TW201905458A - 檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組 - Google Patents
檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組Info
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Abstract
本發明提供了一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組，包含以下步驟。首先，提供一微流道裝置，並在微流道之基板上及/或蓋板上形成一塗佈層，塗佈層上有一抗體，後將一生物樣品注入微流道裝置之注入區中，生物樣品流經該等微流道，從而使生物樣品中的細胞被捕捉在塗佈層上。接著進行一DNA生成步驟，以及進行一雜交步驟。接下來進行一環化步驟，以及一滾環式擴增步驟，而得到一擴增產物。最後進行一偵測步驟，偵測擴增產物以確認細胞的突變位置。
Description
本發明是關於一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組(kit)，特別來說，是關於利用微流道裝置並搭配鎖式探針與滾環式擴增的一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組。
微流道裝置(Microfluidic device)技術是一項把生物、化學和醫學分析過程的樣品製備、反應、分離和檢測等基本操作聚集到一塊微米尺度的晶片上，自動完成分析全過程的技術。近年來，微流道晶片、微流體裝置在生物醫療檢測、製藥、環境和食品安全監測等方面有著越來越重要的應用。
現有的微流道裝置可視需求而產生不同的功用，因此被應用在不同的研究的領域中，目前也有越來越多關於微流道裝置的設計，以符合各種分子生物學對於細胞內分子狀態的檢測需求。
本發明於是提供了一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組，其利用特殊的微流道裝置，搭配鎖式探針與滾環式擴增，可以一次大量的檢測細胞的突變位置。
根據本發明的一個實施方式，提供了一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組，包含以下步驟。首先，提供一微流道裝置。微流道裝置包含一基板以及一蓋板，依序具有一注入區、一微流道區以及一輸出區，注入區與微流道區連通，微流道區與輸出區連通；複數個微流道，設置在微流道區中且由基板以及蓋板架設形成，微流道沿一第一方向延伸，且具有複數個脊骨(rib)設置於微流道之至少一面上，脊骨沿著一第二方向彎曲地延伸。並在微流道之基板上及/或蓋板上形成一塗佈層，塗佈層上有一抗體，後續將一生物樣品注入微流道裝置之注入區中，使生物樣品流經該等微流道，從而使生物樣品中的細胞被捕捉在塗佈層上。接著對細胞進行一DNA生成步驟，包含使細胞產生一目標DNA，該目標DNA具有一目標序列，後續進行一雜交步驟，包含使用一鎖式探針(padlock probe)與目標DNA雜交，鎖式探針具有兩鎖式序列位在鎖式探針的兩末端，兩鎖式序列頭尾合起來互補於目標序列。進行一環化步驟，使鎖式探針的兩鎖式序列連接。進行一滾環式擴增(rolling circle amplification)步驟，以擴增鎖式探針而得到一擴增產物。最後進行一偵測步驟，偵測擴增產物以檢測細胞的突變位置。該細胞並可另用抗體進行免疫螢光染色(immunofluorescence staining)，以進一步確認細胞種類與來源。
根據本發明另一實施例，本發明還另外提供了一種檢測生物樣品中細胞突變位置的套組，包含一微流道裝置、一反轉錄酶、一鎖式探針、一偵測探針、一聚合酶以及核苷酸。微流道裝置，包含一基板以及一蓋板，依序具有一注入區、一微流道區以及一輸出區，注入區與微流道區連通，微流道區與輸出區連通；複數個微流道，設置在微流道區中且由基板以及蓋板架設形成，微流道沿一第一方向延伸，且具有複數個脊骨設置於微流道之至少一面上，脊骨沿著一第二方向彎曲地延伸；以及一塗佈層，設置在該微流道之該基板上及/或該蓋板上形成，該塗佈層上有一抗體。反轉錄酶用以將RNA反轉錄產生一目標DNA，目標DNA具有一目標序列。鎖式探針具有兩鎖式序列位在鎖式探針的兩末端，兩鎖式序列頭尾合起來互補於目標序列。偵測探針包含有與鎖式探針部分互補之一偵測序列。聚合酶與核苷酸用以進行一滾環式擴增步驟。
