TW201815817A

TW201815817A - 分子修飾體脂聯素及包含分子修飾體脂聯素之醫藥組合物

Info

Publication number: TW201815817A
Application number: TW106133580A
Authority: TW
Inventors: 柴田玲; 室原豊明; 上藤洋敬; 與那嶺育子; 新川武; 瀬脇智満; 岩田効志
Original assignee: 國立大學法人名古屋大學; 日商大塚製藥工場股份有限公司
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2018-05-01
Also published as: JP2019205355A; WO2018062175A1

Abstract

本發明之目的在於提供一種可製造出均一之製品，且具有與天然之脂聯素同等以上之活性之分子修飾體脂聯素。本發明藉由形成如下融合蛋白質而製作分子修飾體脂聯素，該融合蛋白質包含母系蛋白家族蛋白質之捲曲螺旋區之類的三聚物化區、與脂聯素之球狀區域者。

Description

分子修飾體脂聯素及包含分子修飾體脂聯素之醫藥組合物

本發明係關於一種分子修飾體脂聯素。更詳細而言，關於一種包含脂聯素之C末端側球狀區域、與母系蛋白之捲曲螺旋區域的分子修飾體脂聯素。

已知因高脂肪食物或運動不足所引起之肥胖不僅會促進新陳代謝症候群或糖尿病等之發病及惡化，亦會增加心血管疾病之風險。尤其在日本，心臟疾病及腦血管疾病占死因之約27%，心血管疾病成為三大死因之一。近年來，心血管疾病隨著因飲食生活或生活習慣之變化所引起之肥胖、及運動不足而增加。例如在日本，急性心肌梗塞之發病人數推定為每年約25萬人，推定其中約有30%死亡。又，接受缺血性心臟病(狹心症及心肌梗塞)之持續醫療之患者人數推定為約90萬人。於缺血性心臟病之治療中，可進行心臟導管治療，但對於自發病起經過6小時以上、或肥胖症或糖尿病患者而言，尤其是無法預見心肌梗塞之病灶縮小之情形較多。因此，除目前所採用之心臟導管治療以外，業界亦期待開發出作為輔助治療之藥劑。脂聯素係於1996年發現之由脂肪細胞特異性地表現並分泌之一種脂肪細胞激素。脂聯素與其他激素相比，極大量地存在於血漿中。已知脂聯素有各種功能，除控制葡萄糖水準、或控制包括脂肪酸分解在內之代謝過程，亦與動脈硬化抑制、心臟保護作用、心肌梗塞之病灶縮小、損傷之血管之修復、巨噬細胞對血管壁之接著、LDL(low density lipoprotein，低密度脂蛋白)之吞噬抑制等相關。脂聯素之血中濃度之降低係伴隨肥胖之新陳代謝症候群、糖尿病、心血管疾病、癌症等生活習慣疾病之發病及惡化之原因之一。一般認為脂聯素對於抑制平滑肌增生、治療動脈硬化症有效(專利文獻1)。脂聯素係約30 kDa之多肽，於健康人之循環中，於2～30 mg/L之範圍內存在。脂聯素包含N末端之類似於膠原蛋白蛋白質之區域(類膠原蛋白區，cAd)、及C末端側之球狀區域(gAd)。其中，已知尤其是C末端側之球狀區域(gAd)可用於動脈硬化之預防及治療(專利文獻2)。血漿中之脂聯素係於混合存在三聚物(低分子量三聚物)、六聚物(中等程度分子量六聚物)、十二～十八聚物(高分子量多聚物)等之狀態下存在。已知與脂聯素總量相比，十六聚物或其以上之高分子多聚物水準強烈地與肥胖、冠狀動脈疾病等相關，一般認為高分子多聚物之生理活性最高(非專利文獻1)。因脂聯素引起之大部分心臟保護訊號之機制係藉由AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase，單磷酸腺苷活化蛋白激酶)之活化而介導。脂聯素具有抗炎、抗氧化及抗細胞凋亡作用，確認到藉由該等作用而帶來對缺血再灌注之保護效果。揭示有對降低之脂聯素進行補充、或將AMPK或PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor，過氧化體增生物活化受體)活化成為伴隨肥胖之新陳代謝症候群、糖尿病、心血管疾病、癌症之治療方法(非專利文獻2～4)。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]日本專利第3538711號公報 [專利文獻2]國際公開第2003/099319號(日本專利第4147220號公報) [非專利文獻] [非專利文獻1]Am. J. Cardiovasc Dis 2012; 2(4): 253-366 [非專利文獻2]Nature, 503, 493-499(2013) [非專利文獻3]Nature Medicine, 11, 1096-1103(2005) [非專利文獻4]Cardiovascular Res. 74(2007)471-479

