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TW201837035A - Ｍａｎｏａｌｉｄｅ衍生物異構物的分離及鑑定、以及其構型依賴抗血癌與抗淋巴癌功效 - Google Patents

Ｍａｎｏａｌｉｄｅ衍生物異構物的分離及鑑定、以及其構型依賴抗血癌與抗淋巴癌功效 Download PDF

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TW201837035A
TW201837035A TW106112268A TW106112268A TW201837035A TW 201837035 A TW201837035 A TW 201837035A TW 106112268 A TW106112268 A TW 106112268A TW 106112268 A TW106112268 A TW 106112268A TW 201837035 A TW201837035 A TW 201837035A
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manoalide
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呂美津
宋秉鈞
蘇瑞欣
賴奎宏
劉益昌
杜英齊
許育銘
郭富雯
Original Assignee
呂美津
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Abstract

本發明揭露由海綿動物萃取出的抗癌manoalide化合物、其醫藥組成物、製備方法及構型鑑定方法。該化合物具有式I結構式： 其中，R為CH3，C-24及C-25的構型組合為24R,25R、24R,25S或24S,25S。式I化合物是以乙酸乙酯萃取海綿動物、濃縮乙酸乙酯萃取物獲得殘留物、層析該殘留物獲得多個分餾物、以及通過矽膠管柱層析以及反相高效液相層析分離而獲得。將式I化合物與標準品的質子化學偏移進行比對，以判斷式I化合物的構型。

Description

Manoalide衍生物異構物的分離及鑑定、以及其構型依賴抗血癌與抗淋巴癌功效
本發明關於一種化合物、其醫藥組成物、製備方法及構型鑑定方法。尤其，本發明關於一種由海綿動物萃取出的抗癌manoalide化合物、其醫藥組成物、製備方法及構型鑑定方法。
科學家已從海洋生物找到可應用於醫療產業的化合物。例如，Cytarabine(Ara-C，商品名：賽德薩(Cytosal®)注射劑)為第一個美國食品藥物管理局核准且源自海綿動物---荔枝海綿(Tethya crypta)的藥物，其被開發為透過針對PDA聚合酶而用於治療急性骨髓性白血病(AML)。例如，來自黑色軟海綿(Halichondria okadai)的Eribulin Mesylate(E7389，商品名：賀樂維(Halaven®)注射劑)阻斷G2/M細胞週期並破壞有絲分裂紡錘體(mitotic spindles)，於延長有絲分裂阻斷期後，最終造成癌細胞凋亡。例如，來自無殼軟體動物---龍骨海鹿(Dolabella auricularia)的Brentuximab vedotin(SGN-35，商品名：雅詩力(Adcetris®)凍晶注射劑)被用於治療何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)。例如，來自海鞘(Ecteinascidia turbinata)的海鞘素743(ecteinascidin 743(ET-743)，又 稱為Trabectedin)被用於治療惡性軟組織惡瘤。因此，從海洋生物尋找新穎化合物已成為藥物開發的新契機。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
為了開發新穎化合物及藥物，本案揭露一種由海綿動物Luffariella sp.萃取出的抗癌manoalide化合物、其醫藥組成物、製備方法及構型鑑定方法。再者，本案揭露一種可鑑定一產品或醫藥組成物中類manoalide的化合物或衍生物的R或S構型的方法，以確定該產品或醫藥組成物中特定構型的manoalide化合物的成分及/或比例。
根據本發明的一個構想，揭露一種用於治療癌症的醫藥組成物，包括第一式I化合物： 其中，R為CH3，而第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合選自由24R,25R、24R,25S及24S,25S所組成的群組其中之一。
在一具體實施例中，該醫藥組成物更包括第二該式I化合物，其中R為H，而第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合為24R,25R及24R,25S其中之一。
