TW201726164A

TW201726164A - 脂質體疫苗

Info

Publication number: TW201726164A
Application number: TW105134639A
Authority: TW
Inventors: 麥克古德; 梅弗茲查曼
Original assignee: 格里菲斯大學
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2017-08-01

Abstract

本發明提供一種適用於針對一或複數個不同病原的預防、治療或免疫之免疫原性試劑，其包含含有呈現於脂囊泡上之一或複數個病原衍生蛋白質、其片段、變異體或衍生物、及位於囊內空間的如白喉類毒素的載體蛋白之免疫原性試劑。免疫原性試劑可適用於鼻內施予且其可誘發黏膜免疫反應。免疫原性試劑可進一步包含例如海藻糖-6,6′-二山萮酸酯及/或膽鹽，例如脫氧膽酸鈉之先天性免疫活化劑。一或複數個病原可為A群鏈球菌、病毒或鉤蟲。

Description

脂質體疫苗

本發明係關於預防及治療感染性疾病。更具體而言，本發明係關於一種藉由誘發黏膜免疫反應以治療或預防感染性疾病及症狀之脂質體疫苗。

全身性免疫已被證明能藉全身部位的血清免疫球蛋白(Ig)有效預防多種不同病原(pathogen)所引發之疾病，但無法預防黏膜部位的拓殖(colonization)因而無法預防人對人的傳染。因此，對於部分疾病，全身性疫苗接種並非為誘發免疫的最佳方法。反之，以鼻部施予以對抗各種生物體的黏膜疫苗能有效誘發全身性及黏膜腔室兩者的抗原專一性免疫反應。由於此雙層保護性免疫，黏膜疫苗對於對抗全身性及黏膜感染兩者為理想策略，其具預防黏膜拓殖之額外效益亦將抑制自上呼吸道之飛沫及氣霧的傳染。黏膜疫苗接種在經濟上亦為有利的，其對於疫苗開發為重要的考量。由於藉由鼻部途徑施予疫苗較為容易，可避免針頭的使用。因其無疼痛，傳遞時病患會有較大的順從性。

本發明的目的係為提供一種免疫原性試劑及誘發對於病原之黏膜免疫反應之傳遞系統。在廣泛形式中，本發明係關於藉由以進一步包含例如白喉類毒素 (diptheria toxoid)(DT)之載體蛋白的脂囊泡的方式傳遞免疫原性蛋白、片段或變異體而輔助或誘發對病原之黏膜免疫。適當地，載體蛋白位在囊內空間(intravesicular space)。在一具體形式中，一種單一免疫原性試劑包含來自複數個不同病原之複數個不同的免疫原性蛋白、片段或變異體。

本發明之一態樣提供適合施予至哺乳類的免疫原性試劑，該免疫原性試劑包含一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物、脂囊泡、載體蛋白或其片段或變異體。

在一實施例中，載體蛋白為白喉類毒素 (DT)。

在一實施例中，免疫原性試劑為包含來自不同病原之複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物之脂囊泡。

在本發明的另一態樣中，提供一種組成物，其包含上述態樣之免疫原性試劑。

在一實施例中，組成物包含免疫原性試劑，其包含含有相同或單一病原之複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物，或含有來自相同或單一病原之複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物之脂囊泡。

在一實施例中，組成物包含分別含有不同病原之一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物，或含有來自不同病原之一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物之複數個不同的免疫原性試劑。

在一實施例中，組成物包含單一免疫原性試劑，其包含含有不同病原之複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物，或含有來自不同病原之複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物之脂囊泡。

在本發明之另一態樣中，提供一種免疫原性試劑在製造用於誘發哺乳類中對一或複數個病原的免疫反應的藥劑之用途，該免疫原性試劑包含一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物、脂囊泡及白喉類毒素(DT)或其片段或變異體，或包含其之組成物。

在本發明之另一態樣中，提供一種免疫原性試劑在製造用於使哺乳類對一或複數個病原免疫的藥劑之用途，該免疫原性試劑包含一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物、脂囊泡及白喉類毒素(DT)或其片段或變異體，或包含其之組成物。

在本發明之又一態樣中，提供一種免疫原性試劑在製造用以治療或預防哺乳類中由一或複數個病原所引發之感染的藥劑之用途，該免疫原性試劑包含一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物、脂囊泡及白喉類毒素(DT)或其片段或變異體，或包含其之組成物。

適當地，免疫原性試劑誘發黏膜免疫反應

典型地，黏膜免疫反應包含IgA的產生。

在一較佳形式中，免疫原性試劑經鼻內施予。

適當地，免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物係呈現於脂囊泡的表面上。適當地，白喉類毒素(DT)或其片段或變異體係位於囊泡內的囊內空間。在一較佳實施例中，脂囊泡係為脂質體。

適當地，免疫原性蛋白片段或變異體為被脂質化的(lipidated)。在部分實施例中，在免疫原性蛋白片段或變異體的N端的離胺酸(K) 殘基係為脂質化的。在較佳形式中，N端離胺酸(K)殘基係經由α及ε胺基脂質化的。在部分實施例中，該脂質或各脂質係為例如棕櫚酸的C₁₆ 脂肪酸。較佳地，N端離胺酸(K)殘基係位在免疫原性蛋白片段或變異體的N端的間隔胺基酸序列(spacer amino acid sequence)中。

在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體係為A群鏈球菌M蛋白片段、其變異體或衍生物。在其他或替代的實施例中，免疫原性蛋白係有利於恢復或加強嗜中性球活性的試劑。

在一特定實施例中，M蛋白片段係為或包含M蛋白的保留區域。在一實施例中，片段係為免疫原性片段，其包含或其中含有p145胜肽。在一特定實施例中，免疫原性片段係為其中為或包含J8胜肽或其變異體。

較佳地，J8胜肽包含或實質上由胺基酸序列QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO：1)所組成

在一廣泛實施例中，有利於恢復或加強嗜中性球活性的試劑係為SpyCEP的蛋白質或其片段。

在一較佳實施例中，SpyCEP片段包含或實質上由胺基酸序列 NSDNIKENQFEDFDEDWENF (SEQ ID NO：2)所組成。

在一特定實施例中，SpyCEP片段與M蛋白片段可融合以形成單一的嵌合胜肽(chimeric peptide)。

在一實施例中，嵌合胜肽係為或可包含胺基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ (SEQ ID NO：3)或其變異體，或由該胺基酸序列或其變異體所組成。

在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體係為流行性感冒病毒之免疫原性蛋白、其片段或變異體。該流行性感冒病毒可為A型流行性感冒(influenza virus)。一非限定例係為或包含胺基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO：11)或實質上由該胺基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO：11)所組成。該流行性感冒病毒可為B型流行性感冒。一非限制例係為或包含胺基酸序列PAKLLKERGFFGAIAGFLE (SEQ ID NO：12)、或實質上由PAKLLKERGFFGAIAGFLE (SEQ ID NO：12)所組成。

在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體係為鼻病毒(rhinovirus)之免疫原性蛋白、其片段或變異體。一非限定例係為或包含胺基酸序列GAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINY (SEQ ID NO：13)或實質上由該胺基酸序列GAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINY (SEQ ID NO：13)所組成。另一非限定例係為或包含胺基酸序列GAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSL (SEQ ID NO：14) 或實質上由該胺基酸序列GAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSL (SEQ ID NO：14)所組成。

在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體係為寄生蟲(worm)，如鉤蟲(hook worm)之免疫原性蛋白、其片段或變異體。一非限定例係為或包含胺基酸序列TSLIAGLKAQVEAIQKYIGAEL (SEQ ID NO：15) 或實質上由該胺基酸序列TSLIAGLKAQVEAIQKYIGAEL (SEQ ID NO：15)所組成。

在部分實施例中，免疫原性試劑可進一步包含先天性免疫活化劑。先天性免疫的活化劑可靶向C型凝集蛋白(lectin)，例如可誘導Ca²⁺ 依賴(C型) 凝集蛋白的巨噬細胞(「Mincle」)。該先天性免疫活化劑可為醣脂。非限定例包含醣脂，例如分支桿菌索狀因子海藻糖-6,6′-二黴菌酸酯(mycobacterial cord factor trehalose-6,6′-dimycolate) (TDM)及/或其合成類似物(analogue)海藻糖-6,6′-二山萮酸酯(trehalose-6,6′-dibehenate) (TDB)或脂質A醣脂佐劑(lipid A glycolipid adjuvant)。

在部分實施例中，免疫原性試劑可進一步包含膽鹽，例如脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)。

除非本文另行要求，否則用語「包含(comprise)」、「包含(comprises)」及「包含(comprising)」或相似用語係意於表示非排他性包括，以使所述列舉的元件或特徵不僅包含其陳述或列舉的元件，而可包含未列舉或陳述之其他元件或特徵。

本文的胺基酸序列藉由「實質上由…組成(consisting essentially of )」係表示所述胺基酸序列為與在N端或C端的其他一個、兩個或三個胺基酸一起之胺基酸序列。

如本文所使用，用於此的不定冠詞「一(a )」及「一(an )」係指或包括單數或複數個元件或特徵，且不應表示或定義「一個(one)」或「單一(single)」元件或特徵。

本發明係至少部分由以下發現所肯定的是，與藉由已建立之非人類相容佐劑CTB所誘發之小鼠相比，藉由包含呈現於脂質體表面上之免疫原性胜肽與例如白喉類毒素(DT)之囊內載體蛋白之脂質體免疫原性進行鼻內免疫的小鼠導致黏膜及全身性抗體反應。在A群鏈球菌及J8胜肽的特定全文中，藉由脂質體製劑誘發的保護免疫的量顯著高於由J8/CTB誘發的量。此外，藉由該脂質體提出的純化人類樹突細胞(DC)子集合的細胞介素反應將有效地誘發人類的黏膜J8專一性IgA及全身性IgG反應。在部分實施例中，脂質體免疫原性試劑可包含單獨的SpyCEP胜肽或其之其他片段或與J8胜肽一起。在特定形式中，脂質體免疫原性試劑可適用於治療或預防由特定致病性菌株(particularly virulent strains)或A群鏈球菌的分離株(isolates)造成之感染，其能耐受用於A群鏈球菌感染的典型抗生素治療。該菌株或分離株通常會引起皮膚嚴重的感染(例如，壞死性筋膜炎(necrotizing fasciitis))且在部分情況下可能藏有CovR/SCovR/S突變。其可類推至包含但不限於：流行性感冒、鼻病毒及寄生蟲(如鉤蟲)的其他病原或其關聯性疾病、異常及症狀。據此，本發明中之實施例提供一種單一免疫原性試劑，其包含複數個不同病原的一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物，或來自其的一或複數個免疫原性蛋白、其片段、變異體或衍生物。

為了本發明的目的，藉由「分離的(isolated )」係表示已自其自然狀態或移除或已受到人為操作的材料。分離的材料可實質上或基本上自通常伴隨其在自然狀態的組成物游離，或可操作以便於在人工狀態下與通常伴隨其在自然狀態的組成物結合。分離的材料可為天然(native)、化學合成或重組形式。

藉由「蛋白質(protein )」係表示胺基酸聚合物。該胺基酸可為所屬技術領域中所理解的自然或非自然胺基酸、D-或L-胺基酸。

用語「蛋白質(protein )」包含及包括「胜肽(peptide )」，其通常用於敘述具有小於五十個(50)胺基酸之蛋白質、以及「多肽(polypeptide )，其通常用於敘述具有大於五十個(50)胺基酸之蛋白質。

於本文中普遍使用之，當蛋白質被歸於「為……的(of )」或「來自(from )」病原，其通常代表該蛋白質包含一胺基酸序列，該序列係至少一部分或完全存在於病原內之蛋白質。

「片段(fragment )」係為蛋白質的斷片、域、部分或區域，其由小於100%的蛋白質的胺基酸序列構成。將理解的是，片段可為單一片段或可為單獨重複或與其他片段一起。

通常片段可包含、實質上由5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600個胺基酸的全長蛋白質所組成、或由高達5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600個胺基酸的全長蛋白質所組成。

如本文所使用，蛋白質「變異體(variant )」與參考胺基酸序列共享可定義的核苷酸或胺基酸序列關係。「變異體」蛋白質可具有刪除或由不同胺基酸置換的參考胺基酸序列的一或複數個胺基酸。在所屬技術領域中所理解的是，部分胺基酸可被置換或刪除而不會改變免疫原性片段及/或蛋白質的活性(保守性取代)。較佳地，蛋白變異體與參考胺基酸序列共享至少70% 或75%，較佳地至少80% 或85%或更佳地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。

通常在此用於敘述各自的蛋白質與核酸之間的序列關係之用語包含「比較窗口(comparison window)」、「序列相同 (sequence identity)」、「序列相同的百分比(percentage of sequence identity)」及「實質上相同(substantial identity)」。由於各自的核酸/蛋白質可各自包含(1)僅藉由核酸/蛋白質共享的完全核酸/蛋白質序列的一或多個蛋白質、以及(2)在核酸/蛋白質之間趨異的一或多個蛋白質，序列比較通常藉由「比較窗口」比較序列來執行，以辨識及比較局部區域的序列相似性。「比較窗口」係指通常為與參考序列比較的6、9或12連續性殘基的概念性片段。與各自序列的最適比對(Optimal alignment)的參考序列相比，比較窗口可包含約20%或以下的附加物(additions)或缺失(deletions)(即，間隙)。用於比對比較窗口的最適比對的序列可藉由演算法的電腦化執行來處理(藉由Intelligenetics的Geneworks程式；Wisconsin遺傳套裝軟體7.0版(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，遺傳計算機組(Genetics Computer Group)，575科學驅動Madison(575 Science Drive Madison)，WI，USA於此併入作為參考)或藉由以任何選擇的各種方法產生的檢驗及最佳比對(即，透過比較窗口產生最高百分比同源性)。參考亦可由例如於此併入作為參考的Altschul等人，1997，Nucl. Acids Res.25 3389所揭露的BLAST家族(BLAST family)的程式進行。序列分析的詳細討論可基於Eds. Ausubel 等人的分子生物學實驗操作手冊(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)的19.3單元(John Wiley及Sons Inc NY，1995-1999)(Unit 19.3 of CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubelet al . (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999))。