爲使本技術領域的技術人員能更進一步瞭解本發明，下文特詳細說明本發明的構成內容及希望實現的效果。下文已揭露足夠的細節使該領域的技術人員能夠據以實施。
本發明之主要一特徵，是在於利用微流道裝置之高捕獲率，在生物樣品中獲取特定細胞後，利用多組針對不同突變位置的鎖式探針(pad lock probe)並使用滾環式擴增(rolling circle amplification)，可一次性地即知細胞的突變位置資訊。
請參考第1圖，所繪示為本發明一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法的流程示意圖。如第1圖所示，其包括以下步驟：
步驟800：提供一微流道裝置；
步驟802：在該微流道之該基板上及/或該蓋板上形成一塗佈層，該塗佈層上有一抗體；
步驟804：將一生物樣品注入該微流道裝置之該注入區中，使該生物樣品流經過該等微流道，從而使該生物樣品中的複數個細胞被捕捉在該塗佈層上；並可另用抗體進行免疫染色，以進一步確認細胞種類與來源。
步驟806：進行一DNA生成步驟，包含使用該細胞產生一目標DNA，該DNA具有一目標序列；
步驟808：進行一雜交步驟，包含使用一鎖式探針(padlock probe)與該目標DNA雜交，該鎖式探針具有兩鎖式序列位在該鎖式探針的兩末端，該兩鎖式序列頭尾合起來之序列互補於該目標序列；
步驟810：進行一環化步驟，使該鎖式探針的該兩鎖式序列連接使該鎖式探針環化；
步驟812：進行一滾環式擴增步驟，以擴增該鎖式探針而得到一擴增產物；以及
步驟814：進行一偵測步驟，偵測該擴增產物以確認細胞的突變位置。
以下內文將針對上述步驟進行進一步的描述。首先，提供一微流道裝置(步驟800)。請參考第2圖，所繪示為本發明一種微流道裝置之其中一種實施例的示意圖。如第2圖所示，本發明之微流道裝置300包含一基板302以及一蓋板304，當把蓋板304對應貼合在基板302上時，兩者之間所形成的腔室可允許生物樣品(例如疑似帶有癌細胞或胎兒細胞之人體血液)通過。大體來說，腔室大體上是在蓋板304上所形成，但也可以形成在基板302上。於一實施例中，根據功能不同，蓋板304可以區分為三個區域：注入區400、微流道區500以及出口區600。注入區400包含一注入口402以及一樹枝狀引道404。當生物樣品(圖未示)從注入口402輸入時，可流經樹枝狀引道404分配引流，進而平均地進入在微流道區500的複數個微流道502中，以在微流道502中進行細胞之捕捉；後續，則再流至出口區600的樹枝狀引道604，最終匯流至輸出口602輸出生物樣品。
基板302與蓋板304可視不同功能而使用不同或是相同的材質。於一實施例中，基板302和蓋板304可各自使用合適的材料來製造。例如，蓋板304可使用彈性體例如聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)來製造而基板302可使用玻璃、聚二甲基矽氧烷或其它彈性體來製造。基板302和蓋板304除了上述材料外，也可以包含塑膠材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate, PMMA)、聚碳酸酯(Polycarbonate, PC)、環烯烴共聚物(cyclo olefin copolymer, COC)，但並不以此為限。
