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TW201734209A - 用於降低pd-l1表現之寡核苷酸 - Google Patents

用於降低pd-l1表現之寡核苷酸 Download PDF

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TW201734209A
TW201734209A TW106108305A TW106108305A TW201734209A TW 201734209 A TW201734209 A TW 201734209A TW 106108305 A TW106108305 A TW 106108305A TW 106108305 A TW106108305 A TW 106108305A TW 201734209 A TW201734209 A TW 201734209A
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海珊 傑凡巴克特
梅蘭妮 傑克羅特
索倫 歐特森
蘇法隆尼 盧安賽
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羅氏創新中心哥本哈根有限公司
赫孚孟拉羅股份公司
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Abstract

本發明係關於能夠降低靶細胞中之PD-L1表現之反義寡核苷酸。該等寡核苷酸雜交至PD-L1 mRNA。本發明另外關於該寡核苷酸之偶聯物及醫藥組合物以及使用該寡核苷酸治療病毒性肝感染(諸如HBV、HCV及HDV)、寄生蟲感染(諸如瘧疾、弓蟲症、利什曼病(leishmaniasis)及錐蟲病)或肝癌或肝中轉移之方法。

Description

用於降低PD-L1表現之寡核苷酸
本發明係關於與程式性死亡配體-1 (PD-L1)互補以降低肝中之PD-L1表現之寡核苷酸(寡聚物)。本發明亦係關於緩解由肝感染或肝癌引起之T細胞耗竭之方法。相關感染係慢性HBV、HCV及HDV及諸如瘧疾及弓蟲症等寄生蟲感染(例如由瘧原蟲屬(Plasmodium )、尤其物種間日瘧原蟲(P.vivax )、三日瘧原蟲(P. malariae )及惡性瘧原蟲(P. falciparum )之原生動物引起)。
由程式性死亡-1 (PD-1)受體及其配體PD-L1 (或B7-H1或CD274)組成之共刺激路徑已知直接促成T細胞耗竭，從而使得在慢性肝感染期間缺乏病毒控制。PD-1路徑亦在自體免疫性中發揮一定作用，此乃因此路徑遭到破壞之小鼠發生自體免疫疾病。 已展示，阻斷PD-1與PD-L1之間之相互作用之抗體會增強T細胞反應、尤其CD8+細胞毒性T細胞之反應(參見Barber等人，2006 Nature第439卷第682頁及Maier等人，2007 J. Immunol.第178卷第2714頁)。 WO 2006/042237闡述藉由評價腫瘤中之PD-L1 (B7-H1)表現來診斷癌症之方法且建議向患者遞送干擾PD-1/PD-L1相互作用之藥劑。干擾劑可為抗體、抗體片段、siRNA或反義寡核苷酸。並未提供該等干擾劑之具體實例且並未提及任何慢性肝感染。 亦在(例如) WO 2005/007855、WO 2007/084865及US 8,507,663中揭示使用雙鏈RNA (dsRNA、RNAi或siRNA)分子來達成RNA干擾調介之PD-L1抑制。該等專利並未闡述至肝之靶向遞送。 Dolina等人， 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72闡述在活體內將靶向PD-L1之siRNA分子遞送至庫弗氏細胞(Kupffer cell)，由此增強MCMV感染小鼠中之NK及CD8+ T細胞清除。此論文斷定，遞送至肝細胞之靶向PD-L1之siRNA分子不能有效地增強CD8+ T細胞效應物功能。 siRNA方式顯著不同於單鏈反義寡核苷酸方式，此乃因生物分佈及作用模式極為不同。如Xu等人，2003 Biochem. Biophys. Res .Comm.第306卷第712-717頁中所闡述，反義寡核苷酸及siRNA對mRNA中之靶位點具有不同偏好。 WO2016/138278闡述使用兩種或更多種在5’端連接之單鏈反義寡核苷酸來抑制免疫檢查點(包含PD-L1)。本申請案並未提及HBV或至肝之靶向遞送。 本發明目標 本發明鑑別在肝臟細胞中(在實質細胞(例如肝細胞)及非實質細胞(例如庫弗氏細胞及肝竇狀隙內皮細胞(LSEC))中)極有效降低PD-L1 mRNA之新穎寡核苷酸及寡核苷酸偶聯物。藉由降低或沉默PD-L1，寡核苷酸及寡核苷酸偶聯物降低PD-1介導之抑制且由此促進耗竭T細胞之免疫刺激。緩解肝之慢性病原性感染中之T細胞耗竭使得重獲免疫控制且在肝之慢性病原性感染期間降低血液中之病毒抗原含量。天然殺手(NK)細胞及天然殺手T (NKT)細胞亦可由本發明之寡核苷酸及寡核苷酸偶聯物活化。 寡核苷酸偶聯物使得肝臟細胞中之PD-L1發生局部降低且由此降低與PD-L1之全身性消耗有關之自體免疫副效應(例如肺炎、非病毒性肝炎及結腸炎)的風險。
本發明係關於靶向能夠調節PD-L1表現之核酸且治療或預防與PD-L1功能相關之疾病之寡核苷酸或其偶聯物。寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物可尤其用於治療針對傳染原之免疫反應已耗竭之疾病。 因此，在第一態樣中，本發明提供包括長度為10至30個核苷酸且與PD-L1靶核酸具有至少90%互補性之鄰接核苷酸序列之寡核苷酸。寡核苷酸可為較佳地具有間隙聚體設計之反義寡核苷酸。較佳地，寡核苷酸能夠藉由裂解靶核酸來抑制PD-L1表現。裂解較佳係經由核酸酶招募來達成。 在另一態樣中，寡核苷酸偶聯至至少一個靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分(例如包括至少一個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分之偶聯物部分)。偶聯物部分及寡核苷酸可藉由連接體、尤其生物可裂解連接體連接至一起。 在另一態樣中，本發明提供包括本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑之醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供降低表現PD-L1之靶細胞中之PD-L1表現之方法(活體內或活體外方法)，其係藉由向該細胞投與有效量之本發明之寡核苷酸或組合物來達成。 在另一態樣中，本發明提供用於恢復針對病毒或寄生蟲之免疫性之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供用作藥劑之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供治療或預防疾病、病症或功能障礙之方法，其係藉由向患有或易患該疾病、病症或功能障礙、尤其選自病毒性肝感染或寄生蟲感染之疾病之個體投與治療或預防有效量之本發明寡核苷酸來達成。 在另一態樣中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物係用於治療或預防病毒性肝感染(例如HBV、HCV及HDV)或寄生蟲感染(例如瘧疾、弓蟲症、利什曼病(leishmaniasis)及錐蟲病)或肝癌或肝中轉移。
定義寡核苷酸 如熟習此項技術者通常所理解，本文所用之術語「寡核苷酸」定義為包括兩個或更多個共價連接之核苷之分子。該等共價結合之核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常係在實驗室中藉由固相化學合成且隨後加以純化來製得。在提及寡核苷酸之序列時，可提及共價連接之核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾之序列或順序。本發明寡核苷酸係人工製得，且係以化學方式合成，並通常進行純化或分離。本發明寡核苷酸可包括一或多個經修飾核苷或核苷酸。反義寡核苷酸 本文所用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至靶核酸、尤其靶核酸上之鄰接序列來調節靶基因表現之寡核苷酸。反義寡核苷酸在本質上並非雙鏈且由此並非siRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸係單鏈。鄰接核苷酸序列 術語「鄰接核苷酸序列」係指寡核苷酸中與靶核酸互補之區域。該術語可在本文中與術語「鄰接核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基序序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸包括鄰接核苷酸序列且可視情況包括其他核苷酸(例如可用於將官能基連接至鄰接核苷酸序列之核苷酸連接體區)。核苷酸連接體區可或可不與靶核酸互補。核苷酸 核苷酸係寡核苷酸及多核苷酸之組成單元且出於本發明目的其包含天然及非天然核苷酸。在性質上，核苷酸(例如DNA及RNA核苷酸)包括核糖糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基團(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱為「單元」或「單體」。經修飾核苷 本文所用之術語「經修飾核苷」或「核苷修飾」係指與等效DNA或RNA核苷相比藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而加以修飾之核苷。在一較佳實施例中，經修飾核苷包括經修飾糖部分。術語經修飾核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾「單元」或經修飾「單體」互換使用。經修飾核苷間鏈接 如熟習此項技術者通常所理解，術語「經修飾核苷間鏈接」定義為除磷酸二酯(PO)鏈接外之以共價方式將兩個核苷偶合至一起之鏈接。具有經修飾核苷間鏈接之核苷亦稱為「經修飾核苷酸」。在一些實施例中，與磷酸二酯鏈接相比，經修飾核苷間鏈接增加了寡核苷酸之核酸酶抗性。對於天然寡核苷酸而言，核苷間鏈接包含在毗鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基團。經修飾核苷間鏈接尤其可用於穩定用於活體內應用之寡核苷酸，且可用於防止在本發明寡核苷酸中之DNA或RNA核苷區域中發生核酸酶裂解(例如在間隙聚體寡核苷酸之間隙區內以及在經修飾核苷之區域中)。 在一實施例中，寡核苷酸包括一或多個自天然磷酸二酯修飾成(例如)對核酸酶攻擊更具抗性之鏈接之核苷間鏈接。可藉由在血清中培育寡核苷酸或藉由使用核酸酶抗性分析(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))來測定核酸酶抗性，此兩種方法在業內已眾所周知。能夠增強寡核苷酸之核酸酶抗性之核苷間鏈接稱為核酸酶抗性核苷間鏈接。在一些實施例中，修飾寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少50%之核苷間鏈接，舉例而言，修飾寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少60%、例如至少70%、例如至少80或例如至少90%之核苷間鏈接。在一些實施例中，修飾寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列之所有核苷間鏈接。應認識到，在一些實施例中，將本發明寡核苷酸連接至非核苷酸官能基(例如偶聯物)之核苷可為磷酸二酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列之所有核苷間鏈接皆係核酸酶抗性核苷間鏈接。 經修飾核苷間鏈接可選自包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及硼烷磷酸酯之組。在一些實施例中，經修飾核苷間鏈接與本發明寡核苷酸之RNaseH招募相容，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。 在一些實施例中，核苷間鏈接包括硫(S)，例如硫代磷酸酯核苷間鏈接。 硫代磷酸酯核苷間鏈接因核酸酶抗性、有益藥物動力學及製造便利性尤其有用。在一些實施例中，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少50%之核苷間鏈接係硫代磷酸酯，舉例而言，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少60%、例如至少70%、例如至少80或例如至少90%之核苷間鏈接係硫代磷酸酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列之所有核苷間鏈接係硫代磷酸酯。 在一些實施例中，寡核苷酸包括一或多個中性核苷間鏈接，尤其係選自磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、醯胺-3、甲縮醛或硫代甲縮醛之核苷間鏈接。 其他核苷間鏈接揭示於WO2009/124238 (以引用方式併入本文中)中。在一實施例中，核苷間鏈接係選自WO2007/031091 (以引用方式併入本文中)中所揭示之連接體。特定而言，核苷間鏈接可選自-O-P(O)2 -O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2 -O-、-S-P(O)2 -O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2 -O-、-O-P(O)2 -S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2 -S-、-O-PO(RH )-O-、O-PO(OCH3 )-O-、-O-PO(NRH )-O-、-O-PO(OCH2 CH2 S-R)-O-、-O-PO(BH3 )-O-、-O-PO(NHRH )-O-、-O-P(O)2 -NRH -、-NRH -P(O)2 -O-、-NRH -CO-O-、-NRH -CO-NRH -，及/或核苷間連接體可選自由以下組成之群：-O-CO-O-、-O-CO-NRH -、-NRH -CO-CH2 -、-O-CH2 -CO-NRH -、-O-CH2 -CH2 -NRH -、-CO-NRH -CH2 -、-CH2 -NRH CO-、-O-CH2 -CH2 -S-、-S-CH2 -CH2 -O-、-S-CH2 -CH2 -S-、-CH2 -SO2 -CH2 -、-CH2 -CO-NRH -、-O-CH2 -CH2 -NRH -CO-、-CH2 -NCH3 -O-CH2 -，其中RH 係選自氫及C1-4-烷基。 核酸酶抗性鏈接(例如硫代磷酸酯鏈接)尤其可用於能夠在與靶核酸形成雙螺旋體時招募核酸酶之寡核苷酸區域，例如用於間隙聚體之區域G或頭聚體及尾聚體之未修飾核苷區域。然而，硫代磷酸酯鏈接亦可可用於非核酸酶招募區域及/或親和力增強區域(例如用於間隙聚體之區域F及F’或頭聚體及尾聚體之經修飾核苷區域)中。 然而，每一設計區域可包括除硫代磷酸酯外之核苷間鏈接(例如磷酸二酯鏈接)，尤其在經修飾核苷(例如LNA)保護鏈接抵抗核酸酶降解之區域中。納入磷酸二酯鏈接(例如一或兩個鏈接，尤其在經修飾核苷單元之間或毗鄰該等經修飾核苷單元(通常位於非核酸酶招募區域中))可改變寡核苷酸之生物可用性及/或生物分佈-參見WO2008/113832 (以引用方式併入本文中)。 在一實施例中，寡核苷酸中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯及/或硼烷磷酸酯鏈接。較佳地，寡核苷酸中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯鏈接。核鹼基 術語核鹼基包含存在於核苷及核苷酸中之在核酸雜交中形成氫鍵之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分。在本發明背景中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，該等經修飾核鹼基可不同於天然核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此背景中，「核鹼基」係指天然核鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤)以及非天然變體。該等變體(例如)闡述於Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1。 在一些實施例中，藉由將嘌呤或嘧啶變成經修飾嘌呤或嘧啶(例如經取代嘌呤或經取代嘧啶)來修飾核鹼基部分，例如選自異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤之核鹼基。 核鹼基部分可藉由用於每一相應核鹼基之字母代碼(例如A、T、G、C或U)來指示，其中每一字母可視情況包含具有等效功能之經修飾核鹼基。舉例而言，在所例示寡核苷酸中，核鹼基部分係選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隙聚體而言，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。經修飾寡核苷酸 術語經修飾寡核苷酸闡述包括一或多個糖修飾性核苷及/或經修飾核苷間鏈接之寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸係在文獻中用於闡述具有經修飾核苷之寡核苷酸之術語。互補性 術語「互補性」闡述核苷/核苷之沃森-克裡克(Watson-Crick)鹼基配對之能力。沃森-克裡克鹼基對係鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A) -胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。應理解，寡核苷酸可包括具有經修飾核鹼基之核苷，舉例而言，通常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，且由此術語互補性涵蓋未修飾核鹼基與經修飾核鹼基之間之沃森-克裡克鹼基配對(例如參見Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1)。 本文所用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中在給定位置與單獨核酸分子(例如靶核酸)中給定位置之鄰接核苷酸序列互補(亦即形成沃森-克裡克鹼基對)之核苷酸的數量(以鄰接核苷酸序列之百分比形式)。藉由以下方式來計算百分比：計數在兩個序列之間形成對之比對鹼基數(在比對靶序列5’-3’與3’-5’之寡核苷酸序列時)，除以寡核苷酸中之核苷酸總數且乘以100。在此一對比中，並不對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸可視為失配。 術語「完全互補」係指100%互補性。 下文係與靶核酸(SEQ ID NO: 772)完全互補之寡核苷酸(SEQ ID NO: 5)之一實例。 5’gcagtagagccaatta3’ (SEQ ID NO:772) 3’cgtcatctcggttaat5’ (SEQ ID NO: 5)一致性 本文所用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中在給定位置與單獨核酸分子(例如靶核酸)中給定位置之鄰接核苷酸序列一致(亦即能夠與互補核苷形成沃森-克裡克鹼基對)之核苷酸的數量(以鄰接核苷酸序列之百分比形式)。藉由以下方式來計算百分比：計數在兩個序列(包含間隙)之間一致之比對鹼基數，除以寡核苷酸中之核苷酸總數且乘以100。百分比一致性= (匹配數× 100)/比對區域長度(含有間隙)。雜交 本文所用之術語「雜交(hybridizing或hybridizes)」應理解為兩條核酸鏈(例如寡核苷酸與靶核酸)在相對鏈上之鹼基對之間形成氫鍵，由此形成雙螺旋體。兩條核酸鏈之間之結合親和力係雜交強度。其通常係針對熔融溫度(Tm )來進行闡述，熔融溫度定義為一半寡核苷酸與靶核酸形成雙螺旋體之溫度。在生理學條件下，Tm 並不與親和力嚴格成正比(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準態吉布斯自由能(Gibbs free energy) ΔG°係結合親和力之更準確代表且與反應之解離常數(Kd )以ΔG°=-RTln(Kd )形式相關，其中R係氣體常數且T係絕對溫度。因此，寡核苷酸與靶核酸之間之反應之極低ΔG°反映寡核苷酸與靶核酸之間的強雜交。ΔG°係與反應有關之能量，其中水性濃度為1M，pH為7，且溫度為37℃。寡核苷酸至靶核酸之雜交係自發反應且自發反應之ΔG°小於零。可以實驗方式藉由(例如)使用等溫滴定量熱(ITC)方法來量測ΔG°，如Hansen等人，1965,Chem. Comm. 36-38及Holdgate等人，2005,Drug Discov Today 中所闡述。熟習此項技術者應知曉，商業設備可用於ΔG°量測。亦可在數值上藉由使用最近鄰居模型(如由SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465所闡述)使用適當導出之熱動力學參數(由Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211-11216及McTigue等人，2004,Biochemistry 43:5388-5405所闡述)來估計ΔG°。為使得可藉由雜交來調節其預期核酸靶，本發明寡核苷酸以低於-10 kcal之估計ΔG°值(對於長10-30個核苷酸之寡核苷酸)雜交至靶核酸。在一些實施例中，藉由標準態吉布斯自由能ΔG°來量測雜交之程度或強度。對於長8-30個核苷酸之寡核苷酸而言，寡核苷酸可以低於-10 kcal範圍(例如低於-15 kcal、例如低於-20 kcal及例如低於-25 kcal)之估計ΔG°值雜交至靶核酸。在一些實施例中，寡核苷酸以(-10 kcal至-60 kcal、例如-12 kcal至-40 kcal、例如-15 kcal至-30 kcal或-16 kcal至-27 kcal、例如-18 kcal至-25 kcal)之估計ΔG°值雜交至靶核酸。靶核酸 根據本發明，靶核酸係編碼哺乳動物PD-L1之核酸且可為(例如)基因、RNA、mRNA及mRNA前體、成熟mRNA或cDNA序列。靶可由此稱為PD-L1靶核酸。本發明寡核苷酸可(例如)靶向哺乳動物PD-L1之外顯子區域，或可(例如)靶向PD-L1 mRNA前體之內含子區域(參見表1)。 表1：人類PD-L1外顯子及內含子 適宜地，靶核酸編碼PD-L1蛋白、尤其哺乳動物PD-L1、例如人類PD-L1 (例如參見表2及3，其提供用於人類、猴及小鼠PD-L1之參考mRNA及mRNA前體序列)。在本發明之情形中，mRNA前體亦視為編碼蛋白質之核酸。 在一些實施例中，靶核酸係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1、2及3或其天然變體(例如編碼哺乳動物PD-L1蛋白之序列)。 若在研究或診斷中採用本發明寡核苷酸，則靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。 對於活體內或活體外應用而言，本發明寡核苷酸通常能夠抑制表現PD-L1靶核酸之細胞中之PD-L1靶核酸表現。本發明寡核苷酸之核鹼基之鄰接序列通常與PD-L1靶核酸互補，如橫跨寡核苷酸之長度所量測，視情況一或兩個失配除外，且視情況排除可將寡核苷酸連接至可選官能基(例如偶聯物)或其他非互補性末端核苷酸之基於核苷酸之連接體區(例如區域D’或D’’)。在一些實施例中，靶核酸可為RNA或DNA，例如信使RNA，例如成熟mRNA或mRNA前體。在一些實施例中，編碼哺乳動物PD-L1蛋白(例如人類PD-L1)之靶核酸係RNA或DNA (例如人類PD-L1 mRNA前體序列(例如揭示為SEQ ID NO 1者)或具有NCBI參考編號NM_014143之人類mRNA序列)。關於實例性靶核酸之其他資訊提供於表2及3中。   表2：各物種中之PD-L1之基因體及組合體資訊。 Fwd =正向鏈。基因體坐標提供mRNA前體序列(基因體序列)。NCBI參考提供mRNA序列(cDNA序列)。 *國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)參考序列資料庫係參考序列(包含基因體、轉錄物及蛋白質)之綜合性、整合、非冗餘、充分注釋集合。其寄存於www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq。 表3：各物種中之PD-L1之序列細節。 靶序列 本文所用之術語「靶序列」係指存在於靶核酸中之包括與本發明寡核苷酸互補之核鹼基序列的核苷酸序列。在一些實施例中，靶序列係由靶核酸上與本發明寡核苷酸之鄰接核苷酸序列互補之區域組成。在一些實施例中，靶序列長於單一寡核苷酸之互補序列，且可(例如)代表靶核酸中可由若干本發明寡核苷酸靶向之較佳區域。 靶序列可為靶核酸之子序列。 在一些實施例中，子序列係選自由a1-a149 (參見表4)組成之群之序列。在一些實施例中，子序列係選自由人類PD-L1 mRNA外顯子(例如選自由以下組成之群之PD-L1人類mRNA外顯子：e1、e2、e3、e4、e5、e6及e7 (參見上表1))組成之群之序列。 在一些實施例中，子序列係選自由人類PD-L1 mRNA內含子(例如選自由以下組成之PD-L1人類mRNA內含子群：i1、i2、i3、i4、i5及i6 (參見上表1))組成之群之序列。 本發明寡核苷酸包括與靶核酸(例如靶核酸之子序列，例如本文所闡述之靶序列)互補或雜交之鄰接核苷酸序列。 寡核苷酸包括具有至少8個核苷酸之與存在於靶核酸分子中之靶序列互補或雜交之鄰接核苷酸序列。鄰接核苷酸序列(及由此靶序列)包括至少8個鄰接核苷酸，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鄰接核苷酸，例如12-25個鄰接核苷酸，例如14-18個鄰接核苷酸。靶細胞 本文所用之術語「靶細胞」係指表現靶核酸之細胞。在一些實施例中，靶細胞可為活體內或活體外靶細胞。在一些實施例中，靶細胞係哺乳動物細胞，例如齧齒類動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)或靈長類動物細胞(例如猴細胞或人類細胞)。 在較佳實施例中，靶細胞表現PD-L1 mRNA (例如PD-L1 mRNA前體或PD-L1成熟mRNA)。PD-L1 mRNA之多腺苷酸尾通常忽視反義寡核苷酸靶向。天然變體 術語「天然變體」係指PD-L1基因或轉錄物之如下變體：其與靶核酸源自相同基因座，但可(例如)因產生多種編碼相同胺基酸之密碼子之基因代碼之簡並性或因mRNA前體之替代剪接或存在多型性(例如單一核苷酸多型性)而有所不同，且係指等位基因變體。基於寡核苷酸之充分互補序列之存在，本發明寡核苷酸可由此靶向靶核酸及其天然變體。 在一些實施例中，天然變體與哺乳動物PD-L1靶核酸(例如選自由SEQ ID NO 1、2及3組成之群之靶核酸)具有至少95% (例如至少98%或至少99%)之同源性。 已知PD-L1基因中之諸多單一核苷酸多型性，例如揭示於下表中者(人類mRNA前體起始/參考序列係SEQ ID NO 2) 表現調節 本文所用之術語「表現調節」欲理解為關於寡核苷酸改變PD-L1量(與投與寡核苷酸之前之PD-L1量相比)之能力之概括性術語。或者，可藉由參照對照實驗來測定表現調節。通常應理解，對照係使用鹽水組合物治療或處理之個體或靶細胞或使用非靶寡核苷酸(模擬)治療或處理之個體或靶細胞。然而，亦可標準護理治療個體。 一類調節係寡核苷酸能夠(例如)藉由降解mRNA或阻斷轉錄來抑制、下調、降低、阻抑、去除、停止、阻斷、預防、減弱、減小、避免或終止PD-L1表現。另一類調節係寡核苷酸能夠(例如)藉由修復剪接位點或防止剪接或去除或阻斷抑制機制(例如微RNA阻遏)來恢復、增加或增強PD-L1表現。高親和力修飾性核苷 高親和力修飾性核苷係在納入寡核苷酸中時會增強寡核苷酸對其互補靶之親和力(例如如藉由熔融溫度(Tm )所量測)之經修飾核苷酸。本發明之高親和力修飾性核苷較佳地使得每一經修飾核苷之熔融溫度增加+0.5℃至+12℃、更佳地+1.5℃至10℃及最佳地+3℃至+8℃。業內已知諸多高親和力修飾性核苷且包含(例如)許多2’取代核苷以及鎖核酸(LNA) (例如參見Freier & Altmann；Nucl.  Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann；Curr.  Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。糖修飾 本發明寡聚物可包括一或多個具有經修飾糖部分(亦即與DNA及RNA中所發現之核糖糖部分相比之糖部分修飾)之核苷。 已製備諸多具有核糖糖部分修飾之核苷，其目的主要在於改良寡核苷酸之某些性質(例如親和力及/或核酸酶抗性)。 該等修飾包含核糖環結構(例如)藉由使用以下結構進行代替來修飾者：己糖環(HNA)；或通常在核糖環上之C2碳與C4碳之間具有雙自由基橋之雙環(LNA)；或通常在C2碳與C3碳之間缺乏鍵之未連接核糖環(例如UNA)。其他糖修飾性核苷包含(例如)雙環己糖核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾核苷亦包含糖部分經非糖部分代替之核苷，例如在肽核酸(PNA)或嗎啉基核酸之情形下。 糖修飾亦包含經由將核糖環上之取代基改變成除氫或DNA及RNA核苷中天然發現之2’-OH基團外之基團而進行之修飾。可(例如)在2’、3’、4’或5’位置引入取代基。具有經修飾糖部分之核苷亦包含2’修飾核苷，例如2’取代核苷。實際上，高度關注研發2’取代核苷，且已發現諸多2’取代核苷在納入寡核苷酸中時具有有益性質(例如增強之核苷抗性及增強之親和力)。2’ 修飾核苷 . 2’糖修飾性核苷係在2’位具有除H或-OH外之取代基(2’取代核苷)或包括2’連接雙自由基之核苷，且包含2’取代核苷及LNA (2’ - 4’雙自由基橋接)核苷。舉例而言，2’修飾糖可向寡核苷酸提供增強之結合親和力及/或增加之核酸酶抗性。2’取代修飾性核苷之實例係2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟-RNA及2’-F-ANA核苷。關於其他實例，請參見(例如) Freier & Altmann；Nucl.  Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann；Curr.  Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。下文闡釋一些2’取代修飾性核苷。 鎖核酸核苷 (LNA) 。 LNA核苷係在核苷酸之核糖糖環之C2’與C4’之間包括連接體基團(稱為雙基或橋)之經修飾核苷。該等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。 