在一具體實施例中，該醫藥組成物更包括至少一式II化合物： 其中，當R為H時，第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合為24R,25R及24R,25S其中之一；及當R為CH3時，第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合為24R,25R及24R,25S其中之一。
在一具體實施例中，該醫藥組成物更包括式III化合物：
在一具體實施例中，癌症為血癌或淋巴癌，血癌涉及的癌細胞包括但不限於人類急性淋巴細胞白血病細胞株Molt 4或人類慢性骨髓性白血病細胞株K562、人類前骨髓性白血病細胞株HL 60及諸如此類，淋巴癌涉及的癌細胞包括但不限於細胞株Sup-T1、U937及諸如此類。而血癌或淋巴癌的治療機轉是相關於拓樸異構酶II之催化抑制活性。
根據本發明的一個構想，揭露一種製備用於抗癌的化合物的方法，該化合物具有上述式I所示的結構式，其中，R為CH3，而第24號 碳位置及第25號碳位置的構型組合選自由24R,25R、24R,25S及24S,25S所組成的群組其中之一，該方法包括：(a)提供一海綿動物Luffariella sp.；(b)以乙酸乙酯萃取該海綿動物，以獲得一乙酸乙酯萃取物；(c)濃縮該乙酸乙酯萃取物，以獲得一殘留物；(d)依序以正己烷、正己烷-乙酸乙酯混合物、以及丙酮層析該殘留物，以獲得多個分餾物；以及(e)分別將該多個分餾物依序通過矽膠管柱層析以及反相高效液相層析，以獲得該式I化合物。
在一具體實施例中，海綿動物為Luffariella variabilis。然而，海綿動物Luffariella sp.包括但不限於Luffariella variabilis。
根據本發明的一個構想，揭露一種用於鑑定manoalide化合物的構型和比例的方法，其中manoalide化合物具有上述式I所示的結構式，該方法包括：(a)比對manoalide化合物與第一標準品24S-O-methylmanoalide、第二標準品24R-manoalide或第三標準品24R-O-methylmanoalide的質子化學偏移的訊號，以判斷manoalide化合物的第24號碳位置的構型為R或S；(b)比對manoalide化合物與第四標準品25R-manoalide diacetate與一第五標準品25S-manoalide diacetate的質子化學偏移的訊號，以判斷manoalide化合物的第25號碳位置的構型為R或S；以及(c)在反相HPLC圖譜中，比對該manoalide化合物之波峰積分面積與一已定量之內部標準品的積分面積比值，以判斷該manoalide化合物之含量及比例。
在一具體實施例中，第24號碳位置的構型更藉由偵測H-4/H24之間以及H-4/H-24-OMe之間的NOESY關聯性而確定，以及第25號碳位置的構型更藉由偵測H-4/H25之間的NOESY關聯性而確定。
基於本發明前述構想，本發明的技術可應用於鑑定一項產品或醫藥組成物中類manoalide的化合物或衍生物的R或S構型的方法，以確定該產品或醫藥組成物中特定構型的manoalide化合物的成分及/或比例。
本文用語「manoalide」、「manoalide化合物」、「manoalide衍生物」、「類manoalide化合物」或「類manoalide二倍半萜類」是指具有manoalide結構的化合物。
本文用語「混合物」或「溶液」是指將兩種或多種溶液依體積比調和的混合物或溶液。因此，本文用語「正己烷-乙酸乙酯(v/v)混合物」是指正己烷與乙酸乙酯依體積比調和的混合物。所屬技術領域中具有通常知識者可理解，其他體積比調和出的混合物或溶液均可應用於本發明且落入申請專利範圍。
本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。
第1圖為本發明實施例中Molt 4細胞經化合物7處理後的與細胞凋亡相關蛋白質表現的西方點漬示意圖。
第2圖(A)為本發明實施例中化合物7在Topo IIα調控的超螺旋pHOT1質體DNA鬆弛作用的效果示意圖。第1至5道：化合物7(0.078、0.15625、0.3125、0.625及1.25μg/mL)；第6道：作為topo II毒物(誘導線型DNA)的正控制組依託泊苷(500μM)；第7道：線型DNA；第8道：負控制組質體DNA(超螺旋DNA)；第9道：質體DNA+topo IIα(誘導DNA鬆弛作用)。
第2圖(B)為本發明實施例中化合物7在Topo I活性的效果示意圖。第1至6道：化合物7(0.078、0.15625、0.3125、0.625、1.25及2.5μg/mL)； 第7道：負控制組質體DNA(超螺旋DNA)；第8道：鬆弛的DNA；第9道：質體DNA+topo IIα(誘導DNA鬆弛作用)；第10道：質體DNA+topo IIα+溶劑控制組(誘導DNA鬆弛作用)。
第2圖(C)為本發明實施例中受化合物7影響的蛋白質ATM、Chk 2及H2A.X磷酸化的西方點漬示意圖。
第3圖為本發明實施例中化合物7對於活體內動物模式的腫瘤生長的效果示意圖。控制組為PBS，實驗組為化合物7。「*」表示與控制組相較具有顯著性差異(p<0.001)。
