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TW201816117A - 一種用於生產葡萄糖胺的培養基及其應用 - Google Patents

一種用於生產葡萄糖胺的培養基及其應用 Download PDF

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TW201816117A
TW201816117A TW105134738A TW105134738A TW201816117A TW 201816117 A TW201816117 A TW 201816117A TW 105134738 A TW105134738 A TW 105134738A TW 105134738 A TW105134738 A TW 105134738A TW 201816117 A TW201816117 A TW 201816117A
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吳和生
陳建豪
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元智大學
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Abstract

本發明關於一種用於生產葡萄糖胺的培養基，包含：25-500 g/L 糖蜜(molasses)、0.01-100 g/L 大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25-100 g/L 玉米漿(Corn Steep Liquor)、0.1-2 g/L七水硫酸鎂(MgSO4 . 7H2 O)、0.1-0.5 g/L硝酸鋁(Al(NO3 )3 )，以及1-5 mL/L甲醇(Methanol)。本發明並關於一種生產葡萄糖胺的方法，包含：提供一產生葡萄糖胺的微生物，以及將該微生物置於上述培養基中進行醱酵培養。

Description

一種用於生產葡萄糖胺的培養基及其應用
本發明係關於一種用於生產葡萄糖胺的培養基，特別是一種使用糖蜜作為碳源，以及使用大豆水解物作為氮源，以降低生產成本，提高葡萄糖胺產率的培養基及其應用。
在醫學上，葡萄糖胺已被大量用於治療骨關節炎，能夠有效作用於軟骨組織治療風濕性關節炎，其次葡萄糖胺對白血病癌細胞具有抑制作用，還有消炎護肝的功效。葡萄糖胺在食品保健領域也有著廣泛的應用，在一些歐美國家葡萄糖胺被視為天然無害的食品及保健品配方而得到大量推廣。
生產葡萄糖胺的方法主要有3種：酸水解法、酵素分解法及微生物醱酵法。傳統製備葡萄糖胺主要是利用化學法或酵素法裂解幾丁聚醣而得，傳統的化學法一般是以強酸(鹽酸、硝酸)對幾丁質或幾丁聚醣進行水解，而水解時間與溫度及製成率有關，然而高濃度的強酸使用，容易引起廢液處理的問題。
以酵素法來生成幾丁寡醣比較少廢液處理的問題，具有較高的選擇性，目前常用的酵素有幾丁質酵素(chitinase)、幾丁聚醣酵素(chitosanase)這兩種，但是這兩種酵素價格高，原料(幾丁質或幾丁聚醣)不溶於中性的水中，因此水解速率非常低，再加上利用酵素法來生成幾丁寡醣的成本高、成份穩定度低、需要較長的反應時間才能獲得較高的產率，所以仍然無法商業化。
在目前工業上生產葡萄糖胺仍是使用蝦蟹殼於鹽酸溶液中進行水解，但不同來源的蝦蟹殼是否會影響葡萄糖胺的純度，以及當被污染的蝦蟹殼其製造出的葡萄糖胺是否不具有毒性，況且水解反應前須將蝦蟹殼進行前處理沖洗以免發臭，為了減少前處理繁瑣的步驟以及在臨床應用過程中會引起過敏體質患者的過敏反應，為減少人體服用後的過敏副作用後遺症考量，選擇利用微生物生產方式代替傳統的化學法。
微生物醱酵法是以微生物在生物反應器發酵培養而得葡萄糖胺。微生物發酵過程並不太會受到反應器的限制，所以微生物醱酵法生產葡萄糖胺得到了越來越多研究者的關注。相較於酸水解法與酵素分解法， 微生物醱酵法生產葡萄糖胺具有消除了地域季節對原料來源的限制、產品無魚腥味、無重金屬污染、生產週期短、供應強度高、對環境污染較小、不產生過敏反應。以微生物醱酵法生產葡萄糖胺可改良工業上以化學法生產葡萄糖胺的諸多缺失，然而以微生物法進行葡萄糖胺之產量無法大幅提升，且培養基成本無法降低。因此，開發低生產成本的培養基以進行微生物醱酵法生產葡萄糖胺，是必要且刻不容緩的事。
本發明於第一部份提供一種用於生產葡萄糖胺的培養基，包含：25-500 g/L 糖蜜(molasses)、0.01-100 g/L 大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25-100 g/L 玉米漿(Corn Steep Liquor)、0.1-2 g/L七水硫酸鎂(MgSO4 . 7H2 O)、0.1-0.5 g/L硝酸鋁(Al(NO3 )3 )，以及1-5 mL/L甲醇(Methanol)。
本發明於第二部份提供一種生產葡萄糖胺的方法，包含： 提供一產生葡萄糖胺的微生物；以及 將該微生物置於含有糖蜜的培養基中進行醱酵培養；且 其中該含有糖蜜的培養基包含：25-500 g/L 糖蜜、0.01-100 g/L 大豆水解物或0.25-100 g/L 玉米漿、0.1-2 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1-0.5 g/L Al(NO3 )3 ，以及1-5 mL/L甲醇。
本發明首先提供一種用於生產葡萄糖胺的低成本培養基，以糖蜜作為碳源，以大豆水解物或玉米漿作為氮源，其組成份包含：25-500 g/L糖蜜、0.01-100 g/L大豆水解物或0.25-100 g/L 玉米漿、0.1-2 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1-0.5 g/L Al(NO3 )3 ，以及1-5 mL/L甲醇。
在某些具體實施例中，該糖蜜為預處理過的糖蜜，預處理的方法為糖蜜原液與水以 0.5 : 1 至 5 : 1 的體積比混和，靜置分層後，分離上層糖蜜溶液為預處理過的糖蜜。在某些具體實施例中，糖蜜原液與水混合的比例較佳為 0.5 : 1、1 : 1、1.5 : 1、2 : 1、2.5 : 1、3 : 1、3.5 : 1、4 : 1、4.5 : 1，或 5 : 1。
在某些實施例中，糖蜜的濃度為25-500 g/L。在某些具體實施例中，糖蜜的濃度較佳為25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475，或 500 g/L。
