TW201828976A - 纖溶酶原在製備預防和治療骨質疏鬆及其相關病症的藥物中的用途和包含纖溶酶原用於預防或治療骨質疏鬆的藥劑 - Google Patents

Abstract

本發明涉及纖溶酶原用於預防和/或治療骨質疏鬆及其相關病症的用途。本發明還涉及預防和/或治療骨質疏鬆的藥物及製品。

Description

纖溶酶原在製備預防和治療骨質疏鬆及其相關病症的藥物中的用途和包含纖溶酶原用於預防或治療骨質疏鬆的藥劑

本發明涉及纖溶酶原用於預防或治療骨質疏鬆及相關疾病的用途。

骨質疏鬆症(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少和骨組織微結構破壞為特徵，並能導致骨脆性增加和易於骨折的全身性疾病。2001年美國國立衛生研究院(NIH)提出骨質疏鬆症是以骨強度下降、骨折風險性增加為特徵的骨骼系統疾病，骨強度反映骨骼的兩個主要方面，即骨密度和骨品質。骨質疏鬆症導致骨量減少和骨微結構的退化，使得患者骨骼的脆性增加，嚴重地降低患者的運動功能和生活品質。

哺乳動物骨骼發育是一個高度有序，受多重因素共同調控的過程。哺乳動物的骨骼發育主要通過膜內成骨和軟骨內成骨兩種方式完成，其中四肢骨、椎骨等長骨主要通過軟骨內成骨形成，顱骨、鎖骨內側部分等扁骨則是通過膜內成骨^〔1〕。骨組織形成後並非一成不變，而是處於骨形成與吸收的穩態動態平衡中。在此動態平衡的過程中，激素、多種信 號通路、骨組織細胞的協同調控及礦物鹽的穩態發揮著重要作用^〔2〕。

骨質疏鬆大致可分為原發性和繼發性兩大類，而絕經後骨質疏鬆和老年性骨質疏鬆均屬於原發性骨質疏鬆，且十分常見。繼發性骨質疏鬆症是一種常見的全身性骨病，除了已知的疾病和誘發骨質疏鬆的藥物之外，一些新興的藥物和治療手段都已經成為繼發性骨質疏鬆症的重要病因。

流行病學調查顯示，1型糖尿病患者骨量減少和骨質疏鬆發病率為48%~72%^〔3〕，對於2型糖尿病患者，骨密度增高、降低或沒有改變的結果國內外文獻均可見報導^〔4-6〕。近年來，研究發現2型糖尿病患者代謝性骨病的發病率和骨質疏鬆性骨折的危險性明顯高於普通人群，其骨質疏鬆發生率可達20%~60%^〔5〕。糖尿病骨質疏鬆易導致病理性骨折，致殘致死率高，可加重糖尿病患者的治療和康復困難。

在經過了一個多世紀的觀察中，人們發現骨質疏鬆患者常常因合併心肌梗死、中風、猝死而使死亡率明顯上升；而有動脈粥樣硬化的患者也常常合併骨量的丟失，導致骨質疏鬆性骨折的發生^〔7-9〕。過去常常認為動脈粥樣硬化與骨質疏鬆是隨年齡增加而出現的退行性改變，但隨著對二者長期的臨床觀察及分子機制的深人研究，人們發現：①二者存在共同的危險因素如衰老、糖尿血管細胞中的血管鈣化細胞(calcifying vascularcells，CVC)其分子特徵與骨生物學特徵之間越來越一致和平行，在敲除骨代謝相關基因的動物出現了血管特徵性表現，提示它們之間有共同的信號途徑、轉錄因數和細胞外基質的相互作用；③活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及氧化型脂質對血管及骨骼共同影響；④內分泌異常如雌激素的 減少、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)和維生素D、降鈣素代謝異常；⑤這兩個疾病的治療策略方面也存在密切的聯繫。隨著人們對這兩個看似矛盾、但常在同一機體發生的疾病的機制進一步瞭解，對As/OP症候群防治也不斷地深入。

近年來的多項研究顯示心血管系統疾病和骨質疏鬆症存在相關性，它們共同發生在老年期，經常在同一老年個體可見，且發病率都隨著年齡的增長而增加。儘管老年是心血管疾病和骨質疏鬆共同的危險因素，但大多數研究發現，忽略年齡這一因素後，這兩種疾病之間仍存在顯著的聯繫。一方面，心血管系統疾病與骨量丟失及骨折風險增加有關，同樣，有證據提示骨密度降低可導致心血管系統疾病的發病率和死亡率增加。進一步研究發現心血管疾病與骨質疏鬆在發病機制層面有緊密而直接的聯繫。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理基礎，而動脈鈣化則是其主要表現之一。動脈鈣化被認為是心血管疾病的一個重要標誌物和臨床監測指標。研究表明，血管鈣化的本質是血管平滑肌細胞向成骨細胞表型的轉化以及血管組織向骨組織的轉化。而血管鈣化的形成也和骨礦物質丟失具有顯著的相關性。第三軍醫大學周銳博士^[10]對一組60歲以上老年人群進行了觀察性研究，探討了老年患者動脈鈣化和骨質疏鬆及骨折之間相關性。他的研究包括：1.從2012年1月1日到12月31日，篩選60歲以上符合條件的來院就診患者為研究物件。2.主動脈鈣化程度的半定量測量：應用腰椎x線側位片對第1-4腰椎對應的腹主動脈鈣化沉積物進行評分。根據鈣化斑塊的長度和累及的節段數，每位患者的主動脈鈣化評分(acs)為0-24分不等，無主動脈鈣化是0分，最嚴重的主動脈鈣化是24分。並依據acs將患者分為進行 了分組。3.骨密度檢測使用雙能x線吸收儀測量(dxa)。骨質疏鬆症定義為基於dxa測定的骨密度值低於同性別、同種族正常成年人骨峰值2.5個標準差或以上。4.採用多因素回歸風險模型評估主動脈鈣化和骨質疏鬆症發生風險的關係。同時，該研究還包括：1.篩選60歲以上符合條件的絕經後婦女為研究物件。2.主動脈鈣化程度的半定量測量。3.椎骨骨折的診斷：通過x線片觀察椎體形態(胸4-腰5節段)確定椎骨骨折的發生(椎體高度下降20%以上)。4.採用多因素回歸分析模型評估主動脈鈣化和椎骨骨折之間的關係。同時，該研究還包括1.篩選60歲以上符合條件的來院就診患者為研究物件。2.骨密度檢測及骨質疏鬆症的診斷。3.頸動脈和冠狀動脈粥樣硬化鈣化斑塊檢測：使用64排螺旋ct行頸動脈和冠狀動脈cta。三維圖像分析工作站評估所有cta圖像。並對動脈斑塊的成分和發生範圍進行評價。4.採用多因素回歸風險模型分析骨質疏鬆和骨量丟失與頸動脈和冠狀動脈鈣化斑塊發生風險之間關係。研究結果發現，在調整年齡等其它混雜因素後，嚴重的骨量丟失與頸動脈斑塊、冠狀動脈斑塊及共存的鈣化斑塊的發生均顯著相關。結論是：在老年人群中，嚴重的主動脈鈣化與骨質疏鬆症的發生相關。骨質疏鬆症的發生風險隨著動脈粥樣硬化的增加而升高。骨密度降低和血25(OH)D水準下降也與骨質疏鬆症發生的相關。在老年絕經後婦女中，嚴重的主動脈鈣化與椎骨骨折的發生相關。骨密度降低和血25(OH)D水準下降與椎骨骨折的發生相關。在老年人群中，骨質疏鬆症、低骨量及血25(OH)D水準下降與動脈鈣化斑塊的發生相關；嚴重的骨量丟失與頸動脈斑塊、冠狀動脈斑塊及共存的鈣化斑塊的發生風險均相關。該研究對一組老年人群的觀察性研究揭示了老年病的一些共同危險因素及內在的相互關係，對骨質疏鬆症及心 血管疾病的防治具有重要意義。

骨質疏鬆症是衰老相關病症中的代表性症狀之一，在中老年人群尤其普遍。骨質疏鬆是生物衰老在骨骼方面的一種特殊表現，已經表明維生素D水準過低或者過高都與骨質疏鬆有關^[11]。隨著老齡化社會的到來，骨質疏鬆的發病率呈逐年上升趨勢，由此所帶來的社會經濟負擔也在大大增加。

