TW201817747A

TW201817747A - 標的組織專一的抗原結合分子

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Publication number: TW201817747A
Application number: TW107103057A
Authority: TW
Inventors: 井川智之; 丹波茂郎; 辰巳加奈子; 清水駿; 門野正次郎
Original assignee: 日商中外製藥股份有限公司
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2018-05-16
Also published as: MX384191B; AU2023229507A1; CN104487457A; EP2857420A4; US20150166654A1; RU2014154067A; KR102677704B1; MX2014014678A; TW201400503A; EP2857420A1; JP7285891B2; CN104487457B; CN107759686A; TWI617578B; DK2857420T3; JP6663941B2; KR20220092644A; KR102413947B1; HK1245300A1; TWI797443B

Abstract

本案發明人等發現藉由創作包含依存於標的組織專一性的化合物濃度而改變對抗原的結合活性的抗原結合分域的抗原結合分子，能解決上述課題。藉由使用本發明之抗原結合分子，能標的組織專一性地治療起因於標的組織之各種疾病。

Description

標的組織專一的抗原結合分子

本發明提供一種抗原結合分子，包含會因應標的組織專一的化合物的濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域，並提供該抗原結合分子之製造方法及篩選方法、以及包含該抗原結合分子之醫藥組合物。

抗體在血漿中之安定性高，副作用也少，所以作為醫藥品受到重視。其中IgG型抗體醫藥已有多數上市，現在也有許多抗體醫藥正在開發(非專利文獻1、及非專利文獻2)。

作為使用抗體醫藥之癌治療藥，至今已認可對抗CD20抗原之Rituximab、對抗EGFR抗原之Cetuximab、對抗HER2抗原之Herceptin等(非專利文獻3)。該等抗體分子係藉由結合於在癌細胞表現之抗原，並利用ADCC等發揮對癌細胞之傷害活性。如此之治療用抗體利用ADCC等之細胞傷害活性，已知依存於在標的細胞表現之抗原之數目(非專利文獻4)，所以，從治療用抗體之效果之觀點，成為標的之抗原之表現量高者較佳。但是抗原表現量即使高，若抗原係表現在正常組織，會對正常細胞發揮ADCC等傷害活性，故副作用會成為大問題。所以，就癌治療藥而言，當作治療用抗體的標的之抗原，宜於癌細胞專一性表現較佳。例如：已知係癌抗原之EpCAM 抗原之抗體分子，雖被認為作為有前景的癌治療藥，但是，EpCAM抗原已知在胰臟也會表現，據報告，實際上在臨床試驗藉由投予抗EpCAM抗體，會因對胰臟之細胞傷害活性而觀察到胰炎的副作用(非專利文獻5)。

受到利用ADCC活性發揮細胞傷害活性之抗體醫藥之成功，已有人報告藉由去除天然型人類IgG1之Fc區之N型糖鏈之岩藻醣而增強ADCC活性(非專利文獻6)、利用天然型人類IgG1之Fc區之胺基酸取代而增強對FcγRIIIa之結合以增強ADCC活性(非專利文獻7)等，以發揮強大之細胞傷害活性之第二世代之改良抗體分子。作為上述NK細胞中介之ADCC活性以外之機制，也有人報告：作為對癌細胞發揮傷害活性之抗體醫藥，將有強力細胞傷害活性之藥物與抗體接合而得之Antibody Drug Conjugate(ADC)(非專利文獻8)、及藉由使癌細胞中補充(recruit)T細胞而發揮對癌細胞之傷害活性之低分子抗體(非專利文獻9)等發揮更強大之細胞傷害活性之改良抗體分子。

如此之發揮更強大細胞傷害活性之抗體分子，即使對抗原表現不多之癌細胞，仍能發揮細胞傷害活性，另一方面，即使對抗原表現少之正常組織也會同樣發揮細胞傷害活性。實際上，相較於對抗EGFR抗原之天然型人類IgG1Cetuximab，對抗CD3與EGFR之雙專一性抗體EGFR-BiTE可藉由在癌細胞補充T細胞而對癌細胞發揮強大的細胞傷害活性並且發揮抗腫瘤效果。另一方面，EGFR在正常組織也會表現，所以，EGFR-BiTE對食蟹猴投予時被認定會出現嚴重的副作用(非專利文獻10)。又，使對抗在癌細胞高表現之CD44v6之抗體結合mertansine而得之ADCbivatuzumab mertansine，由於CD44v6在正常組織也會表現，據認為在臨床會有嚴重的皮膚毒性及肝毒性(非專利文獻11)。

如上，當使用即使對抗原表現少之癌細胞也能發揮強大細胞傷害活性之抗體時，標的抗原須極度癌專一性的表現，但是如Herceptin之標的抗原HER2、Cetuximab之標的抗原EGFR在正常組織也會表現，據認為極度地癌專一性的表現的癌抗原的數目有限。所以，雖能強化對癌之細胞傷害活性，但對於正常組織之細胞傷害作用引起的副作用可能會是問題。

又，最近，藉由抑制有助於癌之免疫抑制之CTLA4而增強腫瘤免疫之Ipilimumab，顯示對轉移性黑色素瘤能延長整體存活(Overall survival)(非專利文獻12)。但是Ipilimumab係將CTLA4以全身性的抑制，所以腫瘤免疫增強，但另一方面，由於全身性免疫活化造成自體免疫疾病狀之嚴重副作用成為問題(非專利文獻13)。

另一方面，作為對付癌以外之疾病的抗體醫藥，藉由抑制發炎性‧自體免疫疾病中的發炎細胞激素發揮治療效果之抗體醫藥為已知(非專利文獻14)。例如以TNF作為標的之Remicade或Humira、及以IL-6R作為標的之Actemra，對於類風濕關節炎發揮高治療效果，但另一方面也已知由於該等細胞激素係全身性的中和，故會有觀察到傳染病之副作用(非專利文獻15)。

作為可應用在第二世代之抗體醫藥之技術已有各種技術開發出來，已有人報告提升效應子機能、抗原結合能力、藥物動態、安定性、或減少免疫原性風險的技術等(非專利文獻16)，但幾乎沒有用以解決如上述副作用之能使抗體醫藥對標的組織專一性作用之技術。例如：針對如癌組織或發炎性組織之病變部位，已有人報告利用使該等標的組織之pH為酸性條件之pH依存性抗體(專利文獻1、及2)。但是癌組織或發炎性組織相較於正常組織之pH之下降(亦即氫離子濃度之上昇)只有少許，製作檢測分子量極小之氫離子濃度之些微上昇並作用之抗體係困難，且同時，有時候破骨細胞骨吸收窩區域等正常組織或成為對象之病變以外之組織其pH也會是酸性條件，將pH條件利用於作為病變部位專一性環境因子據認為仍有許多的課題。另一方面，有人報告：製作藉由以在如癌組織或發炎性組織之病變部位表現之蛋白酶切斷，才發揮抗原結合活性之抗體之方法(專利文獻3)。但是蛋白酶所為之抗體之切斷係不可逆，所以在該病變部位被切斷的抗體會隨著血流回到正常組織，因此造成在正常組織也與抗原結合此種問題。又，據認為如此之蛋白酶之癌專一性也存有問題。所以，為了避免副作用並發揮藥效，在正常組織或血液中不會全身性作用，在病變部位之癌或發炎部位會可逆作用之技術尚為未知。

【先前技術文獻】

【專利文獻】

【專利文獻1】國際公開第WO2003/105757號

【專利文獻2】國際公開第WO2012/033953號

【專利文獻3】國際公開第WO2010/081173號

【非專利文獻】

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【非專利文獻2】The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou AK, Belsey MJ., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396

【非專利文獻3】Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Weiner LM, Surana R, Wang S., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10 (5), 317-327

【非專利文獻4】Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, Shepard HM, Cancer Immunol. Immunotherapy (1993) 37, 255-263

【非專利文獻5】ING-1, a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patients with advanced adenocarcinomas. de Bono JS, Tolcher AW, Forero A, Vanhove GF, Takimoto C, Bauer RJ, Hammond LA, Patnaik A, White ML, Shen S, Khazaeli MB, Rowinsky EK, LoBuglio AF, Clin. Cancer Res. (2004) 10 (22), 7555-7565

【非專利文獻6】Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Satoh M, Iida S, Shitara K., Expert Opin. Biol. Ther. (2006) 6 (11), 1161-1173

【非專利文獻7】Optimizing engagement of the immune system by anti-tumor antibodies: an engineer's perspective. Desjarlais JR, Lazar GA, Zhukovsky EA, Chu SY., Drug Discov. Today (2007) 12 (21-22), 898-910

【非專利文獻8】Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Alley SC, Okeley NM, Senter PD., Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14 (4), 529-537

【非專利文獻9】BiTE: Teaching antibodies to engage T-cells for cancer therapy. Baeuerle PA, Kufer P, Bargou R., Curr. Opin. Mol. Ther. (2009) 11 (1), 22-30

【非專利文獻10】T cell-engaging BiTE antibodies specific for EGFR potently eliminate KRAS- and BRAF-mutated colorectal cancer cells. Lutterbuese R, Raum T, Kischel R, Hoffmann P, Mangold S, Rattel B, Friedrich M, Thomas O, Lorenczewski G, Rau D, Schaller E, Herrmann I, Wolf A, Urbig T, Baeuerle PA, Kufer P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2010) 107 (28), 12605-12610

【非專利文獻11】Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugate bivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma. Riechelmann H, Sauter A, Golze W, Hanft G, Schroen C, Hoermann K, Erhardt T, Gronau S., Oral Oncol. (2008) 44 (9), 823-829

【非專利文獻12】Ipilimumab in the treatment of melanoma. Trinh VA, Hwu WJ., Expert Opin. Biol. Ther., (2012) Apr 14 (doi:10.1517/14712598.2012.675325)

【非專利文獻13】IPILIMUMAB - A NOVEL IMMUNOMODULATING THERAPY CAUSING AUTOIMMUNE HYPOPHYSITIS: A CASE REPORT AND REVIEW. Juszczak A, Gupta A, Karavitaki N, Middleton MR, Grossman A., Eur. J. Endocrinol. (2012) Apr 10 (doi: 10.1530/EJE-12-0167)

【非專利文獻14】The Japanese experience with biologic therapies for rheumatoid arthritis. Takeuchi T, Kameda H., Nat. Rev. Rheumatol. (2010) 6 (11), 644-652

【非專利文獻15】Current evidence for the management of rheumatoid arthritis with biological disease-modifying antirheumatic drugs: a systematic literature review informing the EULAR recommendations for the management of RA. Nam JL, Winthrop KL, van Vollenhoven RF, Pavelka K, Valesini G, Hensor EM, Worthy G, Landewe R, Smolen JS, Emery P, Buch MH., Ann. Rheum. Dis. (2010) 69 (6), 976-986

【非專利文獻16】Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Mol. Cells. (2005) 20 (1), 17-29

本發明係有鑑於此情況而生，其目的在於提供對起因於標的組織之疾病之治療為有用之醫藥組合物、及其有效成分。又，也提供該醫藥組合物及該有效成分之篩選方法以及製造方法。

本案發明人等為了達成上述目的努力研究，並創製了一種抗原結合分子，其包含因應標的組織專一的化合物的濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域。又，本案發明人等發現：該抗原結合分子或包含該抗原結合分子之醫藥組合物對起因於治療標的組織之疾病為有用，而且包含投予該抗原結合分子之步驟對於治療引起標的組織之疾病治療有用、及在製造用以治療標的組織引起之疾病之醫藥時，該抗原結合分子為有用。又，本案發明人等，創作該抗原結合分子之篩選方法及製造方法，乃完成本發明。

亦即，本發明係以下事項；

(1)一種抗原結合分子，其包含因應標的組織專一性的化合物的濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域。

(2)如(1)之抗原結合分子，其中，該標的組織為癌組織。

(3)如(2)之抗原結合分子，其中，該癌組織專一性的化合物，係癌細胞專一的代謝產物、於癌組織浸潤之免疫細胞專一的代謝產物、癌組織之基質細胞專一的代謝產物。

(4)如(1)之抗原結合分子，其中，該標的組織為發炎性組織。

(5)如(4)之抗原結合分子，其中，該發炎組織專一性的化合物，係於發炎性組織浸潤之免疫細胞專一的代謝產物、發炎組織中受傷害之正常細胞專一的代謝產物。

(6)如(1)之抗原結合分子，其中，該化合物係選自於具嘌呤環結構之核苷、胺基酸及其代謝產物、脂質及其代謝產物、或糖代謝之一次代謝產物、菸鹼醯胺及其代謝產物中之至少一種化合物。

(7)如(6)之抗原結合分子，其中，該化合物係選自於腺苷、腺苷3磷酸、肌苷、丙胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、犬尿胺酸、前列腺素E2、琥珀酸、檸檬酸、或1-甲基菸鹼醯胺中之至少一種化合物。

(8)如(1)~(7)中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原為膜型分子。

(9)如(1)~(8)中任一項之抗原結合分子，其係具有中和活性之抗原結合分子。

(10)如(1)~(9)中任一項之抗原結合分子，其係具有細胞傷害活性之抗原結合分子。

(11)如(1)~(10)中任一項之抗原結合分子，其包含Fc區。

(12)如(11)之抗原結合分子，其中，該Fc區係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區。

(13)如(11)之抗原結合分子，其中，該Fc區包含比起天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，對Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合改變Fc區。

(14)如(13)之抗原結合分子，其中，包含該FcγR結合改變Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238 位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位之胺基酸之群組中之至少一種以上之胺基酸係與天然型人類IgG之Fc區之胺基酸為不同之胺基酸。

(15)如(14)之抗原結合分子，包含該FcγR結合改變Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、 228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、 265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、 Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、 315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、 382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、或440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者之群組中之至少一種以上之胺基酸。

(16)如(11)之抗原結合分子，其中，該Fc區係經修飾，使得Fc區之EU編號297位所結合之糖鏈之組成為結合岩藻醣缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或加成有二分化N-乙醯基葡糖胺之Fc區之比例提高。

(17)如(11)、(13)~(16)中任一項之抗原結合分子，其中，該Fc區於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性，比序列編號：5、6、7、或8中之任一者表示之Fc區對FcRn之結合活性增強。

(18)如(17)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257 位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

(19)如(18)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之；238位之胺基酸為Leu、244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或251位之胺基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中之任一者、 257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、Gln、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或Trp中之任一者、309位之胺基酸為Pro、312位之胺基酸為Ala、Asp、或Pro中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、 318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、Asn、或Val中之任一者、380位之胺基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中之任一者382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、 428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、308位之胺基酸為Ile、Pro、或Thr中之任一者之群組中之至少一個以上之胺基酸。

(20)如(1)~(19)中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分域係多重專一性或多重抗原結合位之抗原結合分域。

(21)如(20)之抗原結合分子，其中，該抗原結合分域當中，至少一個抗原結合分域結合之抗原係於癌細胞之細胞膜表現之膜型分子、且至少一個抗原結合分域結合之抗原係於效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子。

(22)如(21)之抗原結合分子，其中，該效應子細胞為NK細胞、巨噬體、或T細胞。

(23)如(21)或(22)之抗原結合分子，其中，於該效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子，係構成TCR之多胜肽、CD2、CD3、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或NKG2D。

(24)如(20)之抗原結合分子，其中，該抗原結合分域之中，至少一個抗原結合分域結合之抗原，係於癌細胞細胞膜表現之膜型分子、且至少一個抗原結合分域結合之抗原係細胞傷害性物質。

(25)如(20)~(24)中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子係抗體片段。

(26)如(1)~(24)任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子為抗體。

(27)如(1)~(7)中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原為可溶型分子。

(28)如(27)之抗原結合分子，其係具有中和活性之抗原結合分子。

(29)如(27)或(28)之抗原結合分子，其包含Fc區。

(30)如(29)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區。

(31)如(29)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係於pH酸性域條件下對FcRn之結合活性，比起序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區對FcRn之結合活性增強之Fc區。

(32)如(31)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257 位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

(33)如(32)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之；238位之胺基酸為Leu、244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或251位之胺基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中之任一者、 257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、Gln、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或Trp中之任一者、309位之胺基酸為Pro、312位之胺基酸為Ala、Asp、或Pro中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、 318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、Asn、或Val中之任一者、380位之胺基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中之任一者382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、 428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、308位之胺基酸為Ile、Pro、或Thr中之任一者群組中之至少一個以上之胺基酸。

(34)如(29)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係於pH中性域下對FcRn之結合活性，比起序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區對FcRn之結合活性增強之Fc區。

(35)如(34)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360 位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位或436位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

(36)如(35)之抗原結合分子，其中，該Fc區，係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之；237位之胺基酸為Met、248位之胺基酸為Ile、250位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Thr、255位之胺基酸為Glu、256位之胺基酸為Asp、Asn、Glu、或Gln中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中之任一者、258位之胺基酸為His、265位之胺基酸為Ala、286位之胺基酸為Ala或Glu中之任一者、289位之胺基酸為His、297位之胺基酸為Ala、303位之胺基酸為Ala、305位之胺基酸為Ala、307位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、308位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中之任一者、311位之胺基酸為Ala、His、或Ile中之任一者、312位之胺基酸為Ala或His中之任一者、314位之胺基酸為Lys或Arg中之任一者、315位之胺基酸為Ala、Asp或His中之任一者、317位之胺基酸為Ala、332位之胺基酸為Val、334位之胺基酸為Leu、360位之胺基酸為His、376位之胺基酸為Ala、380位之胺基酸為Ala、382位之胺基酸為Ala、384位之胺基酸為Ala、385位之胺基酸為Asp或His中之任一者、386位之胺基酸為Pro、387位之胺基酸為Glu、389位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者、424位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、433位之胺基酸為Lys、434位之胺基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為His、Ile、Leu、Phe、Thr、或Val、之群組中之至少一個以上之胺基酸。

(37)如(29)或(31)~(36)中任一項之抗原結合分子，其中，該Fc區係比起對活性型Fcγ受體之結合活性，對抑制型Fcγ受體之結合活性較高之Fc區。

(38)如(37)之抗原結合分子，其中，該抑制型Fcγ受體係人類FcγRIIb。

(39)如(37)或(38)之抗原結合分子，其中，該活性型Fcγ受體，係人類FcγRIa、人類FcγRIIa(R)、人類FcγRIIa(H)、人類FcγRIIIa(V)或人類FcγRIIIa(F)。

(40)如(37)~(39)中任一項之抗原結合分子，其中，包含該Fc區之EU編號表示之238位或328位之胺基酸為與天然型人類IgG之Fc區之胺基酸為不同之胺基酸。

(41)如(40)之抗原結合分子，其中，該Fc區之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu。

(42)如(40)或(41)之抗原結合分子，其中，該Fc區之胺基酸序列之中，選自EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Trp、或Tyr中之任一者、 237位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、267位之胺基酸為Ala、Gln或Val中之任一者、268位之胺基酸為Asn、Asp、或Glu中之任一者、271位之胺基酸為Gly、326位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Leu、Met、Ser或Thr中之任一者、330位之胺基酸為Arg、Lys、或Met中之任一者、323位之胺基酸為Ile、Leu、或Met中之任一者、或296位之胺基酸為Asp、之群組中之至少一個以上之胺基酸。

(43)如(27)至(42)中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子為抗體。

(44)一種如(1)至(43)中任一項之抗原結合分子之製造方法，包含以下步驟：選擇因應標的組織專一性的化合物之濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域。

(45)一種如(1)至(43)中任一項之抗原結合分子之篩選方法，包含以下步驟：選擇因應標的組織專一性的化合物之濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域。

(46)一種醫藥組合物，包含如(1)至(43)中任一項之抗原結合分子。

圖1顯示於低分子不存在之正常環境中，低分子開關抗體(Small molecule switch antibody)不與抗原結合，於低分子以高濃度存在之標的組織，與抗原結合之圖。

圖2顯示低分子藉由夾於低分子抗體與抗原之複合體以發揮開關功能之圖。若低分子不存在，抗體與抗原之交互作用不足，抗體無法與抗原結合，但若低分子存在，藉由夾於抗體與抗原之間，抗體可以與抗原結合。

圖3顯示抗體對人類IL-6之結合之ELISA結果。縱軸為評價由於各低分子之有無所致之各抗體對人類IL-6之結合活性之吸光度值。

圖4顯示100μmol/L犬尿胺酸存在下、不存在下時，A11與4μmol/L人類IL-6之交互作用之感測圖。

圖5顯示評價將1μmol/L之IL-6作為分析物進行60秒交互作用時，對於固定於感測晶片CM5上之A11之結合之回應之變化。縱軸代表IL-6交互作用前後之回應變化(RU)、橫軸代表此時之溶液中含有之犬尿胺酸濃度(μmol/L)。

圖6顯示評價將1μmol/L之IL-6作為分析物進行60秒交互作用時，對於固定於感測晶片CM5上之H01之結合之回應之變化。縱軸代表IL-6交互作用前後之回應變化(RU)、橫軸代表此時之溶液中含有之犬尿胺酸濃度(μmol/L)。

圖7顯示評價將1μmol/L之A11作為分析物進行60秒交互作用時，對於固定於感測晶片CM5上之IL-6之結合之回應之變化。縱軸代表A11交互作用前後之回應變化(RU)、橫軸代表此時之溶液中含有之犬尿胺酸濃度(μmol/L)。

圖8顯示對於固定於感測晶片CM5之IL-6，於100μmol/L犬尿胺酸存在下使A11交互作用，之後於含100μmol/L犬尿胺酸之緩衝條件或不含犬尿胺酸之緩衝條件下，觀察A11從IL6解離之圖。圖縱軸係代表將100μmol/L犬尿胺酸存在下之A11之結合量定為100並標準化之值，橫軸代表從交互作用開始後之經過時間(秒)。

圖9顯示對於固定於感測晶片之IL-6，使800、400、200、100、50、25nmol/L之犬尿胺酸交互作用時之感測圖。圖縱軸係代表犬尿胺酸對IL-6之結合量之變化(RU)(交互作用實驗開始時之回應定為0)、橫軸代表交互作用實驗開始時之經過時間。

圖10顯示對兔免疫使用之腺苷類似物2'-Adenosine-PEG-peptide之結構。

圖11顯示對兔免疫使用之腺苷類似物5'-Adenosine-PEG-peptide之結構。

圖12顯示對兔免疫使用之腺苷類似物之胜肽部分取代為生物素而得之2'-Adenosine-PEG-biotin之結構。

圖13顯示對兔免疫使用之腺苷類似物之胜肽部分取代為生物素而得之5'-Adenosine-PEG-biotin之結構。

圖14顯示各抗體與2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用時之結合量除以各抗體之捕捉量(RU)而得之值(N_binding_100)作為縱軸，2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用後從各抗體解離 2'-Adenosine-PEG-Biotin60秒後之值除以各抗體之捕捉量(RU)而得之值(N_stability_100)作為橫軸之圖。

圖15A顯示選殖體SMB0002與腺苷結合(交互作用)之表面電漿共振分析之感測圖。感測圖從下而上依序表示7.81、31.3、125、500nM之抗原與SMB0002之交互作用。

圖15B顯示選殖體SMB0002與ATP結合(交互作用)之表面電漿共振分析之感測圖。感測圖從下而上依序表示78.1、313、1250、5000nM之抗原與SMB0002之交互作用。

圖15C顯示選殖體SMB0089與腺苷結合(交互作用)之表面電漿共振分析之感測圖。。感測圖從下而上依序表示7.81、31.3、125、500nM之抗原與SMB0089之交互作用。

圖15D顯示選殖體SMB0089與ATP結合之(交互作用)之表面電漿共振分析之感測圖。感測圖從下而上依序表示78.1、313、1250、5000nM之抗原與SMB00089之交互作用。

圖15E顯示選殖體SMB0104與腺苷結合(交互作用)之表面電漿共振分析之感測圖。。感測圖從下而上依序表示7.81、31.3、500nM之抗原與SMB0104之交互作用。

圖15F顯示選殖體SMB0104與ATP結合之(交互作用)之表面電漿共振分析之感測圖。感測圖從下而上依序表示78.1、313、1250、5000nM之抗原與SMB0104之交互作用。

圖16顯示選殖體SMB0171與ATP結合之(交互作用)之表面電漿共振分析之感測圖。感測圖從下而上依序表示5、50μM之抗原與SMB0171之交互作用。

圖17顯示選殖體SMB0002與腺苷及ATP結合之競爭 ELISA之結果。

圖18顯示評價ATP所致抑制ATNLSA1-4_D12對生物素標記抗原(5'-Adenosine-PEG-biotin,ATP-PEG-biotin之混合)結合之能力之圖。

圖19顯示將腺苷或ATP夾於抗體與抗原間，且將與抗原接觸之抗體可變區部分予以庫化，能取得對於任意抗原之腺苷/ATP開關抗體之合理設計抗體庫之概念圖。

圖20顯示將腺苷或ATP夾於抗體與抗原間，能取得對於任意抗原之腺苷/ATP開關抗體之腺苷免疫兔抗體庫之概念圖。

圖21顯示抗體對人類IL-6之結合之ELISA之結果。縱軸代表450nm波長之吸光度值表示之胺基酸及胺基酸代謝物(犬尿胺酸、色胺酸、苯基丙胺酸、鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)、及3-羥基犬尿胺酸、犬尿喹啉酸)之有無所致之各抗體對於人類IL-6之結合活性。

圖22顯示抗體對人類IL-6之結合之ELISA之結果。縱軸代表從450nm波長之吸光度算出之比活性值表示之各低分子(ATP、腺苷、肌苷、PGE2、琥珀酸、乳酸、犬尿胺酸、低分子雞尾酒)之有無所致之I6NMSC1-3_#03抗體對人類IL-6之結合活性。

圖23顯示抗體對人類IL-6之結合之ELISA之結果。縱軸代表從450nm波長之吸光度算出之比活性值表示之各低分子(ATP、腺苷、肌苷、PGE2、琥珀酸、乳酸、犬尿胺酸、低分子雞尾酒)之有無所致之I6NMSC1-3_#17抗體對人類IL-6之結合活性。

圖24顯示抗體對HSA之結合之ELISA之結果。縱軸代表從450nm波長之吸光度算出之比活性值表示之各低分子(ATP、腺苷、肌苷、PGE2、琥珀酸、乳酸、犬尿胺酸、低分子雞尾酒)之有無所致之HSNMSC1-4_#22抗體對HSA之結合活性。

圖25顯示由合理設計抗體庫獲得之選殖體I6DL2C5-4_076對人類IL-6於ATP及/或Adenosine 1mM存在/不存在下之ELISA之結果。縱軸代表評價抗體對人類IL-6之結合活性之吸光度值。陰性對照(Negative Control)，代表使用M13KO7 Helper Phage時之結果。

圖26顯示由合理設計抗體庫獲得之選殖體HSDL3C5-4_015對人類血清白蛋白於ATP及/或Adenosine 1mM存在/不存在下之ELISA之結果。縱軸代表評價抗體對人類血清白蛋白之結合活性之吸光度值。陰性對照(Negative Control)，代表使用M13KO7 Helper Phage時之結果。

圖27顯示由合理設計抗體庫獲得之選殖體6RAD2C1-4_011、及6RAD2C1-4_076對人類IL-6 Receptor於ATP及/或Adenosine(記為ADO)1mM存在/不存在下、及低分子雞尾酒(SC)存在或不存在下之ELISA之結果。縱軸代表評價抗體對人類IL-6 Receptor之結合活性之吸光度值。陰性對照(Negative Control)，代表使用M13KO7 Helper Phage時之結果。

圖28顯示選殖體6RNMSC1-2_F02對人類IL-6R之結合ELISA之結果。縱軸代表評價各低分子之有無所致抗體對人類IL-6R之結合活性之吸光度值。

圖29顯示選殖體6RNMSC1-3_G02對人類IL-6R之結合ELISA之結果。縱軸代表評價各低分子之有無所致抗體對人類IL-6R之結合活性之吸光度值。

圖30顯示抗體對人類IL-6R之結合ELISA之結果圖。縱軸代表評價各胺基酸或胺基酸代謝物之有無所致抗體對人類IL-6R之結合活性之吸光度值。

圖31顯示100μmol/L犬尿胺酸存在下、10mmol/L ATP存在下、犬尿胺酸、ATP不存在下時，6RNMSC1-2_F02與1μmol/L IL-6R之交互作用之感測圖。實線代表犬尿胺酸存在下之交互作用、點線代表ATP存在下之交互作用、及破折線代表該等不存在下之交互作用。

圖32顯示對固定在感測晶片CM5之IL-6R，在100μmol/L犬尿胺酸存在下使6RNMSC1-2_F02交互作用，之後於含100μmol/L犬尿胺酸之緩衝條件或不含犬尿胺酸之緩衝條件下，觀察6RNMSC1-2_F02從IL-6R解離之圖。圖縱軸代表100μmol/L犬尿胺酸存在下之6RNMSC1-2_F02之結合量定為100並標準化之值，橫軸代表交互作用開始後之經過時間(秒)。實線代表犬尿胺酸存在下，6RNMSC1-2_F02從IL-6R之解離，點線代表犬尿胺酸不存在下，6RNMSC1-2_F02從IL-6R之解離。

圖33顯示將5μg/L之6RNMSC1-2_F02作為分析物，使交互作用180秒，評價對於固定於感測晶片CM5上之IL-6R之回應。縱軸代表使6RNMSC1-2_F02交互作用前後之回應之變化(RU)、橫軸代表溶液中含有之犬尿胺酸濃度(μmol/L)。

圖34顯示以FCM評價抗體對膜型人類IL-6R之結合之圖。上段表示犬尿胺酸存在下、下段表示犬尿胺酸不存在下之結果。橫軸表示螢光強度、縱軸表示細胞數。

圖35A顯示低分子存在下，與抗原結合之抗體所致對表現抗原之細胞之ADCC活性。犬尿胺酸存在下，與hIL-6R結合之選殖體6RNMSC1-2_F02所致對在犬尿胺酸存在下(三角)或不存在下(圓)表現hIL-6R之BaF細胞之ADCC活性。白為個別之測定值、黑為平均值。

圖35B顯示低分子存在下，與抗原結合之抗體所致對表現抗原之細胞之ADCC活性。無論犬尿胺酸之有無，與hIL-6R結合之MRA所致對在犬尿胺酸存在下(三角)或不存在下(圓)表現hIL-6R之BaF細胞之ADCC活性。白為個別之測定值、黑為平均值。

圖36顯示低分子存在下，與抗原結合之抗體所致對表現抗原之細胞之ADCC活性。犬尿胺酸存在下，與hIL-6R結合之選殖體6RNMSC1-2_F02所致對在犬尿胺酸存在下(三角)或不存在下(圓)表現hIL-6R之BaF細胞之ADCC活性。橫軸代表犬尿胺酸濃度，縱軸代表ADCC活性(%)。ADCC活性表示平均值與標準偏差。

圖37顯示選殖體6RNMSC1-2_F02在小鼠血清中與人類IL-6R結合之ELISA之結果。縱軸代表評價犬尿胺酸之有無所致抗體對人類IL-6R之結合活性之吸光度之值。

圖38顯示利用合理設計抗體庫獲得之選殖體I6RLSA1-6_011對人類IL-6於ATP及Adenosine 10mM存在或不存在下之ELISA之結果。縱軸代表評價抗體對人類IL-6之結合活性之吸光度之值。陽性對照(Positive Control)，代表使用由合理設計抗體庫獲得，無論低分子有無，顯示對人類IL-6有結合活性之選殖體之結果。陰性對照(Negative Control)代表使用M13KO7 Helper Phage時之結果。

圖39顯示利用合理設計抗體庫獲得之選殖體6RRLSA1-6_037、6RRLSA1-6_045對人類IL-6於ATP及Adenosine 10mM存在或不存在下之ELISA之結果。縱軸代表評價抗體對人類IL-6之結合活性之吸光度之值。陰性對照(Negative Control)代表使用M13KO7 Helper Phage時之結果。

圖40顯示針對合理設計抗體庫，實施4次對於人類IgA-Fc而言利用抗體多價提示噬菌體展示所為之淘選而得之96個選殖體之ELISA之結果。縱軸代表評價於ATP及腺苷不存在下、橫軸代表於存在下抗體對人類IgA-Fc之結合活性之吸光度之值。

圖41顯示針對合理設計抗體庫，實施4次對於人類IgA-Fc而言利用抗體一價提示噬菌體展示所為之淘選而得之96個選殖體之ELISA之結果。縱軸代表評價於ATP及腺苷不存在下、橫軸代表於存在下抗體對人類IgA-Fc之結合活性之吸光度之值。

圖42顯示利用合理設計抗體庫獲得之選殖體IADL3C5-4_048對人類IgA-Fc於ATP及Adenosine 10mM存在或不存在下之ELISA之結果。縱軸代表評價抗體對人類IgA-Fc之結合活性之吸光度之值。陽性對照(Positive Control)，代表使用由合理設計抗體庫獲得，無論低分子有無，顯示對人類IgA-Fc有結合活性之選殖體之結果。陰性對照(Negative Control)代表使用M13KO7 Helper Phage時之結果。

圖43顯示各低分子1mM存在下‧不存在下，使各選殖體1Mm與固定在感測晶片CM5上之IL-6R交互作用120秒時之結合量(Binding response(RU))。

圖44A顯示低分子存在下，與抗原結合之抗體所致對表現抗原之細胞之ADCC活性之圖。於ATP存在下與hIL-6R結合之選殖體6RAD2C1-4_030所致之ATP存在下(三角)或不存在下(圓)之對表現hIL-6R之CHO細胞之ADCC活性。白代表個別之測定值、黑代表平均值。

圖44B顯示低分子存在下，與抗原結合之抗體所致對表現抗原之細胞之ADCC活性之圖。於ATP存在下與hIL-6R結合之選殖體6RAD2C1-4_011所致之ATP存在下(三角)或不存在下(圓)之對表現hIL-6R之CHO細胞之ADCC活性。白代表個別之測定值、黑代表平均值。

圖44C顯示低分子存在下，與抗原結合之抗體所致對表現抗原之細胞之ADCC活性之圖。不論ATP是否存在，與hIL-6R結合之MRA所致之ATP存在下(三角)或不存在下(圓)之對表現hIL-6R之CHO細胞之ADCC活性。白代表個別之測定值、黑代表平均值。

圖45顯示利用合理設計抗體庫獲得之選殖體HSADSA1-6_020對HSA於ATP及Adenosine 10mM存在或不存在下之ELISA之結果。縱軸代表評價抗體對HSA之結合活性之吸光度之值。陽性對照(Positive Control)，代表使用由合理設計抗體庫獲得，無論低分子有無，顯示對HSA有結合活性之選殖體之結果。陰性對照(Negative Control)代表使用M13KO7 Helper Phage時之結果。

以下定義及詳細說明，係為了容易理解在本說明書本發明之說明而提供。

胺基酸

本說明書中，以例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示，將胺基酸以單字母碼或三字母碼、或其兩者表示記載。

胺基酸之改變

為了抗原結合分子之胺基酸序列中之胺基酸之改變，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公眾所知方法。又，作為取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸改變方法，也可採用多數公眾所知之方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等也可理想地使用。

本說明書中，表示胺基酸之改變部位時使用之「及 /或」之用語之意義，包括「及」與「或」適當組合的所有組合。具體而言，例如「33位、55位、及/或96位之胺基酸經取代」，包括以下胺基酸之改變之多樣性；(a)33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位及55位、(e)33位及96位、(f)55位及96位、(g)33位及55位及96位。

又，本說明書中，表示胺基酸改變之表達，可適當使用在表示特定位置之數字前後一併記載胺基酸之單字母碼或3字母碼之表達。例如：對抗體可變區所含之胺基酸施以取代時使用之所謂N100bL或Asn100bLeu之改變，代表將Kabat編號表示之100b位之Asn取代為Leu。亦即，數字係代表Kabat編號表示之胺基酸之位置，在其之前記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表取代前之胺基酸、在其後記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表取代後之胺基酸。同樣地，例如，對抗體不變區所含之Fc區施以胺基酸取代時之稱為P238D或Pro238Asp之改變，係表示EU編號表示之238位之Pro取代為Asp。亦即數字表示EU編號表示之胺基酸之位置，在其前記載之胺基酸單字母碼或3字母碼代表取代前之胺基酸，之後記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表取代後之胺基酸。

抗原

本說明書中，「抗原」只要含有抗原結合分域所結合之抗原決定部位(epitope)即可，其構造不限於特定構造。就其他含意而言，抗原也可為無機物也可為有機物。抗原可列舉如下列分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素(activin)、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、Addressin、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、alpha-1-antitrypsin、alpha-V/beta-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3細胞黏合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3 Osteogenin(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、Bombesin、骨來源神經營養因子(Bone-derived neurotrophic factor)、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、calcitonin、cAMP、癌胎兒抗原(CEA)、癌關連抗原、Cathepsin A、Cathepsin B、Cathepsin C/DPPI、Cathepsin D、Cathepsin E、Cathepsin H、Cathepsin L、Cathepsin O、Cathepsin S、Cathepsin V、Cathepsin X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、 CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)毒素、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、galectin-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、cytokeratin腫瘤關連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、Digoxin、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、endothelin 受體、enkephalinase、eNOS、Eot、eotaxin 1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-selectin、ET-1、第IIa因子、第VII因子、第VIIIc因子、第IX因子、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、ferritin、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、fibrin、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激荷爾蒙、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-alpha1、GFR-alpha2、GFR-alpha3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長荷爾蒙釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB外被糖蛋白、HCMV gH外被糖蛋白、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、heparanase、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤關連抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環圈、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨病毒(HCMV)、人類成長荷爾蒙(hGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1R、 IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干擾素(INF)-alpha、INF-beta、INF-gamma、inhibin、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素狀增殖因子1、細胞黏合素alpha2、細胞黏合素(integrin)alpha3、細胞黏合素alpha4、細胞黏合素alpha4/beta 1、細胞黏合素alpha4/beta 7、細胞黏合素alpha5(alphaV)、細胞黏合素alpha5/beta 1、細胞黏合素alpha5/beta 3、細胞黏合素alpha6、細胞黏合素beta 1、細胞黏合素beta 2、干擾素gamma、IP-10、I-TAC、JE、kallikrein2、kallikrein5、kallikrein6、kallikrein11、kallikrein12、kallikrein14、kallikrein15、kallikreinL1、kallikreinL2、kallikreinL3、kallikreinL4、KC、KDR、角質化細胞增殖因子(KGF)、laminin 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在型TGF-1、潛在型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y關連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-selectin、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺界面活性劑、黃體形成荷爾蒙、lympotoxin beta受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-alpha、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、 Mpo、MSK、MSP、mutin(Muc1)、MUC18、Muller管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cadherin、NCA 90、NCAM、NCAM、neprilysin、neurotrophin-3、-4、或-6、neurturin、神經成長因子(NGF)、NGFR、NGF-beta、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺荷爾蒙、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-Cadherin、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性鹼性磷解酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰島素前體、prorelaxin、proteinC、PS、PSA、PSCA、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、relaxinA鏈、relaxinB鏈、腎素(renin)、呼吸器多核體病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關連糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如T細胞受體alpha/beta)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-alpha、TGF-beta、TGF-beta Pan Specific、TGF-betaRI(ALK-5)、TGF-betaRII、TGF-betaRIIb、TGF-betaRIII、TGF-beta1、TGF-beta2、TGF-beta3、TGF-beta4、TGF-beta5、凝血酶(thrombin)、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激荷爾蒙、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、 TNF、TNF-alpha、TNF-alphabeta、TNF-beta2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、 TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、transferrin受體、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll-like receptor)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、腫瘤關連抗原CA125、腫瘤關連抗原表現Lewis Y關連碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR細胞黏合素、Von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81,CD97,CD98,DDR1,DKK1,EREG、Hsp90,IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、prekallikrein、RON、TMEM16F、SOD1、Chromogranin A、Chromogranin B、tau、VAP1、高分子kininogen、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1,C1q,C1r,C1s,C2,C2a,C2b,C3,C3a,C3b,C4,C4a, C4b,C5,C5a,C5b,C6,C7,C8,C9,factor B、factor D、factor H、properdin、sclerostin、fibrinogen、fibrin、prothrombin、thrombin、組織因子、factor V、factor Va、factor VII、factor VIIa、factor VIII、factor VIIIa、factor IX、factor IXa、factor X、factor Xa、factor XI、factor XIa、factor XII、factor XIIa、factor XIII、factor XIIIa、TFPI、antithrombin III、EPCR、thrombomodulin、TAPI、tPA、plasminogen、plasmin、PAI-1、PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P以及荷爾蒙及成長因子用之受體。作為抗原，宜為在癌組織或發炎性組織之癌細胞‧免疫細胞‧基質細胞等表現之抗原為較佳。

上述抗原例示也有記載受體，但該等受體係於活體液中以可溶型存在的情形，可作為本發明之包含因應標的組織專一性化合物之濃度而與抗原之結合活性改變之抗原結合分域之抗原結合分子所結合之抗原使用。如此之可溶型受體之一非限定態樣，例如：Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之可溶型IL-6R，即由序列編號：1表示之IL-6R多胜肽序列中之1至357號胺基酸構成的蛋白質。

上述抗原之例示，包含於細胞膜表現之膜型分子、及從細胞向細胞外分泌之可溶型分子。本發明之包含因應標的組織專一性化合物之濃度而對抗原之結合活性有改變之抗原結合分域的抗原結合分子，當係與從細胞分泌之可溶型分子結合時，作為該抗原結合分子，宜如後述具有中和活性較理想。

可溶型分子存在之溶液不限定，本可溶型分子能存在於活體液，亦即可存在於充滿活體內之脈管或組織‧細胞之間的所有液體。非限定之一態樣中，本發明之抗原結合分子結合之可溶型分子，可存在於細胞外液。細胞外液，在脊椎動物係指血漿、組織間液、淋巴液、緻密的結締組織、腦脊髓液、髓液、穿刺液、或關節液等骨及軟骨中之成分、肺泡液(支氣管肺泡洗滌液)、腹水、胸水、心囊水、囊泡液、或眼房水(房水)等細胞透過液(細胞之主動輸送‧分泌活動之結果產生的各種腺腔內的液體、及消化管腔等體腔內液)的總稱。

本發明之包含因應標的組織專一性化合物之濃度而對抗原之結合活性有改變之抗原結合分域的抗原結合分子，當與在細胞膜表現之膜型分子結合的情形，作為該抗原結合分子之理想例，可列舉如後述具有細胞傷害活性、或結合細胞傷害性物質或有結合能力之抗原結合分子為理想。又，具有替換細胞傷害活性、或結合細胞傷害性物質或有結合能力之性質，或該性質以外更有中和活性之抗原結合分子，也是非限定之一理想態樣。

抗原決定部位(epitope)

意指抗原中存在之抗原決定基之抗原決定部位，係指本說明書揭示之抗原結合分子中之抗原結合分域所結合之抗原上之部位。因此，例如：抗原決定部位可由其構造定義。又，該抗原決定部位也可由認識該抗原決定部位之抗原結合分子中對抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定部位之胺基酸殘基指定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定部位。

直線狀抗原決定部位，係包含認識胺基酸一次序列的抗原決定部位的抗原決定部位。直線狀抗原決定部位典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如約8至約10個，6至20個胺基酸。

立體構造抗原決定部位，與直線狀抗原決定部位相對照，係指含有抗原決定部位之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如：胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體構造抗原決定部位，可能包含對直線狀抗原決定部位為更多之數之胺基酸。關於立體構造抗原決定部位之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維構造。例如：蛋白質分子折疊形成三維構造時，形成立體構造抗原決定部位之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈，可以並排，抗體可認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體構造之方法，包含例如X射線結晶學、二維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標誌及電磁常磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。

與抗原決定部位結合之抗原結合分域之結構，稱為抗原結合位(paratope)。利用在抗原決定部位與抗原結合位之間作用之氫鍵、靜電力、凡得瓦力、疏水鍵等，使得抗原決定部位與抗原結合位安定結合。此抗原決定部位與抗原結合位間之結合力，稱為親和性(affinity)。多數抗原與多數抗原結合分子結合時之結合力之總和，稱為結合性(avidity)。當包含多數抗原結合分域之(亦即多價之)抗體等結合於多數抗原決定部位時，結合力(affinity)會相乘地作用，因此結合性高於親和性。

結合活性

以下例示確認含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子其對抗原決定部位之結合的確認方法，但是確認含有對抗IL-6R以外之抗原的抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對抗原決定部位之結合的確認方法，也可依照下列例示適當實施。

例如：含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識IL-6R分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成IL-6R之細胞外分域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或，利用IL-6R之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有對IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之ELISA，可評價該抗原結合分子對該胜肽之結合活性。或，依據IL-6R表現細胞中，該抗原結合分子之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確了解該抗原結合分子對線狀胜肽之結合活性。

又，含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識立體構造抗原決定部位之情事，可由以下方式確認。為了上述目的，製備表現IL-6R之細胞。含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子接觸IL-6R表現細胞時，會強力結合於該細胞，另一方面，對於固定化有該抗原結合分子之由構成IL-6R之細胞外分域的胺基酸序列而成的線狀胜肽，實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對人類IL-6R表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。

包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對IL-6R表現細胞之結合活性之測定方法，例如：Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可利用以IL-6R表現細胞為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。

ELISA格式中，包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對IL-6R表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之信號水平而定量評價。亦即，在固定化有IL-6R表現細胞之ELISA板添加待驗抗原結合分子，利用認識待驗抗原結合分子之酵素標記檢測結合於抗體細胞之待驗抗原結合分子。或FACS中，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，決定對IL-6R表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可比較待驗抗原結合分子對IL-6R表現細胞之結合活性。

待驗抗原結合分子對在懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置。

FACSCanto^TM II

FACSAria^TM

FACSArray^TM

FACSVantage^TM SE

FACSCalibur^TM(均為BD Biosciences公司之商品名)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司之商品名)

