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TW201905209A - 於生物學反應中具有改質的表面反應性及抗污性的基板 - Google Patents

於生物學反應中具有改質的表面反應性及抗污性的基板

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TW201905209A
TW201905209A TW107115474A TW107115474A TW201905209A TW 201905209 A TW201905209 A TW 201905209A TW 107115474 A TW107115474 A TW 107115474A TW 107115474 A TW107115474 A TW 107115474A TW 201905209 A TW201905209 A TW 201905209A
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強納森 M 羅斯伯格
傑瑞米 雷克伊
陳國鈞
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美商寬騰矽公司
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Abstract

本發明提供製備樣品槽表面之方法。在一些態樣中，製備樣品槽表面之方法涉及使該樣品槽與嵌段共聚物接觸以在該樣品槽之金屬氧化物表面上方形成抗污性覆蓋。在一些態樣中，提供鈍化及/或選擇性功能化樣品槽表面之方法。

Description

於生物學反應中具有改質的表面反應性及抗污性的基板
本申請案大體係針對經選擇性改質之基板表面部分及其製備方法。本文所提供之技術之態樣係關於改變樣品槽表面之一或多個所需部分之反應性。在一些態樣中，本發明提供選擇性改質樣品槽之一或多個表面部分之方法。
微陣列廣泛用作單分子分析中之工具，該等分析包括核酸分析、核酸定序、基因表現分析、基因分型、突變分析、肽分析、肽定序及藥物篩選。一般形成於玻璃、金屬、塑膠或其他基板之表面上，微陣列可包括經選擇性改質之表面部分，該等部分經呈現為對所需化學物質更高之反應性或更低之反應性。舉例而言，單分子分析可需要將所關注之分子限制至基板之所需區域以用於偵測或觀測。在一群非特異性結合分子處於此類區域內之情況下，可具挑戰性的為在分析期間濾除干擾信號且可藉由促進總體統計分析減小結果之準確度。
本文所揭示之技術之態樣係關於生成樣品槽表面之選擇性功能化部分的方法，及包含其之裝置。在一些實施例中，本文中提供製備樣品槽之鈍化表面部分之方法。在一些實施例中，本發明提供製備具有抗污特性之樣品槽之鈍化表面部分的方法。在一些實施例中，本發明係關於鈍化樣品槽之金屬氧化物表面部分以促進樣品槽之二氧化矽表面部分之選擇性功能化。在一些實施例中，本發明中所提供之技術可用於將所關注之分子限制至樣品槽之所需區域。
在一些態樣中，本發明提供選擇性功能化樣品槽表面之方法，其涉及使具有第一表面及第二表面之樣品槽與較佳地結合第一表面上之塗層之嵌段共聚物接觸。在一些實施例中，使樣品槽與呈足以在第一表面上方形成抗污性覆蓋之量的嵌段共聚物接觸。在一些實施例中，方法進一步涉及使樣品槽與較佳地結合第二表面之功能化試劑接觸以產生功能化第二表面，其中該功能化試劑包含偶合部分。在一些實施例中，在與功能化試劑接觸之前，使樣品槽與嵌段共聚物接觸。在一些實施例中，在與嵌段共聚物接觸之前，使樣品槽與功能化試劑接觸。
在一些實施例中，第一表面係金屬或金屬氧化物表面。在一些實施例中，第一表面係塑膠表面(例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、或其組合)。在一些實施例中，第二表面係二氧化矽表面。在一些實施例中，第一表面係金屬氧化物表面且第二表面係二氧化矽表面。在一些實施例中，塗層包含兩親媒性試劑。
在一些態樣中，本發明提供功能化樣品槽之二氧化矽表面之方法，其涉及使具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面之樣品槽與較佳地結合金屬氧化物表面上之塗層之嵌段共聚物接觸。在一些實施例中，使樣品槽與呈足以在金屬氧化物表面上方形成抗污性覆蓋之量的嵌段共聚物接觸。在一些實施例中，方法進一步涉及使樣品槽與較佳地結合二氧化矽表面之功能化試劑接觸以產生功能化二氧化矽表面。在一些實施例中，功能化試劑包含偶合部分。在一些實施例中，在與功能化試劑接觸之前，使樣品槽與嵌段共聚物接觸。在一些實施例中，在與嵌段共聚物接觸之前，使樣品槽與功能化試劑接觸。
在一些實施例中，方法進一步包含使樣品槽與較佳地結合金屬氧化物表面之兩親媒性試劑接觸以在金屬氧化物表面上形成塗層。在一些實施例中，兩親媒性試劑包含經組態以較佳地結合金屬氧化物表面之親水性頭基及經組態以較佳地結合嵌段共聚物之疏水性尾基。
在一些實施例中，親水性頭基包含硫酸酯、亞硫酸酯、磷酸酯、膦酸酯、羥基、兒茶酚酯、異氰酸酯、異羥肟酸酯、或羧基官能基。在一些實施例中，親水性頭基包含羰基、胺基、硫氫基、醚、酯、磷酸二酯、糖苷或甲醯胺官能基。在一些實施例中，疏水性尾基包含C1 -C30 烷基鏈。在一些實施例中，疏水性尾基選自由以下組成之群：經取代或未經取代之伸烷基；經取代或未經取代之伸烯基；經取代或未經取代之伸炔基；經取代或未經取代之伸雜烷基；經取代或未經取代之伸雜烯基；經取代或未經取代之伸雜炔基；經取代或未經取代之伸雜環基；經取代或未經取代之伸碳環基；經取代或未經取代之伸芳基；經取代或未經取代之伸雜芳基；以及其組合。在一些實施例中，疏水性尾基包含多氟化碳鏈。
在一些實施例中，兩親媒性試劑包含式CH3 (CH2 ) n PO3 H2 之烷基膦酸化合物，其中n 係值為1-30之整數。在一些實施例中，兩親媒性試劑包含己基膦酸、辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、聚乙烯基膦酸、12-膦醯基-1-十二烷磺酸、10-十一炔基膦酸、或十七氟癸基膦酸。在一些實施例中，兩親媒性試劑包含氟界面活性劑。在一些實施例中，氟界面活性劑係式CF3 (CF2 ) n Z之化合物，其中n 係值為1-30之整數且Z係親水性頭基。
在一些實施例中，兩親媒性試劑之疏水性尾部包含共價偶合部分。在此類實施例中，方法進一步包含使樣品槽與經組態以結合共價偶合部分之聚合化合物接觸，進而使聚合化合物共價附著至金屬氧化物表面上之兩親媒性試劑。在一些實施例中，兩親媒性試劑包含式Y(CH2 ) n PO3 H2 之烷基膦酸化合物，其中n 係值為1-30之整數，且Y係共價偶合部分。在一些實施例中，共價偶合部分包含胺基、疊氮基、羧基、羥基、烷基、炔基或硫氫基。
在一些實施例中，嵌段共聚物係包含A嵌段及B嵌段之A-B-A型嵌段共聚物。在一些實施例中，塗層較佳地結合A-B-A型嵌段共聚物之B嵌段(例如以形成抗污性覆蓋)。在一些實施例中，B嵌段之疏水性高於A嵌段。在一些實施例中，A嵌段包含第一聚醚嵌段且B嵌段包含疏水性高於第一聚醚嵌段之第二聚醚嵌段。
在一些實施例中，A-B-A型嵌段共聚物係式I化合物： (A a )(B b )(A a ) (式I)， 其中A係包含A嵌段之聚醚化合物之單體單元；a 係值為2-150之整數；B係包含B嵌段之聚醚化合物之單體單元；且b 係值為10-100之整數。
在一些實施例中，A嵌段包含聚氧化乙烯且B嵌段包含聚氧化丙烯。在一些實施例中，A-B-A型嵌段共聚物係式II化合物：(式II)， 其中a 係值為2-150之整數；且b 係值為10-100之整數。
在一些實施例中，金屬氧化物表面係氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、氧化鐵、氧化錫、或氧化鉭。
在一些實施例中，功能化試劑包含矽烷化合物。在一些實施例中，矽烷化合物包含單乙氧基矽烷、甲氧基矽烷、二乙氧基矽烷、三氯矽烷、或二乙氧基、甲氧基矽烷。在一些實施例中，矽烷化合物包含矽烷-PEG化合物。在一些實施例中，矽烷化合物包含硫醇-矽烷或胺基-矽烷化合物。
在一些實施例中，功能化試劑之偶合部分包含生物素分子、抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素蛋白質、凝集素蛋白質、或SNAP標籤。在一些實施例中，功能化試劑之偶合部分包含胺基、疊氮基、羧基、羥基、烷基、炔基或硫氫基。
在一些實施例中，方法進一步包含在適合於容許所關注之分子結合至偶合部分之條件下，使具有功能化二氧化矽表面之樣品槽與經組態以結合偶合部分之所關注之分子接觸，進而使所關注之分子偶合至功能化二氧化矽表面。
在一些實施例中，樣品槽與所關注之分子之接觸發生在樣品槽與功能化試劑之接觸之後，無中間洗滌步驟。在一些實施例中，樣品槽與所關注之分子之接觸發生在樣品槽與嵌段共聚物之接觸之後，無中間洗滌步驟。在一些實施例中，使樣品槽與嵌段共聚物及功能化試劑在獨立的接觸步驟中接觸且無中間洗滌步驟。
在一些實施例中，所關注之分子包含聚合酶。在一些實施例中，聚合酶係DNA聚合酶。在一些實施例中，DNA聚合酶係T4 DNA聚合酶。在一些實施例中，DNA聚合酶係T7 DNA聚合酶。在一些實施例中，DNA聚合酶係phi29 DNA聚合酶。在一些實施例中，DNA聚合酶係M2Y DNA聚合酶。在一些實施例中，DNA聚合酶係銅綠蠅(Lucilia cuprina )之DNA聚合酶。
