TW201819639A - 結腸直腸癌的糞便細菌標誌物 - Google Patents

Abstract

本發明提供了通過檢測某些細菌物種的富集或減少來診斷受試者的結腸直腸癌的非侵入性方法。還提供了用於此類方法的試劑盒和裝置。此外，本發明提供了通過調節人類結腸中相關的細菌物種來降低結腸癌風險的方法。

Description

結腸直腸癌的糞便細菌標誌物 [相關申請案的交叉引用]

本申請案主張於2016年8月25日提交申請的美國臨時專利申請案第62/379,635號的優先權，將其整體併入本文。

本發明關於結腸直腸癌的糞便細菌標誌物。

結腸直腸癌是全世界第三大常見癌症，約占每年診斷的所有癌症病例的10%。這是一種對人類健康有嚴重影響的致命疾病。例如，在2012年期間，全球診斷出140萬例結腸直腸癌的新病例，並記錄了近70萬例死亡。在發達國家，結腸直腸癌的發病率明顯更高，發現了超過65%的病例。男人比女人更容易患這種疾病。

診斷結腸直腸癌可能是具有挑戰性的。雖然家族史可能為診斷提供有用的暗示，但絕大多數的疾病(大於75- 95%)發生在很少或沒有遺傳風險的人群中。結腸直腸癌的症狀也可能顯著變化，這取決於癌症在結腸中的位置，以及其是否已經擴散到身體的其他地方。根據結腸直腸癌是多早被診斷的，其預後可以從非常好到非常嚴重：當癌症團塊保持被限制在結腸壁內時，其可用手術使其高度可治癒；另一方面，一旦結腸直腸癌已經擴散，其通常不可治癒，此時醫學干預將集中於提高生活品質和緩解症狀。平均而言，美國的5年生存率為約65%。

鑒於結腸直腸癌的高流行性，以及早期診斷對患者預期壽命的至關重要性，迫切需要新的用於早期診斷結腸直腸癌的更有效的方法，尤其是以非侵入性的方式。先前已知，腸道微生物組成的變化與結腸直腸癌(CRC)相關，但因果關係尚未確立。例如，核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)被認為通過募集浸潤性免疫細胞並經由激活β-連環蛋白信號傳導來增強腸腫瘤發生。因此，用糞便微生物來進行早期非侵入性診斷CRC是有前途的。然而，仍然缺乏一種從糞便樣品中診斷CRC的簡單且實惠的方法。本發明滿足這點及其他相關的需要。

發明概述

本發明人已鑑定了與人結腸直腸癌(CRC)顯著相關的數種細菌物種，因此其可以用作診斷標誌物，通過對患者糞便樣品進行非侵入性分析來早期檢測CRC。更具體地， 本發明人展示，與正常個體相比，某些細菌物種如哈撒韋梭菌(Clostridium hathewayi)在CRC患者的糞便樣品中顯著富集，而其他細菌物種如克拉魯斯擬桿菌(Bacteroides clarus)和腸道羅斯氏菌(Roseburia intestinalis)在CRC患者的糞便中顯著降低。這些細菌物種的這種增加或減少導致對於這些物種為獨特的標籤DNA、RNA和蛋白質種類的更高水準或更低水準，其又可用於定性和定量地檢測樣品中異常富集/抑制的細菌群體，從而提供與人類受試者中CRC存在或具有升高的風險相關的關鍵資訊，這包括已被診斷患有該疾病的患者進行初始治療(例如，外科手術、化療和/或放療)後，CRC復發的風險增加。相反，可以預防性地特異性抑制或激活這些細菌物種，以降低個體在未來時間發展CRC的風險。

因此，在第一方面，本發明提供了一種用於評估受試者中結腸癌風險的方法，即用於評估受試者中存在結腸癌的可能性，和/或受試者在後續時間內發展該疾病的可能性，和/或患者患有復發性結腸癌的可能性(例如，首次診斷出該疾病時進行初始治療後)的方法。該方法通常依賴於當與健康受試者糞便中預期的對照值比較時，檢測到相關細菌物種(例如，參見補充表2)、屬或閘的群體的增加或降低，或檢測到患者糞便樣品中指示相關細菌物種、屬或閘的某些細菌基因標誌物的水準的增加或降低。

例如，所要求保護的方法包括以下步驟：(a)定量確定取自受試者的糞便樣品的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌 和哈撒韋梭菌中至少一種細菌物種的水準；(b)將步驟(a)中獲得的水準與標準對照進行比較；(c)將步驟(a)中獲得的水準確定為相對於標準對照增加或降低；和(d)將受試者確定為具有增加的結腸癌風險。

在一些實施方案中，確定克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中每一種的水準。

在一些實施方案中，步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質的水準。在一些實施方案中，步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA的水準。在一些實施方案中，步驟包括確定對於克拉魯斯擬桿菌和哈撒韋梭菌中每一種為特有的DNA的水準，任選地還包括確定對於核梭桿菌為特有的DNA的水準。例如，步驟(a)包括確定基因標誌物m1704941(Fn)(SEQ ID NO：5)、m2736705(Ch)(SEQ ID NO：6)、m3246804(m7)(SEQ ID NO：7)和m370640(Bc)(SEQ ID NO：2)的水準，任選地還包括確定基因標誌物m181682(Ri)(SEQ ID NO：1)的水準。

在一些實施方案中，在步驟(c)中將m1704941(Fn)、m2736705(Ch)和m3246804(m7)確定為增加，並在步驟(c)中將m370640(Bc)和m181682(Ri)確定為降低。在一些實施方案中，步驟(a)包括多核苷酸擴增反應，例如聚合酶鏈式反應(PCR)，尤其是定量PCR(qPCR)。

在一些實施方案中，當受試者被確定為具有增加的結 腸癌風險時，使用來自受試者的後續時間的另一糞便樣品在後續時間重複步驟(a)。與來自最初的步驟(a)的水準相比，檢測到重複的步驟(a)中獲得的水準增加表明結腸癌風險升高；相反，降低表明結腸癌風險下降。

在一些實施方案中，當受試者被確定為具有增加的結腸癌風險時，進行進一步的步驟：向受試者施用有效量的顯示為富集的細菌物種中至少一種(例如哈撒韋梭菌)的抑制劑，和/或顯示為存在降低的一種或多種細菌物種(例如克拉魯斯擬桿菌和腸道羅斯氏菌)的激活劑。

在一些情況下，核梭桿菌的替代性標誌物(nusG基因)可用於定量測量樣品中細菌的存在。該標誌物的示例性引子/探針序列被提供在“用於本研究的引子和探針的列表”(Fn-靶標2)和補充表3中。

在第二方面，本發明提供了用於檢測受試者中的結腸癌的試劑盒。所述試劑盒包括這些組分：(1)標準對照，其提供糞便樣品的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的平均量；和(2)試劑，其特異性且定量地鑑定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質。

在一些實施方案中，所述試劑是特異性結合DNA或RNA的多核苷酸探針，或者所述試劑是特異性結合蛋白質的抗體。在一些實施方案中，所述試劑是特異性結合克拉魯斯擬桿菌和哈撒韋梭菌中每一種特有的DNA的多核苷酸探針，任選地，所述試劑還包括特異性結合核梭桿菌特有 的DNA的多核苷酸探針。在一些實施方案中，所述試劑特異性且定量地鑑定基因標誌物m1704941(Fn)、m2736705(Ch)、m3246804(m7)和m370640(Bc)，任選地所述試劑特異性且定量地鑑定基因標誌物m181682(Ri)。所述試劑任選地可以包含可檢測的部分。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含兩個一組的寡核苷酸引子，其用於在擴增反應中從RNA或其互補物特異性擴增DNA或逆轉錄DNA的至少一段或全長。示例性的寡核苷酸引子組，示於補充表3以及“用於本研究的引子和探針的列表”中。在一些實施方案中，試劑盒還包括操作手冊。

本發明還提供了下述物質在製備檢測受試者的結腸癌的試劑盒中的用途：(1)標準對照，其提供糞便樣品的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的平均量；和(2)試劑，其特異性且定量地鑑定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質。在一些實施方案中，所述試劑是特異性結合所述DNA或RNA的多核苷酸探針，或所述試劑是特異性結合所述蛋白質的抗體。

在第三方面，本發明提供了用於在後續時間在受試者中預防性地治療結腸癌或降低發展為結腸癌的風險的方法。該方法包括向受試者施用有效量相關的細菌物種(例如，克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌)中至少一種的抑制劑或激活劑/增強劑的步驟，使得在CRC患者糞便中發現富集的細菌物種將被阻抑或被抑制，而在 CRC患者糞便中發現降低的細菌物種將被激活或促進。在一些實施方案中，抑制劑用於哈撒韋梭菌，而激活劑/增強劑用於克拉魯斯擬桿菌和腸道羅斯氏菌中至少一種。在一些實施方案中，抑制劑是編碼反義RNA、miRNA或siRNA的核酸，例如編碼針對基因標誌物m1696299和m2736705中至少一種的反義RNA、miRNA或siRNA的核酸。nusG基因作為核梭桿菌的替代性標誌物，可用於實施本文所述的本發明的各個方面。

在第四方面，本發明提供了檢測糞便樣品中的克拉魯斯擬桿菌(Bacteroides clarus)、腸道羅斯氏菌(Roseburia intestinalis)和哈撒韋梭菌(Clostridium hathewayi)中至少一種的水準增加或降低的方法，其包括以下步驟：(a)定量確定糞便樣品中的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的水準；(b)將步驟(a)中獲得的水準與標準對照進行比較；(c)將在步驟(a)中獲得的水準確定為相對於標準對照增加或降低。在一些實施方案中，糞便樣品獲得自受試者，優選獲得自人類受試者。在一些實施方案中，步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質的水準。在一些實施方案中，步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA的水準。在一些實施方案中，步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌和哈撒韋梭菌中每一種為特有的DNA的水準，任選地還包括確定對於核梭桿菌為特有的DNA的水 準。在一些實施方案中，步驟(a)包括確定基因標誌物m1704941(Fn)、m2736705(Ch)、m3246804(m7)和m370640(Bc)的水準，任選地還包括確定基因標誌物m181682(Ri)的水準。在一些實施方案中，步驟(a)包括多核苷酸擴增反應。在一些實施方案中，多核苷酸擴增反應是聚合酶鏈式反應(PCR)，優選定量PCR。

在相關方面，本發明提供了相關細菌物種的調節劑(即，抑制劑或激活劑)在製造用於預防性治療如上所述的結腸癌的藥物中的用途。

序列說明

SEQ ID NO：1為基因標誌物m181682(Ri)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2為基因標誌物m370640(Bc)的核苷酸序 列。

SEQ ID NO：3為m482585的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4為m1696299的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5為基因標誌物m1704941(Fn)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6為基因標誌物m2736705(Ch)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7為基因標誌物m3246804(m7)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8為m2040133的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9為m1559769的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10為m1804565的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11為m2206475的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12為m3319526的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13為m3611706的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14為m3976414的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15為m4171064的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16為m4256106的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17為m2211919的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18為m2361423的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19為m3173495的核苷酸序列。

SEQ ID NO：20為m3531210的核苷酸序列。

定義

在本文中，術語“結腸直腸癌(CRC)”和“結腸癌”具有相同的含義，並且是指大腸(結腸)、人消化系統的較下部分的癌症，儘管直腸癌通常更特別地是指結腸、直腸的最後數英寸的癌症。“結腸直腸癌細胞”是具有結腸癌特徵的結腸上皮細胞，且包括癌前細胞，癌前細胞處於轉化為癌細胞的早期或傾向於轉化為癌細胞。此類細胞可以表現出癌性細胞的一種或多種表型性狀特徵。

在本文中，術語“或”通常以包括“和/或”的含義使用，除非另有明確規定。

如本文所用，術語“基因表現”用於指DNA轉錄以形成編碼特定蛋白質的RNA分子，或由多核苷酸序列編碼的蛋白質的轉譯。換言之，本公開中的術語“基因表現水準”涵蓋了由目標基因編碼的mRNA水準和蛋白質水準。

在本文中，術語“分離的”核酸分子是指與通常和所述分離的核酸分子結合的其他核酸分子相分離的核酸分子。因此，“分離的”核酸分子包括但不限於，不含有天然側接於生物體基因組(分離的核酸的來源)中的核酸一端或兩端的核苷酸序列的核酸分子(例如，通過PCR或限制性內切核酸酶降解產生的cDNA或基因組DNA片段)。這種分離的核酸分子通常被引入到載體(例如，選殖載體或表現載體)中，以便於操作或產生融合核酸分子。此外，分離的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重組或合成的核酸分子。存在於例如，核酸庫(例如cDNA或基因組庫)或包含限制性降解的基因組DNA的凝膠(例如瓊脂糖或聚丙烯 醯胺)內的數百至數百萬個其他核酸分子中的核酸分子不是“分離的”核酸。

