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TW201902929A - 專一性辨識磷脂肌醇蛋白聚醣3 (glypican 3) 之構築體及其用途 - Google Patents

專一性辨識磷脂肌醇蛋白聚醣3 (glypican 3) 之構築體及其用途 Download PDF

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TW201902929A
TW201902929A TW107114343A TW107114343A TW201902929A TW 201902929 A TW201902929 A TW 201902929A TW 107114343 A TW107114343 A TW 107114343A TW 107114343 A TW107114343 A TW 107114343A TW 201902929 A TW201902929 A TW 201902929A
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gpc3
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張鵬博
奕陽 許
賈維亞 莫勞斯
中野陽子
宏 劉
向京宜
堤摩西 艾克
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美商優瑞科生物技術公司
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Abstract

本申請案提供包含抗體部分的構築體，該抗體部分可專一性辨識磷脂肌醇蛋白聚醣3 (Glypican 3) (GPC3)，諸如與細胞表面結合之GPC3。亦提供製備及使用此等構築體之方法。

Description

專一性辨識磷脂肌醇蛋白聚醣3 (GLYPICAN 3) 之構築體及其用途
本發明係關於專一性辨識磷脂肌醇蛋白聚醣3(Glypican 3) (GPC3)之抗體構築體、其製備方法及其用途，包括治療及診斷疾病。
磷脂肌醇蛋白聚醣3 (GPC3，亦稱為SGB、DGSX、MXR7、SDYS、SGBS、OCI-5、SGBS1、GTR2-2)為一種細胞表面蛋白，其過度表現於多種類型的癌症中，包括多種實體腫瘤，諸如肝細胞癌(HCC)、黑色素瘤(Nakatsura T等人,Clin Cancer Res. 2004)、肺鱗狀細胞癌(Yu X等人, Genet Mol Res. 2015)、卵巢癌(Stadlmann S等人,Int J Gynecol Pathol. 2007)、卵黃囊腫瘤、絨膜癌(Zynger DL等人,Am J Surg Pathol. 2006)、威爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)及脂肪肉瘤(Baumhoer D等人,Am J Clin Pathol. 2008)。醫學上仍需要開發針對各種癌症(包括過度表現GPC3的癌症)的療法。
GPC3基因位於X染色體上且編碼580個胺基酸(aa)的70 kDa前驅蛋白。此前驅蛋白可以藉由弗林蛋白酶(Furin)在Arg358 與Cys359 之間分裂且產生經二硫鍵連接的40 kDa N末端亞單元及30 kDa C末端亞單元。成熟GPC3在接近於細胞膜之C末端區域藉由具有兩條硫酸肝素(HS)鏈的糖基化磷脂醯肌醇(GPI)錨附著至細胞表面。作為硫酸肝素蛋白聚醣家族的一員，GPC3為一種癌胚蛋白，其廣泛表現於人類胚胎中且經由與信號傳導因子(諸如Wnt、刺蝟信號傳導等)相互作用來調控形態發生或生長。GPC3不表現於正常成人肝臟中；然而，在肝癌發生期間，已報導GPC3在HCC患者中再活化。Yamauchi N等人檢查了GPC3在正常、非贅生性及贅生性肝臟組織中的表現，且發現GPC3存在於84% (47/56)的HCC患者中，但不存在於正常成人肝臟、肝硬化或肝炎中(Yamauchi N等人,Modern Pathology 2005)。其他研究組報導的結果類似(Nakatsura T等人,Biochem Biophys Res Commun. 2003；Baumhoer D等人,Am J Clin Pathol. 2008；Shirakawa H等人,Cancer Sci. 2009；Wang L等人,Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2015)。研究亦展示，GPC3在HCC患者中可以不同形式自細胞表面釋放至細胞外環境中，但在健康供者中則不然。因此，GPC3目前用作HCC之血清診斷標記物(Hippo Y等人,Cancer Res. 2004；Capurro M等人,Gastroenterology 2003；Haruyama Y及KataokaH,World J Gastroenterol. 2016)。
肝細胞癌(HCC)為最常見的肝癌類型，占所有肝癌的約75%。肝癌為世界上最常見的第五種癌症及最常見的第二種癌症死亡病因。肝癌發生率自1980年以來已增至超過三倍，且肝癌死亡率自2000年以來每年增加幾乎3%(https://www.cancer.org/cancer/liver-cancer/about/what-is-key-statistics.html)。肝癌預後非常不良，死亡率相對於發生率的總體比率為0.95。目前，肝癌治療主要限於化學療法或手術。然而，化學療法的作用因肝細胞表現ATP結合卡匣(ABC)轉運蛋白而通常受到限制，該等轉運蛋白能輸出大範圍的常用化學治療劑。另一選項手術僅可用於早期癌症，其中5年存活率為31%。若癌症診斷處於晚期(5年存活率：3-11%)，則唯一批准的化學療法為酪胺酸激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)。此療法使存活期僅增加2-3個月(Fleming BD及Ho M,Toxins 2016)。因此，需要開發一種新穎的肝癌治療方法。
本文所提及之所有公開案、專利、專利申請案及已公開專利申請案的揭示內容特此以全文引用的方式併入本文中。
本申請案在一個態樣中提供專一性辨識與細胞表面結合之GPC3 (在本文中稱為「原生形式GPC3」或「原生GPC3 (nGPC3)」)的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)。在一些實施例中，構築體(在本文中稱為「抗GPC3構築體」)包含專一性辨識原生形式GPC3的抗體部分(在本文中稱為「抗GPC3抗體部分」)。
因此，在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分。在一些實施例中，該抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3構築體針對與細胞表面結合之GPC3的Kd 為約0.1 nM至約2 nM (例如約0.1 nM至約1 nM，或約0.1 nM至約1.5 nM)。在一些實施例中，可溶性GPC3在抗GPC3構築體與與細胞表面結合之GPC3之間競爭結合的IC50為約1 µg/ml至約100 µg/ml (例如約1 µg/ml至約10 µg/ml，或約2 µg/ml至約5 µg/ml)。在一些實施例中，與細胞表面結合之GPC3包含SEQ ID NO: 460或SEQ ID NO: 462之胺基酸序列。在一些實施例中，與細胞表面結合之GPC3為HepG2細胞上所表現的GPC3。在一些實施例中，可溶性GPC3包含SEQ ID NO: 461或SEQ ID NO: 463之胺基酸序列。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。
在上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內之抗原決定基。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分不與GC33競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基。在一些實施例中，抗體部分不結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 536內的抗原決定基。在一些實施例中，抗體部分不結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO: 536的片段。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，GPC3表現於癌細胞表面上。在一些實施例中，癌細胞為肝癌細胞，諸如肝細胞癌(HCC)。
本申請案在另一個態樣中提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含：i)重鏈可變域(VH)，其包含含有SEQ ID NO: 1-31中任一者之胺基酸序列的重鏈互補決定區(HC-CDR) 1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、含有SEQ ID NO: 52-82中任一者之胺基酸序列的HC-CDR2或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體，及含有SEQ ID NO: 103-133中任一者之胺基酸序列的HC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體；以及ii)輕鏈可變域(VL)，其包含含有SEQ ID NO: 154-184中任一者之胺基酸序列的輕鏈互補決定區(LC-CDR) 1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、含有SEQ ID NO: 205-235中任一者之胺基酸序列的LC-CDR2或包含至多約3個胺基酸取代的其變異體，及含有SEQ ID NO: 256-286中任一者之胺基酸序列的LC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗體部分包含：i) VH ，其包含含有SEQ ID NO: 1-31中任一者之胺基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO: 52-82中任一者之胺基酸序列的HC-CDR2及含有SEQ ID NO: 103-133中任一者之胺基酸序列的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含含有SEQ ID NO: 154-184中任一者之胺基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO: 205-235中任一者之胺基酸序列的LC-CDR2及含有SEQ ID NO: 256-286中任一者之胺基酸序列的LC-CDR3。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分包含：i)包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之胺基酸序列的VH ，或與SEQ ID NO: 307-337中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之胺基酸序列的VL ，或與SEQ ID NO: 358-388中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗體部分包含：i)包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之胺基酸序列的VH ；及ii)包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之胺基酸序列的VL 。
本申請案在另一個態樣中提供抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含分離之抗GPC3構築體中之VH 的HC-CDR及VL 的LC-CDR，該VH 包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之胺基酸序列且該VL 包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之胺基酸序列。
本申請案在另一個態樣中提供一種分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含：i) VH ，其包含含有SEQ ID NO: 32-51中任一者之胺基酸序列的HC-CDR1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、含有SEQ ID NO: 83-102中任一者之胺基酸序列的HC-CDR2或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體，及含有SEQ ID NO: 134-153中任一者之胺基酸序列的HC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含含有SEQ ID NO: 185-204中任一者之胺基酸序列的LC-CDR1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、包含SEQ ID NO: 236-255中任一者之胺基酸序列的LC-CDR2或包含至多約3個胺基酸取代的其變異體，及含有SEQ ID NO: 287-306中任一者之胺基酸序列的LC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗體部分包含：i) VH ，其包含含有SEQ ID NO: 32-51中任一者之胺基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO: 83-102中任一者之胺基酸序列的HC-CDR2及含有SEQ ID NO: 134-153中任一者之胺基酸序列的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含含有SEQ ID NO: 185-204中任一者之胺基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO: 236-255中任一者之胺基酸序列的LC-CDR2及含有SEQ ID NO: 287-306中任一者之胺基酸序列的LC-CDR3。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，抗體部分包含：i)包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之胺基酸序列的VH ，或與SEQ ID NO: 338-357中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之胺基酸序列的VL ，或與SEQ ID NO: 389-408中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗體部分包含：i)包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之胺基酸序列的VH ；及ii)包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之胺基酸序列的VL 。
本申請案在另一個態樣中提供抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含分離之抗GPC3構築體中之VH 的HC-CDR及VL 的LC-CDR，該VH 包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之胺基酸序列且該VL 包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之胺基酸序列。
本申請案在另一個態樣中提供包含抗體部分的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其與上述抗GPC3構築體中任一者之經分離之抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至GPC3。
本申請案在另一個態樣中提供包含抗體部分的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其與上述任一種抗GPC3構築體之經分離之抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，專一性辨識GPC3的抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，專一性辨識GPC3的抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv (scFv)。在一些實施例中，專一性辨識GPC3的抗體部分為scFv。在一些實施例中，專一性辨識GPC3的抗體部分為Fab或Fab'。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，專一性辨識GPC3的抗體部分與Fc片段融合，視情況經由連接子融合。在一些實施例中，Fc片段為IgG1 Fc片段。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，分離之抗GPC3構築體為全長抗體。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，分離之抗GPC3構築體具有單專一性。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，分離之抗GPC3構築體具有多專一性，諸如雙專一性。在一些實施例中，分離之抗GPC3構築體為串聯scFv、雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙重親和力再靶向(DART)抗體、F(ab')2、雙重可變域(DVD)抗體、臼包杵(KiH)抗體、對接及鎖定(DNL)抗體、化學交聯抗體、雜多聚抗體或異結合物抗體。在一些實施例中，分離之抗GPC3構築體為串聯scFv，其包含兩個經肽連接子連接之scFv。在一些實施例中，肽連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，分離之抗GPC3構築體進一步包含專一性辨識第二抗原的第二抗體部分。在一些實施例中，第二抗原為T細胞(諸如細胞毒性T細胞、輔助T細胞或自然殺手T細胞)表面上的抗原。在一些實施例中，第二抗原為B細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或嗜中性球表面上之抗原。在一些實施例中，第二抗原選自由以下組成之群：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。在一些實施例中，第二抗原為CD3ε。在一些實施例中，分離之抗GPC3構築體為串聯scFv，其包含專一性辨識GPC3的N末端scFv及專一性辨識CD3ε的C末端scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體之表現藉由活化工程化T細胞來誘導。在一些實施例中，工程化T細胞為包含嵌合抗原受體(CAR)的T細胞。在一些實施例中，工程化T細胞為包含嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體(caTCR)的T細胞。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，分離之抗GPC3構築體為嵌合抗原受體(CAR)，其包含：(a)包含抗體部分的胞外域；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。在一些實施例中，細胞內信號傳導域包含CD3ζ細胞內信號傳導序列及CD28細胞內信號傳導序列。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，分離之抗GPC3構築體為嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體(caTCR)，其包含：(a)包含抗體部分的胞外域；及(b)T細胞受體模組(TCRM)，其包含含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子募集。在一些實施例中，第一TCR-TM來源於天然存在之第一TCR之跨膜域之一且第二TCR-TM來源於天然存在之第一TCR之另一跨膜域。在一些實施例中，TCR-TM中之至少一者為非天然存在的。在一些實施例中，該TCRM相較於包含天然存在之第一T細胞受體跨膜域的TCRM，可以更增強募集至少一種TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為γ/δ TCR。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為α/β TCR。在一些實施例中，結合TCR的信號傳導分子選自由以下組成之群：CD3δε、CD3γε及ζζ (亦稱為CD3ζ或CD3ζζ)。
在根據上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的一些實施例中，分離之抗GPC3構築體為包含抗體部分及效應分子的免疫結合物。在一些實施例中，效應分子為選自由以下組成之群的治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。在一些實施例中，治療劑為藥物或毒素。在一些實施例中，效應分子為標記。
本申請案在另一個態樣中提供分離之核酸，其編碼上述任一種經分離之抗GPC3構築體中的多肽組分。
本申請案在另一個態樣中提供一種包含經分離之核酸的載體，該核酸編碼上述任一種經分離之抗GPC3構築體中的多肽組分。
本申請案在另一個態樣中提供包含上述任一種抗GPC3構築體中的經分離宿主細胞。
本申請案在另一個態樣中提供包含經分離之核酸的經分離宿主細胞，該核酸編碼上述任一種經分離之抗GPC3構築體中的多肽組分。
本申請案在另一個態樣中提供經分離之宿主細胞，其包含含有經分離之核酸的載體，該核酸編碼上述任一種經分離之抗GPC3構築體中的多肽組分。
本申請案在另一個態樣中提供一種效應細胞，其表現上述任一種經分離之抗GPC3構築體。在一些實施例中，效應細胞為T細胞。
本申請案在另一個態樣中提供一種醫藥組合物，其包含上述任一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)及醫藥學上可接受之載劑。
亦提供套組，其包含上述任一種經分離之抗GPC3構築體、編碼上述任一種經分離之抗GPC3構築體中之多肽組分的經分離核酸、包含編碼上述任一種經分離之抗GPC3構築體中之多肽組分之核酸的載體、上述任一種經分離細胞，或上述任一種效應細胞。
本申請案在另一個態樣中提供一種偵測樣本中之GPC3的方法，包含：使該樣本與包含抗體部分及標記之上述任一種經分離之抗GPC3免疫結合物接觸，及偵測該標記之存在。在一些實施例中，樣本包含細胞表面結合有GPC3的細胞。在一些實施例中，樣本包含可溶性GPC3。
本申請案在另一個態樣中提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向該個體投與：a)有效量的上述任一種醫藥組合物；或b)有效量的上述任一種效應細胞。在一些實施例中，經由靜脈內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投與第一疾病位點遠側之注射位點。在一些實施例中，治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法進一步包含向該個體投與另一種療法。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症，諸如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC，諸如轉移HCC。
本申請案在另一個態樣中提供一種診斷患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含：a)投與有效量的包含抗體部分及標記之上述任一種經分離抗GPC3免疫結合物；及b)測定個體中之標記含量，其中標記含量高於閥值表明該個體患有GPC3陽性疾病。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症，諸如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC，諸如轉移HCC。
本申請案在另一個態樣中提供一種診斷患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含：a)使來源於個體之樣本與包含抗體部分及標記之上述任一種經分離抗GPC3接觸；及b)測定樣本中與經分離之抗GPC3構築體結合之細胞的數目，其中與經分離抗GPC3構築體結合之細胞的數目值高於閥值表明該個體患有GPC3陽性疾病。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症，諸如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC，諸如轉移HCC。
亦提供製備本文所述之任一種構築體的方法、製品及適用於本文所述方法的套組。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年4月26日申請之美國臨時申請案第62/490,586號的優先權，該臨時申請案的內容以全文引用的方式併入本文中。 序列表以ASCII正文檔案提交
以ASCII正文檔案提交之以下內容以全文引用的方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(檔案名稱：750042001240SEQLIST.txt，記錄日期：2018年4月24日，大小：395 KB)。
本申請案在一個態樣中提供構築體(在本文中稱為「抗GPC3構築體」)(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3 (在本文中稱為「原生形式GPC3」或「原生GPC3 (nGPC3)」)的抗體部分(在本文中稱為「抗GPC3抗體部分」)。相對於非細胞表面結合之GPC3 (在本文中稱為「可溶性GPC3 (sGPC3)或「非原生GPC3」」，諸如血清中之循環GPC3蛋白或游離GPC3肽，此等抗GPC3構築體專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。
當以抗CD3雙專一性抗體形式提供或存在於T細胞所表現之嵌合抗原受體(CAR)中時，抗GPC3抗體部分係專一性地再導引人類T細胞殺死表現GPC3之靶細胞(諸如表現GPC3之癌細胞)。此策略的技術優勢顯著優於使用針對任何形式之GPC3 (特別言之，可溶性GPC3)的抗體，原因在於T細胞靶向腫瘤位點可以變得更大為有效且精確，從而有效地發生T細胞介導癌細胞殺死而不傷害正常組織。另外，抗GPC3抗體部分當與可偵測部分融合時，能夠診斷及預後對細胞表面上表現GPC3之細胞(諸如GPC3陽性腫瘤細胞)之數目及分佈變化(疾病進展的一種潛在量度，相關性比循環GPC3含量更大)具有高度敏感性的GPC3陽性疾病或病症。
本申請案亦提供包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之抗體部分的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)。此等構築體亦可以抗CD3雙專一性抗體提供或存在於由T細胞表現的CAR中。在癌症患者(諸如HCC患者)中，GPC3可以表現於細胞表面上或以不同形式自細胞表面釋放至細胞外環境中。因此，此等抗GPC3構築體亦可與可偵測部分融合且用於診斷及預後目的。
使用噬菌體呈現技術，吾等產生具有專一性且展示針對與細胞表面結合之人類GPC3之高親和力的多種單株抗體。流式細胞術及T細胞介導細胞毒性分析證明，此等抗體以限於原生形式GPC3的方式辨識表現GPC3之癌細胞株。當以抗CD3雙專一性抗體或CAR-T細胞形式提供時，抗體再導引人類T細胞殺死GPC3陽性標靶癌細胞。本文中呈遞的資料證明，包含本文所述之專一性辨識與細胞表面結合之GPC3之抗體部分的抗GPC3構築體可為癌症適應症(諸如實體腫瘤適應症(例如HCC))的有效治療劑。
使用噬菌體呈現技術，吾等亦產生具有針對人類GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之專一性及高親和力的多種單株抗體。流式細胞術及T細胞介導細胞毒性分析證明，此等抗體專一性辨識GPC3。
本申請案因此提供包含專一性辨識GPC3 (諸如與細胞表面結合之GPC3)之抗體部分的構築體(諸如分離之構築體)。構築體可為例如抗GPC3 scFv、抗GPC3 Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體、多專一性(諸如雙專一性)抗GPC3分子(例如串聯雙scFv雙專一性T細胞接合體)、抗GPC3嵌合抗原受體(CAR)、抗GPC3嵌合抗體-T細胞受體(caTCRs)及抗GPC3免疫結合物。
在另一態樣中，提供編碼抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)或構築體之部分抗GPC3抗體部分(諸如專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的彼等部分)的核酸。
在另一態樣中，提供包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物(諸如醫藥組合物)，該構築體包含專一性辨識GPC3 (諸如與細胞表面結合之GPC3)的抗體部分。組合物可為醫藥組合物，其包含抗GPC3構築體(諸如與細胞表面結合之GPC3)或表現抗GPC3構築體或與該抗GPC3構築體結合的效應細胞(例如表現抗GPC3 CAR)(專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的CAR)的T細胞)。
亦提供製備及使用抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，或表現抗GPC3構築體或與該抗GPC3構築體結合的細胞)用於治療或診斷目的的方法，以及適用於此類方法的套組及製品。定義
如本文所用，「治療(treatment/treating)」為用於獲得有益或所需結果(包括臨床結果)之方法。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括(但不限於)以下中的一或多者：減輕疾病所引起之一或多種症狀、減弱疾病程度、穩定疾病(例如預防或延遲疾病惡化)、預防或延遲疾病擴散(例如轉移)、預防或延遲疾病復發、延遲或減緩疾病進展、改善疾病狀態、使得疾病緩解(部分或完全)、減少治療疾病所需的一或多種其他藥物之劑量、延遲疾病進展、增加或改良生活品質、增大體重增加及/或延長存活期。「治療」亦涵蓋癌症之病理性結果(諸如腫瘤體積)減小。本發明之方法涵蓋此等治療態樣中之任一者或多者。
如本文中關於T細胞所用之「活化」係指已充分刺激可誘導可偵測細胞增殖之T細胞狀態。活化亦可與誘導之細胞激素產生及可偵測效應功能相關。
術語「抗體部分」包括全長抗體及其抗原結合片段。全長抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈。輕鏈及重鏈之可變區對抗原結合負責。兩種鏈中之可變區一般均含有三個高度可變環，稱作互補決定區(CDR)(輕鏈(LC) CDR包括LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，重鏈(HC) CDR包括HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3)。本文所揭示之抗體及抗原結合片段的CDR邊界可根據Kabat、Chothia或Al-Lazikani公約(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)界定或鑑別。重鏈或輕鏈之三個CDR插入稱為構架區(FR)之側接片段之間，該等側接片段的保守性比CDR更高且形成支撐高變環之支架。重鏈及輕鏈之恆定區不參與抗原結合，但展現各種效應功能。抗體基於其重鏈恆定區之胺基酸序列分類。抗體之五種主要類別或同型為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其特徵為分別存在α、δ、ε、γ及μ重鏈。若干主要抗體類別分成子類，諸如lgG1 (γ1重鏈)、lgG2 (γ2重鏈)、lgG3 (γ3重鏈)、lgG4 (γ4重鏈)、lgA1 (α1重鏈)或lgA2 (α2重鏈)。
如本文所用，術語「抗原結合片段」係指抗體片段，包括例如雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙專一性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定化雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈Fv (scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、由包含一或多個CDR之抗體的一部分形成之多專一性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體、二價域抗體，或結合至抗原但不包含完整抗體結構之任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠結合至與親本抗體或親本抗體片段(例如親本scFv)所結合相同之抗原。在一些實施例中，抗原結合片段可包含移植至來自一或多種不同人類抗體之構架區的來自特定人類抗體之一或多種CDR。
如本文所用，術語「抗原決定基」係指抗體或抗體部分所結合之抗原上之特定原子或胺基酸基團。若兩個抗體或抗體部分對抗原展現競爭性結合，則其可結合抗原內之相同抗原決定基。
如本文所用，在等莫耳濃度之第一抗體部分存在下，當第一抗體部分將第二抗體部分與標靶GPC3的結合抑制至少約50% (諸如至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中之任一者)時，第一抗體部分與第二抗體部分「競爭」結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)，或反之亦然。基於抗體之交叉競爭而將其「分組」之高通量方法描述於PCT公開案第WO 03/48731號中。
如本文所用，術語「專一性結合」、「專一性辨識」或「具有專一性」係指在異質分子(包括生物分子)群存在下確定標靶之存在的可量測且可再現之相互作用，諸如標靶與抗體或抗體部分之間的結合。舉例而言，專一性辨識標靶(其可為抗原決定基)之抗體或抗體部分為結合此標靶之親和力、親合力、容易性及/或持續時間大於其結合至其他標靶之抗體或抗體部分。在一些實施例中，專一性辨識抗原的抗體或抗體部分與抗原之一或多種抗原決定子(諸如原生形式GPC3)反應的結合親和力為其針對其他標靶(諸如可溶性GPC3)的至少約10倍。
如本文所用，「分離之」抗GPC3構築體係指(1)不與自然界中發現之蛋白質結合，(2)不含來自相同來源之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，或(4)不存在於自然界中之抗GPC3構築體。
如本文所用，術語「分離之核酸」意指基因組、cDNA或合成來源或其某一組合之核酸，藉助於其來源，「分離之核酸」(1)不與自然界中該「分離之核酸」所存在之聚核苷酸之全部或一部分結合，(2)可操作地連接至自然界中不與其連接之聚核苷酸，或(3)在自然界中不作為較大序列之一部分存在。
如本文所用，術語「CDR」或「互補決定區」意指重鏈與輕鏈多肽之可變區內發現的非鄰接抗原組合位點。此等特定區域已描述於Kabat等人, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人, 美國健康與人類服務部(U.S. Dept. of Health and Human Services), 「Sequences of proteins of immunological interest」(1991)；Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；Al-Lazikani B.et al. ,J. Mol. Biol. , 273: 927-948 (1997)；MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)；Abhinandan及Martin,Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)；Lefranc M.P.等人,Dev. Comp. Immunol. , 27: 55-77 (2003)；以及Honegger及Plückthun,J. Mol. Biol. , 309:657-670 (2001)，，其中在相互比較時，該等定義包括胺基酸殘基之重疊或亞群。然而，應用任一定義來提及抗體或所移植抗體之CDR或其變異體均意欲屬於如本文所定義及使用之術語的範疇內。涵蓋如上述各參考文獻所定義之CDR的胺基酸殘基闡述於下表1中作為比較。CDR預測算法及界面在此項技術中已知，包括例如Abhinandan及Martin,Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)；Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res. , 38: D301-D307 (2010)；及Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res. , 43: D432-D438 (2015)。此段落中所引述之參考文獻內容以其全文引用的方式併入本文中以用於本發明中且可能包括於本文的一或多個請求項中。表 1 ： CDR 定義 1 殘基編號遵循前述Kabat等人之命名法2 殘基編號遵循前述Chothia等人之命名法3 殘基編號遵循前述MacCallum等人之命名法4 殘基編號遵循前述Lefranc等人之命名法5 殘基編號遵循前述Honegger及Plückthun之命名法
術語「嵌合抗體」係指其中重鏈及/或輕鏈的一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該鏈中的其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源的抗體，以及此類抗體之片段，只要其展現本發明之生物活性(參見美國專利第4,816,567號；及Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。
關於抗體或抗體部分之術語「半合成」意指該抗體或抗體部分具有一或多個天然存在之序列及一或多個非天然存在之(亦即合成)序列。
「Fv」為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由非共價緊密結合之一個重鏈可變區域與一個輕鏈可變區域之二聚體組成。此兩個域摺疊得到六個高變環(重鏈及輕鏈各有3個環)，其貢獻了胺基酸殘基用於抗原結合且向抗體賦予抗原結合專一性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個對抗原具有專一性之CDR之Fv的一半)能夠辨識且結合抗原，但親和力比整個結合位點低。
「單鏈Fv」(亦縮寫為「sFv」或「scFv」)為包含連接成單一多肽鏈之VH 及VL 抗體域的抗體片段。在一些實施例中，scFv多肽進一步包含介於VH 與VL 域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構。關於scFv之評述，參見Plückthun, 於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁(1994)。
術語「雙功能抗體」係指如下製備的小抗體片段：在VH 與VL 域之間典型地使用短連接子(諸如約5至約10個殘基)構築scFv片段(參見前述段落)，使得V域達成鏈間配對，而非鏈內配對，從而產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點的片段。雙專一性雙功能抗體為兩個「互換型」scFv片段之雜二聚體，其中兩個抗體之VH 及VL 域存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更充分描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993)中。
非人類(例如嚙齒動物)抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類抗體之最小序列的嵌合抗體。在很大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的高變區(HVR)殘基經來自非人類物種(供體抗體)的高變區之殘基(諸如具有所期望抗體專一性、親和力及能力之小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可以包含接受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。此等修飾係為了進一步改進抗體效能而達成。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且典型兩個可變域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且全部或基本上全部的FR為具有人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地為人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
關於本文中鑑別之多肽及抗體序列的「胺基酸序列一致性百分比(%)」或「同源性」定義為在序列比對後，在將任何保守取代考慮為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與所比較多肽中胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。用於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可獲得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR)或MUSCLE軟體。熟習此項技術者可確定適用於量測比對之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係利用序列比較電腦程式MUSCLE產生(Edgar, R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004；Edgar, R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004)。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述結合至抗體之Fc區的受體。在一些實施例中，本發明之FcR為結合IgG抗體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體(包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式)的FcR。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有相似的胺基酸序列，不同之處主要在於其細胞質域。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(評述參見M.於Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。該術語包括異型，諸如FcγRIIIA異型：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131及/或FcγRIIA-H131。FcRs評述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人, J. Lab. Clin. Med . 126:330-41 (1995)。本文術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來鑑別之FcR。該術語亦包括負責母體IgG轉移至胎兒的新生兒受體FcRn(Guyer等人, J. Immunol . 117:587 (1976)及Kim等人, J. Immunol . 24:249 (1994))。
術語「FcRn」係指新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn在結構上類似於主要組織相容性複合物(MHC)且由α鏈非共價結合至β2-微球蛋白而組成。新生兒Fc受體FcRn之多種功能評述於Ghetie及Ward (2000)Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766中。FcRn在免疫球蛋白IgG自母親被動遞送至幼兒及血清IgG含量調控方面起作用。FcRn可充當救助受體，其在細胞內與跨細胞結合及輸送完整形式之胞飲IgG，且將其自預設降解路徑中拯救出來。
人類IgG Fc區之「CH1域」(亦稱作「H1」域之「C1」)通常自約胺基酸118延伸至約胺基酸215 (EU編號系統)。
「鉸鏈區」通常定義為自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec .Immunol .22:161-206 (1985))。其他IgG同型之鉸鏈區可以藉由將形成重鏈間S-S鍵之第一個及最後一個半胱胺酸殘基置放在相同位置而與IgG1序列對齊。
人類IgG Fc區之「CH2域」(亦稱作「H2」域之「C2」)通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。實情為兩個N連接分支鏈碳水化合物鏈插入完整原生IgG分子之兩個CH2域之間。已推測碳水化合物可為域-域配對提供替代物且有助於CH2域穩定化。Burton,Molec Immunol. 22:161-206 (1985)。
「CH3域」(亦稱為「C2」或「H3」域)包含C末端殘基至Fc區中之CH2域的片段(亦即，自抗體序列之約胺基酸殘基341至C末端，該C末端典型地位於IgG之胺基酸殘基446或447)。
「功能Fc片段」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應功能通常需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可以使用此項技術中已知的各種分析評估。
具有「經改變」之FcR結合親和力或ADCC活性之變異型IgG Fc的抗體為相較於親本多肽或包含原生序列Fc區之多肽，具有增強或減弱之FcR結合活性(例如FcγR或FcRn)及/或ADCC活性的抗體。「展現」與FcR之「結合增強」之變異型Fc結合至少一種FcR的親和力高於(例如更低的表觀Kd 或IC50 值)親本多肽或原生序列IgG Fc。根據一些實施例，結合改良為親本多肽之約3倍，諸如約5、10、25、50、60、100、150、200或高達500倍中的任一者，或約25%至1000%的結合改良。「展現與FcR之結合減少」之多肽變異體結合至少一種FcR的親和力低於(例如更高的表觀Kd 或更高的IC50 值)親本多肽。相較於親本多肽之結合減少可為結合減少約40%或超過40%。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞)上之Fc受體(FcRs)的所分泌Ig允許此等細胞毒性效應細胞專一性結合至帶有抗原的靶細胞且隨後經由細胞毒素殺死靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且為此類殺死所絕對必需的。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)第464頁之表3中。為了評估所關注分子之ADCC活性，可以進行活體外ADCC分析，諸如美國專利第5,500,362號或5,821,337號中所述之分析。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可以評估所關注分子在活體內(例如在動物模型中，諸如Clynes等人,PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中所揭示的動物模型)的ADCC活性。
當具有變異型Fc區之多肽與具有野生型Fc區之多肽(或親本多肽)的量在分析中基本上相同時，在人類效應細胞存在下比具有野生型IgG Fc的多肽或親本多肽更有效地「展現增強之ADCC」或介導ADCC的包含變異型Fc區之多肽為活體外或活體內實質上更有效地介導ADCC的多肽。一般而言，此類變異體將使用此項技術中已知之任何活體外ADCC分析加以鑑別，諸如用於例如在動物模型中測定ADCC活性之分析或方法等。在一些實施例中，變異體介導ADCC的有效性為野生型Fc (或親本多肽)的約5倍至約100倍，例如約25至約50倍。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體存在下溶解。經典補體路徑之活化始於補體系統(C1q)之第一組分結合至與其同源抗原結合的(適當子類之)抗體。為了評估補體活化，可以進行CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中所述。具有改變之Fc區胺基酸序列及增加或減少之C1q結合能力的多肽變異體描述於美國專利第6,194,551B1號及WO99/51642中。彼等專利公開案之內容以引用之方式特別併入本文中。亦參見Idusogie等人,J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。
除非另外說明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此互為簡併型且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。就編碼蛋白質之核苷酸序列可以在一些形式中含有內含子而言，片語編碼該蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子。
術語「可操作地連接」係指調控序列與異源核酸序列之間的功能連接，從而引起後者表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列以功能關係置放時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。一般而言，可操作地連接之DNA序列為鄰接的，且必要時使兩個蛋白質編碼區在同一個閱讀框架中連接。
「同源」係指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列一致性。當兩個比較序列中之位置被相同鹼基或胺基酸單體亞單元佔據時，例如若兩個DNA分子中之每一者的位置被腺嘌呤佔據，則該等分子在該位置處同源。兩個序列之間的同源性%為兩個序列共用之匹配或同源位置之數目除以所比較位置之數目乘以100之函數。舉例而言，若兩個序列中之6/10位置匹配或同源，則該兩個序列為60%同源。舉例而言，DNA序列ATTGCC與TATGGC共用50%同源性。一般而言，當兩個序列經對齊而得到最大同源性時進行比較。
如本文中所揭示之抗GPC3構築體或組合物的「有效量」為足以進行特定陳述目的之量。「有效量」可憑經驗及藉由與所述目的相關之已知方法確定。
術語「治療有效量」係指如本文所揭示之抗GPC3構築體或組合物的有效「治療」個體之疾病或病症的量。在癌症的情況下，如本文所揭示之抗GPC3構築體或組合物的治療有效量可以減少癌細胞數目；減小腫瘤尺寸或重量；抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳為阻止)癌細胞浸潤至周邊器官；抑制(亦即在一定程度上緩慢且較佳為阻止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕與癌症有關的一或多種症狀。就如本文所揭示之抗GPC3構築體或組合物可阻止生長及/或殺死現有癌細胞而言，其可以具有細胞抑制性及/或細胞毒性。在一些實施例中，治療有效量為生長抑制量。在一些實施例中，治療有效量為延長患者存活期之量。在一些實施例中，治療有效量為改善患者之無進展存活期的量。
如本文所用，「醫藥學上可接受」或「藥理學相容性」意謂在生物學上或在其他方面無不良影響之材料，亦即，該材料可併入投與患者之醫藥組合物中而不會引起任何顯著不良生物學效應或以有害方式與含有其之組合物中的任何其他組分相互作用。醫藥學上可接受之載劑或賦形劑較佳滿足毒理學及製造測試之必需標準且/或包括於美國食品及藥物管理局(U.S. Food and Drug administration)制定之非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
術語「標記」當在本文中使用時係指可以與抗GPC3抗體部分直接或間接結合之可偵測化合物或組合物。標記本身可以是可偵測的(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記之情況下，可以催化受質化合物或組合物發生可偵測的化學變化。
應瞭解，本文所述之本發明實施例包括「由實施例組成」及/或「基本上由實施例組成」。
本文中提及「約」某值或參數包括(及描述)關於該值或參數本身之變化形式。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。
如本文所用，提及「不為」某一值或參數通常意謂及描述「除某一值或參數外」。舉例而言，方法不用於治療X型癌症意謂該方法用於治療除X型外的癌症類型。
除非上下文另外明確指示，否則如本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」或「一(an)」及「該(the)」包括多個指示物。抗 GPC3 構築體
在一個態樣中，本發明提供包含專一性結合至GPC3之抗體部分的GPC3專一性構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)。抗GPC3構築體之專一性來源於專一性結合至GPC3的抗GPC3抗體部分，諸如全長抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，提及專一性結合至GPC3之部分(諸如抗體部分)意謂該部分以其針對非標靶之結合親和力至少約10倍(包括例如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍中之任一者)的親和力結合至GPC3。在一些實施例中，非標靶為並非GPC3的抗原。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分的非標靶為可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分的非標靶為與細胞表面結合之GPC3。結合親和力可以藉由此項技術中已知之方法測定，諸如ELIS、螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱分析(RIA)。Kd 可藉由此項技術中已知之方法測定，諸如利用例如BIACORETM 儀器之表面電漿子共振(SPR)分析，或利用例如Sapidyne儀器之動力學排除分析(KinExA)。
所涵蓋的抗GPC3構築體包括例如抗GPC3 scFv、抗GPC3 Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體、多專一性(諸如雙專一性)抗GPC3分子(例如串聯雙scFv雙專一性T細胞接合體)、抗GPC3嵌合抗原受體(CAR)、抗GPC3嵌合抗體-T細胞受體(caTCR)及抗GPC3免疫結合物。
不同態樣更詳細地論述於下文各章節中。
雖然本文廣泛地論述使用抗GPC3構築體的實施例，該等抗GPC3構築體包含含有人類序列(亦即包含人類CDR序列的人類重鏈及輕鏈可變區序列)的抗GPC3抗體部分，但本發明亦提供非人類抗GPC3構築體。在一些實施例中，非人類抗體藥劑包含來自如本文所述之抗體藥劑之人類CDR序列及非人類構架序列。在一些實施例中，非人類構架序列包括可以藉由使用如本文所述的一或多個人類CDR序列而用於產生合成重鏈及/或輕鏈可變區的任何序列，包括例如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、豬、牛科動物(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、犬、白鼬、靈長類動物(例如狨猴、恆河猴)等。在一些實施例中，所提供之抗體藥劑包括藉由將如本文所述之一或多個人類CDR序列移植至非人類構架序列(例如小鼠或雞構架序列)上所產生之抗體藥劑。在多個實施例中，所提供的抗體藥劑為人類抗體藥劑(例如人類單株抗體或其片段、人類抗原結合蛋白或多肽、人類多專一性結合藥劑[例如人類雙專一性抗體]、具有人類免疫球蛋白多肽之一或多種結構組分的人類多肽)。 抗GPC3抗體部分
抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)包含專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3 (在本文中稱為「抗nGPC3抗體部分」)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對nGPC3的結合親和力高於對sGPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分之結合親和力以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，表面上表現GPC3的細胞為HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7或293。在一些實施例中，細胞在其表面上呈遞含量異常高的GPC3。在一些實施例中，細胞為癌細胞。在一些實施例中，癌細胞存在於實體腫瘤(諸如肝癌，例如HCC)中。在一些實施例中，癌細胞為轉移癌細胞(諸如轉移HCC)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3 (在本文中稱為「抗sGPC3抗體部分」)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識nGPC3與sGPC3。磷脂肌醇蛋白聚醣 3 (GPC3)
磷脂肌醇蛋白聚醣3 (GPC3)為存在於細胞表面上之屬於硫酸肝素蛋白聚醣家族的癌胚抗原，其涉及細胞-細胞外基質界面處發生的細胞信號傳導。GPC3表現於發育期間的胎兒肝臟及胎盤中且在正常成人組織中下調或靜默。此發育階段專一性及組織專一性表現方式表明GPC3可能涉及形態發生。
GPC3 基因編碼580個胺基酸之70 kDa前驅蛋白。移位至內質網中後，N末端信號肽(SS；殘基1-24)及C末端糖基化磷脂醯肌醇(GPI)錨添加信號(預測的裂解位點：S560 )被移除且後者被GPI錨置換。GPC3前驅蛋白可以藉由弗林蛋白酶在Arg358 與Ser359 之間分裂而產生經二硫鍵連接的40 kDa N末端亞單元(Q25 -R358 )及30 kDa C末端亞單元(始於S359 )。GPC3之C末端經由GPI錨連接至膜且經轉譯後修飾而具有兩條接近於細胞表面的O連接型硫酸肝素(HS)側鏈。基於初始胺基酸序列，N末端亞單元、C末端亞單元及兩條HS聚醣鏈形成GPC3之三個功能域。N末端與C末端亞單元形成GPC3之核心蛋白。
GPC3上帶負電的HS鏈為功能上重要的葡糖胺聚醣。其可以結合帶正電之生長因子，諸如HGF、纖維母細胞生長因子(FGF)、Wnts、刺蝟及骨骼形態發生蛋白。因此，HS鏈可能充當此等生長因子之「對接位點」，此視細胞背景而定。
GPC3之N末端亞單元為GPC3之約40 kDa N末端肽，發現其呈GPC3核心蛋白之可溶形式。在一些實施例中，N末端亞單元為包含Met1 至Arg358 之胺基酸序列的肽。在一些實施例中，N末端亞單元為包含Gln25 至Arg358 之胺基酸序列的肽。根據本發明，亦可使用此類N末端肽之片段，在本文中稱為GPC3 N末端片段。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識存在於GPC3蛋白質之N末端亞單元上的抗原決定基。在一些實施例中，專一性辨識本文所述之GPC3蛋白質N末端亞單元(或其片段)的抗體部分係專一性結合至GPC3的可溶形式。在一些實施例中，專一性辨識GPC3蛋白質N末端亞單元(或其片段)的抗體部分係專一性結合至GPC3原生形式。在一些實施例中，專一性辨識GPC3蛋白質N末端亞單元(或其片段)的抗體部分可以結合至nGPC3與sGPC3。
GPC3之C末端亞單元為GPC3之約30 kDa的C末端肽。基於上述裂解位點，在一些實施例中，C末端亞單元為包含Ser359 至His580 之胺基酸序列的肽。在一些實施例中，C末端亞單元為包含Ser359 至Ser560 之胺基酸序列的肽。根據本發明，亦可使用此類C末端肽之片段，在本文中稱為GPC3 C末端片段。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識存在於GPC3蛋白質之C末端亞單元上的抗原決定基。在一些實施例中，專一性辨識本文所述之GPC3蛋白質C末端亞單元(或其片段)的抗體部分係專一性結合至GPC3的可溶形式。在一些實施例中，專一性辨識GPC3蛋白質之C末端亞單元(或其片段)的抗體部分係專一性結合至GPC3的原生形式。在一些實施例中，專一性辨識GPC3蛋白質之C末端亞單元(或其片段)的抗體部分可以結合至nGPC3與sGPC3。
本文所述之抗GPC3構築體與此項技術中已知的抗體不結合至GPC3上的相同抗原決定基，諸如GC33 (Ishiguro等人, Cancer Res 2008; 68:9832-9838)(例如SEQ ID NO: 510)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分不與GC33競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分不結合至SEQ ID NO: 536胺基酸序列內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分不結合至包含SEQ ID NO: 536胺基酸序列的片段。
已報導GPC3表現於各種癌症中且特定言之，表現於HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤及脂肪肉瘤中。因此，GPC3可以潛在地充當基於抗體之免疫療法與基於細胞之免疫療法的治療標靶。特定言之，鑒於GPC3高度表現於HCC中且表現於大於70%的HCC腫瘤中，但不表現於正常肝臟組織中，因此GPC3可以有望成為肝癌療法之候選靶。對於患有GPC3陽性癌症之一些患者而言，可以在血液中偵測到GPC3的可溶形式。因此，GPC3的可溶形式與原生形式均可以充當癌症診斷(諸如HCC診斷)的適用生物標記。已發現GPC3陽性HCC患者的5年存活率顯著低於GPC3陰性HCC患者。因此，GPC3表現與HCC的不良預後相關。
GPC3細胞表面局域化為細胞生長及HCC中之Wnt活化之關鍵。GPC3經由其核心蛋白結合至Wnt。假設GPC3藉由促進且/或穩定化Wnt與其信號傳導受體Frizzled (Fz)之相互作用來刺激Wnt信號傳導。有趣的是，注意到約50% HCC患者的血清中分泌有GPC3。然而，不清楚癌症患者之循環血液中存在哪種形式的GPC3。細胞外脂肪酶Notum可以負責GPC3自腫瘤細胞裂解至細胞外環境中。
在一些實施例中，本文所述之抗GPC3抗體部分(針對nGPC3及/或sGPC3)專一性辨識人類GPC3內的抗原決定基。例示性人類GPC3之完全胺基酸序列具有UniProt第P51654號(SEQ ID NO: 460)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識包含SEQ ID NO: 460胺基酸序列之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-560 (SEQ ID NO: 461)內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸25-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 462)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560 (SEQ ID NO: 463)內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358 (SEQ ID NO: 468)內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 464)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識攜有硫酸肝素側鏈之GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識重組人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，與細胞表面結合之GPC3包含(且在一些實施例中，組成為或主要組成為) SEQ ID NO: 460或SEQ ID NO: 462之胺基酸序列。在一些實施例中，可溶性GPC3為血清中的循環GPC3蛋白質或游離GPC3肽。在一些實施例中，可溶性GPC3為存在於溶液中的GPC3蛋白質或肽。在一些實施例中，可溶性GPC3包含(且在一些實施例中，組成為或主要組成為) SEQ ID NO: 461或SEQ ID NO: 463之胺基酸序列。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分可以與來自除人類之外之物種的GPC3交叉反應。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分可以對一或多種人類GPC3蛋白具有完全的專一性且可能不展現物種或其他類型之非人類交叉反應。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與GPC3蛋白質(或其片段)之至少一種對偶基因變異體交叉反應。在一些實施例中，相較於天然存在之GPC3 (或其片段)，對偶基因變異體具有至多約30 (諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30)個胺基酸取代(諸如保守性取代)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分不與GPC3蛋白質(或其片段)之任何對偶基因變異體交叉反應。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與GPC3蛋白質之至少一種種間變異體交叉反應。在一些實施例中，例如，GPC3蛋白質(或其片段)為人類GPC3且GPC3蛋白質(或其片段)之種間變異體為其小鼠或大鼠變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分不與GPC3蛋白質之任何種間變異體交叉反應。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7或293細胞之細胞表面上所表現的GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識癌細胞(諸如實體腫瘤)之細胞表面上所表現的GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識肝癌(諸如HCC)、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、肝母細胞瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤之細胞表面上所表現的GPC3。結合親和力
結合親和力可以Kd 、K解離 、K結合 或Ka 指示。如本文所用，術語「K解離 」意指抗體部分自抗體部分/抗原複合物解離之解離速率常數，如利用動力學選擇配置所測定。如本文所用，術語「K結合 」意指抗體部分與抗原結合以形成抗體部分/抗原複合物的結合速率常數。如本文所用，術語平衡解離常數「Kd 」係指特定抗體部分-抗原相互作用之解離常數，且描述在平衡時佔據存在於抗體分子溶液中之所有抗體結合域之一半所需的抗原濃度，且等於K解離 /K結合 。Kd 之量測假設所有結合劑均在溶液中。在抗體部分拴系至細胞壁之情況下，例如在酵母表現系統中，相應的平衡速率常數係以EC50 表示，由此得到Kd 之良好近似值。親和力常數Ka 係解離常數Kd 之倒數。
解離常數(Kd )用作展示抗體部分對抗原之親和力的指標。舉例而言，藉由史卡查方法(Scatchard method)，使用經多種標記劑標記的抗體，以及藉由使用BIACORETM (由Amersham Biosciences製造)、藉由表面電漿子共振分析生物分子相互作用，根據使用者手冊及隨附套組，可以使分析簡便。可以使用此等方法得到的Kd 值係以單位M (Mols)表示。專一性結合至標靶之抗體部分可以具有例如≤10-7 M、≤10-8 M、≤10-9 M、≤10-10 M、≤10-11 M、≤10-12 M或≤10-13 M。
抗體部分之結合專一性可以在實驗上藉由此項技術中已知之方法測定。此類方法包含(但不限於)西方印跡、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIACORETM 測試及肽掃描。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分之結合親和力係藉由測試抗GPC3抗體部分對表面上表現GPC3之細胞(例如HepG2細胞)的結合親和力來量測。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3 (例如抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，在使用例如流式細胞術對可溶性GPC3抗原進行的競爭性結合分析中，抗nGPC3抗體部分係專一性結合至與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，當抗nGPC3抗體部分已與可溶性GPC3抗原一起在競爭性結合分析中預培育時，抗nGPC3抗體部分係專一性結合至與細胞表面結合之GPC3。舉例而言，在一些實施例中，包含抗nGPC3抗體部分的抗GPC3構築體可以與各種濃度之可溶性GPC3抗原(例如重組GPC3片段)一起預培育，接著可以將GPC3+ 細胞(例如HepG2細胞)添加至抗體/抗原混合物中且培育，接著可以偵測與細胞表面結合之抗GPC3構築體：可溶性GPC3預培育之抗GPC3構築體對GPC3+細胞的結合相較於在可溶性GPC3預培育不存在下抗GPC3構築體對GPC3+細胞的結合可能不展示顯著差異，證明抗GPC3抗體部分可以專一性辨識與細胞表面結合之GPC3，或抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分以約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)之Kd 專一性結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)。因此在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 、抗sGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 或抗GPC3抗體部分與GPC3 (任何形式)之間結合的Kd 為約10− 7 M至約10− 13 M、約1×10− 7 M至約5×10− 13 M、約10− 7 M至約10− 12 M、約10− 7 M至約10− 11 M、約10− 7 M至約10− 10 M、約10− 7 M至約10− 9 M、約10− 8 M至約10− 13 M、約1×10− 8 M至約5×10− 13 M、約10− 8 M至約10− 12 M、約10− 8 M至約10− 11 M、約10− 8 M至約10− 10 M、約10− 8 M至約10− 9 M、約5×10− 9 M至約1×10− 13 M、約5×10− 9 M至約1×10− 12 M、約5×10− 9 M至約1×10− 11 M、約5×10− 9 M至約1×10− 10 M、約10− 9 M至約10− 13 M、約10− 9 M至約10− 12 M、約10− 9 M至約10− 11 M、約10− 9 M至約10− 10 M、約5×10− 10 M至約1×10− 13 M、約5×10− 10 M至約1×10− 12 M、約5×10− 10 M至約1×10− 11 M、約10− 10 M至約10− 13 M、約1×10− 10 M至約5×10− 13 M、約1×10− 10 M至約1×10− 12 M、約1×10− 10 M至約5×10− 12 M、約1×10− 10 M至約1×10− 11 M、約10− 11 M至約10− 13 M、約1×10− 11 M至約5×10− 13 M、約10− 11 M至約10− 12 M，或約10− 12 M至約10− 13 M。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 大於抗GPC3抗體部分與標靶之間結合的Kd ，且在本文中、在一些實施例中稱為抗GPC3抗體部分對標靶(例如與細胞表面結合之GPC3)的結合親和力高於對非標靶(例如可溶性GPC3)的結合親和力。在一些實施例中，非標靶為非GPC3抗原。在一些實施例中，對於抗nGPC3抗體部分而言，非標靶為可溶性GPC3。在一些實施例中，對於抗sGPC3抗體部分而言，非標靶為與細胞表面結合之GPC3。舉例而言，抗nGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與與細胞表面結合之GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍，諸如約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍或約1011 -1012 倍。亦舉例而言，抗sGPC3抗體部分與與細胞表面結合之GPC3之間結合的Kd 可為抗sGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍，諸如約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍或約1011 -1012 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分(針對nGPC3及/或sGPC3)與非GPC3標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍，諸如約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍或約1011 -1012 倍。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合的Kd 為抗nGPC3抗體部分與與細胞表面結合之GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶結合之Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，非標靶為非GPC3抗原。在一些實施例中，對於抗nGPC3抗體部分而言，非標靶為可溶性GPC3。在一些實施例中，對於抗sGPC3抗體部分而言，非標靶為與細胞表面結合之GPC3。因此在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非GPC3標靶之間結合的Kd 、抗nGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合的Kd 或抗sGPC3抗體部分與與細胞表面結合之GPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M、約1×10-1 M至約5×10-6 M、約10-1 M至約10-5 M、約1×10-1 M至約5×10-5 M、約10-1 M至約10-4 M、約1×10-1 M至約5×10-4 M、約10-1 M至約10-3 M、約1×10-1 M至約5×10-3 M、約10-1 M至約10-2 M、約10-2 M至約10-6 M、約1×10-2 M至約5×10-6 M、約10-2 M至約10-5 M、約1×10-2 M至約5×10-5 M、約10-2 M至約10-4 M、約1×10-2 M至約5×10-4 M、約10-2 M至約10-3 M、約10-3 M至約10-6 M、約1×10-3 M至約5×10-6 M、約10-3 M至約10-5 M、約1×10-3 M至約5×10-5 M、約10-3 M至約10-4 M、約10-4 M至約10-6 M、約1×10-4 M至約5×10-6 M、約10-4 M至約10-5 M，或約10-5 M至約10-6 M。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M。在一些實施例中，專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗nGPC3抗體部分不結合至可溶性GPC3。
在一些實施例中，當提及抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識標靶GPC3 (例如與細胞表面結合之GPC3)且以低結合親和力結合至非標靶(例如可溶性GPC3)時，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如與細胞表面結合之GPC3)結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)，且與非標靶(例如可溶性GPC3)結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。
在一些實施例中，當提及抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3 (例如抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力)時，或當提及抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3、同時以低結合親和力結合至可溶性GPC3時，對抗GPC3抗體部分之結合親和力與對照抗GPC3抗體(諸如單株抗體GC33)進行比較。在一些實施例中，GC33 (例如SEQ ID NO: 510)與與細胞表面結合之GPC3之間結合的Kd 可為本文所述之抗nGPC3抗體部分與與細胞表面結合之GPC3之間結合之Kd 的至少約2倍，諸如約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍，或約1011 -1012 倍。在一些實施例中，抗GPC3構築體相對於與細胞表面結合之GPC3的Kd 為約0.1 nM至約2 nM，諸如約0.1 nM至約0.5 nM、約0.5 nM至約1 nM，或約1.5至約2 nM。在一些實施例中，本文所述之抗nGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合的Kd 可為GC33 (例如SEQ ID NO: 510)與可溶性GPC3之間結合之Kd 的至少約2倍，諸如約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍，或約1011 -1012 倍。在一些實施例中，抗GPC3構築體相對於與細胞表面結合之GPC3的Kd 為約10 nM至約100 nM，諸如約10 nM至約20 nM、約20 nM至約40 nM、約40 nM至約80 nM，或約80 nM至約100 nM。在一些實施例中，對照抗GPC3抗體與與細胞表面結合之GPC3之間結合的Kd 可為本文所述之抗nGPC3抗體部分與與細胞表面結合之GPC3之間結合之Kd 的至少約2倍，諸如約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍，或約1011 -1012 倍，其中對照抗體包含：i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 503的VH ，或與SEQ ID NO: 503具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 504之VL ，或與SEQ ID NO: 504具有至少約95%序列一致性的其變異體。在一些實施例中，本文所述之抗nGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合的Kd 可為對照抗GPC3抗體與可溶性GPC3之間結合之Kd 的至少約2倍，諸如約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍，或約1011 -1012 倍，其中對照抗體包含：i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 503的VH ，或與SEQ ID NO: 503具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 504的VL ，或與SEQ ID NO: 504具有至少約95%序列一致性的其變異體。在一些實施例中，對照抗GPC3抗體與與細胞表面結合之GPC3之間結合的Kd 可為本文所述之抗nGPC3抗體部分與與細胞表面結合之GPC3之間結合之Kd 的至少約2倍，諸如約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍，或約1011 -1012 倍，其中對照抗體包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 497的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 498的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 499的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 500的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 501的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 502的LC-CDR3。在一些實施例中，本文所述之抗nGPC3抗體部分與可溶性GPC3之間結合的Kd 可為對照抗GPC3抗體與可溶性GPC3之間結合之Kd 的至少約2倍，諸如約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍，或約1011 -1012 倍，其中對照抗體包含：i) VH ，包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 497的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 498的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 499的HC-CDR3；及ii) VL ，包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 500的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 501的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 502的LC-CDR3。
在一些實施例中，可溶性GPC3在抗GPC3構築體與與細胞表面結合之GPC3之間競爭結合的IC50為約1 µg/ml至約100 µg/ml，諸如約1 µg/ml至約5 µg/ml、1 µg/ml至約10 µg/ml、約10 µg/ml至約20 µg/ml、約20 µg/ml至約50 µg/ml，或50 µg/ml至約100 µg/ml。在一些實施例中，可溶性GPC3在抗GPC3構築體與與細胞表面結合之GPC3之間競爭結合的IC50為可溶性GPC3在對照抗GPC3抗體(諸如GC33)與細胞表面所結合GPC3之間競爭結合之IC50的至少約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或超過100倍中的任一者。抗 GPC3 抗體部分形式
本文所述之抗GPC3抗體部分(針對例如nGPC3及/或sGPC3)可具有任何抗體或抗原結合片段形式。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分(針對例如nGPC3及/或sGPC3)為全長抗體或免疫球蛋白衍生物。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為抗原結合片段，例如選自由以下組成之群的抗原結合片段：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定化Fv片段(dsFv)或單鏈Fv (scFv)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分(針對nGPC3及/或sGPC3)為包含完全人類序列及一或多個合成區域的半合成抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為包含完全人類輕鏈可變域及半合成重鏈可變域的半合成抗體部分，該半合成重鏈可變域包含完全人類FR1、HC-CDR1、FR2、HC-CDR2、FR3及FR4區域及合成HC-CDR3。在一些實施例中，半合成重鏈可變域包含全合成HC-CDR3，其具有長度為約5至約25 (如約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者)個胺基酸之序列。在一些實施例中，半合成重鏈可變域或合成HC-CDR3獲自半合成文庫(諸如半合成人類文庫)，其包含具有長度為約5至約25 (諸如約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者)個胺基酸之序列的全合成HC-CDR3，其中序列中之各胺基酸隨機選自除半胱胺酸之外的標準人類胺基酸。在一些實施例中，合成HC-CDR3之長度為約5至約19(諸如約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中的任一者)個胺基酸。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為包含人類CDR及非人類構架序列之半合成抗體部分。在一些實施例中，非人類構架序列包括可以使用如本文所述的一或多個人類CDR序列而用於產生合成重鏈及/或輕鏈可變區的任何序列，包括例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、豬、牛科動物(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、犬、白鼬、靈長類動物(例如狨猴、恆河猴)等。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係藉由將如本文所述的一或多個人類CDR序列移植至非人類構架序列(例如小鼠或雞構架序列)上而產生。抗 GPC3 抗體部分序列
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含特定序列或此類序列之某些變異體。在一些實施例中，變異體序列中之胺基酸取代實質上不降低抗nGPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的能力、抗sGPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3的能力，或抗GPC3抗體部分係專一性辨識標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的能力。舉例而言，可以產生實質上不降低標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)結合親和力的變異。亦涵蓋實質上改良標靶GPC3結合親和力或影響一些其他特性(諸如專一性及/或與標靶GPC3之相關變異體的交叉反應性)的變異。
例示性抗體序列展示於表6-9中。使用IgBLAST算法預測表6及8中的例示性CDR序列。參見例如Ye J等人, Nucleic Acids Research, 41:W34-W40 (2013)，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。熟習此項技術者將認識到，多種算法已知用於預測抗體重鏈及輕鏈可變區中的CDR位置，且包含來自本文所述抗體之CDR、但基於除IgBLAST之外之預測算法的抗體藥劑屬於本發明之範疇內。
表7及9中之例示性抗體重鏈及輕鏈可變區序列係根據INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM® (IMGT)界定。參見例如Lefranc, M.-P.等人, Nucleic Acids Res., 43:D413-422 (2015)，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。熟習此項技術者將認識到，包含來自本文所述抗體之VH 或VL 序列、但基於除IMGT之外之算法的抗體藥劑屬於本發明之範疇內。專一性辨識與細胞表面結合之 GPC3 的抗 GPC3 抗體部分
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3 (抗nGPC3抗體部分)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i)重鏈可變域(VH )，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii)輕鏈可變域(VL )，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i)包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者的HC-CDR3；及ii)包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中任一者之HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中任一者之HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者之HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中任一者之LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中任一者之LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者之LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中任一者之HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中任一者之HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者之HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中任一者之LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中任一者之LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者之LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中任一者之HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中任一者之HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者之HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中任一者之LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中任一者之LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者之LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中任一者之HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中任一者之HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者之HC-CDR3，或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，其中胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中；以及ii) VL ，包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中任一者之LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中任一者之LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者之LC-CDR3，或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，其中胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中任一者之HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中任一者之HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者之HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中任一者之LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中任一者之LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者之LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a) VH ，其包含SEQ ID NO: 1-31中任一者之胺基酸序列、SEQ ID NO: 52-82中任一者之胺基酸序列及SEQ ID NO: 103-133中任一者之胺基酸序列；以及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 154-184中任一者之胺基酸序列、SEQ ID NO: 205-235中任一者之胺基酸序列及SEQ ID NO: 256-286中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a) VH ，其包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之一個、兩個或三個CDR，及b) VL ，其包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a) VH ，其包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之重鏈可變域的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及b) VL，其包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之CDR輕鏈可變域的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之胺基酸序列的VH ，或與SEQ ID NO: 307-337中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之胺基酸序列的VL ，或與SEQ ID NO: 358-388中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之胺基酸序列的VH ；及b)包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之胺基酸序列的VL 。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR。