在一些實施例中，所關注之分子係定序模板複合物，其包含具有雜交引子/聚合酶複合物之模板核酸分子。在一些實施例中，模板核酸分子在約1 kb至約5 kb之間、在約5 kb至約10 kb之間、約10 kb至約15 kb之間、約15 kb至約20 kb之間、或約20 kb至約25 kb之間。在一些實施例中，核酸分子在約25 kb至約50 kb之間、約50 kb至約100 kb之間、約100 kb至約250 kb之間、約250 kb至約500 kb之間、或約500 kb至約1000 kb之間。
在一些實施例中，所關注之分子較佳地以約100倍至約1000倍選擇性、約200倍至約800倍選擇性、約400倍至約600倍選擇性、或約1000倍至約2000倍選擇性結合至金屬氧化物表面(例如包含嵌段共聚物及/或塗層之金屬氧化物表面)上方之功能化二氧化矽表面。
在一些實施例中，所關注之分子對金屬氧化物表面(例如包含嵌段共聚物及/或塗層之金屬氧化物表面)上方之功能化二氧化矽表面之選擇性比不與嵌段共聚物接觸之樣品槽高約10倍至約100倍、約50倍至約500倍、約100倍至約1000倍、或約200倍至約400倍。
在一些實施例中，本文中提供之方法進一步包含使所關注之分子進行定序反應。在一些實施例中，本文中提供之方法進一步包含使所關注之分子(例如定序模板複合物)進行下一代定序技術。
在一些態樣中，本發明提供包含基板(例如固體撐體)之積體裝置，該積體裝置包含具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面之樣品槽。在一些實施例中，積體裝置進一步包含藉由包含親水性頭基及疏水性尾基之兩親媒性試劑於金屬氧化物表面上形成之塗層。在一些實施例中，兩親媒性試劑經由親水性頭基結合至金屬氧化物表面。在一些實施例中，積體裝置進一步包含藉由包含A嵌段及B嵌段之A-B-A型嵌段共聚物於塗層上形成之抗污性覆蓋。在一些實施例中，A-B-A型嵌段共聚物經由B嵌段結合至塗層。在一些實施例中，積體裝置進一步包含結合至二氧化矽表面之功能化試劑。在一些實施例中，功能化試劑包含偶合部分。
在一些實施例中，基板包含樣品槽之陣列，各樣品槽具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面。
在一些實施例中，樣品槽包含形成於基板表面處之頂部孔口及遠離基板表面之底表面。在一些實施例中，底表面由二氧化矽表面包含。
在一些實施例中，結合至二氧化矽表面之功能化試劑之偶合部分包含生物素分子、抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素蛋白質、凝集素蛋白質或SNAP標籤。在一些實施例中，結合至二氧化矽表面之功能化試劑之偶合部分包含胺基、疊氮基、羧基、羥基、烷基、炔基或硫氫基。
在一些實施例中，積體裝置經組態以與下一代定序儀器介接。
相關申請案 本申請案在35 U.S.C. § 119(e)下主張2017年5月5日申請之美國臨時專利申請案第62/502,525號之優先權，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
本發明之態樣係關於具有經選擇性改質之表面部分之樣品槽，及其製備方法。在一些態樣中，本發明提供改質具有第一表面部分及第二表面部分之樣品槽之表面部分的方法。在一些實施例中，使樣品槽與較佳地結合第一表面部分之兩親媒性試劑接觸以在第一表面部分上形成塗層。在一些實施例中，使樣品槽與較佳地結合第一表面部分上之塗層之嵌段共聚物接觸(例如以在第一表面部分上方形成抗污性覆蓋)。在一些實施例中，使樣品槽與較佳地結合第二表面部分之功能化試劑接觸以產生功能化第二表面部分。在一些實施例中，第一表面部分係塑膠表面且第二表面部分係二氧化矽表面。在一些實施例中，第一表面部分係金屬氧化物表面且第二表面部分係二氧化矽表面。
在其他態樣中，本發明提供製備具有經選擇性改質之表面部分之樣品槽的方法。在一些實施例中，本文中提供之技術可用於鈍化樣品槽之金屬氧化物表面，該樣品槽具有由金屬氧化物構成之表面部分及由二氧化矽構成之表面部分。在一些實施例中，本發明提供生成具有抗污特性之經鈍化之金屬氧化物表面的方法。在一些實施例中，本文中所描述之經鈍化之金屬氧化物表面可用於促進樣品槽之二氧化矽表面部分之選擇性功能化。在一些實施例中，樣品槽之經選擇性改質之表面部分可用於促進所關注之分子限制至樣品槽之所需區域。
在某些技術中，單分子分析涉及將所關注之分子約束至樣品槽之所需區域，其中單分子觀測及/或信號偵測係最優的。將所關注之分子約束在所需區域內可藉由選擇性改質樣品槽之表面部分來達成。舉例而言，所需區域中之表面部分經功能化以保留所關注之分子，而所需區域外部之表面部分不經功能化。此類選擇性功能化可藉由鈍化所需區域外部之表面部分來達成，使其對功能化具有惰性。
表面鈍化一般係指其中使表面對環境具有較低反應性之製程。舉例而言，在一些實施例中，在可能需要選擇性功能化第一表面上方基板之第二表面情況下，可鈍化第一表面以使其不能功能化、或對功能化具有高度抵抗性。習知之表面鈍化技術可涉及使用形成自組裝單層之組合物，其通常由於單層之各種疵點產生不完美覆蓋之表面。實際上，此等疵點提供可發生功能化之暴露表面之位點。本發明人已認識到且瞭解此等及其他限制可使用有效隱藏單層疵點之試劑解決。本發明人已進一步認識到且進一步瞭解此等試劑中之某些賦予鈍化表面抗污特性，該等鈍化表面可有利地應用於生物反應之情形下。
本發明之態樣係關於樣品槽之表面部分之選擇性改質。在一些實施例中，樣品槽包含具有不同化學組合物之至少兩個表面部分。舉例而言，根據本申請案之一些非限制性實施例，圖1描繪由積體裝置100包含之樣品槽180之橫截面視圖。樣品槽180可包含由開口界定之小體積或區域，該開口形成於金屬層104處且延伸進入積體裝置100之二氧化矽層106中。樣品槽180可具有至少部分經金屬氧化物塗層102覆蓋之一或多個側壁。在一些實施例中，金屬氧化物塗層可根據本文中所描述之技術經鈍化以產生鈍化塗層108。在一些實施例中，鈍化塗層108可使金屬氧化物塗層102對功能化試劑130具有惰性。以此方式，功能化試劑130較佳地結合至二氧化矽層106。在一些實施例中，功能化試劑130包含經組態以結合所關注之分子190之偶合部分。因此，二氧化矽層106之選擇性功能化表面允許將所關注之分子190約束至接近於樣品槽180之底表面之區域。在一些實施例中，鈍化塗層108包括塗層及/或抗污性覆蓋以降低與側壁相互作用或黏附至側壁之所關注之分子190的量。在一些實施例中，塗層及/或抗污性覆蓋降低或消除生物反應中之組分對側壁之黏附。
在一些實施例中，具有經選擇性改質之表面部分的樣品槽可根據圖2A中描繪之工作流程製備。如所展示，具有金屬氧化物表面202及二氧化矽表面206之樣品槽經受鈍化步驟(i)以在金屬氧化物表面上產生塗層210。在一些實施例中，塗層210係藉由使樣品槽與較佳地結合金屬氧化物表面之兩親媒性試劑接觸來形成。樣品槽隨後可暴露於步驟(ii)中之嵌段共聚物以在金屬氧化物表面上方產生抗污性覆蓋220。在一些實施例中，抗污性覆蓋220係藉由使樣品槽與較佳地結合金屬氧化物表面上之塗層之嵌段共聚物接觸來形成。樣品槽可進一步經受功能化步驟(iii)以產生功能化二氧化矽表面230。在一些實施例中，功能化二氧化矽表面230係藉由使樣品槽與較佳地結合二氧化矽表面之功能化試劑接觸來形成。
應瞭解，在一些實施例中，圖2A之製程中之步驟順序可不同於所展示之步驟順序。舉例而言，在一些實施例中，具有經選擇性改質之表面部分的樣品槽可根據圖2B中描繪之工作流程製備。如所展示，具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面之樣品槽經受鈍化步驟(i)以在金屬氧化物表面上產生塗層。具有塗層之樣品槽可進一步經受功能化步驟(ii)以產生功能化二氧化矽表面。樣品槽隨後可暴露於步驟(iii)中之嵌段共聚物以在金屬氧化物表面上方產生抗污性覆蓋。圖2A及2B中所展示之製程描繪具有特定表面組合物，例如金屬氧化物表面及二氧化矽表面之樣品槽之實例。應瞭解，在一些實施例中，此等圖式中所描繪及本文中其他地方所描述之技術可用於具有不同表面組合物之樣品槽。舉例而言，在一些實施例中，表面202可為塑膠表面。塑膠表面之實例包括(作為實例而非限制)聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、以及其組合。
在一些實施例中，功能化試劑能夠結合樣品槽上之多種表面組合物，例如功能化試劑能夠結合金屬氧化物或二氧化矽表面組合物中之每一者。在此類實施例中，本文中所描述之技術可有利地用於將功能化試劑之結合限制於樣品槽之所需區域或指定表面組合物。舉例而言，在一些實施例中，樣品槽之金屬氧化物表面可經鈍化以防止或限制金屬氧化物表面上之功能化程度-隨後將功能化限制於樣品槽之不同表面(例如二氧化矽表面)。在一些實施例中，鈍化塗層之疵點可產生暴露之金屬氧化物表面之位點，其可導致金屬氧化物表面之非所需功能化。在一些實施例中，本文中所描述之技術能夠隱藏鈍化塗層中之暴露之金屬氧化物表面的位點以促進具有高選擇性之二氧化矽表面之功能化。