對於骨質疏鬆的治療而言，關鍵是恢復並維持正常的骨組織含量和降低骨折的發生率。雖然治療的方法較多，但目前仍以藥物治療為主。常用的藥物有骨吸收抑制劑、骨形成促進劑和骨礦化物。骨吸收抑制劑是主要針對破骨細胞的藥物，通過抑制破骨細胞的活動而減少骨的重吸收；骨形成促進劑則是主要針對成骨細胞的藥物，能夠增強成骨細胞的活性，以促進新骨的合成；骨礦化物是治療骨質疏鬆的基礎用藥，包括鈣劑和維生素D，可以起到補充骨基質成分的作用。但當前治療骨質疏鬆的藥物絕大多數為骨吸收抑制劑(如雌激素、雙膦酸鹽、降鈣素等)，而骨形成促進劑(如甲狀旁腺激素等)的種類卻非常少。從藥物的治療效果來看，如今只是停留於改善症狀，延緩病情發展的水準，卻並沒有達到逆轉病情甚至治癒的效果，因此需要尋找新的治療藥物和治療方法。

發明簡述

本發明涉及：

1.一種預防和治療骨質疏鬆及其相關病症的方法，包括給 藥受試者治療有效量的纖溶酶原。

2.項1的方法，其中所述骨質疏鬆包括原發性骨質疏鬆和繼發性骨質疏鬆。

3.項1的方法，其中所述原發性骨質疏鬆包括絕經後骨質疏鬆和老年性骨質疏鬆。

4.項1或2的方法，其中所述繼發性骨質疏鬆包括繼發於內分泌疾病、風濕性疾病、胃腸道疾病，以及藥物治療引起的骨質疏鬆。

5.項4的方法，其中所述繼發性骨質疏鬆包括糖皮質激素、原發性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、原發性膽汁性肝硬化、性腺功能減低、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、骨關節炎、性腺激素治療、抗癲癇藥治療、化療藥物治療引起的骨質疏鬆。

6.一種預防和治療疾病併發的骨質疏鬆的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原，其中所述疾病併發的骨質疏鬆包括糖皮質激素、原發性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、原發性膽汁性肝硬化、性腺功能減低、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、骨關節炎、性腺激素治療、抗癲癇藥治療、化療藥物治療併發的骨質疏鬆。。

7.一種預防骨質疏鬆骨折的方法，包括給藥易患骨質疏鬆的受試者、處於患骨質疏鬆高風險的受試者或診斷患有骨質疏鬆的受試者有效量的纖溶酶原預防骨折的發生。

8.項7的方法，其中所述受試者包括患有糖皮質激素、原 發性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、原發性膽汁性肝硬化、性腺功能減低、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎或骨關節炎的受試者。

9.項7的方法，其中所述受試者包括正接受性腺激素治療、抗癲癇藥治療或化療藥物治療的受試者。

10.一種增強成骨細胞活性的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

11.一種調控骨礦物質代謝的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

12.項11的方法，所述調控包括降低血鈣水準、升高血磷水準，促進鈣在骨基質中的沉積和/或降低鈣在血管壁、內臟的沉積。

13.項1-12任一項的方法，其中所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。

14.項1-12任一項的方法，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

15.項1-12任一項的方法，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

16.項1-12任一項的方法，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保 留纖溶酶原活性的變體。

17.項1-12任一項的方法，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。

18.項1-12任一項的方法，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。

19.項13-18任一項的方法，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。

20.項1-19任一項的方法，其中所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

21.項1-20任一項的方法，其中所述受試者是人。

22.項1-21任一項的方法，其中所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。

23.項22的方法，其中所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

24.一種用於項1-23任一項的方法的纖溶酶原。

25.一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載劑和用於項1-23中任一項所述方法的纖溶酶原。

26.一種預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於項1-23中任一項所述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。

27.根據項26所述的試劑盒，其中所述構件為注射器或小 瓶。

28.項26或27的試劑盒，其還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施項1-23中任一項所述方法。

29.一種製品，其包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於項1-23中任一項所述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施項1-23中任一項所述方法。

30.項26-28中任一項的試劑盒或項29的製品，還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其它藥物。

31.項30的試劑盒或製品，其中所述其它藥物包括治療骨質疏鬆的其它藥物或治療與骨質疏鬆併發的其它疾病的藥物。

32.包含纖溶酶原的用於治療骨質疏鬆的藥劑。

33.包含纖溶酶原的用於治療骨質疏鬆的藥物組合物，試劑盒、製品。

34.纖溶酶原用於治療骨質疏鬆的用途。

35.本發明還涉及纖溶酶原在製備上述項1-23任一項的方法中使用的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。

在本發明的上述任一實施方案中，所述纖溶酶原可與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。在一些實施方案中，所 述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

在一些實施方案中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載劑和用於前述方法的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒可以是預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於前述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。在一些實施方案中，所述構件為注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述 任一方法。

在一些實施方案中，所述製品包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於前述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。在一些實施方案中，所述其他藥物選自下組：降血脂藥物、抗血小板藥物、降血壓藥物、擴張血管藥物、降血糖藥物、抗凝血藥物、溶血栓藥物，保肝藥物，抗心律失常藥物，強心藥物，利尿藥物，抗感染藥物、抗病毒藥物、免疫調節藥物、炎症調節類藥物和抗腫瘤藥物。

在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌內、皮下給予纖溶酶原來進行治療。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施 方案及其要素的所有亞組合，並且在本文中公開，就像每一個此類亞組合單獨且明確在本文中公開一樣。

發明詳述

定義

“骨質疏鬆症”是一種以骨量低下，骨微結構損壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特徵的全身性退化性骨病。一般分為原發性、繼發性和特發性骨質疏鬆症3類。

“原發性骨質疏鬆症”又分為絕經後骨質疏鬆症(I型)和老年骨質疏鬆症(Ⅱ型)，其中絕經後骨質疏鬆症一般發生在婦女絕經後5~10年內；老年骨質疏鬆症一般指老年人60歲及以上發生的骨質疏鬆症。原發性骨質疏鬆症主要強調骨量、骨丟失與骨結構的重要作用，以骨量減少、脆性增加、結構退化、易發生骨折為其臨床特徵。

“繼發性骨質疏鬆症”是指由於某些疾病、藥物或其他原因造成骨量降低，骨骼的微結構發生改變，易發生脆性骨折的疾病。常見的導致骨質疏鬆的疾病或藥物包括：

內分泌疾病：

庫欣症候群、性腺功能減低、甲狀腺功能亢進症、原發性甲狀旁腺功能亢進症、糖尿病

風濕疾病：

類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎

血液系統疾病：

多發性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、地中海貧血、血友病

藥物治療：

糖皮質激素過量、甲狀腺激素過量替代、抗癲癇藥物、鋰或鋁中毒、細胞毒或免疫抑制劑(環孢A、他克莫司)、肝素、引起性腺功能低下的藥物(芳香化酶抑制劑、促性腺激素釋放激素類似物等)

胃腸道疾病：

慢性肝病(尤其是原發性膽汁性肝硬化)、炎性腸病(尤其是克羅恩病)、胃大部分切除術、腹瀉病

腎臟疾病：

腎功能不全或衰竭

遺傳性疾病

成骨不全、馬凡症候群、血色病、高胱氨酸尿、卟啉病

其他原因：

任何原因維生素D不足、酗酒、神經性厭食、營養不良、長期臥床、妊娠及哺乳、慢性阻塞性肺疾病、腦血管意外、器官移植、澱粉樣變、多發性硬化、獲得性免疫缺陷症候群

這些繼發性因素通過影響成骨細胞和破骨細胞功能，使骨吸收增加和/或骨形成減低而導致骨質疏鬆。

本發明所述的“繼發性骨質疏鬆”的術語涵蓋了上述各種原因導致的骨質疏鬆。

“特發性骨質疏鬆”主要發生在青少年中，一般指男性發病年齡小於50歲、女性發病年齡小於40歲的骨質疏鬆，無潛在疾病，其原因 不明。

與某種疾病或狀況“併發的骨質疏鬆”，指的是與所述疾病或狀況相伴發生的骨質疏鬆。所述疾病或狀況與骨質疏鬆之間可以有某種內在的病因或發病機制方面的聯繫。例如糖尿病併發的骨質疏鬆，動脈粥樣硬化併發的骨質疏鬆，慢性腎病併發的骨質疏鬆、強直性脊柱炎併發的骨質疏鬆、骨關節炎併發的骨質疏鬆等。