術語“核酸”或“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限定，該術語涵蓋包括與參考核酸具有相似結合特性且以與天然存在的核苷酸類似的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另有說明，特定核酸序列也隱含地涵蓋了其保守地修飾的變體(例如簡併密碼子取代)、等位元基因、直系同源物、單核苷酸多態性(SNP)和互補序列以及明確指出的序列。具體地，簡併密碼子取代可以通過產生其中一個或多個所選(或所有)密碼子的第三位置被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代的序列來實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。術語核酸可與基因、cDNA以及由基因編碼的mRNA互換使用。

術語“基因”是指參與產生多肽鏈的DNA區段；其包括涉及基因產物的轉錄/轉譯以及轉錄/轉譯的調節的編碼區之前和之後的區域(前導和尾部)，以及各個編碼區段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。

在本文中，術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，是指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學類似物的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物 和非天然存在的胺基酸聚合物。如本文所用，該術語涵蓋任何長度的胺基酸鏈，包括全長蛋白質(即抗原)，其中胺基酸殘基通過共價肽鍵相連接。

術語“胺基酸”是指天然存在的胺基酸和合成的胺基酸，以及與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是那些由遺傳密碼子編碼的胺基酸，以及那些隨後被修飾的胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-磷酸絲胺酸。基於本申請案的目的，胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構的化合物，即與氫、羧基、胺基和R基團相結合的碳，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如正亮胺酸)或修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。基於本申請案的目的，胺基酸類似物是指具有與胺基酸的通常化學結構不同的結構，但以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化合物。

胺基酸可以包括具有非天然存在的D-手性的那些胺基酸，如WO 01/12654中所公開，其可以改善包含一個或多個此類D-胺基酸的多肽的穩定性(例如半衰期)、生物利用性和其他特徵。在一些情況下，治療性多肽的一個或多個以及可能全部胺基酸具有D-手性。

胺基酸在本文中可以通過通常已知的三字母符號，或通過IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來表示。同樣，核苷酸可以通過他們通常被接受的單字母代 碼來表示。

如本文所用，在描述兩個或更多個多核苷酸或胺基酸序列時，術語“相同”或“同一性”百分比是指當使用如下序列比較演算法之一或通過手動比對和目視檢查測量來比較和比對整個比較視窗或指定的區域的最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列是相同的，或者其指定百分比的胺基酸殘基或核苷酸與參考序列具有至少80%的序列同一性，優選85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。然後，將此類序列稱為“基本上相同”。關於多核苷酸序列，該定義也指測試序列的互補序列。優選地，同一性存在於長度至少約50個胺基酸或核苷酸的區域，或更優選地，同一性存在於長度為75-100個胺基酸或核苷酸的區域。

對於序列比較，通常將一個序列作為參考序列，並將測試序列與之進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列和參考序列輸入電腦(如果需要，則指定子序列座標)，並指定序列演算法程式參數。可以使用預設的程式參數，或者可以指定替代性參數。然後，序列比較演算法基於所述程式參數計算出測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。對於核酸和蛋白質的序列比較，使用BLAST和BLAST2.0演算法和如下所述的默認參數。

如本文所用，“比較窗口”包括具有選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150個連續位置數中任一連續位置數的區段，其中在某一序列與具有相同連續位 置數的參照序列進行最優比對後，可以將這兩條序列進行比較。用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。可以通過下述來進行用於比較的序列最優比對：例如Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性演算法、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比對演算法、Pearson & Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性檢索方法、這些演算法的電腦實施(威斯康辛遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學電腦集團(Genetics Computer Group),575 Science Dr.,Madison,WI)、或者手動比對和目視檢查(參見，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，1995增刊))。

適於確定序列同一性百分比和序列相似性的演算法實例是BLAST和BLAST 2.0演算法，這兩種演算法分別在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等人(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述。通過美國國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information)網站ncbi.nlm.nih.gov，可公開獲得用於運行BLAST分析的軟體。該演算法首先涉及通過鑑定查詢序列中長度為W的短序列來鑑定高評分序列對(HSP)，當查詢序列中長度為W的短序列與資料庫序列中相同長度的序列比對時，其能匹配或符合某正值的閾值則評分為T。T被稱為相鄰序列評分閾值(Altschul等人，同 上)。這些初始的相鄰序列作為啟動檢索的基礎，用於發現含有他們的更長HSP。然後，在可以增加累加比對評分的前提下，將序列在兩個方向沿每一序列延伸。對於核苷酸序列，可以利用參數M(匹配殘基對的獎勵評分；一直大於0)以及N(錯配殘基的懲罰評分；一直小於0)來計算累加評分。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累加評分。當出現以下情況時，停止每一方向的序列延伸：累加比對評分從其最大實現值下降X量時；由於一個或多個負評分殘基比對的累積，而使累加評分達到零或零以下時；或者到達任一序列的末端時。BLAST演算法參數W、T和X，決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用序列長(W)為28、期望值(E)為10、M=1、N=-2和雙鏈比較作為默認參數。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用序列長(W)為3、期望值(E)為10和BLOSUM62評分矩陣作為默認參數(參見，Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。

BLAST演算法還執行兩條序列間的相似性統計分析(參見，例如Karlin和Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST演算法提供的相似性的一項測定是最小求和概率(sum probability)(P(N))，其提供了兩條核苷酸或胺基酸序列間偶然發生匹配的概率指示。例如，如果在測試核酸與參照核酸比較中，最小求和概率小於約0.2，更優選小於約0.01，以及最優選小於約0.001時，則認為測試核酸與參照序列是相似的。

如下文所述，兩條核酸序列或多肽基本相同的指示是，由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸所編碼的多肽所產生的抗體發生免疫交叉反應。因此，例如，如果一條多肽與另一多肽的差異僅在於保守型取代，那麼兩條肽通常是基本相同的。如下文所述，兩條核酸序列基本相同的另一指示是，兩個分子或其互補物能在嚴謹條件下彼此雜交。兩條核酸序列基本相同的另一指示是，可以使用相同的引子來擴增所述序列。

在本文中，術語“嚴謹的雜交條件”和“高嚴謹性”是指探針與其靶標子序列(通常處於複雜的核酸混合物中)雜交而不與其他序列雜交的條件。嚴謹的條件是序列依賴性的，並且在不同情況下會不同。較長的序列在較高的溫度下特異性地雜交。核酸雜交的廣泛指導見於，Tssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes(生物化學和分子生物學技術-核酸探針的雜交)，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(雜交原理和核酸測定策略的概述)"(1993)，並且容易被本領域技術人員所理解。通常，將嚴謹的條件被選擇為比在限定的離子強度、pH下具體序列的熱熔點(T_m)低約5-10℃。T_m是平衡時50%的與靶標互補的探針與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)(因為靶序列是過量存在的，所以在T_m下，在平衡時，50%的探針被佔據)。添加去穩定劑如甲醯胺也可以實現嚴謹的條件。對於選擇性 雜交或特異性雜交，陽性信號至少是背景的2倍，優選為10倍於背景的雜交。示例性的嚴謹雜交條件可以如下：50%甲醯胺，5×SSC和1%SDS於42℃下培育，或5×SSC和1%SDS於65℃下培育，在0.2×SSC和0.1% SDS中65℃下洗滌。

對於在嚴謹的條件下不彼此雜交的核酸，如果他們編碼的多肽是基本上相同的，則該核酸仍然是基本上相同的。例如，當使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡併性產生核酸拷貝時，會發生這種情況。在這些情況下，所述核酸通常在中等嚴謹的雜交條件下雜交。示例性的“中等嚴謹的雜交條件”包括：37℃下於40%甲醯胺、1M NaCl、1%SDS的緩衝液中雜交，以及45℃下於1×SSC中洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領域技術人員會容易地認識到，替代性雜交和洗滌條件可以用於提供相似嚴謹性的條件。用於確定雜交參數的其他指導在很多參考文獻中提供，例如，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人編。

“表現卡匣”是重組或合成產生的核酸構建體，其具有允許在宿主細胞中轉錄具體多核苷酸的一系列指定的核酸元件。表現卡匣可以是質體、病毒基因組或核酸片段的一部分。通常，表現卡匣包括與啟動子可操作地連接的待轉錄的多核苷酸。在此背景下，“可操作地連接”表示將兩個或更多個基因元件(諸如多核苷酸編碼序列和啟動子)置於允許元件發揮合適的生物功能(諸如啟動子指導編碼序列 進行轉錄)的相對位置。可以存在於表現卡匣中的其他元件包括能增強轉錄(例如，增強子)和終止轉錄(例如，終止子)的元件，以及賦予表現卡匣所產生的重組蛋白某種結合親和力或抗原性的元件。

術語“免疫球蛋白”或“抗體”(本文可互換使用)是指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的基本四多肽鏈結構的抗原結合蛋白，所述鏈例如通過鏈間二硫鍵來穩定，所述抗原結合蛋白具有特異地結合抗原的能力。重鏈和輕鏈都折疊成結構域。

術語“抗體”還指可以用於免疫結合分析中的抗體如Fab片段的抗原結合片段和表位結合片段。有很多被良好地表徵的抗體片段。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵連接的C端降解抗體，以產生Fab的二聚體F(ab)'₂，所述Fab自身是通過二硫鍵與V_H-C_H1連接的輕鏈。F(ab)'₂可以在溫和的條件下被還原以破壞鉸鏈區的二硫鍵，從而將(Fab')₂二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體在本質上是具有一部分鉸鏈區的Fab(對於其他抗體片段的更詳細描述，參見例如，Fundamental Immunology,Paul編，Raven Press,N.Y.(1993))。儘管根據完整抗體的降解來定義不同的抗體片段，但本領域技術人員應當理解的是，可以通過化學方法從頭合成片段，或通過利用重組DNA技術來合成片段。因此，術語抗體還包括通過修飾整個抗體所產生的抗體片段，或利用重組DNA技術合成的抗體片段。

當在描述具體分子與蛋白或肽的結合關係的上下文中 使用時，短語“特異性地結合”是指能在蛋白和其他生物製劑的混雜群體中確定蛋白的存在的結合反應。因此，在指定的結合測定條件下，指定的結合試劑(例如，抗體)與特定蛋白的結合至少為背景的二倍，並且基本上不以顯著的量與樣品中存在的其他蛋白結合。在這種條件下，抗體的特異性結合可能需要選擇對特定蛋白具有特異性的抗體，或對某一蛋白具有特異性而不對該蛋白的相似“姐妹”蛋白具有特異性的抗體。多種免疫測定模式可用於選擇能與特定的蛋白或以特定的形式發生特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫分析常被用於選擇能與蛋白質發生特異性免疫反應的抗體(對於可用於確定特異性免疫反應性的免疫分析模式和條件的描述，參見例如，Harlow & Lane,Antibodies,ALaboratory Manual(1988))。通常，特異性或選擇性結合反應為背景信號或雜訊的至少兩倍，更通常超過背景的10至100倍。另一方面，當涉及一條多核苷酸序列與另一多核苷酸序列形成雙鏈複合物時，術語“特異性地結合”描述基於Watson-Crick鹼基配對的“多核苷酸雜交”，正如在術語“多核苷酸雜交方法”的定義中所述。

本文中所用的“增加”或“降低”是指，與比較對照相比在量上可檢測出的正向或負向改變，所述比較對照例如是已建立的標準對照(例如，在未患有CRC或具有發展為CRC風險的健康受試者糞便樣品中發現的，相關細菌DNA或RNA或蛋白質的平均水準)。增加是通常為對照值的至少 10%、或至少20%、或50%、或100%的正向改變，並且可以高達對照值的至少2倍、至少5倍或甚至10倍。同樣，降低是通常為對照值的至少10%、或至少20%、30%、或50%、或者甚至高達至少80%或90%的負向改變。指示與比較基準相比的量的改變或差異的其他術語，諸如“多於”、“少於”、“高於”和“低於”，在本申請案中以上述相同的方式使用。相比之下，術語“基本相同的”或“基本沒有變化的”指示與標準對照值相比，在量上具有極小改變或沒有改變，通常改變在標準對照的±10%以內，或±5%、±2%以內，或者甚至與標準對照相比具有更小的改變。

本文所用的術語“抑制(inhibiting/inhibition)”是指對靶標生物過程(如RNA轉錄、蛋白質表現、細胞增殖、細胞信號轉導、細胞增殖、致癌性，轉移潛能以及疾病/病況的復發)的任何可檢測的負面影響。通常，抑制反映為當與不施用抑制劑的對照相比時，在施用抑制劑的靶標過程中(例如，相關細菌DNA、RNA或蛋白質的水準)降低至少10%、20%、30%、40%或50%。