在一些態樣中，本文中所描述之方法涉及使具有金屬氧化物表面部分及二氧化矽表面部分之樣品槽與較佳地結合金屬氧化物表面上之塗層之嵌段共聚物接觸以形成抗污性覆蓋。在一些實施例中，抗污性覆蓋彌補塗層之疵點。在一些實施例中，塗層包含單層。如本文所用，「單層」指代具有單分子厚度之層。在一些實施例中，術語「單層」與「自組裝單層」(self-assembled monolayer；「SAM」)互換使用，後者指代其中分子藉由吸附(例如化性吸附、物理吸附)在表面上自發形成總成之自組裝製程。在此分子組裝製程期間，疵點可由於各種內部因素(例如形成物之熱動力學、被吸附物之化學特性)或外部因素(例如表面上之疵點、雜質)出現於單層中。在一些實施例中，單層中之疵點產生暴露表面之位點。本發明在一些實施例中提供使用抗污性覆蓋隱藏此類疵點位點之方法。
舉例而言，圖3描繪其中抗污性覆蓋形成為經鈍化之金屬氧化物表面部分之部分以使功能化試劑與二氧化矽表面部分選擇性結合的製程。在一些實施例中，具有金屬氧化物表面302及二氧化矽表面304之基板(例如樣品槽)包括金屬氧化物表面302上之塗層310。在一些實施例中，金屬氧化物表面302由氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、氧化鐵、氧化錫、或氧化鉭構成。在一些實施例中，塗層310係使用兩親媒性試劑形成，該兩親媒性試劑具有疏水性尾部314及較佳地結合金屬氧化物表面302之親水性頭基316。在一些實施例中，兩親媒性試劑在金屬氧化物表面302上形成分子總成。如所展示，在一些實施例中，一或多個疵點318可在由兩親媒性試劑形成之塗層310之自組裝期間在單層中形成。在一些實施例中，基板(例如樣品槽)經受鈍化步驟(i)，該鈍化步驟(i)涉及使基板與較佳地結合金屬氧化物表面302上之塗層310之嵌段共聚物322接觸以在金屬氧化物表面302上方形成抗污性覆蓋320。在一些實施例中，形成於嵌段共聚物與塗層之間的相互作用之性質及/或程度有效地覆蓋疵點位點，如圖3中所說明。
在一些實施例中，嵌段共聚物322係具有A嵌段324及B嵌段326之A-B-A型嵌段共聚物。在一些實施例中，塗層310較佳地結合A-B-A型嵌段共聚物之B嵌段326。在一些實施例中，B嵌段326相對於A嵌段324疏水。在此類實施例中，B嵌段326可基於疏水性作用形成與塗層310之疏水性尾基314的相互作用。疏水性作用一般係指非極性分子聚集於水溶液中且排斥水分子之傾向。因此，在塗層310之疏水性尾基314以其他方式暴露於水溶劑時，塗層310較佳地與嵌段共聚物322在疏水性更高之B嵌段326處締合。在一些實施例中，B嵌段之疏水性高於A嵌段，且A及B具有適合之各別的聚合度，使得水溶液中之在0.01 wt%與10 wt%之間或等於0.01 wt%及10 wt% (例如在0.01 wt%與1 wt%之間或等於0.01 wt%及1 wt%)之臨界微胞濃度在25℃下存在。術語「臨界微胞濃度」具有其在此項技術中之一般含義且可指代對於(A嵌段之聚合度)與(B嵌段之聚合度)之某些比值形成穩定微胞(例如：持久微胞)所處於及高於之濃度。臨界微胞濃度可藉由熟習此項技術者已知之方法量測且包括但不限於表面張力量測或動態光散射量測。在一些實施例中，由抗污層320提供之暴露之金屬氧化物表面302的額外覆蓋促進二氧化矽表面304之選擇性功能化。
如圖3中所示，在一些實施例中，本文中所描述之方法可包括使具有抗污性覆蓋320之基板(例如樣品槽)與較佳地結合二氧化矽表面304之功能化試劑332接觸的步驟。在一些實施例中，功能化試劑332能夠結合金屬氧化物表面302或二氧化矽表面304。然而，在一些實施例中，金屬氧化物表面302係由防止功能化試劑332結合金屬氧化物表面302之鈍化層330製備，總是促進其與二氧化矽表面304之選擇性結合以產生功能化二氧化矽表面。在一些實施例中，功能化試劑332包含能夠結合至二氧化矽表面304之矽烷化合物。在一些實施例中，矽烷化合物包含單乙氧基矽烷、甲氧基矽烷、二乙氧基矽烷、三氯矽烷、或二乙氧基、甲氧基矽烷。
在一些實施例中，功能化試劑332包含偶合部分334。在一些實施例中，偶合部分334可用於將所關注之分子附著至二氧化矽表面304。在一些實施例中，偶合部分334可為非共價結合對之第一搭配物。以此方式，在一些實施例中，包含非共價結合對之第二搭配物的所關注之分子可經由非共價附著附著至二氧化矽表面304。在一些實施例中，功能化試劑之偶合部分334可為生物素分子332、抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素蛋白質、凝集素蛋白質、或SNAP標籤。在一些實施例中，偶合部分334可為共價結合對(例如反應性化學基團)之第一搭配物。以此方式，在一些實施例中，包含共價結合對之第二搭配物的所關注之分子可經由共價附著附著至二氧化矽表面304。在一些實施例中，功能化試劑332之偶合部分334可為胺基、疊氮基、羧基、羥基、烷基、炔基或硫氫基。在一些實施例中，偶合部分334與點擊化學共軛技術相容。能夠在點擊化學中共軛之反應性化學基團係此項技術中已知的，例如New, K.,等人 (2009) Cancer Biother. Radiopharm. 24(3):289-302，Thirumurugan, P.,等人 (2013) Chem. Rev. 113(7):4905-4979，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，圖3中描繪之製程進一步包含使樣品槽與兩親媒性試劑接觸以在金屬氧化物表面302上形成塗層310之步驟。
兩親媒性試劑 & 塗層 如本文所用，「兩親媒性試劑」指代可用於在金屬氧化物表面上產生塗層之試劑。在一些實施例中，兩親媒性試劑係考慮為兩親媒性的分子，因為該分子含有相對於第二部分親水之第一部分，後者相對於第一部分必然疏水。在一些實施例中，親水性部分相對於疏水性部分為水溶性的。在一些實施例中，疏水性部分相對於親水性部分為不溶於水的。在一些實施例中，兩親媒性試劑含有親水性頭基及疏水性尾基。
可基於所需特性(例如極性、疏水性、親水性、尺寸、結構剛性等)選擇適當的兩親媒性試劑以促進單層自組裝。舉例而言，在一些實施例中，兩親媒性試劑可藉由改變疏水性尾基之疏水性經設計以用於特定溶劑系統。在一些實施例中，兩親媒性試劑包含式CH3 (CH2 ) n PO3 H2 之烷基膦酸化合物，其中n 係值為1-30之整數。在一些實施例中，兩親媒性試劑包含己基膦酸、辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、聚乙烯基膦酸、12-膦醯基-1-十二烷磺酸、10-十一炔基膦酸、或十七氟癸基膦酸。
在一些實施例中，兩親媒性試劑包含氟界面活性劑。在一些實施例中，氟界面活性劑係式CF3 (CF2 ) n Z之化合物，其中n 係值為1-30之整數且Z係親水性頭基。氟界面活性劑有時亦稱作氟化界面活性劑或全氟烷基化物質，其為具有多個氟原子之合成有機氟化合物。在一些實施例中，氟界面活性劑可為具有-CF2 -、-CF2 CF3 或-CF3 基團中之至少一者之任何化合物。適合之氟界面活性劑可鑒於本文所描述之方法中所使用之表面組合物及其他實驗條件選擇。舉例而言，氟界面活性劑及其特性描述於共同未決的美國公開案第US20060234901號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。氟界面活性劑及其合成方法之額外實例描述於美國申請案第US 09/570,853號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，兩親媒性試劑之親水性頭基係能夠與金屬氧化物表面締合之化學基團(例如官能基)。在一些實施例中，親水性頭基能夠與金屬或金屬氧化物表面組合物螯合。適當之親水性頭基可鑒於存在於基板(例如樣品槽)上之表面組合物選擇。舉例而言，兩親媒性試劑之親水性頭基可經設計使得頭基較佳地結合至待鈍化之所需表面。因此，在一些實施例中，親水性頭基經設計以較佳地結合二氧化矽表面上方之金屬氧化物表面。在一些實施例中，親水性頭基能夠與水分子形成氫鍵供體相互作用或氫鍵受體相互作用。親水性頭基之實例包括但不限於硫酸酯、亞硫酸酯、磺酸酯、硫基、磷酸酯、膦酸酯、羥基、兒茶酚酯、異氰酸酯、異羥肟酸酯、羧基、胺基、醯胺基、羧基、及羥基。應瞭解，本文所揭示之化學基團並非意欲受限於特定質子化狀態或氧化態。因此，舉例而言，如本文所用之「羧基」尤其指代羧酸基團(R-COOH)及羧酸根基團(R-COO- )。
在一些實施例中，疏水性尾基可根據實驗依賴性條件，諸如溶劑溫度、pH值及離子強度設計。一般較佳地，兩親媒性試劑之疏水性尾基對基板之金屬或金屬氧化物表面之親和力低於兩親媒性試劑之親水性頭基。在一些實施例中，疏水性尾基經組態以較佳地與嵌段共聚物之所需嵌段相互作用。在一些實施例中，可能需要設計疏水性尾基使得其在實驗條件之給定設定下不完全可溶。舉例而言，在一些實施例中，限制疏水性尾基之水溶解度促進在形成單層塗層中兩親媒性試劑之自組裝。在一些實施例中，疏水性尾基係飽和或不飽和、經取代或未經取代之環狀、支鏈或非分支鏈脂肪族鏈。在一些實施例中，脂肪族鏈包含4至28個碳原子。在一些實施例中，疏水性尾基包含C1 -C30 烷基鏈。
