11個VH 序列(SEQ ID NO: 23-33)及5個Vκ 序列(SEQ ID NO: 34-38)進行測試。取代以粗體及虛線下劃線來指示。每一可變重鏈及可變輕鏈中之CDR (呈CDR1-CDR2-CDR3定向)係由劃下線指示，即，對於可變重鏈CDR分別為GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17)、VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18)及SQLGRRFDY (SEQ ID NO: 19) (表12)且對於可變輕鏈CDR分別為KASQDVRTGVA (SEQ ID NO: 20)、SASYRNT (SEQ ID NO: 21)及QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22) (表13)。表 12 ：人類化 Y1238 可變重鏈序列： 表 13 ：人類化 Y1238 可變輕鏈序列：
VH 序列在IgG1.3f情況中經格式化。將Vκ 序列格式化為具有共有CL序列之全輕鏈。將該等人類化HC及LC構築體之所有55種組合以及嵌合Y1238分子表現為3 ml上清液，以供藉由SPR進行結合分析。將56種上清液中之每一者以及經純化之Y1238-嵌合IgG1抗體於蛋白質A感測器晶片上捕獲且在篩選分析中使用BIAcoreTM SPR測試與兩種濃度(即，200 nM及1000 nM)之hCD40-單體之結合。所有抗體(含有hz-HC3者除外)均使用表現上清液之100倍稀釋液以高含量(＞300 RU)捕獲，此指示上清液中之高抗體效價(hz-HC3樣品除外)。將兩種濃度之hCD40-單體之動力學數據擬合至1:1朗繆爾(Langmuir)模型，以產生該等相互作用之動力學及親和力值之估計值，且用於對不同分子進行比較。該等數據顯示，所捕獲之抗體以高親和力結合至CD40；所估計KD值在介於2.65 nM與18.2 nM之間，參見 表14。對於給定輕鏈，具有重鏈hzHC1、hz-HC2、hz-HC4、hz-HC5、hz-HC6、hz-HC7、hz-HC8及hz-HC9之抗體展示較含有hz-HC10或hz-HC11之彼等更高之CD40親和力。同樣，對於給定重鏈，具有輕鏈hz-LC1或hz-LC2之抗體較具有hz-LC3、hz-LC4或hz-LC5之彼等具有更高之CD40親和力。當與如表14中所示之分析物之完全動力學滴定系列相比時，CD40與代表性上清液及純化嵌合Y1238之結合之完全動力學滴定系列亦展示，基於2點(200 nM及1000 nM)篩選數據之所估計KD 值係上清液樣品之結合動力學及親和力之合理估計值。表14 ： 在蛋白質A感測器晶片表面上捕獲之人類-CD40單體與人類化Y1238抗體結合之SPR動力學及親和力數據。顯示2點篩選分析之數據，其中測試人類-CD40單體之200 nM及1000 nM樣品，以及「完全動力學」分析之數據，其中測試人類-CD40單體之全濃度系列。
基於上清液篩選SPR數據及對具有較少框架回復突變之構築體之偏向，選擇人類化Y1238抗體之子組用於表現、純化及進一步表徵。用P238K及N297A同型對該等抗體中之兩者(即，Y1238-hz1及Y1238-hz2)進行格式化(即，對於重鏈SEQ ID NO: 39、40、42及43；對於輕鏈參見表15)並藉由SPR測試CD40及FcgR結合。CD40結合SPR數據顯示每一抗體以高親和力結合CD40靶標，表16。將該數據與另一抗CD40抗體抗體BI-mAb-B (即，SEQ ID NO: 95及96，美國專利第9,090,696號中所揭示且在其中稱為「抗體B」)之數據進行比較，該抗體BI-mAb-B以顯著低於人類化Y1238分子之親和力結合，表15。Fc域下劃線。表 15
來自表15之Hz1及Hz2之兩個輕鏈序列(SEQ ID NO: 41及44)之比對如下，且展示該兩個序列之間的一個突變差異(在位置66處；下方劃線)： 表 16 ： 在蛋白質A感測器晶片表面上捕獲之人類-CD40單體與人類化Y1238抗體或BI-mAb-B結合之SPR動力學及親和力數據。
所有Y1238抗體均展示為係由可溶性CD40L三聚體或來自表現CD40L之CHO細胞的細胞CD40L驅動之B細胞增殖之強效拮抗劑(參見表17)。相比之下，競爭抗體BI-mAb-B及5F11-45-P238K顯示對由可溶性CD40L信號驅動之B細胞增殖之強效抑制，但在抑制由細胞CD40L (過表現CD40L之CHO細胞)驅動之B細胞增殖方面不太有效。當使用細胞CD40L來刺激B細胞時，Y1238嵌合及人類化抗體僅展現約10倍之功效轉變。表17. 由可溶性CD40L三聚體或來自CD40L過表現CHO細胞之細胞相關CD40L驅動之扁桃體人類B細胞之抑制。抑制B細胞增殖之IC50以ng/ml給出。指示標準偏差(STDEV)及供體數量(n)。*BI mAb-B及5F11-45-P238K並未完全抑制B細胞增殖，給出1 μg/ml下之平均抑制。
