TW201908479A - 藉由利用地標轉錄因子之幹細胞分化誘導神經先驅細胞、寡樹突細胞先驅細胞及寡樹突細胞 - Google Patents
藉由利用地標轉錄因子之幹細胞分化誘導神經先驅細胞、寡樹突細胞先驅細胞及寡樹突細胞Info
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Abstract
本發明揭示一種以前所未有之效率及功能性從人類iPSC誘導神經先驅細胞、寡樹突細胞先驅細胞、寡樹突細胞之新穎方法。本發明之核心係循著多能細胞至外胚層、神經外胚層至NPC至OPC至寡樹突細胞路徑之多個關鍵分化決定點處經實驗發現之轉錄因子的用途。
Description
本發明係關於誘導及/或引導多能幹細胞分化至神經先驅細胞、分化至寡樹突細胞先驅細胞、分化至寡樹突細胞之分化級聯，其係透過動力學受控之細胞生長過程使用細胞密度、試劑濃度之特定組合及範圍與mRNA之特定組合完成的。
人類幹細胞之產生及隨之而來的分化方面之最新成果已改變關於細胞命運之可塑性、人類疾病模型及臨床療法的範例。從體細胞製得之胚胎幹細胞(ESC)及經誘導多能幹細胞(iPSC)二者可分化成與其對應初生細胞無法區分之一系列日益增加的特定細胞類型。
本發明提供藉由調節細胞生長動力學及相關參數來誘導幹細胞及分化之方法，據此使用細胞密度、試劑濃度之特定組合及mRNA之組合來控制分化/誘導方向。在一個態樣中，本發明之一個有用性為提供神經先驅細胞(NPC)及寡樹突細胞先驅細胞(OPC)( 該寡樹突細胞先驅細胞可變為具有功能及成熟的寡樹突細胞)之新研發方案，以及直接提供用於治療涉及各種類型之髓鞘相關疾病及損傷之寡樹突細胞。
本發明提供利用在組織特異分化中具高度效能及良好表現之主控基因或關鍵轉錄因子之分化方法。更具體言之，此等因子係以經由本發明證明之經恰當修飾及純化的mRNA分子形式引入至多能幹細胞中。
在一個態樣中，本發明提供誘導細胞分化之方法，其包含：使用關鍵細胞命運因子及經優化以將幹細胞朝向不同細胞類型引導之具有轉活化結構域的常規轉錄因子(TF)之間的融合；將此等因子作為合成信使RNA (mRNA)以較佳密度藉由產生適當水準之轉基因表現的方法引入至經培養之多能幹細胞中；以及將細胞維持在經優化條件下以產生高效特異性分化，從而將幹細胞或先驅細胞之多能狀態或先驅狀態朝向特異性譜系或組織細胞類型誘導。
在另一態樣中，本發明提供用於將幹細胞或先驅細胞之多能狀態或先驅狀態朝向特異性譜系或組織細胞類型改變之方法，其包含以下中之至少一者：產生表現關鍵細胞命運基因之幹細胞(統稱為幹細胞)，包括關鍵細胞命運因子及經優化以將幹細胞朝向不同類型之細胞引導之具有轉活化結構域的常規轉錄因子(TF)之間的融合；將此等因子作為合成信使RNA (mRNA)以較佳密度藉由產生適當水準之轉基因表現的方法引入至經培養之多能幹細胞中；將細胞維持在經優化條件下以產生高效特異性分化。
在另一態樣中，本文中揭示用於誘導經誘導多能幹細胞(iPSC)及/或胚胎幹細胞(ESC)分化成神經先驅細胞(NPC)之方法，其中該方法包括以下步驟： a)將iPSC及/或ESC接種在經塗佈、未經組織處理之培養盤上； b)用編碼一或多種細胞命運因子之呈個別mRNA或組合mRNA的mRNA轉染步驟a)之細胞；及 c)培養步驟b)之該等iPSC及/或ESC直至細胞分化成NPC。 d)在需要大量NPC時，來自c)之NPC可藉由以下擴增：將該等細胞轉移至以便在懸浮液中生長之未經塗佈、超低附著條件下。
在此態樣之一實施例中，步驟b)之該等細胞命運因子選自由以下中之一或多者組成之群：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其係呈個別mRNA或組合mRNA轉染。在一些實施例中，經轉染RNA之量係6孔盤每孔約10 ng至約200 ng或約20 ng至約200 ng，或當使用其他類型之盤或培養燒瓶時，則基於容器之面積或培養基量的體積按比例調整。在一些實施例中，重複轉染至少再一次。可以間隔約24小時重複轉染。在另一實施例中，細胞命運因子可與諸如但不限於MyoD或VP16之轉活化結構域融合。在一些實施例中，培養步驟c)之細胞直至細胞表現步驟c)之細胞命運因子中之一或多者。可利用(但不限於)免疫分析及/或qt-PCR判定是否表現細胞因子。在另其他實施例中，可視情況添加SB43542、LDN193189及PD173074中之一或多者至步驟c)之細胞中。在一些實施例中，步驟a)至c)之培養條件為在約2%至約6%的氧氣濃度中。在本發明之一實施例中，用於步驟a)至c)之培養基係選自最低必需培養基-α (MEMa)、杜氏改良伊格爾培養基:營養混合物F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12；DMEM/F12)或具有B27補充劑之DMEM。培養基亦可含有其他組分，諸如基因剔除血清替代物(Knock Out Serum Replacement；KSR)及bFGF、N2或B27、BSA或HSA中之一或多者。在另一實施例中，培養容器係經基質膠及/或PLO-層黏連蛋白塗佈。在方法之一實施例中，步驟a)之iPSC及/或ESC係以每孔約0.75 × 105
個細胞至約1.5 × 106
個細胞接種在六孔盤中。可利用其他尺寸的培養容器。六孔盤以外的其他培養容器的接種密度可依據使用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞，且以細胞數目除以培養容器之生長面積來決定，例如，如表2中所展示。在一些實施例中，步驟c)之細胞經培養約3至約10天，其中細胞具有星形膠質細胞樣或神經元樣形態。在約3至約10天之後，接近於約100%且高於約75%之細胞將具有NPC細胞之特徵形態。在一些實施例中，約40-60%之細胞將具有NPC細胞之特徵形態。若低於約40%之細胞具有NPC細胞之特徵形態，則可利用細胞分選法分離細胞。利用懸浮液培養系統進一步培養可以進一步選擇。在一些實施例中，NPC可藉由顯現諸如Pax6之細胞命運因子中之一者的表現來確認。
本發明之另一態樣係從NPC產生寡樹突細胞先驅細胞(OPC)之方法，其中該方法包括以下步驟： a)將NPC接種在經塗佈培養容器上之培養基中； b)用編碼一或多種細胞命運因子之呈個別mRNA或組合mRNA的mRNA轉染步驟a)之細胞，以便將神經先驅細胞分化成寡樹突細胞先驅細胞； c)培養步驟c)的細胞直至NPC之形態改變為OPC之形態； d)在需要大量OPC時，來自c)之OPC可藉由以下擴增：將該等細胞轉移至以便在懸浮液中生長之未經塗佈、超低附著條件下。
在此方法之一實施例中，在步驟a)中，六孔盤的孔係接種約0.75 × 105
個細胞至約1.5 × 106
個細胞。可利用其他尺寸之培養容器。六孔盤以外之其他培養容器的接種密度可基於利用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞且以細胞數目除以培養容器之生長面積而判定，例如，如表2中所展示。在另一實施例中，用於步驟b)中之轉染的mRNA係編碼細胞命運因子，該mRNA係選自由個別性地或呈組合之Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA組成之群中的一或多者。在另一實施例中，當使用六孔盤時，步驟b)中之轉染劑量為約20 ng-約100 ng/細胞命運因子，或當使用其他類型之盤或培養燒瓶時，則基於容器之面積或培養基量的體積而按比例調整。在另一實施例中，第一次轉染之後，當使用六孔培養盤時以約10 ng/細胞命運因子至約200 ng/細胞命運因子或在利用其他類型之盤或培養燒瓶時基於容器的面積或培養基量之體積按比例調整之mRNA的劑量重複轉染至少再兩次。在另一實施例中，培養容器盤係經基質膠及/或PLO-層黏連蛋白塗佈。在另一實施例中，用於步驟a)至c)之培養基係選自DMEM/F12、DMEM及MEMa。在一些實施例中，培養基補充有KSR、抗壞血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰島素、RA、B27、CAMP及/或生物素中之一或多者。在方法之一實施例中，步驟a)至d)之培養條件為在約2%至約6%之氧氣濃度中。在另一實施例中，步驟c)中之細胞經培養約4至約20天，直至觀測到具有OPC之形態學特徵的細胞。在另一實施例中，OPC產生可基於雙極形態及/或細胞命運因子中之一者的表現來確認。在約4至約20天之後，接近於約100%且高於約75%將具有OPC細胞的特徵形態。在一些實施例中，約40-60%之細胞將具有OPC細胞之特徵形態。若低於約40%之細胞具有OPC細胞之特徵形態，則可利用細胞分選以分離細胞。利用懸浮液培養系統之進一步培養允許進一步選擇。在一些實施例中，OPC之確認可藉由諸如Oligo2或Sox10之細胞命運因子中之一者的表現來展示。
在本發明之另一態樣為從OPC產生寡樹突細胞之方法，該方法係基於以下步驟： a)將OPC接種在經塗佈培養容器上之培養基中；及 b)培養步驟a)之細胞直至細胞出現分支鏈細胞過程及/或產生髓鞘鹼性蛋白(MBP)。