纖溶酶是纖溶酶原啟動系統(PA系統)的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質(ECM)的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖^[12]。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)啟動形成具有活性的金屬蛋白酶(MMPs)。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物^[13-14]。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原啟動劑(tPA)或尿激酶型纖溶酶原啟動劑(uPA)蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水準較高，傳統上認為PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水準實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因數和細胞因數。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶(α2-antiplasmin)。PAs的活性同時被uPA和tPA的纖溶酶原啟動劑抑制劑-1(PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原啟動劑抑制劑-2(PAI-2)調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)^[15-16]。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約為92kDa^[17-18]。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中 纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源^[19-20]。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被稱為谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs啟動。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成^[21]。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原為38kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵^[22]。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用^[18,23-24]。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器^[25]。此外，纖溶酶具有啟動某些潛在形式的生長因數的能力^[26-28]。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成，分子量約為90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中迴圈的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶^域[29-30]，有文獻報導了delta-纖溶酶原的氨基酸序列(序列8)^[31]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[31]，其氨基酸序列如 序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[32]，也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

本領域技術人員可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。

在迴圈過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原啟動劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定 簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原啟動劑的酶，包括：組織纖溶酶原啟動劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原啟動劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。

“纖溶酶原活性片段”是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質，較佳，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原啟動劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原啟動劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的 同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括通過生物工程技術從重組 細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數(%)”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算：分數X/Y乘100

其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中 評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”和“處理”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨 基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複迴圈後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有 助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色氨酸(trp)啟動子系統，beta-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用 於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除主題抗體以外的大分子，等等。

藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低 分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。

本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物，抗心律失常的藥物，治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)，L-谷 氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內，腹膜內，皮下，顱內，鞘內，動脈內(例如經由頸動脈)，肌內來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、 年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如為每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療骨質疏鬆及其相關病症的本發明纖溶酶原或纖溶酶。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述骨質疏鬆及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其 它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

治療效力和治療安全性

本發明的一個實施方案涉及使用纖溶酶原治療受試者後，對治療效力和治療安全性的判斷。常用的骨質疏鬆症治療效果監測與評估內容包括隨訪(不良反應、規範服藥、基礎措施以及骨折風險因數再評估等)，新發骨折評估(臨床骨折、身高降低和影像學檢查)、骨密度(bone mineral density，BMD)測量和骨轉換生化標誌物(bone turnover markers，BTM)檢測，以及基於這些資料的綜合再評估等。其中BMD是目前應用最廣泛的療效監測和評估方法。例如，可以通過雙能X線骨密度儀(dual energy X-ray absorptiometry，DXA)、定量CT(quantitative computed tomography，QCT)、單光子吸收測定法(SPA)、或超聲波測定法來測量BMD。治療開始後可每年檢測1次BMD，在BMD達到穩定後可以適當延長間隔，例如2年監測1次。針對BTM，目前在血清學指標中較多使用的骨形成指標是血清1型原膠原N端前肽(procollagen type 1 n-terminal propeptide，PINP)，骨吸收指標是血清1型原膠原C末端肽(serum C-terminal telopeptide，S-CTX)。可根據研究進展，適時調整更合理的檢測指標。應在開始治療前檢測基線值，應用促形成藥物治療後3個月、應用抑制吸收藥物治療後3~6個月時進行檢測。BTM能夠提供骨骼的動態資訊，在作用和功能上獨立於BMD，同時也與BMD成為互為補充的監測手段，二者結合起來具有更高的臨床價值。一般地，如果治 療後BMD上升或穩定，BTM有預期變化，同時治療期間無骨折發生，可認為治療反應良好。此外，本發明還涉及使用纖溶酶原及其變體對受試者進行治療過程中和治療後，所述該治療方案安全性的判斷，包括但不限於對藥物在受試者體內的血清半衰期、治療半衰期、半數中毒量(TD50)、半數致死量(LD50)進行統計，或對在治療過程中或治療後發生的各種不良事件如致敏反應進行觀察。

圖1 顯示15週齡野生型和纖溶酶原缺陷型小鼠的膝關節Safranin O染色代表性圖片。A為野生型小鼠，B為纖溶酶原缺陷小鼠。與野生型小鼠相比，纖溶酶原缺陷型小鼠展現了廣泛的骨質減少和骨髓細胞增加。

圖2 顯示15週齡纖溶酶原缺陷型以及野生型小鼠血鈣檢測結果。結果顯示，纖溶酶原缺陷型(Ko)小鼠血鈣水準顯著高於野生型小鼠(Wt)，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原在維持正常鈣代謝上發揮著重要作用。

圖3 顯示纖溶酶原缺陷型(Plg^-/-)小鼠給予纖溶酶原30天後膝關節H&E染色觀察結果。A、C為給溶媒PBS對照組，B、D為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組，生長板(箭頭標識)排列紊亂，部分骨髓腔內骨髓消失(三角形標識)；給纖溶酶原組，生長板(箭頭標識)排列整齊。說明纖溶酶原能夠促進Plg^-/-小鼠膝關節生長板的正常生長。

圖4 顯示Plg^-/-小鼠給予纖溶酶原30天後膝關節關節軟骨鹼 性磷酸酶染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組關節軟骨表面只有極少量的鹼性磷酸酶著色，而給纖溶酶原組關節軟骨表面卻有較多的呈深紅色的鹼性磷酸酶著色(箭頭標識)。說明給纖溶酶原組關節軟骨表面的鹼性磷酸酶活性明顯高於PBS對照組，即纖溶酶原促使膝關節關節軟骨的成骨細胞活性明顯增加。

圖5 顯示Plg^-/-小鼠給予纖溶酶原30天後膝關節生長板鹼性磷酸酶染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組在生長板成骨細胞活性處有鹼性磷酸酶著色(箭頭標識)，呈淺紅色；給纖溶酶原組在生長板處有較多鹼性磷酸酶著色，且呈深紅色。說明給纖溶酶原之後，可以促進膝關節生長板的成骨細胞活性的增加。

圖6 顯示0.5μg/kg維生素D衰老模型C57小鼠給予纖溶酶原28天後血清鹼性磷酸酶檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清鹼性磷酸酶活性明顯高於給溶媒PBS對照組小鼠，且統計差異顯著(*表示P<0.05)，並且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組小鼠血清鹼性磷酸酶活性更加接近空白對照組小鼠。這提示，纖溶酶原組能夠顯著促進維生素D衰老模型小鼠成骨細胞活性的增加。

圖7 顯示1μg/kg維生素D衰老模型C57小鼠給予纖溶酶原28天膝關節生長板鹼性磷酸酶染色代表性圖片。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組膝關節生長板鹼性磷酸酶陽性著色(箭頭標識)明顯少於空白對照小鼠；給纖溶酶原組膝關節生長板鹼性磷酸酶陽性著色明顯高於給溶媒PBS對照組小鼠。說明 纖溶酶原能夠改善維生素D誘導的衰老模型小鼠膝關節生長板成骨細胞的活性

圖8 不同週齡段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠頭蓋骨Micro CT骨密度檢測結果。A為皮質骨密度，B為頭蓋骨總骨密度。結果顯示，隨著週齡的增大，Plg^+/+小鼠皮質骨密度和總骨密度有逐漸增加的趨勢，而Plg^-/-小鼠頭蓋骨皮質骨密度和總骨密度逐漸降低。而兩個品系的小鼠骨密度在20-21週齡就有極其顯著差異，在29-30週齡時差異更加顯著。說明纖溶酶原在頭蓋骨骨密度調節中發揮重要作用，與骨質疏鬆密切相關。

圖9 20-21週齡週齡段Plg^/-和Plg^+/+小鼠頭蓋骨Micro CT骨礦物含量檢測結果。結果顯示，20-21週齡Plg^+/+小鼠皮質骨和總骨骨礦物含量明顯高於Plg^/-小鼠，且統計差異顯著。說明纖溶酶原在頭蓋骨礦物含量調節上發揮重要作用，與骨質疏鬆密切相關。

圖10 不同週齡段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠股骨Micro CT骨密度檢測結果。A為皮質骨密度，B為鬆質骨密度，C為小梁骨密度，D為總骨密度。結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+小鼠股骨密度逐漸增加，而Plg^-/-小鼠股骨皮質骨密度、鬆質骨密度、小梁骨密度以及總骨密度逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠股骨密度高於Plg^-/-小鼠，在20週齡時兩個品系小鼠骨密度差異顯著，並且隨著週齡增大，二者差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與股骨密度調節，並在一定時期發揮重要作用。