重鏈與輕鏈可變域可以各種成對組合來組合以產生多種抗nGPC3抗體部分。例示性抗nGPC3抗體提供於表6及7中。表 6 專一性辨識與細胞表面結合之 GPC3 CDR 序列的抗 GPC3 抗體部分 表 7 專一性辨識與細胞表面結合之 GPC3 VH / VL 序列的抗 GPC3 抗體部分 (CDR序列加下劃線)
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 2的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 53的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 104的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 155的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 206的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 257的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 2的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 53的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 104的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 155的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 206的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 257的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 2的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 53的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 104的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 155的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 206的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 257的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 3的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 54的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 105的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 156的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 207的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 258的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 3的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 54的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 105的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 156的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 207的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 258的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 3的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 54的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 105的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 156的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 207的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 258的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 4的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 55的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 106的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 157的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 208的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 259的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 4的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 55的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 106的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 157的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 208的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 259的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 4的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 55的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 106的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 157的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 208的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 259的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 5的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 56的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 107的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 158的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 209的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 260的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 5的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 56的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 107的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 158的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 209的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 260的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 5的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 56的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 107的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 158的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 209的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 260的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 6的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 57的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 108的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 159的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 210的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 261的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 6的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 57的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 108的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 159的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 210的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 261的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 6的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 57的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 108的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 159的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 210的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 261的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 58的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 109的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 160的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 211的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 262的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 58的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 109的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 160的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 211的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 262的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 58的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 109的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 160的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 211的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 262的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 59的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 110的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 161的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 212的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 263的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 59的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 110的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 161的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 212的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 263的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 59的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 110的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 161的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 212的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 263的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 60的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 111的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 162的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 213的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 264的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 60的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 111的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 162的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 213的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 264的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 60的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 111的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 162的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 213的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 264的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 10的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 61的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 112的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 163的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 214的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 265的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 10的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 61的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 112的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 163的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 214的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 265的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 10的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 61的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 112的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 163的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 214的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 265的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 11的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 62的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 113的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 164的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 215的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 266的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 11的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 62的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 113的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 164的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 215的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 266的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 11的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 62的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 113的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 164的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 215的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 266的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 12的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 63的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 114的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 165的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 216的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 267的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 12的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 63的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 114的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 165的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 216的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 267的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 12的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 63的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 114的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 165的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 216的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 267的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 13的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 64的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 115的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 166的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 217的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 268的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 13的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 64的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 115的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 166的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 217的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 268的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 13的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 64的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 115的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 166的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 217的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 268的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 65的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 116的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 167的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 218的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 269的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 65的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 116的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 167的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 218的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 269的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 14的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 65的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 116的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 167的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 218的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 269的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 15的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 66的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 117的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 168的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 219的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 270的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 15的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 66的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 117的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 168的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 219的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 270的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 15的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 66的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 117的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 168的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 219的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 270的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 16的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 67的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 118的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 169的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 220的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 271的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 16的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 67的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 118的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 169的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 220的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 271的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 16的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 67的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 118的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 169的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 220的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 271的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 17的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 68的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 119的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 170的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 221的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 272的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 17的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 68的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 119的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 170的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 221的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 272的LC-CDR3；或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 17的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 68的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 119的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 170的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 221的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 272的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 69的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 120的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 171的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 222的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 273的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 69的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 120的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 171的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 222的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 273的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 69的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 120的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 171的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 222的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 273的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 70的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體及胺基酸序列為SEQ ID NO: 121的HC-CDR3，或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 172的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 223的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 274的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 70的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 121的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 172的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 223的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 274的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 70的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 121的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 172的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 223的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 274的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 20的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 71的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 122的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 173的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 224的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 275的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 20的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 71的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 122的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 173的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 224的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 275的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 20的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 71的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 122的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 173的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 224的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 275的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 21的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 72的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 123的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 174的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 225的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 276的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 21的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 72的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 123的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 174的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 225的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 276的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 21的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 72的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 123的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 174的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 225的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 276的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 22的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 73的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體及胺基酸序列為SEQ ID NO: 124的HC-CDR3，或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 175的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 226的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體及胺基酸序列為SEQ ID NO: 277的LC-CDR3，或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 22的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 73的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 124的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 175的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 226的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 277的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 22的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 73的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 124的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 175的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 226的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 277的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 23的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 74的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 125的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 176的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 227的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 278的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 23的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 74的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 125的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 176的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 227的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 278的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 23的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 74的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 125的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 176的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 227的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 278的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 24的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 75的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 126的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 177的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 228的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 279的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 24的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 75的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 126的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 177的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 228的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 279的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 24的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 75的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 126的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 177的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 228的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 279的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 25的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 76的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 127的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 178的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 229的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 280的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 25的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 76的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 127的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 178的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 229的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 280的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 25的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 76的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 127的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 178的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 229的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 280的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 26的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 77的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 128的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 179的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 230的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 281的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 26的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 77的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 128的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 179的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 230的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 281的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 26的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 77的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 128的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 179的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 230的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 281的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 27的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 78的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 129的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 180的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 231的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 282的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 27的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 78的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 129的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 180的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 231的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 282的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 27的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 78的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 129的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 180的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 231的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 282的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 28的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 79的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 130的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 181的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 232的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 283的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 28的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 79的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 130的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 181的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 232的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 283的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 28的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 79的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 130的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 181的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 232的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 283的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 80的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 131的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 182的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 233的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 284的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 80的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 131的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 182的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 233的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 284的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 29的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 80的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 131的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 182的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 233的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 284的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 30的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 81的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 132的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 183的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 234的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 285的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 30的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 81的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 132的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 183的LC-CDR1、包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 234的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 285的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 30的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 81的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 132的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 183的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 234的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 285的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 31的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 82的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 133的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 184的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 235的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 286的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 31的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 82的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 133的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 184的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 235的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 286的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 31的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 82的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 133的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 184的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 235的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 286的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 307的VH 或與SEQ ID NO: 307具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 358的VL 或與SEQ ID NO: 358具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 307的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 358的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 307之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 358之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:308之VH 或與SEQ ID NO: 308具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 359之VL 或與SEQ ID NO: 359具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 308之VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 359之VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 308之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 359之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 309的VH 或與SEQ ID NO: 309具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 360的VL 或與SEQ ID NO: 360具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 309的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 360的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 309之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 360之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 310的VH 或與SEQ ID NO: 310具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 361的VL 或與SEQ ID NO: 361具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 310的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 361的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 310之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 361之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 311的VH 或與SEQ ID NO: 311具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 362的VL 或與SEQ ID NO: 362具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 311的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 362的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 311之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 362之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 312的VH 或與SEQ ID NO: 312具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 363的VL 或與SEQ ID NO: 363具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 312的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 363的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 312之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 363之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 313的VH 或與SEQ ID NO: 313具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 364的VL 或與SEQ ID NO: 364具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 313的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 364的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 313之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 364之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 314的VH 或與SEQ ID NO: 314具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 365的VL 或與SEQ ID NO: 365具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 314的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 365的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 314之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 365之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 315的VH 或與SEQ ID NO: 315具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 366的VL 或與SEQ ID NO: 366具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 315的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 366的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 315之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 366之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 316的VH 或與SEQ ID NO: 316具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 367的VL 或與SEQ ID NO: 367具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 316的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 367的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 316之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 367之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 317的VH 或與SEQ ID NO: 317具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 368的VL 或與SEQ ID NO: 368具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 317的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 368的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 317之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 368之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 318的VH 或與SEQ ID NO: 318具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 369的VL 或與SEQ ID NO: 369具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 318的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 369的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 318之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 369之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 319的VH 或與SEQ ID NO: 319具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 370的VL 或與SEQ ID NO: 370具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 319的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 370的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 319之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 370之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 320的VH 或與SEQ ID NO: 320具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 371的VL 或與SEQ ID NO: 371具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 320的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 371的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 320之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 371之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 321的VH 或與SEQ ID NO: 321具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 372的VL 或與SEQ ID NO: 372具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 321的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 372的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 321之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 372之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 322的VH 或與SEQ ID NO: 322具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 373的VL 或與SEQ ID NO: 373具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 322的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 373的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 322之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 373之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 323的VH 或與SEQ ID NO: 323具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 374的VL 或與SEQ ID NO: 374具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 323的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 374的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 323之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 374之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 324的VH 或與SEQ ID NO: 324具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 375的VL 或與SEQ ID NO: 375具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 324的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 375的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 324之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 375之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 325的VH 或與SEQ ID NO: 325具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 376的VL 或與SEQ ID NO: 376具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 325的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 376的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 325之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 376之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 326的VH 或與SEQ ID NO: 326具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 377的VL 或與SEQ ID NO: 377具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 326的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 377的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 326之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 377之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 327的VH 或與SEQ ID NO: 327具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 378的VL 或與SEQ ID NO: 378具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 327的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 378的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 327之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 378之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 328的VH 或與SEQ ID NO: 328具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 379的VL 或與SEQ ID NO: 379具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 328的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 379的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 328之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 379之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 329的VH 或與SEQ ID NO: 329具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 380的VL 或與SEQ ID NO: 380具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 329的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 380的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 329之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 380之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 330的VH 或與SEQ ID NO: 330具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 381的VL 或與SEQ ID NO: 381具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 330的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 381的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 330之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 381之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 331的VH 或與SEQ ID NO: 331具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 382的VL 或與SEQ ID NO: 382具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 331的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 382的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 331之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 382之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 332的VH 或與SEQ ID NO: 332具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 383的VL 或與SEQ ID NO: 383具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 332的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 383的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 332之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 383之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 333的VH 或與SEQ ID NO: 333具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 384的VL 或與SEQ ID NO: 384具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 333的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 384的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 333之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 384之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 334的VH 或與SEQ ID NO: 334具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 385的VL 或與SEQ ID NO: 385具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 334的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 385的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 334之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 385之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 335的VH 或與SEQ ID NO: 335具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 386的VL 或與SEQ ID NO: 386具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 335的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 386的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 335之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 386之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 336的VH 或與SEQ ID NO: 336具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 387的VL 或與SEQ ID NO: 387具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 336的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 387的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 336之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 387之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 337的VH 或與SEQ ID NO: 337具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 388的VL 或與SEQ ID NO: 388具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 337的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 388的VL 。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 337之VH 的HC-CDR，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 388之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，該抗nGPC3抗體部分與根據本文所述之任一種抗nGPC3抗體部分的第二抗nGPC3抗體部分競爭結合至與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與第二抗nGPC3抗體部分結合至相同或基本上相同的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分結合至與細胞表面結合之GPC3將第二抗nGPC3抗體部分對相同與細胞表面結合之GPC3的結合抑制至少約70% (諸如至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中之任一者)或反之亦然。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與第二抗nGPC3抗體部分交叉競爭結合至與細胞表面結合之GPC3，亦即，抗nGPC3抗體部分中之每一者與另一者競爭結合至與細胞表面結合之GPC3。