在此方法之一實施例中，用於步驟a)至b)之培養基係選自DMEM/F12、DMEM或MEMa。培養基可補充有選自由以下組成之群的培養基補充劑中之一或多者：KSR、抗壞血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰島素。在另一實施例中，步驟a)之OPC係使用6孔盤每孔接種約0.75 × 105
個細胞至約1.5 × 106
個細胞。六孔盤以外之其他培養容器的接種密度可基於利用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞且以細胞數目除以培養容器之生長面積而判定，例如，如表2中所展示。在另一實施例中，步驟b)之細胞經培養約7至約30天，此時將存在具有分支鏈細胞過程之細胞。在另一實施例中，步驟a)中之細胞培養容器係經基質膠及/或PLO-層黏連蛋白塗佈。
在本發明之另一態樣中為相繼地或直接地利用以下步驟來誘導諸如iPSC或胚胎幹細胞之幹細胞分化成NPC、OPC、寡樹突細胞的方法： a)將iPSC及/或ESC接種在經塗佈培養容器上，其中iPSC及/或ESC係以每孔約0.75 × 105
個細胞至約1.5 × 106
個細胞接種在6孔盤之培養基中，或若利用其他培養容器則按比例調整接種，該培養基包含最低必需培養基-α (MEMa)或杜氏改良伊格爾培養基:營養混合物F-12 (DMEM/F12)或具有B27補充劑的DMEM，所有培養基具有基因剔除血清替代物(KSR)； b)用編碼細胞命運因子之mRNA轉染步驟a)之細胞，該等細胞命運因子選自由以下中之一或多者組成之群：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其係呈個別mRNA或組合mRNA轉染； c)培養步驟b)之該等iPSC及/或ESC直至細胞分化成NPC； d)分離來自步驟c)之NPC； e)將NPC接種在經塗佈細胞培養容器上，其中NPC係以每孔約0.75 × 105
個細胞至約1.5 × 106
個細胞接種在6孔盤之培養基中，或若利用其他培養容器則按比例調整接種，該培養基包含MEMa或DMEM/F12或DMEM，全部具有KSR及選自由以下組成之群的培養基補充劑中之一或多者：抗壞血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰島素、RA、B27、CAMP及生物素； f)用由個別性地或呈組合之以下組成之群中之一或多者利用轉染試劑轉染步驟e)之細胞：Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA； g)以約10 ng至約200 ng(6孔盤的每孔)之劑量重複步驟e)之轉染至少再兩次； h)培養步驟g)之細胞直至細胞之形態自NPC細胞之形態改變為OPC細胞之形態； i)分離來自步驟h)之OPC； j)將來自步驟i)之經分離OPC接種至經塗佈細胞培養容器上，其中OPC係以每孔約0.75 × 105
個細胞至約1.5 × 106
個細胞接種在6孔盤之培養基中，或若利用其他培養容器則按比例調整接種，該培養基包含MEMa或DMEM/F12或DMEM，全部具有KSR及選自由以下組成之群的培養基補充劑中之一或多者：抗壞血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰島素；及 k)培養該等細胞至少約1週，直至寡樹突細胞出現樹枝狀過程及/或產生髓鞘鹼性蛋白(MBP)。
在本發明之另一態樣中，自接受者，諸如自體液或組織，採集本文中所揭示之方法的起始細胞。
本發明之另一態樣為自所揭示之方法獲得的NPC、OPC及寡樹突細胞。在此態樣之一實施例中，細胞可用作醫藥組合物以治療疾病、病症或畸形。此類疾病、病症及畸形可包括但不限於：神經變性病狀，諸如急性神經變性病狀，諸如大腦損傷(局灶性或彌漫性大腦損傷)、脊髓損傷或外周神經損傷，例如，由物理或化學燒傷、深切口或肢體分離、腦血管機能不全造成。在其他實施例中，其為慢性或進行性神經變性病狀，諸如帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、肌肉萎縮性側索硬化、腫瘤或慢性外周神經損傷、匹克症(Pick's disease)、彌漫性路易體疾病、進行性核上麻痹(斯蒂爾-理查森症候群(Steel-Richardson syndrome))、多系統變性(夏伊-德爾格症候群(Shy-Drager syndrome))、與神經變性相關之慢性癲癇病狀、包括肌肉萎縮性側索硬化之運動神經元疾病、退化性共濟失調、皮層基底節變性、關島型ALS-帕金森氏癡呆綜合症、亞急性硬化性全腦炎、共核蛋白病(包括多發性系統萎縮症)、原發性進行性失語症、黑質退化症、馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)/3型脊髓小腦失調及橄欖體腦橋小腦變性、妥瑞症(Gilles De La Tourette's disease)、延髓及假性延髓麻痹(bulbar and pseudobulbar palsy)、脊椎及脊髓延髓肌肉萎縮(spinal and spinobulbar muscular atrophy) (肯尼迪氏病(Kennedy's disease))、原發性側向硬化、家族性痙攣性截癱、沃德尼格-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)、庫格爾伯格-威蘭德病(Kugelberg-Welander disease)、塔伊-薩奇氏疾病(Tay-Sach's disease)、山多夫氏病(Sandhoff disease)、家族性痙攣性病、沃法特-庫格爾伯格-威蘭德病(Wohlfart-Kugelberg-Welander disease)、痙攣性截癱、進行性多病灶腦白質病、家族性自主神經失調(里雷-戴症候群(Riley-Day syndrome))及朊病毒疾病(包括但不限於庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob)、GSS病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、庫魯病及致死家族性失眠)。在另其他實施例中，其為與髓鞘脫失相關之疾病，諸如多發性硬化症、急性播散性腦脊髓炎、視神經脊髓炎、橫貫性脊髓炎、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病、格-巴二氏症候群(Guillain-Barré syndrome)、腦橋中央髓鞘溶解症(central pontine myelinosis)、諸如腦白質障礙之遺傳性脫髓鞘疾病、恰克-馬利-杜斯氏症(Charcot-Marie-Tooth disease)及卡納萬病(Canavan disease)。
相關申請案
本申請案主張2017年7月13日申請之美國臨時申請案第62/532,246號之優先權。
在描述本發明時，本文中未定義之全部術語具有其在此項技術中認識之常見含義。在以下描述具有本發明之具體實施例或特定用途範圍內，意欲僅為說明性的且不限制所主張之發明。以下描述意欲涵蓋包括於本發明之精神及範疇中之所有替代方案、修改及等效物。
iPSC在個體化用藥領域中展示特定潛力，此係由於細胞之無限可用性、獲得細胞之程序的非侵入性及對於個別患者之各治療為免疫匹配之可能性，從而免於使用免疫抑制藥物。
細胞替代治療為治療各種損傷及為治療或預防先前無實際治療之各種人類疾病提供新希望。舉例而言，由事故導致之脊髓損傷、諸如多發性硬化症之其他脊髓病狀及各種腦白質營養不良(leukodystrophy)當前在醫院中處理而無需修正髓鞘及其神經功能損失之手段。尋找NPC、OPC及寡樹突細胞之可信賴供給源仍為待克服之顯著障礙。儘管明確需要可幫助具有脊髓損傷或脊椎疾病之患者的細胞，但單研究人員及公司之努力迄今尚未提供可產生具有成熟形態之完全功能寡樹突細胞的方法。即使NPC或OPC將用於治療脊髓病狀，但此等前驅體產生成熟、功能性、正常寡樹突細胞之能力仍為其用於醫學治療之潛能的關鍵量測。
自多能幹細胞衍生功能組織細胞之最新方法需要在各步驟沿分化級聯利用生長因子、激素、細胞介素、信號肽及其他細胞間信號分子(在本發明中為簡單起見統稱為「生長因子」)之組合，以產生醫療上適用之NPC、OPC或寡樹突細胞。令人遺憾地，在作為純化多肽供應時，生長因子通常為昂貴的、不穩定的且批次間不相容，使得其難以使用。另外，因為生長因子以高度特異性又組合之方式起作用，所以分化之各階段由不同組生長因子指示，其優化困難且昂貴。如本文中所揭示，NPC、OPC及寡樹突細胞可以極高效且以低成本藉由以恰當劑量及遞送條件在關鍵命運改變點處組合mRNA而無需利用大量生長因子來實現。
為緩解成本負擔及不一致性，熟習此項技術者常常採取尋找可影響信號路徑之小分子作為生長因子受體之促效劑或拮抗劑，由此以取代生長因子之方式。小分子通常遠比生長因子便宜。然而，小分子之一個主要不足之處在於非特異性影響，其可作用於非預期標靶，諸如細胞膜結合受體、細胞內細胞器、或基因組組分等。本發明亦提供在不使用或減少使用小分子之情況下實現細胞命運判定之新穎方法。