用語「序列相同」在本文中最廣泛的意義為包含具有考慮到利用標準演算法的適當比對、具有考慮到序列透過比較窗口為相同的程度之精確核苷酸或胺基酸匹配的數目。因此，「序列相同的百分比」係藉由透過比較窗口比較兩個最適比對序列、定義在兩個序列出現相同的核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)的位置數目以產生匹配位置的數目、將匹配位置的數目除以比較窗口位置的總數(即，窗口尺寸)以及將該結果乘以100以產生序列相同的百分比來計算。例如，「序列相同」可理解成藉由DNASIS計算機程式(DNASIS computer program)(用於windows 的2.5版(Version 2.5 for windows)；購得自Hitachi Software engineering Co., Ltd.，南舊金山(South San Francisco)，加州( California)，USA))計算的「匹配百分比(match percentage)」的意義。

如本文所使用的「衍生物(derivatives )」係例如藉由所屬技術領域中所理解的與其他化學部分共軛(conjugation)或複合、藉由轉譯後修飾(post-translational modification)(例如，磷酸化、乙醯化等)、醣化(glycosylation)的修飾(例如，增加、移除或改變醣化)、脂質化及/或額外胺基酸序列的納入所改變的分子，例如蛋白質、其片段或變異體。在一特定實施例中，額外胺基酸序列可包含在其N端及/或C端的一或複數個離胺酸殘基。複數個離胺酸殘基(例如，聚離胺酸)可為離胺酸殘基的線性序列或可為離胺酸殘基的支鏈序列。此額外的離胺酸殘基可有利於增加胜肽溶解度。

額外胺基酸序列可包含融合配偶體(fusion partner)胺基酸序列，其產生融合蛋白。例如，融合配偶體胺基酸序列可協助分離的融合蛋白的檢測及/或純化。非限定例包含金屬結合(例如，聚組胺酸(polyhistidine)) 融合配偶體、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein (MBP))、A蛋白質、麩胺基S-轉移酶(glutathione S-transferase (GST))、螢光蛋白質序列(例如，GFP)、例如myc、FLAG及球凝集素標籤(haemagglutinin tags)的表位標籤(epitope tags)。其他的額外胺基酸序列包含間隔序列。間隔序列的一示例係為在免疫原性蛋白片段的胺基酸序列的N端或C端的胺基酸序列或包含適用於脂質化的離胺酸(K)殘基之變異體。通常地，間隔胺基酸序列包含兩個(2)至十個(10)胺基酸，例如三個(3)胺基酸序列KSS。

由本發明預期的其他衍生物包含，但不限於，對側鏈的修飾、非自然胺基酸及/或胜肽中的其衍生物的併入或蛋白質合成及交聯劑(crosslinkers)的使用以及在本發明的免疫原性蛋白、片段及變異體上加強構形限制(conformational constraints)的其他方法。

在此方面，所屬技術領域中具有通常知識者係參照Coligan等人蛋白質科學實驗操作手冊(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)的第15章(John Wiley及Sons NY，1995-2008)用於對蛋白質以更廣泛的方法進行化學修飾。

本發明揭露的免疫原性蛋白、片段及變異體將被理解為可各自呈現於脂囊泡的表面上或作為包含相同胜肽的多個複製或多個不同胜肽之嵌合體或融合蛋白質。非限制例為SEQ ID NO：3的嵌合胜肽，其將在下文中更詳細地描述。

在本發明的全文中，如本文所用的「免疫原性(immunogenic )」係表示在對哺乳類或其他動物施予免疫原性試劑之後，對例如病原或其分子組成產生或誘發免疫反應的能力或潛力。

藉由「誘發免疫反應(elicit an immune response )」係表示產生或刺激包含細胞免疫系統的免疫系統、抗體及/或天然免疫系統(native immune system)的一或多個元素的產生或活性。適當地，免疫系統的一或多個元素包含B淋巴細胞、抗體、嗜中性球、包含漿細胞樣樹突細胞的樹突細胞、細胞介素及/或化學激活素。細胞介素的非限制例包含促發炎細胞介素，例如TNF-α、IL-6及IL-1(例如，IL-1 β)。化學激活素的非限制例係為嗜中性球趨化物(chemo-attractant) IL-8。適當地，免疫反應係為或包含黏膜免疫反應，例如包含IgA 產生。較佳地，由免疫原性試劑誘發的免疫反應為保護性的。

如本文通常所使用的用語「免疫(immunize )」、「疫苗接種(vaccinate )」及「疫苗(vaccine )」係指誘發保護的免疫反應對抗病原之方法及/或製劑，因而至少部份地避免或最小化因病原的隨後感染。

如本文中所使用的「病原(pathogen )」係為有能力於動物體導致疾病、異常或症狀的任何有生命或無生命之個體，該動物例如為家禽或哺乳類，亦包含人類。病原可為但不限於病毒、細菌、原生動物或寄生蟲。病原之具體非限制例包含細菌，例如A群鏈球菌、呼吸道病毒，如流行性感冒病毒，以及鼻病毒及寄生蟲，如線蟲，亦包含鉤蟲。

如自本文的揭露所理解的，本發明提供包含免疫原性蛋白片段、變異體或衍生物及配製在脂囊泡中的載體蛋白之脂囊泡製劑。如本文廣泛使用，脂囊泡可為脂質體、微小胞(minicell)、多層微脂粒(multilamellar vesicle)、微胞(micelle)、液泡(vacuole)或其他包含脂質雙層的其他泡狀結構(vesicular structure)，適當地，免疫原性蛋白片段、變異體或衍生物係衍生化成包含有利於固定在脂質雙層的一或多種脂質，以使免疫原性蛋白片段、變異體或衍生物呈現在脂囊泡的表面上。在較佳形式中，離胺酸(K)殘基係經由α及/或ε胺基脂質化。為了利於脂質化，免疫原性蛋白片段、變異體或衍生物可進一步包含含有脂質化的離胺酸(K)殘基的N端間隔。間隔通常可包含2~10個相接的胺基酸，例如三個(3)胺基酸間隔KSS。在部分實施例中，該脂質或各脂質為C₁₆ 脂肪酸，例如棕櫚酸。然而，亦將理解的是，其他脂質，例如根據本發明可使用具有C₁₂ -C₂₂ 碳鏈的飽和或不飽和(例如，單元不飽和(mono-unsaturated))脂肪酸。

脂囊泡適當地包含可形成脂質雙層結構的任意脂質或混合脂質。其包含磷脂類(phospholipids)、包含膽固醇(cholesterol)、膽固醇酯(cholesterol-esters)及植物固醇(phytosterols)的固醇類、脂肪酸及/或三酸甘油酯(triglycerides)。磷脂類的非限制例包含磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine (PC))(卵磷脂(lecithin))、磷脂酸(phosphatidic acid)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine(PE))(腦磷脂(cephalin))、磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol(PG))、磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine(PS))、磷脂酸肌醇(phosphatidylinositol(PI))及鞘磷脂(sphingomyelin (SM))或其自然或合成衍生物。自然衍生物包含蛋PC(egg PC)、蛋PG、大豆PC、氫化油大豆PC、大豆PG、腦PS、神經脂質(sphingolipid)、腦SM、半乳糖腦苷脂(galactocerebroside)、神經節苷脂(gangliosides)、腦脂質(cerebrosides)、腦磷脂、心磷脂(cardiolipin)及雙十六烷基磷酸鹽(dicetylphosphate)。合成衍生物包含二棕櫚醯磷酯醯膽鹼(dipalmitoylphosphatidylcholine(DPPC)、二癸醯磷酯醯膽鹼(didecanoylphosphatidylcholine(DDPC))、二芥子醯磷酯醯膽鹼(dierucoylphosphatidylcholine(DEPC))、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(dimyristoylphosphatidylcholine(DMPC))、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(distearoylphosphatidylcholine(DSPC))、二月桂醯磷脂醯膽鹼(dilaurylphosphatidylcholine(DLPC))、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(palmitoyloleoylphosphatidylcholine(POPC))、棕櫚醯肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(palmitoylmyristoylphosphatidylcholine(PMPC))、棕櫚醯硬脂醯磷脂醯膽鹼(palmitoylstearoylphosphatidylcholine(PSPC))、二油醯磷脂醯膽鹼(dioleoylphosphatidylcholine(DOPC))、二油醯磷脂醯乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine(DOPE))、二月桂醯磷脂醯甘油(dilauroylphosphatidylglycerol(DLPG))、二硬脂醯磷脂醯甘油(distearoylphosphatidylglycerol(DSPG))、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油(dimyristoylphosphatidylglycerol(DMPG))、二棕櫚醯磷脂醯甘油(dipalmitoylphosphatidylglycerol(DPPG))、二硬脂醯磷脂醯甘油(distearoylphosphatidylglycerol(DSPG))、二油醯磷脂醯甘油(dioleoylphosphatidylglycerol(DOPG))、棕櫚醯油醯磷脂醯甘油(palmitoyloleoylphosphatidylglycerol(POPG))、二肉豆蔻醯磷脂酸(dimyristoylphosphatidic acid(DMPA))、二棕櫚醯磷脂酸(dipalmitoylphosphatidic acid(DPPA))、二硬脂醯磷脂酸(distearoylphosphatidic acid(DSPA))、二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺(dimyristoylphosphatidylethanolamine(DMPE))、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamine(DPPE))、二肉豆蔻醯磷脂醯絲胺酸(dimyristoylphosphatidylserine(DMPS))、二棕櫚醯磷脂醯絲胺酸(dipalmitoylphosphatidylserine(DPPS))、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine(DSPE))、二油醯磷脂醯乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine(DOPE))、二油醯磷脂醯絲胺酸(dioleoylphosphatidylserine(DOPS))、二棕櫚醯鞘磷脂(dipalmitoylsphingomyelin(DPSM))以及二硬脂醯鞘磷脂(distearoylsphingomyelin(DSSM))。磷脂質亦可為任意上述磷脂質的衍生物或類似物。

適當地，混合的脂質可包含各脂質間為所期望的莫耳或wt%比。例如，脂質體可利用7 7二棕櫚醯基-sn-甘油酸-3-磷酸膽鹼(dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC))：2 膽固醇(CHOL)：1 L-α-磷脂醯甘油(L-α-phosphatidylglycerol (PG))的莫耳比來形成。

適當地，脂囊泡進一步包含載體蛋白。適當地，載體蛋白係為免疫原性蛋白，或至少部分地有利於或加強免性原性試劑的免疫原性。通常載體蛋白係以脂囊泡製備，以使載體蛋白位在脂囊泡內側的內部水性空間中。在部分實施例中，載體蛋白可與該免疫原性蛋白片段、其變異體或衍生物融合、共軛或複合。其包含重組蛋白融合、化學交聯(chemical cross-linking)及例如藉由生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)或其他分子間結合劑的方式之分子間複合(intermolecular complexing)，但不限於此。在此實施例中，該免疫原性蛋白片段、其變異體或衍生物係與載體蛋白位在脂囊泡內側的內部水性空間中融合、共軛或複合。此實施例可特別適用於口服施予的免疫原性試劑，例如包含膽鹽的脂質體，其將在下文中更詳細地描述。載體蛋白的非限制例包含白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(tetanus toxoid(TT))、例如CRM197的CRM蛋白及百日咳毒素突變(Pertussis toxin mutant)，但不限於此。亦考慮為載體蛋白的片段及變異體。在一特定實施例中，載體蛋白係為白喉類毒素 (DT)或其片段。

在部分實施例中，脂囊泡進一步包含先天性免疫的活化劑。先天性免疫的活化劑可靶向由與先天性免疫相關的一或多種細胞表現的C型凝集蛋白。較佳地C型凝集蛋白係為可誘導Ca²⁺ 依賴(C型)凝集蛋白的巨噬細胞(「Mincle」)。非限制例包含醣脂類，例如分支桿菌索狀因子海藻糖-6,6′-二黴菌酸酯(TDM)及/或其合成類似物海藻糖-6,6′-二山萮酸酯(TDB)及/或脂質A醣脂佐劑，如可為PHAD®、3D-PHAD®及3D (6-acyl) PHAD®型態之單磷醯基3-去醯基-脂質A。雖然不希望受任何特定理論的束縛，但如上述所建議的先天性免疫的活化劑可加強或改善由免疫原性試劑誘發的黏膜免疫。較佳地，一或多個醣脂可包含於脂囊泡中以至於其不佔有超過脂囊泡中全體脂質的約25%、約20%、約15%、約10%。

在部分實施例中，脂囊泡可進一步包含膽酸(bile acid)或膽鹽。膽酸通常為具有24個碳的雙羥化(dihydroxylated)或三羥化(trihydroxylated)的固醇類，其包含膽酸(cholic acid)、去氧膽酸(deoxycholic acid)、鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)及熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)。較佳地，脂囊泡包含膽鹽，例如膽酸鹽(cholate)、去氧膽酸鹽(deoxycholate)、鵝去氧膽酸鹽(chenodeoxycholate)或熊去氧膽酸鹽(ursodeoxycholate salt)。較佳地膽鹽為脫氧膽酸鈉。