請參考第3圖，所繪示為本發明其中一種實施例中微流道的示意圖。當蓋板304與基板302貼合在一起時，蓋板304及/或基板302的圖案組合起來即可形成微流道502。如第3圖所示，微流道502具有一頂面502T、兩側面502S以及一底面502B，其中頂面502T與兩側面502S是位在蓋板304上，而底面502B是位在基板302上。但於其他實施例中，微流道502之各個面或壁也可以任意設置在基板302或蓋板304上，只要結合能形成微流道502之腔室即可，其壁或面也不限於四面，而可以是更小或更多。如第3圖右邊之放大圖所示，微流道502之任一面上，例如頂面502T上具有複數個脊骨(rib)504向下突出於微流道502中，脊骨504可以是長條凸塊、圓角凸塊、三角凸塊或其他幾何形狀之凸塊。脊骨504大體上與微流道502的方向垂直，意即，微流道502延伸於第一方向306(從第1圖看來，第一方向306指注入口402向輸出口602的方向)，而脊骨504則延伸於第二方向308，第一方向306不等於第二方向308，較佳者，第一方向306垂直於第二方向308。於本發明較佳實施例中，脊骨504在沿著第二方向延伸時，還可以具有蜿蜒(serpent)或閃電狀(zig-zag)形狀。更詳細來說，脊骨504會沿著第二方向308，且在第一方向306之固定間距內呈現一個或多個波型擺動。於一實施例中，脊骨504具有「大波504A、小波504B」的排列方式，其中小波504B比上大波504A的長度比或是寬度比約1:1.5~1:2.5，脊骨504的寬度與相鄰脊骨504間距比約1:1~1:2.5，脊骨504高比上脊骨504底部與基板302之高之比約為1:2。
請參考第4圖，所繪示為本發明微流道裝置之脊骨其中一種實施例的示意圖，其中第4圖最上方的是平面圖，中間是放大尺寸標記圖，下方是部分剖面尺寸標記圖。如第4圖所示，整體微流道502之寬度約2公釐(mm)，脊骨504沿第一方向306呈現「大波504A、小波504B」的波型擺動，其中大波504A的長寬(沿著第二方向308定義為長，沿著第一方向306定義為寬) 約0.125公釐或0.1公釐，小波504B的長寬約0.05公釐；每個脊骨504的寬與相鄰兩脊骨504間距離的比例約1:1.66，例如每個脊骨504寬約0.075公釐，與相鄰脊骨504間距約0.125公釐；在剖面圖中，脊骨504的高比上脊骨504底部與基板302之高之比約為1:2，例如脊骨504高為35微米(µm)，脊骨504底部與基板302之高為70微米。
接著，在前述的微流道之基板上及/或蓋板上形成一塗佈層，該塗佈層上有一抗體(步驟802)。請參考第5圖，所繪示為微流道裝置中塗佈層之示意圖。如第5圖所示，塗佈層506可形成在微流道502之面(頂面502T、側面502S、底面502B)上，並具有可抓取細胞的抗體，且抗體可視細胞的種類而任意選取，於一實施例中，若細胞是癌細胞，抗體例如是抗泛細胞角質蛋白(anti-Pan Cytokeratin)抗體、或是上皮細胞黏著分子(EpCAM)抗體；若細胞是胎兒細胞，則抗體例如是抗細胞角蛋白抗體(anti- cytokeratin antibody)，但並不以上述為限。如第5圖所示，本發明微流道裝置所具有的特殊脊骨，由於脊骨504和微流道502的方向沒有平行，細胞508流經時會產生擾動碰撞，可增加塗佈層506中吸附物抓取細胞的機率。
接著，將一生物樣品注入該微流道裝置之該注入區中，使該生物樣品流經過該等微流道，從而使該生物樣品中的細胞被捕捉在該塗佈層上(步驟804)。於一實施例中，生物樣品中可以包含各種帶有RNA或DNA分子的細胞，例如是人體血液，甚至也可以是其他動物的血液。當生物樣品中的細胞508流經微流道502時，即可被塗佈層506上的抗體專一性地被抓取。
然後，將微流道裝置300之基板302與蓋板304分開，並以已抓取細胞508之基板302及/或蓋板304(即具有塗佈層506之基板302及/或蓋板304)進行後續實驗。為了方便說明，下文將僅以塗佈層506位在基板302作為示例。
接著進行一固定步驟，以使細胞508固定在基板502上。於本發明之一實施例中，固定步驟可使用3%多聚甲醛(paraformaldehyde )/焦碳酸二乙酯-磷酸鹽緩衝生理鹽水(diethyl pyrocarbonate-phosphate buffered saline, DEPC-PBS)(3% PFA in DEPC-PBS)，後續以焦碳酸二乙酯-磷酸鹽緩衝生理鹽水清洗。