在一些實施例中，本發明寡聚物之經修飾核苷或LNA核苷具有式I或II之一般結構：或式I                        式II 其中W係選自-O-、-S-、-N(Ra )-、-C(Ra Rb )-，例如在一些實施例中係-O-； B指定核鹼基或經修飾核鹼基部分； Z指定至毗鄰核苷之核苷間鏈接或5'-末端基團； Z*指定至毗鄰核苷之核苷間鏈接或3'-末端基團； X指定選自由以下組成之列表之基團：-C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z 在一些實施例中，X係選自由以下組成之群：-O-、-S-、NH-、NRa Rb 、-CH2 -、CRa Rb 、-C(=CH2 )-及-C(=CRa Rb )- 在一些實施例中，X係-O-。 Y指定選自由以下組成之群之基團：-C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z 在一些實施例中，Y係選自由以下組成之群：-CH2 -、-C(Ra Rb )-、-CH2 CH2 -、-C(Ra Rb )-C(Ra Rb )-、-CH2 CH2 CH2 -、-C(Ra Rb )C(Ra Rb )C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-及-C(Ra )=N- 在一些實施例中，Y係選自由以下組成之群：-CH2 -、-CHRa -、-CHCH3 -、CRa Rb - 或-X-Y-一起指定二價連接體基團(亦稱為自由基)，一起指定由1、2、3或4個選自由以下組成之群之基團/原子組成之二價連接體基團：-C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z， 在一些實施例中，-X-Y-指定選自由以下組成之群之雙自由基：-X-CH2 -、-X-CRa Rb -、-X-CHRa- 、-X-C(HCH3 )- 、-O-Y-、-O-CH2 -、-S-CH2 -、-NH-CH2 -、-O-CHCH3 -、-CH2 -O-CH2 、-O-CH(CH3 CH3 )-、-O-CH2 -CH2 -、OCH2 -CH2 -CH2 -、-O-CH2 OCH2 -、-O-NCH2 -、-C(=CH2 )-CH2 -、-NRa -CH2 -、N-O-CH2 、-S-CRa Rb -及-S-CHRa -。 在一些實施例中，-X-Y-指定-O-CH2 -或-O-CH(CH3 )-。 其中Z係選自-O-、-S-及-N(Ra )-， 且Ra 及(在存在時) Rb 各自獨立地係選自氫、視情況經取代之C1-6 -烷基、視情況經取代之C2-6 -烯基、視情況經取代之C2-6 -炔基、羥基、視情況經取代之C1-6 -烷氧基、C2-6 -烷氧基烷基、C2-6 -烯基氧基、羧基、C1-6 -烷氧基羰基、C1-6 -烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6 -烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、C1-6 -烷基-羰基胺基、脲基、C1-6 -烷醯基氧基、磺醯基、C1-6 -烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C1-6 -硫烷基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代且其中兩個孿位取代基Ra 及Rb 一起可指定視情況經取代之亞甲基(=CH2 )，其中對於所有對掌性中心而言，不對稱基團可以R 或S 定向發現。 其中R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1-6 -烷基、視情況經取代之C2-6 -烯基、視情況經取代之C2-6 -炔基、羥基、C1-6 -烷氧基、C2-6 -烷氧基烷基、C2-6 -烯基氧基、羧基、C1-6 -烷氧基羰基、C1-6 -烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6 -烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6 -烷基)胺基-C1-6 -烷基-胺基羰基、C1-6 -烷基-羰基胺基、脲基、C1-6 -烷醯基氧基、磺醯基、C1-6 -烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C1-6 -硫烷基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個孿位取代基一起可指定側氧基、側硫基、亞胺基或視情況經取代之亞甲基。 在一些實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自C1-6 烷基(例如甲基)及氫。 在一些實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。 在一些實施例中，R1 、R2 、R3 皆係氫，且R5 及R5* 中之任一者亦係氫且R5 及R5* 中之另一者不為氫(例如C1-6 烷基，例如甲基)。 在一些實施例中，Ra 係氫或甲基。在一些實施例中，在存在時，Rb 係氫或甲基。 在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者或兩者係氫。 在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者係氫且另一者不為氫。 在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者係甲基且另一者係係氫。 在一些實施例中，Ra 及Rb 皆係甲基。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等LNA核苷揭示於WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352及WO2004/046160 (其皆以引用方式併入本文中)中，且包含通常稱為β-D- 氧基 LNA 及α-L- 氧基 LNA 核苷者。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-S-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等硫代 LNA 核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160 (其以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-NH-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等胺基 LNA 核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160 (其以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH2 -CH2 -或-O-CH2 -CH2 - CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等LNA核苷揭示於WO00/047599及Morita等人，Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76 (其以引用方式併入本文中)中，且包含通常稱為2’-O-4’C-伸乙基橋接之核酸(ENA)者。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 之全部及R5 及R5* 中之一者係氫，且R5 及R5* 中之另一者不為氫(例如C1-6 烷基，例如甲基)。該等5’ 取代 LNA核苷揭示於WO2007/134181 (其以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CRa Rb -，其中Ra 及Rb 中之一者或兩者不為氫(例如甲基)，W係O，且R1 、R2 、R3 之全部及中之一者R5 及R5* 係氫，且R5 及R5* 中之另一者不為氫(例如C1-6 烷基，例如甲基)。該等雙修飾 LNA 核苷 揭示於WO2010/077578 (其以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-指定二價連接體基團-O-CH(CH2 OCH3 )- (2’O-甲氧基乙基雙環核酸- Seth等人，2010, J. Org. Chem.第75卷(5)第1569-81頁)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-指定二價連接體基團-O-CH(CH2 CH3 )- (2’O-乙基雙環核酸- Seth等人，2010, J. Org. Chem.第75卷(5)第1569-81頁)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CHRa -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等6’ 取代 LNA核苷揭示於WO10036698及WO07090071 (二者皆以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH(CH2 OCH3 )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等LNA核苷在業內亦稱為環狀 MOE (cMOE)且揭示於WO07090071中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-指定二價連接體基團-O-CH(CH3 )-。-呈R-或S-構形。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-一起指定二價連接體基團-O-CH2 -O-CH2 - (Seth等人，2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH(CH3 )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等6’甲基LNA核苷在業內亦稱為cET 核苷 ，且可為(S)cET或(R)cET立體異構體，如WO07090071 (β-D)及WO2010/036698 (α-L) (二者皆以引用方式併入本文中)中所揭示。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CRa Rb -，其中Ra 或Rb 皆不為氫，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。在一些實施例中，Ra 及Rb 皆係甲基。該等6’ 二取代 LNA核苷揭示於WO 2009006478 (其以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-S-CHRa -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等6’ 取代硫代 LNA核苷揭示於WO11156202 (其以引用方式併入本文中)中。在一些6’取代硫代LNA實施例中，Ra 係甲基。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-C(=CH2)-C(Ra Rb )- (例如-C(=CH2 )-CH2 -或-C(=CH2 )-CH(CH3 )-)，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。該等乙烯基碳 LNA核苷揭示於WO08154401及WO09067647 (二者皆以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-N(-ORa )- W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。在一些實施例中，Ra 係C1-6 烷基，例如甲基。該等LNA核苷亦稱為N取代LNA且揭示於WO2008/150729 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-一起指定二價連接體基團-O-NRa -CH3 - (Seth等人，2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-N(Ra )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。在一些實施例中，Ra 係C1-6 烷基，例如甲基。 在一些實施例中，R5 及R5* 中之一者或兩者係氫且(在取代時)R5 及R5* 中之另一者係C1-6 烷基(例如甲基)。在此一實施例中，R1 、R2 、R3 可皆係氫，且雙自由基-X-Y-可選自-O-CH2-或-O-C(HCRa )- (例如-O-C(HCH3)-)。 在一些實施例中，雙自由基係-CRa Rb -O-CRa Rb - (例如CH2 -O-CH2 -)，W係O且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。在一些實施例中，Ra 係C1-6 烷基，例如甲基。該等LNA核苷亦稱為構象限制性核苷酸(CRN)且揭示於WO2013036868 (其以引用方式併入本文中)中。 在一些實施例中，雙自由基係-O-CRa Rb -O-CRa Rb - (例如O-CH2 -O-CH2 -)，W係O且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆係氫。在一些實施例中，Ra 係C1-6 烷基，例如甲基。該等LNA核苷亦稱為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238 (其以引用方式併入本文中)中。 應認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構體形式。 LNA核苷之某些實例呈現於結構圖1中。 結構圖1如實例中所闡釋，在本發明之一些實施例中，寡核苷酸中之LNA核苷係β-D-氧基-LNA核苷。核酸酶調介之降解 核酸酶調介之降解係指在與互補核苷酸序列形成雙螺旋體時能夠調介此一序列之降解之寡核苷酸。 在一些實施例中，寡核苷酸可經由靶核酸之核酸酶調介之降解來發揮作用，其中本發明寡核苷酸能夠招募核酸酶、尤其內核酸酶、較佳地內核糖核酸酶(RNase) (例如RNase H)。經由核酸酶調介機制作用之寡核苷酸設計之實例係通常包括至少5或6個DNA核苷之區域且在一側或兩側側接有親和力增強性核苷(例如間隙聚體、頭聚體及尾聚體)的寡核苷酸。RNase H 活性及招募 反義寡核苷酸之RNase H活性係指其在呈與互補RNA分子之雙螺旋體時招募RNase H之能力。WO01/23613提供測定RNaseH活性之活體外方法，該等方法可用於測定招募RNaseH之能力。通常，寡核苷酸在以下情況下可視為能夠招募RNase H：在與互補靶核酸序列一起提供時，其初始速率(如以pmol/l/min形式所量測)為在使用與所測試經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有DNA單體且在寡核苷酸中之所有單體間具有硫代磷酸酯鏈接之寡核苷酸且使用由WO01/23613中實例91 - 95 (以引用方式併入本文中)提供之方法時所測定初始速率的至少5% (例如至少10%或大於20%)。間隙聚體 本文所用之術語間隙聚體係指反義寡核苷酸包括招募RNase H之寡核苷酸區域(間隙)，該區域側接(5’及3’)有包括一或多個親和力增強性經修飾核苷之區域(側翼或翼)。本文闡述各種間隙聚體設計且其特徵在於能夠招募RNaseH。頭聚體及尾聚體係缺失一個側翼之能夠招募RNase H之寡核苷酸，亦即僅寡核苷酸之一端包括親和力增強性經修飾核苷。對於頭聚體而言，3’側翼缺失(亦即，5’側翼包括親和力增強性經修飾核苷)，且對於尾聚體而言，5’側翼缺失(亦即，3’側翼包括親和力增強性經修飾核苷)。LNA 間隙聚體 術語LNA間隙聚體係至少一個親和力增強性經修飾核苷係LNA核苷之間隙聚體寡核苷酸。混合翼間隙聚體 術語混合翼間隙聚體或混合側翼間隙聚體係指至少一個側翼區域包括至少一個LNA核苷及至少一個非LNA經修飾核苷(例如至少一個2’取代經修飾核苷，例如2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟-RNA及2’-F-ANA核苷)之LNA間隙聚體。在一些實施例中，混合翼間隙聚體具有一個僅包括LNA核苷(例如5’或3’)之側翼及包括2’取代經修飾核苷及視情況LNA核苷之另一側翼(分別3’或5’)。間隙中斷體 術語「間隙中斷體寡核苷酸」用於係指即使間隙區由非RNaseH招募性核苷(間隙中斷體核苷，E)破壞(從而間隙區包括小於5個連續DNA核苷)亦能夠維持RNAseH招募之間隙聚體。非RNaseH招募性核苷係(例如)呈3’內向構象之核苷，例如核苷之核糖糖環中C2’與C4’之間之橋係呈β構象的LNA，例如β-D-氧基LNA或ScET核苷。間隙中斷體寡核苷酸招募RNaseH之能力通常係序列或甚至化合物特異性-參見Rukov等人，2015 Nucl. Acids Res.第43卷第8476-8487頁，其揭示招募在一些情況下提供靶RNA之更特異性裂解之RNaseH之「間隙中斷體」寡核苷酸。 在一些實施例中，本發明寡核苷酸係間隙中斷體寡核苷酸。在一些實施例中，間隙中斷體寡核苷酸包括5’-側翼(F)、間隙(G)3’-側翼(F’)，其中間隙藉由非RNaseH招募核苷(間隙中斷體核苷，E)破壞，從而間隙含有至少3或4個連續DNA核苷。在一些實施例中，間隙中斷體核苷(E)係如下LNA核苷：其中核苷之核糖糖環中C2’與C4’之間之橋係呈β構象且置於間隙區內，從而間隙中斷體LNA核苷側接(5’及3’)有至少3 (5’)及3 (3’)或至少3 (5’)及4 (3’)或至少4(5’)及3(3’)個DNA核苷，且其中寡核苷酸能夠招募RNaseH。 間隙中斷體寡核苷酸可由下列各式代表： F-G-E-G-F’；尤其F1-7 -G3-4 -E1 -G3-4- F’1-7 D’-F-G-F’，尤其D’1-3 -F1-7 -G3-4 -E1 -G3-4 -F’1-7 F-G-F’-D’’，尤其F1-7 -G3-4 -E1 -G3-4 -F’1-7 -D’’1-3 D’-F-G-F’-D’’，尤其D’1-3 -F1-7 -G3-4 -E1 -G3-4 -F’1-7 -D’’1-3 其中區域D’及D’’係如「間隙聚體設計」部分中所闡述。 在一些實施例中，間隙中斷體核苷(E)係β-D-氧基LNA或ScET或結構圖1中所展示之另一β-LNA核苷。偶聯物 本文所用之術語偶聯物係指以共價方式連接至非核苷酸部分(偶聯物部分或區域C或第三區域)之寡核苷酸，其亦稱為寡核苷酸偶聯物。 本發明寡核苷酸至一或多個非核苷酸部分之偶聯可(例如)藉由影響寡核苷酸之活性、細胞分佈、細胞攝取或穩定性來改良寡核苷酸之藥理學。在一些實施例中，偶聯物部分使寡核苷酸靶向肝。同時，偶聯用於降低寡核苷酸在非靶細胞類型、組織或器官中之活性，例如脫靶活性或非靶細胞類型、組織或器官中之活性。在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸偶聯物顯示與未偶聯寡核苷酸相比PD-L1在靶細胞中之改良抑制。在另一實施例中，與未偶聯寡核苷酸相比，本發明之寡核苷酸偶聯物在肝與其他器官(例如脾或腎)之間具有改良之細胞分佈(亦即，與脾或腎相比，更多偶聯寡核苷酸去往肝)。在另一實施例中，與未偶聯寡核苷酸相比，本發明之寡核苷酸偶聯物展示偶聯寡核苷酸在肝中之改良之細胞攝取。 WO 93/07883及WO2013/033230提供適宜偶聯物部分，該等專利以引用方式併入本文中。其他適宜偶聯物部分係能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)者。特定而言，三價N-乙醯基半乳糖胺偶聯物部分適於結合至ASGPr，例如參見WO2014/076196、WO2014/207232及WO 2014/179620 (以引用方式併入本文中)。偶聯物部分基本上係反義寡核苷酸偶聯物中並非由核酸構成之部分。 寡核苷酸偶聯物及其合成亦報導於以下綜合性綜述中：Manoharan，Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke編輯，第16章，Marcel Dekker, Inc., 2001及Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103，其中之每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中。 在一實施例中，非核苷酸部分(偶聯物部分)係選自由以下組成之群：碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如細菌毒素)、維他命、病毒蛋白(例如衣殼)或其組合。連接體 鏈接或連接體係兩個原子之間經由一或多個共價鍵連接一個所關注化學基團或區段與另一所關注化學基團或區段之連結。偶聯物部分可直接或經由連接部分(例如連接體或結合體)連接至寡核苷酸。連接體用於以共價方式將第三區域(例如偶聯物部分，區域C)連結至與靶核酸互補之第一區域(例如寡核苷酸或鄰接核苷酸序列，區域A)。 在本發明之一些實施例中，本發明之偶聯物或寡核苷酸偶聯物可視情況包括連接體區(第二區域或區域B及/或區域Y)，該區域定位於與靶核酸互補之寡核苷酸或鄰接核苷酸序列(區域A或第一區域)與偶聯物部分(區域C或第三區域)之間。 區域B係指包括生理上不穩定鍵或由其組成之生物可裂解連接體，該生理上不穩定鍵可在哺乳動物體內通常所遇到之條件或類似於哺乳動物體內所遇到條件之條件下裂解。生理上不穩定連接體發生化學轉變(例如裂解)之條件包含化學條件，例如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑及在哺乳動物細胞中所發現鹽濃度或類似於在哺乳動物細胞中所遇到鹽濃度之鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包含在哺乳動物細胞中通常存在酶促活性(例如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)。在一實施例中，生物可裂解連接體易於發生S1核酸酶裂解。在一較佳實施例中，核酸酶易感連接體包括1至10個含有至少兩個連續磷酸二酯鏈接(例如至少3或4或5個連續磷酸二酯鏈接)之核苷(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷、更佳地2至6個核苷及最佳地2至4個經連接核苷)。較佳地，核苷係DNA或RNA。含有磷酸二酯之生物可裂解連接體更詳細闡述於WO 2014/076195 (以引用方式併入本文中)中。 區域Y係指未必生物可裂解但主要用於以共價方式連結偶聯物部分(區域C或第三區域)與與靶核酸互補之寡核苷酸或鄰接核苷酸序列(區域A或第一區域)之連接體。區域Y連接體可包括諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基等重複單元之鏈結構或寡聚物。本發明之寡核苷酸偶聯物可由下列區域要素構成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些實施例中，連接體(區域Y)係胺基烷基，例如C2 - C36胺基烷基，包含(例如) C6 - C12胺基烷基。在一較佳實施例中，連接體(區域Y)係C6胺基烷基。 治療 本文所用之術語「治療」係指治療現有疾病(例如如本文所提及之疾病或病症)或預防疾病(亦即預防性)。因此應認識到，如本文所提及之治療可在一些實施例中為預防性。 針對病原體之免疫反應之恢復 將免疫反應分成先天性免疫反應及適應性免疫反應。先天性免疫系統提供立即但非特異性之反應。適應性免疫反應係藉由先天性免疫反應活化且對特定病原體具有高度特異性。在將病原體源抗原呈遞於抗原呈遞細胞表面上時，適應性免疫反應之免疫細胞(亦即T及B淋巴球)經由其抗原特異性受體發生活化，從而產生病原性特異性免疫反應且產生免疫記憶。慢性病毒感染(例如HBV及HCV)與特徵在於病毒特異性T細胞之無反應性之T細胞耗竭有關。已充分研究T細胞耗竭，其綜述可參見(例如) Yi等人，2010 Immunology129, 474-481。慢性病毒感染亦與作為先天性免疫細胞之NK細胞之降低功能有關。增強病毒免疫反應對於慢性感染之清除較為重要。可藉由量測增殖、細胞介素分泌及細胞溶解功能來評價由T細胞及NK細胞調介之針對病原體之免疫反應之恢復(Dolina等人，2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72及本文中之實例6)。 本發明的詳細敘述 本發明係關於反義寡核苷酸及其偶聯物及包括該等物質之醫藥組合物用以恢復針對感染動物、尤其人類之病原體之免疫反應的用途。本發明之反義寡核苷酸偶聯物尤其可用於抵抗感染肝之病原體、尤其慢性肝感染(例如HBV)。該等偶聯物容許靶向分佈寡核苷酸且防止靶核酸之全身性敲低。本發明寡核苷酸 本發明係關於能夠調節PD-L1表現之寡核苷酸。可藉由雜交至編碼PD-L1或涉及PD-L1調控之靶核酸來達成該調節。靶核酸可為哺乳動物PD-L1序列，例如選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及/或SEQ ID NO: 3組成之群之序列。靶核酸可為mRNA前體、mRNA或任一自支持PD-L1之表現或調控之哺乳動物細胞表現之RNA序列。 本發明寡核苷酸係靶向PD-L1之反義寡核苷酸。 在本發明之一態樣中，本發明寡核苷酸偶聯至偶聯物部分、尤其靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。 在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠藉由抑制或下調靶來調節靶表現。較佳地，該調節使得與正常靶表現程度相比抑制至少20%之表現，更佳地與正常靶表現程度相比抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。較佳地，該調節使得與在藉由傳染原攻擊細胞或有機體或使用模擬傳染原攻擊之試劑(例如聚I:C或LPS)處理細胞或有機體時之表現程度相比抑制至少20%之表現，更佳地與在藉由傳染原攻擊細胞或有機體或使用模擬傳染原攻擊之試劑(例如聚I:C或LPS)處理細胞或有機體時之表現程度相比抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施例中，在活體外使用KARPAS-299或THP1細胞，本發明寡核苷酸可能夠抑制PD-L1 mRNA之表現程度至少60%或70%。在一些實施例中，在活體外使用KARPAS-299或THP1細胞，本發明化合物可能夠抑制PD-L1蛋白之表現程度至少50%。適宜地，實例提供可用於量測PD-L1 RNA之分析(例如實例1)。藉由寡核苷酸之鄰接核苷酸序列與靶核酸之間之雜交來觸發靶調節。在一些實施例中，本發明寡核苷酸在寡核苷酸與靶核酸之間包括失配。儘管具有失配，但雜交至靶核酸仍可足以展示PD-L1表現之期望調節。源自失配之降低之結合親和力可有利地藉由寡核苷酸中增加數量之核苷酸及/或寡核苷酸序列內所存在增加數量之能夠增加靶結合親和力的經修飾核苷(例如2’修飾核苷，包含LNA)來予以補償。 在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠恢復病原體特異性T細胞。在一些實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明寡核苷酸能夠增加病原體特異性T細胞至少40%、50%、60%或70%。在一實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明之反義寡核苷酸或偶聯物能夠增加HBV特異性T細胞。適宜地，實例提供可用於量測HBV特異性T細胞之分析(例如T細胞增殖、細胞介素分泌及細胞溶解活性)。在另一實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明之反義寡核苷酸或偶聯物能夠增加HCV特異性T細胞。在另一實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明之反義寡核苷酸或偶聯物能夠增加HDV特異性T細胞。 在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠降低動物或人類中之HBsAg含量。在一些實施例中，在與治療之前之含量相比時，本發明寡核苷酸能夠降低HBsAg含量至少40%、50%、60%或70%、更佳地至少80%、90%或95%。最佳地，本發明寡核苷酸能夠達成HBsAg在感染HBV之動物或人類中之血清轉化。 本發明之一態樣係關於包括與PD-L1靶核酸具有至少90%互補性之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列之反義寡核苷酸。 在一些實施例中，寡核苷酸包括與靶核酸區域至少90%互補、例如至少91%、例如至少92%、例如至少93%、例如至少94%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%或100%互補之鄰接序列。 在一較佳實施例中，本發明寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列與靶核酸區域完全互補(100%互補)，或在一些實施例中可在寡核苷酸與靶核酸之間包括一或兩個失配。 在一些實施例中，寡核苷酸包括與存在於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中之靶核酸區域至少90%互補(例如完全(或100%)互補)之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸序列與存在於 SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2中之相應靶核酸區域100%互補。在一些實施例中，寡核苷酸序列與存在於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 3於中之相應靶核酸區域100%互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物包括與相應靶核酸區域至少90%互補(例如100%互補)之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列，其中該鄰接核苷酸序列與選自由SEQ ID NO: 1上之位置371-3068、5467-12107及15317-19511組成之群之靶核酸的子序列互補。在另一實施例中，靶核酸之子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置371-510、822-1090、1992-3068、5467-5606、6470-12107、15317-15720、15317-18083、18881-19494及1881-19494。在一較佳實施例中，靶核酸之子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置7300-7333、8028-8072、9812-9859、11787-11873及15690-15735。 