人類化Y1238抗體(即，Y1238-hz1-N297A、Y1238-hz1-P238K、Y1238-hz2-P238K及Y1238-hz1-N297A)之FcgR結合與嵌合Y1238抗體及5F11-45抗體之先前數據一致，此顯示對所有低親和力FcgR之極弱結合反應，表18。表18 ：1 μM或10 μM人類化Y1238抗體與抗His Fab捕獲之hFcgR-His蛋白結合之Rmax%數據。
另外，當單獨或在添加表現FcgR CD32之CHO細胞之情形下測試時，Y1238抗體之人類化形式相對於陰性對照蛋白質L6-IgG4展現極小之iDC活化。此觀察結果與人類化Y1238抗體不能活化CD40一致，即使在CD32過表現CHO細胞提供增加之交聯之情形下亦如此。相比之下，2141及BMS-986090對照二者均在單獨的情形下顯示iDC之供體依賴性適度活化，其在由CD32 CHO細胞交聯或聚集時強烈增加，圖5及圖6。類似地，當跨越更大之iDC供體組測試時，5F11-45-P238K在單獨或在CD32介導之聚集或交聯之情形下不展現活化，圖6。
用於實例之材料及方法 FCGR 結合 SPR ： FcgR結合可使用(例如) BIAcoreTM 表面電漿共振(SPR)方法使用經純化之FcgR在活體外來量測。一種方法測試經純化抗體與帶His標籤之FcgR蛋白(FcgR-His)之結合，該等蛋白質捕獲於抗His抗體之經固定Fab片段上。該等實驗係在BIAcoreTM T100或BIAcore™ T200儀器(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)上在25℃下實施。使用標準乙基(二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)化學品並利用乙醇胺封阻將來自鼠類抗6×His抗體(內部產生)之Fab片段固定在CM5感測器晶片上，直至於10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性劑p20 (HBS-EP+)之運行緩衝液中之密度為約3000 RU。所有剩餘研究均使用10 mM NaPO4、130 mM NaCl、0.05% p20 (PBS-T) pH 7.1之運行緩衝液實施。在10 μl/min下使用30 sec之接觸時間將含有C端6×多組胺酸標籤(內部產生)之各種FcγR蛋白捕獲於此表面上(通常使用約7 μg/ml之FcgR-his蛋白濃度)。測試各種濃度之經純化抗體之結合，例如使用在30 μl/min下120秒之締合時間及在30 μl/min下120秒之解離時間。在該等研究中測試之FcgR蛋白包括「高親和力」 FcgR CD64 (hFcgRI)，以及「低親和力」 FcgR CD32a-H131 (FcgRIIa-H131)、CD32a-R131 (FcgRIIa-R131)、CD32b (FcgRIIb)、CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158)及CD16b-NA2 (FcgRIIIb-NA2)。
為定量地分析結合反應並比較不同分子之FcgR結合，可藉由使用以下方程式將最大結合反應計算為理論最大結合反應之百分比(Rmax%)來分析SPR結合數據：方程式 1 ： Rmax% = (結合反應分析物) / [ ((Mw分析物) / (Mw配體)) × (反應配體) × (分析物:配體化學計量學) ] 其中「分析物」係抗體且配體係所捕獲之FcgR蛋白。
此分析未慮及抗體或FcgR之醣基化質量並假設所捕獲之配體具有100%分數活性。由於FcgR經醣基化，因此即使在飽和條件下，Rmax%值通常亦小於100%。Rmax%分析尤其可用於評估「低親和力」 FcgR CD32a-H131、CD32a-R131、CD32b、CD16a-V158及CD16b-NA2之結合，其具有相對較快之締合及解離速率及接近或低於所測試分析物濃度(1 uM)之親和力，因此在該等條件下通常不會達成表面飽和。相比之下，「高親和力」 FcgR CD64較其他FcgR以更高之親和力及更慢之解離動力學結合至尤其IgG1及IgG4。因此，該等同型在微莫耳分析物濃度下通常使CD64表面飽和，且更難以使用Rmax%來區分結合親和力。對於該等相互作用而言，藉由比較感測圖數據中之解離速率可容易地觀察到抗體之間之差異。
CD40 結合動力學及親和力： 抗體分子之單價CD40結合親和力係藉由SPR在BIAcoreTM T100或T200儀器(GE Healthcare)上在25℃下來量測，其係藉由將抗體捕獲於經固定之蛋白質A感測器晶片表面上，且然後於pH 7.1之PBS-T (含有Tween®20之磷酸鹽緩衝鹽水)中在30 μl/min下使用180秒之締合時間、360秒之解離時間結合人類-CD40-單體蛋白質(內部產生)來實施。
原代細胞分離及培養： 藉由聚蔗糖密度梯度分離自肝素化人類血液分離PBMC (外周血單核細胞)。遵循Manual EasySep方案(STEMCELL, Vancouver, Canada)，自PBMC分離單核球。將一百萬個經分離單核球平鋪於6孔板之每一孔中之6 ml含有人類IL-4 (介白素-4，100 ng/ml)及人類GM-CSF (顆粒球巨噬細胞群落刺激因子，100 ng/ml)之完全培養基(RPMI-1640，10%熱不活化胎牛血清、100單位/ml青黴素-鏈黴素)中，並在37℃/5% CO2下培育6天，每隔一天更換培養基且將其更換為含有相同濃度細胞介素之新鮮培養基。在第6天收穫iDC，充分洗滌並重新懸浮於完全培養基中。
