TW201807192A

TW201807192A - 經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之製造

Info

Publication number: TW201807192A
Application number: TW106121607A
Authority: TW
Inventors: 蘿拉樂芙拉克; 丹尼爾關; 彼德丹尼爾賀拉克斯; 瑪歌札塔菲爾德; 飛利浦馬克思
Original assignee: 艾普森生物製藥有限公司
Priority date: 2016-07-01
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2018-03-01
Also published as: EP3263710A1; EA201990181A1; US20190161783A1; IL264109A; EP3478849A1; US11453903B2; BR112018075794A2; KR102565312B1; AU2017291252A1; CA3026366A1; JP2019531698A; CN109415750A; KR20190024984A; WO2018002348A1; SG11201810953VA; MX2018015080A

Abstract

本發明係關於一種製造經活化梭狀芽抱桿菌神經毒素之方法，該經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素係實質上無未活化的產物；一種包含此種經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之組成物；以及此等於治療之用途。

Description

經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之製造

本發明係關於一種製造實質上無未活化的產物之經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法、包含此種經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之組成物、及此等於治療的用途。

梭狀芽孢桿菌屬(genus Clostridia)中的細菌產生高效且特異性的蛋白質毒素，其可毒害其此等被遞送至的神經元及其他細胞。此種梭狀芽孢桿菌毒素之例包括由破傷風桿菌(C.tetani)(TeNT)及由肉毒桿菌(Clostridia botulinum)(BoNT)血清型A-G所產生的神經毒素，以及彼等由巴氏梭菌(C.baratii)及酪酸梭菌(C.butyricum)所產生者。

於梭狀芽孢桿菌神經毒素中有一些為已知最強效的毒素。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素視其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5ng/kg之半數致死劑量(LD₅₀)值。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者係藉由抑制受影響之神經元的功能而作用，特別是神經傳導物的釋放。而肉毒桿菌毒素作用於神經肌肉會合處且於周圍神經系統中抑制膽鹼性傳導(cholinergic transmission)，破傷風毒素則作用於中樞神經系統。

自然界中，梭狀芽孢桿菌神經毒素係以單鏈多肽的方式被合成，其係藉由蛋白酶切割事件進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連結在一起的兩條多肽鏈。切割發生於特定切割位(cleavage site)，通常稱為活化位(activation site)，其位於提供鏈間(inter-chain)雙硫鍵之半胱胺酸殘基之間。其為此種雙鏈型，為此毒素之最活性的型式。此兩條鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有大約100kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有大約50kDa之分子量。此H-鏈包含N-端轉位組件(translocation component)(H_N域)及C-端目標組件(targeting component)(H_C域)。切割位係位於L-鏈及轉位域組件之間。於HC域結合至其目標神經元且所結合的毒素經由胞內體(endosome)內化至細胞中後，H_N域將L-鏈轉位通過胞內體膜並進入細胞質液內，且L-鏈提供一種蛋白酶功能(亦已知為無細胞毒性(non-cytotoxic)蛋白酶)。

無細胞毒性蛋白酶係藉由將已知為SNARE蛋白質(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(Syntaxin))之細胞內運輸蛋白進行蛋白酶切割而作用-參見Gerald K(2002)「Cell and Molecular Biology」(第4版)John Wiley & Sons,Inc。首字母縮略詞SNARE衍生自可溶性NSF附著受體(Soluble NSF Attachment Receptor)一詞，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺-敏感性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺的。此蛋白酶功能為鋅依賴型內肽酶(zinc-dependent endopeptidase)活性且展現對SNARE蛋白質之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此無細胞毒性蛋白酶能夠抑制自標的細胞的細胞分泌。梭狀芽孢桿菌神經毒素之L-鏈蛋白酶係切割SNARE蛋白質之無細胞毒性蛋白酶。

鑒於SNARE蛋白質之普遍存在的性質，梭狀芽孢桿菌神經毒素諸如肉毒桿菌毒素已被成功地運用在廣泛的療法中。

舉例而言，吾人參考William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack,Inc.,2004)，其描述梭狀芽孢桿菌神經毒素諸如肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C₁、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F及BoNT/G、以及破傷風神經毒素(TeNT)之用途，其係用於在許多治療及化妝或美容之應用中抑制神經元傳導，例如目前市售肉毒桿菌毒素產品被核准作為治療之適應症包括：局部痙攣狀態、上肢痙攣狀態、下肢痙攣狀態、頸肌張力不全(cervical dystonia)、瞼痙攣、半面痙攣、腋多汗症(hyperhidrosis of the axillae)、慢性偏頭痛、神經性逼尿肌過動(neurogenic detrusor overactivity)、眉間紋(glabellar lines)、及嚴重魚尾紋(lateral canthal lines)。此外，梭狀芽孢桿菌神經毒素療法被描述用於治療神經肌肉失調(參見US 6,872,397)；用於治療子宮疾病(參見US 2004/0175399) ；用於治療潰瘍及胃食道逆流疾病(參見US 2004/0086531)；用於治療肌張力不全(參見US 6,319,505)；用於治療眼疾(參見US 2004/0234532)；用於治療瞼痙攣(參見US 2004/0151740)；用於治療斜視(參見US 2004/0126396)；用於治療疼痛(參見US 6,869,610、US 6,641,820、US 6,464,986、及US 6,113,915)；用於治療纖維肌痛(fibromyalgia)(參見US 6,623,742、US 2004/0062776)；用於治療下背痛(參見US 2004/0037852)；用於治療肌肉傷害(參見US 6,423,319)；用於治療竇性頭痛(sinus headache)(參見US 6,838,434)；用於治療緊張性頭痛(tension headache)(參見US 6,776,992)；用於治療頭痛(參見US 6,458,365)；用於減緩偏頭痛疼痛(參見US 5,714,469)；用於治療心血管疾病(參見US 6,767,544)；用於治療神經失調諸如帕金森氏病(Parkinson's disease)(參見US 6,620,415、US 6,306,403)；用於治療神經精神疾病(參見US 2004/0180061、US 2003/0211121)；用於治療內分泌失調(endocrine disorder)(參見US 6,827,931)；用於治療甲狀腺失調(參見US 6,740,321)；用於治療膽鹼性影響的汗腺失調(參見US 6,683,049)；用於治療糖尿病(參見US 6,337,075、US 6,416,765)；用於治療胰臟疾病(參見US 6,261,572、US 6,143,306)；用於治療癌症諸如骨腫瘤(參見US 6,565,870、US 6,368,605、US 6,139,845、US 2005/0031648)；用於治療耳疾(參見US 6,358,926、US 6,265,379)；用於治療自主神經系統障礙諸如胃腸肌肉失調及其他平滑肌功能異常(參見 US 5,437,291)；用於治療與皮膚細胞增生性疾病有關的皮膚病灶(參見US 5,670,484)；用於處理神經性發炎性疾病(參見US 6,063,768)；用於減緩掉髮及刺激毛髮生長(參見US 6,299,893)；用於治療下垂嘴(downturned mouth)(參見US 6,358,917)；用於降低食慾(參見US 2004/40253274)；用於牙齒療法及處置(參見US 2004/0115139)；用於治療神經肌肉失調及症狀(參見US 2002/0010138)；用於治療各種失調及症狀以及相關的疼痛(參見US 2004/0013692)；用於治療由黏膜過度分泌造成的症狀，諸如氣喘及COPD(參見WO 00/10598)；及用於治療非神經元性症狀諸如炎症、內分泌症狀、外分泌症狀、免疫症狀、心血管症狀、骨症狀(參見WO 01/21213)。藉由引用將所有上述出版物全文併入本文。