在一些實施例中，寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物包括與存在於SEQ ID NO: 1中之相應靶核酸區域至少90%互補(例如100%互補)之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列，其中該靶核酸區域係選自由表4中之區域a1至a449組成之群。 表4：可使用本發明寡核苷酸靶向之SEQ ID NO 1之區域 在一些實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列與靶核酸區域互補，其中靶核酸區域係選自由以下組成之群：a7、a26、a43、a119、a142、a159、a160、a163、a169、a178、a179、a180、a189、a201、a202、a204、a214、a221、a224、a226、a243、a254、a258、269、a274、a350、a360、a364、a365、a370、a372、a381、a383、a386、a389、a400、a427、a435及a438。 在一較佳實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列與靶核酸區域互補，其中靶核酸區域係選自由以下組成之群：a160、a180、a221、a269及a360。 在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括8至35個核苷酸(長度)或由其組成，例如長9至30、例如10至22、例如11至20、例如12至18、例如13至17或14至16個鄰接核苷酸。在一較佳實施例中，寡核苷酸包括16至20個核苷酸(長度)或由其組成。應理解，本文所給出之任一範圍皆包含範圍端點。因此，若提及寡核苷酸包含10至30個核苷酸，則包含10及30個核苷酸。 在一些實施例中，鄰接核苷酸序列包括8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鄰接核苷酸(長度)或由其組成。在一較佳實施例中，寡核苷酸包括16、17、18、19或20個核苷酸(長度)或由其組成。 在一些實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括選自由表5中所列示序列組成之群之序列或由其組成。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與選自由SEQ ID NO: 5至743 (參見表5中所列示之基序序列)組成之群之序列具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與選自由SEQ ID NO: 5至743及771組成之群之序列具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與選自由以下組成之群之序列具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成：SEQ ID NO: 6、8、9、13、41、42、58、77、92、111、128、151、164、166、169、171、222、233、245、246、250、251、252、256、272、273、287、292、303、314、318、320、324、336、342、343、344、345、346、349、359、360、374、408、409、415、417、424、429、430、458、464、466、474、490、493、512、519、519、529、533、534、547、566、567、578、582、601、619、620、636、637、638、640、645、650、651、652、653、658、659、660、665、678、679、680、682、683、684、687、694、706、716、728、733、734及735。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 287具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 342具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 640具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 466具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。 在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 566具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。 在寡核苷酸長於鄰接核苷酸序列(其與靶核酸互補)之實施例中，表5中之基序序列形成本發明之反義寡核苷酸之鄰接核苷酸序列部分。在一些實施例中，寡核苷酸之序列等效於鄰接核苷酸序列(舉例而言，若不添加生物可裂解連接體)。 應理解，鄰接核鹼基序列(基序序列)可經修飾以(例如)增加核酸酶抗性及/或對靶核酸之結合親和力。修飾闡述於定義及「寡核苷酸設計」部分中。表5列列示每一基序序列之較佳設計。 寡核苷酸設計 寡核苷酸設計係指寡核苷酸序列中之核苷糖修飾模式。本發明寡核苷酸包括糖修飾性核苷且亦可包括DNA或RNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包括糖修飾性核苷及DNA核苷。將經修飾核苷納入本發明寡核苷酸中可增強寡核苷酸對靶核酸之親和力。在該情形下，經修飾核苷可稱為親和力增強性經修飾核苷酸，經修飾核苷亦可稱為單元。 在一實施例中，寡核苷酸包括至少1個經修飾核苷，例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包括1至10個經修飾核苷，例如2至8個修飾核苷，例如3至7個經修飾核苷，例如4至6個經修飾核苷，例如3、4、5、6或7個經修飾核苷。 在一實施例中，寡核苷酸包括一或多個糖修飾性核苷，例如2’糖修飾性核苷。較佳地，本發明寡核苷酸包括一或多個獨立地選自由以下組成之群之2’糖修飾性核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA及LNA核苷。甚至更佳地，一或多個經修飾核苷係鎖核酸(LNA)。 在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個經修飾核苷間鏈接。在一較佳實施例中，鄰接核苷酸序列內之所有核苷間鏈接係硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷間鏈接。在一些實施例中，寡核苷酸之鄰接序列中之所有核苷酸間鏈接係硫代磷酸酯鏈接。 在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括至少一個LNA核苷，例如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA核苷，例如2至6個LNA核苷，例如3至7個LNA核苷，4至6個LNA核苷或3、4、5、6或7個LNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸中之至少75%之經修飾核苷係LNA核苷，舉例而言，80%、例如85%、例如90%之經修飾核苷係LNA核苷。在另一實施例中，寡核苷酸中之所有經修飾核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，寡核苷酸可包括β-D-氧基-LNA及下列LNA核苷中之一或多者：硫代-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA及/或ENA (呈β-D或α-L構形或其組合)。在另一實施例中，所有LNA胞嘧啶單元皆係5-甲基-胞嘧啶。在一較佳實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列在核苷酸序列之5’端具有至少1個LNA核苷且在3’端具有至少2個LNA核苷。 在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括至少一個係2’-MOE-RNA核苷之經修飾核苷，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2’-MOE-RNA核苷。在一些實施例中，該等經修飾核苷中之至少一者係2’-氟DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2’-氟-DNA核苷。 在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括至少一個LNA核苷及至少一個2’取代經修飾核苷。 在本發明之一些實施例中，寡核苷酸包括2’糖修飾性核苷及DNA單元。較佳地，寡核苷酸包括LNA及DNA核苷(單元)。較佳地，LNA及DNA單元之組合總數為8-30 (例如10 - 25、較佳地12-22、例如12 - 18、甚至更佳地11-16)。在本發明之一些實施例中，寡核苷酸之核苷酸序列(例如鄰接核苷酸序列)係由至少一個或兩個LNA核苷組成且剩餘核苷係DNA單元。在一些實施例中，寡核苷酸僅包括LNA核苷及天然核苷(例如RNA或DNA、最佳地DNA核苷)，且視情況包括經修飾核苷間鏈接(例如硫代磷酸酯)。 在本發明之一實施例中，本發明寡核苷酸能夠招募RNase H。 本發明寡核苷酸之結構設計可選自間隙聚體、間隙中斷體、頭聚體及尾聚體。 間隙聚體設計 在一較佳實施例中，本發明寡核苷酸具有間隙聚體設計或結構，該間隙聚體設計或結構在本文中亦僅稱為「間隙聚體」。在間隙聚體結構中，寡核苷酸包括至少三個不同結構區域：5’-側翼、間隙及3’-側翼(F-G-F’，以「5 -＞ 3」定向)。在此設計中，在寡核苷酸與靶核酸呈雙螺旋體形式時，側接區F及F’(亦稱為翼區)包括與PD-L1靶核酸互補之經修飾核苷之鄰接序列段，而間隙區G包括能夠招募核酸酶、較佳地內核酸酶(例如RNase，例如RNase H)之核苷酸之鄰接序列段。能夠招募核酸酶、尤其RNase H之核苷可選自由以下組成之群：DNA、α-L-氧基-LNA、2’-氟-ANA及UNA。側接區G之5’及3’端之區域F及F’較佳地包括非核酸酶招募性核苷(具有3’內向結構之核苷)、更佳地一或多個親和力增強性經修飾核苷。在一些實施例中，3’側翼包括至少一個LNA核苷、較佳地至少2個LNA核苷。在一些實施例中，5’側翼包括至少一個LNA核苷。在一些實施例中，5’及3’側接區包括LNA核苷。在一些實施例中，側接區中之所有核苷皆係LNA核苷。在其他實施例中，側接區可包括LNA核苷及其他核苷(混合側翼)，例如DNA核苷及/或非LNA經修飾核苷(例如2’取代核苷)。在此情形下，間隙定義為在5’及3’端側接有由親和力增強性經修飾核苷、較佳地LNA (例如β-D-氧基-LNA)之至少5個RNase H招募性核苷(具有2’內向結構之核苷，較佳係DNA)之鄰接序列。因此，毗鄰間隙區之5’側接區及3’側接區之核苷係經修飾核苷，較佳係非核酸酶招募性核苷。 區域F 連接至區域G之‘5端之區域F(5’側翼或5’翼)包括、含有至少一個經修飾核苷(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷)或由其組成。在一實施例中，區域F包括1至7個經修飾核苷(例如2至6個經修飾核苷、例如2至5個經修飾核苷、例如2至4個經修飾核苷、例如1至3個經修飾核苷、例如1、2、3或4個經修飾核苷)或由其組成。F區域定義為在該區域之5’端及3’端具有至少一個經修飾核苷。 在一些實施例中，區域F中之經修飾核苷具有3’內向結構。 在一實施例中，區域F中之一或多個經修飾核苷係2’修飾核苷。在一實施例中，區域F中之所有核苷皆係2’修飾核苷。 在另一實施例中，除2’修飾核苷外，區域F亦包括DNA及/或RNA。包括DNA及/或RNA之側翼之特徵在於在F區域之5’端及3’端(毗鄰G區域)具有2’修飾核苷。在一實施例中，區域F包括DNA核苷，例如1至3個鄰接DNA核苷，例如1至3個或1至2個鄰接DNA核苷。側翼中之DNA核苷應較佳地不能招募RNase H。在一些實施例中，F區域中之2’修飾核苷及DNA及/或RNA核苷與1至3個2’修飾核苷及1至3個DNA及/或RNA核苷交替。該等側翼亦可稱為交替側翼。具有交替側翼之寡核苷酸中之5’側翼(區域F)之長度可為4至10個核苷，例如4至8個、例如4至6個核苷，例如4、5、6或7個經修飾核苷。在一些實施例中，僅寡核苷酸之5’側翼係交替性。具有交替核苷之區域F之具體實例如下： 2’1-3 -N’1-4 -2’1-3 2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 其中2’指示經修飾核苷且N’係RNA或DNA。在一些實施例中，交替側翼中之所有經修飾核苷皆係LNA且N’係DNA。在另一實施例中，區域F中之一或多個2’修飾核苷係選自2’-O-烷基-RNA單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、2’-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2’-氟-ANA單元。 在一些實施例中，F區域包括LNA及2’取代經修飾核苷。該等形式通常稱為混合翼或混合側翼寡核苷酸。 在本發明之一實施例中，區域F中之所有經修飾核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F中之所有核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫代-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA (呈β-D或α-L構形或其組合)。在一較佳實施例中，區域F在鄰接序列之5’端至少包括1β-D-氧基LNA單元。 區域G 區域G(間隙區)較佳地包括、含有至少4個(例如至少5、例如至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個)能夠招募上文所提及之核酸酶、尤其RNaseH之連續核苷或由其組成。在另一實施例中，區域G包括、含有5至12或6至10或7至9、例如8個能夠招募上文所提及之核酸酶之連續核苷酸單元或由其組成。 區域G中能夠招募核酸酶之核苷單元在一實施例中係選自由以下組成之群：DNA、α-L-LNA、C4’烷基化DNA (如PCT/EP2009/050349及Vester等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300 (二者皆以引用方式併入本文中)中所闡述)、阿拉伯糖源核苷(例如ANA及2'F-ANA) (Mangos等人，2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (非鎖定核酸) (如Fluiter等人，Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039中所闡述，該文獻以引用方式併入本文中)。UNA係非鎖定核酸，通常其中去除核糖之C2與C3之間之鍵，從而形成非鎖定「糖」殘基。 在另一實施例中，區域G中之至少一個核苷單元係DNA核苷單元，例如1至18個DNA單元、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個DNA單元、較佳地2至17個DNA單元、例如3至16個DNA單元、例如4至15個DNA單元、例如5至14個DNA單元、例如6至13個DNA單元、例如7至12個DNA單元、例如8至11個DNA單元、更佳地8至17個DNA單元或9至16個DNA單元、10至15個DNA單元或11至13個DNA單元、例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17個DNA單元。在一些實施例中，區域G係由100%之DNA單元組成。 在其他實施例中，區域G可由DNA及其他能夠介導RNase H裂解之核苷之混合物組成。區域G可由至少50% DNA、更佳地60%、70%或80% DNA及甚至更佳地90%或95% DNA組成。 在另一實施例中，區域G中之至少一個核苷單元係α-L-LNA核苷單元，例如至少一個α-L-LNA、例如2、3、4、5、6、7、8或9個α-L-LNA。在另一實施例中，區域G包括至少一個係α-L-氧基-LNA之α-L-LNA。在另一實施例中，區域G包括DNA及α-L-LNA核苷單元之組合。 在一些實施例中，區域G中之核苷具有2’內向結構。 在一些實施例中，區域G可包括間隙中斷體核苷，從而產生間隙中斷體寡核苷酸，其能夠招募RNase H。 區域F’ 連接至區域G之‘3端之區域F’(3’側翼或3’翼)包括、含有至少一個經修飾核苷(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷)或由其組成。在一實施例中，區域F’包括1至7個經修飾核苷(例如2至6個經修飾核苷，例如2至4個經修飾核苷，例如1至3個經修飾核苷，例如1、2、3或4個經修飾核苷)或由其組成。F’區域定義為在該區域之5’端及3’端具有至少一個經修飾核苷。 在一些實施例中，區域F’中之經修飾核苷具有3’內向結構。 在一實施例中，區域F’中之一或多個經修飾核苷係2’修飾核苷。在一實施例中，區域F’中之所有核苷皆係2’修飾核苷。 在一實施例中，區域F’中之一或多個經修飾核苷係2’修飾核苷。 在一實施例中，區域F’中之所有核苷皆係2’修飾核苷。在另一實施例中，除2’修飾核苷外，區域F’亦包括DNA或RNA。包括DNA或RNA之側翼之特徵在於在F’區域之5’端(毗鄰G區域)及3’端具有2’修飾核苷。在一實施例中，區域F’包括DNA核苷，例如1至4個鄰接DNA核苷、例如1至3或1至2個鄰接DNA核苷。側翼中之DNA核苷應較佳地不能招募RNase H。在一些實施例中，F’區域中之2’修飾核苷及DNA及/或RNA核苷與1至3個2’修飾核苷及1至3個DNA及/或RNA核苷交替，該等側翼亦可稱為交替側翼。具有交替側翼之寡核苷酸中之3’側翼(區域F’)之長度可為4至10個核苷，例如4至8個、例如4至6個核苷，例如4、5、6或7個經修飾核苷。在一些實施例中，僅寡核苷酸之3’側翼係交替性。具有交替核苷之區域F’之具體實例如下： 2’1-2 -N’1-4 -2’1-4 2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 其中2’指示經修飾核苷且N’係RNA或DNA。在一些實施例中，交替側翼中之所有經修飾核苷皆係LNA且N’係DNA。在另一實施例中，區域F’中之經修飾核苷係選自2’-O-烷基-RNA單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、2’-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2’-氟-ANA單元。 在一些實施例中，F’區域包括LNA及2’取代經修飾核苷。該等形式通常稱為混合翼或混合側翼寡核苷酸。 在本發明之一實施例中，區域F’中之所有經修飾核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F’中之所有核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F’中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫代-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA (呈β-D或α-L構形或其組合)。在一較佳實施例中，區域F’在鄰接序列之3’端至少具有2β-D-氧基LNA單元。 區域D’及D’’ 區域D’及D’’可分別連接至區域F之5’端或區域F’之3’端。區域D’或D’’係可選的。 區域D’或D’’可獨立地包括0至5個(例如1至5個，例如2至4個，例如0、1、2、3、4或5個)可與靶核酸互補或非互補之其他核苷酸。就此而言，在一些實施例中，本發明寡核苷酸可包括在5’及/或3’端側接有其他核苷酸能夠調節靶之鄰接核苷酸序列。該等其他核苷酸可用作核酸酶易感性生物可裂解連接體(參見連接體之定義)。在一些實施例中，其他5’及/或3’端核苷與磷酸二酯鏈接連接，且可為DNA或RNA。在另一實施例中，其他5’及/或3’端核苷係可(例如)經包含以增強核酸酶穩定性或便於合成之經修飾核苷。在一實施例中，本發明寡核苷酸在鄰接核苷酸序列之5’或3’端包括區域D’及/或D’’。在另一實施例中，D’及/或D’’區域係由1至5個與靶核酸不互補之磷酸二酯連接之DNA或RNA核苷構成。 本發明之間隙聚體寡核苷酸可由下列各式代表： 5’-F-G-F’-3’；尤其F1-7 -G4-12 -F’1-7 5’-D’-F-G-F’-3’，尤其D’1-3 -F1-7 -G4-12 -F’1-7 5’-F-G-F’-D’’-3’，尤其F1-7 -G4-12 -F’1-7 -D’’1-3 5’-D’-F-G-F’-D’-3’’，尤其D’1-3 -F1-7 -G4-12 -F’1-7 -D’’1-3 區域F、G及F’、D’及D’’中之核苷之較佳數量及類型已闡述於上文中。本發明之寡核苷酸偶聯物具有以共價方式連接至寡核苷酸、尤其上文所呈現之間隙聚體寡核苷酸之5’或3’端之區域C。 在一實施例中，本發明之寡核苷酸偶聯物包括具有式5’-D’-F-G-F’-3’或5’-F-G-F’-D’’-3’之寡核苷酸，其中區域F及F’獨立地包括1 - 7個經修飾核苷，G係6至16個能夠招募RNaseH之核苷之區域且區域D’或D’’包括1 - 5個磷酸二酯連接之核苷。較佳地，區域D’或D’’存在於涵蓋至偶聯物部分之偶聯之寡核苷酸之末端。 具有交替側翼之寡核苷酸之實例可由下列各式代表： 2’1-3 -N’1-4 -2’1-3 -G6-12 -2’1-2 -N’1-4 -2’1-4 2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 -G6-12 -2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 - N’1-2 -2’1-2 F-G6-12 -2’1-2 -N’1-4 -2’1-4 F-G6-12 -2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 2’1-3 -N’1-4 -2’1-3 -G6-12 -F’ 2’1-2 -N’1-2 -2’1-2 -N1-2 -2’1-2 -G6-12 -F’ 其中側翼由F或F’指示，其僅含有2’修飾核苷(例如LNA核苷)。交替區域及區域F、G及F’、D’及D’’中之核苷之較佳數量及類型已闡述於上文中。 在一些實施例中，寡核苷酸係由16、17、18、19、20、21、22個核苷酸(長度)組成之間隙聚體，其中在與PD-L1靶核酸呈雙螺旋體形式時，區域F及F’中之每一者獨立地由1、2、3或4個與PD-L1靶核酸互補之經修飾核苷單元組成且區域G係由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17個能夠招募核酸酶之核苷單元組成，且區域D’係由2磷酸二酯連接之DNA組成。 在另一實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中區域F及F’中之每一者獨立地由3、4、5或6個經修飾核苷單元(例如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)之核苷單元或含有2’-氟-去氧核糖之核苷單元及/或LNA單元)組成，且區域G係由8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個核苷單元(例如DNA單元或其他核酸酶招募性核苷(例如α-L-LNA)或DNA及核酸酶招募性核苷之混合物)組成。 在另一具體實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中F及F’區域中之每一者區域係各自由兩個LNA單元組成，且區域G係由12、13、14個核苷單元、較佳地DNA單元組成。此性質之特定間隙聚體設計包含2-12-2、2-13-2及2-14-2。 在另一具體實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中F及F’中之每一者區域獨立地由三個LNA單元組成，且區域G係由8、9、10、11、12、13或14個核苷單元、較佳地DNA單元組成。具有此性質之特定間隙聚體設計包含3-8-3、3-9-3 3-10-3、3-11-3、3-12-3、3-13-3及3-14-3。 在另一具體實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中F及F’中之每一者區域各自由4個LNA單元組成，且區域G係由8或9、10、11或12個核苷單元、較佳地DNA單元組成。具有此性質之特定間隙聚體設計包含4-8-4、4-9-4、4-10-4、4-11-4及4-12-4。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由6核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-6-1、1-6-2、2-6-1、1-6-3、3-6-1、1-6-4、4-6-1、2-6-2、2-6-3、3-6-2、2-6-4、4-6-2、3-6-3、3-6-4及4-6-3間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由7核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-7-1、2-7-1、1-7-2、1-7-3、3-7-1、1-7-4、4-7-1、2-7-2、2-7-3、3-7-2、2-7-4、4-7-2、3-7-3、3-7-4、4-7-3及4-7-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由8核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-8-1、1-8-2、1-8-3、3-8-1、1-8-4、4-8-1、2-8-1、2-8-2、2-8-3、3-8-2、2-8-4、4-8-2、3-8-3、3-8-4、4-8-3及4-8-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由9核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-9-1、2-9-1、1-9-2、1-9-3、3-9-1、1-9-4、4-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、2-9-4、4-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3及4-9-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由10核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-10-1、2-10-1、1-10-2、1-10-3、3-10-1、1-10-4、4-10-1、2-10-2、2-10-3、3-10-2、2-10-4、4-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3及4-10-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由11核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-11-1、2-11-1、1-11-2、1-11-3、3-11-1、1-11-4、4-11-1、2-11-2、2-11-3、3-11-2、2-11-4、4-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3及4-11-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由12核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-12-1、2-12-1、1-12-2、1-12-3、3-12-1、1-12-4、4-12-1、2-12-2、2-12-3、3-12-2、2-12-4、4-12-2、3-12-3、3-12-4、4-12-3及4-12-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由13核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-13-1、2-13-1、1-13-2、1-13-3、3-13-1、1-13-4、4-13-1、2-13-2、2-13-3、3-13-2、2-13-4、4-13-2、3-13-3、3-13-4、4-13-3及4-13-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由14核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-14-1、2-14-1、1-14-2、1-14-3、3-14-1、1-14-4、4-14-1、2-14-2、2-14-3、3-14-2、2-14-4、4-14-2、3-14-3、3-14-4、4-14-3及4-14-4間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由15核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-15-1、2-15-1、1-15-2、1-15-3、3-15-1、1-15-4、4-15-1、2-15-2、2-15-3、3-15-2、2-15-4、4-15-2及3-15-3間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由16核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-16-1、2-16-1、1-16-2、1-16-3、3-16-1、1-16-4、4-16-1、2-16-2、2-16-3、3-16-2、2-16-4、4-16-2及3-16-3間隙聚體。 具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由17核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-17-1、2-17-1、1-17-2、1-17-3、3-17-1、1-17-4、4-17-1、2-17-2、2-17-3及3-17-2間隙聚體。 在所有情況下，F-G-F’設計可進一步包含區域D’及/或D’’，該等可具有1、2或3個核苷單元(例如DNA單元，例如2磷酸二酯連接之DNA單元)。較佳地，區域F及F’中之核苷係經修飾核苷，而區域G中之核苷酸較佳係未修飾核苷。 在每一設計中，較佳經修飾核苷係LNA。 在另一實施例中，間隙聚體中之間隙中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯及/或硼烷磷酸酯鏈接。