專一性辨識 GPC3 的 抗 GPC3 抗體部分
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 461胺基酸序列內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460 (SEQ ID NO: 467)之胺基酸510-560內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i)重鏈可變域(VH )，其包含含有SEQ ID NO: 134-153中任一者之胺基酸序列的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii)輕鏈可變域(VL )，其包含含有SEQ ID NO: 287-306中任一者之胺基酸序列的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含含有SEQ ID NO: 134-153中任一者之胺基酸序列的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含含有SEQ ID NO: 287-306中任一者之胺基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中任一者之HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中任一者之HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中任一者之HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中任一者之LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中任一者之LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中任一者之LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中任一者之HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中任一者之HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中任一者之HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中任一者之LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代之其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中任一者之LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代之其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中任一者之LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中任一者之HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中任一者之HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中任一者之HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中任一者之LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中任一者之LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中任一者之LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中任一者之HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中任一者之HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中任一者之HC-CDR3，或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，其中胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中任一者之LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中任一者之LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中任一者之LC-CDR3，或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，其中胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a) VH ，其包含SEQ ID NO: 32-51中任一者之胺基酸序列、SEQ ID NO: 83-102中任一者之胺基酸序列及SEQ ID NO: 134-153中任一者之胺基酸序列；以及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 185-204中任一者之胺基酸序列、SEQ ID NO: 236-255中任一者之胺基酸序列及SEQ ID NO: 287-306中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a) VH ，其包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之一個、兩個或三個CDR，及b) VL ，其包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分包含：a) VH ，其包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之重鏈可變域的HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及b) VL，其包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之CDR輕鏈可變域的LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a) VH ，其包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 338-357中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b) VL ，其包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 389-408中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之胺基酸序列的VH ；及b)包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之胺基酸序列的VL 。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR。
重鏈與輕鏈可變域可以各種成對組合來組合以產生多種抗GPC3抗體部分。例示性抗GPC3抗體部分提供於表8及9中。 表8 抗GPC3抗體部分CDR序列 表 9 抗 GPC3 抗體部分 VH / VL 序列 (CDR序列加下劃線 )
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 84的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 135的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 186的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 237的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 288的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 84的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 135的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 186的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 237的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 288的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 84的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 135的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 186的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 237的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 288的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 34的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 85的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 136的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 187的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 238的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 289的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 34的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 85的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 136的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 187的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 238的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 289的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 34的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 85的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 136的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 187的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 238的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 289的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 35的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 86的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 137的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 188的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 239的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 290的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 35的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 86的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 137的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 188的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 239的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 290的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 35的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 86的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 137的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 188的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 239的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 290的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 36的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 87的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 138的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 189的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 240的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 291的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 36的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 87的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 138的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 189的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 240的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 291的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 36的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 87的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 138的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 189的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 240的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 291的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 37的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 88的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 139的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 190的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 241的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 292的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 37的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 88的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 139的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 190的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 241的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 292的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 37的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 88的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 139的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 190的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 241的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 292的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 38的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 89的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 140的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 191的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 242的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 293的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 38的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 89的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 140的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 191的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 242的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 293的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 38的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 89的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO:140的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 191的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 242的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 293的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 39的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 90的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 141的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 192的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 243的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 294的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 39的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 90的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 141的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 192的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 243的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 294的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 39的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 90的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 141的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 192的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 243的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 294的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 40的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 91的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 142的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 193的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 244的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 295的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 40的HC-CDR1、包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 91的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 142的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 193的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 244的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 295的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 40的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 91的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 142的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 193的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 244的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 295的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 41的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 92的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 143的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 194的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 245的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 296的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 41的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 92的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 143的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 194的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 245的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 296的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 41的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 92的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 143的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 194的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 245的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 296的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 42的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 93的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 144的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 195的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 246的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 297的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 42的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 93的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 144的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 195的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 246的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 297的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 42的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 93的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 144的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 195的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 246的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 297的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 43的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 94的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 145的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 196的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 247的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 298的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 43的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 94的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 145的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 196的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 247的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 298的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 43的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 94的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 145的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 196的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 247的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 298的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 44的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 95的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 146的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 197的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 248的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 299的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 44的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 95的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 146的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 197的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 248的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 299的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 44的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 95的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 146的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 197的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 248的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 299的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 45的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 96的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 147的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 198的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 249的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 300的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 45的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 96的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 147的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 198的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 249的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 300的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 45的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 96的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 147的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 198的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 249的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 300的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 46的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 97的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 148的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 199的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 250的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 301的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 46的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 97的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 148的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 199的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 250的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 301的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 46的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 97的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 148的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 199的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 250的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 301的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 47的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 98的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 149的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 200的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 251的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 302的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 47的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 98的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 149的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 200的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 251的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 302的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 47的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 98的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 149的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 200的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 251的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 302的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 48的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 99的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 150的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 201的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 252的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 303的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 48的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 99的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 150的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 201的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 252的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 303的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 48的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 99的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 150的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 201的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 252的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 303的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 49的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 100的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 151的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 202的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 253的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 304的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 49的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 100的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 151的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 202的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 253的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 304的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 49的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 100的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 151的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 202的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 253的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 304的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 50的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 101的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 152的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 203的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 254的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 305的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 50的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 101的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 152的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 203的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 254的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 305的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 50的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 101的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 152的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 203的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 254的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 305的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 51的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 102的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 153的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 204的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 255的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 306的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：(1) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 51的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 102的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 153的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 204的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 255的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 306的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 51的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 102的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 153的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 204的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 255的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 306的LC-CDR3。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 338的VH 或與SEQ ID NO: 338具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；以及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 389的VL 或與SEQ ID NO: 389具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 338的VH ；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 389的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 339的VH 或與SEQ ID NO: 339具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 390的VL 或與SEQ ID NO: 390具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 339的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 390的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 339之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 390之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 340的VH 或與SEQ ID NO: 340具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 391的VL 或與SEQ ID NO: 391具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 340的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 391的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 340之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 391之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 341的VH 或與SEQ ID NO: 341具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 392的VL 或與SEQ ID NO: 392具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 341的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 392的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 341之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 392之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 342的VH 或與SEQ ID NO: 342具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 393的VL 或與SEQ ID NO: 393具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 342的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 393的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 342之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 393之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 343的VH 或與SEQ ID NO: 343具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 394的VL 或與SEQ ID NO: 394具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 343的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 394的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 343之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 394之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 344的VH 或與SEQ ID NO: 344具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 395的VL 或與SEQ ID NO: 395具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 344的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 395的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 344之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 395之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 345的VH 或與SEQ ID NO: 345具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 396的VL 或與SEQ ID NO: 396具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 345的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 396的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 345之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 396之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 346的VH 或與SEQ ID NO: 346具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 397的VL 或與SEQ ID NO: 397具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 346的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 397的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 346之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 397之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 347的VH 或與SEQ ID NO: 347具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 398的VL 或與SEQ ID NO: 398具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 347的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 398的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 347之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 398之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 348的VH 或與SEQ ID NO: 348具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 399的VL 或與SEQ ID NO: 399具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 348的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 399的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 348之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 399之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 349的VH 或與SEQ ID NO: 349具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 400的VL 或與SEQ ID NO: 400具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 349的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 400的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 349之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 400之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 350的VH 或與SEQ ID NO: 350具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 401的VL 或與SEQ ID NO: 401具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 350的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 401的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 350之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 401之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 351的VH 或與SEQ ID NO: 351具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 402的VL 或與SEQ ID NO: 402具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 351的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 402的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 351之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 402之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 352的VH 或與SEQ ID NO: 352具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 403的VL 或與SEQ ID NO: 403具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 352的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 403的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 352之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 403之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 353的VH 或與SEQ ID NO: 353具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 404的VL 或與SEQ ID NO: 404具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 353的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 404的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 353之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 404之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 354的VH 或與SEQ ID NO: 354具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 405的VL 或與SEQ ID NO: 405具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 354的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 405的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 354之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 405之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 355的VH 或與SEQ ID NO: 355具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 406的VL 或與SEQ ID NO: 406具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 355的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 406的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 355之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 406之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 356的VH 或與SEQ ID NO: 356具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 407的VL 或與SEQ ID NO: 407具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 356的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 407的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 356之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 407之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 357的VH 或與SEQ ID NO: 357具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 408的VL 或與SEQ ID NO: 408具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含：a)胺基酸序列為SEQ ID NO: 357的VH ；及b)胺基酸序列為SEQ ID NO: 408的VL 。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 357之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 408之VL 的LC-CDR。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與根據本文所述之任一種抗GPC3抗體部分的第二抗GPC3抗體部分競爭結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與第二抗GPC3抗體部分結合至相同或基本上相同的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分結合至標靶GPC3將第二抗GPC3抗體部分對標靶GPC3的結合抑制至少約70% (諸如至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中之任一者)，或反之亦然。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與第二抗GPC3抗體部分交叉競爭結合至標靶GPC3，亦即，抗GPC3抗體部分中之每一者與另一者競爭結合至標靶GPC3。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，其中該抗nGPC3抗體部分可為本文所述之任一種抗nGPC3抗體部分。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3(例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，其中該抗GPC3抗體部分可為本文所述之任一種抗GPC3抗體部分。
舉例而言，在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(在本文中稱為「抗nGPC3抗體部分」；例如，抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力對高於可溶性GPC3的結合親和力，或抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分。在一些實施例中，提供一種包含抗nGPC3抗體部分的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，該抗nGPC3抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的nGPC3抗原決定基。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體包含視情況經由連接子與Fc片段(例如IgG1 Fc片段)融合的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體(例如單株抗體)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性(諸如雙專一性)分子，諸如串聯雙scFv抗GPC3 T細胞接合體(串聯雙scFv抗GPC3×CD3ε)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為CAR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為caTCR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，抗GPC3構築體具有單專一性。在一些實施例中，抗GPC3構築體具有多專一性(例如雙專一性)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，提供抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之胺基酸序列的VH 或與SEQ ID NO: 307-337中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；以及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 358-388中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含SEQ ID NO: 307-337中任一者之胺基酸序列；及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 358-388中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該構築體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分。在一些實施例中，提供一種包含抗nGPC3抗體部分的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，該抗nGPC3抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的nGPC3抗原決定基。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體包含視情況經由連接子與Fc片段(例如IgG1 Fc片段)融合的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體(例如單株抗體)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性(諸如雙專一性)分子，諸如串聯雙scFv抗GPC3 T細胞接合體(串聯雙scFv抗GPC3×CD3ε)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為CAR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為caTCR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，抗GPC3構築體具有單專一性。在一些實施例中，抗GPC3構築體具有多專一性(例如雙專一性)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，提供抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3，或HC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3，或LC-CDR序列中包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中。在一些實施例中，胺基酸取代發生於LC-CDR1或LC-CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 338-357中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體；以及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 389-408中之任一者具有至少約80% (包括例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性的其變異體。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含SEQ ID NO: 338-357中任一者之胺基酸序列；及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 389-408中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分，該構築體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，提供一種包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，該抗GPC3抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體包含視情況經由連接子與Fc片段(例如IgG1 Fc片段)融合的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體(例如單株抗體)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性(諸如雙專一性)分子，諸如串聯雙scFv抗GPC3 T細胞接合體(串聯雙scFv抗GPC3×CD3ε)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為CAR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為caTCR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，抗GPC3構築體具有單專一性。在一些實施例中，抗GPC3構築體具有多專一性(例如雙專一性)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。抗 GPC3 scFv
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)為包含本文所述之抗GPC3抗體部分(靶向例如nGPC3及/或sGPC3)的scFvs (下文中稱為「抗GPC3 scFv」)。在一些實施例中，抗GPC3 scFv專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。抗GPC3-scFv可以包含本文所述之抗GPC3抗體部分中的任一者(參見「抗GPC3抗體部分」章節)。抗GPC3 scFv (靶向例如nGPC3及/或sGPC3)可以具有(自N末端至C末端) VL (GPC3)-L-VH (GPC3)或VH (GPC3)-L-VL (GPC3)之組態，其中L為連接子(諸如肽連接子)。在一些實施例中，抗GPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。例示性抗GPC3 scFv序列展示於表10-11中。表 10 專一性辨識與細胞表面結合之 GPC3 scFv 序列的抗 GPC3 抗體部分 (CDR序列加下劃線 ；連接子序列加粗 ) 表 11 抗 GPC3 抗體部分 scFv 序列 (CDR序列加下劃線 ；連接子序列加粗 ) 連接子
關於可以用於本文所述之抗GPC3 scFv中的所有適用連接子，參見下文「抗GPC3 Fc融合蛋白」章節下的「連接子」小節。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA (SEQ ID NO: 473)。在一些實施例中，連接子為或包含(GGGGS)n 序列(SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD (SEQ ID NO: 490)。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(例如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的scFv(在本文中稱為「抗nGPC3 scFv」；例如抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內之抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3-scFv (例如抗nGPC3-scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3-scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3-scFv (例如抗nGPC3-scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3-scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 位於抗nGPC3-scFv之VL 的N末端。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 位於抗nGPC3-scFv之VL 的C末端。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子包含胺基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA (SEQ ID NO: 473)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子為或包含(GGGGS)n 序列(SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，位於抗nGPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子包含胺基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD (SEQ ID NO: 490)。在一些實施例中，抗nGPC3 scFv進一步包含標籤(例如用於純化目的之肽標籤)。在一些實施例中，標籤位於抗nGPC3 scFv之N末端。在一些實施例中，標籤位於抗nGPC3 scFv之C末端。在一些實施例中，標籤包含His標籤及HA標籤。在一些實施例中，標籤包含胺基酸序列TSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS (SEQ ID NO: 477)。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3-scFv。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3-scFv抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3-scFv，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3-scFv，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL 。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3-scFv，該抗GPC3-scFv包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3-scFv。在一些實施例中，提供一種包含抗nGPC3-scFv的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，該抗nGPC3-scFv與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的nGPC3抗原決定基。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 位於抗nGPC3-scFv之VL 的N末端。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 位於抗nGPC3-scFv之VL 的C末端。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子包含胺基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA (SEQ ID NO: 473)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子為或包含(GGGGS)n 序列(SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，位於抗nGPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子包含胺基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD (SEQ ID NO: 490)。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3-scFv，其中該抗nGPC3 scFv包含SEQ ID NO: 409-439中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗nGPC3 scFv進一步包含標籤(例如用於純化目的之肽標籤)。在一些實施例中，標籤位於抗nGPC3 scFv之N末端。在一些實施例中，標籤位於抗nGPC3 scFv之C末端。在一些實施例中，標籤包含His標籤及HA標籤。在一些實施例中，標籤包含胺基酸序列TSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS (SEQ ID NO: 477)。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3-scFv。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3-scFv，該抗GPC3-scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3-scFv，包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3-scFv，該抗GPC3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL 。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3-scFv，該抗GPC3-scFv包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3-scFv。在一些實施例中，提供一種包含抗GPC3-scFv的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，該抗GPC3-scFv與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3-scFv專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗GPC3-scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3-scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3-scFv專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3-scFv對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3-scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3-scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3-scFv專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3-scFv與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3-scFv與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3-scFv與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3-scFv與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗GPC3-scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3-scFv之VH 位於抗GPC3-scFv之VL 的N末端。在一些實施例中，抗GPC3-scFv之VH 位於抗GPC3-scFv之VL 的C末端。在一些實施例中，位於抗GPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子包含胺基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA (SEQ ID NO: 473)。在一些實施例中，位於抗GPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子為或包含(GGGGS)n 序列(SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，位於抗GPC3-scFv之VH 與VL 之間的連接子包含胺基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD (SEQ ID NO: 490)。在一些實施例中，提供一種抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3-scFv，其中該抗GPC3 scFv包含SEQ ID NO: 440-459中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗GPC3-scFv進一步包含標籤(例如用於純化目的之肽標籤)。在一些實施例中，標籤位於抗GPC3-scFv之N末端。在一些實施例中，標籤位於抗GPC3-scFv之C末端。在一些實施例中，標籤包含His標籤及HA標籤。在一些實施例中，標籤包含胺基酸序列TSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS (SEQ ID NO: 477)。 抗 GPC3 Fc 融合蛋白