在某些實施例中，大豆水解物的濃度為0.01-100 g/L。在某些具體實施例中，大豆水解物的濃度較佳為0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或 100 g/L。
在某些實施例中，玉米漿的濃度為0.25-100 g/L。在某些具體實施例中，玉米漿的濃度較佳為0.25、0.50、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或 100 g/L。
在某些具體實施例中，MgSO4 . 7H2 O的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9，或 2 g/L。
在某些具體實施例中，Al(NO3 )3 的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4，或 0.5 g/L。
在某些具體實施例中，甲醇的濃度為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或 5 mL/L。
本發明於第二部份提供一種生產葡萄糖胺的方法，包含： 提供一產生葡萄糖胺的微生物；以及 將該微生物置於含有糖蜜的培養基中進行醱酵培養；且 其中該含有糖蜜的培養基包含：25-500 g/L 糖蜜、0.01-100 g/L 大豆水解物或0.25-100 g/L 玉米漿、0.1-2 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1-0.5 g/L Al(NO3 )3 ，以及1-5 mL/L甲醇。
在某些具體實施例中，該產生葡萄糖胺的微生物包含但不限於，傘枝犁頭黴菌(Absidia coerulea )、喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii )，以及印度毛黴菌(Mucor indicus )。
在某些具體實施例中，該糖蜜為預處理過的糖蜜，預處理的方法為糖蜜原液與水以 0.5 : 1 至 5 : 1 的體積比混和，靜置分層後，分離上層糖蜜溶液為預處理過的糖蜜。在某些具體實施例中，糖蜜原液與水混合的比例較佳為 0.5 : 1、1 : 1、1.5 : 1、2 : 1、2.5 : 1、3 : 1、3.5 : 1、4 : 1、4.5 : 1，或 5 : 1。
在某些實施例中，糖蜜的濃度為25-500 g/L。在某些具體實施例中，糖蜜的濃度較佳為25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475，或 500 g/L。
在某些實施例中，大豆水解物的濃度為0.01-100 g/L。在某些具體實施例中，大豆水解物的濃度較佳為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或 100 g/L。
在某些實施例中，玉米漿的濃度為0.25-100 g/L。在某些具體實施例中，玉米漿的濃度較佳為0.25、0.50、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或 100 g/L。
在某些具體實施例中，MgSO4 . 7H2 O的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9，或 2 g/L。
在某些具體實施例中，Al(NO3 )3 的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4，或 0.5 g/L。
在某些具體實施例中，甲醇的濃度為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或 5 mL/L。
在某些具體實施例中，該醱酵培養的溫度為25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49，或50°C。
在某些具體實施例中，該醱酵培養環境的酸鹼值為pH 4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，或9。
在某些具體實施例中，該醱酵培養的轉速為200、225、250、275、300、325、350、375，或400 rpm。
在某些具體實施例中，該醱酵培養的時間為48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230，或240小時。
於本發明中所使用之單數形式「一」、及「該」包含複數形式，除非文中另有清楚指明者。因此，例如，當提及「一樣本」時，包含複數個該等樣本及對該領域具有通常技藝者所知之同等物。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例限制。
實施例一 糖蜜的前處理對真菌生長的影響
糖蜜原液為甘蔗製造實糖的加工過程副產物，一般為棕黑色之濃稠液體，含有豐富的營養物質，但可能因為加工過程中鍋爐設備老舊的問題，因此成品當中通常富含金屬離子，過高的金屬離子可能會影響真菌的生長，進而影響葡萄糖胺的產量。因此，本實施例比較進行前處理的糖蜜與未進行前處理的糖蜜原液，對真菌生長的影響。
一、糖蜜的前處理
將糖蜜與水以1:1的比例混和，不斷攪拌直到完全溶解，再置於4°C下靜置保存，靜置24小時之後，便可發現糖蜜有分層的現象，上層為黑棕色的液體，下層為棕色之泥狀物，體積比例約為9:1，收集上層液體置於4°C下保存。
二、真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方式如下：先將試驗菌株以M300 Sb5 AlMeA固態培養基[300 mL/L (相當於約163 g/L)前處理過的糖蜜(treated molasses)、5 mL/L (相當於約2.81 g/L)大豆水解物(soy bean hydrolysate)、0.1 g/L七水硫酸鎂(MgSO4 . 7H2 O)、0.1 g/L硝酸鋁(Al(NO3 )3 )、1 mL/L甲醇(Methanol)，以及20 g/L瓊脂(Agar)] 於30°C下，以三區劃線培養進行一次活化7天，再將形成單一菌落的試驗菌株置入內含 150 mL 己滅菌的M300 Sb5 AlMe液態培養基(300 mL/L treated molasses、5 mL/L soy bean hydrolysate、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 ，1 mL/L Methanol)的250 mL 搖瓶，進行二次活化，以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下培養 5天。