在另一實施例中，間隙聚體中之側翼(F及F’區域)中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯及/或硼烷磷酸酯鏈接。在另一較佳實施例中，間隙聚體中之D’及D’’區域中之所有核苷間鏈接皆係磷酸二酯鏈接。 對於如本文所揭示之特定間隙聚體而言，在胞嘧啶(C)殘基注釋為5-甲基-胞嘧啶時，在各個實施例中，存在於寡核苷酸中之一或多個C可為未修飾C殘基。 在一特定實施例中，間隙聚體係所謂的短聚體，如WO2008/113832 (其以引用方式併入本文中)中所闡述。 其他間隙聚體設計揭示於WO2004/046160、WO2007/146511中且以引用方式併入本文中。 對於本發明之某些實施例而言，寡核苷酸係選自具有CMP-ID-NO: 5_1至743_1及771_1之寡核苷酸化合物之群。 對於本發明之某些實施例而言，寡核苷酸係選自具有以下編號之寡核苷酸化合物之群：CMP-ID-NO 6_1、8_1、9_1、13_1、41_1、42_1、58_1、77_1、92_1、111_1、128_1、151_1、164_1、166_1、169_1、171_1、222_1、233_1、245_1、246_1、250_1、251_1、252_1、256_1、272_1、273_1、287_1、292_1、303_1、314_1、318_1、320_1、324_1、336_1、342_1、343_1、344_1、345_1、346_1、349_1、359_1、360_1、374_1、408_1、409_1、415_1、417_1、424_1、429_1、430_1、458_1、464_1、466_1、474_1、490_1、493_1、512_1、519_1、519_1、529_1、533_1、534_1、547_1、566_1、567_1、578_1、582_1、601_1、619_1、620_1、636_1、637_1、638_1、640_1、645_1、650_1、651_1、652_1、653_1、658_1、659_1、660_1、665_1、678_1、679_1、680_1、682_1、683_1、684_1、687_1、694_1、706_1、716_1、728_1、733_1、734_1及735_1。 在本發明之一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 287_1。 在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 342_1。 在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 640_1。 在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 466_1。 在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 566_1。 在本發明之另一實施例中，本發明之寡核苷酸基序及寡核苷酸化合物之鄰接核苷酸序列在鄰接核苷酸序列之5’端包括2至4個其他磷酸二酯連接之核苷(例如區域D’)。在一實施例中，該等核苷用作生物可裂解連接體(參見生物可裂解連接體部分)。在一較佳實施例中，ca (胞苷-腺苷)二核苷酸經由磷酸二酯鏈接連接至鄰接核苷酸序列 (亦即表5中所列示基序序列或寡核苷酸化合物中之任一者)之5’端。在一較佳實施例中，在鄰接核苷酸之其餘部分互補之位置，ca二核苷酸並不與靶序列互補。 在本發明之一些實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列係選自由具有SEQ ID NO: 766、767、768、769及770之核苷酸基序序列組成之群。 在本發明之一些實施例中，寡核苷酸係選自由具有CMP-ID-NO 766_1、767_1、768_1、769_1及770_1之寡核苷酸化合物組成之群。碳水化合物偶聯物部分 碳水化合物偶聯物部分包含(但不限於)半乳糖、乳糖、n-乙醯基半乳糖胺、甘露糖及甘露糖-6-磷酸鹽。可使用碳水化合物偶聯物來增強多種組織(例如肝及/或肌肉)中之遞送或活性。例如參見EP1495769、WO99/65925、Yang等人，Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21。Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17。 在一些實施例中，碳水化合物偶聯物部分係多價的，舉例而言，2、3或4個相同或不同碳水化合物部分可視情況經由一或多個連接體以共價方式接合至寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供包括本發明寡核苷酸及碳水化合物偶聯物部分之偶聯物。 在一些實施例中，偶聯物部分係或可包括甘露糖或甘露糖-6-磷酸鹽。此尤其可用於靶向肌肉細胞，參見例如US 2012/122801。 能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)之偶聯物部分尤其可用於靶向肝中之肝細胞。在一些實施例中，本發明提供包括本發明寡核苷酸及靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分之寡核苷酸偶聯物。靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括一或多個能夠以等於或大於半乳糖之親和力結合至去唾液酸醣蛋白受體之碳水化合物部分(結合ASPGr之碳水化合物部分)。許多半乳糖衍生物對去唾液酸醣蛋白受體之親和力已經研究(參見例如：Jobst, S.T.及Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686)或輕易使用業內典型方法測定。 本發明之一態樣係包括以下之反義寡核苷酸偶聯物：a)寡核苷酸(區域A)，其包括與PD-L1靶核酸具有至少90%互補性之長度10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列；及b)至少一個靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分(區域C)，其共價連接至a)中之寡核苷酸。寡核苷酸或鄰接核苷酸序列可如部分「本發明寡核苷酸」、「寡核苷酸設計」及「間隙聚體設計」中之任一者中所述。 在一些實施例中，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括至少一個選自由以下組成之群之結合ASPGr之碳水化合物部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺。在一些實施例中，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係單價、二價、三價或四價(亦即含有1、2、3或4個能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體之末端碳水化合物部分)。較佳地，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係二價，甚至更佳地係三價。在一較佳實施例中，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括1至3個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分(亦稱為GalNAc偶聯物)。在一些實施例中，寡核苷酸偶聯包括三價N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分之靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。GalNAc偶聯物已與磷酸二酯、甲基膦酸酯及PNA反義寡核苷酸(例如US 5,994517及Hangeland等人，Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec; 6(6):695-701；Biessen等人，1999 Biochem J. 340, 783-792及Maier等人，2003 Bioconjug Chem 14, 18-29 )及siRNA (例如WO 2009/126933、WO 2012/089352及WO 2012/083046)以及LNA及2'-MOE修飾核苷(WO 2014/076196 WO 2014/207232及WO 2014/179620 (以引用方式併入本文中))一起使用。 為生成靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分，使ASPGr結合碳水化合物部分(較佳係GalNAc)經由糖之C-l碳連接至支化劑分子。ASPGr結合碳水化合物部分較佳地經由間隔體連接至支化劑分子。較佳間隔體係撓性親水性間隔體(美國專利5885968；Biessen等人。J. Med. Chern. 1995第39卷第1538-1546頁)。較佳撓性親水性間隔體係PEG間隔體。較佳PEG間隔體係PEG3間隔體(三個乙烯單元)。支化劑分子可為任一允許連接兩個或三個結合ASPGr之末端碳水化合物部分且進一步允許將分支點連接至寡核苷酸之小分子。實例性支化劑分子係二離胺酸。二離胺酸分子含有三個胺基團(經由其可連接三個結合ASPGr之碳水化合物部分)及羧基反應性基團(二離胺酸可經由其連接至寡核苷酸)。替代支化劑分子可為雙倍增體或三倍增體，例如由Glen Research所供應者。在一些實施例中，支化劑可選自由以下組成之群：1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1920-xx)、參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1922-xx)、參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]亞甲基氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺及1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲基氧基)戊基醯胺基]-3-[5-茀甲氧基-羰基-氧基-戊基醯胺基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1925-xx)。WO 2014/179620及PCT申請案第PCT/EP2015/073331號闡述各種GalNAc偶聯物部分之生成(以引用方式併入本文中)。可將一或多個連接體插入支化劑分子與寡核苷酸之間。在一較佳實施例中，連接體係生物可裂解連接體。連接體可選自「連接體」部分及其子部分中所闡述之連接體。 可使用業內已知方法將靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分、尤其GalNAc偶聯物部分連接至寡核苷酸之3'-端或5'-端。在較佳實施例中，將靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分連接至寡核苷酸之5’-端。 與siRNA遞送相關之藥物動力學調節劑已闡述於WO2012/083046 (以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，碳水化合物偶聯物部分包括選自由以下組成之群之藥物動力學調節劑：具有16或更多個碳原子之疏水性基團、具有16-20個碳原子之疏水性基團、棕櫚醯基、十六-8-烯醯基、油烯基、(9E,12E)-十八-9,12二烯醯基、二辛醯基及C16-C20醯基及膽固醇。在一較佳實施例中，含有藥物動力學調節劑之碳水化合物偶聯物部分係GalNAc偶聯物。 較佳碳水化合物偶聯物部分包括一至三個結合ASPGr之末端碳水化合物部分、較佳地N-乙醯基半乳糖胺部分。在一些實施例中，碳水化合物偶聯物部分包括三個經由間隔體連接至支化劑分子之結合ASPGr之碳水化合物部分、較佳地N-乙醯基半乳糖胺部分。間隔體分子可長8至30個原子。較佳碳水化合物偶聯物部分包括三個經由PEG間隔體連接至二離胺酸支化劑分子之末端GalNAc部分。較佳地，PEG間隔體係3PEG間隔體。適宜靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分展示於圖1中。較佳靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分展示於圖3中。 其他GalNAc偶聯物部分可包含(例如)連接有GalNAc部分之小肽，例如Tyr-Glu-Glu-(胺基己基GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3；結合至肝細胞上之去唾液酸醣蛋白受體之糖三肽，例如參見Duff等人，Methods Enzymol, 2000, 313, 297)；基於離胺酸之半乳糖簇(例如L3G4；Biessen等人，Cardovasc.  Med., 1999, 214)；及基於膽烷之半乳糖簇(例如用於去唾液酸醣蛋白受體之碳水化合物識別基序)。 在本發明之一些實施例中，反義寡核苷酸偶聯物係選自由以下組成之群：CPM ID NO: 766_2、767_2、768_2、769_2及770_2。 在一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖4中所表示之化合物。 在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖5中所表示之化合物。 在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖6中所表示之化合物。 在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖7中所表示之化合物。 在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖8中所表示之化合物。連接體 生物可裂解連接體 ( 區域 B) 使用偶聯物通常會增強藥物動力學或藥效動力學性質。然而，偶聯物部分之存在可(例如)經由妨礙雜交或核酸酶招募(例如RNAseH)之立體阻礙來干擾寡核苷酸針對其預期靶之活性。在寡核苷酸(區域A或第一區域)與偶聯物部分(區域C或第三區域)之間使用生理上不穩定鍵(生物可裂解連接體)使得因存在偶聯物部分而改良性質，同時確保在靶組織處偶聯基團不妨礙寡核苷酸之有效活性。 在含有生理上不穩定鍵之分子到達適當細胞內及/或細胞外環境時，該不穩定鍵自發發生裂解。舉例而言，在分子進入經酸化胞內體時，pH不穩定鍵可發生裂解。因此，pH不穩定鍵可視為胞內體可裂解鍵。酶可裂解鍵可在暴露於酶(例如存在於胞內體或溶酶體中或細胞質中者)時發生裂解。二硫鍵可在分子進入細胞質之較高還原環境時發生裂解。因此，二硫化物可視為細胞質可裂解鍵。如本文中所使用，pH不穩定鍵係在酸性條件(pH＜7)下選擇性斷裂之不穩定鍵。該等鍵亦可稱為胞內體不穩定鍵，此乃因細胞胞內體及溶酶體之pH小於7。 對於與用於靶向遞送之偶聯物部分締合之生物可裂解連接體而言，較佳地，靶組織(例如肌肉、肝、腎或腫瘤)中所看到之裂解速率大於發現於血清中者。用於測定靶組織與血清中之裂解或S1核酸酶裂解之程度(%)之適宜方法闡述於「材料及方法」部分中。在一些實施例中，本發明偶聯物中之生物可裂解連接體(亦稱為生理上不穩定連接體或核酸酶易感連接體或區域B)與標準相比至少約20%裂解，例如至少約30%裂解、例如至少約40%裂解、例如至少約50%裂解、例如至少約60%裂解、例如至少約70%裂解、例如至少約75%裂解。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸偶聯物包括三個區域：i)第一區域(區域A)，其包括10 - 25個與靶核酸互補之鄰接核苷酸；ii)第二區域(區域B)，其包括生物可裂解連接體；及iii)第三區域(區域C)，其包括偶聯物部分，例如靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分，其中第三區域共價連接至以共價方式連接至第一區域之第二區域。 在本發明之一實施例中，寡核苷酸偶聯物在鄰接核苷酸序列(區域A)與靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分(區域C)之間包括生物可裂解連接體(區域B)。 在一些實施例中，生物可裂解連接體可位於與靶核酸互補之鄰接核苷酸(區域A)之5’端及/或3’端。在一較佳實施例中，生物可裂解連接體位於5’端。 在一些實施例中，可裂解連接體易感可(例如)表現於靶細胞中之核酸酶。在一些實施例中，生物可裂解連接體係由2至5個連續磷酸二酯鏈接構成。連接體可為短區域(例如1 - 10，如連接體定義中所詳述)磷酸二酯連接之核苷。在一些實施例中，生物可裂解連接體區B中之核苷(視情況獨立地)選自由以下組成之群：DNA及RNA或其不干擾核酸酶裂解之修飾。不干擾核酸酶裂解之DNA及RNA核苷修飾可為非天然核鹼基。某些糖修飾性核苷亦可容許核酸酶裂解，例如α-L-氧基-LNA。在一些實施例中，區域B中之所有核苷包括(視情況獨立地) 2’-OH核糖糖(RNA)或2’-H糖-亦即RNA或DNA。在一較佳實施例中，區域B之至少兩個連續核苷係DNA或RNA核苷(例如至少3或4或5個連續DNA或RNA核苷)。在一甚至更佳實施例中，區域B之核苷係DNA核苷。較佳地，區域B係由1至5或1至4 (例如2、3、4)個連續磷酸二酯連接之DNA核苷組成。在較佳實施例中，區域B較短以便其不招募RNaseH。在一些實施例中，區域B包括不超過3或不超過4個連續磷酸二酯連接之DNA及/或RNA核苷(例如DNA核苷)。 在區域B係由磷酸二酯連接之核苷構成之情形下，區域A及B可一起形成連接至區域C之寡核苷酸。在此背景下，區域A與區域B之不同之處可在於，區域A始於至少一個、較佳地至少兩個對靶核酸具有增加之結合親和力之經修飾核苷(例如LNA或具有2’取代糖部分之核苷)且區域A自身能夠調節靶核酸在相關細胞系中之表現。另外，若區域A包括DNA或RNA核苷，則該等核苷與核酸酶抗性核苷間鏈接(例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯)連接。另一方面，區域B在DNA與RNA核苷之間包括磷酸二酯鏈接。在一些實施例中，區域B並不與靶核酸互補或相對於靶核酸包括至少50%失配。 在一些實施例中，區域B並不與靶核酸序列或與區域A中之靶核酸互補之鄰接核苷酸互補。 在一些實施例中，區域B與靶核酸序列互補。就此而言，區域A及B一起可形成與靶序列互補之單一鄰接序列。 在本發明之一些態樣中，第一區域(區域A)及第二區域(區域B)之間之核苷間鏈接可視為第二區域之一部分。 在一些實施例中，基於存在於靶組織或細胞或子細胞腔室中之主要內核酸酶裂解酶，選擇區域B中之鹼基序列以提供最佳內核酸酶裂解位點。就此而言，藉由自靶組織及非靶組織分離細胞提取物，可基於期望靶細胞(例如肝/肝細胞)中與非靶細胞(例如腎)相比之優先裂解活性來選擇用於區域B中之內核酸酶裂解序列。就此而言，可針對期望組織/細胞最佳化化合物關於靶下調之功效。 在一些實施例中，區域B包括序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG之二核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶，及/或T可經U代替。較佳地，核苷間鏈接係磷酸二酯鏈接。在一些實施例中，區域B包括序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC及GGG之三核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U代替。較佳地，核苷間鏈接係磷酸二酯鏈接。在一些實施例中，區域B包括序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX及GGGX之三核苷酸，其中X可選自由以下組成之群：A、T、U、G、C及其類似物，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U代替。較佳地，核苷間鏈接係磷酸二酯鏈接。應識別到，在提及(天然)核鹼基A、T、U、G、C時，該等核鹼基可經用作等效天然核鹼基之核鹼基類似物(例如具有互補核苷之鹼基對)取代。其他連接體 ( 區域 Y) 連接體可具有至少兩個官能基，一個官能基用於連接至寡核苷酸且另一個用於連接至偶聯物部分。實例性連接體官能基可為親電性以用於與寡核苷酸或偶聯物部分上之親核性基團進行反應，或為親核性以用於與親電性基團進行反應。在一些實施例中，連接體官能基包含胺基、羥基、羧酸、硫醇、胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亞磷酸酯、不飽和基團(例如雙鍵或三鍵)及諸如此類。一些實例性連接體(區域Y)包含8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-l-甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、6-胺基己酸(AHEX或AHA)、6-胺基己基氧基、4-胺基丁酸、4-胺基環己基甲酸、琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷- l-羧基-(6-醯胺基-己酸酯) (LCSMCC)、間馬來醯亞胺基-苯甲酸琥珀醯亞胺基酯(MBS)、N-e-馬來醯亞胺基-辛酸琥珀醯亞胺基酯(EMCS)、6-(β-馬來醯亞胺基-丙醯胺基)己酸琥珀醯亞胺基酯(SMPH)、琥珀醯亞胺基N-(a-馬來醯亞胺基乙酸酯) (AMAS)、4-(p-馬來醯亞胺基苯基)丁酸琥珀醯亞胺基酯(SMPB)、β -丙胺酸(β-ALA)、苯基甘胺酸(PHG)、4-胺基環己酸(ACHC)、β -(環丙基)丙胺酸(β-CYPR)、胺基十二烷酸(ADC)、伸烷基二醇、聚乙二醇、胺基酸及諸如此類。在一些實施例中，連接體(區域Y)係胺基烷基，例如C2 - C36胺基烷基(包含(例如) C6 - C12胺基烷基)。在一較佳實施例中，連接體(區域Y)係C6胺基烷基。可(例如)使用(例如經保護)胺基烷基胺基磷酸胺基酯烷基酯添加至寡核苷酸(區域A或區域A-B)中以作為標準寡核苷酸合成之一部分。胺基烷基與寡核苷酸之間之鏈接基團可(例如)為硫代磷酸酯或磷酸二酯或本文所提及其他核苷鏈接基團中之一者。胺基烷基以共價方式連接至寡核苷酸之5’或3’端。市售胺基烷基連接體係(例如) 3'-胺基-修飾劑試劑(用於寡核苷酸之3’端處之鏈接)，且對於寡核苷酸之5 '端處之鏈接而言，可使用5'-胺基-修飾劑C6。該等試劑可自Glen Research Corporation (Sterling, Va.)獲得。該等化合物或類似物在Krieg等人，Antisense Research and Development 1991, 1, 161中用於將螢光黃連接至寡核苷酸之5'-末端。業內已知眾多種其他連接體基團且可用於將偶聯物部分連接至寡核苷酸。許多有用連接體基團之綜述可參見(例如) Antisense Research and Applications, S. T. Crooke及B. Lebleu編輯，CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993，第303-350頁。其他化合物(例如吖啶)經由聚亞甲基鏈接連接至寡核苷酸之3'-末端磷酸酯基團(Asseline等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297)。任一上述基團皆可用作單一連接體(區域Y)或與一或多個其他連接體組合使用(區域Y-Y’或區域Y-B或B-Y)。 連接體及其製備寡核苷酸偶聯物之用途已在業內廣泛提供，例如WO 96/11205及WO 98/52614及U.S. Pat. No. 4,948,882；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,580,731；5,486,603；5,608,046；4,587,044；4,667,025；5,254,469；5,245,022；5,112,963；5,391,723；5,510475；5,512,667；5,574,142；5,684,142；5,770,716；6,096,875；6,335,432；及6,335,437；WO 2012/083046，該等案件中之每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中。 製造方法 在另一態樣中，本發明提供製造本發明寡核苷酸之方法，其包括使核苷酸單元進行反應且由此形成包括於寡核苷酸中之以共價方式連接之鄰接核苷酸單元。較佳地，該方法使用亞磷醯胺化學(例如參見Caruthers等人，1987, Methods in Enzymology第154卷，第287-313頁)。在另一實施例中，該方法進一步包括使鄰接核苷酸序列與偶聯物部分(配體)進行反應。在另一態樣中，提供製造本發明組合物之方法，其包括混合本發明之寡核苷酸或偶聯寡核苷酸與醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。 醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包括任一上文所提及之寡核苷酸及/或寡核苷酸偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥上可接受之稀釋劑包含磷酸緩衝鹽水(PBS)且醫藥上可接受之鹽包含(但不限於)鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸以50 - 300µM溶液之濃度用於醫藥上可接受之稀釋劑中。 用於本發明中之適宜調配物可參見Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.，第17版，1985。關於藥物遞送方法之簡要綜述，參見(例如) Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO2007/031091提供醫藥上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之其他適宜及較佳實例(以引用方式併入本文中)。適宜劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物亦提供於WO2007/031091中。 可混合本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物與醫藥上可接受之活性或惰性物質以用於製備醫藥組合物或調配物。組合物及調配醫藥組合物之方法取決於諸多準則，包含(但不限於)投與途徑、疾病程度或擬投與劑量。 該等組合物可藉由習用滅菌技術進行滅菌，或可無菌過濾。可將所得水溶液包裝以供按原樣使用或將其凍乾，將凍乾製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。製劑之pH通常介於3與11之間，更佳地介於5與9之間或介於6與8之間，且最佳地介於7與8之間(例如7至7.5)。可將呈固體形式之所得組合物包裝成多個單一劑量單元，每一單元含有固定量之上文所提及之一或多種藥劑，例如呈錠劑或膠囊之密封包裝形式。亦可將呈固體形式之組合物包裝成用於撓性量之容器，例如呈設計用於局部施加之乳霜或軟膏之可擠壓管形式。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物係前藥。特定而言，對於寡核苷酸偶聯物而言，在將前藥遞送至作用位點(例如靶細胞)後，偶聯物部分立即與寡核苷酸分離。 應用 本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物可用作用於(例如)診斷、治療及預防之研究試劑。 在研究中，可使用該等寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物來特異性調節PD-L1蛋白在細胞(例如活體外細胞培養物)及實驗動物中之合成，由此促進靶之功能分析或其作為用於治療干預之靶之有用性的評價。通常，藉由降解或抑制產生蛋白質之mRNA (由此防止形成蛋白質)或藉由降解或抑制產生蛋白質之基因或mRNA之調節劑來達成靶調節。 若在研究或診斷中採用本發明寡核苷酸，則靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。 本發明提供調節表現PD-L1之靶細胞中之PD-L1表現之活體內或活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物。 在一些實施例中，靶細胞係哺乳動物細胞、尤其人類細胞。靶細胞可為哺乳動物中之組織之活體外細胞培養物或活體內細胞形成部分。在較佳實施例中，靶細胞存在於肝中。肝靶細胞可選自實質細胞(例如肝細胞)及非實質細胞(例如庫弗氏細胞、LSEC、星形細胞(或Ito細胞)、膽管上皮細胞及肝相關白血球(包含T細胞及NK細胞))。在一些實施例中，靶細胞係抗原呈遞細胞。抗原呈遞細胞在其表面上顯示與種類I或種類II主要組織相容性複合物(MHC)複合之外來抗原。在一些實施例中，抗原呈遞細胞表現種類II MHC (亦即職業性抗原呈遞細胞，例如樹突狀細胞、巨噬球及B細胞)。 在診斷中，可使用寡核苷酸藉由北方印漬(北方印漬)、原位雜交或類似技術來檢測及量化細胞及組織中之PD-L1表現。 對於治療而言，可將本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或其醫藥組合物投與懷疑患有疾病或病症之動物或人類，該疾病或病症可藉由降低PD-L1表現、尤其藉由降低肝靶細胞中之PD-L1表現來予以緩解或治療。 本發明提供治療或預防疾病之方法，其包括向患有或易感該疾病之個體投與治療或預防有效量之本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。 本發明亦係關於用作藥劑之本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。 本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物通常係以有效量來投與。 本發明亦提供本發明之所闡述寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物之用途，其用以製造用於治療如本文所提及之疾病或病症之藥劑。在一實施例中，該疾病係選自a)病毒性肝感染，例如HBV、HCV及HDV；b)寄生蟲感染，例如瘧疾、弓蟲症、利什曼病及錐蟲病；及c)肝癌或肝中轉移。 在一實施例中，本發明係關於用於治療選自病毒或寄生蟲感染之疾病或病症之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。在另一實施例中，該疾病係選自a)病毒性肝感染，例如HBV、HCV及HDV；b)寄生蟲感染，例如瘧疾、弓蟲症、利什曼病及錐蟲病；及c)肝癌或肝中轉移。 如本文所提及之疾病或病症與免疫耗竭有關。特定而言，疾病或病症與病毒特異性T細胞反應之耗竭有關。在一些實施例中，可藉由降低PD-L1表現來緩解或治療疾病或病症。 本發明方法較佳用於治療或預防與免疫耗竭有關之疾病。 