例如：包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對抗原之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現IL-6R之細胞反應之待驗抗原結合分子的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗原結合分子以適當理想的緩衝液稀釋，可將該抗原結合分子製成所望濃度。例如可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。其次，以FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值(Geometric Mean)。亦即，藉由獲得該幾何平均之值，可測定待驗抗原結合分子之結合量所代表之待驗抗原結合分子之結合活性。

包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子與某抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定部位之彼此競爭而確認。抗原結合分子間之彼此競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如彼此競爭ELISA試驗為較佳的交叉阻斷試驗。

具體而言，交叉阻斷試驗中，塗覆在微滴定板之井上的IL-6R蛋白質，於候選的彼此競爭抗原結合分子存在下或不存在下，預備溫育後，添加待驗抗原結合分子。井中之IL-6R蛋白質所結合之待驗抗原結合分子之量，間接相關於成為彼此競爭之候選的彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之結合之結合能力。亦即，彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之親和性愈大，則對於塗覆有待驗抗原結合分子之IL-6R蛋白質之井的結合活性愈低。

經由IL-6R蛋白質而結合於井之待驗抗原結合分子之量，可藉由預先標記抗原結合分子而輕易測定。例如，經生物素標記之抗原結合分子，可藉由抗生物素(avidin)蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試驗，尤其稱為彼此競爭ELISA試驗。抗原結合分子可以用能檢測或測定之其他標記物質予以標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公眾所知。

比起於不存在候選之彼此競爭抗原結合分子組合體下實施之對照試驗中獲得之結合活性，彼此競爭抗原結合分子若能阻斷包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子之結合至少20%，較佳為至少20-50%，更佳為至少50%，則該待驗抗原結合分子係與彼此競爭抗原結合分子實質上結合於相同抗原決定部位，或對於相同抗原決定部位之結合為彼此競爭之抗原結合分子。

包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子所結合之抗原決定部位在鑑定構造時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由比較兩者之抗原結合分子對於構成該抗原決定部位之胜肽導入有胺基酸變異而成之胜肽之結合活性而予以評價。

如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述ELISA格式中，待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於導入有變異的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該變異胜肽的結合活性，以使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流下該管柱後溶出到溶出液中之抗原結合分子進行定量而測定。使變異胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。

又，當鑑定的抗原決定部位為立體抗原決定部位時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現IL-6R之細胞以及表現對於抗原決定部位導入有變異之IL-6R的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液添加待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定由標記抗體染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之結合活性。

本方法中，例如「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已對於表現變異IL-6R之細胞結合之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST軟體解析。從多胜肽組合體存在下及不存在下之幾何平均值，將其比較值(△幾何平均)依下列計算式1計算，可以求得抗原結合分子之結合所致之螢光強度之增加比例。

(式1)△幾何平均值=幾何平均值(多胜肽組合體存在下)/幾何平均值(多胜肽組合體不存在下)

將由解析獲得之反映待驗抗原結合分子對變異IL-6R表現細胞之結合量的幾何平均比較值(變異IL-6R分子△幾何平均值)，與反映待驗抗原結合分子對IL-6R表現細胞之結合量的△幾何平均值比較值進行比較。於該情形，求取對於變異IL-6R表現細胞及IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值時使用之待驗抗原結合分子之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識IL-6R中之抗原決定部位的抗原結合分子當做對照抗原結合分子。

待驗抗原結合分子對變異IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值，若比起待驗抗原結合分子對IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」。求取幾何平均值(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較值而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之抗原決定部位為相同。

標的組織

本說明書中使用之用語「標的組織」，係指包含存在本發明之抗原結合分子以化合物依存性結合之抗原之細胞的組織，且該抗原結合分子對於在該細胞表現之膜型分子之結合、或對於該組織存在之可溶型分子之結合係對含該組織之活體帶來正面藥理作用之組織。此時之「正面藥理作用」，係指包含標的組織之病變部位，對於含該組織之活體帶來症狀減輕、緩和、寛解、或治癒之作用。帶來如此藥理作用之一非限定機制之態樣，例如：於癌等惡性腫瘤帶來之症狀之情形，可列舉對癌細胞之細胞傷害活性及增殖抑制及癌組織之免疫活化等。如此之一非限定機制之態樣，例如：發炎性疾病之情形，可列舉在發炎組織之發炎性細胞激素之作用之遮斷活性或免疫抑制等。

癌組織專一的化合物

本說明書中使用之用語「癌組織專一性的化合物(癌組織專一的化合物)」，係指比起非癌組織，在癌組織中以差別存在之化合物。本說明書中，用語「癌」，一般用於代表惡性新生物，其也可為轉移性或非轉移性。例如：從消化道或皮膚等上皮組織發生之癌腫瘤之非限例，可列舉腦腫瘤、皮膚癌、頸頭部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、乳癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、胰臟癌、肝臟癌、大腸癌、結腸癌、膀胱癌、及卵巢癌等。又，肌肉等非上皮性組織(間質)發生之肉瘤之非限定例，例如骨肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、及血管肉瘤等。再者，從造血器官來的血液癌之非限定例，可列舉包括Hodgkin淋巴腫瘤(Hodgkin's lymphoma)及非Hodgkin淋巴腫瘤(non Hodgkin's lymphoma)之惡性淋巴腫瘤、包括急性(acute myelocytic leukemia)或慢性骨髓性白血病(chronic myelocytic leukemia)、及急性(acute lymphatic leukemia)或慢性淋巴性白血病(chronic lymphatic leukemia)之白血病、以及多發性骨髓瘤(multiple myeloma)。本說明書廣用之「新生物」之用語，也意指新生出之各種病變組織腫瘤。本發明中，新生物之特徵為形成腫瘤，且部分有血管形成。新生物可能為例如：血管腫瘤、神經膠腫瘤、畸形腫瘤等良性、或例如：癌腫瘤、肉腫瘤、膠細胞腫瘤、星狀膠細胞腫瘤、神經芽細胞腫瘤、網膜芽腫瘤等惡性。

用語「癌組織」，指包括至少一個癌細胞之組織。因此係指例如癌組織含有癌細胞與血管般，包括貢獻於癌細胞及內皮細胞之腫瘤(tumor mass)形成的所有細胞類型。本說明書中，腫瘤係指腫瘤組織巢(a foci of tumor tissue)。用語「腫瘤」，一般用於指良性新生物或惡性新生物。

例如：在一些實施形態中，癌組織專一的化合物，可為存在於癌組織，不存在於非癌組織，在或癌組織不存在但於非癌組織存在等定性上由癌組織專一性規定之化合物。別的實施形態中，癌組織專一的化合物，可為比起非癌組織以相異濃度(例如：高濃度或低濃度)於癌組織存在之等以定量的癌組織專一性規定之化合物。例如：癌組織專一的化合物以任意濃度差別的存在。但是一般，癌組織專一的化合物，可能增加到至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少10³倍、至少10⁴倍、至少10⁵倍、至少10⁶倍、或更高、乃至無限大(亦即非癌組織不存在之情形)之濃度存在，或一般可能減少至至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%(亦即，代表不存在)之濃度存在。癌組織專一的化合物，如統計上以顯著濃度(亦即，使用Welch之t檢定或Wilcoxon之順位和檢定中之任一者決定般，p值小於0.05及/或q值小於0.10)較佳為差別地存在。癌組織專一的化合物之非限定態樣，可列舉如以下癌組織包括之癌細胞、免疫細胞、基質細胞特有之代謝活性所產生之癌組織專一性的代謝產物(癌組織專一的代謝產物；癌細胞專一的代謝產物、於癌組織浸潤之免疫細胞專一性的代謝產物、癌基質細胞專一的代謝產物)化合物。

癌組織專一的代謝產物

用語「代謝」，係指在生物之組織內產生之化學變化，包括「同化」及「異化」。同化係指分子之生合成或堆積，異化指分子之分解。「代謝產物」係物質代謝而來之中間體或產物。「一次代謝產物」，係指細胞或生物之成長或繁殖過程直接相關之代謝產物，「二次代謝產物」指與此等之成長或繁殖過程非直接相關，與生合成細胞或生物共通之生命現象未直接相關之物質之代謝結果產生之抗生物質或色素等生產物。代謝產物，可為「活體高分子」之代謝產物，也可為「低分子」之代謝產物。「活體高分子」，係由一種以上之重複單元構成之高分子。活體高分子，一般於生物系找到，形成組織生物之細胞及於其附著之細胞間間質、組織間間質等結構物的分子量約5000以上之分子，尤其多糖類(碳水化物等)及胜肽(此用語以包括多胜肽及蛋白質之方式使用)及聚核苷酸，同樣地，此等之類似體，例如胺基酸類似體或非胺基酸基構成或包含此等之化合物。「低分子」，指在活體存在之「活體高分子」以外之天然化學物質。本說明書記載之非限定態樣之癌組織專一的代謝產物，可列舉癌細胞專一性的低分子代謝產物為理想例(Eva Gottfried,Katrin Peter and Marina P.Kreutz,From Molecular to Modular Tumor Therapy(2010)3(2),111-132)。又，也包括於癌組織浸潤之免疫細胞高量產生之代謝產物或支持癌細胞生存及/或成長之基質細胞(癌基質細胞或癌間質纖維芽細胞(CAF))高量產生之代謝產物。浸潤之免疫細胞，可列舉樹狀細胞、抑制性樹狀細胞、抑制性T細胞、疲弊T細胞(exhausted T cell)、骨髓系來源抑制細胞(myeloma derived suppressor cell、MDSC)等。又，本發明中，代謝產物包括癌組織存在之細胞(癌細胞、免疫細胞、基質細胞)由於細胞凋零或壞死等而細胞死時，從細胞內往細胞外放出之化合物。

為了鑑別癌細胞專一的代謝產物，可適當使用轉錄物層級之解析、(例如：Dhanasekaran等(Nature(2001)412,822-826)、Lapointe等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2004)101,811-816或Perou等人(Nature(2000)406,747-752等)或蛋白質組(proteome)層級之解析(例如：Ahram等人(Mol.Carcinog.(2002)33,9-15、Hood等人(Mol.Cell.Proteomics(2005)4,1741-1753)，此外可適當使用以代謝學的變化為中心之代謝學(Metabolomics)解析。亦即，為了鑑別待驗試樣中之代謝產物，可適當使用單獨或組合使用高壓液體層析(HPLC)、核磁共振(NMR)(Brindle等人(J.Mol.Recognit.(1997)10,182-187)、質量分析法(Gates及Sweeley(Clin.Chem.(1978)24,1663-1673)(GC/MS及LC/MS))及ELISA等之代謝學的曲線變化(profiling)。

由該等研究已了解癌細胞可在低氧壓條件下生長之代謝產物(例如葡萄糖或氧)及生長因子之濃度梯度改變而構成之腫瘤內之異質性(Dang及Semenza(Trends Biochem.Sci. (1999)24,68-72))。該等研究中，為了理解腫瘤惡性度之不同程度所致能量利用路徑之變化，也使用細胞株模型(Vizan等人(Cancer Res.(2005)65,5512-5515)。代謝學平台之技術構成要素之非限定態樣，可列舉Lawton等人(Pharmacogenomics(2008)9,383)記載之試樣萃取、分離、檢測、分光分析、數據正規化、類別專一的代謝產物之描寫、路徑輿圖、確認、及候選代謝產物之功能性特徵附加。利用該等方法可鑑別所望之癌組織之癌細胞專一的代謝產物。

本發明使用之癌組織專一的化合物、或癌組織專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉從以下化合物選擇之至少一種化合物。至少一種化合物，包括後述相同抗原結合分域對抗原之結合活性係依存於一種癌組織專一的化合物、或依存癌組織專一的代謝產物，此外也包含依存多數種類之癌組織專一的化合物、或癌組織專一的代謝產物之情況。

(1)乳酸、琥珀酸、檸檬酸等解糖系、或克氏循環之一次代謝產物

本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉乳酸、琥珀酸、檸檬酸等的比起在周圍存在之非癌部組織，於癌組織以較高濃度存在之葡萄糖代謝之結果生成之一次代謝產物為理想例。丙酮酸激酶、己糖激酶、及乳酸脫氫酵素(LDH)等解糖系(Embden-Myerhof路徑)酵素之上方調節(upregulation)為特徵之解糖系表現型，自以往已知就Warburg效果而言，為固形腫瘤之特徵。

亦即，腫瘤細胞中，非M1構造同型，而是於嫌氣條件下對於解糖(erobic glycolysis)為必要之M2構造同型之丙酮酸激酶高表現據認為活體內對於腫瘤細胞之生長有利(Christofk等人(Nature(2008)452,230-233)。利用丙酮酸激酶生成之丙酮酸，於嫌氣條件下會受到因乳酸脫氫酵素(LDH)之平衡反應結果生成之乳酸所為之反饋抑制。由於該反饋抑制，會促進粒腺體之呼吸(克氏循環)、及抑制細胞增殖，所以被人稱為LDH、己糖激酶、及葡萄糖運送蛋白(GLUT)之上方調節對於腫瘤細胞增殖發揮重要作用(Fantin等人(Cancer Cell(2006)9,425-434))。葡萄糖由解糖系代謝，其最終代謝產物乳酸於腫瘤之周圍與質子一起共輸送之結果，被認為腫瘤之周邊組織之pH會變成酸性條件。解糖系之最終產物乳酸、粒腺體之呼吸促進而生成之琥珀酸及檸檬酸，已知會堆積在癌組織(Teresa等人(Mol.Cancer(2009)8,41-59))。本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉如此之由解糖系之代謝生成之一次代謝產物即乳酸、琥珀酸、檸檬酸等。又，已知因細胞死會使細胞內高濃度存在之琥珀酸往細胞外漏出(Nature Immunology,(2008)9,1261-1269)。所以據認為細胞死頻繁發生的癌組織中，琥珀酸之濃度上昇。

(2)丙胺酸、麩胺酸、天冬胺酸等胺基酸

上述葡萄糖代謝以外，也已知嫌氣條件下須要連續供給對於活體高分子之生合成為必要之必須胺基酸及非必須胺基酸之腫瘤細胞中，胺基酸代謝也會變化。據稱：麩醯胺酸作為在其側鏈包括二個氮之氮運搬體，係於活體最廣泛分布之胺基酸。攝入麩醯胺酸到細胞內之速度上昇之腫瘤細胞，據稱作為麩醯胺酸捕集器(glutamine trap)的功能。如此之麩醯胺酸之攝入及變換為麩胺酸及乳酸之活性之上昇，稱為「麩醯胺酸分解(glutaminolysis)」，被認為是已轉形之(腫瘤)細胞之特徵(Mazurek及Eigenbrodt(Anticancer Res.(2003)23,1149-1154、以及Mazurek等人(J.Cell.Physiol.(1999)181,136-146))。其結果，癌患者血漿中之麩醯胺酸水平減少，但麩胺酸濃度增大(Droge等人(Immunobiology(1987)174,473-479)。並且，利用肺癌組織之經¹³C放射標記之葡萄糖之代謝研究，觀察到¹³C標記琥珀酸、¹³C標記丙胺酸、¹³C標記麩胺酸、及¹³C標記檸檬酸之濃度間有相關。本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定態樣中，如此之由於麩醯胺酸分解等而在癌組織以高濃度堆積之丙胺酸、麩胺酸、天冬胺酸等為理想例。

(3)犬尿胺酸(kyneurine)等胺基酸之代謝產物

吲哚胺2,3-二氧合酶(IDO)，係黑色素瘤、結腸癌、及腎臟癌等許多癌中為高表現之色胺酸代謝酵素(Uyttenhove等人(Nat.Med.(2003)9,1269-127)，已知有二種構造同型存在(Lob等人(CancerImmunol.Immunother.(2009)58,153-157))。IDO係催化色胺酸變換為犬尿胺酸(化1表示之)，且為菸鹼醯胺核苷酸(NAD)之新生路徑之最初之酵素。又，在不表現IDO之腦膠質瘤，利用肝臟之色胺酸2,3-二氧合酶(TDO)，從色胺酸生成犬尿胺酸(Opitz等人(Nature(2011)478,7368,197-203))。又，IDO在於癌組織浸潤之樹狀細胞也會表現，樹狀細胞也產生犬尿胺酸(J.Immunol.(2008)181,5396-5404)。又，IDO也會在癌組織之骨髓系來源抑制細胞(MDSC)表現，MDSC也產生犬尿胺酸(Yu等人(J.Immunol.(2013)190,3783-3797))。

犬尿胺酸已知會抑制同種T細胞回應(Frumento等人(J.Exp.Med.(2002)196,459-468)，有人提倡藉由如此之抑制，腫瘤細胞潛行通過抗腫瘤免疫回應，且藉由犬尿胺酸作用在腦膠質瘤表現之烯丙基烴受體之內因性配體之自泌增殖機構，促進腦膠質瘤細胞之增殖(Opitz等人(上揭))。犬尿胺酸係由犬尿胺酸酶變換為鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)([化2]表示)，並由犬尿胺酸3-脫羧酶變換為3-羥基犬尿胺酸([化3]表示)。鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)、及3-羥基犬尿胺酸，均變換為成為NAD之前驅體之3-羥基鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)。

犬尿胺酸，由於犬尿胺酸胺基轉移酶變換為犬尿喹啉酸(Kynurenic acid)([化4]表示)。本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉如此之犬尿胺酸、及其代謝產物、鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)、3-羥基犬尿胺酸、及犬尿喹啉酸等胺基酸之代謝產物為理想例。

(4)前列腺素E2(Prostaglandin E2)等花生四烯酸之代謝產物

前列腺素E2(PGE2)([化5])，係包括由環氧合酶(COX)-1/2合成之前列腺素及前列凝素(Thromboxane)之稱為前列腺素類(prostanoid)之花生四烯酸之代謝物(Warner及Mitchell(FASEB J.(2004)18,790-804))。促進PGE2結腸癌細胞之增殖，並抑制其細胞凋零(apoptosis)(Sheng等人(Cancer Res.(1998)58,362-366))。已知許多癌細胞中，環氧合酶之表現改變。亦即， COX-1在幾乎所有組織中以結構性表現，相對於此，COX-2主要於腫瘤因某種發炎性細胞激素及癌基因誘導發現(Warner 及Mitchell(前揭))。COX-2之過量表現，據報告與乳癌之預後惡度(Denkert等人(Clin.Breast Cancer(2004)4,428-433)、及卵巢癌急速疾病進行(Denker等人(Mod.Pathol.(2006)19,1261-1269)有關連性。又，於癌組織浸潤之抑制性T細胞也產生前列腺素E2(Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。花生四烯酸之代謝物之前列腺素、白三烯等低分子已知作為控制癌之自泌、及/或旁泌增殖之刺激因子(Nat.Rev.Cancer(2012)12(11)782-792)。本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物或於癌組織浸潤之免疫細胞專一的代謝物之一非限定態樣，可列舉如此之前列腺素E2等花生四烯酸之代謝產物為理想例。前列腺素E2以外，Thromboxane A2(TXA2)在大腸癌等癌組織的產生有增加(J.Lab.Clin.Med.(1993)122,518-523)，可列舉為本發明之花生四烯酸之代謝產物之一非限定態樣。

(5)腺苷、腺苷3磷酸(ATP)、腺苷2磷酸(ADP)、腺苷1磷酸(AMP)等具嘌呤環結構之核苷

癌細胞已知若死亡，會有細胞內大量之ATP往細胞外漏出。所以，癌組織之ATP濃度，比正常組織顯著較高(PLoS One.(2008)3,e2599)。多數類型的細胞會將ATP、ADP及AMP型之腺核苷酸游離。會由細胞外-5'-核苷酸酶(eco-5'-nucleotidase)(CD73)之類之細胞表面之細胞外酵素代謝(Resta及Thompson(Immunol.Rev.(1998)161,95-109)以及Sadej等人(Melanoma Res.(2006)16,213-222)。腺苷係低濃度且於細胞外環境以結構性存在之嘌呤核苷，但據報告固體癌發現的低氧組織中，細胞外腺苷濃度顯著增加(Blay及Hoskin(Cancer Res.(1997)57,2602-2605)。CD73在腫瘤及免疫細胞之表面表現(Kobie等人(J.Immunol.(2006)177,6780-6786)，於乳癌(Canbolat等人(Breast Cancer Res.Treat.(1996)37,189-193)、胃癌(Durak等人(Cancer Lett.(1994)84,199-202)、膵臟癌(Flocke及Mannherz(Biochim.Biophys.Acta(1991)1076,273-281)及膠質母細胞瘤(Bardot等人(Br.J.Cancer(1994)70,212-218))發現活性上昇。腺苷在癌組織堆積，有人認為係因細胞質由於5'-核苷酸酶造成AMP之脫磷酸，而使細胞內腺苷生成增加所引起(Headrick及Willis(Biochem.J.(1989)261,541-550)。又，於癌組織浸潤之抑制性T細胞等也表現ATP分解酵素，並產生腺苷(Proc.Natl.Acad.Sci.(2006)103(35),13132-13137、Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。產生之腺苷，據認為經由A2A受體等腺苷受體使癌組織成為受免疫抑制之環境(Curr.Med.Chem. (2011),18,5217-23)。本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定態樣，如此因ATP等嘌呤核苷酸之代謝造成於癌組織以高濃度堆積之ATP、ADP、AMP、或腺苷等為理想例。又，因腺苷會被腺苷去胺基酶(adenosine deaminase)分解成肌苷，故肌苷以高濃度堆積。

(6)尿酸

尿酸係活體內，嘌呤核苷之代謝路徑之產物，於血液或間質腔等細胞外游離。又，近年已知癌組織等病變部位存在之死細胞會游離出尿酸(Nat.Med.(2007)13,851-856)。本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定態樣中，如此之因ATP等嘌呤核苷酸之代謝而於癌組織以高濃度堆積之尿酸，亦為理想例。

(7)1-甲基菸鹼醯胺

多數人類癌組織中，已知酵素菸鹼醯胺N-甲基轉移酶為高表現。本酵素當從菸鹼醯胺產生安定代謝物即1-甲基菸鹼醯胺時，因為會消耗成為甲基提供體之S-腺苷甲硫胺酸(SAM)之甲基，有人認為由於癌細胞之SAM濃度減少所伴隨之DNA之甲基化能力減損之機構，使菸鹼醯胺N-甲基轉移酶之高表現會幫助腫瘤化(tumorigenesis)(Ulanovskaya等人(Nat.Chem.Biol.(2013)9(5)300-306))。本酵素之安定代謝產物1-甲基菸鹼醯胺，已知會分泌到癌細胞之細胞外(Yamada等人(J.Nutr.Sci.Vitaminol.(2010)56,83-86))，本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定之態樣，可列舉如此之因菸鹼醯胺之代謝而於癌組織以高濃度堆積之1-甲基菸鹼醯胺等為理想例。

發炎組織專一的化合物

本說明書中使用之用語「發炎組織專一性的化合物(發炎組織專一的化合物)」，係比起非發炎組織，於發炎組織中差別存在之化合物。本說明書中，「發炎組織」，係指類風濕關節炎或退化性關節炎之關節

支氣管氣喘或COPD之肺(肺泡)

發炎性腸疾病或克羅病或潰瘍性大腸炎之消化器官

肝臟、腎臟、肺之纖維化症之纖維化組織

臟器移植時發生排斥反應之組織

動脈硬化或心衰竭之血管、心臟(心肌)

代謝症候群之內臟脂肪

異位性皮膚炎等皮膚炎之皮膚組織

椎間板脫出或慢性腰痛之脊髓神經等為理想例。

發炎組織專一的代謝產物

發炎組織專一的代謝產物，係指於發炎性組織浸潤之免疫細胞高量產生之代謝產物、及於發炎組織中受傷害之正常細胞專一的高量產生之代謝產物。浸潤之免疫細胞，可舉效應子T細胞、成熟樹狀細胞、嗜中球、顆粒細胞(肥胖細胞)、嗜鹼球等。又，本發明中，代謝產物也包括發炎組織存在之細胞(免疫細胞、正常細胞)由於細胞凋零或壞死等而死亡時，從細胞內往細胞外放出之化合物。

本發明使用之發炎組織專一的化合物、或發炎組織專一的代謝產物之非限定之態樣，可列舉從以下化合物選擇之至少一種化合物為宜。至少一種化合物，包括指後述相同抗原結合分域所致對於抗原之結合活性，係依存於一種發炎組織專一的化合物、或發炎組織專一的代謝產物，此外，宜存於多數種類之發炎組織專一的化合物、或發炎組織專一的代謝產物的情況。

(1)前列腺素E2(Prostaglandin E2)等花生四烯酸之代謝產物

類風濕關節炎或退化性關節炎，已知PGE2濃度高(Eur.J.Clin.Pharmacol.(1994)46,3-7.、Clin.Exp.Rheumatol.(1999)17,151-160、Am.J.Vet.Res.(2004)65,1269-1275.)。本發明使用之發炎組織專一的化合物，尤其發炎細胞專一的代謝產物或於發炎組織浸潤之免疫細胞專一的代謝物之非限定之態樣，可列舉如此之前列腺素E2等花生四烯酸之代謝產物為理想例。

(2)腺苷、腺苷3磷酸(ATP)、腺苷2磷酸(ADP)、腺苷1磷酸(AMP)等具嘌呤環結構之核苷

發生支氣管氣喘引起之發炎的肺泡中，已知ATP濃度高(Nat.Med.(2007)13,913-919)。又，發生COPD引起之發炎之肺泡中，已知ATP濃度為高(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)181,928-934)。又，類風濕關節炎患者之關節液中，觀察到腺苷濃度為高(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2004)36 877-882)。又，在因GVHD引起排斥反應之組織中，已知ATP濃度為高(Nat.Med.(2010)16,1434-1438)。又，已知肺、肝臟、腎臟之纖維化組織，腺苷濃度增加(FASEB J.(2008)22,2263-2272、J.Immunol.(2006) 176,4449-4458、J.Am.Soc.Nephrol.(2011)22(5),890-901、PLoS ONE J.(2010)5(2),e9242)。又，在肺纖維症患者之纖維化組織，觀察到ATP濃度為上昇(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)182,774-783)。本發明使用之發炎性組織專一的化合物之非限定之態樣，可列舉如此之因ATP等嘌呤核苷酸之代謝而於發炎組織以高濃度堆積之ATP、ADP、AMP、或腺苷等為理想例。又，腺苷因adenosine deaminase分解為肌苷，故肌苷以高濃度堆積。

(3)尿酸

尿酸係於活體內之嘌呤核苷之代謝路徑之產物，在血液或間質腔等細胞外游離。又，近年已知從壞死(necrosis)進行之細胞游離的尿酸，會促進發炎性回應(J.Clin.Invest.(2010)120(6),1939-1949)。本發明使用之發炎組織專一的化合物之非限定之態樣，可列舉如此之因ATP等嘌呤核苷酸之代謝而於發炎性組織以高濃度堆積之尿酸為理想例。

抗原結合分域

本說明書中，「抗原結合分域」只要能結合於目的之抗原則可使用任意構造之分域。如此的分域，例如：抗體之重鏈及輕鏈之可變區、存在於活體內之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組(WO2004/044011、WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin(WO2002/032925)、以構成由ProteinA之58個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的 Affibody(WO1995/001937)、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Anticalin等(WO2003/029462)、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區(WO2008/016854)為佳。本發明之抗原結合分域之較佳例，例如含抗體之重鏈及輕鏈之可變區的抗原結合分域。如此的抗原結合分域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」等為較佳。

本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於相同的抗原決定部位。在此，相同之抗原決定部位可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。或，本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於彼此不同的抗原決定部位。在此，不同的抗原決定部位，可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。

專一性

專一性，係指專一性結合之分子的其中一分子對於其結合之一或多數之對手分子以外之分子為實質上不結合之狀態。又，抗原結合分域對於某抗原中含有多數抗原決定部位中之特定之抗原決定部位為專一的情形也可使用。又，抗原結合分域所結合之抗原決定部位係含於多數不同抗原之情形，具有該抗原結合分域之抗原結合分子可與包含該抗原決定部位之各種抗原結合。在此，實質上不結合，係依如前述結合活性之項目所記載之方法決定，指對於該對手方之分子以外之分子之結合活性為對手方之分子之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下。

細胞傷害活性

本發明之一非限定態樣中，提供包括因應癌組織專一的化合物之濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域，且對於膜型分子表現於其細胞膜之細胞有細胞傷害活性之抗原結合分子、及包含該抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物。本發明中，細胞傷害活性，例如抗體依存性細胞媒介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補體依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性及由於T細胞所致的細胞傷害活性等。本發明中，CDC活性係指利用補體系之細胞傷害活性。另一方面，ADCC活性係指包括於標的細胞之細胞膜表現之膜型分子所結合之抗原結合分域之抗原結合分子之Fc區，經由免疫細胞等由該免疫細胞表現之Fcγ受體中介而結合且該免疫細胞對於標的細胞造成傷害之活性。目的抗原結合分子是否有ADCC活性，或是否有CDC活性，可依公知方法測得(例如Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans、Coligan等人編(1993)等)。

具體而言，首先製備效應子細胞、補體溶液、標的細胞。

(1)效應子細胞之製備

從CBA/N小鼠等摘出之脾臓，在RPMI1640培養基(Invitrogen)中將脾臓細胞分離。以含10%胎牛血清(FBS、HyClone)之同培養基洗滌過的該脾臓細胞之濃度調整為5×10⁶/ml，可製備效應子細胞。

(2)補體溶液之製備

以含10% FBS之培養基(Invitrogen)將Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀釋為10倍，可製備補體溶液。

(3)標的細胞之製備

將表現抗原之細胞與0.2mCi之⁵¹Cr-鉻酸鈉(GEhealthcare bioscience)一起在含10% FBS之DMEM培養基中，於37℃培養1小時，將該標的細胞做放射性標記。放射性標記後，以含10% FBS之RPMI1640培養基洗滌3次後的細胞濃度調整為2×10⁵/ml，可製備該標的細胞。

ADCC活性、或CDC活性依下列所述方法測定。測定ADCC活性的情形，在加到96井U底板(Becton Dickinson)各50μl的標的細胞與抗原結合分子在室溫反應15分鐘。之後，將加有效應子細胞100μl之該板在二氧化碳培養箱內靜置 4小時。抗體之終濃度可設為例如0或10μg/ml等的濃度。靜置後，使用gamma計數器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)測定從各井回收的100μl上清的放射活性。使用測定值依(A-C)/(B-C)x 100之計算式可計算細胞傷害活性(%)。A係表示在各試樣之放射活性(cpm)、B係表示在加有1% NP-40(nacalai tesque)之試樣之放射活性(cpm)、C係表示在僅含標的細胞之試樣之放射活性(cpm)。

另一方面，測定CDC活性的情形。係將在96井平底板(Becton Dickinson)加入的各50μl的標的細胞與抗原結合分子加在冰上反應15分鐘。之後，將加有補體溶液100μl之該板於二氧化碳培養箱靜置4小時。抗體之終濃度可設為例如0或3μg/ml等濃度。靜置後使用gamma計數器測定從各井回收之100μl之上清之放射活性。細胞傷害活性與ADCC活性測定以同樣方式可計算。

又，後述化學療法劑、毒性胜肽或放射性化學物質等細胞傷害性物質結合之修飾抗原結合分子修飾物，也可理想地作為本發明之具細胞傷害活性之抗原結合分子使用。如此之修飾抗原結合分子(以下稱為抗原結合分子藥物接合物)，可藉由將獲得之抗原結合分子進行化學性修飾以取得。又，作為抗原結合分子之修飾方法，可適當使用於抗體藥物接合物等的領域已確立的方法。又，有毒性胜肽結合之修飾抗原結合分子，可藉由將編碼為該毒性胜肽之基因與編碼為本發明之抗原結合分子之基因於讀框內連結而得之融合基因於適當寄主細胞中表現後，從該細胞之培養液單離以取得。

中和活性

本發明之一非限定態樣中，提供包括因應癌組織專一的化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性的抗原結合分域且該對於膜型分子具有中和活性之抗原結合分子為有效成分之誘導免疫回應之醫藥組合物。本發明之一另外的非限定態樣中，提供包括因應癌組織專一的化合物濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域且對膜型分子係表現於其細胞膜之細胞顯示細胞傷害活性，此外對於該膜型分子有中和活性之作為抗原結合分子有效成分之誘導免疫回應之醫藥組合物。一般而言，中和活性係指抑制對病毒或毒素等對細胞有生物學活性之配體之該生物學活性之活性。亦即，有中和活性之物質，係指結合於該配體或該配體所結合之受體，並抑制該配體與受體之結合之物質。利用中和活性使與配體結合受抑制之受體，不能發揮經由該受體媒介之生物學活性。具有如此之中和活性之抗體，一般稱為中和抗體。該中和活性，係藉由將在成為對象的配體存在下其生物學活性在待驗物質存在或非存在下之條件之間比較而測定。

例如，作為IL-6受體之主要配體考量者，以序列編號：27表示之IL-6為理想例。其胺基末端形成細胞外分域之I型膜蛋白質IL-6受體，會與因IL-6而誘導二聚物化之gp130受體一起形成異四聚物(HEINRICH等人(Biochem.J.(1998)334,297-314))。由於該異四聚物之形成，組合於gp130受體之Jak活化。Jak進行自磷酸化及受體之磷酸化。受體及 Jak之磷酸化部位，對於屬於如Stat3之有SH2之Stat家族之分子、或MAP激酶、PI3/Akt、其他具SH2之蛋白質或適應子(adaptor)，發揮結合部位之作用。其次，結合於gp130受體之Stat由於Jak而磷酸化。經磷酸化之Stat形成二聚物並移到核內，調整標的基因之轉錄。Jak或Stat經由其他類別之受體而涉及信號的串流。脫離控制的IL-6之信號串流，會觀察到自體免疫疾病之病態或發炎、多發性骨髓癌或前列腺癌等癌。能作為癌基因之Stat3，在許多癌中係持續地被活化。前列腺癌與多發性骨髓瘤中，來自IL-6受體之信號串流與來自上皮成長因子受體(EGFR)家族成員之信號串流之間有串音(crosstalk)(Ishikawa等人(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。

如此之細胞內之信號串流對每一細胞種類不同，可因應目的標的細胞適當設定標的分子，不限定於上述因子。藉由測定活體內信號之活化，可評價中和活性。又，以對於存在活體內信號串流之下游的標的基因的轉錄誘導作用作為指標，可檢測活體內信號之活化。標的基因之轉錄活性之改變，可利用報告子試驗法的原理檢測。具體而言，在標的基因之轉錄因子或起動子區之下游配置GFP(Green Fluorescence Protein)或發光酶等報告子基因，並測定其報告子活性，可就轉錄活性之改變測定作為報告子活性。活體內信號活化之測定套組，也可適當使用市售品(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。

再者，通常就測定作用於促進細胞增殖之方向之作用於信號串流的EGF受體家族等受體配體之中和活性之方法而言，可藉由測定標的細胞之增殖活性而評價中和抗體之中和活性。例如，就抗HB-EGF抗體基於中和活性對於例如HB-EGF等其增殖受EGF家族之成長因子而促進之細胞增殖之抑制效果予以評價或測定之方法而言，可理想地使用以下方法。在試管內評價或測定該細胞增殖抑制活性之方法，可使用測定培養基中添加之[³H]標記胸腺嘧啶由活細胞之攝入作為DNA複製能力指標的方法。就更簡便的方法，有於顯微鏡下計測將trypan blue等色素排除到細胞外之能力的色素排除法、或MTT法。後者係利用活細胞有將四唑鎓鹽MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)轉換為藍色的formazan產物的能力。更具體而言，在待驗細胞的培養液中同時加入配體及待驗抗體並經過一定時間後，將MTT溶液加入培養液並靜置一定時間以使細胞攝入MTT。其結果黃色化合物MTT由於細胞內之粒腺體內的琥珀酸脫氫酵素而變換為藍色的化合物。使該藍色生成物溶解並呈色後測定其吸光度，作為活細胞數的指標。MTT以外，也有MTS、XTT、WST-1、WST-8等試藥有市售(nacalai tesque等)，可理想地使用。活性測定時，作為對照抗體，將與抗HB-EGF抗體有相同之構造同型之抗體且不具有該細胞增殖抑制活性之結合抗體與抗HB-EGF抗體同樣地使用，藉由抗HB-EGF抗體顯示比對照抗體強的細胞增殖抑制活性，可判定活性。

用於評價活性之細胞，例如其增殖受HB-EGF促進之細胞，例如卵巢癌細胞RMG-1細胞株、經利用將以編碼為人類EGFR之細胞外分域與小鼠GCSF受體之細胞內分域於同一讀框融合而得之融合蛋白質hEGFR/mG-CSFR之基因表現之方式結合之載體轉形之小鼠Ba/F3細胞等可理想地使用。如此，該技術領域中具有通常知識者可適當選擇用於評價活性之細胞而使用於測定前述細胞增殖活性。

抗體

本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之構造同型(isotype)及此等構造同型之次類(subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型(構造同型)。本發明之抗體在該等構造同型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4抗體之不變區，由於基因多型而致之多數副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。尤其人類IgG1之序列，可為EU編號356-358號之胺基酸序列為DEL，也可為EEM。又，就人類Igκ(Kappa)不變區與人類Igλ(Lambda)不變區而言，由於基因多型而致之多數副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。

製作具有所望結合活性之抗體之方法於該技術領域之具有通常知識者為公知。以下列舉製作與IL-6結合之抗體(抗IL-6R抗體)之方法。與IL-6R以外之抗原結合的抗體也可依據下列例示適當製作。

抗IL-6R抗體可使用公眾所知方法以多株或單株抗體之形式取得。抗IL-6R抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。哺乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及由基因工程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之寄主細胞所產生者等。本發明之單株抗體包括「人類化抗體」或「嵌合抗體」。

單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用IL-6R蛋白質當做感作抗原，依通常之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之親代細胞融合。其次依照通常之篩選法，篩選單株抗體產生細胞，可選擇產生抗IL-6R抗體之融合瘤。

具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方式實行。首先，藉由表現在序列編號：2揭示其核苷酸序列之IL-6R基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以序列編號：1表示的IL-6R蛋白質。亦即，藉由將編碼為IL-6R之基因序列插入公知之表現載體，而將適當的寄主細胞轉形。從該寄主細胞中或培養上清中以公知方法精製所望之人類IL-6R蛋白質。為了從培養上清中取得可溶型之IL-6R，例如可使Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之序列編號：1表示之可溶型IL-6R多胜肽序列當中1至357號之胺基酸構成之蛋白質表現，以代替表現以序列編號：1表示之IL-6R蛋白質。又，經精製的天然IL-6R蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。

對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製IL-6R蛋白質。IL-6R之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類IL-6R之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將IL-6R基因之一部分納入表現載體使表現而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將IL-6R蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之IL-6R胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從序列編號：1之胺基酸序列當中相當於20-357號胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8~50、較佳為10~30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。

又，將IL-6R蛋白質之所望之部分多胜肽或胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了製造當做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤(tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於同一讀框(inframe)融合，並將該融合基因以前述方式插入表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。可當做感作抗原使用之IL-6R之取得方法及使用其之免疫方法，在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等亦有具體記載。

以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物，宜考慮與細胞融合使用之親代細胞之間的適合性選擇。一般的囓齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠，或兔、猴等較佳。

依公知方法將上述動物以感作抗原免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹腔內或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物每4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當擔體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白(keyhole lympet hemocyanin)等擔體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。

又，產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物中，藉由感作抗原在該免疫動物之活體內表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。

-可維持如IL-6R之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激

-無需精製免疫抗原

為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現IL-6R蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為IL-6R之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA插入適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利用pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因槍導入免疫動物個體之細胞內而實施DNA免疫。再者，認識IL-6R之抗體之製作也可使用國際公開WO2003/104453記載之方法製作。

以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與IL-6R結合之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。

與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。

HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤(thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5'溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。

如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用例如：P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(l978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。

基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。

更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。

免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。

細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清之操作，可將對融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。

以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。

以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當使用HAT感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。

所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。例如，結合於IL-6R之單株抗體可以結合於在細胞表面表現的IL-6R。如此的單株抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對細胞表面之結合的系統。

為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現IL-6R之細胞。用於篩選之較佳細胞為使IL-6R強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對細胞表面之IL-6R的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於IL-6R強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生IL-6R單株抗體之融合瘤。

或抗體對經固定化之IL-6R表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將IL-6R表現細胞固定化在ELISA板的井。使融合瘤之培養上清接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。

以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。

將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。

從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將寄主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。

例如，可從產生抗IL-6R抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗IL-6R抗體之可變區(V區)之cDNA。為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。

-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)

-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)

萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製) 等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。

從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。

為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。

以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。

具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用能將編碼為當做重鏈之γ1、γ2a、γ2b、γ3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3'側之引子黏合有相當於接近可變區之不變區之部分的引子。另一方面，5'側之引子係利用5’RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。

利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對IL-6R之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗IL-6R之抗體時，抗體對IL-6R之結合，更佳為專一性的。與IL-6R結合之抗體可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸IL-6R表現細胞之步驟、(2)檢測IL-6R表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及(3)選擇與IL-6R表現細胞結合之抗體之步驟。

檢測抗體與IL-6R表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與IL-6R表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當利用IL-6R表現細胞之固定標本。

以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因插入噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。

獲得編碼為目的抗IL-6R抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識插入於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向插入載體，宜插入提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗IL-6R抗體之V區的cDNA插入適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體不變區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於同一讀框融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指不變區與可變區之來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具不變區之表現載體插入前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體不變區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適當配置消化前述V區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於同一讀框融合，可以構建嵌合抗體表現載體。

為了製造抗IL-6R單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體。用於表現抗體之表現控制區，包含例如增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。例如係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：3)之胜肽當做信號序列，但是也可附加其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多胜肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可以取得表現編碼為抗IL-6R抗體之DNA的重組細胞。

為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同寄主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形(參照國際公開WO 1994/11523)。

用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合分域。真核細胞當做寄主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。

(1)哺乳類細胞：CHO(中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese hamster ovary cell line))、COS(猴腎細胞株(Monkey kidney cell line))、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(幼倉鼠腎細胞株(baby hamster kidney cell line))、Hela、Vero、HEK293(有受剪切之腺病毒的人類胚胎腎細胞株(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus)(Ad)5 DNA)、PER.C6細胞(經腺病毒型E1A及E1B基因轉形的人類胚胎網膜細胞株(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5)E1A and E1B genes))等(Current Protocols in Protein Science(May、2001、Unit 5.9、Table 5.9.1))

(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等

(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等

或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。

又，真菌細胞可以利用如下的細胞。

-酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等Pichia屬

-絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴菌(Aspergillus)屬

又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。

重組抗體之產生，除了上述寄主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，將抗體基因藉由於同一讀框插入編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用羊β酪蛋白等。將含有插入有抗體基因之融合基因的DNA片段注入羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌羊體內。從接受胚胎的羊產生之基因轉殖羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對基因轉殖羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。

本說明書記載之抗原結合分子對於人類投予時，該分子中之抗原結合分域，可適當採用以降低對人類之異種抗原性等為目的經人類為改變過的基因重組型抗體來源的抗原結合分域。基因重組型抗體例如包含人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用公知方法適當製造。

本說明書記載之用於製作抗原結合分子中的抗原結合分域所使用之抗體之可變區，通常由插入在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。

人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子係針對4個FR各別準備。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持 CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。

又，連結之鹼基序列可設計為彼此於同一讀框連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。

最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5'末端與3'末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA與編碼為人類抗體C區之DNA以於同一讀框融合之方式插入於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。

以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的變異。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的變異型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之變異FR序列(Cancer Res,1993,53,851-856)。

又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。

再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於同一讀框融合後插入適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

又，就取得抗體基因之方法而言，除上述以外，也可適當使用Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008記載之B細胞選殖(各抗體之編碼序列之鑑定及選殖、其單離、及各抗體(尤其IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)製作用之表現載體構建之用途等)之方法。

EU編號及Kabat編號

依照本發明使用之方法，指定為抗體之CDR與FR之胺基酸位置係依照Kabat規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段時，可變區之胺基酸係依照Kabat編號，不變區之胺基酸係依照Kabat之胺基酸位置的EU編號表示。

標的組織專一的化合物依存性的抗原結合分域

為了取得因應標的組織專一性的化合物濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，亦即，標的組織專一性的化合物依存性的抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可適當使用上述結合活性項目所示之方法等。作為一非限定態樣，以下列舉一些具體例。例如為了確認比起於標的組織專一性的化合物不存在下抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性，於該化合物存在下抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性變化為較高，比較於標的組織專一性的化合物不存在下及存在下、或低濃度存在下及高濃度存在下時，抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性。於一不同的非限定態樣中，為了確認例如：比起存在低濃度標的組織專一性的化合物時，抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性，於該化合物高濃度存在下抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性變化為較高，比較於標的組織專一性的化合物低濃度存在下及高濃度存在下時，抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性。

又，本發明中，「標的組織專一性的化合物存在下對抗原之結合活性，高於該化合物不存在下對抗原之結合活性」之表現法，也可表達為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於標的組織專一性的化合物不存在下對抗原之結合活性低於該化合物存在下對抗原之結合活性」。又，本發明中，「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於標的組織專一性的化合物不存在下對抗原之結合活性低於該化合物存在下對抗原之結合活性」，有時也會記載為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於標的組織專一性的化合物不存在下對抗原之結合活性弱於該化合物存在下對抗原之結合活性」。

又，本發明中，「存在高濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性高於該化合物低濃度存在下對抗原之結合活性」之表達，也可表達為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於該化合物高濃度存在下對抗原之結合活性」。又，本發明中，「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於該化合物高濃度存在下對抗原之結合活性」，有時記載為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性弱於該化合物高濃度存在下對抗原之結合活性」。