無細胞毒性蛋白酶諸如梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如BoNTs及TeNT)於人類及其他哺乳動物之治療及化妝處理之用途，期盼擴展至可受益於此等毒素之性質的疾病及失調之更廣範圍。

傳統上，梭狀芽孢桿菌神經毒素之製造係藉由培養肉毒桿菌細菌，隨後藉由單離及純化該梭狀芽孢桿菌神經毒素複合物而進行。然而，肉毒桿菌為產孢子細菌，因此需要專門的培養設備及設施，該設備及設施對於大腸桿菌(E.coli)等細菌的培養為不需要的。梭狀芽孢桿菌神經毒素之增加中的用途因而導致需要用於製造及純化梭狀芽孢桿菌神經毒素的替代及/或改進的方法。

梭狀芽孢桿菌神經毒素最初表現為單鏈多肽。為了完全地活化，單鏈形式必須轉化為雙鏈形式，其需要在位於輕鏈及重鏈之間的位置(「活化環(activation loop)」)之蛋白酶切割。梭狀芽孢桿菌神經毒素的活體外活化可藉由添加適合的蛋白酶來達成。然而，本技術領域中經常出現的課題係在達到完全活化之前，不希望得到的蛋白水解活性經常發生在活化環外部的位置，造成形成不合需要的「經截短的」(或「過度活化的」)產物。當活化的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素被意圖用於作為醫藥產品而作為所需要的高純度及功能性製劑時，特別有問題的是此種產物之形成。

已公開的問題解決方法需要某種形式的BoNT胺基酸序列的序列修飾；示例包括在活化環內插入特定的蛋白酶識別位，藉此改變其序列。

例如，WO0114570描述編碼BoNT蛋白質的重組核酸分子。然而，WO0114570之核酸分子被修飾成以非天然切割位取代天然切割位。因此，WO0114570之方法亦教示最佳的BoNT表現需要非天然切割位的插入。

US20080103098描述一種以雙鏈形式製造重組BoNT蛋白質的方法，包含於大腸桿菌宿主細胞中重組核酸建構體之表現。然而，該方法需要將特異之非天然的(即非梭狀芽孢桿菌的)五肽序列插入神經毒素的環域(loop domain)。插入的五肽序列形成活化切割位，其在細胞裂解時被內源性大腸桿菌蛋白酶切割。因此，US20080103098的方法教示為了達成最佳的BoNT表現，必須藉由插入非天然切割位來修飾BoNT序列。

WO2010094463描述一種自未加工或部分加工的BoNT中分離經加工的BoNT的方法，其需要使用針對未蛋白水解加工及/或部分加工的BoNT的抗體。

於WO2012020057中描述的另一種方法係基於在輕鏈及重鏈之間插入賦予物理化學性質的經修飾的連接物(linker)，且該連接物在蛋白酶切割位的側邊。該連接物的物理化學性質其必須允許部分加工或未加工的BoNT自經加工的(活化的)BoNT之分離。

因此，在本技術領域中有製造實質上純的、不倚賴於外源序列插入之全長經活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素的生物活性製劑的方法之需求。本發明藉由提供如申請專利範圍中所特定的新穎方法來解決此問題，其避免修飾梭狀芽孢桿菌神經毒素胺基酸序列或使用純化標籤的需求。

根據第一態樣，本發明提供一種製造經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，其包含使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與活化酶接觸，直到至少90%的單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素多肽被轉化成雙鏈形式。

於第二態樣，本發明提供一種藉由依據本發明之方法所獲得的活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於第三態樣，本發明提供一種包含依據本發明之活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之醫藥組成物，其實質上無單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

[發明概要]

本發明係關於一種以反直觀方法(counter-intuitive approach)製造梭狀芽孢桿菌神經毒素之生物活性的、全長的、實質上純的製劑之方法。

對於製造實質上純的梭狀芽孢桿菌神經毒素製劑的問題之直觀解決方法係調節活化過程的條件，以形成最少量之經截短的產物。然而，本發明人等發現：使用此種方法會造成梭狀芽孢桿菌神經毒素的一部分依然未切割(未活化)。換言之，此種方法產生全長經活化的、全長未活化的(單鏈)及經截短的梭狀芽孢桿菌神經毒素產物的混合物。關於此方面，重要的是注意到全長未活化及經截短的活化產物係不合需要的，當經活化雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素被意圖用來作為醫藥產品時更是如此。因此，於製造過程的後續步驟中必須移除此種不合需要的產物。

本發明人等進一步發現：將全長經活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素(雙鏈)自全長未活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素(單鏈)分離係極為困難的。

本發明人等驚訝地發現：藉由使活化步驟進行到實質上無全長未活化的產物殘留的後期階段，使得其在後續純化步驟中更容易移除不不希望得到的副產物(過度活化或經截短的產物)。

不欲受限於理論，假設自全長未活化的肉毒桿菌毒素中分離全長經活化的梭狀芽孢桿菌肉毒桿菌毒素所遇到的困難，係由於全長經活化的肉毒桿菌毒素與全長未活化的肉毒桿菌毒素之間不足以利用的物理化學差異。進一步假設，由於產物之間的一級胺基酸序列的改變，不希望得到的經截短的梭狀芽孢桿菌神經毒素副產物，具有與經活化的全長梭狀芽孢桿菌神經毒素相比而較大的物理化學差異。此等較大的物理化學差異可藉由本技術領域中已知之純化技術(例如管柱層析術)而利用，以達到全長經活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素的分離，並獲得適合用於治療的實質上純的產物。

因此，於第一態樣，提供一種製造經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，包含使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與活化酶接觸，直到超過90%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素多肽被轉化成雙鏈形式。

較佳地，該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素係與活化酶接觸，直到超過95%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素多肽被轉化成雙鏈形式。更佳地，該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素係與活化酶接觸，直到超過96%、97%、98%、99%、99,5%、99,9%或100%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素多肽被轉化成雙鏈形式。

本文中術語「活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素」係指梭狀芽孢桿菌神經毒素能夠結合至目標細胞、得以內化至該細胞、及抑制來自該細胞的神經傳導物之SNARE驅動的分泌。於本技術領域中眾所周知的是：當梭狀芽孢桿菌神經毒素為雙鏈(或「經活化」)形式時，梭狀芽孢桿菌神經毒素之生物活性程度高於當其為單鏈形式時。因此，生物活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳為雙鏈(或「經活化」)梭狀芽孢桿菌神經毒素。

本文中術語「活化」係指單鏈梭狀芽抱桿菌神經毒素多肽轉化成雙鏈(或活性)形式。

本文所用的「活化酶」(或「活化蛋白酶」)意指一種內肽酶，其能夠在位於梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及重鏈之間的位置(本技術領域中稱為「活化環(activation loop)」)切割單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，如此而允許形成完全活性的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(或「經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素」)。