在FcγR 聚集/ 交聯存在或不存在下利用抗CD40 抗體處理iDC ： 各種生物劑之滴定係在完全培養基中進行，且添加至一式兩份之96孔板。在交聯之情形下，將抗體添加至細胞持續30 min.，之後以1:6之比率添加表現CD32a之CHO細胞。將細胞在37℃下在5% CO2下培育大約18-20小時。自每一孔去除150 μL上清液，以1:5稀釋，且使用市售ELISA套組(R&D Systems, Minneapolis, MN)，根據製造商之說明書評估IL-6、TNFα及IL-12之蛋白質濃度。將板中剩餘之來自所收穫上清液之細胞合併成每一式兩份處理1份樣品，並轉移至新的96孔圓底(RB)板且置於4℃下。將細胞用不含Ca++ 及Mg++ 之D-PBS (杜貝克氏(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水)洗滌，並使用LIVE/DEAD®可固定近紅外死細胞染色套組(Invitrogen, Carlsbad, CA)在冰上染色30 min.以獲得細胞存活率。將細胞洗滌並重新懸浮於不含Ca++ 及Mg++ 之D-PBS (2%胎牛血清(FBS)、0.1 % NaN3 (染色緩衝液))中，並用5 μl/孔於染色緩衝液中之人類TruStain FcX™ (Fc受體封阻溶液，Biolegend, San Diego, CA)封阻。
用以下對DC 進行免疫染色： 偶聯PerCpCy5.5α之CD3、αCD19、αCD14 (Lin- )、偶聯BUV395之αCD11c (BD Biosciences, San Diego, CA)、偶聯APC之αCD86 (Biolegend, San Diego, CA)、偶聯PE之αCD83 (eBioscience, San Diego, CA)、偶聯FITC之αCD54 (Biolegend, San Diego, CA)，並在4℃下培育45分鐘。將細胞於染色緩衝液中洗兩次並藉由添加100 μl BD Cytofix固定緩衝液(BD Bioscience, San Diego, CA)固定(在室溫下15分鐘，避光)。使用LSRII-Fortessa流式細胞儀(BD Biosciences, San Diego, CA)及FlowJo分析軟體(Treestar, Ashland, OR)評估DC之CD86、ICAM-1及CD83表現。
CD40L 之抑制誘導人類B 細胞增殖： 人類扁桃體B細胞係在常規扁桃體切除術期間自兒科患者獲得。細胞係藉由以下來分離：切碎並輕輕地搗碎組織，使細胞通過篩網並使用人類Lympholyte®-H分離介質(Cedarlane Labs, Burlington, ON)利用密度梯度分離來分離單核細胞。自界面收集單核細胞、洗滌並與綿羊紅血球在4℃下形成玫瑰花結(SRBC, Colorado Serum Company; Denver, CO)達1小時，之後進行密度梯度分離以去除T細胞。將細胞再次洗滌並重新懸浮於含有10% FBS之RPMI (完全培養基)中。抗體之滴定在完全培養基中進行，並以一式三份添加至96孔圓底(RB)板。添加1 × 105 個扁桃體人類B細胞，並用可溶性IZ-hCD40L (2 µg/mL)或用經10,000拉德(Rad)輻照之經人類CD40L穩定轉染之中國倉鼠卵巢細胞(CHO-hCD40L)進行刺激；然後將細胞以2 × 103 個細胞/孔平鋪，每一孔中之最終體積為200 μL。將板在37℃下在5% CO2下培育72小時，在最後6小時內用每孔0.5 µCi之3 [H]-胸苷進行標記，收穫並藉由液體閃爍來計數。基於胸苷併入定量B細胞增殖。
圖 1 繪示在結合有1 μM 5F11-45抗體之抗His FAB表面上捕獲7 μg/ml hCD64-His之SPR感測圖數據。圖 2 (包含圖2A-2C)繪示藉由兩個獨立供體中之抗CD40抗體5F11處理不成熟樹突細胞(iDC)之iDC活化數據。來自細胞培養基之IL-6 (介白素-6)(圖2A)及細胞表面標記物表現(CD54及CD86)增加，如藉由利用抗CD86及抗CD54抗體染色之流式細胞術平均螢光所指示。在圖2B及圖2C二者中，平均螢光強度(MFI)均係在Y軸上量測。指示抗體濃度(以μg/ml計)。藉由「x-連接」指示在分析中納入CHO-CD32細胞。圖 3 (包含圖3A-3C)繪示利用兩個獨立供體中之嵌合Y1238抗CD40抗體處理不成熟樹突細胞(iDC)之iDC活化數據。IL-6 (圖3A)及細胞表面標記物表現(即，CD54及CD86)增加，如藉由利用抗CD86 (圖3C)及抗CD54 (圖3B)抗體染色之流式細胞術平均螢光所指示。指示抗體濃度(以μg/ml計)。藉由「x-連接」指示納入CHO-CD32細胞。圖 4 (包含圖4A-4C)繪示藉由抗CD40抗體Y1238-P238K及Y1238-N297A處理不成熟樹突細胞(iDC)之iDC活化數據。