在其他實施例中，包含脂質體的免疫原性試劑可製成在特定、所選的或期望的特定尺寸或尺寸範圍。在部分實施例中，較大粒徑脂質體可誘發較強的黏膜免疫反應。

在其他實施例中，包含脂質體的免疫原性試劑可冷凍乾燥或凍乾(lyophilized)，以利於長期儲存。重組冷凍乾燥的脂質體免疫原性試劑誘發的免疫反應可與「新鮮(fresh)」脂質體免疫原性試劑相比。

在部分實施例中，病原為A群鏈球菌。

如本文所使用的用語「A群鏈球菌(group A streptococcus )」、「A群鏈球菌(Group A Streptococci )」、「A群鏈球菌(Group A Streptococcal )」、「A群鏈球菌(Group A Strep )」及縮寫「GAS」係指Lancefield血清群A(Lancefield serogroup A)的鏈球菌，其為化膿性鏈球菌物種(Streptococcus pyogenes )的革蘭氏陽性β-溶血菌(gram positive β-hemolytic bacteria)。GAS的重要致病因子為M蛋白，其為強烈的抗吞噬(anti-phagocytic)且與血清因子H連結，破壞C3轉化酶(C3-convertase)且藉由C3b避免助噬作用(opsonization)。如Graham等人，PNAS USA99 13855(Grahamet al ., 2002, PNAS USA99 13855)所述，其亦包含例如CovR/S或CovRS突變的致病性「突變」，但不限於此。

由A群鏈球菌所引起的疾病及症狀包含蜂窩性組織炎(cellulitis)、丹毒(erysipelas)、膿皰症(impetigo)、猩紅熱(scarlet fever)、例如急性咽炎(acute pharyngitis)的喉部感染(鏈球菌性喉炎(strep throat))、菌血症(bacteremia)、中毒性休克症候群、壞死性筋膜炎、急性風濕熱及急性腎絲球腎炎(acute glomerulonephritis)，但不限於此。

如本文所使用的「嗜中性球(neutrophils )」或嗜中性顆粒細胞係為與嗜鹼性球(basophils)及嗜酸性球(eosinophil)一起形成多型核細胞家族(polymorphonuclear cell family (PMNs))的部分。嗜中性球係自骨髓幹細胞形成相對短壽命的吞噬細胞且在哺乳類中通常構成40%至75%的白血球細胞。吞噬的嗜中性球釋出水性抗微生物(soluble anti-microbials)(例如，顆粒蛋白)並產生嗜中性白血球胞外網狀結構(neutrophil extracellular traps)。嗜中性球對例如介白素8 (IL-8)、C5a、fMLP及白三烯(leukotriene)B4的分子反應，其促使嗜中性球趨化至受傷及/或急性發炎的位置。

在一實施例中，免疫原性蛋白可為M蛋白、其片段或變異體。

如本文所使用「M蛋白片段(M protein fragment )」為GAS M蛋白的任意片段，其為免疫原性及/或可藉由抗體或抗體片段束縛。通常地，該片段係為、包含或被含有在GAS M蛋白的C重複區域的胺基酸序列或其片段。非限制例包含LRRDLDASREAKKQVEKALE (SEQ ID NO：4)胺基酸序列之具有20mer胺基酸序列的p145。在此方面，p145 胺基酸序列片段可表現在J8胜肽中。

如本文所使用的「J8胜肽(J8 peptide )」為包含至少部分地來自或對應於GAS M蛋白C區域胜肽的胺基酸序列之胜肽。J8胜肽適當地包含構形B細胞表位(conformational B-cell epitope)及缺失可預期不良的T細胞自身表位(deleterious T-cell autoepitopes)。較佳的J8胜肽胺基酸序列為QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ (SEQ ID NO：1)或其片段或變異體，其中粗體的殘基對應於GAS M蛋白的殘基344至355。在此實施例中，J8係為進一步包含側面(flanking)GCN4 DNA-結合蛋白序列的嵌合胜肽，其協助維持正確的螺旋摺疊及J8胜肽的構形結構。

在另一實施例中，免疫原性蛋白可為利於恢復或加強嗜中性球活性的試劑。

如本文所使用的「利於恢復或加強嗜中性球活性的試劑(agent that facilitates restoring or enhancing neutrophil activity )」為直接或間接地至少部分地增加、加強或恢復嗜中性球的產生、移動及/或趨化性、及/或嗜中性球的一或多種免疫活性之分子。在一實施例中，試劑誘發對嗜中性球抑制劑的免疫反應。在另一實施例中，試劑結合且至少部分地不活化嗜中性球抑制劑。嗜中性球抑制劑可為衍生自或源自A群鏈球菌的分子。在一特定形式中，嗜中性球抑制劑為絲胺酸蛋白酶(serine protease)或其片段，其蛋白水解地剪切介白素8。在一特定實施例中，嗜中性球抑制劑為SpyCEP或其片段。SpyCEP係為在人類病原化膿性鏈球菌的表面上表現的170-kDa多域絲胺酸蛋白酶，其藉由催化剪切及不活化嗜中性球趨化物介白素8因而在感染上扮演重要的角色。SpyCEP 胺基酸序列的非限制例可基於序列編號YP597949.1及(S. pyogenes MGAS10270)及YP596076.1 (S. pyogenes MGAS9429)。因而，在一特定實施例中，SpyCEP片段係為或包含所述的SEQ ID NO：2 (NSDNIKENQFEDFDEDWENF) 胺基酸序列。其建議的SEQ ID NO：2係為或包含在SpyCEP上的顯性表位(dominant epitope)，其可誘發功能性抗體。

再者，本文提供一種包含M蛋白胺基酸序列及SpyCEP 胺基酸序列的嵌合胜肽，其形成單一、相接的胺基酸序列。M蛋白胺基酸序列可位在SpyCEP 胺基酸序列的C端或其相反。在一實施例中，嵌合胜肽可包含胺基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ (SEQ ID NO：3)或其變異體。

在替代實施例中，包含M蛋白胺基酸序列及SpyCEP 胺基酸序列的各自脂質體可產生用於作為「混合物(admixture)」施予。

在一特定實施例中，變異體M蛋白或胜肽可包含在其N端及/或C端的一或複數個離胺酸殘基。複數個離胺酸殘基(例如，聚離胺酸)可為離胺酸殘基的線性序列或可為離胺酸殘基的支鏈序列。此額外的離胺酸殘基可有利於增加胜肽溶解度。

J8胜肽變異體的非限制例包含： S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q V E K A L C (SEQ ID NO：5) S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K C (SEQ ID NO：6) S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K K Q V E K A L C (SEQ ID NO：7) S R E A K K Q V E K A L D A S R E A K K Q V E K A L C (SEQ ID NO：8) 其他變異體可基於例如Cooper等人，1997所述的七肽(heptad)。

例如，若表位已知位在α-螺旋蛋白結構構形中，接著可合成模型胜肽以摺疊成此構形。其基於GCN4白胺酸拉鍊(GCN4 leucine zipper)的結構(O’Shea等人，1991)設計α-螺旋的捲曲螺旋胜肽的模型。第一七肽含有序列MKQLEDK(SEQ ID NO：9)，其包含數個在穩定的螺旋捲曲的七肽重複模體(heptad repeat motif)(a-b-c-d-e-f-g)n 中發現的特徵(Cohen及Parry，1990)。其包含在a 及d 位置的大的非極性殘基、在e及g位置的酸/鹼對(Glu/Lys)(通常有利於鏈間的離子相互作用)及在b、 c及f位置的極性基(與Lupas等人的預測一致(1991))。GCN4胜肽亦含有在a 位置的共識纈胺酸(consensus valine)。亦應注意的是，當由V及L佔據a 及d 位置時，捲曲螺旋二聚體(coiled coil dimer)為較佳(Harbury等人，1994)。自GCN4白胺酸拉鍊胜肽(VKQLEDK；SEQ ID NO：10)的共識特徵所衍生的七肽重複模型：具有形成α-螺旋形捲曲螺旋的潛能。此胜肽變成架構胜肽(framework peptide)。基於研究的構形表位的重疊片段嵌入模型捲曲螺旋胜肽，以形成嵌合胜肽。每當在螺旋型模型胜肽及表位序列兩者中找到相同的殘基時，將設計成確保正確的螺旋捲曲螺旋構形(Cohen及Parry，1990)的胺基酸置換併入至嵌合胜肽。通常使用的下列置換：在a位置，V換成I；b位置，K換成R；c位置，Q換成N；在d 位置，L換成A；在e位置，E換成Q；在f位置，D換成E；在g位置，K換成R。所有此置換殘基在捲曲螺旋蛋白質的其各自位置中為常見的(Lupas等人，1991)。

於Olive等人，2002，Infect & Immun.70 2734中所述的一特定J8胜肽衍生物係為「脂質核心胜肽(lipid core peptide)」。在一實施例中，脂質核心胜肽可包含直接地將支鏈聚離胺酸核心的各離胺酸中的兩個胺基酸耦接至脂溶性錨定物(lipophilic anchor)而合成的複數個J8胜肽(例如，四個J8胜肽)。

M蛋白片段或變異體及/或SpyCEP片段或變異體可衍生成包含一或多種脂質，其有利於固定至上述的脂質雙層。在又一實施例中，包含M蛋白胺基酸序列及SpyCEP 胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：3)的嵌合胜肽可包含在其N端的間隔胺基酸序列。因而，在實施例中的SpyCEP片段或變異體被包含在脂囊泡，其可與M蛋白片段或變異體單獨地脂質化或可以脂質化的嵌合胜肽呈現。

在部分實施例中，病原為流行性感冒病毒，在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體為A型流行性感冒病毒之免疫原性蛋白、其片段或變異體。該免疫原性蛋白或片段可為基質蛋白2或其片段。非限制例係為或包含胺基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO：11)。在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體為B型流行性感冒病毒之免疫原性蛋白、其片段或變異體。該免疫原性蛋白或片段可為血球凝集素(haemagglutinin)蛋白或其片段。非限制例係為或包含胺基酸序列PAKLLKERGFFGAIAGFLE (SEQ ID NO：12)。

在部分實施例中，病原為鼻病毒。在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體為B型鼻病毒蛋白，如殼蛋白(capsid protein)。非限制例係為或包含胺基酸序列GAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINY (SEQ ID NO：13)。在另一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體為A型鼻病毒蛋白的免疫原性蛋白、片段或變異體，如殼蛋白。另一非限制例係為或包含胺基酸序列GAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSL (SEQ ID NO：14)。

在部分實施例中，病原為寄生蟲，例如鉤蟲。在一特定實施例中，免疫原性蛋白、片段或變異體為美洲鉤蟲(Necator americanus )的免疫原性蛋白、片段或變異體。非限制例係為或包含胺基酸序列TSLIAGLKAQVEAIQKYIGAEL (SEQ ID NO：15)。

本發明的分離的免疫原性蛋白、片段及/或衍生物可由所屬技術領域中已知的任何方法產生，包含但不限於化學合成、重組DNA技術及蛋白水解剪切以產生胜肽片段。

化學合成係包含固態及液態合成。雖然參照Ed. Nicholson (Blackwell科學出版社(Blackwell Scientific Publications))的合成疫苗(SYNTHETIC VACCINES)第9章及Eds. Coligan等人的蛋白質科學實驗操作手冊第15章(John Wiley及Sons, Inc. NY USA 1995-2008)所提供的化學合成技術的示例進行製作，但該方法為所屬技術領域中已知的方法。在此方面，亦參照國際公開號WO 99/02550及國際公開號WO 97/45444進行製作。

重組蛋白藉由所屬技術領域中具有通常知識者利用例如Sambrook等人的分子選殖，實驗室手冊(MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual) (冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，1989)，特別是在第16段及第17段；Eds. Ausubel等人的分子生物學實驗操作手冊(John Wiley及 Sons, Inc. NY USA 1995-2008)，特別是在第10章及第16章；以及Eds. Coligan等人的蛋白質科學實驗操作手冊(John Wiley及 Sons, Inc. NY USA 1995-2008)，特別是在第1章、第5章及第6章所述的標準實驗操作而可方便地製備。通常地，重組蛋白製備包含在適合的宿主細胞中編碼蛋白質的核酸的表現。

如上述，本發明提供用於在哺乳類或其他動物中預防或治療與病原體相關的疾病、異常或症狀的免疫原性試劑及/或其用途。

如本文所使用的「治療(treating )」、「治療(treat )」或「治療(treatment )」係指在其發展之後至少部分地改善(ameliorates)、消除(eliminates)或減輕與病原相關的疾病、異常或症狀的病徵或病理徵兆的治療介入(therapeutic intervention)。該治療不需絕對為對個體為有益的。有益效果可利用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何方法或標準定義。

如本文所使用的「預防(preventin g)」、「預防(prevent )」或「預防(prevention )」係指在藉由或暴露於A群鏈球菌而感染之前及/或與A群鏈球菌相關的疾病、異常或症狀的病徵或病理徵兆的開始之前起始的行動過程，以避免感染及/或降低病徵或病理徵兆。將理解的是，該預防不需絕對為對個體為有益的。「預防性(prophylactic )」治療是對尚未出現疾病、異常或症狀的徵兆、或僅出現早期徵兆的個體施予治療，以用於降低疾病、異常或症狀的病徵或病理徵兆的發展風險的目的。

疾病、異常或症狀可為與A群鏈球菌相關的疾病、異常或症狀。

在本發明的全文中，藉由「與A群鏈球菌相關的疾病、異常或症狀(group A-strep-associated disease, disorder or condition )」係表示由A群鏈球菌感染所造成的任何臨床病理且包含蜂窩性組織炎、丹毒、膿皰症、猩紅熱、例如急性咽炎的喉部感染(鏈球菌性喉炎)、菌血症、中毒性休克症候群、壞死性筋膜炎、急性風濕熱及急性腎絲球腎炎，但不限於此。