適合本發明之活化酶之例包括半胱胺酸、絲胺酸及金屬蛋白酶家族的成員，諸如胰蛋白酶、Lys-C、Lys-N、及精胺醯內肽酶(arginyl endopeptidase)(內蛋白酶(endoproteinase)Arg-C、LeR)、以及活性BoNT水解酶，如EP 2 524 963 A1所揭示，藉由引用將其全文併入本文。

於一較佳具體實施例，該活化酶為胰蛋白酶。

於一最佳具體實施例，該活化酶為牛胰蛋白酶。

本發明人等確實發現相較於例如豬胰蛋白酶之其他來源的胰蛋白酶，牛胰蛋白酶更適合活化肉毒桿菌神經毒素。確實，本發明人等發現：與使用豬胰蛋白酶時相比，以牛胰蛋白酶完全活化可達到非常少之不合需要的經截短產物的出現。

鑒於豬胰蛋白酶胺基酸序列為最常使用的重組GMP等級的胰蛋白酶序列，並且係作為用於此目的的顯著的胰蛋白酶來源而被發表之事實，此對於發明人為令人驚訝的發現。對於製造預定用於治療之GMP等級之梭狀芽孢桿菌神經毒素，使用GMP等級之無動物原料確實為理想的。

於一較佳具體實施例，該活化酶為一GMP等級酵素，諸如GMP等級胰蛋白酶，更佳為GMP等級牛胰蛋白酶，進一步較佳為GMP等級重組牛胰蛋白酶。「GMP等級」意指按品質標準製造，且具有可追溯性，適用於GMP(優良製造規範(Good Manufacturing Practices))製造。

於一較佳具體實施例，該活化酶為牛胰蛋白酶，諸如獲自牛胰臟的天然胰蛋白酶(經TPCK處理或未經TPCK處理)或重組牛胰蛋白酶。

依據本發明，牛胰蛋白酶為與SEQ ID NO：1(UniProtKB登錄號P00760)具有至少90%同一性之蛋白質，例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。

牛胰蛋白酶可獲自任何適當來源且為商業上可取得，例如獲自Applied Biotechnology Institute(TrypZean^®)。或者，牛胰蛋白酶可藉由編碼具有與SEQ ID NO：1具有至少90%同一性的蛋白質之胺基酸序列的重組體表現而獲得。

本發明人等亦發現於pH6-7左右下牛胰蛋白酶對BoNT/E的活化環的特異性較高。此結果出人意料，因為在本技術領域中眾所周知的是胰蛋白酶的性能係在約pH8下最佳。

於一較佳具體實施例，使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與牛胰蛋白酶接觸的步驟係於pH5至7,5之間進行，較佳為6至7之間，例如於pH約6,5。

使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與活化酶(較佳為胰蛋白酶)接觸的步驟，較佳進行10至50小時的期間，更佳為15至30小時之間，例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小時。

使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與胰蛋白酶接觸的步驟較佳在室溫(或環境溫度)。室溫一般為16至27℃之間，較佳為18至25℃之間，例如約18、19、20、21、22、23、24或25℃。

胰蛋白酶之濃度一般為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為0.5至50μg之間，較佳為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為1至20μg之間，更佳為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為2至10μg之間，例如每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為約2、3、4、5、6、7、8、9或10μg之胰蛋白酶。

胰蛋白酶之濃度可以USP(美國藥典(United States Pharmacopeia))單位表示，於此情況下一般為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為1至500USP單位之間，較佳為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為3至100USP單位之間，更佳為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為5至50USP單位之間，例如每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為約5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45或50USP單位之胰蛋白酶。

依據一較佳具體實施例，使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與胰蛋白酶接觸的步驟係於室溫下且於pH6至7之間，藉由濃度為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為1至20μg之間的牛胰蛋白酶，進行15至30小時的期間。

依據另一較佳具體實施例，使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與胰蛋白酶接觸的步驟係於室溫下且於pH6至7之間，藉由濃度為每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為3至100USP單位之間的牛胰蛋白酶，進行15至30小時的期間。

依據本發明之一具體實施例，該方法進一步包含移除經截短的(過度活化的)梭狀芽孢桿菌神經毒素之步驟，特別是經截短的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

術語「經截短的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素」(或「不希望得到的副產物」或「過度活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素」)係指單鏈肉毒桿菌神經毒素之在多於一個位置及/或在活化環外的位置上之切割所產生的產物。

此種步驟可例如藉由使獲得的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與適合的層析樹脂接觸來進行。適合的層析樹脂之例為混合模式層析樹脂(mixed mode chromatography resin)。適合的混合模式層析樹脂之例為陶瓷羥基磷灰石(Ceramic Hydroxyapatite)(CHT)II型40微米樹脂(BioRad)。

許多不同類型的梭狀芽孢桿菌神經毒素適用於本發明。因此，於本發明之上下文中，術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」(或「梭狀芽孢桿菌毒素」)涵蓋肉毒梭狀芽孢桿菌所產生的毒素(肉毒桿菌神經毒素血清型A 、B、C₁、D、E、F及G)、破傷風桿菌所產生的毒素(破傷風神經毒素)、酪酸梭菌所產生的毒素(肉毒桿菌神經毒素血清型E)、及巴氏梭菌所產生的毒素(肉毒桿菌神經毒素血清型F)、以及經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或衍生自前述任一者的衍生物。術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦涵蓋天然存在的肉毒桿菌神經毒素雜合體(hybrid)、鑲嵌體(mosaic)及嵌合體(chimera)。

因此，於一具體實施例中，本發明的或用於本發明的梭狀芽孢桿菌神經毒素可獲自一種或多種選自由以下組成的梭狀芽孢桿菌：肉毒桿菌、破傷風桿菌、巴氏梭菌及酪酸梭菌。

肉毒桿菌神經毒素(BoNT)係由肉毒桿菌以大型蛋白質複合物形式產生，由BoNT本身與多種輔助蛋白質複合所組成。目前有7種不同類型的肉毒桿菌神經毒素，即：肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C₁、D、E、F及G，其全部共有相似的結構及作用模式。可基於利用特異性中和抗血清的去活性化來區分不同的BoNT血清型，關於此種利用血清型之分類係與胺基酸程度的序列同一性(sequence identity)百分比相關。基於胺基酸序列同一性百分比，特定的血清型之BoNT蛋白質被進一步分成不同的亞型。

本發明的或用於本發明的梭狀芽孢桿菌神經毒素可適合為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)，較佳為一種或多種選自由下列組成的群組之BoNT：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C₁、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F及BoNT/G。

於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/A。一參考BoNT/A序列具有UniProtKB登錄號P10845(SEQ ID NO：2)。

於另一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/B。一參考BoNT/B序列具有UniProtKB登錄號P10844(SEQ ID NO：3)。

於另一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/C。一參考BoNT/C₁序列具有UniProtKB登錄號P18640(SEQ ID NO：4)。