然後，進行一DNA生成步驟，含使該細胞產生一目標DNA，該DNA具有一目標序列(步驟806)。在本發明中，目標序列806是指細胞中可能產生突變之序列，例如在癌細胞株H1975中的外顯子(exon)21號位置(L858R)。請參考第6圖，所繪示為本發明反轉錄步驟、雜交步驟、環化步驟與滾環式擴增的步驟示意圖。如第6圖的實施例所示，獲取目標DNA的方式可以從細胞的mRNA經過反轉錄(reverse transcription)生成互補DNA(cDNA)而得到。例如，將一鎖式核酸引子700雜交至mRNA 702上，該mRNA 702具有與目標序列相對應的片段序列。然後以mRNA 702為模版進行原位反轉錄步驟以合成一cDNA(如第6圖的步驟806A)。接著使用一核糖核酸酶(RNase)，以消化(digest)未與該目標DNA雜交之mRNA 702(如第6圖的步驟806B)，而暴露之單股cDNA即可作為目標DNA704。而於本發明另一實施例中，獲取目標DNA 704的方法也可直接將細胞中的具有目標序列的雙股DNA經限制酶(restriction enzyme)以及使用一核酸外切酶(exonucleolysis)切取後而獲得單股之目標DNA。
接著，進行一雜交步驟(步驟808)。如第6圖所示，步驟808包含使用一鎖式探針706與目標DNA 704部份雜交，該鎖式探針706具有兩鎖式序列706A位在鎖式探針的兩末端，兩鎖式序列706A頭尾合起來之序列互補於cDNA中的目標序列，如第6圖所示，鎖式探針706利用在兩末端之鎖式序列706A頭尾地與目標DNA雜交，使得雜交後的鎖式探針706呈現拱橋狀。
後續，進行一環化步驟，使該鎖式探針的末端環化(步驟810)。更詳細來說，步驟810是使用一連接酶(ligase)(圖未示)以將末端的兩個鎖式序列706A相連接，而形成環化的鎖式探針706，如第6圖所示。
然後進行一滾環式擴增(rolling circle amplification)步驟，以擴增該鎖式探針的序列，而得到一擴增產物(步驟812)。最後，進行一偵測步驟(步驟814)，以偵測該擴增產物以確認癌細胞的突變位置。於一實施例中，偵測步驟包含加入一偵測探針(detection probe)708，該偵測探針708包含有與鎖式探針706部分互補之序列以及一螢光分子，而藉由偵測螢光分子的螢光，則可確定細胞的目標序列為何種形式。該細胞並可另用抗體進行免疫螢光染色(immunofluorescence staining)，以進一步確認細胞種類與來源。
值得注意的是，本發明所使用的鎖式探針706與偵測探針708並不限於一組，而可以同時使用多組的鎖式探針706搭配偵測探針708，以同時偵測不同目標序列的突變狀況。或者針對同一目標序列，設計野生型的鎖式探針706與突變型的鎖式探針706，可比較兩者偵測探針的訊號而決定該目標序列是否具有突變。
而根據前文之描述，本發明還另外提供了一種檢測生物樣品中細胞突變位置的套組(kit)，包含一微流道裝置、一反轉錄酶、一鎖式探針、一偵測探針、一聚合酶以及核苷酸。微流道裝置，包含一基板以及一蓋板，依序具有一注入區、一微流道區以及一輸出區，注入區與微流道區連通，微流道區與輸出區連通；複數個微流道，設置在微流道區中且由基板以及蓋板架設形成，微流道沿一第一方向延伸，且具有複數個脊骨(rib)設置於微流道之至少一面上，脊骨沿著一第二方向彎曲地延伸；以及一塗佈層，設置在該微流道之該基板上及/或該蓋板上形成，該塗佈層上有一抗體。反轉錄酶用以將RNA反轉錄產生一目標DNA，目標DNA具有一目標序列。鎖式探針具有兩鎖式序列位在鎖式探針的兩末端，兩鎖式序列合起來互補於目標序列。偵測探針包含有與鎖式探針部分互補之一偵測序列。聚合酶以及核苷酸用以進行一滾環式擴增步驟。連接酶用於環化鎖式探針。
下文將針對上述本發明提供之一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法，提供一詳細之實施方式。
實施例
首先提供如第4圖所示的微流道裝置，其中微流道裝置上已經具有塗佈層，塗佈層具有抗泛細胞角質蛋白(anti-Pan Cytokeratin)抗體。