圖11 不同週齡段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠股骨Micro CT骨礦物含量檢測結果。A為皮質骨礦物含量，B為鬆質骨礦物含量，C為小梁骨礦物含量，D為總骨礦物含量。結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+ 小鼠股骨不同部分礦物含量變化不大或逐步增加，而Plg^-/-小鼠股骨鬆質骨和小梁骨礦物含量逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠股骨礦物含量高於Plg^-/-小鼠，在20週齡時兩個品系小鼠股骨皮質骨、小梁骨和總骨骨礦物含量差異顯著，並且隨著週齡增大，二者骨礦物含量差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與股骨礦物質代謝調節，並在一定時期發揮重要作用。

圖12 不同週齡段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠腰椎骨Micro CT骨密度檢測結果。A為皮質骨密度，B為鬆質骨密度，C為小梁骨密度，D為總骨密度。結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+小鼠腰椎骨骨密度逐漸增大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮質骨密度、鬆質骨密度、小梁骨密度以及總骨密度逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠骨密度高於Plg^-/-小鼠，在12週齡時兩個品系小鼠腰椎骨骨密度差異顯著，並且隨著週齡的增大，二者差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與腰椎骨密度調節，並在一定時期發揮重要作用。

圖13 不同週齡段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠腰椎骨Micro CT骨礦物含量檢測結果。A為皮質骨礦物含量，B為鬆質骨礦物含量，C為小梁骨礦物含量，D為總骨礦物含量。結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+小鼠腰椎骨不同部分礦物含量變化不大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮質骨、鬆質骨、小梁骨以及總骨礦物含量逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠腰椎骨礦物含量高於Plg^-/-小鼠，在20週齡時兩個品系小鼠腰椎骨鬆質骨和皮質骨區域礦物含量差異顯著，並且隨著週齡增大，二者差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與腰椎骨礦物質代謝調節，並在一定時期發揮重要作用。

圖14 不同週齡段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠血清鹼性磷酸酶檢測結果。結果顯示，Plg^+/+小鼠血清鹼性磷酸酶活性在12-30週齡時雖有波動但變 化並不顯著，而Plg^-/-小鼠血清鹼性磷酸酶的活性隨著週齡的增大逐漸的降低；Plg^+/+小鼠血清鹼性磷酸酶的活性明顯高於Plg^-/-小鼠，兩個品系小鼠血清鹼性磷酸酶活性在12週齡時就出現明顯的差異，並且隨著週齡的增大，差異越來越顯著。該結果提示纖溶酶原可能促進成骨細胞的活性，促進骨重建。

圖15 顯示ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後血鈣檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血鈣濃度要明顯的低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠降低ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠血鈣的含量。

圖16 顯示ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後主動脈竇茜素紅染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠主動脈竇鈣沉積明顯少於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能夠改善動脈粥樣硬化中主動脈竇鈣化。

圖17 動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原後股骨密度檢測結果。A為皮質骨密度，B為鬆質骨密度，C為小梁骨密度，D為總骨密度。結果顯示，給藥10天後給纖溶酶原組小鼠股骨密度明顯高於給溶媒PBS對照組，且鬆質骨密度和總骨密度差異顯著(*表示P<0.05)；給藥30天後給纖溶酶原組小鼠鬆質骨密度、小梁骨密度和總骨密度相較於給溶媒PBS對照組顯著升高，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。皮質骨密度兩組無明顯差異。說明纖溶酶原能夠促進動脈粥樣硬化模型小鼠骨密度升高，改善動脈粥樣硬化所致的骨質疏鬆。

圖18 動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原後膝關節H&E 染色代表性圖片。A-C為給溶媒PBS對照組，D-F為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組軟骨表面輕度纖維化(細箭頭標識)，小梁骨(三角標識)明顯變細，粗細不均勻，軟骨組織(星形標識)排列紊亂，生長板(粗箭頭標識)層次紊亂，軟骨細胞輕度減少，潮線基本清晰；給纖溶酶原組關節軟骨表面基本正常，潮線清晰，骨小梁粗細均勻，生長板結構清晰，層次規則而可分。說明纖溶酶原能夠改善ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠膝關節的狀況。

圖19 給予纖溶酶原對C57卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠體重影響。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠體重明顯輕於正常對照組，而給纖溶酶原組體重明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(P<0.05)。說明纖溶酶原能夠顯著促進卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠體重恢復。

圖20 給予纖溶酶原後C57卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠股骨Micro CT掃描測定結果。A為骨體積測量結果，B為骨礦物含量測量結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠股骨的鬆質骨、小梁骨以及總骨體積和骨礦物含量均大於給溶媒PBS對照組，且均統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠促進骨質疏鬆模型小鼠股骨礦物質的沉積、骨體積增加，改善骨質疏鬆。

圖21 給予纖溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠股骨Micro CT掃描測定結果。

圖21的A部分為股骨骨密度測量結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠股骨皮質骨、鬆質骨、小梁骨和總骨骨密度均小於正常對照組； 而給纖溶酶原組小鼠各部分骨密度大於給溶媒PBS對照組。趨勢明確，但由於小鼠數量少，造成統計差異只是接近顯著。可預期增加小鼠數量會出現統計學差異。

圖21的B部分為股骨骨礦物含量測量結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠股骨各部分骨礦物含量均小於正常對照組；而給纖溶酶原組小鼠各部分骨礦物含量均大於給溶媒PBS對照組。趨勢明確，但由於小鼠數量少，造成統計差異只是接近顯著。可預期增加小鼠數量會出現統計學差異。

圖21的C部分為小梁骨體積測量結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠股骨的小梁骨體積小於正常對照組；而給纖溶酶原組小鼠股骨小梁骨體積大於給溶媒PBS對照組。趨勢明確，但由於小鼠數量少，造成統計差異只是接近顯著。可預期增加小鼠數量會出現統計學差異。

綜上所述，纖溶酶原能夠明顯改善骨質疏鬆，促進股骨各部分骨密度和骨量的增加，並且對小梁骨改善作用尤為明顯。

圖22 給予纖溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠膝關節H&E染色和Safrain O染色代表性圖片。A、C為給溶媒PBS組，B、D為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS組骨小梁(箭頭標識)明顯變細，斷裂，出現較大面積的無骨小梁骨髓腔，髓腔增大，骨小梁的連接中斷，生長板下骨細胞輕度減少(三角形標識)；給纖溶酶原組骨小梁部分變細，較之於PBS組，骨小梁連續性較好，較粗，沒有較大面積的無骨小梁區域，軟骨組織層次結構也較規則。說明給予纖溶酶原能明顯改善骨質疏鬆模型小鼠膝關節的狀況。

圖23 給予纖溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠膝關節鹼性磷酸酶染色代表性圖片。A、C為給溶媒PBS對照組，B、D為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠膝關節軟骨組織(細箭頭標識)和生長板(粗箭頭標識)鹼性磷酸酶著色明顯少於給纖溶酶原組。說明纖溶酶原促進骨質疏鬆模型小鼠膝關節成骨細胞活性增加。

圖24 給予纖溶酶原後Plg^+/+卵巢切除誘導的骨質疏鬆模型小鼠血清鈣檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清鈣濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠顯著的降低卵巢切除骨質疏鬆模型小鼠血鈣的濃度。

圖25 給予纖溶酶原後Plg^+/+卵巢切除誘導的骨質疏鬆模型小鼠血清磷檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清磷濃度明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠顯著的升高卵巢切除骨質疏鬆模型小鼠血磷的濃度。

圖26 給予纖溶酶原3%膽固醇高脂血症模型小鼠膝關節鹼性磷酸酶染色結果。A、C為給溶媒PBS對照組，B、D為給纖溶酶原組，E為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠膝關節鹼性磷酸酶著色(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原顯著增加3%膽固醇高脂血症模型小鼠膝關節成骨細胞活性。

圖27 給予纖溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠膝關節H&E染色和Safrain O染色代表性圖片。A、C為給溶媒PBS組，B、D為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠膝關節 骨小梁(箭頭標識)明顯變細，斷裂，出現較大面積的無骨小梁骨髓腔，骨小梁的連接中斷，關節表面部分纖維化，生長板下成骨區成骨組織明顯減少(三角形標識)；給纖溶酶原組骨小梁部分變細，較之於PBS對照組，骨小梁連續性較好，沒有較嚴重的斷裂，沒有較大面積的無骨小梁區域，軟骨組織層次結構也較規則，潮線清晰。說明給予纖溶酶原能明顯改善骨質疏鬆模型小鼠膝關節的狀況。