於另一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/D。一參考BoNT/D序列具有UniProtKB登錄號P19321(SEQ ID NO：5)。

於另一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/E。一參考BoNT/E序列具有UniParc I.D UPI00000010A3(SEQ ID NO：6)。

於另一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/F。一參考BoNT/F序列具有UniProtKB登錄號YP_001390123(SEQ ID NO：7)。

於另一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/G。一參考BoNT/G序列具有UniProtKB登錄號Q60393(SEQ ID NO：8)。

於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素可為TeNT。一參考TeNT序列具有UniProtKB登錄號P04958(SEQ ID NO：9)。

於一具體實施例中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素或用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/E活化環。BONT/E活化環可被定義為包含SEQ ID NO：10：「CKNIVSVKGIRKSIC」(對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基C412至C426)、或包含藉由1、2、3、4或5個胺基酸殘基插入、刪除、或取代而不同於SEQ ID NO：10之序列。

於一具體實施例中，BONT/E活化環具有由SEQ ID NO：10所組成的序列。於另一具體實施例中，BONT/E活化環具有藉由1個胺基酸殘基插入、刪除或取代而不同於SEQ ID NO：10之序列。於另一具體實施例中，BONT/E活化環具有藉由2個胺基酸殘基插入、刪除或取代而不同於SEQ ID NO：10之序列。於另一具體實施例中，BONT/E活化環具有藉由3個胺基酸殘基插入、刪除或取代而不同於SEQID NO：10之序列。於另一具體實施例中，BONT/E活化環具有藉由4個胺基酸殘基插入、刪除或取代而不同於SEQ ID NO：10之序列。於另一具體實施例中，BONT/E活化環具有藉由5個胺基酸殘基插入、刪除或取代而不同於SEQ ID NO：10之序列。

於一較佳具體實施例，該梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/E，例如一具有相對於SEQ ID NO：6至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列之BoNT/E。

術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦意圖涵蓋經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素及其衍生物，包括但不限於彼等下述者。經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或衍生物與天然(未修飾)形式的梭狀芽孢桿菌神經毒素相比，可含有經修飾的一個或多個胺基酸、或可含有一個或多個被插入之不存在於天然(未修飾)形式的梭狀芽孢桿菌神經毒素的胺基酸、或可含有與天然(未修飾)形式的梭狀芽孢桿菌神經毒素相比之一個或多個刪除的胺基酸。舉例而言，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可相對於天然(未修飾)梭狀芽孢桿菌神經毒素序列在一個或多個域(domain)中具有經修飾的胺基酸序列。此種修飾可修飾神經毒素的功能方面，例如生物活性或持續性。

經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可於重鏈的胺基酸序列中具有一個或多個修飾(例如經修飾的H_C域)，其中該經修飾的重鏈以較天然(未修飾)梭狀芽孢桿菌更高或更低的親和力而結合至目標神經細胞。H_C域中的此種修飾可包括修飾H_C域的神經節苷脂(ganglioside)結合位或蛋白質(SV2或突觸結合蛋白(synaptotagmin))結合位中的殘基，其改變與目標神經細胞的神經節苷脂受體及/或蛋白質受體的結合。此種經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之例被描述於WO 2006/027207及WO 2006/114308，藉由引用將其兩者全文併入本文。

經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可於輕鏈的胺基酸序列中具有一個或多個修飾，例如受質結合或催化域中的修飾，其可改變或修改經修飾的LC之SNARE蛋白質特異性。此種經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之例被描述於WO 2010/120766及US 2011/0318385，藉由引用將其兩者全文併入本文。

經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含增加或減少經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素的生物活性及/或生物持續性之一個或多個修飾。

術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」意圖涵蓋嵌合(或雜合)梭狀芽孢桿菌神經毒素。嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素包含來自一種梭狀芽孢桿菌神經毒素之類型或亞型的輕鏈的至少一部分及來自另一種梭狀芽孢桿菌神經毒素類型或亞型的重鏈的至少一部分。

於一具體實施例中，該嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有來自一種梭狀芽孢桿菌神經毒素類型或亞型的整個輕鏈及來自另一種梭狀芽孢桿菌神經毒素類型或亞型的重鏈。於另一具體實施例中，嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有一種梭狀芽孢桿菌神經毒素類型或亞型的重鏈的一部分(例如結合域)，與來自另一種梭狀芽孢桿菌神經毒素類型或亞型的重鏈的另一部分。類似地或替代地，治療成分可包含來自不同梭狀芽孢桿菌神經毒素類型或亞型的輕鏈部分。此種雜合或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素係有用的，例如作為將此種梭狀芽孢桿菌神經毒素的治療益處遞送至下述患者的手段：對指定的梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型具有免疫抗性的患者；對指定的梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈結合域可能具有低於平均濃度的受體的患者；或對可能具有膜或囊泡毒素基質(例如，SNAP-25、VAMP及突觸融合蛋白(syntaxin))的蛋白酶抗性變體(variant)的患者。雜合及嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素被描述於US 8,071,110及GB1607901.4(尚未公開)，藉由引用將其全文併入本文。因此，於一具體實施例中，根據本發明的方法或用途之用於純化的梭狀芽孢桿菌神經毒素可為工程製梭狀芽孢桿菌神經毒素(engineered clostridial neurotoxin)，合適地，其可為工程製嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素。

術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」意圖涵蓋重定靶向的(re-targeted)梭狀芽孢桿菌神經毒素。於一重定靶向的梭狀芽孢桿菌神經毒素，該梭狀芽孢桿菌神經毒素被修飾成包括被稱為目標部分(Targeting Moiety)(TM)的外源性配位體(ligand)。選擇該TM以提供對於所欲目標細胞的結合特異性，並且作為重定靶向過程的一部分，可移除梭狀芽孢桿菌神經毒素之天然結合部分(例如H_C域或H_CC域)。重定靶向的技術被描述於例如：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；及WO 1999/58571；藉由引用將其全部之全文併入本文。因此，於一具體實施例中，用於本發明的工程製梭狀芽孢桿菌神經毒素可為工程製重定靶向的梭狀芽孢桿菌神經毒素。

本發明亦涵蓋使用包含「破壞性(destructive) 切割位」的梭狀芽孢桿菌神經毒素。於該梭狀芽孢桿菌神經毒素中，將非天然蛋白酶切割位併入梭狀芽孢桿菌神經毒素中所選擇的位置，該位置處的切割會降低梭狀芽孢桿菌神經毒素的活性或使梭狀芽孢桿菌神經毒素去活性化。在投予後梭狀芽孢桿菌神經毒素遷移到非目標位置的情況下，破壞性蛋白酶切割位對於藉由局部蛋白酶的切割可為敏感的。適合的非天然蛋白酶切割位包括彼等上述者。包含破壞性切割位的梭狀芽孢桿菌神經毒素被描述於WO 2010/094905及WO 2002/044199，藉由引用將其兩者全文併入本文。

於一較佳具體實施例中，本發明之或用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素不含：天然存在的梭狀芽孢桿菌神經毒素複合物中所存在的複合蛋白質。

於一具體實施例中，本發明之或用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含：示於SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9之多肽序列、或者具有相對於其至少65%或70%序列同一性之多肽序列。