迄今，若有任何信息，則僅有關於如何將多能幹細胞一直分化成寡樹突細胞之極有限信息，可能係因為用生長因子及小分子經由各階段導引分化細胞之詳細道路圖尚待經由繁瑣實驗來獲取。因為mRNA更具有特異性，經由編碼功能性蛋白，在引導細胞及發育事件中，所揭示之方法比在產生原發性寡樹突細胞樣細胞、為人類治療鋪設治療脊髓損傷、缺陷、疾病及髓鞘之道路及其他相關健康問題中的任何已知方法更穩固。
典型分化方案之另一關鍵組分係培養細胞之培養基，該培養基可由營養物質(脂質、胺基酸、碳水化合物、維生素等)、恰當濃度之鹽、pH緩衝劑、關鍵元素及諸如胰島素或血清白蛋白之常見蛋白因子形成。不同類型之細胞具有不同的營養物質及培養基組分需求且由用於信號傳遞之細胞類型特異性生長因子及小分子進一步複雜化。因此，專用「分化培養基」常常藉由每次移除或添加一種組分來費力地測試。本發明之主要益處係經由利用恰當供應之引導分化基因的mRNA來簡化建立分化培養基。然而，mRNA及適當培養基之最佳組合可進一步有益於過程且為本發明之整體部分。
在幹細胞衍生之組織細胞之臨床應用中，所建立之分化培養基的大多數組分需要在當前良好作業規範(cGMP)規章下之個體認證；例如，需要藉由專用程序生產且需要個體認證之生長因子。同樣地，添加至特異性分化培養基中之一些小分子經由在純度、穩定性及毒性方面變化之專用化學合成方法製造。在幹細胞培養物之領域中，一些先前公開之方案亦依賴於動物產物，諸如血清或基質膠。本發明背後之另一激勵為創建主要基於適合於均勻認證及品質控制過程的單一類型之分子的新方法。
本文中所描述的為涉及可如何控制細胞密度及分裂速率以實現所需分化結果之過程。本發明進一步教示優化時序、添加順序、RNA劑量及在RNA轉染期間不同RNA之間的比值以及其持續時間或重複次數。本發明進一步係關於培養容器之表面及諸如氧濃度之環境條件的選擇。本發明進一步包括選擇所需細胞或提高其在總群體中之百分比的方法，以及冷凍保存及再培養分化細胞之方法。
基於在肌肉(MyoD)、眼睛(Pax6)及發生生物學之其他領域中之研究，一般已接受以下概念：「主控」基因，亦即一種關鍵基因(通常為轉錄因子基因，有時是共同發揮作用的少數基因)，其在發育期間可決定細胞及組織之命運及最終整個器官之形成。Shinya Yamanaka發現：經分化細胞可藉由透過病毒傳遞幹細胞中所表現之一群選擇的轉錄因子之表現作用而逆轉成多能狀態，此證明少數關鍵轉錄因子在經由冗長多階段命運變化驅動細胞中之能力。其他團體對iPSC產生之研究擴大了再程式化因子之選擇且證明出於再程式化之目的可容許轉錄因子選擇中有一些變化。在Yamanaka之初始研究中，透過將病毒載體整合至基因組中之應用可以完成再程式化因子之表現，因為需要此等因子之長期表現來影響細胞轉形。伴隨基因組所產生的修飾是對iPSC之治療性應用的重要障礙，同時甚至用於活體外研究，從經整合病毒卡匣之再活化表現之可能性仍為關注點。如由當前發明人團體最近揭示之將mRNA轉染應用於再程式化為尤其吸引人的，因為此系統可以讓再程式化混合物之表現及甚至僅藉由改變添加至細胞培養基中之轉錄物在短時間範圍內調節個體組分因子。一旦終止特定因子之轉染，靶細胞內之異位表現會因為細胞質內mRNA之快速衰減而迅速停止。儘管mRNA不會繼續留存於靶細胞中，但其在細胞質中直接轉譯，而無需如在轉染DNA及整合病毒載體之情況下的速率限制核易位之能力遠遠補償mRNA之短暫半衰期，從而在一段小時間段引起高效表現但表現良好，此對於細胞命運判定而言至關重要。
當持久性DNA載體(諸如附加型質體(episomal plasmid))用於細胞命運改變時，其需要與原生細胞脫離關係(weaning)，以降低任何逢機性基因組整合之風險。諸如仙台病毒(Sendai virus)或委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis，VEE)病毒之RNA病毒或病毒衍生物即使經修飾成非感染性RNA複製子之後仍攜帶有易於與隱藏在宿主基因組中的病毒元素再結合之病毒元素。在沒有頻繁發現呈負面資料形式之證明下始終難以完全確定細胞不含病毒載體。本發明揭示多個發明步驟，旨在將基於mRNA之細胞命運判定之優勢應用於引導式分化。綜上所述，本發明係教示在簡化方法中之單輪或多輪異位轉錄因子表現以引導細胞分化。
儘管如此，基於mRNA之幹細胞分化存在技術障礙。並非所有幹細胞類型及培養基均同等有助於高效mRNA傳遞，且此目前為基於mRNA之分化的障礙。另外，幹細胞(尤其是大部分人類幹細胞株)在沒有形成抗轉染貼片之情況下相當難以培養。如本文中所揭示，多能幹細胞可在使得大部分細胞可經mRNA轉染之條件下生長。在另一實施例中，將RNA及轉染試劑之以下劑量(兩者具有關聯性的毒性)提供給細胞：能夠發揮主控基因影響，同時在面對因細胞命運改變過程產生之促凋亡及細胞生長抑制力時支持靶細胞之存活率。
因此，鑒於與先前已知幹細胞分化程序相關之問題，本文中所描述的新穎方法、材料及方案以所得細胞之過程及質量之改良效率自iPSC或胚胎幹細胞(ESC)產生不同細胞類型。本發明展示經由增強傳遞至標靶幹細胞之TF mRNA之顯著改良。本發明亦提供支持在不利用滋養細胞或任何其他可能異種污染物之情況下，自人類幹細胞產生無痕跡組織細胞的新穎方案。新方案擴展經修飾之mRNA之益處且幫助清除幹細胞衍生技術之治療性應用的剩餘障礙。
鑒於自多能至末端分化狀態之分化常常採取多步驟，從而需要若干週至甚至若干月之時間範圍，基於生長因子之步進式策略本質上為低效且繁瑣的。因此，本發明之實施例根本上去除在導引神經先驅細胞至寡樹突細胞先驅細胞至寡樹突細胞的產生中對生長因子之需求。
更特定言之，本發明係關於藉由表現關鍵細胞命運基因將幹細胞或先驅細胞(統稱為幹細胞)之多能狀態或先驅狀態朝向特異性譜系或組織細胞類型改變，該等關鍵細胞命運基因包括關鍵細胞命運因子及經優化以將幹細胞朝向不同類型之細胞引導的具有諸如MyoD或VP16之轉活化結構域的常規轉錄因子(TF)與本領域中通常已知之提供較強轉錄活化活性的多種其他轉錄因子之間的融合；將此等因子作為合成信使RNA (mRNA)以較佳密度藉由產生適當水準之轉基因表現的方法引入經培養多能幹細胞中；將細胞維持在經優化條件下以產生先前難達成之特異性分化效率。經由引入mRNA表現之因子亦可包括生長因子、細胞介素、激素、信號肽及影響分泌因子或修飾酶之其他細胞命運。利用類似程序，微RNA (miRNA)或其他編碼非蛋白質之RNA可在細胞狀態轉換下引入細胞中，以便引導分化，此係因為此等非編碼RNA可控制或影響TF、基本上提供與直接轉染TF mRNA相同的效果。此外，如實例中所描述之對分化關鍵之TF可藉由使用經修飾CRISPR-Cas9系統活化，其中經工程改造之Cas9 (例如未切割Cas9)或其他Cas家族成員蛋白質與轉錄活化結構域(及在一些情況下，用於抑制具有與所需TF相反效果的TF之轉錄抑制結構域)、染色體修飾酶或其酶促結構域或其他表觀遺傳修飾酶或其酶促結構域連同將此等作用結構域引導至染色體上的標靶TF基因附近之導引RNA融合。本文中所揭示的為除在需要DNA分子作為模板以改變基因組序列時外，出於與上文所描述相同之益處，用於細胞分化、較佳地僅利用RNA作為在標靶細胞內部傳遞之分子的CRISPR-Cas系統。與此項技術中已知之其他方法相比，本文中所揭示之方法大大減少涉及幹細胞分化成NPC、OPC及寡樹突細胞之時間、成本及工作量。
本文中本發明特異性詳細描述將幹細胞或先驅細胞之多能狀態或原始狀態朝向特異性譜系或組織細胞類型改變的方法，包含以下中之至少一者：表現關鍵細胞命運基因，包括經優化用於將幹細胞朝向不同類型之細胞引導之關鍵細胞命運因子；將此等因子作為合成信使RNA (mRNA)以較佳密度藉由產生適當水準之轉基因表現的方法引入經培養多能幹細胞中；以及將細胞維持在經優化條件下以產生高效特異性分化。
在某些實施例中，提供完全穩定化、經擴增之人類ESC或iPSC。
在某些實施例中，無需清除游離基因體或RNA病毒(例如仙台病毒)，其在分離後可進行10多次iPSC繼代。
在某些實施例中，該過程沒有滋養層。
在某些實施例中，該過程沒有異種成分，包含所有合成性或人類試劑，且沒有非人類動物衍生之組分。
在某些實施例中，該過程沒有留下足跡：不會將DNA逢機性整合至基因組中(如附加型DNA構築體常常發生)。
在某些實施例中，mRNA之功能可藉由利用非編碼RNA (包括miRNA)或導引RNA/Cas融合系統在理解哪些TF之活性對下文實例中所揭示之特異性分化步驟為關鍵的情況下來實現。
在某些實施例中，該過程經由患者特異性起始組織及/或基因組編輯來獲得完全客製化之遺傳基因背景。定義
如本文中所使用，術語「約」意謂20%內、更佳地10%內且最佳地5%內。當用於天數之上下文中時，術語「約」意謂或多或少一天或兩天。因此，若細胞培養物經培養約3至約10天，則此可意謂3至10天、1至12天或2至11天。