如本文上述所述，本文所揭露的用於治療及/或免疫的用途包含對哺乳類施予含有有利於回復或加強嗜中性球活性的M蛋白片段、變異體或衍生物、脂囊泡、載體蛋白及/或SpyCEP胜肽或其他片段之免疫原性試劑。

如本文所揭露，此外，治療及/或免疫可包含抗體或抗體片段的施予以治療性處理GAS感染，例如藉由靶向在感染位置(例如，皮膚)的SpyCEP及/或結合M蛋白、其片段或變異體的抗體或抗體片段。

抗體及抗體片段可為多株(polyclonal)或單株(monoclonal)、自然或重組。抗體片段包含Fc、Fab或F(ab)2片段及/或可包含單一鏈Fv抗體(scFvs)。此scFvs可例如根據美國專利號5,091,513、歐洲專利號239,400或由Winter及Milstein，1991，自然349:293(Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293)的文章中分別所述的方法製備。抗體亦可包含多價重組抗體片段，例如二抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)及/或四抗體(tetrabodies)，其包含複數個scFvs以及二聚化活化半抗體(dimerisation-activated demibodies)(例如，WO/2007/062466)。例如，此抗體可根據Holliger等人，1993 Proc Natl Acad Sci USA90 6444；或Kipriyanov，2009 Methods Mol Biol562 177所述的方法製備。已知的實驗操作可基於例如Coligan等人的免疫學實驗操作手冊(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)的第2章(John Wiley及Sons NY，1991-1994)以及Harlow, E.及Lane, D.的抗體：實驗室手冊，冷泉港，冷泉港實驗室，1988(Harlow, E. & Lane, D.Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)應用於抗體產生、純化及使用。

產生多株抗體的方法為所屬技術領域中具有通常知識者已知。例示性實驗操作可使用例如Coligan等人的免疫學實驗操作手冊，同上，與Harlow及Lane，1988，同上，中所述。在特定實施例中，抗SpyCEP多株抗體可自個體暴露於A群鏈球菌或由A群鏈球菌感染的人類血清獲得或純化。替代地，多株抗體可在例如馬的產生物種中針對純化或重組SpyCEP或其免疫原性片段而產生，且接著在施予之前進行純化。

單株抗體可利用例如由Köhler及Milstein，1975， Nature256 ，495的文章中原始所述的標準方法或藉由例如在Coligan等人的免疫學實驗操作手冊，同上，所述的更最近的修改方法，藉由已接種本發明的一或多種的分離蛋白、片段、變異體或衍生物之永生化(immortalizing)脾臟或源自產生物種的其他抗體產生細胞而產生。因而，單株抗體可針對M蛋白片段、變異體或衍生物及/或根據本發明的用途之有利於回復或加強嗜中性球活性(例如，SpyCEP)之試劑而產生。在部分實施例中，單株抗體或其片段可為重組形式。若單株抗體最初由非人類哺乳類的脾臟細胞所產生，則其可特別有利於「人類化(humanizing)」單株抗體或片段。

於與治療性抗體有關的實施例，較佳的M蛋白片段可為p145胜肽。

用於抗體產生的SpyCEP的較佳片段可包含胺基酸序列 NSDNIKENQFEDFDEDWENF (SEQ ID NO：2)或由胺基酸序列 NSDNIKENQFEDFDEDWENF (SEQ ID NO：2)組成。

在部分實施例中，疾病、異常及症狀可為流行性感冒病毒相關的疾病、異常或症狀。流行性感冒病毒可導致已知為「流行性感冒(flu)」的傳播或其他傳染性疾病，其。典型的症狀包含發燒、頭痛、咳嗽、嗜睡、呼吸道及鼻咽的黏液產生以及分泌性肌肉疼痛、噁心及嘔吐。該症狀可持續數天或數周。在部分情況下，可能發生二次呼吸道細菌感染，在部分情況下，造成重度症狀，如肺炎。據此，本發明之免疫原性試劑及/或其用途可治療或預防如上述之流行性感冒病毒相關的疾病、異常或症狀。

在部分實施例中，疾病、異常或症狀可為鼻病毒相關之疾病、異常或症狀。鼻病毒(例如：A型鼻病毒及B型鼻病毒)微小核醣核酸病毒(Picornaviridae )家族病毒之腸病毒屬(genusEnterovirus )的物種。鼻病毒通常是一般感冒的致病因，其症狀與流行性感冒類似但較不嚴重且較少有機會造成二次細菌感染，如肺炎。

據此，本發明之免疫原性試劑及/或其用途可治療或預防如上述之鼻病毒相關疾病、異常及症狀。

在部分實施例中，疾病、異常或症狀可為鉤蟲相關疾病、異常或症狀。鉤蟲屬侵擾多種不同的動物的線蟲。通常感染人類的鉤蟲可包含美洲鉤蟲(Necator americanus )及十二指腸鉤蟲(Ancylostoma duodenalis )。鉤蟲具有鉤狀之口部以使鉤蟲附著於腸壁、刺穿血管並以血液為食，在部分情況下導致重度貧血。感染孕婦之鉤蟲可造成胎兒的成長遲緩、早產及低出生體重。感染孩童之鉤蟲可造成智能、認知及成長障礙。

據此，本發明之免疫原性試劑及/或其用途可治療或預防如上述之寄生蟲相關疾病、異常或症狀。

在部分實施例中，前述之用途可包含： (i) 包含單一或同樣病原之一或複數個不同的蛋白質、片段、變異體或衍生物之免疫原性試劑； (ii) 分別包含不同病原之一或複數個不同的蛋白質、片段、變異體或衍生物之複數個不同的免疫原性試劑；或 (iii) 包含不同病原之一或複數個不同的蛋白質、片段、變異體或衍生物之免疫原性試劑；其用於： (i) 誘發對一或多個病原之免疫反應； (ii) 針對一或多個病原之免疫；或 (iii) 預防或治療由一或複數個病原導致之一或複數種疾病、異常或症狀。

在部分態樣及實施例中，免疫原性試劑可以組成物之形式施予。

在特定實施例中，該組成物可包含： (i) 包含單一或同樣病原之一或複數個不同的蛋白質、片段、變異體或衍生物之免疫原性試劑； (ii) 分別包含不同病原之一或複數個不同的蛋白質、片段、變異體或衍生物之複數個不同的免疫原性試劑；或 (iii) 包含不同病原之一或複數個不同的蛋白質、片段、變異體或衍生物之免疫原性試劑；在一較佳型態，該組成物包含可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

藉由「可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(acceptable carrier, diluent or excipient )」係表示可安全地用在全身性施予的固態或液態填充物、稀釋劑或封裝物質。根據施予的特定途徑，可使用所屬技術領域中已知的各種載體、稀釋劑及賦形劑。其可選自包含糖類、澱粉類、纖維素及其衍生物、麥芽(malt)、明膠(gelatine)、滑石(talc)、硫酸鈣、植物油、合成油(synthetic oils)、多元醇(polyols)、海藻酸(alginic acid)、磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered solutions)、乳化劑、等張生理食鹽水(isotonic saline)及例如包含氫氯化物(hydrochlorides)、溴化物及硫酸鹽類(sulfates)的無機酸鹽類(mineral acid salts)、例如乙酸鹽(acetates)、丙酸鹽(propionates)及丙二酸鹽(malonates)的有機酸類之鹽類、水以及滅菌無熱原水(pyrogen-free water)的群組

描述可接受的載體、稀釋劑及賦形劑之有益參照為於此併入作為參考的Remington’s藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)( Mack Publishing Co. N.J. USA，1991)。

較佳地，為了誘發免疫反應的目的，部分免疫試劑可與本文所揭露的免疫原性試劑結合而用於製劑。

用語「免疫試劑(immunological agent )」包含如所屬技術領域中已知的其範圍內的載體、傳遞試劑(delivery agents)、免疫刺激物(immunostimulants)及/或佐劑。如所屬技術領域中已理解的，免疫刺激物及佐劑係指或包含一或多種加強免疫原性及/或製劑的有效性之物質。適合的免疫刺激物及佐劑的非限制例包含角鯊烷(squalane)和角鯊烯(squalene)(或植物源或動物源之其他油類)；嵌段共聚物(block copolymers)；例如Tween®‑80的洗滌劑；Quil® A、例如Drakeol或Marcol的礦物油、例如花生油的植物油；例如小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum )的棒狀桿菌衍生佐劑；例如痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acne )的丙酸桿菌衍生佐劑；牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis )(Bacille Calmette及Guerin或BCG)；百日咳博特氏桿菌(Bordetella pertussis )抗原；破傷風類毒素；白喉類毒素；例如十六烷基胺(hexadecylamine)、十八烷基胺(octadecylamine)、十八烷基胺基酸酯(octadecyl amino acid esters)、脫脂酸卵磷脂(lysolecithin)、溴化二甲基二十八烷基銨(dimethyldioctadecylammonium bromide)、N,N -雙十八烷基- N¢, N¢雙(2-羥乙基-丙二胺)(N,N -dicoctadecyl-N¢, N¢bis(2-hydroxyethyl-propanediamine))、甲氧基十六烷基甘油醇(methoxyhexadecylglycerol)以及普洛尼克多元醇(pluronic polyols)的表面活性物質；例如吡喃(pyran)、葡聚糖硫酸酯(dextransulfate)、聚IC卡波莫(poly IC carbopol)的多元胺類(polyamines)；例如胞壁二胜肽(muramyl dipeptide)及衍生物、二甲基甘胺酸(dimethylglycine)、特夫素(tuftsin)的胜肽；油乳化劑；以及例如磷酸鋁(aluminium phosphate)、氫氧化鋁(aluminium hydroxide)或明礬(alum)的礦物膠；例如介白素2及介白素12的介白素；例如介白素1的單核因子；腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor)；例如γ干擾素的干擾素；例如CpG DNA的免疫刺激DNA(immunostimulatory DNA)、例如皂素氫氧化鋁(saponin‑aluminium hydroxide)或Quil‑A氫氧化鋁(Quil‑A aluminium hydroxide)的組成物；脂質體；ISCOM®及ISCOMATRIX®佐劑；分支桿菌細胞壁萃取物；例如胞壁二胜肽或其他衍生物的合成醣肽(synthetic glycopeptides)；阿夫立定(Avridine)；脂質A衍生物；葡聚糖硫酸酯(dextran sulfate)；單獨或與磷酸鋁的DEAE‑Dextran；例如卡波莫' EMA(Carbopol' EMA)的羧聚乙烯(carboxypolymethylene)；例如Neocryl A640(例如，美國專利號No. 5,047,238)的丙烯共聚物乳液(acrylic copolymer emulsions)；例如蒙太得(Montanide) ISA 720的油中水型乳化劑(water in oil emulsifiers)；脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、疫苗或動物痘病毒蛋白(animal poxvirus proteins)；或其混合物。

免疫試劑可包含例如甲狀腺球蛋白(thyroglobulin)的載體蛋白；例如人類血清白蛋白(human serum albumin)的白蛋白；自破傷風、白喉、百日咳、假單胞菌(Pseudomonas )、大腸桿菌(E. coli )、葡萄球菌(Staphylococcus )及鏈球菌(Streptococcus )的毒素之毒素、類毒素或任何突變交叉反應性材料(CRM)；例如聚(離胺酸：麩胺酸)(poly(lysine:glutamic acid))的聚胺基酸；流行性感冒；輪狀病毒(Rotavirus) VP6、小病毒(Parvovirus) VP1及VP2；B型肝炎病毒(hepatitis B virus)核心蛋白；B型肝炎病毒重組疫苗等。替代地，可使用載體蛋白或其他免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可使用細菌毒素、類毒素或CRM的T細胞表位。在此方面，可參照於此併入作為參考的美國專利號第5,785,973號來製造。

任何適當的步驟為考慮用於生產疫苗製劑。例示性步驟包含例如於此併入作為參考的新一代疫苗(New Generation Vaccines) (1997，Levine等人，Marcel Dekker, Inc. New York，巴賽爾(Basel)，香港(Hong Kong))所述之步驟。

可採用任何安全的施予途徑，包含鼻內、口服、直腸(rectal)、非經口(parenteral)、舌下(sublingual)、經頰(buccal)、靜脈內(intravenous)、關節內(intra-articular)、肌肉內(intra-muscular)、真皮內(intra-dermal)、皮下(subcutaneous)、吸入(inhalational)、眼內(intraocular)、腹膜內(intraperitoneal)、腦室內(intracerebroventricular)、局部、粘膜及經皮施予，但不限於此。

劑型(Dosage form)包含片劑、分散劑、懸浮劑、注射劑、溶液、糖漿、錠劑、膠囊、鼻腔噴霧劑、栓劑(suppositories)、噴霧劑(aerosols)、經皮貼劑(transdermal patches)等。該劑型亦可包含注射或植入特別為此目的設計的控制釋出裝置或修改以額外地採取此方式植入的其他形式。控制釋出可因以包含丙烯酸酯樹脂(acrylic resins)、蠟、高級脂肪醇(higher aliphatic alcohols)、聚乳酸(polylactic acid)和聚乙醇酸(polyglycolic acids)以及例如羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethyl cellulose)的部分纖維素衍生物之疏水性聚合物包覆而影響。