實施例

材料與方法：

動物：C57小鼠和Plg^+/+以及Plg^-/-小鼠(Jackson Lab)用於相關實驗。動物飼養於符合國標的實驗動物使用環境。

試劑：維生素D(Sigma Aldrich，貨號D1530)，玉米油(Sigma Aldrich，貨號C8267，)，低鈣特殊飼料(0.2%鈣，1%磷酸鹽，2000U維生素D3/kg，南通特洛菲飼料科技有限公司，15kg)，鈣含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C004-2)，人纖溶酶原(10mg/ml，純化自健康血漿捐獻者)。

Aloka Micro CT專用於小鼠、大鼠形態觀察，採用最新的第三代X射線測量，短時間內即可獲得高品質斷層掃描圖像。可用於骨測量(骨密度、骨礦物質含量、骨體積、骨微結構等)、體脂肪率測量、內臟、皮下脂肪的辨別及測量、同步攝影等。骨測量以小鼠股骨、頭蓋骨或腰椎骨為檢測對象。小鼠犧牲後取材股骨、頭蓋骨和腰椎骨於4%多聚甲醛固定，採 用Micro CT(Aloka，日本HITACHI公司生產)，對骨進行測定。

實施例1 纖溶酶原缺乏與骨質疏鬆密切相關

15週齡野生型和纖溶酶原缺陷型(Plg^-/-)小鼠各5隻。取膝關節於4%多聚甲醛固定24小時，然後10%EDTA中脫鈣三周，梯度蔗糖溶液洗滌，以上操作需在4℃條件下進行。然後石蠟包埋，8μm切片行Safranin O染色。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，與野生型小鼠(圖1A)相比，Plg^-/-小鼠(圖1B)展現了廣泛的骨質減少和骨髓細胞增加。

實施例2 野生小鼠和纖溶酶原缺陷型小鼠的鈣流失對比

15週齡野生型(wt)和纖溶酶原缺陷型(ko)小鼠各5隻。兩組小鼠摘除眼球取血，檢測血鈣濃度。在正常情況下，體內鈣平衡受到非常精密的調節。然而，在骨質疏鬆的情況下，鈣流失是骨質疏鬆的一個關鍵標誌。我們研究在野生型和Plg^-/-小鼠中鈣的水準發現，Plg^-/-(Ko)小鼠在15週齡時血鈣水準顯著高於野生型小鼠，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖2)。

實施例3 纖溶酶原對Plg ^-/- 小鼠膝組織結構的保護作用

20週齡的Plg^-/-小鼠8隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各4隻。實驗第1天稱重分組並開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射給予相同體積的PBS。連續給藥30天，第31天犧牲小鼠，取膝關節於固定液中4℃固定24小時。固定液配方：2%多聚甲醛，0.075mol/L賴氨酸，0.01mol/L過碘酸鈉。固定後4℃ PBS洗液梯度洗滌各12小時，然 後置於4℃脫鈣液中脫鈣2周，每5天換一次脫鈣液。脫鈣完成後4℃ PBS洗液梯度洗滌12小時，膝關節經酒精梯度脫水、二甲苯透明浸蠟後進行石蠟包埋。切片厚度5um，切片脫蠟複水，並用蘇木素和伊紅染色(H&E染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖3A、C)，生長板(箭頭標識)排列紊亂，部分骨髓腔內骨髓消失(三角形標識)；給纖溶酶原組(圖3B、D)，生長板排列整齊。說明纖溶酶原能促進Plg^-/-小鼠膝關節生長板的生長。

實施例4 纖溶酶原促進Plg ^-/- 小鼠膝關節關節軟骨表面成骨細胞活性的增加

20週齡的Plg^-/-小鼠8隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各4隻。實驗第1天稱重分組並開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。連續給藥30天，第31犧牲小鼠，取股骨與固定液中4℃固定24小時。固定液配方：2%多聚甲醛，0.075mol/L賴氨酸，0.01mol/L過碘酸鈉。固定後4℃ PBS洗液梯度洗滌各12小時，然後置於4℃脫鈣液中脫鈣2周，每5天換一次脫鈣液。脫鈣完成後4℃ PBS洗液梯度洗滌12小時，膝關節經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片5um，脫蠟複水，氯化鎂緩衝液4℃孵育過夜。鹼性磷酸酶底物溶液室溫孵育1小時，蘇木素複染2分鐘。流水沖洗5分鐘，60℃烤30分鐘，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是成骨細胞早期分化的標誌^[33]。結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖4A)關節軟骨表面只有極少量的鹼性磷酸酶著色(箭頭標識)，而給纖溶酶原組(圖4B)關節軟骨表面卻有較多的呈深紅色的鹼性磷酸酶著色。說明給纖溶酶原組關節軟骨表面的鹼性磷酸酶活性明顯高於對照組，即纖溶酶原促使膝關節關節軟骨的成骨細胞活性明顯增加。

實施例5 纖溶酶原促進Plg ^-/- 小鼠膝關節生長板成骨細胞活性的增加

20週齡的Plg^-/-小鼠8隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各4隻。實驗第1天稱重分組並開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。連續給藥30天，第31犧牲小鼠，取股骨與固定液中4℃固定24小時。固定液配方：2%多聚甲醛，0.075mol/L賴氨酸，0.01mol/L過碘酸鈉。固定後4℃ PBS洗液梯度洗滌各12小時，然後置於4℃脫鈣液中脫鈣2周，每5天換一次脫鈣液。脫鈣完成後4℃ PBS洗液梯度洗滌12小時，股骨經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片5um，脫蠟複水，氯化鎂緩衝液4℃孵育過夜。鹼性磷酸酶底物溶液室溫孵育1小時，蘇木素複染2分鐘。流水沖洗5分鐘，60℃烤30分鐘，中性樹膠封片，在顯微鏡下200倍下觀察拍照。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖5A)在生長板成骨細胞活性處有鹼性磷酸酶著色(箭頭標識)，呈淺紅色；給纖溶酶原組(圖5B)在生長板處有較多鹼性磷酸酶著色，呈深紅色。說明給纖溶酶原之後，可以 促進膝關節生長板的成骨細胞活性的增加。說明給纖溶酶原之後，可以促進膝關節生長板的成骨細胞活性的增加。

實施例6 纖溶酶原改善維生素D誘導的衰老模型小鼠血清鹼性磷酸酶活性

取5-6週齡的雄性C57小鼠25隻，稱重後隨機分為3組，空白對照組5隻，給纖溶酶原組10隻和給溶媒PBS對照組10隻。空白對照組小鼠每天腹腔注射50μl玉米油；給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組小鼠按照0.5μg/kg/天腹腔注射維生素D(Sigma Aldrich)，誘導衰老^[34,35]。與此同時小鼠開始給藥，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，空白對照組小鼠不做給藥處理，連續造模給藥28天。給藥期間空白對照組小鼠飼餵低鈣飼料，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組小鼠飼餵低鈣飼料。開始造模給藥定為第1天，第29天摘除眼球取血，離心獲得上清，用以檢測血清鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清鹼性磷酸酶活性明顯高於給溶媒PBS對照組小鼠，且統計差異顯著，並且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組小鼠血清鹼性磷酸酶活性更加接近空白對照組小鼠(圖6)。

血清ALP是一種同工酶糖蛋白，血清ALP主要來源於肝臟和骨骼，其中來源於骨骼的ALP占40%~75%。ALP活性測定主要用於診斷肝膽和骨骼系統疾病。臨床上除肝臟疾患、妊娠等因素外，血清ALP還可反映成骨情況。骨代謝旺盛時成骨細胞活躍，ALP分泌量增加，存在於成骨細胞周圍及其表面，極易釋放入血中，使血清ALP活性上升，因此，血清ALP 是骨重建活躍性改變的標誌之一^〔36〕。

本研究中，給纖溶酶原組小鼠血清鹼性磷酸酶活性明顯高於給溶媒PBS對照組小鼠，且統計差異顯著。這提示，纖溶酶原組能夠顯著促進維生素D衰老模型小鼠成骨細胞活性的增加。