術語「寡樹突細胞樣細胞」欲意謂與寡樹突細胞共有特性之細胞。寡樹突細胞樣細胞藉由形態特徵以及藉特異性標記物特徵進一步定義。由於誘導多能幹細胞衍生之寡樹突細胞樣細胞與原發性寡樹突細胞共有類似特徵(包括標記物及激素特徵)，所以誘導多能衍生之寡樹突細胞樣細胞可與誘導多能幹細胞衍生之寡樹突細胞或簡單地寡樹突細胞互換使用。
「胚狀體」係指衍生自多能細胞之細胞的聚集體，其中細胞聚集可藉由防止細胞黏附至表面以形成典型的集落生長之任何方法引發。如本文中所使用，「胚狀體」係指多能幹細胞之三維球狀體聚集體，包括但不限於衍生自來自哺乳動物來源之胚胎之囊胚階段的胚胎幹細胞。胚狀體可由經由此項技術中一般已知之任何技術衍生之胚胎幹細胞形成，該技術包括但不限於為獲得誘導多能幹細胞之體細胞之體細胞核轉移或再程式化。
如本文中所使用，術語「誘導多能幹細胞」係指衍生自體細胞(例如成人體細胞)之多能幹細胞。誘導多能幹細胞在其形成任何成人細胞類型之分化能力方面類似於胚胎幹細胞，但並非衍生自胚胎，亦即能夠分化成自非多能細胞人工衍生(非天然地衍生)之多種細胞類型的細胞。
如本文中所使用，「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」包括子代。亦應理解因有意或無意突變所致，所有子代在DNA內含物方面可能不會精確一致。包括具有與最初轉型細胞中所篩檢相同之功能或生物性質的變異體子代。
如本文中所使用，「組合物」係指活性劑與至少一種其他惰性(例如，可偵測試劑或標記)或活性化合物或分子，諸如佐劑之組合。在本發明之上下文中，組合物亦將包括自本文中所描述之方法產生的經分化細胞，包括NPC、OPC及寡樹突細胞。
如本文中所使用，「培養」係指將細胞維持在其中該等細胞可增殖且避免以細胞群形式衰老之條件下。「培養」亦可包括細胞亦或可替代地分化之條件。
如本文中所使用，「差異表現」係指相比於由正常或對照細胞中之相同基因或調節區產生RNA之水準，RNA之差異產量，該RNA包括但不限於自基因組或由基因編碼之蛋白質產物的基因或調節區轉錄之mRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snRNA及piRNA。在另一情況中，「差異表現」亦指與正常或對照細胞相比，具有不同時間及/或空間表現圖譜之細胞或組織中之核苷酸序列或蛋白質。
如本文中所使用，「過度表現(overexpressed/overexpression)」係指相比於正常或對照細胞中之RNA或蛋白質產物之表現量，由基因編碼的RNA或蛋白質產物之表現量增加。
如本文中所使用，「不足表現(underexpressed/underexpression)」係指相比於正常或對照細胞中之RNA或蛋白質產物之表現量，由基因編碼的RNA或蛋白質產物之表現量減小。
如本文中所使用，「分化(differentiate/differentiation)」係指前驅體或先驅細胞(亦即，神經先驅細胞)分化成例如寡樹突細胞之特異性細胞類型的過程。
如本文中所使用，「有效量」係足以實現細胞、組織、系統、動物或人類之有益或所需生物、情感、醫藥或臨床反應的量。有效量可以一或多次投藥、施用或劑量形式來投與。該術語在其範疇內亦包括有效增強正常生理功能之量。
如本文中所使用，在細胞之上下文中之「擴增(expansion/expanded)」係指特徵細胞類型或可能相同或可能不相同之來自原始細胞群之細胞類型的數目之增加。用於擴增之原始細胞不必與經擴增所產生之細胞相同。舉例而言，經擴增之細胞可藉由原始細胞群以離體方式或活體外方式生長及分化而產生。
如本文中所使用，「表現」係指聚核苷酸轉錄成RNA轉錄物之過程。在mRNA及其他轉譯RNA物種之上下文中，「表現」亦指經轉錄之RNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質之一或多個過程。
如本文中所使用，「不含整合之iPS細胞」係指不含整合於非多能細胞之基因組中的外源性轉基因之iPS細胞。
如本文中所使用，「分離」意謂與成分、細胞及其他者分離，其中聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段通常在性質上相關。非天然產生之聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要「分離」以將其與其天然產生之對應物區分。相對於如本文中所描述之NPC、OPC及寡樹突細胞，分離意謂與未經分化細胞分開且分離所關注細胞的純淨群體。
如本文中所使用，「濃縮」係指可與其天然存在對應物區分之分子，包括但不限於細胞、特定類型之細胞、聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段，因為每體積之分子濃度或數目大於其天然存在對應物的每體積之分子濃度或數目。
如本文中所使用，「稀釋」係指可與其天然存在對應物區分之分子，包括但不限於細胞、特定類型之細胞、聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段，因為每體積之分子濃度或數目小於其天然存在對應物之每體積之分子濃度或數目。
如本文中所使用，「分離」係指與初始源或群體物理分開之狀態，以使得可不再考慮分離之化合物、細胞、試劑、顆粒或分子為初始源或群體之部分。
如本文中所使用，出於治療目的之「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農畜、非人類靈長類動物及動物園、運動或寵物動物，諸如但不限於狗、馬、貓及牛。
如本文中所使用，「幹細胞」係指能夠分化成多個細胞類型之任何自身更新分化全能、多能細胞或多潛能細胞或先驅細胞或前驅體細胞。
如本文中所使用，「分化全能」係指可分化且在生物體中產生所有細胞類型之細胞加胚胎外細胞或胎盤細胞。
如本文中所使用，「多能」係指除胚胎外細胞或胎盤細胞以外，可分化且產生構成生物體之包括任何胚胎或成人細胞類型的所有細胞類型之細胞。
如本文中所使用，「多潛能」係指可產生超過一種細胞類型但在其可產生之細胞類型方面比多能細胞更加受限的細胞。
如在本文中可互換地使用，「受試者(subject)」、「個體(individual)」或「患者」係指脊椎動物生物體。
如本文中所使用，「實質上純細胞群」係指具有指定細胞標記物特徵及為構成總細胞群之細胞之約50%、較佳地約75%至80%、更佳地約85%至90%、及最佳地至少約95%的分化潛能的細胞群。因此，「實質上純細胞群」係指含有在指定檢驗條件下不呈現指定標記物特徵及分化潛能之細胞之少於約50%、較佳地少於約20%至25%、更佳地少於約10%至15%、且最佳地少於約5%的細胞群。
如本文中所使用，「前分化」係指前驅體或先驅細胞(例如，多能幹細胞)分化成具有進一步分化成最終效應細胞(例如寡樹突細胞)之潛能的例如神經或寡樹突細胞先驅細胞之中間細胞類型的過程。
如本文中所使用，「治療性」係指治療、治癒及/或改善疾病、病症、病狀或副作用或係指降低疾病、病症、病狀或副作用之進展速率。該術語在其範疇內亦包括增強正常生理功能、緩解性治療及疾病、病症、病狀或副作用之局部補救。
如本文中所使用之術語「治療(treating/treatment)」一般係指獲得所需藥理及/或生理效果。該效果就預防或部分預防疾病或其症狀或病況而言可具防治性，且/或就部分或完全治癒疾病、病狀、症狀或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文中所使用之術語「治療」涵蓋對哺乳動物，尤其人類之任何治療，且包括：(a)預防疾病在易患該疾病但尚未診斷患有該疾病之受試者中發生；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展；或(c)減輕疾病，亦即緩和或改善疾病及/或其症狀或病狀。如本文中所使用之術語「治療」係指治療性治療及防治性或預防性措施兩者。需要治療者包括已患有病症者以及待預防病症者。
如本文中所使用，「預防性」係指在疾病或病狀發生之前(即使未診斷出)或在疾病或病狀仍處於亞臨床階段時妨礙或阻止疾病或病狀。
如本文中所使用，「活性劑」係指在生物學上具有活性或以其他方式誘導對投與受試者之生物或生理影響之物質、化合物或分子。在本發明之上下文中，由本文中所描述之方法產生的NPC、OPC及寡樹突細胞為「活性劑」。
如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」係指稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑，其中活性劑、本發明之軟骨細胞或含有本發明的寡樹突細胞之組合物與其結合投與且其經聯邦或州政府之監管機構批准或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他一般認識之供用於動物及/或人類的藥典中。
如本文中所使用，「FoxO」係指叉形頭轉錄因子家庭成員之亞類。對於本文中所揭示之實驗，可使用來自例如FoxO1、FoxO2、FoxO3a及FoxO4的FoxO家庭成員中之一或多者的mRNA。