測定對抗原之結合活性時，標的組織專一性的化合物濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可於HEPES緩衝液、37℃之條件測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)與抗原之結合活性之測定，於抗原為可溶型分子時，可將抗原作為分析物流過固定有抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)之晶片，以評價對可溶型分子之結合活性，抗原為膜型分子時，可將抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)作為分析物，流過固定有抗原之晶片，以評價對膜型分子之結合活性。

本發明之抗原結合分子所含之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於標的組織專一性的化合物不存在下對抗原之結合活性，只要弱於標的組織專一性的化合物存在下對抗原之結合活性即可，於該化合物不存在下對抗原之結合活性與該化合物存在下對抗原之結合活性之比不特別限定，較佳為對抗原之標的組織專一性的化合物不存在下之KD(Dissociation constant：解離常數)與存在下之KD之比KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值為2以上，更佳為KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值為10以上，又更佳為KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值為40以上。KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等任意值。標的組織專一性的化合物不存在下時，未觀察到對抗原之結合活性的情形，其上限成為無限大之數值。

本發明之抗原結合分子所含之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，只要於存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性弱於存在高濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性即可，在低濃度存在該化合物時對抗原之結合活性與在高濃度存在該化合物時對抗原之結合活性之比不特別限定，較佳為對抗原，存在低濃度標的組織專一性的化合物時KD(Dissociation constant：解離常數)與高濃度存在時之KD之比，即KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值為2以上，更佳為KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值為10以上，又更佳為KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值為40以上。KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術能製作，可為400、1000、10000等任意值。於低濃度存在標的組織專一性的化合物時未觀察到對抗原之結合活性之情形，其上限成為無限大之數值。

對抗原之結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用KD(解離常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)。KD(解離常數)、及視KD(視解離常數)可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、scatchard作圖法、流式細胞計數器等。

又，代表本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)在標的組織專一性的化合物不存在下對抗原之結合活性與存在下對抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對抗原在標的組織專一性的化合物不存在下對抗原之結合活性之比之kd(解離速度常數)與在該化合物存在下之kd(解離速度常數)之比，即kd(化合物不存在下)/kd(化合物存在下)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(化合物不存在下)/kd(化合物存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。標的組織專一性的化合物不存在下時，未觀察到對抗原之結合活性的情形也不生解離，因此其上限成為無限大之數值。

又，代表本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)在標的組織專一性的化合物存在低濃度時對抗原之結合活性與高濃度存在時對抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對抗原在標的組織專一性的化合物存在低濃度時對抗原之結合活性之比之kd(解離速度常數)與在該化合物高濃度存在時之kd(解離速度常數)之比，即kd(化合物低濃度存在下)/kd(化合物高濃度存在下)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(化合物低濃度存在下)/kd(化合物高濃度存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。標的組織專一性的化合物低濃度存在時，未觀察到對抗原之結合活性的情形也不生解離，因此其上限成為無限大之數值。

抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數器等。又，本發明中，當測定某濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性時，宜將該化合物濃度以外之條件設為相同。

例如本發明提供之一個態樣，即在標的組織專一性的化合物不存在時對抗原之結合活性低於在該化合物存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)之篩選取得。

(a)獲得標的組織專一性的化合物不存在時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性

(b)獲於標的組織專一性的化合物存在時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性

(c)選擇標的組織專一性的化合物不存在時抗原結合活性低於該化合物存在時抗原結合活性之抗原結合分域(或抗原結合分子)。

例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於在該化合物以高濃度存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)之篩選取得。

(a)獲得存在低濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性

(b)獲得存在高濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性

(c)選擇存在低濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合活性低於該化合物以高濃度存在時抗原結合活性之抗原結合分域(或抗原結合分子)。

例如本發明提供之一個態樣，即存在標的組織專一性的化合物不存在時對抗原之結合活性低於在該化合物存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之庫之篩選取得。

(a)於標的組織專一性的化合物存在時，使抗原結合分域 (或抗原結合分子)或此等之庫接觸抗原

(b)將於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於該化合物不存在下

(c)單離於前述步驟(b)解離之抗原結合分域(或抗原結合分子)。

例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於在該化合物以高濃度存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之庫之篩選取得。

(a)於存在高濃度標的組織專一性的化合物時使抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之庫與抗原接觸

(b)將於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於該化合物低濃度存在下

例如本發明提供之一個態樣，即標的組織專一性的化合物不存在時對抗原之結合活性低於在該化合物存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之庫之篩選取得。

(a)於標的組織專一性的化合物不存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之庫與抗原接觸、

(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域(或抗原結合分子)

(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物存在下與抗原結合

(d)單離於前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)。

例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於在該化合物以高濃度存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之庫之篩選取得。

(a)於標的組織專一性的化合物低濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之庫與抗原接觸、

(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物高濃度存在下與抗原結合

例如本發明提供之一個態樣，即標的組織專一性的化合物不存在時對抗原之結合活性低於在該化合物存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之庫之篩選取得。

(a)於標的組織專一性的化合物存在下使抗原結合分域 (或抗原結合分子)之庫接觸固定有抗原之管柱；(b)使於前述步驟(a)結合於管柱之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物不存在下從管柱溶出；(c)將於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。

例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於該化合物以高濃度存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之庫之篩選取得。

(a)於標的組織專一性的化合物以高濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之庫接觸固定有抗原之管柱；(b)使於前述步驟(a)結合於管柱之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物以低濃度存在下從管柱溶出；(c)將於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。

例如本發明提供之一個態樣，即標的組織專一性的化合物不存在時對抗原之結合活性低於在該化合物存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。

(a)於標的組織專一性的化合物不存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之庫通過固定有抗原之管柱；(b)回收於前述步驟(a)未結合於管柱而溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)； (c)使前述步驟(b)回收之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物存在下結合於抗原；(d)將於前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)單離。

例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於在該化合物以高濃度存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。

(a)於標的組織專一性的化合物於低濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之庫通過固定有抗原之管柱；(b)回收於前述步驟(a)未結合於管柱而溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)；(c)使前述步驟(b)回收之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物高濃度存在下結合於抗原；(d)將於前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)單離。

(a)於標的組織專一性的化合物存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之庫與抗原接觸；(b)取得於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)；(c)將前述步驟(b)取得之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於化合物不存在下；(d)將前述步驟(c)中抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。

(a)於標的組織專一性的化合物高濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之庫與抗原接觸；(b)取得於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)；(c)將前述步驟(b)取得之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於化合物低濃度存在下；(d)將前述步驟(c)中抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。

又，前述步驟也可重複2次以上。因此依本發明，提供藉由在上述篩選方法更包括重複(a)~(c)或(a)~(d)之步驟2次以上之步驟的篩選方法取得之標的組織專一性的化合物不存在時對抗原之結合活性低於該化合物存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)或存在低濃度標的組織專一性的化合物時對抗原之結合活性低於該化合物以高濃度存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複的次數不特別限定，通常為10次以內。

本發明之篩選方法中，標的組織專一性的化合物，可為相較於非標的組織，以相異濃度(例如：高濃度或低濃度)存在於標的組織等之定量性標的組織專一性規定之化合物。例如：標的組織專一的化合物以任意濃度差示地存在。但是一般而言，標的組織專一性的化合物，可於至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少10³倍、至少10⁴倍、至少10⁵倍、至少10⁶倍、或更多且直到無限大(亦即於非標的組織不存在之情形)之增加濃度存在。

區別低濃度及高濃度之閾值可因應化合物適當設定。例如：於ATP或腺苷之閾值之一非限定態樣中，作為閾值，低濃度條件可從10nM、1nM、100pM、10pM、1pM或0M之值適當設定。因應設定之閾值，高濃度條件，可從各閾值之至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少10³倍、至少10⁴倍、至少10⁵倍、至少10⁶倍之值適當設定。又，於PGE2之一非限定態樣中，作為閾值，低濃度條件可從10pM、1pM、100fM、10fM、1fM或0M之值適當設定。因應設定之閾值，高濃度條件可從各閾值之至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少10³倍、至少10⁴倍、至少10⁵倍、至少10⁶倍之值適當設定。再者，作為犬尿胺酸之一非限定態樣中，作為閾值，低濃度條件可從10μM、1μM、100nM、10nM、1nM或0M之值適當設定。因應設定之閾值，高濃度條件可從各閾值之至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少10³倍、至少10⁴倍、至少10⁵倍、至少10⁶倍之值適當設定。

抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，可利用對該技術領域中具有通常知識者為公眾所知之方法測定，針對標的組織專一性的化合物之濃度以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等的形式進行評價。此等可利用對該技術領域中具有通常知識者為公眾所知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、scatchard作圖法、FACS等。

本發明中，選擇標的組織專一性的化合物存在時抗原結合活性高於該化合物不存在時抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇標的組織專一性的化合物不存在時抗原結合活性低於該化合物存在時抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟之含意相同。

又，本發明中，選擇存在高濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合活性高於該化合物於低濃度存在下時之抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇標的組織專一性的化合物不存在時抗原結合活性低於該化合物存在時抗原結合活性之抗原結合分域或抗體的步驟的含意相同。

只要是標的組織專一性的化合物不存在時對抗原之結合活性低於該化合物存在時對抗原之結合活性，則該化合物存在時之抗原結合活性與不存在時之抗原結合活性之差距不特別限定，較佳為該化合物存在時之抗原結合活性為不存在時之抗原結合活性之2倍以上，更佳為10倍以上，又更佳為40倍以上。該抗原結合活性之差距之上限不特別限定，只要是該技術領域中具有通常知識者之技術可製作，亦可為400倍、1000倍、10000倍等各種值。標的組織專一性的化合物不存在下，未觀察到對抗原之結合活性之情形，其上限成為無限大之數值。

利用前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)可為任意抗原結合分域(或抗原結合分子)，可篩選例如上述抗原結合分域(或抗原結合分子)。例如：可篩選具有天然序列之抗原結合分域(或抗原結合分子)，也可篩選胺基酸序列經取代之抗原結合分域(或抗原結合分子)。

庫

依某一態樣，本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可從使抗原結合分子對抗原之結合活性依存於標的組織專一性的化合物變化之至少一個胺基酸殘基含於抗原結合分域之彼此序列不同之多數抗原結合分子為主而成之庫取得。作為該化合物之例，可列舉：(1)乳酸、琥珀酸、檸檬酸等解糖系、或克氏循環(Krebs cycle)之一次代謝產物、(2)丙胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸等胺基酸、(3)犬尿胺酸、及其代謝產物、鄰胺苯甲酸、3-羥基犬尿胺酸、及犬尿喹啉酸等胺基酸之代謝產物、(4)前列腺素E2等花生四烯酸之代謝產物、以及(5)腺苷、腺苷3磷酸(ATP)、腺苷2磷酸(ADP)、腺苷1磷酸(AMP)等具有嘌呤環結構之核苷等。以下，針對如此之使抗原結合分子對抗原之結合活性依存於作為標的組織專一性的化合物之腺苷、及/或ATP變化之至少一個胺基酸殘基含於抗原結合分域之彼此序列互異之多數抗原結合分子為主而成之庫舉例說明。

本說明書中，「庫」係指多數抗原結合分子或含有抗原結合分子之多數融合多胜肽、或編碼為該等序列之核酸、聚核苷酸。庫中所含之多數抗原結合分子或含有抗原結合分子之多數融合多胜肽之序列，可為單一序列，也可為彼此序列互異之抗原結合分子或含有抗原結合分子之融合多胜肽。

本說明書中，彼此序列互異之多數抗原結合分子之記載中的「彼此序列互異」之用語，係指庫中之各個抗原結合分子之序列彼此相異。亦即，庫中之彼此互異之序列之數目，係反映庫中之序列相異之獨立選殖體之數目，有時也稱為「庫尺寸」。通常之噬菌體展示庫，係10⁶至10¹²，可利用核糖體展示法等公眾所知之技術將庫尺寸擴大到10¹⁴。但是噬菌體庫之淘選選擇時使用之噬菌體粒子之實際數目，通常比庫尺寸大10至10,000倍。該過剩的倍數，也稱為「庫當量數」，但代表可能存在具有相同胺基酸序列之各個選殖體10至10,000個。所以本發明中之「彼此序列互異」之用語，係指排除庫當量數後之庫中之各個抗原結合分子之序列彼此不同，更具體而言，係指彼此序列互異之抗原結合分子存在10⁶至10¹⁴個分子，較佳為10⁷至10¹²分子，更佳為10⁸至10¹¹，尤佳為10⁸至10¹⁰個分子。

又，本發明之由多數抗原結合分子為主而成之庫之記載中之用語「多數」，例如本發明之抗原結合分子、融合多胜肽、聚核苷酸分子、載體或病毒通常係指其物質2種以上之集合。例如：若某2種以上之物質就特定形質彼此互異，則代表此物質存在有2種以上。舉例而言，在胺基酸序列中之特定胺基酸位置觀察到的變異體胺基酸。例如：柔性殘基以外、或在表面露出之非常多樣化的胺基酸位置的特定變異體胺基酸以外係實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2種以上之抗原結合分子時，本發明之抗原結合分子存在多個。其他例中，若有編碼為柔性殘基之鹼以外、或編碼為於表面露出之非常多樣之胺基酸位置之特定之變異體胺基酸之鹼以外實質相同，較佳為相同序列之本發明之2種以上之聚核苷酸分子，則本發明之聚核苷酸分子存在多數個。

再者，本發明之由多數抗原結合分子為主而成之庫之記載中，「為主而成」之用語，係反映庫中之序列之不同獨立選殖體之數目當中，依標的組織專一性化合物之濃度條件而抗原結合分子對抗原之結合活性相異之抗原結合分子之數目。具體而言，顯示如此結合活性之抗原結合分子在庫中至少有10⁴個分子存在較佳。又，更佳為本發明之抗原結合分域係從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在10⁵分子之庫取得。更佳為本發明之抗原結合分域可從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在10⁶分子之庫取得。尤佳為本發明之抗原結合分域可從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在10⁷分子之庫取得。又，較佳為本發明之抗原結合分域可從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在10⁸分子之庫取得。於另一表達中，庫中不同序列之獨立選殖體之數目中，依腺苷、及/或ATP之存在或不存在而抗原結合分域對抗原之結合活性不同之抗原結合分子之比例，也可理想地表達。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此結合活性之抗原結合分子含於庫中不同序列之獨立選殖體之數目之0.1%至80%，較佳為0.5%至60%，更佳為1%至40%，又更佳為2%至20%，尤佳為4%至10%的庫取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可由分子數目或在分子全體之比例表達。又，病毒之情形，亦與上述相同，可由病毒個體之數目或在個體全體之比例表達。

依腺苷、及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之胺基酸

依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可以任意地製備，可從預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、與腺苷或ATP適當連結之高免疫原性之T細胞抗原決定部位胜肽之類的佐劑作用劑間之連結物(conjugate)免疫之動物之B細胞等免疫細胞製作之抗體或庫等。作為該T細胞抗原決定部位胜肽之一非限定例，可理想地列舉來自Tetanus toxin之p30幫助者胜肽(以序列編號：4表示，也稱為Fragment C(FrC))等。

作為如前述依腺苷及/或ATP存在或不存在而使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸，可列舉形成腺苷及/或ATP結合模體之胺基酸。含有前述胺基酸之抗原結合分域中之胺基酸之位置不限於特定位置，只要依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化即可，形成抗原結合分域之重鏈可變區或輕鏈可變區中之任一位置均有可能。亦即，本發明之抗原結合分域，可從依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸含於重鏈之抗原結合分域之彼此序列互異的抗原結合分子為主而成之庫取得。於一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸係含於重鏈之CDR1、CDR2、及/或CDR3之彼此序列互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。於一非限定之另一態樣中，本發明之抗原結合分域，可從依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸係含於重鏈之FR1、FR2、FR3及/或FR4的彼此序列互異之抗原結合分子為主而成的庫取得。

又，本發明之一態樣中，本發明之抗原結合分域，可從依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸係含於重鏈及/或輕鏈之抗原結合分域之彼此序列互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。於一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從依腺苷及/或ATP存在或不存在而使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸係含於重鏈及/或輕鏈之CDR1、CDR2、及/或CDR3之彼此序列互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。於另一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，係從依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸係含於重鏈及/或輕鏈之FR1、FR2、FR3及/或FR4之彼此序列互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。

作為如此之胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位之胺基酸中任一者以上之胺基酸等。又，作為如此之胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位之Ser、52a位之Ser、53位之Arg、96位之Gly、100a位之Leu、100c位之Trp等胺基酸中之任一者以上之胺基酸。

只要抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區之框架序列依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸係含有於重鏈及/或輕鏈之抗原結合分域，可使用任意框架序列。框架序列之起源雖不限定，但可從非人類動物之任意生物或人類取得。較佳為作為任意生物，列舉從小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、羊、山羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類選擇之生物為理想。尤理想的實施形態中，抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區之框架序列，以具有人類之生殖細胞系框架序列為理想。因此，於本發明之一態樣中，若框架序列完全為人類序列，且對人類投予(例如疾病之治療)時，可認為本發明之抗原結合分子幾乎或完全不會引起免疫原性反應。由上述含意，本發明之「含有生殖細胞系列之序列」，係指本發明之框架序列的一部分與任一人類之生殖細胞系框架序列的一部分為相同。例如，當為本發明之抗原結合分子之重鏈FR2之序列與多數不同之人類之生殖細胞系框架序列之重鏈FR2序列組合而得之序列時，亦為本發明之「含有生殖細胞系列之序列」抗原結合分子。又，本發明之抗原結合分子之框架序列係經取代之序列的情形，係為本發明之「含有生殖細胞系列之序列」之抗原結合分子。作為經如此取代之序列之例，尤其可列舉人類之生殖細胞系框架序列之一部分胺基酸取代為依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之胺基酸之序列。

框架，例如V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網站包括的現在已知之完全人類型之框架區之序列為理想。該等框架區之序列可適當使用作為在本發明之抗原結合分子包含之生殖細胞系列之序列。生殖細胞系列之序列，也可依其類似性分類(Tomlinson等人(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23, 1456-1461)及Cox等人(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可從分類為7個次群之Vκ、分類為10個次群之Vλ、分類為7個次群之VH適當選擇理想的生殖細胞系列之序列。

完全人類型之VH序列不僅限定於下列，但可舉例如VH1次群(例如：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2次群(例如：VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3次群(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4次群(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5次群(VH5-51)、VH6次群(VH6-1)、VH7次群(VH7-4、VH7-81)之VH序列等為理想例。該等在公知文獻(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等也有記載，該技術領域中具有通常知識者可依據該等序列資訊適當設計本發明之抗原結合分子。該等以外之完全人類型之框架或框架之準區也可理想地使用。

完全人類型之Vκ序列，不僅限定於下列，例如可舉分類於Vk1次群之A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18、分類於Vk2次群之A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11、分類於Vk3次群之A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25、分類於Vk4次群之B3、分類於Vk5次群之B2(本說明書中，也稱為Vk5-2))、分類於 Vk6次群之A10、A14、A26等(Kawasaki等人，(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable及Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)及Brensing-Kuppers等人(Gene(1997)191,173-181))為理想例。

完全人類型之Vλ序列不僅限定於下列，例如可舉分類於VL1次群之V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22、分類於VL1次群之V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、分類於VL3次群之V3-2、V3-3、V3-4、分類於VL4次群之V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、分類於VL5次群之V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等人(Genome Res.(1997)7,250-261))為理想例。

通常該等框架序列由於一個或更多胺基酸殘基的不同而彼此互異。該等框架序列可以與本發明之「依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基」一起使用。與本發明之「依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基」一起使用之完全人類型之框架之例，不僅限定於此，其他也有比如KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如前述Kabat等人(1991)及Wu等人(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。

本發明不拘於特定理論，在使用生殖細胞系序列能期待排除幾乎於個人類的有害免疫反應之理由之一，據認為係如下所述。由於在通常之免疫反應中發生之親和性成熟步驟，會在免疫球蛋白之可變區頻繁地發生體細胞之突變。該等突變主要產生在其該序列為超可變的CDR的周邊，但也會影響到框架區的殘基。該等框架的突變在生殖細胞系之基因不存在，成為患者之免疫原性的可能性少。據推論此係通常之人類族群係已暴露於由生殖細胞系之基因表現的框架序列中的大多數，而有免疫寛容，可預測該等生殖細胞系之框架在患者為低免疫原性或非免疫原性。為了使免疫寛容之可能性最大，可從普通存在之機能性生殖細胞系基因之集合選擇編碼為可變區之基因。

為了製作本發明之依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之胺基酸包含於可變區序列之序列、重鏈可變區或輕鏈可變區之序列、或CDR序列或框架序列之抗原結合分子，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。

例如，可藉由將選擇預先含有依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基之作為CDR序列及/或框架序列之輕鏈可變區、及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區予以組合，而製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。

又，在選擇預先含有前述依腺苷或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基之作為CDR序列及/或框架序列之重鏈及/或輕鏈可變區之序列中，也可設計使得含有多樣的胺基酸作為該胺基酸殘基以外之殘基。本發明中，如此之殘基稱為柔性殘基。本發明之抗原結合分子對抗原之結合活性，只要會依組織專一的化合物之濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可包括一個或更多柔性殘基。是否能將柔性殘基及其殘基取代為其他某一胺基酸而庫化，可藉由進行腺苷及/或ATP與抗體之複合體之結晶結構解析或變異導入以鑑定。例如：可從腺苷及/或ATP與抗體之複合體之結晶結構解析，鑑定未涉及腺苷及/或ATP之結合之抗體之殘基。可選擇鑑定為即使將未涉及腺苷及/或ATP之結合鑑定之殘基取代為其他胺基酸仍能維持對化合物之適度結合之胺基酸。藉此，能設計在選擇之殘基出現經選擇之胺基酸之庫。於此情形，可設計由多數抗原結合分子為主而成之庫，以使得成為鑑定為未涉及腺苷及/或ATP之結合之殘基取代為彼此不同之胺基酸而得之抗原結合分子之集合。亦即，藉由組合取代為彼此互異之胺基酸之各個柔性殘基，可帶來含有該柔性殘基之抗原結合分子之序列之多樣性。

又，可設計含有該等殘基之抗原結合分子，使得鑑定為涉及腺苷及/或ATP之結合之殘基中至少一個成為選自該殘基及與該殘基不同之殘基之任意殘基。作為鑑定為涉及腺苷及/或ATP之結合之胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位之胺基酸中之任一者以上之胺基酸等。又，作為如此之胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位之Ser、52a位之Ser、53位之Arg、96位之Gly、100a位之Leu、100c位之Trp等胺基酸中之任一者以上之胺基酸。例如：前述100a位之Leu鑑定為涉及腺苷及/或ATP之結合之情形，庫中包含之抗原結合分子之100a位之胺基酸殘基，除了Leu以外，也可為選自His、Met、Leu、Arg、Trp、或Tyr中之任一者之柔性殘基之胺基酸殘基。

作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之31位、32位、33位、35位、50位、55位、56位、57位、58位、59位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、100a位、及100b位之胺基酸。作為如此之胺基酸之另一非限定態樣，可列舉輕鏈可變區所含之26位、27位、27a位、27b位、27c位、28位、29位、31位、32位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95a位、96位、及97位之胺基酸。

作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉係重鏈可變區所含之胺基酸；且31位之胺基酸為Asp、Gly、Asn、Ser、Arg、或Thr中之任一者、32位之胺基酸為Ala、Phe、His、Asn、Ser、或Tyr中之任一者、33位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Thr中之任一者、35位之胺基酸為His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中之任一者、50位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、 Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Ser中之任一者、55位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Leu、Thr、Ser、Arg、或Asn中之任一者、56位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Val、或Tyr中之任一者、57位之胺基酸為Ala、Lys、Arg、Thr、或Ile中之任一者、58位之胺基酸為Asp、Gly、Phe、His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中之任一者、59位之胺基酸為Leu、或Tyr中之任一者、95位之胺基酸為Ala、Ile、Lys、Met、Leu、Arg、Trp、Val、Tyr、或Phe中之任一者、96位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、或Ser中之任一者、97位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Ser、Val、Tyr、或Arg中之任一者、98位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Lys中之任一者、99位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Gly中之任一者、100位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asp中之任一者、 100a位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、His、Lys、Met、Arg、Trp、Val、或Tyr中之任一者、或100b位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中之任一者之胺基酸。

作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉係輕鏈可變區所含之胺基酸；且26位之胺基酸為Ala、Ser、或Thr中之任一者、27位之胺基酸為Thr、或Ser中之任一者、27a位之胺基酸為Gly、Asn、Thr、或Ser中之任一者、27b位之胺基酸為Asn、或Asp中之任一者、27c位之胺基酸為Ile、或Val中之任一者、28位之胺基酸為Asp、或Gly中之任一者、29位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Gly中之任一者、31位之胺基酸為Glu、Asp、Lys、或Asn中之任一者、32位之胺基酸為Ala、Asp、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、50位之胺基酸為Asp、Gly、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Tyr、或Glu中之任一者、51位之胺基酸為Asp、Gly、Lys、Asn、Thr、或Val中之任一者、52位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、或Ser中之任一者、53位之胺基酸為Glu、Asp、His、Asn、Gln、Ser、Tyr、或Lys中之任一者、54位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、55位之胺基酸為Leu、或Pro中之任一者、89位之胺基酸為Ala、Gly、Phe、Leu、Asn、Gln、Thr、Val、Tyr、或Ser中之任一者、90位之胺基酸為Ala、Leu、Thr、Val、或Ser中之任一者、91位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、或Tyr中之任一者、92位之胺基酸為Glu、Asp、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Ala中之任一者、93位之胺基酸為Ala、Asp、Ile、Asn、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Gly中之任一者、94位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、Ile、Asn、Arg、Thr、或Ser中之任一者、95位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中之任一者、95a位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Asn中之任一者、96位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val中之任一者、或97位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Met、Leu、Ser、或Val中之任一者之胺基酸。

本說明書中，柔性殘基係指當比較公知之及/或天然抗體或抗原結合分域之胺基酸序列時，在該位置提示之幾個具有不同胺基酸之輕鏈及重鏈可變區上之胺基酸為非常多樣的位置所存在胺基酸殘基的變化(variation)。非常多樣的位置一般存在於CDR區。於一態樣中，當決定公知之及/或天然抗體之非常多樣的位置時，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年)提供之資料係為有效。又，在網路上的許多資料庫(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)，提供收集的多數人類輕鏈及重鏈序列及其配置，該等序列及其配置的資訊在決定本發明中之非常多樣的位置時有用。依本發明，當胺基酸位在的位置較佳有約2至約20，更佳為約3至約19，較佳為約4至約18、較佳為5至17、較佳為6至16、較佳為7至15、較佳為8至14、較佳為9至13、較佳為10至12個可能的不同胺基酸殘基的多樣性時，其位置可稱為非常多樣。在一些實施形態中，有些胺基酸位置，可具有較佳為至少約2、較佳為至少約4、較佳為至少約6、較佳為至少約8、較佳為約10、較佳為約12之可能的相異胺基酸殘基的多樣性。

又，藉由組合導入有前述依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區及製作為作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區，也能製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。同樣地，藉由導入前述依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基，且組合設計其他胺基酸殘基作為柔性殘基之重鏈可變區，也可製作含有本發明之多數彼此序列互異抗原結合分子之庫。

將前述導入有依標的組織專一性化合物之濃度條件使抗原結合分子對抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基之輕鏈可變區及製作為無規化可變區序列庫之重鏈可變區予以組合之情形，亦與前述同樣，可設計成使柔性殘基含於該輕鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對抗原之結合活性，只要依腺苷及/或ATP存在或不存在變化即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即，可於重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列含有一個或更多柔性殘基。

作為組合之重鏈可變區之例，可列舉無規化可變區庫為理想例。無規化可變區庫之製作方法可適當組合公眾所知之方法。於本發明之一非限定態樣中，依以特定之抗原免疫之動物、傳染病患者或接種疫苗而使血中抗體價上昇之人類、癌患者、自體免疫疾病之淋巴球來源之抗體基因為依據構建之免疫庫，可理想地作為無規化可變區庫使用。

又，本發明之一非限定態樣中，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸組而得之合成庫，也可理想地作為隨機化可變區庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶有多樣性。露出於表面之位置，係指可基於抗原結合分子之構造、構造整體、及/或模式化的構造而判斷可露出表面，及/或可與抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之三維模型的座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維構造資訊實施。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4埃以下。再者，使用個人類電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。

又，本發明之一非限定態樣中，為了提高抗體之安定性，也可適當改變包含CDR區及/或框架區之可變區之胺基酸。如此之胺基酸一非限定態樣，可列舉1位、5位、10位、30位、48位、58位之胺基酸。更具體而言，可列舉1位之Gln、5位之Gln、10位之Asp、30位之Asn、48位之Leu、58位之Asn。為了提高抗體之安定性，可將該等胺基酸取代為生殖細胞系列之序列所含之對應之胺基酸。作為如此之生殖細胞系列一非限定態樣之序列，可列舉VH3-21之序列。於此情形中，可取代為1位之Gln為Glu、5位之Gln為Val、10位之Asp 為Gly、30位之Asn為Ser、48位之Leu為Val、58位之Asn為Tyr。

又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人類之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其曲目不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變庫作為隨機化可變區庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本發明記載之含有未改變序列之胺基酸序列，係指從如此之未改變庫取得的胺基酸序列。

Fc區

Fc區包含從抗體重鏈之不變區而來之胺基酸序列。Fc區，係EU編號表示之約216位之胺基酸中，自木瓜酶切斷部位之鉸鏈區之N末端起包含該鉸鏈、CH2及CH3分域之抗體之重鏈不變區之部分。Fc區可從人類IgG1得到，但也可限定為IgG之特定之次類別。如此之Fc區之理想例，可列舉如後述在pH酸性域對FcRn有結合活性之Fc區。又，該Fc區之理想例，可列舉如後述對Fcγ受體有結合活性之Fc區。作為如此之Fc區之一非限定態樣，可列舉人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之Fc區。

Fcγ受體(FcγR)

Fcγ受體(也記載為FcγR)，係指能與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合的受體，實質上意指由Fcγ受體基因編碼之蛋白質之家族的任一成員。人類中，該家族包括含同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；含同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131。亦即，包括FcγRIIa(H)及FcγRIIa(R))、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及含構造同型FcγRIIIa(包括副型V158及F158。亦即，包括FcγRIIIa(V)及FcγRIIIa(F))及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)、及任意未曾發現的人類FcγR類或FcγR構造同型或副型，但不限定於此等。FcγR，包括人類、小鼠、大鼠、兔及猴來源者，但不限定於此等，可為任意生物來源。小鼠FcγR類，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、及任意未曾發現的小鼠FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。如此的Fcγ受體之理想例，可舉人類FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。人類FcγRI之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：9(NM_000566.3)及10(NP_000557.1)，FcγRIIa(副型H131)之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：11(BC020823.1)及12(AAH20823.1)、(副型R131，係序列編號：12之166號胺基酸取代為Arg之序列)、FcγRIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：13(BC146678.1)及14(AAI46679.1)，FcγRIIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：15(BC033678.1)及16(AAH33678.1)，及FcγRIIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：17(BC128562.1)及18(AAI28563.1)(括弧內代表RefSeq等資料庫登錄編號)。Fcγ 受體是否有與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合之活性，除了上述記載之FACS或ELISA格式以外，也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)及包括同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，會與IgG之Fc部分結合之α鏈及在細胞內傳遞活化信號之有ITAM之共通γ鏈組合。另一方面，含有同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)本身的細胞質分域，包括ITAM。該等受體在巨噬細胞或肥大細胞(mast cell)、抗原提示細胞等許多免疫細胞表現。該等受體藉由與IgG之Fc部分結合而傳遞的活化信號，促進巨噬細胞之吞噬能力或發炎性細胞激素產生、肥大細胞之脫顆粒、抗原提示細胞之機能亢進。如上述，具有傳遞活化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為活性型Fcγ受體。

另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)本身的細胞質內分域包括傳遞抑制型信號之ITIM。B細胞中，由於FcγRIIb與B細胞受體(BCR)的交聯，抑制來自BCR之活化信號。結果使BCR之抗體產生受抑制。巨噬細胞中，由於FcγRIII與FcγRIIb之交聯使吞噬能力或發炎性細胞激素的產生能力受抑制。如上述有傳遞抑制化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為抑制型Fcγ受體。

Fc區對Fcγ受體之結合活性

如前述，作為本發明之抗原結合分子含有之Fc區，可列舉對Fcγ受體有結合活性之Fc區。作為如此之Fc區之一非限定態樣，可列舉人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之Fc區。Fcγ受體是否對IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區有結合活性，可利用如上記載之FACS或ELISA格式確認，此外也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

ALPHA篩選，係利用使用提供者與接受者的2種珠之ALPHA技術，依下列之原理實施。接近於提供者珠之分子會與結合於接受者珠之分子以生物學交互作用，僅在2珠接近的狀態檢測出發光信號。由雷射激發的提供者珠內的光敏劑將周邊的氧變換為激發狀態的單態氧。單態氧擴散到提供者珠周邊，到達接近的接受者珠時會引起珠內之化學發光反應，最終發出光。與提供者珠結合之分子及結合於接受者珠之分子彼此未交互作用時，提供者珠產生之單態氧未到達接受者珠，故不起化學發光反應。

例如於提供者珠結合有包括經生物素標記之Fc區之抗原結合分子，於接受者珠結合有以麩胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化的Fcγ受體。競爭的含Fc區改變體之抗原結合分子不存在時，有天然型Fc區之抗原結合分子與Fcγ受體會交互作用並產生520-620nm的信號。含有未標籤化的Fc區改變體之抗原結合分子，會與有天然型Fc區之抗原結合分子在與Fcγ受體間之交互作用競爭。將競爭結果表示之螢光減少予以定量，可決定相對的結合親和性。抗體等抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係為公知。將Fcγ受體以GST予以標籤化之方法，可適當採用將編碼為Fcγ受體之聚核苷酸與編碼為GST之聚核苷酸於同一讀框融合而得之融合基因連結於保持有可作用之載體的細胞等中表現，並使用麩胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號可藉由使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等的軟體以非線性回歸解析之一部位競爭(one-site competition)模型擬合(fitting)而理想地解析。

將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感應晶片之金薄膜上，並從感應晶片的背側照射光使在金薄膜與玻璃的交界面發生全反射，則反射光的一部分會形成反射強度下降的部分(SPR信號)。將觀察交互作用之物質的其中另一者(分析物)流過感應晶片的表面並使配體與分析物結合，則經固定化之配體分子的質量增加，感應晶片表面之溶劑之折射率會改變。藉由該折射率的變化，SPR信號的位置會偏移(反之，結合若解離，則回到信號位置)。Biacore系統取上述偏移量，亦即感應晶片表面之質量變化作為縱軸，將質量之時間變化作為測定資料表示(感測圖)。從感測圖的曲線，求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，由該常數之比求出親和性(KD)。BIACORE法也可理想地使用於抑制測定法。抑制測定法，例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。。

Fcγ受體(FcγR)結合改變Fc區

作為本發明含有之Fc區，除了人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之Fc區以外，也可適當使用比起天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，對Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合改變Fc區。本說明書中，「天然型人類IgG之Fc區」，係指序列編號：5、6、7或8例示之人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc區之EU編號297位所結合之糖鏈係含岩藻醣之糖鏈之Fc區。如此之FcγR結合改變Fc區，可藉由改變天然型人類IgG之Fc區之胺基酸以製作。FcγR結合改變Fc區對FcγR之結合活性，是否比天然型人類IgG之Fc區對FcγR之結合活性高，可使用前述結合活性之項目記載之方法適當實施。

本發明中，Fc區之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，包含改變為與初始Fc區之胺基酸序列不同之胺基酸序列。只要初始Fc區之修飾改變體在pH中性域會與人類Fcγ受體結合，可使用任一Fc區作為初始Fc區。又，將已施有改變之Fc區作為初始Fc區再進一步施加改變之Fc區也可理想地作為本發明之Fc區。初始Fc區，可指多胜肽本身、含有初始Fc區之組成物、或編碼為初始Fc區之胺基酸序列。初始Fc區，可包含利用在抗體項目大概說明的重組而產生之公眾所知之Fc區。初始Fc區之起源不限定，但可從非人類動物之任意生物或人類取得。較佳為任意生物，可列舉小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、羊、山羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類選出的生物。於其他態樣中，初始Fc區可也從食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩、或人類取得。較佳為初始Fc區從人類IgG1取得，但不限於IgG之特定類別。此代表可適當使用人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之Fc區作為初始Fc區。同樣地，本說明書中，意指前述任意生物來源的IgG之任意類別或次類之Fc區，可較佳地作為初始Fc區。天然存在之IgG之變異體或操作型，例如記載於公眾所知之文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、國際公開WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、及WO2006/105338)，但不限定於此等。

改變例如包括：一個以上之變異，例如，取代為與初始Fc區之胺基酸相異之胺基酸殘基之變異、或對初始Fc區之胺基酸插入一個以上之胺基酸殘基或使初始Fc區之胺基酸有一個以上胺基酸缺失等。較佳為，改變後之Fc區之胺基酸序列中包括至少一部分非天然之Fc區之胺基酸序列。如此的變種必然與初始Fc區有少於100%之序列同一性或類似性。理想之實施形態中，變種與初始Fc區之胺基酸序列有約75%~少於100%之胺基酸序列同一性或類似性，更佳為約80%~少於100%，又更佳為約85%~少於100%，再更佳為約90%~少於100%，最佳為約95%~少於100%之同一性或類似性之胺基酸序列。本發明之一非限定態樣中，初始Fc區及本發明之經改變之Fc區之間，有至少1個胺基酸之差異。初始Fc區與本發明之FcγR結合改變Fc區之胺基酸之不同，尤其以前述EU編號指定之胺基酸殘基之位置之經指定之胺基酸之差異也可理想地指定。如此之變種之製作方法，例示於「胺基酸之改變」之項目。

本發明之抗原結合分子所含之比起天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性對Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合改變Fc區(FcγR結合改變Fc區)，可利用任意方法取得，具體而言，藉由改變作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸，可取得該FcγR結合改變Fc區。用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如：序列編號：5、6、7或8例示之人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。

改變為其他胺基酸，只要比起天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，對Fcγ受體之結合活性較高即可，可改變任意位置之胺基酸。抗原結合分子含有人類IgG1之Fc區作為人類Fc區的情形，宜包含EU編號297位結合之糖鏈為含岩藻醣之糖鏈即帶來使比起天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，對Fcγ受體之結合活性較高之效果之改變較佳。如此之胺基酸之改變，例如國際公開WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260及WO2006/023403等已有報告。

可為如此改變之胺基酸，例如從EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中選出之至少一個以上之胺基酸。藉由該等胺基酸之改變，可取得比起天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，對Fcγ受體之結合活性較高之Fc區(FcγR結合改變Fc區)。

為了於本發明使用，特別理想的改變，例如從Fc區之EU編號表示之；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、 223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、 263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、 293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、 305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、 377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、或440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群中選出之至少一個以上之胺基酸之改變。又，改變之胺基酸之數目不特別限定，可僅有一處胺基酸改變，也可有二處以上之胺基酸改變。二處以上之胺基酸之改變之組合，例如表1(表1-1~表1-3)記載之組合。

【表1-1】

表1-2係接續表1-1之表。

【表1-2】

表1-3係接續表1-2之表。

【表1-3】

測定本發明之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合域與Fcγ受體間之結合活性之pH之條件，可適當使用pH酸性域至pH中性域之條件。作為測定本發明之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合域與Fcγ受體間之結合活性之條件的pH酸性域至pH中性域，通常指pH5.8~pH8.0。較佳為pH6.0~pH7.4之任意pH值代表之範圍，較佳為從pH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、及7.4選擇，尤佳為接近癌組織之pH之pH6.15~7.4(Vaupel等人(Cancer Res.(1989)49,6449-6665))。就測定條件使用之溫度而言，Fcγ受體結合域與人類Fcγ受體間之結合親和性可於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為為了決定人類Fcγ受體結合域與Fcγ受體間之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為將20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一者之20℃至35℃的任意溫度也同樣使用在決定Fcγ受體結合域與Fcγ受體間之結合親和性。25℃之溫度，為本發明之態樣一非限定例。

本說明書中，FcγR結合改變Fc區對Fcγ受體之結合活性高於天然型Fc區對Fcγ受體之結合活性，係指FcγR結合改變Fc區對FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性高於天然型Fc區對該等人類Fcγ受體之結合活性。例如：依據上述解析方法，相較於作為對照之含人類IgG之天然型Fc區之抗原結合分子之結合活性，含FcγR結合改變Fc區ㄅ抗原結合分子之結合活性顯示105%以上，較佳為110%以上、115%以上、120%以上、125%以上，尤佳為130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上之結合活性。作為天然型Fc區，也可使用初始Fc區，也可使用相同次類之抗體之天然型Fc區。

本發明中，作為對照之人類IgG之天然型Fc區，宜使用EU編號表示之297位之胺基酸所結合之糖鏈為含岩藻醣之糖鏈者即天然型人類IgG之Fc區。是否EU編號表示之297位之胺基酸所結合之糖鏈為含岩藻醣之糖鏈，可使用非專利文獻6記載之方法。例如：可依如下方法判定天然型人類IgG之Fc區所結合之糖鏈是否為含岩藻醣之糖鏈。藉由使待驗天然型人類IgG與N-Glycosidase F(Roche diagnostics)反應，可從待驗天然型人類IgG使糖鏈游離(Weitzhandler等人(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。然後，使乙醇反應，並將已去除蛋白質之反應液(Schenk等(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)之濃縮乾固物以2-胺基吡啶進行螢光標記(Bigge等人(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。利用使用纖維素匣之固相萃取進行脫試藥、並已螢光標記之2-AB化糖鏈，以順相層析解析。藉由觀察檢測到的層析圖的峰部，可判定人類IgG之天然型Fc區所結合之糖鏈是否為含岩藻醣之糖鏈。

作為對照之含有相同次類之抗體之天然型Fc區之抗原結合分子，可適當使用具有IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子。該Fc區之結構，記載於序列編號：5(資料庫註冊編號AAC82527.1之N末端有A加成)、6(資料庫註冊編號AAB59393.1之N末端有A加成)、7(資料庫註冊編號CAA27268.1)、及8(資料庫註冊編號AAB59394.1之N末端有A加成)。又，當將含有某特定之構造同型之抗體之Fc區之抗原結合分子作為待驗物質的情形，藉由將具有該特定之構造同型之IgG單株抗體之Fc區的抗原結合分子作為對照使用，可驗證含有待驗Fc區之抗原結合分子對Fcγ受體之結合活性之效果。如上述，可適當選擇含有已驗證對Fcγ受體之結合活性高之Fc區之抗原結合分子。

對Fcγ受體有選擇性結合活性之Fc區

又，本發明中可理想地使用之Fcγ受體結合域，例如有對特定之Fcγ受體之結合活性高於對其他Fcγ受體之結合活性之性質之Fcγ受體結合域(對Fcγ受體有選擇性結合活性之Fcγ受體結合域)亦為理想。抗原結合分子使用抗體(作為Fcγ受體結合域之Fc區)的情形，一分子之抗體僅能與一分子之Fcγ受體結合，所以在一分子之抗原結合分子結合於抑制型Fcγ受體之狀態無法與其他活性型FcγR結合，在與活性型Fcγ受體結合之狀態無法與其他活性型Fcγ受體或抑制型Fcγ受體結合。

對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性的Fc區

如前述，作為活性型Fcγ受體，含有FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、FcγRIIa、含有FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)亦為理想例。又，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)為抑制型Fcγ受體之理想例。

本說明書中，作為對特定之Fcγ受體之結合活性高於對其他Fcγ受體之結合活性之例，例如：對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性之情形。於此情形，係指Fc區對於FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性，高於對於FcγRIIb之結合活性。例如：代表依上述解析方法，含Fc區之抗原結合分子對於FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性，為對FcγRIIb之結合活性之105%以上，較佳為110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，尤佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上之結合活性。對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性之Fc區，可理想地含有於抗原結合分域係結合於膜型分子之本發明之抗原結合分子。含有如此之Fc區之IgG1抗體，已知後述ADCC活性增強，所以含有該Fc區之抗原結合分子，作為本發明之醫藥組合物所含之抗原結合分子亦有用。

本發明之一非限定態樣中，對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性(對抑制型Fcγ受體有選擇性結合活性)之Fc區之例，可列舉從前述EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254 位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群選出之至少一個以上之胺基酸係改變為與天然型Fc區不同之胺基酸的Fc區為理想例。

本發明之一非限定態樣中，對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性(對抑制型Fcγ受體有選擇性的結合活性)之Fc區，例如表1-1至1-3記載之多數胺基酸改變為與天然型Fc區相異之胺基酸之Fc區為理想例。

對抑制型Fcγ受體之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性之Fc區

本說明書中，對特定之Fcγ受體之結合活性高於對其他Fcγ受體之結合活性之例，例如：對抑制型Fcγ受體之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性之情形。於此情形，指Fc 區對FcγRIIb之結合活性，高於對FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性。例如：依上述解析方法，含Fc區之抗原結合分子對FcγRIIb之結合活性顯示對FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性之105%以上，較佳為110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，尤佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上之結合活性。對抑制型Fcγ受體之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性之Fc區，可適當地含於抗原結合分域係結合於可溶型分子之本發明之抗原結合分子。

本發明之一非限定態樣中、對抑制型Fcγ受體之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性之(對抑制型Fcγ受體有選擇性的結合活性)之Fc區之例，可列舉前述Fc區之胺基酸中之EU編號表示之238或328之胺基酸改變為與天然型Fc區相異之胺基酸之Fc區為理想例。