接著通入血液，血液中含有肺癌細胞株H1975，其表皮生長因子接受器(EGFR)於外顯子第21號處具有點突變，作為本實施例的目標區域。後續使用的鎖式探針與偵測探針係針對此目標區域而設計。後續將癌細胞固定，是取100μl之3%多聚甲醛/焦碳酸二乙酯-磷酸鹽緩衝生理鹽水於室溫進行30分鐘。接著以100μl之DEPC-PBS沖洗，重複兩次。後續進行一脫水(dehydration)步驟，包含先以100μl之70%乙醇浸泡，再以100μl之85%乙醇浸泡，最後以100μl之100%乙醇浸泡各1分鐘。接著以100μl之PBS-T(DEPC-PBS with 0.05% Tween-20)沖洗後，進行細胞透化(permeabilization)，包含以100μl之0.1M鹽酸(HCl)在室溫下處理10分鐘。後續以100μl之PBS-T溶液清洗兩次。
接著，進行原位反轉錄步驟，包含加入如表1之試劑，並在攝氏37度下處理3小時，其中cDNA primer(P-EGFR-L858R)具有 TCTTTCTCTTCCGCACCCAG(SEQ ID No: 1)的序列。 表1
以100μl之PBS-T沖洗兩次後，以100 μl之3% PFA in DEPC-PBS再次固定細胞後，100μl之PBS-T沖洗兩次，然後進行鎖式探針雜交步驟與環化步驟，使用如表2之配方在攝氏37度處理30分鐘後，將溫度提高到攝氏45度浸泡45分鐘。在表2的鎖式探針PP-EGFR-wt1是對應於野生型的目標序列，具有GGCCAAACTGCTGGGTCCTAGTAATCAGTAGCCGTGACTATCGACTGGTTCAAAGCACAGATTTTGGGCT(SEQ ID No: 2)的序列；鎖式探針PP-EGFR-L858R是對應於點突變型的目標序列，具有GGCCAAACTGCTGGGTTCTAGATACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACGGTTCAAGCACAGATTTTGGGCG(SEQ ID No: 3)的序列。 表2
以100μl之PBS-T沖洗兩次後，進行滾環式擴增，加入如表3的試劑，在攝氏37度處理2小時後，以100μl之PBS-T沖洗兩次。 表3
後續。加入100nM的偵測探針。探針包含「1 μl DP-1 Cy5 10uM」及「1μl DP-3 Cy3 10uM」，並將其加入檸檬酸鈉鹽(SSC)(2倍)與 20% 福馬林，溶液共100μl，在攝氏37度下處理15分鐘。DP-1 Cy5具有偵測序列如下：AGTAGCCGTGACTATCGACT(SEQ ID No: 4)的序列，並且會在5’端上接上螢光分子Cy5。而DP-3- Cy3具有偵測序列如下，CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC(SEQ ID No: 5) 並且會在5’端上接上螢光分子Cy3。
以100μl之PBS-T沖洗兩次後，再先後以100μl之70%乙醇、100μl之85%乙醇、以及100μl之100%乙醇各浸泡30秒。最後以不同螢光設定之顯微鏡偵測。
請參考第8圖，所示為本實施例中在螢光顯微鏡中的照片顯示圖。這些照片都是針對同一個細胞，僅以改變螢光參數而得到不同訊號。Merge表示所有的圖結合；Cy5-野生型表示目標序列為野生型，Cy3-L858R表示目標序列具有突變；FITC-PanCK是用免疫染色法(immune staining)以抗泛細胞角質蛋白(anti-Pan Cytokeratin)抗體接上一FITC之螢光，由於細胞角質蛋白在此肺癌細胞有專一表現，因此可進一步證明前述流程所抓取的確實是肺癌細胞。DAPI是指經過4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)之處理，可以顯示細胞核的位置。如第8圖所示，可以看到在此細胞株中具有Cy3-L858R Mutation(突變型)之螢光表現，即證明此細胞株於目標片段確實具有點突變，符合細胞株H1975的情況，證明本發明之檢測細胞點突變位置的步驟確實可行。
綜上所述，本發明提供了一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法及其套組，其利用特殊的微流道裝置，搭配鎖式探針與滾環式擴增，可以一次大量的檢測細胞的突變位置。 以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