本案所提出之發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得所屬技術領域中具有通常知識者可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，所屬技術領域中具有通常知識者仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
實驗方法：
動物材料及化合物的萃取：
海綿動物Luffariella sp.的樣本是在2012年9月從台灣屏東後灣海岸10公尺深處以水肺潛水採集。該海綿動物的保證樣本寄存於台灣國立海洋生物博物館(樣本編號：2012-09-SP)。由台灣國立海洋生物博物館進行該海綿動物的分類鑑定。由於海綿動物Luffariella sp.可為所屬技術領域中具有通常知識者輕易取得及鑑別，因此並無須依據專利法暨其施行細則的相關規定進行生物材料之寄存。在本發明的具體實施例中，海綿動物Luffariella sp.包括但不限於Luffariella variabilis，所屬技術領域中具有通常 知識者理解，本發明具體實施例可以任何Luffariella sp.的海綿動物進行實驗及獲得結果。
收集並冷凍乾燥該海綿動物(790g鮮重)。將冷凍乾燥的海綿動物(207g，乾重)切碎並以乙酸乙酯(EtOAc)徹底地萃取，獲得乙酸乙酯萃取物。在減壓下以蒸發方式濃縮乙酸乙酯萃取物，獲得一殘留物(8g)，再使用正己烷(n-hexane)、極性漸增的正己烷-乙酸乙酯(v/v)混合物及最終純丙酮對該殘留物進行矽膠管柱層析，獲得12個分餾物：L1(以n-hexane沖提)、L2(以n-hexane：EtOAc=100：1沖提)、L3(以n-hexane：EtOAc=50：1沖提)、L4(以n-hexane：EtOAc=20：1沖提)、L5(以n-hexane：EtOAc=10：1沖提)、L6(以n-hexane：EtOAc=5：1沖提)、L7(以n-hexane：EtOAc=3：1沖提)、L8(以n-hexane：EtOAc=2：1沖提)、L9(以n-hexane：EtOAc=1：1沖提)、L10(以n-hexane：EtOAc=1：2沖提)、L11(以EtOAc沖提)及L12(以丙酮沖提)。以矽膠管柱層析(以n-hexane：EtOAc=3：1至1：1沖提)進一步純化分餾物L8，獲得10個子分餾物(L8-1至L8-10)。對子分餾物L8-7進行反相高效能液相層析(reverse-phase HPLC，MeOH：H2O=92：8(v/v)，水中含0.1%乙酸(v/v))，獲得化合物4(32.7mg，滯留時間42.8分鐘)、化合物5(9.9mg，滯留時間37.8分鐘)及化合物9(19.3mg，滯留時間44.8分鐘)。也以反相HPLC(MeOH：H2O=90：10(v/v)，水中含0.1%乙酸(v/v))分離子分餾物L8-9，獲得化合物2(2.5mg，滯留時間35.9分鐘)、化合物3(8.7mg，滯留時間64.5分鐘)、化合物7(1.6mg，滯留時間37.7分鐘)及化合物8(5.8mg，滯留時間67.9分鐘)。以反相HPLC(MeOH：H2O=90：10(v/v)，水中含0.1%乙酸(v/v))分離子分餾物L8-10，獲得化合物1(4.8mg，滯留時間33.0分鐘)、化合物6(3.2mg，滯留時間31.7分鐘)及化合物10(19.2mg，滯留時間33,9分鐘)。進一步以反相HPLC定 量分析方法檢測該manoalide化合物之含量及比例，先配置內部標準品之適當濃度(5,10,20,40,80μg/mL)，接著將內部標準品不同濃度之標準溶液取10μL注入HPLC-PDA以三重複(n=3)進行分析，以平均吸收峰面積(peak area)為Y軸，濃度為X軸繪製檢量線，並求得標準曲線之線性回歸方程式(y=ax+b)，進而建立內部標準品之檢量線。接續在反相HPLC圖譜中，比對該manoalide化合物之波峰積分面積與已定量之內部標準品的積分面積比值，並以建立之檢量線進行濃度換算，以判斷該manoalide化合物之含量及比例。
化合物1(24R,25R-Luffariellin A)：無色油狀物質；+70.6(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3481,2988,1749及1645cm-1；1H NMR數據，參見表1；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物2(24R,25S-Luffariellin A)：無色油狀物質；+31.0(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3384,2954,2877,1758及1658cm-1；1H NMR數據，參見表1；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物3(24R-O-Methyl-25R-luffariellin A)：無色油狀物質；-14.5(c 0.1,MeOH)：IR(neat)v max 3443,2955,1744及1648cm-1；1H NMR數據，參見表1；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物4(24R-O-Methyl-25S-luffariellin A)：無色油狀物質；-15.2(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3411,2954,2874,1759及1640cm-1；1H NMR數據，參見表1；ESIMS m/z 537[M+Na]+；HRESIMS m/z 537.3546[M+Na]+(計算為C32H50O5Na,537.3550)。
