TW201800109A

TW201800109A - 禽類新城病疫苗用佐劑及其製備方法

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Publication number: TW201800109A
Application number: TW105120668A
Authority: TW
Inventors: 林建宏
Original assignee: 國年實業有限公司
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2018-01-01
Also published as: TWI603740B

Abstract

本發明涉一種禽類新城病疫苗用佐劑，其係由至少包括：約35.0重量份至約95.0重量份之油劑；約1.0重量份至約5.0重量份之乳化劑；約2.0重量份至約10.0重量份之膠質萃取物；約1.0重量份至約15.0重量份之緩衝劑；及約1.0重量份至約5.0重量份之界面活性劑所組成；且在實際施用時，該禽類新城病疫苗用佐劑(Adj)與禽類新城病抗原液(Vat)的摻混比(Adg：Vat)為 1：5(v/v)～1：1(v/v)，其該禽類新城病抗原液(Vat)為寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC 970070、BCRC 970071、BCRC 970072，寄存日期為中華民國105年3月24日之禽類VII型新城病的病毒株中的至少一種所製備。

Description

禽類新城病疫苗用佐劑及其製備方法

本發明係關於一種禽類疫苗用佐劑，特別是關於一種禽類新城病疫苗用佐劑及其製備方法。

疫苗接種被認為是用來預防病毒感染動物之最有效且最具效率的方式。然而，至今仍有許多病毒性或細菌性疾病尚無可利用的疫苗，或還未能達到足夠的免疫作用。此外，許多疫苗因為其抗原效能太低或使用劣質佐劑、會產生嚴重副作用、穩定性低或是價格昂貴而不適用。因此，亟需研發出更有效的疫苗或相關佐劑產品。

很多傳染病控制計劃之基礎係藉由用活的微生物或經滅活的微生物或其產物進行疫苗接種來誘導專一性免疫。有效之疫苗接種程序容許在動物中形成針對專一抗原之免疫記憶能力，從而在日後與抗原接觸時在動物中引起快速且強烈的免疫反應。然而，有些抗原僅具有弱免疫原性。該等抗原可能無力誘導在日後攻毒時足以為動物提供有效保護之免疫反應，或可能需要投與助增免疫原性以提供有效保護之其他藥劑。

將抗原與稱為佐劑之物質混合後，一起注射於動物體內可增強免疫系統對抗原之免疫抗性，該稱為佐劑的物質係藉由直接作用於免疫系統或藉由修改抗原之藥物動力學特徵，來增強動物體對野外病毒的抵禦反應且藉此增加抗原與免疫系統的相互作用時間。

滅活抗原單獨免疫動物時，不足于產生免疫原性，特別是免疫原性低、分子量小的抗原。因此需要用不同種類的佐劑來增強抗原所誘導的免疫應答。國內外獸用疫苗生產商推廣應用的油質疫苗含有大量的礦物質油，在為養禽業保駕護航的同時也帶來了不少的食品安全問題，例如，肉雞屠體的疫苗殘留問題已經引起越來越多人的擔憂。

油包水(W/0)型油質疫苗是由抗原液、界面活性劑及礦物質油混合後，在高剪切力作用下製備而成。其免疫機理是在接種部位貯存一段時間，局部產生肉芽腫和炎症反應，吸引巨噬細胞、淋巴細胞等聚集以識別抗原，產生抗體。同時，緩慢擴散的油質佐劑使抗原輸送到二級淋巴器官的時間延長，不斷刺激機體的免疫系統，從而產生續期長、抗體水準高的免疫效力。雖然國內外疫苗生產廠家的生產工藝不斷改進，用油品質也不斷提高，但由於這種製劑的連續油相在注射部位有駐留的傾向，在不少的情形中，這種W/0型油質疫苗在接種部位附近產生大量肉芽腫，保護性抗體產生速度慢、易對動物屠體品質造成不良影響，並且在接種期間可能引起劇烈的疼痛。