300‧‧‧微流道裝置
508‧‧‧細胞
302‧‧‧基板
600‧‧‧輸出區
304‧‧‧蓋板
602‧‧‧輸出口
306‧‧‧第一方向
604‧‧‧樹枝狀引道
308‧‧‧第二方向
700‧‧‧鎖式核酸引子
400‧‧‧注入區
702‧‧‧mRNA
402‧‧‧注入口
704‧‧‧目標DNA
404‧‧‧樹枝狀引道
706‧‧‧鎖式探針
406‧‧‧去泡腔室
706A‧‧‧末端序列
500‧‧‧微流道區域
708‧‧‧偵測探針
502‧‧‧微流道
800‧‧‧步驟
502T‧‧‧頂面
802‧‧‧步驟
502S‧‧‧側面
804‧‧‧步驟
502B‧‧‧底面
806,806A,806B‧‧‧步驟
504‧‧‧脊骨
808‧‧‧步驟
504A‧‧‧大波
810‧‧‧步驟
504B‧‧‧小波
812‧‧‧步驟
506‧‧‧塗佈層
814‧‧‧步驟
第1圖所繪示為本發明一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法的流程示意圖。 第2圖所繪示為本發明一種微流道裝置之其中一種實施例的示意圖。 第3圖所繪示為本發明其中一種實施例中微流道的示意圖。 第4圖所繪示為本發明微流道裝置之脊骨其中一種實施例的示意圖。 第5圖所繪示為微流道裝置中塗佈層之示意圖。 第6圖所繪示為本發明反轉錄步驟、雜交步驟、環化步驟與滾環式擴增的步驟示意圖。 第7圖所示為一實施例癌細胞在偵測步驟中以不同螢光處理的顯示照片。
SEQUENCE LISTING ＜110＞ 亞諾法生技股份有限公司 ＜120＞ 檢測生物樣品中細胞突變位置的方法與套組 ＜130＞ ABN-P0013-TWN ＜160＞ 5 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ dDNA primer ＜400＞ 1 tctttctctt ccgcacccag 20 ＜210＞ 2 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ padlock probe wild type ＜400＞ 2 ggccaaactg ctgggtccta gtaatcagta gccgtgacta tcgactggtt caaagcacag 60 attttgggct 70 ＜210＞ 3 ＜211＞ 70 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ padlock probe mutation ＜400＞ 3 ggccaaactg ctgggttcta gatacctcaa tgctgctgct gtactacggt tcaagcacag 60 attttgggcg 70 ＜210＞ 4 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ detection probe ＜400＞ 4 agtagccgtg actatcgact 20 ＜210＞ 5 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ detection probe ＜400＞ 5 cctcaatgct gctgctgtac tac 23
Claims (10)
- 一種檢測生物樣品中細胞突變位置的方法，包含： 提供一微流道裝置，包含： 一基板以及一蓋板，依序具有一注入區、一微流道區以及一輸出區，該注入區與該微流道區連通，該微流道區與該輸出區連通；以及 複數個微流道，設置在該微流道區中且由該基板以及該蓋板架設形成，各該微流道沿一第一方向延伸，且具有複數個脊骨(rib)設置於各該微流道之至少一面上，該等脊骨沿著一第二方向彎曲地延伸； 在該微流道之該基板上及/或該蓋板上形成一塗佈層，該塗佈層上有一抗體； 將一生物樣品注入該微流道裝置之該注入區中，使該生物樣品流經過該等微流道，從而使該生物樣品中的複數個細胞被捕捉在該塗佈層上； 進行一DNA生成步驟，包含使用該等細胞產生一目標DNA，該目標DNA具有一目標序列； 進行一雜交步驟，包含使用一鎖式探針(padlock probe)與該目標DNA雜交，該鎖式探針具有兩鎖式序列位在該鎖式探針的兩末端，該兩鎖式序列頭尾合起來之序列互補於該目標序列； 進行一環化步驟，使該鎖式探針的該兩鎖式序列連接，使該鎖式探針環化； 進行一滾環式擴增(rolling circle amplification)步驟，以擴增該鎖式探針而得到一擴增產物；以及 進行一偵測步驟，偵測該擴增產物以檢測該等細胞的突變位置。