化合物5(24S-O-Methyl-25S-luffariellin A)：無色油狀物質；-10.7(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3450,2968,2868,1742及1650cm-1；1H NMR數據，參見表1；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物6(24R,25R-Manoalide)：無色油狀物質；+27.0(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3414,2958及1756cm-1；1H NMR數據，參見表2；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物7(24R,25S-Manoalide)：無色油狀物質；+79.4(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3403,2888及1758cm-1；1H NMR數據，參見表2；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物8(24R-O-Methyl-25R-manoalide)：無色油狀物質；+56.8(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3444,2969,1761及1650cm-1；1H NMR數據，參見表2；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物9(24R-O-Methyl-25S-manoalide)；無色油狀物質；+38.7(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3384,2959,2886,1761及1658cm-1；1H NMR數據，參見表2；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
化合物10(24R,25S-Thorectolide)：無色油狀物質；+12.6(c 0.1,MeOH)；IR(neat)v max 3421,2936,1754及1651cm-1；1H NMR數據，參見表2；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(計算為C31H48O5Na,523.3399)。
Annexin V/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試驗：
使用annexin V-FITC染色套組來定量磷脂醯絲胺酸(PS)的外顯化及膜完整性(Su et al.,Marine Drugs,2013,11(9)：3168-3185.)。簡而言之，將106個細胞培養於35mm直徑培養盤並在收取細胞前以annexin V-FITC(10μg/mL)及PI(20μg/mL)標記細胞。在標記後，以結合緩衝液清洗所有的培養盤並收取細胞。以2×105cells/mL的濃度將細胞重新懸浮於結合緩衝液，再以流式細胞儀FACS-Calibur(Becton-Dickinson,San Jose,CA,USA)及CellQuest軟體分析。每次測定計數約10,000個細胞。
活性含氧物(ROS)生成作用、鈣累積作用及MMP破壞作用的測定：
這些試驗是依據文獻(Lai et al.,Sci.Rep.2016,6：36170.)描述內容進行。分別以JC-1陽離子染劑(5μg/mL)、螢光鈣離子指示劑(Fluo 3,5mM)及螢光素羧基衍生物(carboxy-H2DCFDA,1.0mM)(均購自Molecular Probes and Invitrogen technologies(Carlsbad,CA,USA))偵測MMP破壞作用、鈣累積作用及ROS生成作用。簡而言之，以特定螢光染劑標記經處理的細胞30分鐘。在標記後，以PBS清洗細胞，並在流式細胞試驗分析之前以1×106cells/mL的濃度將細胞懸浮於PBS。
拓樸異構酶II催化抑制劑及毒物試驗：