組成物可以各含有本發明的一或多種治療性試劑的預定量之例如膠囊、囊劑(sachets)、功能性食品/飼料或片劑的分散單元、以粉末或顆粒或以在水性液體中的懸浮液、非水性液體、水中油乳液(oil-in-water emulsion)或油中水液體乳液(water-in-oil liquid emulsion)呈現。此製劑可以任何製藥方法製備，但所有方法包含將上述一或多種製劑與由一或多種需要成分構成的載體組合之步驟。通常，製劑藉由均勻且緊密地將本發明的製劑與液體載體或細碎的固體載體或兩者混合，且接著若需要，將產物成型為期望的形式來製備。

上述製劑可施予在與劑型相容的方式，且可以有效的劑量施用。在本發明的全文中，施予給患者的劑量應足以使患者在一段適當的時間產生有益反應的效果。試劑的量可依據治療的患者包含其年齡、性別、體重及通常健康狀況、依據醫師的判斷的因素來施予。

在特定實施例中，組成物適用於對個體鼻內施予。

如本文通常使用的用語「患者(patient )」、「個體(individual )」及「個體(subjec t)」為使用在全文中的接受本文所揭露的治療或製劑的任何哺乳類。因而，本文所揭露的方法及製劑可具有醫藥及/或獸醫的應用。在較佳形式中，哺乳類為人類。

因此本發明可參照下文非限制例製成而完全理解並達到實際效果。

示例

範例1導論

A群鏈球菌 (GAS)主要為感染上呼吸道(URT)黏膜，但亦會感染人類的皮膚，而造成疾病的普遍性。感染可能導致中毒性休克症候群、壞死性筋膜炎及肌炎。壞死性筋膜炎具有100,000分之1的發病率及高達70%的死亡率(1)。鏈球菌疾病後之風濕熱(RF)及風濕性心臟病(RHD)亦有極大關係。其估計每年有1560萬的RHD的流行案例及大約400,000死亡數(2)。URT的拓殖後最常見的疾病是咽炎及RF與RHD，其與未處理的原咽腔感染有密切的關連(3)。GAS感染及相關疾病是在發展中國家的熱帶地區流行，且在每年造成500,000死亡數的發展中國家的本土族群 (4)中凸顯出對疫苗的迫切需要。

GAS疫苗候選可區分成M蛋白質及非M蛋白類疫苗(5)。由3個主要域構成的捲曲螺旋蛋白之細胞表面M蛋白是主要的致病因子(6)。此蛋白是由高度變異胺基端及用於流行病學分子型(emm 或M型)的A重複域；B重複域及保留C重複域所組成(6)。根據臨床調查的領導次單元疫苗是胺基端M蛋白類多價疫苗及保留C重複的M蛋白胜肽疫苗(5)。該GAS疫苗候選基於其成功地誘發全身性免疫而已進入臨床試驗(7)。全身性免疫已證明透過在全身部位的血清免疫球蛋白(Ig)有效地預防GAS傳播至深部組織及預防疾病，但無法預防黏膜部位的拓殖因而無法預防人對人的傳染(8)。因此，全身性疫苗接種並非為誘發免疫對抗GAS的最佳方法。反之，對抗各種微生物施予鼻的黏膜疫苗有效地在全身性及黏膜腔室兩者誘發抗原專一性免疫反應(9-11)。由於雙層保護性免疫，對於對抗全身性及黏膜GAS感染兩者為理想策略，其具預防黏膜拓殖之額外效益亦將抑制自URT的飛沫及氣霧傳染(7)。黏膜疫苗接種在經濟上亦為有利的，其對於疫苗開發為重要的考量。由於藉由鼻部路徑施予疫苗較為容易，而可避免針頭的使用(7)。因其無疼痛，傳遞時病患會有較大的順從性。

如先前基於自M蛋白的保留C3重複域的最小化B細胞表位定義疫苗候選胜肽J8(12)。J8胜肽(QAEDKVKQSREAKKQVEKAL KQLEDKVQ；SEQ ID NO：1)為含有自位於GCN4 DNA結合蛋白序列側面的C區域(以粗體顯示)的12個胺基酸之嵌合胜肽，以維持正確的螺旋構形結構(13)。當連接至載體蛋白白喉類毒素(DT)且與明礬(Alum)施予時，J8誘發保護小鼠免於因多發性GAS菌株的全身性及皮膚激發之IgG抗體(4, 13)。此外，當與動物限定(animal-restricted)黏膜佐劑CTB施予(14, 15)或當作為蛋白酶體(proteasomes)施予(16)時，基於GAS的M蛋白的保留區域之疫苗候選有效地保護對抗因GAS的鼻內感染。當誘發黏膜免疫及降地URT拓殖時，辨識出與IgA的產生相關。有鑑於此，本目的為發展一種J8類、人類可相容的黏膜疫苗。

然而，在發展用於人類的黏膜疫苗的限制之一為缺乏安全且有效的黏膜佐劑(17, 18)。

脂質體是由生物相容的磷脂質雙層所構成的球形囊泡且可裝載及傳遞親水性及疏水性分子兩者(19)。磷脂質經由鼻內途徑安全地對人類施予(20, 21)。然而，呈現胜肽抗原的脂質體對於誘發胜肽專一性抗體反應不是理想的平台。胜肽可能僅含有可活化對於B細胞的抗體反應所需的輔助T細胞(helper T cells)之限制抗原表位。其需要共軛至「載體」蛋白，以在遠親(outbred)族群呈現其免疫原性且使其無法理想地適用於藉由脂質體呈現。然而，由於自然病原體亦為顆粒物且已被免疫系統認識，因此藉由例如脂質體的顆粒物賦予免疫原性增強是無庸置疑的(22)。使脂質體與抗原呈現細胞(antigen presenting cell)交互的自然趨勢是作為利用脂質體將抗原呈現給免疫系統的主要理論(23)。本研究的目標為發展一種J8類脂質體製劑(在佐劑的缺乏下)，其中親脂性J8構造是納入在脂質雙層中且親水性載體蛋白(DT)封裝在內部水性核心。材料與方法

小鼠。 所有動物操作由葛瑞菲斯大學研究倫理審查委員會的動物相關作業(Griffith University Research Ethics Review Board for Animal-Based Work)，GU Ref No: GLY/09/14/AEC批准使用。此研究是嚴格根據澳大利亞國家健康及醫學研究委員會(NHMRC)的實驗動物指導方針(National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia guidelines)進行。選擇對小鼠的疼痛及痛苦最小化的方法且動物是由受培訓的動物照護員每日觀察。小鼠是利用CO₂ 吸入室終止活動。

人類血液。 在具有書面告知同意下，在葛瑞菲斯大學健康中心(Griffith university health centre)由抽血員自捐贈者獲得血液。該研究的許可由葛瑞菲斯大學人類研究倫理委員會(Griffith University Human Research Ethics Committee)批准(GU HREC, Protocol # GLY/03/14/HREC)。樣本在實驗室人員處理之前去識別化(de-identified)。

J8-Lipo-DT 製劑。 為了促進使J8非共價複合至脂質體雙層，將由兩個棕櫚酸(C16)組成的疏水錨定物(hydrophobic anchor)加至在J8胺基端呈現的三肽間隔(由Lys Ser Ser組成)的離胺酸的ε(epsilon)及一級(primary)胺基(C16-C16-KSSJ8)。此構成由Chinapeptides Co., Ltd.(上海(Shanghai)，中國)所製造。該構成的預期分子量(MW 4061.97 g/mol)由ESI-MS確認，且獲得的產物具有大於95%純度(由分析曲線分析下的RP-HPLC面積)。脂質體利用薄膜水合法(thin film hydration method)製備(42)。自Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster，美國)的脂質以7 二棕櫚醯基-sn-甘油酸-3-磷酸膽鹼(DPPC)：2 膽固醇(CHOL)：1 L-α-磷脂醯甘油(PG)的莫耳比使用。三氯甲烷(chloroform (CHCl₃ ))溶液中的脂質是利用旋轉式蒸發器與預定量的C16-C16-KSSJ8一起塗佈在原底燒瓶(round-bottom flasks)。使用的量為在CHCl₃ 中0.7 ml的DPPC(10 mg/ml)、在CHCl₃ 中0.2 ml的CHOL(5 mg/ml)以及在CHCl₃ 中0.1 ml的PG (10 mg/ml)。脂質薄膜接著在室溫下藉由充分混合而水合且分散在含有預定量的DT之1 mL的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。合成脂質體懸浮液(resultant liposomal suspension)在16,162g 下離心10分鐘，移除上清液，且脂質體沉澱物(liposome pellet)再次懸浮在適當量的PBS中，以施予小鼠。為了定義DT封裝率，收集上清液且利用NanoDrop 2000 UV-Vis分光光度計(Thermo Scientific，Massachusetts，美國)定義在上清液中未封裝的DT量。將用於脂質的再水合的PBS中起始DT濃度減去上清液的DT濃度以產生脂質體預定量化的封裝率。脂質體的平均粒徑(nm)是在25°C下利用Nanosizer (Zetasizer Nano Series ZS，Malvern Instruments，英國(United Kingdom))以拋棄式毛細比色管(disposable capillary cuvettes)進行測定。尺寸是利用非侵入式反向散射系統(non-invasive backscatter system)且採取173°散射角度的測量進行分析。相關時間是基於每次運作10秒鐘且每次測量進行至少五次的連續運作。結果是利用分散技術軟體(Dispersion Technology Software )(Malvern Instruments，英國)分析重複三次獨立測量的平均。均質尺寸分布(Homogenous size distribution)是由J8-Lipo-DT所示的0.238的低多分散性指數(low polydispersity index) (PDI)定義。PDI為樣本尺寸分布為多狹窄的表示，且數值大於0.7表示樣品具有廣泛的尺寸分布。

小鼠的鼻內免疫。 B10.BR及BALB/c(動物資源中心(Animal Resources Centre)，西澳大利亞(Western Australia)，澳大利亞(Australia))是利用甲苯噻嗪(xylazine)及氯胺酮(ketamine)的混合物(xylazine：ketamine：H₂ O的1：1：10混合物)麻醉以進行免疫。小鼠施予在總體積20 µL PBS(10 µL/鼻孔)中單獨30 µg的J8-Lipo-DT，同時控制組小鼠施予20 µL 的PBS(10 µL/鼻孔)。陽性控制組(Positive control)小鼠接收在總體積20 µL PBS中的30 µg 的共軛至DT的J8與共施予(co-administered)的10 µg的CTB(Sigma Aldrich，St. Louis，美國)。小鼠在間隔21天以與初次免疫的相同方式接收兩次加強免疫(2 booster immunizations)。其他控制組為單獨接收上述等量的J8、DT或脂質體。

收集血清、唾液及糞便樣本。 在初次免疫之後20天、40天及60天收集血清，以定義J8-專一性全身性抗體的程度。血液是經由尾動脈(tail artery)收集小鼠的血液且允許在37 °C下凝集至少30分鐘。以1000g 離心10分鐘之後收集血清，在56 °C下熱不活化10分鐘且儲存在–20 °C。

小鼠施予毛果芸香鹼(pilocarpine)的0.1%溶液50 μL以誘發流涎。將唾液收集在含有2 μL的50 mmol/L苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF))蛋白酶抑制劑(Sigma Aldrich)的微離心管中。顆粒物質(Particulate matter)以13,000 g離心10分鐘來分離且將樣本儲存在−80°C。

自各個小鼠收集六至十個新鮮空隙糞粒、冷凍且接著凍乾。在糞便藉由渦流在5%無脂乾燥奶粉、50 mmol/L EDTA(Sigma Aldrich)、0.1 mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑(soyabean trypsin inhibitor)(Sigma Aldrich)以及2 mmol/L PMSF(20 μL/mg 的乾重)而再懸浮之前，測定糞便固體的乾重。固體物質以15,000g 離心10分鐘來分離。將上清液儲存在−80°C。

藉由酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA) 定義抗體效價。 如上所述，ELISA是用於測定J8-專一性血清IgG及黏膜IgA(43)。J8胜肽在碳酸酯塗佈緩衝液(carbonate coating buffer)，pH 9.6中稀釋成0.5 mg/ml，且在100 μl/孔的體積中塗佈在聚碳酸酯(polycarbonate)板上，在4°C下放置一晚。移除未結合的胜肽且將孔以150 μl的5%脫脂奶粉PBS-Tween 20在37°C下進行阻隔2小時。接著將板以PBS-Tween 20緩衝液清洗3次。將樣本以0.5%脫脂奶粉PBS-Tween 20緩衝液在板中進行序列稀釋，對血清開始為1:100的起始稀釋至1:12,800的最終稀釋，對於唾液/糞便樣本為1:2至1:256。各樣本稀釋成100 μl的最終體積且在37°C下培養1.5小時。將板清洗5次且加入以0.5%脫脂奶粉PBS-Tween20分別稀釋成1:3000或1:1000的過氧化物酶共軛山羊抗小鼠IgG或IgA(Invivogen，San Diego，美國)在37°C下1.5小時。在清洗之後，根據製造商的說明，加入100 μl的OPD基質(Sigma Aldrich)且避光在室溫下培養30分鐘。以Victor³ 1420多標記計數器(multilabel counter) (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences，Shelton，美國) 測定在450 nm的吸光度。效價是描述成最低稀釋度，其給予陰性控制組孔(negative control wells)(含有以PBS免疫的正常小鼠血清)的平均吸光度以上的＞3標準偏差(SD)的吸光度。顯著差異(p ＜ 0.05)是利用單因子變異數分析(one-way analysis of variance (ANOVA))與利用GraphPad Prism 5 軟體(GraphPad，加州，美國)的Tukey事後檢測來定義。