[發明所欲解決之問題] 天然型脂聯素係以經由類膠原蛋白區而混合存在三聚物、六聚物、十二～十八聚物等之狀態存在。因此，於製造使用有天然型脂聯素之醫藥品時，無法控制多聚物形成，難以獲得均一之脂聯素，故而就製造方面之品質等規格設定之方面而言存在問題，而難以處理。本發明之目的在於提供一種可製造出均一之製品，且具有與天然之脂聯素同等以上之活性之分子修飾體脂聯素、及包含分子修飾體脂聯素之醫藥組合物。 [解決問題之技術手段] 於本案發明中，藉由製成包含三聚物化區及脂聯素之球狀區域之融合蛋白質，而製作分子修飾體脂聯素。本發明之分子修飾體脂聯素自然地締合而形成均一之三聚物。認為脂聯素之十二～十八聚物等多聚物具有活性，但驚奇地發現形成三聚物之本案發明之分子修飾體脂聯素具有與天然之脂聯素同等或超過其之程度的效果。因此，於本發明中，提供一種包含脂聯素之C末端側球狀區域、與母系蛋白之捲曲螺旋區域之分子修飾體脂聯素。該分子修飾體脂聯素可利用母系蛋白之捲曲螺旋區域而有效率地形成三聚物。本發明之分子修飾體脂聯素可使用母系蛋白之捲曲螺旋區域位於N末端側，且脂聯素球狀區域位於C末端側者。本發明之分子修飾體脂聯素可進而包含至少1個葡萄球菌之蛋白質A之ZZ區，該蛋白質A之ZZ區亦可位於母系蛋白之捲曲螺旋區域之N末端側。作為分子修飾體脂聯素中所包含之母系蛋白，可使用母系蛋白-2。本發明之分子修飾型脂聯素可使用含有包含序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列之多肽、包含序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列之多肽、及包含序列編號3之胺基酸序列之多肽者。又，本發明之分子修飾體脂聯素可使用包含選自序列編號5、7、9及11中之胺基酸序列者。作為本發明之另一實施態樣，提供一種上述分子修飾體脂聯素之三聚物。又，作為本發明之又一實施態樣，提供一種編碼上述分子修飾體脂聯素之核酸。作為本發明之核酸，較佳為包含選自序列編號4、6、8及10中之核酸序列者。進而又，作為本發明之實施態樣，提供一種包含上述核酸之載體。作為本發明之又一實施態樣，提供一種包含上述核酸或上述載體之宿主細胞。作為本發明之又一態樣，提供一種包含分子修飾體脂聯素之三聚物、與製劑學上所容許之載體之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物可用於治療或預防動脈硬化症，治療或預防糖尿病，或者治療或預防肥胖。動脈硬化症包括狹心症、心肌梗塞或腦梗塞。 [發明之效果] 根據本發明，可提供一種與形成多樣化之多聚物之天然型脂聯素相比，形成均一之三聚物，且具有與天然型脂聯素同等或超過其之生理學活性之分子修飾體脂聯素。例如，利用天然型脂聯素之約三分之一濃度的分子修飾體脂聯素，便可發揮出與天然型脂聯素同等之效果。進而，本發明之分子修飾體脂聯素由於將由天然之脂聯素所介導之訊號傳遞機制活化，故而對於因脂聯素之缺乏引起之疾病、例如動脈硬化症之類的心血管疾病、包括心衰竭、心臟肥大在內之心臟疾病、致死性心律不整、腦梗塞、肥胖症、糖尿病、高血壓、高脂血症之類的所謂生活習慣疾病及惡性腫瘤(癌症)等之預防及治療有效。

(分子修飾體脂聯素) 本案發明之分子修飾體脂聯素係包含脂聯素球狀區域及母系蛋白之捲曲螺旋區域的融合蛋白質，較佳為於N末端側融合母系蛋白之捲曲螺旋區域，於C末端側融合脂聯素球狀區域而成者。藉由使捲曲螺旋區域與脂聯素球狀區域融合，可極高效率地形成三聚物。又，分子修飾體脂聯素可進而包含作為葡萄球菌之蛋白質A之IgG結合區之ZZ區。ZZ區可與作為融合蛋白質之分子修飾體脂聯素之N末端或C末端、或者N末端及C末端兩者連結。較佳為於N末端連結Z區。已知藉由連結Z區，一般於自宿主細胞進行表現時，會促進可溶性組分中之蛋白質之表現。本案之分子修飾體脂聯素即便不包含ZZ區，亦發揮出與脂聯素同等之生理活性、例如AMPK活化效果、抗細胞凋亡效果、抗炎效果、心肌梗塞之病灶縮小效果等，但驚奇地確認到藉由導入ZZ區，不僅會促進可溶性組分中之表現，即便為更低濃度之蛋白質，亦發揮出與天然之脂聯素同等之生理活性。本發明之分子修飾體脂聯素例如含有包含序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列之多肽、包含序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列之多肽、及包含序列編號3之胺基酸序列之多肽。又，本發明之分子修飾體脂聯素例如包含序列編號5、7、9及11之胺基酸序列。本發明之分子修飾體脂聯素可藉由通常之基因工程學方法而製造。更詳細而言，可藉由將編碼分子修飾體脂聯素之基因引入至表現載體，並將其導入至適當之宿主細胞中進行表現，而製造本案發明之分子修飾體脂聯素。 (脂聯素) 本案發明之分子修飾體脂聯素中所包含之脂聯素之C末端側之球狀區域可源自天然之脂聯素。天然之脂聯素之胺基酸序列已確定，可藉由公知之方法取得。於本發明中，較佳為使用人類之脂聯素，例如可使用具有序列編號1(圖1)之胺基酸序列之脂聯素。脂聯素如上所述包含N末端之類似於膠原蛋白蛋白質之區域(類膠原蛋白區域，cAd)、及C末端側之球狀區域(gAd)。脂聯素之C末端之球狀區域之胺基酸序列係包含序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列的多肽。只要具有脂聯素之活性，則不限於包含序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列之多肽，亦可使用具有該等胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失或者附加之胺基酸序列的變異體多肽。作為此種變異體多肽，可列舉對於序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列具有胺基酸之保存性置換者。