又，本發明之一非限定態樣中，對抑制型Fcγ受體之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性之(對抑制型Fcγ受體有選擇性的結合活性之)Fc區之例，可列舉為前述Fc區之EU編號表示之胺基酸且EU編號表示之238之胺基酸改變為Asp、或328之胺基酸改變為Glu中之任一者以上之Fc區為理想例。又，對抑制型Fcγ受體有選擇性結合活性之Fc 區，可適當選擇US2009/0136485記載之Fc區或改變。

又，本發明之一非限定態樣中，為前述Fc區之EU編號表示之胺基酸且EU編號表示之238之胺基酸改變為Asp、或328之胺基酸改變為Glu中之任一者以上之Fc區為理想例。

又，本發明之一非限定態樣中，有以下任一者以上的改變的Fc為理想例：PCT/JP2012/054624例示之EU編號表示之238位之Pro為Asp之取代、及EU編號表示之237位之胺基酸為Trp、EU編號表示之237位之胺基酸為Phe、EU編號表示之267位之胺基酸為Val、EU編號表示之267位之胺基酸為Gln、EU編號表示之268位之胺基酸為Asn、EU編號表示之271位之胺基酸為Gly、EU編號表示之326位之胺基酸為Leu、EU編號表示之326位之胺基酸為Gln、EU編號表示之326位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Met、EU編號表示之239位之胺基酸為Asp、EU編號表示之267位之胺基酸為Ala、EU編號表示之234位之胺基酸為Trp、EU編號表示之234位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之237位之胺基酸為Ala、EU編號表示之237位之胺基酸為Asp、EU編號表示之237位之胺基酸為Glu、EU編號表示之237位之胺基酸為Leu、EU編號表示之237位之胺基酸為Met、EU編號表示之237位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之330位之胺基酸為Lys、EU編號表示之330位之胺基酸為Arg、EU編號表示之233位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ser、EU編號表示之326位之胺基酸為Thr、EU編號表示之323位之胺基酸為Ile、EU編號表示之323位之胺基酸為Leu、EU編號表示之323位之胺基酸為Met、EU編號表示之296位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ala、EU編號表示之326位之胺基酸為Asn、EU編號表示之330位之胺基酸為Met。

糖鏈經修飾之Fc區

作為本發明提供之抗原結合分子所含之Fc區，可包含經修飾之Fc區，使得Fc區所結合之糖鏈之組成成為結合有岩藻醣缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或加成有二分化N-乙醯基葡糖胺之Fc區之比例提高。已知若從抗體Fc區所結合之N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺去除岩藻醣殘基，對FcγRIIIa之親和性會增強(非專利文獻6)。如此之含有Fc區之IgG1抗體，已知後述ADCC活性會增強，所以含有該Fc區之抗原結合分子，作為本發明之醫藥組合物含有之抗原結合分子亦為有用。從抗體Fc區所結合之N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺去除岩藻醣殘基而得之抗體，例如：如以下之抗體；經糖苷化修飾之抗體(國際公開WO1999/054342等)、於糖鏈加成之岩藻醣已缺損之抗體(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)、更具體而言，作為從抗體Fc區所結合之N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺去除岩藻醣殘基而得之抗體之不同之一非限定態樣，為了製作於糖鏈加成之岩藻醣已缺損之抗體(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)，而改變形成接受糖鏈修飾之多胜肽之糖鏈結構之活性，結果可製作於糖鏈加成岩藻醣之能力低之寄主細胞。藉由在該寄主細胞表現所望之抗體基因，可從該寄主細胞之培養液回收在此糖鏈中之岩藻醣已缺損之該抗體。作為形成多胜肽之糖鏈結構之活性，可列舉從岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖轉運蛋白(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-去氧甘露糖3,5-差向異構酶，4-還原酶)(EC 1.1.1.271)、及GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC 2.7.7.30)構成之群組中選出之酵素或轉運蛋白之活性為非限定之理想例。該等酵素或轉運蛋白只要能發揮活性即可，不指定其結構。本說明書中，將能發揮該等活性之蛋白質稱為機能性蛋白質。作為改變該等活性之方法之一非限定態樣，可列舉該等活性之缺失。為了製作該等活性缺失之寄主細胞，可適當採用破壞該等機能性蛋白質之基因使不能作用之方法等公知方法(WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。如此之活性缺失之寄主細胞，可以利用將CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞等的內在性該等機能性蛋白質之基因破壞使無法作用之方法等以製作。

具有含二分化GlcNAc結構之糖鏈的抗體(WO2002/079255等)為公知。一非限定態樣中，為了製作含二分化GlcNAc之糖鏈的抗體，係製作表現編碼為具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基轉移酶)(EC 2.4.1.38)活性之機能性蛋白質的基因的寄主細胞。另一非限定之理想態樣中，係製作除了前述機能性蛋白質以外，尚共同表現編碼為具有人類ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTI(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶I)(EC 2.4.1.94)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTII(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶II)(EC 2.4.1.143)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性之機能性蛋白質之基因、及α-1,6-岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.68)之寄主細胞(WO2004/065540)。

藉由對如前述糖鏈加成岩藻醣之能力低之寄主細胞、及具有形成含二分化GlcNAc結構之糖鏈之活性的寄主細胞轉形導入含有抗體基因之表現載體，可分別製作從抗體Fc區所結合之N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺去除岩藻醣殘基而得之抗體、及具有具二分化GlcNAc之糖鏈之抗體。該等抗體之製造方法，也可應用以提高本發明之Fc區所結合之糖鏈之組成係提高已結合岩藻醣缺損糖鏈之Fc區之比例之方式、或以提高已加成二分化N-乙醯基葡糖胺之Fc區之比例之方式修飾之含改變Fc區之抗原結合分子之製造方法。利用如此之製造方法製作之本發明之抗原結合分子所含之Fc區結合之糖鏈之組成，可利用在前述「Fcγ受體(FcγR)結合改變Fc區」記載之方法確認。

多重專一性抗原結合分子或多重抗原結合位之抗原結合分子

特徵為其至少一個抗原結合分域係與抗原分子中之第1抗原決定部位結合且其至少一個其他之抗原結合分域係與抗原分子中之第2抗原決定部位結合的至少包含二個抗原結合分域之抗原結合分子，從其反應之專一性之觀點，稱為多重專一性抗原結合分子。當利用一分子之抗原結合分子所含之二種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合於二個不同之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為雙專一性抗原結合分子。又，當利用一分子之抗原結合分子所含之三種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合於三個不同之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為三重專一性抗原結合分子。

與抗原分子中之第1抗原決定部位結合之抗原結合分域中之抗原結合位、及與第1抗原決定部位在結構方面相異之第2抗原決定部位結合之抗原結合分域中之抗原結合位，其結構係彼此互異。所以，特徵為其至少一個抗原結合分域係與抗原分子中之第1抗原決定部位結合且其至少一個其他之抗原結合分域係與抗原分子中之第2抗原決定部位結合的至少包含二個抗原結合分域之抗原結合分子，從其結構之專一性之觀點，稱為多重抗原結合位抗原結合分子。利用一分子之抗原結合分子含有之二種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合於二個相異之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為二重抗原結合位抗原結合分子。又，利用一分子之抗原結合分子含有之三種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合於三個相異之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為三重抗原結合位抗原結合分子。

包含一或多數抗原結合分域之多價之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子及其製備方法，也記載於Conrath等人(J.Biol.Chem.(2001)276(10)7346-7350)、Muyldermans(Rev.Mol.Biotech.(2001)74,277-302)及Kontermann R.E.(2011)Bispecific Antibodies(Springer-Verlag)等非專利文獻、以及國際公開WO1996/034103或WO1999/023221等專利文獻等。藉由在此等文獻記載之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子及其製備方法，可製作本發明之抗原結合分子

雙專一性抗體及其製作方法

作為製備如前述多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子及其製備方法之一態樣，可採用下列例示之雙專一性抗體及其製作方法。雙專一性抗體，係指包含對不同抗原決定部位專一性結合之二種可變區的抗體。IgG型之雙專一性抗體，可藉由從將2種產生IgG抗體之融合瘤融合而產生的混成融合瘤(hybrid hybridoma(quadroma)分泌(Milstein等人(Nature(1983)305,537-540)。

當使用前述抗體之項目記載之重組方法製造雙專一性抗體的情形，可採用將編碼為含目的之二種可變區之重鏈的基因導入細胞並使此等共同表現的方法。但是如此的共同表現方法中，僅考慮重鏈之組合，會成為如下的組合成為2：1：1之分子數之比例存在的混合物，即(i)含有與第1抗原決定部位結合之可變區的重鏈及含有與第2抗原決定部位結合之可變區的重鏈成為一對的重鏈的組合、(ii)僅成為含有與第1抗原決定部位結合之可變區之重鏈成為一對之重鏈之組合、(iii)僅含有與第2抗原決定部位結合之可變區的重鏈成為一對的重鏈的組合。從此等三種重鏈之組合之混合物難以將含目的之重鏈組合之抗原結合分子精製。

當使用如此的重組方法製造雙專一性抗體時，可藉由對構成重鏈之CH3分域施以適當胺基酸取代之改變，而優先分泌含有異質組合之重鏈的雙專一性抗體。具體而言，將存在於其中一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob(「突起」之意))，並將存在於另一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole(「空隙」之意))，藉此使突起能配置於空隙內，而引起異種重鏈形成之促進及同種重鏈形成之妨害的方法(WO1996/027011、Ridgway等人(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等人(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。

又，也已知將利用多胜肽之組合、或多胜肽構成之異種多聚物之組合之控制方法用在重鏈之組合而製作雙專一性抗體之技術。亦即，可採用藉由改變形成重鏈內界面之胺基酸殘基以控制使具相同序列之重鏈之組合受抑制且形成序列相異之二條重鏈的方法於雙專一性抗體之製作(WO2006/106905)。如此的方法也可採用於製造雙專一性抗體。

本發明之一非限定態樣中，作為抗原結合分子含有的Fc區，可適當使用上述雙專一性抗體作為起源之形成Fc 區之二條多胜肽。更具體而言，宜使用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之349之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Trp且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Ser、368之胺基酸為Ala、407之胺基酸為Val。

此外，在本發明之一非限定態樣中，作為Fc區可採用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys。上述態樣中，也可理想地將409之胺基酸從Asp換為Glu、399之胺基酸從Lys換為Arg。又，也可除了399之胺基酸之Lys以外，尚追加使360之胺基酸為Asp或392之胺基酸為Asp。

本發明之其他非限定態樣中，作為Fc區可理想地採用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之357之胺基酸為Lys。

本發明之又另一非限定態樣中，作為Fc區宜使用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之439之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys。

本發明之另一非限定態樣中，作為Fc區，可適當採用此等組合之以下態樣中之任一者；(i)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可換為Asp，EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可換為392之胺基酸之ASp)、(ii)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之439之胺基酸之Glu也可換為360之胺基酸之Asp、EU編號表示之392之胺基酸之Asp或439之胺基酸之Asp)、(iii)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之357之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys、或為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys、 356之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸也可不取代為Glu，而且370之胺基酸不取代為Glu的前提，可將439之胺基酸之Glu換為Asp或將439之胺基酸之Glu換為392之胺基酸之Asp)。

再者，本發明之另一非限定態樣中，可理想採用二條多胜肽，其為形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu。

再者，本發明之其他非限定態樣可理想採用二條多胜肽，其為形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu、435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu。

又，上述異種重鏈之組合技術以外，可以將作為將形成與第1抗原決定部位結合之可變區的輕鏈、及形成與第2抗原決定部位結合之可變區的輕鏈各和形成與第1抗原決定部位結合之可變區的重鏈、及形成與第2抗原決定部位結合之可變區的重鏈組合的已知異種輕鏈的組合技術即CrossMab技術(Scaefer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,11187-11192))用在製作本發明提供之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子。又，作為利用引起相異IgG4之重鏈彼此之交換，使形成與第1抗原決定部位結合之可變區之重鏈、及形成與第2抗原決定部位結合之可變區之重鏈組合之異種重鏈之組合技術為已知之Fab-Arm Exchange(Labrijn等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2013)110,5145-5150)、WO2008119353)，也可在製作本發明提供之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子使用。

效應子細胞

本發明中，「效應子細胞」，可於包含T細胞(CD4⁺(幫助者淋巴球)T細胞及/或CD8⁺(細胞傷害性)T細胞)、多核白血球(嗜中球、嗜酸球、嗜鹼球、肥胖細胞)、單球、巨噬體、組織球或天然殺手細胞(NK細胞)、NK様T細胞、Kupffer細胞、Langerhans細胞、或淋巴素活化殺手細胞(LAK細胞)等白血球、B淋巴球、或樹狀細胞或巨噬體等抗原提示細胞之最廣義的含意使用，但理想之效應子細胞，例如CD8⁺(細胞傷害性)T細胞、NK細胞、或巨噬體。若為於效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子，則可作為本發明之抗原結合分子含有之至少1個抗原結合分域所結合之抗原使用，但理想的膜型分子，可列舉構成TCR之多胜肽、CD3、CD2、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或NKG2D或NK細胞活化配體作為非限定例。

細胞傷害性物質

為了使本發明之抗原結合分子與癌細胞結合並發揮細胞傷害活性，也可使抗原結合分子有細胞傷害性物質結合。作為細胞傷害性物質，可為以下例示之化學療法劑，也可為Curr Opin Chem Biol(2010)14,529-37、國際公開2009/140242揭示之化合物，該等化合物利用適當的連結子等與抗原結合分子結合。本發明之抗原結合分子係作為醫藥組合物使用時，在對於對象(受試者、患者等)投予該抗原結合分子前也可能使該等細胞傷害性物質結合，也可在投予之前後或同時投予。

又，結合了後述化學療法劑、毒性胜肽或放射性化學物質等細胞傷害性物質之修飾抗原結合分子修飾物，也可理想地作為本發明之具細胞傷害活性之抗原結合分子使用。如此之修飾抗原結合分子(以下稱為抗原結合分子藥物接合物)，可藉由對於獲得之抗原結合分子進行化學性修飾以取得。又，作為抗原結合分子之修飾方法，可適當使用在抗體藥物接合物等領域已經確立的方法。又，已有毒性胜肽結合之修飾抗原結合分子，可藉由將編碼為該毒性胜肽之基因與編碼為本發明之抗原結合分子之基因於讀框內連結而得之融合基因於適當寄主細胞中表現後，從該細胞之培養液單離以取得。

本發明之抗原結合分子所結合之化學療法劑可列舉如下：阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿扎胞苷(azacytidine)、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、10-羥基喜樹鹼(10-hydroxycamptothecin)、卡莫司汀(carmustine)、西樂葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)、卡鉑(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、多西他賽(docetaxel)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素葡萄糖醛酸(daunomycin glucuronide)、柔紅黴素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星葡萄糖醛酸苷(doxorubicin glucuronide)、表柔比星(epirubicin)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、足葉乙甙(etoposide)、足葉乙甙葡萄糖苷酸(etoposide glucuronide)、脫氧氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟脲嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基孕酮己酸(hydroxyprogesterone caproate)、羥基脲(hydroxyurea)、去甲氧柔紅黴素(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、亞葉酸鈣(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、美登素(maytansinoid)、氮芥(mechlorethamine)、甲羥孕酮乙酸酯(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法崙(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、苯基丁酸(phenylbutyrate)、潑尼松(prednisone)、甲基芐肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、噴司他丁(pentostatin)、司莫司汀(semustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉烷類(taxanes)、紫杉醇(taxol)、丙酸睾酮(testosterone propionate)、沙利度胺(thalidomide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、尿嘧啶芥末(uracil mustard)、長春鹼 (vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春新鹼(vincristine)。

本發明中，理想之化學療法劑為低分子之化學療法劑。低分子之化學療法劑，在本發明之抗原結合分子結合後，干涉抗原結合分子之功能之可能性仍低。本發明中，低分子之化學療法劑通常具有100~2000，較佳為200~1000之分子量。在此例示之化學療法劑均為低分子之化學療法劑。該等本發明之化學療法劑，包括於活體內變換為活性之化學療法劑之前驅藥。前驅藥之活化可利用酵素性變換，也可為非酵素性的變換。

又，本發明之抗原結合分子結合之細胞傷害物質，可列舉Pseudomonas exotoxin A、Saporin-s6、Diphtheria toxin、Cnidarian toxin等毒性胜肽(毒素)、Radioiodine、Photosensitizer。毒性胜肽，例如：以下為理想例。

-白喉毒素A鏈(Diphtheria toxin A Chain)(Langone等人(Methods in Enzymology(1993)93,307-308)

-假單胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin)(Pai等人(Nat.Med.(1996)2(3),350-353)

-蓖麻蛋白鏈(Ricin A Chain)(Fulton等人(J.Biol.Chem.(1986)261,5314-5319)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Gheeite等人(J.Immunol.Methods(1991)142,223-230))

-無糖鏈蓖麻蛋白A鏈(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931)

-相思豆毒素A鏈(Abrin A Chain)(Wawrzynczak等人(Br.J.Cancer(1992)66,361-366)、；Wawrzynczak等人(Cancer Res(1990)50,7519-7562)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931)

-白樹種子儲藏蛋白(Gelonin)(Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346))

-商陸抗病毒蛋白(PAP-s或Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992),89,341-346))

- Briodin(Briodin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346))

-皂草毒蛋白(Saporin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992),89,341-346))

-苦瓜毒蛋白(Momordin)(Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、(Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)

-木鳖毒蛋白(Momorcochin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)

-香石竹毒蛋白32(Dianthin 32)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)

-香石竹毒蛋白30(Dianthin 30)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)

-蒴蓮根毒蛋白(Modeccin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)

-槲寄生素(Viscumin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)

- Volkesin(Volkesin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)

-商陸毒蛋白(Dodecandrin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)

- Tritin(Tritin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)

-絲瓜籽毒蛋白(Luffin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)

-括樓種子毒蛋白(Trichokirin)(Casellas等人(Eur.J.Biochem.(1988)176,581-588)、Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)

抗原結合分子

本發明中，抗原結合分子係以代表包含標的組織專一性的化合物存在時對抗原之結合活性高於該化合物不存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域的最廣含意使用，具體而言，此等只要顯示對抗原之結合活性即可，包括各種分子型。例如：抗原結合分域與Fc區結合之分子，例如抗體。抗體包括單一單株抗體(包含致效劑及拮抗劑抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體等。又，當作抗體之片段使用時，抗原結合分域及抗原結合片段(例如，Fab、F(ab')2、scFv及Fv)為理想例。將既有之安定的α/β筒狀蛋白質構造等立體構造作為支架(scaffold)，僅將其一部分構造用於建構抗原結合分域而庫化之支架分子，也包括在本發明之抗原結合分子。

本發明之抗原結合分子，可包含媒介對Fcγ受體之結合及/或對FcRn之結合之Fc區之至少一部分。例如，於非限定之一態樣中，抗原結合分子可為抗體或Fc融合蛋白質。融合蛋白質，係指含有與在天然在具有其自然不連結之第二胺基酸序列之多胜肽連結之第一胺基酸序列之多胜肽的嵌合多胜肽。例如，融合蛋白質可包括編碼為Fc區之至少部分(例如賦予對Fcγ受體之結合之Fc區之部分及/或賦予對FcRn之結合之Fc區之部分)之胺基酸序列之多胜肽。胺基酸序列也可存在於一起運到融合蛋白質之其他蛋白質，或此等通常存在於相同蛋白質但會重新再編入融合多胜肽中。融合蛋白質例如可依化學合成，或製作以所望關係編碼為胜肽區之聚核苷酸並以表現其之基因重組的方法製作。

本發明之各分域可利用多胜肽鍵直接連結，並可經由連結子連結。連結子，可使用能依基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如Protein Engineering(1996)9(3),299-305)揭示之連結子等，但本發明以胜肽連結子較理想。胜肽連結子之長度不特別限定，可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，但理想長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。

例如：胜肽連結子之情形：Ser

Gly‧Ser

Gly‧Gly‧Ser

Ser‧Gly‧Gly

Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：19)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：20)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：21)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：22)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：23)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：24)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：25)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：26)

(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：21))n

(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：22))n

[n為1以上之整數]等為理想例。惟，胜肽連結子之長度或序列可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。

合成化學物連結子(化學交聯劑)，為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。

連結各分域之連結子使用多個時，可均使用同種連結子，也可使用異種連結子。又，上述記載例示之連結子以外，也可適當使用有例如His標籤、HA標籤、myc標籤、FLAG標籤等胜肽標籤之連結子。又，氫鍵、雙硫鍵、共價鍵、離子性交互作用或該等結合之組合而彼此結合之性質也可適當利用。例如利用抗體之CH1與CL間之親和性、利用與異Fc區組合時以前述雙專一性抗體為起源之Fc區。再者，在分域間形成之雙硫鍵也可適當地利用。

為了將各分域以胜肽鍵連結，將編碼為該分域之聚核苷酸於同一讀框連結。聚核苷酸於同一讀框連結之方法，以限制片段之接合或融合PCR、重疊PCR等方法為公知，本發明之抗原結合分子之製作也可適當單獨或組合使用該等方法。本發明中，用語「經連結」、「經融合」、「連結」或「融合」可相互交換的使用。該等用語，指利用包含上述化學結合手段或重組方法之所有方法將二個以上之多胜肽等的要素或成分形成為單一構造的方式進行連結。於同一讀框融合，當二以上之要素或成分為多胜肽時，係指以維持該多胜肽之正確讀取框之方式，為了形成連續的較長的讀取框之二個以上讀取框單位之連結。當二分子之Fab作為抗原結合分域使用時，該抗原結合分域與含Fc區之不變區未經連結子而以胜肽鍵於同一讀框連結而得之本發明之抗原結合分子抗體，可作為本發明之理想抗原結合分子使用。

低分子化抗體

本發明使用之抗體，不限於抗體之全長分子，也可為低分子化抗體或其修飾物。低分子化抗體，包括全長抗體(whole antibody、例如whole IgG等)有部分缺損之抗體片段。只要有對抗原之結合活性，則不特別限定。本發明中的低分子化抗體只要是全長抗體之一部分即不特別限定，宜包含重鏈可變區(VH)或/及輕鏈可變區(VL)較佳。VH或VL之胺基酸序列可包含取代、缺失、加成及/或插入。又，只要具有對抗原之結合活性，則VH或/及VL中部分缺損亦可。又，可變區可嵌合化或人型化。抗體片段之具體例，例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等。又，低分子化抗體之具體例，例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(single chain Fv)、雙體抗體(Diabody)、sc(Fv)2(single chain(Fv)2)等。該等抗體之多量體(例如：二聚體、三聚體、四聚體、聚合物)也包括在本發明之低分子抗體。

抗體片段，可藉由將抗體以木瓜酶、胃蛋白酶處理而獲得，或，可藉由建構編碼為該等抗體片段之基因，將其導入到表現載體後，於適當寄主細胞使其表現而取得(例如參考(例如：Co等(J.Immunol.(1994)152,2968-2976)、Better及Horwitz(Methods in Enzymology(1989)178,476-496)、Plueckthun及Skerra等(Methods in Enzymology(1989)178,476-496)、Lamoyi(Methods in Enzymology(1989)121,652-663)、Rousseaux等(Methods in Enzymology(1989)121,663-669)及Bird等(TIBTECH(1991)9,132-137))。

雙體抗體(Diabody)係指利用基因融合而建構之二價(bivalent)之低分子化抗體(Holliger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,6444-6448、EP404,097、WO1993/11161等)。雙體抗體，係由二條多胜肽鏈構成之二聚體。通常，多胜肽鏈分別在相同鏈中以VL及VH之無法彼此結合之程度之短之約5個殘基連結子結合。所以，在同一多胜肽鏈上編碼之VL與VH，因為其之間的連結子短，無法形成單鏈可變區片段，而會形成二聚體。其結果，雙體抗體成為有二個抗原結合部位。

scFv可藉由將抗體之H鏈V區域與L鏈V區域連結以取得。具體而言，scFv可藉由將H鏈V區域與L鏈V區域經由連結子，較佳為胜肽連結子予以連結而製作(Huston等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,(1988)85,5879-5883)。scFv中，H鏈V區域及L鏈V區域，也可為在本說明書作為抗體記載之任意抗體來源。將V區域連結之胜肽連結子，無特別的限制，例如可使用由3各至25個殘基左右構成的任意單鏈胜肽、或後述胜肽連結子等作為連結子。作為V區域之連結方法，可利用如上述PCR法。將編碼為前述抗體之H鏈或H鏈V區域之DNA序列、及編碼為L鏈或L鏈V區域之DNA序列當中編碼為全部或所望胺基酸序列之DNA部分當作模板，並使用具有對應於其兩端之序列之序列的一對引子的PCR法，可將編碼為scFv之DNA放大。其次藉由將編碼為胜肽連結子部分之DNA、及設計為其兩端與各H鏈、L鏈能連結之序列之一對引子組合並進行PCR反應，可取得具所望序列之 DNA。又，若先製作編碼為scFv之DNA，可依常法取得含有此等之表現載體、及利用該表現載體轉形之重組細胞，又，培養其結果獲得之重組細胞，並使編碼為該scFv之DNA表現，可取得該scFv。

sc(Fv)2，係將2條VH及2條VL以連結子等結合成單鏈之低分子化抗體(Hudson等(J.Immunol.Methods(1999)231,177-189)。sc(Fv)2可藉由例如將scFv以連結子連結以製作。

又，宜為特徵係2條VH及2條VL以單鏈多胜肽之N末端側作為基點，依VH、VL、VH、VL([VH]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VL])之順序排列之抗體為較佳。2條VH與2條VL之順序不特別限於上述配置，任意順序排列均可。例如可依以下方式配置。

-[VL]連結子[VH]連結子[VH]連結子[VL]

-[VH]連結子[VL]連結子[VL]連結子[VH]

-[VH]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VL]

-[VL]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VH]

-[VL]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VH]

作為將抗體可變區結合之連結子，可使用與前述抗原結合分子之項目記載連結子為同樣之連結子。例如：本發明中特好的sc(Fv)2之態樣，可列舉例如以下之sc(Fv)2。

-[VH]胜肽連結子(15胺基酸)[VL]胜肽連結子(15胺基酸)[VH]胜肽連結子(15胺基酸)[VL]

結合4個抗體可變區時，通常需要3個連結子，但可全部使用相同連結子也可使用不同的連結子。本發明非限定之低分子化抗體態樣，可列舉係彼此互異之抗原結合位且其中一抗原結合位結合到在與癌細胞細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位，另一抗原結合位結合於在效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子中存在之抗原決定部位的Diabody或sc(Fv)2。上述Diabody或sc(Fv)2中，其中一抗原結合位對與癌細胞之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位之結合活性可依存於癌組織專一性化合物，其中一抗原結合位對在效應子細胞之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位的結合活性，可依存於癌組織專一性化合物，又，兩抗原結合位之結合活性可依存於癌組織專一性化合物。

本發明一非限定低分子化抗體之態樣，可列舉係彼此互異之抗原結合位，且其中一抗原結合位係與癌細胞之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位結合，另一抗原結合位係與細胞傷害性物質存在之抗原決定部位結合之Diabody或sc(Fv)2。上述Diabody或sc(Fv)2中，其中一抗原結合位對癌細胞之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位之結合活性，可依存於癌組織專一性化合物，且其中一抗原結合位對細胞傷害性物質存在之抗原決定部位之結合活性可依存於癌組織專一性化合物，又，兩抗原結合位之結合活性可依存於癌組織專一性化合物。

為了獲得如此之低分子化抗體，可將抗體以酵素例如：木瓜酶、胃蛋白等處理，使生成抗體片段、或建構編碼為該等抗體片段或低分子化抗體之DNA，將其導入表現載體後，使適當寄主細胞表現(例如參照：Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.(1989)178,476-496；Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497-515；Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986)121,652-663；Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.(1986)121,663-669；Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137)。

FcRn

與屬於免疫球蛋白超級家族之Fcγ受體不同，人類FcRn在構造上與主要組織不適合性複合體(MHC)第I類之多胜肽在構造相類似，且與第I類之MHC分子有22至29%之序列同一性(Ghetie等人，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn，係由與可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)複合體化之穿膜α或重鏈構成的異二聚體的形式表現。如MHC，FcRn之α鏈係由3個細胞外分域(α1、α2、α3)構成，且短的細胞質分域係將蛋白質留在細胞表面。α1及α2域會與抗體之Fc區中之FcRn結合分域交互作用(Raghavan等人(Immunity(1994)1,303-315)。

FcRn係於哺乳動物之母性胎盤或卵黃嚢表現，其涉及IgG從母親移動到胎兒。此外，於表現FcRn之囓齒類新生兒的小腸中，涉及母體IgG從攝取FcRn之初乳或乳橫切移動到刷子緣上皮。FcRn有多數種類，在多數其他組織、及各種內皮細胞系表現。其在人類成人類血管內皮、肌肉血管系、及肝臓洞狀毛細血管也有表現。FcRn會與IgG結合，並且再循環到血清，而據認為有維持IgG之血漿中濃度之作用。FcRn對IgG分子之結合，通常係嚴格依存於pH，最適結合據認為是小於7.0之pH酸性域。

以含序列編號：28表示之信號序列之多胜肽當做前驅體之人類FcRn，於活體內(序列編號：29記載包含信號序列之其多胜肽)會與人類β2-微球蛋白形成複合體。與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn可使用通常之重組表現方法製造。可以評價本發明之Fc區對與如此的與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn的結合活性。本發明中，未特別記載時，人類FcRn指能與本發明之Fc區結合之形態者，例如人類FcRn與人類β2-微球蛋白之複合體。

Fc區對FcRn尤其是人類FcRn之結合活性

本發明提供之Fc區對FcRn尤其對人類FcRn之結合活性，如前述結合活性之項目中所述，可依照該技術領域之人類士所公知之方法測定，針對pH以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗原結合分子之抗原結合活性與人類FcRn結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度k_d(Dissociation rate：解離速度常數)、或視k_d(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。該等可由該技術領域中具有通常知識者公眾所知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、流式細胞計數器等。

測定本發明Fc區對FcRn之結合活性時之pH以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可如WO2009/125825記載，於MES緩衝液、37℃之條件測定。又，本發明之Fc區對FcRn之結合活性之測定，可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行，例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。本發明之Fc區與人類FcRn之結合活性之測定，可藉由分別以人類FcRn或Fc區或含Fc區之本發明之抗原結合分子作為分析物流過固定有Fc區或含Fc區之本發明之抗原結合分子或人類FcRn的晶片而評價。

作為本發明之抗原結合分子含有之Fc區與FcRn有結合活性之條件的pH中性域，通常指pH6.7~pH10.0。pH中性域較佳為pH7.0~pH8.0之任意pH值所示之範圍，較佳為從pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0選擇，尤佳為接近活體內之血漿中(血中)之pH之pH7.4。由於在pH7.4時人類FcRn結合域與人類FcRn之結合親和性低，當難評價其結合親和性時，可將pH7.4替換為使用pH7.0。作為本發明之抗原結合分子含有之Fc區與FcRn有結合活性之條件的pH中性域，通常指pH4.0~pH6.5。較佳指pH5.5~pH6.5，尤佳為接近活體內之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。就測定條件使用之溫度而言，人類FcRn結合域與人類FcRn之結合親和性可於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為為了決定人類FcRn結合域與人類FcRn之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為與從20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一者之20℃至35℃的任意溫度，也同樣用於決定人類FcRn結合域與人類FcRn之結合親和性而可使用。25℃的溫度為本發明之態樣之一非限定例。

依The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671，天然型人類IgG1對人類FcRn之結合活性，在pH酸性域(pH6.0)KD為1.7μM，但於pH中性域幾乎未能檢測到活性。是以良好態樣中，可篩選包括在pH酸性域之條件下對人類FcRn之結合活性為KD 20μM或更強之抗原結合分子。更佳的態樣中，可篩選包括在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性為KD 2.0μM或更強之Fc區的抗原結合分子。又更佳的態樣中，可篩選包括在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性為KD 0.5μM或更強之Fc區之抗原結合分子。上述KD值，可依The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671記載之方法(將抗原結合分子固定在晶片，並流過作為分析物之人類FcRn)決定。

於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區

本發明提供之抗原結合分子含有之Fc區，可理想地使用於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性之Fc區。一般而言，IgG抗體已知藉由與FcRn結合，具有長血漿中滯留性。IgG與FcRn之結合，僅於酸性條件下(pH6.0)被觀測到，於中性條件下(pH7.4)幾乎未認為有結合。IgG抗體係非專一性地攝入細胞，但於內體內之酸性條件下藉由與內體內之FcRn結合，回到細胞表面上，於血漿中之中性條件下，從FcRn解離。若對IgG之Fc區導入變異，並使於pH酸性域條件下對FcRn之結合喪失，不能從內體內再循環回血漿中，所以抗體之血漿中滯留性會顯著受損。改善IgG抗體之血漿中滯留性之方法，據報告有使在pH酸性域之條件下對FcRn之結合提高之方法。對IgG抗體之Fc區導入胺基酸取代並使在pH酸性域之條件下對FcRn之結合提高，據認為從內體內往血漿中之再循環效率上升，其結果，該IgG抗體之血漿中滯留性改善。

本發明不拘於特定理論，例如：本發明提供之抗原結合分子係與在癌組織含有之癌細胞表現之膜型抗原結合時等，也可認為如以下所示，能持續抑制癌細胞增殖。癌組織專一性的化合物高濃度存在下，表現本發明之抗原結合分子結合之膜型分子的癌細胞，當利用由該抗原結合分子中介之細胞傷害活性受傷害後，據認為係此抗原結合在該抗原結合分子所含之抗原結合分域之狀態。從非專一性的被攝入細胞之該抗原結合分子，於癌組織專一性的化合物低濃度存在下將抗原游離而得之該抗原結合分子，在內體內之酸性條件下會與內體內之FcRn結合而回到細胞表面上，於血漿中之中性條件下從FcRn解離。以此方式，據認為已再循環之本發明之抗原結合分子，在癌組織專一性的化合物高濃度存在下能與此抗原癌細胞中表現之膜型分子再度結合。

本發明不拘於特定理論，例如：本發明提供之抗原結合分子結合之可溶型抗原係將標的組織含有之標的細胞之增殖或發炎細胞之活化向正調節之配體之情形等，據認為如以下可抑制標的細胞之增殖或發炎細胞之活化。該等標的組織專一性的化合物高濃度存在下與此抗原可溶型分子結合之本發明之抗原結合分子被非專一性的攝入細胞後，於標的組織專一性的化合物低濃度存在下已將抗原游離之該抗原結合分子，會於內體內之酸性條件下與內體內之FcRn結合，以回到細胞表面上，於血漿中之中性條件下從FcRn解離。以此方式，已再循環之本發明之抗原結合分子，能於標的組織專一性的化合物高濃度存在下，與此抗原可溶型分子再度結合。另一方面，標的組織專一性的化合物低濃度存在下從抗原結合分子游離之抗原，會於溶體中被分解。其結果，可溶型抗原濃度會隨經過上述再循環階段而減少，因此據認為能夠抑制癌細胞之增殖或發炎細胞之活化。

本發明中，宜為於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性之Fc區為較佳。該分域若於預先在pH酸性域條件下對FcRn有結合活性之Fc區，則可直接使用。該分域於pH酸性域條件下對FcRn無結合活性或弱結合活性時，可藉由改變抗原結合分子中之胺基酸以取得所望之對FcRn有結合活性之Fc區，但是，藉由改變Fc區中之胺基酸，也可理想地取得於pH酸性域條件下具有所望之對FcRn之結合活性、或增強之Fc區。帶來如此之所望結合活性之Fc區之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後於pH酸性域條件下對FcRn之結合活性以找出。可使用與用以改變對前述Fcγ受體之結合活性可使用之方法為同樣之公眾所知之方法，由該技術領域中具有通常知識者實施適當胺基酸之改變。

本發明之抗原結合分子含有之於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性之Fc區，可依各種方法取得，具體而言，可藉由改變作為初始Fc區之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸，以取得於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性、或增強之FcRn結合域。用以改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要使於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性、或於酸性域條件下對人類FcRn之結合活性提高即可，可改變任意位置之胺基酸。抗原結合分子係包括作為Fc區之人類IgG1之Fc區時，於pH酸性域之條件下對FcRn之結合，宜包括帶來人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果的改變較佳。可為如此改變之胺基酸，例如：國際公開WO1997/034631所記載，EU編號表示之252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位、及/或434位以及與該等胺基酸組合之253位、310位、435位、及/或426位之胺基酸。如國際公開WO2000/042072記載，EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸為理想例。同樣，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2002/060919所記載，EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸亦理想。再者，可為如此改變之胺基酸，如國際公開WO2004/092219所記載，可列舉EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸。此外，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2006/020114所記載，238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位、及/或442位之胺基酸亦理想。又，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2010/045193所記載，EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸亦為理想。藉由該等胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區於pH酸性域條件下對FcRn之結合增強。

Fc區係包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合，比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣中，可列舉選自於EU編號表示之251位之胺基酸為Arg或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、或Thr中之任一者、308位之胺基酸為Ile或Thr中之任一者、 309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser中之任一者、312位之胺基酸為Ala或Asp中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者、之群組中之至少一個以上胺基酸之改變。又，改變之胺基酸之數不特別限定，可僅改變一處胺基酸，也可改變二處以上之胺基酸。

Fc區係包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉包括EU 編號表示之308位之胺基酸為Ile、309位之胺基酸為Pro、及/或311位之胺基酸為Glu之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可包括308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Leu、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可包括308位之胺基酸為Ile或Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基酸為Ala或Leu之改變。該改變之不同非限定態樣，可包括308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Ser、312位之胺基酸為Asp、及/或314位之胺基酸為Leu之改變。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉包括EU編號表示之、251位之胺基酸為Leu、252位之胺基酸為Tyr、254位之胺基酸為Ser、或Thr、255位之胺基酸為Arg、及/或256位之胺基酸為Glu之改變。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉包括EU編號表示之428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、及/或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可包括428位之胺基酸為His或Met、及/或434位之胺基酸為His或Met之改變。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉包括EU編號表示之385位之胺基酸為Arg、386位之胺基酸為Thr、387位之胺基酸為Arg、及/或389位之胺基酸為Pro之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包括385位之胺基酸為Asp、386位之胺基酸為Pro及/或389位之胺基酸為Ser之改變。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉從EU編號表示之250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者、之群組選擇之至少一個以上之胺基酸之改變。又，改變之胺基酸數不特別限定，可僅改變一處胺基酸，也可改變二處胺基酸。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉包括EU編號表示之250位之胺基酸為Gln、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可包括250位之胺基酸為Glu、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之改變。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉從EU編號表示之251位之胺基酸為Asp或Glu中之任一者、252位之胺基酸為Tyr、307位之胺基酸為Gln、308位之胺基酸為Pro、378位之胺基酸為Val、380位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Leu、430位之胺基酸為Ala、或Lys中之任一者、434位之胺基酸為Ala、His、Ser、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Ile、之群組選擇之至少二個以上之胺基酸之改變。又，改變之胺基酸數不特別限定，可僅改變二處胺基酸，也可改變三處以上之胺基酸。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可包括EU編號表示之、307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包括308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包括252位之胺基酸為Tyr、及434位之胺基酸為Ala之改變。該改變之一不同之非限定態樣，可為包括378位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為Ala之改變。該改變之其他不同之非限定態樣，可為包括428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一不同之非限定態樣，可為包括434位之胺基酸為Ala、及436位之胺基酸為Ile之改變。再者，該改變之又另一非限定態樣，可包括308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之改變。再者，該改變之又另一非限定態樣，可為包括307位之胺基酸為Gln、及436位之胺基酸為Ile之改變。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可包括EU編號表示之307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ser中之任一者之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包括307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包括252位之胺基酸為Tyr、308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之改變。該改變之不同非限定態樣，可為包括251位之胺基酸為Asp、307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為His之改變。

Fc區包括人類IgG1之Fc區時，作為帶來於pH 酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為選自EU編號表示之、238位之胺基酸為Leu、244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、252位之胺基酸為Tyr、256位之胺基酸為Pro、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、 293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val、或Trp中之任一者、312位之胺基酸為Pro、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、或Asn中之任一者、380位之胺基酸為Asn、Ser、或Thr中之任一者、382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、 430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、434位之胺基酸為Phe、Gly、His、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Ile、Leu、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、之群組中之至少二個以上之胺基酸之改變。又，改變之胺基酸數不特別限定，可以僅改變二處胺基酸，也可改變三處以上之胺基酸。

作為Fc區包括人類IgG1之Fc區時，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之257位之胺基酸為Ile、及311位之胺基酸為Ile之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包括257位之胺基酸為Ile、及434位之胺基酸為His之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包括376位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為His之改變。

pH中性域條件下對FcRn有結合活性之Fc區

又，另一非限定態樣中，可篩選包含具有將上述記載之於pH酸性域對人類FcRn之結合活性特徵替換為於pH中性域對人類FcRn之結合活性之特徵的Fc區的抗原結合分子。更理想態樣中，可篩選包括於pH中性域之人類FcRn結合活性為KD 40μM或更強之Fc區之抗原結合分子。更理想態樣中，可篩選包括於pH中性域對人類FcRn之結合活性為KD 15μM或更強之Fc區之抗原結合分子。

又，另一非限定態樣中，可篩選包含具有將上述記載之於pH酸性域對人類FcRn之結合活性特徵以外更具有於pH中性域對人類FcRn之結合活性之特徵的Fc區的抗原結合分子。更理想態樣中，可篩選包括於pH中性域之人類FcRn結合活性為KD 40μM或更強之Fc區之抗原結合分子。更理想態樣中，可篩選包括於pH中性域對人類FcRn之結合活性為KD 15μM或更強之Fc區之抗原結合分子。

本發明中，宜為於pH酸性域及/或pH中性域對人類FcRn有結合活性之Fc區為較佳。該Fc區，若為已於pH酸性域及/或pH中性域對人類FcRn有結合活性之Fc區，則可直接使用。該Fc區於pH酸性域及/或pH中性域無人類FcRn結合活性或弱時，可藉由改變抗原結合分子含有之Fc區中之胺基酸，以取得所望之包括對人類FcRn有結合活性之Fc區之抗原結合分子，但也可理想地藉由改變人類Fc區中之胺基酸，以取得於pH酸性域及/或pH中性域具有所望之對人類FcRn有結合活性之Fc區。又，藉由改變已於pH酸性域及/或pH中性域具有人類FcRn結合活性之Fc區中之胺基酸，也可取得包括所望之對人類FcRn有結合活性之Fc區的抗原結合分子。帶來如此之所望結合活性之人類Fc區之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後於pH酸性域及/或pH中性域之對人類FcRn之結合活性以找出。可由該技術領域中具有通常知識者使用公眾所知之方法實施適當胺基酸之改變。

本發明中，Fc區之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，包括改變為與初始Fc區之胺基酸序列相異之胺基酸序列。初始Fc區之修飾改變體只要於pH酸性域能與人類FcRn結合，(初始Fc區於pH中性域條件下對人類FcRn之結合活性不一定必要)，任一Fc區均可作為初始分域。初始Fc區之例，可列舉IgG抗體之Fc區、亦即天然型之Fc區為理想例。又，已施加改變之Fc區作為初始Fc區並進一步改變而得之改變Fc區，也可作為本發明之改變Fc區。初始Fc區，可指多胜肽本身、含初始Fc區之組成物、或編碼為初始Fc區之胺基酸序列。初始Fc區，可包括於抗體項目概說之利用重組產生之公眾所知之IgG抗體之Fc區。初始Fc區之起源不限定，可從非人類動物之任意生物或人類取得。較佳之任意生物，可理想地列舉從小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類選擇之生物。其他態樣中，初始Fc區也可從食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩、或人類取得。較佳為初始Fc區係從人類IgG1取得，但不限於IgG之特定次類。此代表可將人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之Fc區適當作為初始Fc區。同樣，本說明書中，意指從前述任意生物得到之IgG之任意類或次類之Fc區，較佳作為初始Fc區使用。天然存在之IgG之變異體或經操作之類型，例如公眾所知文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin. Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、國際公開WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、及WO2006/105338)記載者，但不限於此等。

作為改變之例，包括一個以上之變異，例如取代為與初始Fc區之胺基酸相異之胺基酸殘基之變異、或對初始Fc區之胺基酸插入一個以上胺基酸殘基或從初始Fc區之胺基酸使一個以上之胺基酸缺失等。較佳為改變後之Fc區之胺基酸序列中，包括非天然之Fc區之至少部分的胺基酸序列。如此之變種必然與初始Fc區具有低於100%之序列相同性或類似性。理想之實施形態中，變種與初始Fc區之胺基酸序列有約75%~低於100%之胺基酸序列相同性或類似性，更佳為有約80%~低於100%，更佳為約85%~低於100%，又更佳為約90%~低於100%、最佳為約95%~低於100%之相同性或類似性之胺基酸序列。本發明之一非限定態樣中，初始Fc區及本發明之經改變之Fc區之間，至少有1個胺基酸之差異。初始Fc區與改變Fc區之胺基酸之差異，特別可由前述EU編號表示之胺基酸殘基之位置之指定胺基酸之差異來指定。如此之變種之製作方法，列舉於「胺基酸之改變」之項目。

本發明之抗原結合分子含有之於pH中性域對人類FcRn有結合活性之Fc區，可利用任意方法取得，但具體而言，可藉由改變作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸，來篩選包括於pH中性域對人類FcRn之結合活性為KD 20μM或更強之Fc區，更佳態樣中，為於pH中性域對人類FcRn之結合活性為KD 2.0μM或更強之Fc區，又更佳態樣，係於 pH中性域對人類FcRn之結合活性為KD 0.5μM或更強之Fc區的抗原結合分子。為了改變的理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如：序列編號：5、序列編號：6、序列編號：7、或序列編號：8分別表示IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等人類IgG、及此等之改變體之Fc區。