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測生物樣品中細胞突變位置的方法，還包含： 進行一免疫染色步驟，包含使用專一性抗體對細胞進行免疫染色，確認細胞之種類與來源。
- 一種檢測細胞突變位置的方法，包含： 對細胞進行一DNA生成步驟，使其產生一目標DNA，該目標DNA具有一目標序列； 進行一雜交步驟，包含使用一鎖式探針(padlock probe)與該目標DNA雜交，該鎖式探針具有兩鎖式序列位在該鎖式探針的兩末端，該兩鎖式序列頭尾合起來之序列互補於該目標序列； 進行一環化步驟，使該鎖式探針的該兩鎖式序列連接，使該鎖式探針環化； 進行一滾環式擴增(rolling circle amplification)步驟，以擴增該鎖式探針而得到一擴增產物； 進行一偵測步驟，偵測該擴增產物以檢測該等細胞的突變位置；以及 進行一免疫染色步驟，包含使用專一性抗體對細胞進行免疫染色，確認細胞之種類與來源。
- 如申請專利範圍第1項或第3項所述之方法，其中該細胞為癌細胞或胎兒細胞。
- 如申請專利範圍第1項或第3項所述之方法，其中使該細胞生成DNA的步驟，包含： 進行一反轉錄步驟，使該細胞中一mRNA產生該目標DNA。
- 如申請專利範圍第1項或第3項所述之方法，其中該偵測步驟包含： 加入一偵測探針，該偵測探針包含有與該鎖式探針部分互補之一偵測序列，以及一螢光分子。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法，還包含偵測細胞中該螢光分子的螢光表現，以決定細胞的該目標序列為野生型(wild type)序列或是突變型序列。
- 一種檢測生物樣品中細胞突變位置的套組(kit)，包含： 一微流道裝置，包含： 一基板以及一蓋板，依序具有一注入區、一微流道區以及一輸出區，該注入區與該微流道區連通，該微流道區與該輸出區連通； 複數個微流道，設置在該微流道區中且由該基板以及該蓋板架設形成，各該微流道沿一第一方向延伸，且具有複數個脊骨(rib)設置於各該微流道之至少一面上，該等脊骨沿著一第二方向彎曲地延伸；以及 一塗佈層，設置在該微流道之該基板上及/或該蓋板上形成，該塗佈層上有一抗體； 一反轉錄酶，以將一RNA產生一目標DNA，目標DNA具有一目標序列； 一鎖式探針，該鎖式探針具有兩鎖式序列位在該鎖式探針的兩末端，該兩鎖式序列合起來互補於該目標序列； 一偵測探針，該偵測探針包含有與該鎖式探針部分互補之一偵測序列； 一聚合酶，以進行一滾環式擴增(rolling circle amplification)步驟； 接合酶，以進行一環化處理；以及 核苷酸。
- 如申請專利範圍第8項所述之檢測生物樣品中細胞突變位置的套組，還包含: 一抗體，以進行一免疫染色步驟。
- 如申請專利範圍第8項或第9項所述之檢測生物樣品中細胞突變位置的套組，其中該鎖式探針的序列為GGCCAAACTGCTGGGTCCTAGTAATCAGTAGCCGTGACTATCGACTGGTTCAAAGCACAGATTTTGGGCT(SEQ ID No: 2)或GGCCAAACTGCTGGGTTCTAGATACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACGGTTCAAGCACAGATTTTGGGCG(SEQ ID No: 3)，而該偵測探針的該偵測序列為AGTAGCCGTGACTATCGACT(SEQ ID No: 4)或CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC(SEQ ID No: 5)。
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