如本文所用，“多核苷酸雜交方法”是指在合適的雜交條件下，基於預先確定的多核苷酸序列與已知序列的多核苷酸探針形成Watson-Crick鹼基配對的能力，來檢測預先確定的多核苷酸序列的存在和/或量的方法。這類雜交方法的實例包括南方(Southern)印跡、北方(Northern)印跡和原位雜交。

如本文所用，“引子”是指可以在擴增方法(如聚合酶 鏈式反應(PCR))中用來基於對應於目的基因(例如，相關細菌物種的DNA或RNA序列)的多核苷酸序列擴增核苷酸序列的寡核苷酸。通常，用於擴增多核苷酸序列的至少一條PCR引子，對於該多核苷酸序列是序列特異性的。引子的確切長度取決於多種因素，包括溫度、引子來源和所用的方法。例如，對於診斷和預後應用，取決於靶序列的複雜性，寡核苷酸引子通常含有至少10、或15、或20、或25或更多個核苷酸，儘管其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。在確定引子合適長度中所涉及的因素是本領域技術人員熟知的。具體實施方案中所用的引子，如本公開的“用於本研究的引子和探針的列表”所示，其中標明了他們的具體應用。在本文中，術語“引子對”表示與靶DNA分子的相反鏈雜交，或與位於待擴增的核苷酸序列側翼的靶DNA區域雜交的引子對。在本文中，術語“引子位點”表示與引子雜交的靶DNA或其他核酸的區域。

“標記”、“可檢測的標記”或“可檢測的部分”是可通過分光光度計、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理手段進行檢測的組成部分。例如，有用的標記包括³²P、螢光染料、電子密度試劑、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、或可被製成可檢測的(例如，通過將放射性成分併入肽中)或用於檢測抗體與肽發生特異性反應的半抗原和蛋白。通常，將可檢測的標記與具有確定的結合特性的探針或分子(例如，具有已知結合特異性的多肽或多核苷酸)連接，以允許容易地檢測探針(以及其 結合靶標)的存在。

如本文所用，“標準對照”是指存在於已建立的無疾病糞便樣品(例如，來自未被診斷患有CRC或已知具有增加的發展成CRC的風險的平均健康個體的糞便樣品)中的預定量或濃度的多核苷酸序列或多肽(例如，相關細菌的DNA、RNA或蛋白質)。標準對照值適合用於本發明方法，作為用於比較測試樣品中所存在的相關細菌的DNA、RNA或蛋白質的量的基礎。作為標準對照的已建立樣品，提供了對於不患有常規定義的任何結腸疾病(尤其是CRC)的平均健康人的糞便樣品中通常的相關細菌的DNA、RNA或蛋白質的平均量。標準對照值可以根據樣品的性質以及其他因素而變化，所述其他因素例如作為建立該對照值基礎的所述個體的性別、年齡、種族。

當用於描述不患有常規定義的任何結腸疾病(尤其是CRC)的健康人時，術語“平均”是指在能代表隨機選擇的不患有任何結腸疾病(尤其是CRC)並且沒有已知的發展成該疾病的風險的健康人群的人糞便樣品中的某些特性，尤其是某些相關細菌的DNA、RNA或蛋白質的水準。所選擇的人群應當包括足夠數量的人，使得這些個體的糞便中發現的相關細菌的DNA、RNA或蛋白質的平均水準或量能以合理的準確性反映一般的健康人群中這些DNA、RNA或蛋白質的對應水準或量。此外，所選擇的人群通常與糞便樣品被用於測試結腸癌指示的受試者具有相似的年齡。此外，還應考慮諸如性別、種族、病史等其他因素，並優選實現 測試受試者與所選的建立“平均”值的個體組在特徵上密切匹配。

如本文中所用，術語“量(amount)”是指樣品中存在的目的多核苷酸或目的多肽(例如，相關細菌的DNA、RNA或蛋白質)的量。此類量可以以絕對值來表示，即樣品中多核苷酸或多肽的總量，或以相對值來表示，即樣品中多核苷酸或多肽的濃度。

如本文中所用，術語“治療(treat/treating)”描述能實現消除、減輕、緩解、逆轉或預防或延遲相關病況的任何症狀的發生或復發的行為。換言之，“治療”病況包括對該病況的治療性干預和預防性干預。

如本文所用，術語“有效量”是指在量上足以產生期望效應的給定物質的量。例如，有效量的編碼反義RNA的多核苷酸，是在細菌物種中實現相應的RNA或蛋白表現或生物活性的水準降低，使得在為治療性目的給予多核苷酸的患者中結腸癌的風險、症狀、嚴重性和/或復發變化被減輕、逆轉、消除、預防或延遲發生的所述多核苷酸的量。足以實現這點的量被定義為“治療有效劑量”。劑量範圍根據所給予的治療劑的性質，以及諸如給藥途徑和患者病況的嚴重程度等其他因素而改變。

如本文所用，術語“受試者”或“需要治療的受試者”包括由於具有患結腸癌風險或實際患有結腸癌而尋求醫療幫助的個體。受試者還包括尋求治療方案改進的當前正經歷治療的個體。需要治療的受試者或個體包括表現出結腸癌 的症狀，或具有患結腸癌或其症狀的風險的受試者或個體。例如，需要治療的受試者包括具有結腸癌遺傳傾向或家族史的個體、過去已忍受相關症狀的個體、已暴露於觸發物質或事件的個體，以及忍受病況的慢性或急性症狀的個體。“需要治療的受試者”可以處於生命的任何年齡。

所使用的細菌物種的“抑制劑”、“激活劑”和“調節劑”分別是指，使用體外分析和體內分析鑑定的抑制性分子、活化性分子或調節性分子，其用於結合相關細菌的DNA、RNA或蛋白質，或用於影響細菌的存活或增殖。術語“調節劑”包括抑制劑和激活劑。例如，抑制劑是可能通過抑制細菌物種的生長或存活，來部分或完全地阻斷結合、降低、阻止、延遲激活、失活、去敏化或下調相關細菌的DNA、RNA或蛋白質的水準或量的試劑。在一些情況下，抑制劑直接或間接與細菌DNA或RNA如反義分子結合。本文所用的抑制劑與失活劑和拮抗劑同義。例如，激活劑是可能通過促進細菌物種的生長或存活，來刺激、增加、促進、增強活化、敏化或上調相關細菌的DNA、RNA或蛋白質的水準或量的試劑。抑制劑、激活劑和調節劑可以是大分子，例如多核苷酸、包括抗體和抗體片段的多肽，或者他們可以是小分子，其包括含有碳水化合物的分子、siRNA、RNA適體等。

發明詳述 I. 引言

當在後期檢測到疾病時，結腸直腸癌患者常常面臨嚴酷的預後。因此，早期檢測結腸直腸癌對於提高患者生存率至關重要。雖然先前已知人腸中存在的細菌群體在結腸直腸癌的腫瘤發生和發展中起作用，但沒有足夠的資訊可用於開發允許基於糞便細菌標誌物快速和可靠地檢測所述疾病的非侵入性診斷工具。

本發明人首次發現，如通過相關細菌的DNA、RNA或蛋白質的水準增加所證實的，某些細菌物種在糞便中存在的增加與患者中結腸直腸癌的存在或升高的風險相關。相關細菌物種在結腸直腸癌患者的結腸中富集這一發現，提供了以非侵入性方式早期檢測結腸直腸癌的重要手段，以及在監測或治療疾病中的影響。通常，測試受試者的糞便樣品中可見的相關細菌DNA、RNA或蛋白質的水準高於正常水準(其可能呈現或可能不呈現結腸病症或異常的任何跡象)，這表明受試者有高可能性已經患有或將在以後發展成結腸直腸癌。如果進一步的診斷方法確認了該疾病的存在，此類升高的風險的識別允許立即治療患者，或者如果疾病還沒有發生，此類升高的風險的識別允許對患者進行密切監測和/或採用預防措施。

在發明人的第二研究中，發明人通過宏基因組測序鑑定出，五個細菌候選物(包括核梭桿菌(Fn)、克拉魯斯擬桿菌(Bc)、腸道羅斯氏菌(Ri)、哈撒韋梭菌(Ch)和一種未定義的物種(m7))的豐度，在雙重qPCR分析所示的CRC患者的糞便樣品與健康對照的比較中有顯著的差異。糞便Fn的 值，作為用於CRC診斷的基於糞便的生物標誌物被證實(靈敏度為77.7%，特異性為79.5%)。四個細菌標誌物候選物(Fn、Bc、Ch和m7)的簡單線性組合，提高了單獨Fn對CRC的診斷能力。作為檢測CRC的生物標誌物，在與糞便免疫化學測試(FIT)的組合時，增加了Fn(靈敏度為92.8%，特異性為79.8%)和四個細菌(靈敏度為92.8%，特異性為81.5%)的性能。

本發明描述了用於定量細菌DNA含量的基於探針的內部對照分析，以及用於通過宏基因組測序來定量本發明人新鑑定的糞便細菌標誌物的進一步雙重qPCR分析。通過如下方面良好地建立並優化內部對照分析：1)設計簡併引子-探針組，使其具有適合於靶向16S rRNA基因的保守區域的qPCR定量的擴增子大小(小於150bp)，並在核糖體資料庫專案版本10.8中，覆蓋大於90%的真細菌群體；2)使用良好優化的實驗方案，Cq值與Log2 DNA量良好相關(R2=0.6466)。簡言之，本發明人已經建立了用於方便地轉化應用新細菌標誌物的可靠平臺。通過本文所述的宏基因組測序研究所鑑定的基於糞便的CRC相關的細菌，可以作為用於對CRC患者進行非侵入性診斷的新型生物標誌物。

II. 一般方法

本發明的實踐利用分子生物學領域的常規技術。公開了本發明使用的一般方法的基礎教科書包括：Sambrook和 Russell,Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，1994))。

對於核酸，以千鹼基對(kb)或鹼基對(bp)給出大小。核酸大小是從瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、從測序的核酸或從公開的DNA序列得到的估計值。對於蛋白，以千道爾頓(kDa)或胺基酸殘基數給出大小。蛋白大小是從凝膠電泳、從測序的蛋白、從導出的胺基酸序列或從公開的蛋白序列估算的。

例如，使用Van Devanter等人，Nucleic Acids Res.12：6159-6168(1984)中的描述的自動化合成儀，根據Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Lett.22：1859-1862(1981)中首先描述的固相亞磷醯胺三酯法，可以通過化學方法合成不能商購的寡核苷酸。利用任何本領域公認的策略，例如天然丙烯醯胺凝膠電泳或Pearson和Reanier,J.Chrom.255：137-149(1983)中所描述的陰離子交換高效液相層析(HPLC)，進行寡核苷酸的純化。

利用例如Wallace等人，Gene 16：21-26(1981)中的用於雙鏈模板的鏈終止法，可以驗證本發明所用的目的序列，例如相關細菌DNA或RNA的多核苷酸序列，以及合成的寡核苷酸(例如，引子)。

III. 獲取樣品和分析細菌DNA或RNA

本發明涉及測量在人糞便樣品中發現的一種或多種細菌物種的識別標誌DNA或RNA的水準或量，將其作為檢測結腸癌的存在、評估發展成結腸癌的風險和/或監測結腸癌的進展或治療功效(包括評估疾病復發的可能性)的手段。因此，實施本發明的第一步驟是，從測試受試者獲得糞便樣品並從所述樣品中提取DNA或RNA。

A.糞便樣品的獲取和製備

使用本發明的方法，從待測試或監測結腸癌的人獲得糞便樣品。可以在診所或在患者家中容易地實現收集個體的糞便樣品。收集適量的糞便，並且可以在進一步的製備之前，根據標準程式儲存糞便。可以使用已建立的技術，對根據本發明的患者糞便樣品中發現的細菌DNA或RNA進行分析。製備用於核酸提取的糞便樣品的方法是本領域技術人員熟知的。參見，例如Yu等人，Gut.2015年9月25日pii：gutjnl-2015-309800.doi：10.1136/gutjnl-2015-309800。

B. DNA和RNA的提取和定量

從生物樣品中提取DNA的方法是公知的，並在分子生物學領域中是常規實施的(例如，描述於Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第三版，2001)。應消除RNA污染以避免干擾DNA分析。

同樣，有許多用於從生物樣品中提取mRNA的方法。 可以遵循mRNA製備的一般方法，參見，例如Sambrook和Russell，同上；各種可商購的試劑或試劑盒，如Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)，Oligotex Direct mRNA試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)，RNeasy Mini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)和PolyATtract^® Series 9600^TM(Promega,Madison,WI)，也可以用於從測試受試者的生物樣品中獲得mRNA。也可以使用這些方法中多於一種方法的組合。從RNA製劑中消除所有污染的DNA是重要的。因此，應仔細處理樣品，用DNA酶徹底處理，並在擴增和定量步驟中使用適當的陰性對照。