水包油(0/W)型佐劑疫苗具有注射部位顯現局部反應小且穩定性高的優勢，然而包含或者暴露在連續相中的抗原很快在注射部位分散和被體液酶分解，難以提供長期的保護性抗體，常常需要特殊的免疫刺激劑和多次加強免疫，製備成本高，不被廣泛使用。

因此，各界莫不期待開發出一種能夠加強滅活抗原單獨給予免疫動物時，會產生不足免疫反應及效果；所以各界殷切期盼開發出一種能夠增加免疫反應及效果、且能具有免疫反應持續力等之傳統技術的問題點的佐劑。

有鑑於此，本發明人等經由潛心研究用於解決傳統技術問題點的各種可能方案，進而開發出一種不但能夠改善上述習用技術之問題點，而且針對現有技術的不足，提供一種水包油包水型佐劑。本發明的佐劑可以減少現有滅活疫苗的用油量，加快被免疫動物相應抗體的產生速度，減少疫苗製備成本，至此乃完成本發明。《發明概要》

首先，對於本說明書中所使用的特定用語或名詞進行描述性的說明；然而，下列說明僅為例示性說明，非作為限制本發明說明書及申請專利範圍。除非本說明書另有定義以外，在本文中所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

如本文中所使用，"疫苗組合物"為可用於在接受者中誘發保護性免疫之組合物。因此，在受檢者已接種抗原之後，疫苗可預防、延緩或減輕曝露於相同或相關抗原之受檢者的疾病發展之嚴重程度(相對於未接種疫苗之受檢者)。藉由疫苗所提供之保護性免疫可為體液(抗體介導)免疫或細胞免疫，或兩者。例如，疫苗接種可消除或降低病原體或受感染細胞之負荷，或產生任何其他可量測之感染減輕。疫苗接種亦可降低已免疫(已接種疫苗)之受檢者的腫瘤負荷。

如本文中所使用，術語"保護性免疫"係指當受檢者已曝露於抗原，從而在受檢者中引起免疫反應(主動/後天或被動/先天，或兩者)時抵禦抗原所獲得的免疫力，從而使抗原失活及/或降低抗原負荷且形成免疫記憶(例如記憶T細胞或B細胞)。

藉由疫苗接種所提供之保護性免疫可能為部分的或僅在一部分已接種疫苗之受檢者中提供。因此，疫苗可在一部分免疫群體中誘發保護性免疫，因為有些個體可能無力建立強免疫反應或保護性免疫反應或(在有些情況下)任何免疫反應。此能力不夠可能歸因於個體的遺傳背景或歸因於免疫缺乏病狀(後天或先天性)或免疫抑制(例如，由於經化學療法治療或使用免疫抑制藥物以例如預防器官排斥反應或抑制自體免疫病狀)。向一部分免疫群體提供保護之疫苗仍然適用且視為有效。

如本文中所使用，術語"佐劑"係指當連同抗原投與時，使受檢者對彼抗原之免疫反應增強的化合物。

具體而言，根據本發明之一觀點可以提供一種禽類新城病疫苗用佐劑，其係由至少包括：約35.0重量份至約95.0重量份之油劑；約1.0重量份至約5.0重量份之乳化劑；約2.0重量份至約10.0重量份之膠質萃取物；約1.0重量份至約15.0重量份之緩衝劑；及約1.0重量份至約5.0重量份之界面活性劑所組成；其該佐劑可以提高禽類新城病疫苗中抗原在生物體內，對免疫系統刺激的時間增加，進而可以增加禽類的記憶性免疫效果。

在本發明之禽類新城病疫苗用佐劑中，為了提高防止新城病的感染或增加疫苗穩定性及效能而達到防疫之效果，可以使產品達到良好之功效。根據本發明之一觀點，在實際施用時，該禽類新城病疫苗用佐劑(Adj)與禽類新城病抗原液(Vat)的摻混比(Adg：Vat)為 1：5(v/v)～1：1(v/v)。例如，在本發明之該禽類新城病疫苗用佐劑(Adj)與禽類新城病抗原液(Vat)的摻混比之比例可以是在約1：5(v/v)～1：1(v/v)；在某些具體實施例中，較佳為在約1：6(v/v)之範圍；更佳為在約1：5(v/v) 之範圍；特佳為在約1：4(v/v) 之範圍；最好的為約在1.02：0.98(v/v) 之範圍。