接著，取二次活化後的試驗菌株15 mL 菌液，接種到含有150 mL的M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L未處理過的糖蜜原液或前處理過的糖蜜 (molasses stock or treated molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 ，以及1 mL/L Methanol，pH 7] 的250 mL 搖瓶中，以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下進行醱酵培養。此時培養基中使用的糖蜜分為兩種，一為未處理過的糖蜜原液(molasses stock)，一為前處理過的糖蜜(treated molasses)。試驗結果顯示，使用未處理過的糖蜜原液進行醱酵培養，真菌無法生長；而使用前處理過的糖蜜進行發酵培養，真菌生長良好。
三、糖蜜成分分析
將未處理過的糖蜜原液與前處理過的糖蜜進行營養成分分析[委託台美檢驗科技有限公司(台北，台灣)進行]，結果如表一所示。由表一成分分析結果可知，本發明的前處理步驟可以有效降低糖蜜中金屬離子的含量，以解決過多的金屬離子影響真菌生長的問題，且前處理過的糖蜜所含的適量金屬離子可以幫助真菌生長，有利於葡萄糖胺的生產。本發明其他實施例所用的糖蜜皆指前處理過的糖蜜。 【表一】糖蜜原液與前處理過的糖蜜的成分分析表
實施例二 不同的糖蜜濃度對真菌生長的影響
一、真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株亦為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株15 mL菌液，接種到分別各含有150 mL的以下培養基之一的搖瓶中： (1) M200 Sb5 AlMe 液態培養基[200 mL/L molasses (相當於約110.8 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]；以及 (2) M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]。 並以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
二、葡萄糖胺鑑定分析
醱酵培養5天後收集菌液，經抽氣過濾後得菌塊，將菌塊取樣以60°C烘乾，稱得乾菌重(biomass)後，取1 g乾菌並加入10 mL 6N HCl 於85°C震盪水槽中水浴反應6小時，得到含葡萄糖胺之液體。待該液體冷卻後加入10 mL超純水，以10 N的NaOH將反應液中和至pH 7，再以抽氣過濾收集液體，取0.2 mL至試管中，加入 0.2 mL二硝基苯乙腈(3,5-Dinitrobenzonitrile acetonitrile)溶液作為內部標準品，再加入0.6 mL 40 mol/m3 1-萘基異硫氰酸酯吡啶(1-naphthyl isothiocyanate pyridine)溶液，於50°C之震盪水槽中水浴反應1小時，反應後取5 μL進行葡萄糖胺鑑定分析。
以高效液相層析技術(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)進行葡萄糖胺鑑定分析，HPLC分析條件如下： HPLC pump：Shimadzu LC-20A 偵測器：Shimadzu Model SPD-10A UV-VIS index detector 管柱：Merck Purospher® STAR Rp-18 endcapped (5μm)，250 x 4 mm I.D. 移動相：Water/Acetonitrile (85/15) 流速：1.1 mL /min UV偵測波長：230nm。
再依葡萄糖胺鹽酸鹽衍生物對內部標準品波峰面積比，代入以葡萄糖胺鹽酸鹽衍生物對內部標準品波峰面積比之葡萄糖胺鹽酸鹽檢量線，以內插法求得葡萄糖胺的克數，換算出葡萄糖胺濃度(Glucosamine Concentration，g葡萄糖胺/L)以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量(Glucosamine Content，g葡萄糖胺/g乾菌重)。結果如圖一所示，在本實施例中，當糖蜜的濃度增加時，真菌的生物量會大幅的成長，且每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量也增加，因此每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度也會增加。
實施例三 不同的硝酸鋁濃度對真菌生長的影響
一、真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株亦為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株15 mL菌液，接種到分別各含有150 mL的以下培養基之一的搖瓶中： (1) M300 Sb5 Me 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； (2) M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； (3) M300 Sb5 Al2 Me 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.2 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； (4) M300 Sb5 Al4 Me 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.4 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； (5) M300 Sb5 Al5 Me 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.5 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]；以及 (6) M300 Sb5 Al10 Me 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； 並以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