變異體多肽可例示與序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或98%以上之同源性者。 (三聚物化區) 本發明之分子修飾體脂聯素於脂聯素之C末端側球狀區域之N末端側連結有多聚物化區。多聚物化區會促進與多聚物化區結合之多肽之多聚物化。多聚物化區較佳為三聚物化區，一般具有捲曲螺旋區。作為此種三聚物區之例，可例示：異白胺酸拉鏈、母系蛋白(matrilin)家族蛋白質、GCN4等之捲曲螺旋區。尤佳為母系蛋白家族蛋白質之捲曲螺旋區。母系蛋白家族蛋白質係分泌性細胞外基質蛋白質，包含母系蛋白-1至母系蛋白-4。於本說明書中，亦將包含母系蛋白-1至母系蛋白-4之母系蛋白家族蛋白質簡稱為母系蛋白。母系蛋白-1係非關節性軟骨之細胞外基質之成分，主要由軟骨細胞分泌。母系蛋白-2係與基質締合相關之分泌性蛋白質。母系蛋白-3係於軟骨性組織中表現之分泌性蛋白質。母系蛋白-4係於胎兒腎、胚胎及胎盤中表現，對於軟骨之細胞外基質為重要之分泌性蛋白質。其中，尤其於本發明中，較佳為使用人類之母系蛋白作為三聚物化區，尤其適宜使用人類之母系蛋白-2之捲曲螺旋區。母系蛋白-2之胺基酸序列係以序列編號2(圖1)表示，捲曲螺旋區係包含序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列之多肽。只要具有三聚物形成活性，且無損分子修飾體脂聯素之活性，則不限於包含序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列之多肽，亦可使用具有該等胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失或者附加之胺基酸序列的變異體多肽。作為此種變異體多肽，可列舉對於序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列具有胺基酸之保存性置換者。變異體多肽可例示與序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或98%以上之同源性者。藉由使脂聯素之球狀區域與三聚物化區融合，所產生之融合蛋白質形成三聚物。天然之脂聯素係包含三聚物、六聚物、組合該等而成之多聚物之混合物，相對於此，關於本案之分子修飾體脂聯素，所表現之多肽之至少約60%、進而較佳為至少約70%、最理想為至少約75%係以三聚物之形式存在。 (ZZ區) 本發明之分子修飾體脂聯素亦可進而包含葡萄球菌之蛋白質A之Z區。Z區係源自葡萄球菌之蛋白質A之與抗體之Fc區域結合的區。Z區一般用於使未摺疊或者錯誤摺疊之蛋白質可溶化(例如參照Biochemistry 1994, 33, 4207-4211)。較佳為以將2個Z區串聯排列而成之ZZ區之形式使用。ZZ區可使用具有序列編號3(圖1)所記載之胺基酸序列之多肽。作為編碼ZZ區之核苷酸序列，例如可利用pEZZ18(GE Healthcare Japan股份有限公司)等市售之載體。只要促進蛋白質之可溶化，無損分子修飾體脂聯素之活性，則不限於包含序列編號3之胺基酸序列之多肽，亦可使用具有該等胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失或者附加之胺基酸序列的變異體多肽。作為此種變異體多肽，可列舉對於序列編號3之胺基酸序列具有胺基酸之保存性置換者。又，變異體之多肽可例示與序列編號3之胺基酸114～244之胺基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或98%以上之同源性者。 (純化用標籤) 為了使純化變得容易，分子修飾體脂聯素亦可包含純化用標籤。純化用標籤為業者眾所周知，並無特別限定，例如可使用His(Histidine，組胺酸)標籤、GST(glutathione S-transferase，麩胱甘肽S-轉移酶)標籤、MBP(Maltose binding protein，麥芽糖結合蛋白)標籤、Strep(II)標籤等。於純化後，並非必須切斷包含標籤之區域，於切斷包含標籤之區域之情形時，可將蛋白酶等之識別部位導入至純化用標籤之鄰接部，而利用該蛋白酶進行切斷。於脂聯素球狀區域與母系蛋白之捲曲螺旋區域之間，可包含任意之連接子。連接子並無特別限定，可使用源自母系蛋白之捲曲螺旋區域、或脂聯素球狀區域之鄰接之區域者。 (核酸) 本案發明中可使用之核酸包含分別編碼脂聯素之C末端側球狀區域及母系蛋白之捲曲螺旋區域的核酸序列。作為此種核酸序列，例如可例示包含分別編碼包含序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列之多肽、及序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列的核酸序列者。進而，可包含編碼葡萄球菌之蛋白質A之ZZ區之核酸序列。作為編碼蛋白質A之ZZ區之核酸，可使用源自pEZZ18(GE Healthcare Japan股份有限公司)等市售載體者。又，編碼蛋白質A之ZZ區的核酸例如可使用編碼包含序列編號3之胺基酸序列之ZZ區的核酸序列。進而，為了使純化變得容易，本案發明中可使用之核酸中亦可包含編碼上述純化用標籤之核酸序列。