本試驗是參照文獻(Lai et al.,Sci.Rep.2016,6：36170.)描述內容進行。含有50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、200mM麩胺酸鉀、10mM二硫蘇糖醇、50μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、1mM ATP、0.3μg pHOT1質體DNA、2單位的人類拓樸異構酶II(Topogen,Columbus,OH,USA)及特定濃度的依託泊苷(etoposide)的標準鬆弛反應混合物(20μL)與化合物1至10一起於37℃培養30分鐘。加入2μL的10% SDS來終止反應，以幫助捕捉切割複合物中的酵素，接著加入2.5μL蛋白酶K(50μg/mL)來消化所結合的蛋白質(培養於37℃、15分鐘)，且最後加入0.1倍體積的樣本填充染劑。經由在0.5×TAE緩衝液、以2voltage/cm的垂直型2%洋菜膠體 電泳來分析DNA產物。以溴化乙錠(EtBr)染色膠體，並使用Eagle Eye II系統(Stratagene,La Jolla,CA,USA)拍攝膠體。定量分析DNA拓樸異構酶II(DNA Topo II)活性。以影像分析儀直接掃描膠體，並計算呈現超螺旋DNA的區域來估計導致50%的Topo II活性抑制(IC50)的化合物之濃度。
偵測DNA雙股斷裂(DSB)的中性慧星試驗：
本試驗是使用CometAssayTM套組(Trevigen,Gaithersburg,MD,USA)、按照中性慧星試驗的製造商手冊來進行。簡而言之，以化合物7(0.0625μg/mL)按特定時間處理癌細胞(2×105cells/mL)。將細胞與1%低熔點洋菜醣以1：10(v/v)的比例合併，且立即將75μL混合物吸取到CometSlideTM上並置於4℃暗處。以冰冷裂解溶液(Trevigen)淹蓋玻片30到60分鐘。將玻片置於水平電泳裝置並在1x TBE緩衝液(90mM Tris-HCl、90mM硼酸及2mM EDTA(pH 8.0))中以20伏特進行電泳10分鐘。接著將樣本固定於70%酒精並風乾，以1：10,000的SYBR Green I(Trevigen)染色，使可觀察到細胞DNA。使用TriTek彗星影像軟體分析螢光影像，以選圈出每一彗星的「頭部」區域及「尾部」區域，且記錄每一定義的區域的積分螢光值。測量從核的後緣到尾部的前緣之彗星長度。此長度表示DNA損傷的程度。計算是以每重複來平均。結果以三次獨立實驗的平均±標準差表示(* p<0.05)。
免疫螢光分析：
在以化合物處理細胞後，以在50mM HEPES緩衝液(pH 7.3)的4%聚甲醛固定細胞30分鐘，並以在PBS(pH 7.4)的0.2% Trition X-100淹蓋20分鐘。為了避免非專一性的蛋白質結合，在室溫下以在PBS(含有0.05% Trition X-100)(T-PBS)中的5% BSA處理細胞1小時。接著於室溫將細胞與初級抗體Hsp70(1：500)培養2小時，再與二次抗體(Alexa Fluor 586-耦合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)) (1：1000)培養1小時。以PBS清洗細胞後，在FV1000共焦雷射掃描式顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)觀察細胞。
人類血癌Molt 4細胞異種移植動物模式：
六週大免疫缺陷的無胸腺公小鼠購自台灣台北的國家實驗動物動物研究中心。全部動物都在標準實驗室條件下(溫度24-26℃、12小時-12小時黑暗-明亮循環)照料，且以實驗室飼料及水飼養。將懸浮於0.2mL PBS的Molt 4細胞(1×106個細胞)皮下注射至右脇部，且每日監測腫瘤生長。腫瘤細胞注射後14天將確定有腫瘤生長的小鼠隨機地分為兩組。將化合物7(1μg/g小鼠體重)腹膜注射至治療組，而僅注射溶劑至控制組小鼠。每隔一天注射化合物7，持續33天。以二氧化碳犧牲小鼠。使用卡尺每週測量腫瘤大小三次，並根據標準公式「寬度2×長度/2」計算腫瘤體積。
統計：
結果以平均±標準差(SD)表示。每個實驗的比較是使用未配對的學生t-試驗進行，且p值小於0.05被認為是具有統計上顯著性。
實驗結果：
Manoalide衍生物的化學鑑定：
對冷凍乾燥的Luffariella sp.樣本的乙酸乙酯萃取物以正相層析系統處理，再使用反相HPLC分離經沖提的分餾物，獲得一系列的manoalide化合物及類manoalide二倍半萜類(如下所示)，包括24R,25R-luffariellin A(化合物1)、24R,25S-luffariellin A(化合物2)、24R-O-methyl-25R-luffariellin A(化合物3)、24R-O-methyl-25S-luffariellin A(化合物4)、24S- O -methyl-25S-luffariellin A(化合物5)、24R,25R-manoalide(化合物6)、24R,25S-manoalide(化合物7)、24R-O-methyl-25R-manoalide(化合物8)、24R-O-methyl-25S-manoalide(化合物9)及24R,25S-thorectolide(化合物10)。其中化合物1、2、6及7為首次被分離純化並進行結構鑑定，化合物3、4及5為新穎化合物。