除非本文中另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習此項技術者通常理解相同之含義。
細胞類型：例示性細胞類型可包括例如外胚層細胞；神經先驅細胞；寡樹突細胞先驅細胞；寡樹突細胞。
用於iPSC之培養容器的適合表面之實例包括但不限於：Vitronetin、E-鈣黏附蛋白、Corning® Synthemax® II或基質膠；對於神經外胚層及神經先驅細胞而言，適合表面包括但不限於基質膠、PLO-層黏連蛋白；對於神經先驅細胞及寡樹突細胞先驅細胞及寡樹突細胞而言，適合表面包括但不限於基質膠或PLO-層黏連蛋白或膠原蛋白。
在一個態樣中，用於去分化或再程式化體細胞之例示性方法可包括使用選自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog及Lin28的合成mRNA再程式化因子及轉活化結構域中之任何一或多者，從而體細胞經再程式化或去分化。用於iPSC調節之方法及組合物描述於美國專利申請案第13/893,166號及第14/292,317號中，此類iPSC可用於本文中所描述之方法。該等申請案之內容以引用之方式併入本文中。
若可能，以臨床應用而言，用於大規模生產之懸浮液系統更實際。因此，在各階段，該等步驟方案係經測試以觀察細胞是否能以懸浮液方式順利擴增。在某些實施例中，針對此懸浮培養，存在有針對使用懸浮細胞培養，及低細胞附著培養盤及容器之步驟方案可使用。
在某些實施例中，可針對最佳誘導條件調節諸如氧濃度之環境條件。
在某些實施例中，提供選擇所需細胞或提高其在總細胞培養物群體中之匯合百分比或細胞密度的過程及方法。
在某些實施例中，提供低溫保存NPC、OPC或寡樹突細胞樣細胞之方法。有些經分化細胞出於最佳細胞存活率之目的可能需要在儲存期間低溫保存。舉例而言，可在培養基中使用含10% DMSO之2.5% HSA。可使用此應用優化細胞數量，以進一步改良儲存之存活率。
亦提供再培養分化細胞方法。細胞可在大部分培養容器中再培養：例如但不限於T75燒瓶、T25燒瓶、4孔盤、6孔盤、8孔盤、24孔盤、48孔盤及96孔盤。細胞可依不同細胞密度再培養，以供不同應用。
在某些實施例中，本發明亦提供在操作整個分化過程期間處理細胞受到之物理應激壓力，藉以改良存活率的方法。在分化期間某些類型之細胞極小，如iPSC。此等小細胞對離心力極其敏感。進行維持時，此等細胞可培養成群落，隨後再解離為集群而非單細胞。進行分化時，若需要單細胞，則吾人可在剝離細胞之前先結束解離，去除解離溶液，且使剩餘解離溶液進一步解離細胞。此方案常用在細胞培養物中。iPSC對過度離心力極其敏感。有些類型之細胞在分化期間極具黏性，如iPSC。此等細胞對剪切力極其敏感。當處理此等細胞時，利用10 mL移液管以避免利用任何小尖端且避免反覆上下移液細胞。寡樹突細胞具有包括多個分支之獨特細胞形態，有能力處理而附著至軸突。需要精細操作及本發明之發明人經由試驗及磨難獲得的不常見技能，才能將寡樹突細胞從一個容器移至另一個容器。
經由本發明之方法產生之NPC、OPC及寡樹突細胞可用於治療脊損傷及其他損傷。舉例而言，利用本發明之方法產生之NPC、OPC及/或寡樹突細胞的高度增濃或純化群可用於移植至腦及脊柱疾病及損傷之各種病況中--背景資訊參見(Liu K等人，「Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration」Annu Rev Neurosci
. 2011; 34:131-152)。(Tuszynski MH, Steward O., Concepts and Methods for the Study of Axonal Regeneration in the CNS.Neuron
. 2012; 74:777-791)。(Gage, 「Mammalian Neural Stem Cells」，Science
287:1433-1438 (2000)，其皆以全文引用之方式併入本文中)。(Goldman,「Adult Neurogenesis: From Canaries to the Clinic」，J . Neurobiology
36:267-286 (1998)；Pincus等人,「Neural Stem and Progenitor Cells: A Strategy for Gene Therapy and Brain Repair」，Neurosurgery
42:858-868 (1998)；Svendsen等人,「Neural Stem Cells in the Developing Central Nervous System: Implications for Cell Therapy Through Transplantation」，Prog . Brain Res .
127:13-34 (2000)；以及Svendsen等人,「New Prospects for Human Stem-Cell Therapy in the Nervous System」，Trends Neurosci .
22:357-364 (1999)，該等文獻全部以全文引用之方式併入本文中)。(Snyder等人,「Multipotent Neural Precursors Can Differentiate Toward Replacement of Neurons Undergoing Targeted Apoptotic Degeneration in Adult Mouse Neocortex」，Proc . Natl . Acad . Sci . USA
94:11663-11668 (1997)，其以全文引用之方式併入本文中)，且可用於在化學脫髓鞘中使脫髓鞘之大腦區域再髓鞘化(Windrem等人,「Progenitor Cells Derived from the Adult Human Subcortical White Matter Disperse and Differentiate as Oligodendrocytes Within Demyelinated Regions of the Rat Brain」，J . Neurosci . Res .
69:966-975 (2002)，其以全文引用之方式併入本文中)或在自身免疫脫髓鞘中使脫髓鞘之大腦區域再髓鞘化(Pluchino等人,「Injection of Adult Neurospheres Induces Recovery in a Chronic Model of Multiple Sclerosis」，Nature
422:688-694 (2003)，其以全文引用之方式併入本文中)。(Yandava等人，「Global Cell Replacement is Feasible Via Neural Stem Cell Transplantation: Evidence from the Dysmyelinated Shiverer Mouse Brain」，Proc . Natl . Acad . Sci . USA
96:7029-7034 (1999)，其以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，根據本發明所產生及投與之細胞會分化成神經元、寡樹突細胞及星形膠質細胞，且因而使受傷大腦及脊髓的損失細胞元素重建。在一些實施例中，將本發明之NPC、OPC及寡樹突細胞植入至患病區域中可調解結構再生作用及修復。此可包括但不限於因中風及損傷之大腦組織損失的重建。另外，神經幹細胞在產期前後的大腦中具有高度遷移性，且因此亦可用以添補在遺傳性及代謝疾病中有缺陷或經突變之酵素。
迄今，神經幹細胞及先驅細胞移植之大部分實驗治療性研究已利用胚胎或成人組織作為神經幹細胞及先驅細胞之來源來完成。此等方法需要從動物及人類供體兩者持續採集新胚胎及成人組織。人類供體作為來源特別是個問題，此係因為人類組織衍生之細胞(不論是胚胎或成人來源)均難以獲得且更難以標準化及按比例增長(Keyoung等人,「Specific Identification, Selection and Extraction of Neural Stem Cells from the Fetal Human Brain」，Nature Biotech .
19:843-850 (2001)；Pincus等人,「Fibroblast Growth Factor-2/Brain-Derived Neurotrophic Factor-Associated Maturation of New Neurons Generated from Adult Human Subependymal Cells」，Ann . Neurol .
43:576-585 (1998)；Roy等人,「Promoter-Targeted Selection and Isolation of Neural Progenitor Cells from the Adult Human Ventricular Zone」，J . Neurosci . Res .