在一些實施例中，兩親媒性試劑之疏水性尾部包含共價偶合部分。在此類實施例中，方法進一步包含使樣品槽與經組態以結合共價偶合部分之聚合化合物接觸，進而使聚合化合物共價附著至金屬氧化物表面上之兩親媒性試劑。舉例而言，圖4描繪鈍化金屬氧化物表面之非限制性製程。如所展示，具有金屬氧化物表面402及二氧化矽表面404之基板(例如樣品槽)經受第一鈍化步驟(i)，該第一鈍化步驟(i)涉及使基板與包含共價偶合部分444之兩親媒性試劑442接觸。在一些實施例中，兩親媒性試劑包含式Y(CH2 ) n PO3 H2 之烷基膦酸化合物，其中n 係值為1-30之整數，且Y係共價偶合部分。在一些實施例中，共價偶合部分包含胺基、疊氮基、羧基、羥基、烷基、炔基或硫氫基。兩親媒性試劑442經由親水性頭基在金屬氧化物表面402上自組裝，該親水性頭基較佳地結合二氧化矽表面404上方的金屬氧化物表面402。在一些實施例中，金屬氧化物表面402較佳地結合兩親媒性試劑之共價偶合部分上方的親水性頭基。
在一些實施例中，如圖4中所示，基板(例如樣品槽)進一步經受額外的鈍化步驟(ii)，該鈍化步驟(ii)涉及使基板與經組態以結合兩親媒性試劑442之共價偶合部分444之聚合化合物452接觸。以此方式，聚合化合物452經接枝於金屬氧化物表面402上之兩親媒性試劑442以在單層形成物中提供更加緻密之表面覆蓋，此將暴露之金屬氧化物表面之位點減到最少。在一些實施例中，聚合化合物452包含聚醚化合物。本文中描述聚合及聚醚化合物。在一些實施例中，聚合化合物452經選擇以賦予經鈍化之金屬氧化物表面402抗污特性。在一些實施例中，聚合化合物452經選擇以較佳地與如本文所述之嵌段共聚物締合。在一些實施例中，聚合化合物452包括組態聚合化合物452以結合共價偶合部分444之部分454。在一些實施例中，部分454包含胺基、疊氮基、羧基、羥基、烷基、炔基或硫氫基。
在一些態樣中，本文中所描述之方法可用於藉由在金屬氧化物表面上形成塗層鈍化金屬氧化物表面。如本文所用，「塗層」指代直接在金屬氧化物表面上形成之單層。在一些實施例中，塗層係藉由單層自組裝形成於金屬氧化物表面上。在一些實施例中，塗層係有序或無序單層。在一些實施例中，塗層可為有序及稠密填充之單層。在一些實施例中，塗層可為均質或非均質單層。在一些實施例中，使用於形成塗層之組分在金屬氧化物表面上自組裝。不希望受理論束縛，咸信金屬氧化物表面上之單層自組裝經由自由能最小化出現。舉例而言，可較佳地將兩親媒性試劑之親水性頭基吸引至金屬氧化物表面，其促進頭基聚集於金屬氧化物表面上以實現單層之有序組裝。金屬氧化物表面亦可視為兩親媒性試劑之頭基所圍繞之模板，此使兩親媒性試劑之疏水性尾基自金屬氧化物表面延伸。因此，在一些實施例中，尾基在塗層之情形下與嵌段共聚物自由締合以產生抗污性覆蓋。
抗污性覆蓋 & 嵌段共聚物 如本文所用，「抗污性覆蓋」指代提供或提高對組合物所附著之物品表面之生物分子的抗性之組合物。舉例而言，在一些實施例中，相對於對參考基板(亦即相同或另外功能上等效之缺乏抗污性覆蓋之基板)之黏著量，樣品槽表面(例如金屬氧化物)上方之抗污性覆蓋可抵抗生物分子之黏附，該等生物分子包括蛋白質、核酸、核苷酸、經標記之核苷酸、細胞、組織及/或其他生物物質。在一些實施例中，樣品槽表面(例如金屬氧化物)上方之抗污性覆蓋可抵抗疏水性分子之黏附，該等疏水性分子諸如用於生物反應之疏水性組分(例如染料分子、經染料標記之核苷酸、核苷酸、核酸等)。在一些實施例中，相對於參考基板，黏附量將降低20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更高，例如85%、90%、95%、99%、99.5 %、99.9%或更高。在一些實施例中，抗污性覆蓋對聚合酶及/或核酸具有實質上抵抗性。在一些實施例中，抗污性覆蓋對血液樣品中存在之生物分子具有實質上抵抗性。
在一些實施例中，抗污性覆蓋形成於金屬氧化物表面上方。在一些實施例中，抗污性覆蓋可藉由與金屬氧化物表面之直接相互作用(例如與金屬氧化物組合物螯合)形成於金屬氧化物表面上方。在一些實施例中，抗污性覆蓋可經由與一或多個介入層之相互作用在金屬氧化物表面上方形成。舉例而言，在一些實施例中，抗污性覆蓋經由與金屬氧化物表面上之塗層(例如單層)的相互作用形成於金屬氧化物表面上方。在一些實施例中，抗污性覆蓋由於疏水性作用與塗層相互作用。疏水性作用係指疏水性分子聚集於水溶液中且排斥水分子之傾向。在一些實施例中，抗污特性係藉由使具有塗層之金屬氧化物表面與較佳地結合塗層之嵌段共聚物接觸賦予金屬氧化物表面。
如本文所用，「嵌段共聚物」指代具有超過一種聚合嵌段之聚合物，其各自具有與相鄰嵌段相異之結構。包涵全部嵌段之完整結構形成嵌段共聚物。具有兩種或三種相異嵌段之嵌段共聚物分別稱為二嵌段或三嵌段共聚物。在一些實施例中，共聚物之各嵌段由字母表示(例如「A」嵌段、「B」嵌段、「C」嵌段等)，其中各字母表示具有產生共聚物嵌段之相異特性之相異結構組合物的共聚物之嵌段。在一些實施例中，各嵌段由一或多種類型之單體或結構單元組成，其可基於待相對於嵌段共聚物內之另一嵌段賦予於彼嵌段之所需特性，諸如疏水性或親水性選擇。舉例而言，在一些實施例中，如本文所述之嵌段共聚物係具有A嵌段及B嵌段之A-B-A型三嵌段共聚物，其中B嵌段相對於A嵌段疏水。在一些實施例中，如本文所述之嵌段共聚物係具有A嵌段及B嵌段之A-B型二嵌段共聚物，其中B嵌段相對於A嵌段疏水。
在一些實施例中，三嵌段共聚物具有三種相異嵌段，其可具有交替的親水性(A)及疏水性(B)嵌段。圖5一般描繪嵌段共聚物及其部分之非限制性組態。如所展示，A-B-A型三嵌段共聚物502可包括由第一組單體單元(陰影圓)組成之B嵌段，該等單體單元在各側由由第二組單體單元(空心圓)組成之A嵌段側接。在一些實施例中，A-B-A型嵌段共聚物可由式I表示：(A a )(B b )(A a )，其中A係包含A嵌段之聚合結構之單體單元，a 係A嵌段之聚合度及值為2-150之整數，B係包含B嵌段之聚合結構之單體單元，且b 係A嵌段之聚合度及值為10-100之整數。
在一些實施例中，A或B嵌段中之任一者可自身為共聚物。舉例而言，在一些實施例中，嵌段共聚物之A嵌段及/或B嵌段可包括兩種或更多種類型之單體單元。在一些實施例中，單體單元可存在於A嵌段及/或B嵌段內作為交替單體504。在一些實施例中，單體單元可按隨機組態506存在於A嵌段及/或B嵌段內。在一些實施例中，共聚物接合點處之化學界面可為漸尖的。舉例而言，在一些實施例中，A嵌段及B嵌段可由漸尖界面508分離，使得A嵌段之單體單元逐漸轉移至B嵌段之單體單元。因此，應瞭解，如本文所用之術語「A嵌段」及「B嵌段」可一般指代具有不同相對疏水性/親水性特性之嵌段共聚物之嵌段，且不應視為將嵌段限制為特定單體單元。
在一些實施例中，三嵌段共聚物之示意性一般化可由式[A a B b C c . . .] a [X x Y y Z z . . . ] b [A a B b C c . . .] a 表示，其中各字母表示單體單元，單體單元之各下標表示特定嵌段中之彼單元之莫耳分數，三個圓點表明在各嵌段中可能存在更多或更少之單體單元，且a 及b 分別表明A及B嵌段之聚合度。如示意圖表明，在一些實施例中，各結構單元之數目及性質對於各嵌段而言可分別受控制。示意圖不意謂且不應視為意指嵌段中之每一者中之結構單元的數量或不同類型的結構單元之數量之間的任何關係，示意圖亦不意謂描述特定嵌段內之結構單元之任何特定數目或配置。在各嵌段中，除非以其他方式明確地陳述，否則結構單元可以純粹隨機、交替隨機、規則交替、規則嵌段、或隨機嵌段組態安置。
在一些實施例中，嵌段共聚物可包括支鏈組態。舉例而言，圖5描繪嵌段共聚物之支鏈嵌段510之實例，其中給定嵌段內之一或多個單體單元可連接至超過兩個相鄰的單體單元。在一些實施例中，如本文所述之嵌段共聚物可經組態為刷狀共聚物512。以此方式，第一聚合物嵌段(陰影圓)可經設計以較佳地與塗層相互作用而第二聚合物嵌段(空心圓)朝外延伸且可經設計以提供抗污特性。
在一些實施例中，嵌段共聚物之至少一種嵌段(例如A嵌段及/或B嵌段)包含具有抗污特性之組合物。在一些實施例中，嵌段共聚物之至少一種嵌段(例如A嵌段及/或B嵌段)具有電中性組合物、親水性組合物、及/或包含氫鍵供體但不包含氫鍵受體之組合物。在一些實施例中，嵌段共聚物之至少一種嵌段(例如A嵌段及/或B嵌段)包含聚丙烯酸酯(例如包含胺基甲酸酯連接之側鏈的聚丙烯酸酯)、寡醣、聚胺基甲酸酯(例如熱塑性嵌段聚胺甲酸酯)、或聚醚(例如聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(丁二醇))、或其組合。在一些實施例中，嵌段共聚物之各嵌段(例如A嵌段及B嵌段)包含各別聚丙烯酸酯(例如包含胺基甲酸酯連接之側鏈的聚丙烯酸酯)、寡醣、聚胺基甲酸酯(例如熱塑性嵌段聚胺甲酸酯)、或聚醚(例如聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(丁二醇))、或其組合。
在一些實施例中，嵌段共聚物之至少一種嵌段係包含聚醚之聚合結構。在一些實施例中，嵌段共聚物之各嵌段係包含聚醚之聚合結構。在一些實施例中，至少一種嵌段係由環氧乙烷(-CH2 CH2 O-)重複單元組成之單體單元之寡聚結構或聚合結構。在一些實施例中，A嵌段包含第一聚醚嵌段且B嵌段包含疏水性高於第一聚醚嵌段之第二聚醚嵌段。在一些實施例中，A嵌段包含聚氧化乙烯且B嵌段包含聚氧化丙烯。在一些實施例中，A嵌段及/或B嵌段包含聚氧化乙烯與聚氧化丙烯之混合物，其中該混合物不改變B嵌段相比於A嵌段之相對疏水性。在一些實施例中，A-B-A型嵌段共聚物係式II化合物：(式II)， 其中a 係值為2-150之整數；且b 係值為10-100之整數。在一些實施例中，a 為10-30 (包括端點)之值，且b 為40-100 (包括端點)之值。在一些實施例中，a 為約20之值，且b 為約70之值。在一些實施例中，a 為80-120 (包括端點)之值，且b 為35-95 (包括端點)之值。在一些實施例中，a 為約100之值，且b 為約65之值。