實施例7 纖溶酶原促進維生素D誘導的衰老模型小鼠膝關節生長板鹼性磷酸酶活性增加

取5-6週齡的雄性C57小鼠15隻，稱重後隨機分為3組，空白對照組、給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各5隻。空白對照組小鼠每天腹腔注射50μl玉米油；給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組小鼠按照1μg/kg/天腹腔注射維生素D(Sigma Aldrich)，誘導衰老^[34,35]。與此同時小鼠開始給藥，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，空白對照組小鼠不做給藥處理，連續造模給藥28天。給藥期間所有小鼠飼餵低鈣飼料(南通特諾菲)。開始造模給藥定為第1天，第29天犧牲小鼠取材膝關節於固定液中固定24小時。固定液配方：2%多聚甲醛，0.075mol/L賴氨酸，0.01mol/L過碘酸鈉。固定後4℃ PBS洗液梯度洗滌各12小時，然後置於4℃脫鈣液中脫鈣2周，每5天換一次脫鈣液。脫鈣完成後4℃ PBS洗液梯度洗滌12小時，膝關節經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片5um，脫蠟複水，氯化鎂緩衝液4℃孵育過夜。鹼性磷酸酶底物溶液室溫孵育1小時，蘇木素複染2分鐘。流水沖洗5分鐘，60℃烤30分鐘，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖7B)膝關節生長板鹼性磷酸 酶陽性著色(箭頭標識)明顯少於空白對照小鼠(圖7A)；給纖溶酶原組(圖7C)膝關節生長板鹼性磷酸酶陽性著色明顯高於給溶媒PBS對照組小鼠。說明纖溶酶原能夠改善維生素D誘導的衰老模型小鼠膝關節生長板成骨細胞的活性。

實施例8 纖溶酶原對頭蓋骨密度的影響

取12-13、20-21、29-30週齡的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5隻，各組小鼠體重基本相同。小鼠在實驗過程中都飼以同樣的食物和水。取頭蓋骨於4%多聚甲醛固定24小時，進行Micro CT掃描，測定骨密度。

結果顯示，隨著週齡的增大，而Plg^+/+小鼠皮質骨密度(圖8A)和總骨密度(圖8B)有逐漸增加的趨勢，而Plg^-/-小鼠頭蓋骨皮質骨密度和總骨密度逐漸降低。兩個品系的小鼠骨密度在20-21週齡有極其顯著差異，在29-30週齡時差異更加顯著。說明纖溶酶原參與骨礦物質代謝調節，並在一定時期發揮重要作用。

骨質疏鬆是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特徵，致使骨脆性增加、易於骨折的一種全身性骨骼疾病。WHO建議採用骨密度(bone mineral density，BMD)測量結果診斷骨質疏鬆症^[37,38]。上述實驗結果說明，說明纖溶酶原參與骨礦物質代謝調節，並在一定時期發揮重要作用。

實施例9 纖溶酶原對頭蓋骨礦物含量的影響

取20-21週齡的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5隻，小鼠體重基本相同。小鼠在實驗過程中都飼以同樣的食物和水。取頭蓋骨於4%多聚甲醛固定24小時，進行Micro CT掃描，測定骨礦物含量。

結果顯示，結果顯示，20-21週齡Plg^+/+小鼠皮質骨和總骨 骨礦物含量明顯高於Plg^/-小鼠，且統計差異極其顯著或顯著。說明纖溶酶原在頭蓋骨礦物含量調節上發揮重要作用，與骨質疏鬆密切相關。

實施例10 纖溶酶原缺乏小鼠股骨密度降低

取12-13、20-21、29-30週齡的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5隻，各組小鼠體重基本相同。小鼠在實驗過程中都飼以同樣的食物和水。取股骨於4%多聚甲醛固定24小時，進行Micro CT掃描，測定骨密度。

結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+小鼠股骨密度逐漸增加，而Plg^-/-小鼠股骨皮質骨密度(10A)、鬆質骨密度(圖10B)、小梁骨密度(圖10C)以及總骨密度(圖10D)逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠股骨密度高於Plg^-/-小鼠，在20週齡時兩個品系小鼠骨密度差異顯著，並且隨著週齡增大，二者差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與股骨礦物質代謝調節，並在一定時期發揮重要作用。

實施例11 纖溶酶原缺乏小鼠股骨礦物含量減少

取12-13、20-21、29-30週齡的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5隻，各組小鼠體重基本相同。小鼠在實驗過程中都飼以同樣的食物和水。取股骨於4%多聚甲醛固定24小時，進行Micro CT掃描，測定骨礦物含量。

結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+小鼠股骨不同部分礦物含量變化不大或逐步增加，而Plg^-/-小鼠股骨鬆質骨(11B)和小梁骨礦物含量逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠股骨礦物含量高於Plg^-/-小鼠，在20週齡時兩個品系小鼠股骨皮質骨(11A)、小梁骨(11C)和總骨(11D)骨礦物含量差異顯著，並且隨著週齡增大，二者骨礦物含量差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與股骨礦物質代謝調節，並在一定時期發揮重要作用。

實施例12 纖溶酶原缺乏小鼠腰椎骨密度降低

取12-13、20-21、29-30週齡的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5隻，各組小鼠體重基本相同。小鼠在實驗過程中都飼以同樣的食物和水。取腰椎骨骨於4%多聚甲醛固定24小時，進行Micro CT掃描，測定骨密度。

結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+小鼠腰椎骨骨密度逐漸增大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮質骨密度(12A)、鬆質骨密度(圖12B)、小梁骨密度(圖12C)以及總骨密度(圖12D)逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠骨密度高於Plg^-/-小鼠，在12週齡時兩個品系小鼠腰椎骨骨密度差異顯著，並且隨著週齡的增大，二者差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與腰椎骨骨密度調節，並在一定時期發揮重要作用。

實施例13 纖溶酶原缺乏小鼠腰椎骨礦物含量減少

取12-13、20-21、29-30週齡的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5隻，各組小鼠體重基本相同。小鼠在實驗過程中都飼以同樣的食物和水。取腰椎骨於4%多聚甲醛固定24小時，進行Micro CT掃描，測定骨礦物含量。

結果顯示，在12-30週齡期間隨著週齡增大Plg^+/+小鼠腰椎骨礦物含量變化不大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮質骨礦物含量(13A)、鬆質骨礦物含量(圖13B)、小梁骨礦物含量(圖13C)以及總骨礦物含量(圖13D)逐漸減小。在此期間，Plg^+/+小鼠骨礦物含量高於Plg^-/-小鼠，在20週齡時兩個品系小鼠腰椎骨鬆質骨和皮質骨區域礦物含量差異顯著，並且隨著週齡增大，二者差異越來越顯著。說明纖溶酶原參與腰椎骨骨礦物質代謝調節，並在一定時期發揮重要作用。

實施例14 纖溶酶原缺乏對小鼠血清鹼性磷酸酶活性的影 響

取12-13、20-21、29-30週齡的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5隻，各組小鼠體重基本相同。小鼠在實驗過程中都飼以同樣的食物和水。所有小鼠摘除眼球取血，離心取上清。用鹼性磷酸酶檢測試劑盒檢測血清中鹼性磷酸酶活性。

結果顯示，Plg^+/+小鼠血清鹼性磷酸酶活性在12-30週齡時雖有波動但變化並不顯著，而Plg^-/-小鼠血清鹼性磷酸酶的活性隨著週齡的增大逐漸的降低；Plg^+/+小鼠血清鹼性磷酸酶的活性明顯高於Plg^-/-小鼠，兩個品系小鼠血清鹼性磷酸酶活性在12週齡時就出現明顯的差異，並且隨著週齡的增大，差異越來越顯著(圖14)。該結果提示纖溶酶原可能促進成骨細胞的活性，促進骨重建。

實施例15 纖溶酶原降低動脈粥樣硬化ApoE小鼠血鈣濃度

6週齡ApoE雄性小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料16周，誘導動脈粥樣硬化^[39,40]。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇濃度，並據其將小鼠隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻以及給纖溶酶原組6隻。開始給藥定為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥期間小鼠繼續飼餵高脂飼料。在第30天小鼠禁食16小時，第31天摘除眼球取血，離心獲得上清，用以檢測血清鈣的濃度。血鈣檢測採用鈣檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C004-2)並按照說明書方法進行檢測。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血鈣濃度要明顯的低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(圖15)。說明纖溶酶原能夠降低ApoE動脈粥 樣硬化模型小鼠血鈣的含量。

實施例16 纖溶酶原改善動脈粥樣硬化ApoE小鼠主動脈竇鈣化

6週齡ApoE雄性小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周，誘導動脈粥樣硬化^[39,40]。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇濃度，並據其將小鼠隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻以及給纖溶酶原組6隻。開始給藥定為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥期間小鼠繼續飼餵高脂飼料。於給藥的第31天犧牲小鼠，取材心臟於4%多聚甲醛固定24-48小時，15%、30%蔗糖脫水沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，茜素紅S染色3分鐘。切片在40倍光學顯微鏡下觀察。