又，亦可包含編碼任意之連接子序列之核酸序列。本案發明中可使用之核酸只要為編碼上述分子修飾體脂聯素之胺基酸序列者，則其序列並無特別限定。例如可使用序列編號4、6、8及10之核酸序列、或編碼序列編號5、7、9及11之胺基酸序列之核酸序列。 (載體) 表現載體可使用質粒載體、噬菌體載體、病毒載體、人工染色體載體等，例如可將pET-24a-d之類的pET系、pUC系、pBI系、pSMA系、pBluscript系、λgt11、λZAP、pUB110、pTP5、YEp13、YCp50、桿狀病毒、腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒等任意之載體同時用於宿主細胞，並無特別限定。作為表現載體，可使用包含啟動子、促進子、剪切訊號、多聚腺苷酸化部位、終止子、選擇標記、複製起點等者。宿主可使用原核生物及真核生物中之任一種。作為原核生物宿主，可使用大腸桿菌、枯草桿菌等，作為真核生物宿主，可使用酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等。作為導入表現載體之方法，可使用任意之公知方法、例如磷酸鈣法、脂轉染法、電穿孔法等。分子修飾體脂聯素可藉由利用公知方法自宿主細胞之培養基回收，並進行純化而獲得。所表現之分子修飾體脂聯素係利用三聚物化區而形成三聚物，並蓄積於細胞內或分泌至細胞外。於回收及純化中，可藉由一般之方法進行，例如可使用親和性層析法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法等各種層析法。又，是否形成三聚物可於非加熱及非還原之條件下藉由SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析及西方墨點分析等而容易地確認。 (醫藥組合物) 本發明之醫藥組合物可以本發明之分子修飾體脂聯素作為有效成分，進而加入藥學上所容許之載體，而製成各種投予形態之醫藥組合物。又，可以包含編碼本發明之分子修飾體脂聯素之核酸之基因治療用載體作為有效成分，進而加入藥學上所容許之載體，而製成各種投予形態之醫藥組合物。作為醫藥組合物之投予形態，可進行經口投予及非經口投予。於採用非經口投予之情形時，可為靜脈內、動脈內、皮下、肌內及腹腔內之投予等各種形態。作為經口投予用醫藥組合物，例如可例示：錠劑、膠囊、顆粒、細粒、糖漿、腸溶劑、緩釋性膠囊等。經口投予用醫藥組合物中可使用乳糖、結晶纖維素、澱粉等賦形劑、硬脂酸鎂、滑石、硬脂酸鈣等潤滑劑之類的載體。進而，亦可利用乙基纖維素、羥丙基纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素酯、鄰苯二甲酸羥丙甲纖維素酯等塗佈劑進行塗佈。又，於採用膠囊之情形時，亦可利用腸溶性塗佈劑等而製成腸溶性膠囊。靜脈內、動脈內、皮下、肌內及腹腔內投予用藥劑中，例如可包含蒸餾水、穩定劑、乳化劑、緩衝劑等載體。業者可考慮保存穩定性等而選擇載體。本案發明之醫藥組合物例如可以0.01～0.05 μg/天之投予量投予分子修飾體脂聯素，但該投予量可根據投予途徑、性別、年齡、體重、疾病之狀態等進行變更。包含本案發明之分子修飾體脂聯素之醫藥組合物由於使藉由脂聯素結合於脂聯素受體而活化之AMPK活化，故而對藉由天然之脂聯素可預料治療及預防效果之疾病，可期待相同之高治療及預防效果。例如，包含本案發明之分子修飾體脂聯素之醫藥組合物對於動脈硬化症之類的心血管疾病、包含心衰竭、心臟肥大之心臟疾病、致死性心律不整、腦梗塞、肥胖症、糖尿病、高血壓、高脂血症之類的所謂生活習慣疾病及惡性腫瘤(癌症)等發揮出預防及治療效果。預防及治療係不僅包括疾病之發病之預防及疾病之治療，亦包括該疾病所伴隨之症狀之預防及治療、該疾病之復發之抑制在內的概念。治療不僅包括根治治療，亦包括與治療前相比改善症狀之情形。以下，基於實施例說明本發明，但下述實施例係用以說明本發明者，並非用以限定本發明者。 [實施例] ＜實施例1：hMat2cc-gAd表現大腸桿菌株之製作＞為了於大腸桿菌中表現於人類之脂聯素(序列編號1)之球狀區域(114殘基至244殘基)之胺基末端連結有人類之母系蛋白2(序列編號2)之捲曲螺旋區域(912殘基至952殘基)的多肽(以下，稱為hMat2cc-gAd)(序列編號5)(圖2)，設計編碼該多肽之DNA序列(序列編號4)(圖2)，並人工合成附加有用以選殖於表現載體之向5'末端之NdeI識別序列及向3'末端之XhoI識別序列的DNA。將該合成DNA插入至質粒pET-24a(+)(Merck股份有限公司)之T7啟動子之下游，將所獲得之質粒導入至大腸桿菌BL21(DE3)株(Merck股份有限公司)中，而獲得hMat2cc-gAd表現大腸桿菌株。＜實施例2：ZZ-hMat2cc-gAd表現大腸桿菌株之製作＞為了於大腸桿菌中表現於hMat2cc-gAd(序列編號5)之胺基末端連結有源自金黃色葡萄球菌之蛋白質A之ZZ區域(序列編號3)的多肽(以下，稱為ZZ-hMat2cc-gAd)(序列編號7)(圖3)，設計編碼該多肽之DNA序列(序列編號6)(圖3)，並人工合成附加有用以選殖於表現載體之向5'末端之NcoI識別序列及向3'末端之XhoI識別序列的DNA。