用於 GAS 激發的步驟。 免疫及控制組小鼠在初次免疫之後的63天以預定劑量的GAS菌株M1進行鼻內激發。GAS菌株M1已在小鼠脾臟中連續傳代以加強致病性，且進行耐鏈黴素(streptomycin-resistant)而可在喉部擦拭中使GAS可與正常鼠菌叢(murine bacterial flora)區分(44)。為了定義GAS拓殖，在激發之後的1天至3天自小鼠得到喉部擦拭。將喉部擦拭在含有2%去纖維蛋白(defibrinated)馬血的Todd-Hewitt瓊脂板上進行劃線接種且在37°C下培養一晚。鼻部流出的細菌負荷是藉由將各小鼠的鼻孔按壓在哥倫比亞血瓊脂(columbia blood agar (CBA))盤的表面上十次(重複三次CBA盤/小鼠/天)並將呼出的顆粒進行劃線接種來定義。在第3天犧牲小鼠，將器官樣本在PBS中均質且將樣本利用混稀平板法(pour plate method)塗盤重複三次。對於鼻部流出及喉部擦拭，結果是以10隻小鼠/組在1天、2天及3天的平均菌落形成單元(CFU) +平均標準差(SEM)來表示。對於器官樣本，結果是以10隻小鼠/組在第3天的平均CFU + SEM來表示。差異是以GraphPad Prism 5利用無母數、無配對的Mann-Whitney U檢定比較測試群組與PBS控制群組進行分析(p ＜ 0.05被認為具顯著性)。

DC 的製備及成熟。 末梢血液自健康志願者收集且藉由標準步驟透過Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典(Sweden))分次(fractionated)。藉由透過Ficoll Paque離心、清洗及再懸浮獲得每0.35 mL MACS緩衝液(Miltenyi Biotec S.L.，德國(Germany))為1 x 10⁸ 的最終密度的PBMC。DC是根據製造商的說明利用Pan DC分離套組(Miltenyi Biotec)分離。合成DC族群再懸浮在RPMI 1640 (Gibco，Gaithersburg，美國)完全培養基(具有2 mM 1-麩醯胺酸(l-glutamine)、1%非必須胺基酸(non-essential amino acids)、1% Pen-strep、10 mM HEPES)且補充10% FCS(Gibco)。將0.2 mL總體積的DCs (2 x 10⁶ )鋪開且隨後加入下列指示進行刺激：10 µg/mL的pIC(Invivogen，San Diego，美國)、J8-Lipo-DT (150 µg/mL)或單獨完全培養基刺激24小時。在24小時之後收集上清液並儲存在-20ºC。

藉由 流式細胞儀的免疫分型 (Immunophenotype) 分析。 對於各種標記的表面表現的分析，將處理的DC以一或多種下列螢光標記(fluorophore-labeled) mAb染色且藉由利用LSR Fortessa細胞儀(Becton Dickinson，加州，美國)及FlowJo軟體(Treestar, Inc.，加州，美國)的流式細胞儀進行分析。合成族群藉由利用下列抗體(Becton Dickinson)的流式細胞分析進行測定：抗-HLA-DR-V450、-CD1c-APC、-CD80-PE-Cy7、-CD83-PE-TexasRed、-CD86-PE、-CD123-Percp-5.5、-CD141-APC-Cy7。以適當的抗體在4°C下避光30分鐘進行染色之後，將細胞以PBS清洗兩次，且以1% 聚甲醛(paraformaldehyde)固定。框選(Gating)為大顆粒細胞(large granular cell)，且自各樣本收集2000–5000框選事件(gated event)。簡而言之，框選HLA-DR陽性細胞以定義人類DC且根據先前建立的方法進一步細分成CD141+1型習知DC(conventional DCs type 1)、CD1c+ 2型DCs習知(骨髓) DC以及CD123+漿細胞樣DC(45)。平均螢光強度(MFI)值定義在框選族群。數據以平均+ SEM報告，且差異是以GraphPad Prism 5 軟體(GraphPad，加州，美國) 利用學生t檢驗進行分析。小於0.05的P 值被認為具顯著性。

體外以抗原刺激脾細胞。 流式微球陣列(CBA)分析及流式細胞儀分析用於定量以J8胜肽刺激之後脾細胞產生的促發炎反應。簡而言之，在RPMI 1640培養基中製備自J8-Lipo-DT免疫小鼠的去除紅血球的脾臟的單一細胞懸浮液。將總體積0.1 mL的脾細胞 (4 x 10⁵ ) 鋪開且隨後加入下列指示進行刺激：2 µg/mL的LPS (Sigma Aldrich)、J8 (10 µg/mL)或單獨RPMI 1640 培養基刺激72小時。在72小時之後分離上清液且儲存在-80ºC，以用於CBA流式細胞分析。

以 CBA 定量分泌的化學激活素及細胞介素。 累積的發炎細胞介素的量根據製造商的說明進行定量。對於小鼠發炎套組CBA，將樣本及標準品的量縮減至10 μl，且各使用2 μl的捕獲珠(capture bead)。根據製造商的建議，將自人類DC細胞的上清液使用於人類發炎套組CBA(Becton Dickinson)。將樣本在LSR Fortessa細胞儀上運作，且數據以FCAP array (用於Windows的 v1.01)軟體(Becton Dickinson)進行分析。數據以平均+平均標準差(SEM)報告，且差異是以GraphPad Prism 5 軟體利用學生t檢驗進行分析。小於0.05的P 值被認為顯著性。結果

具有表面相關J8胜肽且含有白喉類毒素的脂質體(第1圖)如材料及方法所述的方式建構。施予的製劑每劑含有30 μg的J8，其利用棕櫚酸類部分(moiety)連結至脂質體表面。在內部，脂質體含有每劑30 μg的DT。脂質體的平均直徑由動態光散射測定(見材料與方法)為1.8 μm(標準偏差= 100.3 nm)。

利用初次及2次-加強方案，BALB/c小鼠(每組10隻)以J8-Lipo-DT及各控制組：單獨脂質體(Lipo)；脂質體封裝DT(Lipo-DT)；J8嵌入在脂質體的表面但不封裝DT(J8-Lipo)；J8-DT+CTB；PBS+CTB；以及PBS進行鼻內免疫。

為了評估J8-Lipo-DT與其他建構相比的效力，將鼻內疫苗接種的小鼠接著藉由自猩紅熱的病人得到的咽部分離M1 GAS菌株經鼻腔進行激發(16)。在激發之前，我們觀察到J8-Lipo-DT誘發比J8-Lipo更高的J8-專一性IgA(糞便及唾液)及血清IgG效價。雖然在J8-Lipo-DT與J8-Lipo之間的差在任何一組沒有統計上顯著性，但觀察到J8-Lipo-DT有較優異的唾液IgA反應、糞便IgA反應及血清IgG反應(第2圖A部分至C部分)。以GAS激發之後，在鼻內流出的細菌負荷，J8-Lipo-DT免疫小鼠與PBS組相比顯著地較低，而與J8-DT+CTB免疫的小鼠相當(第3天，第3圖A部分)。

然而令人驚訝的是，J8-DT+CTB免疫小鼠並未保護喉部或NALT的拓殖，反之J8-Lipo-DT免疫小鼠在兩個腔室皆顯示有顯著地預防拓殖(第3圖B部分及C部分)。由於J8-Lipo-DT的保護顯著優於由J8-Lipo誘發。鼠NALT對於持續性GAS感染是進入的入口(24)，且為人類扁桃腺的功能性同源(25)。因此，該結果凸顯J8-Lipo-DT在降低黏膜GAS感染的偏向位置(preferential site)的生物負荷(bio-burden)的效力。

接著我們探討J8-Lipo-DT是否同樣保護不同品系的小鼠。將J8-DT/CTB及PBS作為控制免疫原。B10.BR小鼠(n=5)以J8-Lipo-DT的免疫誘發顯著的J8-專一性抗體效價(第4圖)。在唾液及糞便樣本中的黏膜抗體效價與以J8-DT+CTB免疫的小鼠相當(第4圖A部分及B部分)。為了測試J8-Lipo-DT是否保護B10.BR小鼠免於GAS感染，將另一組小鼠(n=5)免疫並以GAS M1菌株激發。透過3天觀察期間監測鼻部流出及喉部擦拭。到第2天，J8-Lipo-DT及J8-DT+CTB免疫小鼠在鼻部流出已檢測不出生物負荷(第5圖A部分)。與BALB/c小鼠相似，數據亦證明J8-Lipo-DT免疫小鼠在激發後第2天的喉部擦拭中沒有細菌，反之J8-DT+CTB免疫小鼠在第3天的喉部擦拭中仍可檢測到GAS的量(第5圖B部分)。

先前研究證明，當封裝在脂質體中的胜肽無法誘發免疫球蛋白反應，脂質體加脂質A(lipid A)(脂多醣(lipopolysaccharides)的成分)在經腹腔(intra-peritoneal)免疫之後可誘發抗體反應(26)，因此表示脂質A的脂質尾端可作為佐劑。為了探討將J8固定在脂質體表面的雙C16脂質尾端是否負責抗體反應的誘發，將另一組小鼠以C16-C16-KSSJ8、J8-Lipo-DT、J8-DT+CTB或PBS進行免疫。我們觀察到J8-Lipo-DT 及J8-DT+CTB為免疫性，反之C16-C16-KSSJ8則無(第6圖A部分及B部分)。

測定自鼻內免疫小鼠的脾細胞的細胞介素反應，以定義鼻內免疫是否誘發全身性細胞免疫反應，其可解釋J8-Lipo-DT的自體佐劑性(self adjuvanticity)及對IgA的同型(isotype)抗體的開關。分析促發炎細胞介素 (γ干擾素(gamma interferon [IFN-γ])、介白素1[IL-1]、IL-6、IL-12p70、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1)[MCP-1]及腫瘤壞死因子α[TNF-α])。犧牲以J8-Lipo-DT免疫的B10.BR小鼠且將脾細胞以J8、LPS或培養基刺激。我們觀察到，對應於J8及LPS產生顯著的IFN-γ、MCP-1及IL-6(第7圖)。沒有檢測到評估的其他細胞介素。該結果證明，以J8-Lipo-DT的疫苗接種誘發促發炎反應，提供J8-Lipo-DT的自體佐劑性的潛在機制。尤其是，IL-6已知為負責開關IgA的抗體反應 (27)。此外，趨化物MCP-1已知在GAS防禦機制上扮演主要的角色(28)。

為了評估J8-Lipo-DT在人類具有自體佐劑活性以誘發有效的免疫反應的可能性，樹突細胞子集合自三位健康志願者的血液分離且以J8-Lipo-DT刺激。成熟DC為有效的抗原呈現細胞，其表現參與抗原呈現及有利於抗原識別及細胞之間交互作用(cell-cell interactions)之共同刺激的高量的細胞表面分子。為了描繪人類DC成熟的特性，對應於J8-Lipo-DT的各種細胞表面分子的調節藉由流式細胞儀測定(第8圖A部分至C部分)。利用合成的雙股RNA佐劑、多核糖腺苷酸-多核糖胞苷酸(pIC)作為控制組(29)。共同刺激分子CD80、CD83及CD86的量在以J8-Lipo-DT培養的CD123+漿細胞樣DC(pDCs)中顯著較高(第8圖A部分)。CD80的表現在CD141+典型1型DC及CD1c+典型2型DC的典型DC(cDC)的兩個子集合中亦增加(第8圖B部分至C部分)。此外，CD86表現在CD141+ DC亦增加(第8圖B部分)。

為了進一步確定與人類DC的交互作用，刺激後的促發炎細胞介素的量利用流式微球陣列評估。我們觀察到促發炎細胞介素(TNF-α、IL-6及IL-1 beta (IL-1 β))及嗜中性球趨化物IL-8的表現增加(第9圖)。嗜中性球已知為IgA控制GAS感染的關鍵(30)。亦觀察到抗發炎細胞介素IL10的量提升(第9圖)。其可能因在DC成熟步驟中IL-10的調節作用及制衡宿主促發炎反應(31, 32)。然而，特別是IL-6反應顯示J8-lipo-DT將引起人類的IgA開關，且與嗜中性球反應(經由IL-8)一起使宿主有利於控制GAS感染。如第10圖所示，當兩者作為單獨或作為S2-J8嵌合體(SEQ ID NO：3)呈現時，藉由與囊內DT一起的脂質體呈現的SpyCEP胜肽(S2； SEQ ID NO：2)誘發黏膜IgA反應。

參照第11圖，J8+S2-Lipo-DT誘發抗原專一性IgA、IgG反應。對應於J8-Lipo-DT及S2-Lipo-DT觀察到相當的免疫反應。不同製劑策略採用(i)在脂質體中的兩個表位(J8+S2-Lipo-DT)或(ii) J8/S2S2-Lipo-DT脂質體的混合物。

A群鏈球菌感染可能造成各種皮膚及軟組織感染，其中部分是嚴重的甚至危及生命。因此其有興趣觀察在以88/30菌株激發後，J8-Lipo-DT是否可預防皮膚感染。初始實驗採取僅包含DT及J8的脂質體的鼻內施予，在以J8-Lipo-DT的鼻內免疫後顯示顯著的IgG效價，但其在皮膚激發試驗中顯示沒有保護(未顯示數據)。目前正在進行透過不同脂質體製劑或透過經皮下給予的J8-DT+明礬的免疫來增強全身性IgG反應。討論

我們已發展一種對A群鏈球菌(GAS)的黏膜活化子單元脂質體疫苗候選。脂質體的免疫刺激特性與蛋白載體DT的封裝結合，且在脂質體表面上呈現GAS-專一性B細胞表位。胜肽及載體蛋白兩者為最佳免疫所需。藉由複合脂質體誘發的黏膜免疫優於藉由胜肽-蛋白質與CTB共軛施予的誘發。