二、葡萄糖胺鑑定分析
菌液的處理以及HPLC分析方法、條件皆同實施例二所述，測得的生物量、每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度結果如圖二所示。
在本實施例中，微量的硝酸鋁可以有效地增加每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度，但是隨著硝酸鋁濃度的增加，真菌的生物量受到了負面的影響而減少，進而影響到每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度。因此，考量到葡萄糖胺的產量，培養基中的硝酸鋁濃度以0.1-0.5 g/L為宜，而以0.1 g/L為最佳，此時每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度最高。
實施例四 不同的甲醇濃度對真菌生長的影響
一、真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株亦為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株15 mL菌液，接種到分別各含有150 mL的以下培養基之一的搖瓶中： (1) M300 Sb5 Al液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、0 mL/L Methanol，pH 7]； (2) M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； (3) M300 Sb5 AlMe2 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、2 mL/L Methanol，pH 7]； (4) M300 Sb5 AlMe5 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、5 mL/L Methanol，pH 7]； (5) M300 Sb5 AlMe10 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、10 mL/L Methanol，pH 7]； 並以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
二、葡萄糖胺鑑定分析
菌液的處理以及HPLC分析方法、條件皆同實施例二所述，測得的生物量、每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度結果如圖三所示。
在本實施例中，微量的甲醇可以有效地增加每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度，但是隨著甲醇濃度的增加，真菌的生物量受到了負面的影響而減少，進而影響到每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度。因此，考量到葡萄糖胺的產量，培養基中可添加的甲醇濃度以1-5 mL/L為宜，甲醇濃度高達10 mL/L (1%)時，會抑制真菌的生長，葡萄糖胺濃度顯著下降。
實施例五 不同的培養基組合對真菌生長的影響
一、 真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株亦為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株15 mL菌液，接種到分別各含有150 mL的以下培養基之一的搖瓶中： (1) M300 Sb5 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O，pH 7]； (2) M300 Sb5 Al 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 ，pH 7]； (3) M300 Sb5 Me 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、1 mL/L Methanol，pH 7]； (4) M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； 並以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
二、 葡萄糖胺鑑定分析
菌液的處理以及HPLC分析方法、條件皆同實施例二所述，測得的生物量、每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度結果如圖四所示。
在本實施例的比較中，以M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol]培養的真菌的生物量最多，且其每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度最高。
實施例六 不同的培養基對真菌在搖瓶中生長的影響
一、 真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株分別為傘枝犁頭黴菌(Absidia coerulea BCRC32931，新竹，台灣)、喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)，以及印度毛黴菌(Mucor indicus BCRC32158，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株15 mL菌液，接種到分別各含有150 mL的以下培養基之一的搖瓶中： (1) M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； (2) GP液態培養基[33.9 g/L 葡萄糖(Glucose)、40.6 g/L 真菌蛋白腖(Mycological-peptone)、0.5 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.5 g/L 磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、0.1 g/L 氯化鈣(CaCl2 )]； (3) WF液態培養基[33.9 g/L 白細砂糖(White fine-granulated sugar)、40.6 g/L Mycological-peptone、0.5 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.5 g/L KH2 PO4 、0.1 g/L CaCl2 ]； (4) YPG液態培養基[20 g/L Glucose、10 g/L Mycological-peptone、1 g/L 酵母萃取物(Yeast extract)、1 g/L 硫酸銨[(NH4 )2 SO4 ]、1 g/L 氯化鈉(NaCl)、0.5 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L CaCl2 )； 並以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