抗原結合分子包括人類IgG1之Fc區作為Fc區時，帶來於pH中性域條件下對FcRn之結合，可藉由改變作為初始Fc區之IgG型免疫球蛋白而帶來效果之胺基酸，例如：如國際公開WO2000/042072記載之EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸為理想例。同樣，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2002/060919所記載，EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸為理想例。再者，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2004/092219記載，EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸。又，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2010/045193所記載，EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸為理想例。藉由該等胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區於pH中性域條件下對FcRn之結合增強。

藉由改變作為初始Fc區之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸，也可取得於pH中性域對人類FcRn有結合活性之Fc區。用以改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如：序列編號：5、序列編號：6、序列編號：7、或序列編號：8分別表示之IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等人類IgG、及此等之改變體之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要於pH中性域對人類FcRn有結合活性、或於中性域對人類FcRn之結合活性提高，則任意位置之胺基酸都可改變。抗原結合分子係包括人類IgG1之Fc區作為人類Fc區時，於pH中性域對人類FcRn之結合，宜為帶來使人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果的改變較佳。作為可如此改變之胺基酸，例如：EU編號221位~225位、227位、228位、230位、232位、233位~241位、243位~252位、254位~260位、262位~272位、274位、276位、278位~289位、291位~312位、315位~320位、324位、325位、327位~339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位~378位、380位、382位、385位~387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位~438位、440位及442位之位置之胺基酸。藉由該等胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區於pH中性域對人類FcRn之結合增強。

為了於本發明使用，可適當選擇該等改變中於pH中性域也會增強對人類FcRn之結合之改變。特別理想之Fc區改變體之胺基酸，例如EU編號表示之237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265 位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位及436位之胺基酸。藉由將從該等胺基酸選擇之至少1個胺基酸取代為其他胺基酸，抗原結合分子含有之Fc區於pH中性域對人類FcRn之結合活性能增強。

特好之改變，例如：Fc區之EU編號表示之237位之胺基酸為Met、248位之胺基酸為Ile、250位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Thr、255位之胺基酸為Glu、256位之胺基酸為Asp、Asn、Glu、或Gln中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中之任一者、258位之胺基酸為His、265位之胺基酸為Ala、286位之胺基酸為Ala或Glu中之任一者、289位之胺基酸為His、297位之胺基酸為Ala、303位之胺基酸為Ala、 305位之胺基酸為Ala、307位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、308位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中之任一者、311位之胺基酸為Ala、His、或Ile中之任一者、312位之胺基酸為Ala或His中之任一者、314位之胺基酸為Lys或Arg中之任一者、315位之胺基酸為Ala、Asp或His中之任一者、317位之胺基酸為Ala、332位之胺基酸為Val、334位之胺基酸為Leu、360位之胺基酸為His、376位之胺基酸為Ala、380位之胺基酸為Ala、382位之胺基酸為Ala、384位之胺基酸為Ala、385位之胺基酸為Asp或His中之任一者、386位之胺基酸為Pro、387位之胺基酸為Glu、389位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者、 424位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、433位之胺基酸為Lys、434位之胺基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為His、Ile、Leu、Phe、Thr、或Val。又，改變之胺基酸數不特別限定，可以僅改變一處胺基酸，也可改變二處以上之胺基酸。該等胺基酸之改變之組合，例如表2-1~2-33所示之胺基酸之改變。

【表2-1】

表2-2係接續表2-1之表。

【表2-2】

表2-3係接續表2-2之表。

【表2-3】

表2-4係接續表2-3之表。

【表2-4】

表2-5係接續表2-4之表。

【表2-5】

表2-6係接續表2-5之表。

【表2-6】

表2-7係接續表2-6之表。

【表2-7】

表2-8係接續表2-7之表。

【表2-8】

表2-9係接續表2-8之表。

【表2-9】

表2-10係接續表2-9之表。

【表2-10】

表2-11係接續表2-10之表。

【表2-11】

表2-12係接續表2-11之表。

【表2-12】

表2-13係接續表2-12之表。

【表2-13】

表2-14係接續表2-13之表。

【表2-14】

表2-15係接續表2-14之表。

【表2-15】

表2-16係接續表2-15之表。

【表2-16】

表2-17係接續表2-16之表。

【表2-17】

表2-18係接續表2-17之表。

【表2-18】

表2-19係接續表2-18之表。

【表2-19】

表2-20係接續表2-19之表。

【表2-20】

表2-21係接續表2-20之表。

【表2-21】

表2-22係接續表2-21之表。

【表2-22】

表2-23係接續表2-22之表。

【表2-23】

表2-24係接續表2-23之表。

【表2-24】

表2-25係接續表2-24之表。

【表2-25】

表2-26係接續表2-25之表。

【表2-26】

表2-27係接續表2-26之表。

【表2-27】

表2-28係接續表2-27之表

【表2-28】

表2-29係接續表2-28之表。

【表2-29】

表2-30係接續表2-29之表。

【表2-30】

表2-31係接續表2-30之表。

【表2-31】

表2-32係接續表2-31之表。

【表2-32】

表2-33係接續表2-32之表。

【表2-33】

包含二分子之FcRn及一分子之活性型Fcγ受體四者之異複合體

依FcRn與IgG抗體間的結晶學的研究，FcRn-IgG複合體，係由二分子之FcRn對一分子之IgG構成，且據認為位於IgG之Fc區兩側之CH2及CH3分域之接觸面附近發生二分子之結合(Burmeister等(Nature(1994)372,336-343)。另一方面，如PCT/JP2012/058603之實施例3已確認，抗體之Fc區能形成含有二分子之FcRn及一分子之活性型Fcγ受體四者的複合體(PCT/JP2012/058603)。此異複合體之形成，係針對於含有pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區之抗原結合分子之性質進行解析之結果而明白的現象。

本發明不受特定理論所拘束，但也認為抗原結合分子含有之Fc區與含二分子之FcRn及一分子之活性型Fcγ受體四者之異複合體之形成，會對於抗原結合分子投予到活體內時之抗原結合分子在該活體內之藥物動態(血漿中滯留性)、及對於所投予之抗原結合分子之免疫回應(免疫原性)帶來如以下之影響。免疫細胞上除了表現各種活性型Fcγ受體也表現FcRn，抗原結合分子在免疫細胞上形成如此之四者複合體，使對於免疫細胞之親和性提高，而且藉由進一步將細胞內分域組合化，使內在化信號增強，啟示會促進攝入免疫細胞。抗原提示細胞中也同樣，藉由在抗原提示細胞之細胞膜上形成四者複合體，啟示可能使抗原結合分子容易攝入抗原提示細胞。一般而言，被攝入抗原提示細胞之抗原結合分子，係在抗原提示細胞內之溶體被分解，並且對T細胞提示。結果，藉由在抗原提示細胞之細胞膜上形成上述四者複合體，使攝入針對抗原結合分子之抗原提示細胞被促進，可能造成抗原結合分子之血漿中滯留性惡化。又，同樣，可能引發免疫回應(惡化)。

所以，當將如此之形成四者複合體之能力下降的抗原結合分子對活體投予時，可認為該抗原結合分子之血漿中滯留性提高，由於該活體引起之免疫回應誘發受抑制。在如此之包括抗原提示細胞之免疫細胞上抑制該複合體形成之抗原結合分子之理想態樣，可列舉以下三種。

抑制異複合體形成之抗原結合分子

(態樣1)含有於pH中性域條件下對FcRn有結合活性，且對活性型FcγR之結合活性低於對天然型Fc區之活性型FcγR之結合活性之Fc區之抗原結合分子

態樣1之抗原結合分子，係藉由與二分子之FcRn結合而形成三者複合體，但不形成含有活性型FcγR之複合體。對活性型FcγR之結合活性低於天然型Fc區對活性型FcγR之結合活性的Fc區，可如前述藉由改變天然型Fc區之胺基酸而製作。改變Fc區對活性型FcγR之結合活性，是否比起天然型Fc區對活性型FcγR之結合活性，可使用前述結合活性之項目記載之方法適當實施。

作為活性型Fcγ受體，可列舉包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、FcγRIIa(包括副型R131及H131)以及包括構造同型FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)為理想例。

本說明書中，Fc區改變體對活性型Fcγ受體之結合活性低於天然型Fc區對活性型Fcγ受體之結合活性，係指Fc區改變體對FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體的結合活性，低於天然型Fc區對該等人類Fcγ受體之結合活性。例如：係指依據上述解析方法，相較於作為對照之含天然型Fc區之抗原結合分子之結合活性，含Fc區改變體之抗原結合分子之結合活性顯示95%以下，較佳為90%以下、85%以下、80%以下、75%以下，尤佳為70%以下、65%以下、60%以下、55%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下之結合活性。作為天然型Fc區，可使用初始Fc區，也可使用野生型抗體之不同構造同型之Fc區。

又，天然型對活性型FcγR之結合活性，係指人類IgG1對Fcγ受體之結合活性較佳，使對Fcγ受體之結合活性減低，可藉由上述改變，除此以外癟可藉由改變為人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4之構造同型以達成。又，使對Fcγ受體之結合活性下降，除了上述改變以外，也可藉由使含Fc區之抗原結合分子於大腸菌等未加成糖鏈之寄主表現以獲得。

作為對照之含Fc區之抗原結合分子，可適當使用具有IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子。該Fc區之結構，記載於序列編號：5(RefSeq註冊編號AAC82527.1之N末端有A加成)、6(RefSeq註冊編號AAB59393.1之N末端有A加成)、7(RefSeq註冊編號CAA27268.1)、8(RefSeq註冊編號AAB59394.1之N末端有A加成)。又，當將含有某特定構造同型之抗體之Fc區之抗原結合分子作為待測物質的情形，藉由將具有該特定構造同型之IgG單株抗體之Fc區的抗原結合分子當作對照，可驗證含該Fc區之抗原結合分子所致之對Fcγ受體之結合活性之效果。如上述，可適當選擇已驗證含有對Fcγ受體之結合活性為高之Fc區之抗原結合分子。

本發明之一非限定態樣中，作為對活性型FcγR之結合活性低於天然型Fc區對活性型FcγR之結合活性的Fc區之例，可列舉前述Fc區之胺基酸中之EU編號表示之234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、及329中之任一者以上之胺基酸改變為與天然型Fc區相異之胺基酸的Fc區為理想例，但Fc區之改變不限於上述改變，例如也可為Cur.Opin.in Biotech.(2009)20(6),685-691記載之脫糖鏈(N297A,N297Q)、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、 IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改變、及國際公開WO2008/092117記載之G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改變、及EU編號233位、234位、235位、237位之胺基酸之插入、國際公開WO2000/042072記載之部位之改變。

又，本發明之一非限定態樣中，係前述Fc區之EU編號表示之胺基酸；且234位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Arg中之任一者、236位之胺基酸為Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr或Arg中之任一者、238位之胺基酸為Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp或Arg中之任一者、239位之胺基酸為Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Arg中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、 His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、267位之胺基酸為Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中之任一者、269位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、270位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、271位之胺基酸為Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Arg、Gly、Lys或Pro中之任一者、297位之胺基酸為Ala、298位之胺基酸為Arg、Gly、Lys、Pro、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Arg、Lys或Pro中之任一者、324位之胺基酸為Lys或Pro中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、Pro、Thr、TrpTyr、或Val中之任一者、327位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、328位之胺基酸為Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中之任一者、329位之胺基酸為Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或Arg中之任一者、330位之胺基酸為Pro或Ser中之任一者、331位之胺基酸為Arg、Gly或Lys中之任一者、或332位之胺基酸為Arg、Lys或Pro中之任一者、中之任一者以上之經改變之Fc區為理想例。

(態樣2)含有於pH中性域條件下對FcRn有結合活性，且對抑制型FcγR之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性之Fc區的抗原結合分子

態樣2之抗原結合分子，可藉由結合於二分子之FcRn與一分子之抑制型FcγR而形成包含此等四者的複合體。但是一分子之抗原結合分子僅可與一分子之FcγR結合，所以，一分子之抗原結合分子在已與抑制型FcγR結合之狀態無法與其他活性型FcγR結合。再者，據報告已與抑制型FcγR結合之狀態攝入細胞內之抗原結合分子會再循環到細胞膜上，並避免在細胞內分解(Immunity(2005)23,503-514)。亦即，對於抑制型FcγR有選擇性的結合活性的抗原結合分子，據認為無法形成成為免疫回應之原因的含活性型FcγR及二分子之FcRn之異複合體。

作為活性型Fcγ受體，含FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、FcγRIIa(包括副型R131及H131)以及含構造同型FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型 FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)為理想例。又，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)為抑制型Fcγ受體之理想例。

本說明書中，對抑制型FcγR之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性，係指Fc區改變體對FcγRIIb之結合活性，高於對FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性。例如：依據上述解析方法，含Fc區改變體之抗原結合分子對FcγRIIb之結合活性，顯示對FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性之105%以上，較佳為110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，尤佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上之結合活性。

對FcγRIIb之結合活性高於FcγRIa、FcγRIIa(包括副型R131及H131)及FcγRIIIa(包括副型V158及F158)最佳。FcγRIa對天然型IgG1之親和性極高，所以，據認為在活體內由於大量內因性IgG1使結合飽和，因此，即使對FcγRIIb之結合活性高於FcγRIIa及FcγRIIIa、低於FcγRIa，仍會抑制該複合體形成。

作為對照之含Fc區之抗原結合分子，可適當使用具有IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子。該Fc區之結構，記載於序列編號：5(RefSeq註冊編號AAC82527.1之N末端有 A加成)、6(RefSeq註冊編號AAB59393.1之N末端有A加成)、7(RefSeq註冊編號CAA27268.1)、8(RefSeq註冊編號AAB59394.1之N末端有A加成)。又，當使用含特定之構造同型之抗體之Fc區之抗原結合分子作為待測物質使用的情形，藉由將具有該特定構造同型之IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子作為對照，可驗證由於該含Fc區之抗原結合分子所致之對Fcγ受體之結合活性之效果。以上述方式，可適當選擇含有已驗證對Fcγ受體之結合活性為高之Fc區之抗原結合分子。

本發明之一非限定態樣中，作為對抑制型FcγR有選擇性結合活性之Fc區之例，可列舉前述Fc區之胺基酸中之EU編號表示之238或328之胺基酸改變為與天然型Fc區相異之胺基酸之Fc區為理想例。又，作為對抑制型Fcγ受體有選擇性結合活性之Fc區，US2009/0136485記載之Fc區或改變也可適當選擇。

又，本發明之一非限定態樣中，係前述Fc區之EU編號表示之胺基酸且EU編號表示之238之胺基酸改變為Asp、或328之胺基酸改變為Glu中之任一者以上之Fc區為理想例。

又，本發明之一非限定態樣中，EU編號表示之238位之Pro取代為Asp、及EU編號表示之237位之胺基酸為Trp、EU編號表示之237位之胺基酸為Phe、EU編號表示之267位之胺基酸為Val、EU編號表示之267位之胺基酸為Gln、EU編號表示之268位之胺基酸為Asn、EU編號表示之271位之胺基酸為Gly、EU編號表示之326位之胺基酸為Leu、EU編號表示之326位之胺基酸為Gln、EU編號表示之326位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Met、EU編號表示之239位之胺基酸為Asp、EU編號表示之267位之胺基酸為Ala、EU編號表示之234位之胺基酸為Trp、EU編號表示之234位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之237位之胺基酸為Ala、EU編號表示之237位之胺基酸為Asp、EU編號表示之237位之胺基酸為Glu、EU編號表示之237位之胺基酸為Leu、EU編號表示之237位之胺基酸為Met、EU編號表示之237位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之330位之胺基酸為Lys、EU編號表示之330位之胺基酸為Arg、EU編號表示之233位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ser、EU編號表示之326位之胺基酸為Thr、EU編號表示之323位之胺基酸為Ile、EU編號表示之323位之胺基酸為Leu、EU編號表示之323位之胺基酸為Met、EU編號表示之296位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ala、EU編號表示之326位之胺基酸為Asn、EU編號表示之330位之胺基酸為Met中之任一者以上之經改變的Fc區為理想例。

(態樣3)含有構成Fc區之二條多胜肽其中之一在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性且另一在pH中性域之條件下對FcRn無結合能力活性之Fc區的抗原結合分子

態樣3之抗原結合分子，能藉由一分子之FcRn與一分子之FcγR結合而形成三者複合體，但是不形成包含二分子之FcRn與一分子之FcγR之四者異複合體。本態樣3之抗原結合分子含有之構成Fc區之二條多胜肽其中之一在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性且另一在pH中性域之條件下對FcRn無結合能力活性之Fc區，可適當使用將雙專一性抗體(bispecific抗體)作為起源之Fc區。雙專一性抗體，係對相異抗原具有專一性之二種類之抗體。IgG型之雙專一性抗體，可藉由使將2種產生IgG抗體之融合瘤融合而產生之混成融合瘤(hybrid hybridoma)(quadroma)分泌(Milstein等人(Nature(1983)305,537-540)。

當上述態樣3之抗原結合分子係使用前述抗體項目記載之重組方法製造的情形，可採用將編碼為構成目的之二種Fc區之多胜肽之基因導入細胞並使此等共同表現的方法。但是製造的Fc區，會成為以2：1：1之分子數比例存在以下分子之混合物，即：構成Fc區之二條多胜肽其中之一在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性且另一多胜肽於pH中性域之條件下對FcRn無結合能力活性之Fc區、構成Fc區之二條多胜肽均在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區、構成Fc區之二條多胜肽均在pH中性域之條件下對FcRn無結合活性之Fc區。難以從3種IgG精製出含有目的組合之Fc區之抗原結合分子。

當使用如此的重組方法製造態樣3之抗原結合分子時，可藉由對構成Fc區之CH3分域施以適當胺基酸取代之改變，而優先分泌含有異質組合之Fc區的抗原結合分子。具體而言，將存在於其中一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob(「突起」之意))，並將存在於另一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole(「空隙」之意))，藉此使突起能配置於空隙內，而引起異種重鏈形成之促進及同種重鏈形成之妨害的方法(WO1996/027011、Ridgway等人(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等人(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。

又，也已知將利用多胜肽之組合、或多胜肽構成之異種多聚物之組合之控制方法用在構成Fc區之二條多胜肽之組合而製作雙專一性抗體之技術。亦即，可採用藉由改變形成構成Fc區之二條多胜肽內之界面之胺基酸殘基以控制使具相同序列之構成Fc區之多胜肽之組合受抑制且形成序列相異之二條構成Fc區之多胜肽之組合體的方法於雙專一性抗體之製作(WO2006/106905)。具體而言，在前述雙專一性抗體及其製作方法之項目記載之方法，於製造本發明之態樣3之抗原結合分子時可作為一非限定態樣。

此等態樣1~3之抗原結合分子，相較於能形成四者複合體之抗原結合分子，均可期待使免疫原性下降、及血漿中滯留性提高。

抗原結合分域之製造方法

本發明提供於標的組織專一性的化合物存在時對抗原之結合活性高於該化合物不存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域之製造方法。

亦即，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟；

(a)獲得標的組織專一性的化合物不存在時抗原結合分域之抗原結合活性

(b)獲得標的組織專一性的化合物存在時抗原結合分域之抗原結合活性

(c)選擇標的組織專一性的化合物不存在時之抗原結合活性低於該化合物存在時之抗原結合活性之抗原結合分域

(d)培養導入有將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞，及

(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

又，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含(a)~(e)之步驟；

(a)獲得存在低濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合分域之抗原結合活性

(b)獲得存在高濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合分域之抗原結合活性

(c)選擇存在低濃度標的組織專一性的化合物時之抗原結合活性低於該化合物以高濃度存在時之抗原結合活性之抗原結合分域

(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟；

(a)於標的組織專一性的化合物存在時使抗原結合分域或此等之庫與抗原接觸、

(b)將前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域放置於該化合物不存在下

(c)單離於前述步驟(b)解離之抗原結合分域

(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

(a)於存在高濃度標的組織專一性的化合物時使抗原結合分域或此等之庫與抗原接觸、

(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域放置於該化合物低濃度存在下

(c)單離於前述步驟(b)解離之抗原結合分域

(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

又，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；

(a)於標的組織專一性的化合物不存在下使抗原結合分域之庫與抗原接觸

(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域

(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域於該化合物存在下與抗原結合

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

(a)於標的組織專一性的化合物低濃度存在下使抗原結合分域之庫與抗原接觸

(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域

(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域於該化合物高濃度存在下與抗原結合

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(e)培養導入有將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞，及

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

(a)於標的組織專一性的化合物存在下使抗原結合分域之庫接觸固定有抗原之管柱

(b)使於前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域於該化合物不存在下從管柱溶出

(c)單離於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域

(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

(a)於標的組織專一性的化合物高濃度存在下使抗原結合分域之庫接觸固定有抗原之管柱

(b)使於前述步驟(a)已與管柱結合之抗原結合分域於該化合物低濃度存在下從管柱溶出

(c)單離於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域

(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；

(a)於標的組織專一性的化合物不存在下使抗原結合分域之庫通過固定有抗原之管柱

(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結合分域

(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域於該化合物存在下與抗原結合

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

(a)於標的組織專一性的化合物低濃度存在下使抗原結合分域之庫通過固定有抗原之管柱

(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結合分域

(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域於該化合物高濃度存在下與抗原結合

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

(a)於標的組織專一性的化合物存在下使抗原結合分域之庫與抗原接觸

(b)取得於前述步驟(a)已與抗原結合之抗原結合分域

(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域放置於化合物不存在下

(d)單離於前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

(a)於標的組織專一性的化合物高濃度存在下使抗原結合分域之庫與抗原接觸

(b)取得於前述步驟(a)已與抗原結合之抗原結合分域

(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域放置於化合物低濃度存在下

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域。

「細胞」、「細胞系」及「細胞培養」在本說明書係以相同含意使用，如此的稱呼可包括細胞或細胞系的所有後代。如此，例如：「轉形體」及「轉形細胞」之類的用語，無論繼代數，包括由此而來的一次對象細胞及培養物。又，也可理解為因為故意或偶發性的突異使得所有的後代的DNA的內容並非精確地相同。也包括於起初之轉形細胞篩選出的具有實質相同機能或生物學的活性的變異體的後代。當意圖記載相異稱呼時，從該記載之前後關係應可明白其意圖。使用之細胞，可適當選擇在前述「抗體」項目記載之細胞中之適當者。

提及編碼序列之表現時，控制序列係指為了於特定寄主生物以可作用地連結之編碼序列之表現所必要之DNA鹼基序列。例如原核生物的理想控制序列，包括啟動子，視情形有操縱組序列、核糖體結合部位、及不是十分理解之其他之序列。真核細胞，為了表現編碼序列，利用啟動子、Poly A化信號及增強子已為公眾所知。

關於核酸「可作用地連結」，係指該核酸與其他核酸序列在機能方面有關係。例如，前驅序列(presequence)或分泌前導的DNA，當就某多胜肽之分泌以前驅體蛋白質的形式表現的情形，與該多胜肽之DNA以可作動地結合。起動子或增強子，在其影響某編碼序列之轉錄的情形，與其序列以可作用地連結。或核糖體結合部，在位於其容易轉譯的位置的情形，以可作用地與編碼序列連結。通常，「可作用地連結」，係指結合之DNA序列連續，且為分泌前導的情形，連續且位於讀取框內。但增強子不需連續。連結可藉由以適當的限制部位接合而達成。不存在如此之部位之情形，合成寡核苷酸適應子(adaptor)或連結子可依習知的慣用方式使用。又，依前述Overlap Extension PCR之方法也可製作連結的核酸。

「接合」係在2個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵之方法。為了將2個片段接合，必需使片段的末端彼此搭配。視情形，該末端在核酸內切酶消化之後立即可有搭配性。但為了適於接合，首先在核酸內切酶消化之後需將一般形成之附著末端改為平滑末端。為了成為平滑末端，將DNA於適當緩衝液中於15℃、於4種去氧核糖核苷酸三磷酸之存在下，以DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶之Klenow片段的約10單位處理至少15分鐘。其次將DNA以酚氯仿萃取與乙醇沉澱、或二氧化矽精製精製。待連結之DNA片段係以等莫耳量加到溶液中。在該溶液中，加入ATP、接合酶緩衝液，以外，如T4DNA接合酶之接合酶係就DNA0.5μg含有約10單位。將DNA連結到載體的情形，載體首先由適當的限制核酸內切酶以消化作用使成線狀。成為線狀之片段其次以細菌之鹼性磷解酶或小牛腸管之磷解酶處理，而預防在接合之步驟之間之該片段自行接合。

本發明之製造方法中，將由上述「標的組織專一性化合物依存性的抗原結合分域」之項目說明之方法選擇之標的組織專一性的化合物存在時對抗原之結合活性高於該化合物不存在時對抗原之結合活性之抗原結合分域予以單離。例如以此方式單離之抗原結合分域係從庫選出的情形，係依後述實施例所記載，將編碼為該抗原結合分域之聚核苷酸利用從噬菌體等病毒依通常之基因放大而單離。又，當如此之經單離之抗原結合分域或抗體係從融合瘤等細胞之培養液選出的情形，如前述抗體之項目所示，係從該細胞將抗體基因等依通常之基因放大單離。

抗原結合分子之製造方法

本發明提供標的組織專一性的化合物存在時對抗原之結合活性高於該化合物不存在時對抗原之結合活性之抗原結合分子之製造方法。

亦即，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；

(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結

(e)培養導入有將(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞，及

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；

(a)獲得存在低濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合分域之抗原結合活性(b)獲得存在高濃度標的組織專一性的化合物時抗原結合分域之抗原結合活性(c)選擇存在低濃度標的組織專一性的化合物時之抗原結合活性低於該化合物以高濃度存在時抗原結合活性之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；

(c)單離於前述步驟(b)解離之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

(a)於存在高濃度標的組織專一性的化合物時使抗原結合分域或此等之庫與抗原接觸

(c)單離於前述步驟(b)解離之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；

(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結

(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞，及

(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

(b)將於前述步驟(a)已與管柱結合之抗原結合分域於該化合物不存在下從管柱溶出

(c)單離於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

(b)將於前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域於該化合物低濃度存在下從管柱溶出

(c)單離於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域

(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；

(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結合分域

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結合分域

(c)將於前述步驟(b)回收之抗原結合分域於該化合物高濃度存在下與抗原結合

(d)單離於前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域

(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

(b)取得於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域

(c)將前述步驟(b)取得之抗原結合分域放置於化合物不存在下

(d)單離前述步驟(c)抗原結合活性弱於前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域

(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

(b)取得於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域

(d)單離於前述步驟(c)之抗原結合活性弱於前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域

(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。

作為對編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，可列舉人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之抗體之不變區含有之Fc區。Fc區，係EU編號表示之約216位之胺基酸之木瓜酶切斷部位之鉸鍊區之N末端起、包含該鉸鍊、CH2及CH3分域之抗體之重鏈不變區之部分。Fc區，可從人類IgG1取得，但不限於IgG之特定次類。

又，作為對編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，也可列舉比起天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，對Fcγ受體之結合活性較高之Fc區。如此之Fc區，可列舉選自EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280 位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群組中之至少一個以上之胺基酸係與序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之對應EU編號之胺基酸殘基相異之Fc區。

又，作為前述Fc區之一非限定態樣，例如含有序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基當中，EU編號表示之；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、 232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、 Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、 Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、 396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、或440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者之群中選出之至少一個以上之胺基酸之改變的Fc區。又，改變之胺基酸數不特別限定，可僅有一處胺基酸改變，也可改變二處以上之胺基酸。二處以上之胺基酸之改變之組合，例如表1(表1-1~表1-3)記載之組合。

作為對編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，可列舉對抑制型Fcγ受體之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性之Fc區。具體而言，作為如此之Fc區之一非限定態樣，可列舉對FcγRIIb之結合活性高於對FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性的Fc區。

又，作為前述Fc區之一非限定態樣，例如：序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基當中，EU編號表示之238或328之胺基酸改變為與天然型Fc區相異之胺基酸之Fc區為理想例。如此之Fc區之例，宜為係前述Fc區之EU編號表示之胺基酸之EU編號表示之238之胺基酸為Asp、或328之胺基酸為Glu中之任一者以上之Fc區為理想例。

又，前述Fc區之一非限定態樣中，PCT/JP2012/054624例示之EU編號表示之238位之Pro取代為Asp、及EU編號表示之237位之胺基酸為Trp、EU編號表示之237位之胺基酸為Phe、EU編號表示之267位之胺基酸為Val、EU編號表示之267位之胺基酸為Gln、EU編號表示之268位之胺基酸為Asn、EU編號表示之271位之胺基酸為Gly、EU編號表示之326位之胺基酸為Leu、EU編號表示之326位之胺基酸為Gln、EU編號表示之326位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Met、EU編號表示之239位之胺基酸為Asp、EU編號表示之267位之胺基酸為Ala、EU編號表示之234位之胺基酸為Trp、EU編號表示之234位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之237位之胺基酸為Ala、EU編號表示之237位之胺基酸為Asp、EU編號表示之237位之胺基酸為Glu、EU編號表示之237位之胺基酸為Leu、EU編號表示之237位之胺基酸為Met、EU編號表示之237位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之330位之胺基酸為Lys、EU編號表示之330位之胺基酸為Arg、EU編號表示之233位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ser、EU編號表示之326位之胺基酸為Thr、EU編號表示之323位之胺基酸為Ile、EU編號表示之323位之胺基酸為Leu、EU編號表示之323位之胺基酸為Met、EU編號表示之296位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ala、EU編號表示之326位之胺基酸為Asn、EU編號表示之330位之胺基酸為Met中之任一者以上之改變之Fc區為理想例。

作為對編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，可列舉於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區。可為如此之改變之胺基酸，例如：國際公開WO1997/034631記載之EU編號表示之252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位、及/或434位以及與該等胺基酸組合之253位、310位、435位、及/或426位之胺基酸。國際公開WO2000/042072所記載，EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸為理想。同樣，作為可如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2002/060919所記載，EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸為理想。再者，作為可如此改變之胺基酸，可列舉如國際公開WO2004/092219記載，EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸。此外，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2006/020114所記載，238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260 位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位、及/或442位之胺基酸亦為理想。又，可為如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2010/045193記載，EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸亦為理想。

作為前述Fc區之一非限定態樣，例如：包含序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中，從EU編號表示之：251位之胺基酸為Arg或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、或Thr中之任一者、308位之胺基酸為Ile或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser中之任一者、312位之胺基酸為Ala或Asp中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者之群組中選出之至少一個以上胺基酸之改變之Fc區。上述改變之胺基酸之數不特別限定，可以僅改變一處之胺基酸，也可改變二處以上之胺基酸。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如：序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之308位之胺基酸為Ile、309位之胺基酸為Pro、及/或311位之胺基酸為Glu之Fc區。又，該Fc區之另一非限定態樣，可列舉包含308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Leu、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基酸為Ala之Fc區。又，該改變之又另一非限定態樣，可列舉包含308位之胺基酸為Ile或Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基酸為Ala或Leu之Fc區。該改變之不同非限定態樣，可列舉包含308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Ser、312位之胺基酸為Asp、及/或314位之胺基酸為Leu之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之251位之胺基酸為Leu、252位之胺基酸為Tyr、254位之胺基酸為Ser、或Thr、255位之胺基酸為Arg、及/或256位之胺基酸為Glu之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之一非限定的不同態樣，包含例如：序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、及/或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者之Fc區。又，該改變之另一非限定態樣，可列舉包含428位之胺基酸為His或Met、及/或434位之胺基酸為His或Met之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之非限定之其他不同態樣，例如包含序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之385位之胺基酸為Arg、386位之胺基酸為Thr、387位之胺基酸為Arg、及/或389位之胺基酸為Pro之改變。又，該改變之另一非限定態樣，例如包含385位之胺基酸為Asp、386位之胺基酸為Pro及/或389位之胺基酸為Ser之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含從序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者、之群組中選出之至少一個以上之胺基酸之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之250位之胺基酸為Gln、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之Fc區。又，作為該改變之另一非限定態樣，可列舉包含250位之胺基酸為Glu、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含從序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之251位之胺基酸為Asp或Glu中之任一者、252位之胺基酸為Tyr、307位之胺基酸為Gln、308位之胺基酸為Pro、378位之胺基酸為Val、380位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Leu、430位之胺基酸為Ala、或Lys中之任一者、434位之胺基酸為Ala、His、Ser、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Ile、之群組中選出之至少二個以上之胺基酸之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者之Fc區。又，作為該Fc區之另一非限定態樣，可列舉包含308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Ala之Fc區。又，該Fc區之又另一非限定態樣，可列舉包含252位之胺基酸為Tyr、及434位之胺基酸為Ala之Fc區。作為該Fc區之一不同的非限定態樣，可列舉包含378位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為Ala之Fc區。作為該Fc區之又另一不同的非限定態樣，可列舉包含428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，作為該Fc區之又另一不同的非限定態樣，可列舉包含434位之胺基酸為Ala、及436位之胺基酸為Ile之Fc區。再者，作為該改變之又另一非限定態樣，可列舉包含308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之Fc區。再者，該改變之又另一非限定態樣，可列舉包含307位之胺基酸為Gln、及436位之胺基酸為Ile之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ser中之任一者之Fc區。又，作為該Fc區之另一非限定態樣，例如包含307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ala之Fc區。又，作為該Fc區之又另一非限定態樣，例如包含252位之胺基酸為Tyr、308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之Fc區。作為該Fc區之一不同非限定態樣，例如包含251位之胺基酸為Asp、307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為His之Fc區。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含從序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中、EU編號表示之、EU編號表示之、 238位之胺基酸為Leu、244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、252位之胺基酸為Tyr、256位之胺基酸為Pro、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val、或Trp 中之任一者、312位之胺基酸為Pro、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、或Asn中之任一者、380位之胺基酸為Asn、Ser、或Thr中之任一者、382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、 434位之胺基酸為Phe、Gly、His、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Ile、Leu、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、之群組中選出之至少一個以上之胺基酸之改變。又，改變之胺基酸之數不特別限定，可以僅改變二處胺基酸，也可改變三處以上之胺基酸。

前述於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性強於人類IgG1之初始Fc區之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如：包含序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中、EU編號表示之、257位之胺基酸為Ile、及311位之胺基酸為Ile之Fc區。又，作為該Fc區之另一非限定態樣，例如包含257位之胺基酸為Ile、及434位之胺基酸為His之Fc區。又，該Fc區之又另一非限定態樣，可列舉包含376位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為His之Fc區。

作為對編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，可列舉於pH中性域之條件下對人類FcRn有結合活性之Fc區。pH中性域對人類FcRn有結合活性之Fc區，例如包含從序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之221位~225位、227位、228位、230位、232位、233位~241 位、243位~252位、254位~260位、262位~272位、274位、276位、278位~289位、291位~312位、315位~320位、324位、325位、327位~339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位~378位、380位、382位、385位~387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位~438位、440位及442位之群組中選出之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

前述pH中性域之條件下對有FcRn結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含從序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區含有之Fc區之胺基酸殘基之中EU編號表示之237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位及436位之胺基酸經取代之Fc區。藉由將從該等胺基酸選擇之至少1個胺基酸取代為其他胺基酸，能使抗原結合分子含有之Fc區在pH中性域對人類FcRn結合。

前述pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區之另一非限定態樣，例如包含從EU編號表示之：237位之胺基酸為Met、248位之胺基酸為Ile、250位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、 Trp、或Tyr中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Thr、255位之胺基酸為Glu、256位之胺基酸為Asp、Asn、Glu、或Gln中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中之任一者、258位之胺基酸為His、265位之胺基酸為Ala、286位之胺基酸為Ala或Glu中之任一者、289位之胺基酸為His、297位之胺基酸為Ala、303位之胺基酸為Ala、305位之胺基酸為Ala、307位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、308位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中之任一者、311位之胺基酸為Ala、His、或Ile中之任一者、312位之胺基酸為Ala或His中之任一者、314位之胺基酸為Lys或Arg中之任一者、 315位之胺基酸為Ala、Asp或His中之任一者、317位之胺基酸為Ala、332位之胺基酸為Val、334位之胺基酸為Leu、360位之胺基酸為His、376位之胺基酸為Ala、380位之胺基酸為Ala、382位之胺基酸為Ala、384位之胺基酸為Ala、385位之胺基酸為Asp或His中之任一者、386位之胺基酸為Pro、387位之胺基酸為Glu、389位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者、424位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、433位之胺基酸為Lys、434位之胺基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為His、Ile、Leu、Phe、Thr、或Val、之群組中選出之至少一個以上之胺基酸之Fc區。又，改變之胺基酸數不特別限定，可僅改變一處胺基酸，也可改變二處以上之胺基酸。該等胺基酸之改變之組合，例如表2-1~2-33 所示之胺基酸之改變。

作為對編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，可列舉對活性型FcγR之結合活性低於天然型Fc區對活性型FcγR之結合活性的Fc區。作為該Fc區之另一非限定態樣，可列舉EU編號表示之、EU編號表示之234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、及329中之任一者以上之胺基酸改變為與例如：序列編號：5、6、7、或8表示之天然型Fc區相異之胺基酸的Fc區為理想例，但Fc區之改變不限於上述改變，也可為例如Cur.Opin.in Biotech.(2009)20(6),685-691記載之脫糖鏈(N297A,N297Q)、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改變、及國際公開WO2008/092117記載之G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改變、及EU編號233位、234位、235位、237位中插入胺基酸、國際公開WO2000/042072記載之部位之改變。

作為對前述活性型FcγR之結合活性低於天然型Fc區對活性型FcγR之結合活性之Fc區之另一非限定態樣，可列舉包含從EU編號表示之、234位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、 His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Arg中之任一者、236位之胺基酸為Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr或Arg中之任一者、238位之胺基酸為Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp或Arg中之任一者、239位之胺基酸為Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Arg中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、267位之胺基酸為Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中之任一者、269位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、270位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、271位之胺基酸為Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp或Tyr 中之任一者、295位之胺基酸為Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Arg、Gly、Lys或Pro中之任一者、297位之胺基酸為Ala、298位之胺基酸為Arg、Gly、Lys、Pro、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Arg、Lys或Pro中之任一者、324位之胺基酸為Lys或Pro中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、Pro、Thr、TrpTyr、或Val中之任一者、327位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、328位之胺基酸為Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中之任一者、329位之胺基酸為Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或Arg中之任一者、330位之胺基酸為Pro或Ser中之任一者、331位之胺基酸為Arg、Gly或Lys中之任一者、或332位之胺基酸為Arg、Lys或Pro中之任一者之群組中選出之至少一個以上之胺基酸之Fc區。又，改變之胺基酸數不特別限定，可僅有一處胺基酸改變，也可改變二處以上之胺基酸。

本發明之非限定態樣中之抗原結合分子含有之Fc區，可適當使用形成將上述雙專一性抗體作為起源之Fc區之二條多胜肽。更具體而言可適當使用為形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之349之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Trp、且另一多胜肽之胺基酸序列之EU編號表示之356之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Ser、368之胺基酸為Ala、407之胺基酸為Val的二條多胜肽。

其他本發明之一非限定態樣之Fc區，可適當使用為形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之409之胺基酸為Asp、且另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之399之胺基酸為Lys的二條多胜肽。上述態樣中，也可將409之胺基酸從Asp替換為Glu、399之胺基酸從Lys替換為Arg。又，也可除了399之胺基酸之Lys以外，追加作為360之胺基酸的Asp或追加作為392之胺基酸的Asp為理想。

本發明之另一非限定態樣之Fc區，可理想地使用係形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之370之胺基酸為Glu、另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之357之胺基酸為Lys之二條多胜肽。

本發明之另一非限定態樣之Fc區，可理想地使用係形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之439之胺基酸為Glu、且另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之356之胺基酸為Lys之二條多胜肽。

本發明之另一非限定態樣之Fc區，例如組合此等之以下態樣中之任一者為理想；(i)係形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu、且另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys之二條多胜肽(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可替換為Asp、EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可替換為392之胺基酸之Asp)、(ii)係形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之409之胺基酸為Asp、439之胺基酸為Glu、且另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之399之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys之二條多胜肽(本態樣中，EU編號表示之439之胺基酸之Glu也可替換為360之胺基酸之Asp、EU編號表示之392之胺基酸之Asp或439之胺基酸之Asp)、(iii)係形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu、且另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之357之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys之二條多胜肽、或係形成Fc區之二條多胜肽，且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu、且另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys之二條多胜肽(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸也可替換為Glu，又，也可370之胺基酸不取代為Glu，而將439之胺基酸之Glu替換為Asp或439之胺基酸之Glu替換為392之胺基酸之Asp)。

再者，本發明之另一非限定態樣中，也可理想地使用係形成Fc區之二條多胜肽且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之356之胺基酸為Lys、另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu的二條多胜肽。

再者，本發明之另一非限定態樣中，也可理想地使用係形成Fc區之二條多胜肽且特徵為其中一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之356之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys、另一多胜肽之胺基酸序列中之EU編號表示之370之胺基酸為Glu、435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu之二條多胜肽。

以如上述記載方式連結之編碼為抗原結合分域之聚核苷酸及編碼為包含Fc區之多胜肽的聚核苷酸利用可作用地連結之所望表現載體轉形而得之細胞之培養液中，可單離本發明之抗原結合分子。

本發明之抗原結合分子含有之Fc區，係修飾成使該Fc區結合之糖鏈之組成係結合有岩藻醣缺損糖鏈之Fc區之比例高、或加成有二分化N-乙醯基葡糖胺之Fc區之比例高之Fc區時，作為前述經轉形之細胞，可適當使用接受糖鏈修飾之多胜肽形成糖鏈結構之活性改變使得對於糖鏈加成岩藻醣之能力低之寄主細胞(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。該寄主細胞之一非限定態樣，可適當使用從岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖轉運蛋白(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-去氧甘露糖3,5-差向異構酶，4-還原酶)(EC 1.1.1.271)、及GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC 2.7.7.30)構成之群中選出之酵素或運送蛋白之活性係缺失之寄主細胞(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。如此之活性缺失之寄主細胞，可藉由將CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞等的內在性的機能性蛋白質之基因破壞為無法作用的方法等製作。

本發明之抗原結合分子含有之Fc區為具有二分化GlcNAc之糖鏈之Fc區時，作為前述經轉形之細胞，為了製作含二分化GlcNAc之糖鏈的抗體，係適當使用表現編碼為具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基轉移酶)(EC 2.4.1.38)活性之機能性蛋白質的基因的寄主細胞(國際公開WO2002/079255等)。另一非限定之理想態樣中，係適當使用除了前述機能性蛋白質以外，尚共同表現編碼為具有人類 ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTI(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶I)(EC 2.4.1.94)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTII(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶II)(EC 2.4.1.143)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性之機能性蛋白質之基因、及α-1,6-岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.68)之寄主細胞(國際公開WO2004/065540)。

使用從上述細胞之培養液單離等依上述抗體之項目記載之抗體之製造方法的方法，可製造本發明之抗原結合分子。前述含Fc區之多胜肽之一非限定態樣，例如：序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區。又，本發明之抗原結合分子之一非限定態樣，例如全長抗體分子。

醫藥組合物

依本發明提供一種醫藥組合物，其為了避免副作用且同時發揮藥效，包含於正常組織或血液中不全身性作用，而是於係病變部位之癌或發炎部位作用之抗原結合分子。本發明之醫藥組合物含有之抗原結合分子，由於會與於癌組織中之癌細胞‧免疫細胞‧基質細胞等表現之抗原、癌組織分泌之抗原、或發炎性組織中之免疫細胞等表現之抗原、發炎性組織分泌之抗原結合，且不與正常組織表現之抗原結合，所以可避免對於正常組織之細胞傷害作用或中和作用等造成副作用，對於癌發揮強大的細胞傷害作用或增殖抑制作用、免疫亢進作用等、或於發炎性組織發揮對發炎性細胞之免疫抑制效果等。例如：包含對癌組織專一性化合物依存性地在T細胞表現之CD3結合之抗原結合分域、及與癌細胞表現之EGFR結合之抗原結合分域的雙專一性抗原結合分子或雙重抗原結合位之抗原結合分子，不會與正常組織表現之EGFR結合，而會與癌細胞表現之EGFR結合，所以會避免副作用且同時發揮強大的抗腫瘤效果。亦即，對癌細胞附近之T細胞表現的CD3會以癌組織專一性化合物依存性的結合，但是對癌細胞附近以外之T細胞表現之CD3不結合，所以會活化癌細胞附近存在的T細胞，且避免副作用，同時發揮強大的抗腫瘤效果。

如上，於標的組織與抗原結合，且於其他正常組織或血液中不與抗原結合之抗原結合分子，會避免副作用且同時發揮藥效。本發明提供於活體內之標的組織以高濃度存在之低分子作為開關而與抗原結合之抗原結合分子，亦即，低分子開關抗原結合分子(Small molecule switch antigen binding molecule)，於該低分子不存在之正常環境不與抗原結合，而於該低分子以高濃度存在之標的組織可與抗原結合。

如此之低分子開關抗原結合分子之一非限定態樣，首先，可列舉於癌組織或發炎性組織以高濃度存在且能作為開關功能之癌組織或發炎性組織專一性化合物即腺苷(adenosine)、腺苷3磷酸(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿胺酸(犬尿胺酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid)夾持於本發明之抗原結合分子(含有之抗原結合位)與抗原(含有之抗原決定部位)，而發揮開關機能之癌組織或發炎性組織專一性的化合物依存性抗原結合分子。若該化合物不存在，本發明之抗原結合分子所含之抗原結合位與抗原含有之抗原決定部位間之交互作用不夠，本發明之抗原結合分子無法與抗原結合，但若該化合物存在，藉由夾於本發明之抗原結合分子所含之抗原結合位與抗原含有之抗原決定部位之間，於該化合物以高濃度存在之癌組織或發炎性組織等標的組織中與抗原結合之該抗原結合分子能夠對於表現該抗原之細胞發揮藥效。又，成為此開關之化合物之結合係可逆的，故據認為該等化合物之開關所致之本發明之抗原結合分子對抗原之結合之控制係可逆的。如此，在癌組織或發炎性組織等病變部位之癌組織或發炎性組織，與癌細胞或免疫細胞等病態細胞結合或與於癌組織或發炎性組織分泌之抗原結合且可發揮藥效之本發明之抗原結合分子，作為醫藥組合物係有用。本發明之醫藥組合物可包含醫藥上可容許之擔體。