黏膜免疫作為誘發保護性免疫以對抗感染性疾病的方式已吸引許多關注。絕大多數的感染發生在黏膜表面或從黏膜表面開始。因此，可誘發黏膜保護性免疫反應的疫苗應用為理想且實用的。尤其是，利用子單元胜肽抗原經常證明難以刺激強烈的黏膜IgA免疫反應且在黏膜疫苗接種成果的進度是令人失望的。其部分因相較於傳統的全生物體(whole-organism)基礎法，難以刺激有效的免疫反應。對於佐劑的添加及子單元抗原共軛至載體蛋白作為T細胞輔助的來源證明對於全身性免疫為有效的。然而，黏膜免疫的誘發需要新穎的策略。

與抗原相關的脂質體的地形位置(topographical position)影響抗原處理及對B細胞及輔助T細胞的呈現(33)。已證明的是，露出於脂質體表面上的抗原優先由B細胞處理及呈現，同時包覆抗原的脂質體藉由抗原呈現細胞而更有效地處理及呈現至T細胞(34)。因此，疫苗候選J8-Lipo-DT表現合理的子單元脂質體疫苗設計，確保B細胞表位與脂質體雙層相關而使結合至B細胞的Ig受體(receptor)露出，同時DT的包覆允許有效的傳遞、處理及呈現至T細胞。

我們已證明在URT組織中GAS的清除率，其包含NALT。藉由疫苗候選有效的鼻咽免疫有可能降低與主要咽部感染(primary pharyngeal infection)相關之RF及RHD的潛能(7)。在人類URT、扁桃腺為GAS的主要蓄積處，其在全球為持續的地方性疾病(25)。降低在人類扁桃腺的功能性同源的NALT中的GAS拓殖，暗示以J8-Lipo-DT鼻內免疫將降低人類扁桃腺的拓殖及感染，因此降低GAS的傳播(25)。

雖然先前已報告脂質體傳遞封裝胜肽以誘發細胞免疫反應，但除了有效的佐劑，例如脂質A的存在之外，該脂質體並未誘發IgA或IgG反應(26, 35)。由於J8上的脂質尾端可能提供佐劑活性，因而有助於J8-Lipo-DT的免疫原性；然而，在其所有的具有脂質尾端的J8胜肽並未證明對於脂質體製劑的免疫原性的需要。脂質體的自體佐劑免疫刺激活性已如先前報告且顯示是由於與抗原呈現細胞交互作用且誘發促發炎反應(36)。在本研究的體外測定顯示在免疫小鼠中誘發抗原特異性發炎化學激活素及細胞介素。值得關注的是，抗原專一性MCP-1及IL-6的分泌。MCP-1為對於淋巴細胞、單核細胞及抗原呈現細胞的趨化物(37)。先前相關的中介黏膜發炎，其已報告因顯著地增加黏膜IgA分泌而作為可能的黏膜佐劑(37)。

雖然抗原可藉由各種細胞類型呈現至免疫系統，但是主要的初始T細胞(naive T cell)需要成熟、抗原的呈現及僅在專業的抗原呈現細胞，例如DC上發現的共同刺激分子的參與(38)。DC為將先天性反應及適應性免疫反應與感染橋接的關鍵元素(39)。成熟DC產生發炎細胞介素、向上調控(up-regulate)共同刺激及抗原呈現分子且移動至淋巴結，其功能為作為對於初始T細胞的有效抗原呈現細胞，以起始適應性免疫反應。依據體外露出及包含IL-6及IL-8的促發炎細胞介素的誘發，我們已證明J8-Lipo-DT介導在人類DC上的細胞表面活化及成熟標誌的表現。人類及鼠的IL-6在B細胞最後分化(terminal differentiation)扮演關鍵角色，且在黏膜位置刺激其增生且在黏膜位置分泌IgA(27)。對抗GAS的IgA專一性免疫需要嗜中性球的存在(30)。IL-8在嗜中性球的補充及活化具有關鍵性。在此方面，SpyCEP S2胜肽(SEQ ID NO：2)的施予藉由單獨脂質體顆粒傳遞系統(particulate delivery system)或與J8胜肽誘發胜肽專一性IgA結合來呈現。

因此，在賦予人類對GAS感染的免疫性的基礎機制可利用脂質體平台進行介導，對臨床上的基礎研究的相關性有重要影響。

我們證明人類pDC在藉由J8-Lipo-DT刺激後增加成熟及共同刺激指標兩者。人類pDC容易吞噬及處理陷入在顆粒傳遞系統中的抗原(40)，其表示顆粒傳遞系統可用於促進將抗原有效傳遞至pDC。據我們所知，我們結果首次顯示可以脂質體類顆粒傳遞系統刺激人類pDC。人類pDC最初在血液中被辨識，隨後在脾臟、淋巴結及包含扁桃腺的黏膜位置被偵測到(41)。因此，脂質體類疫苗傳遞在人類中可潛在地利用於靶向用於期望的黏膜免疫反應之DC子集合。範例 2

實驗進行以研究脂質體尺寸對免疫原性的影響。

以熱阻斷(heat block)、1 mL注射器微擠製器(syringe mini-extruder)(Avanti Polar Lipids)進行脂質體擠製。將再水合溶液(rehydrated solution)透過50 nm、400 nm、1000 mm過濾器(Avanti Polar Lipids)通過11次，同時將熱阻斷設定在~40°C。脂質體尺寸測量以Nanosizer(動態光散射或DLS)執行。

如第12圖所示，可擠製J8-Lipo-DT以形成奈米至微米尺寸粒子。主要的粒徑具有窄分子-重量分布(narrow molecular-weight distribution)(＜ 0.3的低多分散性指數)。如第13圖所示的數據顯示J8-Lipo-DT尺寸不影響全身性IgG反應。然而，如第14圖所示，較大尺寸的脂質體誘發J8-專一性黏膜反應。範例 3

實驗進行以研究冷凍乾燥的脂質體對免疫原性的影響。脂質體薄膜以含有10% 海藻糖的milliQ水再水合且接著凍乾。在冷凍乾燥1週、4週及7週之後，將J8-Lipo-DT粉末復原在PBS中。

第15圖顯示脂質體尺寸的尺寸結果以Nanosizer(動態光散射或DLS)測定。主要的粒徑具有窄分子-重量分布(＜ 0.3的低多分散性指數)。第16圖顯示復原、冷凍乾燥的J8-Lipo-DT脂質體不添加佐劑而誘發J8-專一性全身性反應。其與新鮮製作的J8-Lipo-DT具有相當的免疫反應。海藻糖對於冷凍乾燥的J8-Lipo-DT的免疫原性為重要的。第17圖證明復原、冷凍乾燥的J8-Lipo-DT脂質體誘發J8專一性黏膜反應。範例 4

進一步實驗定義如第18圖示意性繪示含有先天免疫的醣脂活化劑，如海藻糖-6,6′-二山萮酸酯(TDB)及3D PHAD®的免疫原性脂質體的效力。TDB基於脂質體中的總磷脂質的%與脂質體進行製劑。使用9 mg的磷脂質且使用其20%比率的TDB (1.8 mg)。效力以免疫後的抗體效價測定(IgA及IgG抗體)且以GAS菌株進行皮膚激發實驗。數據顯示於第19圖。小鼠(每群組n=5)經30 µg的J8-Lipo-Dt+TDB經鼻內免疫。小鼠被初始(第0天)及加強兩次(第21天及第42天)施予。與J8-Lipo-DT相比，與TDB併用之結果在唾液及糞便樣本兩者的黏膜IgA反應顯著較高。該結果源於J8-Lipo-DT+TDB之冷凍乾燥粉末方案，其增進了脂質體的穩定性。

進一步實驗將定義含有例如脫氧膽酸鈉的膽鹽之免疫原性脂質體的效力。含有膽鹽脫氧膽酸鈉的脂質體示例示意性繪示於第20圖中。應被注意的是，免疫原性試劑(此例指J8胜肽)可被融合或接合至載體蛋白(例如：DT)或可呈現於脂質體表面上。當磷脂脫水以產生脂質體時，將膽鹽製劑在脂質體中(含有脂質體的膽鹽稱為「膽鹽體(bilosomes)」)。膽鹽體的製備如下。

具有150μg的以棕櫚酸部分修飾的J8的圓底燒瓶中，將山梨醇酐三硬脂酸酯(Sorbitan tristearate)(150 mmol)、膽固醇及雙十六烷基磷酸鹽(DCP)以莫耳比7:3:1溶解在10 mL三氯甲烷中。溶劑藉由旋轉蒸發器移除，以形成在原底燒瓶的玻璃表面上的薄膜。接著，將該薄膜以含有100 mg的脫氧膽酸鈉(膽鹽)的3.5 mL PBS(pH 7.4)與150 μg的白喉類毒素進行水合。範例 5

脂囊泡對於A型流行性感冒、B型流行性感冒及A群鏈球菌之免疫原性藉由抗原專一性唾液IgA效價測定。第21A圖及第21B圖繪示免疫原性試劑之示意圖，該免疫原性試劑包含具有自A型流行性感冒、B型流行性感冒及A群鏈球菌的每一個的各自免疫原之單一脂囊泡。第22圖所示之結果呈現包含來自A型流行性感冒、B型流行性感冒及A群鏈球菌的每一個之各自免疫原之脂囊泡(如第21A圖所示)誘導針對小鼠的上述各病原之免疫。如第21B圖示意性繪示，進一步研究將探究包含醣脂佐劑的免疫原性試劑的免疫原性。

結論，此成果為首次報告脂質體類的黏膜活化GAS疫苗候選。我們的發現在GAS疫苗的發展為克服目前障礙的重要步驟，以預防黏膜位置的感染及群落傳染。該研究提供脂質體微粒傳遞系統可如何共同地誘發期望的黏膜免疫反應以對抗GAS感染之重要機制性觀點。本文所載之策略相關於針對其他病原有機體之子單元黏膜疫苗的發展。非限制例包含前述之流行性感冒病毒、鼻病毒及鉤蟲。在部分實施例中，單一脂囊泡可包含針對複數個不同病原之免疫原。

在此說明書全文中，其目的為描述本發明之較佳實施例，而非將本發明限制於任一實施例或特徵的特定集合。在不脫離本發明的廣泛精神與範疇下，可對描述及本文所示的實施例進行各種的改變及修改。

本文所提及的所有計算機程式、演算、專利及科學文獻，其全部內容於此併入作為參考。參考資料

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30、Brandt ER等人(1999)，IgA抗體對在澳大利亞原始特有群落之A群鏈球菌的M蛋白中的保留表位的專一性的功能性分析。國際免疫學，11(4):569-576。(Brandt ER, et al. (1999) Functional analysis of IgA antibodies specific for a conserved epitope within the M protein of group A streptococci from Australian Aboriginal endemic communities.International immunology 11(4):569-576.)

31、Lyke KE等人(2004)，在具有嚴重惡性瘧疾及匹配複雜性瘧疾或健康控制組的馬里兒童的促發炎細胞介素介白素-1β (IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α及IL-12(p70)的血清量。感染及免疫72(10):5630-5637。(Lyke KE, et al. (2004) Serum levels of the proinflammatory cytokines interleukin-1 beta (IL-1beta), IL-6, IL-8, IL-10, tumor necrosis factor alpha, and IL-12(p70) in Malian children with severe Plasmodium falciparum malaria and matched uncomplicated malaria or healthy controls.Infection and immunity 72(10):5630-5637.)

32、Samarasinghe R等人(2006)，在類toll受體訊號之後在樹突細胞中的抗發炎細胞介素IL10的誘導。干擾素及細胞介素研究期刊：干擾素及細胞介素研究的國際協會官方刊物，26(12):893-900。(Samarasinghe R, et al. (2006) Induction of an anti-inflammatory cytokine, IL-10, in dendritic cells after toll-like receptor signaling.Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research 26(12):893-900.)

33、Dal Monte P及Szoka FC, Jr. (1989)，脂質體封裝在體外的抗原呈現的影響。藉由腹腔巨噬細胞及B細胞腫瘤呈現的比較。免疫學期刊(Baltimore, Md. : 1950) 142(5):1437-1443。(Dal Monte P & Szoka FC, Jr. (1989) Effect of liposome encapsulation on antigen presentation in vitro. Comparison of presentation by peritoneal macrophages and B cell tumors.Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 142(5):1437-1443.)

34、Harding CV；Collins DS；Slot JW；Geuze HJ及Unanue ER (1991)，脂質體封裝的抗原在溶酶體中的處理、回收及對T細胞的表現。細胞，64(2):393-401。(Harding CV, Collins DS, Slot JW, Geuze HJ, & Unanue ER (1991) Liposome-encapsulated antigens are processed in lysosomes, recycled, and presented to T cells.Cell 64(2):393-401.)

35、Ninomiya A；Ogasawara K；Kajino K；Takada A及Kida H (2002)，在小鼠中與抗CD40抗體一起封裝在脂質體中的合成胜肽疫苗的鼻內施予誘發抗流行性感冒A型病毒的保護免疫。疫苗，20(25-26):3123-3129。(Ninomiya A, Ogasawara K, Kajino K, Takada A, & Kida H (2002) Intranasal administration of a synthetic peptide vaccine encapsulated in liposome together with an anti-CD40 antibody induces protective immunity against influenza A virus in mice.Vaccine 20(25-26):3123-3129.)

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37、Stevceva L及Ferrari MG (2005)，黏膜佐劑。目前醫藥設計，11(6):801-811。(Stevceva L & Ferrari MG (2005) Mucosal adjuvants.Current pharmaceutical design 11(6):801-811.)