59:321-331 (2000)；以及Roy等人，「In Vitro
Neurogenesis by Progenitor Cells Isolated from the Adult Human Hippocampus」，Nature Med . 6 : 271 - 277
(2000)，該等文獻以全文引用之方式併入本文中)。相反地，利用本發明之方法產生之NPC、OPC及寡樹突細胞允許神經幹細胞及先驅細胞事先採集、可擴展性的擴增及引導式分化。
此外，根據本發明，在一些實施例中可使用自體NPC、OPC及寡樹突細胞。可替代地，在本發明之治療方法中的任一者中可使用異源NPC、OPC及寡樹突細胞。已認為衍生自鼠類及人類源兩者之ES細胞之神經幹細胞及先驅細胞能夠在ES衍生之神經膠質及寡樹突細胞情況下進行再髓鞘化且在ES衍生之中腦多巴胺激導性神經元情況下於實驗性帕金森氏病中進行多巴胺激導性補給兩者。現藉由實現自ES細胞培養物純化神經幹細胞，本發明實質上增加其用途之可靠性及安全性兩者，且因此可除去對人類組織採集之需求。
本發明之另一態樣提供治療患有神經變性病狀之受試者的方法，該方法包含以有效治療神經變性病狀之量向患者投與如上文所描述之產後衍生細胞。在某些實施例中，神經變性病狀為急性神經變性病狀，諸如大腦損傷(病灶性或彌漫性大腦損傷)、脊髓損傷或外周神經損傷，例如，因物理或化學燒傷、深切口或肢體分離、腦血管機能不全造成。在其他實施例中，其為慢性或進行性神經變性病狀，諸如帕金森氏病、阿茲海默氏病、亨廷頓氏病、肌肉萎縮性側索硬化、腫瘤或慢性外周神經損傷、匹克症、泛發性路易體疾病、進行性核上麻痹(斯蒂爾-理查森症候群)、多系統變性(夏伊-德爾格症候群)、與神經變性相關之慢性癲癇病症、包括肌肉萎縮性側索硬化之運動神經元疾病、變性運動失調、皮層基底節變性、關島型ALS-帕金森氏癡呆綜合症、亞急性硬化性全腦炎、共核蛋白病(包括多發性系統萎縮症)、原發性進行性失語症、黑質退化症、馬查多-約瑟夫病/3型脊髓小腦失調及橄欖體腦橋小腦變性、妥瑞症、延髓及假性延髓麻痹、脊及脊髓延髓肌肉萎縮 (肯尼迪氏病)、原發性側向硬化、家族性痙攣性截癱、沃德尼格-霍夫曼病、庫格爾伯格-威蘭德病、塔伊-薩奇氏疾病、山多夫氏病、家族性痙攣性病、沃法特-庫格爾伯格-威蘭德病、痙攣性截癱、進行性多病灶腦白質病、家族性自主神經失調(里雷-戴症候群)及朊病毒疾病(包括但不限於庫賈氏症、GSS氏病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、庫魯病及致死家族性失眠)。
在另其他實施例中，其為與脫髓鞘相關之疾病，諸如多發性硬化症、急性播散性腦脊髓炎、視神經脊髓炎、橫貫性脊髓炎、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病、格-巴二氏症候群、腦橋中央髓鞘溶解症、諸如腦白質障礙之遺傳性脫髓鞘疾病、恰克-馬利-杜斯氏症及卡納萬病。
在某些實施例中，本發明之iPSC、ESC、NPC、OPC、寡樹突細胞可個別性地、共同或以兩種或多於兩種之組合形式投與。在另其他實施例中，細胞與諸如用於神經治療之藥物的至少一種其他試劑或諸如抗炎劑、抗凋亡劑、抗氧化劑或生長因子的另一有益輔助試劑共同投與。
在某些實施例中，細胞在患者之中樞神經系統或外周神經系統中之預定位點處投與。其可藉由注入或輸液或包封於可植入器件內或藉由植入含有細胞之基質或架構來投與。
本發明之另一態樣提供用於治療患有神經變性病狀之患者的醫藥組合物，其包含本發明之細胞類型中之一或多者及醫藥學上可接受之載劑。待治療之神經變性病狀可為急性神經變性病狀，或其可為慢性或進行性病狀。
在某些實施例中，醫藥組合物包含諸如用於神經治療之藥物的至少一種其他試劑或諸如抗炎劑、抗凋亡劑、抗氧化劑或生長因子的另一有益輔助試劑。
在某些實施例中，調配醫藥組合物供用於藉由注入或輸液投與。可替代地，其可包含包封細胞之可植入器件或含有細胞之基質或架構。醫藥組合物可含有諸如天然生物材料之其他材料，例如明膠、膠原蛋白、羧基甲基、纖維素。可注射傳遞可利用生理鹽水媒劑。實例
現參考以下實例描述本發明。僅出於說明之目的提供此等實例，且本發明不限於此等實例，而係涵蓋由於本文中所提供之教示顯而易見之變化形式。下表包括供用於一些實施例之實驗條件，包括實驗上檢驗之條件。來自下表或本文中所提供之參數、參數範圍或例示性參數中的任一者可與下表或本文中所提供之參數、參數範圍或例示性參數中的任何其他者一起使用。
表
1
：寡樹突細胞分化
在一些實施例中，用於接種之細胞數目可為例如約(7.1250 × 104
、1.187500 × 106
、2.375000 × 106
、4.750000 × 106
、7.125000 × 106
、9.500000 × 106
、1.1875000 × 107
或1.4250000 × 107
)或任何兩個所列舉細胞數目之間的任何細胞數目。可藉由以細胞數目除以培養容器之生長面積來判定任何培養容器的以細胞數目/cm2
為單位之接種密度(參見表2)，例如利用具有9.5 cm2
生長面積之6孔盤，接種密度將為約(0.75 × 105
、1 × 105
、1.25 × 105
、2.50 × 105
、5.00 × 105
、7.50 × 105
、1 × 106
、1.25 × 106
或1.5 × 106
個細胞/cm2
)/六孔盤，或任何兩個所列舉密度之間的任何密度。因此，任何培養容器所需之細胞密度可以類似方式判定。
表
2
常見培養容器之生長面積
在一些實施例中，氧氣濃度可為例如約(2%、2.25%、2.5%、2.75%、3.0%、3.25%、3.5%、3.75%、4.0%、4.25%、4.5%、4.75%、5%、5.25%、5.5%、5.75%或6.0%)氧氣或任何兩個所列舉百分比之間的任何範圍。實例 1 ： 自 iPSC 產生神經先驅細胞
將iPSC接種於標準尺寸6孔細胞培養盤(約9.5 cm2生長面積/孔)或標準尺寸12孔細胞培養盤(約3.8 cm2生長面積/孔)中以開始分化。其他尺寸之培養容器視情況亦可應用且有時由於利用試劑及時間之更高效率可比6孔或12孔盤更佳。申請人已確認所揭示之方法可用於其他尺寸培養容器。
在6孔盤中，已成功地利用約1 × 105
至約1 × 106
/孔之群體尺寸的細胞。在存在足夠具有清晰界定邊緣之典型iPSC群落時，認為iPSC準備分化，其中細胞為緊湊的且群落未過度生長。即使本申請人能夠成功地衍生由其他工作人員利用非mRNA方法製得之iPSC，諸如藉由NIH/Lonza (資料未展示)製得之NCL2 iPSC株，利用此等指標產生之本發明的iPSC之質量亦證明在本發明之iPSC株與由其他者利用其他方法產生之iPSC株相比較時對分化至關重要。在另一方面，所揭示之技術亦可在過程期間在任何階段應用，例如NPC開始朝向OPC、星形膠質細胞或其他膠細胞衍生；或OPC開始朝向星形膠質細胞或其他膠細胞衍生。在一個例示性實驗中，申請人利用自供給組織分離之原發性NPC，且利用相同方案將其進一步分化成OPC及寡樹突細胞並同時自iPSC直接地分化NPC。利用兩種不同來源之NPC之結果通常與具有略高效率及在申請人嘗試在彼階段在懸浮液中生長細胞時(資料未展示)形成球體之較高趨勢的iPSC衍生之NPC類似。
誘導在此階段之iPSC以分化成外胚層譜系細胞。吾等發現懸浮液培養系統極其適用於在此階段之規模擴大，儘管用於分化之最新方案傾向於利用附著單層細胞。吾等發現用於誘導之生長於懸浮液中之iPSC對化學毒性更具有抵抗性且在後續階段更易於再接種。吾等在針對特定分化「回合」選擇懸浮液培養途徑時係利用超低附著盤(Sigma-Aldrich)或其他低附著盤以促進iPSC懸浮液細胞生長。
在需要繼代iPS細胞時，重要的為用引起低細胞毒性且產生更小iPSC集群之方案解離iPSC群落，該等iPSC群落可在需要懸浮液培養時迅速形成球體。利用TripLETM
(ThermoFisher)、Accutase (Life Technology)或EDTA藉由用含約0.1 mM、有時約0.5 mM或約1 mM EDTA之DPBS (Fisher Scientific)在約37℃下解離5分鐘來解離iPSC。成功利用各種解離時間，包括約1至約2分鐘，及有時對此步驟約10至約20分鐘。在一些實施例中，解離時間可為約(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)或在任何兩個所列舉之間的任何時間範圍內。
針對培養基，吾等用5% KSR測試MEMa或DMEM/F12或DMEM+B27且能夠視需要在此分化階段得到結果。培養基補充劑N2、BSA或HAS及bFGF亦取決於在此階段利用哪種基礎培養基而用於培養基中。隨後誘導iPSC離開多能階段且作為視情況選用之步驟藉由例如約(5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM)或任何兩個所列舉濃度之間的任何範圍之SB431542、LDN193189、PD173074的存在而朝向外胚層分化。LDN-193189為骨形態生成蛋白(BMP) I型受體ALK2及ALK3之高效小分子抑制劑。LDN193189為選擇性轉錄活性形態生成蛋白質(BMP) I型受體抑制劑。其抑制活化素受體樣激酶-2 (ALK2)及ALK3。SB431542為TGF-β/活化素/NODAL路徑之選擇性及強力抑制劑且為ALK5之強力及選擇性抑制劑。PD173074為強力FGFR1抑制劑且亦抑制VEGFR2。在其他實施例中，亦可使用此等路徑之其他抑制劑。