本發明中，醫藥組合物係指通常用於疾病之治療或預防、或檢查‧診斷用的藥劑。又，本發明中，「包含因應標的組織專一性化合物之濃度而對抗原之結合活性改變之抗原結合分子的醫藥組合物」之用語，也可代換為「包含對於治療對象投予因應標的組織專一性化合物之濃度而對抗原之結合活性改變之抗原結合分子之步驟的疾病之治療方法」，也可代換為「在製造用於治療疾病之醫藥時使用因應標的組織專一性化合物之濃度而對抗原之結合活性改變化之抗原結合分子之用途」。又，「包含因應標的組織專一性化合物之濃度而對抗原之結合活性改變之抗原結合分子的醫藥組合物」之用語，也可代換為「為了治療疾病，使用因應標的組織專一性化合物之濃度而對抗原之結合活性改變化之抗原結合分子」。

本發明之醫藥組成物，能以該技術領域之人士公知之方法製劑化。例如：能以與水或其他藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式以非經口的使用。例如：藥理學上可容許之擔體或介質，具體而言，可考慮適當組合滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、運載劑、防腐劑、黏結劑等，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合而製劑化。該等製劑中的有效成分量，可設定為可獲得指示範圍之適當容量。

用於注射之無菌組成物，可使用如注射用蒸餾水之運載劑而依通常之製劑實務配方。注射用之水溶液，例如生理食鹽水、葡萄糖或含其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酸酯80(TM)、HCO-50等)。

油性液，例如麻油、黃豆油，溶解輔助劑可併用苯甲酸苄酯及/或苯甲醇。又，也可摻合緩衝劑(例如：磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、止痛劑(例如：鹽酸普羅卡因)、安定劑(例如：苯甲醇及酚)、抗氧化劑。製備的注射液通常充填在適當的安瓿。

本發明之醫藥組成物較佳為以非經口投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組成物。例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等對全身或局部投予。

投予方法可視患者之年齡、症狀適當選擇。含抗原結合分子之醫藥組成物之投予量，例如可設定為每次體重1kg為0.0001mg至1000mg之範圍。或，可定為例如每位患者為0.001~100000mg之投予量，但本發明不一定限於該等數值。投予量及投予方法，視患者之體重、年齡、症狀等而變動，但如為該技術領域之人士，可考慮該等條件，設定適當的投予量及投予方法。

又，本發明記載之胺基酸序列所包含之胺基酸，有時會受到轉譯後修飾(例如：N末端之麩醯胺酸由於焦麩胺醯基化而修飾為焦麩胺酸為該技術領域之人士熟知之修飾)，但如此的胺基酸為轉譯後修飾時，當然也包含在本發明記載之胺基酸序列。

又，本說明書引用之所有先前技術文獻納入本說明書作為參考。

以下對於本發明於實施例更具體說明，但是本發明不限於此等實施例。

【實施例】

[實施例1]以於標的組織以高濃度存在之低分子作為開關而與抗原結合之抗體之概念

為了避免副作用同時發揮藥效，尋求於正常組織或血液中不全身性作用，而是在係病變部位之癌或發炎部位作用之新藥開發技術。投予後與癌細胞表現之抗原結合且無法與在正常組織表現之抗原結合之抗體分子，能避免對於正常組織因為細胞傷害作用導致之副作用且同時對於癌發揮強大的細胞傷害作用。例如：前述EGFR-BiTE(非專利文獻9)係經改變之抗原結合分子，該不與正常組織表現之EGFR結合，而與癌細胞表現之EGFR結合之分子，能避免副作用且同時發揮強大抗腫瘤效果。又，BiTE藉由CD3補充T細胞且活化，以發揮抗腫瘤效果(非專利文獻8)，所以對於EGFR-BiTE，若能賦予會與癌細胞附近存在的T細胞表現之CD3結合，而與癌細胞附近以外存在之T細胞表現之CD3不結合之性質，則賦予了如此之性質之改變EGFR-BiTE，能夠將癌之T細胞活化，可避免副作用且同時發揮強大的抗腫瘤效果。

抗體分子不限於作為對抗癌之抗體醫藥，抗體分子若能在類風濕關節炎中引起發炎之關節之滑膜液中與細胞激素結合並抑制其作用，且不會全身性地抑制，則據認為可避免由於全身性細胞激素之中和造成傳染病風險增大，且同時可對於類風濕關節炎等發炎性疾病‧自體免疫疾病發揮高治療效果。

如上，於癌組織與抗原結合，且於其他正常組織或血液中不與抗原結合之抗體，能避免副作用且發揮藥效。但是至今為止，尚無具有如此特性之理想抗體被報告。而，以活體內之癌組織中以高濃度存在之低分子作為開關而與抗原結合之抗體分子，亦即，低分子開關抗體(Small molecule switch antibody)，如圖1，於不存在低分子之環境不與抗原結合，於低分子以高濃度存在之標的組織可與抗原結合。

在開發如此之低分子開關抗體時，首先找尋於癌組織以高濃度存在且據認為能作為開關使用之低分子。其結果，腺苷(adenosine)、腺苷3磷酸(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿胺酸(犬尿胺酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid)作為開關有希望。該等低分子均藉由從癌細胞自體產生、或從細胞死之癌細胞放出、或從於癌組織浸潤之免疫細胞等產生，而於癌組織以高濃度存在，且於正常組織或血液中相較於癌組織以較低濃度存在。該等低分子，如圖2，若能夾於抗體與抗原之複合體，則該低分子可執行開關功能。亦即，若低分子不存在，抗體與抗原之交互作用不夠，抗體無法與抗原結合，但若低分子存在，藉由夾於抗體與抗原之間，抗體能與抗原結合。換言之，於低濃度低分子存在下，抗體與抗原之交互作用不足，抗體無法與抗原結合，但是於高濃度之低分子存在下藉由夾於抗體與抗原之間，抗體能與抗原結合。又，成為此開關之低分子之結合係可逆的，所以利用該等低分子開關控制抗原結合係可逆的。

而，首先嘗試取得對於關於涉及癌細胞之增殖之IL-6(Br.J.Haematol.(2011)152(5),579-92)之低分子開關抗體。

[實施例2]從使用噬菌體展示技術之人類抗體庫取得於低分子存在下與人類IL-6結合之抗體

(2-1)未改變(naïve)人類抗體噬菌體展示庫之製作

將從人類PBMC製成之Poly A RNA、或市售之人類Poly A RNA等作為模板，依該技術領域中具有通常知識者公知之方法，建構由展示彼此互異之人類抗體序列之Fab分域之多數噬菌體構成的人類抗體噬菌體展示庫。

(2-2)利用珠粒淘選由庫取得於低分子存在下與人類IL-6結合之抗體

從(2-1)建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，進行低分子存在下對抗原顯示結合活性之抗體之篩選。亦即，收集提示對於捕捉在珠粒之抗原於低分子存在下顯示結合活性之抗體的噬菌體。從於低分子不存在之條件從珠粒溶出之噬菌體溶出液回收噬菌體。本取得方法，係使用經生物素標記之人類IL-6作為抗原。

由保持已構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生之噬菌體，係依一般的方法精製。之後，獲得經TBS透析處理之噬菌體庫液。對噬菌體庫液添加BSA，使終濃度為4%。實施使用於磁珠固定化之抗原的淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。

為了有效率地取得於癌組織能發揮開關作用之低分子依存性的低分子開關抗體，實施濃縮於該等低分子(腺苷(adenosine)、腺苷3磷酸(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿胺酸(犬尿胺酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid))之混合液(以下表示記載為SC(small molecule cocktail))之存在下與抗原結合且於SC不存在下不與抗原結合之抗體的淘選。

具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250pmol之生物素標記抗原，藉此使由各終濃度為1mM之腺苷3磷酸鈉鹽(ATP-Na)、腺苷(Adenosine)、肌苷(Inosine)、琥珀酸(Succinic acid)、及乳酸(Lactic acid)、終濃度為1μM之前列腺素E2(PGE2)、以及終濃度為100μM之犬尿胺酸(犬尿胺酸)構成且以NaOH調成pH7.4之SC、與該噬菌體庫液於室溫接觸60分鐘。於噬菌體庫液添加以BSA阻斷的磁珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。將珠以SC/TBS(包括SC之TBS)洗滌1次。之後，將添加有0.5mL之1mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

第1次之淘選係回收於低分子存在下可結合之噬菌體，第2次後之淘選，係實施於SC存在下對抗原可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，於製備的噬菌體庫液添加40pmol之生物素標記抗原及SC、NaOH，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原及低分子接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。珠以1mL之SC/TBST與SC/TBS洗滌。之後，將添加有0.5mL之TBS的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。再次重複此作業後，將分2次溶出之噬菌體液混合。再對於殘留的珠粒加入0.5mL之TBS，將該珠粒於室溫進行5 分鐘攪拌。從使用磁座分離之珠粒回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液添加100mg/mL之胰蛋白酶5μL，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者(helper)噬菌體來源之pIII蛋白質)，使未呈現Fab之噬菌體失去對於大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225mm x 225mm之板。將第2次淘選獲得之2種感染大腸菌在此時點各等量混合，其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。重複3次取得於SC存在下對抗原有結合活性之抗體的淘選。

(2-3)利用負選擇法從庫取得於低分子存在下與人類IL-6結合之抗體

從建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，進行低分子存在下對抗原顯示結合活性之抗體之篩選。為了篩選，首先使未改變人類抗體噬菌體展示庫於低分子不存在下與生物素標記抗原-鏈黴親和素(streptavidin)接觸，去除提示即使於分子不存在下仍對抗原有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於低分子存在下同樣進行淘選，以實施於低分子存在之條件下對抗原有結合活性之抗體之篩選。抗原使用經生物素標記之IL-6。

由保持已構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生噬菌體。依一般的方法精製產生之噬菌體後，獲得經TBS透析處理之噬菌體庫液。對噬菌體庫液添加BSA，使終濃度為4%。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)，並實施使用於磁珠固定化之抗原的淘選。

於製備之噬菌體庫液加入250pmol之生物素標記抗原、及由各終濃度為1mM之ATP-Na、Adenosine、Inosine、Succinic acid、及Lactic acid、終濃度1μM之PGE2、以及終濃度100μM之犬尿胺酸構成且以NaOH調整pH為7.4之SC，使與該噬菌體庫液於室溫接觸60分鐘。於噬菌體庫液添加以BSA阻斷的磁珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。將珠以SC/TBS洗滌1次。之後，將添加有0.5mL之1mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

第1次之淘選係回收於SC存在下可結合之噬菌體，第2次後之淘選，係實施於SC存在下對抗原可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，具體而言，於經BSA阻斷之Sera-Mag NeutrAvidin珠粒加入250pmol生物素化抗原，於室溫使結合15分鐘。對以TBS洗滌3次的珠粒，加入經BSA阻斷的噬菌體庫液，於室溫使其進行1小時結合。使用磁座將珠粒分離，以回收未與抗原及珠粒結合之噬菌體。對回收之噬菌體加入40 pmol之生物素標記抗原及SC、NaOH，使噬菌體庫於室溫與抗原及含SC之低分子接觸60分鐘。然後，於標記抗原、SC及噬菌體庫之混合液中加入以BSA阻斷之磁珠，於室溫使抗原與噬菌體之複合體與磁珠結合15分鐘。珠粒以1mL之SC/TBST與SC/TBS洗滌。之後將1mg/mL之Trypsin溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫進行20分鐘攪拌後，從使用磁座分離之珠粒回收噬菌體。回收之噬菌體添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，以使噬菌體感染到大腸菌。受感染之大腸菌接種到225mm x 225mm之板。取得於SC存在下對抗原有結合活性之抗體的淘選重複進行3次。

(2-4)利用噬菌體ELISA評價於低分子存在下之結合活性

從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，參考常法(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。

使用NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)，將回收之培養上清進行超過濾。將已將培養上清各100μL對各井塗用之NucleoFast 96進行離心分離(4,500g,45分鐘)，以去除通流物(flow through)。將100μL之H₂O已加到各井之該NucleoFast 96再度離心分離(4,500g,30分鐘離心)以洗滌。最後，加入TBS 100μL，回收於室溫靜置5分鐘之該NucleoFast 96之各井之上清含有之噬菌體液。

已加入TBS、或SC/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體，將該板於37℃靜置1小時，使提示噬菌體之抗體於SC不存在/存在下結合於在各井存在的抗原。於以TBST或SC/TBST洗滌之各井添加經TBS或SC/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或SC/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。

使用經單離96種選殖體進行噬菌體ELISA，獲得於低分子雞尾酒存在下對係抗原之人類IL-6有結合活性之選殖體「I6NMSC1-3_A11」。

[實施例3]於低分子存在下與抗原結合之抗體之評價

(3-1)與人類IL-6結合之抗體之表現與精製

解析從實施例2噬菌體ELISA顯示之判斷於SC存在下對抗原有結合活性之選殖體I6NMSC1-3_A11使用專一性的引子(序列編號：110及112)放大之基因之鹼基序列(重鏈之序列為序列編號：30及輕鏈之序列為序列編號：31)。將編碼為I6NMSC1-3_A11之可變區之基因插入人類IgG1/Lambda之動物表現用質體、既知之抗人類IL-6抗體CLB8-F1(重鏈為序列編號：32、輕鏈為序列編號：33)、及編碼為陰性對照即抗人類Glypican 3抗體GC413(重鏈為序列編號：34、輕鏈為序列編號：35)之可變區之基因各插入人類IgG1/kappa之動物表現用質體。使用以下方法表現抗體。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)而得之細胞懸浮液，以1.33 x 10⁶個/mL之細胞密度對6井盤的各井各接種3mL。其次以脂轉染法將製備之質體導入細胞。將該細胞於CO₂培養箱(37℃、8%CO₂,90rpm)培養4日，從單離之培養上清使用rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。經精製之抗體溶液之吸光度(波長：280nm)使用分光光度計測定。從獲得之測定值使用依PACE法計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。

(3-2)取得之抗體對人類IL-6之結合為必要之低分子之鑑定

取得之I6NMSC1-3_A11(以下簡稱A11)與對照之CLB8-F1及GC413共3種之抗體，於表3所示之9種條件下供ELISA。又，以表4所示之緩衝液以表3所示濃度適當製備各低分子。抗原使用經生物素標記之人類IL-6。

【表3】

先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以Wash buffer洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以Blocking Buffer 250μL阻斷1小時以上。於已去除Blocking Buffer之各井添加為表3之終濃度且含有低分子之以Sample Buffer製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時，使IgG結合於在各井存在的抗原。於表3之終濃度且含低分子之Wash Buffer洗滌後，將以含該低分子之Sample Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)添加到各井之板於溫育1小時。以含各低分子之Wash Buffer洗滌後，將添加有TMB single溶液 (ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。

測定結果如圖3。CLB8-F1，不論低分子之種類及是否存在，吸光度為相同，相對於此，I6NMSC1-3_A11，比起於條件8(全部低分子之雞尾酒溶液)之吸光度，於條件9(無低分子)之吸光度顯著較低。從此結果，於噬菌體ELISA同樣可確認I6NMSC1-3_A11具有取決於低分子有無而改變與抗原之結合之性質。又，I6NMSC1-3_A11在條件7(犬尿胺酸100μM存在下)中，顯示與條件8為同等吸光度，在其他條件下則吸光度為顯著較低，顯示係於犬尿胺酸存在下會與抗原人類IL-6結合且於犬尿胺酸不存在下不與IL-6結合之抗體。

[實施例4]利用表面電漿共振評價犬尿胺酸對與人類IL6之結合之影響

(4-1)犬尿胺酸之開關功能對與人類IL-6結合之評價

使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析A11與人類IL-6(KAMACURA TECHNOSCIENCE)間之抗原抗體反應之交互作用。使以胺偶聯法適量固定protein A/G(Invitrogen)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)捕捉目的抗體，並與抗原IL-6交互作用。運行緩衝液使用10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、100μmol/L犬尿胺酸、pH7.4、或10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4之2種。與抗原IL-6之交互作用係於37℃測定，IL-6之稀釋使用與運行緩衝液為相同之緩衝。

將人類IL-6稀釋液與空白運行緩衝液以流速 5μL/min注射3分鐘，使感測晶片上捕捉的A11與人類IL-6交互作用。之後，以流速5μL/min流通運行緩衝液3分鐘，觀察抗體從人類IL-6解離後，將10mmol/L Glycine-HCl、pH1.5以流速30μL/min注射30秒，使感測晶片再生。從測定獲得之感測圖算出之動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)為依據，計算A11對人類IL-6之解離常數K_D(M)。各參數之計算，使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。

於此測定取得之於100μmol/L犬尿胺酸存在下、或不存在下，A11與4μmol/L之人類IL-6間之交互作用之感測圖如圖4。如圖4，A11於100μmol/L之犬尿胺酸存在下會與IL-6結合，但於犬尿胺酸不存在下未觀察到對IL-6結合。因此，可確認A11具有以犬尿胺酸作為開關而與IL-6結合之性質。又，100μmol/L犬尿胺酸存在下，A11之解離常數K_D為1.0E^-6mol/L。

(4-2)犬尿胺酸濃度對於與人類IL-6結合造成之影響之評價

其次，使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價犬尿胺酸濃度對於A11與人類IL-6間之抗原抗體反應之影響。運行緩衝液使用10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，A11與人類IL-6之抗原抗體反應係於25℃測定。在感測晶片CM5上利用胺偶聯固定A11，將經含製成各種濃度之含犬尿胺酸之10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4稀釋之1μmol/L之IL-6作為分析物，進行60秒交互作用，觀察其結合量之變化。其結果如圖5。從此結果可明白：成為開關之犬尿胺酸濃度愈高，IL-6對A11結合更多。

其次，為了評價犬尿胺酸濃度對於固定在感測晶片CM5上之A11之犬尿胺酸開關功能之對照即庫來源之人類IL-6所結合之H01抗體(重鏈為序列編號：36、輕鏈為序列編號：37)與人類IL-6間之抗原抗體反應之影響，實施與上述為同樣之實驗。其結果如圖6。由此結果可知，庫來源之對照之抗IL-6抗體H01，即使犬尿胺酸濃度變化，對IL-6之結合仍無變化。

其次，使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價A11對IL-6為以二價結合時，開關犬尿胺酸之濃度對其結合造成影響。運行緩衝液使用10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，A11與人類IL-6之抗原抗體反應於25℃測定。在感測晶片CM5上以胺偶聯將IL-6固定化，並將以包含製備為各種濃度之犬尿胺酸之10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4稀釋之0.1μmol/L之A11作為分析物，進行60秒交互作用，觀察以二價結合時，A11對IL-6之結合量之變化。其結果如圖7。此評價系，由於IL-6係固定於感測晶片上，故可認為A11以二價結合。於乳此之A11以二價認識IL-6之評價系，也觀察到犬尿胺酸濃度愈高，A11之IL-6之結合量愈增加。從此結果可知，以二價之結合，A11具有對IL-6以犬尿胺酸作為開關結合之性質。

(4-3)犬尿胺酸開關對於抗體從人類IL-6解離之效果

使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價於犬尿胺酸存在下對IL-6結合之A11，是否於犬尿胺酸不存在下會以犬尿胺酸濃度依存的解離。運行緩衝液使用10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4及10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4、100μmol/L犬尿胺酸，於25℃測定。於利用胺偶聯固定IL-6之感測晶片CM5，將以含100μmol/L之犬尿胺酸之10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4稀釋之0.1μmol/L作為A11進行60秒交互作用後，觀察於各運行緩衝液條件下IL-6之解離狀態。為了比較各運行緩衝液條件下之解離程度，比較定於100μmol/L之犬尿胺酸存在下對IL-6之A11之結合量為100並標準化(normalize)之值。顯示該標準化之後之A11與IL-6之交互作用之狀態的感測圖，如圖8。由圖8之結果，可知A11於犬尿胺酸存在下與IL-6結合後，若犬尿胺酸不存在，IL-6會快速解離。亦即，可確認利用犬尿胺酸控制抗體對人類IL-6之結合係完全可逆的。

從該等結果，可知A11係以犬尿胺酸作為開關，於犬尿胺酸存在下與IL-6結合，並於犬尿胺酸不存在下從IL-6解離之抗體。又，確認A11於犬尿胺酸不存在下，可進行對人類IL-6完全無結合活性之完全ON/OFF控制，如圖2所示態樣，推測發揮開關機能。

(4-4)犬尿胺酸對於人類IL-6之結合性之評價

使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析IL-6(鎌倉TECHNOSCIENCE)與犬尿胺酸之交互作用。於以胺偶聯法固定IL-6約5000RU之Sensor chip CM5(GE Healthcare)，使800、400、200、100、50、25nmol/L之犬尿胺酸交互作用。作為運行緩衝液，使用0mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4。前述交互作用均於25℃測定。犬尿胺酸之稀釋使用運行緩衝液。取得之IL-6與犬尿胺酸之交互作用之感測圖如圖9。

前述實驗中，係固定IL-6約5000RU。IL-6之分子量為約20,000g/mol，犬尿胺酸之分子量為約200g/mol，故期待犬尿胺酸最大以50RU程度交互作用。但是本次之測定條件中，即使使最大濃度800nmol/L之犬尿胺酸交互作用，也未能觀察到與IL-6之明確交互作用。

由前述實施例之結果，推測包括A11、IL-6及犬尿胺酸之複合體形成時，犬尿胺酸之KD為數十nM至數nM。由此可認為：假定犬尿胺酸與IL-6直接交互作用，則藉由以800nmol/L與犬尿胺酸交互作用，能觀察到明確的交互作用。從此結果啟示，犬尿胺酸與IL-6並非直接交互作用，而是與A11交互作用、或對於A11與IL-6之複合體以數十nM交互作用。

[實施例5]利用兔B細胞選殖取得抗腺苷抗體

(5-1)用於腺苷結合庫製作之免疫原之設計

作為對兔免疫之免疫原，使用圖10所示之2'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30 helper peptide(2'-Adenosine-PEG-peptide)、及圖11示 5'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30 helper peptide(5'-Adenosine-PEG-peptide)。Tetanus toxin p30 helper peptide係由FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(序列編號：4)之胺基酸序列構成，鑑定為在幫助者T細胞上表現之T細胞受體之抗原決定部位的胜肽(Eur.J.Immunol.(1989)19,2237-2242)。已知活化抗體產生(J.Immunol.(1992)149,717-721)，藉由與腺苷連結，作用為佐劑，期待能增加對抗腺苷之抗體之產生。設計以使產生之抗體之抗原決定部位與腺苷不易含於Tetanus toxin p30 helper peptide，腺苷與Tetanus toxin p30 helper peptide之連結係介由PEG。腺苷為ATP之代謝物，ATP之磷酸基係加成於腺苷之5'位羥基，因此，據認為腺苷之5'位羥基不是抗原決定部位之抗體，可與腺苷結合也可與ATP結合。即，5'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30 helper peptide藉由作為免疫原，可容易獲得能與腺苷與ATP兩者結合之抗體，推測藉由將2'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30 helper peptide作為免疫原，容易獲得與腺苷結合且與ATP不結合之抗體，故依(5-2)記載製作與腺苷之2'位或5'位連結之包含Tetanus toxin p30 helper peptide之二種免疫原。

此外，依以下方式製作將Tetanus toxin p30 helper peptide替換為使生物素接合物之2'-Adenosine-PEG-biotin(圖12)及5'-Adenosine-PEG-biotin(圖13)。藉由驗證對於此等二種Adenosine-PEG-biotin之結合，可判別不是包括Tetanus toxin p30 helper peptide作為抗原決定部位之抗體。

(5-2)用於腺苷結合庫製作之免疫原之合成

將2'-Adenosine-PEG-peptide(adenosine 2'-PEG-peptide conjugate或2'-(PEG-peptide)adenosine)及2'-Adenosine-PEG-biotin(adenosine 2'-PEG-biotin conjugate或2'-(PEG-biotin)adenosine)以如下方式合成。又，合成之2'-Adenosine-PEG-peptide或2'-Adenosine-PEG-biotin依以下條件分析或分取。

LCMS之分析條件如下。

HPLC之分取條件如下。

(5-2-1)化合物006(Boc-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr(tBu)-Val-Ser(tBu)-Phe-Trp(Boc)-Lue-Arg(Pbf)-Val-Pro-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Ala-Ser(tBu)-His(Trt)-Leu-Glu(tBu)-OH)之合成

使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis)，依Fmoc法實施胜肽合成。所有之Fmoc胺基酸係從渡邊化學工業購買。又，操作之詳細程序依合成機附帶的手冊。

於合成機中放置已鍵結C末端之Fmoc-Glu(tBu)-OH之2-氯三苯甲基樹脂(每根管柱250mg、30根管柱、11.7mmol)、各種Fmoc胺基酸(0.6mol/L)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(0.375mol/L)之N,N-二甲基甲醯胺溶液、二異丙基碳二醯亞胺之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10%v/v)，並且使用含5%(wt/v)之尿素之哌啶之N,N-二甲基甲醯胺溶液(20%v/v)作為Fmoc脫保護溶液實施合成反應。樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗滌後，進行Fmoc脫保護，再進行Fmoc胺基酸之縮合反應，作為1個循環，重複此循環，在樹脂表面上使胜肽伸長。伸長結束後，將樹脂以三氟乙醇洗滌，加入三氟乙醇/二氯甲烷(=1/1)，從樹脂切出胜肽，獲得化合物006(7.2g)粗產物。

LCMS(ESI)m/z=1185(M+3H)3+

保持時間：1.24分(分析條件SQDAA05)

(5-2-2)化合物007之合成

將於冷卻至0℃之腺苷(2.00g、7.48mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(40ml)懸浮液中已加入60%氫化鈉(0.42g、10.48mol)之反應液在0℃攪拌1小時。將已加入溴乙酸甲酯(0.76ml、8.01mmol)之該反應液於室溫攪拌5小時。將已加入乙酸(1ml)及甲醇(3ml)之反應混合物減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(二氯甲烷/甲醇)精製，獲得化合物007(0.93g、37%)。

LCMS(ESI)m/z=340(M+H)+

保持時間：0.27分(分析條件SQDFA05)

(5-2-3)化合物008之合成

將已加入第三丁基二甲基矽基氯(999mg、6.63mol)及咪唑(722mg、10.61mol)之化合物007(900mg、2.65mmol)之吡啶(8ml)溶液於室溫攪拌4小時。將從反應混合物經乙酸乙酯/水萃取而得之有機層以飽和食鹽水洗滌。將以無水硫酸鈉乾燥過的有機層過濾後減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(二氯甲烷/甲醇)精製，獲得化合物008(1.17g、78%)。

LCMS(ESI)m/z=568(M+H)+

保持時間：1.10分(分析條件SQDFA05)

(5-2-4)化合物009之合成

將加入已溶於水(0.17ml)之氫氧化鋰(61mg、2.55mol)之化合物008(290mg、0.511mmol)之甲醇(0.34ml)/四氫呋喃(0.34ml)溶液於室溫攪拌30分鐘。將以1M鹽酸中和之反應混合物減壓濃縮。將從濃縮殘渣以乙酸乙酯/水萃取而得之有機層以飽和食鹽水洗滌。以無水硫酸鈉乾燥過的有機層經過濾後減壓濃縮，獲得化合物009(319mg、90%)。

LCMS(ESI)m/z=552(M-H)-

保持時間：0.97分(分析條件SQDFA05)

(5-2-5)化合物010及化合物011之合成

將已加入1-羥基苯并三唑(75mg、0.553mol)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(106mg、0.553mol)之化合物009(255mg、0.460mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1.5ml)溶液於室溫攪拌3分鐘。將已加入O-(2-胺基乙基)-O'-2-疊氮乙基)九乙二醇(291mg、0.553mmol)的反應液於室溫攪拌3小時。將已減壓濃縮之反應混合物之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得化合物010(177mg、42%)及011(72mg、19%)。

化合物010

LCMS(ESI)m/z=1063(M+H)+

保持時間：0.98分(分析條件SQDFA05)

化合物011

LCMS(ESI)m/z=949(M+H)+

保持時間：0.67分(分析條件SQDFA05)

(5-2-6)化合物012之合成

將已加入10%鈀碳(34mg)之化合物010(170mg、0.160mmol)之乙醇(1ml)溶液於氫氣環境攪拌2小時。再加入10%鈀碳(34mg)，於氫氣環境攪拌2小時，使反應完結。將反應液之濾液減壓濃縮，獲得化合物012(34mg、95%)。

LCMS(ESI)m/z=1037(M+H)+

保持時間：0.70分(分析條件SQDFA05)

(5-2-7)化合物013及化合物014之合成

將已加入化合物006(354mg、0.110mmol)、1-羥基苯并三唑(13mg、0.100mol)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(19mg、0.100mol)之化合物012(86mg、0.083mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1.5ml)溶液於室溫攪拌2小時。將反應混合物之濾液以表6記載之分取條件A精製，獲得化合物013及014之混合物(72mg)。

化合物013

LCMS(ESI)m/z=1525(M+3H)3+、1144(M+4H)4+

保持時間：1.13分(分析條件SQDAA50)

化合物014

LCMS(ESI)m/z=1444(M+3H)3+、1083(M+4H)4+

保持時間：1.02分(分析條件SQDAA50)

(5-2-8)2'-Adenosine-PEG-peptide(adenosine 2'-PEG-peptide conjugate或2'-(PEG-peptide)adenosine)(化合物015)之合成

將已加入三氟乙酸(16ml)、二氯甲烷(8ml)、水(1.3ml)、及四異丙基矽烷(1.3ml)之化合物013及014之混合物(42mg)於室溫攪拌6小時。將已減壓濃縮之反應混合物之殘渣以表6記載之分取條件B精製，獲得化合物015(10mg)。

LCMS(ESI)m/z=1090(M+3H)3+、818(M+4H)4+

保持時間：0.52分(分析條件SQDAA50)

(5-2-9)化合物016之合成

將已加入10%鈀碳(34mg)之化合物011(70mg、0.074mmol)之乙醇(1ml)溶液於氫氣環境攪拌5小時。將反應液之濾液減壓濃縮，獲得化合物016(58mg、85%)。

LCMS(ESI)m/z=923(M+H)+

保持時間：0.50分(分析條件SQDFA05)

(5-2-10)化合物017之合成

將已加入D-生物素N-琥珀醯亞胺基(24mg、0.069mmol)、及三乙胺(13μl、0.094mol)之化合物016(58mg、0.063mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1ml)溶液於室溫攪拌2小時。再加入D-生物素N-琥珀醯亞胺基(5mg、0.015mmol)後，於室溫攪拌1.5小時，使反應完結。將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得化合物017(50mg、69%)。

LCMS(ESI)m/z=1149(M+H)+

保持時間：1.04分(分析條件SQDFA05)

(5-2-11)2'-Adenosine-PEG-biotin(adenosine 2'-PEG-biotin conjugate或2'-(PEG-biotin)adenosine)(化合物018)之合成

將已加入1M氟化四正丁基銨四氫呋喃溶液(65μl、0.065mmol)之化合物017(62mg、0.054mmol)之四氫呋喃(2ml)溶液於室溫攪拌1小時。再加入1M氟化四正丁基銨四氫呋喃溶液(20μl、0.020mmol)，於室溫攪拌1小時使反應完結。將已減壓濃縮之反應液之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈)精製，獲得化合物018(12mg、21%)。

LCMS(ESI)m/z=1035(M+H)+

保持時間：0.71分(分析條件SQDAA05)

又，5'-Adenosine-PEG-peptide及5'-Adenosine-PEG-biotin也使用同樣反應合成。

(5-3)利用動物製作腺苷結合抗體及抗體之篩選

將兔以通常之方法利用2'-Adenosine-PEG-peptide及/或5'-Adenosine-PEG-peptide免疫。使用autoMACS Pro Separator與FACSAria(BD)之Adenosine-PEG-biotin結合性及兔IgG之表現為指標，從經免疫之兔血液採集之細胞懸浮液挑選出有腺苷結合活性之細胞之候選者。其次，篩選在挑選之細胞之培養上清中分泌之抗體。篩選，係利用ELISA法評價是否對於 Adenosine-PEG-biotin有結合活性。又，將Adenosine與Adenosine-PEG-biotin一起加入1000倍以上，是否會抑制對於Adenosine-PEG-biotin之結合，也是以ELISA法評價。從具有對Adenosine-PEG-biotin之結合活性且將以Adenosine-PEG-biotin與Adenosine一起加入時會抑制對Adenosine-PEG-biotin之結合作為指標而挑選的細胞，使用PCR法取得H鏈可變區及L鏈可變區。將取得之可變區與人類IgG1重鏈不變區、及人類輕鏈不變區組合表現。

(5-4)取得用以製作腺苷結合免疫庫之B細胞

從以2'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin peptide及5'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin peptide免疫之兔之脾臟採取之細胞懸浮液，使用autoMACS Pro Separator與FACSAria(BD)，將Adenosine-PEG-biotin結合性與兔IgG或IgM之表現作為指標，挑選有Adenosine結合活性之細胞之候選者。將從經PBS(-)洗滌之前述挑選細胞製備的細胞圓粒，供免疫庫之製作。

[實施例6]從兔B細胞選殖獲得之選殖體之評價

(6-1)從兔B細胞選殖獲得之選殖體對於2'-Adenosine-PEG-Biotin之結合活性之評價

使用SPR法評價利用兔B細胞選殖法獲得之選殖體對於腺苷之結合活性。使用Biacore 4000(GE Healthcare)，以反應動力學解析上述選殖體與2'-Adenosine-PEG-Biotin之抗原抗體反應。使目的之抗體捕捉到經胺偶聯法固定有適量protein A/G(Invitrogen)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)。其次，將作為分析物之100nmol/L之2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用60秒後，追蹤測定分析物之解離60秒。運行緩衝液使用HBS-P+(GE Healthcare)。測定均於25℃實施，分析物之稀釋使用運行緩衝液。

將使2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用時之結合量除以各抗體之捕捉量(RU)得到之值(N_binding_100)、及2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用後從各抗體解離2'-Adenosine-PEG-Biotin60秒後之值除以各抗體之捕捉量(RU)得到之值(N_stability_100)作為指標，比較各抗體對2'-Adenosine-PEG-Biotin之結合活性。惟，捕捉量為1500RU以下之抗體未能充分觀察到結合，故排除在探討的對象以外。其結果如圖14。從圖14之結果可知：利用B細胞選殖法可取對對於腺苷以各種親和性結合之選殖體。

(6-2)2'-Adenosine-PEG-Biotin結合選殖體對於腺苷及ATP之結合活性之評價及其序列解析

已認定對2'-Adenosine-PEG-Biotin結合之選殖體對於腺苷或ATP之結合，以SPR法及競爭ELISA法進行評價。

(6-2-1)2'-Adenosine-PEG-Biotin結合選殖體利用SPR法所為之對於腺苷或ATP之結合之評價

使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析B cell cloning法獲得之抗體SMB0002、SMB0089、SMB0104與腺苷、ATP之抗原抗體反應之交互作用。使目的之抗體捕捉到在Sensor chip CM5(GE Healthcare)上經以胺偶聯法適量固定之protein A/G(Invitrogen)，使抗原腺苷、或ATP交互作用。運行緩衝液使用10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4。測定均於25℃實施，抗原之稀釋使用運行緩衝液。

針對SMB0002、SMB0089、SMB0104，將抗原稀釋液與空白運行緩衝液以流速20μL/min注射2分鐘，使各抗原於捕捉在感測晶片上抗體交互作用。之後以流速20μL/min流通運行緩衝液3分鐘，觀察抗原從抗體之解離。之後，以流速30μL/min注射30秒10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，將感測晶片再生。從測定獲得之感測圖，計算動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。依該等常數計算解離常數KD(M)。各參數之計算係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。

其結果發現：SMB0002、SMB0089、SMB0104等多數選殖體對於腺苷與ATP兩者顯示結合。評價各選殖體與腺苷以500、125、31.3、7.81nM及ATP 5000、1250、313、78.1nM之濃度之結合時觀察到的感測圖整理於圖15。如圖15，認為SMB0002、SMB0089、SMB0104對於腺苷與ATP兩者有結合。SMB0002、SMB0089、SMB0104對於腺苷之KD各為9.3E^-9、6.9E^-9、4.1E^-8(mol/L)及1.0E^-5(mol/L)，SMB0002、SMB0089、SMB0104對於ATP之KD各為1.0E^-5、8.8E^-7、1.4E^-7(mol/L)。

同樣地，使用Biacore 4000(GE Healthcare)，解析依B cell cloning法得到之抗體SMB0171與腺苷、ATP之抗原抗體反應之交互作用。使目的抗體捕捉到在Sensor chip CM5(GE Healthcare)上經胺偶聯法適量固定之protein A/G(Invitrogen)，使抗原腺苷、或ATP交互作用。運行緩衝液使用HBS-P+(GE Healthcare)。測定均於25℃實施，抗原之稀釋使用運行緩衝液。

針對SMB0171，以流速10μL/min注射1分鐘抗原稀釋液與空白運行緩衝液，使各抗原與捕捉於感測晶片上之抗體交互作用。之後，以流速10μL/min流通3分鐘運行緩衝液，觀察抗原從抗體之解離。之後，以流速30μL/min注射30秒10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，將感測晶片再生。從測定獲得之感測圖，計算動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。依該等常數計算解離常數KD(M)。各參數之計算，使用Biacore 4000 Evaluation Software(GE Healthcare)。

其結果，於SMB0171發現對ATP有結合。評價各選殖體與ATP以50、5μM之濃度結合時觀察到的感測圖，如圖16。如圖16，認為SMB0171對ATP有結合。SMB0171對ATP之KD為5.9E^-6(mol/L)。

(6-2-2)2'-Adenosine-PEG-Biotin結合選殖體利用競爭ELISA法進行之對腺苷及ATP之結合評價

將已認為對2'-Adenosine-PEG-Biotin結合之抗體以PBS稀釋成1μg/mL，加到384well之MAXISorp(Nunc)之各井，於室溫放置1小時以上，使與板結合。去除板之各井中經PBS稀釋之抗體後，將已加入含1% BSA之TBS之該板放置1小時以上。之後去除含1% BSA之TBS pH7.4，將已加入經PBS稀釋之50nM之2'-Adenosine-PEG-Biotin、經PBS稀釋之50nM 之2'-Adenosine-PEG-Biotin與500μM之Adenosine之混合物、經PBS稀釋之50nM之2'-Adenosine-PEG-Biotin與500μM之ATP之混合物、或僅加入PBS中之任一者之該板，放置於室溫1小時。之後，將該板之各井以含0.05% Tween-20之PBS 80μL洗滌3次。之後，將經PBS稀釋為20000倍之Streptavidine-HRP(Thermo fisher scientific)已加到各井之板，於室溫放置1小時以上。對於經含0.05% Tween-20之PBS 80μL洗滌3次之該板之各井，加入發色基質(ABTS peroxidase substrate)。將該板溫育1小時後，將各井中之溶液之發色以Molecular Device公司製SpectraMax測定405nm之吸光度。

其結果，如圖17，由於過量添加腺苷與ATP，使SMB0002對2'-Adenosine-PEG-Biotin之結合受抑制，故確認該等選殖體係不僅是2'-Adenosine-PEG-Biotin，也結合與腺苷與ATP兩者之抗體。

(6-2-3)利用SPR法進行腺苷及ATP結合選殖體之序列解析

已認定對於腺苷與ATP兩者有結合之選殖體之胺基酸序列如表7。

[實施例7]從使用噬菌體展示技術之人類抗體庫取得與腺苷及/或ATP結合之抗體

(7-1)未改變人類抗體噬菌體展示庫之製作

將從人類PBMC製成之polyA RNA或市售之人類polyA RNA等作為模板，依該技術領域中具有通常知識者公知的方法，建構提示彼此互異之人類抗體序列之Fab分域的由多數噬菌體構成之人類抗體噬菌體展示庫。

(7-2)利用珠粒淘選從庫取得對腺苷及/或ATP結合之抗體

從(7-1)建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，篩選對抗原顯示結合活性之抗體之篩選。亦即，收集提示對於捕捉於珠粒之抗原顯示結合活性之抗體的噬菌體。抗原，使用生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin。

將從保持建構之噬菌體展示用噬粒的大腸菌產生的噬菌體，依一般方法精製。之後，獲得經TBS透析處理之噬菌體庫液。其次，於噬菌體庫液添加BSA，使得終濃度成為4%。實施使用固定於磁珠之抗原的淘選。磁珠，使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。

之後，藉由添加製備之噬菌體庫液與250pmol之生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin，使該噬菌體庫液與腺苷及ATP於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液中加入經BSA阻斷的磁珠，將腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。將珠粒以TBS洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時從以磁座分離之珠粒回收噬菌體溶液。回收之噬菌體溶液添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。藉由於37℃進行上述大腸菌之緩慢攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。被感染之大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後，從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備噬菌體庫液。

於第2次淘選，也進行可對腺苷及/或ATP結合之噬菌體之濃縮。對於獲得之噬菌體庫液各加入50pmol之生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin，將該噬菌體庫液與腺苷及ATP於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，將腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。以TBST洗滌珠粒3次、以TBS洗滌珠粒2次。之後，將已加入1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時從以磁座分離之珠粒回收噬菌體溶液。回收之噬菌體溶液添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。藉由於37℃進行上述大腸菌之緩慢攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。被感染之大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後，從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備噬菌體庫液。

以同樣程序重複3次取得對腺苷及/或ATP可結合之抗體的淘選。第4次淘選，以TBST、TBS均洗滌5次。

(7-3)利用噬菌體ELISA進行腺苷及ATP結合性之評價

從依上述實施例所示之淘選(Panning)法獲得之大腸菌之單一菌落依定法(Method Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。針對此，將使用NucleoFast 96(MACHERY-NAGEL)回收之培養上清進行超過濾。將培養上清各100μL施用於NucleoFast 96之各井，以4,500g進行45分鐘離心分離，去除流過物。加入H₂O 100μL，再度以4,500g進行30分鐘離心分離以洗滌。之後加入TBS 100μL，於室溫靜置5分鐘後，回收上清含有之噬菌體液。

將已加入TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原(2'-Adenosine-PEG-biotin、5'-Adenosine-PEG-biotin、及ATP-PEG-biotin各等量混合)之100μL之TBS於室溫塗覆1小時。將該板之各井以TBST(含0.1%Tween20之TBS)洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，之後將各井中已加入已製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時，使提示噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。對於以TBST洗滌之各井，添加經TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將此板溫育1小時。以TBST洗滌後，已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應以硫酸之添加停止後，測定於450nm之吸光度以測定其發色。

從已實施噬菌體ELISA之192個選殖體中，獲得對2'-Adenosine-PEG-biotin、5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin中之任一者、任二者、或三者均有結合能力之106個選殖體。

然後，為了確認該等選殖體對2'-Adenosine-PEG-biotin、5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin中之哪個抗原具有結合能力，將該精製噬菌體以TBS稀釋後，依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原(2'-Adenosine-PEG-biotin,5'-Adenosine-PEG-biotin,ATP-PEG-biotin)中任一者的100μLTBS於室溫塗覆1小時。將該板之各井以TBST洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，之後將已對各井加入製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時，以使提示噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。對於以TBST洗滌之各井，添加經TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將此板溫育1小時。以TBST洗滌後，已添加MB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應利用硫酸之添加使停止後利用450nm之吸光度測定該發色。噬菌體ELISA之結果記載於以下表8。

【表8】

已實施噬菌體ELISA之選殖體之中，確認結合2種以上抗原的有1個選殖體，以該抗體片段作為模板，進行依專一性的引子放大之基因之鹼基序列解析。本選殖體為對5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin二者具結合能力之選殖體，命名為ATNLSA1-4_D12。ATNLSA1-4_D12抗體之重鏈可變區之序列記載於序列編號：46，輕鏈可變區之序列記載於序列編號：47記載。

(7-4)利用噬菌體競爭ELISA進行腺苷或ATP結合性之評價

噬菌體ELISA之結果，判斷對5'-Adenosine-PEG-biotin及ATP-biotin兩者有結合能力之選殖體、ATNLSA1-4_D12(重鏈可變區序列：46、輕鏈序列：47)，可能認識5'-Adenosine-PEG-biotin,ATP-PEG-biotin之結構上、生物素標籤或PEG區域。而，為了顯示非生物素標籤或PEG認識抗體，使用ATNLSA1-4_D12及準備作為負對照之IL-6R結合選殖體PF1(重鏈序列：48、輕鏈序列：49)，利用噬菌體ELISA確認是否腺苷或ATP與抗原之結合受抑制。ATNLSA1-4_D12及PF1分別以TBS，並依以下程序供ELISA。

將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原(5'-Adenosine-PEG-biotin,ATP-PEG-biotin之混合)之100μL之TBS於室溫塗覆1小時。將該板之各井以TBST洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，之後將於各井已添加製備之精製噬菌體之該板於室溫靜置1小時，使噬菌體提示之抗體與各井存在之抗原結合。其次將無抗原、以及含抗原及等量至10,000倍量之ATP之稀釋系列的TBS加到該井。於室溫將該板靜置1小時，使固定化之抗原與ATP競爭。之後，對於經TBST洗滌之各井，將已添加已經TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)的板溫育1小時。以TBST洗滌後，使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加停止後，利用450nm之吸光度測定該發色。