在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於恢復針對肝癌或肝中轉移之免疫反應。 在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於恢復針對病原體之免疫反應。在一些實施例中，病原體可發現於肝中。病原體可為病毒或寄生蟲，尤其係本文所闡述者。在一較佳實施例中，病原體係HBV。 本發明另外係關於如本文所定義之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物之用途，其用以製造用於恢復針對如本文所提及病毒或寄生蟲感染之免疫性之藥劑。 本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於治療病毒感染、尤其影響PD-1路徑之肝中之病毒感染(例如參見Kapoor及Kottilil 2014 Future Virol第9卷第565-585頁及Salem及El-Badawy 2015 World J Hepatol第7卷第2449-2458頁)。病毒性肝感染可選自由以下組成之群：肝炎病毒、尤其HBV、HCV及HDV、尤其該等感染之慢性形式。在一實施例中，使用本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物來治療HBV、尤其慢性HBV。慢性HBV感染之指標係循環中之高病毒負荷值(HBV DNA)及甚至較高含量之空HBsAg顆粒(＞100倍過量病毒體)。 本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物亦可用於治療與HIV共感染發生之病毒性肝感染。可使用本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物治療之其他病毒感染係lcmv (淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒)及HIV (呈單菌性感染形式)、HSV-1及HSV-2及其他皰疹病毒。該等病毒並非感染肝細胞傾向性，然而，其可對PDL1下調敏感。 在一些實施例中，免疫性或免疫反應之恢復涉及改良T細胞及/或NK細胞反應及/或緩解T細胞耗竭，特定而言，恢復HBV特異性T細胞反應、HCV特異性T細胞反應及或HDV特異性T細胞反應。可(例如)將T細胞反應之改良評價為與對照(例如在治療之前之值或在媒劑治療個體中之值)相比肝中之T細胞增加、尤其CD8+及/或CD4+ T細胞增加。在另一實施例中，病毒特異性CD8+ T細胞與對照相比有所恢復或增加，特定而言，HBV特異性CD8+ T細胞或HCV特異性CD8+ T細胞或HDV特異性CD8+ T細胞與對照相比有所恢復或增加。在一較佳實施例中，在使用本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物治療之個體中，與對照相比，HBV s抗原(HBsAg)特異性CD8+ T細胞及/或HBV e抗原(HBeAg)特異性CD8+ T細胞及/或HBV核心抗原(HBcAg)特異性CD8+ T細胞有所增加。較佳地，HBV抗原特異性CD8+ T細胞產生一或多種細胞介素(例如干擾素-γ(IFN-γ)或腫瘤壞死因子α (TNF-α))。尤其在肝中觀察到上述CD8+ T細胞之增加。在與對照相比時，本文所闡述之增加應在統計學上顯著。較佳地，在與對照相比時，增加至少20% (例如25%，例如50%，例如75%)。在另一實施例中，藉由本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物活化天然殺手(NK)細胞及/或天然殺手T (NKT)細胞。 本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於治療寄生蟲感染、尤其影響PD-1路徑之寄生蟲感染(例如參見Bhadra等人， 2012 J Infect Dis第206卷第125-134頁；Bhadra等人， 2011 Proc Natl Acad Sci U S A第108卷第9196-9201頁；Esch等人， J Immunol第191卷第5542-5550頁；Freeman及Sharpe 2012 Nat Immunol第13卷第113-115頁；Gutierrez等人， 2011 Infect Immun第79卷第1873-1881頁；Joshi等人， 2009 PLoS Pathog第5卷e1000431；Liang等人， 2006 Eur J Immunol第36卷第58-64頁；Wykes等人， 2014 Front Microbiol第5卷第249頁)。寄生蟲感染可選自由以下組成之群：瘧疾、弓蟲症、利什曼病及錐蟲病。瘧疾感染係由瘧原蟲屬、尤其物種間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及惡性瘧原蟲之原生動物引起。 弓蟲症係由弓蟲(Toxoplasma gondii )引起之寄生蟲疾病。利什曼病係由利什曼原蟲(Leishmania )屬之原生動物寄生蟲引起之疾病。 錐蟲病係藉由布魯氏錐蟲(Trypanosoma )屬之原生動物引起。查加斯病(Chaga disease)係由物種克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi )引起之熱帶形式，且睡眠疾病係由物種布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei )引起。 在一些實施例中，免疫性恢復涉及恢復寄生蟲特異性T細胞及NK細胞反應、尤其瘧原蟲屬特異性T細胞反應、弓蟲特異性T細胞及NK細胞反應、利什曼原蟲特異性T細胞及NK細胞反應、克魯斯錐蟲特異性T細胞及NK細胞反應或布魯氏錐蟲特異性T細胞及NK細胞反應。在另一實施例中，恢復寄生蟲特異性CD8+ T細胞及NK細胞反應。 投與 可局部(例如皮膚、吸入、眼部或耳部)或經腸(例如經口或經由胃腸道)或非經腸(例如靜脈內、皮下、肌內、大腦內、大腦心室內或鞘內)投與本發明之寡核苷酸或醫藥組合物。 在一較佳實施例中，藉由非經腸途徑(包含靜脈內、動脈內、皮下、腹膜腔內或肌內注射或輸注、鞘內或顱內(例如大腦內)或心室內、玻璃體內投與)投與本發明之寡核苷酸或醫藥組合物。在一實施例中，經靜脈內投與活性寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物。在另一實施例中，經皮下投與活性寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物。 在一些實施例中，以0.1 - 15 mg/kg (例如0.1 - 10 mg/kg，例如0.2 - 10 mg/kg，例如0.25 - 10 mg/kg，例如0.1 - 5 mg/kg，例如0.2 - 5 mg/kg，例如0.25 - 5 mg/kg)之劑量投與本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。可每週一次、每第2週，每第三週或甚至每月一次進行投與。 組合療法 在一些實施例中，將本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物與另一治療劑用於組合治療。治療劑可為(例如)用於上述疾病或病症之標準護理。 為治療慢性HBV感染，推薦使用抗病毒藥物及免疫系統調節劑之組合作為標準護理。有效針對HBV之抗病毒藥物係(例如)核苷(酸)類似物。5種核苷(酸)類似物已經許可用於治療HBV，亦即拉米夫定(lamivudine) (Epivir)、阿德福韋(adefovir) (Hepsera)、替諾福韋(tenofovir) (Viread)、替比夫定(telbivudine) (Tyzeka)、恩替卡韋(entecavir) (Baraclude)，該等藥劑有效阻抑病毒複製(HBV DNA)，但對HBsAg含量並無效應。其他抗病毒藥物包含利巴韋林(ribavirin)及HBV抗體療法(單株或多株)。免疫系統調節劑可為(例如)干擾素α-2a及聚乙二醇化干擾素α-2a (Pegasys)或TLR7激動劑(例如GS-9620)或治療疫苗。IFN-α治療僅展示降低病毒負荷之極輕微效應，但產生一定程度之HBsAg下降，但該下降極低(在48週療法之後＜10%)。 本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物亦可與其他有效抵抗HBV之抗病毒藥物(例如闡述於WO2012/145697及WO 2014/179629中之反義寡核苷酸或闡述於WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520及WO 2013/159109中之siRNA分子)進行組合。 在組合療法中投與本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物與其他藥劑時，可依序或同時將其投與個體。或者，本發明之醫藥組合物可包括本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物以及如本文所闡述醫藥上可接受之賦形劑及業內已知之另一治療性或預防性藥劑的組合。 實施例 本發明之下列實施例可與本文所闡述之任一其他實施例組合使用。 1. 一種反義寡核苷酸，其包括長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列或由其組成且能夠降低PD-L1表現。 2. 如實施例1之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與PD-L1靶核酸至少90%互補。 3. 如實施例1或2之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與選自由以下組成之群之靶核酸互補：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及/或SEQ ID NO: 3。 4. 如實施例1至3之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與SEQ ID NO: 1上之位置1及15720內之區域互補。 5. 如實施例1至4之寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠以低於-10 kcal之ΔG°雜交至選自由以下組成之群之靶核酸：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及/或SEQ ID NO: 3。 6. 如實施例1至5之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸之子序列互補，其中該子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置371至3068、5467至12107、15317至15720、15317-18083、15317至19511及18881至19494。 7. 如實施例6之寡核苷酸，其中該子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置7300至7333、8028至8072、9812至9859、11787至11873及15690至15735。 8. 如實施例2至7之寡核苷酸，其中該靶核酸係RNA。 9. 如實施例8之寡核苷酸，其中該RNA係mRNA。 10. 如實施例9之寡核苷酸，其中該mRNA係mRNA前體或成熟mRNA。 11. 如實施例1至10之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括至少14個鄰接核苷酸、尤其15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸或由其組成。 12. 如實施例1至10之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括16至20個核苷酸或由其組成。 13. 如實施例1至10之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括14至35個核苷酸(長度)或由其組成。 14. 如實施例13之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括18至22個核苷酸(長度)或由其組成。 15. 如實施例1至14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸或鄰接核苷酸序列係單鏈。 16. 如實施例1至15之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸之子序列互補，其中該子序列係選自由以下組成之群：A7、A26、A43、A119、A142、A159、A160、A163、A169、A178、A179、A180、A189、A201、A202、A204、A214、A221、A224、A226、A243、A254、A258、269、A274、A350、A360、A364、A365、A370、A372、A381、A383、A386、A389、A400、A427、A435及A438。 17. 如實施例16之寡核苷酸，其中該子序列係選自由以下組成之群：A221、A360、A180、A160及A269。 18. 如實施例1至17之寡核苷酸，其中該寡核苷酸並非siRNA且並不自我互補。 19. 如實施例1至18之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括選自SEQ ID NO: 5至743或771之序列或由其組成。 20. 如實施例1至19之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括選自以下之序列或由其組成：SEQ ID NO: 6、8、9、13、41、42、58、77、92、111、128、151、164、166、169、171、222、233、245、246、250、251、252、256、272、273、287、292、303、314、318、320、324、336、342、343、344、345、346、349、359、360、374、408、409、415、417、424、429、430、458、464、466、474、490、493、512、519、519、529、533、534、547、566、567、578、582、601、619、620、636、637、638、640、645、650、651、652、653、658、659、660、665、678、679、680、682、683、684、687、694、706、716、728、733、734及735。 21. 如實施例1至20之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括選自SEQ ID NO:466、640、342、287及566之序列或由其組成。 22. 如實施例1至21之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與其互補靶核酸相比具有零至三個失配。 23. 如實施例22之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸相比具有一個失配。 24. 如實施例22之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸相比具有兩個失配。 25. 如實施例22之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸序列完全互補。 26. 如實施例1至25之寡核苷酸，其包括一或多個經修飾核苷。 27. 如實施例26之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係高親和力經修飾核苷。 28. 如實施例26或27之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係2’糖修飾性核苷。 29. 如實施例28之寡核苷酸，其中該一或多個2’糖修飾性核苷獨立地選自由以下組成之群：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA及LNA核苷。 30. 如實施例28之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係LNA核苷。 31. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷係氧基-LNA。 32. 如實施例31之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係β-D-氧基-LNA。 33. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係硫代-LNA。 34. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係胺基-LNA。 35. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係cET。 36. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係ENA。 37. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷係選自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-胺基-LNA、α-L-胺基-LNA、β-D-硫代-LNA、α-L-硫代-LNA、(S)cET、(R)cETβ-D-ENA及α-L-ENA。 38. 如實施例30至37之寡核苷酸，其中除該經修飾LNA核苷外存在至少一個2’取代經修飾核苷。 39. 如實施例38之寡核苷酸，其中該2’取代經修飾核苷係選自由以下組成之群：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA。 40. 如實施例1至39中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個經修飾核苷間鏈接。 41. 如實施例40之寡核苷酸，其中該經修飾核苷間鏈接係核酸酶抗性。 42. 如實施例40或41之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列內之至少50%之該等核苷間鏈接係硫代磷酸酯核苷間鏈接或硼烷磷酸酯核苷間鏈接。 43. 如實施例40或41之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列內之所有該等核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯核苷間鏈接。 44. 如實施例1至43之寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠招募RNase H。 45. 如實施例44之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係間隙聚體。 46. 如實施例44或45之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係式5’-F-G-F’-3’之間隙聚體，其中區域F及F’獨立地包括1至7個經修飾核苷或由其組成且G係能夠招募RNaseH之6至16個核苷之區域。 47. 如實施例44或45之寡核苷酸，其中該間隙聚體具有式5’-D’-F-G-F’-3’或5’-F-G-F’-D’’-3’，其中區域F及F’獨立地包括1至7個經修飾核苷，G係能夠招募RNaseH之6至16個核苷之區域且區域D’或D’’包括1至5個磷酸二酯連接之核苷。 48. 如實施例47之寡核苷酸，其中D’或D’’係可選的。 49. 如實施例47之寡核苷酸，其中區域D’係由兩個磷酸二酯連接之核苷組成。 50. 如實施例49之寡核苷酸，其中該等磷酸二酯連接之核苷係ca (胞苷-腺苷)。 51. 如實施例46或47之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係獨立地選自由以下組成之群之2’糖修飾性核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA及LNA核苷。 52. 如實施例46至51之寡核苷酸，其中區域F及F’中之該等經修飾核苷中之一或多者係LNA核苷。 53. 如實施例52之寡核苷酸，其中區域F及F’中之所有該等經修飾核苷皆係LNA核苷。 54. 如實施例53之寡核苷酸，其中區域F及F’係由LNA核苷組成。 55. 如實施例52至54之寡核苷酸，其中區域F及F’中之所有該等經修飾核苷皆係氧基-LNA核苷。 56. 如實施例52之寡核苷酸，其中區域F或F’中之至少一者進一步包括至少一個獨立地選自由以下組成之群之2’取代經修飾核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA及2’-氟-DNA。 57. 如實施例46至56之寡核苷酸，其中區域G中之該等招募RNaseH之核苷獨立地選自DNA、α-L-LNA、C4’烷基化DNA、ANA及2'F-ANA及UNA。 58. 如實施例57之寡核苷酸，其中區域G中之該等核苷係DNA及/或α-L-LNA核苷。 59. 如實施例57或58之寡核苷酸，其中區域G由至少75%之DNA核苷組成。 60. 如實施例1至59之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自CMP ID NO: 5_1至743_1及771_1 (表5)中之任一者。 61. 如實施例1至60之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自由以下組成之群：CMP ID NO: 6_1、8_1、9_1、13_1、41_1、42_1、58_1、77_1、92_1、111_1、128_1、151_1、164_1、166_1、169_1、171_1、222_1、233_1、245_1、246_1、250_1、251_1、252_1、256_1、272_1、273_1、287_1、292_1、303_1、314_1、318_1、320_1、324_1、336_1、342_1、343_1、344_1、345_1、346_1、349_1、359_1、360_1、374_1、408_1、409_1、415_1、417_1、424_1、429_1、430_1、458_1、464_1、466_1、474_1、490_1、493_1、512_1、519_1、519_1、529_1、533_1、534_1、547_1、566_1、567_1、578_1、582_1、601_1、619_1、620_1、636_1、637_1、638_1、640_1、645_1、650_1、651_1、652_1、653_1、658_1、659_1、660_1、665_1、678_1、679_1、680_1、682_1、683_1、684_1、687_1、694_1、706_1、716_1、728_1、733_1、734_1及735_1。 62. 如實施例1至61之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自由以下組成之群：CMP ID NO:287_1、342_1、466_1、640_1、566_1、766_1、767_1、768_1、769_1及770_1。 63. 一種反義寡核苷酸偶聯物，其包括 a. 如實施例1至62中任一項之寡核苷酸(區域A)；及 b.     至少一個以共價方式連接至該寡核苷酸之偶聯物部分(區域C)。 64. 如實施例63之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係選自碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素、維他命、病毒蛋白質或其組合。 65. 如實施例63或64之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係含有碳水化合物之部分。 66. 如實施例65之寡核苷酸偶聯物，其中該碳水化合物偶聯物部分包括至少一個共價連接至如實施例1至62中任一項之寡核苷酸之靶向去唾液酸醣蛋白受體之部分。 67. 如實施例66之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括至少一個選自由以下組成之群之碳水化合物部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺。 68. 如實施例66或67之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係單價、二價、三價或四價。 69. 如實施例68之寡聚物偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係由二至四個末端GalNAc部分、將每一GalNAc部分連接至支化劑分子之PEG間隔體組成。 70. 如實施例66至69之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係三價N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。 71. 如實施例66至70之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係選自圖1中之三價GalNAc部分中之一者。 72. 如實施例71之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係圖3中之三價GalNAc部分。 73. 如實施例63至72之寡核苷酸偶聯物，其中連接體存在於該寡核苷酸或鄰接寡核苷酸序列與該偶聯物部分之間。 74. 如實施例73之寡核苷酸偶聯物，其中該連接體係生理上不穩定連接體(區域B)。 75. 如實施例74之寡核苷酸偶聯物，其中該生理上不穩定連接體係核酸酶易感連接體。 76. 如實施例74或75之寡核苷酸偶聯物，其中該生理上不穩定連接體係由2至5個連續磷酸二酯鏈接構成。 77. 如實施例76之寡核苷酸偶聯物，其中該生理上不穩定連接體等效於實施例47至50中所呈現之區域D’或D’’。 78. 如實施例63至77中任一項之寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸偶聯物係選自CMP ID NO: 766_2、767_2、768_2、769_2及770_2。 79. 如實施例78之寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸偶聯物係選自圖4、5、6、7及8中所表示之寡核苷酸偶聯物。 80. 如實施例63至76之寡核苷酸偶聯物，其與未偶聯寡核苷酸相比顯示靶細胞中之PD-L1之改良抑制，或在肝與脾之間顯示改良之細胞分佈，或顯示偶聯寡核苷酸在肝中之改良之細胞攝取。 81. 一種醫藥組合物，其包括如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。 82. 一種製造如實施例1至62之寡核苷酸之方法，其包括使核苷酸單元進行反應，由此形成包括於該寡核苷酸中之以共價方式連接之鄰接核苷酸單元。 83. 如實施例82之方法，其進一步包括使該鄰接核苷酸序列與非核苷酸偶聯物部分進行反應。 84. 一種製造如實施例81之組合物之方法，其包括混合該寡核苷酸與醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。 85. 一種調節表現PD-L1之靶細胞中之PD-L1表現之活體內或活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63-80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物。 86. 一種治療或預防疾病之方法，其包括向患有或易患該疾病之個體投與治療或預防有效量之如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63-80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物。 87. 一種恢復針對病毒或寄生蟲之免疫性之方法，其包括向感染病毒或寄生蟲之個體投與治療或預防有效量之如實施例63至80之寡核苷酸偶聯物或如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例81之醫藥組合物。 88. 如實施例87之方法，免疫性之該恢復係在與對照相比時增加肝中之對一或多種HBV抗原具有特異性之CD8+ T細胞。 89. 如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物，其用作用於治療或預防個體之疾病之藥劑。 90. 一種如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物之用途，其用以製備用於治療或預防個體之疾病之藥劑。 91. 如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物，其用於恢復針對病毒或寄生蟲之免疫性。 92. 如實施例91之用途，其中免疫性之該恢復係在與對照相比時增加肝中之對一或多種HBV抗原具有特異性之CD8+ T細胞。 93. 如實施例92之用途，其中該HBV抗原係HBsAg。 94. 如實施例86至93之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病與PD-L1之活體內活性有關。 95. 如實施例86至94之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病與抗原呈遞細胞中之增加之PD-L1表現有關。 96. 如實施例95之方法、寡核苷酸或用途，其中與未治療或在使用如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物進行治療之前之表現相比，該PD-L1降低至少30%或至少40%或至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或至少95%。 97. 如實施例86至95之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係選自病毒性肝感染或寄生蟲感染。 98. 如實施例98之方法、寡核苷酸或用途，其中該病毒感染係HBV、HCV或HDV。 99. 如實施例86至95之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係慢性HBV。 100. 如實施例98之方法、寡核苷酸或用途，其中該寄生蟲感染係瘧疾、弓蟲症、利什曼病或錐蟲病。 101. 如實施例86至100之方法、寡核苷酸或用途，其中該個體係哺乳動物。 102. 如實施例101之方法、寡核苷酸或用途，其中該哺乳動物係人類。 實例 材料及方法基序序列及寡核苷酸化合物 表5：靶向人類PD-L1轉錄物(SEQ ID NO: 1)之寡核苷酸基序序列(由SEQ ID NO指示)、該等序列之設計以及基於基序序列設計之特定反義寡核苷酸化合物(由CMP ID NO指示)之列表。 