化合物1、2及6至10的平面結構是以電子撞擊式質譜(EIMS)及高解析電灑式游離質譜(HRESIMS)數據確認，並將1H核磁共振(1H NMR)圖譜(表1及表2)的特徵訊號與文獻(Dilipdesilva et al.,Tetrahedrin Letters,1980,21(17)：1611-1614.、Soriente et al.,Eur.J.Org.Chem.2000,2000(6)：947-953.、Namikoshi et al.,Fisheries Sci.2004,70(1)：152-158.及Gauvin-Bialecki et al.Molecules,2008,13(12)：3184-3191.)內容進行比對。進一步確定這些化合物的立體結構。所有化合物第4號碳(C-4)的軸型性質是從其6.4至11.2Hz的大範圍耦合常數以及在C-4表明R構型的C-5質子推論而得。
以化合物5為例，藉由將其質子化學偏移(CDCl3，在400MHz：δ H 4.66(H-4),5.71(H-6),5.06(H-24))與先前已確定的標準品24S-O-methylmanoalide的質子化學偏移(CDCl3，在600MHz：δ H 4.67(H-4),5.73(H-6),5.03/5.11(H-24))(Namikoshi et al.,Fisheries Sci.2004,70(1)：152-158.)進行比對，確定C-24的相對構型為S。另一方面，除了化合物5的C-24為S構型(即：24S)之外，藉由將其他化合物的質子化學偏移與標準品24R-manoalide(Dilipdesilva et al.,Tetrahedrin Letters,1980,21(17)：1611-1614.)及標準品24R-O-methylmanoalide(Namilkoshi et al., Fisheries Sci.2004,70(1)：152-158.)的質子化學偏移進行比對，確定所有其他化合物為24R構型(化合物1至4及6至10(CDCl3，在400MHz)：δ H 4.76-4.86(H-4),5.66-5.69(H-6),5.29-5.30或4.78-4.80(H-24)；24R-manoalide(CDCl3)：δ H 4.85(H-4),5.69(H-6),5.32(H-24)；24R-O-methylmanoalide(CDCl3，在600MHz)：δ H 4.76/4.83(H-4),5,68(H-6),4.79/4.82(H-24))。化合物3、4及5的C-24構型再藉由偵測H-4/H-24(存在於化合物5)之間以及H-4/H-24-OMe(出現於化合物3及4)之間的NOESY關聯性而確定。
為了確定C-25的構型，將化合物的1H NMR質子化學偏移與文獻(Soriente et al.,European Journal of Organic Chemistry,2000,6：947-953.)的標準品25R-manoalide diacetate及標準品25S-manoalide diacetate的質子化學偏移進行比對。具有25R構型的化合物較具有24S構型的化合物存在更往下的化學偏移。於是，化合物1、3、6及8被確認為25R構型，且化合物2、4、5、7、9及10被確認為25S構型。化合物4及5的25S構型再藉由偵測H-4/H-25之間的NOESY關聯性而確定。
本發明立體異構物的構型依賴抗血癌功效：
並未有先前技術揭露本發明立體異構物的C-24及C-25構型及其生物活性。在本發明中，以MTT試驗確定了血癌細胞株(Molt 4、K562)及淋巴癌細胞株(Sup-T1及U937)經過化合物1至10處理72小時後，其細胞增生受到影響。請參閱表3，其為本發明manoalide立體異構物對不同血癌細胞株的IC50值。24R,25S-衍生物(化合物2、4、7及9)對大部分的血癌及淋巴癌細胞株的IC50值小於1μg/mL，顯示出具潛力的細胞毒殺活性。在72小時處理後，相較於其他化合物在對抗Molt 4、K562、Sup-T1及U937細胞上，化合物2(IC50：0.41、1.8、1.55及0.21μg/mL)、4(IC50：0.22、1.92、0.5及2.5μg/mL)、7(IC50：0.34、3.19、0.56及0.65μg/mL)及9(IC50：0.29、 3.22、1.48及0.52μg/mL)顯示出較低的IC50值。根據表3之結果，24R,25S相較於其他構型在manoalide及其衍生物中對於抗血癌及抗淋巴癌具有2.1至47.6倍較佳之活性，故確認24R,25S構型為「關鍵活性作用構型」。
a NA(無活性，non-active)=72小時的IC50>20μg/mL
b 正控制組
化合物7經由DNA損傷及MMP破壞作用調控細胞凋亡誘導作用：