茜素紅染色能夠顯示鈣化的程度。結果顯示，給纖溶酶原組(圖16B)小鼠主動脈竇鈣沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖16A)。說明纖溶酶原能夠改善動脈粥樣硬化中主動脈竇鈣沉積。

實施例17 纖溶酶原對AopE動脈粥樣硬化模型小鼠股骨骨密度的影響

6週齡AopE雄性小鼠19隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周，誘導動脈粥樣硬化^[39,40]。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇濃度，並據其將小鼠隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組9隻以及給纖溶酶原組10隻。開始給藥定為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥期間小鼠繼續飼餵高脂飼料。於給藥的第11天每組各取5 隻小鼠，犧牲後取材股骨於4%多聚甲醛固定。給藥的31天犧牲剩餘小鼠，取材股骨於4%多聚甲醛固定。取材的股骨進行Micro CT掃描，測定骨密度。

動脈粥樣硬化與骨質疏鬆相關性早已有報導，高血脂是動脈粥樣硬化的重要致病因素。近來研究表明，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)不僅影響脂代謝，而且與骨密度、骨丟失以及骨質疏鬆性骨折有關^[41,42]。

結果顯示，給藥10天後給纖溶酶原組小鼠股骨密度明顯高於給溶媒PBS對照組，且鬆質骨密度(圖17B)和總骨密度(圖17D)差異顯著(*表示P<0.05)；給藥30天後給纖溶酶原組小鼠鬆質骨密度、小梁骨密度(圖17C)和總骨密度相較於給溶媒PBS對照組顯著升高，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。皮質骨密度(圖17A)兩組無明顯差異。說明纖溶酶原能夠促進動脈粥樣硬化模型小鼠骨密度升高，改善動脈粥樣硬化伴隨的骨質疏鬆。

已有研究表明，血管鈣化的本質是血管平滑肌細胞向成骨細胞表型的轉化以及血管組織向骨組織的轉化。而血管鈣化的形成也和骨礦物質丟失具有顯著的相關性^[10]。綜合上述實施例16和17的實驗結果可以看出，纖溶酶原能夠在降低動脈壁鈣沉積的同時增強骨密度。對骨質疏鬆症及心血管疾病的防治具有重要意義。

實施例18 纖溶酶原對AopE動脈粥樣硬化模型小鼠膝關節組織結構的保護作用

6週齡AopE雄性小鼠7隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周，誘導動脈粥樣硬化^[39,40]。在給藥前三天每隻小鼠取血 50μL，檢測總膽固醇濃度，並據其將小鼠隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組3隻以及給纖溶酶原組4隻。開始給藥定為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥期間小鼠繼續飼餵高脂飼料。於給藥的31天犧牲小鼠，取材股骨於4%多聚甲醛固定。然後用酸性脫鈣液(用超純水配製體積分數為8%鹽酸和10%甲酸的脫鈣液)脫鈣3.5小時。然後石蠟包埋，8μm切片行H&E染色，切片在100倍(A、D)、200倍(B、C、E、F)光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖18A-C)軟骨表面輕度纖維化(細箭頭標識)，骨小梁(三角標識)明顯變細，粗細不均勻，軟骨組織(星形標識)排列紊亂，生長板(粗箭頭標識)層次紊亂，軟骨細胞輕度減少，潮線基本清晰；給纖溶酶原組(圖18D-F)關節軟骨表面基本正常，潮線清晰，骨小梁粗細均勻，生長板結構清晰，層次規則而可分。說明纖溶酶原能夠改善ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠膝關節的狀況。

實施例19 纖溶酶原對卵巢切除-地塞米松骨質疏鬆模型小鼠體重的影響

8-10週齡C57雌性小鼠17隻稱量體重，小鼠根據體重隨機分為兩組，正常對照組3隻和模型組14隻。模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢。正常對照小鼠僅在相同位置切開，不做卵巢切除。卵巢切除14天後，模型組小鼠根據 體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。模型組小鼠按照125μg/隻腹腔注射地塞米松，5天/周注射頻率，共注射12天誘導骨質疏鬆^[43]，正常對照組小鼠不做注射處理。注射地塞米松的同時小鼠開始給藥，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥16天，正常對照組小鼠不注射纖溶酶原或PBS。開始給藥定為第1天，第17天測量小鼠體重。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠體重明顯輕於正常對照組，而給纖溶酶原組體重明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(P<0.05)(圖19)。說明纖溶酶原能夠顯著促進卵巢切除及注射地塞米松誘導骨質疏鬆模型小鼠體重恢復。

實施例20 纖溶酶原對卵巢切除-地塞米松骨質疏鬆模型小鼠股骨的影響

8-10週齡C57雌性小鼠14隻稱量體重。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢。卵巢切除14天後，小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。兩組小鼠按照125μg/隻腹腔注射地塞米松，5天/周注射頻率，共注射12天誘導骨質疏鬆^[43]。造模同時小鼠開始給藥，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥16天。開始給藥定為第1天， 第17天犧牲取材股骨於4%多聚甲醛固定液中固定。進行Micro CT掃描，測定股骨各項指標。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠股骨的鬆質骨、小梁骨以及總骨體積(圖20A)和骨礦物含量(圖20B)均大於給溶媒PBS對照組，且均統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠促進骨質疏鬆模型小鼠股骨的鬆質骨、小梁骨和總骨體積的增加及礦物質的沉積，改善骨質疏鬆。

實施例21 纖溶酶原改善卵巢切除-地塞米松骨質疏鬆模型小鼠股骨結構

8-10週齡C57雌性小鼠17隻稱量體重，小鼠根據體重隨機分為兩組，正常對照組3隻和模型組14隻。模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢。正常對照小鼠僅在相同位置切開，不做卵巢切除。卵巢切除14天後，模型組小鼠按照125μg/隻腹腔注射地塞米松，5天/周注射頻率，共注射12天誘導骨質疏鬆^[43]，正常對照組小鼠不做注射處理。地塞米松注射完成後，模型組小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。模型建立後(地塞米松注射完成第二天)，小鼠開始給藥。給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥16天，正常對照組小鼠不注射纖溶酶原或PBS。開始給藥定為第1天，第17天犧牲取材股骨於4%多聚甲醛固定液中固定。取材 的股骨進行Micro CT掃描，測定股骨密度。

骨密度

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠股骨皮質骨、鬆質骨、小梁骨和總骨骨密度均小於正常對照組；而給纖溶酶原組小鼠各部分骨密度大於給溶媒PBS對照組。趨勢明確，但由於小鼠數量少，造成統計差異只是接近顯著。可預期增加小鼠數量會出現統計學差異(圖21的A部分)。

骨礦物含量

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠股骨各部分骨礦物含量均小於正常對照組；而給纖溶酶原組小鼠各部分骨礦物含量均大於給溶媒PBS對照組。趨勢明確，但由於小鼠數量少，造成統計差異只是接近顯著。可預期增加小鼠數量會出現統計學差異(圖21的B部分)。

骨體積

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠股骨的小梁骨體積小於正常對照組；而給纖溶酶原組小鼠股骨小梁骨體積大於給溶媒PBS對照組。趨勢明確，但由於小鼠數量少，造成統計差異只是接近顯著。可預期增加小鼠數量會出現統計學差異(圖21的C部分)。

綜上所述，纖溶酶原能夠明顯改善骨質疏鬆，促進股骨各部分骨密度和骨量的增加，並且對小梁骨改善作用尤為明顯。

實施例22 纖溶酶原改善卵巢切除-地塞米松骨質疏鬆模型小鼠膝關節組織結構的狀況

8-10週齡C57雌性小鼠14隻稱量體重。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒 精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢。卵巢切除14天後，小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。兩組小鼠按照125μg/隻腹腔注射地塞米松，5天/周注射頻率，共注射12天誘導骨質疏鬆^[43]。造模同時小鼠開始給藥，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥16天。開始給藥定為第1天，第17天犧牲取材膝關節於4%多聚甲醛固定液中固定。然後用酸性脫鈣液(用超純水配製體積分數為8%鹽酸和10%甲酸的脫鈣液)脫鈣3.5小時。然後石蠟包埋，3μm切片行H&E(A、B)和Safrain O染色(C、D)，切片在100倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS組(圖22A、C)小鼠膝關節骨小梁(箭頭標識)明顯變細，斷裂，出現較大面積的無骨小梁骨髓腔，髓腔增大，骨小梁的連接中斷，生長板下骨細胞輕度減少(三角形標識)；給纖溶酶原組(圖22B、D)骨小梁部分變細，較之於PBS組，骨小梁連續性較好，較粗，沒有較大面積的無骨小梁區域，軟骨組織層次結構也較規則。說明纖溶酶原能明顯改善骨質疏鬆模型小鼠膝關節組織結構的狀況。