在一些實施例中，諸如三嵌段共聚物之嵌段共聚物可具有結構限制以提供特定功能需求。舉例而言，嵌段共聚物之總分子量(例如重量平均分子量或數目平均分子量)可足夠低以使得聚合物在25℃下為液體或在25℃下具有指定的最大黏度。在一些實施例中，嵌段共聚物之總分子量(例如重量平均分子量)可使用測角計測定表面功能化，之後使用飛行時間次級離子質譜分析進行分析來測定。在一些實施例中，嵌段共聚物之總分子量(例如重量平均分子量)可為例如約7,000 g/mol或更小、或約6,500 g/mol或更小、或約6,000 g/mol或更小、或約5,500 g/mol或更小、或約5,000 g/mol或更小、或約、或約4,500 g/mol或更小、或約4,000 g/mol或更小、或約3,500 g/mol或更小、或約3,000 g/mol、或約2,500 g/mol或更小、或約2,000 g/mol或更小、或約1,500 g/mol或更小、或約1,000 g/mol或更小。在一些實施例中，嵌段共聚物之總分子量在600 g/mol與1,500 g/mol之間。
在一些實施例中，聚合物內之特定嵌段之分子量可經指定以賦予嵌段共聚物特定特徵。舉例而言，A-B-A型嵌段共聚物中之B嵌段之分子量可相對於嵌段共聚物之總分子量變化以改變B嵌段與塗層相互作用之程度。A：44.05 (881)，B：58.08 (4065)。在一些實施例中，B嵌段之分子量可佔A-B-A型嵌段共聚物之總分子量之約30%至約40%之間、約40%至約50%之間、約50%至約60%之間、約60%至約70%之間、約70%至約80%之間、或更高。
功能化 在某些實施例中，本文中所描述之技術可用於將所關注之分子約束至樣品槽之所需區域。在一些實施例中，所需區域可稱為「目標體積」或「反應體積」。在一些實施例中，樣品槽佔據由開口界定之體積或空間，該開口形成於積體裝置之表面處，該表面延伸穿過第一層且進入積體裝置之第二層直至遠離開口之底表面。在一些實施例中，安置在樣品槽之開口與底表面之間的第一層及第二層之暴露表面可稱為進一步限定樣品槽所佔據之體積或空間之側壁。
在一些實施例中，第一層係金屬包覆層。在一些實施例中，金屬包覆層包含一或多種類型之金屬(例如鋁、鈦、鋯、鐵、錫、鉭等)。在一些實施例中，第一層之暴露表面部分包含金屬氧化物。在一些實施例中，第二層係透明材料或玻璃。在一些實施例中，第二層之暴露表面部分包含熔融矽石或二氧化矽。在一些實施例中，樣品槽之側壁由第一及第二層之暴露表面部分中之每一者的至少一部分構成。在一些實施例中，樣品槽之底表面包含二氧化矽。在一些實施例中，鄰接於底表面之側壁之至少一部分包含二氧化矽。
在實施例中，在將一或多種分子或複合物(例如定序模板)固定於底表面上時，可能需要功能化底表面以允許一或多種分子或複合物之附著。在某些實施例中，底表面包含透明玻璃。在某些實施例中，底表面包含熔融矽石或二氧化矽。在一些實施例中，底表面用矽烷功能化。在一些實施例中，底表面用帶離子電荷之聚合物功能化。在一些實施例中，帶離子電荷之聚合物包含聚(離胺酸)。在一些實施例中，底表面用聚(離胺酸)-接枝-聚(乙二醇)功能化。在一些實施例中，底表面用生物素標記之牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)功能化。
在一些實施例中，底表面用包含烷基鏈之矽烷功能化。在一些實施例中，底表面用包含視情況經取代之烷基鏈之矽烷功能化。在一些實施例中，底表面用包含聚(乙二醇)鏈之矽烷功能化。在一些實施例中，底表面用包含偶合基團之矽烷功能化。舉例而言，偶合基團可包含化學部分，諸如胺基、羧基、羥基、巰基、金屬、螯合劑及類似物。可替代地，其可包括特定結合元件，諸如生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白、凝集素、SNAP-標籤™ 或受質，因此締合或結合肽或蛋白質、抗體或抗體片段、核酸或核酸類似物或類似物。另外或可替代地，偶合基團可用於偶合額外基團，該額外基團用於耦合所關注之分子或與所關注之分子結合，該額外基團可在某些情況下包括化學官能基及特定結合元件兩者。藉助於實例，偶合基團，例如生物素，可在基板表面上沈積且選擇性地在給定區域中活化。中間體結合劑，例如抗生蛋白鏈菌素，可隨後偶合於第一偶合基團。在此特定實例中將為生物素標記之所關注之分子隨後偶合於抗生蛋白鏈菌素。
在一些實施例中，底表面用包含生物素，或其類似物之矽烷功能化。在一些實施例中，底表面用包含聚(乙烯)二醇鏈之矽烷功能化，其中聚(乙二醇)鏈包含生物素。在某些實施例中，底表面用矽烷之混合物功能化，其中矽烷之至少一種類型包含生物素且矽烷之至少一種類型不包含生物素。在一些實施例中，混合物所包含之生物素標記之矽烷比不包含生物素之矽烷少約10倍、少約25倍、少約50倍、少約100倍、少約250倍、少約500倍、或少約1000倍。
所關注之分子 在一些態樣中，本發明提供適用於將所關注之分子約束至樣品槽之所需區域的技術。在一些實施例中，本文中所描述之方法涉及使具有功能化表面之樣品槽與經組態以結合功能化表面之所關注之分子接觸。
在一些實施例中，所關注之分子係聚合酶。如本文中所使用，術語「聚合酶(polymerase)」及「聚合酶(polymerizing enzyme)」一般係指能夠催化聚合反應之任何酶。聚合酶之實例包括(但不限於)核酸聚合酶、轉錄酶或連接酶。聚合酶可為聚合反應酶。針對單分子核酸延伸部分(例如用於核酸定序)之實施例可使用能夠合成與靶核酸分子互補之核酸之任何聚合酶。在一些實施例中，聚合酶可為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶及/或其一或多種突變體或改變形式。在一些實施例中，聚合酶可為選自2016年12月19日申請之審查中美國臨時申請案第62/436,410號之任何聚合酶，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，所關注之分子係定序模板。如本文所用，「定序模板」係作為分析(例如定序分析)主題之分子。在一些實施例中，定序模板包含核酸分子。在一些實施例中，核酸分子稱為「標靶」或「模板」核酸。在一些實施例中，核酸分子包含至少一種雜交引子/聚合酶複合物。舉例而言，在一些實施例中，使核酸分子與定序引子接觸使得定序引子黏接至核酸分子，該定序引子與核酸分子之一部分互補。此引發位置產生其中聚合酶(例如DNA或RNA聚合酶)可偶合至核酸分子以形成雜交引子/聚合酶複合物之位點。因此，在一些實施例中，所關注之分子係定序模板複合物，其包含具有雜交引子/聚合酶複合物之模板核酸分子。
在一些實施例中，樣品槽與所關注之分子之接觸發生在樣品槽與功能化試劑之接觸之後，無中間洗滌步驟。
在一些實施例中，所關注之分子較佳地以約100倍至約1000倍選擇性、約200倍至約800倍選擇性、約400倍至約600倍選擇性、或約1000倍至約2000倍選擇性結合至鈍化之金屬氧化物表面上方的功能化二氧化矽表面。舉例而言，在一些實施例中，所關注之分子較佳地以約80倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、或約2000倍或更高的選擇性結合至功能化二氧化矽表面。
在一些實施例中，所關注之分子對鈍化之金屬氧化物表面上方之功能化二氧化矽表面的選擇性比不與嵌段共聚物接觸之樣品槽高約10倍至約100倍、約50倍至約500倍、約100倍至約1000倍、或約200倍至約400倍。舉例而言，在一些實施例中，所關注之分子對鈍化之金屬氧化物表面上方之功能化二氧化矽表面的選擇性比不與嵌段共聚物接觸之樣品槽高約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、或約1000倍或更高。
樣品裝載 在一些態樣中，本發明係關於適用於製備樣品槽之一或多個表面之技術。舉例而言，在一些實施例中，本發明提供用於功能化樣品槽之表面之方法及組合物。包含本文中所描述之一或多種組合物之樣品可藉由任何數目之適合方法添加至包含樣品槽之基板。在一些實施例中，樣品由醫師例如經由移液管、分配器或任何適合之流體傳送裝置/系統裝載。在一些實施例中，樣品藉由自動化構件(例如機器人裝置/系統)裝載。在一些實施例中，樣品經由一或多種微流體通道裝載。
在一些實施例中，樣品可藉由一般用於將分子遞送至分析裝置之方法遞送至基板(例如包含樣品槽之積體裝置、陣列)。舉例而言，遞送方法可包括將本文中所描述之組合物中之一或多者懸浮於流體中且使所得懸浮液在基板上流動。此可包括僅將相關懸浮液移液於基板之一或多個區域上，或可包括更活躍之流動方法，諸如電引導或基於壓力之流體流。在一些實施例中，使樣品流入基板之選擇區中，例如所需表面待於基板之特定區域中功能化之區域。基板之區域亦可為僅藉由將相關懸浮液移液至基板之正確區域中之遞送的選擇性目標。在一些實施例中，根據2016年12月19日申請之共同未決之美國臨時申請案第62/436,407號中所描述的技術將本文中所描述之試劑、共聚物、分子、化學物質、組合物及/或物質裝載於樣品槽中，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