在一個實驗中，細胞隨後用Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2、FoxO (亞類之一或多個成員) mRNA以個別性地或呈組合形式以20 ng/孔之劑量利用具有Stemgent轉染劑(Stemgent)或其他轉染試劑的六孔盤進行轉染。當使用其他類型培養盤時，mRNA劑量可基於培養容器之面積或培養培養基量之體積按比例調整。此轉染有時以高約10倍之mRNA劑量利用Stemgent轉染劑或其他可商購轉染試劑重複3、4、5或6次。本文中所揭示之實例之重複轉染可在第一次轉染之後執行約24小時加或減2至3小時或自第一次轉染執行隔夜或在第一次轉染之後執行約(6-24小時、7-24小時、8-24小時、9-24小時、10-24小時、11-24小時、12-24小時、13-24小時、14-24小時、15-24小時、16-24小時、17-24小時、18-24小時、19-24小時、20-24小時、21-24小時、22-24小時)或兩個所列舉時間點之間的所有範圍。在此階段之細胞展示比間葉細胞更接近於神經先驅細胞的形態，但由表現TF產生之此等NPC相比於由其他大部分基於化學的方法產生之NPC似乎在寡樹突細胞路徑中產生細胞之更高產率。在此階段之NPC藉由抗體染色為Pax6陽性，從而證明其在神經原始譜系中之一致性(圖1)。mRNA DNA及Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2、FoxO之蛋白質序列為此項技術中已知的，例如GenBank。製備供用於本文中所描述之方法轉染之mRNA的方法為此項技術中已知的，例如美國專利申請案第13/893,166號及第14/292,317號；(內容以引用之方式併入本文中)。實例 2 ： 自神經先驅細胞產生寡樹突細胞先驅細胞
將神經先驅細胞或NPC接種在商業細胞培養容器上。將6孔盤用於圖2中所展示之實驗，但亦可應用其他孔尺寸。盤用基質膠(BD Biosciences)及PLO-層黏連蛋白預塗，隨後將約1 × 105至1 × 106個細胞接種於補充有常用濃度之KSR以及抗壞血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰島素、RA、B27、CAMP、生物素的DMEM/F12或DMEM或MEM3中。藉由利用本領域中通常已知之基於化學之方案產生的NPC亦用於在以下步驟中產生OPC，觀測到藉由引入TF活性產生之NPC產生更多且更好的OPC。
在一個實驗中，細胞隨後用Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA中的一種或各種組合以個別性地或呈組合形式以約20 ng/孔/細胞命運因子之劑量在培養基中使用Stemgent轉染劑(Stemgent)進行轉染，且在約24小時以低至約10 ng且高達約200 ng/孔的劑量利用Stemgent轉染劑或其他可商購轉染試劑重複2、3、4或更多次。在此階段之細胞呈現自NPC之典型形態改變至OPC且對A2B5及O4為染色陽性(圖2)。實例 3 ： 自 OPC 產生寡樹突細胞
寡樹突細胞先驅細胞培養於用含基質膠(BD Biosciences)及/或PLO-層黏連蛋白之DMEM/F12或MEMa或DMEM B27預塗之6孔或其他盤中。其他類似附著細胞培養基亦適合於使用。培養基通常補充有常用濃度之抗壞血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3、胰島素及KSR。細胞經培養約1週、有時約2、約3或甚至約4週，在此期間成熟狀寡樹突細胞出現且自OPC集群向外轉移隨後擴散至空間中，其中其形成增加數目之樹枝狀過程(圖3)。實例 4 ： 在進一步培養期間 ， 寡樹突細胞形成新集群
在使來自階段2之寡樹突細胞樣細胞繼續再生長約1週至約4週或甚至更久時，其以重疊過程，在某種程度上模擬活體內外鞘形成來形成新集群(圖4)。實例 5 ： 衍生自人類 iPSC 之 寡樹突細胞展示特異性細胞標記物之示例性實施例
為證明衍生自人類多能幹細胞之寡樹突細胞為成熟寡樹突細胞，藉由化學或物理手段將其自分化培養盤移至球體中、固定且用抗MBP抗體染色。呈現出如此產生之所有細胞對於MBP (一種通常已知的成熟寡樹突細胞標記物)為染色陽性(圖5)。實例 6 ： 動物模型中之 iPSC 衍生 寡樹突細胞功能
為進一步測試根據本發明產生之成熟寡樹突細胞的功能，可在諸如由Mark Tuszynski組及其他者描述之彼等的脊髓損傷大鼠模型中測試iPSC衍生之寡樹突細胞的脊髓修復功能。寡樹突細胞可傳遞為細胞、細胞片、細胞集群、個別細胞類型或與諸如OPC或NPC之其他細胞組合。藉由所揭示之方法自iPSC衍生之OPC亦將作為治療脊髓損傷或其他中樞神經疾病和病狀之治療候選物來測試。在另一實施例中，在一些情況下，在存在諸如BDNF、NGF等之細胞營養因子的情況下，寡樹突細胞、OPC、NPC或其組合可存在於水凝膠上。
諸如猴及黑猩猩之非人類靈長類模型亦可用於就安全性及功效而言使用免疫抑制劑或使用對應非人類靈長類iPSC衍生NPC、OPC或寡樹突細胞利用基本上本文中所揭示的相同方法測試諸如中樞神經元系統之寡樹突細胞的人類細胞。實例 7 ： 治療患有脊髓損傷或其他中樞神經疾病和病狀之人類患者中之 iPSC 衍生 寡樹突細胞
利用人類iPSC衍生寡樹突細胞、OPC、NPC、神經元或以上之組合利用經調適以符合根據cGMP程序的要求之所揭示之方案的臨床試驗將參考其他細胞治療根據動物研究給藥。所製造細胞可傳遞至脊髓或可能傳遞至人類中樞神經系統之其他部分，諸如大腦。實例 8 ： 利用用於驅動關鍵基因表現之 CRISPR - Cas9 系統由此利用經由細胞內轉錄產生之 mRNA 以供細胞命運決策
如圖6中所展示，Cas9、dCas9之核酸酶去活化版本鍵聯至螢光蛋白、mNeonGreen (Allele Biotechnology)，作為實例展示功能蛋白可經由由gRNA引導之Cas9融合定位至基因組內所關注之區域。相同策略可應用於功能結構域、蛋白質、肽等，以便驅動基因表現(亦即細胞內之mRNA產生將為細胞命運決定的)，實例為圖6中所展示之MyoD轉錄活化結構域；其他實例可為VP16及多個其他此類結構域。在此轉錄活化融合Cas9融合蛋白質經由接通諸如Ngn2或Pax6或Sox2或Brn2或FoxO或Oligo2或NKX2.2或SOX10之關鍵TF之gRNA置放於區域中時，可得到轉染活體外經轉錄mRNA的結果。相同策略可應用於藉由表觀遺傳修飾染色體上之特定區域而影響基因表現之酶活性域或蛋白質，諸如利用DNA (胞嘧啶-5)-甲基轉移酶1或DMNT1。與Cas9融合之核苷酸轉化酶可用於將特定核苷酸轉換成另一核苷酸，由此改變所編碼蛋白質或致使蛋白質產生之提前終止。以此方式，細胞之基因表現概況可改變且細胞命運在所改變基因為諸如上文所列之基因及其他基因的關鍵TF時遵循本申請案中所揭示之一般策略判定。
核酸酶去活化Cas9以及利用導引RNA融合轉錄活化結構域及標靶之方法為此項技術中已知的。(Didovyk等人,Current Opinion in Biotechnology
(2016), 40:177-184) (內容以引用之方式併入本文中)。製備靶向細胞命運因子啟動子之導引RNA序列可如Balboa等人，Stem Cell Reports
(2015) 5:448-459 (內容以引用之方式併入本文中)中製備。
現將相對於如下文所描述之圖式描述本發明之態樣：
圖1.神經先驅細胞(NPC)誘導之示例性實施例。
圖2.寡樹突細胞先驅細胞(OPC)誘導之示例性實施例。
圖3.寡樹突細胞誘導之示例性實施例。
圖4.寡樹突細胞進一步培養及成熟之示例性實施例。
圖5.衍生自人類iPSC之寡樹突細胞展示特異性細胞標記物之示例性實施例。
圖6.利用基於CRISPR-Cas之基因表現調節劑來實現經分化之細胞內部的不同關鍵TF mRNA含量之示例性實施例。
Claims (48)
- 一種用於誘導經誘導多能幹細胞(iPSC)及/或胚胎幹細胞(ESC)分化成神經先驅細胞(NPC)之方法，該方法包含： a)將iPSC及/或ESC接種在經塗佈、未經組織處理之培養容器上之培養基中； b)用編碼一或多種細胞命運因子之呈個別mRNA或組合mRNA的mRNA轉染步驟a)之該等細胞；及 c)培養步驟b)之該等iPSC及/或ESC直至該等細胞分化成NPC。