二、葡萄糖胺鑑定分析
菌液的處理以及HPLC分析方法、條件皆同實施例二所述，測得的生物量、每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量、每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度，以及對於醱酵培養之碳源換算求得其產率(Yield)，並與工作天數換算求得生產率(Productivity)，結果如表二所示。
如表二所示，本實施例所使用的三種培養基中，以M300 Sb5 AlMe培養基生產的葡萄糖胺生產成本最低，且對試驗的三個菌種皆適用，可以在最低的成本下，生產出相同產量的葡萄糖胺。另外，本實施例所使用的三種菌株中，以喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii. BCRC 31742)在M300 Sb5 AlMe培養基中培養，可生產成本最低的葡萄糖胺(358.6 NTD/kg-葡萄糖胺)。 【表二】各菌株以不同的培養基經搖瓶培養所產出之葡萄糖胺濃度、葡萄糖胺含量、產率和生產率的比較
實施例七 不同的轉速對真菌在醱酵槽中生長的影響
一、 真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株300 mL 菌液進行攪拌式醱酵槽試驗，將菌液接種至含有3L M300 Sb5 AlMe 液體培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]的醱酵槽中，於30°C下，轉速分別為200、300、400 rpm進行醱酵培養，以外加管線通入空氣，進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
二、葡萄糖胺鑑定分析
菌液的處理以及HPLC分析方法、條件皆同實施例二所述，測得的生物量以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量結果如圖五所示。
在本實施例中得知，在轉速為300 rpm時，真菌的生物量最高，且每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量也最高，葡萄糖胺的生產效率最好。反觀在轉速為200 rpm時，由於轉速過慢通氣不佳使得真菌生產趨於緩慢，而當轉速為400 rpm時，則因轉速太快，不停地將菌塊打散，讓真菌無法快速生長。
實施例八 不同的培養基對真菌在醱酵槽中生長的影響
一、真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株亦為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株300 mL 菌液進行攪拌式醱酵槽試驗，將菌液接種到分別各含有3 L的以下培養基之一的醱酵槽中： (1) M300 Sb5 AlMe 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L Al(NO3 )3 、1 mL/L Methanol，pH 7]； (2) GP液態培養基(33.9 g/L Glucose、40.6 g/L Mycological-peptone、0.5 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.5 g/L KH2 PO4 、0.1 g/L CaCl2 )； (3) WF液態培養基(20 g/L Glucose、10 g/L Mycological-peptone、1 g/L Yeast extract、1 g/L (NH4 )2 SO4 、1 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4 . 7H2 O、0.1 g/L CaCl2 )； 於30°C下、轉速為300 rpm進行醱酵培養，以外加管線通入空氣，進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
二、 葡萄糖胺鑑定分析
菌液的處理以及HPLC分析方法、條件皆同實施例二所述，測得的生物量、每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量、每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度，以及對於醱酵培養之碳源換算求得其產率，並與工作天數換算求得生產率，結果如表三所示。
如表三所示，本實施例所使用的三種培養基中，以M300 Sb5 AlMe培養基生產的葡萄糖胺生產成本最低，可以花費不到其他二種培養基的生產成本的1%而生產相同產量的葡萄糖胺；因此，本發明所提供的含有糖蜜的培養基適合應用於大量製造葡萄糖胺，以降低生產成本。 【表三】以不同的培養基經醱酵槽培養所產出之葡萄糖胺濃度、葡萄糖胺含量、產率和生產率的比較
實施例九　不同的氮源對真菌生長的影響
真菌醱酵試驗
在本實施例中，試驗菌株亦為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台灣)。首先對試驗菌株進行二次活化培養，方法同實施例一所述。