其上述，其該禽類新城病抗原液(Vat)為寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC 970070、BCRC 970071、BCRC 970072，寄存日期為中華民國105年3月24日之禽類VII型新城病的病毒株所製備。

具體而言，根據本發明之一觀點可以提供一種禽類新城病疫苗用佐劑，其係由油劑、乳化劑、膠質萃取物、緩衝劑、及界面活性劑之比例並未特別限制，只要不造成禽類的傷害和可達到防疫效果即可。舉例來說，例如，在本發明之禽類新城病疫苗用佐劑中，油劑、乳化劑、膠質萃取物、緩衝劑、及界面活性劑之比例可以是在約35重量份：約1重量份：約2重量份：約1重量份：約1重量份至約95重量份：約5重量份：約10重量份：約15重量份：約5重量份之範圍；在某些具體實施例中，較佳為在約25重量份：約0.25重量份：約1重量份：約0.25重量份：約0.25重量份至約99重量份：約5.75重量份：約10.75重量份：約15.75重量份：約5.75重量份之範圍；更佳為在約30重量份：約0.5重量份：約1重量份：約0.5重量份：約0.5重量份至約96重量份：約5.5重量份：約10.5重量份：約15.5重量份：約5.5重量份之範圍；特佳為在約35重量份：約1重量份：約2重量份：約1重量份：約1重量份至約95重量份：約5重量份：約10重量份：約15重量份：約5重量份之範圍。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之該佐劑配合使用的抗原液並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是死毒抗原、次單位抗原、核酸抗原。根據本發明之某些具體實施例，該抗原液來源例如可以是自死毒抗原、次單位抗原、核酸抗原、其衍生物、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種；適用於本發明之抗原液較佳使用來源為死毒抗原、次單位抗原、或核酸抗原；更佳使用來源為死毒抗原。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑中該油劑並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是礦物油、植物油。根據本發明之某些具體實施例，該油劑來源例如可以是自藥用級白油、花生油、礦物油、植物油、維生素E、其衍生物、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種；適用於本發明之油劑較佳使用來源為藥用級白油、花生油、礦物油、植物油、或維生素E；更佳使用來源為藥用級白油、花生油、礦物油、或維生素E；特佳使用來源為藥用級白油、或礦物油。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之該乳化劑並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是卵磷脂、豆磷脂、司盤85、司盤83、司盤80、司盤65、司盤60、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯、等。根據本發明之某些具體實施例，該乳化劑例如可以是自卵磷脂、豆磷脂、司盤85、司盤83、司盤80、司盤65、司盤60、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯、中之至少一種；適用於本發明之乳化劑較佳使用為卵磷脂、豆磷脂、司盤85、司盤83、司盤80、司盤65、司盤60、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯、或；更佳使用為卵磷脂、豆磷脂、司盤85、司盤83、司盤80、司盤65、或司盤60；特佳使用來源為卵磷脂、豆磷脂、司盤85、司盤83、司盤80、或司盤65。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之該膠質萃取物並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是蘆薈萃取物、五加皮萃取物、馬齒莧萃取物、葡萄柚萃取物、柿子葉萃取物、β- 葡聚醣、桑黃蘑萃取物、冬蟲夏草萃取物。根據本發明之某些具體實施例，該膠質萃取物來源例如可以是自蘆薈萃取物、五加皮萃取物、馬齒莧萃取物、葡萄柚萃取物、柿子葉萃取物、β- 葡聚醣、桑黃蘑萃取物、冬蟲夏草萃取物、其衍生物、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種；適用於本發明之膠質萃取物較佳使用來源為蘆薈萃取物、五加皮萃取物、馬齒莧萃取物、葡萄柚萃取物、柿子葉萃取物、β- 葡聚醣、桑黃蘑萃取物、或冬蟲夏草萃取物；更佳使用來源為蘆薈萃取物、五加皮萃取物、馬齒莧萃取物、葡萄柚萃取物、或β- 葡聚醣；特佳使用來源為蘆薈萃取物、五加皮萃取物、或β- 葡聚醣。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之該緩衝劑並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑。根據本發明之某些具體實施例，該緩衝劑來源例如可以是自磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、馬來酸鹽緩衝劑、其衍生物、及彼等之混合物構成群組中所選出之至少一種；適用於本發明之緩衝劑較佳使用來源為磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、或馬來酸鹽緩衝劑；更佳使用來源為磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、或兩性離子緩衝劑；特佳使用來源為磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、或兩性離子緩衝劑。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之該界面活性劑之並未特別加以限定，舉例來說，例如可以是、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醇醚等。根據本發明之某些具體實施例，該界面活性劑例如可以是自、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醇醚中之至少一種；適用於本發明之界面活性劑較佳使用為、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、或聚氧乙烯月桂醇醇醚；更佳使用為、聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、或吐溫85；特佳使用來源為辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、或吐溫85。