為了測定化合物7的細胞毒殺作用是否相關於與粒腺體有關的細胞凋亡，以annexin-V/PI、DAPI及JC-1染色進行在Molt 4細胞中的細胞凋亡數量及粒腺體膜電位分佈。在24小時後，化合物7(0、0.15625、0.3125及0.625μg/mL)以劑量依賴方式(36.4%、66%及98.7%)造成Molt 4細胞的細胞凋亡數量增加。為了評估由化合物7引起的細胞核型態變化，以DAPI染色進一步檢驗Molt 4細胞，並在螢光顯微鏡下觀察。相較於顯示完整及正常細胞核的對照組，化合物7增加了濃縮細胞核的數量(結果未示出)。為 了評估化合物7的細胞凋亡誘導作用是否與粒腺體路徑有關，使用玫瑰紅123螢光染劑來測定粒腺體膜電位。以0.3125μg/mL的化合物7處理Molt 4細胞1、2、3、4、6及20小時，並以玫瑰紅123螢光染劑及2',7'-二氯螢光素二乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)染色。化合物7(0.3125μg/mL)以時間依賴方式增加具有遭破壞的膜電位及ROS生成的Molt 4細胞數量(結果未示出)。為了測定化合物7是否對Molt 4細胞具有細胞毒殺作用，以化合物7處理細胞24小時，並以西方點漬法分析細胞凋亡相關蛋白質(PARP、caspase 3、caspase 8及caspase 9)。化合物7以較高劑量(0.3125及0.625μg/mL)導致Molt 4細胞的PARP斷裂。在Molt 4血癌細胞株中，化合物7以劑量依賴方式導致caspase 3、8及9的活化(第1圖)。這些結果證明，化合物7的細胞毒殺活性是透過粒腺體破壞作用及ROS過度產生而調控，導致Molt 4血癌細胞的細胞凋亡誘導作用。
為了精確地確定化合物7在拓樸異構酶I及拓樸異構酶II(Topo I及Topo II)的效果，使用經純化人類蛋白質(而非小牛蛋白質)及酵素負調控的超螺旋pHOT1質體DNA的無細胞DNA斷裂試驗進行實驗，確認化合物7在Topo I及Topo II的實際功效。在Topo II試驗中，當以依託泊苷(etoposide，一種標準的Topo II毒物)處理超螺旋pHOT1質體DNA時，觀察到線型DNA。與控制組超螺旋DNA相較，漸增濃度(0.078、0.15625、0.3125、0.625及1.25μg/mL)的化合物7以劑量依賴方式抑制了DNA鬆弛作用，且在Topo IIα出現時導致形成超螺旋DNA產物(第2圖(A)第1至5道)。
在Topo I試驗中，如第2圖(B)所示，最低劑量(0.078、0.15625、0.3125及0.625μg/mL)的化合物7在出現拓樸異構酶I(Topo I)時誘導了DNA鬆弛作用(第1至4道)，但在較高劑量(1.25及2.5μg/mL)時，化合物7抑制了Topo I活性，將超螺旋DNA轉變為鬆弛形態(第5至6道)。 化合物7以劑量依賴方式(IC50值為0.75μg/mL)抑制超螺旋DNA的鬆弛作用。與控制組超螺旋DNA相較，漸增濃度(0.078、0.15625、0.3125、0.625、1.25及2.5μg/mL)的化合物7以劑量依賴方式抑制了DNA鬆弛，且在Topo I出現時導致形成超螺旋DNA產物(第2圖(B)第1至6道)。再者，如無細胞系統所證明的，化合物7分別以0.75及0.49μg/mL的IC50值抑制Topo I及Topo II活性。這些結果證實化合物7可作為Topo I及Topo II雙重抑制劑。
為了確認化合物7的細胞凋亡機制影響了γH2AX(DNA損傷的生物標記物)誘導作用，使用西方點漬分析及慧星試驗測定經化合物7處理的DNA損傷程度。在西方點漬分析中，蛋白質ATM、Chk 2及H2A.X磷酸化是以時間依賴方式顯著地增加(第2圖(C))。為了確認化合物7誘導了Molt 4細胞的DNA損傷，使用中性電泳條件下的慧星試驗，測定化合物7在不同時間間隔(0、2、4及8小時)在細胞核DNA完整性程度的效果。化合物7增加了Molt 4細胞的DNA遷移程度(結果未示出)。如慧星試驗的異常拖尾大小所表明的，DNA遷移是以時間依賴增加方式由DSB誘導作用表示。這些結果指出，化合物7可作為Topo IIα的有效催化抑制劑。
化合物7在活體內人類Molt 4腫瘤異種移植動物模式中抑制腫瘤生長：
化合物2、4、7及9對於數種癌細胞株顯示出有效的細胞凋亡，其中，藉由評估化合物7對於人類血癌細胞Molt 4在異種移植動物模式中腫瘤生長的抗腫瘤活性效果。將1×106個Molt 4細胞皮下接種於免疫缺陷無胸腺母小鼠的右脇部。在注射34天後，Molt 4細胞的腫瘤生長在化合物7(1μg/g)腹膜內注射的影響下顯著地被抑制。控制組在第34天的平均腫瘤尺寸為433.77mm3，然而在化合物7處理組的平均腫瘤尺寸為147.01mm3(參閱第3圖)。與對照組(p<0.05)相較，在化合物7處理組的腫瘤尺寸顯著 地低了66.11%，而在小鼠體重並沒有顯著差異(結果未示出)。這些結果表示，化合物7在活體內異種移植模式中顯示出抗腫瘤效果。
結論：