量測來自細胞培養基之IL-6的增加(圖4A)。量測細胞表面標記物表現(CD54及CD86)，如藉由利用抗CD86 (圖4B)及抗CD54 (圖4C)抗體染色之流式細胞術平均螢光所指示。指示抗體濃度(以μg/ml計)。指示納入CHO-CD32細胞。圖 5 (包含圖5A-5C)繪示利用添加(x-連接)及不添加過表現CD32 CHO細胞之Y1238抗體之人類化(hz)形式處理iDC之iDC活化數據。指示10 μg/ml、30 μg/ml或100 μg/ml之抗體處理濃度。圖5A：細胞介素產生IL-6 (以pg/ml計) (上部圖)。圖5B：CD54染色之平均螢光強度。圖5C：CD86之平均螢光強度。圖 6 (包含圖6A-6C)繪示藉由8個獨立供體中之抗CD40抗體5F11處理不成熟樹突細胞(iDC)之iDC活化數據。來自細胞培養基之IL-6 (介白素-6)(圖6A)及細胞表面標記物表現(CD54；圖6B，及CD86；圖6C)增加，如藉由利用抗CD86及抗CD54抗體染色之流式細胞術平均螢光所指示。在圖6B及圖6C二者中，平均螢光強度(MFI)均係在Y軸上量測。指示抗體濃度(以μg/ml計) (10 µg/ml、30 µg/ml或100 µg/ml)。在分析中納入CHO-CD32細胞如所指示介導FcgR介導之交聯或聚集。CD40激動劑抗體2141號及抗CD40-dAB-IgG4用作陽性對照。IgG4-L6融合蛋白用作陰性對照。

Claims (23)

  1. 一種經分離之抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至人類CD40，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中： 該重鏈包含含有GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1)之CDR1、含有YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)之CDR2、含有LILQRGAY (SEQ ID NO: 3)之CDR3及人類重鏈恆定區；且 該輕鏈包含含有RASKNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4)之CDR1、含有RASNLES (SEQ ID NO: 5)之CDR2及含有QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6)之CDR3及人類輕鏈恆定區，且 該人類重鏈恆定區係人類IgG1 Fc域，其包含：(1) 在Kabat位置238之突變，降低與Fc-γ-受體(FcgR)之結合，其中脯胺酸238 (P238)突變為選自由以下組成之群之殘基中之一者：離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、精胺酸及色胺酸，且其中該抗體或抗原結合部分具有降低之FcgR結合；或(2)在Kabat位置297取代之丙胺酸。
  2. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分拮抗CD40之活性。
  3. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含人類IgG1 Fc域，該人類IgG1 Fc域包含在Kabat位置238之突變，降低與Fc-γ-受體(FcgR)之結合，其中脯胺酸238 (P238)突變為選自由以下組成之群之殘基中之一者：離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、精胺酸及色胺酸，且其中該抗體或抗原結合部分具有降低之FcgR結合。
  5. 如請求項4之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中P238突變為離胺酸。
  6. 如請求項4或5之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中該Fc域包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 98 (IgG1a-P238K (-C端Lys))、SEQ ID NO: 9 (IgG1a-P238K)、SEQ ID NO: 99 (CH1-IgG1a-P238K (-C端Lys))、SEQ ID NO: 10 (CH1-IgG1a-P238K)、SEQ ID NO: 100 (IgG1f-P238K (-C端Lys))、SEQ ID NO: 11 (IgG1f-P238K)、SEQ ID NO: 101 (CH1-IgG1f-P238K (-C端Lys))或SEQ ID No: 12 (CH1-IgG1f-P238K)。