具體而言，根據本發明之一觀點可以提供一種禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其係包括以下步驟: 將約35.0重量份至約95.0重量份之油劑、約1.0重量份至約5.0重量份之乳化劑、及約1.0重量份至約10.0重量份之膠質萃取物，以第一反應條件予以充分乳化混合而形成乳化液；由上述(a)所得的該乳化液中加入約1.0重量份至約15.0重量份之緩衝劑、及約1.0重量份至約2.5重量份之界面活性劑充分混合並於第二反應條件下形成禽類新城病疫苗用佐劑。

依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其中(a) 第一反應條件包括於65℃~80℃之溫度下，震幅 20 mm〜25mm，攪拌轉速1200 rpm〜2400 rpm，進行反應1〜3小時後，水油度(HLB)於10〜16之間。

另，依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其中(b) 第二反應條件包括於55℃~65℃之溫度下且調整pH值為6.8〜7.4，震幅 14 mm〜18mm，攪拌轉速 800 rpm〜1200 rpm，進行反應2〜3小時。

又，依據本發明之一觀點，可使用於本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其中該油劑係為礦物油；該乳化劑係為司盤80；該膠質萃取物係為蘆薈萃取物；該緩衝劑係為；該界面活性劑係為吐溫20。

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。

以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

在以下實施例及實驗中所使用的各種試劑為市售可購得的。例如，礦物油為採用德國漢聖H&R公司製作的產品(例如，商品名：藥用級白油 70號)；禽類新城病抗原液為採用台灣國年實業有限公司委託屏東科技大學製作的產品，商品名：其本發明所用禽類新城病抗原液(Vat)為下三株病毒株中的至少一種所製備；這三株病毒株於中華民國105年3月24日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC 970070、BCRC 970071、BCRC 970072，名稱皆為禽類第VII型新城病的病毒株，將上述完成生物寄存的三株禽類第VII型新城病的病毒株接種至受精11天之雞胚胎中，孵化96小時後採收該病毒，然後將病毒以最終濃度為0.2%的福馬林(formalin,Sigma,USA)去活性。；乳化劑為採用SIGMA公司生產的司盤80 ( 例如，商品名：S6760)；介面活性劑為採用SIGMA公司生產的吐溫20(例如，商品名：P2287)。《製備禽類新城病疫苗用佐劑》《製備例1》