1. 基於PCR的DNA或RNA水準的定量測定

當從樣品中提取DNA或mRNA，可以定量所預定的細菌DNA或RNA(如由細菌物種特有的細菌基因所編碼的16s rDNA或RNA)的量。測定所述DNA或RNA水準的優選方法是基於擴增的方法，例如通過聚合酶鏈反應(PCR)，其包括用於RNA定量分析的逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。

當細菌DNA直接進行擴增時，必須首先逆轉錄細菌RNA。在擴增步驟之前，必須合成靶RNA的DNA拷貝(cDNA)。這一過程是通過逆轉錄實現的，其可以作為單獨步驟進行，或在均相逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)中進行，所述RT-PCR是用於擴增RNA的一種改良的聚合酶鏈式反應。適於通過PCR擴增核糖核酸的方法描述於： Romero和Rotbart，Diagnostic Molecular Biology：Principles and Applications pp.401-406；Persing等人編，Mayo Foundation,Rochester,MN,1993；Egger等人，J.Clin.Microbiol.33：1442-1447,1995；以及美國專利第5,075,212號。

PCR的一般方法是本領域公知的，並且因而在本文沒有詳細描述。對於PCR方法、實驗方案和設計引子的原理的綜述，參見例如，Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR試劑和實驗方案還可以從供應商如Roche Molecular Systems獲得。

最通常的情況下，利用熱穩定酶以自動化過程來實施PCR。在該過程中，使反應混合物的溫度自動地通過變性區、引子退火區和延伸反應區進行迴圈。專門適用於該目的的儀器是可商購獲得的。

儘管在實施本發明中通常使用靶細菌DNA或RNA的PCR擴增，但本領域技術人員應當認識到，通過任何已知的方法可以實現樣品中這些DNA或RNA種類的擴增，如連接酶鏈式反應(LCR)、轉錄介導的擴增和半保留序列複製或基於核酸序列的擴增(NASBA)，這些方法中的每一種都能提供充分的擴增。最近研發的支鏈DNA技術也可以用於定量地測定樣品中DNA或mRNA的量。對於直接定量臨床樣品中核酸序列的支鏈DNA信號擴增的綜述，參見Nolte,Adv.Clin.Chem.33：201-235,1998。

2.其他定量方法

還可以利用本領域技術人員公知的其他標準技術來檢測靶細菌DNA或RNA。儘管在檢測步驟之前通常進行擴增步驟，但是本發明方法不是一定需要擴增。例如，無論事先是否進行擴增步驟，都可以通過大小分級(例如，凝膠電泳)來鑑定DNA或RNA。在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中運行樣品並按照公知的技術用溴化乙錠進行標記(參見例如，Sambrook和Russell，同上)之後，與標準對照具有相同大小的條帶的存在指示出靶DNA或RNA的存在，然後基於條帶的強度將所述靶DNA或RNA的量與對照進行比較。或者，可將對靶細菌DNA或RNA具有特異性的寡核苷酸探針用於檢測此類DNA或RNA的存在，並基於探針提供的信號強度，通過與標準對照比較來指示出細菌DNA或RNA的量。

序列特異性探針雜交是檢測包含其他種類核酸的特定核酸的公知方法。在足夠嚴謹的雜交條件下，所述探針只與基本上互補的序列特異性雜交。可以放鬆雜交條件的嚴謹性，以允許不同量的序列錯配。

本領域中公知有很多雜交模式，包括但不限於：液相、固相或混合相雜交測定。下面的文章提供了多種雜交測定模式的綜述：Singer等人，Biotechniques 4：230,1986；Haase等人，Methods in Virology,pp.189-226,1984；Wilkinson,In situ Hybridization,Wilkinson編，IRL Press,Oxford University Press,Oxford；以及Hames和Higgins編，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach,IRL Press,1987。

按照公知的技術檢測雜交複合物。通過常用於檢測雜交核酸存在的數種方法中任一種，可以標記能夠與靶核酸(即細菌16s rDNA)特異性雜交的核酸探針。一種常用的檢測方法是，利用以³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P等標記的探針的放射自顯影技術。因為合成的便利性、穩定性和所選同位素的半衰期，放射性同位素的選擇取決於研究的參數選擇。其他標記包括化合物(例如，生物素和地高辛)，其與用螢光團、化學發光試劑和酶標記的抗配體或抗體結合。或者，探針可以與諸如螢光團、化學發光試劑和酶的標記直接共軛。標記的選擇取決於所需的敏感度、與探針共軛的便利性、穩定性需要和可利用的儀器。

利用公知的技術，可以合成和標記實施本發明所需的探針和引子。例如，使用Needham-Van Devanter等人，Nucleic Acids Res.12：6159-6168,1984中所描述的自動化合成儀，按照Beaucage和Caruthers,Tetrahedroh Lett.22：1859-1862,1981首次描述的固相亞磷醯胺三酯法，可以通過化學方法合成用作探針和引子的寡核苷酸。通過天然丙烯醯胺凝膠電泳，或通過Pearson和Reanier,J.Chrom.255：137-149,1983中所描述的陰離子交換HPLC，可以進行寡核苷酸的純化。

IV. 細菌蛋白的定量 A. 準備用於細菌蛋白檢測的樣品

還可以通過分析細菌特有的一種或多種蛋白質來定量測定樣品中的相關細菌物種的存在。將來自受試者的糞便樣品用於實施本發明，並且可以根據已知的方法或如前面章節所述獲得並處理以進行分析。

B. 測定細菌蛋白的水準

可以利用多種免疫學分析來檢測蛋白質，例如指示細菌身份的蛋白質。在一些實施方案中，通過使用對靶蛋白具有特異性結合親和力的抗體來從測試樣品捕獲所述靶蛋白，可以進行夾心法分析。然後，可以用對所述蛋白具有特異性結合親和力的標記抗體來檢測。可以利用微流式裝置(如微陣列蛋白晶片)來實施此類免疫學分析。還可以通過凝膠電泳(如二維凝膠電泳)和利用特異性抗體的南方(Western)印跡分析，來檢測目的蛋白(例如，細菌物種特有的蛋白質)。或者，可以通過利用合適的抗體的標準免疫組織學技術來檢測靶蛋白。單株抗體和多株抗體(包括具有期望的結合特異性的抗體片段)，可用於靶蛋白的特異性檢測。可以通過已知技術來產生對特定蛋白具有特異性結合親和力的抗體及其結合片段。

在實施本發明中，還可以利用其他方法來測定標誌物蛋白的水準。例如，基於質譜測量技術已開發出多種技術來快速和精確定量靶蛋白(甚至在大量樣品中)。這些方法 涉及高精密儀器，如利用多反應監測(MRM)技術的三個四極杆(triple Q)儀器、基質輔助鐳射解吸/電離飛行時間串聯質譜儀(MALDI TOF/TOF)、利用選擇性離子檢測(SIM)模式的離子阱儀器，以及基於電噴霧離子化(ESI)的QTOP質譜儀。參見例如，Pan等人，J Proteome Res.2009年2月；8(2)：787-797。

V. 建立標準對照

為了建立用於實施本發明方法的標準對照，首先選擇未患有常規定義的任何結腸病(尤其是任何形式的腫瘤如結腸癌)的一組健康人。為了利用本發明的方法篩查和/或監測結腸癌，如果可以的話，這些個體符合合適的參數。任選地，所述個體為相同的性別、相似的年齡或相似的種族背景。

通過成熟的、常規使用的方法來確認所選個體的健康狀態，所述方法包括但不限於個體的一般身體檢查及其醫療史的總體回顧。

此外，所選的健康個體組必須具有合理的樣品大小，使得從組中獲得的糞便樣品中相關的細菌、其DNA、mRNA或蛋白質的平均量/濃度，能夠被合理地看作代表一般健康人群中的正常或平均水準。優選地，選擇的組包括至少10個人類受試者。

一旦基於所選健康對照組每個受試者的個體值，建立了細菌、其標誌物DNA、mRNA或蛋白質的平均值，該平 均值、或中值、或代表值、或特徵被視為標準對照。在相同的過程中還確定標準差。在一些情況下，可以為具有不同特徵(如年齡、性別或種族背景)的單獨定義的組，建立單獨的標準對照。

VI. 結腸癌的預防性治療

通過說明人腸道中某些細菌物種的富集與結腸癌的相關性，本發明提供了用於預防性治療具有增加的後續發展成結腸癌風險的患者的預防措施：通過抑制相關細菌物種並降低其在患者腸道中的存在的方式。相比之下，本發明人已經示出了在CRC患者結腸中某些其他細菌物種具有受抑制的群體或低於正常群體。然後可以設計預防措施，以用於預防性治療具有增加的後續發展成結腸癌風險的患者：通過促進相關細菌物種和增加/恢復其在患者結腸中的存在的方式。

如本文所用，結腸癌的預防性治療包括預防或延遲所述疾病的一種或多種相關症狀的發作，其包括降低已經接受初始治療的患者的死亡率或疾病復發可能性。相關細菌物種的抑制劑實際上可具有任何化學性質和結構性質：他們可以是多肽(例如抗體、抗體片段、適體)、多核苷酸(例如反義DNA/RNA、小抑制性RNA或微小RNA)以及小分子。只要他們具有經證實的對靶細菌的抑制作用(例如，抑制細菌增殖或誘導細菌細胞死亡)，則此類抑制劑可用於抑制患者腸道中結腸癌細胞的發展，因此可用於治療結 腸癌。類似地，相關細菌物種的激活劑實際上可具有任何化學性質和結構性質，只要他們具有經證實的對靶細菌的增強作用(例如，促進細菌增殖或抑制細菌細胞死亡)。

A. 相關細菌物種的調節劑

通過使用靶向特異性細菌基因的抑制劑核酸(如siRNA、微小RNA、微型RNA(mini RNA)、lncRNA、反義寡核苷酸、適體)，可以實現細菌物種的抑制。此類核酸可以是單鏈核酸(例如mRNA)或雙鏈核酸(例如DNA)，其可以在合適的條件下轉化為靶細菌RNA的抑制劑的活性形式。

在一個實施方案中，以表現卡匣的形式提供編碼抑制劑的核酸，其通常是重組產生的，具有可操作地連接於編碼所述抑制劑的多核苷酸序列的啟動子。在一些情況下，所述啟動子是在選擇的細菌細胞中特異性表現的啟動子。施用此類核酸可以抑制靶細菌的基因表現，並因此抑制細菌群體。由於幾乎所有已知的細菌均已完全測序，並且資訊已被存儲在資料庫中，因此可以基於序列資訊來設計合適的抑制劑核酸。

在細菌培養物暴露於候選化合物時，可以在分析中確認相關細菌物種的抑制劑和激活劑，並且分析所述化合物對培養物的影響。例如，可以觀察到抑制劑對細菌培養物表現出抑制或抑制作用，導致生長減弱和/或細菌細胞死亡增加。相比之下，可以觀察到激活劑對細菌培養物表現 出積極作用，促進細菌的存活以及增殖/生長。當在測試組中確立了對細菌培養物的負面作用時，則檢測到抑制作用。優選地，負面作用是至少10%的降低；更優選地，降低是C。類似地，激活劑表現出在細胞增殖中至少10%、20%、50%或更高增加的作用，更優選地，增加是至少1倍、或2倍、或甚至5倍。

如上所述，這些細菌抑制劑或激活劑可具有不同的化學特徵和結構特徵。例如，抑制劑或激活劑可以是僅影響特定細菌物種生長或存活的任何小分子或大分子。基本上任何化合物都可以作為潛在的抑制劑或激活劑進行測試。此類調節劑可以通過篩選含有大量潛在的有效化合物的組合庫來鑑定。如本文所述，可以在一個或多個分析中篩選此類組合化學庫，以鑑定顯示所需特徵活性的那些庫成員(特定的化學物質種類或亞類)。因此，所鑑定的化合物可以用作常規的“先導化合物”，或者可以將其本身用作潛在的或實際的治療劑。

組合化學庫的製備和篩選是本領域技術人員公知的。此類組合化學庫包括但不限於：肽庫(參見例如，美國專利第5,010,175號，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等人，Nature 354：84-88(1991))，以及碳水化合物庫(參見例如，Liang等人，Science，274：1520-1522(1996)和美國專利第5,593,853號)。也可以使用用於產生化學多樣性庫的其他化學品。此類化學物質包括但不限於：擬肽(PCT公開WO 91/19735)、編碼的肽 (PCT公開WO 93/20242)、隨機生物寡聚物(PCT公開WO 92/00091)、苯二氮卓類(美國專利第5,288,514號)、多樣體(diversomer)(例如乙內醯脲、苯二氮卓類和二肽(Hobbs等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))、插烯多肽(vinylogous polypeptides)(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))、具有β-D-葡萄糖骨架的非肽類肽模擬物(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、小化合物的類似有機合成庫(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、寡聚胺基甲酸酯(Cho等人，Science 261：1303(1993))和/或肽基膦酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.59：658(1994)、核酸庫(參見Ausubel、Berger和Sambrook，全部同上)、肽核酸庫(參見例如，美國專利第5,539,083號)、抗體庫(參見例如，Vaughn等人，Nature BioteChnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)、小有機分子庫(參見例如，苯二氮卓類，Baum C & EN，1月18日，第33頁(1993)；類異戊二烯，美國專利第5,569,588號；噻唑烷酮和間噻嗪烷酮，美國專利第5,549,974號；吡咯烷，美國專利第5,525,735號和第5,519,134號；嗎啉化合物，美國專利第5,506,337號；和苯二氮卓類，美國專利第5,288,514號)。