接著，取二次活化後的試驗菌株15 mL菌液，接種到分別各含有150 mL的以下培養基之一的搖瓶中： (1) M300 Sb5 液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O，pH 7]； (2) M300 Sb5 Me液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、5 mL/L soy bean hydrolysate (相當於約2.81 g/L大豆水解物)、0.1 g/L MgSO4 . 7H2 O、1 mL/L Methanol，pH 7]； (3) M300 C20 Me液態培養基[300 mL/L molasses (相當於約163 g/L molasses)、20 mL/L玉米漿(相當於約7.6 g/L)、1 mL/L Methanol，pH 7]； 並以恆溫培養箱在30°C、200 rpm轉速下進行醱酵培養5天，接著進行葡萄糖胺鑑定分析。
在本實施例中，使用二種不同的氮源，一種為大豆水解物，另一種為玉米漿，二者的成份分析如表四所示。 【表四】大豆水解物以及玉米漿的成份分析表
二、葡萄糖胺鑑定分析
菌液的處理以及HPLC分析方法、條件皆同實施例二所述，測得的生物量、每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培養基所生產的葡萄糖胺濃度結果如圖六所示。
在本實施例中，將氮源替換為玉米漿時，雖然生物量較低，但是每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量較M300 Sb5 液態培養基培養的真菌的含量高；而且將氮源替換為玉米漿時，可降低生產成本，甚至較以大豆水解物作為氮源的培養基的生產成本還要低，顯示玉米漿也是理想的氮源。 【表五】喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii )以不同的培養基經搖瓶培養所產出之葡萄糖胺濃度、葡萄糖胺含量、產率和生產率的比較
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
圖一為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同濃度糖蜜的培養基進行搖瓶培養後，所產出的生物量、葡萄糖胺濃度，以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量。
圖二為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同濃度硝酸鋁的培養基進行搖瓶培養後，所產出的生物量、葡萄糖胺濃度，以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量。
圖三為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同濃度甲醇的培養基進行搖瓶培養後，所產出的生物量、葡萄糖胺濃度，以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量。
圖四為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以不同培養基組成進行搖瓶培養後，所產出的生物量、葡萄糖胺濃度，以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量。
圖五為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以不同轉速進行醱酵槽培養後，所產出的生物量以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量。
圖六為喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同氮源的培養基組成進行搖瓶培養後，所產出的生物量、葡萄糖胺濃度，以及每克乾菌重所含的葡萄糖胺含量。

Claims (9)

  1. 一種用於生產葡萄糖胺的培養基，包含： 25-500 g/L 糖蜜(molasses)； 0.01-100 g/L 大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25-100 g/L玉米漿(Corn Steep Liquor)； 0.1-2 g/L七水硫酸鎂(MgSO4 . 7H2 O)； 0.1-0.5 g/L硝酸鋁(Al(NO3 )3 )；以及 1-5 mL/L甲醇(Methanol)。
  2. 如申請專利範圍第1項之培養基，其中該糖蜜為預處理過的糖蜜，預處理的方法為糖蜜原液與水以 0.5 : 1 至 5 : 1 的體積比混和，靜置分層後，分離上層糖蜜溶液為預處理過的糖蜜。
  3. 一種生產葡萄糖胺的方法，包含： 提供一產生葡萄糖胺的微生物；以及 將該微生物置於含有糖蜜的培養基中進行醱酵培養；且 其中該含有糖蜜的培養基包含：25-500 g/L 糖蜜(molasses)、0.01-100 g/L 大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25-100 g/L玉米漿(Corn Steep Liquor)、0.1-2 g/L七水硫酸鎂(MgSO4 . 7H2 O)、0.1-0.5 g/L硝酸鋁(Al(NO3 )3 )，以及1-5 mL/L甲醇(Methanol)。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該產生葡萄糖胺的微生物選自下列所組成之群組：傘枝犁頭黴菌(Absidia coerulea )、喜多氏麴黴(Aspergillus sydowii )，以及印度毛黴菌(Mucor indicus )。
  5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該糖蜜為預處理過的糖蜜，預處理的方法為糖蜜原液與水以 0.5 : 1 至 5 : 1 的體積比混和，靜置分層後，分離上層糖蜜溶液為預處理過的糖蜜。
  6. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該醱酵培養的溫度為25 – 50°C。
  7. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該醱酵培養環境的酸鹼值為pH 4-9。
  8. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該醱酵培養的轉速為200 – 400 rpm。
  9. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該醱酵培養的時間為48 – 240小時。
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