  7. 如請求項3之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中該人類IgG1 Fc域包含SEQ ID NO: 98或SEQ ID NO: 100之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈包含選自由以下組成之群之胺基酸序列或由其組成：SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107及SEQ ID NO: 108；且該輕鏈包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列或由其組成。
  9. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含人類IgG1 Fc域，該人類IgG1 Fc域包含在Kabat位置297取代之丙胺酸。
  10. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中該Fc域包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 102 (IgG1a-N297A (-C端Lys))、SEQ ID NO: 13 (IgG1a-N297A)、SEQ ID NO: 103 (CH1-IgG1a-N297A (-C端Lys))、SEQ ID NO: 14 (CH1-IgG1a-N297A)、SEQ ID NO: 104 (IgG1f-N297A (-C端Lys))、SEQ ID NO: 15 (IgG1f-N297A)、SEQ ID NO: 105 (CH1-IgG1f-N297A (-C端Lys))或SEQ ID NO: 16 (CH1-IgG1f-N297A)。
  11. 如請求項1至10中任一項之經分離之抗體或其抗原結合部分，其中該經分離之抗體或其抗原結合部分經人類化。
  12. 如請求項1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗原結合部分係scFv-Fc。
  13. 如請求項12之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分連接至治療劑。
  14. 如請求項12之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分連接至具有不同於該抗體或其抗原結合部分之結合特異性之第二功能性部分。
  15. 如請求項1之抗體或其抗原結合部分，其進一步包含另外部分。
  16. 一種核酸，其編碼如請求項1至15中任一項之經分離之抗體或其抗原結合部分。
  17. 一種表現載體，其包含如請求項16之核酸分子。
  18. 一種細胞，其經如請求項17之表現載體轉化。
  19. 一種製備抗人類CD40抗體或其抗原結合部分之方法，其包含： a) 在如請求項18之細胞中表現該抗體或其抗原結合部分；及 b) 自該細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
  20. 一種醫藥組合物，其包含：a) 如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合部分；及b) 醫藥上可接受之載劑。
  21. 一種治療或預防個體免疫反應之方法，其包含向該個體投與如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合部分。
  22. 如請求項21之方法，其中該個體患有選自由以下組成之群之疾病：艾迪森氏病(Addison’s disease)、過敏、過敏反應、關節黏連性脊椎炎、氣喘、動脈粥樣硬化、異位性過敏(atopic allergy)、耳之自體免疫疾病、眼之自體免疫疾病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、支氣管氣喘、冠狀動脈心臟病、克隆氏病(Crohn’s disease)、糖尿病、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷氏病(Graves’ disease)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏病(Hashimoto’s disease)、溶血性貧血、特發性血小板減少紫斑症、發炎性腸病、對重組藥物產品之免疫反應(例如血友病患者中之因子VII)、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、重症肌無力、天疱瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮症、薛格連氏症候群(Sjogren’s syndrome)、脊椎關節病變、甲狀腺炎、移植排斥、血管炎及潰瘍性結腸炎。
  23. 一種包含如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合部分之藥劑之用途，其用於治療有需要之個體。
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