測定結果如圖18。ATNLSA1-4_D12隨ATP濃度提高，確認於過量ATP存在下發色值減小，確認ATP濃度依存性的ATNLSA1-4_D12與抗原之結合受抑制。又，作為陰性對照進行比較實驗之PF1，無論ATP濃度，未確認與抗原之結合。由此，可確認ATNLSA1-4_D12係有ATP結合能力之抗體，並非認識生物素標籤或PEG之抗體。

(7-5)與ATP及腺苷結合之抗體之表現與精製

解析從實施例7之噬菌體ELISA所示之判斷具有與ATP及腺苷結合之活性之選殖體ATNLSA1-4_D12，使用專一性引子放大之基因之鹼基序列(重鏈之序列以序列編號：46表示，輕鏈之序列以序列編號：47表示)。將編碼為ATNLSA1-4_D12 之可變區之基因，插入到人類IgG1/Lambda之動物表現用質體。使用以下方法表現抗體。對於在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 10⁶細胞/mL之細胞密度懸浮，並對於6well plate之各井各接種3mL之人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，利用脂轉染法導入製備之質體。從在CO₂培養箱(37℃、8%CO₂,90rpm)培養4日之培養上清，使用rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)，利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法將抗體精製。使用分光光度計，測定精製抗體溶液於280nm之吸光度。使用從獲得之測定值以PACE法計算之吸光係數，計算精製抗體之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(7-6)使用表面電漿共振評價ATP、腺苷結合抗體之ATP、腺苷結合

使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析對ATP及腺苷有結合活性之選殖體ATNLSA1-4_D12之可變區連結於IgG之不變區而得之D12之抗原抗體反應之交互作用。使目的抗體捕捉於經胺偶聯法適量固定protein A(Life technologies)之Sensor chip CM5或CM4(GE Healthcare)，使抗原ATP(Wako)、腺苷(Wako)、ADP(adenosine diphosphate)(Wako)交互作用。運行緩衝液使用50mM Tris-HCl(Takara,T903),500mM NaCl,0.01%(w/v)Tween20。使抗原以流速30μL/min交互作用30秒，並使其進行30秒解離。與抗原之交互作用，於15℃測定，抗原之稀釋使用與運行緩衝液為相同之緩衝液。

依從測定獲得之感測圖算出之動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)，計算解離常數K_D(M)。或，使用穩定狀態解析法(Steady state analysis)計算解離常數K_D(M)。各參數之計算，係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。

為了計算對腺苷之K_D，取得於20μmol/L ADP存在下及不存在下之各濃度之腺苷存在下之結合回應，又另取得於20μmol/L ADP存在下之結合回應。藉由將推定為非專一性結合成分之ADP存在下對於各濃度腺苷之結合回應減去在ADP單獨存在下之回應而得之值，從ADP不存在下對於腺苷之結合回應之值減去，取得對腺苷之專一性結合回應(R)。對於以腺苷濃度為X軸、從式2算出之R為Y軸作圖之曲線，套用Office Excel2007(Microsoft)之求解機能適用最小平方法，決定對於腺苷之K_D值。

(式2)R=Rmax×conc/(K_D+conc)

式2中，conc代表腺苷濃度(mol/L)，Rmax對於抗體，腺苷最多結合時期待之回應值。為了抽取實測之回應值，採用Scrubber2(BioLogics.Inc)。

在此測定取得之D12對於ATP之KD，為8.5μmol/L、對於ADP之KD為0.25μmol/L、對於腺苷之KD為1100μmol/。由此可認為：D12對ATP、ADP、腺苷有結合活性，且對AMP(adenosine monophosphate)及cAMP(cyclinc adenosine monophosphate)也有結合活性。

[實施例8]利用抗ATP/腺苷抗體之ATP/腺苷開關抗體取得用之庫之設計

癌組織及發炎性組織中，已知不僅腺苷，ATP之濃度也高。所以，不僅是只將腺苷或ATP中之任一者當作開關之抗體，能將腺苷及ATP兩者(本實施例中，記載為ATP/腺苷)利用為開關之抗體(亦即腺苷或ATP哪一個以高濃度存在，則會與抗原結合的抗體)也有用。實施例7-4所示之ATNLSA1-4_D12，為與ATP/腺苷結合之抗體，該抗體，如圖19所示，可認為包含ATP/腺苷夾於抗體與標的抗原之間，且包含與標的抗原接觸之抗體可變區。而，藉由將能與標的抗原接觸，能保持對ATP/腺苷之結合之抗體可變區部分予以庫化，據認為可製作能取得對於任意之抗原因為ATP/腺苷之有無而使對於任意抗原之結合活性改變之ATP/腺苷開關抗體的合成抗體庫。

於實施例7-4由人類抗體庫取得之ATP/腺苷抗體ATNLSA1-4_D12與ATP之複合體之結晶結構已經過解析。從結晶結構解析之結果，鑑別該抗體認識之腺苷(及ATP)之認識樣式、及設定未與腺苷(及ATP)之結合有大相關之抗體可變區之胺基酸殘基。經鑑別，主要涉及對腺苷(ATP)之結合之胺基酸殘基，係在重鏈之Ser52、Ser52a、Arg53、Gly96、Leu100a、Trp100c(Kabat編號)。

在庫設計時，係選擇滿足以下條件至少其中之一之部位作為庫化可能部位。

條件1)與對ATP之結合無大相關之部位、或即使涉及結合但不會使對ATP之結合下降之天然序列以外之胺基酸存在之部位、條件2)在人類抗體之曲目有某程度胺基酸出現頻度多樣性之部位、條件3)對典型結構(Canonical structure)之形成不重要之部位。

製作重鏈、輕鏈均滿足上述條件之部位且ATNLSA1-4_D12之序列含有之部位之中關於CDR1及CDR2之部位在生殖細胞系列之出現頻度為2%以上之胺基酸、關於CDR3之部位在生殖細胞系列之出現頻度為1%以上之胺基酸進行全面性取代，以製作組合該等取代之多個ATNLSA1-4_D12之改變體。

重鏈之部位之中，經改變之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位之中，改變前之胺基酸(表中，記為「天然序列」之胺基酸)及改變後之胺基酸(表中記為「改變胺基酸」之胺基酸)，如表9。

【表9】

輕鏈之部位之中，經改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中改變前之胺基酸(表中，記為「天然序列」之胺基酸)及改變後之胺基酸(表中記為「改變胺基酸」之胺基酸)，如表10。

【表10】

以實施例7-1所示方法表現及精製之各改變體對ATP及腺苷之結合，依與實施例7-6所示之使用Biacore之測定方法為相同方法實施測定。測定結果，計算各改變體對ATP之親和性作為KD值。作為重鏈之部位，由於改變使ATP結合能力未下降ATNLSA1-4_D12之1/5之結合能力者(亦即KD值小於42.5μmol/L者)、及作為輕鏈之部位，ATNLSA1-4_D12之結合能力提高者(亦即KD值小於8.5μmol/L者)，判定為可改變部位，於該部位經取代之胺基酸，判定為可庫化之胺基酸(庫出現之柔性殘基)。

從各改變體對ATP結合能力之評價結果，可預測藉由將各部位予以庫化，對ATP之結合能力下降。而，藉由將推測涉及與ATP之結合之部位之周邊部位取代，並組合該等取代而得之各種改變體予以全面性評價，來驗證是否可鑑別期待使對ATP之結合能力增強之效果的改變。如此之經改變之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位改變前之胺基酸(表中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後之胺基酸(表中，記為「改變胺基酸」之胺基酸)，如表11。

將以實施例7-1所示方法表現及精製而得之各改變體對ATP及腺苷之結合，使用與實施例7-6所示之使用Biacore之測定方法為相同方法測定。測定結果，期待對ATP及腺苷之結合增強之改變為Kabat編號表示之56位、100位等部位(例如Tyr56His、Asn100bLeu等胺基酸之改變)，於該部位取代之胺基酸判定為可庫化之胺基酸(庫出現之柔性殘基)。

藉由設計ATNLSA1-4_D12之CDR之部位中，含有從前述改變體之解析選出之可庫化胺基酸(庫出現之胺基酸柔性殘基)及該胺基酸改變前之胺基酸(亦即，ATNLSA1-4_D12之天然序列含有之胺基酸)之胺基酸曲目及含該曲目之部位，建構ATP/腺苷開關抗體取得用之庫。以使胺基酸曲目含有之各胺基酸之出現頻度為相等的方式(例如：胺基酸曲目為10種之情形，使各胺基酸各出現10%)，建構庫。

重鏈中，含有胺基酸曲目之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位之胺基酸曲目，如表12。輕鏈中，含胺基酸曲目之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位之胺基酸曲目，如表13。

【表13】

從序列解析之結果，推測ATNLSA1-4_D12之框架係從VH3-21生殖細胞系列而來。而，為了提高抗體之安定性，為了使ATNLSA1-4_D12之框架序列回到VH3-21生殖細胞序列，對ATNLSA1-4_D12之框架序列導入Gln01Glu、Gln05Val、Asp10Gly、Asn30Ser、Leu48Val、Asn58Tyr(數字代表Kabat編號)之改變。以DSC測定實施例7-1所示之方法表現及精製之ATNLSA1-4_D12之改變體之Tm。利用DSC之測定，係依該技術領域中具有通常知識者公眾所知之方法實施。施以該等改變之ATNLSA1-4_D12之改變體之Tm，從74.37℃大幅上升為81.44℃，可承認其結構安定化。有時抗體庫也宜使用高安定性之框架，所以施以前述改變之框架序列，作為庫框架序列使用。庫使用之框架，如表14。

【表14】

合成以如此設計之庫含有之包含各個序列之基因(DNA2.0)，將該等各個基因之集合體(庫)作為模板，利用可分別放大VH及VL之引子將基因庫放大。又，VL放大用引子之序列，記載於序列編號：102及103，VH放大用引子之序列記載於序列編號：104及105。將經放大之合理設計之人類抗體重鏈可變區之基因庫與人類抗體輕鏈可變區之基因庫對於具有人類IgG來源CH1序列及人類IgG來源輕鏈不變區序列兩者之適當噬粒載體導入。將此噬粒載體利用電穿孔法對大腸菌導入，以建構能取得提示由人類抗體可變區-不變區構成Fab分域且能將腺苷或ATP作為開關而與抗原結合之抗體的合理設計庫。如此，從具有多樣腺苷或ATP結合活性之H鏈及L鏈構成之合理設計庫，如圖19所示，據認為以良好效率取得作為含有腺苷或ATP夾於抗體與抗原之間且對抗任意抗原之ATP/腺苷開關抗體的人類抗體的庫為有用。又，如上述，ATNLSA1-4_D12不僅對腺苷與ATP結合，也會對ADP結合，故可預料對ATP、ADP及腺苷的結構類似之AMP及cAMP也有結合活性。所以，該庫舉認為對於取得因為對於ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷中之任一以上之低分子之有無而使對任意標的抗原之結合活性改變之開關抗體為有用。

[實施例9]含抗ATP/腺苷抗體曲目之腺苷/ATP/腺苷開關抗體取得用之免疫庫之建構

將從在實施例5-4中使用MACS及FACS挑選到表現腺苷-PEG-生物素結合抗體之B細胞群回收之mRNA作為模板，建構提示由兔抗體序列構成之Fab分域之多數兔抗體噬菌體展示庫。作為建構方法，參照Rader(Methods Mol.Biol.(2009)525,101-28)。

更具體而言，利用將從9隻經免疫之兔挑選之600,000個細胞之上述B細胞回收之mRNA作為模板之反轉錄反應，製備cDNA。將此cDNA作為模板，利用使用表15記載之引子之PCR反應，於適當條件下以PCR放大重鏈可變區、及輕鏈可變區-不變區序列。

【表15】

將經放大之兔抗體重鏈可變區之基因庫與兔抗體輕鏈可變區-不變區之基因庫之組合，導入具有兔IgG來源CH1序列之適當噬粒載體。藉由將此噬粒載體以電穿孔法導入大腸菌，建構能取得提示由兔抗體可變區-不變區構成之Fab分域且以腺苷或ATP作為開關而與抗原結合之抗體的兔抗體噬菌體展示庫(以下稱為腺苷免疫兔抗體庫)。如此，由發揮多樣腺苷結合性之H鏈及L鏈構成之腺苷免疫庫，據認為作為如圖20所示，腺苷(或ATP)夾持於抗體與抗原之間，且能取得對任意抗原之腺苷/ATP開關抗體的免疫庫為有用。

[實施例10]從使用噬菌體展示技術抗體庫取得於腺苷、ATP存在下與抗原結合之抗體

(10-1)利用腺苷及ATP之混合物從庫取得在低分子存在下與抗原結合之抗體

從建構之腺苷免疫兔抗體噬菌體展示庫、合理設計抗體噬菌體展示庫，取得於腺苷、及/或ATP存在條件下對抗原顯示結合活性之抗體。為了取得，回收提示於腺苷、及ATP存在下對於捕捉在珠粒之抗原顯示結合能力之抗體的噬菌體，之後從於腺苷、及ATP不存在條件下從珠粒溶出之溶出液中回收噬菌體。

使保持建構之噬菌體展示用噬粒之大腸菌生產噬菌體。對於產生噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體庫液。然後，於該噬菌體庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠，使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。

於製備之噬菌體庫液，加入500pmol之生物素標記抗原、以及各終濃度1mM之ATP-Na及腺苷，以使該噬菌體庫液於室溫與抗原及腺苷、及ATP接觸60分鐘。於該噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠粒已溶有ATP及腺苷之TBS洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm之板。然後，從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

第1次淘選係回收於腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體，但第2次以後之淘選，係濃縮僅在腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體。具體而言，藉由在製備之噬菌體庫液加入40pmol生物素標記抗原以及各終濃度1mM之腺苷及ATP，以使噬菌體庫於室溫與抗原以及腺苷及ATP接觸60分鐘。加入經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將珠粒以溶有1mL腺苷及ATP之TBST(以下稱為(腺苷+ATP)/TBST)及溶有腺苷、腺苷及ATP之TBS(以下稱為(腺苷+ATP)/TBS)洗滌。之後，將已加入0.5mLTBS之珠粒於室溫懸浮後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。在重複此作業後，將分2次溶出之噬菌體液混合。於回收之噬菌體溶液加入100mg/mL之胰蛋白酶5μL，使未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者噬菌體來源之pIII蛋白質)被切斷，未提示Fab之噬菌體對大腸菌失去感染能力。從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，對成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738添加。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。然後從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以回收噬菌體庫液。取得於腺苷及ATP存在下對抗原有結合活性之抗體之淘選，重複3次。

(10-2)利用負選擇法從抗體庫取得於腺苷、ATP存在下與抗原結合之抗體

從已以腺苷免疫之兔建構之抗體噬菌體展示庫、或合理設計抗體噬菌體展示庫，篩選對於抗原於腺苷及/或ATP存在之條件下顯示對抗原之結合活性之抗體。為了篩選，首先使抗體噬菌體展示庫於腺苷及ATP不存在下與生物素標記抗原-鏈黴親和素接觸，去除提示即使腺苷及ATP不存在下也對抗原有結合活性之抗體之噬菌體。然後，於腺苷及ATP存在之條件下同樣淘選，實施於腺苷及ATP存在之條件下對抗原有結合活性之抗體之篩選。

使保持建構之噬菌體展示用噬粒之大腸菌生產噬菌體。對於產生噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體庫液。然後，於該噬菌體庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠，使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)，並使用固定於磁珠之抗原實施淘選。

於製備之噬菌體庫液，加入250pmol之生物素標記抗原、以及各終濃度1mM之腺苷及ATP之混合液，以使該噬菌體庫液於室溫與抗原及腺苷、及ATP接觸60分鐘。然後於該噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠粒以(腺苷+ATP)/TBS洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm之板。然後，從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

第1次淘選係回收於腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體，但第2次以後之淘選，係濃縮僅在腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體。具體而言，藉由在經BSA阻斷之Sera-Mag NeutrAvidin珠粒加入250pmol生物素化抗原，於室溫使結合15分鐘。對於以TBS洗滌過3次珠粒，加入經BSA阻斷之噬菌體庫液，於室溫進行1小時結合。使用磁座分離珠粒，從珠粒回收未與抗原及珠粒結合之噬菌體。對於回收之噬菌體，加入40pmol生物素標記抗原以及各終濃度1mM之腺苷及ATP，以使噬菌體庫於室溫與抗原以及腺苷及ATP接觸60分鐘。然後在該標記抗原以及腺苷及ATP與噬菌體庫之混合液中加入經BSA阻斷之磁珠，於室溫使抗原與噬菌體之複合體與磁珠結合15分鐘。珠粒以1mL腺苷+ATP)/TBST與(腺苷+ATP)/TBS洗滌。之後將1mg/mL之Trypsin溶液0.5mL加到該混合液。該混合液於室溫進行20分鐘攪拌後，使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體。回收之噬菌體加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。取得於腺苷及ATP存在之條件下對抗原有結合活性之抗體的淘選係重複3次。

(10-3)利用交互淘選法，從抗體庫取得於腺苷、ATP存在下與抗原結合之抗體

從已以腺苷免疫之兔建構之抗體噬菌體展示庫、或合理設計抗體噬菌體展示庫，篩選對抗原於腺苷及/或ATP存在之條件下顯示對抗原之結合活性之抗體。為了篩選，首先使抗體噬菌體展示庫於非標記抗原存在之條件下與生物素化腺苷及ATP-NeutrAvidin接觸，回收於抗原存在下與腺苷及/或ATP結合之抗體噬菌體展示庫。然後，然後使該抗體噬菌體展示庫於腺苷及ATP存在之條件下，與生物素化抗原-鏈黴親和素接觸，回收於腺苷及ATP存在下與抗原結合之抗體。藉由交互進行如此的淘選，實施於腺苷及ATP存在之條件下對抗原有結合活性之抗體之篩選。

使保持建構之噬菌體展示用噬粒之大腸菌生產噬菌體。對產生噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體庫液。然後，於該噬菌體庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠，使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)，並使用固定於磁珠之抗原實施淘選。

於製備之噬菌體庫液，加入250pmol之生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin、及1000pmol之非標記抗原，以使該噬菌體庫液於室溫與抗原及腺苷、及ATP接觸60分鐘。然後於該噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原以及腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠粒以含1000pmol之抗原之TBS洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm之板。然後，從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

於第2次淘選，進行於腺苷及ATP存在之條件下可對生物素化抗原結合之噬菌體之濃縮。具體而言，對製備之噬菌體庫液加入40pmol生物素化抗原以及終濃度1mM之腺苷及ATP，以使該噬菌體庫液與抗原以及腺苷及ATP於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，將抗原以及腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。以含終濃度1mM之腺苷及ATP之TBST洗滌珠粒3次、以含終濃度1mM之腺苷及ATP之TBS洗滌珠粒2次。之後，將已加入1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時從以磁座分離之珠粒回收噬菌體溶液。回收之噬菌體溶液添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7) 之10mL之大腸菌株ER2738。藉由於37℃進行上述大腸菌之緩慢攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。被感染之大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後，從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備噬菌體庫液。

之後，於第偶數次淘選中，重複實施與第2次淘選為相同條件之淘選。惟，第4次以後的淘選，將利用(腺苷+ATP)/TBST及(腺苷‧ATP)/TBS進行之珠粒之洗滌總共增為5次而實施。

第3次淘選，再度進行於抗原存在下可對生物素化腺苷及ATP結合之噬菌體之濃縮。具體而言，於製備之噬菌體庫液加入250pmol生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin，及1000pmol非標記抗原，以使該噬菌體庫液與抗原以及腺苷及ATP於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液中加入經BSA阻斷之磁珠，使抗原以及腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體，與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠粒以含1000pmol之抗原之TBST洗3次，及以含1000pmol之抗原之TBS洗2次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶溶液0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒並從珠粒回收噬菌體溶液。回收之噬菌體溶液添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。藉由於37℃進行上述大腸菌之緩慢攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。被感染之大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後，從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備噬菌體庫液。

之後，在第奇數次淘選中，以與第3次淘選為相同條件反複實施淘選。惟，含抗原之TBST及含抗原之TBS進行之珠粒洗滌，於第4次後之淘選總共增為5次。或第3次後之淘選，無論第偶數次、第奇數次，以後以與第3次淘選為相同條件反複實施淘選。惟，含抗原之TBST及含抗原之TBS進行之珠粒洗滌，於第4次後之淘選總共增為5次。

(10-4)利用噬菌體ELISA評價腺苷及/或ATP存在下及不存在下之結合活性

使用NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)，將回收之培養上清進行超過濾。將已將培養上清各100μL對於各井塗用之NucleoFast 96進行離心分離(4,500g,45分鐘)，以去除通流物(flow through)。將100μL之H₂O已加到各井之該NucleoFast 96再度離心分離(4,500g,30分鐘離心)以洗滌。最後，加入TBS 100μL，回收於室溫靜置5分鐘之該NucleoFast 96之各井之上清含有之噬菌體液。

已加入TBS、或(腺苷+ATP)/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之TBS 100μL塗覆一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體，將該板於37℃靜置1小時，使提示抗體之噬菌體於腺苷及/或ATP不存在/存在下結合於在各井存在的抗原。於以TBST或(腺苷+ATP)/TBST洗滌之各井添加經TBS或(腺苷+ATP)/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或(腺苷+ATP)/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。其結果，確認對於人類IL6、人類IL6 Receptor、HAS(人類血清白蛋白)之三種抗原，於低分子存在下結合之多個抗體。也從人類未改變抗體庫取得於ATP存在下結合之抗體，但能以更高效率取得對於人類IL6、人類IL6 Receptor、HAS之開關抗體。噬菌體ELISA之結果如表16。

(10-5)因腺苷及ATP之有無而改變對抗原之結合活性之開關抗體之結合能力之評價及序列解析

由(10-4)表示之噬菌體ELISA之結果，解析從判斷為於腺苷或ATP存在之條件下對抗原有結合活性之選殖體使用專一性的引子(序列編號：111及112)放大之基因之鹼基序列。解析之結果，取得具有與抗原human IL6、HSA、human IL6R結合之多數彼此互異之序列之抗體。對於human IL6之抗體 I6DL2C1-4_076、對於HAS之抗體HSDL3C5-4_015、及對於human IL-6R之抗體6RAD2C1-4_011與6RAD2C1-4_076之胺基酸序列，如表17。

(10-6)取得之抗體對抗原結合所必要之低分子之鑑定

取得之I6DL2C1-4_076、HSDL3C5-4_015、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_076之各抗體供ELISA使用。低分子使用1mM ATP、腺苷、及其混合物。抗原使用經生物素標記之人類IL6、人類IL6R、HSA。

首先，使StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之100μL之TBS於室溫塗覆1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未與板結合之生物素標記抗原後，將該井以2%脫脂奶/TBS 250μL阻斷1小時以上。於已去除2%脫脂奶/TBS之各井，加入提示抗體之噬菌體50μL，將該板於室溫靜置1小時，使各噬菌體與各井存在之生物素標記抗原在ATP及/或腺苷存在下及不存在下結合。以含ATP及/或腺苷之TBST或不含之TBST洗滌後，將已添加經TBS或(腺苷及/或ATP)/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)於各井之板溫育1小時。以含各低分子之TBST、及不含之TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。(圖25、26、27)。

[實施例11]實施例2取得之抗體在犬尿胺酸(kyneurine)以外之胺基酸代謝物存在下對人類IL-6之結合活性

實施例2-4取得之低分子存在下與人類IL-6結合之抗體I6NMSC1-3_A11，如實施例3-2所示，係於犬尿胺酸存在下與人類IL-6結合之抗體。犬尿胺酸是色胺酸代謝物，且犬尿胺酸會利用犬尿胺酸酶變換為鄰胺苯甲酸、及利用犬尿胺酸3-脫羧酶變換為3-羥基犬尿胺酸、利用犬尿胺酸胺基轉移酶變換為犬尿喹啉酸(Stefan Lob et.Al.Nat Rev Cancer.(2009)9(6),445-452)。針對如此之一系列色胺酸代謝物等胺基酸代謝物，是否適於作為本發明使用之癌組織專一性化合物、尤其癌細胞專一性代謝產物之非限定態樣進行驗證。

將實施例3-2所示之於犬尿胺酸存在下對抗原有結合活性之抗體I6NMSC1-3_A11及既知之抗人類IL-6抗體CLB8-F1、及作為陰性對照之GC413，於表18所示7種條件下供ELISA。又，以表4所示緩衝液製備各胺基酸及其代謝物為表18所示濃度。抗原使用經生物素標記之人類IL-6。

【表18】

首先，將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之100μL之PBS於室溫塗覆1小時以上。將該板之各井以Wash buffer洗滌，以去除未與板結合之抗原後，將該井以Blocking Buffer 250μL阻斷1小時以上。於已去除Blocking Buffer之各井，將以表18之終濃度含低分子之Sample Buffer製備為2.5μg/mL之精製IgG之各100μL加入，將該板於室溫靜置1小時，使各IgG與各井存在之抗原結合。以表18終濃度含胺基酸及胺基酸代謝物之Wash Buffer洗滌後，將經含胺基酸及胺基酸代謝物之Sample Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)對各井添加，將該板溫育1小時。以含各胺基酸及胺基酸代謝物之Wash Buffer洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。又，Bufferr使用含有表4記載之組成之Buffer。

測定結果如圖21。CLB8-F1不論低分子種類及其有無，吸光度相同，相對於此，I6NMSC1-3_A11，相較於在條件1(犬尿胺酸溶液)之吸光度，在條件7(無低分子)之吸光度顯著較低。同樣，在條件2(色胺酸溶液)與條件5(3-羥基犬尿胺酸溶液)之吸光度，與條件1顯示同樣為高之吸光度，所以，代表I6NMSC1-3_A11係不僅在犬尿胺酸存在下，於犬尿胺酸之前驅體胺基酸(色胺酸)及犬尿胺酸之代謝物存在下也會與抗原即人類IL-6結合之抗體。

由此，可認為藉由相同方法，不僅於一種胺基酸代謝物存在下，於結構相異之多數種類胺基酸或胺基酸代謝物存在下，可取得與目的抗原結合之抗體。

[實施例12]

從使用噬菌體展示技術之人類抗體庫取得於低分子存在下與人類IL-6結合之抗體

(12-1)利用珠粒淘選或負選擇法，從庫取得於低分子存在下與人類IL-6結合之抗體

從實施例2-1建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，以與2-2及2-3所示之方法為相同方法，篩選於低分子存在下對抗原顯示結合活性之抗體。

(12-2)利用噬菌體ELISA評價於低分子存在下之結合活性

以與實施例2-4相同之方法，從獲得之大腸菌單一菌落回收含噬菌體之培養上清，將精製噬菌體供ELISA。使用單離之768個選殖體進行噬菌體ELISA，新獲得於低分子雞尾酒成分(cocktail)存在下對抗原人類IL-6有結合活性之選殖體「I6NMSC1-3_#03」及「I6NMSC1-3_#17」。

(12-3)與人類IL-6結合之抗體之表現與精製

解析從噬菌體ELISA顯示之判斷於SC存在下對抗原有結合活性之選殖體選殖體I6NMSC1-3_#03及I6NMSC1-3_#17使用專一性的引子(序列編號：110及112)放大之基因之鹼基序列。I6NMSC1-3_#03之重鏈之序列為序列編號：50及輕鏈之序列為序列編號：51。又，I6NMSC1-3_#17之重鏈之序列為序列編號：52及輕鏈之序列為序列編號：53。將編碼為I6NMSC1-3_#17之可變區之基因插入人類IgG1/Lambda之動物表現用質體，I6NMSC1-3_#03、既知之抗人類IL-6抗體CLB8-F1(重鏈為序列編號：32、輕鏈為序列編號：33)、及編碼為陰性對照即抗人類Glypican 3抗體GC413(重鏈為序列編號：34、輕鏈為序列編號：35)之可變區之基因各插入人類IgG1/kappa之動物表現用質體。表現之抗體依實施例3記載之方法精製。

(12-4)I6NMSC1-3_#03抗體對人類IL-6之結合為必要之低分子之鑑定

I6NMSC1-3_#03，於表3所示之9種條件下供ELISA。又，以表4所示之緩衝液以表3所示濃度適當製備各低分子。抗原使用經生物素標記之人類IL-6。

先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以Wash buffer洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以Blocking Buffer 250μL阻斷1小時以上。於已去除Blocking Buffer之各井添加以表3之終濃度含有低分子之Sample Buffer製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時，使IgG結合於在各井存在的抗原。於表3之終濃度且含低分子之Wash Buffer洗滌後，將以含該低分子之Sample Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)添加到各井之板於溫育1小時。以含各低分子之Wash Buffer洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。又，Bufferr使用含表4記載之組成之Buffer。

測定結果如圖22。I6NMSC1-3_#03，比起於條件8(全部低分子之雞尾酒溶液)之吸光度，於條件9(無低分子)之吸光度顯著較低。從此結果，於噬菌體ELISA同樣可確認I6NMSC1-3_#03具有取決於低分子有無而改變與抗原之結合之性質。又，I6NMSC1-3_#03在條件7(犬尿胺酸100μM存在下)中，顯示與條件8為同等吸光度，在其他條件下則吸光度為顯著較低，顯示係與實施例3記載之I6NMSC1-3_A11同樣，為於犬尿胺酸存在下會與抗原人類IL-6結合之抗體。

I6NMSC1-3_#03，與I6NMSC1-3_A11具有相異胺基酸序列，藉此方法，可取得多種於低分子存在下與抗原之抗體。

(12-5)I6NMSC1-3_#17抗體對人類IL-6之結合所必要之低分子之鑑定

取得之I6NMSC1-3_#17與對照之CLB8-F1及陰性對照GC413之3種抗體，於表3所示之9種條件下供ELISA。又，以表4所示之緩衝液以表3所示濃度適當製備各低分子。抗原使用經生物素標記之人類IL-6。

先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以Wash buffer洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以Blocking Buffer 250μL阻斷1小時以上。於已去除Blocking Buffer之各井添加為表3之終濃度且含有低分子之以Sample Buffer製備為0.15μg/mL之精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時，使IgG結合於在各井存在的抗原。於表3之終濃度且含低分子之Wash Buffer洗滌後，將以含該低分子之Sample Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)添加到各井之板於溫育1小時。以含各低分子之Wash Buffer洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。又，Bufferr使用含有表4記載之組成之Buffer。

測定結果如圖23。CLB8-F1，不論低分子之種類及是否存在，吸光度為相同，相對於此，I6NMSC1-3_#17，比起於條件8(全部低分子之雞尾酒溶液)之吸光度，於條件9(無低分子)之吸光度顯著較低。從此結果，於噬菌體ELISA同樣可確認I6NMSC1-3_#17具有取決於低分子有無而改變與抗原之結合之性質。又，I6NMSC1-3_#17在條件1(ATP-Na 1mM)及條件5(琥珀酸1mM)中，顯示與條件8為同等吸光度，在其他條件下則吸光度為顯著較低，顯示係於ATP-Na或琥珀酸其中之一存在下會與抗原人類IL-6結合之抗體。ATP已知會從癌細胞放出，但關於琥珀酸，已知癌細胞專一性地在細胞內外會蓄積。癌細胞在好氣環境下，已知比起氧化性磷酸化，會傾向進行解糖系依存性代謝，稱為Warburg效果，但缺血性癌症中，由於慢性的血流不足，使得解糖、氧化性磷酸化都被慢性地受限，在更惡劣環境下獲得能量。如此之缺血性癌症，已知會進行富馬酸呼吸依存性的能量代謝，其結果會堆積富馬酸代謝物即琥珀酸(Succinic acid)(Cancer Res.(2009)69(11),4918-4925)。

藉由使用如此的方法，顯示可取得於犬尿胺酸以外之低分子存在下與抗原結合之抗體。又，ATP-Na與琥珀酸具有帶有多數負電荷之共通特徵，顯示可取得在結構彼此互異之低分子之存在下與抗原結合之抗體。

[實施例13]從使用噬菌體展示技術之人類抗體庫取得於低分子存在下與人類血清白蛋白(人類血清白蛋白、以下也稱為HSA)結合之抗體

(13-1)利用珠粒淘選由庫取得於低分子存在下與HSA結合之抗體

從實施例2建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，進行低分子存在下對HSA顯示結合活性之抗體之篩選。亦即，收集提示對捕捉在珠粒之HSA於低分子存在下顯示結合活性之抗體的噬菌體。從於低分子不存在之條件從珠粒溶出之噬菌體溶出液回收噬菌體。本取得方法，係使用經生物素標記之HSA作為抗原。

由保持已構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生之噬菌體，係依一般的方法精製。之後，獲得經TBS透析處理之噬菌體庫液。對噬菌體庫液添加脫脂奶，使終濃度為3%。實施使用於磁珠固定化之抗原的淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。

為了有效率地取得能在癌組織作為開關作用的依存於低分子之低分子開關抗體，實施濃縮於該等低分子(腺苷(adenosine)、腺苷3磷酸(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿胺酸(犬尿胺酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid))之混合液(以下記載為SC(small molecule cocktail))存在下結合於抗原，且於SC不存在下不結合於抗原之抗體之淘選。

具體而言，藉由在製備之噬菌體庫液加入250pmol生物素標記抗原以及由各終濃度1mM之腺苷3磷酸鈉鹽(ATP-Na)、腺苷(Adenosine)、肌苷(Inosine)、琥珀酸(Succinic acid)、及乳酸(Lactic acid)、終濃度為1μM之前列腺素E2(PGE2)、以及終濃度為100μM之犬尿胺酸(犬尿胺酸)構成且利用NaOH調整其pH為7.4之SC，以使於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液加入經脫脂奶阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將珠粒以SC/TBS(含SC之TBS)洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶溶液0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液，對成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738添加。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。然後從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

第1次淘選係回收於低分子存在下可對抗原結合之噬菌體，但第2次以後之淘選，係濃縮在低分子存在下可對抗原結合之噬菌體。具體而言，藉由在製備之噬菌體庫液加入40pmol生物素標記抗原以及SC、NaOH，以使噬菌體庫與抗原及低分子於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液加入經脫脂奶阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將珠粒以1mL之SC/TBST與SC/TBS洗滌。之後，將已加入0.5mL之TBS之珠粒於室溫懸浮後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。再次重複此作業後，將分2次溶出之噬菌體液混合。再對殘留的珠粒加入0.5mL之TBS，將該珠粒於室溫進行5分鐘攪拌。從使用磁座分離之珠粒回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液加入100mg/mL胰蛋白酶5μL，將未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者噬菌體來源之pIII蛋白質)切斷，未提示Fab之噬菌體喪失對大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。將第2次淘選獲得之2種感染大腸菌於此時点點以等量混合，然後從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，得到菌體庫液。取得於低分子存在下對抗原有結合活性之抗體的淘選係重複3次。

(13-2)利用負選擇法從庫取得於低分子存在下與HSA結合之抗體

從建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，進行低分子存在下對HSA顯示結合活性之抗體之篩選。為了篩選，首先使未改變人類抗體噬菌體展示庫於低分子不存在下與生物素標記抗原-鏈黴親和素(streptavidin)接觸，去除提示即使於分子不存在下仍對HSA有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於低分子存在下同樣進行淘選，以實施於低分子存在之條件下對HSA有結合活性之抗體之篩選。抗原使用經生物素標記之HSA。

由保持已構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生噬菌體。依一般的方法精製產生之噬菌體後，獲得經TBS透析處理之噬菌體庫液。對噬菌體庫液添加脫脂奶，使終濃度為3%。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)，並實施使用於磁珠固定化之生物素標記HSA的淘選。

於製備之噬菌體庫液加入250pmol之生物素標記HSA、及由各終濃度為1mM之ATP-Na、Adenosine、Inosine、Succinic acid、及Lactic acid、終濃度1μM之PGE2、以及終濃度100μM之犬尿胺酸構成且以NaOH調整pH為7.4之SC，使與該噬菌體庫液於室溫接觸60分鐘。於噬菌體庫液添加以脫脂奶阻斷的磁珠，將生物素標記HSA與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。將珠以SC/TBS洗滌1次。之後，將添加有0.5mL之1mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

第1次之淘選係回收於低分子存在存在下可結合之噬菌體，第2次後之淘選，係實施於低分子存在存在下對生物素標記HSA可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，具體而言，於經脫脂奶阻斷之Sera-Mag NeutrAvidin珠粒加入250pmol生物素化HSA，於室溫使結合15分鐘。對於以TBS洗滌3次的珠粒，加入經脫脂奶阻斷的噬菌體庫液，於室溫使其進行1小時結合。使用磁座將珠粒分離，以回收未與生物素標記HSA及珠粒結合之噬菌體。對回收之噬菌體加入40pmol之生物素標記HSA及SC、NaOH，使噬菌體庫於室溫與含生物素標記HSA及SC之低分子接觸60分鐘。然後，於生物素標記HSA、SC及噬菌體庫之混合液中加入以脫脂奶阻斷之磁珠，於室溫使生物素標記HSA與噬菌體之複合體與磁珠結合15分鐘。珠粒以1mL之SC/TBST與SC/TBS洗滌。之後將1mg/mL之Trypsin溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫進行20分鐘攪拌後，從使用磁座分離之珠粒回收噬菌體。回收之噬菌體添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，以使噬菌體感染到大腸菌。受感染之大腸菌接種到225mm x 225mm之板。取得於低分子存在下對生物素標記HSA有結合活性之抗體的淘選重複進行3次。

(13-3)利用噬菌體ELISA評價於低分子存在下之結合活性

已加入TBS、或SC/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記HSA之TBS 100μL塗覆一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除生物素標記HSA後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體，將該板於37℃靜置1小時，使提示噬菌體之抗體於SC不存在/存在下結合於在各井存在的生物素標記HSA。於以TBST或SC/TBST洗滌之各井添加經TBS或SC/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或SC/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。

使用經單離之782種選殖體進行噬菌體ELISA，獲得於低分子雞尾酒存在下對抗原HSA有結合活性之選殖體 HSNMSC1-4_#22。

(13-4)與HSA結合之抗體之表現與精製

解析從(13-3)記載之噬菌體ELISA顯示之判斷於SC存在下對生物素標記HSA有結合活性之選殖體HSNMSC1-4_#22使用專一性的引子(序列編號：110及112)放大之基因之鹼基序列(重鏈之序列為序列編號：54及輕鏈之序列為序列編號：55)。將編碼為HSNMSC1-4_#22之可變區之基因插入人類IgG1/Lambda之動物表現用質體。將編碼為陰性對照即抗人類Glypican 3抗體GC413(重鏈為序列編號：34、輕鏈為序列編號：35)之可變區之基因各插入人類IgG1/kappa之動物表現用質體。表現之抗體依實施例3記載之方法精製。

(13-5)取得之抗體對HSA之結合為必要之低分子之鑑定

取得之HSNMSC1-4_#22與GC413共2種之抗體，於表3所示之9種條件下供ELISA。又，以表19所示之緩衝液以表3所示濃度適當製備各低分子。抗原使用經生物素標記之HSA。

先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記HSA之PBS 100μL塗覆1小時以上。以Wash buffer洗滌該板之各井以去除未與板結合之生物素標記HSA後，將該井以Blocking Buffer 250μL阻斷1小時以上。於已去除Blocking Buffer之各井添加為表3之終濃度且含有低分子之以Sample Buffer製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時，使IgG結合於在各井存在的生物素標記HSA。於表3之終濃度且含低分子之Wash Buffer洗滌後，將以含該低分子之Sample Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)添加到各井之板於溫育1小時。以含各低分子之Wash Buffer洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。又，Bufferr係使用含表19記載之組成之Buffer。

測定結果如圖24。HSNMSC1-4_#22，比起於條件8(全部低分子之雞尾酒溶液)之吸光度，於條件9(無低分子)之吸光度顯著較低。從此結果，於噬菌體ELISA同樣可確認HSNMSC1-4_#22具有取決於低分子有無而改變與抗原之結合之性質。又，HSNMSC1-4_#22在條件2(腺苷1mM)中，顯示與條件8為同等吸光度，在其他條件下則吸光度為顯著較低，顯示係於腺苷存在下會與抗原HSA結合之抗體。藉由使用如此之方法，顯示可取得於犬尿胺酸以外之低分子存在下與抗原結合之抗體。

[實施例14]從使用噬菌體展示技術之人類抗體庫取得於低分子存在下與人類IL-6受體(hIL-6R)結合之抗體

(14-1)利用珠粒淘選從未改變人類抗體庫取得於低分子存在下與hIL-6R結合之抗體

從實施例2建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，篩選於低分子存在下對hIL-6R顯示結合活性之抗體。亦即，收集提示對捕捉在珠粒之HSA於低分子存在下顯示結合活性之抗體的噬菌體。從於低分子不存在之條件從珠粒溶出之噬菌體溶出液回收噬菌體。本取得方法，係使用經生物素標記之hIL-6R作為抗原。

為了有效率地取得能在癌組織作為開關作用的依存於低分子之低分子開關抗體，實施濃縮於(2-2)記載之SC存在下與抗原結合且於SC不存在下不與抗原結合之抗體的淘選。

具體而言，藉由在製備之噬菌體庫液加入250pmol生物素標記抗原以及(2-2)記載之方式製備之SC，以使於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液加入經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將珠粒以SC/TBS(含SC之TBS)洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶溶液0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液，對於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株 ER2738添加。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。然後從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

為了將未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者噬菌體來源之pIII蛋白質)切斷，使未提示Fab之噬菌體喪失對大腸菌之感染能力，而加入100mg/mL胰蛋白酶10μL，除此以外實施(2-2)記載之淘選。

(13-2)利用負選擇法從未改變人類抗體庫取得於低分子存在下與hIL-6R結合之抗體

從建構之未改變人類抗體噬菌體展示庫，進行低分子存在下對hIL-6R顯示結合活性之抗體之篩選。為了篩選，首先使未改變人類抗體噬菌體展示庫於低分子不存在下與生物素標記抗原-鏈黴親和素(streptavidin)接觸，去除提示即使於分子不存在下仍對hIL-6R有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於低分子存在下同樣進行淘選，以實施於低分子存在之條件下對hIL-6R有結合活性之抗體之篩選。抗原使用經生物素標記之hIL-6R。然後依使用生物素標記hIL-6R作為抗原之(2-3)記載之方法，製備噬菌體庫液。

(14-3)利用噬菌體ELISA評價於低分子存在下之結合活性

從(14-2)獲得之大腸菌單一菌落，參考常法(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。將以(2-4)記載之方法精製之精製噬菌體以以下程序供ELISA。

將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記hIL-6R之TBS 100μL塗覆一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除生物素標記hIL-6R後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體，將該板於37℃靜置1小時，使提示噬菌體之抗體於SC不存在/存在下結合於在各井存在的生物素標記HSA。於以TBST或SC/TBST洗滌之各井添加經TBS或SC/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或SC/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。

使用經單離960種選殖體進行噬菌體ELISA，獲得於低分子雞尾酒存在下對抗原hIL-6R有結合活性之選殖體6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02。

(14-4)與hIL-6R結合之抗體之表現與精製

解析從(14-3)記載之噬菌體ELISA顯示之判斷於SC存在下對生物素標記hIL-6R有結合活性之選殖體6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02使用專一性的引子(序列編號：110及112)放大之基因之鹼基序列(6RNMSC1-2_F02：重鏈之序列為序列編號：86及輕鏈之序列為序列編號：87、6RNMSC1-3_G02：重鏈之序列為序列編號：88及輕鏈之序列為序列編號：89表示)。將編碼為6RNMSC1-2_F02、6RNMSC1-3_G02之可變區及編碼為陰性對照即抗人類Glypican 3抗體GC413(重鏈為序列編號：34、輕鏈為序列編號：35)之可變區之基因插入人類 IgG1/kappa之動物表現用質體。表現之抗體依實施例3記載之方法精製。

(14-5)取得之抗體對hIL-6R之結合所必要之低分子之鑑定

取得之6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02與GC413共3種之抗體，於表3所示之9種條件下供ELISA。又，以表19所示之緩衝液以表3所示濃度適當製備各低分子。抗原使用經生物素標記之hIL-6R。

先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記HSA之hIL-6R 100μL塗覆1小時以上。以Wash buffer洗滌該板之各井以去除未與板結合之生物素標記hIL-6R後，將該井以Blocking Buffer 250μL阻斷1小時以上。於已去除Blocking Buffer之各井添加為表3之終濃度且含有低分子之以Sample Buffer製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時，使IgG結合於在各井存在的生物素標記hIL-6R。於表3之終濃度且含低分子之Wash Buffer洗滌後，將以含該低分子之Sample Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)添加到各井之板於溫育1小時。以含各低分子之Wash Buffer洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。又，Bufferr係使用含表19記載之組成之Buffer。

測定結果如圖圖28與圖29。使用6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02之情形，比起於條件8(全部低分子之雞尾酒溶液)之吸光度，於條件9(無低分子)之吸光度顯著較低。從此結果，於噬菌體ELISA同樣可確認6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02具有取決於低分子有無而改變與抗原之結合之性質。又，6RNMSC1-2_F02之情形，在條件7(犬尿胺酸100uM)中，顯示與條件8為同等吸光度，在其他條件下則吸光度為顯著較低，顯示6RNMSC1-2_F02係於犬尿胺酸存在下會與抗原hIL-6R結合之抗體(圖28)。又，6RNMSC1-3_G02之情形，在條件1(ATP-Na 1mM)中，顯示與條件8為同等吸光度，在其他條件下則吸光度為顯著較低，顯示6RNMSC1-3_G02係於ATP存在下會與抗原hIL-6R結合之抗體(圖29)。藉由使用如此之方法，顯示可一次取得多數在不同低分子存在下對抗原之結合能力改變之抗體。