於一具體實施例中，本發明之或用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含：示於SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9之多肽序列、或者具有相對於其至少75%或80%序列同一性之多肽序列。

於一具體實施例中，本發明之或用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含：示於SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9之多肽序列、或者具有相對於其至少85%或90%序列同一性之多肽序列。

於一具體實施例中，本發明之或用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含：示於SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9之多肽序列、或者具有相對於其至少95%或99%序列同一性之多肽序列。

於一較佳具體實施例中，本發明之或用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素包含：示於SEQ ID NO：6之多肽序列、或者具有相對於其至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之多肽序列。

兩個或更多個核酸或胺基酸序列之間的「序列同一性百分比」係序列共有的相同位置的數目的函數。因此，可以將相同的核苷酸/胺基酸的數目除以核苷酸/胺基酸的總數乘以100來計算同一性%。序列同一性%的計算亦可考量為了最佳化兩個或更多個序列的比對所需要導入之間隙的數目及每個間隙的長度。兩個或更多個序列之間的序列比較及百分比同一性的確定可使用諸如BLAST的特定數學演算法來進行，其會為本技術領域中具有通常知識者所熟悉的。

於一具體實施例中，用於本發明之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由於異源宿主細胞諸如細菌、昆蟲、酵母、微生物、哺乳動物或植物細胞中、或者於無細胞系統中，表現編碼單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的基因而獲得。較佳地，異源宿主細胞為大腸桿菌。

於另一態樣，本發明提供一種可藉由依據本發明之方法而獲得的活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於另一態樣，本發明提供一種包含依據本發明之活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的醫藥組成物，其中該組成物係實質上無單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

本文使用之術語「實質上純的」或「實質上無」意指不希望得到的污染物(或副產物)的含量低於10%，例如低於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0.1%。

於一較佳具體實施例中，依據本發明之醫藥組成物包含低於10%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如低於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0.1%。

於一更佳具體實施例，依據本發明之醫藥組成物進一步包含低於10%之經截短的(過度活化的)梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如低於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0.1%。

於一較佳具體實施例，依據本發明之醫藥組成物包含低於5%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素及低於5%之經截短的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一更佳具體實施例，依據本發明之醫藥組成物包含低於1%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素及低於1%之經截短的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一更佳具體實施例，依據本發明之醫藥組成物包含低於0.1%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素及低於0.1%之經截短的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。

單鏈、雙鏈及經截短的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的相對量可藉由本技術領域中眾所周知的方法來評估，例如藉由使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然後藉由光密度測定法(densitometry)分析來確定相對量(參見例如實施例1)，藉由毛細管電泳或藉由UPLC(超高效液相層析)方法來評估純度(粒徑篩析、離子交換、逆相、疏水性相互作用層析)。

於一具體實施例中，依據本發明之醫藥組成物係用於治療。

依據本發明之醫藥組成物可用於治療或預防選自下列之疾病、症狀或症候群：肌肉失調(muscular disorder)、神經肌肉失調、神經失調、眼科疾病(ophtalmological disorder)、疼痛障礙、心理障礙、關節疾病(articular disorder)、發炎性疾病(inflammatory disorder)、內分泌失調及泌尿學疾病(urological disorder)，包括：‧眼科疾病，選自由下列組成的群組：瞼痙攣、斜視(包括限制性或肌原性斜視)、弱視、振動幻視(oscillopsia)、保護性眼瞼下垂(protective ptosis)、對於角膜保護之治療性眼瞼下垂(therapeutic ptosis for corneal protection)、眼球震顫、內斜視(estropia)、複視、瞼內翻、眼瞼退縮(eyelid retraction)、眼眶肌病(orbital myopathy)、隱斜視、伴隨性眼對準失調(concomitant misalignment)、非伴隨性眼對準失調(nonconcomitant misalignment)、原發性或繼發性內斜視(esotropia)或外斜視(exotropia)、核間性眼肌麻痺(internuclear ophthalmoplegia)、反側偏斜(skew deviation)、杜恩氏症候群(Duane's syndrome)及上眼瞼退縮； ‧運動障礙(movement disorder)，包括：半面痙攣、斜頸、兒童或成人的痙攣狀態(例如於腦性麻痺、中風後(post-stroke)、多發性硬化、創傷性(traumatic)腦損傷或脊髓損傷患者)、特發性局部肌張力不全(idiopathic focal dystonia)、肌肉僵硬(muscle stiffness)、書寫痙攣(Writer's cramp)、手肌張力不全、VI神經麻痺(VI nerve palsy)、口下頜肌張力不全、頭部震顫(head tremor)、遲發性運動障礙、遲發性肌張力不全、職業性痙攣(occupational cramp)(包括音樂家痙攣(musicians' cramp))、面神經麻痺(facial nerve palsy)、頜閉合痙攣(jaw closing spasm)、面痙攣、聯帶運動(synkinesia)、震顫、原發性書寫震顫、肌陣攣、僵體症候群(stiff-person-syndrome)、足部肌張力不全、面部麻痺(facial paralysis)、臂痛指動症候群(painful-arm-and-moving-fingers-syndrome)、抽搐障礙(tic disorder)、肌張力不全抽搐、妥瑞氏症(Tourette's syndrome)、神經性肌強直(neuromyotonia)、下巴震顫(trembling chin)、外直肌麻痺(lateral rectus palsy)、肌張力不全型足內翻(dystonic foot inversion)、下頜肌張力不全、兔症候群(Rabbit syndrome)、小腦震顫、III神經麻痺、腭肌陣攣、靜坐不能(akasthesia)、肌肉痙攣、IV神經麻痺、步態凍結(freezing-of-gait)、伸肌軀幹肌張力不全(extensor truncal dystonia)、後臉神經麻痺聯帶運動(post-facial nerve palsy synkinesis)、繼發性肌張力不全、帕金森氏病、亨汀頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)、癲癇、關閉期肌張力不全(off period dystonia)、腦破傷風、肌纖維顫動及良性痙攣-肌束顫動症候群(benign cramp-fasciculation syndrome)；‧耳鼻喉科疾病(otorhinolaryngological disorder)，包括：痙攣性發音困難、耳疾、聽力損傷、耳內敲擊聲(ear click)、耳鳴、眩暈、梅尼爾氏病(Meniere's disease)、耳蝸神經功能異常(cochlear nerve dysfunction)、口吃、環咽肌性吞嚥困難(cricopharyngeal dysphagia)、磨牙、慢性吸氣中的喉部閉合(closure of larynx in chronic aspiration)、聲帶肉芽腫(vocal fold granuloma)、室性肌張力不全(ventricular dystonia)、室性發音困難、突變性發音困難、牙關緊閉、打鼾、聲音震顫、間斷音(aspiration)、舌前突肌張力不全(tongue protrusion dystonia)、腭震顫、唇部深咬(deep bite of lip)及喉肌張力不全；初次咀嚼症候群(First Bite Syndrome)；‧胃腸疾病(gastrointestinal disorder)，包括：弛緩不能(achalasia)、肛裂、便秘、顳下頜關節功能異常(temperomandibular joint dysfunction)、歐蒂氏括約肌功能異常、歐蒂氏括約肌持續高血壓(sustained sphincter of Oddi hypertension)、腸肌肉失調、恥骨直腸肌症候群、肛門痙攣(anismus)、幽門痙攣、膽囊功能異常、胃腸或食道運動功能異常、瀰漫性食道痙攣及胃輕癱；‧泌尿生殖器疾病(urogenital disorder)，包括：逼尿肌括約肌協同失調(detrusor sphincter dyssynergia)、逼尿肌反射過強、神經性膀胱功能異常(例如於帕金森氏病、脊髓損傷、中風或多發性硬化症患者)、膀胱過動症(overactive bladder)、神經性逼尿肌過動、膀胱痙攣、尿失禁、尿滯留、肥厚性膀胱頸、排尿功能異常(voiding dysfunction)、間質性膀胱炎(interstitial cystitis)、陰道痙攣、子宮內膜異位症、骨盆痛、前列腺肥大(良性前列腺增生)、前列腺痛(prostatodynia)、前列腺癌及陰莖異常勃起(priapism)；‧皮膚病學疾病(dermatological disorder)，包括：皮膚細胞增生性疾病(cutaneous cell proliferative disorder)、皮膚傷口、牛皮癬、紅斑痤瘡(rosacea)、痤瘡(acne)；罕見的遺傳性皮膚疾病，如福克斯-福代斯症候群(Fox-Fordyce syndrome)或Hailey-Hailey氏病(Hailey-Hailey disease)；瘢瘤及肥厚性瘢痕減少；毛孔縮小(pore size reduction)；皮膚之發炎症狀；皮膚之疼痛性發炎症狀；‧疼痛障礙，包括：背痛(上背痛、下背痛)、肌筋膜痛(myofascial pain)、緊張性頭痛、纖維肌痛、疼痛症候群(painful syndrome)、肌痛、偏頭痛、頸椎過度屈伸損傷(whiplash)、關節痛、術後疼痛、與肌肉痙攣無關的疼痛及與平滑肌疾病相關的疼痛；‧發炎性疾病，包括：胰臟炎、神經性發炎性疾病(包括痛風、肌腱炎、滑囊炎、皮肌炎及僵直性脊椎炎)；‧分泌失調(inflammatory disorder)，諸如：過多的腺體分泌、多汗症(包括腋窩多汗症、手掌多汗症及弗雷氏症候群(Frey's syndrome))、流涎過多(hypersalivation)、多涎(sialorrhoea)、溴汗症、黏液分泌過多、淚液分泌過多(hyperlacrimation)、全泌腺功能異常(holocrine gland dysfunction)；過多皮脂分泌；‧呼吸障礙(respiratory disorder)，包括：鼻炎(包括過敏性鼻炎)、COPD、氣喘及結核病；‧肥厚性疾病(hypertrophic disorder)，包括：肌肉肥大、咬肌肥大(masseteric hypertrophy)、肢端肥大症及伴隨肌肉痛之神經性脛骨前肌肥大(neurogenic tibialis anterior hypertrophy with myalgia)；‧關節疾病，包括：網球肘(或肘之上髁炎)、關節炎、髖關節炎(coxarthrosis)、骨關節炎、肩部迴旋肌冠病變(rotator muscle cap pathology of the shoulder)、類風濕關節炎及腕隧道症候群；‧內分泌失調，如：第II型糖尿病、高升糖素血症、高胰島素症、低胰島素症、高鈣血症、低鈣血症、甲狀腺疾病(包括格雷氏病(Grave's disease)、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲狀腺機能亢進及甲狀腺機能減退)、副甲狀腺疾病(包括副甲狀腺機能亢進及副甲狀腺機能減退)、庫欣氏症候群(Gushing's syndrome)及肥胖；‧自體免疫疾病，如全身性紅斑狼瘡；‧增生性疾病，包括副神經節瘤腫瘤、前列腺癌及骨腫瘤；‧創傷性損傷(traumatic injury)，包括運動損傷、肌肉損傷、肌腱傷口及骨折；以及‧獸醫用途(例如，哺乳動物的固定(immobilisation)、馬疝痛、動物弛緩不能(achalasia)或動物肌肉痙攣)。