將該合成DNA插入至質粒pET-24d(+)(Merck股份有限公司)之T7啟動子之下游，將所獲得之質粒導入至大腸桿菌BL21(DE3)株(Merck股份有限公司)中，而獲得ZZ-hMat2cc-gAd表現大腸桿菌株。＜實施例3：hMat2cc-gAd-ZZ表現大腸桿菌株之製作＞為了於大腸桿菌中表現於hMat2cc-gAd(序列編號5)之羧基末端連結有ZZ區域(序列編號3)之多肽(以下，稱為hMat2cc-gAd-ZZ)(序列編號9)(圖4)，設計編碼該多肽之DNA序列(序列編號8)(圖4)，並人工合成附加有用以選殖於表現載體之向5'端之NcoI識別序列及向3'末端之XhoI識別序列的DNA。將該合成DNA插入至質粒pET-24d(+)(Merck股份有限公司)之T7啟動子之下游，將所獲得之質粒導入至大腸桿菌BL21(DE3)株(Merck股份有限公司)中，而獲得hMat2cc-gAd-ZZ表現大腸桿菌株。＜實施例4：ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ表現大腸桿菌株之製作＞為了於大腸桿菌中表現於hMat2cc-gAd(序列編號5)之胺基末端及羧基末端兩者連結有ZZ區域(序列編號3)之多肽(以下，稱為ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ)(序列編號11)(圖6)，設計編碼該多肽之DNA序列(序列編號10)(圖5)，並人工合成附加有用以選殖於表現載體之向5'末端之NcoI識別序列及向3'末端之XhoI識別序列的DNA。將該合成DNA插入至質粒pET-24d(+)(Merck股份有限公司)之T7啟動子之下游，將所獲得之質粒導入至大腸桿菌BL21(DE3)株(Merck股份有限公司)中，而獲得ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ表現大腸桿菌株。＜實施例5：hMat2cc-gAd之製備及性狀分析＞對hMat2cc-gAd表現大腸桿菌株，使用包含康黴素與異丙基-β-硫代半乳糖苷之2xYT培養基進行培養，將藉由離心分離而回收之菌體再懸浮於包含20 mM之Tris-HCl(pH值7.5)之緩衝液中，並進行超音波破碎。將所獲得之細胞破碎物藉由離心分離而分離為可溶性組分與不溶性組分，將可溶性組分利用HiTrap Q FF管柱(GE Healthcare Japan股份有限公司)及HiTrap TALON crude管柱(GE Healthcare Japan股份有限公司)連續地進行純化。針對該純化物，使用BCA蛋白分析套組(Thermo Scientific)進行蛋白質濃度測定。又，於非加熱及非還原之條件下進行SDS-PAGE分析及西方墨點分析，確認到hMat2cc-gAd形成三聚物且為高純度。＜實施例6：ZZ融合型hMat2cc-gAd之製備及性狀分析＞針對ZZ-hMat2cc-gAd表現大腸桿菌株、hMat2cc-gAd-ZZ表現大腸桿菌株及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ表現大腸桿菌株，分別使用包含康黴素及異丙基-β-硫代半乳糖苷之2xYT培養基進行培養，使藉由離心分離而回收之菌體再懸浮於包含20 mM之Tris-HCl(pH值7.5)之緩衝液中，並進行超音波破碎。將所獲得之細胞破碎物藉由離心分離而分離為可溶性組分與不溶性組分，將可溶性組分利用HiTrap TALON crude管柱(GE Healthcare)及HiLoad 16/60 Superdex 200 pg(GE Healthcare)管柱連續地進行純化。針對該純化物，使用BCA蛋白分析套組(Thermo Scientific)進行蛋白質濃度測定。又，於非加熱及非還原之條件下進行SDS-PAGE分析及西方墨點分析，確認到3種ZZ融合型hMat2cc-gAd形成三聚物且為高純度。＜實施例7：使用大鼠心肌細胞之因hMat2cc-gAd所引起之AMPK及Akt活性作用之研究＞使用大鼠之心肌細胞，確認到利用分子修飾體脂聯素hMat2cc-gAd使心臟保護訊號活化。將大鼠之心肌細胞於DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium，杜爾貝科改良伊格爾培養基)中進行培養，利用10 μg/ml之hMat2cc-gAd處理18小時。將心肌細胞於溶解緩衝液中進行均質化，使用10%聚丙烯醯胺凝膠，藉由變性條件下之SDS-PAGE而分離30 μg量之蛋白質。於電泳後，使分離之蛋白質轉印至膜，進行西方墨點分析。具體而言，以1：1,000之比率稀釋初級抗體，並以1：15,000之比率稀釋複合有HRP(Horseradish Peroxidase，辣根過氧化物酶)之二級抗體而使用。檢測係使用ECL-PLUS西方墨點檢測套組(Amersham Pharmacia Biotec製造)。所使用之初級抗體係針對p-AMPK(磷酸化AMPK)、p-Akt(磷酸化Akt)之抗體(Cell Signaling Technology公司)。抗微管蛋白抗體(Oncogene公司)係為了測定作為蛋白量之內部標準之微管蛋白量而使用。此處，AMPK係脂聯素訊號傳遞機制中之核心介質，且係藉由使脂聯素受體活化而進行磷酸化之蛋白質。