B. 藥物組合物 1. 製劑

相關細菌物種的調節劑可用於藥物組合物或藥物的製 備。可以將藥物組合物或藥物施用於個體以治療結腸癌，尤其是用於預防。

本發明的治療方法中所用的化合物，可用於製備包含有效量的所述化合物的藥物組合物或藥物，所述有效量的化合物與適於應用的賦形劑或載體組合或混合。

用於此類治療用途的示例性藥物組合物包含：(i)包含編碼本文所述的抑制劑(例如siRNA、微小RNA、微型RNA、lncRNA、反義寡核苷酸)的多核苷酸序列的表現卡匣，和(ii)藥學上可接受的賦形劑或載體。術語“藥學上可接受的”和“生理學上可接受的”，在本文可同義使用。對於本文所述的治療方法中的使用，可以提供治療有效劑量的表現卡匣。

可以通過脂質體施用抑制劑或激活劑，脂質體用作將共軛物靶向特定的組織，以及增加組合物的半衰期。脂質體包括乳劑、起泡劑、膠束、不溶性單層、液態晶體、磷脂分散劑、片狀層等。在這些製劑中，將待遞送的抑制劑作為脂質體的一部分，所述抑制劑單獨的或與能結合例如靶細胞中廣泛存在的受體的分子或其他治療性或免疫原性組合物聯合。因此，用本發明所需的調節劑填充的脂質體，可被引導至治療位點(例如結腸)，然後在該治療位點，所述脂質體遞送所選的抑制劑組合物。用於本發明中的脂質體由標準的囊泡形成脂質形成，所述囊泡形成脂質通常包括中性和帶負電的磷脂和甾醇(如膽固醇)。通常考慮以下因素來指導脂質的選擇，例如，脂質體尺寸、血流 中脂質體的酸不穩定性和穩定性。可獲得用於製備脂質體的多種方法，其描述於例如Szoka等人(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467，美國專利第4,235,871號、第4,501,728號和第4,837,028號。

利用一種或多種生理學上可接受的載體或賦形劑，通過標準技術可製備用於本發明中的藥物組合物或藥物。合適的藥物載體在本文和E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中有描述。可以將本發明的化合物和藥劑及他們的生理學上可接受的鹽及溶劑化物配製為用於通過任何合適的途徑進行給藥，包括吸入給藥、局部給藥、經鼻給藥、經口給藥、腸胃外給藥或直腸給藥。

用於局部給藥的典型劑型包括乳膏、軟膏、噴霧、洗液和膏藥。然而，藥物組合物可以被配製成用於任何類型的給藥，例如，利用注射器或其他裝置的皮內注射、皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射、鼻內注射、大腦內注射、氣管內注射、動脈內注射、腹膜內注射、膀胱內注射、胸膜內注射、冠狀動脈內或腫瘤內注射。還考慮了通過吸入(例如，氣霧劑)給藥或口服給藥、直腸給藥或陰道給藥的劑型。

2. 給藥途徑

用於局部施加於例如皮膚和眼部的合適劑型，優選本領域內公知的水性溶液、軟膏、乳膏或凝膠。這種劑型可以含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩衝劑和防腐劑。

用於經皮施加的合適劑型，包括伴隨載體的有效量本發明的調節劑。優選的載體包括可吸收的、藥學上可接受的溶劑，以有助於透過宿主皮膚。例如，透皮裝置採用繃帶的形式，所述繃帶包括支持構件、容納化合物和任選的載體的貯存器，任選的速率控制屏障，以及將所述裝置固定於皮膚的器具，其中所述速率控制屏障能以受控和預定的速率在長的時間段內將化合物遞送至宿主皮膚。還可以使用基質透皮劑型。

對於口服給藥，藥物組合物或藥物可以採用例如用藥學上可接受的賦形劑通過常規方式製備的片劑或膠囊形式。優選的是包含以下物質的片劑和明膠膠囊：活性成分(即抑制劑或激活劑)，以及(a)稀釋劑或填充劑，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素(例如，乙基纖維素、微晶纖維素)、糖膠、果膠、聚丙烯酸酯和/或磷酸氫鈣、硫酸鈣，(b)潤滑劑，例如，矽石、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、金屬硬脂酸鹽、膠體二氧化矽、氫化植物油、玉米澱粉、苯甲酸鈉、醋酸鈉和/或聚乙二醇；對於片劑，還可以包含(c)黏合劑，例如，矽酸鎂鋁、澱粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或羥丙基纖維素；如果需要，還可以包含(d)崩解劑，例如，澱粉(例如，馬鈴薯澱粉或澱粉鈉)、乙醇酸鹽(酯)、瓊脂、褐藻酸或其鈉鹽、或起泡混合物，(e)潤濕劑，例如，月桂基硫酸鈉，和/或(f)吸收劑、著色劑、芳香劑和甜味劑。

還可以根據本領域內已知的方法，用薄膜包被片劑或用腸衣包被片劑。用於口服給藥的液體製劑，可以採用例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或者可以將他們提供為乾的產品，用於在使用前用水或其他合適介質復原。使用藥學上可接受的添加劑，通過常規方式可製備這種液體製劑，所述添加劑為例如，懸浮劑，例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食脂肪；乳化劑，例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠；非水性介質，例如，杏仁油、油酯、乙醇或分級的植物油；以及防腐劑，例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸。視情況而定，所述製劑還可以含有緩衝鹽、芳香劑、著色劑和/或甜味劑。需要時，口服給藥的製劑可以被適當配製以實現活性化合物的控釋。

本發明的化合物和藥劑，可以配製成通過注射用於腸胃外給藥，例如通過快速推注或連續輸注。可以以單位劑量形式提供用於注射的劑型，例如，添加了防腐劑的安瓿或多劑量容器。可注射的組合物優選是水性等滲溶液或懸浮液，並且優選為由脂肪乳劑或懸浮液製備的栓劑。組合物可以是無菌的和/或含有佐劑，如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進劑、調節滲透壓的鹽和/或緩衝劑。或者，活性成分可以為粉末形式，在使用前用合適的介質(例如，無菌無熱原的水)復原。此外，他們還可以含有其他有治療價值的物質。分別按照常規的混合、粒化或包被方法來製備組合物，且組合物含有約0.1%至75%，優選約1%至50%的活性成分。

為了通過吸入給藥，使用合適的推進劑，可從加壓包或或噴霧器中以氣霧劑噴霧的方式便利地遞送活性成分，所述推進劑例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。就加壓氣霧劑而言，通過提供閥可以確定劑量單位，以遞送計量的量。例如，在吸入器或吹入器中使用的明膠膠囊或明膠盒，可以被製備成含有化合物和合適的粉末基質(例如，乳糖或澱粉)的粉末混合物。

還可以將調節劑配製在直腸組合物中，例如，栓劑或保留灌腸劑，例如，含有常規的栓劑基質，例如，可可油或其他甘油酯。

此外，可以將活性成分配製成貯庫製劑。這種長效劑型可以通過植入(例如，皮下或肌肉內)或肌肉內注射來給藥。因此，例如，活性成分可以與合適的聚合材料或疏水材料(例如作為可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂一起配製，或者可以被配製成難溶的衍生物，例如，難溶性鹽。

在一些情況下，本發明的藥物組合物或藥物包含：(i)有效量的如本文所述的化合物，其抑制或促進本文鑑定的一種或多種相關細菌物種的群體，和(ii)另一種治療劑。當與本發明的化合物一起使用時，所述治療劑可以單獨使用、依次使用或與一種或多種其他這類治療劑(例如，第一治療劑、第二治療劑和本發明的調節劑)聯合使用。可以通過相同或不同的給藥途徑進行給藥或可以在同一藥物 製劑中進行給藥。

3. 劑量

可以以能預防、治療或控制本文所述的結腸癌的治療有效劑量給予個體藥物組合物或藥物。以足以引起個體中有效的治療反應的量給予藥物組合物或藥物。

所給予的活性劑的劑量取決於個體的體重、年齡、個體狀況、待治療的區域的表面積或體積以及給藥形式。劑量大小還由具體個體中具體化合物的給藥所伴隨的任何不良反應的存在、性質和程度來決定。例如，每種類型的抑制劑或編碼抑制劑的核酸都可能具有獨特的劑量。用於向約50至70kg的哺乳動物口服給予單位劑量，可以含有約5至500mg的活性成分。通常，本發明的活性化合物的劑量是足以實現期望效應的劑量。最佳給藥方案可以從個體體內藥劑累積的測量值來計算。通常，可以每天、每週、或每月一次或多次地給予劑量。本領域技術人員能夠容易地確定最佳劑量、給藥方法和重複率。

為了實現期望的治療效應，可以以治療有效的每日劑量分多日給予化合物或藥劑。因此，治療有效地給予化合物以治療個體中本文所述的相關疾病狀態或疾病，需要持續3天至兩周或更長時間的週期性(例如，每日)給藥。通常，藥劑的給藥持續至少連續3天，通常至少連續5天，更通常至少連續10天，有時連續20、30、40或更多天。儘管連續的每日給藥是達到治療有效劑量的優選途徑，但是， 即使沒有每天給予藥劑也能實現治療有利效應，只要足夠頻繁地重複給藥以維持個體中藥劑的治療有效濃度。例如，可以每隔一天、每三天給予藥劑，或者如果使用更高的劑量範圍並且能被個體所耐受，則每週給予一次。

所述化合物或藥劑的最佳劑量、毒性或治療功效，可以隨個體化合物或藥劑的相對效力而不同，並且可以通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥學方法來測定，例如，通過測定LD₅₀(導致50%的群體死亡的劑量)和ED₅₀(在50%的群體中治療有效的劑量)。毒性效應和治療效應的劑量比是治療指數，且可以表示為比值LD₅₀/ED₅₀。優選表現出大的治療指數的藥劑。儘管可以使用表現出毒副作用的藥劑，但是應當考慮設計能將這類藥劑靶向涉及組織位元點的遞送系統，從而使對正常細胞的潛在破壞最小化，進而降低副作用。

例如，從細胞培養測定和動物研究獲得的資料，可以用於制定人類中使用的劑量範圍。這類化合物的劑量優選位於包括ED₅₀但具有較小毒性或沒有毒性的迴圈濃度範圍內。劑量可以在該範圍內變化，這取決於所用的劑量形式和給藥途徑。對於本發明方法中所用的任何藥劑，首先可以從細胞培養測定中估算治療有效劑量。可以在動物模型中制定劑量，以實現包括在細胞培養中所測定的IC₅₀(能實現症狀最大抑制的一半的藥劑濃度)的迴圈血漿濃度範圍。這些資訊可用於更精確地確定人類可用的劑量。例如，可以通過高效液相層析(HPLC)測量血漿中的水準。通 常，對於典型的個體，藥劑的劑量當量為約1ng/kg至100mg/kg。

提供了本文所述的抑制劑或編碼抑制劑的核酸的示例性劑量。當採用IV給藥時，編碼抑制劑的核酸(例如表現載體)的劑量可以為0.1-0.5mg(例如，5-30mg/kg)。可以以5-1000mg口服給予小的有機化合物抑制劑，或以10-500mg/ml靜脈內輸注小的有機化合物抑制劑。可以按照以下量通過靜脈內注射或輸注給予多肽抑制劑：50-500mg/ml(120分鐘的時間內)；1-500mg/kg(60分鐘的時間內)；或1-100mg/kg(快速推注)，每週5次。可以以10-500mg皮下給予調節劑；以0.1-500mg/kg每天兩次，或約50mg每週一次，或25mg每週兩次，靜脈內給予調節劑。

可以單獨給予本發明的藥物組合物，或可以將其與至少一種其他治療性化合物聯合給藥。示例性的有利的治療性化合物，包括全身和局部抗炎藥、止疼藥、抗組織胺藥、麻醉化合物等。其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，或者甚至在同一組合物中進行給藥。還可以在單獨的組合物中，或以與主要的活性成分不同的劑量形式，單獨給予其他治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其他治療性化合物同時給藥，而其他劑量可以單獨給藥，這取決於腸細菌群體的具體發現和個體的特徵。