[實施例15]6RNMSC1-2_F02抗體之定性

(15-1)利用ELISA評價在犬尿胺酸以外之胺基酸及胺基酸代謝物存在下對hIL6R之結合活性

實施例2-4取得之低分子存在下與hIL-6R結合之抗體6RNMSC1-2_F02，係於犬尿胺酸存在下與hIL-6R結合之抗體。針對如此之一系列色胺酸代謝物等胺基酸代謝物，是否適於作為本發明使用之癌組織專一性化合物、尤其癌細胞專一性代謝產物之非限定態樣進行驗證。

將實施例14所示之於犬尿胺酸存在下對抗原有結合活性之抗體6RNMSC1-2_F02、及作為陰性對照之GC413，於表18所示7種條件下供ELISA。又，以表4所示緩衝液製備各胺基酸及其代謝物為表18所示濃度。抗原使用經生物素標記之hIL-6R，ELISA使用實施例11記載之方法。

測定結果如圖圖30。6RNMSC1-2_F02之情形，相較於在條件1(犬尿胺酸溶液)之吸光度，在條件7(無低分子)之吸光度顯著較低。同樣，在條件5(3-羥基犬尿胺酸溶液)之吸光度，與條件1顯示同樣為高之吸光度，所以，代表6RNMSC1-2_F02係不僅在犬尿胺酸存在下，於犬尿胺酸之代謝物存在下也會與抗原即hIL-6R結合之抗體。又，於其他條件也是顯著低之吸光度，可知6RNMSC1-2_F02係即使犬尿胺酸之前驅體色胺酸存在，也不與抗原hIL-6R結合之抗體。在癌微小環境，代謝色胺酸而產生犬尿胺酸之酵素IDO之表現上昇，所以，與色胺酸存在下不與抗原結合，而在犬尿胺酸及其代謝物存在下與抗原結合之抗體，據認為作為僅在癌微小環境下與抗原結合之抗體為重要。又，由此，可認為藉由相同方法，可取得不僅於一種類胺基酸代謝物存在，在結構相異之多種胺基酸代謝物存在下也對目的抗原結合之抗體。

(15-2)利用表面電漿共振評價犬尿胺酸對人類IL6受體之結合之影響

使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析6RNMSC1-2_F02與人類IL-6受體(IL-6R)間之抗原抗體反應之交互作用。使目的抗體捕捉於經胺偶聯法固定適量protein A(Invitrogen)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)，使抗原IL-6R交互作用。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4。與抗原IL-6R之交互作用係於25℃測定，IL-6R之稀釋使用運行緩衝液、運行緩衝液中加有100μmol/L 犬尿胺酸之緩衝液，又，為了比較對照，使用於運行緩衝液加有10mmol/L ATP之緩衝液。

將IL-6R稀釋液與空白運行緩衝液以流速10μL/min注射1分鐘，使捕捉於感測晶片上之6RNMSC1-2_F02與IL-6R交互作用。之後，以流速10μL/min流過1分鐘運行緩衝液，觀察到IL-6R從抗體解離之後，將10mmol/L Glycine-HCl、pH1.5以流速30μL/min注射30秒，將感測晶片再生。從測定獲得之感測圖算出之動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)為依據，計算6RNMSC1-2_F02對IL-6R之解離常數K_D(M)。各參數之計算，使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。

於此測定取得之100μmol/L犬尿胺酸存在下、10mmol/L ATP存在下、或不存在下之6RNMSC1-2_F02與1μmol/L之IL-6R間之交互作用之感測圖，如圖31。如圖31，6RNMSC1-2_F02於100μmol/L之犬尿胺酸存在下會與IL-6R結合，但於犬尿胺酸不存在下未觀察到與IL-6R結合。由此，可確認6RNMSC1-2_F02具有以犬尿胺酸為開關而與IL-6R結合之性質。又，100μmol/L犬尿胺酸存在下之6RNMSC1-2_F02之解離常數K_D為1.5μmol/L。

(15-3)犬尿胺酸開關對抗體從IL-6R解離之效果

使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價於犬尿胺酸存在下對IL-6R已結合之6RNMSC1-2_F02，是否會於犬尿胺酸存在下以犬尿胺酸濃度依存的解離。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4及20 mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4、100μmol/L犬尿胺酸，於25℃測定。於利用胺偶聯固定IL-6R之感測晶片CM5，將以含100μmol/L之犬尿胺酸之20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4稀釋之5μg/mL之6RNMSC1-2_F02作為分析物，進行180秒交互作用後，觀察於各運行緩衝液條件下之IL-6R之解離狀態。為了比較於各運行緩衝液條件下之解離程度，比較將於100μmol/L犬尿胺酸存在下對IL-6R之6RNMSC1-2_F02之結合量定為100而標準化(normalize)之值。此標準化後之6RNMSC1-2_F02與IL-6R之交互作用之狀態之感測圖，如圖32。從圖32之結果，可知：6RNMSC1-2_F02於犬尿胺酸存在下與IL-6R結合後，若犬尿胺酸不存在，會有快速解離出IL-6R之性質。亦即，可確認犬尿胺酸獲致之影響抗體對IL-6R之結合之控制係可逆的。

(15-4)犬尿胺酸濃度對IL-6R結合之影響之評價

然後使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價在6RNMSC1-2_F02與IL-6R之抗原抗體反應中，犬尿胺酸濃度之影響。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，6RNMSC1-2_F02與人類IL-6R之抗原抗體反應於25℃測定。在感測晶片CM5上利用胺偶聯固定IL-6R，將經製備為含各種濃度之犬尿胺酸之20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4稀釋之1μg/mL之6RNMSC1-2_F02當作分析物，進行180秒交互作用，觀察其結合量的變化。其結果如圖33。從此結果，可知：成為開關之犬尿胺酸濃度愈高，6RNMSC1-2-F02對IL-6R會結合更多。

又，此評價系中，IL-6R係固定於感測晶片上，可認為6RNMSC1-2_F02係以二價結合。在如此之6RNMSC1-2_F02係以二價認識IL-6R之評價系中，亦觀察到犬尿胺酸濃度愈高，則RNMSC1-2_F02之IL-6R之結合量愈增加。從此結果可知，於二價之結合亦為6RNMSC1-2_F02對IL-6R有以犬尿胺酸作為開關而結合之性質。

從該等結果可明白：6RNMSC1-2_F02，係以犬尿胺酸作為開關，於尿胺酸存在下與IL-6R結合且於犬尿胺酸不存在下從IL-6R解離之抗體。又，可確認6RNMSC1-2_F02顯示於犬尿胺酸不存在下不顯示與IL-6R結合之活性之完全ON/OFF控制，可推測可以圖2之態樣發揮開關機能。

(15-5)犬尿胺酸對6RNMSC1-2_F02之ADCC活性之影響

將實施例14決定之編碼為6RNMSC1-2_F02之可變區之基因，插人包含序列編號：90之重鏈抗體不變區與包含序列編號：91之輕鏈kappa不變區序列之人類IgG1/Kappa之動物表現用質體。(重鏈之序列以序列編號：92表示，輕鏈之序列以序列編號：93表示)、編碼為既知之抗人類IL-6R抗體MRA之可變區之基因，也分別插入具有上述(序列編號：90、及91)之不變區之人類IgG1/Kappa之動物表現用質體。使用以下方法表現抗體。於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)以1.33 x 10⁶細胞/mL之細胞密度懸浮且對於6well plate之各井各接種3mL之人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，利用脂轉染法導入製備之質體。M61CO2培養箱(37℃、8%CO2,90rpm)培養4日，從培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域中具有通常知識者公眾所知之方法精製抗體。使用分光光度計，測定精製之抗體溶液於280nm之吸光度。從得到之測定值利用PACE法算出之吸光係數，計算經精製之抗體之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

評價實施例14所示之於犬尿胺酸存在下對抗原之結合活性之抗體6RNMSC1-2_F02是否對於至今為止之可溶型hIL-6R結合。為了評價6RNMSC1-2_F02對hIL-6R表現細胞之ADCC活性，首先，評價6RNMSC1-2_F02是否對hIL-6R表現細胞表現之膜型hIL-6R有結合能力。具體而言，使用Flow cytometer測定、及解析6RNMSC1-2_F02對BaF/hIL-6R細胞株(WO2012/073992)之結合。將製成適當細胞數之BaF/hIL-6R於冰上，以2%FBS於PBS阻斷1小時以上。經已阻斷之細胞利用離心分離從上清除去，將6RNMSC1-2_F02或對照抗體MRA(重鏈之序列以序列編號：92表示，輕鏈之序列以序列編號：93表示)於終濃度100μM之犬尿胺酸存在或不存在下二種條件，添加100μL。此時於冰上使抗體與細胞膜上之hIL-6R接觸30分鐘。將細胞與抗體之複合體以含犬尿胺酸之Wash Buffer或不含之Wash Buffer洗滌，其次使認識該複合體與抗體之不變區之二次抗體(Beckman Coulter IM1627)於犬尿胺酸存在下、或不存在下接觸。經冰上與抗體反應30分鐘後，將細胞再度以Wash Buffer洗滌後，再懸浮於2%FBS於PBS。6RNMSC1-2_F02對製備之細胞之結合，以BD FACS cant II Flow Cytometer(BD)測定、及解析。

測定結果如圖34。對照抗體MRA無論犬尿胺酸是否存在，認為有螢光發色，相對於此，6RNMSC1-2_F02於犬尿胺酸100μM存在下才可觀察到螢光的轉移(shift)，於犬尿胺酸不存在下未認有螢光發色，代表6RNMSC1-2_F02係於犬尿胺酸存在下對細胞膜上表現之hIL-6R有結合能力之抗體。

通常，天然型抗體藉由標的細胞上之抗原與抗體之Fab直接結合，再使效應子細胞上之FcγR與抗體之Fc結合，以從效應子細胞誘導對標的細胞之細胞傷害活性(ADCC活性)。而，依以下方法驗證藉由6RNMSC1-2_F02於犬尿胺酸存在下與hIL-6R結合，是否對表現hIL-6R之細胞發揮ADCC活性。

使用6RNMSC1-2_F02之效應子作用增強改變體(重鏈之序列以序列編號：94 輕鏈序列編號：91表示)。依參考例1之方法，測定於犬尿胺酸存在或不存在下，相異濃度之6RNMSC1-2_F02h所致之對表現IL-6R之細胞之ADCC活性。測定結果如圖35。

測定結果，確認於犬尿胺酸存在下，對表現hIL-6R之細胞，6RNMSC1-2_F02具有抗體濃度依存的ADCC活性。從此結果，利用經由犬尿胺酸之抗原與抗體之結合，會誘導該抗體所致之對表現抗原之細胞之ADCC活性，所以，於成為開關之低分子分子存在下與抗原結合之抗體，也可利用是否有成為開關之低分子控制ADCC活性等抗腫瘤活性之功能。

又，犬尿胺酸濃度在正常組織中與腫瘤組織中有差異，所以，希望僅對於於腫瘤組織中犬尿胺酸濃度表現抗原之腫瘤細胞發揮抗體所致之ADCC活性，而在正常組織中之濃度不發揮或減弱ADCC活性。而，依參考例2之方法，測定不同犬尿胺酸濃度中，6RNMSC1-2_F02所致對表現hIL-6R之細胞之ADCC活性。測定結果如圖36。測定結果，確認6RNMSC1-2_F02帶來對犬尿胺酸濃度依存性表現hIL-6R之細胞之ADCC活性。再者，作為正常組織中之犬尿胺酸濃度考慮的4~6μM，ADCC活性約10%，作為腫瘤組織中之犬尿胺酸濃度考慮的30~40μM，ADCC活性約25%。

從該等結果，可知，於犬尿胺酸濃度低之正常組織，6RNMSC1-2_F02所致對表現hIL-6R之細胞之ADCC活性弱，於濃度高之腫瘤組織中，6RNMSC1-2-F02所致對表現hIL-6R之細胞之ADCC活性較強。由以上顯示，藉由投予以犬尿胺酸作為開關之抗體，能維持對表現標的抗原之腫瘤組織之藥效，另一方面，可減輕對表現標的抗原之正常組織之毒性。

(15-6)利用IgG ELISA評價取得之抗體對小鼠血清中之hIL-6R之結合活性

實施例14取得之於低分子存在下與hIL-6R結合之抗體6RNMSC1-2_F02，係於犬尿胺酸存在下與hIL-6R結合之抗體。至今為止，6RNMSC1-2_F02在PBS或TBS等緩衝中與抗原之結合能力已有人評價。小鼠血清中存在胺基酸等各種未知低分子，由於此等低分子，無法否定6RNMSC1-2_F02對抗原結合之影響。而，評價小鼠血清中之6RNMSC1-2_F02之抗原結合能力。

將實施例14表示之於犬尿胺酸存在下對抗原有結合活性之抗體6RNMSC1-2_F02及既知之抗hIL-6R抗體MRA，以表20所示之二種條件下供ELISA。抗原使用經生物素標記之hIL-6R。

首先，使StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之100μL之PBS於室溫塗覆1小時以上。將該板之各井以Wash buffer洗滌以去除未與板結合之抗原後，將該井以Blocking Buffer 250μL阻斷1小時以上。於已去除Blocking Buffer 250μL之各井，加入以表20條件2製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時，使IgG結合於在各井存在的抗原。以含100μM之犬尿胺酸之Wash Buffer洗滌後，將以含該犬尿胺酸之Sample Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)添加到各井之板於溫育1小時。以含犬尿胺酸之Wash Buffer洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。

測定結果如圖37。使用MRA之情形，無論有無犬尿胺酸，吸光度均相同，相對於此，使用6RNMSC1-2_F02之情形，比起於表20所示之條件2((犬尿胺酸存在之小鼠血清)之吸光度，於條件1(不存在犬尿胺酸存在之小鼠血清)之吸光度顯著較低。由此可顯示，6RNMSC1-2_F02係不受小鼠血清中之未知低分子影響，於犬尿胺酸存在下會與抗原hIL-6R結合之抗體。

[實施例16]從使用噬菌體展示技術之抗體庫取得於腺苷、ATP不存在下與抗原結合之抗體

(16-1)利用腺苷及ATP之混合物，從庫取得於低分子存在下對抗原之結合受抑制之抗體

取得上述實施例中於成為開關之低分子存在下與標的抗原結合之抗體。本實施例中嘗試取得於低分子不存在下與標的抗原結合之抗體。

從建構之合理設計抗體噬菌體展示庫，取得於腺苷、及/或ATP不存在條件下對抗原顯示結合活性之抗體且於存在下結合能力衰減之抗體。為了取得，首先使抗體噬菌體展示庫與生物素化腺苷及ATP-NeutrAvidin接觸，回收與腺苷及/或ATP結合之抗體噬菌體展示庫。然後使該抗體噬菌體展示庫於腺苷及ATP不存在條件下與生物素化抗原-鏈黴親和素接觸，回收於腺苷及ATP不存在下與抗原結合之抗體。藉由交替進行如此之淘選，篩選具有與腺苷及/或ATP、及抗原兩者有結合活性之抗體。帶有如此性質之抗體，於腺苷及ATP存在下，藉由抗體與腺苷及/或ATP結合，可期待抑制抗體對抗原之結合。

於製備之噬菌體庫液，加入500pmol之生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin，以使該噬菌體庫液於室溫與腺苷、及ATP接觸60分鐘。於該噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠粒以TBS洗滌1次。之後，加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL。

將珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm之板。然後，從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。

第2次之淘選，係濃縮在腺苷及ATP不存在下可對生物素化抗原結合之噬菌體。具體而言，藉由在製備之噬菌體庫液加入250pmol生物素化抗原以使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。於噬菌體庫液加入經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將珠粒以TBST洗滌2次、以TBS洗1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶溶液0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液加入對於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。然後從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以回收噬菌體庫液。

之後，在第奇數次淘選中，以與第1次淘選為相同條件反複實施淘選。惟，以TBST及TBS進行之珠粒洗滌，各增為3次、2次實施。

之後，於第偶數次淘選中，重複實施與第2次淘選為相同條件之淘選。惟，第4次以後的淘選，將生物素化抗原減為40pmol，利用TBST及TBS進行之珠粒之洗滌各增為3次、2次。

(16-2)利用噬菌體ELISA評價低分子存在下之結合活性

已加入TBS、或ATP及腺苷/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之TBS 100μL塗覆一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體，將該板於37℃靜置1小時，使提示噬菌體之抗體於腺苷及/或ATP10mM存在下或不存在下結合於在各井存在的抗原。於以TBST或10mM ATP及腺苷/TBST洗滌之各井添加經TBS或10mM ATP及腺苷/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或10mM ATP及腺苷/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。

使用經單離之96個選殖體進行噬菌體ELISA，從合理設計抗體庫獲得於ATP及腺苷不存在下顯示對於係抗原之人類IL-6有結合活性之選殖體「I6RLSA1-6_011」、於ATP及腺苷不存在下對抗原人類血清白蛋白(HSA)顯示結合活性之選殖體「HSADSA1-6_020」、及於ATP及腺苷不存在下顯示對人類IL-6 receptor有結合活性之選殖體「6RRLSA1-6_037」、「6RRLSA1-6_045」(圖38、39、45)。

(16-3)將腺苷及ATP作為開關之抗體之序列解析

解析從(16-2)表示之噬菌體ELISA之結果，判斷在腺苷或ATP之不存在條件下對抗原有結合活性之選殖體使用專一性的引子序列編號：111及112)放大之基因之鹼基序列。針對解析結果，於以下表21表示胺基酸序列。

[實施例17]從使用多價提示噬菌體展示技術之抗體庫取得於腺苷、ATP存在下與抗原結合之抗體

(17-1)從利用多價提示之庫取得於低分子存在下與抗原結合之抗體

利用抗體對噬菌體之多價提示，從合理設計抗體噬菌體展示庫取得對抗原於腺苷、及/或ATP存在下顯示結合活性之抗體。從庫取得抗體時，於低分子存在下與不存在下對抗原之結合能力比愈大，取得機率愈高。而，為了以良好效率回收於低分子存在下有結合能力之抗體，實施利用增強視結合能力之淘選。更具體而言，藉由使抗體對於噬菌體以多價提示，利用結合性效果(由於多價對抗原之結合效果)增強視結合能力。首先，使合理設計抗體噬菌體展示庫於腺苷及ATP存在下接觸生物素化抗原，於腺苷及ATP存在下回收與抗原結合之抗體噬菌體展示庫。然後參照於Rondot(Nat.Biotechnol.(2001)19,75-78)記載之方法，對於已感染回收之抗體噬菌體展示庫之大腸菌，使編碼為pIII之基因已缺失之幫助者噬菌體感染，製備在所有pIII提示抗體之抗體多價提示噬菌體提示庫。使此抗體多價提示噬菌體展示庫於腺苷及ATP存在條件下接觸生物素化抗原-鏈黴親和素並回收後，於腺苷、及ATP不存在條件下，回收從珠粒溶出之溶出液中的噬菌體。進行多次如此之噬菌體製備及淘選，篩選僅於腺苷及/或ATP存在下對抗原有結合活性之抗體。

使幫助者噬菌體M13KO7感染保持已建構之噬菌體展示用噬粒的大腸菌，於30℃培養一晚，產生抗體一價提示噬菌體展示庫。於產生噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，得到噬菌體庫液。然後於噬菌體庫液添加BSA，使終濃度成為4%。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)，並實施使用固定於磁珠之抗原之淘選。

於製備之噬菌體庫液中，加入作為抗原之500pmol之生物素標記人類IgA-Fc(序列編號：99)、以及各終濃度1mM之ATP-Na及腺苷，以使該噬菌體庫液於室溫與抗原及腺苷、及ATP接觸60分鐘。於該噬菌體庫液加入經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於室溫進行15分鐘結合。將珠粒以溶有ATP及腺苷之TBS洗1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠粒，從珠粒回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種於225mm x 225mm之板。然後使幫助者噬菌體M13KO7、或M13KO7△pIII(稱為高(hyper)噬菌體)(PROGEN Biotechnik)感染已接種之大腸菌培養液，從於30℃培養一晚之上清回收噬菌體，以分別製備抗體一價提示噬菌體庫及抗體多價提示噬菌體庫液。

第1次之淘選係回收於腺苷及ATP存在下可結合於抗原之噬菌體，第2次後之淘選，係實施僅於腺苷及ATP存在下對抗原可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250pmol之生物素標記抗原及各終濃度1mM之腺苷及ATP，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原及腺苷及ATP接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。珠以1mL之溶解腺苷及ATP之TBST(以下稱為(腺苷+ATP)/TBST)、溶解腺苷及ATP之TBS(以下稱為(腺苷+ATP)/TBS)洗滌。之後，將添加有0.5mL之TBS的珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。再次重複此作業後，將分2次溶出之噬菌體液混合。於回收之噬菌體溶液添加100mg/mL之胰蛋白酶5μL，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者(helper)噬菌體來源之pIII蛋白質)，使未呈現Fab之噬菌體失去對大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株 ER2738。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225mm x 225mm之板。然後從已接種之大腸菌之培養液與第1次淘選同樣回收噬菌體，將抗體一價提示噬菌體庫及抗體多價提示噬菌體庫液回收。重複3次取得於腺苷及ATP存在下對抗原有結合活性之抗體的淘選。但，第3次以後的淘選，使用生物素化抗原40pmol。

(17-2)利用噬菌體ELISA評價於腺苷及/或ATP存在及不存在下之結合活性

已加入TBS、或或(腺苷+ATP)/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之TBS100μL塗覆一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體，將該板於37℃靜置1小時，使提示抗體之噬菌體於腺苷及 ATP不存在/存在下結合於在各井存在的抗原。於以TBST或(腺苷+ATP)/TBST洗滌之各井添加經TBS或(腺苷+ATP)/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或(腺苷+ATP)/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。其結果，於抗體多價提示噬菌體展示庫中，取得較多於低分子存在下具結合活性之抗體(圖40、41)。由此啟示，藉由使用抗體多價提示噬菌體展示法，能以較好效率取得在低分子存在下具有結合活性之抗體。噬菌體ELISA之結果如以下表22。

(17-3)將腺苷及ATP作為開關之抗體之結合能力之評價及序列解析

解析從(17-2)表示之噬菌體ELISA之結果判斷在腺苷及ATP存在之條件下對抗原有結合活性之選殖體使用專一性的引子(序列編號：111及112)放大之基因之鹼基序列。其結果，取得於腺苷及ATP存在下對抗原顯示結合活性之選殖體「IADL3C5-4_048(重鏈序列編號：100、輕鏈序列編號：101)」(圖42)。

[實施例18]從庫取得之ATP/腺苷依存性抗體之定性

(18-1)從庫取得之ATP/腺苷依存性抗體之製備

從在實施例10取得之判斷於ATP或腺苷存在下對生物素標記hIL-6R(hI-L6)有結合活性之選殖體6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011，解析使用專一性的引子放大之基因之鹼基序列(表23)。

將6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、 6RDL3C5-4_011之可變區序列，插入到具序列編號：90之重鏈抗體不變區及具序列編號：91之輕鏈kappa不變區序列的人類IgG1/Kappa的動物表現用質體。使用以下方法表現抗體。對在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)以1.33 x 10⁶細胞/mL之細胞密度懸浮且對於6well plate之各井各接種3mL之人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，將製備之質體以脂轉染法導入。於CO₂培養箱(37℃、8%CO₂,90rpm)培養4日，從培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域中具有通常知識者公眾所知之方法精製抗體。使用分光光度計，測定精製之抗體溶液於280nm之吸光度。使用從獲得之測定值依PACE法算出之吸光係數，計算精製之抗體之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(18-2)利用表面電漿共振評價各種低分子對於對人類IL6受體之結合之影響

使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價從庫取得之ATP/腺苷依存性抗體9選殖體(6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011)與IL-6R之抗原抗體反應中的各種低分子的影響。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，於25℃測定。在感測晶片CM5上利用胺偶聯將IL-6R固定，將抗體作為分析物交互作用120秒，並觀察其結合量之變化。抗體稀釋，使用運行緩衝液及在運行緩衝液分別添加ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷(ADO)中之任一者的緩衝液，並製備為各低分子之終濃度成為1mM、抗體之終濃度為1μM。又，1mM ATP條件下，測定數階段之抗體之濃度系列，從平衡值對抗體濃度作圖，計算各選殖體對IL-6R之解離常數K_D(mol/L)。參數計算使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。1mM ATP存在下之各選殖體之解離常數K_D，如表24。

於此測定取得之1mM之各低分子存在下、或不存在下，各選殖體對IL-6之結合量如圖43。如圖43，各選殖體於1mM ATP存在下與IL-6R結合，但於ATP不存在下未觀察到與IL-6R結合。由此可確認，具有以ATP作為開關而與IL-6R結合之性質。ATP以外之低分子中，全部選殖體均觀察到ADP存在下之結合，一部分選殖體也觀察到於AMP及cAMP存在下之結合。ADO存在下，未觀察到對IL-6R之結合。

藉由使用合理設計庫，可取得於ATP、ADP、AMP、 cAMP中之1個或任一者存在下與標的抗原結合之抗體。本實施例中，設計庫設計時係於參照之抗體ATNLSA1-4_D12所結合之ATP與ADO共存下進行淘選，但是其結果，會取得於ATNLSA1-4_D12較強結合之ATP存在下與標的抗原強力結合之抗體，但不取得ATNLSA1-4_D12比ATP弱結合之ADO存在下與標的抗原強結合之抗體。僅於所望低分子存在之條件下使抗原與庫接觸，並將與抗原結合之抗體單離，能夠取得僅依存於該低分子而與抗原結合之抗體。例如藉由僅於ADO存在下淘選，據認為可從本庫以良好效率取得於ADO存在下結合之抗體。

(18-3)ATP對於取得之抗體之ADCC活性之影響

依以下方法驗證：取得之抗體6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_011在Adenosine Triphosphate(ATP)存在下與hIL-6R結合，是否能對表現hIL-6R之細胞發揮ADCC活性。本驗證係使用實施例18-1製作之6RAD2C1-4_030之效應子作用增強改變體(重鏈抗體可變區：序列編號119、輕鏈抗體可變區：序列編號120、重鏈抗體不變區：序列編號90、輕鏈抗體不變區：序列編號91)、6RAD2C1-4_011之效應子作用增強改變體(重鏈抗體可變區：序列編號82、輕鏈抗體可變區：序列編號83、重鏈抗體不變區：序列編號90、輕鏈抗體不變區：序列編號91)、及實施例15-5製作之既知之抗人類IL-6R抗體MRA(重鏈抗體可變區：序列編號92、輕鏈抗體可變區：序列編號92、重鏈抗體不變區：序列編號90、輕鏈抗體不變區：序列編號91)。依參考例3之方法，測定於ATP存在、或不存在下，對表現hIL-6R之細胞，不同抗體濃度之6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_011、MRA所獲之ADCC活性。測定結果如圖44。

測定結果，確認ATP存在下，6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_011

有抗體濃度依存性ADCC活性。由此結果，可知：不僅犬尿胺酸，介由ATP之抗原與抗體之結合，也能誘導該抗體對表現抗原之細胞之ADCC活性，所以，在成為開關之低分子分子存在下與抗原結合之抗體，其ADCC活性等抗腫瘤活性之功能也可利用成為開關之低分子控制。

從該等結果，可認為在ATP濃度低之正常組織中，對於表現hIL-6R之細胞之ADCC活性誘導弱，在濃度高之腫瘤組織中，對於表現hIL-6R之細胞之ADCC活性誘導強。由以上啟示，藉由投予將ATP作為開關之抗體，對於表現標的抗原之腫瘤組織的藥效可維持，此外，對於表現標的抗原之正常組織的毒性可減輕。

[參考例1]使用人類末梢血單核球作為效應子細胞之待驗抗體之ADCC活性

依以下方法，測定犬尿胺酸依存的與抗原結合之抗體所致之對表現抗原之細胞在不同抗體濃度之ADCC活性。使用人類末梢血單核球(以下稱為人類PBMC)作為效應子細胞測定各待驗抗體之ADCC活性，係以下列方式進行。

(1)人類PBMC溶液之製備

使用預先注有1000單位/ml肝素溶液(NOVO‧HEPARIN 注5千單位、NOVO‧NORDISK)200μl之注射器，從中外製藥(股)公司所屬之健常人自願者(成人男性)抽取末梢血50ml。將使用PBS(-)稀釋為2倍後等分為四的該末梢血，加入預先注入15ml之Ficoll-Paque PLUS並實施離心分離操作之Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)。分注該末梢血後，以2150rpm之速度於室溫進行10分鐘離心分離之操作後的分離管，分取單核球組分層。將以含10%FBS之RPMI-1640(nacalai tesque)(以下稱為10%FBS/RPMI)洗滌一次後的該組分層含有之細胞，懸浮於10%FBS/RPMI中使其細胞密度成為1x10⁷細胞/ml。將該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液，供以後實驗。

(2)標的細胞之製備

於Ba/F3使人類IL-6 receptor強制表現之BaF/hIL6R(Mihara等人(Int.Immunopharmacol.(2005)5,1731-40)3x10⁶細胞，加入0.74MBq之Cr-51。之後於5%二氧化碳中於37℃進行1小時溫育後，將該細胞以10%FBS/RPMI洗滌3次後，於10%FBS/RPMI中懸浮使其細胞密度成為2x10⁵細胞/ml。該細胞懸浮液作為標的細胞，供以後實驗。

(3)犬尿胺酸溶液之製備

將使用PBS(-)稀釋為5mM之L-犬尿胺酸(sigma)，使用10%FBS/RPMI製備為400μM之濃度。該溶液作為犬尿胺酸溶液，供以後試驗。

(4)鉻游離試驗(ADCC活性)

ADCC活性以利用鉻釋出法之專一性鉻游離率評價。首先，將製備為各濃度(0、0.04、0.4、4、40μg/ml)之抗體溶液，各以50μl添加到96井U底板之各井中。其次，於該井接種(2)製備之標的細胞各50μl(1x10⁴細胞/井)。其次，將於該井已各添加(3)製備之犬尿胺酸溶液50μl之板於室溫靜置15分鐘。然後，於各井中，添加(1)製備之人類PBMC溶液各50μl(5x10⁵細胞/井)，於5%二氧化碳培養箱中於37℃靜置4小時之後，進行離心操作。使用蓋氏計數器測定該板之各井中之100μl之培養上清之放射活性。依下式求取專一性鉻游離率。

鉻游離率(%)=(A-C)×100/(B-C)

上式中，A代表各井中之100μl培養上清之放射活性(cpm)之平均值。又，B代表對標的細胞添加50μl之4% NP-40水溶液(Nonidet P-40、NACALAI TESQUE)及100μl之10% FBS/RPMI之井中之100μl培養上清之放射活性(cpm)之平均值。再者，C代表對標的細胞添加150μl之10% FBS/RPMI或100μl之10% FBS/RPMI及50μl之犬尿胺酸溶液之井中之100μl培養上清之放射活性(cpm)之平均值。試驗以二重複實施，計算反映各待驗抗體之ADCC活性之前述試驗中的專一的鉻游離率(%)的平均值。

[參考例2]使用人類末梢血單核球作為效應子細胞之各待驗抗體之ADCC活性

依以下方法，測定犬尿胺酸依存的與抗原結合之抗體所致之對表現抗原之細胞在不同犬尿胺酸濃度之ADCC活性。使用人類末梢血單核球作為效應子細胞之各待驗抗體所致之ADCC活性，如以下方式測定。又，人類PBMC溶液、及標的細胞，依與參考例1相同方法製備。

(1)犬尿胺酸溶液之製備

將使用PBS(-)稀釋為5mM之L-犬尿胺酸(sigma)，使用10%FBS/RPMI製備為1200、400、133、44、14.8、4.9μM之濃度。該溶液作為犬尿胺酸溶液，供以後試驗。

(2)鉻游離試驗(ADCC活性)

ADCC活性以利用鉻釋出法之專一性鉻游離率評價。首先，將製備為200μg/ml之抗體溶液，各以50μl添加到96井U底板之各井中。其次，於該井接種前述標的細胞50μl(1x10⁴cells/井)。其次，將於該井已各添加(1)製備之各濃度之犬尿胺酸溶液50μl之板於室溫靜置15分鐘。然後，於各井中，添加前述人類PBMC溶液各50μl(5x10⁵細胞/井)，於5%二氧化碳培養箱中於37℃靜置4小時之後，進行離心操作。使用蓋氏計數器測定該板之各井中之100μl之培養上清之放射活性。依參考例1記載之式求取專一性鉻游離率。

[參考例3]使用人類NK細胞株NK92作為效應子細胞之各受測抗體之ADCC活性

依以下方法，測定ATP依存性地與抗原結合之抗體對表現抗原之細胞在不同抗體濃度時之ADCC活性。

使用使人類NK細胞株NK92強制表現人類FcgRIIIa而得之NK92-CD16(V)作為效應子細胞，依以下方式測定各受測抗體之ADCC活性。

(1)NK92-CD16(V)之製備

將NK92-CD16(V)懸浮於10%FBS/RPMI中使其細胞密度成為1x10⁷細胞/ml。定該細胞懸浮液為NK92-CD16(V)溶液，供以後之實驗。

(2)標的細胞之製備

對於使CHO強制表現人類IL-6受體之CHO/hIL6R 3x10⁶細胞加入0.74MBq之Cr-51。之後於5%二氧化碳培養箱中於37℃進行1小時溫育後，以10%FBS/D-MEM洗滌細胞3次，並將該細胞懸浮於10%FBS/RPMI中使其細胞密度成為2x10⁵細胞/ml。將該細胞懸浮液作為標的細胞，供以後實驗。

(3)ATP溶液之製備

將使用10%FBS/RPMI稀釋為100mM之ATP(sigma)調整為4mM之濃度。將該溶液作為ATP溶液，供以後之試驗。

(4)鉻游離試驗(ADCC活性)

ADCC活性以利用鉻釋出法之專一性鉻游離率評價。首先，將製備為各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)之抗體溶液，各以50μl添加到96井U底板之各井中。其次，接種(2)製備之標的細胞50μl(1x10⁴cells/井)，於室溫靜置15分鐘。於各井中，將添加有於(1)製備之NK92-CD16(V)溶液各50μl(5x10⁵cells/井)之該板，於5%二氧化碳培養箱中於37℃靜置4小時之後，進行離心操作。使用蓋氏計數器測定該板之各井中之100μl之培養上清之放射活性。依參考例1記載之式求取專一性鉻游離率。

<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)

<120> 標的組織專一的抗原結合分子(ANTIGEN BINDING MOLECULES SPECIFIC AT TARGET TISSUES)

<130> C1-A1204Y1-TWD1

<150> JP 2012-123781

<151> 2012-05-30

<150> JP 2012-177311

<151> 2012-08-09

<160> 126

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 梭菌屬(Clostridium sp.)

<400> 4

<210> 5

<211> 330

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 5

<210> 6

<211> 326

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 6

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<211> 377

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 7

<210> 8

<211> 327

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1125)

<400> 9

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<211> 374

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 10

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<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

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<400> 11

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 12

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<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

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<400> 13

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<211> 291

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

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<400> 17

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<211> 233

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 18

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 19

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<211> 4

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 21

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 22

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 24

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 26

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 27

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 28

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 29

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 30

<210> 31

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 31

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<210> 33

<211> 213

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 33

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<211> 443

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 34

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 35

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<211> 453

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<211> 213

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<211> 446

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 38

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<211> 220

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

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<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

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<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

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<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

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<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

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<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

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<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

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<210> 54

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<211> 217

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<211> 30

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 56

<210> 57

<211> 14

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 57

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<211> 50

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> n is a,c,g,or t

<400> 64

<210> 65

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> n is a,c,g,or t

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<211> 50

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<211> 50

<212> DNA

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<220>

<223> 人工合成之序列

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<220>

<223> 人工合成之序列

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

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<220>

<223> 人工合成之序列

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<212> DNA

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<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 71

<210> 72

<211> 55

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 72

<210> 73

<211> 44

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 73

<210> 74

<211> 40

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 74

<210> 75

<211> 40

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n is a,c,g,or t

<400> 75

<210> 76

<211> 40

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(27)

<223> n is a,c,g,or t

<400> 76

<210> 77

<211> 40

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 77

<210> 78

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 80

<210> 81

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 81

<210> 82

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 82

<210> 83

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 83

<210> 84

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 84

<210> 85

<211> 109

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 85

<210> 86

<211> 123

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 86

<210> 87

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 87

<210> 88

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 90

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<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 91

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<211> 119

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 92

<210> 93

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 93

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<211> 328

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 94

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 95

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<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 96

<210> 97

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 97

<210> 98

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 98

<210> 99

<211> 233

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 99

<210> 100

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 100

<210> 101

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 101

<210> 102

<211> 25

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 102

<210> 103

<211> 27

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 103

<210> 104

<211> 18

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 104

<210> 105

<211> 18

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 105

<210> 106

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 106

<210> 107

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 107

<210> 108

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 108

<210> 109

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 109

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 110

<210> 111

<211> 18

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 111

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人工合成之序列

<400> 112

<210> 113

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 113

<210> 114

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 114

<210> 115

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 115

<210> 116

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 116

<210> 117

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 117

<210> 118

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 118

<210> 119

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 119

<210> 120

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 120

<210> 121

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 121

<210> 122

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 122

<210> 123

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 123

<210> 124

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 124

<210> 125

<211> 122

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 125

<210> 126

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 126

Claims

一種抗原結合分子，其包含因應標的組織專一性的化合物的濃度而改變對抗原的結合活性之抗原結合分域，其中該抗原結合分域包含一抗體重鏈可變區及一抗體輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1項之抗原結合分子，其中，該標的組織為癌組織。
如申請專利範圍第2項之抗原結合分子，其中，該癌組織專一性的化合物，係癌細胞專一的代謝產物、於癌組織浸潤之免疫細胞專一的代謝產物、癌組織之基質細胞專一的代謝產物。
如申請專利範圍第1項之抗原結合分子，其中，該標的組織為發炎性組織。
如申請專利範圍第4項之抗原結合分子，其中，該發炎組織專一性的化合物，係於發炎性組織浸潤之免疫細胞專一的代謝產物、發炎組織中受傷害之正常細胞專一的代謝產物。
如申請專利範圍第1項之抗原結合分子，其中，該化合物係選自於具嘌呤環結構之核苷、胺基酸及其代謝產物、脂質及其代謝產物、或糖代謝之一次代謝產物、菸鹼醯胺及其代謝產物中之至少一種化合物。
如申請專利範圍第6項之抗原結合分子，其中，該化合物係選自於腺苷、腺苷3磷酸、肌苷、丙胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、犬尿胺酸、前列腺素E2、琥珀酸、檸檬酸、或1- 甲基菸鹼醯胺中之至少一種化合物。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原為膜型分子。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子，其係具有中和活性之抗原結合分子。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子，其係具有細胞傷害活性之抗原結合分子。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子，其包含Fc區。
如申請專利範圍第11項之抗原結合分子，其中，該Fc區係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區。
如申請專利範圍第11項之抗原結合分子，其中，該Fc區包含對Fcγ受體之結合活性高於對天然型人類IgG之Fc區的Fcγ受體之結合活性的FcγR結合改變Fc區。
如申請專利範圍第13項之抗原結合分子，其包含該FcγR結合改變Fc區之胺基酸序列之中選自下列EU編號表示之胺基酸之群組的至少一種以上之胺基酸不同於天然型人類IgG之Fc區之胺基酸的胺基酸：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、 272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位。
如申請專利範圍第14項之抗原結合分子，其包含該FcγR結合改變Fc區之胺基酸序列之中選自下列EU編號所示之群的至少一個以上的胺基酸：221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr 中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、 Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、 280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、 318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、 392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、或440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者。
如申請專利範圍第11項之抗原結合分子，其中，該Fc區為以提高Fc區之EU編號297位所結合的糖鏈之組成結合岩藻醣缺損糖鏈之Fc區的比例、或者提高加成有二分化N-乙醯基葡糖胺之Fc區的比例之方式修飾的Fc區。
如申請專利範圍第11項之抗原結合分子，其中，該Fc區於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性被增強高於序列編號：5、6、7、或8中之任一者表示之Fc區對FcRn之結合活性。
如申請專利範圍第17項之抗原結合分子，其中，該Fc區係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區的胺基酸序列中選自下列EU編號表示之群的至少一個以上的胺基酸被取代之Fc區，238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、 286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位、或447位。
如申請專利範圍第18項之抗原結合分子，其中，該Fc區係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區的胺基酸序列中選自下列EU編號表示之群的至少一個以上的胺基酸：238位之胺基酸為Leu、244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或251位之胺基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、Gln、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或Trp中之任一者、309位之胺基酸為Pro、312位之胺基酸為Ala、Asp、或Pro中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、 332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、Asn、或Val中之任一者、380位之胺基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中之任一者382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、308位之胺基酸為Ile、Pro、或Thr中之任一者。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分域係多重專一性或多重抗原結合位之抗原結合分域。
如申請專利範圍第20項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分域之中，至少一個抗原結合分域結合之抗原為癌細胞之細胞膜表現之膜型分子，且至少一個抗原結合分域結合之抗原為效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子。
如申請專利範圍第21項之抗原結合分子，其中，該效應子細胞為NK細胞、巨噬體、或T細胞。
如申請專利範圍第21或22項之抗原結合分子，其中，於該效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子，係構成TCR之多胜肽、CD2、CD3、CD28、CD44、CD 16、CD32、CD64、或NKG2D。
如申請專利範圍第20項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分域之中，至少一個抗原結合分域結合之抗原為癌細胞細胞膜表現之膜型分子、且至少一個抗原結合分域結合之抗原為細胞傷害性物質。
如申請專利範圍第20項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子係抗體片段。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子為抗體。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原為可溶型分子。
如申請專利範圍第27項之抗原結合分子，其係具有中和活性之抗原結合分子。
如申請專利範圍第27項之抗原結合分子，其包含Fc區。
如申請專利範圍第29項之抗原結合分子，其中，該Fc區係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區。
如申請專利範圍第29項之抗原結合分子，其中，該Fc區於pH酸性域條件下對FcRn之結合活性被增強高於序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區對FcRn之結合活性。
如申請專利範圍第31項之抗原結合分子，其中，該Fc區係於序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區的胺基酸序列之中選自下列EU編號表示之群的至少一個以上之胺基酸被取代之Fc區：238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位、或447位。
如申請專利範圍第32項之抗原結合分子，其中，該Fc區係於序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區的胺基酸序列之中選自下列EU編號表示之群組中之至少一個以上之胺基酸；238位之胺基酸為Leu、244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或251位之胺基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、 254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、Gln、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或Trp中之任一者、309位之胺基酸為Pro、 312位之胺基酸為Ala、Asp、或Pro中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、Asn、或Val中之任一者、380位之胺基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中之任一者382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、308位之胺基酸為Ile、Pro、或Thr中之任一者。
如申請專利範圍第29項之抗原結合分子，其中，該Fc區於pH中性域下對FcRn之結合活性被增強高於序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區對FcRn之結合活性增強。
如申請專利範圍第34項之抗原結合分子，其中，該Fc區係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區的胺基酸序列之中選自下列EU編號表示之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區：237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位或436位。
如申請專利範圍第35項之抗原結合分子，其中，該Fc區係序列編號：5、6、7、或8記載之不變區含有之Fc區之胺基酸序列之中選自下列EU編號表示之群組中之至少一個以上之胺基酸；237位之胺基酸為Met、248位之胺基酸為Ile、250位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Thr、255位之胺基酸為Glu、256位之胺基酸為Asp、Asn、Glu、或Gln中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中之任一者、258位之胺基酸為His、 265位之胺基酸為Ala、286位之胺基酸為Ala或Glu中之任一者、289位之胺基酸為His、297位之胺基酸為Ala、303位之胺基酸為Ala、305位之胺基酸為Ala、307位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、308位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中之任一者、311位之胺基酸為Ala、His、或Ile中之任一者、312位之胺基酸為Ala或His中之任一者、314位之胺基酸為Lys或Arg中之任一者、315位之胺基酸為Ala、Asp或His中之任一者、317位之胺基酸為Ala、332位之胺基酸為Val、334位之胺基酸為Leu、360位之胺基酸為His、376位之胺基酸為Ala、380位之胺基酸為Ala、382位之胺基酸為Ala、 384位之胺基酸為Ala、385位之胺基酸為Asp或His中之任一者、386位之胺基酸為Pro、387位之胺基酸為Glu、389位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者、424位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、433位之胺基酸為Lys、434位之胺基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為His、Ile、Leu、Phe、Thr、或Val。
如申請專利範圍第29或31至36項中任一項之抗原結合分子，其中，該Fc區為對抑制型Fcγ受體之結合活性高於對活性型Fcγ受體之結合活性的Fc區。
如申請專利範圍第37項之抗原結合分子，其中，該抑制型Fcγ受體係人類FcγRIIb。
如申請專利範圍第37項之抗原結合分子，其中，該活性型Fcγ受體，係人類FcγRIa、人類FcγRIIa(R)、人類FcγRIIa(H)、人類FcγRIIIa(V)或人類FcγRIIIa(F)。
如申請專利範圍第37項之抗原結合分子，其中，包含該Fc區之EU編號表示之238位或328位之胺基酸不同於天然型人類IgG之Fc區之胺基酸的胺基酸。
如申請專利範圍第40項之抗原結合分子，其中，該Fc區之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp，或328位之胺基酸為Glu。
如申請專利範圍第40或41項之抗原結合分子，其為該Fc區之胺基酸序列之中選自下列EU編號表示之群組中之至少一個以上之胺基酸：233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Trp、或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、267位之胺基酸為Ala、Gln或Val中之任一者、268位之胺基酸為Asn、Asp、或Glu中之任一者、271位之胺基酸為Gly、326位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Leu、Met、Ser或Thr中之任一者、330位之胺基酸為Arg、Lys、或Met中之任一者、323位之胺基酸為Ile、Leu、或Met中之任一者、或296位之胺基酸為Asp。
如申請專利範圍第27項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子為抗體。
一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1至43項中任一項之抗原結合分子。