已知若使AMPK磷酸化、活化，則會使作用於心肥大抑制、糖尿病性心肌病抑制、心肌梗塞抑制之心臟保護訊號活化(Am. J. Cardiovasc Dis 2012; 2(4): 253-366)，又，使引起醣攝入或脂肪酸燃燒之訊號活化(Nature Medicine 2002: Vol.8, 1288-1295)。經磷酸化之AMPK(p-AMPK)進而將其下游之Akt磷酸化。將結果示於圖7。圖中，左側為P-AMPK、P-Akt，右側係為了慎重起見再次對P-AMPK進行西方墨點法之結果。+係利用hMat2cc-gAd進行了處理者，-係未處理者。確認到關於利用hMat2cc-gAd進行了處理者，p-AMPK及p-Akt量與對照相比提高，利用分子修飾體脂聯素使脂聯素訊號活化。＜實施例8：使用大鼠心肌細胞之因ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ引起之AMPK及Akt活性作用之研究＞使用大鼠之心肌細胞，以與實施例7相同之方式，確認到即便為其他分子修飾體脂聯素，亦使心臟保護訊號活化。利用ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ，以與實施例7相同之方式對大鼠之心肌細胞進行處理。將心肌細胞於溶解緩衝液中進行均質化，使用10%聚丙烯醯胺凝膠，藉由變性條件下之SDS-PAGE而分離30 μg量之蛋白質。於電泳後，使分離之蛋白質轉印至膜，進行西方墨點分析。具體而言，以1：1,000之比率稀釋初級抗體，並以1：15,000之比率稀釋複合有HRP之二級抗體而使用。檢測係使用ECL-PLUS西方墨點檢測套組(Amersham Pharmacia Biotec製造)。所使用之初級抗體係針對p-AMPK(磷酸化AMPK)、T-AMPK(所有AMPK)、p-Akt(磷酸化Akt)、T-Akt(所有Akt)之抗體。抗微管蛋白抗體(Oncogene公司)係為了測定作為蛋白質之內部標準之微管蛋白量而使用。將結果示於圖8。右側及左側之照片係為了慎重起見而進行2次西方墨點法者。確認到分子修飾體脂聯素均p-AMPK及p-Akt量與對照相比提高，利用分子修飾體脂聯素使脂聯素訊號活化。尤其對於ZZ-hMat2cc-gAd，AMPK及Akt之活化較明顯。＜實施例9：使用大鼠纖維母細胞之因ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ引起之AMPK及Akt活性之研究＞確認到即便為大鼠纖維母細胞，利用其他種類之分子修飾體脂聯素亦使脂聯素訊號活化。將大鼠纖維母細胞利用10 μg/ml之濃度之ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ或ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ之分子修飾體脂聯素處理18小時。以與實施例8相同之方式，藉由西方墨點法檢測p-AMPK(磷酸化AMPK)(Cell Signaling Technology公司)、T-AMPK(所有AMPK)(Cell Signaling Technology公司)、p-Akt(磷酸化Akt)、T-Akt(所有Akt)。將結果示於圖9。確認到即便為纖維母細胞，利用分子修飾體脂聯素亦使脂聯素訊號活化。尤其對於ZZ-hMat2cc-gAd，AMPK及Akt之活化較明顯。＜實施例10：使用大鼠心肌細胞之因hMat2cc-gAd引起之抗細胞凋亡效果之研究＞確認到大鼠心肌細胞利用hMat2cc-gAd而抑制因低氧狀態引起之細胞凋亡。將大鼠心肌細胞於無血清培養基中於氧正常狀態下處理48小時，或者於低氧狀態(＜1%之O₂ 及5%之CO₂ ，37℃)下處理12小時，其後於10 μg/ml之hMat2cc-gAd之存在下或非存在下之氧氣條件下(＜21%之O₂ 及5%之CO₂ ，37℃)靜置24小時。依據通常方法進行TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，末端脫氧核苷酸轉移酶介導之dUTP缺口末端標記)染色(綠)，將引起細胞凋亡之細胞染色。藉由DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色(藍)將所有死細胞染色。將TUNEL染色及DAPI染色之結果之代表性照片示於圖10之上段，將定量地分析之因TUNEL陽性之細胞凋亡引起之死細胞的比率示於下段之圖表。顯示出低氧狀態下之TUNEL陽性細胞之比率、即因細胞凋亡所引起之死細胞之比率藉由hMat2cc-gAd處理，與對照相比顯著減少，hMat2cc-gAd發揮出抗細胞凋亡作用。＜實施例11：使用大鼠心肌細胞之因ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ所引起之抗細胞凋亡效果之研究＞確認到大鼠心肌細胞即便利用其他種類之分子修飾體脂聯素，亦抑制因低氧狀態引起之細胞凋亡。以與實施例10相同之方式，將大鼠心肌細胞利用ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ或ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ進行處理，計測因細胞凋亡引起之死細胞之比率。將TUNEL染色之結果之代表性照片示於圖11之上段，將定量地分析之因TUNEL陽性之細胞凋亡引起之死細胞的比率示於下段之圖表。