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)為Fc融合蛋白(下文中稱為「抗GPC3-Fc融合蛋白」)，其包含與Fc片段(諸如IgG1 Fc片段)融合之本文所述抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與Fc片段經由連接子(諸如肽連接子)融合。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白包含含有Fc片段的抗體。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為全長抗體。「抗GPC3抗體部分章節」中所述的任一種抗GPC3抗體部分可以用於抗GPC3 Fc融合蛋白中。Fc 片段
術語「Fc區」、「Fc域」或「Fc」係指含有恆定區之至少一部分之免疫球蛋白重鏈的C末端非抗原結合區。該術語包括原生Fc區及變異型Fc區。在一些實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可以或可以不存在，此不影響Fc區之結構或穩定性。除非另外說明，否則IgG或Fc區中之胺基酸殘基係根據抗體之EU編號系統編號，亦稱為EU索引，如以下文獻中所述：Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 公眾健康服務署(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD, 1991。
在一些實施例中，Fc片段包含含有鉸鏈區(始於Cys226)、IgG CH2域及CH3域的免疫球蛋白IgG重鏈恆定區。如本文所用，術語「鉸鏈區」或「鉸鏈序列」係指位於連接子與CH2域之間的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含含有鉸鏈區的Fc片段。在一些實施例中，鉸鏈區包含胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 478)(發現於原生IgG1鉸鏈區中的一種序列)，以促進二聚合。在一些實施例中，融合蛋白之Fc片段始於鉸鏈區且延伸至IgG重鏈之C末端。在一些實施例中，融合蛋白包含不包含鉸鏈區之Fc片段。
在一些實施例中，融合蛋白包含選自由來自以下之Fc片段組成之群的Fc片段：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，及其組合及混合物。在一些實施例中，Fc片段來源於人類IgG。在一些實施例中，Fc片段包含人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之Fc區，或組合或混合IgG。在一些實施例中，Fc片段為IgG1 Fc片段。在一些實施例中，Fc片段包含IgG1之CH2及CH3域。在一些實施例中，Fc片段為IgG4 Fc片段。在一些實施例中，Fc片段包含IgG4之CH2及CH3域。已知IgG4 Fc展現的效應子活性小於IgG1 Fc，且因此可為一些應用中所需要的。在一些實施例中，Fc片段來源於小鼠免疫球蛋白。
在一些實施例中，IgG CH2域始於Ala231。在一些實施例中，CH3域始於Gly341。應瞭解，人類IgG之C末端Lys殘基可視情況為不存在的。亦應瞭解，本發明之範疇內涵蓋不影響Fc之所需結構及/或穩定性的Fc區保守胺基酸取代。
另外，涵蓋包含下述任一種Fc變異體或其組合的抗GPC3-Fc融合蛋白。在一些實施例中，Fc片段包含已改變或以其他方式變化的序列，以使得其具有增強之抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)效應功能。
在一些實施例中，Fc片段中之每條鏈與相同實體融合。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白包含本文所述之兩種相同抗GPC3抗體部分(專一性辨識例如nGPC3及/或sGPC3)，其各自與Fc片段中之一條鏈融合。在一些實施例中，Fc片段之兩條鏈相同。在一些實施例中，包含Fc片段的抗GPC3-Fc融合蛋白(包括包含抗體的抗GPC3-Fc融合蛋白)為同二聚體。
在一些實施例中，Fc片段中之每條鏈與不同實體融合。在一些實施例中，融合蛋白包含兩種不同抗GPC3抗體部分，其各自與Fc片段中之一條鏈融合。在一些實施例中，兩種抗GPC3抗體部分不同，但均專一性辨識nGPC3。在一些實施例中，兩種抗GPC3抗體部分不同，但均專一性辨識sGPC3。在一些實施例中，一種抗GPC3抗體部分係專一性辨識nGPC3，且另一種抗GPC3抗體部分係專一性辨識sGPC3。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為單價的，亦即，僅一種抗GPC3抗體部分與Fc片段中之一條鏈融合，且Fc片段中之第二條鏈不與抗GPC3抗體部分融合。在一些實施例中，包含Fc片段的抗GPC3-Fc融合蛋白(包括包含抗體的抗GPC3-Fc融合蛋白)為雜二聚體。
抗GPC3-Fc融合蛋白中之不相同多肽之雜二聚化可藉由此項技術中已知之方法促進，包括(但不限於)藉由臼包杵式技術進行雜二聚化。臼包杵式技術之結構及組裝方法可以發現於例如US5,821,333、US7,642,228、US 2011/0287009及PCT/US2012/059810中，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。此技術係藉由在一個Fc之CH3域中用大胺基酸殘基置換小胺基酸殘基來引入「杵」(或隆凸)且在另一個Fc之CH3域中用較小胺基酸殘基置換一或多個大胺基酸殘基來引入「臼」(或空腔)而開發。在一些實施例中，融合蛋白中之Fc片段的一條鏈包含杵，且Fc片段的第二條鏈包含臼。
用於形成杵之較佳殘基通常為天然存在之胺基酸殘基且較佳選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。最佳為色胺酸及酪胺酸。在一個實施例中，用於形成杵之原始殘基具有較小側鏈體積，諸如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。用於形成杵之CH3域中的例示性胺基酸取代包括(不限於) T366W、T366Y或F405W取代。
用於形成臼之較佳殘基通常為天然存在之胺基酸殘基且較佳選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。在一個實施例中，用於形成臼之原始殘基具有大側鏈體積，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。用於產生臼之CH3域中的例示性胺基酸取代包括(不限於) T366S、L368A、F405A、Y407A、Y407T及Y407V取代。在某些實施例中，杵包含T366W取代，且臼包含T366S/L368A/Y 407V取代。應瞭解，本申請案亦預期且涵蓋此項技術中已知之促進雜二聚化之針對Fc區的其他修飾。
預期其他抗GPC3 Fc融合蛋白變異體(諸如分離之抗GPC3-Fc融合蛋白之變異體，例如全長抗GPC3抗體變異體)，包含本文所述之任一種變異體(例如Fc變異體、效應功能變異體、糖基化變異體、半胱胺酸工程化變異體)或其組合。關於抗GPC3 Fc融合蛋白之所有適用變異體(例如全長抗GPC3抗體)，參見「抗GPC3變異體」章節。連接子
在一些實施例中，本文所述之抗GPC3-Fc融合蛋白包含與Fc片段經由連接子融合的本文所述之抗GPC3抗體部分。
抗GPC3-Fc融合蛋白中所用之連接子的長度、柔性度及/或其他特性可以對特性產生一些影響，包括(但不限於)抗GPC3抗體部分之親和力、專一性或親合力，及/或抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如包含Fc片段及抗GPC3抗體部分的抗體)之一或多種特定抗原或抗原決定基。舉例而言，可以選擇較長連接子以確保兩個相鄰抗體部分在空間上彼此無干擾。在一些實施例中，連接子(諸如肽連接子)包含柔性殘基(諸如甘胺酸及絲胺酸)，使得相鄰抗體部分相對於彼此自由移動。舉例而言，甘胺酸-絲胺酸對可為適合的肽連接子。在一些實施例中，連接子為非肽連接子。在一些實施例中，連接子為肽連接子。在一些實施例中，連接子為不可裂解的連接子。在一些實施例中，連接子為可裂解的連接子。
其他連接子考慮因素包括對所得抗GPC3-Fc融合蛋白之物理或藥物動力學特性的影響，諸如溶解性、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(較穩定或不大穩定以及有計劃的降解)、硬度、柔性、免疫原性、抗體部分結合之調節、併入微胞或脂質體中之能力，及其類似因素。非肽連接子
本文所述之任一種或所有連接子可以藉由使兩個分子結合的任何化學反應完成，只要組分或片段保持其相應活性，亦即結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)、結合至FcR，或ADCC/CDC。此連接可以包括許多化學機制，例如共價結合、親和力結合、插入、配位結合及錯合。在一些實施例中，結合為共價結合。共價結合可藉由現有側鏈之直接縮合或藉由併入外部橋連分子實現。許多二價或多價連接劑適用於蛋白質分子的偶合，諸如Fc片段與本發明之抗GPC3抗體部分的偶合。舉例而言，代表性偶合劑可以包括有機化合物，諸如硫酯、碳化二亞胺、丁二醯亞胺酯、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯及六亞甲基二胺。不希望此清單為此項技術中已知之各類偶合劑的詳盡清單，而實際上為較常見之偶合劑的示例(參見Killen及Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)；Jansen等人, Immunological Reviews 62:185-216 (1982)；及Vitetta等人, Science 238:1098 (1987))。
可適用於本申請案中的連接子描述於文獻中(參見例如Ramakrishnan, S.等人, Cancer Res. 44:201-208 (1984)，其描述MBS (M-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯)之用途)。在一些實施例中，本文所用的非肽連接子包括：(i) EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽；(ii) SMPT (4-丁二醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem.Co.，目錄號(21558G)；(iii) SPDP (丁二醯亞胺基-6[3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，目錄號21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP (磺基丁二醯亞胺基6[3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(Pierce Chem. Co.，目錄號2165-G)；及(v)與EDC結合的磺基-NHS (N-羥基磺基-丁二醯亞胺：Pierce Chem. Co.，目錄號24510)。
上述連接子含有具有不同屬性的組分，從而產生具有不同物理化學特性的抗GPC3-Fc融合蛋白。舉例而言，烷基羧酸酯之磺基-NHS酯的穩定性大於芳族羧酸酯之磺基-NHS酯。含有NHS酯之連接子溶解性低於磺基-NHS酯。另外，連接子SMPT含有位阻二硫鍵，且可以形成穩定性增強的融合蛋白。二硫鍵的穩定性一般小於其他鍵聯，原因是二硫鍵在活體外裂解，使得融合蛋白可用性較差。特定言之，磺基-NHS可增強碳化二亞胺偶合之穩定性。碳化二亞胺偶合(諸如EDC)當結合磺基-NHS使用時，形成的酯對水解之抗性大於單獨的碳化二亞胺偶合反應。肽連接子
本文所述之任一種或全部連接子可為肽連接子。肽連接子可以具有天然存在之序列或非天然存在之序列。舉例而言，來源於抗體單獨重鏈之鉸鏈區的序列可以用作連接子。參見例如WO1996/34103。在一些實施例中，肽連接子包含胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 478)，一種發現於原生IgG1鉸鏈區中的序列。
肽連接子可具有任何適合的長度。在一些實施例中，肽連接子具有至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或超過100個胺基酸(aa)長度中之任一者。在一些實施例中，肽連接子具有不超過約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或少於5個胺基酸長度中之任一者。在一些實施例中，肽連接子長度為約1 aa至約10 aa、約1 aa至約20 aa、約1 aa至約30 aa、約5 aa至約15 aa、約10 aa至約25 aa、約5 aa至約30 aa、約10 aa至約30 aa、約30 aa至約50 aa、約50 aa至約100 aa或約1 aa至約100 aa中之任一者。
此類肽連接子之必需技術特徵為該肽連接子不包含任何聚合活性。肽連接子之特徵(包含二級結構之促進作用的缺乏)在此項技術中已知且描述於例如Dall'Acqua等人(Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle等人(Mol Immunol (1992) 29, 21-30)以及Raag及Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)。在「肽連接子」之情形下，尤佳胺基酸為Gly。此外，較佳為亦不促成任何二級結構的肽連接子。分子彼此間的連接可以藉由例如基因工程來實現。用於製備經融合及可操作地連接之抗體構築體且在哺乳動物細胞或細菌中表現其的方法在此項技術中熟知(例如WO 99/54440, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989及1994或Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001)。
在一些實施例中，肽連接子為穩定連接子，其不可藉由蛋白酶(諸如藉由基質金屬蛋白酶(MMP))裂解。
在一些實施例中，肽連接子不容易呈現剛性三維結構，而是使多肽(例如第一及/或第二組分)具有柔性，諸如使抗GPC3抗體部分與Fc片段之間具有柔性。在一些實施例中，肽連接子為柔性連接子。例示性柔性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n (SEQ ID NO: 469)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 470)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)及(GGGS)n (SEQ ID NO: 472)，其中n為至少一之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物，及此項技術中已知的其他柔性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物相對而言非結構化，且因此能夠充當各組分之間之中性繫鏈。甘胺酸甚至比丙胺酸更顯著地近接φ-ψ空間，且所受限制比具有較長側鏈之殘基少得多(參見Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992))。一般熟習此項技術者將認識到，抗GPC3-Fc融合蛋白之設計可以包括完全或部分具有柔性的連接子，使得連接子可以包括柔性連接子部分以及賦予結構較少柔性以提供所需融合蛋白結構的一或多個部分。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與Fc片段藉由連接子連接在一起，該連接子的長度足以使抗GPC3-Fc融合蛋白能夠依允許結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)以及FcR的方式摺疊。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA (SEQ ID NO: 473)。在一些實施例中，連接子為或包含(GGGGS)n 序列(SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD (SEQ ID NO: 490)。
天然連接子的二級結構呈現各種構形，諸如螺旋形、β股、捲曲螺旋/彎曲及轉彎，以發揮其功能。α-螺旋結構中之連接子可以充當有效分隔蛋白域的剛性間隔子，從而減少其不利相互作用。具有富含Pro序列的非螺旋形連接子可以增強連接子剛性且發揮減少域間干擾的作用。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分(專一性辨識例如nGPC3及/或sGPC3)及Fc片段(或包含Fc片段的抗體)藉由α-螺旋形連接子與胺基酸序列A(EAAAK)4 A (SEQ ID NO: 475)連接在一起。抗 GPC3-Fc 融合蛋白 序列
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)為包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白，該抗體部分視情況經由連接子(諸如肽連接子)與Fc片段(諸如IgG1 Fc片段)融合。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分(靶向例如nGPC3及/或sGPC3)為Fab、Fab'、Fc或scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為全長抗體。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有單專一性。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為單價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)為多價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有多專一性。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 478)。
因此，舉例而言，在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如，抗GPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) Fc片段。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)與本文所述之抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗GPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗GPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) Fc片段。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與Fc片段經由連接子(諸如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 478)。在一些實施例中，Fc片段包含IgG1 Fc序列。在一些實施例中，Fc片段包含人類IgG1 Fc序列。在一些實施例中，Fc片段包含小鼠IgG1 Fc序列。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為全長抗體。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有單專一性。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為單價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)為多價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有多專一性。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)抗nGPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)抗nGPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)抗nGPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)抗nGPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的HC-CDR；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的LC-CDR；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含a)抗nGPC3抗體部分，該抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的nGPC3抗原決定基；以及b) Fc片段。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與Fc片段經由連接子(諸如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 478)。在一些實施例中，Fc片段包含IgG1 Fc序列。在一些實施例中，Fc片段包含人類IgG1 Fc序列。在一些實施例中，Fc片段包含小鼠IgG1 Fc序列。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為全長抗體。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有單專一性。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為單價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)為多價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有多專一性。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
在一些實施例中，包含抗nGPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)與第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如第二全長抗GPC3抗體)競爭結合至與細胞表面結合之GPC3，該第二抗GPC3-Fc融合蛋白包含根據本文所述之任一種抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)的抗nGPC3抗體部分。在一些實施例中，包含抗nGPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)與包含抗nGPC3抗體部分的第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如第二全長抗GPC3抗體)結合至相同或基本上相同的抗原決定基。在一些實施例中，包含抗nGPC3抗體部分之抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)結合至與細胞表面結合之GPC3將包含抗nGPC3抗體部分之第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)對與細胞表面結合之相同GPC3的結合抑制至少約70% (諸如至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中之任一者)，或反之亦然。在一些實施例中，包含抗nGPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)與包含抗nGPC3抗體部分的第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如第二全長抗GPC3抗體)交叉競爭結合至與細胞表面結合之GPC3，亦即，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)中之每一者與另一者競爭結合至與細胞表面結合之GPC3。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者之VH 的HC-CDR；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者之VL 的LC-CDR；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含a)抗GPC3抗體部分，該抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基；及b) Fc片段。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M(諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與Fc片段經由連接子(諸如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 478)。在一些實施例中，Fc片段包含IgG1 Fc序列。在一些實施例中，Fc片段包含人類IgG1 Fc序列。在一些實施例中，Fc片段包含小鼠IgG1 Fc序列。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為全長抗體。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有單專一性。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白為單價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)為多價的。在一些實施例中，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)具有多專一性。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
在一些實施例中，包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)與第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如第二全長抗GPC3抗體)競爭結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)，該第二抗GPC3-Fc融合蛋白包含根據本文所述之任一種抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)與包含抗GPC3抗體部分的第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如第二全長抗GPC3抗體)結合至相同或基本上相同的抗原決定基。在一些實施例中，包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)將包含抗GPC3抗體部分的第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)對標靶GPC3的結合抑制至少約70% (諸如至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中之任一者)，或反之亦然。在一些實施例中，包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)與包含抗GPC3抗體部分的第二抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如第二全長抗GPC3抗體)交叉競爭結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)，亦即，抗GPC3-Fc融合蛋白(諸如全長抗GPC3抗體)中之每一者與另一者競爭結合至標靶GPC3。
在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如，抗GPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) Fc片段。在一些實施例中，Fc片段包含IgG1 Fc序列(例如人類或小鼠IgG1 Fc序列)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗GPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3-Fc融合蛋白，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗GPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗GPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) Fc片段。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為非天然存在的。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為單株抗體。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體具有單專一性。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體具有多專一性(例如雙專一性)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 507的小鼠IgG1重鏈恆定域(CH )。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 508的小鼠λ輕鏈恆定域(CL )。舉例而言，在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 505的重鏈，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 506的輕鏈。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體之重鏈及/或輕鏈視情況包含N末端信號肽。在一些實施例中，信號肽包含SEQ ID NO: 509之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL 。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分；及Fc片段。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：抗nGPC3抗體部分，該抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的nGPC3抗原決定基；及Fc片段。在一些實施例中，Fc片段包含IgG1 Fc序列(例如人類或小鼠IgG1 Fc序列)。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為非天然存在的。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為單株抗體。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體具有單專一性。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體具有多專一性(例如雙專一性)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 507的小鼠IgG1重鏈恆定域(CH )。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 508的小鼠λ輕鏈恆定域(CL )。舉例而言，在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 505的重鏈，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 506的輕鏈。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體之重鏈及/或輕鏈視情況包含N末端信號肽。在一些實施例中，信號肽包含SEQ ID NO: 509之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；以及b) Fc片段。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL 。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；及Fc片段。在一些實施例中，提供一種全長抗GPC3抗體(諸如分離之全長抗GPC3抗體)，其包含：抗GPC3抗體部分，該抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基；及Fc片段。在一些實施例中，Fc片段包含IgG1 Fc序列(例如人類或小鼠IgG1 Fc序列)。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體為單株抗體。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體具有單專一性。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體具有多專一性(例如雙專一性)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 507的小鼠IgG1重鏈恆定域(CH )。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 508的小鼠λ輕鏈恆定域(CL )。在一些實施例中，全長抗GPC3抗體之重鏈及/或輕鏈視情況包含N末端信號肽。在一些實施例中，信號肽包含SEQ ID NO: 509之胺基酸序列。多專一性抗 GPC3 分子
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)包含多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，該抗GPC3分子包含根據本文所述之任一種抗GPC3抗體部分的抗GPC3抗體部分及專一性辨識第二抗原的第二結合部分(諸如第二抗體部分)。在一些實施例中，多專一性抗GPC3分子包含抗GPC3抗體部分及專一性辨識第二抗原的第二抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。
多專一性分子為對至少兩種不同抗原或抗原決定基具有結合專一性的分子(例如雙專一性抗體對兩種抗原或抗原決定基具有結合專一性)。亦涵蓋具有超過兩個價和/或專一性之多專一性分子。舉例而言，可以製備三專一性抗體(Tutt等人,J. Immunol. 147: 60 (1991))。應瞭解，熟習此項技術者可以選擇本文所述之個別多專一性分子的適當特徵以彼此組合而形成本發明之多專一性抗GPC3分子。
因此，舉例而言，在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分(例如scFv)及b)專一性辨識第二抗原的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，第二結合部分係專一性辨識與抗GPC3抗體部分相同的GPC3形式(例如nGPC3及/或sGPC3)。在一些實施例中，相較於抗GPC3抗體部分，第二結合部分係專一性辨識不同GPC3抗原決定基。在一些實施例中，相較於抗GPC3抗體部分，第二結合部分係專一性辨識GPC3之不同形式。舉例而言，在一些實施例中，第二結合部分係專一性辨識sGPC3 (或sGPC3與nGPC3)，而抗GPC3抗體部分係專一性辨識nGPC3 (不結合至或極少結合至sGPC3)。在一些實施例中，第二結合部分係專一性辨識不為GPC3的第二抗原。在一些實施例中，第二結合部分係專一性辨識細胞(諸如細胞毒性細胞)表面上的第二抗原。在一些實施例中，第二結合部分係專一性結合至淋巴球(諸如T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞)表面上的抗原。在一些實施例中，第二結合部分係專一性結合至效應子T細胞，諸如細胞毒性T細胞(亦稱為細胞毒性T淋巴球(CTL)或T殺手細胞)或自然殺手T (NKT)細胞。在一些實施例中，第二結合部分係專一性結合至效應細胞表面上的第二抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD27、CD28、CD16a、CD40L、CD56、CD68、CD137、OX40、GITR、HVEM及GDS2D。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，第二結合部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，多專一性抗GPC3分子進一步包含至少一種(諸如至少約2、3、4、5或大於5中之任一者)其他抗體部分。
在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)，及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如scFv；例如抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如scFv；例如抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為scFv。在一些實施例中，第一與第二抗體部分藉由連接子(例如SEQ ID NO: 474)連接。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分位於第二抗體部分之N末端。在一些實施例中，效應細胞為T細胞(例如細胞毒性T細胞、輔助T細胞或自然殺手T細胞)、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或嗜中性球。在一些實施例中，第二抗原為CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L或HVEM。
在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)上的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上之CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的LC-CDR；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，其中抗nGPC3抗體部分與根據本文所述之任一種抗nGPC3抗體部分的第二抗nGPC3抗體部分競爭結合至與細胞表面結合之GPC3；及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如scFv)；及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上之CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為scFv。在一些實施例中，第一與第二抗體部分藉由連接子(例如SEQ ID NO: 474)連接。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分位於第二抗體部分之N末端。在一些實施例中，效應細胞為T細胞(例如細胞毒性T細胞、輔助T細胞或自然殺手T細胞)、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或嗜中性球。在一些實施例中，第二抗原為CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L或HVEM。
在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上之CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者之VL 的LC-CDR；以及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識GPC3的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，其中抗nGPC3抗體部分與根據本文所述之任一種抗GPC3抗體部分的第二抗GPC3抗體部分競爭結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)；及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的抗GPC3抗體部分(例如scFv)；及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二結合部分(諸如第二抗體部分，例如scFv)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如gGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，第一及/或第二抗體部分為scFv。在一些實施例中，第一與第二抗體部分藉由連接子(例如SEQ ID NO: 474)連接。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分位於第二抗體部分之N末端。在一些實施例中，效應細胞為T細胞(例如細胞毒性T細胞、輔助T細胞或自然殺手T細胞)、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或嗜中性球。在一些實施例中，第二抗原為CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L或HVEM。
在一些實施例中，多專一性抗GPC3分子為例如雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、串聯scDb (Tandab)、線性二聚scDb (LD-scDb)、圓形二聚scDb (CD-scDb)、雙重雙功能抗體、串聯scFv、串聯雙scFv (例如雙專一性T細胞接合體)、串聯三scFv、三功能抗體、雙專一性Fab2、雙微型抗體、四功能抗體、scFv-Fc-scFv融合體、雙親和力再靶向(DART)抗體、雙可變域(DVD)抗體、IgG-scFab、scFab-ds-scFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合體、對接及鎖定(DNL)抗體、臼包杵(KiH)抗體(藉由KiH技術製備之雙專一性IgG)、DuoBody (藉由Duobody技術製備之雙專一性IgG)、雜多聚體抗體或雜結合抗體。在一些實施例中，多專一性抗GPC3分子為串聯scFv (例如串聯雙scFv，如雙專一性T細胞接合體)。
第二抗原
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)包含多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，該抗GPC3分子包含抗GPC3抗體部分(諸如抗nGPC3抗體部分)及專一性辨識第二抗原的第二抗體部分(例如scFv)。在一些實施例中，第二抗原亦為GPC3，但包含與抗GPC3抗體部分所辨識不同的抗原決定基。在一些實施例中，第二抗原不為GPC3。在一些實施例中，第二抗原為腫瘤抗原。在一些實施例中，第二抗原為細胞表面分子。在一些實施例中，第二抗原為效應細胞上之細胞表面分子。
可被本文所述之第二抗體部分辨識的例示性腫瘤抗原包括(但不限於)α胎蛋白(AFP)、CA15-3、CA27-29、CA19-9、CA-125、鈣視網膜蛋白(calretinin)、癌胚抗原、CD34、CD99、CD117、染色顆粒素(chromogranin)、細胞角蛋白、肌間線蛋白、上皮細胞膜蛋白(EMA)、因子VIII、CD31 FL1、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)、粗大囊腫病體液蛋白質(GCDFP-15)、HMB-45、人類絨毛膜激性腺素(hGG)抑制素、角蛋白、CD45 (淋巴球標記物)、MART-1 (Melan-A)、Myo Dl、肌肉專一性肌動蛋白(MSA)、神經纖毛、神經元專一性烯醇酶(NSE)、胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)、前列腺專一性抗原、S100蛋白質、平滑肌肌動蛋白(SMA)、突觸素、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉錄因子-1、腫瘤M2-PK及波形蛋白。
在一些實施例中，本文所述之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子可以經工程改造以藉由將效應細胞(諸如細胞毒性T細胞)導引(或募集)至腫瘤位點而促進腫瘤細胞殺死(例如細胞毒性溶解或噬菌作用)。在一些實施例中，腫瘤細胞毒性可以利用LDH細胞毒性分析加以測試。在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子可以有效地將效應細胞(例如T細胞、NK細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)導引至免疫抑制環境(諸如免疫抑制腫瘤環境)中的靶細胞。
例示性效應細胞包括(不限於) T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、單核球、嗜中性球、自然殺手T (NKT)細胞、抗體依賴性細胞毒性細胞、嵌合抗原受體(CAR)效應細胞(例如CAR-T)、嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體(caTCR)效應細胞(參見下文caTCR章節)或其類似物。在一些實施例中，效應細胞為T細胞(例如細胞毒性T細胞、輔助T細胞或NKT細胞)。在一些實施例中，效應細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，效應細胞係同種異體的。在一些實施例中，效應細胞係自體的。
本發明之細胞表面分子為特定細胞類型或有限數目之細胞類型之外部細胞壁或質膜上所發現的分子。細胞表面分子之實例包括(但不限於)膜蛋白質，諸如受體、轉運蛋白、離子通道、質子泵及G蛋白偶聯受體；細胞外基質分子，諸如黏附分子(例如整合素、鈣黏素、選擇素或NCAMS)；參見例如美國專利第7,556,928號，其以全文引用之方式併入本文中。效應細胞上的細胞表面分子包括(但不限於) CD3 (例如CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)、CD4、CD5、CD7、CD8、CD13、CD14、CD16、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD31、CD38、CD40L (TNFSF5或CD154)、CD56、CD64、CD68、CD89、CD94、CD137 (TNFRSF9或4-1BB)、CD278、NKp46、NKp30、NKG2D、MAC-l/MAC-3、IL-2Ra、OX40 (TNFRSF4或CD134)、GITR、HVEM (TNFRSF14或CD270)、Ly49或恆定TCR。
熟習此項技術者將認識到免疫細胞具有不同細胞表面分子。舉例而言，CD3為T細胞上之細胞表面分子，而CD16、NKG2D或NKp30為NK細胞上之細胞表面分子，且CD3或恆定TCR為NKT細胞上之細胞表面分子。在一些實施例中，例如在效應細胞為T細胞的情況下，活化分子為CD3 (例如CD3γ、CD3δ或CD3ε)、CD27、CD28、CD40、CD134、CD137及CD278中之一或多者。在一些實施例中，例如在效應細胞為NK細胞的情況下，細胞表面分子為CD16、NKG2D或NKp30；或在效應細胞為NKT細胞的情況下，細胞表面分子為CD3或恆定TCR。
在一些實施例中，第二抗體部分係專一性結合至CD3。CD3為由T細胞表現的抗原且包含三條不同多肽鏈(ε、δ及γ鏈)。三條CD3多肽鏈與T細胞受體(TCR)及ζ鏈結合而形成TCR複合物，該TCR複合物具有活化T細胞中之信號傳導級聯之功能。當前，許多治療策略靶向TCR信號轉導以使用抗人類CD3單株抗體治療疾病。熟習此項技術者應認識到，TCR複合物為具有可變TCR α及β鏈與三個二聚合信號傳導模組CD3δ/ε、CD3γ/ε及CD3ζ/ζ或ζ/η之八聚體複合物。雖然在一些實施例中，本文所述之第二抗體部分(諸如scFv)結合至CD3ε，但本發明亦涵蓋靶向其他CD3分子，特定言之，CD3ζ，或TCR α及β鏈。
在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，及b)專一性結合至CD3的第二抗體部分(例如scFv)。在一些實施例中，第二抗體部分係專一性結合至CD3ε。在一些實施例中，第二抗體部分係專一性結合至CD3ε之促效抗原決定基。如本文所用，術語「促效抗原決定基」意謂(a)在多專一性分子結合後，視情況在若干個多專一性分子在相同細胞上結合後，允許所述多專一性分子活化TCR信號傳導且誘導T細胞活化的抗原決定基，及/或(b)僅由CD3之ε鏈之胺基酸殘基組成且當在其天然背景下在T細胞上呈遞(亦即被TCR、CD3γ鏈等包圍)時可近接以供多專一性分子結合的抗原決定基，及/或(c)在多專一性分子結合後，不引起CD3ε之空間位置相對於CD3γ穩定化的抗原決定基。
在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，及b)專一性結合至效應細胞表面上之抗原(包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68及GDS2D)的第二抗體部分(例如scFv)。
在一些實施例中，提供一種多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含a)專一性辨識標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，及b)專一性結合至補體系統之組分(諸如C1q)的第二抗體部分(例如scFv)。C1q為活化血清補體系統之C1酶複合物之亞單元。
在一些實施例中，第二抗體部分係專一性結合至Fc受體。在一些實施例中，第二抗體部分係專一性結合至Fcγ受體(FcγR)。FcγR可為存在於NK細胞表面上之FcγRIII或存在於巨噬細胞、單核球、嗜中性球及/或樹突狀細胞表面上之FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIBI、FcγRIIB2及FcγRIIIB之一。在一些實施例中，第二抗體部分為Fc區或其功能片段。如本中所用之「功能片段」係指抗體Fc區之片段，該片斷仍能夠以足夠的專一性及親和力結合至FcR，特定言之，FcγR之，以允許攜有FcγR之效應細胞(特定言之，巨噬細胞、單核球、嗜中性球及/或樹突狀細胞)藉由細胞毒性溶解或吞噬作用殺死靶細胞。功能Fc片段能夠競爭性地抑制原始全長Fc部分結合至FcR，諸如活化FcγRI。在一些實施例中，功能Fc片段保持其對活化FcγR之親和力的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一些實施例中，Fc區或其功能片段為增強型Fc區或其功能片段。如本文所用，術語「增強型Fc區」係指一種Fc區，其經修飾以增強Fc受體介導之效應功能，特定言之，抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體介導之吞噬作用。此可如此項技術中所知來達成，例如藉由以引起活化受體(例如NK細胞上所表現之FcγRIIIA (CD16A))之親和力增強及/或與抑制受體(例如FcγRIIB1/B2 (CD32B))之結合減少的方式改變Fc區。在又其他實施例中，第二抗體部分為一種抗體或其抗原結合片段，其以足夠專一性及親和力專一性結合至FcR，特定言之，FcγR，從而允許攜有FcγR的效應細胞(特定言之，巨噬細胞、單核球、嗜中性球及/或樹突狀細胞)藉由細胞毒性溶解或吞噬作用殺死靶細胞。
在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子允許殺死GPC3+細胞(諸如HCC細胞)且/或可以有效地再導引CTL溶解靶細胞表面上表現GPC3之細胞。在一些實施例中，本發明之多專一性抗GPC3分子展示10至500 ng/ml範圍內的活體外EC50 ，且能夠以約1:1至約50:1 (諸如約1:1至約15:1，或約2:1至約10:1)的CTL與靶細胞比率、經由CTL誘導約50%靶細胞再定向溶解。
在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子能夠以使得靶細胞溶解的方式與經刺激或未刺激的CTL及靶細胞(諸如GPC3+ 細胞，例如HCC細胞)發生交聯。由此得到的優勢在於，多專一性抗GPC3分子無需產生標靶專一性T細胞純系或由樹突狀細胞呈遞共同抗原便可發揮其所需活性。在一些實施例中，本發明之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子能夠在缺乏其他活化信號的情況下再導引CTL溶解靶細胞(諸如GPC3+ 細胞，例如HCC細胞)。在一些實施例中，多專一性抗GPC3分子之第二抗體部分係專一性結合至CD3 (例如專一性結合至CD3ε)，且再導引CTL溶解靶細胞無需經由CD28及/或IL-2發生信號傳導。
用於量測多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子同時結合至兩種抗原(例如兩種不同細胞上之抗原)之偏好的方法屬於熟習此項技術者之正常能力範圍內。舉例而言，當第二結合部分(例如第二抗體部分)專一性結合至CD3時，可以使多專一性抗GPC3分子與CD3+ /GPC3- 細胞及CD3- /GPC3+ 細胞之混合物接觸。接著可藉由此項技術中已知之顯微術或螢光活化細胞分選(FACS)評估多專一性抗GPC3分子陽性單細胞的數目及與多專一性抗GPC3分子交聯之細胞的數目。
在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子包含a)專一性辨識標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分(例如scFv)，及b)專一性結合至T細胞上之CD3ε的第二抗體部分(例如scFv)(下文中稱為「抗CD3抗體部分」)。在一些實施例中，抗CD3抗體部分(例如scFv)包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 479的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 480的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 481的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 482的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 483的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 484的LC-CDR3。在一些實施例中，抗CD3抗體部分(例如scFv)包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3抗體部分(例如scFv)包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含SEQ ID NO: 487之胺基酸序列。連接子
在一些實施例中，專一性辨識標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分(例如scFv)與專一性辨識第二抗原(例如T細胞上的CD3)的第二抗體部分(例如scFv)藉由連接子(諸如肽連接子)連接。關於可以用於本文所述之多專一性抗GPC3分子中的所有適用連接子，參見「抗GPC3 Fc融合蛋白」章節下的「連接子」小節。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA (SEQ ID NO: 473)。在一些實施例中，連接子為或包含(GGGGS)n 序列(SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD (SEQ ID NO: 490)。串聯 scFv
在一些實施例中，多專一性抗GPC3分子為串聯scFv，其包含含有專一性辨識GPC3之抗GPC3抗體部分的第一scFv (在本文中稱為「抗GPC3 scFv」；辨識nGPC3及/或sGPC3)及專一性辨識第二抗原之第二scFv (在本文中亦稱為「串聯scFv多專一性抗GPC3抗體」)。在一些實施例中，串聯scFv多專一性抗GPC3抗體進一步包含至少一種(諸如至少約2、3、4、5或大於5中的任一者)的其他scFv。
在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3的第一scFv，及b)專一性辨識第二抗原(例如T細胞上之CD3)的第二scFv，其中串聯scFv多專一性抗GPC3抗體為串聯雙scFv或串聯三scFv。在一些實施例中，串聯scFv多專一性抗GPC3抗體為串聯雙scFv。在一些實施例中，串聯scFv多專一性抗GPC3抗體為雙專一性T細胞接合體。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗sGPC3 scFv對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至不同的GPC3抗原決定基。在一些實施例中，第二scFv專一性辨識不為GPC3的第二抗原。在一些實施例中，第二scFv專一性辨識細胞(諸如細胞毒性細胞)表面上的第二抗原。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至淋巴球(諸如T細胞(例如CTL、輔助T細胞或NKT)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞)表面上的抗原。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應子T細胞，諸如CTL或NKT細胞。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應細胞表面上的第二抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD27、CD28、CD16a、CD40L、CD56、CD68、CD137、OX40、GITR、HVEM及GDS2D。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，串聯scFv多專一性抗GPC3抗體進一步包含至少一種(諸如至少約2、3、4、5或大於5中的任一者)的其他scFv。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv與第二scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv位於第二scFv之N末端。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv位於第二scFv之C末端。在一些實施例中，串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體進一步包含標籤(例如用於純化目的之肽標籤)。在一些實施例中，標籤位於串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體之N末端。在一些實施例中，標籤位於串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體之C末端。在一些實施例中，標籤包含胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 476)。
在一些實施例中，串聯scFv多專一性抗GPC3抗體為包含兩種scFvs的串聯雙scFv (在本文中稱為「串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體」)。串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體可以具有以任何構型組裝的VH 及VL ，諸如下文所列的構型(N末端至C末端)，其中X為第二scFv專一性結合的第二抗原，L1、L2及L3為視情況存在之連接子(諸如肽連接子)。關於所有適用的連接子，參見「抗GPC3 Fc融合蛋白」章節下的「連接子」小節。在一些實施例中，連接子(L1、L2或L3)包含胺基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA (SEQ ID NO: 473)。在一些實施例中，連接子(L1、L2或L3)為或包含(GGGGS)n 序列(SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子(L1、L2或L3)包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，連接子(L1、L2或L3)包含胺基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD (SEQ ID NO: 490)。
在一些實施例中，多專一性抗GPC3抗體為具有以下結構之一串聯雙scFv：
VL (GPC3)-L1-VH (GPC3)-L2-VL (X)-L3-VH (X)；
VL (GPC3)-L1-VH (GPC3)-L2-VH (X)-L3-VL (X)；
VH (GPC3)-L1-VL (GPC3)-L2-VL (X)-L3-VH (X)；
VH (GPC3)-L1-VL (GPC3)-L2-VH (X)-L3-VL (X)；
VL (X)-L1-VH (X)-L2-VL (GPC3)-L3-VH (GPC3)；
VL (X)-L1-VH (X)-L2-VH (GPC3)-L3-VL (GPC3)；
VH (X)-L1-VL (X)-L2-VL (GPC3)-L3-VH (GPC3)；
VH (X)-L1-VL (X)-L2-VH (GPC3)-L3-VL (GPC3)；
VL (GPC3)-L1-VH (X)-L2-VL (X)-L3-VH (GPC3)；
VL (GPC3)-L1-VL (X)-L2-VH (X)-L3-VH (GPC3)；
VH (GPC3)-L1-VH (X)-L2-VL (X)-L3-VL (GPC3)；
VH (GPC3)-L1-VL (X)-L2-VH (X)-L3-VL (GPC3)；
VL (X)-L1-VH (GPC3)-L2-VL (GPC3)-L3-VH (X)；
VL (X)-L1-VL (GPC3)-L2-VH (GPC3)-L3-VH (X)；
VH (X)-L1-VH (GPC3)-L2-VL (GPC3)-L3-VL (X)；或
VH (X)-L1-VL (GPC3)-L2-VH (GPC3)-L3-VL (X)。
在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv (例如第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)，及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460 (SEQ ID NO: 466)之胺基酸359-580內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的第一抗nGPC3 scFv(例如，第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上的第二抗原，例如T細胞上的CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的第一抗nGPC3 scFv (例如，第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上的第二抗原，例如T細胞上的CD3)的第二scFv。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv與第二scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv位於第二scFv之N末端。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至淋巴球(諸如T細胞(例如CTL、輔助T細胞或NKT)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞)表面上的抗原。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應子T細胞，諸如CTL或NKT細胞。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應細胞表面上的第二抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD27、CD28、CD16a、CD40L、CD56、CD68、CD137、OX40、GITR、HVEM及GDS2D。
在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b)專一性辨識第二抗原的第二scFv (諸如效應細胞上的第二抗原，例如T細胞上的CD3)。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；以及b)專一性辨識第二抗原的第二scFv(諸如效應細胞上的第二抗原，例如T細胞上的CD3)。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；以及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上的第二抗原，例如T細胞上的CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的LC-CDR；以及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的第一抗nGPC3 scFv；及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的第一抗nGPC3 scFv；及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv與第二scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv位於第二scFv之N末端。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至淋巴球(諸如T細胞(例如CTL、輔助T細胞或NKT)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞)表面上的抗原。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應子T細胞，諸如CTL或NKT細胞。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應細胞表面上的第二抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD27、CD28、CD16a、CD40L、CD56、CD68、CD137、OX40、GITR、HVEM及GDS2D。
在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；以及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；以及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3的第一scFv，該第一scFv包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者之VL 的LC-CDR；以及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3的第一抗GPC3 scFv；及b)專一性辨識第二抗原(諸如效應細胞上之第二抗原，例如T細胞上之CD3)的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯scFv多專一性(例如雙專一性)抗GPC3抗體，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的第一抗GPC3 scFv；及b)專一性辨識第二抗原(例如效應細胞上的第二抗原，例如T細胞上的CD3)的第二scFv。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，第一抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，第一抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，第一抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗GPC3-scFv與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，第一抗GPC3-scFv與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3-scFv與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3-scFv與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv與第二scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv位於第二scFv之N末端。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至淋巴球(諸如T細胞(例如CTL、輔助T細胞或NKT)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞)表面上的抗原。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應子T細胞，諸如CTL或NKT細胞。在一些實施例中，第二scFv專一性結合至效應細胞表面上的第二抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD27、CD28、CD16a、CD40L、CD56、CD68、CD137、OX40、GITR、HVEM及GDS2D。
在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3的第一scFv，及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體為雙專一性T細胞接合體。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗sGPC3 scFv對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv與第二scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv位於第二抗CD3-scFv之N末端。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 479的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 480的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 481的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 482的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 483的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 484的LC-CDR3。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含胺基酸序列SEQ ID NO: 487。
在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv (例如第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)，及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460 (SEQ ID NO: 466)之胺基酸359-580內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的第一抗nGPC3-scFv (例如第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的第一抗nGPC3-scFv (例如，第一抗nGPC3 scFv對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或第一抗nGPC3 scFv以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv與第二scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv位於第二scFv之N末端。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 479的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 480的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 481的HC-CDR3；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 482的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 483的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 484的LC-CDR3。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含胺基酸序列SEQ ID NO: 487。在一些實施例中，串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體進一步包含標籤(例如用於純化目的之肽標籤)。在一些實施例中，標籤位於串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體之N末端。在一些實施例中，標籤位於串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體之C末端。在一些實施例中，標籤包含胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 476)。
在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；以及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；以及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，該抗體包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv，該第一scFv包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的LC-CDR；以及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，該抗體包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的第一抗nGPC3-scFv；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的第一抗nGPC3-scFv；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3-scFv與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3-scFv與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv與第二scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv位於第二scFv之N末端。在一些實施例中，第一抗nGPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3 scFv包含SEQ ID NO: 409-439中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 479的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 480的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 481的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 482之LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 483之LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 484之LC-CDR3。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含SEQ ID NO: 487之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的第一scFv；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv，其中串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體包含SEQ ID NO: 488及511-515中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體進一步包含標籤(例如用於純化目的之肽標籤)。在一些實施例中，標籤位於串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體之N末端。在一些實施例中，標籤位於串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體之C末端。在一些實施例中，標籤包含胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 476)。
在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中任一者之HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中任一者之HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及包含SEQ ID NO: 134-153中任一者之胺基酸序列的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中任一者之LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中任一者之LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中任一者之LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的第一scFv，該第一scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中任一者之HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中任一者之HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中任一者之HC-CDR3，其中胺基酸取代發生於HC-CDR1或HC-CDR2中；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中任一者之LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中任一者之LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中任一者之LC-CDR3；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的第一scFv，該第一scFv包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL ；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之第一scFv，該第一scFv包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的第一抗GPC3-scFv；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的第一抗GPC3-scFv；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，第一抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，第一抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，第一抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，第一抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3-scFv與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3-scFv與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3-scFv與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv與第二抗CD3-scFv藉由連接子(例如肽連接子)連接。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 471)，其中n等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv位於第二scFv之N末端。在一些實施例中，第一抗GPC3 scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第二scFv為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，第一與第二scFvs為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3 scFv包含SEQ ID NO: 440-459中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 479的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 480的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 481的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 482的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 483的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 484的LC-CDR3。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 485的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 486的VL 。在一些實施例中，抗CD3-scFv包含SEQ ID NO: 487之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體，其包含a)專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之第一scFv；及b)專一性辨識T細胞之細胞表面上之CD3ε的第二scFv，其中串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體包含SEQ ID NO: 489所例示的胺基酸序列。在一些實施例中，串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體進一步包含標籤(例如用於純化目的之肽標籤)。在一些實施例中，標籤位於串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體之N末端。在一些實施例中，標籤位於串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體之C末端。在一些實施例中，標籤包含胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 476)。可誘導的表現
在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之表現為可誘導性。在一些實施例中，效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR T細胞)包含編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸序列，該核酸序列可操作地連接至誘導型啟動子，包括本文所述之任何誘導型啟動子(例如參見「核酸」章節)。在一些實施例中，經由效應細胞上之信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)發生信號傳導後，可誘導效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR T細胞)表現多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)。在一些此類實施例中，CAR-T細胞包含編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列，該核酸序列可操作地連接至對經由CAR傳導信號有反應之啟動子或調控元件。在一些此類實施例中，caTCR-T細胞包含編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列，該核酸序列可操作地連接至對經由caTCR傳導信號有反應的啟動子或調控元件。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至活化T細胞(NFAT)源啟動子的核因子。在一些實施例中，源自NFAT之啟動子為源自NFAT之最小啟動子(參見例如Durand, D.等人,Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988)；Clipstone, NA, Crabtree, GR.Nature. 1992 357(6380): 695-7；Chmielewski, M.等人,Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706；及Zhang, L.等人,Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759)。NFAT轉錄因子家族為T細胞活化之重要調節因子。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至IL-2啟動子。
在一些實施例中，提供一種工程化免疫細胞(諸如T細胞)，其在其表面上表現二聚合caTCR及表現或能夠表現根據本文所述之任一種多專一性抗GPC3分子的多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性抗體)，其中工程化免疫細胞包含：a)編碼caTCR之第一caTCR多肽鏈的第一caTCR核酸序列；b)編碼caTCR之第二caTCR多肽鏈的第二caTCR核酸序列；及c)編碼多專一性抗GPC3分子的核酸序列，其中caTCR定位於免疫細胞之表面上且多專一性抗GPC3分子能夠自免疫細胞分泌。在一些實施例中，第一caTCR核酸序列包含於第一載體(諸如病毒載體，例如慢病毒載體)中，第二caTCR核酸序列包含於第二載體(諸如病毒載體，例如慢病毒載體)中，且編碼多專一性抗GPC3分子的核酸序列包含於第三載體(諸如病毒載體，例如慢病毒載體)中。在一些實施例中，第一及第二caTCR核酸序列中之一些或全部以及編碼多專一性抗GPC3分子的核酸序列包含於同一載體(諸如病毒載體，例如慢病毒載體)中。在一些實施例中，第一及第二caTCR核酸序列中之每一者與編碼多專一性抗GPC3分子的核酸序列個別地可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，核酸序列中之一些或全部處於單一啟動子的控制下。在一些實施例中，啟動子中的一些或全部具有相同序列。在一些實施例中，啟動子中的一些或全部具有不同序列。在一些實施例中，啟動子中的一些或全部為可誘導性。在一些實施例中，編碼caTCR之核酸序列處於一或多種組成型啟動子的控制下，諸如EF1-α啟動子(例如包含核酸序列SEQ ID NO: 527的EF1-α啟動子)。在一些實施例中，編碼多專一性抗GPC3分子的核酸序列處於誘導型啟動子的控制下。在一些實施例中，免疫細胞活化後，誘導型啟動子為可誘導性。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，例如包含核酸序列SEQ ID NO: 524或526的源自NFAT之啟動子。在一些實施例中，載體中的一些或全部為病毒載體(諸如慢病毒載體)。在一些實施例中，免疫細胞不表現TCR亞單元，caTCR之TCR-TM來源於該等TCR亞單元。舉例而言，在一些實施例中，免疫細胞為αβ T細胞且所引入caTCR之TCR-TM包含來源於TCR δ及γ鏈之序列，或免疫細胞為γδ T細胞且所引入caTCR之TCR-TM包含來源於TCR α及β鏈之序列。在一些實施例中，免疫細胞經修飾以阻斷或減少其內源TCR亞單元中之一者或兩者的表現。舉例而言，在一些實施例中，免疫細胞為經修飾以阻斷或減少TCR α及/或β鏈表現的αβ T細胞，或者免疫細胞為經修飾以阻斷或減少TCR γ及/或δ鏈表現的γδ T細胞。在一些實施例中，免疫細胞選自由以下組成之群：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺手T細胞及抑制T細胞。在一些實施例中，載體中的一些或全部為整合於免疫細胞之宿主基因組中的病毒載體(諸如慢病毒載體)。在一些實施例中，caTCR專一性辨識AFP/MHC I類複合物(例如AFP158/HLA-A*02:01)。在一些實施例中，caTCR包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 522的第一多肽及胺基酸序列為SEQ ID NO: 523的第二多肽。在一些實施例中，多專一性抗GPC3分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 511。 嵌合抗原受體 (CAR) 及 CAR 效應細胞
抗GPC3構築體在一些實施例中為包含抗GPC3抗體部分的CAR(在本文中亦稱為「抗GPC3 CAR」)。本文所述之抗GPC3抗體部分中之任一者可以用於抗GPC3 CAR中。亦提供一種包含CAR的CAR效應細胞(例如T細胞)，該CAR包含抗GPC3抗體部分(在本文中亦稱為「抗GPC3 CAR效應細胞」，例如「抗GPC3 CAR T細胞」)。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含專一性辨識可溶性GPC3的抗GPC3抗體部分。
抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；及b)細胞內信號傳導域。跨膜域可以存在於胞外域與胞內域之間。
在抗GPC3 CAR之胞外域與跨膜域之間，或在抗GPC3 CAR之胞內域與跨膜域之間，可存在間隔域。間隔域可為用於將多肽鏈中之跨膜域連接至胞外域或胞內域之任何寡肽或多肽。間隔域可包含至多約300個胺基酸，包括例如約10至約100，或約25至約50個胺基酸。