可以在治療過程中，根據各種因素(包括患者腸細菌群體的分佈和對治療方案的生理應答)來調整本發明藥物組合物的劑量。本領域技術人員通常參與這種治療方案的 調整。

VII. 試劑盒和裝置

本發明提供了用於實施本文所述方法的組合物和試劑盒，以評估從受試者獲得的糞便樣品中一種或多種相關細菌物種的水準。例如，可以分析一種或多種指示相關細菌物種的基因標誌物，用以檢測或診斷結腸癌的存在，確定發展成結腸癌的風險，並監測患者結腸癌的發展，使得可以例如通過手術、化學療法和/或放射療法來治療患者。在預防性治療的情況下，尚未發展成結腸癌但被認為後續具有發展成疾病的風險增加的患者，可以接受包含相關細菌物種的一種或多種調節劑(抑制劑和/或激活劑)的藥物。

用於進行分析以確定特定細菌DNA或RNA水準的試劑盒，通常包括至少一種可用於與靶DNA或RNA序列或其互補序列的至少一個區段特異性雜交的寡核苷酸。任選地，用可檢測的部分標記這一寡核苷酸。在一些情況下，試劑盒可以包括至少兩個能用於通過PCR(包括通過RT-PCR)擴增靶細菌DNA或RNA的至少一個區段的寡核苷酸引子。

用於進行分析以確定細菌蛋白質水準的試劑盒，通常包括至少一種可用於與所述蛋白質特異性結合的抗體。任選地，用可檢測的部分標記所述抗體。抗體可以是單株抗體或多株抗體。在一些情況下，試劑盒可以包括至少兩種不同的抗體，一種用於與靶細菌蛋白特異性結合(即一抗體)，另一種用於該一抗體的檢測(即二抗體)，該二抗體通 常與可檢測的部分連接。

通常，試劑盒還包括合適的標準對照。標準對照指示既未患結腸癌也不具有發展成結腸癌的任何增加的風險的健康受試者糞便中發現的所選細菌DNA、RNA或蛋白質的平均水準。在一些情況下，可以以設定值的方式提供此類標準對照。此外，本發明的試劑盒可以提供說明書手冊，以指導使用者分析測試樣品和評價測試受試者中結腸癌的存在或風險。

在另一方面，還可以在一種裝置或包括一個或多個這種裝置的系統中實施本發明，所述裝置或系統能實施本文所述的所有或部分方法步驟。例如，在一些情況下，在收到糞便樣品、評價發展成結腸癌的風險、或監測病況的進展後，所述裝置或系統執行以下步驟：(a)確定樣品中相關細菌物種的量或水準(例如，以測量指示細菌物種的細菌DNA、RNA或蛋白質的量或水準的方式)；(b)將所述量或水準與標準對照值進行比較；以及(c)提供指示如下的結果：受試者中是否存在結腸癌、或受試者是否具有將來發展成結腸癌的風險、或受試者結腸癌病況是否有變化(即，惡化或改善)、或患者是否具有增加的復發結腸癌的可能性(例如在初始診斷和/或治療後)。在其他情況下，在進行步驟(a)且將來自(a)的量或濃度輸入所述裝置之後，本發明的裝置或系統執行步驟(b)和(c)的任務。優選地，所述裝置或系統是部分或完全自動化的。

圖1：qPCR分析的評估。(a)16S rDNA對照的模板量和Cq值之間的相關性。由10個隨機選擇的糞便樣品的混合物連續稀釋的樣品# 1-10的qPCR評估的代表性實例。當最終DNA濃度<10ng/μL(# 4→# 10)時，qPCR結果與模板量良好相關，而>10ng/μL的DNA抑制PCR擴增(# 1→# 3)。(b)內部對照的Cq值與DNA量(n=29)之間的相關性。(c)新的雙重qPCR分析可以使用來自糞便樣品的合適的DNA模板濃度穩定地評估相對靶標豐度。一個實例示出了在一個隨機選擇的具有若干最終DNA濃度<10ng/μL的糞便樣品中，穩定地評估核梭桿菌(Fn)的豐度。(d)在已知具有低和非常低的Fn豐度且最終DNA濃度<10ng/μL的樣品中，穩定地評估Fn豐度，但極低DNA濃度可能導致在低Fn豐度的樣品中的假陰性檢測。

圖2：通過宏基因組學(Metagenomic)方法和qPCR分析，各個標誌物的定量中的良好相關性。(a)通過宏基因組學方法(基因水準，具有所示的基因ID)和qPCR分析，腸道羅斯氏菌(Ri)、克拉魯斯擬桿菌(Bc)、哈撒韋梭菌(Ch)和一種未定義的物種(標記為m7)的定量的相關性。示出了來自宏基因組學研究的相應的基因標誌物數量。(b)通過宏基因組學方法(物種水準)和qPCR分析，核梭桿菌(Fn)的定量的相關性。

圖3：在CRC患者的診斷中定量檢測糞便細菌標誌物。(a)在第一群組的健康對照受試者(n=200)和CRC患者(n=170)之間，糞便樣品中核梭桿菌(Fn)、克拉魯斯擬桿菌(Bc)、腸道羅斯氏菌(Ri)、哈撒韋梭菌(Ch)和一個未定義的物種(標記為m7)的豐度不同。(b)區分群組-I中CRC患者與健康對照受試者的標誌物Fn、Ch、m7、Bc和Ri的接受者操作特徵(ROC)曲線。(c)來自獨立群組-II的33個CRC患者和36個健康受試者的糞便樣品中的Fn豐度，以及在該群組中區分CRC患者與健康對照受試者的Fn的相應ROC曲線。具有四分位範圍的中位數，通過Tukey法示於箱鬚圖(box and whisker plots)中。

圖4：四種標誌物的組合示出了針對CRC的改善的診斷能力。(a)在第一群組中，四種選擇的細菌標誌物候選者(包括核梭桿菌(Fn)、克拉魯斯擬桿菌(Bc)、哈撒韋梭菌(Ch)和一種未定義的物種(標記為m7))的簡單線性組合、三種選擇的細菌(Fn、m7和Bc)、單獨Fn和邏輯回歸模型的概 率圖值的ROC曲線。(b)與第一群組的健康對照受試者相比，CRC患者中的Fn和四細菌(Fn、Bc、Ch和m7)的糞便豐度。(c)在獨立第二群組中，四細菌(Fn、Bc、Ch和m7)、三細菌(Fn、m7和Bc)、單獨Fn和邏輯回歸模型的概率圖值的ROC曲線。(d)在群組-II的CRC患者和健康對照受試者中，Fn和四細菌的糞便豐度。具有四分位範圍的中位數通過Tukey法示於箱鬚圖中。

圖5：商業糞便免疫化學測試(FIT)的靈敏度和根據腫瘤-淋巴結-轉移(TNM)期亞群的細菌標誌物。示出了FIT、四細菌(4-細菌)及其組合根據腫瘤期的結腸直腸癌的檢測靈敏度。括弧中的數字是各個類別中參與者的數量。

圖6：使用發明人的便利的平臺，通過兩個實驗者實現了nusG/核梭桿菌定量的良好一致性。

圖7：污染的人類DNA對新的qPCR平臺幾乎沒有影響。(a)對添加有不同濃度人類DNA的10個隨機選擇的糞便樣品的混合物的內部對照進行qPCR評估的代表性實例。(b)對添加有不同濃度人類DNA的隨機選擇的糞便樣品的內部對照和核梭桿菌進行雙重qPCR評估的代表性實例。

提供以下實施例僅用作說明而不是限制。本領域技術人員將容易地認識到，可以改變或修改各種非關鍵參數，以產生基本相同或相似的結果。

用於本研究的引子和探針的列表

使用克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌、哈撒韋梭菌、M7和核梭桿菌作為CRC的糞便標誌物

腸道微生物群是結腸直腸癌(CRC)發展中的重要病因學因素。本研究的目的是通過巨集基因組測序來評估新鑑定的糞便細菌標誌物候選物對CRC診斷的效用。在本研究中，通過雙重定量PCR(qPCR)分析，在來自兩個獨立群組的439個受試者(203個CRC和236個健康受試者)的糞便樣品中，對五種細菌的豐度進行定量。通過雙重qPCR，在203個CRC患者和236個健康對照的糞便樣品中，檢查通過宏基因組測序鑑定的候選物(包括核梭桿菌(Fn)、克拉魯斯擬桿菌(Bc)、腸道羅斯氏菌(Ri)、哈撒韋梭菌(Ch)和一種未定義的物種(標記為m7))。通過qPCR分析和宏基因組學方法，在各個候選物的定量之間證明了強的正相關性(r=0.801~0.934，全部P<0.0001)。在五個候選者中，CRC中的Fn豐度顯著高於對照(P<0.0001)，接受者操作曲線下面積(AUROC)為0.868(P<0.0001)。在最佳截斷值，在群組I中，Fn將CRC與對照相區分，靈敏度為77.7%，特異性為79.5%。在群組I中，與單獨Fn相比，四細菌(Fn、Bc、Ch和m7)的簡單線性組合顯示出改善的診斷能力(AUROC=0.886，P<0.0001)。這些發現也在獨立群組II中得到證實。特別地，在與糞便免疫化學測試(FIT)組合以檢測CRC時，實現了改善的單獨Fn(靈敏度為92.8%，特異性為79.8%)和四細菌(靈敏度為92.8%，特異性為81.5%)的診斷性能。總之，本研究提供了基於糞便的CRC相關的細菌可作為CRC的新型非侵入性診斷生物標誌物的證據。

引言

結腸直腸癌(CRC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一。包括中國在內的許多亞洲國家在過去十年中CRC發病率增加了2至4倍(1)。腸道微生物群組成的異常，已被認為是在CRC起始和發展中潛在的重要病因學因素(2)。隨著宏基因組測序和焦磷酸測序在腸微生物群研究中的廣泛應用，越來越多的細菌已被確定與CRC的發病率呈正相關(3-7)。最近的研究表明，梭桿菌(尤其是核梭桿菌(Fn))與CRC相關。Fn在CRC患者的糞便和結腸粘膜中富集(3,5,8)，並在結腸直腸癌發生中起重要作用(9,10)。在最近的研究中，在結腸直腸腫瘤發生的不同期，使用16SrRNA測序對人腸道粘膜中的微生物群落進行分類，還發現了梭桿菌在結腸直腸腫瘤中富集(11)。然後，通過使用宏基因組學分析，比較74個CRC患者和54個健康受試者的糞便微生物組，發明人已經鑑定了可以用作CRC的非侵入性生物標誌物的細菌候選物(12)，這包括Fn、克拉魯斯擬桿菌(Bc)、腸道羅斯氏菌(Ri)、哈撒韋梭菌(Ch)、一種未定義的物種(標記為m7)。與Fn不同，其他細菌尚未與CRC相關。此外，將這些細菌候選物轉化應用為診斷生物標誌物，需要使用簡單、具有成本效益和靶向的方法(如定量PCR(qPCR))的進一步研究。

在該研究中，在203個CRC患者和236個對照受試者的大群組中，驗證了基於糞便的細菌候選標誌物，以鑑定作為CRC的新型診斷工具的、具有良好靈敏度和特異性的一 組標誌物。發明人建立了用於定量細菌的基於探針的雙重qPCR分析；與目前可用的測試相比，所涉及的技術易於實施且成本更低。

方法 人類糞便樣品收集

糞便樣品(n=439)收集自兩個獨立的群組，所述群組包括群組I-香港：370個受試者，其由170個CRC患者(平均年齡67.2±11.6歲；100個男性和70個女性)和200個正常對照(59.3±5.8歲；77個男性和123個女性)組成，2009年至2013年間在香港中文大學的威爾斯親王醫院(the Prince of Wales Hospital)(補充表1)，以及群組II-上海：69個受試者，其由33個CRC患者(平均年齡63.4±9.6歲；17個男性和16個女性)和36個正常對照(53.2±12.2歲；10個男性和26個女性)組成，2014年至2015年間在上海交通大學的仁濟醫院(Renji Hospital)(補充表1)。用以收集糞便樣品所招募的受試者包括呈現諸如腸習慣改變、直腸出血、腹痛或貧血症狀的個體，以及如先前宏基因組學研究中進行了結腸鏡篩查的年齡50歲或以上的無症狀個體(12)。在結腸鏡篩查前或結腸鏡篩查後一個月收集樣品，此時腸道微生物組應恢復到基線(13)。排除標準是：1)在過去3個月內使用抗生素；2)素食飲食；3)在過去3個月內有侵入性醫療干預；4)具有任何癌症或腸炎性疾病的既往病史。要求受試者於家中在標準化容器內收集糞便樣品，並立即將樣品存儲在其 家用-20℃冷凍箱中。然後將冷凍樣品置於絕緣聚苯乙烯泡沫容器中並遞送到醫院，並立即儲存在-80℃直到進一步分析。通過結腸鏡檢查和任何所進行的活組織檢查的組織病理學檢查來診斷患者。從所有受試者獲得知情同意書。研究獲得香港中文大學臨床研究倫理委員會和上海交通大學仁濟醫院倫理委員會的批准。