顯示出低氧狀態下之TUNEL陽性細胞之比率、即因細胞凋亡所引起之死細胞之比率即便利用其他種類之分子修飾體脂聯素，與對照相比亦顯著減少，其他種類之分子修飾體脂聯素發揮出抗細胞凋亡作用。＜實施例12：使用大鼠心肌細胞之因hMat2cc-gAd引起之抗炎效果(TNFα及IL-1β之mRNA表現量之抑制)之研究＞確認到心肌細胞之炎症被hMat2cc-gAd所抑制。心肌細胞若受到因脂多糖(LPS)引起之刺激，則會產生TNFα及IL-1β，從而產生炎症。基於TNFα及IL-1β之mRNA量，而確認到hMat2cc-gAd抑制炎症。將新生大鼠心肌細胞(NRVM)以250 μl/孔(2.5×10⁵ 細胞/孔)之濃度接種至24孔之培養皿中。利用10 μg/ml之濃度之hMat2cc-gAd處理1小時後，利用100 ng/ml之LPS處理6小時，而誘導作為炎症性細胞激素之TNFα及IL-1β之表現。藉由RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，反轉錄-聚合酶鏈反應)而測定TNFα及IL-1β之mRNA量。對照係使用PBS(phosphate buffer saline，磷酸鹽緩衝液)代替分子修飾體脂聯素。將結果示於圖12。利用hMat2cc-gAd，TNFα及IL-1β之mRNA表現量與對照相比減少，確認到抑制炎症。於如此使用分子修飾體脂聯素之情形時，於10 μg/ml之濃度下確認到抗炎效果。另一方面，對於天然之脂聯素，於測定因LPS刺激引起之TNF-α產生之情形時，確認到於10 μg/ml之濃度下未抑制TNFα產生，但於30 μg/ml之濃度下抑制(Nature Medicine, 11, 1096-1103(2005))。由此顯示，本案發明之分子修飾體脂聯素即便為天然之脂聯素之約三分之一濃度，亦發揮出同等之效果。＜實施例13：使用大鼠心肌細胞之抗炎效果(TNF抑制)之研究＞確認到心肌細胞之炎症即便利用其他種類之分子修飾體脂聯素亦得到抑制。將新生大鼠心肌細胞(NRVM)以250 μl/孔(2.5×10⁵ 細胞/孔)之濃度接種至24孔之培養皿中。利用10 μg/ml之濃度之ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ或ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ處理1小時後，利用100 ng/ml之LPS處理6小時而誘導炎症。藉由RT-PCR而測定TNFα之mRNA量。對照係使用PBS代替分子修飾體脂聯素。將結果示於圖13。利用ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ或ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ，TNFα表現量與對照相比減少，而確認到抑制炎症。＜實施例14：因分子修飾體脂聯素處理引起之缺血再灌注損傷後之梗塞尺寸之影響＞確認到利用分子修飾體脂聯素hMat2cc-gAd，缺血再灌注損傷後之梗塞尺寸與野生型無處理小鼠相比減少。將1.0 μg/g之分子修飾體脂聯素hMat2cc-gAd投予至複數隻C57BL/6系統小鼠之頸動脈內。對於對照之小鼠，投予PBS。自投予起30分鐘後進行LAD(Left Anterior Descending，左前降支)血管結紮30分鐘，繼而再灌注48小時。將LAD動脈再縫合後，將1 ml之1.0%伊凡氏藍(Sigma Chemilal Co.)自頸靜脈注入，而將非梗塞組織染色。其後，取出心臟，利用PBS進行清洗後，製作橫截面之切片，於23℃下利用1.0 ml之1.5%之氯化2,3,5-三苯基四氮唑(Sigma Chemilal Co.)染色5分鐘，而將梗塞區域染色。圖14中之照片表示藉由表示缺血區域(AAR)之伊凡氏藍、及表示梗塞區域(IA)之氯化2,3,5-三苯基四氮唑進行染色後之心臟組織的照片。藍色之部分表示未受到缺血之影響之健康之心肌，白色區域表示死亡之組織。進而，使用軟體ImageJ利用電腦進行面積測定，而確定左室區域(LV)、缺血區域(AAR)、梗塞區域(IA)之面積。將缺血區域(AAR)相對於左室區域(LV)之比率(AAR/LV)、梗塞區域(IA)相對於缺血區域(AAR)之比率(IA/AAR)、及梗塞區域(IA)相對於左室區域(LV)之比率(IA/LV)示於圖14之圖表。與對照相比，投予hMat2cc-gAd之群之IA/AAR及IA/LV減少。因此，顯示出hMat2cc-gAd對於心肌梗塞縮小有效。＜實施例15：因分子修飾體脂聯素處理引起之缺血再灌注損傷後之梗塞尺寸之影響＞確認到即便利用其他分子修飾體脂聯素，缺血再灌注損傷後之梗塞尺寸亦減少。以與實施例14相同之方式投予1.0 μg/g之ZZ-hMat2cc-gAd或ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ。對於對照之小鼠，投予PBS。以與實施例14相同之方式，於缺血再灌注損傷後，進行伊凡氏藍染色及氯化2,3,5-三苯基四氮唑染色，並測定缺血區域(AAR)、梗塞區域(IA)及左室區域(LV)之面積並圖表化。將結果示於圖15。與對照相比，投予了分子修飾體脂聯素之群之IA/AAR及IA/LV減少。因此，顯示出ZZ-hMat2cc-gAd或ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ對於心肌梗塞縮小有效。