跨膜域可來源於天然來源或合成來源。在來源為天然的情況下，結構域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在本發明中具有特定用途的跨膜區可以來源於T細胞受體、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154之α、β、δ或γ鏈(亦即至少包含其跨膜區)。在一些實施例中，跨膜域可為合成的，在此情況下，其可以主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些實施例中，在合成跨膜域之各端可以發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。在一些實施例中，長度在例如約2與約10 (如約2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一者)個胺基酸之間的短寡肽或多肽連接子可以在抗GPC3 CAR之跨膜域與胞內信號傳導域之間形成鍵聯。在一些實施例中，連接子為甘胺酸-絲胺酸二聯體。
在一些實施例中，使用與抗GPC3 CAR之胞內域之一序列天然結合的跨膜域(例如若抗GPC3 CAR胞內域包含CD28協同刺激序列，則抗GPC3 CAR之跨膜域來源於CD28跨膜域)。在一些實施例中，可以選擇跨膜域或藉由胺基酸取代來修飾跨膜域，以避免此類域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域，從而使得與受體複合物之其他成員之相互作用最小化。
抗GPC3 CAR之胞內信號傳導域負責其中已置入抗GPC3 CAR之免疫細胞之至少一種正常效應功能的活化。T細胞之效應功能可以是例如溶胞活性或輔助活性，包括細胞介素的分泌。因此，術語「胞內信號傳導域」係指轉導效應功能信號且導引細胞執行特定功能之蛋白質部分。儘管通常可以使用整個胞內信號傳導域，但在許多情況下，無需使用整條鏈。就使用胞內信號傳導域之截斷部分而言，此類截斷部分只要轉導效應功能信號即可用於替代完整鏈。術語「胞內信號傳導序列」因此意欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域的任何截斷部分。
用於本發明之抗GPC3 CAR中之胞內信號傳導域實例包括在抗原受體接合之後起始信號轉導方面起協同作用的T細胞受體(TCR)及共受體之細胞質序列，以及此等序列之任何衍生物或變異體，及具有相同功能能力之任何合成序列。
已知經由單獨的TCR產生之信號不足以完全活化T細胞且亦需要次級或協同刺激信號。因此，T細胞活化可稱為由兩種不同類別之胞內信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性初始活化之彼等序列(初始信號傳導序列)，及以抗原非依賴性方式起作用以提供次級或協同刺激信號之彼等序列(協同刺激信號傳導序列)。
初始信號傳導序列以刺激方式或抑制方式調控TCR複合物之初始活化。以刺激方式起作用之初始信號傳導序列可以含有信號傳導基元，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM。在一些實施例中，抗GPC3 CAR構築體包含一或多種ITAM。
在本發明中具有特定用途之含有ITAM之初始信號傳導序列實例包括來源於TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之彼等序列。
在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含來源於CD3ζ之初始信號傳導序列。舉例而言，CAR之胞內信號傳導域可以包含CD3ζ胞內信號傳導序列本身或與適用於本發明之抗GPC3 CAR之情形下之任何其他所需胞內信號傳導序列組合。舉例而言，抗GPC3 CAR之胞內域可以包含CD3ζ胞內信號傳導序列及協同刺激信號傳導序列。協同刺激信號傳導序列可為協同刺激分子之胞內域的一部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、專一性結合CD83之配體，及其類似物。
在一些實施例中，抗GPC3 CAR之胞內信號傳導域包含CD3ζ之胞內信號傳導序列及CD28之胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3 CAR之胞內信號傳導域包含CD3ζ之胞內信號傳導序列及4-1BB之胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3 CAR之胞內信號傳導域包含CD3ζ之胞內信號傳導序列及CD28及4-1BB之胞內信號傳導序列。
因此，例如，在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含：a)包含抗GPC3抗體部分的胞外域，該抗體部分係專一性結合至與細胞表面結合之GPC3 (例如抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含：a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含：a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，胞內信號傳導域能夠活化免疫細胞。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含初始信號傳導序列及協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，初始信號傳導序列包含CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施例中，協同刺激信號傳導序列包含CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，胞內域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含胞外域，該胞外域包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合的本文所述抗GPC3抗體部分，該抗體部分係專一性結合至與細胞表面結合之GPC3(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含：a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含：a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的LC-CDR；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合的胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的本文所述抗GPC3抗體部分。舉例而言，在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含胺基酸序列SEQ ID NO: 491。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，胞內信號傳導域能夠活化免疫細胞。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含初始信號傳導序列及協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，初始信號傳導序列包含CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施例中，協同刺激信號傳導序列包含CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，胞內域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內之抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，胞內信號傳導域能夠活化免疫細胞。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含初始信號傳導序列及協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，初始信號傳導序列包含CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施例中，協同刺激信號傳導序列包含CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，胞內域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，該CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者之VL 的LC-CDR；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內之抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，胞內信號傳導域能夠活化免疫細胞。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含初始信號傳導序列及協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，初始信號傳導序列包含CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施例中，協同刺激信號傳導序列包含CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，胞內域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合的胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的本文所述抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含：a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含：a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合的胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的本文所述抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一種)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的LC-CDR；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合的胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的本文所述抗GPC3抗體部分。舉例而言，在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含胺基酸序列SEQ ID NO: 491。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR，其包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的抗GPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列的胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合的胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的本文所述抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。
本文亦提供表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如淋巴細胞，例如T細胞)。
亦提供一種產生表現抗GPC3 CAR之效應細胞的方法，該方法包含將包含編碼抗GPC3 CAR之核酸的載體引入效應細胞中。在一些實施例中，將載體引入效應細胞中包含藉由載體轉導效應細胞。在一些實施例中，將載體引入效應細胞中包含藉由載體轉染效應細胞。載體轉導或轉染至效應細胞中可使用此項技術中已知之任何方法進行。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 CAR效應細胞(諸如淋巴細胞，例如T細胞)，其包含編碼本文所述之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸序列，該核酸序列可操作地連接至誘導型啟動子。在一些實施例中，經由抗GPC3 CAR傳導信號後，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)在抗GPC3 CAR效應細胞中的表現為可誘導性。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至源自NFAT之啟動子。在一些實施例中，源自NFAT之啟動子為源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至IL-2啟動子。 嵌合抗體 -T 細胞受體 (TCR) 構築體 (caTCR) 及 caTCR 效應細胞
在一些實施例中，抗GPC3構築體為包含抗GPC3抗體部分的嵌合抗體-T細胞受體構築體(caTCR)(在本文中亦稱為「抗GPC3 caTCR」)。例示性caTCRs提供於PCT/US2016/058305中，該文獻以引用之方式併入本文中。抗GPC3 caTCR中可以使用本文所述之任一種抗GPC3抗體部分(靶向例如nGPC3及/或sGPC3)。抗GPC3 caTCR可以專一性結合至GPC3且能夠募集至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)。亦提供一種包含含有抗GPC3抗體部分之caTCR的caTCR效應細胞(例如T細胞)(在本文中亦稱為「抗GPC3 caTCR效應細胞」，例如「抗GPC3 caTCR T細胞」)。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR包含專一性辨識可溶性GPC3的抗GPC3抗體部分。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該模組包含專一性辨識本文所述之GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗體部分；及b)T細胞受體模組(TCRM)，該模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR包含天然存在之TCR域。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR包含至少一個非天然存在的TCR域。抗GPC3 caTCR包含：含有提供抗原專一性之抗GPC3抗體部分的抗原結合模組；及允許CD3募集及信號傳導的TCRM。抗原結合模組不為天然存在之T細胞受體抗原結合部分。在一些實施例中，抗原結合模組連接至TCRM中之多肽鏈之N末端。在一些實施例中，抗原結合模組為抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。TCRM包含來源於一或多種TCR之跨膜域的跨膜模組(TCR-TM)，諸如αβ及/或γδ TCR，且視情況進一步包含TCR之連接肽或其片段及/或一或多種TCR胞內域或其片段中的一者或兩者。在一些實施例中，TCRM包含兩條多肽鏈，各多肽鏈自N末端至C末端包含連接肽、跨膜域及視情況存在之TCR胞內域。在一些實施例中，TCRM包含一或多個非天然存在的TCR域。舉例而言，在一些實施例中，TCRM包含一或兩個非天然存在的TCR跨膜域。非天然存在的TCR域可為天然存在之TCR之相應域，其藉由取代一或多個胺基酸及/或藉由用來自另一TCR之類似域的一部分置換相應域的一部分而經修飾。抗GPC3 caTCR可以包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一及第二多肽鏈一起形成抗原結合模組及TCRM。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈為分開的多肽鏈，且caTCR為多聚體，諸如二聚體。在一些實施例中，第一與第二多肽鏈共價連接，諸如藉由肽鍵或藉由另一種化學鍵(諸如二硫鍵)連接。在一些實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈藉由至少一個二硫鍵連接。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR進一步包含一或多個T細胞協同刺激信號傳導序列。一或多個協同刺激信號傳導序列可以個別地為協同刺激分子之胞內域的全部或一部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、專一性結合CD83的配體，及其類似物。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCR-TM與第一TCR胞內域之間及/或第二TCR-TM與第二TCR胞內域之間。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCRD及/或第二TCRD之C末端。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR缺乏T細胞協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR進一步包含穩定模組，該穩定模組包含第一穩定域及第二穩定域，其中第一與第二穩定域彼此具有使抗GPC3 caTCR穩定的結合親和力。在一些實施例中，穩定模組位於抗原結合模組與TCRM之間。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR進一步包含位於任何兩個caTCR模塊或域之間的間隔模組。在一些實施例中，間隔模組包含連接兩個caTCR模塊或域的一或多個肽連接子。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有VH 及CH 1抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一T細胞受體域(TCRD)；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有VL 及CL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 及CH 1域與第二抗原結合域之VL 及CL 域形成專一性結合至GPC3的抗原結合模組，且其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗原結合模組包含位於CH 1域中之殘基與CL 域中之殘基之間的二硫鍵。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有VH 抗體域之第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一TCRD；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有VL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 域與第二抗原結合域之VL 域形成專一性結合至GPC3的抗原結合模組，其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 495。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 496。
在一些實施例中，本文所述之TCRM包含a)含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一T細胞受體域(TCRD)及b)含有第二TCR-TM的第二TCRD，其中TCRM促進募集至少一種TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，兩種TCR-TM均為天然存在的。在一些實施例中，TCR-TM中之至少一者為非天然存在的。在一些實施例中，兩種TCR-TM為非天然存在的。在一些實施例中，第一TCR-TM來源於T細胞受體(諸如αβ TCR或γδ TCR)之跨膜域之一且第二TCR-TM來源於T細胞受體之另一跨膜域。在一些實施例中，該TCRM相較於包含T細胞受體跨膜域之TCRM，達成增強募集至少一種TCR相關信號傳導分子。TCR相關信號傳導分子的募集可以藉由此項技術中已知之方法測定，諸如針對TCR-CD3複合物表面表現或CD3亞單元與caTCR共免疫沈澱的FACS分析。
在一些實施例中，抗原結合模組包含含有VH 抗體域(諸如本文關於抗GPC3抗體部分所述之任一種VH 抗體域)的第一抗原結合域及含有VL 抗體域(諸如本文關於抗GPC3抗體部分所述之任一種VL 抗體域)的第二抗原結合域。在一些實施例中，VH 抗體域及VL 抗體域CDR來源於相同抗體部分。在一些實施例中，VH 抗體域及VL 抗體域CDR中的一些來源於不同抗體部分。在一些實施例中，VH 抗體域及/或VL 抗體域為人類的、人類化的、嵌合的、半合成的或全合成的。
在一些實施例中，caTCR包含連接至本文所述TCRM的本文所述抗原結合模組，視情況包括穩定模組。舉例而言，在一些實施例中，caTCR包含連接至TCRD中之一者或兩者之N末端的抗原結合模組。在一些實施例中，caTCR包含位於TCRM與抗原結合模組之間的穩定模組。在一些實施例中，caTCR進一步包含位於任何兩個caTCR模塊或域之間的間隔模組。在一些實施例中，間隔模組包含長度在約5至約70個胺基酸之間(諸如約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70中之任一者，包括此等數值之間的任何範圍)的一或多個肽連接子。在一些實施例中，caTCR進一步包含一或多個附屬胞內域。在一些實施例中，一或多個附屬胞內域位於第一及/或第二TCRD之羧基端。在一些實施例中，一或多個附屬胞內域位於第一TCR-TM與第一TCR胞內域之間及/或第二TCR-TM與第二TCR胞內域之間。在一些實施例中，一或多個附屬胞內域個別地包含TCR協同刺激域。在一些實施例中，TCR協同刺激域包含免疫協同刺激分子(諸如CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、專一性結合CD83之配體，及其類似物)之胞內域的全部或一部分。在一些實施例中，TCR協同刺激域包含SEQ ID NO: 51-56中任一者之胺基酸序列的全部或一部分，或其變異體。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) T細胞受體模組，該T細胞受體模組(TCRM)包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有VH 及CH 1抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一T細胞受體域(TCRD)；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有VL 及CL 抗體域之第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 及CH 1域與第二抗原結合域之VL 及CL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組(例如VH 及VL 對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或VH 及VL 以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)，且其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗原結合模組包含位於CH 1域中之殘基與CL 域中之殘基之間的二硫鍵。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有VH 抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一TCRD；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有VL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域中之VH 域及第二抗原結合域中之VL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組(例如，VH 及VL 對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或VH 及VL 以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)，其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為人類的、人類化的、嵌合的或合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD之N末端。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為γ/δ TCR。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為α/β TCR。在一些實施例中，TCR-TM中之至少一者為非天然存在的。在一些實施例中，第一及第二TCR-TM為非天然存在的。在一些實施例中，第一TCR-TM相較於衍生其之跨膜域包含至多5 (諸如1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代且/或第二TCR-TM相較於衍生其之跨膜域包含至多5 (諸如1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代。在一些實施例中，TCRM包含來源於一或多種TCR之跨膜域的跨膜模組(TCR-TM)，諸如αβ及/或γδ TCR，且視情況進一步包含TCR之連接肽或其片段及/或一或多種TCR胞內域或其片段中的一者或兩者。在一些實施例中，TCRM包含兩條多肽鏈，各多肽鏈自胺基末端至羧基末端包含連接肽、跨膜域及視情況存在的TCR胞內域。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR可以包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一及第二多肽鏈一起形成抗原結合模組及TCRM。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈為分開的多肽鏈，且caTCR為多聚體，諸如二聚體。在一些實施例中，第一與第二多肽鏈共價連接，諸如藉由肽鍵或藉由另一種化學鍵(諸如二硫鍵)連接。在一些實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈藉由至少一個二硫鍵連接。在一些實施例中，caTCR進一步包含一或多個T細胞協同刺激信號傳導序列。一或多個協同刺激信號傳導序列可以個別地為協同刺激分子之胞內域的全部或一部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、專一性結合CD83的配體，及其類似物。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCR-TM與第一TCR胞內域之間及/或第二TCR-TM與第二TCR胞內域之間。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCRD及/或第二TCRD之羧基端。在一些實施例中，caTCR缺乏T細胞協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，caTCR進一步包含穩定模組，該穩定模組包含第一穩定域及第二穩定域，其中第一及第二穩定域彼此具有使該caTCR穩定的結合親和力。在一些實施例中，穩定模組位於抗原結合模組與TCRM之間。在一些實施例中，穩定模組包含含有CH 1抗體域或其變異體的第一穩定域及含有CL 抗體域或其變異體的第二穩定域。在一些實施例中，caTCR進一步包含位於任何兩個caTCR模塊或域之間的間隔模組。在一些實施例中，TCRM能夠募集至少一種選自由CD3δε、CD3γε及ζζ組成之群的TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，該TCRM相較於包含天然存在之T細胞受體跨膜域的TCRM，可以更增強募集至少一種TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，TCRM促進caTCR-CD3複合物形成。在一些實施例中，任何兩個caTCR模組或域之間存在間隔子模組。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR為雜多聚體，諸如雜二聚體。舉例而言，在一些實施例中，抗GPC3 caTCR為雜二聚體，其包含含有第一TCRD的第一多肽鏈及含有第二TCRD的第二多肽鏈，其中該抗體部分係連接至第一及/或第二多肽鏈。在一些實施例中，TCRM包含一或多個非天然存在的TCR域。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 495。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 496。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分，及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的第一抗原結合域及CH 1抗體域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一T細胞受體域(TCRD)；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 的第二抗原結合域及CL 抗體域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 及CH 1域與第二抗原結合域之VL 及CL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組，且其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗原結合模組包含位於CH 1域中之殘基與CL 域中之殘基之間的二硫鍵。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者之VH 的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一TCRD；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者之VL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 域與第二抗原結合域之VL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組，其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR包含兩條多肽鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 492及SEQ ID NO: 493。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為人類的、人類化的、嵌合的或合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD之N末端。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為γ/δ TCR。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為α/β TCR。在一些實施例中，TCR-TM中之至少一者為非天然存在的。在一些實施例中，第一及第二TCR-TM為非天然存在的。在一些實施例中，第一TCR-TM相較於衍生其之跨膜域包含至多5 (諸如1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代且/或第二TCR-TM相較於衍生其之跨膜域包含至多5 (諸如1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代。在一些實施例中，TCRM包含來源於一或多種TCR之跨膜域的跨膜模組(TCR-TM)，諸如αβ及/或γδ TCR，且視情況進一步包含TCR之連接肽或其片段及/或一或多種TCR胞內域或其片段中的一者或兩者。在一些實施例中，TCRM包含兩條多肽鏈，各多肽鏈自胺基末端至羧基末端包含連接肽、跨膜域及視情況存在的TCR胞內域。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR可以包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一及第二多肽鏈一起形成抗原結合模組及TCRM。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈為分開的多肽鏈，且caTCR為多聚體，諸如二聚體。在一些實施例中，第一與第二多肽鏈共價連接，諸如藉由肽鍵或藉由另一種化學鍵(諸如二硫鍵)連接。在一些實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈藉由至少一個二硫鍵連接。在一些實施例中，caTCR進一步包含一或多個T細胞協同刺激信號傳導序列。一或多個協同刺激信號傳導序列可以個別地為協同刺激分子之胞內域的全部或一部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、專一性結合CD83的配體，及其類似物。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCR-TM與第一TCR胞內域之間及/或第二TCR-TM與第二TCR胞內域之間。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCRD及/或第二TCRD之羧基端。在一些實施例中，caTCR缺乏T細胞協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，caTCR進一步包含穩定模組，該穩定模組包含第一穩定域及第二穩定域，其中第一及第二穩定域彼此具有使該caTCR穩定的結合親和力。在一些實施例中，穩定模組位於抗原結合模組與TCRM之間。在一些實施例中，穩定模組包含含有CH 1抗體域或其變異體的第一穩定域及含有CL 抗體域或其變異體的第二穩定域。在一些實施例中，caTCR進一步包含位於任何兩個caTCR模塊或域之間的間隔模組。在一些實施例中，TCRM能夠募集至少一種選自由CD3δε、CD3γε及ζζ組成之群的TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，該TCRM相較於包含天然存在之T細胞受體跨膜域的TCRM，可以更增強募集至少一種TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，TCRM促進caTCR-CD3複合物形成。在一些實施例中，任何兩個caTCR模組或域之間存在間隔子模組。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR為雜多聚體，諸如雜二聚體。舉例而言，在一些實施例中，抗GPC3 caTCR為雜二聚體，其包含含有第一TCRD的第一多肽鏈及含有第二TCRD的第二多肽鏈，其中該抗體部分係連接至第一及/或第二多肽鏈。在一些實施例中，TCRM包含一或多個非天然存在的TCR域。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 495。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 496。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之抗體部分，及b) TCRM，該TCRM包含來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域的第一及第二TCR-TM，其中該TCRM能夠募集至少一種TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識GPC3的抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3，及b) TCRM，該TCRM包含來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域的第一及第二TCR-TM，其中該TCRM能夠募集至少一種TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性辨識(例如nGPC3及/或sGPC3)的抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3的抗GPC3抗體部分；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的抗GPC3抗體部分，及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之跨膜域之一之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者之VH 的第一抗原結合域及CH 1抗體域及含有 第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一T細胞受體域(TCRD)；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者之VL 的第二抗原結合域及CL 抗體域及包含第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 及CH 1域與第二抗原結合域之VL 及CL 域形成專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗原結合模組，且其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗原結合模組包含位於CH 1域中之殘基與CL 域中之殘基之間的二硫鍵。在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR，其包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者之VH 抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一TCRD；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者之VL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 域與第二抗原結合域之VL 域形成專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗原結合模組，其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為人類的、人類化的、嵌合的或合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD之N末端。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為γ/δ TCR。在一些實施例中，天然存在之第一TCR為α/β TCR。在一些實施例中，TCR-TM中之至少一者為非天然存在的。在一些實施例中，第一及第二TCR-TM為非天然存在的。在一些實施例中，第一TCR-TM相較於衍生其之跨膜域包含至多5 (諸如1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代且/或第二TCR-TM相較於衍生其之跨膜域包含至多5 (諸如1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代。在一些實施例中，TCRM包含來源於一或多種TCR之跨膜域的跨膜模組(TCR-TM)，諸如αβ及/或γδ TCR，且視情況進一步包含TCR之連接肽或其片段及/或一或多種TCR胞內域或其片段中的一者或兩者。在一些實施例中，TCRM包含兩條多肽鏈，各多肽鏈自胺基末端至羧基末端包含連接肽、跨膜域及視情況存在的TCR胞內域。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR可以包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一及第二多肽鏈一起形成抗原結合模組及TCRM。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈為分開的多肽鏈，且caTCR為多聚體，諸如二聚體。在一些實施例中，第一與第二多肽鏈共價連接，諸如藉由肽鍵或藉由另一種化學鍵(諸如二硫鍵)連接。在一些實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈藉由至少一個二硫鍵連接。在一些實施例中，caTCR進一步包含一或多個T細胞協同刺激信號傳導序列。一或多個協同刺激信號傳導序列可以個別地為協同刺激分子之胞內域的全部或一部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、專一性結合CD83的配體，及其類似物。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCR-TM與第一TCR胞內域之間及/或第二TCR-TM與第二TCR胞內域之間。在一些實施例中，一或多個協同刺激信號傳導序列位於第一TCRD及/或第二TCRD之羧基端。在一些實施例中，caTCR缺乏T細胞協同刺激信號傳導序列。在一些實施例中，caTCR進一步包含穩定模組，該穩定模組包含第一穩定域及第二穩定域，其中第一及第二穩定域彼此具有使該caTCR穩定的結合親和力。在一些實施例中，穩定模組位於抗原結合模組與TCRM之間。在一些實施例中，穩定模組包含含有CH 1抗體域或其變異體的第一穩定域及含有CL 抗體域或其變異體的第二穩定域。在一些實施例中，caTCR進一步包含位於任何兩個caTCR模塊或域之間的間隔模組。在一些實施例中，TCRM能夠募集至少一種選自由CD3δε、CD3γε及ζζ組成之群的TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，該TCRM相較於包含天然存在之T細胞受體跨膜域的TCRM，可以更增強募集至少一種TCR相關信號傳導分子。在一些實施例中，TCRM促進caTCR-CD3複合物形成。在一些實施例中，任何兩個caTCR模組或域之間存在間隔子模組。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR為雜多聚體，諸如雜二聚體。舉例而言，在一些實施例中，抗GPC3 caTCR為雜二聚體，其包含含有第一TCRD的第一多肽鏈及含有第二TCRD的第二多肽鏈，其中該抗體部分係連接至第一及/或第二多肽鏈。在一些實施例中，TCRM包含一或多個非天然存在的TCR域。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 495。在一些實施例中，TCR-TM包含胺基酸序列SEQ ID NO: 496。
本文亦提供表現抗GPC3 caTCR的效應細胞(諸如淋巴細胞，例如T細胞)。
亦提供一種產生表現抗GPC3 caTCR之效應細胞的方法，該方法包含將含有編碼抗GPC3 caTCR之核酸的載體引入效應細胞中。在一些實施例中，將載體引入效應細胞中包含藉由載體轉導效應細胞。在一些實施例中，將載體引入效應細胞中包含藉由載體轉染效應細胞。載體轉導或轉染至效應細胞中可使用此項技術中已知之任何方法進行。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如淋巴細胞，例如T細胞)，其包含可操作地連接至誘導型啟動子之核酸序列，該核酸序列編碼本文所述之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)。在一些實施例中，經由抗GPC3 caTCR傳導信號後，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)在抗GPC3 caTCR效應細胞中的表現為可誘導性。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至源自NFAT之啟動子。在一些實施例中，源自NFAT之啟動子為源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至IL-2啟動子。 協同刺激嵌合受體 (CSR) 構築體
在一些實施例中，抗GPC3構築體為一種協同刺激嵌合受體(CSR)，其專一性結合至GPC3且能夠刺激免疫細胞，其在標靶配體結合後，在該免疫細胞的表面上受到功能表現。CSR包含提供配體結合專一性的配體結合模組、跨膜模組，及允許刺激免疫細胞的協同刺激免疫細胞信號傳導模組。CSR缺乏功能性初始免疫細胞信號傳導序列。在一些實施例中，CSR缺乏任何初始免疫細胞信號傳導序列。在一些實施例中，CSR包含含有配體結合模組、跨膜模組及協同刺激信號傳導模組的單一多肽鏈。在一些實施例中，CSR包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一與第二多肽鏈一起形成配體結合模組、跨膜模組及協同刺激信號傳導模組。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈為分開的多肽鏈，且CSR為多聚體，諸如二聚體。在一些實施例中，第一與第二多肽鏈共價連接，諸如藉由肽鍵或藉由另一種化學鍵(諸如二硫鍵)連接。在一些實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈藉由至少一個二硫鍵連接。在一些實施例中，CSR在caTCR加CSR免疫細胞中的表現為可誘導性。在一些實施例中，經由caTCR傳導信號後，CSR在caTCR加CSR免疫細胞中的表現為可誘導性。
在一些實施例中，提供一種專一性結合至GPC3的CSR，該CSR包含a) scFv，該scFv包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 309的VH域及胺基酸序列為SEQ ID NO: 360的VL域；及b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 530、基本上由該序列組成或由該序列組成的CD28片段。在一些實施例中，scFv包含胺基酸序列SEQ ID NO: 441、主要由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，CSR自胺基末端至羧基末端包含scFv、具有胺基酸序列AAA的肽連接子及CD28片段。在一些實施例中，CSR包含胺基酸序列SEQ ID NO: 530、主要由該序列組成或由該序列組成。
在一些實施例中，提供一種包含核酸的免疫細胞(諸如T細胞)，該核酸編碼caTCR (諸如專一性結合至AFP/MHC I類分子(例如AFP158/HLA-A02)的caTCR)及根據本文所述之任一種CSR的抗GPC3 CSR，其中caTCR及CSR由核酸表現且定位於免疫細胞表面。在一些實施例中，該核酸包含編碼caTCR之第一caTCR多肽鏈的第一caTCR核酸序列、編碼caTCR之第二caTCR多肽鏈的第二caTCR核酸序列，及編碼CSR之CSR多肽鏈的CSR核酸序列。在一些實施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列各自包含於不同載體中。在一些實施例中，核酸序列中的一些或全部包含於同一載體中。載體可選自由例如哺乳動物表現載體及病毒載體(諸如來源於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒之彼等載體)組成之群。在一些實施例中，將一或多種載體整合於免疫細胞之宿主基因組中。在一些實施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列各自處於不同啟動子的控制下。在一些實施例中，啟動子中的一些或全部具有相同序列。在一些實施例中，啟動子中的一些或全部具有不同序列。在一些實施例中，核酸序列中之一些或全部處於單一啟動子的控制下。在一些實施例中，啟動子中的一些或全部為可誘導性。在一些實施例中，免疫細胞選自由以下組成之群：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺手T細胞及抑制T細胞。 免疫結合物
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)包含免疫結合物，該免疫結合物包含連接至效應分子的根據本文所述之任一種抗GPC3抗體部分的抗GPC3抗體部分(在本文中亦稱為「抗GPC3免疫結合物」)。在一些實施例中，效應分子為治療劑，諸如藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽、碳水化合物、脂質或核酸。在一些實施例中，效應分子為癌症治療劑，其具有細胞毒性、細胞抑制性或以其他方式提供一些治療益處。在一些實施例中，根據本發明使用之治療劑可以具有與調節免疫系統及/或增強T細胞介導之細胞毒性有關的生物活性。在一些實施例中，效應分子為標籤，其可以直接或間接地產生可偵測信號。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供包含抗GPC3抗體部分及治療劑之抗GPC3免疫結合物(在本文中亦稱為「抗體-藥物結合物」或「ADC」)。在一些實施例中，治療劑為毒素，該毒素具有細胞毒性、細胞抑制性或以其他方式阻止或降低靶細胞分裂能力。在癌症治療中利用ADC局部遞送細胞毒性劑或細胞抑制劑(亦即藥物)殺死或抑制腫瘤細胞(Syrigos及Epenetos,Anticancer Research 19:605-614 (1999)；Niculescu-Duvaz及Springer,Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172 (1997)；美國專利第4,975,278號)允許藥物部分靶向遞送至靶細胞及在其中發生的胞內積聚，其中此等未結合治療劑的全身性投與可能對正常細胞以及設法排除之靶細胞產生不可接受的毒性程度(Baldwin等人,Lancet (1986年3月15日): 603-605 (1986)；Thorpe, (1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」，於Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等人(編), 第475-506頁)。藉此尋求毒性最小的最大功效。
抗GPC3免疫結合物中使用的治療劑包括例如柔紅黴素(daunomycin)、小紅莓(doxorubicin)、甲胺喋呤(methotrexate)及長春地辛(vindesine)(Rowland等人,Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187 (1986))。抗GPC3免疫結合物中使用的毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如蓖麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人,J.Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000)；Mandler等人,Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002))、類美登素(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996))及卡奇黴素(calicheamicin)(Lode等人,Cancer Res. 58:2928 (1998)；Hinman等人,Cancer Res. 53:3336-3342 (1993))。毒素可以藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制之機制發揮其細胞毒性及細胞抑制效應。一些細胞毒性藥物當與較大抗體或蛋白質受體配體結合時，傾向於為非活性的或弱活性的。
可以使用之酶活性毒素及其片段包括例如白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿假單胞菌)、篦麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物包含抗GPC3抗體部分及一或多種小分子毒素，諸如卡奇黴素、類美登素、海兔毒素、奧瑞他汀、新月毒素及CC1065，及具有毒素活性的此等毒素之衍生物，其亦涵蓋於本文中。
在一些實施例中，提供包含具有胞內活性之治療劑的抗GPC3免疫結合物。在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物被內化且治療劑為阻斷細胞中之蛋白質合成、藉此引起細胞死亡之細胞毒素。在一些實施例中，治療劑為包含具有核糖體不活化活性之多肽的細胞毒素，包括例如白樹素、波甘寧(bouganin)、皂草素(saporin)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、欖香膠素、白喉毒素、侷限麴菌素、綠膿桿菌外毒素A及其變異體。在一些實施例中，當治療劑為包含具有核糖體不活化活性之多肽的細胞毒素時，抗GPC3免疫結合物在結合至靶細胞後必須被內化以使蛋白質對細胞具有細胞毒性。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含用於斷裂DNA的治療劑。在一些實施例中，用於斷裂DNA之治療劑例如選自由以下組成之群：烯二炔(例如卡奇黴素及埃斯培拉黴素(esperamicin))及非烯二炔小分子藥劑(例如博萊黴素(bleomycin)、甲錠丙基-EDTA-Fe (II))。根據本申請案適用的其他癌症治療劑包括(但不限於)道諾黴素、小紅莓、偏端黴素A (distamycin A)、順鉑、絲裂黴素C、海鞘素(ecteinascidins)、倍癌黴素(duocarmycin)/CC-1065，及博萊黴素/派萊黴素(pepleomycin)。
本發明另外涵蓋抗GPC3抗體部分與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如去氧核糖核酸酶DNA酶)之間所形成的抗GPC3免疫結合物。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物包含用於分裂微管蛋白之藥劑。此類藥劑可包括例如根瘤菌素/美登素(rhizoxin/maytansine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、奧瑞他汀海兔毒素10 MMAE (auristatin dolastatin 10 MMAE)及派羅苷A (peloruside A)。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物包含烷基化劑，包括例如Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNU NSC 409962、白消安(Busulfan) NSC 750、羧基鄰苯二甲酸鉑NSC 271674、CBDCA NSC 241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥NSC 3088、氯脲菌素(chlorozotocin) NSC 178248、順鉑NSC 119875、氯乙礬(clomesone) NSC 338947、氰基(N-嗎啉基)小紅莓NSC 357704、塞迪遜(cyclodisone) NSC 348948、衛康醇(dianhydrogalactitol) NSC 132313、氟多潘(fluorodopan) NSC 73754、海普法姆(hepsulfam) NSC 329680、羥胺硫蒽酮(hycanthone) NSC 142982、美法侖(melphalan) NSC 8806、甲基CCNU NSC 95441、絲裂黴素C NSC 26980、米托唑醯胺(米托唑醯胺)NSC 353451、氮芥NSC 762、PCNU NSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪二酮NSC 135758、哌泊溴烷(pipobroman) NSC 25154、泊非羅黴素(porfiromycin) NSC 56410、螺乙內醯脲氮芥(spirohydantoin mustard) NSC 172112、替羅昔隆(teroxirone) NSC 296934、四鉑NSC 363812、噻替派(thio-tepa)NSC 6396、三伸乙基三聚氰胺(triethylenemelamine) NSC 9706、尿嘧啶氮芥NSC 34462及Yoshi-864 NSC 102627。
在一些實施例中，本申請案之抗GPC3免疫結合物中的癌症治療劑部分可以包含抗有絲分裂劑，包括(但不限於)別秋水仙鹼(allocolchicine) NSC 406042、軟海綿素B (Halichondrin B) NSC 609395、秋水仙鹼NSC 757、秋水仙鹼衍生物NSC 33410、海兔毒素10 NSC 376128 (NG-奧瑞他汀衍生物)、美登素NSC 153858、根瘤菌素NSC 332598、紫杉醇NSC 125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫代秋水仙鹼NSC 361792、三苯甲基半胱胺酸NSC 83265、硫酸長春鹼NSC 49842及硫酸長春新鹼NSC 67574。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物包含拓樸異構酶I抑制劑，包括(但不限於)喜樹鹼NSC 94600、喜樹鹼Na鹽NSC 100880、胺基喜樹鹼NSC 603071、喜樹鹼衍生物NSC 95382、喜樹鹼衍生物NSC 107124、喜樹鹼衍生物NSC 643833、喜樹鹼衍生物NSC 629971、喜樹鹼衍生物NSC 295500、喜樹鹼衍生物NSC 249910、喜樹鹼衍生物NSC 606985、喜樹鹼衍生物NSC 374028、喜樹鹼衍生物NSC 176323、喜樹鹼衍生物NSC 295501、喜樹鹼衍生物NSC 606172、喜樹鹼衍生物NSC 606173、喜樹鹼衍生物NSC 610458、喜樹鹼衍生物NSC 618939、喜樹鹼衍生物NSC 610457、喜樹鹼衍生物NSC 610459、喜樹鹼衍生物NSC 606499、喜樹鹼衍生物NSC 610456、喜樹鹼衍生物NSC 364830、喜樹鹼衍生物NSC 606497及嗎啉基阿黴素NSC 354646。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物包含拓樸異構酶II抑制劑，包括(但不限於)小紅莓NSC 123127、胺萘非特(amonafide)NSC 308847、m-AMSA NSC 249992、蒽吡唑衍生物NSC 355644、派拉瑞丁(pyrazoloacridine) NSC 366140、比山群(bisantrene) HCL NSC 337766、道諾黴素NSC 82151、去氧小紅莓NSC 267469、米托蒽醌NSC 301739、美諾立爾(menogaril) NSC 269148、N,N-二苯甲基柔紅黴素NSC 268242、氧雜蒽唑(oxanthrazole) NSC 349174、柔紅黴素苯腙(rubidazone) NSC 164011、VM-26 NSC 122819及VP-16 NSC 141540。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物包含RNA或DNA抗代謝物，包括(但不限於) L-丙氨菌素(L-alanosine) NSC 153353、5-氮雜胞苷NSC 102816、5-氟尿嘧啶NSC 19893、阿西維辛(acivicin) NSC 163501、胺基喋呤衍生物NSC 132483、胺基喋呤衍生物NSC 184692、胺基喋呤衍生物NSC 134033、抗葉酸劑NSC 633713、抗葉酸劑NSC 623017、貝氏(Baker's)可溶抗葉酸劑NSC 139105、二氯烯丙基指甲花醌(dichlorallyl lawsone) NSC 126771、布喹那(brequinar) NSC 368390、替加氟(ftorafur)(前藥) NSC 148958、5,6-二氫-5-氮雜胞苷NSC 264880、甲胺喋呤NSC 740、甲胺喋呤衍生物NSC 174121、N-(膦醯乙醯基)-L-天冬胺酸(PALA) NSC 224131、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin) NSC 143095、曲美沙特(trimetrexate) NSC 352122、3-HP NSC 95678、2'-去氧-5-氟尿苷NSC 27640、5-HP NSC 107392、α-TGDR NSC 71851、甘胺酸阿非迪黴素(aphidicolin glycinate) NSC 303812、阿糖胞苷NSC 63878、5-氮雜-2'-去氧胞苷NSC 127716、β-TGDR NSC 71261、環胞苷NSC 145668、胍唑(guanazole) NSC 1895、羥基脲NSC 32065、肌苷乙醇醛NSC 118994、麥克菌素Il (macbecin Il ) NSC 330500、吡唑并咪唑NSC 51143、硫鳥嘌呤NSC 752及硫代嘌呤NSC 755。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物包含高放射性原子。多種放射性同位素可利用於產生放射性結合的抗體。實例包括211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb及Lu之放射性同位素。
在一些實施例中，抗GPC3抗體部分可以與「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合，以用於腫瘤預靶向，其中將抗體-受體結合物投與患者，隨後使用清除劑將未結合之結合物自循環中移除，且接著投與與細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)結合之「配體」(例如抗生素蛋白)。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物可以包含與前藥活化酶結合的抗GPC3抗體部分。在一些此類實施例中，前藥活化酶使前藥(例如肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉化為活性藥物，諸如抗癌藥物。在一些實施例中，此類抗GPC3免疫結合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法(「ADEPT」)。可以與抗體結合之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶，其適用於將含磷酸酯前藥轉化成游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於將含硫酸酯前藥轉化成游離藥物；胞嘧啶脫胺酶，其適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷菌屬(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)，其適用於將含肽前藥轉化成游離藥物；D-丙胺醯基羧基肽酶，其適用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶，其適用於將糖基化前藥轉化成游離藥物；β-內醯胺酶，其適用於將β-內醯胺衍生化藥物轉化成游離藥物；以及青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其適用於將胺氮分別經苯氧基乙醯基或苯乙醯基衍生化之藥物轉化成游離藥物。在一些實施例中，酶可藉由此項技術中熟知之重組DNA技術與抗體部分共價結合。參見例如Neuberger等人,Nature 312:604-608 (1984)。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物之治療部分可為核酸。可以使用的核酸包括(但不限於)反義RNA、基因或其他聚核苷酸，包括核酸類似物，諸如硫鳥嘌呤及硫代嘌呤。
本申請案另外提供包含抗GPC3免疫結合物，其包含連接至效應分子的抗GPC3抗體部分，其中該效應分子為可以間接或直接地產生可偵測信號的標記。此等抗GPC3免疫結合物可用於研究或診斷應用，諸如活體內癌症偵測。標記較佳能夠直接或間接地產生可偵測信號。舉例而言，標記可為不透射線的或為放射性同位素，諸如3 H、錒-225、砹-211、鉍-212、碳-14、鉻-51、氯-36、鈷-57、鈷-58、銅-67、銪-152、鎵-67、氫-3、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131、銦-111、鐵-59、鉛-212、鎦-177、磷-32、鐳-223、鐳-224、錸-186、錸-188、硒-75、硫-35、鎝-99m、釷-227、釔-90或鋯-89；螢光(螢光團)或化學發光(發色團)化合物，諸如螢光異硫氰酸鹽、若丹明、螢光素、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-F1、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、級聯藍、Cy3、Cy5,6-FAM、HEX、6-JOE、俄勒岡綠(Oregon Green) 488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍、REG、腎造影劑(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明及/或德克薩斯紅(Texas Red)；酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化酶；成像劑；或金屬離子，例如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)、鉺(III)、鑭(III)、金(III)、鉛(II)及/或鉍(III)。在一些實施例中，標記為閃爍照相研究用之放射性原子，例如99 Tc或123 I，或核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)用之自旋標記，如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合劑錯合且與抗體結合，例如用於PET成像(WO 2011/056983)。
在一些實施例中，可間接地偵測抗GPC3免疫結合物。舉例而言，對於抗GPC3免疫結合物具有專一性且含有可偵測標記之二級抗體可以用於偵測抗GPC3免疫結合物。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含：a)專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)效應分子。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內之抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸25-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 463)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內之抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內之抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含：a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b)效應分子。在一些實施例中，GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。在一些實施例中，GPC3表現於癌細胞(諸如肝癌細胞，例如HCC)之表面上。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，效應分子共價連接至抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，效應分子為選自由例如以下組成之群的治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。在一些實施例中，效應分子為癌症治療劑。在一些實施例中，癌症治療劑為化學治療劑。在一些實施例中，癌症治療劑為選自由例如以下組成之群的高放射性原子：211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P及212 Pb。在一些實施例中，效應分子為可以直接或間接地產生可偵測信號的標記。在一些實施例中，標記為選自由例如以下組成之群的放射性同位素：3 H、14 C、32 P、35 S、123 I、125 I及131 I。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；以及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR；以及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分；及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)抗nGPC3抗體部分，該抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的nGPC3抗原決定基；及b)效應分子。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 可為抗nGPC3抗體部分與nGPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分與sGPC3之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，效應分子共價連接至抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，效應分子為選自由例如以下組成之群的治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。在一些實施例中，效應分子為癌症治療劑。在一些實施例中，癌症治療劑為化學治療劑。在一些實施例中，癌症治療劑為選自由例如以下組成之群的高放射性原子：211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P及212 Pb。在一些實施例中，效應分子為可以直接或間接地產生可偵測信號的標記。在一些實施例中，標記為選自由例如以下組成之群的放射性同位素：3 H、14 C、32 P、35 S、123 I、125 I及131 I。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。
在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；以及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；以及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR；以及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；及b)效應分子。在一些實施例中，提供一種抗GPC3免疫結合物，其包含a)抗GPC3抗體部分，該抗體部分與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基；及b)效應分子。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之間結合的Kd 為約10-7 M至約10-13 M (諸如約10-7 M至約10-13 M、約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 可為抗GPC3抗體部分與標靶GPC3之間結合之Kd 的至少約10倍(諸如至少約10、102 、103 、104 、105 、106 或107 倍)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分與非標靶之間結合的Kd 為約10-1 M至約10-6 M (諸如約10-1 M至約10-6 M、約10-1 M至約10-5 M，或約10-2 M至約10-4 M)。在一些實施例中，效應分子共價連接至抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，效應分子為選自由例如以下組成之群的治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。在一些實施例中，效應分子為癌症治療劑。在一些實施例中，癌症治療劑為化學治療劑。在一些實施例中，癌症治療劑為選自由例如以下組成之群的高放射性原子：211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P及212 Pb。在一些實施例中，效應分子為可以直接或間接地產生可偵測信號的標記。在一些實施例中，標記為選自由例如以下組成之群的放射性同位素：3 H、14 C、32 P、35 S、123 I、125 I及131 I。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、人類化的或半合成的。 核酸
亦涵蓋編碼抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)或抗GPC3抗體部分的核酸分子。在一些實施例中，提供編碼全長抗GPC3抗體之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，提供編碼抗GPC3 scFv之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，提供編碼抗GPC3 Fc融合蛋白之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，提供一種核酸(或一組核酸)，其編碼多專一性抗GPC3分子(例如多專一性抗GPC3抗體、雙專一性抗GPC3抗體或雙專一性T細胞接合體抗GPC3抗體)或其多肽部分。在一些實施例中，提供編碼抗GPC3 CAR之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，提供編碼抗GPC3 caTCR之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，提供編碼抗GPC3免疫結合物或其多肽部分之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，編碼本文所述之抗GPC3構築體的核酸(或一組核酸)可以進一步包含編碼肽標籤(諸如蛋白質純化標籤，例如其標籤、HA標籤)的核酸序列。
本文亦涵蓋包含抗GPC3構築體的經分離之宿主細胞、編碼抗GPC3構築體之多肽組分的經分離之核酸，或包含編碼本文所述之抗GPC3構築體之多肽組分之核酸的載體。
本申請案亦包括此等核酸序列之變異體。舉例而言，變異體包括與編碼本申請案之抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)或抗GPC3抗體部分的核酸序列在至少中等嚴格雜交條件下雜交的核苷酸序列。
本發明亦提供其中插有本發明之核酸的載體。
簡單概述言之，抗GPC3構築體(例如抗GPC3 CAR、抗GPC3 caTCR)或其多肽部分表現編碼該抗GPC3構築體或其多肽部分之天然或合成核酸可以如下達成：將核酸插入適當表現載體中，使得核酸可操作地連接至5'及3'調控元件，包括例如啟動子(例如淋巴球專一性啟動子)及3'非轉譯區(UTR)。載體可以適於在真核宿主細胞中複製及整合。典型的選殖及表現載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調控所需核酸序列表現之啟動子。
使用標準基因遞送方案，本發明之核酸亦可用於核酸免疫接種及基因療法。基因遞送方法在此項技術中已知。參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明提供一種基因療法載體。
核酸可以選殖入許多類型的載體中。舉例而言，核酸可以選殖入載體中，包括(但不限於)質體、噬菌質體、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體。備受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。
此外，表現載體可以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術為此項技術中熟知的且描述於例如Sambrook等人(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)及其他病毒學及分子生物學手冊中。適用作載體之病毒包括(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合載體含有在至少一種生物體中起作用的複製起點、啟動子序列、適宜的限制性核酸內切酶位點，及一或多種可選標記物(參見例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已開發出多種基於病毒之系統用於將基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言，逆轉錄病毒提供基因遞送系統之適宜平台。所選基因可以插入載體中且使用此項技術中已知之技術封裝於逆轉錄病毒顆粒中。接著可以分離出重組病毒且活體內或活體外遞送至個體之細胞中。此項技術中已知多種逆轉錄病毒系統。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多種腺病毒載體在此項技術中已知。在一些實施例中，使用慢病毒載體。來源於逆轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為達成長期基因轉移之適合工具，因為其允許轉殖基因長期穩定整合且繁殖於子細胞中。慢病毒載體優於來源於致癌逆轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體的額外優勢在於其可以轉導非增殖細胞，諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之額外優勢。
其他啟動子元件(例如強化子)調控轉錄起始頻率。典型地，此等元件定位於起始位點上游30-110 bp區域中，但是多種啟動子最近已展示含有亦位於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間的間距通常為靈活的，使得當元件相對於彼此倒置或移動時時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始下降之前可以增加至相隔50 bp。
適合啟動子之一個實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅使與其可操作地連接之任何聚核苷酸序列高量表現的強組成型啟動子序列。適合啟動子之另一實例為延長因子-1α (EF-1α)。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括(但不限於)猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明應不限於使用組成型啟動子。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之一部分。誘導型啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列的表現或不需要表現時關閉表現。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
如上文所提及，在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的表現為可誘導性。在一些實施例中，效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR T細胞)包含編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸序列，該核酸序列可操作地連接至誘導型啟動子，包括本文所述之任何誘導型啟動子。在一些實施例中，經由效應細胞上之信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)發生信號傳導後，可誘導效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR T細胞)表現多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至源自NFAT之啟動子。在一些實施例中，源自NFAT之啟動子為源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的核酸序列可操作地連接至IL-2啟動子。
誘導型啟動子
誘導型啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列的表現或不需要表現時關閉表現。用於真核細胞中之例示性誘導型啟動子系統包括(但不限於)激素調控元件(參見例如Mader, S.及White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607)、合成配體調控元件(參見例如Spencer, D. M.等人, 1993) Science 262: 1019-1024)及電離輻射調控元件(參見例如Manome, Y.等人 (1993) Biochemistry 32: 10607-10613；Datta, R.等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014-10153)。用於活體外或活體內哺乳動物系統中之其他例示性誘導型啟動子系統評述於Gingrich等人(1998) Annual Rev. Neurosci 21:377-405中。在一些實施例中，用於表現多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的誘導型啟動子系統為Tet系統。在一些實施例中，用於表現多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的誘導型啟動子系統為來自大腸桿菌的lac抑制系統。在一些實施例中，用於表現多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的誘導型啟動子系統為源自NFAT之啟動子。
用於本發明之例示性誘導型啟動子系統為Tet系統。此類系統係基於Gossen等人(1993)所述之Tet系統。在一個例示性實施例中，所關注的聚核苷酸處於包含一或多個Tet操縱子(TetO)位點之啟動子的控制下。處於非活性狀態時，Tet抑制子(TetR)將結合至TetO位點且抑制自啟動子轉錄。處於活性狀態時，例如在諸如四環素(Tc)、無水四環素、多西環素(doxycycline；Dox)或其活性類似物之誘導劑存在下，誘導劑促使TetR自TetO釋放，從而允許轉錄發生。多西環素為四環素抗生素家族之成員，化學名稱為1-二甲胺基-2,4a,5,7,12-五羥基-11-甲基-4,6-二側氧基-1,4a,11,11a,12,12a-六氫并四苯-3-甲醯胺。
在一個實施例中，TetR的密碼子經最佳化以便表現於哺乳動物細胞中，例如鼠類或人類細胞。由於遺傳密碼之簡併，因此大部分胺基酸由超過一個密碼子編碼，從而允許指定核酸之核苷酸序列存在相當大的變化，而核酸編碼之胺基酸序列無任何改變。然而，許多生物體在密碼子使用方面呈現差異，亦稱為「密碼子偏差」(亦即，特定密碼子之使用偏向於指定胺基酸)。密碼子偏差常常與特定密碼子之tRNA的主要種類之存在相關，此又提高mRNA轉譯效率。因此，可以經由密碼子最佳化來定製來源於特定生物體(例如原核生物)之編碼序列，以改良在不同生物體(例如真核生物)中之表現。
Tet系統之其他特定變化形式包括以下「Tet關」及「Tet開」系統。在Tet關系統中，轉錄在Tc或Dox存在下為不活躍的。在彼系統中，四環素控制的轉活化蛋白(tTA)調控靶核酸在四環素反應性啟動子元件(TRE)之轉錄控制下的表現，該轉活化蛋白係由TetR與來自單純疱疹病毒之VP16的強轉活化域融合而組成。TRE係由TetO序列多聯體與啟動子(通常為來源於人類巨細胞病毒(hCMV)即刻早期啟動子之最小啟動子序列)融合而組成。在不存在Tc或Dox的情況下，tTA結合至TRE且活化靶基因之轉錄。在Tc或Dox存在下，tTA不能結合至TRE，且靶基因之表現仍不活躍。
反之，在Tet開系統中，轉錄在Tc或Dox存在下為活躍的。Tet開系統係基於四環素控制的逆向轉活化劑rtTA。如同tTA，rtTA為包含TetR抑制子及VP16轉活化域的融合蛋白。然而，TetR DNA結合部分中之四個胺基酸變化使rtTA之結合特徵改變，使得其在Dox存在下僅可識別標靶轉殖基因之TRE中之tetO序列。因此，在Tet開系統中，TRE調控之靶基因的轉錄在Dox存在下僅受rtTA刺激。
另一種誘導型啟動子系統為來自大腸桿菌的lac抑制子系統(參見Brown等人, Cell 49:603-612 (1987))。lac抑制子系統藉由調控可操作地連接至包含lac操縱子(lacO)之啟動子之所關注聚核苷酸的轉錄來起作用。lac抑制子(lacR)結合至LacO，從而防止所關注之聚核苷酸轉錄。所關注之聚核苷酸的表現係由適合誘導劑誘導，例如異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)。
用於本發明之另一例示性誘導型啟動子系統為NFAT系統。NFAT轉錄因子家族為T細胞活化之重要調節因子。NFAT反應元件發現於例如IL-2啟動子中(參見例如Durand, D.等人,Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988)；Clipstone, NA, Crabtree, GR.Nature. 1992 357(6380): 695-7；Chmielewski, M.等人,Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706；及Zhang, L.等人,Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759)。
為了評估多肽或其部分之表現，待引入細胞中之表現載體亦可含有可選標記基因或報導基因或兩者，以有利於自設法經由病毒載體轉染或感染之細胞群中鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記物可攜載於單獨的DNA段上且用於共轉染程序。可選標記物與報導基因均可側接適當的調控序列以實現在宿主細胞中的表現。適用的可選標記物包括例如耐抗生素基因，諸如neo及其類似物。
報導基因用於鑑別潛在經轉染的細胞及評估調控序列功能性。一般而言，報導基因為不存在於接受者生物體或組織中或由接受者生物體或組織表現的基因，且該基因編碼表現藉由一些容易偵測之特性(例如酶促活性)顯現之多肽。在DNA已引入接受者細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合的報導基因可以包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tel等人, 2000FEBS Letters 479: 79-82)。適合的表現系統已熟知且可使用已知技術製備或商業購買。一般而言，其中最小5'側接區展示報導基因最高表現量的構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區域可連接至報導基因且用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
在一些實施例中，提供的核酸編碼根據本文所述之任一種抗GPC3 CAR及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的抗GPC3 CAR及/或多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)。在一些實施例中，核酸包含一或多種編碼抗GPC3 CAR之所有多肽鏈的核酸序列。在一些實施例中，核酸包含一或多種編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之所有多肽鏈的核酸序列。在一些實施例中，核酸包含一或多種編碼抗GPC3 CAR及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之所有多肽鏈的核酸序列。在一些實施例中，一或多種核酸序列各自包含於單獨載體中。在一些實施例中，至少一些核酸序列包含於同一載體中。在一些實施例中，所有核酸序列包含於同一載體中。載體可選自由例如哺乳動物表現載體及病毒載體(諸如來源於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒之彼等載體)組成之群。
在一些實施例中，抗GPC3 CAR為包含單一多肽鏈的單體(例如抗GPC3 scFv-CAR)且多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子為包含單一一條多專一性(例如雙專一性)抗GPC3多肽鏈(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的單體，且核酸包含編碼抗GPC3 CAR多肽鏈的第一核酸序列及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3多肽鏈的第二核酸序列。在一些實施例中，第一核酸序列包含於第一載體中，且第二核酸序列包含於第二載體中。在一些實施例中，第一及第二核酸序列包含於同一載體中。在一些實施例中，第一核酸序列處於第一啟動子控制下且第二核酸序列處於第二啟動子控制下。在一些實施例中，第一與第二啟動子中的一個或兩個具有相同序列。在一些實施例中，第一及第二啟動子中的一個或兩個具有不同序列。在一些實施例中，第一及第二核酸序列中的一個或兩個在多順反子載體中、在單一啟動子的控制下以單一轉錄物形式表現。參見例如Kim, JH等人, PLoS One 6(4):e18556, 2011。在一些實施例中，啟動子中的一個或兩個為可誘導性。在一些實施例中，控制該編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3多肽鏈之核酸序列的啟動子為可誘導性(諸如可經由抗GPC3 CAR之活化來誘導)。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子。
在一些實施例中，提供的核酸係編碼根據本文所述之任一種抗GPC3 caTCRs及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的抗GPC3 caTCR及/或多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)。在一些實施例中，核酸包含一或多種編碼抗GPC3 caTCR之所有多肽鏈的核酸序列。在一些實施例中，核酸包含一或多種編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之所有多肽鏈的核酸序列。在一些實施例中，核酸包含一或多種編碼抗GPC3 caTCR及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之所有多肽鏈的核酸序列。在一些實施例中，一或多種核酸序列各自包含於單獨載體中。在一些實施例中，至少一些核酸序列包含於同一載體中。在一些實施例中，所有核酸序列包含於同一載體中。載體可選自由例如哺乳動物表現載體及病毒載體(諸如來源於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒之彼等載體)組成之群。
在一些實施例中，抗GPC3 caTCR為包含第一caTCR多肽鏈及第二caTCR多肽鏈的二聚體且多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子為包含單一一條多專一性(例如雙專一性)抗GPC3多肽鏈的單體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)，且核酸包含編碼第一caTCR多肽鏈的第一核酸序列、編碼第二caTCR鏈的第二核酸及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3多肽鏈的第三核酸序列。在一些實施例中，第一核酸序列包含於第一載體中，第二核酸序列包含於第二載體中，且第三核酸序列包含於第三載體中。在一些實施例中，第一及第二核酸序列包含於第一載體中，且第三核酸序列包含於第二載體中。在一些實施例中，第一及第三核酸序列包含於第一載體中，且第二核酸序列包含於第二載體中。在一些實施例中，第二及第三核酸序列包含於第一載體中，且第一核酸序列包含於第二載體中。在一些實施例中，第一、第二及第三核酸序列包含於同一載體中。在一些實施例中，第一核酸序列處於第一啟動子的控制下，第二核酸序列處於第二啟動子的控制下，且第三核酸序列處於第三啟動子的控制下。在一些實施例中，第一、第二及第三啟動子中的一些(諸如全部)具有相同序列。在一些實施例中，第一、第二及第三啟動子中的一些(諸如全部)具有不同序列。在一些實施例中，第一、第二及第三核酸序列中的一些(諸如全部)係在多順反子載體中、在單一啟動子的控制下以單一轉錄物形式表現。參見例如Kim, JH等人, PLoS One 6(4):e18556, 2011。在一些實施例中，啟動子中的一或多者為可誘導性。在一些實施例中，控制核酸序列的啟動子為可誘導的(諸如可經由抗GPC3 caTCR之活化來誘導)，該核酸序列編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3多肽鏈。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子。