如本文中所描述，本發明之態樣提供使用兩親媒性試劑、嵌段共聚物、功能化試劑及所關注之分子中之一或多者製備樣品槽之方法。在一些實施例中，樣品槽可在約同一時間暴露於此等組分中之兩者或超過兩者。在一些實施例中，樣品槽以逐步方式暴露於此等組分中之每一者。在一些實施例中，樣品槽以約同一時間暴露於兩親媒性試劑及嵌段共聚物以產生鈍化表面。在一些實施例中，樣品槽在其他組分之前暴露於兩親媒性試劑以產生塗層。在一些實施例中，樣品槽暴露於兩親媒性試劑歷經一段時間，該時間段超過樣品槽暴露於嵌段共聚物之時段時間。舉例而言，在一些實施例中，兩親媒性試劑經由分子自組裝之製程產生塗層，該製程可能需要與具有金屬氧化物表面之樣品槽之較長培育期。
在一些實施例中，在樣品槽暴露於嵌段共聚物之前，樣品槽暴露於兩親媒性試劑歷經約24小時之時段以形成塗層。在一些實施例中，在樣品槽暴露於嵌段共聚物之前，樣品槽暴露於兩親媒性試劑歷經約4至8小時、約8至12小時、約12至16小時、約16至20小時、約20至24小時、約24至28小時、約28至32小時、約32至36小時、約36至40小時、約40至44小時、約44至48小時或更長之時段。在一些實施例中，在樣品槽暴露於功能化試劑之前，具有塗層之樣品槽暴露於嵌段共聚物歷經約2小時之時段。在一些實施例中，具有塗層之樣品槽暴露於嵌段共聚物歷經約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時或更長之時段以在金屬氧化物表面上方形成抗污層。
在一些實施例中，具有抗污層之樣品槽暴露於功能化試劑歷經約1至2小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於功能化試劑歷經約30分鐘。在一些實施例中，樣品槽暴露於功能化試劑歷經約1小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於功能化試劑歷經約2小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於功能化試劑歷經約30至90分鐘。在一些實施例中，樣品槽暴露於功能化試劑歷經約3小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於功能化試劑歷經超過3小時。
在一些實施例中，具有功能化二氧化矽表面之樣品槽暴露於所關注之分子歷經約1至2小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於所關注之分子歷經約30分鐘。在一些實施例中，樣品槽暴露於所關注之分子歷經約1小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於所關注之分子歷經約2小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於所關注之分子歷經約30至90分鐘。在一些實施例中，樣品槽暴露於所關注之分子歷經約3小時。在一些實施例中，樣品槽暴露於所關注之分子歷經超過3小時。
樣品製備 在一些實施例中，包含靶核酸之樣品可自獲自個體(例如人類或其他個體)之生物樣品提取。在一些實施例中，個體可為患者。在一些實施例中，靶核酸可出於診斷、預後及/或療法目的偵測及/或定序。在一些實施例中，用於定序分析之資訊可適用於幫助疾病或病狀之診斷、預後及/或治療。在一些實施例中，個體可疑似患有健康狀況，諸如疾病(例如癌症)。在一些實施例中，個體可經歷疾病治療。
在一些實施例中，生物樣品可自個體之體液或組織提取，諸如氣息、唾液、尿液、血液(例如全血或血漿)、大便或其他體液或活檢樣品。在一些實例中，一或多種核酸分子提取自個體之體液或組織。一或多種核酸可自獲自個體之一或多種細胞提取，諸如個體組織之部分，或獲自個體之游離體液，諸如全血。
生物樣品可在製備中處理以用於偵測(例如定序)。此類處理可包括來自生物樣品之生物分子(例如核酸分子)之分離及/或純化，及生物分子之更多複本之產生。在一些實例中，使一或多種核酸分子自個體之體液或組織分離及純化，且經由諸如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction；PCR)之核酸擴增擴增。隨後，可諸如經由定序鑑別一或多種核酸分子或其子單元。然而，在一些實施例中，核酸樣品可在不需要擴增下評估(例如定序)。
如本申請案中所描述，定序可包括藉由合成與模板互補或類似於模板之另一生物分子，諸如藉由合成與模板核酸分子互補之核酸分子及鑑別隨時間推移核苷酸之併入(例如藉由合成定序)來測定模板生物分子之個體子單元。作為替代方案，定序可包括生物分子之個體子單元之直接鑑別。
定序 在一些態樣中，本文中所描述之方法及裝置可用於容許偵測樣品中之個體分子或粒子之分析技術。個體分子可為(作為實例而非限制)胺基酸、多肽、核苷酸、核酸、或其包含可偵測部分之變體。舉例而言，在一些實施例中，本發明中所提供之方法及組合物可與單分子核酸定序技術結合使用。單分子核酸定序允許藉由實時監測與模板核酸互補之核酸分子之延伸部分測定單核酸分子之序列。
在一些實施例中，本申請案之態樣可用於與生物樣品分析相關方法中。在一些實施例中，本文提供之方法適用於用於測定樣品中之一或多種核酸或多肽之序列及/或測定樣品中之一或多種核酸或多肽變體(例如相關基因中之一或多種突變)之存在或不存在的技術。在一些實施例中，可針對患者樣品(例如人類患者樣品)進行測試以出於診斷、預後及/或療法目的提供核酸序列資訊或測定所關注之一或多種核酸之存在或不存在。在一些實例中，診斷性測試可包括例如藉由定序個體之生物樣品中之不含細胞之DNA分子及/或表現產物(例如RNA)定序個體之生物樣品中之核酸分子。舉例而言，本發明提供可有利地用於以下各者中所描述之技術中的方法及組合物：共同未決之美國專利申請案第14/543,865號、第14/543,867號、第14/543,888號、第14/821,656號、第14/821,686號、第14/821,688號、第15/161,067號、第15/161,088號、第15/161,125號、第15/255,245號、第15/255,303號、第15/255,624號、第15/261,697號、第15/261,724號、第15/600,979號、第15/846,967號、第15/847,001號、第62/289,019號、第62/296,546號、第62/310,398號、第62/339,790號、第62/343,997號、第62/344,123號、第62/426,144號、第62/436,407號、及第62/436,410號，其各自內容以引用之方式併入本文中。
本申請案之一些態樣適用於能夠定序生物聚合物，諸如核酸及蛋白質之技術。在一些實施例中，本申請案中所描述之方法及組合物可用於(例如藉由偵測一系列經標記之核苷酸或胺基酸單體之併入時程)鑑別併入至核酸或蛋白質中之一系列核苷酸或胺基酸單體之技術。在一些實施例中，本申請案中所描述之方法及組合物可併入至鑑別一系列核苷酸之技術中，該等核苷酸併入至藉由樣品槽中之聚合酶合成之模板依賴性核酸定序反應產物中。在一些實施例中，聚合酶可使用本文中所描述之高選擇性表面功能化技術附著至樣品槽之所需區域。
在一些實施例中，在溶液中形成包含聚合酶、靶核酸及引子之複合物且使該複合物固定於固體撐體(例如經由固定聚合酶、引子及/或靶核酸)。
樣品槽 在一些態樣中，本發明提供包含基板之積體裝置，該基板包含具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面之樣品槽。在一些實施例中，積體裝置進一步包含藉由包含親水性頭基及疏水性尾基之兩親媒性試劑於金屬氧化物表面上形成之塗層。在一些實施例中，兩親媒性試劑經由親水性頭基結合至金屬氧化物表面。在一些實施例中，積體裝置進一步包含藉由包含A嵌段及B嵌段之A-B-A型嵌段共聚物於塗層上形成之抗污性覆蓋。在一些實施例中，A-B-A型嵌段共聚物經由B嵌段結合至塗層。在一些實施例中，積體裝置進一步包含結合至二氧化矽表面之功能化試劑，其中功能化試劑包含偶合部分。
在一些實施例中，基板包含樣品槽之陣列，各樣品槽具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面。在一些實施例中，樣品槽包含形成於基板表面處之頂部孔口及遠離基板表面之底表面。在一些實施例中，底表面由二氧化矽表面包含。在一些實施例中，積體裝置經組態以與下一代定序儀器介接。
如本文所用，「積體裝置」係能夠與基本儀器介接之裝置。在一些實施例中，積體裝置可包含一或多個樣品槽及/或感測器。在一些實施例中，積體裝置能夠與發射或偵測光線之基本儀器介接。在此類實施例中，積體裝置可包含各自包括波導之一或多個樣品槽。
本文中所描述之類型之積體裝置可包含經組態以在其中接受所關注之分子的一或多個樣品槽。在一些實施例中，樣品槽接受可安置於樣品槽之表面，諸如底表面上。在一些實施例中，樣品槽在積體裝置內形成，其中樣品槽之底表面位於形成其之積體裝置之表面的遠端。在一些實施例中，安置所關注之分子之底表面與經組態以用所要程度之激發能量激勵所關注之分子的波導可具有一定距離。在一些實施例中，樣品槽可相對於波導安置，使得沿著波導傳播之光模之瞬逝場與所關注之分子重疊。
樣品槽可具有積體裝置之表面處之頂部開口，經由該頂部開口可將所關注之分子置放於樣品槽中。頂部開口之尺寸可視不同因素而定，該等因素諸如所裝載之樣品中之所關注之分子(例如定序模板、聚合酶)的尺寸。在一些實施例中，頂部開口之尺寸可視其中利用包含樣品槽之積體裝置之儀器或設備而定。舉例而言，在偵測來自樣品槽內之光線之裝置中，背景信號可由雜散光產生。在將所關注之分子安置於樣品槽中且用激發能量激發時，背景信號可造成發射能量之非所需波動，因此產生量測雜訊。為限制此類波動，頂部開口之尺寸可經組態以阻斷背景信號之至少一部分。