首先，將3.5 L的藥用級的白油、0.5 L的卵磷脂及0.5L的司盤80，一起加入調配瓶中，再加入1.5 L的磷酸鉀緩衝液(磷酸二氫鉀 34g，1mol/L氫氧化鈉溶液 175ml，蒸餾水 825ml，pH值7.2)、1.5 L的兩性離子緩衝液(NaCl 8g，KCl 0.2g，磷酸氫二鈉1.15g，磷酸二氫鉀0.2g，CaCl₂ 0.1g，含6個結晶水的氯化鎂0.1g溶於1L ddH₂ O中)，利用攪拌機(型號:UHM-10，廠牌: NIHONSEIKI 日本) 在無菌環境下，溫度65℃下，振幅20mm，攪拌轉速1200 rpm，反應進行60分鐘，充分混合後得乳化液M1，水油度10。

接著，如表1所示，將1 L的蘆薈膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取 1000 g 蘆薈，進一步可以萃取出蘆薈膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度為18.8 g/ml)、1 L的五加皮膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取1000 g 五加皮，進一步可以萃取出五加皮膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度為18.8 g/ml)一起加入乳化液M1，再同時加入0.25 L的吐溫20、0.25 L的吐溫80，在無菌環境下于室溫下先行均勻攪拌2小時；繼續利用超高速均質機以800 rpm，振幅14 mm、55℃均質攪拌1小時，pH值調整為6.8，然後經由冷凝降溫而得到本發明的禽類新城病疫苗用佐劑(S1)。《製備例2》

首先，將 6.0L的藥用級的白油、0.5 L的卵磷脂及0.5L的司盤80，一起加入調配瓶中，再加入1.5 L的磷酸鹽緩衝液(磷酸二氫鉀 34g，1mol/L氫氧化鈉溶液 175ml，蒸餾水 825ml，pH值7.2)、1.5 L的兩性離子緩衝液(NaCl 8g，KCl 0.2g，磷酸氫二鈉1.15g，磷酸二氫鉀0.2g，CaCl₂ 0.1g，含6個結晶水的氯化鎂0.1g溶於1L ddH₂ O中)，利用攪拌機(型號:UHM-10，廠牌: NIHONSEIKI日本) 在無菌環境下，溫度70 ℃下，振幅22 mm，攪拌轉速1600 rpm，反應進行80分鐘，充分混合後得乳化液M2，水油度12。

接著，如表1所示，將0.5 L的蘆薈膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取1000 g 蘆薈，進一步可以萃取出蘆薈膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度 20g/ml)、0.5 L的五加皮膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取1000 g 五加皮，進一步可以萃取出五加皮膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度 20g/ml)一起加入乳化液M2，再同時加入0.5 L的吐溫20、0.5 L的吐溫80，在無菌環境下于室溫下先行均勻攪拌2.2 小時；繼續利用超高速均質機以 900 rpm，振幅 16 mm、60 ℃均質攪拌1.2 小時，pH值調整為7.0，然後經由冷凝降溫而得到本發明的禽類新城病疫苗用佐劑(S2)。《製備例3》

首先，將7 L的三酸甘油脂、0.25 L的卵磷脂及0.25L的司盤80，一起加入調配瓶中，再加入0.2 L的磷酸鹽緩衝液(磷酸二氫鉀 34g，1mol/L氫氧化鈉溶液 175ml，蒸餾水 825ml，pH值7.2)、0.8 L的兩性離子緩衝液(NaCl 8g，KCl 0.2g，磷酸氫二鈉1.15g，磷酸二氫鉀0.2g，CaCl₂ 0.1g，含6個結晶水的氯化鎂0.1g溶於1L ddH₂ O中)，利用攪拌機(型號:UHM-10，廠牌: NIHONSEIKI日本) 在無菌環境下，溫度 75 ℃下，振幅23 mm，攪拌轉速2000 rpm，反應進行120分鐘，充分混合後得乳化液 M3，水油度14。