實施例23 纖溶酶原增加卵巢切除-地塞米松骨質疏鬆模型小鼠膝關節成骨細胞活性

8-10週齡C57雌性小鼠14隻稱量體重。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒 精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢。卵巢切除14天後，小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。兩組小鼠按照125μg/隻腹腔注射地塞米松，5天/周注射頻率，共注射12天誘導骨質疏鬆^[43]。造模同時小鼠開始給藥，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥16天。開始給藥定為第1天，第17天犧牲小鼠取材膝關節於固定液中固定。固定液配方：2%多聚甲醛，0.075mol/L賴氨酸，0.01mol/L過碘酸鈉。固定後4℃ PBS洗液梯度洗滌各12小時，然後置於4℃脫鈣液中脫鈣2周，每5天換一次脫鈣液。脫鈣完成後4℃ PBS洗液梯度洗滌12小時，膝關節經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片3um，脫蠟複水，氯化鎂緩衝液4℃孵育過夜。鹼性磷酸酶底物溶液室溫孵育1小時，蘇木素複染2分鐘。流水沖洗5分鐘，60℃烤30分鐘，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖23A、C)膝關節軟骨組織(細箭頭標識)和生長板(粗箭頭標識)鹼性磷酸酶著色明顯少於給纖溶酶原組(圖23B、D)。說明纖溶酶原促進骨質疏鬆模型小鼠膝關節成骨細胞活性增加。

實施例24 纖溶酶原降低卵巢切除骨質疏鬆模型小鼠血鈣濃度

8-10週齡Plg^+/+雌性小鼠11隻。小鼠按照50mg/kg體重腹腔注 射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢^〔44,45〕。卵巢切除65天後，小鼠稱重，並根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組6隻和給溶媒PBS對照組5隻，並開始給藥。給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥11天。開始給藥定為第1天，第12天摘除眼球取血，離心取上清，檢測血鈣濃度。血鈣檢測採用鈣檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C004-2)並按照說明書方法進行檢測。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清鈣濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖24)。說明纖溶酶原能夠明顯地降低卵巢切除骨質疏鬆模型小鼠血鈣的濃度。

實施例25 纖溶酶原升高卵巢切除骨質疏鬆模型小鼠血磷濃度

8-10週齡Plg^+/+雌性小鼠11隻。小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢^〔44,45〕。卵巢切除65天後，小鼠稱重，並根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組6隻和給溶媒PBS對照組5隻，並開始給藥。給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶 原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥11天。開始給藥定為第1天，第12天摘除眼球取血，離心取上清，檢測血磷濃度。血磷檢測採用磷檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C006-3)並按照說明書方法進行檢測。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清磷濃度明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖25)。說明纖溶酶原能夠明顯的升高卵巢切除骨質疏鬆模型小鼠血磷的濃度。

實施例26 纖溶酶原增加3%膽固醇高脂血症模型小鼠膝關節成骨細胞活性

9週齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症^[46,47]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，並根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥20天。在第20天小鼠禁食16小時，第21天犧牲小鼠取材膝關節於固定液中固定。固定液配方：2%多聚甲醛，0.075mol/L賴氨酸，0.01mol/L過碘酸鈉。固定後4℃ PBS洗液梯度洗滌各12小時，然後置於4℃脫鈣液中脫鈣2周，每5天換一次脫鈣液。脫鈣完成後4℃ PBS洗液梯度洗滌12小時，膝關節經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片3um，脫蠟複水，氯化鎂緩衝液4℃孵育過夜。鹼性磷酸酶底物溶液室溫孵育1小時，蘇木素複染2分鐘。流水沖洗5分鐘，60℃烤30分鐘，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

高脂血症是一種脂代謝紊亂，並能引起一系列併發症的疾病。近年來多項研究發現高脂血脂是骨質疏鬆和動脈粥樣硬化的共同病因^[48,49]。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖26B、D)小鼠膝關節鹼性磷酸酶著色(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖26A、C)，且統計差異顯著(圖26E)。說明纖溶酶原增加3%膽固醇高脂血症模型小鼠膝關節成骨細胞活性。

實施例27 纖溶酶原改善卵巢切除-地塞米松骨質疏鬆模型小鼠膝關節組織結構狀況

8-10週齡C57雌性小鼠14隻稱量體重。小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，小鼠脫去背部兩側毛髮以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結紮，然後摘除卵巢。切口縫合後，外部敷以消炎粉。同法摘除另一側卵巢。卵巢切除14天後，模型組小鼠按照125μg/隻腹腔注射地塞米松，5天/周注射頻率，共注射12天誘導骨質疏鬆^[43]。地塞米松注射完成後，小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。模型建立後(地塞米松注射完成第二天)，小鼠開始給藥。給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥16天。開始給藥定為第1天，第17天犧牲取材膝關節於4%多聚甲醛固定液中固定。然後用酸性脫鈣液(用超純水配製體積分數為8%鹽酸和10%甲酸的脫鈣液)脫鈣3.5小時。然後石蠟包埋，3μm切片行H&E (A、B)和Safrain O染色(C、D)，切片在100倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖27A、C)小鼠骨小梁(箭頭標識)明顯變細，斷裂，出現較大面積的無骨小梁骨髓腔，骨小梁的連接中斷，關節表面部分纖維化，生長板下成骨區成骨組織明顯減少(三角形標識)；給纖溶酶原組(圖27B、D)骨小梁部分變細，較之於PBS對照組，骨小梁連續性較好，沒有較嚴重的斷裂，沒有較大面積的無骨小梁區域，軟骨組織層次結構也較規則，潮線清晰。說明給予纖溶酶原能明顯改善骨質疏鬆模型小鼠膝關節的組織結構狀況。

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<110> 深圳瑞健生命科學研究院有限公司

<120> 纖溶酶原在製備預防和治療骨質疏鬆及其相關病症的藥物中的用途和包含纖溶酶原用於預防或治 療骨質疏鬆的藥劑

<130> PDK03572

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的核酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)核酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)核酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的核酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的胺基酸序列

<400> 14

Claims (10)

1. 一種纖溶酶原在製備預防和治療骨質疏鬆及其相關病症的藥物中的用途。
2. 如請求項1所述之用途，其中該骨質疏鬆包括原發性骨質疏鬆和繼發性骨質疏鬆。
3. 如請求項1所述之用途，其中該原發性骨質疏鬆包括絕經後骨質疏鬆和老年性骨質疏鬆。
4. 如請求項1或2所述之用途，其中該繼發性骨質疏鬆包括繼發於內分泌疾病、風濕性疾病、胃腸道疾病，以及藥物治療引起的骨質疏鬆。
5. 如請求項4所述之用途，其中該繼發性骨質疏鬆包括糖皮質激素、原發性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、原發性膽汁性肝硬化、性腺功能減低、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、骨關節炎、性腺激素治療、抗癲癇藥治療、化療藥物治療引起的骨質疏鬆。
6. 一種纖溶酶原在製備預防和治療疾病併發的骨質疏鬆的藥物中的用途，其中該疾病併發的骨質疏鬆包括糖皮質激素、原發性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、原發性膽汁性肝硬化、性腺功能減低、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、骨關節炎、性腺激素治療、抗癲癇藥治療、化療藥物治療併發的骨質疏鬆。
7. 一種纖溶酶原在製備預防受試者骨質疏鬆骨折的藥物中的用途，該受試者包括給藥易患骨質疏鬆的受試者、處於患骨質疏鬆高風險的 受試者或診斷患有骨質疏鬆的受試者有效量的纖溶酶原預防骨折的發生。
8. 如請求項7所述之用途，其中該受試者包括患有糖皮質激素、原發性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、原發性膽汁性肝硬化、性腺功能減低、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎或骨關節炎的受試者。
9. 如請求項7所述之用途，其中該受試者包括正接受性腺激素治療、抗癲癇藥治療或化療藥物治療的受試者。
10. 一種用途預防或治療骨質疏鬆的包含纖溶酶原的藥劑。