向細胞中引入及表現基因之方法在此項技術中已知。在表現載體之情形下，該載體可以容易地藉由此項技術中的任何方法引入宿主細胞中，例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。舉例而言，表現載體可以藉由物理、化學或生物學方式轉移至宿主細胞中。
用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。用於產生包含載體及/或外源核酸之細胞的方法在此項技術中熟知。參見例如Sambrook等人(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。在一些實施例中，聚核苷酸引入宿主細胞中係藉由磷酸鈣轉染來實施。
將所關注的聚核苷酸引入宿主細胞中之生物學方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其逆轉錄病毒載體已成為將基因插入哺乳動物(例如人類)細胞中之最廣泛使用方法。其他病毒載體可來源於慢病毒、痘病毒、單純疱疹病毒1、腺病毒及腺相關病毒，及其類似病毒。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
將聚核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之例示性膠態系統為脂質體(例如人工膜微脂粒)。
在利用非病毒遞送系統之情況下，例示性遞送媒劑為脂質體。涵蓋使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，可使核酸與脂質結合。與脂質結合之核酸可囊封於脂質體之水性內部中，散置於脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸結合之連接分子連接至脂質體，包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質合併，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質結合。與脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體結合的組合物不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可存在於雙層結構中，以微胞形式存在或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地散置於溶液中，可能形成尺寸或形狀上不均一的聚集物。脂質為可天然存在之脂肪物質或合成脂質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴之化合物類別及其衍生物，諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。
不論用於將外源核酸引入宿主細胞或以其他方式使細胞暴露於本發明之抑制劑的方法，為了確認重組DNA序列在宿主細胞中之存在，可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知之「分子生物學」分析，諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如偵測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所述之分析來鑑別屬於本發明範疇內的藥劑。製備抗 GPC3 構築體及抗 GPC3 抗體部分
在一些實施例中，抗GPC3構築體或抗GPC3抗體部分為單株抗體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR，該抗GPC3抗體部分(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv)包含來源於單株抗體的序列。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分包含來自單株抗體的VH 及VL 域，或其變異體。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分進一步包含來自單株抗體的CH 1及CL 域，或其變異體。單株抗體可例如使用融合瘤方法，諸如Kohler及Milstein,Nature , 256:495 (1975)及Sergeeva等人,Blood , 117(16):4262-4272所述之方法；使用本文及下文實例中所述之噬菌體呈現方法，或使用重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)製備。
在融合瘤方法中，倉鼠、小鼠或其他適當宿主動物典型地用免疫媒介物免疫以誘使淋巴細胞產生或能夠產生將專一性結合至該免疫媒介物之抗體。或者，淋巴細胞可在活體外免疫。免疫媒介物可以包括多肽或所關注蛋白質之融合蛋白，或包含至少兩種分子之複合物，諸如包含肽及MHC蛋白質之複合物。一般而言，若需要人類來源之細胞，則使用周邊血液淋巴細胞(「PBL」)；或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。淋巴細胞接著使用適合融合劑(諸如聚乙二醇)與永生化細胞株融合以形成融合瘤細胞。參見例如Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), 第59-103頁。永生化細胞株通常為經轉型之哺乳動物細胞，特定言之，嚙齒動物、牛科動物及人類來源之骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。融合瘤細胞可以在適合培養基中培養，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合、永生化細胞生長或存活之物質。舉例而言，若親代細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基典型地包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(「HAT培養基」)，該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞生長。
在一些實施例中，永生化細胞株有效融合，藉由所選產抗體細胞支持抗體之穩定高量表現且對於諸如HAT培養基之培養基敏感。在一些實施例中，永生化細胞株為鼠類骨髓瘤細胞株，其可獲自例如沙克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California)及美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株亦已描述。Kozbor,J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) 第51-63頁。
接著可以分析其中培養融合瘤細胞之培養基中針對多肽之單株抗體的存在。融合瘤細胞產生之單株抗體的結合專一性可以藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析來確定，諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA)。此類技術及分析在此項技術中已知。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson及Pollard等人,Anal. Biochem. , 107:220 (1980)之史卡查分析(Scatchard analysis)測定。
鑑別出所需融合瘤細胞之後，純系可藉由限制稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長。Goding，同上。適用於此目的之培養基包括例如達爾伯克氏改良型伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)及RPMI-1640培養基。或者，融合瘤細胞可以在哺乳動物中以腹水形式活體內生長。
次純系所分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序自培養基或腹水液中分離或純化，諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
在一些實施例中，根據本文所述之包含抗GPC3抗體部分的任一種抗GPC3構築體，該抗GPC3抗體部分包含來自選自抗體部分文庫(諸如呈遞scFv或Fab片段的噬菌體文庫)之純系的序列。純系可藉由篩選組合文庫中具有所要活性之抗體片段來鑑別。舉例而言，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體呈現文庫及自此類文庫中篩選出具有所需結合特徵的抗體。此類方法評述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, N.J., 2001)且進一步描述於McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人,J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編, Human Press, Totowa, N.J., 2003)；Sidhu等人,J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人,J. Mol. Biol . 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)。
在某些噬菌體呈現方法中，VH 及VL 基因之譜系分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中隨機重組，接著可以篩選出抗原結合噬菌體，如Winter等人,Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994)中所述。噬菌體典型地以scFv片段形式或以Fab片段形式呈現抗體片段。來自免疫來源之文庫提供針對免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可以選殖(例如自人類)初始譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人,EMBO J , 12: 725-734 (1993)所述。最後，初始文庫亦可以合成方式如下製備：自幹細胞選殖未重排V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變的CDR3區域且在活體外實現重排，如Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. , 227: 381-388 (1992)所述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
可以藉由使用噬菌體呈現術篩選文庫中專一性針對標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之抗GPC3抗體部分來製備抗GPC3構築體。文庫可為具有至少1×109 (諸如至少約1×109 、2.5×109 、5×109 、7.5×109 、1×1010 、2.5×1010 、5×1010 、7.5×1010 或1×1011 中的任一者)個獨特人類抗體片段之多樣性的人類scFv噬菌體呈現文庫。在一些實施例中，文庫為初始人類文庫，該文庫由自健康供者之人類PMBC及脾提取之DNA構築，包含所有人類重鏈及輕鏈亞家族。在一些實施例中，文庫為初始人類文庫，該文庫由分離自患有各種疾病之患者(諸如自體免疫疾病患者、癌症患者及感染性疾病患者)之PBMC提取的DNA構築。在一些實施例中，文庫為半合成人類文庫，其中重鏈CDR3為完全隨機化的，所有胺基酸(除半胱胺酸之外)同等地可能存在於任何指定位置(參見例如Hoet, R.M.等人,Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005)。在一些實施例中，半合成人類文庫之重鏈CDR3具有約5至約24 (諸如約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24中的任一者)個胺基酸的長度。在一些實施例中，文庫為全合成的噬菌體呈現文庫。在一些實施例中，文庫為非人類噬菌體呈現文庫。
以高親和力結合至標靶GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的噬菌體純系可以如下選擇：使噬菌體迭代結合至與固體載體(諸如溶液淘選用的珠粒或細胞淘選用的哺乳動物細胞)結合的標靶GPC3，隨後移除未結合之噬菌體；及將專一性結合的噬菌體溶離。在溶液淘選之一個實例中，GPC3多肽可經生物素標記以固定至固體載體。將生物素標記之GPC3與噬菌體文庫及固體載體(諸如抗生蛋白鏈菌素結合之DYNABEADS® M-280)混合，且接著分離出GPC3-噬菌體-珠粒複合物。接著將所結合的噬菌體純系溶離且用於感染適當宿主細胞，諸如大腸桿菌XL1-Blue，用於表現及純化。在細胞淘選的一個實例中，將細胞表面上過度表現GPC3的SK-Hep1細胞與噬菌體文庫混合，之後收集細胞且將所結合的純系溶離且用於感染適當的宿主細胞用於表現及純化(所有皆參見實例)。可藉由溶液淘選、細胞淘選或兩者之組合進行多輪(諸如約2、3、4、5、6或大於6中之任一者)淘選，以富集專一性結合至標靶GPC3的噬菌體純系。可藉由此項技術中已知之任何方法(包括例如ELISA及FACS)測試所富集之噬菌體純系對標靶GPC3的專一性結合。
單株抗體亦可藉由重組DNA法製得，諸如美國專利第4,816,567號中描述之方法。編碼本發明單株抗體之DNA可以容易使用習知程序(例如使用能夠專一性結合至編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離及測序。如上文所述之融合瘤細胞或本發明之GPC3專一性噬菌體純系可以充當此類DNA之來源。DNA一經分離，則可置放於表現載體中，接著轉染至原本不產生免疫球蛋白的宿主細胞(諸如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中達成單株抗體之合成。DNA亦可經修飾，例如藉由用編碼序列取代人類重鏈及輕鏈恆定域及/或用構架區替代同源非人類序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，同上)或藉由使非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或一部分共價連接至免疫球蛋白編碼序列。此類非免疫球蛋白多肽可取代本發明抗體之恆定域，或可取代本發明抗體之一個抗原組合位點的可變域以產生嵌合二價抗體。
抗體可為單價抗體。用於製備單價抗體之方法在此項技術中已知。舉例而言，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈與經修飾之重鏈的重組表現。通常在Fc區中之任一點截斷重鏈以防止重鏈交聯。或者，相關半胱胺酸殘基經另一胺基酸殘基取代或缺失以防止交聯。
活體外方法亦適合於製備單價抗體。可使用此項技術中已知之任何方法實現抗體之消化以產生其片段，特定言之，Fab片段。
具有所需結合專一性之抗體可變域(抗體-抗原組合位點)可以與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳與包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定域進行融合。在一些實施例中，含有輕鏈結合所需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於融合物中之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨的表現載體中，且共轉染至適合之宿主生物體中。關於產生雙專一性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人,Methods in Enzymology , 121: 210 (1986)。人類及人類化抗體
抗GPC3構築體(例如抗GPC3 CAR或caTCR)或抗GPC3抗體部分可為人類化抗體或人類抗體。人類化形式之非人類(例如鼠類)抗體部分為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 、scFv或抗體之其他抗原結合子序列)，其典型地含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列。人類化抗體部分包括人類免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(接受者抗體)，其中來自接受者之CDR的殘基經來自具有所需專一性、親和力及能力之非人類物種(供者抗體)(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基經相應的非人類殘基置換。人類化抗體部分亦可包含既未在接受者抗體部分中、亦未在所輸入之CDR或構架序列中發現的殘基。一般而言，人類化抗體部分可以包含至少一個且典型兩個可變域之基本上全部，其中CDR區之全部或基本上全部對應於非人類免疫球蛋白之彼等區域，且FR區域之全部或基本上全部為人類免疫球蛋白共同序列之彼等區域。參見例如Jones等人,Nature, 321: 522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature, 332: 323-329 (1988)；Presta,Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
一般而言，人類化抗體部分中已引入來自非人類來源的一或多個胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地獲自「輸入」可變域。根據一些實施例，人類化基本上可遵循Winter及同事之方法(Jones等人,Nature , 321: 522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature , 332: 323-327 (1988)；Verhoeyen等人,Science , 239: 1534-1536 (1988))，藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列進行。因此，此類「人類化」抗體部分是抗體部分(美國專利號4,816,567)，其中實質上小於完整的人類可變域已經來自非人類物種的相應序列取代。在實務中，人類化抗體部分典型地為人類抗體部分，其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點之殘基取代。
作為人類化之一個替代方案，可以產生人類抗體部分。舉例而言，現可以產生轉殖基因動物(例如小鼠)，其在免疫接種後能夠在不產生內源免疫球蛋白的情況下產生完整譜系的人類抗體。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中之抗體重鏈接合區(JH)基因的同型接合缺失導致內源抗體產生被完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此類生殖系突變小鼠中將使得人類抗體在抗原攻擊時產生。參見例如Jakobovits等人,PNAS USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等人, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol., 7:33 (1993)；美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,591,669號、第5,545,807號及WO 97/17852。或者，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的小鼠)來製備人類抗體。攻毒之後，觀測人類抗體產生，其在所有方面與人體中所見密切相似，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號，及Marks等人, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg等人, Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison,Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger,Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；Lonberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)。
人類抗體亦可由活體外活化的B細胞產生(參見美國專利5,567,610及5,229,275)或藉由使用此項技術中已知之各種技術(包括噬菌體呈現文庫)產生。Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體。Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77頁(1985)及Boerner等人, J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)。
多專一性抗體
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)為多專一性抗體(例如串聯雙scFv雙專一性抗GPC3抗體)。適用於製備多專一性(例如雙專一性)抗體之方法在此項技術中熟知。舉例而言，雙專一性抗體之產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現，其中兩對各具有不同專一性，且在結合後，產生雜二聚體抗體(參見例如Milstein及Cuello,Nature , 305: 537-539 (1983)；WO 93/08829，及Traunecker等人,EMBO J. 10: 3655 (1991))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分類，因此此等融合瘤(四源融合瘤)產生十種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙專一性結構。適當分子之純化通常藉由親和層析步驟完成。類似程序揭示於WO 93/08829中及Traunecker等人,EMBO , 10: 3655-3659 (1991)中。或者，重鏈與輕鏈之組合可藉由利用侷限於物種的配對來導引(參見例如Lindhofer等人,J. Immunol. , 155:219-225 (1995))且重鏈之配對可藉由使用CH3域之「臼包杵」工程改造來導引(參見例如美國專利第5,731,168號；Ridgway等人,Protein Eng. , 9(7):617-621 (1996))。多專一性抗體亦可藉由工程改造靜電轉向效應以製造抗體Fc-雜二聚體分子而製得(參見例如WO 2009/089004A1)。在又一種方法中，穩定的雙專一性抗體可以藉由可控的Fab臂交換而產生，其中將具有不同抗原專一性且CH3域中具有匹配點突變的兩種親本抗體在還原條件下混合以允許分離、重組及再氧化而形成高純度雙專一性抗體。Labrigin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. , 110(13):5145-5150 (2013)。包含重鏈/輕鏈對之混合物的此類抗體在本文中亦稱為「雜多聚體抗體」。
具有不同專一性之抗體或其抗原結合片段亦可發生化學交聯以產生多專一性雜結合物抗體。舉例而言，各具有針對不同抗原之專一性的兩個F(ab')2分子可以化學方式連接。Pullarkat等人,Trends Biotechnol. , 48:9-21 (1999)。舉例而言，已提出此類抗體可使免疫系統細胞靶向非所需細胞(美國專利第4,676,980號)且用於治療HIV感染。WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089。預期抗體可使用合成蛋白質化學中之已知方法(包括涉及交聯劑之方法)在活體外製備。舉例而言，免疫毒素可使用二硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築。適於此目的的試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基-4-巰基丁醯亞胺酯及例如美國專利第4,676,980號中揭示之試劑。
在一些實施例中，多專一性抗體可使用重組DNA技術製備。舉例而言，雙專一性抗體可藉由將兩種scFv融合而經工程改造，諸如經由肽連接子將其融合，從而產生串聯scFv。串聯scFv之一個實例為雙專一性T細胞接合體。雙專一性T細胞接合體係藉由將抗CD3 scFv連接至對靶細胞之表面抗原(諸如GPC3)具有專一性之scFv而製得，從而將T細胞再導引至靶細胞(例如HCC細胞)。Mack等人, Proc. Natl. Acad. Sci. , 92:7021-7025 (1995)；Brischwein等人, Mol. Immunol., 43(8):1129-1143 (2006)。藉由縮短兩個可變域之間的肽連接子長度，可防止其自組裝且迫使其與第二多肽上之結構域配對，從而產生緊湊型雙專一性抗體，稱為雙功能抗體(Db)。Holliger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. , 90:6444-6448 (1993)。Db之兩個多肽各自包含藉由太短而不允許同一鏈上之兩個域之間配對之連接子連接至VL 之VH 。相應地，迫使一個多肽之VH 及VL 域與另一多肽之互補VL 及VH 域成對，藉此形成兩個抗原結合位點。經由此形式之修飾，兩個多肽藉由另一肽連接子連接，從而產生單鏈雙功能抗體(scDb)。經由Db形式之另一修飾，雙親和力再靶向(落鏢)雙專一性抗體可藉由在各多肽之C末端處之半胱胺酸殘基之間引入二硫鍵而產生，視情況在C末端半胱胺酸殘基之前包括驅動所需雜二聚體結構組裝之結構域。Veri等人, Arthritis Rheum. , 62(7):1933-1943 (2010)。此項技術中亦已知雙可變域免疫球蛋白(DVD-Ig™)，其中兩種單株抗體之標靶結合可變域經由天然存在之連接子組合而產生四價雙專一性抗體。Gu及Ghayur,Methods Enzymol. , 502:25-41 (2012)。在又一種形式中，利用來源於人類cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)之調控亞單元的肽(DDD2)與來源於人類A激酶錨定蛋白(AKAP)之錨定域的肽(AD2)之二聚合來製備對接及鎖定(DNL)雙專一性抗體。Rossi等人, Proc. Natl. Acad. Sci. , 103:6841-6846 (2006)。
直接自重組細胞培養物製備及分離雙專一性抗體片段之各種技術亦已描述。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙專一性抗體。Kostelny等人, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。此方法亦可用於產生抗體同二聚體。抗 GPC3 變異體
在一些實施例中，涵蓋本文所提供之抗GPC3構築體(例如抗GPC3全長抗體)的胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要提高抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成製備。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。為了獲得最終構築體，缺失、插入與取代可任意組合，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗GPC3抗體變異體。所關注之取代型突變誘發位點包括HVR及FR。可以將胺基酸取代引入所關注的抗體中且篩選出具有所需活性的產物，例如保持/改善的抗原結合、減小的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
保守取代展示於下表2中。表 2 ： 保守取代
胺基酸可根據共同的側鏈特性分成不同類別： a. 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； b. 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； c. 酸性：ASP、Glu； d.鹼性：His、Lys、Arg； e. 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； f.芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
例示性取代型變異體為親和力成熟抗體部分，其宜例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術產生。簡言之，使一或多個CDR殘基突變且在噬菌體上呈現變異抗體部分且針對特定生物活性(例如結合親和力)篩選。變異(例如取代)可發生於HVR中，以例如改良抗體親和力。此類變異可在HVR「熱點」(亦即在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008))，及/或專一性決定殘基(SDR))中產生，其中測試所得變異體VH 或VL 之結合親和力。藉由構築二級文庫及自二級文庫再選擇來達成親和力成熟已描述於Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))。
在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一種將多樣性引入為了成熟所選之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩選文庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體部分變異體。引入多樣性之另一方法包括HVR定向方法，其中若干個HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機進行。涉及抗原結合之CDR殘基可專門鑑別，例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來鑑別。特定言之，通常以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在一些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等變異實質上不降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，HVR中可發生實質上不降低結合親和力之保守變異(例如如本文所提供之保守取代)。此類變異可位於HVR「熱點」或SDR外部。在上文所提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR不變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別可靶向突變誘發之抗體殘基或區域的適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所述。在此方法中，鑑別殘基或一組標靶殘基(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互相用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構可經測定以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之標靶或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或超過一百個殘基之多肽範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合物，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如對於ADEPT而言)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。Fc 區 變異體
在一些實施例中，可以將一或多種胺基酸修飾引入本文所提供之全長抗GPC3抗體或抗GPC3Fc融合蛋白的Fc區中，藉此產生Fc區變異體。在一些實施例中，Fc區變異體具有增強的ADCC效應功能，其通常與結合至Fc受體(FcR)有關。在一些實施例中，Fc區變異體具有降低的ADCC效應功能。Fc序列中存在可以改變效應功能的許多變化或突變實例。舉例而言，WO 00/42072及Shields等人,J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)描述對FcR之結合改善或減弱的抗體變異體。此等公開案之內容以引用之方式特別併入本文中。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為治療性抗體針對腫瘤細胞之作用機制。ADCC為細胞介導之免疫防禦，藉此免疫系統之效應細胞主動地溶解靶細胞(例如癌細胞)，其膜表面抗原已被專一性抗體(例如抗GPC3抗體)結合。典型的ADCC涉及NK細胞被抗體活化。NK細胞表現作為Fc受體之CD16。此受體識別且結合至靶與細胞表面結合之抗體的Fc部分。NK細胞表面上之最常見Fc受體稱作CD16或FcγRIII。Fc受體與抗體Fc區之結合引起NK細胞活化、溶胞顆粒釋放及隨之而來的靶細胞發生細胞凋亡。ADCC對腫瘤細胞殺死之貢獻可藉由使用已經高親和力FcR轉染之NK-92細胞之專門測試來量測。將結果與不表現FcR之野生型NK-92細胞進行比較。
在一些實施例中，本發明涵蓋抗GPC3構築體變異體(諸如分離之抗GPC3構築體變異體)，其包含具有一些而非全部效應功能的Fc區，對於其中抗GPC3構築體活體內半衰期很重要、然某些效應功能(諸如CDC及ADCC)不必要或有害的應用而言，此使得其成為合乎需要的候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之減小/耗竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)第464頁之表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med . 166:1351-1361 (1987))。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流式細胞術用的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.；及CytoTox 96™非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, Wis.)。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可評估所關注分子在活體內之ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示的動物模型。亦可進行C1q結合分析以證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S.等人,Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M. S.及M. J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova, S. B.等人,Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))測定FcRn結合及活體內清除/半衰期。
效應功能減小的抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者發生取代的彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者發生取代的Fc突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
對FcR之結合改良或減弱的某些抗體變異體已有描述。(參見美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields等人,J. Biol. Chem . 9(2): 6591-6604 (2001))。
在一些實施例中，提供抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)變異體，其包含含有改良ADCC之一或多種胺基酸取代的變異型Fc區。在一些實施例中，變異型Fc區包含一或多個改良ADCC之胺基酸取代，其中取代發生於變異型Fc區之位置298、333及/或334 (EU殘基編號)。在一些實施例中，抗GPC3構築體(例如全長抗GPC3抗體)變異體包含發生於其變異型Fc區中之以下胺基酸取代：S298A、E333A及K334A。
在一些實施例中，變異發生於Fc區中，從而引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或減弱)，例如如以下文獻中所述：美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人,J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。
在一些實施例中，提供包含變異型Fc區的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)變異體，該變異型Fc區包含一或多種延長半衰期及/或改良對新生兒Fc受體(FcRn)之結合的胺基酸取代。半衰期延長且對FcRn之結合改良的抗體描述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn的結合。此類Fc變異體包括以下一或多個Fc區殘基發生取代的彼等變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434被取代(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
涵蓋包含本文所述之任一種Fc變異體或其組合的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)。糖基化變異體
在一些實施例中，本文中提供的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)經改變以增強或減少抗GPC3構築體發生糖基化的程度。抗GPC3構築體中之糖基化位點的添加或缺失宜藉由改變抗GPC3構築體或其多肽部分之胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來完成。
在抗GPC3構築體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體典型地包含分支雙觸角寡醣，其通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡醣結構之「莖」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可以修飾本發明之抗GPC3構築體中的寡醣以便產生某些特性改良的抗GPC3構築體變異體。
連接至Fc之CH2域的N-聚醣為非均質的。CHO細胞中產生的抗體或Fc融合蛋白藉由海藻糖基轉移酶活性發生海藻糖基化。參見Shoji-Hosaka等人, J. Biochem. 2006, 140:777- 83。通常，可以在人類血清中偵測到小百分比之天然存在之去海藻糖基化IgG。Fc之正-糖基化對於結合至FcγR而言具有重要作用；且正-聚醣之去海藻糖基化增強了Fc對FcγRIIIa的結合能力。增強的FcγRIIIa結合可以增強ADCC，此在需要細胞毒性的某些抗體治療應用中可為有利的。
在一些實施例中，當Fc介導的細胞毒性非所需時，增強的效應功能可為有害的。在一些實施例中，Fc片段或CH2域未發生糖基化。在一些實施例中，CH2域中的N-糖基化位點發生突變以防止糖基化。
在一些實施例中，提供包含Fc區的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)變異體，其中連接至Fc區之碳水化合物結構中的海藻糖減少或缺乏海藻糖，此可以改良ADCC功能。特定言之，本文中涵蓋其中海藻糖相對於野生型CHO細胞中產生之相同抗GPC3構築體上之海藻糖的量減少的抗GPC3構築體。亦即，其特徵為海藻糖之量比其原本由原生CHO細胞(例如產生原生糖基化模式之CHO細胞，諸如含有原生FUT8基因之CHO細胞)產生之量低。在一些實施例中，抗GPC3構築體為其上之N連接型聚醣中小於約50%、40%、30%、20%、10%或5%包含海藻糖之構築體。舉例而言，此類抗GPC3抗體中之海藻糖含量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%，或20%至40%。在一些實施例中，抗GPC3構築體為其上N連接型聚醣均不包含海藻糖的抗GPC3構築體，亦即，其中抗GPC3構築體完全不含海藻糖，或無海藻糖或去海藻糖基化。海藻糖之量係藉由計算糖鏈內Asn297處之海藻糖之平均量來確定，此平均量係相對於連接至Asn 297之所有醣結構(例如複雜、混合的高甘露糖結構)的總和而言，如藉由例如WO 2008/077546中所述的MALDI-TOF質譜法所量測。Asn297係指Fc區中之位於約位置297處的天冬醯胺殘基(Fc區殘基之EU編號)；然而，Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即位置294與300之間，原因是抗體中之序列變異較少。此類海藻糖基化變異體可以具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。關於「去海藻糖基化」或「海藻糖缺乏型」抗體變異體之公開案實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng. 87: 614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人,Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta, L；以及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其實例11)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人,Biotechnol. Bioeng. , 94(4):680-688 (2006)；以及WO2003/085107)。
抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)變異體進一步提供有對分寡醣，例如其中連接至抗GPC3構築體Fc區之雙觸角寡醣被GlcNAc對分。此類抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)變異體可以具有減少的海藻糖基化及/或改良的ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；US 2005/0123546 (Umana等人)及Ferrara等人,Biotechnology and Bioengineering , 93(5): 851-861 (2006)中。亦提供寡醣中有至少一個半乳糖殘基連接至Fc區的抗GPC3構築體(諸如全長抗GPC3抗體)變異體。此類抗GPC3構築體變異體可以具有改良之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)。
在一些實施例中，包含Fc區的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)變異體能夠結合至FcγRIII。在一些實施例中，包含Fc區的抗GPC3構築體(例如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)變異體在人類效應細胞(例如T細胞)存在下具有ADCC活性，或相較於包含人類野生型IgG1Fc區的原本相同抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)，在人類效應細胞存在下具有增強的ADCC活性。半胱胺酸工程化變異體
在一些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程化抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)，其中一或多個胺基酸殘基經半胱胺酸殘基取代。在一些實施例中，經取代之殘基存在於抗GPC3構築體之可近接位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗GPC3構築體之可近接位點處且可用於使抗GPC3構築體與其他部分結合，諸如藥物部分或連接子-藥物部分，以產生抗GPC3免疫結合物，如本文中進一步描述。半胱胺酸工程化抗GPC3構築體(諸如全長抗GPC3抗體)可以如例如美國專利第7,521,541號中所述產生。衍生物
在一些實施例中，本文所提供的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3-Fc融合蛋白、全長抗GPC3抗體)可以進一步加以修飾，以含有此項技術中已知且容易利用的其他非蛋白質部分。適於衍生抗GPC3構築體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支或未分支的。連接至抗GPC3構築體之聚合物數目可變化，且若連接超過一種聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物數目及/或類型可以基於包括(但不限於)以下之考慮因素來確定：待改良之抗GPC3構築體的具體特性或功能、抗GPC3構築體衍生物是否將用於限定條件下之療法等。
在一些實施例中，提供抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如全長抗GPC3抗體)與非蛋白質部分之結合物，該非蛋白質部分可以藉由暴露於輻射而選擇性地受熱。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不傷害普通細胞、但將非蛋白質部分加熱至殺死抗GPC3構築體-非蛋白質部分近側之細胞之溫度的波長。CAR 效應細胞及 caTCR 效應細胞製備
在一個態樣中，本發明提供表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如淋巴細胞，例如T細胞)。本文提供製備表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)(抗GPC3 CAR效應細胞，諸如抗GPC3 CAR T細胞)之例示性方法。
在一些實施例中，抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)可以藉由將包含抗GPC3 CAR (例如包含抗GPC3抗體部分及CD28及CD3ζ胞內信號傳導序列之CAR)之載體(包括例如慢病毒載體)引入效應細胞(諸如T細胞)中而產生。在一些實施例中，本發明之抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)能夠在活體內複製，從而可以長期存留，由此可以持續控制GPC3陽性疾病(諸如癌症，例如HCC)。在一些實施例中，藉由將包含多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的載體(包括例如慢病毒載體)引入效應細胞(諸如T細胞)內，抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)進一步表現本文所述之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子。在一些實施例中，編碼抗GPC3 CAR及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的核酸包含於同一載體中。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之核酸處於誘導型啟動子之控制下。在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之表現可經由抗GPC3 CAR活化來誘導。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子。
在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞表現包含抗GPC3抗體部分之抗GPC3 CAR (在本文中亦稱為「抗GPC3 CAR T細胞」)。在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞表現包含含有抗GPC3抗體部分之胞外域及含有CD3ζ及CD28之胞內信號傳導序列之胞內域的抗GPC3 CAR。在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞表現包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3 CAR，及本文所述之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)。本發明之抗GPC3 CAR T細胞可以經歷穩定的活體內T細胞擴增且可以建立在血液及骨髓中長時間高含量保持之GPC3專一性記憶細胞。在一些實施例中，輸注至患者中的本發明抗GPC3 CAR T細胞可以活體內排除患有GPC3陽性疾病之患者中的GPC3+ 細胞，諸如GPC3+ 癌細胞(例如HCC細胞)。
本發明在另一個態樣中提供表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如淋巴細胞，例如T細胞)。本文提供製備表現抗GPC3 caTCR (抗GPC3 caTCR效應細胞，諸如抗GPC3 caTCR T細胞)之效應細胞(諸如T細胞)的例示性方法。
在一些實施例中，可以藉由將包含抗GPC3 caTCR的載體(包括例如慢病毒載體)引入效應細胞(諸如T細胞)中來產生抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)。在一些實施例中，本發明之抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)能夠在活體內複製，從而可以長期存留，由此可以持續控制GPC3陽性疾病(諸如癌症，例如HCC)。在一些實施例中，藉由將包含多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的載體(包括例如慢病毒載體)引入效應細胞(諸如T細胞)內，抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)進一步表現本文所述之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子。在一些實施例中，編碼抗GPC3 caTCR及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的核酸包含於同一載體中。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之核酸處於誘導型啟動子之控制下。在一些實施例中，多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之表現可經由抗GPC3 caTCR活化來誘導。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子。
在一些實施例中，抗GPC3 caTCR T細胞表現包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3 caTCR(在本文中亦稱為「抗GPC3 caTCR T細胞」)。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR T細胞表現包含含有抗GPC3抗體部分之胞外域的抗GPC3 caTCR及包含含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)之第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM之第二TCRD的T細胞受體模組(TCRM)，其中該TCRM促進至少一個TCR相關信號傳導分子的募集。在一些實施例中，TCR-TM來源於αβTCR或γδTCR。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR T細胞表現包含抗GPC3抗體部分的抗GPC3 caTCR，及本文所述之多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)。本發明的抗GPC3 caTCR T細胞可以經歷穩定的活體內T細胞擴增且可以建立在血液及骨髓中長時間高含量存留的GPC3專一性記憶細胞。在一些實施例中，輸注至患者中的本發明抗GPC3 caTCR T細胞可以活體內排除患有GPC3陽性疾病之患者中的GPC3+ 細胞，諸如GPC3+ 癌細胞(例如HCC細胞)。
在一些實施例中，本發明係關於利用淋巴球輸注來投與表現抗GPC3 CAR之經基因修飾之T細胞或表現抗GPC3 caTCR之經基因修飾之T細胞，以治療患有GPC3陽性疾病或處於GPC3陽性疾病之風險下的患者。在一些實施例中，治療時利用自體淋巴球輸注。自需要治療之患者收集自體PBMC且使用本文所述及此項技術中已知之方法活化及擴增T細胞，且接著輸注回至患者體內。
在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞表現在細胞表面均勻分佈之抗GPC3 CAR。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR T細胞表現在細胞表面均勻分佈的抗GPC3 caTCR。均勻細胞表面分佈可例如藉由具有連續外觀及均勻厚度或信號強度之染色圖案表徵。舉例而言，在一些實施例中，包含抗GPC3 CAR T細胞(或抗GPC3 caTCR T細胞)的組合物(諸如醫藥組合物)包含少於約10% (諸如少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%)的細胞，該等細胞的細胞表面上聚集有抗GPC3 CAR (或抗GPC3 caTCR)。聚集可藉由例如具有不均勻厚度或信號強度的染色圖案或不連續、塊狀、點狀及/或不均勻分佈圖案表徵。在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞表現抗GPC3 CAR，其中小於約10% (諸如小於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)的抗GPC3 CAR聚集於細胞表面上。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR T細胞表現抗GPC3 caTCR，其中小於約10% (諸如小於約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%)的抗GPC3 caTCR聚集於細胞表面上。在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞中存在低水準的抗原非依賴性抗GPC3 CAR活化。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR T細胞中存在低水準的抗原非依賴性抗GPC3 caTCR活化。在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞發生低水準的T細胞耗竭。T細胞衰竭在延長之免疫活化條件期間自然發生，諸如在癌症或慢性感染情況下，其中T細胞變得功能異常。T細胞衰竭的特徵可為相較於功能效應子或記憶T細胞，效應功能減弱、抑制受體之表現延長及/或轉錄狀態改變。T細胞耗竭阻礙了腫瘤細胞及感染之最佳清除。抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞發生的T細胞耗竭可藉由此項技術中已知的任何方式表徵，例如藉由測定其功能及/或表型概況來表徵(Wherry, E. J.,Nature immunology 12(6): 492-499, 2011；Jiang, Y.等人,Cell death & disease 6(6): e1792, 2015)。舉例而言，在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞表現低含量的一或多種T細胞耗竭標記物，包括例如PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、BTLA及TIGIT。在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞維持非耗竭T細胞的特徵含量用於IL-2產生、TNF-α產生、IFN-γ產生及顆粒酶b產生，且/或在靶細胞存在下維持活體外殺死能力，此表明抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞不經歷自活化及過早耗竭。
在T細胞擴增及基因修飾之前，T細胞來源獲自個體。T細胞可獲自許多來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸膜積液、脾組織及腫瘤。在本發明之一些實施例中，可以使用此項技術中可利用的任何數目個T細胞株。在本發明之一些實施例中，T細胞可獲自使用熟習此項技術者已知之任何數目種技術(諸如Ficoll™分離)自個體收集之血液單元。在一些實施例中，藉由血球分離術獲得來自個體之循環血液的細胞。血球分離術產物典型地含有淋巴球，包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一些實施例中，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施例中，細胞用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)洗滌。在一些實施例中，洗滌溶液缺乏鈣且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若非全部)二價陽離子。如一般技術者將容易瞭解，洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知的方法實現，諸如根據製造商說明書使用半自動「流過式」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗滌之後，可以將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液中，諸如無Ca2+ 、無Mg2+ 之PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有緩衝劑之生理鹽水溶液。或者，可移除血球分離術樣本之非所要組分且將細胞直接再懸浮於培養基中。
在一些實施例中，藉由溶解紅血球及耗竭單核球而使T細胞與周邊血液淋巴球分離，例如藉由PERCOLL™梯度進行離心或藉由逆流離心淘析。T細胞之特定亞群(諸如CD3+ 、CD28+ 、CD4+ 、CD8+ 、CD45RA+ 及CD45RO+ T細胞)可藉由正向或負向選擇技術進一步分離。舉例而言，在一些實施例中，藉由將T細胞與抗CD3/抗CD28 (亦即3×28)結合之珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以正向選擇所需T細胞的時間段來分離出T細胞。在一些實施例中，該時間段為約30分鐘。在一些實施例中，該時間段的範圍為30分鐘至36小時或更長及其間的所有整數值。在一些實施例中，該時間段為為至少1、2、3、4、5或6小時。在一些實施例中，該時間段為10至24小時。在一些實施例中，培育時間段為24小時。為了自白血病患者分離出T細胞，使用較長培育時間(諸如24小時)可提高細胞產量。在T細胞相較於其他細胞類型而言很少的任何情形下，可以使用較長培育時間分離T細胞，諸如自腫瘤組織或自免疫功能不全個體分離出腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。此外，使用較長培育時間可提高捕捉CD8+ T細胞之效率。因此，藉由僅縮短或延長允許T細胞結合至CD3/CD28珠粒之時間及/或藉由增加或減少珠粒與T細胞的比率，可以在培養起始或在製程期間之其他時間點藉此優先選擇T細胞亞群。此外，藉由增加或降低珠粒或其他表面上之抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，可以在培養起始時或在其他所要時間點藉此優先選擇T細胞亞群。熟習此項技術者將認識到在本發明之背景下亦可使用多輪選擇。在一些實施例中，在活化及擴增過程中可能需要執行選擇程序且使用「未選擇之」細胞。「未選擇之」細胞亦可經受其他多輪選擇。
藉由負向選擇富集T細胞群可以經由將抗體組合導引至經負向選擇之細胞所獨有的表面標記物來完成。一種方法為經由負向磁性免疫黏附或流式細胞術進行的細胞分選及/或選擇，其使用導引至存在於經負向選擇之細胞上之細胞表面標記物的單株抗體混合物。舉例而言，為了藉由負向選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物典型地包括CD-14、CD20、CD11b、CD-16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施例中，可能需要富集或正向選擇典型地表現CD4+ 、CD25+ 、CD62Lhi、GITR+ 及FoxP3+ 之T調控細胞。或者，在一些實施例中，T調控細胞藉由抗CD25結合之珠粒或其他類似選擇方法耗竭。
為了藉由正向或負向選擇分離出所要細胞群，可以改變細胞濃度及表面(例如顆粒，諸如珠粒)。在一些實施例中，可能需要顯著減小珠粒與細胞混合在一起之體積(亦即增加細胞濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，在一些實施例中，使用約20億個細胞/毫升之濃度。在一些實施例中，使用約10億個細胞/毫升之濃度。在一些實施例中，使用大於約1億個細胞/毫升。在一些實施例中，使用約10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/毫升中之任一者之細胞濃度。在一些實施例中，使用約75、80、85、90、95或100百萬個細胞/毫升中之任一者的細胞濃度。在一些實施例中，使用約125或約150百萬個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可以引起細胞產量、細胞活化及細胞擴增增加。另外，使用高細胞濃度可以更有效地捕捉可能微弱表現所關注之靶抗原的細胞，諸如CD28陰性T細胞，或來自存在許多腫瘤細胞之樣本(亦即，白血病血液、腫瘤組織等)的細胞。此類細胞群可以具有治療價值且需要獲得。舉例而言，使用高細胞濃度允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在本發明之一些實施例中，T細胞直接獲自治療之後的患者。就此而言，已觀測到在某些癌症治療(特定言之，用損傷免疫系統之藥物治療)之後，在治療之後不久，在患者自治療正常恢復之時間期間，所得T細胞之品質可為最佳的或其離體擴增之能力得到改良。類似地，在使用本文所述之方法離體操縱之後，此等細胞可以處於移植及活體內擴增增強之較佳狀態。因此，本發明之上下文內涵蓋在此恢復階段期間收集血細胞，包括T細胞、樹突狀細胞或造血譜系之其他細胞。此外，在一些實施例中，移動(例如隨GM-CSF移動)及調理療法可以用於建立個體內之條件，其中有利於重建、再循環、再生及/或擴增特定細胞類型，尤其在治療之後的限定時間窗期間。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
不論在對表現所需抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR(及在一些實施例中，進一步共表現多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子)的T細胞進行基因修飾之前或之後，通常均可以利用例如以下文獻中所述的方法活化及擴增T細胞：美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國專利申請公開案第20060121005號。
一般而言，本發明之T細胞係藉由使刺激CD3/TCR複合物相關信號的藥劑及刺激T細胞表面上之協同刺激分子的配體與其所連接之表面接觸來擴增。特定言之，T細胞群可以如下刺激：諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段或固定於表面上之抗CD3抗體接觸，或藉由與結合鈣離子載體之蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)接觸。為了協同刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配體。舉例而言，可以使T細胞群與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞增殖，抗CD3抗體及抗CD28抗體。可以使用的抗CD28抗體之實例包括9.3、b-T3、XR-CD28 (Diaclone, Besançon, France)，亦可使用此項技術中通常已知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc . 30(8):3975-3977, 1998；Haanen等人,J. Exp. Med . 190(9):13191328, 1999；Garland等人,J. Immunol. Meth . 227(1-2):53-63, 1999)。免疫結合物製備
抗GPC3免疫結合物可以使用此項技術中已知之任何方法製備。參見例如WO 2009/067800、WO 2011/133886及美國專利申請公開案第2014322129號，其以全文引用之方式併入本文中。
抗GPC3免疫結合物中之抗GPC3抗體部分可以藉由使抗GPC3抗體部分能與效應分子結合或連接的任何方式「連接至」效應分子。舉例而言，抗GPC3免疫結合物中之抗GPC3抗體部分可以藉由化學或重組方式連接至效應分子。製備融合物或結合物之化學方式在此項技術中已知且可用於製備抗GPC3免疫結合物。用於使抗GPC3抗體部分與效應分子結合的方法必須能夠在不干擾結合蛋白結合至靶細胞上之抗原之能力的情況下使結合蛋白與效應分子連接。
抗GPC3免疫結合物中之抗GPC3抗體部分可以間接連接至效應分子。舉例而言，抗GPC3免疫結合物中之抗GPC3抗體部分可以直接連接至含有若干類型之一之效應分子的脂質體。效應分子及/或抗GPC3抗體部分亦可結合至固體表面。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物中之抗GPC3抗體部分與效應分子均為蛋白質且可使用此項技術中熟知之技術結合。可供能使兩種蛋白質結合用的交聯劑存在數百種。(參見例如「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」. 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor)。交聯劑一般基於抗GPC3抗體部分及/或效應分子上可利用的或插入的反應性官能基選擇。另外，若不存在反應性基團，則可使用光可活化交聯劑。在某些情況下，抗GPC3抗體部分與效應分子之間可能需要包括間隔子。此項技術已知之交聯劑包括同雙官能藥劑：戊二醛、二亞胺代己二酸二甲酯及雙(重氮聯苯胺)及異雙官能藥劑：間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺及磺酸基-間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺。
在一些實施例中，抗GPC3免疫結合物中的抗GPC3抗體部分可以用特定殘基加以工程改造以便化學連接效應分子。此項技術已知之用於化學連接分子的特定殘基包括離胺酸及半胱胺酸。交聯劑一般基於抗GPC3抗體部分中所插入及效應分子上可利用的反應性官能基選擇。
抗GPC3免疫結合物亦可使用重組DNA技術製備。在此情況下，使編碼抗GPC3抗體部分之DNA序列與編碼效應分子之DNA序列融合，產生嵌合DNA分子。將嵌合DNA序列轉染至表現融合蛋白之宿主細胞中。融合蛋白可自細胞培養物回收且使用此項技術中已知之技術純化。
作為標記的效應分子連接至結合蛋白之實例包括以下文獻中所述的方法：Hunter等人,Nature 144:945 (1962)；David等人,Biochemistry 13:1014 (1974)；Pain等人,J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)；Nygren, J.Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)；Wensel及Meares,Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy , Elsevier, N.Y. (1983)；及Colcher等人, 「Use of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts in Athymic Mice」,Meth. Enzymol. , 121:802-16 (1986)。
放射性標記或其他標記可以已知方式併入免疫結合物中。舉例而言，肽可生物合成或可藉由化學胺基酸合成、使用包括例如氟-19 (替代氫)的適合胺基酸前驅物合成。諸如99 Tc或123 I、186 Re、188 Re及111 In之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。IODOGEN方法(Fraker等人,Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))可以用於併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製得抗GPC3抗體部分與細胞毒性劑之結合物，該等雙官能蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如二丁二醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science 238:1098 (1987)所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見例如WO94/11026。連接子可為促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可以使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人,Cancer Research 52:127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明的抗GPC3免疫結合物明確地涵蓋但不限於用交聯試劑製備之ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其可市購(例如購自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A)。參見Applications Handbook and Catalog第467-498頁, 2003-2004。醫藥組合物
本文亦提供包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)之組合物(諸如醫藥組合物，在本文中亦稱為調配物)、編碼該構築體之核酸、包含編碼該構築體之核酸的載體、包含該核酸或載體的宿主細胞，或包含該核酸或載體之效應細胞。在一些實施例中，組合物進一步包含與抗GPC3構築體結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞)。在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含抗GPC3構築體及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含與抗GPC3構築體結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)。
適合的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)調配物係藉由將具有所需純度之抗GPC3構築體與視情況存在之醫藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編(1980))混合、以凍乾調配物或水溶液形式獲得。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨、氯化六羥季銨、苯紮氯銨、苄索氯銨、苯酚、丁醇或苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)的多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，例如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。例示性調配物描述於WO98/56418中，該專利以引用的方式明確併入本文中。適於皮下投與之凍乾調配物描述於WO97/04801中。此類凍乾調配物可以用適合稀釋劑復原至高蛋白質濃度且經復原的調配物可以皮下投與本文中之待治療個體。脂質體(Lipofectin/liposome)可用於將本發明之抗GPC3構築體遞送至細胞中。
本文中之調配物在所治療之特定適應症需要時亦可含有除抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)之外的一或多種活性化合物，較佳為具有對彼此無有害影響之互補活性的彼等活性化合物。舉例而言，除抗GPC3構築體之外，可能需要進一步提供抗贅生劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化學治療劑。此類分子宜以對預期目的有效之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視以下因素而定：存在於調配物中之抗GPC3構築體的量、疾病或病症或治療之類型及如上文所述之其他因素。此等藥劑一般以如本文所述之相同劑量及投藥途徑或迄今使用之劑量的約1%至99%使用。
抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)亦可包覆於微膠囊中，例如分別藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊，例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包覆於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或包覆於巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編(1980)中。可以製備持續釋放製劑。
可以製備抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體(或其片段)之固體疏水性聚合物的半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸酯(leuprolide acetate)組成之可注射微球體))，及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物允許分子釋放逾100天，但某些水凝膠釋放蛋白質的時間段較短。若囊封抗體長時間留存於體內，則其可因在37℃下暴露於水分而變性或聚集，引起生物活性損失及可能的免疫原性變化。根據所涉及的機制，可以設計出使抗GPC3構築體穩定的合理策略。舉例而言，若發現聚集機制係經由硫基-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，則穩定化可藉由修飾巰基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成。
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)係在緩衝液中調配，該緩衝液包含檸檬酸鹽、NaCl、乙酸鹽、丁二酸鹽、甘胺酸、聚山梨醇酯80 (吐溫80)或前述者之任何組合。在一些實施例中，抗GPC3構築體係在包含約100 mM至約150 mM甘胺酸之緩衝液中調配。在一些實施例中，抗GPC3構築體係在包含約50 mM至約100 mM NaCl之緩衝液中調配。在一些實施例中，抗GPC3構築體係在包含約10 mM至約50 mM乙酸鹽之緩衝液中調配。在一些實施例中，抗GPC3構築體係在包含約10 mM至約50 mM丁二酸鹽之緩衝液中調配。在一些實施例中，抗GPC3構築體係在包含約0.005%至約0.02%聚山梨醇酯80之緩衝液中調配。在一些實施例中，抗GPC3構築體係在具有約5.1與5.6之間之pH的緩衝液中調配。在一些實施例中，抗GPC3構築體係在包含10 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl、100 mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝液中調配，其中調配物的pH為5.5。
用於活體內投與之調配物必須為無菌的。此容易藉由例如無菌過濾膜過濾來完成。使用抗 GPC3 構築體之治療方法
本發明的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)及/或組合物可以投與個體(例如哺乳動物，諸如人類)，以治療涉及GPC3表現異常高的疾病及/或病症(在本文中亦稱為「GPC3陽性」疾病或病症)，包括例如癌症(諸如肝細胞癌(HCC))。本申請案因此在一些實施例中提供治療個體之GPC3陽性疾病(諸如癌症)的方法，包含向個體投與有效量之包含含有抗GPC3抗體部分之抗GPC3構築體(諸如本文所述之任一種抗GPC3構築體)的組合物(諸如醫藥組合物)。在一些實施例中，該組合物進一步包含與抗GPC3構築體(例如抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR)結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞)。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(諸如癌症)的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)的組合物(諸如醫藥組合物)，其中在經由效應細胞(例如T細胞)上之信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)傳導信號後，可誘導抗GPC3構築體表現。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(諸如癌症)的方法，包含向個體投與有效量之包含效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)的組合物(諸如醫藥組合物)，其中該效應細胞經由效應細胞信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化來誘導抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFvT細胞接合體)表現。在一些實施例中，編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸可操作地連接至誘導型啟動子，諸如信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化依賴性啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 CAR-T細胞。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 caTCR-T細胞。
在一些實施例中，癌症選自由例如以下組成之群：HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌及脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為肝細胞癌且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，個體為人類。
舉例而言，在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性分子(例如雙專一性T細胞接合體)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為CAR或caTCR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，組合物進一步包含與抗GPC3構築體結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞)。在一些實施例中，組合物包含效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)，其中該效應細胞經由效應細胞信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)之活化來誘導抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸可操作地連接至誘導型啟動子，諸如信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化依賴性啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 CAR-T細胞。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 caTCR-T細胞。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性分子(例如雙專一性T細胞接合體)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為CAR或caTCR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，組合物進一步包含與抗GPC3構築體結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)。在一些實施例中，效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)經由效應細胞信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)之活化來誘導抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)係在誘導型啟動子(諸如信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化依賴性啟動子)的控制下表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 CAR-T細胞。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 caTCR-T細胞。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ，；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL 。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性分子(例如雙專一性T細胞接合體)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為CAR或caTCR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，組合物進一步包含與抗GPC3構築體結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)。在一些實施例中，效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)經由效應細胞信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)之活化來誘導抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)係在誘導型啟動子(諸如信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化依賴性啟動子)的控制下表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 CAR-T細胞。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 caTCR-T細胞。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；以及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL 。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，提供一種治療患有GPC3陽性疾病(例如癌症)之個體的方法，包含向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物，該構築體包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性分子(例如雙專一性T細胞接合體)。在一些實施例中，抗GPC3構築體為CAR或caTCR。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，組合物進一步包含與抗GPC3構築體結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)。在一些實施例中，效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)經由效應細胞信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)之活化來誘導抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)係在誘導型啟動子(諸如信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化依賴性啟動子)的控制下表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 CAR-T細胞。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 caTCR-T細胞。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療個體之轉移HCC的方法，包含向個體投與有效量之包含根據上述任一實施例之抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物。在一些實施例中，組合物進一步包含與抗GPC3構築體結合的細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供抑制(諸如預防)個體之肝細胞癌轉移的方法，包含向個體投與有效量之包含根據上述任一實施例之抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)的組合物。在一些實施例中，個體為人類。
在用於治療上述GPC3陽性疾病之任一方法的一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)在投與個體之前與細胞(諸如免疫細胞，例如T細胞)結合。因此，舉例而言，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含a)使本文所述之任一種抗GPC3構築體與細胞(諸如免疫細胞，例如T細胞)結合以形成抗GPC3構築體/細胞結合物，及b)向個體投與有效量之包含抗GPC3構築體/細胞結合物的組合物。在一些實施例中，細胞來源於個體。在一些實施例中，細胞不來源於個體。在一些實施例中，抗GPC3構築體藉由共價連接至細胞表面上之分子而與細胞結合。在一些實施例中，抗GPC3構築體藉由非共價連接至細胞表面上之分子而與細胞結合。在一些實施例中，抗GPC3構築體係藉由將抗GPC3構築體的一部分插入細胞之外膜中而與細胞結合。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性(諸如雙專一性)分子。在一些實施例中，抗GPC3構築體為嵌合抗原受體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為caTCR。在一些實施例中，治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法包含向個體投與有效量之抗GPC3 CAR T細胞。在一些實施例中，治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法包含向個體投與有效量之抗GPC3 caTCR T細胞。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，個體為人類。
在用於治療上述GPC3陽性疾病之任一方法的一些實施例中，在效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)經由其信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化後，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)受到表現。在一些實施例中，效應細胞包含編碼抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸序列，該核酸序列可操作地連接至誘導型啟動子，諸如信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化依賴性啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 CAR-T細胞。在一些實施例中，效應細胞為抗GPC3 caTCR-T細胞。因此，舉例而言，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含a)將編碼本文所述之任一種抗GPC3構築體的核酸引入效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR-T細胞)，其中核酸可操作地連接至誘導型啟動子(諸如信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)活化依賴性啟動子)；及b)向個體投與有效量之包含效應細胞的組合物。在一些實施例中，細胞來源於個體。在一些實施例中，細胞不來源於個體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為非天然存在的。在一些實施例中，抗GPC3構築體為scFv。在一些實施例中，抗GPC3構築體為全長抗體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為多專一性(諸如雙專一性)分子。在一些實施例中，抗GPC3構築體為嵌合抗原受體。在一些實施例中，抗GPC3構築體為caTCR。在一些實施例中，治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法包含向個體投與有效量之抗GPC3 CAR T細胞。在一些實施例中，治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法包含向個體投與有效量之抗GPC3 caTCR T細胞。在一些實施例中，抗GPC3構築體為免疫結合物。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，個體為哺乳動物(例如人類、非人類靈長類動物、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、犬、貓等)。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為臨床患者、臨床試驗自願者、實驗動物等。在一些實施例中，個體年齡小於約60歲(包括例如年齡小於約50、40、30、25、20、15或10歲中的任一者)。在一些實施例中，個體年齡大於約60歲(包括例如年齡大於約70、80、90或100歲中的任一者)。在一些實施例中，個體經診斷患有或在遺傳上容易患有本文所述之一或多種疾病或病症(諸如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤)。在一些實施例中，個體具有與一或多種本文所述之疾病或病症相關之一或多種風險因素。