基序序列代表存在於寡核苷酸中之核鹼基之鄰接序列。 設計係指間隙聚體設計F-G-F’，其中每一數值代表連續經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第一數值=5’側翼)，隨後係DNA核苷數量(第二數值=間隙區)，隨後係經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第三數值=3’側翼)，視情況前接或後接有DNA及LNA之其他重複區域，該等重複區域未必係與靶核酸互補之鄰接序列之一部分。 寡核苷酸化合物代表基序序列之特定設計。大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯核苷間鏈接。 表6：靶向小鼠PD-L1轉錄物(SEQ ID NO: 4)之寡核苷酸、該等寡核苷酸之設計以及基於基序序列設計之特定寡核苷酸化合物(由CMP ID NO指示)。 基序序列代表存在於寡核苷酸中之核鹼基之鄰接序列。 設計係指間隙聚體設計F-G-F’，其中每一數值代表連續經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第一數值=5’側翼)，隨後係DNA核苷數量(第二數值=間隙區)，隨後係經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第三數值=3’側翼)，視情況前接或後接有DNA及LNA之其他重複區域，該等重複區域未必係與靶核酸互補之鄰接序列之一部分。 寡核苷酸化合物代表基序序列之特定設計。大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯核苷間鏈接。 表7：寡核苷酸基序序列及具有5’ ca生物可裂解連接體之反義化合物。 大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，下標o代表磷酸二酯核苷間鏈接且除非另外指示，否則其他核苷間鏈接係硫代磷酸酯核苷間鏈接。 表8：GalNAc偶聯之反義寡核苷酸化合物。 GN2代表圖3中所展示之三價GalNAc簇，C6代表具有6個碳之胺基烷基，大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，下標o代表磷酸二酯核苷鏈接且除非另外指示，否則核苷間鏈接係硫代磷酸酯核苷間鏈接。代表一些分子之化學圖式展示於圖4至8中。 AAV/HBV小鼠模型 巴斯德 (Pasteur) 模型 ： 產生HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉基因H-2種類I-/種類II-剔除(在本文中稱為HLA-A2/DR1)小鼠且在巴斯德研究院(Institut Pasteur)處飼餵。 該等小鼠代表用於人類免疫功能研究之並無任何小鼠MHC反應干擾之活體內實驗模型(Pajot等人，2004 Eur J Immunol. 34(11):3060-9)。 在該等研究中使用攜載可複製HBV DNA基因體之腺相關病毒(AAV)載體AAV血清型2/8。在無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋AAV-HBV載體(GVPN批號6163)以達到5 × 1011 vg/mL之效價。在尾部靜脈中經靜脈內(i.v.)向小鼠注射100μL此經稀釋溶液(劑量/小鼠：5 × 1010 vg)。在攜帶HBV之小鼠之血液中檢測含有HBV DNA之完整病毒顆粒。在最多一年內檢測肝中之HBcAg以及血液中之HBV循環蛋白質HBeAg及HBsAg。在AAV2/8-HBV轉導小鼠中，HBsAg、HBeAg及HBV DNA在血清中持續至少一年(Dion等人，2013 J Virol 87:5554-5563)。 上海模型 ： 在此模型中，感染攜載HBV基因體(AAV/HBV)之重組腺相關病毒(AAV)之小鼠維持穩定病毒血症及抗原血症30週以上(Dan Yang等人，  2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71–78)。 自SLAC (Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences)購買無特定病原體之雄性C57BL/6小鼠(4-6週齡)且飼養於個別通風籠中之動物護理設施中。遵循如由WuXi IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee, WUXI IACUC方案編號R20131126-小鼠)所指示之動物護理及使用導則。使小鼠適應新環境3天且根據實驗設計進行分組。 在PBS中稀釋重組AAV-HBV，每一注射使用200 µL。此重組病毒攜載1.3個HBV基因體(基因型D，血清型ayw)之拷貝。 在第0天，經由尾部靜脈向所有小鼠注射200 µL AAV-HBV。在AAV注射之後第6、13及20天，下頜下對所有小鼠進行抽血(0.1 ml血液/小鼠)以用於收集血清。在注射後第22天，將患有穩定病毒血症之小鼠備用於寡核苷酸治療。寡核苷酸可未偶聯或偶聯GalNAc。DNA 疫苗 質體DNA無內毒素且由Plasmid-Factory (Germany)製得。pCMV-S2.S ayw編碼HBsAg (基因型D)之preS2及S結構域，且其表現由巨細胞病毒極早期基因啟動子控制(Michel等人，1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311)。pCMV-HBc編碼攜載肝炎核心(HBc) Ag之HBV衣殼(Dion等人，2013 J Virol 87:5554-5563)。 如本文中所闡述使用DNA疫苗實施治療。在接種疫苗之前5天，向小鼠之肌肉中注射心臟毒素(CaTx, Latoxan refL81-02, 50 µl/肌肉)。CaTx使肌肉纖維去極化以誘導細胞退化，在注射後5天，出現新肌肉纖維且接受DNA疫苗以針對轉染獲得較佳效能。等量混合pCMV-S2.S ayw及pCMVCore (各1 mg/ml)且使小鼠在麻醉下(100 µL 12.5 mg/mL氯胺酮(ketamine)、1.25 mg/mL甲苯噻嗪(xylazine))藉由向經心臟毒素處理之脛骨前肌中進行雙側肌內注射來接受總共100 μg該混合物，如先前在Michel等人，1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311中所闡述。抗 PD-L1 抗體 此係在Genetech處內部產生之小鼠抗小鼠PD-L1 IgG1抗體純系6E11。其係交叉阻斷阿替珠單抗(atezolizumab)且與在Roche處內部產生之阿替珠單抗具有類似活體外阻斷活性之替代抗體。藉由腹膜腔內(i.p.)注射在12.5 µg/g之劑量下來投與抗體。寡核苷酸合成 業內通常已知寡核苷酸合成。下文係可應用之方案。可藉由針對所使用裝置、載體及濃度略微改變之方法來產生本發明寡核苷酸。 在尿苷通用載體上使用亞磷醯胺方式在Oligomaker 48上以1 μmol規模來合成寡核苷酸。在合成結束時，使用氨水溶液在60℃下經5-16小時自固體載體裂解寡核苷酸。藉由反相HPLC (RP-HPLC)或藉由固相萃取純化寡核苷酸且藉由UPLC進行表徵，且藉由ESI-MS進一步證實分子質量。寡核苷酸之延長 : 藉由使用經5’-O-DMT保護之亞醯胺化物於乙腈之0.1 M溶液及於乙腈中之DCI (4,5-二氰基咪唑) (0.25 M)作為活化劑來偶合β-氰基乙基-亞磷醯胺(DNA-A(Bz)、DNA- G(ibu)、DNA- C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)L、NA-A(Bz)、LNA- G(dmf)或LNA-T)。對於最終循環而言，可使用具有期望修飾之亞磷醯胺，例如用於連接偶聯物基團之C6連接體或偶聯物基團本身。藉由使用氫化黃元素(0.01 M於9:1乙腈/吡啶中)來實施硫醇化以用於引入硫代磷酸酯鏈接。可使用於7:2:1 THF/吡啶/水中之0.02 M碘來引入磷酸二酯鏈接。其餘試劑係通常用於寡核苷酸合成者。 對於後固相合成偶聯而言，可將市售C6胺基連接體亞磷醯胺用於固相合成之最後循環中，且在去保護及自固體載體裂解之後，分離胺基連接之去保護寡核苷酸。經由使用標準合成方法活化官能基來引入偶聯物。 或者，可在仍位於固體載體上時藉由使用GalNAc-或GalNAc簇亞磷醯胺將偶聯物部分添加至寡核苷酸，如PCT/EP2015/073331或EP appl. NO. 15194811.4中所闡述。藉由 RP-HPLC 進行之純化 ： 藉由製備型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10µ 150×10 mm管柱上來純化粗製化合物。使用0.1 M pH 8乙酸銨及乙腈作為緩衝劑且流速為5 mL/min。凍乾收集部分以得到通常白色固體形式之純化化合物。縮寫： DCI：           4,5-二氰基咪唑 DCM：         二氯甲烷 DMF：         二甲基甲醯胺 DMT：         4,4’-二甲氧基三苯甲基 THF：          四氫呋喃 Bz：             苯甲醯基 Ibu：            異丁醯基 RP-HPLC：   反相高效液相層析Tm 分析 將寡核苷酸及RNA靶(磷酸酯連接，PO)雙螺旋體在500 ml無RNase水中稀釋至3 mM且與500 ml 2×Tm 緩衝液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM pH 7.0磷酸鈉)混合。將溶液加熱至95℃保持3 min且然後將其在室溫下退火30 min。在配備有帕耳帖穩定程控器(Peltier temperature programmer) PTP6之λ 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測雙螺旋體熔融溫度(Tm )。將溫度自20℃斜升至95℃且然後斜降至25℃，且在260 nm下記錄吸收。使用熔融及退火之第一導數及局部最大值來評價雙螺旋體Tm 。組織特異性活體外連接體裂解分析 使用相關組織(例如肝或腎)及血清之均質物對具有擬測試生物可裂解連接體(例如DNA磷酸二酯連接體(PO連接體))之經FAM標記之寡核苷酸實施活體外裂解。 自適宜動物(例如小鼠、猴、豬或大鼠)收集組織及血清試樣且在均質化緩衝液(0.5% Igepal CA-630、25 mM pH 8.0 Tris、100 mM pH 8.0 NaCl (使用1 N NaOH調節)。向組織均質物及血清中摻加寡核苷酸直至濃度為200 µg/g組織。將試樣在37℃下培育24小時且然後使用苯酚-氯仿萃取試樣。在Dionex Ultimate 3000上使用Dionex DNApac p-100管柱及介於10mM - 1 M過氯酸鈉(pH 7.5)之間之梯度對溶液實施AIE HPLC分析。針對標準使用615 nm下螢光檢測器及260 nm下uv檢測器來測定經裂解寡核苷酸及未裂解寡核苷酸之含量。S1 核酸酶裂解分析 在S1核酸酶提取物或血清中對具有S1核酸酶易感連接體(例如DNA磷酸二酯連接體(PO連接體))之經FAM標記之寡核苷酸實施活體外裂解。 藉由S1核酸酶在核酸酶緩衝液(60 U pr.100 µL)中對100 µM寡核苷酸實施活體外裂解20分鐘及120分鐘。藉由將EDTA添加至緩衝液溶液中來停止酶促活性。在Dionex Ultimate 3000上使用Dionex DNApac p-100管柱及介於10mM - 1 M過氯酸鈉(pH 7.5)之間之梯度對溶液實施AIE HPLC分析。針對標準使用615 nm下螢光檢測器及260 nm下uv檢測器來測定經裂解寡核苷酸及未裂解寡核苷酸之含量。肝單核細胞之製備 如下文所闡述且根據由Tupin等人，2006 Methods Enzymol 417:185-201所闡述之方法(具有輕微修改)來製備來自AAV/HBV小鼠之肝臟細胞。在小鼠安樂死之後，經由肝門靜脈使用具有G25針之注射器向肝灌注10 ml無菌PBS。在器官發白時，在漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS) (GIBCO® HBSS, 24020) + 5 %去補體胎牛血清(FCS)中收穫器官。經由100 μm細胞過濾器(BD Falcon, 352360)輕微壓製所收穫肝且將細胞懸浮於30 ml HBSS + 5 % FCS中。將細胞懸浮液在50 g下離心5 min。然後將上清液在289 g及4℃下離心10 min。在離心之後，棄除上清液且將糰粒在室溫下再懸浮於15 mL 35 %等滲Percoll溶液(稀釋至RPMI 1640 (GIBCO, 31870)中之GE Healthcare Percoll 17-0891-01號)且轉移至15 ml管中。將細胞在1360g及室溫下進一步離心25 min。藉由抽吸棄除上清液且使用HBSS + 5 % FCS將含有單核細胞之糰粒洗滌兩次。 在完整培養基(α-最小必需培養基(Gibco, 22571)，其補充有10 % FCS (Hyclone, SH30066號，批號APG21570)、100 U/mL青黴素(penicillin) + 100 μg/mL鏈黴素(streptomycin) + 0.3 mg/mL L-麩醯胺酸(Gibco, 10378)、1X非必須胺基酸(Gibco, 11140)、10 mM Hepes (Gibco, 15630)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco, 11360)及50 μM β-巰基乙醇(LKB, 1830))中培養細胞。細胞之表面標記 將細胞接種於U形底96孔板中並使用PBS FACS (含有1 %牛血清白蛋白及0.01%疊氮化鈉之PBS)洗滌。將細胞與5 μL含有大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體及可固定黃色存活標記物LD (Thermofisher, L34959)之PBS FACS在4℃下於暗處一起培育10 min。然後，使用25 μL含有針對NK P46 BV421 (大鼠Mab抗小鼠NK P46，Biolegend, 137612)及F4/80 (大鼠Mab抗小鼠F4/80 FITC, BD Biolegend, 123108)之單株抗體(Mab)之PBS FACS將細胞在4℃下於暗處染色20 min且亦添加兩種補充表面標記物：PD1 (大鼠Mab抗小鼠PD1 PE，BD Biosciences, 551892)及PDL1 (大鼠Mab抗小鼠PDL1 BV711，Biolegend, 124319)。細胞內細胞介素染色 (ICS) 分析 對脾細胞及肝單核細胞實施ICS分析。將細胞接種於U形96孔板中。將含有細胞之板在37℃下於僅完整培養基(作為陰性對照)中或與表9中所闡述之肽(在2 μg/ml之濃度下)過夜培育。在培育一小時之後添加2μg/mL佈雷菲德菌素A (Brefeldin A) (Sigma, B6542)。 在過夜培養之後，使用PBS FACS洗滌細胞且與5 μL含有大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體及可固定黃色存活標記物LD (Thermofisher, L34959)之PBS FACS在4℃下於暗處一起培育10min。然後，使用25 μL含有Mab之PBS FACS將細胞在4℃下於暗處染色20 min。混合物係由針對CD3 (倉鼠Mab抗小鼠CD3-PerCP，BD Biosciences, 553067)、CD8 (大鼠Mab抗小鼠CD8-APC-H7，BD Biosciences, 560182)、CD4 (大鼠Mab抗小鼠CD4-PE-Cy7，BD Biosciences, 552775)及NK細胞 (大鼠Mab抗小鼠NK P46 BV421，Biolegend, 137612)之單株抗體構成。在洗滌數次之後固定細胞且使用Cytofix/Cytoperm在室溫下於暗處滲透20 min，使用Perm/Wash溶液(BD Biosciences, 554714)在4℃下洗滌。 在4℃下於暗處使用針對IFNγ (大鼠Mab抗小鼠IFNγ-APC，純系XMG1.2,BD Biosciences, 554413)及腫瘤壞死因子α (TNFα) (大鼠Mab抗小鼠TNFα-FITC，純系MP6-XT22；1/250 (BD Biosciences 554418)之抗體實施細胞內細胞介素染色30 min。在藉由流式細胞術使用MACSQuant分析儀進行分析之前，使用Perm/Wash洗滌細胞且再懸浮於含有1%甲醛之PBS FACS中。 選通CD3+CD8+CD4-及細胞CD3+CD8-CD4+且呈現於點狀圖上。定義兩個區域以選通用於每一細胞介素之陽性細胞。將該等閘門中所發現之事件數除以親代群體中之事件總數以得到反應性T細胞之百分比。對於每一小鼠而言，在單獨培養基中所獲得之百分比可視為背景且自使用肽刺激獲得之百分比扣除。 根據實驗背景來定義陽性臨限值，亦即在單獨培養基條件中針對每一組所獲得染色細胞之平均百分比+兩個標准偏差。僅代表至少5個事件之細胞介素之百分比可視為陽性。 表9：含於HBV核心蛋白及HBsAg之套膜蛋白結構域(S2+S)中之HLA-A2/DR1限制性表位。 實例1 測試活體外效能 在人類PD-L1轉錄物中主要使用16至20具體間隙聚體來實施基因步移。在活體外實驗中於人類白血病單核球細胞系THP1及人類非何傑金氏K淋巴瘤(non-Hodgkin's K lymphoma)細胞系(KARPAS-299)中實施效能測試。細胞系 THP1及Karpas-299細胞系最初係購自European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)且如由供應商所推薦在37℃及5% CO2 下維持於加濕培育器中。寡核苷酸效能 將THP-1細胞(3.104 in RPMI-GLutamax, 10% FBS, 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)添加至96孔圓底板中之寡核苷酸(4-5 ul)中且以100 µl/孔之最終體積培養6天。在一種單一濃度(20 µM)下及在自25 µM至0.004 µM之劑量範圍濃度(1:3稀釋於水中)來篩選寡核苷酸。根據製造商說明書使用MagNA Pure 96 Cellular RNA大體積套組在MagNA Pure 96系統(Roche Diagnostics)上來提取總mRNA。對於基因表現分析而言，使用TaqMan RNA-to-ct 1-Step套組(Thermo Fisher Scientific)在QuantStudio機器(Applied Biosystems)上利用靶向人類PDL1之預設計Taqman引子及用作內源性對照之ACTB (Thermo Fisher Scientific)來實施RT-qPCR。使用2(-Delta Delta C(T))方法計算相對PD-L1 mRNA表現程度且將抑制百分比(呈%形式)與對照試樣(未處理細胞)進行比較。 在RPMI 1640、2 mM麩醯胺酸及20% FBS (Sigma)中培養Karpas-299細胞。將細胞以10000個細胞/孔平鋪於96孔板中，培育24小時，然後添加溶於PBS中之寡核苷酸。單一劑量中之寡核苷酸之最終濃度為5 µM，最終培養體積為100 µl/孔或以於100 µL培養體積中自50 µM、15.8 µM、5.0 µM、1.58 µM、0.5 µM、0.158 µM、0.05 µM至0.0158 µM之劑量反應範圍來添加。在添加寡核苷酸化合物之後3天收穫細胞且根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)來提取RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析而言，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 (Applied Biosystems；Hs01125299_m1)及TBP (Applied Biosystems；4325803)來實施qPCR。相對PD-L1 mRNA表現程度以對照試樣(經PBS處理細胞)之%形式展示於表10中。 表10：抗PD-L1化合物在THP1及KARPAS-299細胞系中之活體外效能(來自n=3個實驗之平均值)。將PD-L1 mRNA含量正規化至KARPAS-299細胞中之TBP或THP1細胞中之ACTB且展示為對照% (經PBS處理之細胞)。 實例2-以劑量反應曲線測試活體外效能 在實例1中所闡述之活體外效能分析中於KARPAS-299細胞中使用於PBS中之半對數連續稀釋液(50 µM、15.8µM、5.0µM、1.58µM、0.5µM、0.158µM、0.05µM至0.0158µM寡核苷酸)來測試來自表10之所選寡核苷酸。評價寡核苷酸之IC 50及最大抑制(殘餘PD-L1表現%)。 在GraphPad Prism6中實施EC50計算。IC50及最大PD-L1敲低量展示於表11中(以經對照(PBS)處理之細胞之%形式)。 表11：KARPAS-299細胞系中之最大抑制(呈鹽水之%形式)及EC50。 在實例1中所闡述之活體外效能分析中在THP-1中使用1:3連續水溶液(25 µM至0.004 µM)來測試來自表6之所選寡核苷酸。評價寡核苷酸之IC 50及最大抑制(殘餘PD-L1表現百分比)。 在GraphPad Prism6中實施EC50計算。IC50及最大PD-L1敲低量展示於表12中(以經對照(PBS)處理之細胞之%形式)。 表12：THP1細胞系中之最大抑制(呈鹽水之%形式)及EC50。 表7及8中之結果亦展示於圖2中(與其靶向SEQ ID NO: 1之PD-L1 mRNA前體之位置相關)。 自此圖可看到，幾乎所有化合物皆具有低於1 µM之EC50值及低於25%之對照細胞(經鹽水處理)中之PD-L1表現程度之靶敲低。 實例3 -聚(I:C)誘導之小鼠中使用裸及GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸之活體外功效及效能及活體內PD-L1降低 在活體外實驗之劑量-反應研究中於MCP-11細胞中使用表6中之寡核苷酸來實施效能及功效測試。在聚(I:C)誘導之C57BL/6J雌性小鼠中於活體內測試相同寡核苷酸以及GalNAc偶聯形式(表8 CMP ID NO 755_2 - 765_2)降低PD-L1 mRNA及蛋白質表現之能力。活體外分析 將懸浮於DMEM (Sigma目錄編號D0819，補充有10%馬血清、2 mM L-麩醯胺酸、0.025 mg/ml慶大黴素(gentamicin)及1 mM丙酮酸鈉)中之MCP-11細胞(最初購自ATCC)以8000細胞/孔之密度添加至96孔圓底板中之寡核苷酸(10µl)中且以200 µl/孔之最終體積在37℃及5% CO2 下於加濕培育器中培養3天。以劑量範圍濃度(50 µM、15.8 µM、5.0 µM、1.58 µM、0.5 µM、0.158 µM、0.05 µM及0.0158 µM)篩選寡核苷酸。 根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)來提取總RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 (Thermo Fisher Scientific；FAM-MGB Mm00452054-m1)及Gusb (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL  Mm01197698-m1)來實施qPCR。相對PD-L1 mRNA表現程度以殘餘PD-L1表現%於PBS對照試樣(經PBS處理細胞)之%示於表9中。在GraphPad Prism6中實施EC50計算。EC50及最大PD-L1敲低量以對照(PBS)細胞之%示於表13中。 活體內分析 向C57BL/6J雌性小鼠(20-23 g；5隻小鼠/組)經皮下注射5 mg/kg靶向小鼠PD-L1之未偶聯寡核苷酸或2.8 mg/kg靶向小鼠PD-L1之GalNAc偶聯之寡核苷酸。3天後，小鼠經靜脈內注射10 mg/kg聚(I:C) (LWM, Invivogen)。在聚(I:C)注射之後5 h將小鼠處死且將肝試樣置於RNAlater (Thermo Fisher Scientific)中用於RNA提取或冷凍於乾冰上用於蛋白質提取。 根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)自均質化肝試樣來提取總RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析，使用TaqMan® Fast Advanced Master Mix TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 mRNA (Thermo Fisher Scientific；FAM-MGB Mm00452054-m1)及TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1)來實施qPCR。相對PD-L1 mRNA表現程度示於表13中(以使用鹽水及聚(I:C)注射之小鼠之對照試樣之%)。 藉由在2 ml/100 mg組織之T-PER®組織蛋白提取試劑(Thermo Fisher Scientific) (與1× Halt蛋白酶抑制劑混合劑混合，無EDTA (Thermo Fisher Scientific))中均質化肝試樣來製備肝均質物。根據製造商說明書使用Coomassie Plus (Bradford)分析試劑(Thermo Scientific)來量測肝均質物中之蛋白質濃度。在4-12% Bis-Tris Plus聚丙烯醯胺凝膠(Thermo Fisher Scientific)上於1×MOPS運行緩衝液中分離肝均質物(40 µg蛋白質)且根據製造商說明書使用iBLOT乾燥印漬系統(Thermo Fisher Scientific)轉移至硝基纖維素膜中。在64 kDa帶處將每一印漬水平切割成兩個部分。在含有5%脫脂奶粉及0.05% Tween20之TBS中阻斷後，將膜與兔單株抗紐蛋白(Abcam目錄編號ab129002，以1:10000稀釋於含有5%脫脂奶粉及0.05% Tween20之TBS中，上膜)或山羊多株抗mPD-L1 (R&D Systems目錄編號AF1019，以1:1000稀釋，下膜)一起在4℃下於培育過夜。在含有0.05% Tween20之TBS中洗滌膜，且在室溫下暴露與HRP偶聯之豬抗兔IgG (DAKO，以1:3000稀釋於含有5%脫脂奶粉及0.05% Tween20之TBS中，上膜)或HRP偶聯之兔抗山羊IgG (DAKO，以1:2000稀釋) 1 h。在洗滌膜後，使用ECL select (Amersham GE Healthcare)檢測反應性。對於使用寡核苷酸治療之每一組小鼠而言，藉由與注射有鹽水及聚(I:C) (對照)之小鼠之PD-L1/紐蛋白帶強度進行比較來評估與紐蛋白帶相關之PD-L1帶的強度。結果展示於表13中，且使用裸寡核苷酸及偶聯寡核苷酸之對之西方印漬展示於圖9 A-E中。 表13：靶向小鼠PD-L1之寡核苷酸之活體外及活體內效能 +++：類似於對照之PD-L1/紐蛋白帶強度；++：弱於對照之PD-L1/紐蛋白帶強度；+：遠弱於對照之PD-L1/紐蛋白帶強度；nd=未測定。 自表13中之數據可看到，寡核苷酸之GalNAc偶聯明顯改良活體內PD-L1降低。mRNA之降低通常與PD-L1蛋白之降低相關。除CMP ID NO: 754_1外，在寡核苷酸偶聯至GalNAc後，低活體外EC50值通常反映良好活體內PD-L1 mRNA降低。 實例4 -來自聚(I:C)誘導之小鼠中之經分選肝細胞及非實質細胞中之活體內PK/PD 在自聚(I:C)誘導之小鼠分離之肝細胞及非實質細胞中探究裸寡核苷酸及GalNAc偶聯之寡核苷酸之分佈以及PD-L1 mRNA降低。 向C57BL/6J雌性小鼠(n=3隻/組)經皮下注射靶向小鼠PD-L1 mRNA之5 mg/kg未偶聯寡核苷酸(748_1)或7 mg/kg GalNAc偶聯之寡核苷酸(759_2)。2天後，向小鼠經腹膜腔內注射15 mg/kg聚(I:C) (LWM, Invivogen)。在聚(I:C)注射之後將小鼠麻醉18-20 h且使用含有15 mM Hepes及0.38 mM EGTA之漢克氏平衡鹽溶液經由腔靜脈以7 ml/min之流速灌注肝5 min，隨後使用膠原酶溶液(含有0.17 mg/ml膠原酶類型2 (Worthington 4176)、0.03% BSA、3.2 mM CaCl2 及1.6 g/l NaHCO3 之漢克氏平衡鹽溶液)灌注12 min。在灌注後，取出肝且打開肝囊，經由70 µm細胞過濾器使用威廉E培養基(William E medium)過濾肝懸浮液且取出細胞懸浮液之等分試樣(=混合肝臟細胞)以用於隨後分析。將其餘細胞懸浮液在50×g下離心3 min。收集上清液以用於非實質細胞之隨後純化。將糰粒再懸浮於25 ml威廉E培養基(Sigma目錄編號W1878，補充有1× Pen/Strep、2 mM L-麩醯胺酸及10% FBS (ATCC 30-2030號))中，與含有90% percoll之25 ml威廉E培養基混合且藉由在50×g下離心10 min來沈澱肝細胞。在威廉E培養基中洗滌2次後，將沈澱之肝細胞再懸浮於威廉E培養基中。將含有非實質細胞之上清液在500×g下離心7 min且將細胞再懸浮於4 ml RPMI培養基中並經由兩層percoll (25%及50% percoll)在1800×g下離心30 min。在收集兩個percoll層之間之非實質細胞後，洗滌細胞且再懸浮於RPMI培養基中。 根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)自純化肝細胞、非實質細胞及總肝懸浮液(未分級分離之肝臟細胞)來提取總RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析而言，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 (Thermo Fisher Scientific；FAM-MGB Mm00452054-m1)及TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1)。相對PD-L1 mRNA表現程度展示於表10中(以來自使用鹽水及聚(I:C)注射之小鼠之對照試樣之%形式)。 使用ELISA採用利用序列5´-TACCGT-s-Bio-3'之生物素化捕獲探針及利用序列5´- DIG-C12-S1-CCTGTG - 3´之地高辛偶聯檢測探針來實施寡核苷酸含量分析。該等探針僅由具有磷酸二酯主鏈之LNA組成。將肝試樣(大約50 mg)在含有一種5mm不銹鋼珠粒之2 mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)中於1.4 mL MagNa純裂解緩衝液(Roche目錄編號03604721001)中均質化。將試樣在Retsch MM400均質器(Merck Eurolab)上均質化直至獲得均勻裂解物為止。將試樣在室溫下培育30 min。藉由將未偶聯反義寡核苷酸化合物(CMP ID NO 748_1)以界定濃度摻加至未處理肝試樣中且將其處理為試樣來生成標準。