本發明揭露的由海綿動物Luffariella sp.萃取出的新穎化合物3、4至5的C-24及C-25構型顯著地影響其對於血癌(Molt 4及K562細胞)及淋巴癌(Sup-T1及U937細胞)的抗增生活性。24R,25S異構物(化合物2、4、7及9)顯示出最有效的抗增生活性(IC50值為0.29-3.22μg/mL)，因此可製備成醫藥組成物。化合物7為一種有效的Topo II催化抑制劑及抗癌藥物，而不是Topo II毒物。而本案揭露的鑑定方法可確定一產品或醫藥組成物中類manoalide的化合物或衍生物的R或S構型，以進一步確定該產品或醫藥組成物中特定構型的manoalide化合物的成分及/或比例。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

Claims (10)

  1. 一種製備用於抗癌的化合物的方法，該化合物具有如式I所示的結構式： 其中，R為CH 3，而第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合選自由24 R,25 R、24 R,25 S及24 S,25 S所組成的群組其中之一，該方法包括：(a)提供一海綿動物 Luffariella sp.；(b)以乙酸乙酯萃取該海綿動物，以獲得一乙酸乙酯萃取物；(c)濃縮該乙酸乙酯萃取物，以獲得一殘留物；(d)依序以正己烷、正己烷-乙酸乙酯混合物、以及丙酮層析該殘留物，以獲得多個分餾物；以及(e)分別將該多個分餾物依序通過矽膠管柱層析以及反相高效液相層析，以獲得該式I化合物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該海綿動物為 Luffariella variabilis。
  3. 一種用於鑑定一manoalide化合物的構型和比例的方法，其中該manoalide化合物具有式I化合物： 其中，R為CH 3，而第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合選自由24 R,25 R、24 R,25 S及24 S,25 S所組成的群組其中之一，該方法包括：(a)比對該manoalide化合物與一第一標準品24 S- O-methylmanoalide、一第二標準品24 R-manoalide或一第三標準品24 R- O-methylmanoalide的質子化學偏移的訊號，以判斷該manoalide化合物的第24號碳位置的構型為 R或 S；(b)比對該manoalide化合物與一第四標準品25 R-manoalide diacetate與一第五標準品25 S-manoalide diacetate的質子化學偏移的訊號，以判斷該manoalide化合物的第25號碳位置的構型為 R或 S；以及(c)在反相HPLC圖譜中，比對該manoalide化合物之波峰積分面積與一已定量之內部標準品的積分面積比值，以判斷該manoalide化合物之含量及比例。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中第24號碳位置的構型更藉由偵測H-4/H24之間以及H-4/H-24-OMe之間的NOESY關聯性而確定，以及第25號碳位置的構型更藉由偵測H-4/H25之間的NOESY關聯性而確定。
  5. 一種用於治療癌症的醫藥組成物，包括一第一式I化合物： 其中，R為CH 3，而第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合選自由24 R,25 R、24 R,25 S及24 S,25 S所組成的群組其中之一。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的醫藥組成物，更包括一第二該式I化合物，其中R為H，而第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合為24 R,25 R及24 R,25 S其中之一。
  7. 如申請專利範圍第5項所述的醫藥組成物，更包括至少一式II化合物： 其中，當R為H時，第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合為24 R,25 R及24 R,25 S其中之一；及當R為CH 3時，第24號碳位置及第25號碳位置的構型組合為24 R,25 R及24 R,25 S其中之一。
  8. 如申請專利範圍第5項所述的醫藥組成物，更包括式III化合物：
  9. 如申請專利範圍第5至8項中任一項所述的醫藥組成物，其中該癌症為血癌或淋巴癌，且該血癌或該淋巴癌的治療機轉是相關於拓樸異構酶II之催化抑制活性。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的醫藥組成物，其中血癌涉及的癌細胞為人類急性淋巴細胞白血病細胞株Molt 4或人類慢性骨髓性白血病細胞株K562，且淋巴癌涉及的癌細胞為細胞株Sup-T1或U937。
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