圖1係表示脂聯素之胺基酸序列(序列編號1)、母系蛋白-2胺基酸序列(序列編號2)及ZZ區胺基酸序列(序列編號3)的圖。於脂聯素之胺基酸序列及母系蛋白-2胺基酸序列中，分別以粗體字表示脂聯素球狀區域及捲曲螺旋區域之胺基酸序列。圖2係表示hMat2cc-gAd之DNA序列(序列編號4)及hMat2cc-gAd之胺基酸序列(序列編號5)之圖。圖3係表示ZZ-hMat2cc-gAd之DNA序列(序列編號6)及ZZ-hMat2cc-gAd之胺基酸序列(序列編號7)之圖。圖4係表示hMat2cc-gAd-ZZ之DNA序列(序列編號8)及hMat2cc-gAd-ZZ之胺基酸序列(序列編號9)之圖。圖5係表示ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ之DNA序列(序列編號10)之圖。圖6係表示ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ胺基酸序列(序列編號11)之圖。圖7係表示使用大鼠心肌細胞之因hMat2cc-gAd引起之AMPK及AKT之活化之西方墨點法的照片。圖8係表示使用大鼠心肌細胞之因ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ、ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ引起之AMPK及AKT之活化之西方墨點法的照片。圖9係表示使用大鼠纖維母細胞之因ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ引起之AMPK及AKT之活化之西方墨點法的照片。圖10係表示使用大鼠心肌細胞之因hMat2cc-gAd產生之抗細胞凋亡效果的照片及圖表。上段係TUNEL染色及DAPI染色之結果之代表性照片，下段係表示定量地分析之因TUNEL陽性之細胞凋亡引起之死細胞之比率的圖表。圖11係表示使用大鼠心肌細胞之因ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ引起之抗細胞凋亡效果之照片及圖表。上段係TUNEL染色之結果之代表性照片，下段係表示定量地分析之因TUNEL陽性之細胞凋亡引起之死細胞之比率的圖表。圖12係表示使用大鼠心肌細胞之因hMat2cc-gAd引起之抗炎效果的圖表。右側之圖表表示IL-1β之表現量，左側之圖表表示TNFα之表現量。圖13係表示使用大鼠心肌細胞之因ZZ-hMat2cc-gAd、hMat2cc-gAd-ZZ及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ引起之抗炎效果的圖表。圖表表示TNFα之表現量。圖14係表示因hMat2cc-gAd引起之缺血再灌注損傷後之梗塞尺寸之影響的照片及圖表。照片係表示缺血區域(AAR)之伊凡氏藍染色、及藉由表示梗塞區域(IA)之氯化2,3,5-三苯基四氮唑進行染色後之心臟組織之切片的照片，圖表表示缺血區域(AAR)相對於左室區域(LV)之比率(AAR/LV)、梗塞區域(IA)相對於缺血區域(AAR)之比率(IA/AAR)、及梗塞區域(IA)相對於左室區域(LV)之比率(IA/LV)。圖15係表示因ZZ-hMat2cc-gAd及ZZ-hMat2cc-gAd-ZZ引起之缺血再灌注損傷後之梗塞尺寸之影響的照片及圖表。照片係藉由伊凡氏藍及氯化2,3,5-三苯基四氮唑進行染色後之心臟組織之切片之照片，圖表表示AAR/LV、IA/AAR及IA/LV。

Claims

一種分子修飾體脂聯素，其包含脂聯素之C末端側球狀區域、與母系蛋白之捲曲螺旋區域。
如請求項1之分子修飾體脂聯素，其中母系蛋白之捲曲螺旋區域位於N末端側，脂聯素球狀區域位於C末端側。
如請求項1或2之分子修飾體脂聯素，其進而包含至少1個葡萄球菌之蛋白質A之ZZ區。
如請求項3之分子修飾體脂聯素，其中蛋白質A之ZZ區位於母系蛋白之捲曲螺旋區域之N末端側。
如請求項1至4中任一項之分子修飾體脂聯素，其中母系蛋白為母系蛋白-2。
如請求項3或4之脂聯素，其含有包含序列編號1之胺基酸114～244之胺基酸序列之多肽、包含序列編號2之胺基酸912～952之胺基酸序列之多肽、及包含序列編號3之胺基酸序列之多肽。
如請求項6之分子修飾體脂聯素，其包含選自序列編號5、7、9及11中之胺基酸序列。
一種三聚物，其係如請求項1至7中任一項之分子修飾體脂聯素之三聚物。
一種核酸，其編碼如請求項1至7中任一項之分子修飾體脂聯素。
如請求項9之核酸，其包含選自序列編號4、6、8及10中之核酸序列。
一種載體，其包含如請求項9或10之核酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項9或10之核酸、或如請求項11之載體。
一種醫藥組合物，其包含藥學有效量之如請求項8之修飾型脂聯素之三聚物、與製劑學上所容許之載體。
如請求項13之醫藥組合物，其係用以治療或預防動脈硬化症。
如請求項14之醫藥組合物，其中動脈硬化症為狹心症、心肌梗塞或腦梗塞。