DNA提取

將糞便樣品在冰上解凍，並使用QIAamp DNA Stool Mini Kit，按照製造商的說明書(Qiagen，Hilden，Germany)進行DNA提取。然後用無DNA酶的RNA酶處理提取物以消除RNA污染。使用NanoDrop2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE)，測定DNA的品質和數量。

引子和探針的設計

基於細菌16S rRNA基因中的保守片段，人工設計用於內部對照的引子和探針序列(14)，然後使用PrimerExpress v3.0工具(Applied Biosystems，Foster City，CA)測試他們，用於確定Tm、GC含量和可能的二級結構。簡併位點包括在引子和探針中以增加靶標覆蓋；簡併位點不接近引子的3'末端和探針的5'末端。擴增子靶標是對應的大腸桿菌基因組的nt1063-1193。

選擇通過先前宏基因組測序所鑑定的五個細菌標誌物 候選物用於qPCR定量，包括核梭桿菌(Fn)、克拉魯斯擬桿菌(Bc)、腸道羅斯氏菌(Ri)、哈撒韋梭菌(Ch)、一種未定義的物種(標記為m7)(補充表2)。使用在一個先前的宏基因組研究中以結腸鏡檢查作為分層因素的封閉的獨立Wilcoxon秩和檢驗，通過消除結腸鏡檢查的混雜效應來鑑定這些候選者(12)。Fn也已經被其他人鑑定為在CRC患者中富集(3,5,8)，而其他研究者認為其他四種與CRC沒有關聯。使用PrimerExpress設計靶向Fh的nusG基因(登錄號#GMHS-1916)和我們先前的基因組測序研究中鑑定的基因標誌物(包括Bc(ID m370640)、Ch(ID m2736705)、Ri(ID m181682)和m7(ID m3246804))的引子和探針序列(12)。引子-探針組特異性檢測出預期靶標，而不檢測由Blast搜索確認的任何其他已知序列。各個探針攜帶有5'報告染料FAM(6-羧基螢光素)或VIC(4,7,2'-三氯-7'-苯基-6-羧基螢光素)和3'淬滅染料TAMRA(6-羧基四甲基-羅丹明)。引子和水解探針由Invitrogen(Carlsbad，CA)合成。引子和探針的核苷酸序列列於補充表3中。通過PCR產物的直接Sanger測序，或通過對隨機挑選的TA選殖測序，來確認PCR擴增的特異性。

定量PCR(qPCR)

在黏合密封的MicroAmp快速光學96孔反應板(Applied Biosystems)中，在含有0.3μM的各個引子和0.2μM的各個探針的20μL的TaqMan Universal Master Mix II(Applied Biosystems)的反應體系中，進行qPCR擴增。ABI PRISM 7900HT序列檢測系統的熱迴圈儀參數為，95℃ 10分鐘和(95℃ 15秒，60℃ 1分鐘)×45個迴圈。在每個實驗中都包括陽性/參考對照和陰性對照(H₂O作為範本)。對每個樣品進行三次重複測量。對於所有臨床樣品，使用序列檢測軟體(Applied Biosystems)，並人工設置閾值=0.05且基線從3-15個迴圈來分析qPCR資料。如果他們的陰性對照Cq值<42，則實驗不合格。根據△Cq法進行資料分析，其中△Cq=Cq_靶標-Cq_對照，且豐度=POWER(2，-△Cq)。

糞便免疫化學測試(FIT)

如前所述，使用由中國國家食品藥品管理局認證的HemoSure免疫金標記的FIT浸漬條(WHPM Co.Ltd，北京，中國)(15)。

統計分析

數值適當地都表示為平均值±SD或中值(四分位間距[IQR])。通過Wilcoxon符號秩檢驗或Mann-Whitney U檢驗，確定特異性的細菌豐度的差異。通過T檢驗比較連續的臨床和病理變數，而通過卡方檢驗比較分類變數。使用斯皮爾曼(Spearman)相關係數，以估計細菌豐度和若干感興趣的因素的關聯。使用單變數和多變數線性回歸，估計與CRC診斷獨立相關的因素。使用接受者操作特徵(ROC)曲線，以評估細菌候選物在區分CRC中的診斷價值。應用 邏輯回歸模型以獲得用於估計在所有受試者中CRC發生率的概率圖值。然後構建邏輯回歸模型的ROC曲線。通過Graphpad Prism 5.0(Graphpad Software Inc.，San Diego，CA)或SPSS軟體v17.0(SPSS，Chicago，IL)進行所有測試。將P<0.05視為統計學顯著。

結果 方便且可靠地定量細菌豐度的雙重qPCR分析

為了便於定量細菌含量，發明人設計了簡併引子-探針(VIC標記的)組，其擴增子大小適用於靶向16S rRNA基因的131-bp保守區域的qPCR定量。在核糖體資料庫專案版本10.8中，引子和探針序列覆蓋了大於90%的真細菌群體(14)。使用不同糞便DNA樣品的測試表明，這一內部對照分析能夠在終反應體系中，以小於10ng/μL的DNA模板評估總細菌(圖1a)。較高的模板濃度抑制PCR擴增，這可能是由於從糞便中分離出的DNA中的常見雜質，這是因為從培養的大腸桿菌中提取的純的總DNA，達到至少25ng/μL都沒有觀察到抑制。使用濃度小於10ng/μL的模板，Cq值與Log2 DNA量良好相關(R=0.804)(圖1b)。然後使用VIC標記的內部對照和FAM標記的引子-探針組開發雙重qPCR分析，以便特異性靶向細菌候選物。可以用小於10ng/μL的模板一致地定量單個樣品中靶細菌的相對豐度(圖1c)，但模板濃度應當大於0.1ng/μL以避免在具有低豐度靶細菌的樣品中的假陰性結果(圖1d)。使用發明人的qPCR分析進行 細菌豐度的定量，可以很好地重複(圖6)，並且不受人類DNA污染的干擾(圖7)。這一平臺和明確的實驗條件，可以保證使用雙重qPCR分析來可靠且方便地定量細菌靶標。

通過宏基因組學方法對各個細菌候選物的定量與qPCR分析相關

為了驗證通過qPCR分析測量的基因豐度是否與宏基因組學測序具有可比性，將通過qPCR的受試者亞組(51個CRC和45個對照)中四種細菌候選物(Bc、Ch、Ri和m7)的豐度與宏基因組測序相比較。通過qPCR分析與宏基因組測序相比較，這些細菌中每一種的定量都顯示出強相關性(Spearman R=0.816-0.934；圖2a)。來自Fn的基因標誌物丁醯輔酶A脫氫酶(m1704941；99.13%同一性)，在CRC患者中顯示出僅2.7%的發生率(74個中的39個)；而在物種水準上，Fn在CRC患者中顯示出83.8%的發生率(74個中的62個)(補充表4)，這推斷出對於CRC的診斷而言，在物種水準上Fn好於基因標誌物m1704941。因此，發明人建立了靶向Fu的nusG基因(據報導，其在結腸直腸腫瘤中比在匹配的正常樣品中轉錄更有活性(5))的雙重qPCR分析，以評估Fn對於CRC的診斷價值。通過宏基因組測序，這一qPCR分析顯示出在物種水準上與Fn的良好相關性(圖2b)，這表明靶向nusG的qPCR可以覆蓋更多的Fn株，並且可以在檢測CRC中更靈敏。

與健康對照相比，在CRC患者中，Fn、Ch和m7的豐 度顯著升高，且Bc和Ri的豐度降低

通過qPCR定量，與健康對照(n=200)(P<0.0001；圖3a和表1)相比，CRC患者(n=170)中糞便Fn的豐度明顯更高。此外，與對照受試者相比，CRC患者中Ch(P<0.0001)和m7(P<0.0001)的豐度顯著升高，且Bc(P<0.05)和Ri(P<0.05)的豐度降低。雙變數相關性檢驗顯示出，所有五種細菌的豐度與CRC顯著相關，但與腫瘤-淋巴結-轉移(TNM)分期或腫瘤位置無關(表2)。這五種細菌的發生率，在CRC患者與健康對照受試者之間顯著不同(補充表5)。這些結果共同證實了，這些細菌標誌物候選物在將CRC患者與健康受試者相區分中的潛力。

Fn是用於診斷CRC患者的潛在的非侵入性糞便生物標誌物

在所有五種細菌中，Fn在區分CRC與健康對照中表現出最佳的性能，接受者操作曲線下的面積(AUROC)為0.868(0.831-0.904，95%置信區間；P<0.0001)(圖3b)。在使靈敏度和特異性之和最大化的最佳截斷值，在170個CRC患者和200個健康受試者的第一群組中，Fn可以將CRC與對照相區分，靈敏度為77.7%，特異性為79.5%，陰性預測值(NPV)為80.7%，且陽性預測值(PPV)為76.3%。這在33個CRC患者和36個健康對照的第二獨立群組中得到了進一步驗證。與健康對照相比，CRC患者中的Fn豐度顯著更高(P=0.012)(圖3c)。作為區分CRC患者與對照受試者的單一因素，糞便Fn的AUROC為0.675(0.545-0.804； P=0.013)。在第二群組中，Fn的最佳截斷值可以區分CRC與對照，靈敏度為81.8%，特異性為52.8%，NPV為76.0%，PPV為61.4%。

Fn、m7、Bc和Ch的組合改善了單獨Fn對CRC患者的診斷能力

線性回歸分析顯示出，Fn、m7和Bc的豐度與CRC診斷顯著相關(所有P<0.05)，且Ch的豐度與CRC略微相關(P=0.073)，而Ri的豐度與CRC之間的關聯不顯著(表3)。因此，評估三種(Fn、m7和Bc)或四種(Fn、m7、Bc和Ch)細菌用於診斷CRC的能力。在第一群組中發現，與三細菌(0.877)、單獨Fn(0.868)以及包括所有四種細菌的邏輯回歸模型(0.869)相比，四細菌的簡單線性組合(0.886)使AUROC增加(圖4a)。與健康對照相比，CRC患者中四細菌的組合豐度顯著更高(P<0.0001)(圖4b)。在最佳截斷值，這組四細菌(Fn、m7、Bc和Ch)可以區分CRC患者和健康對照，靈敏度為77.7%，特異性為81.5%，NPV為81.1%，PPV為78.1%，其比單獨Fn表現出更好的診斷性能(表4)。在第二獨立群組中，進一步驗證了四細菌的改善的性能。與三細菌(0.731)、單獨Fn(0.675)或邏輯回歸模型(0.746)相比，四細菌的組合還表現出增加的AUROC(0.756)(圖4c)。CRC患者中四細菌的組合豐度顯著高於健康對照(P=0.0002)(圖4d)。在最佳截斷值，這組細菌可以區分CRC與對照，靈敏度為84.9%，特異性為61.1%，NPV為81.5%，PPV為66.7%，這也顯示出比單獨Fn更好的診斷性 能。因此，在區分CRC與健康對照時，Fn、m7、Bc和Ch的細菌組可以提高單獨Fn的診斷能力。

細菌標誌物與FIT的組合改善了單獨細菌對CRC患者的診斷能力

對111個CRC患者和119個對照受試者的糞便樣品進行FIT。發現70.3%(78/111)的CRC患者的糞便樣品顯示出FIT陽性。在此CRC患者的亞群組中，FIT的檢測率小於單獨Fn(82.0%)或四細菌組(83.8%)(通過卡方，兩者均P<0.05)的定量。FIT與TNM分期略微相關(P=0.084)，而四細菌或單獨Fn的豐度與TNM分期不相關(補充表6)。根據TNM期亞群，癌症檢測的比較結果證明，與I期癌症的FIT相比，細菌標誌物的定量顯示出顯著更高的靈敏度(圖5)。還觀察到相比通過FIT，通過細菌對II期和III期癌症的檢測率更高，但對晚期IV期癌症則並非如此。這些結果表明，對於CRC(尤其是對於早期CRC)的檢測，細菌標誌物的定量比FIT顯著更靈敏。

細菌標誌物與FIT的組合顯著地將Fn的靈敏度從82.0%提高至92.8%，將四個細菌的靈敏度從83.8%提高至92.8%，隨之改善PPV和NPV並幾乎不改變特異性(表5)。根據TNM分期，對於I、II和III期癌症，相比單獨使用FIT，細菌標誌物與FIT的組合顯示出顯著更高的靈敏度(圖5)。這些結果表明，對於CRC患者的非侵入性診斷價值而言，細菌標誌物和FIT的組合具有最佳的靈敏度和特異 性。