本申請案在一些實施例中，提供一種將抗GPC3構築體(諸如本文所述之任一種抗GPC3構築體，例如分離之抗GPC3構築體)遞送至個體或具有可溶性GPC3 (例如血清中具有循環GPC3蛋白或游離GPC3肽)之個體之細胞表面上表現GPC3的細胞中的方法，該方法包含向個體投與包含抗GPC3構築體之組合物。在一些實施例中，待遞送之抗GPC3構築體與細胞(諸如效應細胞，例如T細胞)結合。在一些實施例中，該方法包含向個體投與抗GPC3 CAR T細胞。在一些實施例中，該方法包含向個體投與抗GPC3 caTCR T細胞。
此項技術中已知用於癌症(諸如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤)或展現異常GPC3表現之任何其他疾病的許多診斷方法及彼等疾病的臨床界定。此類方法包括(但不限於)例如免疫組織化學、PCR及螢光原位雜交(FISH)。
在一些實施例中，本發明的抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)及/或組合物係與第二、第三或第四藥劑(包括例如抗贅生劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化學治療劑)組合投與以治療涉及異常GPC3表現的疾病或病症。在一些實施例中，藥劑包括例如IFN受體促效劑、Hsp90抑制劑、p53表現增強劑及化學治療劑。在一些實施例中，藥劑為IFN受體促效劑，包括例如IFNγ、IFNβ及IFNα。在一些實施例中，藥劑為Hsp90抑制劑，包括例如坦螺旋黴素(tanespimycin)(17-AAG)、阿螺旋黴素(alvespimycin)(17-DMAG)、瑞他黴素(retaspimycin)(IPI-504、IPI-493、CNF2024/BIIB021、MPC-3100、Debio 0932 (CUDC-305)、PU-H71、加利特皮(Ganetespib)(STA-9090)、NVP-AUY922 (VER-52269)、HSP990、KW-2478、AT13387、SNX-5422、DS-2248及XL888。在一些實施例中，藥劑為p53表現增強劑，包括例如5-氟尿嘧啶及努特林-3 (nutlin-3)。在一些實施例中，藥劑為化學治療劑，包括例如拓朴替康、依託泊苷、順鉑、太平洋紫杉醇及長春鹼。
癌症治療可以根據以下來評估：例如腫瘤消退、腫瘤重量或尺寸萎縮、進展時間、存活持續時間、無進展存活率、總體反應率、反應持續時間、生活品質、蛋白質表現及/或活性。可以使用測定治療功效之方法，包括例如經由放射學成像量測反應。
在一些實施例中，治療功效以腫瘤生長抑制百分比(TGI%)量度，使用方程式100-(T/C×100)計算，其中T為所治療腫瘤之平均相對腫瘤體積，且C為未治療腫瘤之平均相對腫瘤體積。在一些實施例中，TGI%為約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%或大於95%。
投與抗GPC3構築體組合物之劑量及方法
投與個體(諸如人類)之抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體或以抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞形式投與)組合物的劑量可以隨特定組成、投藥模式及所治療之疾病類型而變化。在一些實施例中，組合物(諸如包含分離之抗GPC3構築體、抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞)的量有效引起目標反應(諸如部分反應或完全反應)。在一些實施例中，抗GPC3構築體組合物的量足以引起個體中之完全反應。在一些實施例中，抗GPC3構築體組合物的量足以引起個體中之部分反應。在一些實施例中，抗GPC3構築體組合物的投與量(例如單獨投與時)足以在抗GPC3構築體組合物治療之個體群體中產生大於約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、64%、65%、70%、75%、80%、85%或90%中的任一者之總體反應率。個體對本文所述方法之治療的反應可以例如基於RECIST水準來確定。
在一些實施例中，組合物(諸如包含分離之抗GPC3構築體、抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞的組合物)的量足以延長個體之無進展存活期。在一些實施例中，組合物的量足以延長個體之總體存活期。在一些實施例中，組合物的量(例如單獨投與時)足以在抗GPC3構築體組合物治療之個體群體中產生大於約50%、60%、70%或77%中的任一者之臨床益處。
在一些實施例中，組合物(諸如包含分離之抗GPC3構築體、抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞之組合物)單獨或與第二、第三及/或第四藥劑組合的量為足以使腫瘤尺寸減少、癌細胞數目減少或腫瘤生長速率降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%中之任一者的量(相較於同一個體在治療之前的相應腫瘤尺寸、癌細胞數目或腫瘤生長速率，或相較於未接受治療之其他個體中的相應活性)。標準方法可以用於量測此效應之量級，諸如使用純化酶之活體外分析、基於細胞之分析、動物模型或人類測試。
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3 scFv、全長抗GPC3抗體、多專一性抗GPC3分子、抗GPC3 CAR、抗GPC3 caTCR，或抗GPC3免疫結合物)在組合物中的量低於誘導毒理學效應(亦即，高於臨床上可接受之毒性水準的效應)的水準或處於當組合物投與個體時潛在副作用可控或可耐受的水準。
在一些實施例中，組合物的量接近遵循相同給藥方案之組合物之最大耐受劑量(MTD)。在一些實施例中，組合物的量大於MTD之約80%、90%、95%或98%中的任一者。
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如全長抗GPC3抗體、多專一性抗GPC3分子或抗GPC3免疫結合物)在組合物中的量包括約0.001 µg至約1000 µg的範圍。
在上述任一態樣之一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如全長抗GPC3抗體、多專一性抗GPC3分子或抗GPC3免疫結合物)在組合物中的有效量係在每公斤總體重約0.1 µg至約100 mg範圍內。
抗GPC3構築體組合物可以經由各種途徑投與個體(諸如人類)，包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肺內、經口、吸入、囊泡內、肌肉內、氣管內、皮下、眼內、鞘內、經黏膜及經皮。在一些實施例中，可以使用組合物之持續連續釋放調配物。在一些實施例中，靜脈內投與組合物。在一些實施例中，門靜脈內投與組合物。在一些實施例中，動脈內投與組合物。在一些實施例中，腹膜內投與組合物。在一些實施例中，肝內投與組合物。在一些實施例中，藉由肝動脈輸注投與組合物。在一些實施例中，投與第一疾病位點遠側之注射位點。
抗GPC3 CAR效應細胞療法及抗GPC3 caTCR效應細胞療法
本申請案亦提供利用抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR將效應細胞(諸如初始T細胞)之專一性再導向GPC3 (諸如與細胞表面結合之GPC3或可溶性GPC3)的方法。因此，本發明亦提供一種在哺乳動物中刺激效應細胞介導之針對包含GPC表現細胞之靶細胞群或組織之反應(諸如T細胞介導之免疫反應)的方法，包含向哺乳動物投與表現抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的步驟。在一些實施例中，抗GPC3 CAR效應細胞或抗GPC3 caTCR效應細胞進一步包含編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)之核酸，該核酸可操作地連接至誘導型啟動子。在一些實施例中，(分別)經由抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR傳導信號後，可誘導抗GPC3 CAR效應細胞或抗GPC3 caTCR效應細胞表現多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。
可以將表現抗GPC3 CAR (視情況進一步表現抗GPC3雙專一性T細胞接合體)的抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)輸注至有需要的接受者。可以將表現抗GPC3 caTCR (視情況進一步表現抗GPC3雙專一性T細胞接合體)的抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)輸注至有需要的接受者。所輸注的細胞能夠殺死接受者中之在細胞表面上表現GPC3的細胞。在一些實施例中，不同於抗體療法，抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)能夠在活體內複製，引起長期存留，從而可以維持腫瘤控制。
在一些實施例中，抗GPC3 CAR效應細胞為可以經歷穩定活體內T細胞擴增且可以長時間存留的抗GPC3 CAR T細胞。在一些實施例中，本發明之抗GPC3 CAR T細胞發展為專一性記憶T細胞，其可以再活化以抑制任何額外腫瘤形成或生長。
在一些實施例中，抗GPC3 caTCR效應細胞為可以經歷穩定活體內T細胞擴增且可以長時間存留的抗GPC3 caTCR T細胞。在一些實施例中，本發明之抗GPC3 caTCR T細胞發展為專一性記憶T細胞，其可以再活化以抑制任何額外腫瘤形成或生長。
本發明的抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞亦可充當一種疫苗類型用於哺乳動物的離體免疫及/或活體內治療。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，抗GPC3 CAR T細胞或抗GPC3 caTCR T細胞進一步包含編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)之核酸，該核酸可操作地連接至誘導型啟動子。在一些實施例中，經由抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。
關於離體免疫，在細胞投與哺乳動物之前，發生以下中之至少一者：i)擴增細胞；ii)將編碼抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR之核酸引入細胞；及/或iii)細胞之低溫保存。在一些實施例中，藉由引入可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸來進一步活體外操縱細胞。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。
離體程序在此項技術中熟知且在下文中更充分地論述。簡言之，自哺乳動物(較佳為人類)分離出細胞且用本文揭示之表現抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR的載體進行基因修飾(亦即，活體外轉導或轉染)。可以將抗GPC3 CAR效應細胞或抗GPC3 caTCR效應細胞投與哺乳動物接受者以得到治療益處。哺乳動物接受者可為人類且抗GPC3 CAR細胞(或抗GPC3 caTCR細胞)相對於接受者可為自體的。或者，細胞相對於接受者可為同種異體的、同基因型的或異種的。在一些實施例中，抗GPC3 CAR效應細胞或抗GPC3 caTCR效應細胞進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸，其中誘導型啟動子對經由抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR發生的信號傳導有反應。
造血幹細胞及祖細胞離體擴增程序描述於美國專利第5,199,942號中，該專利以引用之方式併入本文中，可應用於本發明之細胞。其他適合方法在此項技術中已知；因此，本發明不限於任何特定的細胞離體擴增方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包含：(1)自哺乳動物、自周邊血液收集物或骨髓外植體收集CD34+ 造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴增此類細胞。除美國專利第5,199,942號中所述的細胞生長因子之外，亦可使用其他因子(諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體)培養及擴增細胞。
除了在離體免疫方面使用基於細胞之疫苗之外，本發明亦提供用於活體內免疫以在患者中引發抗原之免疫反應的組合物及方法。
本發明之抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)可以單獨投與，或與稀釋劑及/或其他組分(諸如IL-2或其他細胞介素或細胞群)組合成醫藥組合物投與。簡言之，本發明之醫藥組合物可以包含抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)與一或多種醫藥學或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的組合。此類組合物可以包含緩衝液，諸如中性緩衝生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。在一些實施例中，抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)組合物經調配用於靜脈內投與。
本發明之抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)組合物的精確投與量可以由醫師在考慮個體年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉移程度及患者(個體)狀況之差異的情況下確定。在一些實施例中，包含抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)的醫藥組合物係以每公斤體重約104 至約109 個細胞的劑量投與，諸如每公斤體重約104 至約105 、約105 至約106 、約106 至約107 、約107 至約108 或約108 至約109 個細胞中的任一者，包括彼等範圍內的所有整數值。抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)組合物亦可以此等劑量分多次投與。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。特定患者之最佳劑量及治療方案可以由熟習醫藥技術者藉由監測患者之疾病病徵且相應地調整療法而容易確定。
在一些實施例中，可能需要將活化的抗GPC3 CAR T細胞或活化的抗GPC3 caTCR T細胞投與個體且接著隨後再抽血(或已進行血球分離術)、根據本發明活化來自其的T細胞且將此等經活化及擴增的T細胞再輸注至患者中。此過程可每幾週進行多次。在一些實施例中，T細胞可自10 cc至400cc之抽血活化。在一些實施例中，T細胞自20 cc、30 cc、40 cc、50 cc、60 cc、70 cc、80 cc、90 cc或100 cc之抽血活化。
抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)之投與可依任何適宜方式進行，包括氣溶膠吸入、注射、攝取、輸注、植入或移植。本文所述之組合物可以皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內投與患者。在一些實施例中，本發明之抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)組合物藉由皮內或皮下注射投與患者。在一些實施例中，本發明之抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)組合物藉由靜脈內注射投與。抗GPC3 CAR效應細胞(諸如T細胞)或抗GPC3 caTCR效應細胞(諸如T細胞)之組合物可以直接注射至腫瘤、淋巴結或感染位點。
因此，舉例而言，在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含胞外域，該胞外域包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合之本文所述之專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 CAR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，經由靜脈內、腹膜內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，經由靜脈內途徑投藥。在一些實施例中，經由瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投藥包含在GPC3陽性疾病(諸如GPC3陽性腫瘤)位點遠側之注射位點進行局域注射。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤(亦即，經由瘤內途徑投藥)。在一些實施例中，GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤且GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含胞外域，該胞外域包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合之專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的本文所述抗GPC3抗體部分。舉例而言，在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含SEQ ID NO: 491及516-521中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，表現抗GPC3 CAR的效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 CAR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，經由靜脈內、腹膜內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，經由靜脈內途徑投藥。在一些實施例中，經由瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投藥包含在GPC3陽性疾病(諸如GPC3陽性腫瘤)位點遠側之注射位點進行局域注射。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤(亦即，經由瘤內途徑投藥)。在一些實施例中，GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤且GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)之抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 CAR包含a)胞外域，該胞外域包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的抗GPC3抗體部分；b)跨膜域；及c)胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗GPC3 CAR包含胞外域，該胞外域包含與SEQ ID NO: 494之N末端融合之專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的本文所述抗GPC3抗體部分。在一些實施例中，表現抗GPC3 CAR之效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 CAR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，經由靜脈內、腹膜內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，經由靜脈內途徑投藥。在一些實施例中，經由瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投藥包含在GPC3陽性疾病(諸如GPC3陽性腫瘤)位點遠側之注射位點進行局域注射。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤(亦即，經由瘤內途徑投藥)。在一些實施例中，GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤且GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 462內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 463內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 468)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 464內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 465)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸359-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 466)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識跨越位於SEQ ID NO: 460之胺基酸R358 /S359 之弗林裂解位點的抗原決定基。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分可以專一性結合至人類成熟全長GPC3 (例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560或25-580)，但不結合至人類GPC3之N末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358)或人類GPC3之C末端片段(例如SEQ ID NO: 460之胺基酸359-560或359-580)。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分(例如，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有VH 及CH 1抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一T細胞受體域(TCRD)；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有VL 及CL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 及CH 1域與第二抗原結合域之VL 及CL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組(例如，VH 及VL 對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或VH 及VL 以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)，且其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗原結合模組包含位於CH 1域中之殘基與CL 域中之殘基之間的二硫鍵。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有VH 抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一TCRD；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有VL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 域與第二抗原結合域之VL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組(例如，VH 及VL 對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力，或VH 及VL 以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3)，其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，表現抗GPC3 caTCR的效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 caTCR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，第一TCR-TM來源於天然存在之T細胞受體(諸如αβ TCR或γδ TCR)之跨膜域之一。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，經由靜脈內、腹膜內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，經由靜脈內途徑投藥。在一些實施例中，經由瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投藥包含在GPC3陽性疾病(諸如GPC3陽性腫瘤)位點遠側之注射位點進行局域注射。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤(亦即，經由瘤內途徑投藥)。在一些實施例中，GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤且GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL ；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至nGPC3的抗nGPC3抗體部分；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同nGPC3抗原決定基的抗nGPC3抗體部分；b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的第一抗原結合域及CH 1抗體域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一T細胞受體域(TCRD)；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的第二抗原結合域及CL 抗體域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 及CH 1域與第二抗原結合域之VL 及CL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組，且其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗原結合模組包含位於CH 1域中之殘基與CL 域中之殘基之間的二硫鍵。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一TCRD；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 域與第二抗原結合域之VL 域形成專一性結合至與細胞表面結合之GPC3的抗原結合模組，其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗GPC3 caTCR包含兩條含有胺基酸序列SEQ ID NO: 492及SEQ ID NO: 493的多肽鏈。在一些實施例中，表現抗GPC3 caTCR的效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 caTCR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，第一TCR-TM來源於天然存在之T細胞受體(諸如αβ TCR或γδ TCR)之跨膜域之一。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，經由靜脈內、腹膜內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，經由靜脈內途徑投藥。在一些實施例中，經由瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投藥包含在GPC3陽性疾病(諸如GPC3陽性腫瘤)位點遠側之注射位點進行局域注射。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤(亦即，經由瘤內途徑投藥)。在一些實施例中，GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤且GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3 (諸如約1、2或3中之任一者)個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5 (諸如約1、2、3、4或5中之任一者)個胺基酸取代的其變異體；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3，及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ，及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL ；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病(例如HCC)的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分，該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR；以及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗GPC3抗體部分；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含a)抗原結合模組，該抗原結合模組包含與本文所述之任一種抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的抗GPC3抗體部分；及b) T細胞受體模組(TCRM)，該T細胞受體模組包含含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之一跨膜域之第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有來源於天然存在之TCR (諸如αβTCR或γδTCR)之另一跨膜域之第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進至少一種TCR相關信號傳導分子(諸如CD3δε、CD3γε及/或ζζ)的募集，且其中該抗體部分係連接至第一及/或第二TCRD。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的第一抗原結合域及CH 1抗體域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一T細胞受體域(TCRD)；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的第二抗原結合域及CL 抗體域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 及CH 1域與第二抗原結合域之VL 及CL 域形成專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗原結合模組，且其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，抗原結合模組包含位於CH 1域中之殘基與CL 域中之殘基之間的二硫鍵。在一些實施例中，提供一種治療個體之GPC3陽性疾病的方法，包含向個體投與有效量之包含表現抗GPC3 caTCR之效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該抗GPC3 caTCR包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 抗體域的第一抗原結合域及含有第一TCR亞單元之第一跨膜域的第一TCRD；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 抗體域的第二抗原結合域及含有第二TCR亞單元之第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原結合域之VH 域與第二抗原結合域之VL 域形成專一性結合至GPC3 (例如nGPC3及/或sGPC3)的抗原結合模組，其中第一TCRD與第二TCRD形成能夠募集至少一種TCR相關信號傳導模組的T細胞受體模組(TCRM)。在一些實施例中，表現抗GPC3 caTCR的效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 caTCR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。在一些實施例中，第一TCR-TM來源於天然存在之T細胞受體(諸如αβ TCR或γδ TCR)之跨膜域之一。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力高於對可溶性GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗nGPC3抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識可溶性GPC3。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分對可溶性GPC3的結合親和力高於對與細胞表面結合之GPC3的結合親和力。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識胺基酸序列SEQ ID NO: 461內的抗原決定基。在一些實施例中，抗sGPC3抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸510-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 467)。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分係專一性辨識與細胞表面結合之GPC3與可溶性GPC3。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為Fab或Fab'。在一些實施例中，抗GPC3抗體部分為scFv。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為HCC且治療包含預防癌症擴散，例如抑制(諸如預防)癌症轉移。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，經由靜脈內、腹膜內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，經由靜脈內途徑投藥。在一些實施例中，經由瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投藥包含在GPC3陽性疾病(諸如GPC3陽性腫瘤)位點遠側之注射位點進行局域注射。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤(亦即，經由瘤內途徑投藥)。在一些實施例中，GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，注射位點為第一GPC3陽性腫瘤且GPC3陽性疾病位點為第二GPC3陽性腫瘤。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種治療個體之轉移HCC的方法，包含向個體投與有效量之包含效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該效應細胞表現根據上述任一實施例的抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，表現抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR的效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。
在一些實施例中，提供一種抑制(諸如預防)個體HCC轉移的方法，包含向個體投與有效量之包含效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該效應細胞表現根據上述任一實施例的抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，表現抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR的效應細胞(諸如T細胞)進一步包含可操作地連接至誘導型啟動子之編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)的核酸。在一些實施例中，經由抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR傳導信號後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3雙專一性T細胞接合體)表現。在一些實施例中，誘導型啟動子為源自NFAT之啟動子，諸如源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為IL-2啟動子。
在一些實施例中，提供一種使個體中之T細胞預致敏的方法，包含向個體投與有效量之包含效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該效應細胞表現根據上述任一種抗GPC3 CAR的抗GPC3 CAR。在一些實施例中，提供一種使個體中之T細胞預致敏的方法，包含向個體投與有效量之包含效應細胞(諸如T細胞)的組合物，該效應細胞表現根據上述任一種抗GPC3 caTCRs的抗GPC3 caTCR。在一些實施例中，個體患有GPC3陽性疾病。在一些實施例中，GPC3陽性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，經由靜脈內、腹膜內或瘤內途徑投藥。在一些實施例中，經由靜脈內途徑投藥。在一些實施例中，經由瘤內途徑投藥。在一些實施例中，投與第一疾病位點遠側之注射位點。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，根據上述任一種方法，該方法進一步包含向個體投與抗原呈遞細胞或APC (諸如單核球或單核球分化之樹突狀細胞)。樹突狀細胞可以經由將單核球與專一性細胞介素一起培養而離體產生(Palucka及Banchereau,Nature Reviews Cancer 12:265-277, 2012 )。在一些實施例中，APC與效應細胞組合物同時投與。在一些實施例中，APC與效應細胞組合物並行投與。在一些實施例中，APC與效應細胞組合物依序投與。在一些實施例中，APC經由與效應細胞組合物相同之途徑投與。在一些實施例中，APC與效應細胞組合物投與相同位點。在一些實施例中，效應細胞組合物包含APC。癌症
在一些實施例中，抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)、抗GPC3 CAR細胞及抗GPC3 caTCR細胞可以適用於治療癌症。可使用本文所述之任一種方法治療的癌症包括未血管化或實質上尚未血管化之腫瘤，以及血管化腫瘤。癌症可以包含實體腫瘤。待用本發明之抗GPC3構築體、抗GPC3 CAR細胞及抗GPC3 caTCR細胞治療的癌症類型包括(但不限於)癌瘤、母細胞瘤、肉瘤、良性及惡性腫瘤，以及惡性疾病，例如肉瘤、癌瘤及黑色素瘤。亦包括成人腫瘤/癌症及兒科腫瘤/癌症。
實體腫瘤為通常不含有囊腫或液體區域之異常組織團塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。不同類型的實體腫瘤根據形成其之細胞類型命名(諸如肉瘤、癌瘤及淋巴瘤)。實體腫瘤(諸如肉瘤及癌瘤)之實例包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性疾病、胰臟癌、乳癌、肺癌(例如肺鱗狀細胞癌)、卵巢癌、卵黃囊腫瘤(內胚層竇瘤)、前列腺癌、肝細胞癌(HCC)、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓質癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝瘤、膽管癌、絨膜癌、威爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤及CNS腫瘤(諸如神經膠質瘤(諸如腦幹神經膠質瘤及混合神經膠質瘤)、神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤)星形細胞瘤、CNS淋巴瘤、胚細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經鞘瘤顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠質瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤及腦轉移瘤)。
在一些實施例中，可以藉由本發明治療的癌症為HCC。GPC3高表現於HCC及HCC細胞株中，例如HepG2、Hep3B、HT17、HuH6、HuH7及PLC/PRF/5。GPC3表現與HCC之不良預後相關。在一些實施例中，HCC為早期HCC、非轉移HCC、原發HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、轉移HCC、緩解之HCC或復發HCC。在一些實施例中，HCC為局部可切除的(亦即，腫瘤侷限於允許完全手術移除之肝臟部分)、局部不可切除的(亦即，局部腫瘤可由於所牽涉之關鍵血管結構或由於肝臟受損而不可切除)，或不可切除的(亦即，腫瘤牽涉所有肝葉及/或已擴散而牽涉其他器官(例如肺、淋巴結、骨骼)。在一些實施例中，根據TNM分類，HCC為I期腫瘤(無血管侵入之單一腫瘤)、II期腫瘤(具有血管侵入之單一腫瘤，或多個腫瘤，均不大於5 cm)、III期腫瘤(多個腫瘤，均大於5 cm，或牽涉門靜脈或肝靜脈之主要分支的腫瘤)、IV期腫瘤(具有除膽囊之外之相鄰器官的直接侵入，或內臟腹膜穿孔之腫瘤)、N1腫瘤(區域淋巴結轉移)，或M1腫瘤(遠端轉移)。在一些實施例中，根據AJCC (美國癌症聯合委員會)分期標準，HCC為T1、T2、T3或T4期HCC。在一些實施例中，HCC為肝細胞癌、HCC纖維板層變異體及混合肝細胞膽管癌中的任一者。
在一些實施例中，GPC3陽性癌症為卵黃囊腫瘤(YST，內胚層竇瘤)。在一些實施例中，GPC3陽性癌症為卵巢癌。在一些實施例中，GPC3陽性癌症為絨膜癌。在一些實施例中，GPC3陽性癌症為睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤。
YST為3歲以下兒童中最常見的睪丸腫瘤且亦稱為嬰兒胚胎性癌瘤。不同於嬰兒典型的純形式，成人YSTs通常與其他類型的生殖細胞腫瘤(特定言之，畸胎瘤及胚胎性癌瘤)組合存在。雖然純畸胎瘤通常為良性的，但YST為惡性的。
GPC3表現於小於20%的卵巢癌中，但大於60%的卵巢透明細胞癌中，表明GPC3可以代表卵巢透明細胞癌之潛在生物標記。GPC3免疫染色可以有益於診斷YST及絨膜癌。
絨膜癌為通常發生於胎盤的惡性滋養細胞癌。絨膜癌罕見地發生於除胎盤之外的原發位置；其極罕見地發生於睪丸。成人睪丸之純絨膜癌為罕見的，但代表成人中之最具侵襲性的生殖細胞腫瘤(GCT)病理學變化形式。其特徵為早期血原性及淋巴轉移性擴散。患者由於早期擴散及固有的抗癌藥物抗性而預後非常不良。
GPC3可以用作診斷黑色素瘤(尤其疾病之早期)之腫瘤標記物，因為已在＞80%黑色素瘤及黑色素細胞痣中發現GPC3 mRNA及蛋白質。
GPC3的表現亦發現於神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤細胞、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤，及不同類別的胃癌(稱為GPC3-GC)中。因此，在一些實施例中，本發明可用於治療或診斷此等GPC3陽性疾病。
癌症治療可以根據以下來評估：例如腫瘤消退、腫瘤重量或尺寸萎縮、進展時間、存活持續時間、無進展存活率、總體反應率、反應持續時間、生活品質、蛋白質表現及/或活性。可以使用測定治療功效之方法，包括例如經由放射學成像量測反應。
利用抗 GPC3 構築體診斷、偵測及成像的方法
專一性結合至GPC3 (細胞表面所結合或可溶性)的經標記之抗GPC3抗體部分及其衍生物及類似物(例如包含標記的抗GPC3免疫結合物)可用於診斷目的，以偵測、診斷或監測與GPC3之表現、異常表現及/或活性有關的疾病及/或病症，包括上述任一種疾病及病症，諸如癌症(例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌瘤或脂肪肉瘤)。舉例而言，本發明之抗GPC3抗體部分可用於原位、活體內、離體及活體外診斷分析或成像分析中。
本發明的其他實施例包括偵測樣本中之GPC3的方法，包含使樣本與本文所述之抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如包含標記的抗GPC3免疫結合物)接觸及偵測標記的存在。在一些實施例中，樣本包含細胞表面結合有GPC3的細胞。在一些實施例中，樣本包含可溶性GPC3。
本發明的其他實施例包括診斷與個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之GPC3表現或異常表現有關之疾病或病症的方法。方法包含偵測個體中之與細胞表面結合之GPC3或可溶性GPC3。在一些實施例中，提供一種診斷個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之與GPC3表現或異常表現有關之疾病或病症的方法，包含(a)將有效量的根據上述任一實施例之經標記抗GPC3抗體部分(例如包含標記的抗GPC3免疫結合物)投與個體；及(b)測定該個體中之標記含量，因此標記含量高於閥值表示個體患有GPC3陽性疾病或病症。在一些實施例中，GPC3陽性疾病或病症為癌症。在一些實施例中，癌症選自由例如以下組成之群：HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌及脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，癌症為轉移HCC，且方法進一步包含測定個體血液中之標記含量。在一些實施例中，提供一種診斷個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之轉移性肝細胞癌的方法，包含(a)向個體投與有效量的根據上述任一實施例之經標記抗GPC3抗體部分(例如包含標記之抗GPC3免疫結合物)；及(b)測定個體中之標記含量，因此標記含量高於閥值表示個體患有HCC (例如轉移HCC)。閥值可以藉由各種方法測定，包括例如根據上述診斷方法偵測患有疾病或病症之第一組個體及不患有疾病或病症之第二組個體中的標記，且臨限值設定為允許區分第一組與第二組之水準。在一些實施例中，閥值為零，且方法包含測定個體中之標記存在或不存在。在一些實施例中，方法進一步包含在步驟(a)之投與之後等待一段時間以允許經標記之抗GPC3抗體部分(例如包含標記之抗GPC3免疫結合物)優先在個體中之表現GPC3之位點(例如GPC3陽性腫瘤位點，且未結合的經標記抗GPC3抗體部分將清除)集中。在一些實施例中，方法進一步包含減去標記之背景含量。可以藉由各種方法測定背景含量，包括例如在投與經標記之抗GPC3抗體部分(例如包含標記之抗GPC3免疫結合物)之前偵測個體中之標記，或根據上述診斷方法偵測未患該疾病或病症之個體中的標記。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，提供一種診斷與個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之GPC3表現或異常表現有關之疾病或病症的方法，包含(a)使根據上述任一實施例之經標記抗GPC3抗體部分(例如包含標記的抗GPC3免疫結合物)與來源於個體的樣本(諸如全血或均質化組織)接觸；及(b)測定樣本中之與經標記抗GPC3抗體部分結合之細胞的數目，因此與經標記之抗GPC3抗體部分結合之細胞的數目值高於閥值表示個體患有疾病或病症。在一些實施例中，疾病或病症為癌症。在一些實施例中，癌症選自由例如以下組成之群：HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌及脂肪肉瘤。在一些實施例中，癌症為HCC。在一些實施例中，癌症為轉移HCC，且樣本為血液樣本(諸如全血)。在一些實施例中，癌症為轉移HCC。在一些實施例中，提供診斷個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之HCC (例如轉移HCC)的方法，包含(a)使根據上述任一實施例之經標記抗GPC3抗體部分與來源於個體之樣本(諸如全血)接觸；及(b)測定樣本中之與經標記抗GPC3抗體部分結合之細胞的數目，因此與經標記之抗GPC3抗體部分結合之細胞的數目值高於閥值表示個體患有HCC (例如轉移HCC)。閥值可以藉由各種方法測定，包括例如根據上述診斷方法測定患有疾病或病症之第一組個體及不患有疾病或病症之第二組個體中的與經標記抗GPC3抗體部分結合之細胞數目，及將臨限值設定為允許區分第一組與第二組的水準。在一些實施例中，臨限值含量為零，且方法包含測定樣本中之與經標記之抗GPC3抗體部分結合之細胞的存在或不存在。在一些實施例中，方法進一步包含減去與經標記之抗GPC3抗體部分結合之細胞的背景數目水準。背景水準可以藉由各種方法測定，包括例如在投與經標記之抗GPC3抗體部分之前測定個體中之與經標記抗GPC3抗體部分結合之細胞數目，或根據上述診斷方法測定不患有該疾病或病症之個體中之與經標記抗GPC3抗體部分結合之細胞數目。在一些實施例中，個體為人類。
利用熟習此項技術者已知的方法，可以使用本發明的抗GPC3抗體部分分析生物樣本中之GPC3含量。適合的抗體標記在此項技術中已知且包括酶標記，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115m In、113m In、112 In、111 In)、鎝(99 Tc、99m Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、釤(153 Sm)、鎦(177 Lu)、釓(159 Gd)、鉕(149 Pm)、鑭(140 La)、鐿(175 Yb)、鈥(166 Ho)、釔(90 Y)、鈧(47 Sc)、錸(186 Re、188 Re)、鐠(142 Pr)、銠(105 Rh)及釕(97 Ru)；魯米諾(luminol)；螢光標記，諸如螢光素及若丹明；及生物素。
可以對本發明的經標記抗GPC3抗體部分(例如包含標記的抗GPC3免疫結合物)應用此項技術中已知的技術。此類技術包括(但不限於)使用雙官能結合劑(參見例如美國專利第5,756,065號；第5,714,631號；第5,696,239號；第5,652,361號；第5,505,931號；第5,489,425號；第5,435,990號；第5,428,139號；第5,342,604號；第5,274,119號；第4,994,560號；及第5,808,003號)。除上述分析以外，熟習此項技術者可使用各種活體內及離體分析。舉例而言，可以將個體體內之細胞暴露於視情況經可偵測標記(例如放射性同位素)標記之抗GPC3抗體部分，且可以例如藉由外部放射性掃描或藉由分析來源於先前暴露於抗GPC3抗體部分之個體的樣本(例如活體組織切片或其他生物樣本)來評估抗GPC3抗體部分對細胞之結合。製品及套組
在本發明的一些實施例中，提供一種含有適用於治療GPC3陽性疾病之材料的製品，該疾病諸如癌症(例如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌瘤或脂肪肉瘤)，用於將抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)遞送至表面上表現GPC3之細胞，或用於分離或偵測細胞表面上表現GPC3之細胞，或用於分離或偵測個體中之可溶性GPC3。製品可以包含容器及附於或系連於容器之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑料)形成。一般而言，容器容納有效治療本文所述疾病或病症之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗GPC3構築體。標籤或藥品說明書指示該組合物用於治療特定病狀。標籤或藥品說明書將進一步包含向患者投與抗GPC3構築體組合物之說明。亦涵蓋包含本文所述之組合療法的製品及套組。
藥品說明書係指市售治療產品封裝中通常所包括之說明書，其含有關於適應症、使用、劑量、投與、與此類治療產品之使用有關之禁忌及/或警告的資訊。在一些實施例中，藥品說明書指示組合物用於治療癌症(諸如HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌或脂肪肉瘤)。
另外，製品可以進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可以進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
亦提供適用於各種目的之套組，例如用於治療本文所述之GPC3陽性疾病或病症，用於遞送抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體)至表面上表現GPC3之細胞，或用於分離或偵測細胞表面上表現GPC3之細胞，或用於分離或偵測個體中之可溶性GPC3，視情況與製品組合。本發明之套組包括一或多個容器，該等容器包含抗GPC3構築體組合物(或單位劑型及/或製品)，且在一些實施例中，進一步包含根據本文所述任一種方法的另一藥劑(諸如本文所述之藥劑)及/或使用說明書。套組可以進一步包含選擇適於治療之個體的說明。本發明套組中供應之說明書典型地為標籤或藥品說明書(例如，套組中包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀指令(例如，磁性或光學儲存盤上承載的指令)亦為可接受的。
舉例而言，在一些實施例中，套組包含含有抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3 scFv、全長抗GPC3抗體、多專一性抗GPC3分子(諸如雙專一性抗GPC3抗體)或抗GPC3免疫結合物)的組合物。在一些實施例中，套組包含a)含有抗GPC3構築體之組合物，及b)有效量的至少一種其他藥劑，其中該其他藥劑增強抗GPC3構築體之作用(例如治療效果、偵測效果)。在一些實施例中，套組包含a)包含抗GPC3構築體之組合物，及b)向個體投與抗GPC3構築體組合物以治療GPC3陽性疾病(諸如HCC)的說明書。在一些實施例中，套組包含a)含有抗GPC3構築體的組合物；b)有效量的至少一種其他藥劑，其中該其他藥劑增強抗GPC3構築體之效果(例如治療效果、偵測效果)；及c)用於將抗GPC3構築體組合物及其他藥劑投與個體以便治療GPC3陽性疾病(諸如HCC)的說明書。抗GPC3構築體及其他藥劑可存在於分開的容器或單一容器中。舉例而言，套組可以包含一種不同的組合物或兩種或超過兩種組合物，其中一種組合物包含抗GPC3構築體且另一組合物包含另一藥劑。
在一些實施例中，套組包含a)包含抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3 scFv、全長抗GPC3抗體、多專一性抗GPC3分子(諸如雙專一性抗GPC3抗體)，或抗GPC3免疫結合物)的組合物，及b)關於將抗GPC3構築體與細胞(諸如效應細胞，例如來源於個體的免疫細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)組合而形成包含抗GPC3構築體/細胞結合物之組合物且將抗GPC3構築體/細胞結合物組合物投與個體以治療GPC3陽性疾病(諸如HCC)的說明書。在一些實施例中，套組包含a)含有抗GPC3構築體的組合物，及b)細胞(諸如細胞毒性細胞，例如細胞毒性T細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)。在一些實施例中，套組包含a)含有抗GPC3構築體的組合物；b)細胞(諸如細胞毒性細胞，例如細胞毒性T細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)；及c)關於將抗GPC3構築體與細胞組合而形成包含抗GPC3構築體/細胞結合物之組合物及將抗GPC3構築體/細胞結合物組合物投與個體以治療GPC3陽性疾病(諸如HCC)的說明書。在一些實施例中，套組包含含有抗GPC3構築體與細胞(諸如細胞毒性細胞，例如細胞毒性T細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)結合之組合物。在一些實施例中，套組包含a)含有抗GPC3構築體與細胞(諸如細胞毒性細胞，例如細胞毒性T細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)結合之組合物，及b)關於將組合物投與個體以治療GPC3陽性疾病(諸如HCC)的說明書。在一些實施例中，結合為抗GPC3構築體結合至細胞表面上之分子。在一些實施例中，結合為抗GPC3構築體(例如抗GPC3 CAR、抗GPC3 caTCR)的一部分插入細胞之外膜中。
在一些實施例中，套組包含編碼抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3 scFv、全長抗GPC3抗體、多專一性抗GPC3分子(諸如雙專一性抗GPC3抗體)、抗GPC3 CAR、抗GPC3caTCR或抗GPC3免疫結合物)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，套組包含a)編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)，及b)表現核酸(或一組核酸)的宿主細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)。在一些實施例中，套組包含a)編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)；及b)關於以下之說明書：i)在宿主細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)中表現抗GPC3構築體；ii)製備包含抗GPC3構築體或表現抗GPC3構築體之宿主細胞的組合物；及iii)向個體投與包含抗GPC3構築體或表現抗GPC3構築體之宿主細胞的組合物以治療GPC3陽性疾病，諸如HCC。在一些實施例中，宿主細胞來源於個體。在一些實施例中，套組包含a)編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)；b)宿主細胞(諸如效應細胞，例如T細胞、CAR-T細胞或caTCR-T細胞)以表現核酸(或一組核酸)；及c)關於以下之說明書：i)在宿主細胞中表現抗GPC3構築體，ii)製備包含抗GPC3構築體或表現抗GPC3構築體之宿主細胞的組合物，及iii)向個體投與包含抗GPC3構築體或表現抗GPC3構築體之宿主細胞的組合物以治療GPC3陽性疾病，諸如HCC。在一些實施例中，抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分之表現為可誘導性。在一些實施例中，編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)處於誘導型啟動子的控制下。在一些實施例中，經由效應細胞上之信號傳導受體(例如TCR、CAR、caTCR)發生信號傳導後，可誘導效應細胞(例如T細胞、CAR-T細胞、caTCR T細胞)表現抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分。舉例而言，在一些實施例中，根據套組說明書將編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)引入CAR-T細胞中且將包含抗GPC3構築體或表現抗GPC3構築體之宿主細胞的組合物引入患有GPC3陽性疾病之個體後，編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)處於誘導型啟動子的控制下，該(等)誘導型啟動子對經由CAR-T細胞上之CAR發生的信號傳導有反應。在一些實施例中，根據套組說明書將編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)引入caTCR-T細胞且將包含抗GPC3構築體或表現抗GPC3構築體之宿主細胞的組合物引入患有GPC3陽性疾病之個體後，編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)處於回應於caTCR-T細胞上之caTCR之信號傳導之誘導型啟動子的控制下。在一些實施例中，編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)可操作地連接至源自NFAT之啟動子。在一些實施例中，源自NFAT之啟動子為源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，編碼抗GPC3構築體(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)或其多肽部分的核酸(或一組核酸)可操作地連接至IL-2啟動子。
在一些實施例中，套組包含編碼抗GPC3 CAR之核酸。在一些實施例中，套組包含含有編碼抗GPC3 CAR之核酸的載體。在一些實施例中，套組包含a)含有編碼抗GPC3 CAR之核酸的載體；及b)關於以下之說明書：i)將載體引入效應細胞(諸如來源於個體之T細胞)中，ii)製備包含抗GPC3 CAR效應細胞之組合物，及iii)向個體投與抗GPC3 CAR效應細胞組合物以治療GPC3陽性疾病(諸如HCC)。
在一些實施例中，套組包含編碼抗GPC3 CAR之第一核酸，及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之第二核酸。在一些實施例中，套組包含含有編碼抗GPC3 CAR之核酸的第一載體，及含有編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸的第二載體。在一些實施例中，套組包含含有編碼抗GPC3 CAR之第一核酸及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之第二核酸的載體。在一些實施例中，套組包含a)含有編碼抗GPC3 CAR之核酸的第一載體，及含有編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸的第二載體；及b)關於以下之說明書：i)將載體引入效應細胞，諸如來源於個體之T細胞，ii)製備包含抗GPC3 CAR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的組合物，及iii)向個體投與抗GPC3 CAR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子組合物以治療GPC3陽性疾病，諸如HCC。在一些實施例中，套組包含a)含有編碼抗GPC3 CAR之第一核酸及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之第二核酸的載體；及b)關於以下之說明書：i)將載體引入效應細胞，諸如來源於個體之T細胞，ii)製備包含抗GPC3 CAR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子之組合物，及iii)向個體投與抗GPC3 CAR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子組合物以治療GPC3陽性疾病，諸如HCC。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸處於誘導型啟動子的控制下。在一些實施例中，經由抗GPC3-CAR之信號傳導(例如在GPC3陽性疾病環境中)，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸處於源自NFAT之啟動子的控制下。在一些實施例中，源自NFAT之啟動子為源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸處於IL-2啟動子的控制下。
在一些實施例中，套組包含編碼抗GPC3 caTCR之核酸。在一些實施例中，套組包含含有編碼抗GPC3 caTCR之核酸的載體。在一些實施例中，套組包含a)含有編碼抗GPC3 caTCR之核酸的載體；及b)關於以下之說明書：i)將載體引入效應細胞，諸如來源於個體之T細胞，ii)製備包含抗GPC3 caTCR效應細胞之組合物，及iii)向個體投與抗GPC3 caTCR效應細胞以治療GPC3陽性疾病，諸如HCC。
在一些實施例中，套組包含編碼抗GPC3 caTCR之第一核酸，及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之第二核酸。在一些實施例中，套組包含含有編碼抗GPC3 caTCR之核酸的第一載體，及含有編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸的第二載體。在一些實施例中，套組包含含有編碼抗GPC3 caTCR之第一核酸及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之第二核酸的載體。在一些實施例中，套組包含a)含有編碼抗GPC3 caTCR之核酸的第一載體，及含有編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸的第二載體；及b)關於以下之說明書：i)將載體引入效應細胞，諸如來源於個體之T細胞，ii)製備包含抗GPC3 caTCR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的組合物，及iii)向個體投與抗GPC3 caTCR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子組合物以治療GPC3陽性疾病，諸如HCC。在一些實施例中，套組包含a)含有編碼抗GPC3 caTCR之第一核酸及編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之第二核酸的載體；及b)關於以下之說明書：i)將載體引入效應細胞，諸如來源於個體之T細胞，ii)製備包含抗GPC3 caTCR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子的組合物，及iii)向個體投與抗GPC3 caTCR效應細胞及多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子組合物以治療GPC3陽性疾病，諸如HCC。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸處於誘導型啟動子的控制下。在一些實施例中，經由抗GPC3 caTCR傳導信號(例如在GPC3陽性疾病環境中)後，可誘導多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)表現。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸處於源自NFAT之啟動子的控制下。在一些實施例中，源自NFAT之啟動子為源自NFAT之最小啟動子。在一些實施例中，編碼多專一性(例如雙專一性)抗GPC3分子(例如抗GPC3×CD3串聯雙scFv T細胞接合體)之核酸處於IL-2啟動子的控制下。
本發明之套組使用適合的包裝。適合的包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封的Mylar或塑膠袋)及其類似物。套組可視情況提供諸如緩衝液之額外組分及說明性資訊。本申請案因此亦提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶子、罐、可撓性包裝及其類似物。
與抗GPC3構築體組合物之使用相關的說明書通常包括關於預期療法之劑量、給藥時程及投藥途徑的資訊。容器可為單位劑量、成批包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。舉例而言，可以提供含有足夠劑量之如本文所揭示之抗GPC3構築體(諸如分離之抗GPC3構築體，例如抗GPC3 scFv、全長抗GPC3抗體、多專一性抗GPC3分子(諸如雙專一性抗GPC3抗體)、抗GPC3 CAR、抗GPC3 caTCR或抗GPC3免疫結合物)的套組，以向個體提供延長時間的有效治療，諸如一週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2週、3週、4週、6週、8週、3個月、4個月、5個月、7個月、8個月、9個月或超過9個月中之任一者。套組亦可包括多個單位劑量的抗GPC3構築體及醫藥組合物及使用說明書，其包裝量足以在藥房(例如醫院藥房及複合藥房)中儲存及使用。
熟習此項技術者將認識到，在本發明之範疇及精神內，若干實施例為可能的。現將參照下列非限制性實例來更詳細地描述本發明。以下實施例進一步說明本發明，但當然不應理解為以任何方式限制其範疇。例示性實施例
實施例1. 一種分離的抗磷脂肌醇蛋白聚醣3 (GPC3)構築體，包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分。
實施例2. 如實施例1之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。
實施例3. 如實施例2之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗GPC3構築體相對於與細胞表面結合之GPC3的Kd 為約0.1 nM至約2 nM。
實施例4. 如實施例2或3之經分離之抗GPC3構築體，其中可溶性GPC3競爭結合該抗GPC3構築體與與細胞表面結合之該GPC3的IC50為約1 µg/ml至約100 µg/ml。
實施例5. 如實施例1之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分以低結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以高結合親和力結合至可溶性GPC3。
實施例6. 如實施例5之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗GPC3構築體相對於與細胞表面結合之GPC3的Kd 為約10 nM至約100 nM。
實施例7. 如實施例5或6之經分離之抗GPC3構築體，其中可溶性GPC3競爭結合該抗GPC3構築體與與細胞表面結合之該GPC3的IC50為約0.01 µg/ml至約1 µg/ml。
實施例8. 如實施例3-7中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中與細胞表面結合之該GPC3為HepG2細胞上所表現的GPC3。
實施例9. 如實施例1-8中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中與細胞表面結合之該GPC3包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460或SEQ ID NO: 462。
實施例10. 如實施例1-9中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該可溶性GPC3包含胺基酸序列SEQ ID NO: 461或SEQ ID NO: 463。
實施例11. 如實施例1-10中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460之人類GPC3內的抗原決定基。
實施例12. 如實施例11之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸1-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 461)。
實施例13. 如實施例11之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸25-580內的抗原決定基(SEQ ID NO: 462)。
實施例14. 如11或12實施例之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸25-560內的抗原決定基(SEQ ID NO: 463)。
實施例15. 如實施例1-15中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識GPC3之N末端片段內的抗原決定基。
實施例16. 如實施例15之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識SEQ ID NO: 460之胺基酸25-358內的抗原決定基(SEQ ID NO: 464)。
實施例17. 如實施例1-15中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識GPC3之C末端片段內的抗原決定基。
實施例18. 如實施例17之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。
實施例19. 如實施例1-18中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分不與GC33競爭性地專一性結合至相同或基本上相同的GPC3抗原決定基。
實施例20. 如19實施例之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分不結合至SEQ ID NO: 460之胺基酸524-565內的抗原決定基(SEQ ID NO: 536)。
實施例21. 如實施例19或20之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分不結合至包含SEQ ID NO: 460之胺基酸524-565的片段(SEQ ID NO: 536)。
實施例22. 如實施例1-21中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該GPC3表現於選自由以下組成之群之細胞的表面上：HepG2、Hep3B、Huh7、JHH-7及293。
實施例23. 如實施例1-22中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該GPC3表現於癌細胞表面上。
實施例24. 如實施例23之經分離之抗GPC3構築體，其中該癌細胞為肝癌細胞。
實施例25. 如實施例24之經分離之抗GPC3構築體，其中該癌細胞為肝細胞癌(HCC)。
實施例26. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含：i)重鏈可變域(VH )，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中任一者的重鏈互補決定區(HC-CDR) 1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中任一者之HC-CDR2或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中任一者之HC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體；以及ii)輕鏈可變域(VL )，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中任一者之輕鏈互補決定區(LC-CDR) 1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中任一者之LC-CDR2或包含至多約3個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中任一者之LC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體。
實施例27. 如實施例26之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3。
實施例28. 如實施例26或27之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH 或與SEQ ID NO: 307-337中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL 或與SEQ ID NO: 358-388中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體。
實施例29. 如實施例28之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者的VL 。
實施例30. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中任一者之VH 的HC-CDR；及胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中任一者之VL 的LC-CDR。
實施例31. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含：i) VH，其包含SEQ ID NO: 1-31中之任一者的胺基酸序列、SEQ ID NO: 52-82中之任一者的胺基酸序列及SEQ ID NO: 103-133中之任一者的胺基酸序列；及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 154-184中之任一者的胺基酸序列、SEQ ID NO: 205-235中之任一者的胺基酸序列及SEQ ID NO: 256-286中之任一者的胺基酸序列。
實施例32. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體。
實施例33. 如實施例32之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分包含：i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3；及ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3。
實施例34. 如實施例32或33之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH 或與SEQ ID NO: 338-357中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL 或與SEQ ID NO: 389-408中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體。
實施例35. 如實施例34之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分包含：i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH ；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL 。
實施例36. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中任一者之VH 的HC-CDR；及胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中任一者之VL 的LC-CDR。
實施例37. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含：i) VH，其包含SEQ ID NO: 32-51中之任一者的胺基酸序列、SEQ ID NO: 83-102中之任一者的胺基酸序列及SEQ ID NO: 134-153中之任一者的胺基酸序列；及ii) VL ，其包含SEQ ID NO: 185-204中之任一者的胺基酸序列、SEQ ID NO: 236-255中之任一者的胺基酸序列及SEQ ID NO: 287-306中之任一者的胺基酸序列。
實施例38. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含與實施例1-37中任一者之經分離之抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至GPC3的抗體部分。
實施例39. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含與實施例1-37中任一者之經分離之抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至相同或基本上相同GPC3抗原決定基的抗體部分。
實施例40. 如實施例1-39中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中專一性辨識GPC3的該抗體部分為嵌合的、人類的、部分人類化的、完全人類化的或半合成的。
實施例41. 如實施例1-40中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中專一性辨識GPC3的該抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv (scFv)。
實施例42. 如實施例41之經分離之抗GPC3構築體，其中專一性辨識GPC3的該抗體部分為scFv。
實施例43. 如實施例41之經分離之抗GPC3構築體，其中專一性辨識GPC3的該抗體部分為Fab或Fab'。
實施例44. 如實施例1-43中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中專一性辨識GPC3的該抗體部分與Fc片段融合，視情況經由連接子融合。
實施例45. 如實施例44之經分離之抗GPC3構築體，其中該Fc片段為IgG1 Fc片段。
實施例46. 如實施例1-40及44-45中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為全長抗體。
實施例47. 如實施例1-46中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體具有單專一性。
實施例48. 如實施例1-46中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體具有多專一性。
實施例49. 如實施例48之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體具有雙專一性。
實施例50. 如實施例48或49之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為串聯scFv、雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙親和力再靶向(DART)抗體、F(ab')2、雙可變域(DVD)抗體、臼包杵型(KiH)抗體、對接及鎖定(DNL)抗體、化學交聯抗體、雜多聚體抗體或雜結合物抗體。
實施例51. 如實施例50之經分離之抗GPC3構築體，其中經分離之抗GPC3構築體為串聯scFv，該scFv包含兩個藉由肽連接子連接之scFv。
實施例52. 如實施例51之經分離之抗GPC3構築體，其中該肽連接子包含胺基酸序列TSGGGGS (SEQ ID NO: 474)。
實施例53. 如實施例48-52中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體進一步包含專一性辨識第二抗原的第二抗體部分。
實施例54. 如實施例53之經分離之抗GPC3構築體，其中第二抗原為T細胞表面上之抗原。
實施例55. 如實施例54之經分離之抗GPC3構築體，其中該第二抗原選自由以下組成之群：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。
實施例56. 如實施例55之經分離之抗GPC3構築體，其中該第二抗原為CD3ε。
實施例57. 如實施例56之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為串聯scFv，該串聯scFv包含專一性辨識GPC3的N末端scFv及專一性辨識CD3ε的C末端scFv。
實施例58. 如實施例53之經分離之抗GPC3構築體，其中該第二抗原為B細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或嗜中性球之表面上的抗原。
實施例59. 如實施例1-43中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含：(a)含有該抗體部分的胞外域；(b)跨膜域；及(c)胞內信號傳導域。
實施例60. 如實施例59之經分離之抗GPC3構築體，其中該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。
實施例61. 如實施例1-43中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體(caTCR)，該嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體包含：(a)含有該抗體部分的胞外域；及(b) T細胞受體模組(TCRM)，其包含含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM的第二TCRD，其中該TCRM促進募集至少一種TCR相關信號傳導分子。
實施例62. 如實施例61之經分離之抗GPC3構築體，其中該第一TCR-TM來源於天然存在之第一TCR之一跨膜域且第二TCR-TM來源於天然存在之第一TCR的另一跨膜域。
實施例63. 如實施例61之經分離之抗GPC3構築體，其中TCR-TM中之至少一者為非天然存在的。
實施例64. 如實施例63之經分離之抗GPC3構築體，其中相較於包含天然存在之第一T細胞受體跨膜域的TCRM，該TCRM增強募集至少一種TCR相關信號傳導分子。
實施例65. 如實施例62之經分離之抗GPC3構築體，其中天然存在之該第一TCR為γ/δ TCR。
實施例66. 如實施例62之經分離之抗GPC3構築體，其中天然存在之該第一TCR為α/β TCR。
實施例67. 如實施例61-66中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中該TCR相關信號傳導分子選自由CD3δε、CD3γε及ζζ組成之群。
實施例68. 如實施例1至58中任一者之經分離之抗GPC3構築體，其中經分離之抗GPC3構築體為包含抗體部分及效應分子之免疫結合物。
實施例69. 如實施例68之經分離之抗GPC3構築體，其中效應分子為選自由以下組成之群的治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。
實施例70. 如實施例69之經分離之抗GPC3構築體，其中該治療劑為藥物或毒素。
實施例71. 如實施例68之經分離之抗GPC3構築體，其中效應分子為標記。
實施例72. 一種經分離之核酸，其編碼如實施例1-71中任一者之經分離之抗GPC3構築體。
實施例73. 一種載體，其包含如實施例72之經分離之核酸。
實施例74. 一種經分離之宿主細胞，其包含如實施例1-71中任一者之抗GPC3構築體、如實施例72之經分離之核酸或73之載體。
實施例75. 一種效應細胞，其表現如實施例53至67中任一者之經分離之抗GPC3構築體。
實施例76. 如實施例75之效應細胞，其中該效應細胞為T細胞。
實施例77. 如實施例76之效應細胞，其中該T細胞係選自由細胞毒性T細胞、輔助T細胞及自然殺手T細胞組成之群。
實施例78. 如實施例75-77中任一者之效應細胞，其中該抗GPC3構築體之表現係藉由該效應細胞之活化來誘導。
實施例79. 如實施例75-78中任一者之效應細胞，其中該效應細胞進一步包含嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體(caTCR)。
實施例80. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1-71中任一者之經分離之抗GPC3構築體或如實施例75-79中任一者之效應細胞，及醫藥學上可接受之載劑。
實施例81. 一種套組，其包含如實施例1-71中任一者之經分離之抗GPC3構築體、如實施例72之經分離之核酸、如實施例73之載體、如實施例74之經分離之宿主細胞、如實施例75-79中任一者之效應細胞，或如實施例80之醫藥組合物。
實施例82. 一種偵測樣本中之GPC3的方法，包含使該樣本與如實施例71之經分離之抗GPC3構築體接觸及偵測該標記之存在。
實施例83. 如實施例82之方法，其中該樣本包含細胞表面結合有GPC3的細胞。
實施例84. 如實施例83之方法，其中該樣本包含可溶性GPC3。
實施例85. 一種治療患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含向該個體投與有效量之如實施例80之醫藥組合物。
實施例86. 如實施例85之方法，其中該投藥係經由靜脈內或瘤內途徑。
實施例87. 如實施例85之方法，其中該投藥位於第一疾病位點遠側之注射位點。
實施例88. 如實施例85至87中任一者之方法，進一步包含向該個體投與另一種療法。
實施例89. 一種診斷患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含：a)向該個體投與有效量之如實施例71之經分離之抗GPC3構築體；及b)測定該個體中之標記含量，其中該標記含量高於閥值表示該個體患有該GPC3陽性疾病。
實施例90. 一種診斷患有GPC3陽性疾病之個體的方法，包含：a)使來源於該個體的樣本與如實施例71之經分離之抗GPC3構築體接觸；及b)測定該樣本中之與該經分離之抗GPC3構築體結合之細胞的數目，其中與該經分離之抗GPC3構築體結合之細胞的數目值高於閥值表示該個體患有該GPC3陽性疾病。
實施例91. 如實施例85-90中任一者之方法，其中該GPC3陽性疾病為癌症。
實施例92. 如實施例91所述之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌及脂肪肉瘤。
實施例93. 如實施例92之方法，其中該癌症為HCC。
實施例94. 如實施例93之方法，其中該癌症為轉移HCC。
實施例95. 一種產生經分離之抗GPC3構築體的方法，包含：(a)在有效表現該抗GPC3構築體的條件下培養包含如實施例72之經分離之核酸或如實施例73之載體的宿主細胞或如實施例74之經分離之宿主細胞；及(b)自該宿主細胞獲得該經表現之抗GPC3構築體。
實施例96. 如實施例95之方法，其中步驟(a)進一步包含產生包含該經分離之核酸或該載體的宿主細胞。實例 材料及方法
細胞株HepG2及SK-Hep1獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)。HepG2為人類肝細胞癌細胞株(ATCC HB-8065)。SK-Hep1為肝臟內皮細胞腺癌細胞株(ATCC HTB-52)。細胞株在補充有10% FBS之RPMI 1640或DMEM中，在37℃/5% CO2 下培養。
經FITC標記之抗其抗體購自Thermo Fisher Scientific (目錄號MA1-81891)，用於偵測本文所述之雙專一性抗GPC3 T細胞接合體抗體，該抗體在C末端具有6×His標籤。
GC33為來源於經人類C末端GPC3片段免疫之小鼠的單株抗體，該片段由胺基酸524-565組成(Ishiguro等人, Cancer Res 2008; 68:9832-9838)。圖7B中所用的GC33抗體購自Roche Diagnostics (目錄號790-4564)。重組人類 GPC3 片段的產生
重組人類GPC3(560) 蛋白質包含人類全長GPC3前驅蛋白之胺基酸1-560 (SEQ ID NO: 461)，該重組蛋白質包含缺乏GPI錨點之人類GPC3的胞外域且另外在其C末端與6×His標籤融合。重組人類GPC3(560) 蛋白質由慢病毒載體pCDH EF1-MCS (System Biosciences)表現。
生物素標記之GPC3(560) (bt-GPC3(560) )係根據標準方案(Altman, J.D.及Davis, M.M.,Current Protocols in Immunology 17.3.1-17.3.33, 2003)製備。簡言之，使編碼BirA受質肽(BSP)的DNA連接至重組人類GPC3(560) 蛋白質(SEQ ID NO: 461)之C末端且選殖入載體pET-27b中，在大腸桿菌BL21細胞中轉型，接著以包涵體形式自細菌培養物中分離。GPC3(560) -BSP蛋白質藉由超濾加以濃縮且經由尺寸排阻層析法進一步純化。GPC3(560) -BSP肽接著經由BirA介導之酶反應進行生物素標記且隨後藉由高解析度陰離子交換層析法加以純化。