- 如請求項1之方法，其中步驟b)之該等細胞命運因子選自由以下中之一或多者組成之群：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其係呈個別mRNA或組合mRNA轉染。
- 如請求項2之方法，其中步驟b)之該等細胞命運因子為Ngn2。
- 如請求項2之方法，其中步驟b)之該細胞命運因子為Pax6。
- 如請求項2之方法，其中步驟b)之該細胞命運因子為Sox2。
- 如請求項2之方法，其中步驟b)之該細胞命運因子為Brn2。
- 如請求項2之方法，其中步驟b)之該細胞命運因子為FoxO家族因子。
- 如請求項2之方法，其中步驟b)之該等細胞命運因子中之一或多者與轉活化結構域融合。
- 如請求項1之方法，其中步驟c)之該等細胞係經培養直至該等細胞表現步驟c)之該等細胞命運因子中之一或多者。
- 如請求項1之方法，其進一步包含將SB43542、LDN193189及PD173074中之一或多者添加至步驟c)之該等細胞中。
- 如請求項1之方法，其中步驟a)至c)之該等培養條件為在約2%至約6%的氧氣濃度中。
- 如請求項1之方法，其中用於步驟a)至c)的該培養基選自由以下組成之群：最低必需培養基-α (minimal essential media-alpha；MEMa)或杜氏改良伊格爾培養基:營養混合物F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12；DMEM/F12)或具有B27補充劑之DMEM。
- 如請求項12之方法，其中所用之該培養基亦含有基因剔除血清替代物(Knock Out Serum Replacement；KSR)。
- 如請求項13之方法，其中該培養基進一步由bFGF、N2或B27、BSA或HSA(人類血清白蛋白)中之一或多者組成。
- 如請求項1之方法，其中該培養容器係經基質膠(Matrigel)及/或PLO-層黏連蛋白塗佈。
- 如請求項1之方法，其中步驟a)之該等iPSC及/或ESC係每個培養燒瓶或培養孔盤使用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞進行接種。
- 如請求項1之方法，其中步驟c)之該等細胞經培養約3至約10天。
- 如請求項1之方法，其中步驟b)之該轉染重複至少一次。
- 一種用於自神經先驅細胞產生寡樹突細胞先驅細胞(OPC)之方法，該方法包含： a)將NPC接種在經塗佈細胞培養容器上之培養基中； b)用編碼一或多種細胞命運因子之呈個別mRNA或組合mRNA的mRNA轉染步驟a)之該等細胞，以便將神經先驅細胞分化成寡樹突細胞先驅細胞； c)培養步驟c)之該等細胞直至該等NPC之形態改變成OPC之形態。
- 如請求項19之方法，其中步驟a)之該等NPC係每個培養燒瓶或培養孔盤使用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞進行接種。
- 如請求項19之方法，其中用於步驟b)中之轉染的該mRNA係編碼細胞命運因子 ，該mRNA係選自由個別性地或呈組合之Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA組成之群中的一或多者。
- 如請求項21之方法，其中該mRNA編碼Oligo2。
- 如請求項21之方法，其中該mRNA編碼NKX2.2。
- 如請求項21之方法，其中該mRNA編碼Sox10。
- 如請求項21之方法，其中該mRNA編碼Oligo1。
- 如請求項19之方法，其中係使用六孔培養盤，且用於步驟b)中之轉染劑量為約20 ng/細胞命運因子。
- 如請求項19之方法，其中第一次轉染之後，該轉染重複至少再兩次。
- 如請求項19之方法，其中步驟a)至d)之該等培養條件為在約2%至約6%的氧氣濃度中。
- 如請求項19之方法，其中該等培養容器盤係經基質膠及PLO-層黏連蛋白塗佈。
- 如請求項19之方法，其中用於步驟a)至c)之該培養基選自由以下組成之群：DMEM/F12、DMEM及MEMa。
- 如請求項30之方法，其中該培養基經補充以下之一或多者：KSR、抗壞血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰島素、RA、B27、CAMP及生物素。
- 一種用於自OPC產生寡樹突細胞之方法，其包含： a) 將OPC接種在經塗佈細胞培養容器上之培養基中；及 b)培養步驟a)之該等細胞直至細胞出現樹枝狀過程或產生髓鞘鹼性蛋白(MBP)。
- 如請求項32之方法，其中用於步驟a)至b)之該培養基選自由以下組成之群：DMEM/F12、DMEM及MEMa。
- 如請求項33之方法，其中該培養基經補充選自由以下組成之群的培養基補充劑中之一或多者：KSR、抗壞血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰島素。
- 如請求項32之方法，其中步驟a)之該等OPC係每個培養燒瓶或培養孔盤使用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞進行接種。
- 如請求項32之方法，其中步驟b)之該等細胞經培養約7至約30天。
- 如請求項32之方法，其中步驟a)中之該等細胞培養容器係經基質膠及/或PLO-層黏連蛋白塗佈。
- 一種細胞，其以請求項1、19或32之方法獲得。
- 一種用於治療疾病、病症或畸形之組合物，其包含如請求項38之細胞。
- 一種如請求項38之細胞或如請求項39之組合物的用途，其用於製造用以治療疾病、病症及/或畸形之藥物。
- 一種用於誘導幹細胞相繼或直接地分化成NPC、OPC、寡樹突細胞的方法，該方法包含執行如請求項1之步驟、隨後如請求項19之步驟、隨後如請求項32之步驟。
- 一種用於誘導幹細胞相繼或直接地分化成NPC、OPC、寡樹突細胞之方法，該方法包含： a)將iPSC及/或ESC接種在經塗佈培養容器上，其中該等iPSC及/或ESC係每個培養燒瓶或培養孔盤使用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞接種於培養基中，該培養基包含最低必需培養基-α (MEMa)或杜氏改良伊格爾培養基:營養混合物F-12 (DMEM/F12)或具有B27補充劑之DMEM，所有培養基具有基因剔除血清替代物(KSR)； b)用編碼細胞命運因子之mRNA轉染步驟a)之該等細胞，該等細胞命運因子選自由以下中之一或多者組成之群：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其係呈個別mRNA或組合mRNA轉染； c)培養步驟b)之該等iPSC及/或ESC直至該等細胞分化成NPC； d)分離來自步驟c)的該等NPC； e)將NPC接種在經塗佈細胞培養容器上，其中該等NPC係每個培養燒瓶或培養孔盤使用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞接種於培養基中，該培養基包含MEMa或DMEM/F12或DMEM，所有培養基具有KSR及選自由以下組成之群的該等培養基補充劑中之一或多者：抗壞血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰島素、RA、B27、CAMP及生物素； f)用由個別性地或呈組合之以下組成之群中之一或多者利用轉染試劑轉染步驟e)之該等細胞：Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA； g)重複步驟e)之轉染至少再兩次； h)培養步驟g)之該等細胞直至該等細胞之形態自NPC細胞之形態改變成OPC細胞之形態； i)分離來自步驟h)之該等OPC； j) 將來自步驟i)之該等分離之OPC接種在經塗佈細胞培養容器上，其中該等OPC係每個培養燒瓶或培養孔盤使用約70,000個細胞至約14,000,000個細胞接種於培養基中，該培養基包含MEMa或DMEM/F12或DMEM，所有培養基具有KSR及選自由以下組成之群的該等培養基補充劑中之一或多者：抗壞血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰島素；及 k)培養該等細胞至少約1週，直至寡樹突細胞出現樹枝狀過程及/或產生髓鞘鹼性蛋白(MBP)。
- 19、41或42之方法，其中該NPC衍生自該接受者個體。
- 19、41或42之方法，其中該等起始細胞係採集自體液或組織。
- 19、41或42之方法，其中該等起始細胞係採集自該接受者。
- 如請求項1或19之方法，其進一步包含以下步驟d)： d)將該等來自步驟c)之NPC藉由轉移至未經塗佈超低附著培養盤進行擴增。
- 如請求項27之方法，其中利用六孔培養盤，且該轉染劑量為呈約10 ng/細胞命運因子至約200 ng/細胞命運因子之mRNA劑量。
- 如請求項19之方法，其中步驟c)之該等細胞經培養約4至約20天。
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