選擇摻加濃度以匹配預期試樣寡核苷酸含量(在約10倍內)。 將均質化試樣在5 × SSCT緩衝液(750 mM NaCl及75 mM檸檬酸鈉，含有0.05 % (v/v) Tween-20，pH 7.0)中稀釋最少10倍且使用捕獲-檢測溶液(於5×SSCT緩衝液中之35 nM捕獲探針及35 nM檢測探針)製備經6次2倍稀釋之一系列稀釋液並在室溫下培育30 min。將試樣轉移至96孔鏈黴抗生物素蛋白(Streptavidin)塗覆板(Nunc目錄編號436014)中且使每孔含有100 µL。將板在室溫及輕微攪動下培育1小時。使用2 × SSCT緩衝液洗滌三次且向每一孔中添加以1:4000稀釋於PBST (磷酸鹽緩衝鹽水，含有0.05 % (v/v) Tween-20，pH 7.2，新製)中之100 μL抗DIG-AP Fab片段(Roche Applied Science，目錄編號11 093 274 910)，並在室溫及輕微攪動下培育1小時。使用2 × SSCT緩衝液洗滌三次且添加100 μL鹼性磷酸酶(AP)受質溶液(藍磷基質(Blue Phos Substrate)，KPL產品代碼50-88-00，新製)。在培育30分鐘之後於輕微攪動下以分光光度方式在615 nm下量測色彩強度。將原始數據自讀數器(Gen5 2.0軟體)輸出為excel格式且在excel中進一步分析。使用GraphPad Prism 6軟體及邏輯4PL回歸模型生成標準曲線。 表14：來自使用未偶聯寡核苷酸及GalNAc偶聯之寡核苷酸治療之聚(I:C)小鼠(n=3)之總肝懸浮液、肝細胞及非實質細胞中的PD-L1表現及寡核苷酸含量。 結果展示，裸(CMP ID NO: 748_1)及偶聯(CMP ID NO: 759_2)寡核苷酸同等程度地降低總肝臟細胞中之PD-L1 mRNA。在經分離肝細胞中，偶聯寡核苷酸之效應幾乎強於裸寡核苷酸之效應5倍，而裸寡核苷酸展示其效應強於非實質細胞中之GalNAc偶聯之寡核苷酸兩倍。在肝細胞及非實質細胞中， PD-L1 mRNA表現之降低在一定程度上與該等細胞類型中之寡核苷酸含量相關。 實例5 -使用裸及GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸之AAV/HBV小鼠中之活體內PD-L1敲低 在本發明研究中，使用裸或GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸治療AAV/HBV小鼠，且在肝中評估PD-L1 mRNA表現及HBV基因表現。 在第-1週使用媒劑(鹽水)、裸PD-L1反義寡核苷酸(CMP ID NO 752_1，在5 mg/kg下，經皮下)及GalNAc PD-L1反義寡核苷酸(CMP ID NO 763_2，在7 mg/kg下，經皮下)預處理5-8週齡雌性HLA-A2/DR1小鼠(5隻動物/組)，該等劑量對應於等莫耳濃度之寡核苷酸。在第0週藉由5× 1010 vg AAV-HBV轉導小鼠(關於其他細節，參見材料及方法部分中之AAV/HBV小鼠模型闡述)。自AAV-HBV轉導後W1至W4，使小鼠接受4次PD-L1寡核苷酸或媒劑(鹽水溶液)之其他皮下注射且相隔一週給予。 在轉導之前一週及在每一注射之後一週獲取血樣。 在最後注射之後兩週將小鼠處死且在PBS灌注後取出其肝。將肝切割成較小切片且直接冷凍。 為量測HBV基因表現，利用Qiagen Biorobot使用 the QIAamp One for all核酸套組(目錄編號965672)自血清提取DNA，將血清以1:20稀釋度稀釋於PBS中，在200ul緩衝液AL中裂解總共100 µl。自套組在100 µl中洗脫DNA。 對於實時qPCR而言，將TaqMan Gene Expression Master Mix (目錄編號4369016，Applied Biosystems)與藉由添加1:1:0.5之下列引子F3_core、R3_core、P3_core (Integrated DNA Technologies，皆各自以100uM重構)來製得之引子混合物一起使用： 正向(F3_core)：CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784) 反向(R3_core)：AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA(SEQ ID NO: 785) 探針(P3_core)：56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ(SEQ ID NO: 786) 使用10倍稀釋液(始於1×109 個拷貝/µl至1個拷貝/µl且以5µl/反應使用)製得使用HBV質體(基因型D，GTD)之標準曲線。 對於每一反應而言，添加10µl Gene Expression Master Mix、4.5µl水、0.5µl引子混合物及5µl試樣或標準且運行qPCR。 對於分析而言，使用標準曲線計算拷貝數/ml/孔。結果展示於表15中。 使用qPCR量測PD-L1 mRNA表現。 自添加至含有陶瓷珠粒(Lysing Matrix D管，116913500, mpbio)及1ml Trizol之2ml管中之經冷凍肝切片提取mRNA。 使用Precellys組織破碎器將肝切片均質化。將200µl氯仿添加至均質物中，渦旋且在4℃及10000rpm下離心20min。將含有RNA之澄清相(大約500ul)轉移至新管中且添加相同體積之70% EtOH。在充分混合之後，將溶液轉移至RNeasy自旋管柱上且遵循RNeasy套組之人工RNeasy微型套組(目錄編號74104，Qiagen) (包含RNA消解RNase-free DNase Set，目錄編號79254) 進一步提取RNA。在50µl H2 O中洗脫。對於所有試樣而言，量測最終RNA濃度且調節至100ng/ul。 根據製造商說明書在7.5µl RNA下使用Taqman RNA-to-ct 1-step套組(目錄編號4392938，Thermo Fisher)實施qPCR。所用引物混合物含有PD-L1_1-3 (引物編號Mm00452054_m1、Mm03048247_m1及Mm03048248_m1)及內源性對照(ATCB Mm00607939_s1、CANX Mm00500330_m1、YWHAZ Mm03950126_s1及GUSB Mm01197698_m1) 使用2^-ddct方法分析數據。使用所有4種內源性對照之平均值來計算dct值。PD-L1表現係相對於內源性對照之平均值且以鹽水之%形式 表15：使用未偶聯及GalNAc偶聯之寡核苷酸治療之AAV/HBV小鼠(n=5)中之PD-L1 mRNA表現及HBV DNA。 自該等結果可看到，裸寡核苷酸及GalNAc偶聯之寡核苷酸能夠降低AAV/HBV小鼠之肝中之PD-L1 mRNA表現，其中GalNAc偶聯之寡核苷酸略微較佳。兩種寡核苷酸亦使得血清中之HBV DNA略有降低。 實例6 -對AAV/HBV小鼠中之T細胞反應之活體內效應 在本發明研究中，使用靶向PD-L1之抗體或反義寡核苷酸治療來自巴斯德之AAV/HBV小鼠。反義寡核苷酸係裸反義寡核苷酸或偶聯至GalNAc。在治療期間，使用針對HBs及HBc抗原之DNA疫苗對動物實施免疫(參見材料及方法部分)以確保T細胞由抗原呈遞細胞有效引發。評估該治療如何影響肝及脾中之細胞群體以及該等群體上之PD-L1表現及是否可鑑別HBV特異性T細胞反應。治療方案 ： 根據下文方案來治療雌性HLA-A2/DR1小鼠。在兩個單獨子研究中實施研究，其中投與方案略有差異，如下表16及17中所指示。 如材料及方法部分中所闡述來投與DNA疫苗及抗PD-L1抗體。所用反義寡核苷酸係5 mg/kg CMP ID NO 748_1 (裸)及7mg/kg CMP ID NO: 759_2 (GalNAc偶聯)，二者皆係以皮下注射(s.c.)形式來投與。 表16：使用DNA疫苗及DNA疫苗+抗PD-L1抗體之AAV/HBV小鼠治療方案，每組6隻小鼠 同型=小鼠IgG對照Ab，CaTx =心臟毒素，DNA = DNA疫苗，Ab=抗PD-L1 Ab且*=血清收集 表17：使用DNA疫苗及DNA疫苗+裸或偶聯PD-L1寡核苷酸(ASO)之AAV/HBV小鼠治療方案，每組7隻小鼠 DNA = DNA疫苗，CaTx =心臟毒素，Ab=抗PD-L1 Ab，ASO=裸PDL-1寡核苷酸，GN-ASO= GalNAc-PDL-1寡核苷酸且*=血清收集 在處死時，收集來自每一組之每一小鼠之血液、脾及肝單核細胞且消耗紅血球(裂解緩衝液，BD biosciences, 555899)。肝單核細胞需要如材料及方法部分中所闡述之特定製備。細胞群體 ： 在肝中，藉由肝單核細胞上之表面標記(參見材料及方法)使用細胞術來分析細胞群體。 與對照組(亦即媒劑及DNA免疫化組)相比，經治療小鼠之脾及肝中之NK細胞頻率並未發現顯著變化。表18展示，在肝中，使用裸PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO 748_1)及GalNAc偶聯之PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO: 759_2)治療之組之T細胞數與亦呈現於圖10 A中的任一對照組(亦即媒劑及DNA免疫化組)相比顯著增加。此增加係源於CD4+及CD8+ T細胞群體有所增加(分別在表18及圖10B及10C中)。   表18：在治療後之肝中之T細胞(以百萬個細胞之形式) PD-L1 表現： 在處死時，在來自脾及肝之巨噬球、B及T細胞上評估PD-L1蛋白之表現。PD-L1抗體在表面標記抗體混合物(參見材料及方法)中之存在使得可藉由細胞術量化PD-L1表現細胞。 在脾中，據觀察，在治療之間表現PD-L1之巨噬球、B細胞及CD4+ T細胞之%並無顯著差異。使用裸PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO 748_1)及GalNAc偶聯之PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO: 759_2)治療之小鼠中之表現PD-L1之CD8+ T細胞的%低於其他治療(數據未展示)。 在肝中，PD-L1主要以32%之平均頻率表現於CD8+ T細胞上且在對照組(分別係兩個媒劑及DNA接種疫苗組組合，圖11A)中為41%。使用裸PD-L1寡核苷酸或GalNAc PD-L1寡核苷酸進行治療使得表現PD-L1之CD8+ T細胞之頻率有所降低(參見表19及圖11A)。亦在ASO治療之後針對B細胞及CD4+ T細胞觀察到表現PD-L1之細胞%具有顯著差異，但該等細胞類型表現顯著小於CD8+ T細胞之PD-L1 (參見表19及圖11B及C)。使用抗PD-L1 Ab進行治療亦使得所有細胞類型中之PD-L1表現明顯降低。然而，此降低可能係由於PD-L1表位由用於治療之抗PD-L1抗體部分地阻斷，從而防止表面標記抗體混合物中之PD-L1檢測抗體預防結合至PD-L1。因此，藉由用於治療之抗PD-L1抗體所達成之PD-L1下調似乎可為治療抗體與檢測抗體之間之表位競爭的結果。 表19：具有PD-L1表現之肝臟細胞群體之% HBV 特異性 T 細胞反應： 使用檢測IFNγ及TNFα產生之細胞內細胞介素染色分析(參見材料及方法部分)檢測產生促發炎性細胞介素之NK細胞及CD4+及CD8+ T細胞。 在脾中，在處死時，未檢測到分泌IFNγ-及TNFα之NK細胞且可檢測到少量CD4+ T細胞(頻率＜ 0.1%)。在使用裸PD-L1寡核苷酸或GalNAc PD-L1寡核苷酸治療之小鼠以及此研究中僅接受DNA疫苗之小鼠中檢測靶向兩種HBV抗原之產生IFNγ的CD8+ T細胞(數據未展示)。 在DNA免疫化HBV攜載小鼠之肝中，在處死時並未檢測到產生IFNγ之NK細胞，而在少數DNA免疫化小鼠之肝中以低頻率檢測到對核心或S2+S具有特異性之產生IFNγ之CD4+ T細胞(＜ 0.4%，數據未展示)。在大部分DNA免疫化小鼠中檢測到產生IFNγ之HBV S2+S 特異性CD8+ T細胞。在使用DNA疫苗及裸PD-L1寡核苷酸或GalNAc PD-L1寡核苷酸之組合治療之小鼠中，分泌IFNγ之CD8+ T細胞之頻率有所增加，而使用抗PD-L1抗體之治療並不向DNA接種疫苗增加任何明顯額外效應(圖12)。在大部分DNA免疫化組(除抗PD-L1抗體外)中檢測到靶向套膜蛋白及核心抗原之產生IFNγ之CD8+ T細胞(圖12B)。大部分S2-S特異性T細胞產生IFNγ及TNFα (圖12C)。結果亦展示於表20中。 表20：來自總IFNγ或IFNγ + TNFα細胞群體之HBV抗原(S2-S或核心)特異性CD8+ T細胞之% 實例7 -對AAV/HBV小鼠血清中之HBV抗原及HBV DNA之活體內效應 在本發明研究中，使用GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸CMP ID NO 759_2治療來自上海之AAV/HBV小鼠(參見材料及方法部分)。 評估該治療與媒劑治療動物相比如何影響血清中之HBe及HBs抗原及HBV DNA含量。治療方案 ： 在此研究中使用如在材料及方法部分中之上海模型下所闡述感染攜載HBV基因體(AAV/HBV)之重組腺相關病毒(AAV)之雄性C57BL/6小鼠。經8週每週一次向小鼠(6小鼠/組)注射5 mg/kg反義寡核苷酸CMP ID NO: 759_2或媒劑(鹽水)，其中二者皆係如皮下注射(s.c.)所投與。在治療期間每週以及在治療後6週收集血樣。如下文所闡述在血清試樣中量測HBV DNA、HBsAg及HBeAg含量。前10週之結果展示於表21及圖13中。在歸檔時研究仍在進行，因此，剩餘4週之數據尚未獲得。HBsAg 及 HBeAg 檢測： 在經感染AAV-HBV小鼠中使用HBsAg化學發光免疫分析(CLIA)及HBeAg CLIA套組(Autobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou,China，目錄編號分別為CL0310-2及CL0312-2)根據製造商方案在血清中來測定血清HBsAg及HBeAg含量。簡言之，將50 μl血清轉移至各別抗體塗覆微量滴定板中且添加50 μl酶偶聯物試劑。將板在室溫下於振盪器上培育60 min，然後利用洗滌緩衝液使用自動洗滌器將所有孔洗滌6次。向每一孔中添加25 μl受質A且然後添加25 μl受質B。將板在室溫下培育10 min，然後使用Envision發光讀數儀量測發光。以單位IU/ml給出HBsAg；其中1 ng HBsAg =1.14 IU。以單位NCU/ml血清給出HBeAg。HBV DNA 提取及 qPCR ： 首先，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)將小鼠血清稀釋10倍(1:10)。使用MagNA Pure 96 (Roche)機器人提取DNA。將50μl經稀釋血清在處理柱中與200ul MagNA Pure 96外部裂解緩衝液(Roche，目錄編號06374913001)一起混合且培育10分鐘。然後使用「MagNA Pure 96 DNA及Viral Nucleic Acid Small Volume Kit」 (Roche，目錄編號06543588001)及「Viral NA Plasma SV external lysis 2.0」方案提取DNA。DNA洗脫體積為50 μl。 使用Taqman qPCR機器(ViiA7, life technologies)來量化所提取HBV DNA。一式兩份在PCR中測試每一DNA試樣。將5μl DNA試樣添加至384孔板中含有10 μl TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems，目錄編號4369016)、0.5 μl PrimeTime XL qPCR引子/探針(IDT)及4.5μl蒸餾水之15μl PCR標準混合物中且使用下列設置實施PCR：UDG培育(2min, 50℃)，酶活化(10min, 95℃)及PCR (40個循環，其中在95℃下變性15sec且在60℃下退火及延伸1min)。自Ct 值基於HBV質體DNA標準曲線藉由ViiA7軟體來計算DNA拷貝數。 用於TaqMan引子及探針(IDT)之序列： 正向核心引子(F3_core)：CTG TGC CTT GGG TGG CTT T(SEQ ID NO: 784) 反向引子(R3_core)：AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785) Taqman探針(P3_core)：56-FAM/AGC TCC AAA /ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ (SEQ ID NO: 786)。 表21：在使用GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸治療後來自AAV/HBV小鼠之血中之清HBV-DNA、HBsAg及HBeAg含量。 自此研究可看到，在治療6週之後，GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸CMP NO 759_2對血清中之HBV-DNAH、BsAg及HBeAg含量降低具有顯著效應，且在治療之後持續至少2週之效應已終止。 實例8 -使用GalNAc偶聯之PD-L1寡核苷酸之人類原代肝細胞中之活體外PD-L1敲低 使用基因體學探究GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸化合物降低原代人類肝細胞中之PD-L1轉錄之能力。細胞培養物 將經冷藏保存之人類肝細胞以大約5 × 106 個細胞/ml之密度懸浮於補充有10%胎牛血清、青黴素(100 U/ml)、鏈黴素(0.1 mg/ml)及L-麩醯胺酸(0.292 mg/ml)之WME中且以2 × 105 細胞/孔之密度接種至膠原塗覆之24孔板中(Becton Dickinson AG, Allschwil, Switzerland)。在開始使用寡核苷酸以100 µM之最終濃度進行處理之前，將細胞預培養4h以使得連接至細胞培養板。所用寡核苷酸展示於表21及表8中，媒劑係PBS。將接種培養基更換為315 µl無血清WME (補充有青黴素(100 U/ml)、鏈黴素(0.1 mg/ml)、L-麩醯胺酸(0.292 mg/ml))且將35 µl於PBS中之1 mM寡核苷酸儲備溶液添加至細胞培養物中並在細胞上保留24小時或66小時。文庫製備 使用Illumina Stranded mRNA化學在Illumina測序平臺上利用2 × 51 bp配對端讀數及每一樣品中30M之最小讀取深度之測序策略(Q squared EA)來描述轉錄物表現。藉由添加350 µl Qiagen RLT緩衝液來在孔中裂解細胞且登錄於隨機化方案中。 使用Qiagen RNeasy微型套組純化mRNA。量化mRNA且使用Agilent生物分析儀評價完整性。在經分離RNA之初始品質評價後，據觀察，所有試樣皆符合100ng之輸入品質度量且RIN評分＞7.0。 使用Illumina TruSeq Stranded mRNA文庫製備自100 ng總RNA開始來生成用於所有試樣之測序文庫。使用Agilent生物分析儀(DNA 1000套組)分析最終cDNA文庫之大小分佈，藉由qPCR (KAPA Library Quant套組)量化且在製備中正規化至2 nM以用於測序。使用標準簇生成套組v5來使cDNA文庫以等溫方式結合至流動槽表面及cBot以將連接cDNA構築體各自擴增至最高約1000個拷貝之純系簇。藉由邊合成邊測序技術使用TruSeq SBS套組測定DNA序列。數據處理 使用GSNAP短讀數比對程式將長2×51 bp之Illumina配對端測序讀數定位於人類參考基因體hg19上。使用SAMTOOLS程式將SAM格式比對轉換成分選比對BAM格式檔案。基於來自NCBI RefSeq之外顯子注釋(由hg19之相應GTF檔案指定)來估計PD-L1之基因讀取計數。使用DESeq2 R套件應用考慮每一試樣之不同文庫大小之正規化步驟。 在與GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸化合物一起培育之後之PD-L1轉錄降低展示於表22中。 表22：在使用GalNAc偶聯之寡核苷酸處理後原代一級肝細胞中之PD-L1轉錄降低，n=4 在培育24及66小時之後，在與使用媒劑處理之試樣相比時，所有5種GalNAc偶聯之反義化合物皆展示顯著PD-L1轉錄降低。 實例9 -偶聯及裸PD-L1反義寡核苷酸在HBV感染之ASGPR-HepaRG細胞中之EC50 在HBV感染之ASGPR-HepaRG細胞中比較兩種裸及等效GalNAc偶聯PD-L1反義寡核苷酸之功效。細胞系 將HepaRG細胞(Biopredic International, Saint-Gregoire, France)培養於威廉E培養基(補充有10% HepaRG生長補充物(Biopredic))中。自此細胞系，使用慢病毒方法生成穩定過度表現人類ASGPR1及ASGPR2之HepaRG細胞系。以MOI 300使用由Sirion biotech按需產生之編碼人類ASGPR1及2之慢病毒(CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro)在CMV啟動子及嘌呤黴素抗性基因之控制下來轉導增殖HepaRG細胞。使用1µg/ml嘌呤黴素經11天選擇轉導細胞且然後維持於相同濃度之抗生素中以確保轉基因之穩定表現。在mRNA層面下藉由RT-qPCR (ASGPR1：8560倍對非轉導，ASGPR2：2389倍對非轉導)及在蛋白質層面下藉由流式細胞術分析來證實ASGPR1/2過度表現。 在感染之前使用1.8% DMSO分化細胞至少2週。HBV基因型D係衍生自HepG2.2.15細胞培養上清液且使用PEG沈澱濃縮。為評估測試化合物針對HBV之活性，使用HBV以20至30之MOI感染96孔板中之分化ASGPR-HepaRG細胞20 h，然後使用PBS將細胞洗滌4次以去除HBV接種物。寡核苷酸功效 將下列寡核苷酸 在感染後第7天及第10天使用25µM至0.4 nM之連續稀釋液(於PBS中以1:4稀釋)添加至HBV感染之ASGPR-HepaRG細胞中。在感染後第13天收穫細胞。 根據製造商說明書使用MagNA Pure 96 Cellular RNA大體積套組在MagNA Pure 96系統(Roche Diagnostics)上來提取總mRNA。對於基因表現分析而言，如實例5中所闡述來實施RT-qPCR。 使用2^-ddct方法分析數據。使用肌動蛋白B作為內源性對照以計算dct值。PD-L1表現係相對於內源性對照及鹽水媒劑。 在GraphPad Prism6中實施EC50計算且展示於表23中。 表23：ASGPR-HepaRG HBV感染細胞中之EC50，n=4。 該等數據明確展示，PD-L1反義寡核苷酸之GalNAc偶聯物顯著改良EC50值。 實例10 -衍生自慢性HBV患者之PBMC中之T細胞功能刺激 探究在末梢血單核細胞(PBMC)之離體HBV抗原刺激之後裸PD-L1反義化合物是否可增加慢性感染HBV (CHB)患者之T細胞功能。 將來自三名慢性HBV感染患者之冷凍PBMC解凍且以200’000個細胞/孔之密度接種於100µl培養基(RPMI1640 + GlutaMax+ 8%人類血清+ 25mM Hepes + 1% PenStrep)中。第二天，使用1µM PepMix HBV大套膜蛋白或1µM PepMix HBV核心蛋白(參見表9)使用或不使用5µM CMP ID NO: 466_1或CMP ID NO: 640_1在100µl含有100pg/ml IL-12及5ng/ml IL-7之培養基中刺激細胞(在第8天僅施加伴刀豆球蛋白(Concanavalin)刺激)。4天後，使用含有50IU IL-2之培養基更新PD-L1反義寡核苷酸處理。在第一刺激之後第8天，使用PepMix或5µg/ml伴刀豆球蛋白A以及PD-L1反義寡核苷酸再刺激細胞24h。對於最後5h刺激而言，添加0.1 µl佈雷菲德菌素A (佈雷菲德菌素A)、0.1µl莫能菌素(monensin)及3µl抗人類CD-107 (APC)。 在24h之後，使用染色緩衝液(PBS + 1% BSA + 0.09%疊氮化鈉+ EDTA)洗滌細胞且在4℃下施加表面染色30min [抗人類CD3 (BV 605)、抗人類CD4 (FITC)、抗人類CD8 (BV711)、抗人類PDL1 (BV421)、抗人類PD1 (PerCP-Cy5.5)及活及死亡染色(BV510) (BD Biosciences)]。將細胞在4℃下固定於BD固定緩衝液中保持15min。次日早上，使用BD Perm/Wash緩衝液將細胞在4℃下滲透15min且在4℃下實施細胞內染色30mi [抗人類INF( (PE)]。在Perm/Wash緩衝液中洗滌之後，將細胞溶於250µl染色緩衝液中。 在BD Fortessa (BD Biosciences)上實施FACS量測。對於分析而言，首先將整個細胞群體選通於活細胞上(活及死亡染色，BV510)，且然後選通於CD3+ (BV605)細胞上。然後將CD3+細胞繪圖為CD107a+ (APC)對IFNg+ (PE)。 結果展示於表24中。   表24：PD-L1 ASO處理對來自分離自三名慢性HBV感染患者之PBMC之CD3+ T細胞之效應。 自該等數據可看到，抗原刺激本身能夠誘導CHB患者(n=3)之PBMC中之T細胞活化(增加表現INFg(及/或CD107a之CD3+細胞之%)。添加PD-L1反義寡核苷酸CMP 466_1或640_1使得額外增加CD3+ T細胞反應。此增加主要於HBV套膜蛋白刺激組中觀察到。
圖 1 ：圖解說明實例性反義寡核苷酸偶聯物，其中將寡核苷酸表示為波浪線(A-D)或「寡核苷酸」 (E-H)或T2 (I)且靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係三價N-乙醯基半乳糖胺部分。化合物A至D包括二離胺酸支化劑分子、PEG3間隔體及三個末端GalNAc碳水化合物部分。在化合物A及B中，寡核苷酸無需連接體即直接連接至靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。在化合物C及D中，寡核苷酸經由C6連接體直接連接至靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。化合物E-I包括三倍增體支化劑分子及具有不同長度及結構之間隔體及三個末端GalNAc碳水化合物部分。圖 2 ：圖形展示實例2中所測試化合物與其在靶核酸上之位置相關之EC50 (A)及PD-L1敲低 (以鹽水%形式) (B)。測試化合物之細胞系係THP1(●)及Karpas ()。圖 3 ：三價GalNAc簇(GN2)之結構式。GN2可用作本發明中之偶聯物部分。波浪線圖解說明簇至(例如) C6胺基連接體或直接至寡核苷酸之偶聯位點。圖 4 ：CMP ID NO 766_2之結構式。圖 5 ：CMP ID NO 767_2之結構式。圖 6 ：CMP ID NO 768_2之結構式。圖 7 ：CMP ID NO 769_2之結構式。圖 8 ：CMP ID NO 770_2之結構式。圖 9 ：檢測來自在使用鹽水及所指示CMP ID NO治療後之聚(IC)誘導動物之肝中之PD-L1蛋白表現的西方印漬(Western blot)。每一印漬展示裸寡核苷酸與相同寡核苷酸之GalNAc偶聯形式，印漬A) CMP ID NO 744_1及755_2，B)  CMP ID NO 747_1及758_2，C) CMP ID NO 748_1及759_2，D) CMP ID NO 752_1及763_2及E) CMP ID NO 753_1及764_2。上帶係紐蛋白載量對照，下帶係PD-L1蛋白。每一印漬中之第一泳道展示並無聚(IC)誘導之鹽水治療小鼠。該等小鼠表現極少PD-L蛋白。圖 10 ：在使用●媒劑(組10及1)、◆ DNA疫苗(組11及2)、○抗PD-L1抗體(組12)、▲裸PD-L1 ASO + DNA疫苗(組7)或ΔGalNAc偶聯之PD-L1 ASO + DNA疫苗(組8)治療之後肝中之單核細胞之群體，表示每一組之個別動物且藉由每一組之垂直線指示平均值(參見表18)。評價DNA疫苗組與三個治療組之間之統計學顯著性且在存在時其由組間之*指示(* = P＜0.05，*** = P＜ 0.001且**** = P＜0.0001)。A)代表在治療後肝中之T細胞數。B)代表CD4+ T細胞部分且C)代表CD8+ T細胞部分。圖 11 ：在使用●媒劑(組10及1)、◆ DNA疫苗(組11及2)、○抗PD-L1抗體(組12)、▲裸PD-L1 ASO + DNA疫苗(組7)或ΔGalNAc偶聯之PD-L1 ASO + DNA疫苗(組8)治療之後肝中之PD-L1陽性細胞之調節，表示每一組之個別動物且藉由每一組之垂直線指示平均值(參見表19)。評價DNA疫苗組與三個治療組之間之統計學顯著性且在存在時其由組間之*指示(* = P＜0.05且**** = P＜0.0001)。A)代表在治療後肝中之表現PD-L1之CD8+ T細胞之百分比。B)代表在治療後肝中之表現PD-L1之CD4+ T細胞之百分比且C)代表在治療後肝中之表現PD-L1之B細胞之百分比。圖 12 ：在使用●媒劑(組10及1)、◆ DNA疫苗(組11及2)、○抗PD-L1抗體(組12)、▲裸PD-L1 ASO + DNA疫苗(組7)或ΔGalNAc偶聯之PD-L1 ASO + DNA疫苗(組8)治療之後肝中之HBV抗原特異性CD8+細胞介素分泌細胞，表示每一組之個別動物且藉由每一組之垂直線指示平均值(參見表20)。評價DNA疫苗組與三個治療組之間之統計學顯著性且在存在時其由組間之*指示(* = P＜0.05)。A)代表在治療後肝中之HBV PreS2+S抗原特異性IFN-γ分泌性CD8+ T細胞之百分比。B)代表在治療後肝中之HBV核心抗原特異性IFN-γ分泌性CD8+ T細胞之百分比，且C)代表在治療後肝中之HBV PreS2+S抗原特異性IFN-γ及TNF-α分泌性CD8+ T細胞之百分比。圖 13 ：與媒劑(■)相比，在使用GalNAc偶聯之PD-L1反義CMP NO: 759_2 (▼)治療後AAV/HBV小鼠中之HBV-DNA、HBsAg及HBeAg。垂直線指示治療終點。

Claims (24)

  1. 一種反義寡核苷酸偶聯物(conjugate)，其包括： a. 寡核苷酸(區域A)，其包括與PD-L1靶核酸具有至少90%互補性之長度10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列；及 b.     至少一個靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分(區域C)，其共價連接至a)中之寡核苷酸。
  2. 如請求項1之寡核苷酸偶聯物，其中該鄰接核苷酸序列與選自由以下組成之群之靶核酸互補：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及/或SEQ ID NO: 3。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸之子序列互補，其中該子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置371至3068、5467至12107及15317至19511。
  4. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸之子序列互補，其中該子序列係選自由以下組成之群：A221、A360、A180、A160及A269。