GPC3-51聚體片段代表人類全長GPC3前驅蛋白之胺基酸510-560 (SEQ ID NO: 467)，此肽及此肽之生物素標記形式係由Elim Biopharmaceuticals合成。SK-Hep1-GPC3 細胞的產生
過度表現GPC3蛋白質的SK-Hep1細胞係由Eureka Therapeutics利用攜載於慢病毒載體(pCDH EF1-MCS，System Biosciences)的人類全長GPC3 (SEQ ID NO: 460)製得，在本文中稱為「SK-Hep1-GPC3」。HepG2 GPC3 基因剔除 (HepG2-GPC3-KO) 細胞的產生
HepG2 GPC3基因剔除細胞株HepG2-GPC3-KO-2、KO-3及KO-11係利用如所述的市售CRISPR-Cas9載體(lentiCRISPR-V2, OriGene; Sanjana等人, Nat Methods. 2014; 11:783-784)產生。將GPC3專一性嚮導RNA (gRNA)序列選殖入lentiCRISPR-V2主鏈中且使用載體將Stb13細菌轉型。對陽性純系測序且轉染至HEK 293FT細胞中以產生GPC3-CRISPR慢病毒。感染HepG2細胞且選擇培養2週且藉由FACS分析量測GPC3表現。FACS 分析
使用市售小鼠抗人類GPC3抗體(1G12，Santa Cruz Biotech sc-65443)進行FACS，該抗體結合至GPC3之C末端部分。50 μl IG12抗體在PBS加5% FBS中稀釋50、100及200倍且在4℃與GPC3+ HepG2細胞培育一小時。細胞在PBS中洗滌且添加1:200於PBS + 5% FBS中稀釋之與PE結合之小鼠抗IgG二級抗體(Vector Labs #EI-2007)且在黑暗中、在4℃另培育30分鐘。細胞用PBS洗滌兩次且固定。
FACS分析結果概述於圖8中。所產生的所有13種HepG2-GPC3-KO細胞株對於抗hGPC3抗體(1G12)結合呈陰性，證明HepG2細胞中之GPC3表現被成功剔除。測序分析進一步證實HepG2-GPC3-KO細胞株KO#2、KO#3及KO#11呈GPC3陰性。在13種HepG2-GPC3-KO細胞株中，使用HepG2-GPC3-KO-2、HepG2-GPC3-KO-3及HepG2-GPC3-KO-11細胞株進行進一步研究。噬菌體呈現文庫之淘選
藉由淘選來篩選出Eureka Therapeutics E-ALPHATM 噬菌體文庫(人類scFv噬菌體文庫)中的GPC3反應性噬菌體純系。利用以下試劑對噬菌體純系進行分離及FACS分析：小鼠抗M13 mAb (Thermo Fisher Scientific (#MA1-12900)、PE-抗小鼠IgG (Vector Labs (#EI-2007)及固定緩衝液(Biolegend #420801)。對照小鼠抗GPC3抗體(純系1G12)購自Santa Cruz Biotech (#SC-65443)。ELISA 淘選
在塗有抗生蛋白鏈菌素之96孔盤中進行ELISA淘選，用經生物素標記之GPC3肽標靶(bt-GPC3(560) 或bt-GPC3-51聚體)阻斷且塗佈，接著與噬菌體文庫一起培育(人類scFv表現於噬菌體衣殼上)。洗掉未結合之噬菌體之後，將所結合之噬菌體溶離，擴增且在若干輪選擇過程中再淘選。接著篩選出結合至表現GPC3之HepG2細胞的ELISA淘選純系。珠粒淘選
對塗有抗生蛋白鏈菌素及bt-GPC3-51聚體肽的DYNABEADS® 進行珠粒淘選。添加噬菌體文庫用於培育。洗掉未結合之噬菌體之後，珠粒結合之噬菌體用胰蛋白酶溶離且進行若干輪珠粒-GPC3-51聚體培育、洗滌及溶離。進一步測試結合至GPC3+ HepG2細胞及GPC3- HepG2-GPC3-KO細胞的陽性噬菌體純系。細胞淘選
藉由將噬菌體純系與表現GPC3之SK-Hep1-GPC3細胞在懸浮液中一起培育來進行細胞淘選。藉由洗滌來移除未結合的噬菌體。結合有噬菌體的細胞與小鼠抗M13抗體一起培育，隨後與PE結合之抗小鼠二級抗體一起培育，接著藉由流式細胞術證實。針對SK-Hep1-GPC3細胞選擇的噬菌體純系進一步針對GPC3+ HepG2細胞及GPC3- HepG2-GPC3-KO細胞篩選。實例 1. 產生及選擇對人類 GPC3 具有專一性之人類抗體構築體
此實例展現對人類GPC3 (hGPC3)具有專一性之人類抗體構築體之產生。特定言之，此實例展現專一性結合至人類GPC3之原生形式(與細胞表面結合之GPC3)之人類scFv的產生。本文所述之人類抗體構築體係利用由正常供者及/或自體免疫疾病供者產生的初始或半合成人類抗體文庫開發且針對與細胞表面結合之人類GPC3的原生構形、經由淘選、基於對人類GPC3之高專一性來選擇。因此，此等人類抗GPC3抗體構築體(例如抗GPC3 scFv)為構建例如全長IgG、多專一性抗GPC3抗體分子、抗GPC3 CAR或抗GPC3 caTCR提供寶貴的抗體組分來源。
用於開發抗人類GPC3構築體之例示性概述闡述於表3中。方法開始為自Eureka Therapeutics E-ALPHATM 噬菌體文庫中鑑別出人類GPC3專一性及生物活性抗體構築體。
利用一組在Eureka Therapeutics構建的人類scFv抗體噬菌體呈現文庫(多樣性 = 10×1010 )(商標為E-ALPHATM 噬菌體文庫)選擇對人類GPC3具有專一性之人類抗體構築體(例如scFv)。E-ALPHATM 噬菌體文庫包括包含完全初始人類重鏈及輕鏈譜系的初始文庫，以及含有完全初始人類輕鏈譜系及重鏈CDR3區域完全隨機化之半合成重鏈的半合成文庫。將初始抗體譜系選殖於健康供者之PBMC及脾中或自體免疫疾病(諸如全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎)供者之PBMC中。針對與細胞表面結合之 GPC3 (GPC3A) 的 淘選策略及噬菌體文庫篩選 針對 GPC3+ 細胞的淘選
針對人類GPC3如下篩選(淘選)E-APLPHATM scFv噬菌體文庫：與重組GPC3表現SK-Hep1細胞(SK-Hep1-GPC3)共培育，接著根據對GPC3+ HepG2細胞的結合來確認，兩者均使用流式細胞術(參見方法)。將0.2百萬個SK-Hep1-GPC3細胞與噬菌體文庫(約1×107 溶菌斑形成單位)在4℃共培育1小時。細胞/噬菌體混合物用PBST洗滌，與小鼠抗M13抗體一起在4℃培育1小時，在PBST中再次洗滌，接著在黑暗中、在4℃與PE結合之抗小鼠IgG一起培育30分鐘，且進行FACS分析。
利用相同程序，根據針對GPC3+HepG2細胞株之細胞表面hGPC3結合來進一步驗證得自初始SK-Hep1-GPC3篩選的36種陽性純系。利用FACS分析，33種噬菌體純系對GPC3+ HepG2細胞(表4)展現專一性結合。如方法中所述進行FACS。簡言之，稀釋市售小鼠抗人類GPC3抗體(1G12，Santa Cruz Biotech sc-65443)且與GPC3+ HepG2細胞一起在4℃培育一小時。細胞用PBS洗滌且添加PE結合之小鼠抗IgG二級抗體(Vector Labs #EI-2007)且在黑暗中、在4℃另培育30分鐘。接著用PBS洗滌細胞且固定。對14種例示性GPC3+ HepG2結合純系的FACS分析展示於圖1A-1G中，表明對與細胞表面結合之GPC3的結合強。亦使用輔助噬菌體與GPC3+ HepG2細胞一起培育，充當對照。
進一步測試得自GPC3A篩選的噬菌體純系對Eureka Therapeutics所製得之GPC3基因剔除細胞株HepG2-GPC3-KO-2及HepG2-GPC3-KO-3 (參見方法中之「HepG2 GPC3基因剔除(HepG2-GPC3-KO)細胞的產生」)的結合。在根據對GPC3+ HepG2細胞株之結合所鑑別的33種純系中，五種純系(GPC3A-34、37、38、58及62)展示對HepG2-GPC3-KO細胞株(HepG2-GPC3-KO-2及HepG2-GPC3-KO-3)的結合很少或無結合，證明其對GPC3陽性細胞結合具有高專一性。FACS分析例示於圖2A-2F中：GPC3A-39 (圖2A)、GPC3A-46 (圖2B)、GPC3A-56 (圖2C)及GPC3A-64 (圖2E)展示對GPC3+ HepG2細胞株的結合顯著，及對HepG2-GPC3-KO細胞株之結合水準相對較低；而GPC3A-58 (圖2D)展現對GPC3+ HepG2細胞株的結合水準高及對HepG2-GPC3-KO細胞株的結合幾乎沒有。幾種純系展示對GPC3+ HepG2與HepG2-GPC3-KO細胞株的結合水準均較高(資料未展示)。
藉由ELISA測試GPC3A噬菌體純系對可溶性GPC3的結合。使用三種形式的經生物素標記之可溶性GPC3蛋白(GPC3(560) ，R&D Systems GPC3蛋白[目錄號2119-GP-0505]及GPC3-51聚體)塗佈如所述的96孔ELISA盤(參見方法)。所有純系均能夠結合GPC3(560) 及GPC3 (R&D Systems)，其中純系GPC3A-37、GPC3A-42、GPC3A-43及GPC3A-47顯示對GPC3(560) 的結合最小及對GPC3-51聚體無結合(資料未展示)。 使用 51 聚體 GPC3 片段 (GPC3B) 的 淘選策略及噬菌體文庫篩選
另一方面，利用經生物素標記之C末端51聚體hGPC3片段(bt-GPC3-51聚體，參見方法)實施三種類型的噬菌體文庫淘選。此篩選策略稱為GPC3B且概述於表4中。盤式淘選
在PBS中，以100 μl體積，使用2 ug/ml的經生物素標記之GPC3-51聚體片段(參見方法)進行盤式淘選篩選且添加至經抗生蛋白鏈菌素塗佈的96孔ELISA盤中，允許在4℃培育隔夜。培養盤在室溫下用含有5%無脂乳粉(NFDM)的PBS阻斷2小時。兩次額外洗滌之後，將100 μl噬菌體文庫(效價為2×1012 pfu/ml)添加至個別孔中。測試138種噬菌體純系。培養盤在4℃培育2小時且用PBSTB洗滌6次。各孔在室溫下藉由胰蛋白酶(100 μl，1 mg/ml)溶離10分鐘。所溶離的噬菌體根據標準方法回收。進行三輪盤式淘選以根據針對hGPC3-51聚體片段的專一性噬菌體結合進行富集。利用此篩選，在138種經分離之噬菌體純系中，99種根據ELISA呈陽性且鑑別出53種獨特純系。盤式加細胞淘選
對138種經分離之噬菌體純系進行第二輪淘選篩選，其中進行兩輪盤式淘選，隨後進行一輪細胞淘選，使用SK-Hep1細胞株進行減除淘選且使用SK-Hep1-GPC3細胞株進行正向淘選。在第三輪細胞淘選中，使用約4×107 個SK-Hep1細胞、藉由在室溫下共培育2小時而對各種噬菌體文庫進行減除淘選。使用約1×107 個SK-Hep1-GPC3細胞，亦藉由在4℃共培育2小時而對各噬菌體文庫進行正向淘選。細胞/噬菌體混合物在含10% FBS的PBS中洗滌4次且用單獨的PBS洗滌兩次。專一性結合的噬菌體在室溫下用胰蛋白酶(1 ml，1 mg/ml)溶離10分鐘。溶離的噬菌體使用標準技術拯救。使用此淘選方法，自138種純系中進一步分離出14種獨特純系。珠粒淘選
亦對另外92種經分離之噬菌體純系進行珠粒淘選篩選。50 µl DYNABEADS® 用PBST洗滌2次且再懸浮於500 µl噬菌體文庫(效價為2×1012 pfu/ml)中。噬菌體/珠粒混合物在室溫下培育2小時以耗竭對抗生蛋白鏈菌素展示非專一性結合的噬菌體。使用相同洗滌程序製備另外50 µl DYNABEADS® 且以2.4 µg/ml再懸浮於500 μl bt-GPC3-51聚體片段/2.5% PBSM溶液中，以便在室溫下培育15分鐘，接著洗滌兩次。抽吸噬菌體文庫且與bt-GPC3-51聚體片段/珠粒混合物混合，接著在4℃培育2小時且用PBSM洗滌5-10次。結合之噬菌體在室溫下使用胰蛋白酶(400 μl，1 mg/ml)溶離10分鐘且使用標準技術拯救。進行三輪珠粒淘選以富集針對hGPC3-51聚體片段結合的GPC3專一性噬菌體。使用珠粒淘選方法分離出另外62種獨特純系。
在利用GPC3B篩選鑑別的所有此等129種獨特純系中，使用流式細胞術測試20種結合GPC3+ HepG2細胞的能力。對於陽性細胞淘選而言，將0.2百萬個GPC3+ HepG2細胞懸浮於50 μl含5% FBS之PBS及0.05% NaN3 中。對於減除淘選而言，將0.2百萬個HepG2-GPC3基因剔除細胞(HepG2-GPC3-KO-2)懸浮於50 μl含5% FBS之PBS及0.05% NaN3 中。GPC3B噬菌體及陰性對照噬菌體(輔助噬菌體)於PBS中以約1.0×1011 pfu/mL添加且在4℃培育1小時。混合物用PBST洗滌，且200倍稀釋之小鼠抗M13抗體(參見方法)於5% FBS (PBS中)及0.05% NaN3 中以100 μl體積添加且在4℃培育另一小時。混合物用PBS再次洗滌且PE-抗小鼠IgG二級抗體於100 μl含5% FBS之PBS及0.05% NaN3 中以200倍稀釋度添加且在黑暗中、在4℃培育另一小時。混合物用PBS洗滌兩次且以三倍稀釋度在固定緩衝液中、以150 μl體積固定。在所測試的20種純系中，其均未展示對HepG2-GPC3-KO-2細胞的結合。如圖3A-3D中所例示，GPC3B噬菌體純系#81、#87及#115展示對GPC3+ HepG2細胞的結合強，而GPC3B-80純系展示微弱的結合，但其均未展示對HepG2-GPC3-KO-2細胞的任何結合。
利用ELISA分析進一步測試得自GPC3B篩選之此等20種純系對經生物素標記之可溶性GPC3(560) 及GPC3-51聚體的結合(參見方法)。20種純系中有16種展示對bt-GPC3-51聚體的結合強且對可溶性bt-GPC3(560) 的結合甚至更強。3種純系展示對bt-GPC3-51聚體的結合強，但對可溶性bt-GPC3(560) 無結合。1種純系未結合任一種可溶性蛋白(資料未展示)。實例 2 .抗 GPC3 雙專一性抗體構築體 利用人類抗 GPC3 抗體產生雙專一性抗體構築體
此實例展現使用對人類GPC3具有專一性之人類scFv片段構建多專一性抗GPC3分子。特定言之，此實例展現雙專一性抗體的構建，該等雙專一性抗體具有結合人類GPC3之原生形式(細胞表面表現)的第一抗體部分(例如scFv)及結合T細胞上之CD3的第二抗體部分(例如scFv)。本文所述之此等多特異性抗GPC3分子(例如串聯雙scFv 抗GPC3T細胞接合體)可用於導引T細胞殺死表現人類GPC3的靶細胞。
雙專一性抗體(稱為「L2K」)係利用人類GPC3專一性噬菌體純系之scFv序列產生，該等噬菌體純系展示專一性細胞表面-GPC3結合及很少或不存在的GPC3-KO細胞結合(根據GPC3A與GPC3B篩選)。雙專一性抗體係利用單鏈形式構建，該單鏈形式包含位於N末端之人類GPC3專一性噬菌體純系的VL -VH scFv序列及位於C末端的抗人類CD3ε小鼠單株scFv (抗GPC3×CD3雙scFv；參見例如Brischwein, k.等人,Mol. Immunol. 43:1129-1143, 2006)。來源於GPC3A-34、GPC3B-87、GPC3A-37、GPC3A-45、GPC3A-46、GPC3A-55及GPC3A-58抗體純系的例示性抗GPC3×CD3雙scFv抗體分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 488、489及511-515。
藉由Genewiz或Genscript合成編碼抗人類GPC3 scFv及抗人類CD3ε scFv的DNA片段且使用標準重組DNA技術次選殖至哺乳動物表現載體pQD-T (Eureka Therapeutics, Inc.)中。在C末端插入六組胺酸標籤用於純化及偵測。HEK293細胞用雙專一性抗體表現載體轉染且培養七天以便產生雙專一性抗GPC3抗體。基於細胞培養物體積，利用FPLC AKTA系統的HisTrap HP管柱(GE healthcare)或His GraviTrap管柱(GE healthcare)自HEK293細胞上清液中純化雙專一性抗體。澄清HEK293細胞培養物上清液且隨低濃度的咪唑(20 mM)一起裝載至管柱上，且接著利用等度的高咪唑濃度溶離緩衝液(500 mM)溶離所結合的雙專一性抗GPC3抗體。在非還原條件下藉由凝膠電泳量測經純化之人類GPC3雙專一性抗體的分子量。在凝膠上觀測到對應於雙專一性抗GPC3抗體(抗GPC3 scFv-抗CD3 scFv)的色帶(約98 kD)為主要物種(資料未展示)。
綜合而言，此實例展現雙專一性抗GPC3分子之成功構建，該等分子具有對細胞表面上所表現之人類GPC3 (亦即原生形式)具有專一性之第一抗體部分及對CD3具有專一性之第二抗體部分。此類雙專一性分子之進一步表徵在下文描述。自GPC3A篩選選擇20種獨特純系且自GPC3B篩選選擇14種獨特純系用於產生雙專一性抗GPC3抗體且進一步表徵(表4)。抗 GPC3 雙專一性抗體 (GPC3A L2K) 對人類肝細胞癌細胞株的結合
在兩個實驗中使用人類GPC3+ HepG2細胞、GPC3-陰性SK-Hep1細胞及SK-Hep1-GPC3 (過度表現GPC3)細胞，藉由流式細胞術測試表現GPC3之HCC細胞株相對於抗GPC3雙專一性抗體的結合。
對照-L2K雙專一性抗體如上所述藉由將非GPC3結合scFv與抗人類CD3ε scFv融合而類似地產生，其中C末端插入六組胺酸標籤用於純化及偵測。此對照-L2K抗體用作陰性GPC3結合對照物。
將GPC3A L2K雙專一性抗體或對照-L2K雙專一性抗體(分別)與GPC3陰性SK-Hep1細胞及SK-Hep1-GPC3細胞一起在含有5% FBS的PBS與0.05% NaN3 中、在4℃培育1小時，最終濃度為5 μg/ml。細胞接著用PBS洗滌一次。將APC結合的抗His標籤小鼠抗體(R&D Systems)添加至經洗滌的細胞中(體積為100 μl，在含有5% FBS的PBS及0.05% NAN3 中以20倍稀釋)，且在黑暗中、在4℃培育1小時。接著用PBS洗滌細胞兩次。細胞在150 μl體積的PBS中、在3倍稀釋的固定緩衝液(BioLegend)中固定。如圖4A及4B中所示，GPC3A L2K雙專一性抗體未結合至GPC3陰性SK-Hep1細胞且良好結合至過度表現GPC3的SK-Hep1-GPC3細胞。
GPC3A L2K雙專一性抗體或對照-L2K雙專一性抗體與GPC3+ HepG2細胞一起在含有5% FBS的PBS及0.05% NaN3 中、在4℃培育1小時(最終濃度為5 μg/ml)，接著用PBS洗滌一次。添加與APC結合的抗His標籤小鼠抗體(R&D Systems)(體積為100 μl，在含有5% FBS的PBS及0.05% NAN3 中以20倍稀釋)，且在黑暗中、在4℃培育1小時，接著用PBS洗滌兩次。細胞在150 μl體積的PBS中、在3倍稀釋的固定緩衝液(BioLegend)中固定。相較於對照-L2K抗體與GPC3+ HepG2細胞之間的結合，圖5A-5B展現GPC3A L2K雙專一性抗體顯著結合至GPC3+ HepG2細胞。抗 GPC3 雙專一性抗體 (GPC3B L2K) 對人類肝細胞癌細胞株的結合
在兩個實驗中使用人類GPC3+ HepG2細胞、HepG2-GPC3-KO細胞、GPC3陰性SK-Hep1細胞及SK-Hep1-GPC3 (過度表現GPC3)細胞，藉由流式細胞術類似地測試來源於b篩選(GPC3B L2K雙專一性抗體)的抗GPC3×CD3雙scFv抗體。
GPC3B L2K雙專一性抗體或對照-L2K雙專一性抗體(分別)與GPC3陰性SK-Hep1細胞及SK-Hep1-GPC3細胞一起在含有5% FBS的PBS及0.05% NaN3 中、在4℃培育1小時，最終濃度為5 μg/ml。接著用PBS洗滌細胞一次。將APC結合的抗His標籤小鼠抗體(R&D Systems)添加至經洗滌的細胞中(體積為100 μl，在含有5% FBS的PBS及0.05% NAN3 中稀釋20倍)，且在黑暗中、在4℃培育1小時。接著用PBS洗滌細胞兩次。細胞在150 μl體積的PBS中、在3倍稀釋的固定緩衝液(BioLegend)中固定。進行FACS分析，以比較GPC3B L2K雙專一性抗體對GPC3陰性SK-Hep1細胞及過度表現GPC3之SK-Hep1-GPC3細胞的結合。展現與細胞表面結合之人類GPC3專一性的GPC3B L2K雙專一性抗體預期可展示顯著結合至SK-Hep1-GPC3細胞，及很少或不結合至GPC3陰性SK-Hep1細胞。
亦測試GPC3B L2K雙專一性抗體及對照L2K雙專一性抗體對GPC3+ HepG2細胞的結合。將兩組抗體與GPC3+ HepG2細胞一起在含有5% FBS的PBS及0.05% NaN3 中、在4℃培育1小時(最終濃度為5 μg/ml)，接著用PBS洗滌一次。添加與APC結合的抗His標籤小鼠抗體(R&D Systems)(體積為100 μl，在含有5% FBS的PBS及0.05% NAN3 中以20倍稀釋)，且在黑暗中、在4℃培育1小時，接著用PBS洗滌兩次。細胞在150 μl體積的PBS中、在3倍稀釋的固定緩衝液(BioLegend)中固定。進行FACS分析以比較GPC3B L2K雙專一性抗體及對照L2K雙專一性抗體對GPC3+ HepG2細胞的結合。展現與細胞表面結合之人類GPC3專一性的GPC3B L2K雙專一性抗體預期可展示顯著結合至GPC3+ HepG2細胞，而對於對照L2K雙專一性抗體，預期對此等細胞的結合很少或無結合。
GPC3B L2K雙專一性抗體及對照-L2K雙專一性抗體亦在含有5% FBS的PBS及0.05% NaN3 中與HepG2-GPC3-KO細胞一起在4℃培育1小時，最終濃度為5 μg/ml。細胞接著用PBS洗滌一次。將APC結合的抗His標籤小鼠抗體(R&D Systems)添加至經洗滌的細胞中(體積為100 μl，在含有5% FBS的PBS及0.05% NAN3 中稀釋20倍)，且在黑暗中、在4℃培育1小時。接著用PBS洗滌細胞兩次。細胞在150 μl體積的PBS中、在3倍稀釋的固定緩衝液(BioLegend)中固定。進行FACS分析以比較GPC3B L2K雙專一性抗體及對照IgG1同型抗體對HepG2-GPC3-KO細胞的結合。展現與細胞表面結合之人類GPC3專一性的GPC3B L2K雙專一性抗體預期可展示很少或不展示對HepG2-GPC3-KO細胞的結合，此類似於IgG1同型對照抗體。實例 3. 人類 GPC3 雙專一性抗體的表徵 與可溶性 GPC3 競爭結合至人類肝臟細胞株
在競爭性結合分析(IC50)中，使用經生物素標記之重組GPC3(560)蛋白(參見方法)，測試針對與細胞表面結合之GPC3所產生之抗體結合GPC3+ HepG2細胞的能力。將抗GPC3 L2K抗體(來源於GPC3A篩選)或對照-L2K雙專一性抗體與不同濃度的可溶性bt-GPC3 (560)蛋白預混合且在4℃培育一小時；接著添加HepG2細胞且在4℃培育混合物另一小時。以20倍稀釋度添加與APC結合之抗His抗體(R&D Systems，#IC050A)，以偵測L2K抗體結合(攜帶C末端His標籤的L2K抗體)。亦以200倍稀釋度添加抗生蛋白鏈菌素-PE (Vector Labs EI-2007)且在黑暗中、在4℃培育30分鐘以監測可溶性bt-GPC3(560)蛋白。小鼠抗GPC3抗體陽性對照物(1G12，Santa Cruz #sc-65443)在相同條件下使用PE結合之抗小鼠IgG (H+L)、用或不用可溶性bt-GPC3(560)蛋白處理。表5展示所測試之六種GPC3A L2K抗體的IC50值。所有GPC3 L2K展示的IC50值皆比抗GPC3陽性對照抗體(1G12)高得多，其中GPC3A-37及GPC3A-46展示最高值，亦即，受可溶性GPC3存在的影響最小。如自圖6可見，所有GPC3A L2K雙專一性抗體的中值螢光強度(MFI)證明對存在於HepG2細胞上之GPC3的結合顯著地強於對照-L2K雙專一性抗體及抗GPC3陽性對照抗體(1G12)。此外，在競爭分析中，大部分GPC3A L2K雙專一性抗體證明對與細胞表面結合之GPC3的專一性比可溶性bt-GPC3(560)蛋白高得多，諸如GPC3A-37及GPC3A-46純系。
類似地，在競爭性結合分析(IC50 )中，使用如上文所述的經生物素標記之重組GPC3(560) 蛋白，測試純系GPC3B-87 L2K結合至GPC3+ HepG2細胞之能力。GC33 L2K (轉化成L2K的GC33抗體)及抗CD19 L2K用作對照。簡言之，將GPC3B-87 L2K雙專一性抗體或對照-L2K雙專一性抗體與不同濃度的可溶性bt-GPC3(560) 蛋白預混合且在4℃培育一小時；添加HepG2細胞且在4℃培育混合物另一小時。以20倍稀釋度添加與APC結合之抗His標籤抗體(R&D Systems，#IC050A)，以偵測L2K抗體結合(攜帶C末端His標籤的L2K抗體)。亦以200倍稀釋度添加抗生蛋白鏈菌素-PE (Vector Labs EI-2007)且在黑暗中、在4℃培育30分鐘以監測可溶性bt-GPC3(560) 蛋白。小鼠抗GPC3抗體陽性對照物(1G12，Santa Cruz #sc-65443)在相同條件下使用PE結合之抗小鼠IgG (H+L)、用或不用可溶性bt-GPC3(560) 蛋白處理。進行FACS分析。
如圖10及表12中所示，GPC3B-87 L2K (IC50 0.12 µg/ml)及GC33 L2K (IC50 0.86 µg/ml)展示的IC50 比所測試的GPC3A L2K低得多(IC50 在1.2與4.6 µg/ml之間)。此表明相較於GPC3A L2K對細胞表面GPC3的結合，可溶性GPC3更容易淘汰GPC3B-87 L2K及GC33 L2K對細胞表面GPC3的結合。 GPC3A 及 GPC3B L2K 純系對 HepG2 細胞的結合親和力
使用人類GPC3+ HepG2細胞，藉由流式細胞術測試抗GPC3雙專一性抗體(GPC3 L2K純系)對表現GPC3之HCC細胞株的結合。
藉由將非GPC3結合scFv與抗人類CD3ε scFv融合來產生對照-L2K雙專一性抗體，其中在C末端插入六組胺酸標籤用於純化及偵測。此對照-L2K抗體(命名為ET-901 L2K)用作GPC3結合的陰性對照物。參考抗GPC3雙專一性抗體亦類似地使用GC33之scFv產生且命名為GC33 L2K。
GPC3A L2K純系(GPC3A-34 L2K、GPC3A-37 L2K、GPC3A-45 L2K、GPC3A-46 L2K、GPC3A-55 L2K及GPC3A-58 L2K)、GPC3B L2K純系(GPC3B-87 L2K)、參考物GC33 L2K雙專一性抗體或陰性對照抗CD19 L2K與GPC3陽性HepG2細胞一起在含有5% FBS的PBS及0.05% NaN3 中、在4℃培育1小時(最終濃度為5 μg/ml)，接著用PBS洗滌一次。添加與APC結合的抗His標籤小鼠抗體(R&D Systems)(體積為100 μl，在含有5% FBS的PBS及0.05% NAN3 中以20倍稀釋)，且在黑暗中、在4℃培育1小時，接著用PBS洗滌兩次。細胞在150 μl體積的PBS中、在3倍稀釋的固定緩衝液(BioLegend)中固定。作為單獨的對照，亦將HepG2細胞與APC結合之抗His標籤小鼠抗體(R&D Systems)一起在任何L2K雙專一性抗體不存在的情況下培育。圖11證明GPC3A L2K純系顯著結合至GPC3陽性HepG2細胞。
具體言之，藉由FACS分析6種GPC3A L2K雙專一性抗體純系(GPC3A-34 L2K、GPC3A-37 L2K、GPC3A-45 L2K、GPC3A-46 L2K、GPC3A-55 L2K、GPC3A-58 L2K)及1種GPC3B L2K雙專一性抗體純系(GPC3B-87 L2K)以及參考物抗GPC3 GC33 L2K，以測定其對GPC3+ HepG2細胞的結合親和力。6種GPC3A L2K純系展示0.045-0.12 µg/ml之間的EC50 ，及0.86-2.4 nm之間的表觀Kd 值。GPC3B L2K純系(GPC3B-87 L2K)展示弱得多的結合，其EC50 為4.3 µg/ml且表觀Kd 為84 nM。GC33 L2K展示0.14 µg/ml之EC50 ，及2.7 nM之表觀Kd 。相較於GC33 L2K (Kd = 2.7 nM)，所有GPC3A L2K純系展示較高的結合親和力，尤其GPC3A-37 L2K (Kd = 0.92 nM)、GPC3A-46 L2K (Kd = 1.0 nM)及GPC3A-55 L2K (Kd = 0.86 nM)(參見表13及圖11)。 T 細胞 介導細胞毒性分析
使用LDH細胞毒性分析(Promega)來分析腫瘤細胞毒性。將人類T細胞(AllCells)或來自全血之Ficoll純化細胞(Blood Centers of the Pacific)活化且用CD3/CD28 DYNABEADS® (Invitrogen)、根據製造商說明書擴增。活化T細胞在具有10% FBS加100 U/mL IL-2之RPMI1640培養基中培養及維持，且在活化後第7-14天使用。根據FACS分析，T細胞為＞99% CD3+ 。活化T細胞及靶細胞以5:1比率與雙專一性抗體(0.2 μg/ml；GPC3A L2K或GPC3B L2K)共培養16小時。藉由量測培養物上清液中的LDH活性來測定細胞毒性。
如圖7A及圖7B中所示，來源於GPC3A與GPC3B篩選的雙專一性抗GPC3×CD3抗體以人類GPC3專一性方式有效介導癌細胞的殺死。亦測試來源於經C末端人類GPC3片段免疫之小鼠(參見方法)的單株抗體GC33對GPC3的專一性殺死(圖7B)，結果表明GC33的癌細胞殺死能力不具有GPC3專一性，原因為GC33介導GPC3基因剔除細胞株HepG-GPC3-KO-2以及GPC3陽性細胞株HepG2及SK-Hep1-GPC3的殺死。另一方面，GPC3A L2K雙專一性抗體#43、#53、#58及#61 (以及其他；圖7A)及GPC3B L2K雙專一性抗體#87 (圖7B)介導GPC3陽性細胞(HepG2及SK-Hep1-GPC3)的穩定殺死，同時對GPC3陰性細胞株(SK-Hep1及HepG2-GPC3-KO細胞)無顯著作用。實例 4. 小鼠抗 hGPC3 單專一性 IgG 抗體的構建
使用表現鼠類IgG1重鏈Fc區之選殖質體及表現IgG輕鏈之質體，使用與小鼠IgG1恆定區及Fc區序列融合的GPC3A-39、46、51、56、58及64重鏈及輕鏈可變區序列(VH 及VL 分別為SEQ ID NO: 311及362、318及369、323及374、328及379、330及381、336及387)構建全長小鼠抗人類GPC3 (hGPC3)單專一性IgG抗體。所得抗體純系稱為抗GPC3 mIgG1純系A-39、A-46、A-51、A-56、A-58及A-64。例示性抗GPC3 mIgG1 A-39序列包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 505之重鏈，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 506之輕鏈。使用GPC3B純系87之重鏈及輕鏈可變區(SEQ ID NO: 350及401)及抗GPC3抗體GC33之重鏈及輕鏈可變區(SEQ ID NO: 503及504)，以相同方式構建全長GPC3B單專一性IgG抗體及全長GC33抗體且分別命名為抗GPC3 mIgG1純系B-87及抗GPC3 mIgG1-GC33。
簡言之，所選噬菌體純系之全長小鼠IgG1在HEK293及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株中產生，如(Tomimatsu, K.等人, Biosci. Biotechnol. Biochem. 73(7):1465-1469, 2009)所述(資料未展示)。GPC3純系可變區隨小鼠IgG1重鏈及輕鏈恆定區次選殖入哺乳動物表現載體中。藉由電泳在還原與非還原條件下量測純化全長IgG抗體之分子量，以測定蛋白質純度，其經計算超過95% (資料未展示)。
藉由流式細胞術測試抗GPC3 mIgG1抗體對GPC3陽性HepG2及GPC3陰性SK-Hep1細胞的結合。將10 µg/ml經構建之抗體添加至位於冰上之細胞中維持1小時。洗滌之後，添加PE結合之抗小鼠IgG (H及L)(Vector Labs#EI-2007)(在4℃、在黑暗中維持30分鐘且洗滌兩次)以偵測抗體結合。如自圖9A可見，發現所有抗GPC3 mIgG結合至GPC3陽性HepG2細胞，而二級抗體及單獨的對照抗體(對照mIgG1)確實不結合至相同細胞。抗GPC3 mIgG或對照mIgG1均不顯示結合至SK-Hep1細胞(圖9B)。使用抗GPC3 mIgG1純系B-87及mIgG-GC33抗體進行相同FACS分析。根據 ELISA ， GPC3A mIgG1 抗體針對大鼠 GPC3 之 反應性
在ELISA分析中，測試GPC3專一性及陰性對照(ET-901)小鼠嵌合IgG1對大鼠GPC3肽的結合。抗體在3倍連續稀釋下測試，自100 ng/mL開始，總計8種濃度。經生物素標記之大鼠GPC3於PBS中以100 μL體積、以2 ug/ml塗佈至抗生蛋白鏈菌素培養盤上且添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈之96孔ELISA盤中，以便在4℃培育隔夜。培養盤在室溫下用含有5%無脂乳粉(NFDM)的PBS阻斷2小時。在PBST緩衝液中以5 µg/mL復原的GPC3A mIgG1純系(A-34、A-46、A-53、A-58、A-61)中之每一者以及陰性對照ET-901 mIgG1分別與單獨的大鼠bt-GPC3塗佈孔一起在室溫下培育1小時。培養盤用PBST洗滌，且與抗小鼠Fc (Bethyl Labs #A90-131P，1:2000稀釋度)一起在室溫下培育30分鐘。用PBST洗滌之後，反應用1-STEP™ Ultra TMB-ELISA受質溶液(Thermofisher Scientific #34028)顯影且用2 N硫酸中止。相較於陰性對照抗CD19 mIgG1，5種GPC3A mIgG1純系中有4種(A-34、A-46、A-58、A-61)與大鼠bt-GPC3反應(圖12)。GPC3A-53 mIgG1純系確實不與大鼠bt-GPC3反應。在一個同時進行的實驗中，所測試的全部GPC3A mIgG1 (A-34、A-46、A-53、A-58、A-61)與人類GPC3反應(圖12)。實例 5. 抗 hGPC3 單專一性及雙專一性抗體對細胞表面及可溶性 GPC3 之結合分佈測定
此實例展現所選單專一性及雙專一性抗體之GPC3結合分佈。特定言之，此實例描述所選抗hGPC3單專一性mIgG1純系之抗原決定基結合位點表徵(如實例4中所述)。另一方面，此實例亦描述本發明之所選抗hGPC3單專一性mIgG1純系及人類抗hGPC3抗CD3雙專一性抗體(GPC3A L2K及GPC3B L2K，如實例2中所述)的結合分佈，以及純系GC33 mIgG1及雙專一性GC33-L2K對癌細胞(諸如GPC3陽性HepG2及SK-Hep1-GPC3細胞)表面上之重組人類可溶性GPC3 (亦即，人類GPC3(560) ，hGPC3之殘基1-560aa)或GPC3抗原的結合分佈。GPC3A mIgG 純系之抗原決定基結合位點表徵
進行GPC3抗原決定基分組以確定參考GC33-mIgG1及抗hGPC3單專一性mIgG1純系GPC3A-37 mIgG及GPC3A-55 mIgG是否辨識不同抗原決定基。使第一對mIgG蛋白質與GPC3發生反應以便第一mIgG佔據其在GPC3上之結合抗原決定基，隨後添加第二種不同mIgG以便確定兩種mIgG蛋白質是否結合至不同抗原決定基。簡言之，測定結合親和力且使用1:1結合位點、部分擬合模型計算結合參數。mIgG蛋白質與GPC3首次配對之後(其中該對中之一個實體固著至抗生蛋白鏈菌素生物感測器上)，生物感測器所偵測到之信號尖峰反映了第一mIgG與GPC3之間的結合，且在洗滌之後，第一對mIgG/GPC3仍結合至抗生蛋白鏈菌素塗佈盤。隨後，將第二mIgG添加至所固著之GPC3/第一mIgG對之後，另一個信號尖峰反映了第二mIgG與所固著之GPC3之間的結合，表明在與第一mIgG反應之後，第二mIgG與GPC3上暴露之未結合抗原決定基發生反應。因此，添加第二mIgG後的信號尖峰證明第一與第二mIgG結合至不同抗原決定基。相反，添加第二mIgG後的信號尖峰缺乏可以證明第一與第二mIgG結合至相同的抗原決定基。
在GPC3抗原決定基分組之線性形式中，將5 µg/mL經生物素標記之GPC3裝載至抗生蛋白鏈菌素生物感測器上。洗掉過量抗原之後，依序添加mIgG蛋白，其中添加50 µg/mL第一mIgG，隨後添加100 µg/mL第二mIgG。具體言之，首先添加50 µg/mL GC33-mIgG1，觸發信號尖峰，藉此表明GC33-mIgG1專一性結合至GPC3抗原決定基(圖13)。隨後，添加100 µg/mL GPC3A-37 mIgG或GPC3A-55 mIgG。在兩種情況下，在添加GPC3A-37 mIgG或A-55 mIgG後記錄到第二尖峰(圖13)，表明GPC3A-37 mIgG與GC33-mIgG1結合至不同抗原決定基，且GPC3A-55 mIgG與GC33-mIgG1亦結合至不同抗原決定基。
在另一實驗中，首先添加50 µg/mL GPC3A-37 mIgG，其觸發信號尖峰，藉此表明GPC3A-37 mIgG專一性結合至GPC3抗原決定基。隨後，添加100 µg/mL GPC3A-55 mIgG，其觸發第二尖峰，表明GPC3A-37 mIgG與GPC3A-55 mIgG結合至不同抗原決定基(圖13)。將上述結果組合，GC33 mIgG1、GPC3A-37 mIgG及GPC3A-55 mIgG各自結合至GPC3上之不同抗原決定基。
在GPC3抗原決定基分組之夾心形式中，mIgG蛋白質經生物素標記且以5 µg/mL固著於抗生蛋白鏈菌素生物感測器上。洗掉過量mIgG之後，將GPC3以10 µg/mL添加至所固著之抗體中且保持結合至所固著之mIgG。洗滌之後，接著以10 µg/mL添加第二mIgG且監測結合。
具體言之，GC33-mIgG、GPC3A-37 mIgG及GPC3A-55 mIgG蛋白質中之每一者(作為第一mIgG1)經生物素標記且以5 µg/mL分別固著於抗生蛋白鏈菌素生物感測器上。洗掉過量mIgG之後，將10 µg/mL GPC3添加至所固著之抗體中，觸發三種經測試之mIgG中之每一者出現尖峰，藉此表明GC33-mIgG、GPC3A-37 mIgG及GPC3A-55 mIgG中之每一者專一性結合GPC3抗原決定基。洗掉過量GPC3抗原之後，添加10 µg/mL第二mIgG (不同於第一mIgG)且監測結合。類似於抗原決定基分組之線性形式，隨後添加第二種不同mIgG觸發另一個信號尖峰(圖14)，因此表明GC33-mIgG1、GPC3A-37 mIgG及GPC3A-55 mIgG各自結合至GPC3上之不同抗原決定基。GPC3-L2K 結合至重組人類可溶性 GPC3 蛋白
藉由表面電漿子共振技術、使用BIACORETM X100儀器(GE Healthcare)及生物素捕捉套組(GE Healthcare，目錄號28-9202-33)、以單循環動力學模式、根據製造商說明書量測抗hGPC3抗hGPC3 L2K雙專一性抗體(GPC3A L2K來源於純系GPC3A-34、GPC3A-37、GPC3A-45、GPC3A-46、GPC3A-55、GPC3A-58)對經生物素標記之重組GPC3(560) (bt-GPC3(560) )的結合特性。分析中所用的全部蛋白質在使用之前均在HBS-E緩衝液中稀釋。簡言之，使5-10 µg/mL bt-GPC3(560) 固著於經捕捉試劑預功能化的感測晶片上且注射至流動池上。如下量測L2K雙專一性抗體對所固著之抗原的親和力：以30 µl/分鐘之流速注射0.3-5 mg/ml之各種雙專一性抗體，90秒結合期後為90秒解離期。每次操作結束時，使用生物素捕捉套組中所提供的試劑使感測晶片表面再生。使用1:1結合模型(BIACORETM X-100評估軟體，圖15a及15b)，藉由非線性回歸分析來確定結合常數。接著計算各種L2K純系的結合速率-k結合 、親和力常數-ka 、解離常數-kd 及平衡解離常數-Kd (表14)。 對 HepG2 (GPC3 陽性 ) 細胞的結合
測試HepG2細胞相對於抗hGPC3 mIgG1或BsAb的劑量依賴性結合。簡言之，將HepG2細胞與10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.041、0.014或0 µg/mL的抗hGPC3 mIgG1或BsAb一起在冰上培育1小時。用PBS緩衝液進行一輪短暫洗滌之後，用經二級抗體APC標記之抗His標籤抗體偵測到BsAb。用經PE標記之抗小鼠二級抗體偵測到mIgG1抗體。根據劑量依賴性曲線(MFI相對於BsAb濃度)之EC50評估抗GPC3 mIgG1或BsAb對HepG2細胞的親和力。另外，基於EC50值來確定表觀Kd 。計算本發明之mIgG1純系針對純系GC33 mIgG1之EC50 或表觀Kd 比率。亦計算本發明之BsAb純系針對純系GC33 BsAb的EC50 或表觀Kd 比率。實例 6. 抗 GPC3 嵌合抗原受體之構建及表徵
使用慢病毒CAR表現載體構建抗GPC3 CAR。將來源於抗GPC3純系(GPC3A-34、GPC3A-37、GPC3A-45、GPC3A-46、GPC3A-55、GPC3A-58及GPC3B-87；本文中稱為「GPC3A-CAR」或「GPC3B-CAR」)之scFv中之每一者移植至CAR表現載體上。亦使用來源於GC33之scFv構建GC33 CAR。各種CAR構築體包含CD28之胞內信號傳導域及CD3ζ之胞內信號傳導域。來源於GPC3A-34、GPC3A-37、GPC3A-45、GPC3A-46、GPC3A-55及GPC3A-58抗體純系之例示性CAR分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 491及516-521。
人類初始T細胞藉由在介白素-7及介白素-15存在下用CD3/CD28珠粒(DYNABEADS® ，Invitrogen)刺激一天而活化。以6之MOI將濃縮的慢病毒施加至經重組人纖維連接蛋白(Retronectin)(Takara)塗佈之6孔盤中的T細胞中維持72小時。轉導效率展示於表15中。
使用LDH細胞毒性分析對經轉導的CAR T細胞(GPC3A、GPC3B或GC33 CAR-T細胞)進行功能評估。CAR-T細胞與靶細胞(HepG2、HepG2-GPC3-KO、SK-Hep1，或SK-Hep1-GPC3)以2:1之效應子與標靶比率混合，其中每個測試孔接種100,000個靶細胞且用200,000個CAR-T細胞處理(經感染之CAR T細胞經歸一化為67% CAR陽性)。培育隔夜之後，進行LDH細胞毒性分析。
將一組七種GPC3A或GPC3B CAR以及GC33 CAR轉導至T細胞中且針對靶細胞株HepG2、HepG2-GPC3-KO、SK-Hep1及SK-Hep1-GPC3加以測試。經CAR構築體(GPC3A-CAR-37、GPC3A-CAR-45、GPC3A-CAR-46、GPC3A-CAR-55、GPC3A-CAR-58、GPC3B-CAR-87)轉導之T細胞專一性殺死GPC3陽性細胞株，諸如HepG2及SK-Hep1-GPC3 (圖16)。然而，相同CAR T細胞不能充分地辨識GPC3陰性細胞，諸如野生型SK-Hep1或HepG2-GPC3-KO。在此等LDH細胞毒性實驗中，包含GPC3A-CAR-37、GPC3A-CAR-55及GPC3A-CAR-58 CAR的CAR-T在殺死GPC3陽性靶細胞方面顯示高效率，但在非專一性殺死GPC3陰性細胞方面則較低(圖16)。
在第二批LDH細胞毒性分析中，將CAR-T細胞與靶細胞(HepG2、HepG2-GPC3-KO、SK-Hep1、SK-Hep1-GPC3、JHH-5、A498或PANC-1)以2:1效應子與標靶比率混合，其中每個測試孔接種100,000個細胞且用200,000個抗GPC3 CAR陽性T細胞處理(經感染之CAR T細胞經歸一化為37.1% CAR陽性)。CAR-T細胞之轉導效率展示於表16中。培育隔夜之後，進行LDH分析。
如圖17A及17B中所示，經CAR構築體GPC3A-CAR-37、GPC3A-CAR-45、GPC3A-CAR-46、GPC3A-CAR-55及GPC3B-CAR-87轉導之T細胞專一性殺死GPC3陽性細胞株HepG2、SK-Hep1-GPC3及JHH-5。然而，相同CAR-T細胞不能充分地辨識GPC陰性靶細胞，諸如A-498、PANC-1、野生型SK-Hep1細胞及HepG2-GPC3-KO (圖16A及16B)。此等實驗證明使用抗GPC3 GPC3A或GPC3B CAR-T在專一性靶向表現GPC3之腫瘤細胞方面而對GPC3陰性細胞無顯著影響的治療益處。實例 7. 經 抗 AFP caTCR-1 及抗 CD3/ 抗 GPC3 雙專一性抗體轉導之 T 細胞的構建及表徵
初始T細胞用編碼抗AFP caTCR (SEQ ID NO: 522及523)或抗AFP caTCR + 抗GPC3/抗CD3 BsAb (SEQ ID NO: 511)的慢病毒轉導。確定caTCR陽性細胞百分比測量結果以評估轉導效率。抗AFP caTCR處於EF1-α啟動子(SEQ ID NO: 527)的控制下且抗GPC3/抗CD3 BsAb處於源自NFAT之啟動子(SEQ ID NO: 526)的控制下，該源自NFAT之啟動子包含6個NFAT反應元件(SEQ ID NO: 524)及最小TA啟動子(SEQ ID NO: 525)。T細胞藉由與模擬T細胞混合而以指定的受體陽性百分比匹配。以2.5:1之效應子與標靶比率使用兩種細胞株：HEPG2 (AFP+/GPC3+)及HepG2-GPC3-KO (AFP+/GPC3-)。培育16小時後，使用Cytox 96非放射性細胞毒性分析(Promega)量測專一性T細胞溶解。
活體外殺死資料表明，在T細胞劑量的整個範圍內，抗GPC3/抗CD3 BsAb在經抗AFP caTCR + 抗GPC3/抗CD3 BsAb轉導之T細胞中的表現以GPC3依賴性方式使經轉導之T細胞的效能相較於經單獨抗AFP caTCR轉導的T細胞增強(圖18)。展現細胞毒性效能增強的反應亦展示細胞介素(IFNγ、TNFα及IL-2)之釋放量增加(圖19)。因此，經誘導之抗GPC3/抗CD3 BsAb表現使T細胞之效能及細胞介素產生增強。
除抗AFP caTCR T細胞毒性之外，為了直接量測抗原所誘導之抗GPC3/抗CD3 BsAb之細胞毒性，吾等使用具有BsAb滲透膜的跨孔。將2.5×105 個SK-HEP1-GPC3 (GPC3+ )或SK-HEP1 (GPC3- )腫瘤細胞及4×106 個受體陰性「模擬」T細胞一起接種於下部腔室中。將2.5×105 個經抗AFP caTCR轉染之T細胞隨2.5×105 個相應靶細胞SK-HEP1-mg (AFP+ )或SK-HEP1 (AFP- )一起接種於上部腔室中。當抗AFP caTCR + 抗GPC3/抗CD3 BsAb T細胞用AFP陽性(SK-Hep1-mg)腫瘤細胞刺激時，所分泌的抗GPC3/抗CD3 BsAb通過跨孔膜且能夠刺激GPC3陽性SK-Hep1-GPC3腫瘤細胞溶解(圖20)。此等結果證明抗AFP caTCR + 抗GPC3/抗CD3 BsAb T細胞能夠回應於caTCR受體接合而分泌完全功能的專一性抗GPC3/抗CD3 BsAb，且此類BsAbs的治療作用可以與caTCR療法以相加方式使用。實例 8. 經 抗 AFP caTCR-1 及抗 GPC3 嵌合刺激受體轉導之 T 細胞的構建及表徵
使用編碼抗AFP結合部分(SEQ ID NO: 528及529)的核酸片段產生caTCR-1構築體(caTCR-1-0或caTCR-1-TM5)。使用編碼抗GPC3結合部分(SEQ ID NO: 309及360)的核酸片段產生包含CD28跨膜及胞內信號傳導序列(SEQ ID NO: 530)的CSR (亦即CSR1)。 活體外殺死
以2.5:1的效應子與標靶比率使用HEPG2細胞(表現AFP及GPC3之人類肝癌細胞)及HEPG2-GPC3-KO細胞作為靶細胞用於T細胞刺激。培育16小時之後，使用Cytox 96非放射性細胞毒性分析(Promega)量測專一性T細胞溶解。
抗GPC3-CSR (SEQ ID NO: 531)與抗AFP-caTCR-1-0 (SEQ ID NO: 532、533)或抗AFP-caTCR-1-TM5 (SEQ ID NO: 534、535)一起表現使得完全功能的細胞毒性T細胞能夠在活體外溶解HEPG2細胞(圖21)。僅表現caTCR-1-0之T細胞的專一性殺死(約15%)比表現caTCR-1 (caTCR-1-0或caTCR-1-TM5)與CSR之T細胞(約55%至約65%之間)少得多。相比之下，當使用HEPG2-GPC3-KO靶細胞時(圖21)，對於表現caTCR與CSR之T細胞而言，專一性殺死減小至約10%，表明CSR與其標靶配體的接合引起細胞毒性增強。 細胞介素分泌
活體外殺死實驗之上清液中所釋放的細胞介素濃度係藉由Bioplex200 (Luminex)、使用Bio-plex Pro人類細胞介素8-plex套組(BioRad)量測。對於表現caTCR靶抗原與CSR標靶配體的HEPG2靶細胞而言，CSR陽性及caTCR陽性T細胞釋放的細胞毒性細胞介素多於僅表現ca-TCR-1-0之T細胞(圖22)。相比之下，對於缺乏CSR標靶配體之HEPG2-GPC3-KO靶細胞而言，僅表現ca-TCR-1-0之T細胞或表現caTCR與CSR之T細胞之間的差異很小或無差異(圖22)。 胞內細胞介素表現
在分泌抑制劑布雷菲爾德菌素A (brefeldin A，BFA)存在下，以1:2之E:T比率用靶細胞(HEPG2)刺激T細胞4小時。T細胞被滲透且使用細胞介素專一性抗體偵測回應於腫瘤刺激而表現的細胞介素。使用流式細胞術測定細胞介素陽性細胞百分比。CSR陽性及caTCR陽性T細胞表現的胞內細胞介素比僅表現ca-TCR-1-0的T細胞多(表17)。表 17
綜合而言，結果表明CSR的添加增強了具有不同caTCR靶抗原及CSR標靶配體之caTCR加CSR T細胞的敏感性及反應。此等CSR-caTCR雙重陽性T細胞中所表現及所釋放的細胞介素之量增加進一步證明caTCR-1與CSR之協同刺激提高了T細胞之細胞毒性潛力。 去顆粒
將T細胞與螢光結合之抗CD107a混合且在內吞抑制劑莫能菌素(monensin)存在下以1:2之E:T比率用HEPG2靶細胞刺激4小時。caTCR T細胞上之CSR接合增強了T細胞去顆粒，進一步證明CSR使治療T細胞具有更多的針對預定腫瘤細胞之反應性(圖23)。 增殖
T細胞用胞內染料CFSE標記，且量測在指定日剩餘的CFSE陽性細胞之染料稀釋度及數目。
使相應的T細胞在血清中饑餓隔夜且使用CellTrace CFSE (Thermo Fisher C34554)經CFSE標記。100,000個T細胞以2:1之E:T比率培育且當T細胞在指定日分裂時，使用流式細胞術觀測CFSE染料之連續稀釋度。藉由FAC對T細胞總數目計數。
CFSE稀釋度在CSR刺激下增大，表明此等T細胞具有較高的增殖潛力(圖24)。重要的是，細胞數目亦增加，此意謂該等細胞不僅增殖較佳，而且其存留亦得以維持(表18)。表 18
結果表明吾等能夠以配體陽性腫瘤細胞同時刺激CSR與caTCR，且CSR與caTCR之協同刺激增強caTCR T細胞的細胞毒性、增殖潛力及存留。此等為利用過繼轉移來增強基於caTCR之療法之治療潛力的所有特徵。實例 9 ： 經抗 AFP caTCR-1 及抗 GPC3 CSR 轉導之 T 細胞的活體內功效研究
測試表現抗AFP caTCR-1與抗GPC3 CSR-1之T細胞在所建立之人類AFP+ /HLA-A2+ Hep G2肝癌異種移植模型中的活體內抗腫瘤活性(構築體資訊參見實例8)。將Hep G2細胞皮下植入(s.c.)SCID-Beige小鼠之右側腹中。腫瘤達到約100 mm3 時，向小鼠瘤內(I.T.)注射(1) 5×106 個未轉導的供者匹配(模擬)T細胞；(2) 2×106 個表現抗AFP CAR的T細胞，該抗AFP CAR包含相同的抗AFP結合部分(SEQ ID NO: 528及529)；或(3) 2×106 個表現抗AFP caTCR-1與抗GPC3 CSR-1的T細胞(n= 6個小鼠/組)。T細胞輸注對小鼠造成的健康影響係藉由監測其全身外觀、體重及不良反應之其他臨床徵象(包括體溫降低、呼吸困難及後肢麻痹/虛弱)來評估。
如圖25中所示，抗AFP CAR T細胞療法與抗AFP caTCR-1/抗GPC3 CSR-1 T細胞療法均引起深刻且顯著(****P＜0. 0001；鄧尼特氏多重比較檢驗(Dunnett's multiple comparison test))的腫瘤生長抑制。所有抗AFP CAR-T治療的小鼠及抗AFP caTCR-1/抗GPC3 CSR-1 T細胞治療的小鼠在研究持續時間期間均展現正常的步態、姿勢及活動/反應。另外，抗AFP CAR-T治療之小鼠及抗AFP caTCR-1/抗GPC3 CSR-1 T細胞治療之小鼠的體重在研究期間無損失。總體而言，所治療小鼠缺乏可觀測到的異常參數證明抗AFP caTCR-1/抗GPC3 CSR-1 T細胞療法安全。
圖1A-1G展示FACS分析14種例示性GPC3A噬菌體純系對GPC3+ HepG2細胞的結合。輔助噬菌體對GPC3+ HepG2細胞的結合用作對照。
圖2A-2E展示FACS分析5種例示性GPC3A噬菌體純系對GPC3+ HepG2細胞株及HepG2 GPC3基因剔除細胞株(HepG2-GPC3-KO-2及HepG2-GPC3-KO-3)的結合。輔助噬菌體用作陰性對照。
圖3A至3D展示FACS分析4種例示性GPC3B噬菌體純系對GPC3+ HepG2細胞株及HepG2-GPC3-KO-2細胞株的結合。輔助噬菌體用作陰性對照。
圖4A-4B展示FACS分析例示性GPC3A L2K雙專一性抗體(來源於GPC3A篩選的抗GPC3×CD3雙scFv)對SK-Hep1-GPC3細胞及GPC3陰性SK-Hep1細胞的結合。y軸展示中值螢光強度(MFI)。
圖5A-5B展示FACS分析例示性GPC3A L2K雙專一性抗體(來源於GPC3A篩選的抗GPC3×CD3雙scFv)對GPC3+ HepG2細胞的結合。對照L2K雙專一性抗體對GPC3+ HepG2細胞的結合用作陰性對照。
圖6展示在提供有或未提供可溶性GPC3抗原的競爭分析中，對GPC3A L2K雙專一性抗體結合至GPC3+ HepG2細胞進行的FACS分析。陰性對照L2K雙專一性抗體及市售抗GPC3 (1G12)抗體用於比較目的。
圖7A展示T細胞介導GPC3A L2K雙專一性抗體殺死靶細胞，如針對GPC3+ HepG2細胞、GPC3陰性SK-Hep1細胞、SK-Hep1-GPC3細胞、HepG2-GPC3-KO細胞(#2及#11)所測試。圖7B展示T細胞介導GPC3B L2K雙專一性抗體殺死靶細胞，如針對GPC3+ HepG2細胞、GPC3陰性SK-Hep1細胞、SK-Hep1-GPC3細胞及HepG2-GPC3-KO-2細胞所測試。
圖8展示使用市售小鼠抗人類GPC3抗體(1G12)對HepG2 GPC3基因剔除細胞株進行的FACS分析，證明成功產生了HepG2-GPC3-KO細胞株。
圖9A展示FACS分析具有小鼠恆定域/Fc區(mIgG1)之抗人類GPC3 (hGPC3)單專一性IgG抗體對GPC3陽性HepG2細胞的結合。圖9B展示FACS分析抗hGPC3 mIgG1對GPC3陰性SK-Hep1細胞的結合。
圖10展示FACS螢光強度曲線，其表明GPC3 L2K抗體(GPC3B-87 L2K或GC33 L2K)藉由可溶性GPC3對HepG2的競爭結合。
圖11展示FACS螢光強度曲線，其表明GPC3 LK2純系對HepG2細胞的結合親和力。
圖12展示ELISA分析GPC3 mIgG1純系相對於大鼠GPC3及人類GPC3 (hGPC3)的反應性。
圖13展示利用抗原決定基分組之線性形式對GC33-mIgG、GPC3A-37 mIgG及GPC3A-55 mIgG進行的GPC3抗原決定基分組分析。
圖14展示利用抗原決定基分組之夾層形式對GC33-mIgG、GPC3A-37 mIgG及GPC3A-55 mIgG進行的GPC3抗原決定基分組分析。
圖15A及15B展示GPC3A L2K純系與GPC3抗原之間結合之單一循環動力學分析的資料圖。
圖16展示經GPC3A或GPC3B CAR-T細胞及GC33 CAR-T細胞處理之GPC3陽性HepG2細胞、GPC3陰性SK-Hep1細胞、SK-Hep1-GPC3細胞及HepG2-GPC3-KO細胞的LDH細胞毒性分析。
圖17A展示經GPC3A或GPC3B CAR-T細胞及GC33 CAR-T細胞處理之GPC3+ HepG2細胞、GPC3陰性SK-Hep1細胞、SK-Hep1-GPC3細胞及HepG2-GPC3-KO細胞的LDH細胞毒性分析。圖17B展示經GPC3A或GPC3B CAR-T細胞及GC33 CAR-T細胞處理之GPC3陽性JHH5細胞、GPC3陰性A-498細胞及GPC3陰性PANC-1細胞的LDH細胞毒性分析。
圖18展示T細胞介導殺死癌細胞株HepG2 (AFP+ /GPC3+ )及HepG2-GPC3-KO (AFP+ /GPC3- )之比溶胞率百分比，該等T細胞經指定百分比之caTCR陽性(5%至40%)的單獨抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR或抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR + 抗CD3/抗GPC3 BsAb轉導。
圖19展示T細胞介導活體外殺死癌細胞株HepG2及HepG2-GPC3-KO之後，在上清液中發現之細胞介素(IL-2、IFN-γ及TNF-α)的濃度，該等T細胞經指定百分比之caTCR陽性(5%至40%)的單獨抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR或抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR + 抗CD3/抗GPC3 BsAb轉導。
圖20展示自活化抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR + 抗CD3/抗GPC3 BsAb T細胞釋放之抗CD3/抗GPC3 BsAb所介導之標靶專一性癌細胞株殺死增強。將指定的經轉導T細胞與靶細胞一起培育且藉由可透過BsAb、但不能透過T細胞的膜與指定的靶細胞及模擬T細胞分離。
圖21展示T細胞介導殺死癌細胞株HepG2 (AFP+ /GPC3+ )及HepG2-GPC3.ko (AFP+ /GPC3- )的比溶胞率百分比，該等T細胞經單獨的抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0、單獨的抗GPC3 CSR，或抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR (1-0及1-TM5) + 抗GPC3 CSR轉導。
圖22展示T細胞介導活體外殺死癌細胞株HepG2及HepG2-GPC3-KO之後，在上清液中發現之細胞介素(IL-2、GM-CSF、IFN-γ及TNF-α)的濃度，該等T細胞經單獨的抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0、單獨的抗GPC3 CSR，或抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR (1-0及1-TM5) + 抗GPC3 CSR轉導。
圖23展示用癌細胞株HepG2刺激之後，經單獨的抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0、單獨的抗GPC3 CSR，或抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR (1-0及1-TM5) + 抗GPC3 CSR轉導之T細胞中的去顆粒活性(如根據CD107a表現所測定)。
圖24展示用癌細胞株HepG2刺激之後，經單獨的抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0、單獨的抗GPC3 CSR，或抗AFP158/HLA-A*2:01 caTCR (1-0及1-TM5) + 抗GPC3 CSR轉導之T細胞的增殖(如藉由CFSE染料稀釋所測定)。
圖25展示HepG2在皮下小鼠模型中的腫瘤生長，其經模擬物處理或單次瘤內注射經抗AFP CAR轉導的T細胞，或抗AFP CAR與抗GPC3 CSR的組合。

Claims (40)

  1. 一種經分離的抗磷脂肌醇蛋白聚醣3(Glypican 3) (GPC3)構築體，其包含專一性辨識與細胞表面結合之GPC3的抗體部分。
  2. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分以高結合親和力專一性辨識與細胞表面結合之GPC3且以低結合親和力結合至可溶性GPC3。
  3. 如請求項2之經分離之抗GPC3構築體，其中可溶性GPC3在該抗GPC3構築體與該與細胞表面結合之GPC3之間競爭結合的IC50為約1 µg/ml至約100 µg/ml。
  4. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識包含SEQ ID NO: 460-464中任一者之胺基酸序列之人類GPC3內的抗原決定基。
  5. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分係專一性辨識缺乏硫酸肝素側鏈之GPC3之C末端片段內的抗原決定基。
  6. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分不與GC33競爭性地專一性結合至該相同或基本上相同GPC3抗原決定基。
  7. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該GPC3表現於癌細胞表面上。
  8. 一種經分離之抗GPC3構築體，其包含專一性辨識GPC3的抗體部分，其中該抗體部分包含： (a) i)重鏈可變域(VH )，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1-31中之任一者之重鏈互補決定區(HC-CDR) 1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 52-82中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 103-133中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體；及 ii)輕鏈可變域(VL )，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 154-184中之任一者的輕鏈互補決定區(LC-CDR) 1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 205-235中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 256-286中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體；或 (b) i) VH ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 32-51中之任一者的HC-CDR1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 83-102中之任一者的HC-CDR2或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 134-153中之任一者的HC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體；及 ii) VL ，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 185-204中之任一者的LC-CDR1或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體、胺基酸序列為SEQ ID NO: 236-255中之任一者的LC-CDR2或包含至多約3個胺基酸取代的其變異體，及胺基酸序列為SEQ ID NO: 287-306中之任一者的LC-CDR3或包含至多約5個胺基酸取代的其變異體。
  9. 如請求項8之經分離之抗GPC3構築體，其中該抗體部分包含： (a) i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 307-337中之任一者的VH 或與SEQ ID NO: 307-337中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 358-388中之任一者的VL 或與SEQ ID NO: 358-388中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體；或 (b) i)胺基酸序列為SEQ ID NO: 338-357中之任一者的VH 或與SEQ ID NO: 338-357中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體；及ii)胺基酸序列為SEQ ID NO: 389-408中之任一者的VL 或與SEQ ID NO: 389-408中之任一者具有至少約95%序列一致性的其變異體。
  10. 一種包含抗體部分的經分離之抗GPC3構築體，該抗體部分與如請求項1之經分離之抗GPC3構築體競爭性地專一性結合至GPC3。
  11. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中專一性辨識GPC3的該抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv或單鏈Fv (scFv)。
  12. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體具有多專一性。
  13. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中專一性辨識GPC3的該抗體部分與Fc片段融合，視情況經由連接子融合。
  14. 如請求項13之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為串聯scFv，該串聯scFv包含兩個藉由肽連接子連接之scFv。
  15. 如請求項13之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體進一步包含專一性辨識第二抗原的第二抗體部分。
  16. 如請求項15之經分離之抗GPC3構築體，其中該第二抗原為T細胞表面上之抗原。
  17. 如請求項16之經分離之抗GPC3構築體，其中該第二抗原選自由以下組成之群：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。
  18. 如請求項17之經分離之抗GPC3構築體，其中該第二抗原為CD3ε。
  19. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (a)包含該抗體部分的胞外域； (b)跨膜域；及 (c)胞內信號傳導域。
  20. 如請求項19之經分離之抗GPC3構築體，其中該細胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列及CD28胞內信號傳導序列。
  21. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體(caTCR)，其包含： (a)包含該抗體部分的胞外域；及 (b) T細胞受體模組(TCRM)，其包含含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)之第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM之第二TCRD，其中該TCRM促進募集至少一種TCR相關信號傳導分子。
  22. 如請求項1之經分離之抗GPC3構築體，其中該經分離之抗GPC3構築體為包含該抗體部分及效應分子的免疫結合物。
  23. 如請求項22之經分離之抗GPC3構築體，其中該效應分子為選自由以下組成之群的治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。
  24. 如請求項22之經分離之抗GPC3構築體，其中該效應分子為標記。
  25. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1之經分離之抗GPC3構築體中的多肽組分。
  26. 一種載體，其包含如請求項25之經分離之核酸。
  27. 一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項1之抗GPC3構築體、如請求項25之經分離之核酸或如請求項26之載體。
  28. 一種效應細胞，其表現如請求項19至21中任一項之經分離之抗GPC3構築體。
  29. 如請求項28之效應細胞，其中該效應細胞為T細胞。
  30. 如請求項28之效應細胞，其中藉由活化該效應細胞來誘導該抗GPC3構築體之表現。
  31. 如請求項28之效應細胞，其中該效應細胞進一步包含嵌合抗體-T細胞受體(TCR)構築體(caTCR)。
  32. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至24中任一項之經分離之抗GPC3構築體及醫藥學上可接受之載劑。
  33. 一種套組，其包含如請求項1至24中任一項之經分離之抗GPC3構築體。
  34. 一種偵測樣本中之GPC3的方法，其包含使該樣本與如請求項24之經分離之抗GPC3構築體接觸及偵測該標記之存在。
  35. 一種如請求項1至24中任一項之經分離之抗GPC3構築體的用途，其用於製備供治療患有GPC3陽性疾病之個體的藥劑。
  36. 一種如請求項24之經分離之抗GPC3構築體的用途，其用於製備供診斷患有GPC3陽性疾病之個體之方法用的藥劑，其中該方法包含： a)向該個體投與有效量的該經分離之抗GPC3構築體；及 b)測定該個體中之該標記的含量，其中該標記之含量高於閥值表示該個體患有該GPC3陽性疾病。
  37. 一種如請求項24之經分離之抗GPC3構築體的用途，其用於製備供診斷患有GPC3陽性疾病之個體之方法用的藥劑，其中該方法包含： a)使來源於該個體之樣本與該經分離之抗GPC3構築體接觸；及 b)測定該樣本中與該經分離之抗GPC3構築體結合之細胞的數目，其中與該經分離之抗GPC3構築體結合之細胞的數目值高於閥值表示該個體患有該GPC3陽性疾病。
  38. 如請求項35至37中任一項之用途，其中該GPC3陽性疾病為癌症。
  39. 如請求項38之用途，其中該癌症選自由以下組成之群：HCC、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、卵黃囊腫瘤、絨膜癌、神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、睪丸非精原細胞瘤型生殖細胞腫瘤、胃癌及脂肪肉瘤。
  40. 一種產生經分離之抗GPC3構築體的方法，包含： (a)在有效表現該抗GPC3構築體的條件下培養包含如請求項25之經分離之核酸的宿主細胞；及 (b)自該宿主細胞獲得所表現之抗GPC3構築體。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI849430B (zh) * 2021-06-08 2024-07-21 美商凱特製藥公司 Ｇｐｃ３結合分子
US12540196B2 (en) 2022-06-07 2026-02-03 Kite Pharma, Inc. GPC3 binding molecules

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018004721A (es) 2015-10-23 2018-07-06 Eureka Therapeutics Inc Construcciones quimericas anticuerpo/receptor de celulas t y usos de las mismas.
WO2018200586A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
US11613573B2 (en) 2017-04-26 2023-03-28 Eureka Therapeutics, Inc. Chimeric antibody/T-cell receptor constructs and uses thereof
JP2021527689A (ja) 2018-06-22 2021-10-14 カイト ファーマ インコーポレイテッドＫｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ キメラ膜貫通タンパク質及びその使用
JP7530362B2 (ja) * 2018-12-21 2024-08-07 カイマブ・リミテッド 共通の軽鎖を有するＦＩＸａ×ＦＸ二重特異性抗体
WO2020156554A1 (zh) * 2019-02-01 2020-08-06 科济生物医药（上海）有限公司 Tcr融合蛋白及表达tcr融合蛋白的细胞
CA3139507A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Unversity Chimeric antigen receptors targeting glypican-2
JP2022536975A (ja) 2019-06-21 2022-08-22 カイト ファーマ インコーポレイテッド ＴＧＦ－β受容体及び使用方法
JP2023507369A (ja) * 2019-12-20 2023-02-22 メディミューン，エルエルシー グリピカン３を標的とするキメラ抗原受容体を用いて癌を治療する組成物及び方法
AU2021218441A1 (en) * 2020-02-14 2022-09-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric antigen receptors with CD2 activation
IL295774A (en) * 2020-02-27 2022-10-01 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Antibodies and chimeric antigen receptors targeting glypican-3 (gpc3) and methods of use thereof
WO2021186395A1 (en) * 2020-03-18 2021-09-23 Eutilex Co., Ltd. Gpc3 car- t cells secreting il-18 and methods of making and using the same
CA3173176A1 (en) * 2020-05-07 2021-11-11 Huiwen WU Anti-tumor associated antigen antibodies and uses thereof
TW202216788A (zh) * 2020-06-26 2022-05-01 日商協和麒麟股份有限公司 與GPC3及TfR結合之雙特異性抗體
US20240199759A1 (en) * 2021-04-05 2024-06-20 Cytovia Therapeutics, Llc. Bispecific antibodies targeting nkp46 and gpc3 and methods of use thereof
IL307923A (en) * 2021-04-23 2023-12-01 Shanghai Henlius Biotech Inc Anti-gpc3 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
CN113203780B (zh) * 2021-05-13 2022-05-31 桂林电子科技大学 一种非诊断目的无标记适配体传感器检测gpc3的方法
CN113238040B (zh) * 2021-05-18 2022-05-31 桂林电子科技大学 一种非诊断目的基于纳米复合材料的laps传感器检测gpc3方法
JP2024522078A (ja) * 2021-05-21 2024-06-11 ベイジーン スウィッツァーランド ゲーエムベーハー 抗ｇｐｃ３及び抗ｃｄ１３７多重特異性抗体ならびにそれらの使用方法
WO2023061505A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Concept To Medicine Biotech Co., Ltd. Anti-glypican 3 antibodies
WO2023215738A1 (en) * 2022-05-02 2023-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions targeting gpc2 and gpc3 and their use for treating solid tumors
WO2023249071A1 (ja) * 2022-06-24 2023-12-28 国立研究開発法人国立がん研究センター Ｔ細胞受容体
CN119790063A (zh) * 2022-07-22 2025-04-08 莱尔免疫制药股份有限公司 免疫细胞疗法
CN120225562A (zh) * 2022-11-21 2025-06-27 广州百济神州生物制药有限公司 抗cd137抗体和使用方法
WO2025159562A1 (ko) * 2024-01-24 2025-07-31 국립암센터 Gpc3에 특이적으로 결합하는 신규 항체 및 이의 용도

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US4994560A (en) 1987-06-24 1991-02-19 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants and radioactive rhodium complexes thereof for conjugation to antibodies
US5489425A (en) 1987-06-24 1996-02-06 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
JP2755395B2 (ja) 1987-09-23 1998-05-20 ブリストル―マイアーズ スクイブ コムパニー Ｈｉｖ感染細胞に殺作用する抗体異種結合体
NZ229700A (en) 1988-06-24 1993-01-27 Dow Chemical Co Tetraazacyclododecane derivatives containing a linker/spacer moiety capable of forming antibody conjugates; complexes with radionuclides and conjugates of such compounds and complexes with antibodies or antibody fragments
US5756065A (en) 1988-06-24 1998-05-26 The Dow Chemical Company Macrocyclic tetraazacyclododecane conjugates and their use as diagnostic and therapeutic agents
CN1033030C (zh) 1988-06-24 1996-10-16 唐化学原料公司 大环双官能螯合剂及其配合物和抗体共轭物的制备方法
US5274119A (en) 1988-07-01 1993-12-28 The Dow Chemical Company Vicinal diols
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5342604A (en) 1988-10-31 1994-08-30 The Dow Chemical Company Complexes possessing ortho ligating functionality
US5696239A (en) 1988-10-31 1997-12-09 The Dow Chemical Company Conjugates possessing ortho ligating functionality and complexes thereof
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5808003A (en) 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
PL174494B1 (pl) 1992-11-13 1998-08-31 Idec Pharma Corp Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chłoniaka z limfocytów B i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chłoniaka z limfocytów B
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
PT1516628E (pt) 1995-07-27 2013-09-24 Genentech Inc Formulação de proteína liofilizada isotónica estável
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
EP0999853B1 (en) 1997-06-13 2003-01-02 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
ATE296315T1 (de) 1997-06-24 2005-06-15 Genentech Inc Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6602684B1 (en) 1998-04-20 2003-08-05 Glycart Biotechnology Ag Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE69909459T2 (de) 1998-04-21 2004-05-27 Micromet Ag Cd19xcd3 spezifische polypeptide und deren verwendung
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
EP2270150B2 (en) 1999-04-09 2019-08-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
CA2393730A1 (en) 1999-12-13 2001-06-14 Epimmune Inc. Hla class i a2 tumor associated antigen peptides and vaccine compositions
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP3690043A1 (en) 2000-10-06 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
ATE410680T1 (de) 2001-05-26 2008-10-15 One Cell Systems Inc Sekretion von proteinen durch verkapselte zellen
MXPA04001072A (es) 2001-08-03 2005-02-17 Glycart Biotechnology Ag Variantes de glicosilacion de anticuerpos que tienen citotoxicidad celulares dependiente de anticuerpos incrementada.
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
EP1461423B1 (en) 2001-12-03 2008-05-14 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN1930288B (zh) 2002-04-09 2012-08-08 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
WO2003085119A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcϜ RECEPTOR IIIa
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
EP1500698B1 (en) 2002-04-09 2011-03-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2002338020A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against blood-solubilized n-terminal peptide in gpc3
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
KR101364902B1 (ko) 2003-11-05 2014-02-21 로슈 글리카트 아게 증가된 ｆｃ 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 가진 ｃｄ20 항체
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
HRP20130440T1 (en) 2004-04-13 2013-06-30 F. Hoffmann - La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
CA2544692C (en) 2004-07-09 2014-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US7521541B2 (en) 2004-09-23 2009-04-21 Genetech Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
MX2010000537A (es) * 2007-07-17 2010-03-25 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales contra glipicano-3.
US8426561B2 (en) 2007-11-27 2013-04-23 Francina C. Chahal Antibodies against a cancer-associated epitope of variant NFKBIB and uses thereof
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
BR112012027001A2 (pt) 2010-04-23 2016-07-19 Genentech Inc produção de proteínas heteromultiméricas
WO2012145469A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
HK1202878A1 (zh) 2011-10-11 2015-10-09 F. Hoffmann-La Roche Ag 双特异性抗体的改进的组装
US20140322216A1 (en) * 2011-11-08 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
US9409994B2 (en) 2012-06-01 2016-08-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
US20160000842A1 (en) * 2013-03-05 2016-01-07 Baylor College Of Medicine Oncolytic virus
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
CN107460201A (zh) 2013-05-08 2017-12-12 科济生物医药（上海）有限公司 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EP2944652A1 (en) 2014-05-13 2015-11-18 Technische Universität München Glypican-3-specific T-cell receptors and their uses for immunotherapy of hepatocellular carcinoma
MX2016015162A (es) * 2014-05-22 2017-03-03 Genentech Inc Anticuerpos anti - gpc3 e inmunoconjugados.
WO2016036973A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3 antibody and uses thereof
US20170281683A1 (en) * 2014-09-26 2017-10-05 Baylor College Of Medicine Glypican-3 specific chimeric antigen receptors for adoptive immunotherapy
HK1249048A1 (zh) * 2015-04-03 2018-10-26 Eureka Therapeutics, Inc. 靶向afp肽/mhc复合体的构建体及其用途
EA202090931A3 (ru) 2015-05-18 2020-10-30 Тср2 Терапьютикс Инк. Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков
MX2018004721A (es) 2015-10-23 2018-07-06 Eureka Therapeutics Inc Construcciones quimericas anticuerpo/receptor de celulas t y usos de las mismas.
JP7109789B2 (ja) 2016-08-02 2022-08-01 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を使用したｔｃｒの再プログラム化のための組成物及び方法
CN112280796A (zh) 2016-10-07 2021-01-29 T细胞受体治疗公司 使用融合蛋白进行t细胞受体重编程的组合物和方法
CA3044593A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
CN110234343A (zh) 2016-12-21 2019-09-13 T细胞受体治疗公司 用于治疗癌症的经工程改造t细胞
US20190359678A1 (en) 2017-02-09 2019-11-28 The Regents Of The University Of California Chimeric t cell antigen receptors and methods of use thereof
WO2018200586A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
US20210079057A1 (en) 2017-06-13 2021-03-18 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
KR102061677B1 (ko) 2018-08-23 2020-02-11 주식회사 나노테크 텅스텐과 티타늄 복합 탄화물 분말의 제조 방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI849430B (zh) * 2021-06-08 2024-07-21 美商凱特製藥公司 Ｇｐｃ３結合分子
TWI887005B (zh) * 2021-06-08 2025-06-11 美商凱特製藥公司 Gpc3結合分子
US12540196B2 (en) 2022-06-07 2026-02-03 Kite Pharma, Inc. GPC3 binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
KR102663596B1 (ko) 2024-05-10
US11447564B2 (en) 2022-09-20
MX420947B (es) 2025-02-10
MY201065A (en) 2024-02-01
AU2018258049B2 (en) 2025-03-27
EP3615574A1 (en) 2020-03-04
KR20240067275A (ko) 2024-05-16
AU2018258049A1 (en) 2019-12-12
WO2018200586A1 (en) 2018-11-01
IL270138B2 (en) 2025-08-01
EP3615574A4 (en) 2021-02-24
MX2024009388A (es) 2024-08-13
IL319308A (en) 2025-04-01
PH12019502412A1 (en) 2020-09-14
KR20200012860A (ko) 2020-02-05
WO2018200586A9 (en) 2019-11-28
JP2020517294A (ja) 2020-06-18
JP7295030B2 (ja) 2023-06-20
IL270138B1 (en) 2025-04-01
CA3059820A1 (en) 2018-11-01
TWI878207B (zh) 2025-04-01
JP2023123540A (ja) 2023-09-05
CN110741019B (zh) 2025-06-13
SG10201913582XA (en) 2020-02-27
IL270138A (en) 2019-12-31
CN110741019A (zh) 2020-01-31
US12479924B2 (en) 2025-11-25
US20230048360A1 (en) 2023-02-16
US20210107992A1 (en) 2021-04-15
SG11201909728XA (en) 2019-11-28
ZA202000027B (en) 2023-10-25

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