討論

根據最新的對於CRC篩選的亞太共識性建議，將FIT應用於選擇結腸鏡檢查高風險的患者(16)。FIT已廣泛應用於世界其他地區(17)。然而，根據Lee等人最近的系統性綜述和元分析，FIT的靈敏度在CRC中受限[0.79(95%CI，0.69至0.86)]，並且在各種研究中存在很大差異(17)。然而，FIT的廣泛應用使得容易獲得糞便樣品。在糞便樣品中檢測分子生物標誌物用於非侵入性診斷CRC，這可能是比在目前臨床中實施的血液/血漿生物標誌物更有前途的一種替代。隨著焦磷酸測序和宏基因組測序在微生物群領域的廣泛應用，越來越多的CRC相關細菌被確定，其中包括發明人所確定的那些(12)。迫切需要驗證這些候選標誌物，並通過靶向定量方法來評估其臨床應用價值。

為了開發方便且可靠的用於針對細菌候選物的有效性和潛在的臨床實施來靶向定量細菌候選物的方法，建立了用於在糞便樣品中定量的qPCR平臺。基於可獲得的所有16S rRNA基因的保守序列，設計靶向16S rRNA基因的引子-探針組(14)，以保證足夠的覆蓋並適合於qPCR的擴增子大小(小於150bp)。這一內部對照被證實能很好地代表不同樣品中的細菌DNA含量。然後，基於探針的雙重qPCR分析允許在各個樣品的相同反應中檢測內部對照和 靶標，以節省試劑和樣品，並產生更可靠的資料。通過△Cp法計算相對於總細菌含量的靶標誌物豐度。本發明人首次定義了應受限制的DNA模板濃度(小於10ng/μL)以避免由糞便DNA引起的抑制效應，且大於0.1ng/μL以避免使用發明人的雙重qPCR分析的靶標的假陰性評估。通過宏基因組學方法和qPCR分析，在細菌候選物的定量中進一步顯示出良好的相關性。因此，雙重qPCR分析是可靠且方便的，並且在靶細菌的定量檢測中具有極大的臨床應用價值。

使用這一平臺，進一步證實了Fn作為用於基於糞便的CRC診斷的生物標誌物的潛在價值。CRC患者中糞便Fn的豐度顯著高於健康對照受試者。作為區分CRC患者與健康受試者的單一因素，在170個CRC患者和200個健康對照受試者的第一群組中，Fn具有77.7%的靈敏度和79.5%的特異性。還顯示出，相比對照受試者，CRC患者中Bc、Ri、Ch和m7的糞便豐度顯著增加或減少，這與宏基因組學研究的結果相一致。儘管由於CRC患者或對照受試者中的發生率受限，這些單個細菌的區分CRC患者與健康受試者的能力受到限制，但發現將Bc、Ch和m7的豐度與Fn的豐度組合，可以改善Fn對CRC的診斷能力。Ri的豐度沒有提高Fn對CRC的診斷能力，並且其在進一步的分析中被排除。在使靈敏度和特異性之和最大化的最佳截斷值處，在370個受試者的第一群組中，組合的四細菌組具有77.7%的靈敏度和81.5%的特異性。重要的是，還在CRC患者和健康 對照的糞便樣品的第二獨立群組中，驗證了用於診斷CRC的Fn和四細菌標誌物的組合(Fn、Bc、Ch和m7)。

與FIT相比，發現細菌標誌物在CRC(尤其是早期CRC)診斷的靈敏度上更為優越。令人感興趣的是，在II期和III期中的16個和15個樣品分別在細菌標誌物或FIT中顯示出陽性(補充表7)，總計達到II期和III期案例的36.5%。結合在細菌標誌物和FIT中顯示為陽性的60%的案例(II：26/42和III：25/43)，細菌與FIT的組合檢測到了96.5%的II期和III期CRC。已顯示，巨集基因組分析與標準糞便隱血試驗(FOBT)的結合改善了CRC檢測的靈敏度(18)。因此，可以預期，在CRC的非侵入性診斷中，細菌標誌物定量分析與廣泛應用的FIT的結合，可以提高診斷靈敏度。

Bc是2010年從人類糞便中分離的革蘭氏陰性、專性厭氧、非孢子形成的棒狀細菌物種(19)。Ch是嚴格缺氧、革蘭氏陽性、孢子形成的桿狀細菌，其使用碳水化合物作為可醱酵受質參與葡萄糖代謝，以產生乙酸鹽、乙醇、二氧化碳和氫(20)。與已知促進CRC腫瘤發生的得到良好表徵的Fn不同，Ri、Bc或m7的豐度改變是否在CRC發展中起致病作用或是否是CRC發生的結果，需要進一步研究。

總之，單獨Fn的定量可以作為具有中等靈敏度和特異性的CRC的非侵入性診斷方法。四種細菌標誌物(Fn、Bc、Ch和m7)的組合，改善了單獨Fn對CRC的診斷能力。此外，細菌標誌物和FIT的組合，對CRC(尤其是對早期CRC)診斷顯示出最佳的靈敏度和特異性。因此，基於糞 便的細菌標誌物檢測，可作為CRC患者的新型非侵入性診斷方法。

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本申請所引用的所有專利、專利申請和其他出版物(包括GenBank登錄號)，出於所有目的通過引用以其整體併入本文。

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 腸道羅斯氏菌(Roseburia intestinalis)

<400> 1

<210> 2

<211> 1161

<212> DNA

<213> 克拉魯斯擬桿菌(Bacteroides clarus)

<400> 2

<210> 3

<211> 1935

<212> DNA

<213> 拉氏梭菌(Lachnoclostridium sp.)

<400> 3

<210> 4

<211> 930

<212> DNA

<213> 微單胞菌(Parvimonas micra)

<400> 4

<210> 5

<211> 687

<212> DNA

<213> 核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)

<400> 5

<210> 6

<211> 627

<212> DNA

<213> 哈撒韋梭菌(Clostridium hathewayi)

<400> 6

<210> 7

<211> 1305

<212> DNA

<213> m7

<400> 7

<210> 8

<211> 504

<212> DNA

<213> 未知

<400> 8

<210> 9

<211> 750

<212> DNA

<213> 卵形瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)

<400> 9

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<211> 594

<212> DNA

<213> 未知

<400> 10

<210> 11

<211> 708

<212> DNA

<213> 未知

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<210> 12

<211> 1401

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<213> 普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)

<400> 12

<210> 13

<211> 777

<212> DNA

<213> Ruminococcus bicirculans

<400> 13

<210> 14

<211> 858

<212> DNA

<213> 普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)

<400> 14

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<211> 945

<212> DNA

<213> 普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 未知

<400> 17

<210> 18

<211> 816

<212> DNA

<213> 梅毒螺旋體(Treponema sp.)

<400> 18

<210> 19

<211> 432

<212> DNA

<213> 未知

<400> 19

<210> 20

<211> 873

<212> DNA

<213> 未知

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Claims (33)

1. 一種評估受試者的結腸癌風險的方法，其包括以下步驟：(a)定量確定取自所述受試者的糞便樣品中的克拉魯斯擬桿菌( Bacteroides clarus)、腸道羅斯氏菌( Roseburia intestinalis)和哈撒韋梭菌( Clostridium hathewayi)中至少一種的水準；(b)將步驟(a)中獲得的水準與標準對照進行比較；(c)將在步驟(a)中獲得的水準確定為相對於標準對照增加或降低；和(d)將所述受試者確定為具有增加的結腸癌風險。
2. 如請求項1所述的方法，其中步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質的水準。
3. 如請求項2所述的方法，其中步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA的水準。
4. 如請求項2所述的方法，其中步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌和哈撒韋梭菌中每一種為特有的DNA的水準，任選地還包括確定對於核梭桿菌( Fusobacterium nucleatum)為特有的DNA的水準。
5. 如請求項4所述的方法，其中步驟(a)包括確定基因標誌物m1704941( Fn)、m2736705( Ch)、m3246804( m7)和m370640( Bc)的水準，任選地還包括確定基因標誌物m181682( Ri)的水準。
6. 如請求項5所述的方法，其中在步驟(c)中將m1704941( Fn)、m2736705( Ch)和m3246804( m7)確定為增加，並且在步驟(c)中將m370640( Bc)和m181682( Ri)確定為降低。
7. 如請求項2所述的方法，其中步驟(a)包括多核苷酸擴增反應。
8. 如請求項7所述的方法，其中所述多核苷酸擴增反應是聚合酶鏈式反應(PCR)，優選定量PCR。
9. 如請求項1所述的方法，其中當所述受試者被確定為具有增加的結腸癌風險時，還包括使用來自所述受試者的後續時間的另一糞便樣品在後續時間重複步驟(a)，其中與最初的步驟(a)的水準相比，重複的步驟(a)獲得的水準的增加表明結腸癌風險升高，且降低表明結腸癌風險下降。
10. 如請求項1所述的方法，其中當所述受試者被確定為具有增加的結腸癌風險時，還包括向所述受試者施用有效量的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的抑制劑或激活劑的步驟。
11. 一種檢測受試者的結腸癌的試劑盒，其包括(1)標準對照，其提供糞便樣品的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的平均量；和(2)試劑，其特異性且定量地鑑定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質。
12. 如請求項11所述的試劑盒，其中所述試劑是特異性結合所述DNA或RNA的多核苷酸探針，或所述試劑是特異性結合所述蛋白質的抗體。
13. 如請求項12所述的試劑盒，其中所述試劑是特異性結合克拉魯斯擬桿菌和哈撒韋梭菌中每一種特有的DNA的多核苷酸探針，任選地所述試劑還包括特異性結合核梭桿菌特有的DNA的多核苷酸探針。
14. 如請求項12所述的試劑盒，其中所述試劑特異性且定量地鑑定基因標誌物m1704941( Fn)、m2736705( Ch)、m3246804( m7)和m370640( Bc)，任選地所述試劑特異性且定量地鑑定基因標誌物m181682( Ri)。
15. 如請求項11所述的試劑盒，其中所述試劑包含可檢測部分。
16. 如請求項11所述的試劑盒，其還包含兩個一組的寡核苷酸引子以用於在擴增反應中從RNA或其互補物特異性擴增DNA或逆轉錄DNA的至少一段或全長。
17. 如請求項11所述的試劑盒，其中所述兩個一組的寡核苷酸引子選自實施例2的補充表3。
18. 如請求項11所述的試劑盒，其還包括操作手冊。
19. 一種下述物質在製備檢測受試者的結腸癌的試劑盒的用途：(1)標準對照，其提供糞便樣品的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的平均量；和(2)試劑，其特異性且定量地鑑定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質。
20. 如請求項19所述的用途，其中所述試劑是特異性結合所述DNA或RNA的多核苷酸探針，或所述試劑是特異性結合所述蛋白質的抗體。
21. 一種在受試者中降低發展結腸癌細胞的風險的方法，其包括：向所述受試者施用有效量的克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的抑制劑或增強劑。
22. 如請求項21所述的方法，其中所述抑制劑針對哈撒韋梭菌。
23. 如請求項21所述的方法，其中所述增強劑針對克拉魯斯擬桿菌和腸道羅斯氏菌中至少一種。
24. 如請求項21所述的方法，其中所述抑制劑是編碼反義RNA、miRNA或siRNA的核酸。
25. 如請求項24所述的方法，其中所述核酸編碼針對基因標誌物m2736705( Ch)的反義RNA、miRNA或siRNA。
26. 一種檢測糞便樣品中克拉魯斯擬桿菌( Bacteroides clarus)、腸道羅斯氏菌( Roseburia intestinalis)和哈撒韋梭菌( Clostridium hathewayi)中至少一種的水準增加或降低的方法，其包括以下步驟：(a)定量確定糞便樣品中克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種的水準；(b)將步驟(a)中獲得的水準與標準對照進行比較；和(c)將在步驟(a)中獲得的水準確定為相對於標準對照 增加或降低。
27. 如請求項26所述的方法，其中所述糞便樣品獲得自受試者，優選獲得自人類受試者。
28. 如請求項26所述的方法，其中步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA、RNA或蛋白質的水準。
29. 如請求項28所述的方法，其中步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌、腸道羅斯氏菌和哈撒韋梭菌中至少一種為特有的DNA的水準。
30. 如請求項28所述的方法，其中步驟(a)包括確定對於克拉魯斯擬桿菌和哈撒韋梭菌中每一種為特有的DNA的水準，任選地還包括確定對於核梭桿菌為特有的DNA的水準。
31. 如請求項30所述的方法，其中步驟(a)包括確定基因標誌物m1704941( Fn)、m2736705( Ch)、m3246804( m7)和m370640( Bc)的水準，任選地還包括確定基因標誌物m181682( Ri)的水準。
32. 如請求項28所述的方法，其中步驟(a)包括多核苷酸擴 增反應。
33. 如請求項32所述的方法，其中所述多核苷酸擴增反應是聚合酶鏈式反應(PCR)，優選定量PCR。