接著，如表1所示，將0.5 L的蘆薈膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取1000 g 蘆薈，進一步可以萃取出蘆薈膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度 22.1 g/ml)、0.5 L的五加皮膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取1000 g 五加皮，進一步可以萃取出五加皮膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度 22.1 g/ml)一起加入乳化液M3，再同時加入0.25 L的吐溫20、0.25 L的吐溫80，在無菌環境下于室溫下先行均勻攪拌2小時；繼續利用超高速均質機以 1000 rpm，振幅17 mm、62 ℃均質攪拌1小時，pH值調整為7.2，然後經由冷凝降溫而得到本發明的禽類新城病疫苗用佐劑(S3)。《製備例4》

首先，將9.5 L的礦物油、0.1 L的卵磷脂，一起加入調配瓶中，再加入0.1 L的磷酸鹽緩衝液(磷酸二氫鉀 34g，1mol/L氫氧化鈉溶液 175ml，蒸餾水 825ml，pH值7.2)，利用攪拌機(型號:UHM-10，廠牌:NIHONSEIKI日本) 在無菌環境下，溫度80 ℃下，振幅 25 mm，攪拌轉速 2400 rpm，反應進行180分鐘，充分混合後得乳化液M4，水油度16。

接著，如表1所示，將0.1 L的蘆薈膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取1000 g 蘆薈，進一步可以萃取出蘆薈膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度 25.8 g/ml)、0.1 L的五加皮膠質萃取物(利用 70%酒精來萃取1000 g 五加皮，進一步可以萃取出五加皮膠質萃取物的有效成分，製成酊劑的形式使用，其濃度 25.8 g/ml)一起加入乳化液M4，再同時加入0.1 L的吐溫20，在無菌環境下于室溫下先行均勻攪拌1小時；繼續利用超高速均質機以1200 rpm，振幅18 mm、65℃均質攪拌2小時，pH值調整為7.4，然後經由冷凝降溫而得到本發明的禽類新城病疫苗用佐劑(S4)。

依據上述《製備例1～4》其比例及資料記載於《表1》如下：

《表1》

再來，將450毫升〜600毫升的製備例S1〜製備例S4放於2000毫升燒杯中，再來將乳化均質機放入燒杯中，讓製備例S1〜製備例S4之本發明禽類新城病佐劑覆蓋乳化均質機的攪拌棒達2/3(約15公分)，轉動乳化均質機(型號:T.T-S.M-S，廠牌:台灣大鼎機械)的高速剪切力至3000rpm緩緩將350毫升〜600毫升的抗原加入轉動中的製備例S1〜製備例S4中(抗原不足350毫升時可加緩沖液補足至350毫升)；最後，當350毫升抗原都加完時可將轉速調成5000rpm，在進行最後攪拌時間五至十分鐘。其詳細配比方式記錄於下《表2》中。

《表2》

ND 實驗 1 為檢測含本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗V1〜V4應用於防疫禽類第VII型新城病之效用，用 1 日齡 SPF 雞隻 30 隻分為 5 組，分別為控制例皮下注射 2.5 μL之磷酸鹽緩衝液 (PBS)，實施例1為點鼻方式2.0 μL之含本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗V1，實施例2為皮下注射2.5 μL之含本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗V2，實施例3為肌肉注射3.0 μL之含本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗V3，實施例4為皮下注射3.2 μL之含本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗V4。

於接種後三週再補強免疫一次，其注射之疫苗與第一次相同，補強免疫兩週後犧牲雞隻，所有試驗雞隻分別於接種前 (PI-0wk)、接種後 1 週 (PI-1wk)、接種後 2 週 (PI-2wk) 及接種後 3 週 (PI-3wk) 採血，並檢測血液中細胞增殖試驗。雞隻犧牲後取其脾臟細胞，進行檢測脾臟細胞中 CD4⁺ 及 CD8⁺ 細胞之百分比。