在一些實施中，樣品槽之體積可在約10-21 升與約10-15 升之間。因為樣品槽具有小體積，所以單樣品事件(例如單分子事件)之偵測可為可能的，即使所關注之分子可以類似於發現於天然環境中之濃度的濃度濃縮於檢測試樣中。舉例而言，微莫耳濃度之所關注之分子可存在於經置放以與積體裝置接觸之試樣中，但在像素級別下，僅約一種所關注之分子(或單分子事件)可在任何給定時間位於樣品槽內。
統計學上，一些樣品槽可不含所關注之分子且一些可含有超過一種所關注之分子。然而，可觀數量之樣品槽可含有單一所關注之分子(例如在一些實施例中至少30%)，使得對於大量樣品槽可同時進行單分子分析。因為單分子或單樣品事件可在各樣品槽處分析，所以積體裝置使得有可能偵測可另外在總體均值中未被察覺之個體事件。
實例實例 1. 使用嵌段共聚物之金屬氧化物表面上之改善的可濕性 用於鈍化金屬氧化物表面之製程係藉由可濕性實驗評估。具有由TiO2 及SiO2 構成之表面區域之試片經受兩步驟製程，該製程涉及塗層之形成及抗污性覆蓋之後續形成。出於此等實驗之目的，使用己基膦酸(HPA)產生塗層，且使用普洛尼克P123 (Pluronic P123)三嵌段共聚物(HO(C2 H4 O)a (C3 H6 O)b (C2 H4 O)a H)產生抗污層。
使TiO2 /SiO2 試片暴露於HPA歷經24小時之時段以允許HPA單層在TiO2 表面上自組裝。在HPA鈍化之後，表面可濕性藉由接觸角量測評估，其中試片之TiO2 側面上之液滴量測約85°且SiO2 側面上之液滴量測約15°。接觸角隨時間變化之曲線指示液滴接觸角在兩小時之後在HPA鈍化之TiO2 表面上保持穩定。
在用HPA鈍化之後，使TiO2 /SiO2 試片暴露於三嵌段共聚物歷經兩小時。再次地，獲得各試片側面之接觸角量測。SiO2 側面上之可濕性看起來不受三嵌段共聚物步驟之影響，其中接觸角維持在約15°。此將表明SiO2 之親水性未由嵌段共聚物之添加改變。相比之下，試片之TiO2 側面出現可濕性之可量測提高，其中接觸角降低至約45°。在初始HPA鈍化(圖6，頂部)之後及使HPA鈍化表面暴露於嵌段共聚物(圖6，底部)之後獲得TiO2 液滴之成像。此處可濕性之變化將表明HPA鈍化TiO2 之親水性在添加嵌段共聚物之後顯著提高。另外，此等觀測結果將與藉由嵌段共聚物形成之抗污性覆蓋之形成一致。
實例 2. 用以評估表面功能化之結合選擇性分析 矽烷化對TiO2 /SiO2 試片之表面選擇性係藉由量子點(QD)-抗生蛋白鏈菌素分析使用生物素共軛之矽烷評估。在此等實驗中，檢測僅用HPA鈍化塗層製備之試片，或藉由HPA鈍化繼之以利用三嵌段共聚物之抗污性覆蓋製備的試片之矽烷化合物的表面選擇性。所分析之不同條件之螢光成像結果展示於圖7中。
使用未經受表面化學反應改質步驟之TiO2 /SiO2 試片獲得背景螢光量測(圖7，頂部)。對於對照實驗，TiO2 /SiO2 試片係藉由利用HPA之鈍化繼之以利用矽烷-PEG-生物素之表面功能化製備。螢光量測使用QD-抗生蛋白鏈菌素結合分析獲得，其表明對試片之矽烷化以對SiO2 側面之接近2倍選擇性發生(圖7，中間)。選擇性藉由自對照強度量測減去背景螢光強度量測測定。舉例而言，使用圖7 (頂部，中間)中報告之量測估算SiO2 :TiO2 之對照選擇性，其中選擇性藉由以下獲得：(Si對照 - Si空白 )/(Ti對照 - Ti空白 ) = (53000 - 3400)/(25000 - 2000) = (49600)/(23000) = 約2.2，或約2倍選擇性。
接著，如在實例1中，利用HPA鈍化及三嵌段共聚物覆蓋製備TiO2 /SiO2 試片。在共聚物改質之試片之矽烷化以後，螢光量測表明矽烷化合物以＞500:1選擇性結合至TiO2 側面上方的SiO2 側面(圖7，底部)。如所展示，針對共聚物試片之TiO2 側面所偵測之螢光信號接近空白實驗中之TiO2 側面。因此，如先前計算選擇性，且估算以表明對SiO2 側面之超過500倍偏好。
實例 3. 生物反應中之抗污性效果 對定序晶片之抗污性覆蓋效果藉由觀測來自用HPA或HPA/三嵌段共聚物處理之晶片上的染料標記之核苷酸之螢光發射評估。如圖8 (左)中所示，在經HPA/三嵌段共聚物處理之晶片中觀測到最小螢光信號。相比之下，僅用HPA處理之晶片展示自溶液中之經標記之核苷酸偵測到的高得多的發射(圖8，右)。此等結果表明經HPA處理之晶片比HPA/三嵌段共聚物處理之晶片更易受保留在樣品槽之漸逝體積內之經染料標記的核苷酸影響。另外，此將表明三嵌段共聚物賦予抗污特性以將附著至漸逝體積內之表面之染料的易感性降至最低或消除。使用經HPA/三嵌段共聚物處理之晶片進一步進行定序反應以證實與三嵌段共聚物表面鈍化方法之相容性(圖9)。
等效物及範疇 在本文中已經描述及說明數種本發明實施例的同時，一般熟習此項技術者將易於設想用於進行該功能及/或獲得該等結果及/或獲得本文所述之該等優點中之一或多者的多種其他方法及/或構造，且將此類變化及/或修改之各者視為在本文所述之本發明實施例之範疇內。更一般而言，熟習此項技術者將容易地理解本文所述之所有參數、尺寸、物質及組態意欲為例示性且實際參數、尺寸、物質及/或組態將視特定應用或使用本發明教示之應用而定。熟習此項技術者將認識到或使用不多於常規實驗便能夠確定本文中所描述之特定本發明實施例之許多等效物。因此應瞭解，前述實施例僅藉由實例呈現且在隨附申請專利範圍及其等效物之範疇內，本發明可以不同於特定描述及主張之其他方式來實施。本發明之本發明實施例係有關本文中所描述之各個別特徵、系統、物品、物質、套組及/或方法。另外，若此類特徵、系統、物品、物質、套組及/或方法相互間無不一致，則兩種或多於兩種此類特徵、系統、物品、物質、套組及/或方法之任何組合包括於本發明之範疇內。
如本文中所定義及使用之所有定義應理解為控制在辭典定義、以引用之方式併入之文獻中的定義及/或所定義術語之普通含義內。
本文中所揭示之所有參考、專利及專利申請案以引用之方式相關於各自經引用之主題併入，其在一些情況下可涵蓋文件之全部內容。
除非明確相反指示，否則如在本文說明書及申請專利範圍中使用之不定冠詞「一(a/an)」應理解為意謂「至少一個」。
如本文在說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或」應理解為意謂如此結合之要素的「任一者或兩者」，亦即，在一些情況下結合地存在且在其他情況下未結合地存在的要素。使用「及/或」列出的多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此結合之「一或多個」要素。可視情況存在除了藉由「及/或」短語所確切地鑑別之要素以外之其他要素，無論與確切地鑑別之彼等要素相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，參考「A及/或B」在結合諸如「包含」等開放式措辭使用時，在一個實施例中，可僅指A (視情況包括除了B以外之要素)；在另一實施例中，可僅指B (視情況包括除了A以外之要素)；在另一實施例中，可指A及B兩者(視情況包括其他要素)；等。
如在本說明書及申請專利範圍中所使用，「或」應被理解為具有與如上所定義之「及/或」相同的含義。舉例而言，當分隔清單中之項目時，「或」或「及/或」應被解釋為包括性的，亦即，包括要素之數目或清單及(視情況)額外未列出項目的至少一個，以及多於一個。截然相反的術語，諸如「中之僅一者」或「中之恰好一者」或當用於申請專利範圍中時「由……組成」將指包括元件之數目或清單中之恰好一個元件。一般而言，當置於排他性術語，諸如「任一者」、「中之一者」、「中之僅一者」或「中之恰好一者」之前時，如本文中所使用之術語「或」應僅解釋為表明排他性替代方式(亦即「一者或另一者但非二者皆」)。當用於申請專利範圍中時，「主要由……組成」應具有如其在專利法律領域中所使用之普通含義。
如本說明書及申請專利範圍中所使用，關於一或多個要素之清單的片語「至少一個」應被理解為意謂由要素之清單中要素之任何一或多個中選出的至少一個要素，但未必包括要素之清單內具體列出的每一及每個要素中之至少一者，且未必排除元件之清單中之要素的任何組合。此定義亦允許可視情況存在除片語「至少一個」所指的要素之清單內具體鑑別的要素以外的要素，而無論與具體鑑別的彼等要素相關抑或不相關。由此，作為非限制性實例，「至少一個A及B」(或等效地「至少一個A或B，」或，等效地「至少一個A及/或B」)可在一個實施例中指至少一個(視情況包括超過一個)A而不存在B (且視情況包括除B以外的要素)；在另一實施例中，指至少一個(視情況包括超過一個)B而不存在A (且視情況包括除A以外的要素)；在又一實施例中，指至少一個(視情況包括超過一個) A及至少一個(視情況包括超過一個) B (且視情況包括其他要素)；等。
亦應理解除非截然相反地指示，否則在本文中所主張之包括超過一個步驟或操作之任何方法中，該方法之步驟或操作之順序並非必需限制於列舉該方法之步驟或操作之順序。