依據本發明之醫藥組成物於化妝品或美容中的用途亦為本發明之一態樣，例如用於治療或預防性治療或預防皮膚皺紋，特別是面部皺紋，諸如面部皺眉紋(facial frown lines)、眼睛輪廓的皺紋(wrinkles of the contour of the eye)、頭鞍皺眉紋(glabellar frown lines)、下垂嘴(downturned mouth)。

依據本發明之醫藥物組成物亦可用於美容醫學(其係用於改善美容外觀)，特別是用於治療或預防皮膚皺紋，特別是面部皺紋，諸如面部皺眉紋、眼睛輪廓的皺紋、頭鞍皺眉紋、下垂嘴、頸部皺紋(頸闊肌紋(platysmal band))、下巴皺紋(頦肌(mentalis)、橘皮現象(peau d'orange)、淺凹下巴(dimpled chin))、額頭紋、「刮傷皮膚」皺紋、隆鼻治療(nasal lift treatment)或睡紋(sleep lines)。

除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有如本揭示內容之所屬技術領域中具通常知識者通常理解之相同意義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,20 ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)；及Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)對所屬技術領域中具通常知識者提供本揭示內容使用的許多術語的通用字典。

本揭示內容不受本文揭示的示例性方法及材料的限制，並且類似或等同於本文所述者的任何方法及材料皆可用於本揭示內容之具體實施例的實踐或測試。數值範圍包括定義範圍的數字。除非另有指明，分別將任何核酸序列皆以5’至3’的方向從左寫至右；將胺基酸序列以胺基至羧基的方向從左寫至右。

本文提供的標題並非本揭示內容之各個態樣或具體實施例的限制，其可藉由參考說明書整體而獲得。因此，緊接於後所定義的術語藉由參考說明書整體而被更完整地定義。

胺基酸於本文中使用胺基酸的名稱，以三個字母的縮寫或單個字母的縮寫。

於本文中使用時，術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術語「蛋白質」同義。於某些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「肽」同義。於某些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「酶」同義。

於本文中使用時，術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。

術語「蛋白質」及「多肽」於本文中可互換使用。於本揭示內容及申請專利範圍中，可以使用用於胺基酸殘基的習用單字母及三字母代碼。用於胺基酸的三字母代碼係遵守IUPACIUB生物化學聯合命名委員會(JCBN)而定義。亦應當理解，由於遺傳密碼的簡併性(degeneracy)，多肽可被多於一個核苷酸序列所編碼。

術語之其它定義可展現於整個說明書中。於更詳細地描述示例性具體實施例之前，應理解本揭示內容並未限於所描述的特定具體實施例，因此當然可加以變化。亦應當理解，本文使用的術語僅用於描述特定具體實施例之目的，並無意作為限制，因此本揭示內容的範疇將僅被所附之申請專利範圍所限制。