  5. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸包括選自SEQ ID NO: 466、640、342、287及566之序列。
  6. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該鄰接核苷酸序列包括一或多個經修飾核苷，例如一或多個2’糖修飾性核苷。
  7. 如請求項6之寡核苷酸偶聯物，其中該一或多個2’糖修飾性核苷獨立地選自由以下組成之群：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA及LNA核苷。
  8. 如請求項6之寡核苷酸偶聯物，其中所有該等經修飾核苷皆係LNA核苷。
  9. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該鄰接核苷酸序列包括至少一個經修飾核苷間鏈接，例如至少一個硫代磷酸酯核苷間鏈接。
  10. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸係間隙聚體(gapmer)
  11. 如請求項10之寡核苷酸偶聯物，其中該間隙聚體具有式5’-D’-F-G-F’-3’或5’-F-G-F’-D’’-3’，其中區域F及F’獨立地包括1至7個經修飾核苷，G係能夠招募RNaseH之6至16個核苷之區域，且區域D’或D’’係可選的且包括0至5個磷酸二酯連接之核苷。
  12. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括至少一個選自由以下組成之群之碳水化合物部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺。
  13. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係單價、二價、三價或四價。
  14. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係三價N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。
  15. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係圖3中之三價GalNAc部分。
  16. 如請求項1或2之寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸偶聯物係選自CMP ID NO: 766_2、767_2、768_2、769_2及770_2。
  17. 一種反義寡核苷酸，其包括如請求項1至11中任一項之寡核苷酸或鄰接核苷酸序列。
  18. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至16中任一項之寡核苷酸偶聯物或如請求項17之寡核苷酸及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
  19. 一種調節表現PD-L1之靶細胞中PD-L1表現之活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之如請求項1至16中任一項之寡核苷酸偶聯物或如請求項17之寡核苷酸。
  20. 一種如請求項1至16中任一項之寡核苷酸偶聯物或如請求項17之寡核苷酸之用途，其用以製備用於調節PD-L1表現之藥劑。
  21. 一種如請求項1至16中任一項之寡核苷酸偶聯物或如請求項17之寡核苷酸或如請求項18之醫藥組合物之用途，其用以製備用於恢復針對病毒或寄生蟲之免疫反應之藥劑。
  22. 如請求項21之用途，其中該免疫反應之恢復係在與對照相比時肝中特異性針對一或多種HBV抗原之CD8+ T細胞增加。
  23. 一種如請求項1至16中任一項之寡核苷酸偶聯物或如請求項17之寡核苷酸或如請求項18之醫藥組合物之用途，其用於製備藥劑。
  24. 一種如請求項1至16中任一項之寡核苷酸偶聯物或如請求項17之寡核苷酸或如請求項18之醫藥組合物之用途，其用以製備用於治療或預防病毒性肝感染(諸如HBV、HCV及HDV)、寄生蟲感染(諸如瘧疾、弓蟲症、利什曼病(leishmaniasis)及錐蟲病)或肝癌或肝中轉移之藥劑。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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PL2872485T3 (pl) 2012-07-13 2021-05-31 Wave Life Sciences Ltd. Asymetryczna grupa pomocnicza
CN104661664B (zh) 2012-07-13 2020-07-03 波涛生命科学有限公司 手性控制
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
EP4137572A1 (en) 2014-01-16 2023-02-22 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
MX2018000897A (es) 2015-07-21 2018-11-09 The Children´S Medical Center Corp Celulas madre hematopoyeticas que expresan pd-l1 y usos.
CN114736901B (zh) 2016-03-14 2024-05-31 豪夫迈·罗氏有限公司 用于减少pd-l1表达的寡核苷酸
EP3475424A1 (en) 2016-06-22 2019-05-01 ProQR Therapeutics II B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
US20220354888A1 (en) * 2016-08-03 2022-11-10 Aalborg Universitet ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASOs) DESIGNED TO INHIBIT IMMUNE CHECKPOINT PROTEINS
DK3507366T3 (da) 2016-09-01 2020-11-02 Proqr Therapeutics Ii Bv Kemisk modificeret, enkeltstrengede rna-modificerende oligonukleotider
EP3523434A1 (en) 2016-10-07 2019-08-14 Secarna Pharmaceuticals GmbH & Co. KG Novel approach for treating cancer
WO2019060708A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 The Children's Medical Center Corporation TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS
KR102431353B1 (ko) 2017-10-16 2022-08-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 B형 간염 감염을 치료하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 감소용 핵산 분자
MY203356A (en) 2018-01-12 2024-06-25 Bristol Myers Squibb Co Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
JP7547201B2 (ja) 2018-01-12 2024-09-09 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー アルファ－シヌクレインを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
GB201808146D0 (en) 2018-05-18 2018-07-11 Proqr Therapeutics Ii Bv Stereospecific Linkages in RNA Editing Oligonucleotides
CN112513273A (zh) 2018-06-22 2021-03-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节scn9a表达的寡核苷酸
WO2020007772A1 (en) * 2018-07-02 2020-01-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting gbp-1
WO2020011653A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting kynu
MX2021000404A (es) 2018-07-13 2021-03-25 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de rtel1.
WO2020081585A1 (en) * 2018-10-15 2020-04-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. The long non-coding rna inca1 and homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein h1 (hnrnph1) as therapeutic targets for immunotherapy
JP2022522898A (ja) * 2019-03-05 2022-04-20 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 分子の細胞内標的化
EP3947678A1 (en) 2019-04-02 2022-02-09 ProQR Therapeutics II B.V. Antisense oligonucleotides for immunotherapy
KR20220019676A (ko) * 2019-04-26 2022-02-17 스톡 테라퓨틱스, 인크. 선택적 인트론의 스플라이싱을 조절하기 위한 방법 및 조성물
CN114051531A (zh) 2019-05-03 2022-02-15 瑟卡尔纳制药有限公司 用于在肿瘤治疗中使用的pd-l1反义寡核苷酸
JP7634542B2 (ja) * 2019-12-19 2025-02-21 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのｓｅｐｔ９阻害剤の使用
CN114829601A (zh) * 2019-12-19 2022-07-29 豪夫迈·罗氏有限公司 Sbds抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
AR120817A1 (es) * 2019-12-20 2022-03-23 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos mejorados para inhibir la expresión de scn9a
CN114828852A (zh) * 2019-12-24 2022-07-29 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗hbv的靶向hbv的抗病毒药剂和/或免疫调节剂的药物组合
WO2021173812A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Aligos Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting pd-l1
CA3190794A1 (en) * 2020-08-05 2022-02-10 Soren Ottosen Oligonucleotide treatment of hepatitis b patients
CN114507663A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 寡核苷酸及其在抗乙型肝炎和丁型肝炎病毒中的应用
TW202246500A (zh) * 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
CN115216474B (zh) * 2021-04-15 2025-09-30 武汉大学 促进pd-l1外显子3跳跃的反义寡核苷酸及其应用
JP2024528270A (ja) * 2021-08-04 2024-07-26 ヘパジーン セラピューティクス（エイチケー）リミティド 治療活性剤の送達のためのリガンド共役体
CN113789324B (zh) * 2021-08-17 2023-08-25 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种aie探针及其制备方法与在荧光定量pcr方法中的应用
CN118284695A (zh) 2021-11-11 2024-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗hbv的药物组合
EP4551596A2 (en) * 2022-07-06 2025-05-14 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treatment of achromotopsia
TW202504619A (zh) * 2023-07-20 2025-02-01 大陸商上海舶望製藥有限公司 用於抑制pd-l1表達的組合物和方法

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
RU2175657C2 (ru) * 1990-11-08 2001-11-10 Чирон Корпорейшн Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа
ATE198598T1 (de) 1990-11-08 2001-01-15 Hybridon Inc Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
AU2916292A (en) 1991-10-24 1993-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
AU3999495A (en) 1994-10-06 1996-05-02 Buchardt, Dorte Peptide nucleic acid conjugates
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US5770716A (en) 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
IL132941A0 (en) 1997-05-21 2001-03-19 Univ Leland Stanford Junior Composition and method for enhancing transport across biological membranes
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
EP1152009B2 (en) 1999-02-12 2017-09-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
WO2005007855A2 (en) 2003-07-14 2005-01-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF B7-H1 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20060276422A1 (en) 2001-05-18 2006-12-07 Nassim Usman RNA interference mediated inhibition of B7-H1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
EP2206517B1 (en) * 2002-07-03 2023-08-02 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiating compositions comprising anti-PD-L1 antibodies
AU2003281969B2 (en) 2002-11-18 2011-01-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Amino-LNA, thio-LNA and alpha-L-oxy-LN
EP3470518A1 (en) 2003-06-12 2019-04-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing
ATE387217T1 (de) 2003-07-11 2008-03-15 Lbr Medbiotech B V Mannose-6-phosphat rezeptor vermittelter gentransfer zu muskelzellen
MX2007004176A (es) * 2004-10-06 2007-06-15 Mayo Foundation B7-h1 y metodos de diagnosis, prognosis, y tratamiento de cancer.
CN101084438B (zh) * 2004-10-06 2013-12-25 梅约医学教育与研究基金会 B7-h1和癌症的诊断、预后和治疗方法
US20120122801A1 (en) 2005-01-05 2012-05-17 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
DK1907000T4 (da) * 2005-06-08 2020-03-30 The President And Fellows Of Harvard College Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af persisterende HIV-infektioner ved hæmning af reaktionsvejen for programmeret celledød 1 (PD-1).
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
CN102908630B (zh) 2006-01-27 2014-11-19 Isis制药公司 6-修饰的双环核酸类似物
ES2386578T3 (es) 2006-05-05 2012-08-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de PCSK9
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007339897B2 (en) 2006-12-27 2013-02-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for the treatment of infections and tumors
WO2008113832A2 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Santaris Pharma A/S SHORT RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF TARGET mRNA
WO2008150729A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
ATE538127T1 (de) 2007-07-05 2012-01-15 Isis Pharmaceuticals Inc 6-disubstituierte bicyclische nukleinsäureanaloga
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
DK2285819T3 (da) 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
EP2274425A2 (en) 2008-04-11 2011-01-19 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
EP2370593B1 (en) * 2008-11-28 2016-03-30 Emory University Methods for determining the efficacy of pd-1 antagonists
EP4331604B9 (en) * 2008-12-09 2025-07-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
JPWO2010101249A1 (ja) * 2009-03-06 2012-09-10 国立大学法人三重大学 Ｔ細胞の機能増強方法
CN102459596B (zh) * 2009-05-06 2016-09-07 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
ES2618576T3 (es) * 2009-05-28 2017-06-21 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen antivírico mediante la inhibición de una transcripción antisentido natural a un gen antivírico
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US8507663B2 (en) * 2010-04-06 2013-08-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of CD274/PD-L1 gene
AU2011256098A1 (en) * 2010-05-18 2013-01-10 The Royal Institution For The Advancement Of Learning / Mcgill University Method for reducing expression of downregulated in renal cell carcinoma in malignant gliomas
WO2011156202A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
JP2013537423A (ja) 2010-08-17 2013-10-03 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
SI3124610T1 (sl) 2010-10-28 2019-08-30 Benitec Biopharma Limited Zdravljenje HBV
MX346144B (es) 2010-12-17 2017-03-09 Arrowhead Res Corp * Porcion activadora del modulador farmacocinetico del agregado de galactosa para arnsi.
CA2976966C (en) 2010-12-29 2021-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
EA029137B1 (ru) 2011-04-21 2018-02-28 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Модулирование экспрессии вируса гепатита в (hbv)
KR102167524B1 (ko) 2011-06-30 2020-10-20 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스의 유전자 발현 저해용 조성물 및 방법
EP2734208B1 (en) 2011-07-19 2017-03-01 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
EP3453761A1 (en) 2011-08-29 2019-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
US9751909B2 (en) 2011-09-07 2017-09-05 Marina Biotech, Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
WO2013049307A2 (en) 2011-09-30 2013-04-04 University Of Miami Enhanced immune memory development by aptamer targeted mtor inhibition of t cells
PL2768524T3 (pl) * 2011-10-17 2022-09-19 Io Biotech Aps Immunoterapia oparta na pd-l1
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
US10174323B2 (en) * 2012-05-16 2019-01-08 The General Hospital Corporation Compositions and methods for modulating ATP2A2 expression
US20150232836A1 (en) 2012-05-16 2015-08-20 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
PL2872485T3 (pl) 2012-07-13 2021-05-31 Wave Life Sciences Ltd. Asymetryczna grupa pomocnicza
CN117126846A (zh) 2012-11-15 2023-11-28 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合物
WO2014083178A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of patients in need of pd-l1 inhibitor cotherapy
WO2014118272A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
CA2893801A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
DK2991656T3 (da) 2013-05-01 2020-03-23 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af apolipoprotein c-iii-ekspression
SG11201510656PA (en) 2013-06-27 2016-01-28 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
WO2015114146A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Sividon Diagnostics Gmbh Method for predicting the response to an anti-her2 containing therapy and/or chemotherapy in patients with breast cancer
US20170224777A1 (en) 2014-08-12 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine
CA2961993A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
US9828601B2 (en) 2015-02-27 2017-11-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting checkpoint gene expression and uses thereof
GB201507926D0 (en) * 2015-05-08 2015-06-24 Proqr Therapeutics N V Improved treatments using oligonucleotides
US10577388B2 (en) * 2015-10-02 2020-03-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process
CN108738321B (zh) 2015-11-16 2021-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 GalNAc簇亚磷酰胺
WO2017100587A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting programmed cell death 1 ligand 1 (pd-l1) and methods of use thereof
CN114736901B (zh) * 2016-03-14 2024-05-31 豪夫迈·罗氏有限公司 用于减少pd-l1表达的寡核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
CN114717235A (zh) 2022-07-08
KR20210120131A (ko) 2021-10-06
JP2020172488A (ja) 2020-10-22
US20170283496A1 (en) 2017-10-05
CR20200119A (es) 2021-04-19
TW202128997A (zh) 2021-08-01
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