檢測血液中細胞增殖試驗、及脾臟細胞中CD4⁺ /CD8⁺ 細胞百分比之檢測方法分別敘述於後段。

於接種後三週再補強免疫一次，其注射之疫苗與第一次相同，補強免疫兩週後犧牲雞隻，所有試驗雞隻分別於接種前 (PI-0wk)、接種後 1 週 (PI-1wk)、接種後 2 週 (PI-2wk) 及接種後 3 週 (PI-3wk) 採血，並檢測血液中細胞增殖試驗。雞隻犧牲後取其脾臟細胞，進行檢測脾臟細胞中 CD4⁺ 及 CD8⁺ 細胞之百分比。《細胞增殖試驗之檢測方法》

細胞增殖試驗採取雞隻血液，以 Histopaque^® 1077 density gradient medium 分離其 PBMC 細胞，計數細胞，調整細胞數為 2 x 10⁵ cells/100 μL/well 分注於96孔盤中，分別加入1 g/50 μL/well之Con A (Sigma，USA) 與同等體積之培養液，各三重複，置於 5% CO₂ 、37℃培養箱中培養 48 小時，加入 10 μL/well BrdU試劑標示細胞，再培養 24 小時，1000 rpm、10 分鐘離心，除去上清液，加入 200 μL/well FixDenat solution，置於室溫 30 分鐘，除去 FixDenat solution 並加入 100 μL/well anti-Brd U-pod working solution，置於室溫 90 分鐘，除去 anti-Brd U-pod working solution，加入 300 μL/ well wash solution，重複三次清洗，去除 wash solution 加入 100 μL /well substrate solution 置於室溫 5 分鐘呈色，以 ELISA reader 370 nm 波長讀取數值。將各實施例每組6隻雞隻試驗結果的細胞增殖之百分比平均值分別記錄於《表3》。

《表3》

《CD4⁺ /CD8⁺ 細胞百分比之檢測方法》

CD4⁺ /CD8⁺ 細胞表面抗原檢測將細胞液濃度調整為 2×10⁵ cells，分別以禽類單株抗體IgG1- FITC 及 IgG1-PE 染色之細胞液，作為陰性對照組(isotype control)。檢測雞細胞表面抗原CD4⁺ 及 CD8⁺ ，將 anti-CD4 單株抗體及及 anti-CD8 單株抗體 (Beckman Coulter, Inc. USA) 分別加入待測細胞液中，混合均勻後，置於冰上避光作用 30 分鐘後，於 4℃下以 300 xg離心 5 分鐘。去除上清液後加入 PBS 懸浮細胞，於 4℃下以 300 xg 離心 5 分鐘清洗細胞，重複清洗 2 次。最後加入 100 μL 含有 1% paraformaldehyde 之 PBS 懸浮細胞，以流式細胞儀 (Coulter Epics Altra Flow Cytometry，Beckman Coulter，CA) 分析其細胞表面抗原，再以 Expo 32 v1.0 MultiCOMP Software (Applied Cytometry Systems，Sheffield，UK) 分析其 CD4⁺ 及 CD 8⁺ 細胞百分比。將各實施例每組6隻雞隻試驗結果的病毒力價之平均值分別記錄於《表4》。

《表4》

根據如上述表4所示，在對照組中，該未施打本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗的雞隻血液中的免疫細胞僅增加15-18%；相對地，在實施例1~4中，經施打本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗的雞隻則顯示血液中免疫細胞的增加幅度至少超過30%，且經過時間拉長的觀察，本發明之禽類新城病疫苗用佐劑可以增加免疫保護力，因為雞隻血液中的免疫細胞三周後測試，都比原本接種對照組前高出50%。

另外，CD4⁺ /CD8⁺ 細胞百分比的結果亦顯示：在對照組沒有使用本發明的該疫苗，其CD4⁺ /CD8⁺ 細胞百分比約為10%/18%；另一方面，在實施例1~4中，經施打本發明之禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗的雞隻，CD4⁺ /CD8⁺ 細胞百分比約為25%/35%以上，顯示出接種使用本發明佐劑的疫苗可以提高雞隻體內CD4⁺ /CD8⁺ 細胞的比例，進一步證明提高免疫力及對抗新城病的效果。