在提供一數值範圍的情況下，應當理解除非上下文另有明確規定，否則在該範圍的上限及下限之間的每個居中值(intervening value)至下限單位的十分之一亦被具體揭示。於本揭示內容中涵蓋「所述範圍內的任何所述數值或居中值」與「所述範圍內的任何其他所述或居中值」之間的每個較小範圍。此等較小範圍的上限及下限可獨立地在該範圍內被包括或排除，且在較小範圍內包括此限值中之任一者、兩者皆不包括或兩者皆包括的每個範圍亦涵蓋在本揭示內容中，受到所述範圍內任何明確排除的限制。當於所述範圍包括此限值之一個或兩個時，排除彼等所包括的限值之任一者或兩者的範圍亦被包括於本揭示內容中。

應指出，於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」(「a」、「an」)、及「該」(「the」)包括複數指涉對象，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一種梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括多種的此種候選試劑；並且提及「該梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括所屬技術領域中具通常知識者已知之一種或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物(equivalent)等。

本文所討論的公開文獻僅作為在本申請的申請日之前的揭示內容而提供。本文中的任何內容皆不得解釋為承認這些公開文獻構成所附申請專利範圍之先前技術。

僅作為例示，將參考以下圖式及實施例來描述本發明。

僅作為例示，將參考所附圖式來描述本發明之具體實施例，其中：圖1顯示以最終濃度分別為0.3及0.4μg/mL之重組豬胰蛋白酶(Roche)，於pH8、蛋白質濃度0.55mg/mL、20℃下將未活化的肉毒桿菌神經毒素樣品保溫(incubate)後，全長經活化的肉毒桿菌神經毒素(endonegative)及經截短的活化肉毒桿菌神經毒素重鏈的相對量。將樣品移動用於SDS-PAGE分析。藉由光密度測定法分析每個SDS-PAGE樣品。

圖2顯示於pH8，以各種濃度的牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)活化單鏈endonegative肉毒神經毒素E(0.55mg/mL)且在20℃下保溫8小時後，在還原條件下藉由SDS-PAGE的分析。(電泳道(lane)1：分子量標記；電泳道2：-20℃對照；電泳道3：+20℃對照；電泳道4：0.2μg/mL胰蛋白酶；電泳道5：0.4μg/mL胰蛋白酶；電泳道6：0.6μg/mL胰蛋白酶；電泳道7：0.8μg/mL胰蛋白酶；電泳道8：1.0μg/mL胰蛋白酶)。

圖3顯示在pH6.5、7.0、7.5及7.8下以重組牛胰蛋白酶活化並在20℃(神經毒素濃度：0.55mg/mL，重組牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)濃度：1,5μg/mL)下保溫16小時後，endonegative肉毒桿菌神經毒素E重鏈(HC)、輕鏈(LC)及經截短的重鏈(tHC)之各自的百分比。於還原條件下藉由SDS-PAGE並藉由光密度測定法而分析樣品。

圖4顯示以牛胰蛋白酶活化，並使用陶瓷羥基磷灰石II型層析管柱進行分離後，可以達成自經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素分離全長雙鏈肉毒桿菌神經毒素E(endonegative)。藉由線上A_280nm讀數(online A_280nm readings)監測來自管柱之全長雙鏈肉毒桿菌神經毒素及經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素的洗提(elution)，合併僅含有全長雙鏈肉毒桿菌神經毒素之選定部分(fraction)，並於還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE分析。

圖5：BoNT/A-UniProtKB登錄號P10845(SEQ ID NO：2)之蛋白質序列。

圖6：BoNT/B-UniProtKB登錄號P10844(SEQ ID NO：3)之蛋白質序列。

圖7：BoNT/C-UniProtKB登錄號P18640(SEQ ID NO：4)之蛋白質序列。

圖8：BoNT/D-UniProtKB登錄號P19321(SEQ ID NO：5)之蛋白質序列。

圖9：BoNT/E-UniParc I.D UPI00000010A3(SEQ ID NO：6)之蛋白質序列。

圖10：BoNT/F-UniProtKB登錄號YP_001390123(SEQ ID NO：7)之蛋白質序列。

圖11：BoNT/G-UniProtKB登錄號Q60393(SEQ ID NO：8)之蛋白質序列。

圖12：TeNT-UniProtKB登錄號P04958(SEQ ID NO：9)之蛋白質序列。

圖13：牛胰蛋白酶(SEQ ID NO：1)之蛋白質序列。

[實施例]

藉由引用將上述說明書中提及的所有公開文獻併入本文。於不脫離本發明之範疇及精神的情況下，本發明之所述方法及系統的各種修飾及變化對於本技術領域中具通常知識者會為顯而易見的。儘管本發明係以結合特定之較佳具體實施例的方式來描述，但應當理解，所請求之本發明不應被不適當地限於此等特定具體實施例。確實，用於實施本發明之所述模式的各種修飾係確定在後述申請專利範圍之範疇內，此對於生物化學及生物技術或相關領域中具有通常知識者係顯而易見的。

實施例1

於pH8，將蛋白質濃度為0.55mg/mL的單鏈肉毒桿菌神經毒素E(endonegative)樣品與最終濃度為0.3及0.4μg/mL的重組豬胰蛋白酶(Roche)在20℃下保溫。至6小時為止每30分鐘、以及之後至9小時為止每60分鐘，將樣品移動用於在還原條件下藉由SDS-PAGE之分析。藉由光密度測定法分析每個SDS-PAGE樣品，以確定全長雙鏈肉毒桿菌神經毒素、經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素重鏈及單鏈肉毒桿菌神經毒素的相對量。然後將全長雙鏈肉毒桿菌神經毒素及經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素的數值繪製在圖表上(圖1)。當與豬胰蛋白酶接觸時，於達成肉毒桿菌神經毒素之完全活化之前，出現經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素。

實施例2-藉由不同濃度之牛胰蛋白酶的活化於pH8.0，將蛋白質濃度為0.55mg/mL的單鏈肉毒桿菌神經毒素E(endonegative)樣品分別與最終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8及1.0μg/mL之牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)於20℃下保溫。於8小時後，將樣品移動用於在還原條件下藉由SDS-PAGE之分析。結果示於圖2，顯示達成完全活化之前，於每個樣品中觀察到重鏈截短。

實施例3-不同pH下之藉由牛胰蛋白酶的活化

於pH6.5、7.0、7.5及7.8，將蛋白質濃度0.55mg/mL的單鏈肉毒桿菌神經毒素E(endonegative)樣品與最終濃度1,5μg/mL的重組牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)在20℃下保溫。於16小時後，將樣品移動用於還原條件下藉由SDS-PAGE之分析。藉由光密度測定法分析每個SDS-PAGE樣品，以確定經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素重鏈的相對量。結果示於圖3及表1。於較高pH下更容易發生經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素的形成。

表1-於不同pH下經截短的重鏈之百分比(<LOD：低於檢測極限)