在申請專利範圍中以及在上述說明書中，諸如「包含」、「包括」、「攜載」、「具有」、「含有」、「涉及」、「擁有」、「由……組成」及其類似者之全部過渡性片語應理解為開放的，亦即，意謂包括但不限於。僅過渡片語「由……組成」及「基本上由……組成」應分別為封閉或半封閉過渡片語，如美國專利局手冊專利考察程序(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)第2111.03節中所闡述。應瞭解，在替代實施例中，亦涵蓋此文件中使用開放式過渡片語(例如「包含」)描述之實施例，如「由……組成」及「基本上由……組成」由開放式過渡片語描述之特性。舉例而言，若本發明描述「包含A及B之組合物」，則本發明亦涵蓋替代實施例「由A及B組成之組合物」及「基本上由A及B組成之組合物」。
100‧‧‧積體裝置
102‧‧‧金屬氧化物塗層
104‧‧‧金屬層
106‧‧‧二氧化矽層
108‧‧‧鈍化塗層
130‧‧‧功能化試劑
180‧‧‧樣品槽
190‧‧‧所關注之分子
202‧‧‧金屬氧化物表面/表面
206‧‧‧二氧化矽表面
210‧‧‧塗層
220‧‧‧抗污性覆蓋
230‧‧‧二氧化矽表面
302‧‧‧金屬氧化物表面
304‧‧‧二氧化矽表面
310‧‧‧塗層
314‧‧‧疏水性尾部/疏水性尾部
316‧‧‧親水性頭基
318‧‧‧疵點
320‧‧‧抗污性覆蓋/抗污層
322‧‧‧嵌段共聚物
324‧‧‧A嵌段
326‧‧‧B嵌段
330‧‧‧鈍化層
332‧‧‧功能化試劑
334‧‧‧偶合部分
402‧‧‧金屬氧化物表面
404‧‧‧二氧化矽表面
442‧‧‧兩親媒性試劑
444‧‧‧共價偶合部分
452‧‧‧聚合化合物
454‧‧‧部分
502‧‧‧A-B-A型三嵌段共聚物
504‧‧‧交替單體
506‧‧‧隨機組態
508‧‧‧漸尖界面
510‧‧‧支鏈嵌段
512‧‧‧刷狀共聚物
(i)‧‧‧步驟
(ii)‧‧‧步驟
(iii)‧‧‧步驟
熟練技術人員應瞭解，本文所描述之圖僅用於說明性目的。應理解，在一些情況下，為輔助理解本發明，本發明之各種態樣可能經放大或擴大顯示。在圖式中，在通篇各種圖中，相同參考標號一般係指相同特徵、功能上相似及/或結構上相似之單元。圖式未必為按比例的，實際上重點在於說明教示內容之原理。圖式不意欲以任何方式限制本教示內容之範疇。 本發明之特徵及優點將自下文結合圖式所闡述之實施方式而變得更顯而易見。 當參考圖式描述實施例時，可使用方向參考(「之上」、「之下」、「頂部」、「底部」、「左側」、「右側」、「水平」、「垂直」等)。此類參考僅意欲作為讀者在正常定向上觀看圖式之輔助。此等方向參考不意欲描述實施裝置之較佳或唯一定向。裝置可實施於其他定向中。 如自具體實施方式顯而易見，在本申請案通篇，圖(例如圖1-9)中描繪及出於說明的目的進一步描述之實例描述非限制性實施例，且在一些情況下可出於更清楚說明的目的簡化某些方法或省略特徵或步驟。 圖1描繪樣品槽之橫截面視圖。 圖2A及2B說明選擇性功能化樣品槽之二氧化矽表面部分之製程的工作流程。 圖3描繪其中基板之二氧化矽表面部分藉由在基板之金屬氧化物表面部分上形成抗污性覆蓋來選擇性功能化之製程。 圖4描繪藉由在基板之金屬氧化物部分上生成接枝聚合物鈍化層來鈍化金屬氧化物表面之製程。 圖5描繪嵌段共聚物之非限制性組態。 圖6提供可濕性實驗之成像結果。 圖7提供結合選擇性分析之成像結果。 圖8描繪獲自螢光分析之結果之讀數及圖示。 圖9描繪定序反應之結果，該定序反應使用積體裝置進行，該定序反應具有根據本文中所描述之一些實施例選擇性功能化之表面。

Claims (30)

  1. 一種功能化樣品槽之二氧化矽表面之方法，該方法包含， 使具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面之樣品槽與較佳地結合該金屬氧化物表面上之塗層之嵌段共聚物接觸；及 使該樣品槽與較佳地結合該二氧化矽表面之功能化試劑接觸以產生功能化二氧化矽表面，其中該功能化試劑包含偶合部分。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含使該樣品槽與較佳地結合該金屬氧化物表面之兩親媒性試劑接觸以在該金屬氧化物表面上形成該塗層。
  3. 如請求項2之方法，其中該兩親媒性試劑包含經組態以較佳地結合該金屬氧化物表面之親水性頭基及經組態以較佳地結合該嵌段共聚物之疏水性尾基。
  4. 如請求項3之方法，其中該親水性頭基包含硫酸酯、亞硫酸酯、磷酸酯、膦酸酯、羥基、兒茶酚酯、異氰酸酯、異羥肟酸酯、或羧基官能基。
  5. 如請求項3或4之方法，其中該疏水性尾基包含C1 -C30 烷基鏈。
  6. 如請求項2至5中任一項之方法，其中該兩親媒性試劑包含式CH3 (CH2 ) n PO3 H2 之烷基膦酸化合物，其中n 係值為1-30之整數。
  7. 如請求項2至5中任一項之方法，其中該兩親媒性試劑包含己基膦酸、辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、聚乙烯基膦酸、12-膦醯基-1-十二烷磺酸、10-十一炔基膦酸、或十七氟癸基膦酸。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該嵌段共聚物係包含A嵌段及B嵌段之A-B-A型嵌段共聚物。
  9. 如請求項8之方法，其中該塗層較佳地結合該A-B-A型嵌段共聚物之該B嵌段。
  10. 如請求項8或9之方法，其中該B嵌段之疏水性高於該A嵌段之疏水性。
  11. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該A嵌段包含第一聚醚嵌段且該B嵌段包含疏水性高於該第一聚醚嵌段之第二聚醚嵌段。
  12. 如請求項8至11中任一項之方法，其中該A-B-A型嵌段共聚物係式I化合物： (A a )(B b )(A a ) (式I)， 其中： A係包含該A嵌段之聚醚化合物之單體單元；a 係值為2-150之整數； B係包含該B嵌段之聚醚化合物之單體單元；且b 係值為10-100之整數。
  13. 如請求項8至12中任一項之方法，其中該A嵌段包含聚氧化乙烯且該B嵌段包含聚氧化丙烯。
  14. 如請求項8至13中任一項之方法，其中該A-B-A型嵌段共聚物係式II化合物：(式II)， 其中：a 係值為2-150之整數；且b 係值為10-100之整數。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中該金屬氧化物表面包含氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、氧化鐵、氧化錫或氧化鉭。
  16. 如前述請求項中任一項之方法，其中該功能化試劑包含矽烷化合物。
  17. 如請求項16之方法，其中該矽烷化合物包含單乙氧基矽烷、甲氧基矽烷、二乙氧基矽烷、三氯矽烷、或二乙氧基、甲氧基矽烷。
  18. 如前述請求項中任一項之方法，其中該功能化試劑之該偶合部分包含生物素分子、抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素蛋白質、凝集素蛋白質或SNAP標籤。
  19. 如前述請求項中任一項之方法，其中該功能化試劑之該偶合部分包含胺基、疊氮基、羧基、羥基、烷基、炔基或硫氫基。
  20. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含在適合於容許所關注之分子結合至該偶合部分之條件下，使具有該功能化二氧化矽表面之該樣品槽與經組態以結合該偶合部分之該所關注之分子接觸，進而使該所關注之分子偶合至該功能化二氧化矽表面。
  21. 如請求項20之方法，其中該樣品槽與該所關注之分子之該接觸發生在該樣品槽與該功能化試劑之該接觸之後，無中間洗滌步驟。
  22. 如請求項20或21之方法，其中該所關注之分子係聚合酶。
  23. 如請求項20或21之方法，其中該所關注之分子係定序模板複合物，該定序模板複合物包含具有雜交引子/聚合酶複合物之模板核酸分子。
  24. 如請求項20至23中任一項之方法，其中該所關注之分子較佳地以約100倍至約1000倍選擇性、約200倍至約800倍選擇性、約400倍至約600倍選擇性、或約1000倍至約2000倍選擇性結合至該金屬氧化物表面上方之該功能化二氧化矽表面。
  25. 如請求項20至24中任一項之方法，其中該所關注之分子對該金屬氧化物表面上方之該功能化二氧化矽表面之選擇性比不與該嵌段共聚物接觸之樣品槽高約10倍至約100倍、約50倍至約500倍、約100倍至約1000倍、或約200倍至約400倍。
  26. 一種積體裝置，其包含： 基板，該基板包含具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面之樣品槽； 藉由包含親水性頭基及疏水性尾基之兩親媒性試劑於該金屬氧化物表面上形成之塗層，其中該兩親媒性試劑經由該親水性頭基結合至該金屬氧化物表面； 藉由包含A嵌段及B嵌段之A-B-A型嵌段共聚物於該塗層上方形成之抗污性覆蓋，其中該A-B-A型嵌段共聚物經由該B嵌段結合至該塗層；及 結合至該二氧化矽表面之功能化試劑，其中該功能化試劑包含偶合部分。
  27. 如請求項26之積體裝置，其中該基板包含樣品槽之陣列，各樣品槽具有金屬氧化物表面及二氧化矽表面。
  28. 如請求項26或27之積體裝置，其中該樣品槽包含形成於該基板之表面處之頂部孔口及遠離該基板之該表面的底表面。
  29. 如請求項28之積體裝置，其中該底表面由該二氧化矽表面包含。
  30. 如請求項26至29中任一項之積體裝置，其中該積體裝置經組態以與下一代定序儀器介接。
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