從而，可以確認經施打使用該禽類新城病疫苗用佐劑之疫苗的雞隻能夠增加免疫保護能力，進而具有對抗新城病感染之優異的效果。所以，本發明之禽類新城病疫苗用佐劑能夠明顯地提高雞隻的免疫力及免疫細胞增殖，增強疫苗對雞隻在新城病上誘發保護性免疫反應。

綜上所述，本發明的內容已經以如上的實施例舉例說明了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可再進行各種的更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示的各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式也當然視為本發明所屬內容。因此，本案所欲保護的範圍也包括後述的申請專利範圍及其所界定的範圍。

Claims

一種禽類新城病疫苗用佐劑，其係由至少包括：約35.0重量份至約95.0重量份之油劑；約1.0重量份至約5.0重量份之乳化劑；約2.0重量份至約10.0重量份之膠質萃取物；約1.0重量份至約15.0重量份之緩衝劑；及約1.0重量份至約5.0重量份之界面活性劑所組成；且在實際施用時，該禽類新城病疫苗用佐劑(Adj)與禽類新城病抗原液(Vat)的摻混比(Adg：Vat)為 1：5(v/v)～1：1(v/v)，其該禽類新城病抗原液(Vat)為下三株病毒株中的至少一種所製備；這三株病毒株於中華民國105年3月24日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC 970070、BCRC 970071、BCRC 970072，名稱皆為禽類第VII型新城病的病毒株。
如請求項1所記載之禽類新城病疫苗用佐劑，其中該油劑係選自藥用級白油、花生油、礦物油、植物油、或維生素E中的至少一種。
如請求項1所記載之禽類新城病疫苗用佐劑，其中該乳化劑係選自卵磷脂、豆磷脂、司盤85、司盤83、司盤80、司盤65、司盤60、單硬脂酸甘油酯、或單油酸甘油酯中的至少一種。
如請求項1所記載之禽類新城病疫苗用佐劑，其中該膠質萃取物係選自蘆薈萃取物、五加皮萃取物、馬齒莧萃取物、葡萄柚萃取物、柿子葉萃取物、β- 葡聚醣、桑黃蘑萃取物、或冬蟲夏草萃取物中的至少一種。
如請求項1所記載之禽類新城病疫苗用佐劑，其中該緩衝劑係選自磷酸鹽緩衝劑(PBS)、Tris-HCl緩衝劑、檸檬酸鈉-磷酸鹽緩衝劑、兩性離子緩衝劑、Hepes緩衝劑、或馬來酸鹽緩衝劑中的至少一種。
如請求項1所記載之禽類新城病疫苗用佐劑，其中該界面活性劑係選自聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油、普朗尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醇醚中的至少一種。
一種禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其係包括以下步驟: (a) 將約35.0重量份至約95.0重量份之油劑、約1.0重量份至約5.0重量份之乳化劑、及約1.0重量份至約10.0重量份之膠質萃取物，以第一反應條件予以充分乳化混合而形成乳化液； (b) 由上述(a)所得的該乳化液中加入約1.0重量份至約15.0重量份之緩衝劑、及約1.0重量份至約2.5重量份之界面活性劑充分混合並於第二反應條件下形成禽類新城病疫苗用佐劑。
如請求項7所記載之禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其中(a) 第一反應條件包括於65℃~80℃之溫度下，震幅 20 mm〜25mm，攪拌轉速1200 rpm〜2400 rpm，進行反應1〜3小時後，水油度(HLB)於10〜16之間。
如請求項7所記載之禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其中(b) 第二反應條件包括於55℃~65℃之溫度下且調整pH值為6.8〜7.4，震幅 14 mm〜18mm，攪拌轉速 800 rpm〜1200 rpm，進行反應2〜3小時。
如請求項7所記載之禽類新城病疫苗用佐劑之製備方法，其中該油劑係為礦物油；該乳化劑係為司盤80；該膠質萃取物係為蘆薈萃取物；該緩衝劑係為磷酸鹽緩衝劑；該界面活性劑係為吐溫20。