實施例4-以牛胰蛋白酶活化後之經活化神經毒素的純化

將含有已藉由與78.57μg Trypzean(牛胰蛋白酶)於 20℃下保溫18小時而活化之endonegative BoNT/E的 26mg總蛋白質，施用於5mL陶瓷羥基磷灰石II型管柱。將管柱以結合緩衝液(binding buffer)(25mM磷酸鈉，pH6.5)洗滌，然後使用結合緩衝液及洗提緩衝液(elution buffer)(500mM磷酸鈉pH6.5)，以線性梯度提高磷酸鈉濃度的方式、以35倍管柱體積進行洗提，以2.5mL部分(fraction)進行收集。藉由線上A_280nm讀數監測來自管柱的全長雙鏈肉毒桿菌神經毒素及經截短的雙鏈肉毒桿菌神經毒素的洗提，合併僅含有全長雙鏈肉毒桿菌神經毒素的選定部分，並於還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE分析(圖4)。

實施例5-全長經活化的肉毒桿菌神經毒素E製劑

藉由解凍種源庫小瓶(seed bank vial)並接種於含有100mL modified Terrific Broth(mTB)的振盪瓶中來製備肉毒桿菌神經毒素E接種體大腸桿菌培養物。然後將燒瓶在振盪培養箱中於25℃下培育17小時。接種體培養物係用於接種五個振盪瓶，每個振盪瓶中含有1L的mTB。將細胞在振盪培養箱中於37℃下培養至指數生長期；將培養的溫度降至16℃；藉由加入異丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)(IPTG)至終濃度為0.1mM而誘導培養物。使用中空纖維膜藉由切向流過濾(TFF)而於誘導細胞20小時後收集細胞。首先將培養物濃縮5倍，然後以5倍體積的裂解緩衝液(lysis buffer)(100mM磷酸鈉，100mM NaCl，1.3M(NH4)2SO4，pH7.8)滲濾。

藉由通過機械細胞破碎機兩次而均質化所產生的細胞糊漿料。藉由離心使不溶性細胞碎片沉澱，並回收上清液，將其施用於填充有Butyl Sepharose 4 FF(GE Lifesciences)的管柱，該管柱以結合緩衝液(100mM磷酸鈉，100mM NaCl，1.25M(NH₄)₂SO₄，pH7.8)洗滌。以下述結合及洗提(100mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH7.8)緩衝液之混合物，使用三階段梯度，從管柱中洗提未活化的肉毒桿菌神經毒素E，產物係洗提於階段2。

階段1 88%裝填緩衝液(loading buffer)；12%洗提緩衝液

階段2 58%裝填緩衝液；42%洗提緩衝液

階段3 100%洗提緩衝液

然後使用中空纖維膜藉由TFF將來自階段2的材料濃縮約兩倍，然後以10倍體積的25mM磷酸鈉pH6.5緩衝液進行滲濾。滲濾後，藉由離心使滲餘物中的任何不溶物質沉澱，並將上清液施用於負層析(negative chromatography)步驟中填充有Q Sepharose HP(GE Lifesciences)的管柱。收集含有未活化的肉毒桿菌神經毒素的流出液(flowthrough)，並將管柱以25mM磷酸鈉pH6.5洗滌以使產物回收率最大化。

然後以25mM磷酸鈉pH6.5將流出液稀釋至總蛋白濃度0.5mg/ml，且與7.27USP單位/mL重組牛胰蛋白酶(TrypZean^®)於室溫下保溫21小時。保溫後，將活化的肉毒桿菌神經毒素E施加到陶瓷羥基磷灰石柱II型管柱，以結合緩衝液(25mM磷酸鈉，pH6.5)洗滌。使用結合緩衝液及洗提緩衝液(500mM磷酸鈉，pH6.5)，以線性梯度從管柱洗提經活化肉毒桿菌神經毒素。

合併含有全長經活化的肉毒桿菌神經毒素的部分，並於負層析步驟中將其施用於填充有Benzamidine Sepharose FF(high-sub)(GE Lifesciences)的管柱。收集含有全長經活化的肉毒桿菌神經毒素的流出液，並將管柱以裝填緩衝液(110mM磷酸鈉，pH6.5)洗滌以使產物回收率最大化。使用中空纖維筒藉由TFF將流出液滲濾到具有5倍體積的25mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH6.5的最終儲存緩衝液中。

<110> IPSEN BIOPHARM LIMITED

<120> 經活化梭菌神經毒素之製造

<130> IBL 002-EP

<160> 10

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 246

<212> PRT

<213> 歐洲牛

<400> 1

<210> 2

<211> 1296

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 1276

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 1252

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 1278

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 7

<210> 8

<211> 1297

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸

<400> 8

<210> 9

<211> 1315

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<400> 9

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E活化環

<400> 10

Claims

一種製造經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，其包含使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與活化酶接觸，直到至少90%之單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素被轉化成雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。
如請求項1之方法，其中該活化酶為胰蛋白酶。
如請求項2之方法，其中該胰蛋白酶為牛胰蛋白酶，且其中該牛胰蛋白酶具有相對於SEQ ID NO：1具至少90%同一性之胺基酸序列。
如請求項3之方法，其中該牛胰蛋白酶係選自由牛胰臟獲得的天然胰蛋白酶及重組牛胰蛋白酶。
如請求項3或4之方法，其中該使該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與牛胰蛋白酶接觸的步驟係於pH5至7,5之間進行，較佳為6至7之間，例如於pH約6,5。
如請求項5之方法，其中該使該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與該牛胰蛋白酶之接觸係於室溫下，於pH值6至7之間，進行15至25小時的期間，且其中該牛胰蛋白酶之濃度係每毫克之梭狀芽孢桿菌神經毒素為0.5至3μg之間。
如請求項1至6中任一項之方法，其進一步包含移除經截短的梭狀芽孢桿菌神經毒素之步驟。
如請求項7之方法，其中該移除經截短的梭狀芽孢桿菌神經毒素之步驟包含使該經活化梭狀芽孢桿菌神經毒素與混合模式層析樹脂(mixed mode chromatography resin)接觸。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G及TeNT。
如請求項1至9中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係相較於野生型肉毒桿菌神經毒素為經修飾的肉毒桿菌神經毒素，例如經突變的梭狀芽孢桿菌神經毒素、嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素或重定靶向的(retargeted)梭狀芽孢桿菌神經毒素。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/E活化環(activation loop)。
如請求項1至11中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/E。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由於異源性宿主細胞中、較佳為於大腸桿菌中，表現編碼該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的基因而獲得。
一種活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，其可獲自如請求項1至13中任一項之方法。
一種包含如請求項14之活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之醫藥組成物，其中該組成物係實質上無單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。
如請求項15之醫藥組成物，其係用於治療之用途，例如用於治療眼科疾病(ophtalmological disorder)、運動障礙(movement disorder)、耳鼻喉科疾病(otorhinolaryngological disorder)、胃腸疾病 (gastrointestinal disorder)、泌尿生殖器疾病(urogenital disorder)、皮膚病學疾病(dermatological disorder)、疼痛障礙、發炎性疾病(inflammatory disorder)、分泌失調(inflammatory disorder)、呼吸障礙(respiratory disorder)、肥厚性疾病(hypertrophic disorder)、關節疾病(articular disorder)、內分泌失調(endocrine disorder)、自體免疫疾病、增生性疾病、創傷性損傷(traumatic injury)、獸醫用途。
一種如請求項15之醫藥組成物之用途，其係用於化妝品或美容。