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45、Kassianos AJ；Jongbloed SL；Hart DN及Radford KJ (2010)，人類血液DC亞型的分離。分子生物學的方法(Clifton, N.J.) ， 595:45-54.。(Kassianos AJ, Jongbloed SL, Hart DN, & Radford KJ (2010) Isolation of human blood DC subtypes.Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 595:45-54.)

無

第1圖係為J8-Lipo-DT的理想化結構。脂質體封裝DT，同時附著在N端之間隔KSS的J8共價耦接至兩個棕櫚酸分子，以有利於J8插入至脂質體膜。

第2圖係為J8專一性抗體對個別BALB/c小鼠的反應。平均抗體效價(antibody titer)以柱狀圖表示。A) 為唾液的IgA效價。B) 為糞便的IgA效價。C) 為血清的IgG效價。統計分析係在Tukey事後檢測(Tukey post hoc test)後，利用單因子變異數分析(one-way ANOVA)進行(ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05；**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.001)。

第3圖係在BALB/C小鼠以M1 GAS菌株進行鼻內激發(intranasal challenge)之後的細菌負荷(Bacterial burden)。A) 為鼻部流出(Nasal shedding)。B) 為咽部擦拭。C) 為NALT的拓殖。以平均CFU + SEM表示10隻小鼠/群在第1天至第3天的喉部擦拭、鼻部流出以及第3天NALT的結果。統計分析係利用無母數(nonparametric)、無配對(unpaired)的Mann-Whitney U檢定進行測試群組與PBS控制群組的比較 (ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05；**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.001)。

第4圖係為J8專一性抗體對個別B10.BR小鼠(每群組n=5)的反應。平均抗體效價以柱狀圖表示。A) 為唾液的IgA效價。B) 為糞便的IgA效價。C) 為血清的IgG效價。統計分析係在Tukey事後檢測後，利用單因子變異數分析進行(ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05；**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.001)。

第5圖係為URT GAS激發(challenge)模式評估以M1菌株進行鼻內激發後的細菌負荷。A) 為B10.BR小鼠的鼻部流出。B) 為B10.BR小鼠的喉部擦拭。以平均CFU + SEM表示5隻小鼠/群在第1天至第3天的結果。統計分析係利用無母數、無配對的Mann-Whitney U檢定進行測試群組與PBS控制群組的比較 (ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05)。

第6圖係為J8專一性抗體對個別BALB/c小鼠的反應。平均抗體效價以柱狀圖表示。A) 為唾液的IgA效價。B) 為血清的IgG效價。統計分析係在Tukey事後檢測後，利用單因子變異數分析進行(ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05；**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.001)。

第7圖係在免疫小鼠中抗原專一性分泌的化學激活素及細胞介素。將脾細胞(Splenocytes)平舖且隨後加入如下列指示進行刺激：LPS (2 µg/mL)、J8 (10 µg/mL)或單獨培養基。刺激72小時之後，分離上清液且利用流式微球陣列(cytometric bead array)(參照材料與方法)分析釋出的化學激活素或細胞介素的量(level)。統計分析利用學生t檢驗(Student’s t test)進行(ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05；**，p ＜ 0.01)。

第8圖係為以試劑及沒有以試劑處理在人類DC子集合(subsets)的表面標誌的量。隨後加入如下列指示進行刺激：聚肌苷酸：聚胞嘧啶核苷酸(Polyinosinic:polycytidylic acid) (pIC, 10 µg/mL)、J8-Lipo-DT (150 µg/mL)或單獨培養基。細胞表面標誌係在刺激24小時之後藉由流式細胞儀進行測定。A) 為CD123+漿細胞樣(plasmacytoid) DC。B) 為CD141+典型1型(classical type 1)DC。C) 為CD1c+典型2型(classical type 2 )DC。數值由自三個各自施予者± SEM總匯數據的平均螢光強度(median fluorescence intensities) (MFI)來表示。統計分析利用無母數、無配對的Mann-Whitney U檢定進行測試群組與培養基控制群組的比較(ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05；**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.001)。

第9圖係為J8-Lipo-DT在人類樹突細胞中誘發化學激活素及細胞介素的分泌。將樹突細胞鋪開(plated out)且隨後加入下列指示進行刺激：pIC (10 µg/mL)、J8-Lipo-DT (150 µg/mL)或單獨培養基。在刺激24小時之後分離上清液且利用流式微球陣列 (參照材料與方法)分析釋出的化學激活素或細胞介素的量。統計分析利用學生t檢驗進行(ns，p ＞ 0.05；*，p ＜ 0.05；**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.001)。

第10圖係為SpyCEP胜肽(S2；SEQ ID NO：2)脂質傳遞試劑誘發黏膜IgA反應。脂質體顯示棕櫚酸脂質化的S2胜肽或S2-J8嵌合體(chimera) (SEQ ID NO：3)的脂質體與囊內DT共同由鼻內施予至小鼠且測定S2專一性IgA效價。

第11圖係為J8+S2-Lipo-DT免疫原性試劑誘發小鼠中的抗原專一性IgA、IgG反應。

第12圖係為J8-Lipo-DT免疫原性試劑可擠製(extruded)以形成奈米(nano-)至微米(micro-)尺寸粒子。脂質體尺寸係以Nanosizer測定(動態光散射或DLS)測定。

第13圖係為J8-Lipo-DT免疫原性試劑的尺寸不影響全身性IgG反應。

第14圖係為較大尺寸的J8-Lipo-DT免疫原性試劑誘發J8專一性黏膜反應。

第15圖係為在PBS中重組的冷凍乾燥的J8-Lipo-DT粉末的尺寸分布。脂質體尺寸係以Nanosizer測定(動態光散射或DLS)測定。

第16圖係為重組、冷凍乾燥的J8-Lipo-DT脂質體免疫原性試劑於沒有額外的佐劑之情況誘發J8-專一性全身反應。

第17圖係為重組、冷凍乾燥的J8-Lipo-DT脂質體免疫原性試劑誘發J8-專一性黏膜反應。

第18圖係為包含醣脂佐劑海藻糖-6,6′-二山萮酸酯(TDB)之脂質體J8-Lipo-DT免疫原性試劑之示意圖。

第19圖係為TDB提升由J8-Lipo-DT誘發之黏膜IgA反應。小鼠(每群組n=5)以30 µg的J8-Lipo-DT+TDB經鼻內免疫。該小鼠在初始(第0天)及兩次加強(第21天及第42天)施予。與TDB併用之結果在唾液及糞便樣本兩者中比起施予J8-Lipo-DT呈現顯著較高的黏膜IgA反應。該結果源於J8-Lipo-DT+TDB之冷凍乾燥粉末方案，其消除脂質體的穩定性問題。

第20圖係為包含膽鹽脫氧膽酸鈉之脂質體免疫原性試劑之示意圖。

第21A圖為包含脂囊泡、囊內DT及複數個不同病原(亦即A型流行性感冒、B型流行性感冒及A群鏈球菌)之免疫原性蛋白，或來自其之免疫原性蛋白之單一免疫原性試劑的示意圖；第21B圖為包含脂囊泡、囊內DT及複數個不同病原(亦即A型流行性感冒、B型流行性感冒、A群鏈球菌)之免疫原性蛋白或來自其之免疫原性蛋白與醣脂佐劑(海藻糖-6,6′-二山萮酸酯(TDB)及單磷醯基3-去醯基-脂質A(Monophosphoryl 3-Deacyl Lipid A，3D-PHAD®))之單一免疫原性試劑的示意圖。

第22圖係藉由抗原專一性唾液IgA效價(antigen-specific salivary IgA titre)的測量比較針對A型流行性感冒、B型流行性感冒及A群鏈球菌之單一免疫原性試劑(“Multivax”)的免疫原性與針對A型流行性感冒、B型流行性感冒及A群鏈球菌的每一個之單獨免疫原性試劑的個別疫苗(“Single Antigen-vax”)的比較。

＜110＞格里菲斯大學(Griffith University) ＜120＞脂質體疫苗＜130＞ 31639TW3 ＜150＞ AU2015904403 ＜151＞ 2015-10-27 ＜150＞ TW105111153 ＜151＞ 2016-04-08 ＜150＞ AU2016901026 ＜151＞ 2016-03-18 ＜160＞ 15 ＜170＞ PatentIn 版本 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 28 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞合成胜肽＜400＞ 1 Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val 1 5 10 15 Glu Lys Ala Leu Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Gln 20 25 ＜210＞ 2 ＜211＞ 20 ＜212＞ PRT ＜213＞化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes) ＜400＞ 2 Asn Ser Asp Asn Ile Lys Glu Asn Gln Phe Glu Asp Phe Asp Glu Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Phe 20 ＜210＞ 3 ＜211＞ 48 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞合成嵌合胜肽＜400＞ 3 Asn Ser Asp Asn Ile Lys Glu Asn Gln Phe Glu Asp Phe Asp Glu Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Phe Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Ser Arg Glu Ala 20 25 30 Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Gln 35 40 45 ＜210＞ 4 ＜211＞ 20 ＜212＞ PRT ＜213＞化膿性鏈球菌＜400＞ 4 Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Glu 20 ＜210＞ 5 ＜211＞ 27 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞合成胜肽＜400＞ 5 Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Cys 20 25 ＜210＞ 6 ＜211＞ 27 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞合成胜肽變異型＜400＞ 6 Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Lys Gln Ser Arg Glu Ala Lys Cys 20 25 ＜210＞ 7 ＜211＞ 27 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞合成胜肽變異型＜400＞ 7 Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Lys Gln Ser Arg 1 5 10 15 Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Cys 20 25 ＜210＞ 8 ＜211＞ 27 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞合成胜肽變異型＜400＞ 8 Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Asp Ala Ser Arg 1 5 10 15 Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Cys 20 25 ＜210＞ 9 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞模擬胜肽(Modeled peptide) ＜400＞ 9 Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys 1 5 ＜210＞ 10 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞模擬胜肽＜400＞ 10 Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys 1 5 ＜210＞ 11 ＜211＞ 24 ＜212＞ PRT ＜213＞ A型流行性感冒病毒(Influenza A virus) ＜400＞ 11 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 ＜210＞ 12 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ B型流行型感冒病毒(Influenza B virus) ＜400＞ 12 Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly 1 5 10 15 Phe Leu Glu ＜210＞ 13 ＜211＞ 31 ＜212＞ PRT ＜213＞鼻病毒(Rhinovirus) ＜400＞ 13 Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Asn Gln Asn 1 5 10 15 Ile Leu Thr Asn Gly Ser Asn Gln Thr Phe Thr Val Ile Asn Tyr 20 25 30 ＜210＞ 14 ＜211＞ 24 ＜212＞ PRT ＜213＞鼻病毒＜400＞ 14 Gly Ala Gln Val Ser Arg Gln Asn Val Gly Thr His Ser Thr Gln Asn 1 5 10 15 Met Val Ser Asn Gly Ser Ser Leu 20 ＜210＞ 15 ＜211＞ 22 ＜212＞ PRT ＜213＞美洲鉤蟲(Necator americanus) ＜400＞ 15 Thr Ser Leu Ile Ala Gly Leu Lys Ala Gln Val Glu Ala Ile Gln Lys 1 5 10 15 Tyr Ile Gly Ala Glu Leu 20

無

Claims

一種免疫原性試劑，其適用於施予至一哺乳類，該免疫原性試劑包含一或複數個免疫原性蛋白、其片段、其變異體或其衍生物、一脂囊泡、一載體蛋白或其片段或其變異體。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其適用於鼻內施予。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其能在該哺乳類中誘發黏膜免疫反應。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該載體蛋白係位於一囊內空間。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該載體蛋白係為白喉類毒素(DT)。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段、其變異體或其衍生物係呈現於該脂囊泡的表面上。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段、其變異體或其衍生物係融合或接合於該載體蛋白。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該脂囊泡係為一脂質體。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其包含病原之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物，或自該病原之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其包含複數個不同病原的每一個之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物，或自該複數種不同病原的每一個之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物。
如申請專利範圍第9項所述之免疫原性試劑，其中該病原係為細菌、病毒或寄生蟲。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫性蛋白、其片段或其變異體係為A群鏈球菌M蛋白的片段、變異體或衍生物。
如申請專利範圍第12項所述之免疫原性試劑，其中該片段係在一J8胜肽或J8胜肽變異體中、或包含該J8胜肽或J8胜肽變異體。
如專利申請範圍第13項所述之免疫原性試劑，其中該J8胜肽係為或包含胺基酸序列QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO：1)或主要由胺基酸序列QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO：1)所組成。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白係為或包含有利於恢復或加強嗜中性球活性的試劑。
如申請專利範圍第15項所述之免疫原性試劑，其中有利於恢復或加強嗜中性球活性的該試劑係為SpyCEP的蛋白或SpyCEP片段。
如申請專利範圍第16項所述之免疫原性試劑，其中該SpyCEP片段係為或包含胺基酸序列 NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO：2)或主要由胺基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO：2)所組成。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段或其變異體包含SpyCEP片段及M蛋白片段以作為單一的嵌合胜肽。
如申請專利範圍第18項所述之免疫原性試劑，其中該嵌合胜肽係為或包含胺基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO：3)或其變異體、或主要由胺基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO：3)或其變異體所組成。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段或其變異體係為流行性感冒病毒之免疫原性蛋白、片段或變異體。
如申請專利範圍第20項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段或其變異體係為或包含胺基酸序列 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO：11)或PAKLLKERGFFGAIAGFLE(SEQ ID NO：12)或主要由胺基酸序列 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO：11)或PAKLLKERGFFGAIAGFLE(SEQ ID NO：12)所組成。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段或其變異體係為鼻病毒之免疫原性蛋白、片段或變異體。
如申請專利範圍第22項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段或其變異體係為或包含胺基酸序列GAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINY(SEQ ID NO：13)或 GAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSL(SEQ ID NO：14)或主要由胺基酸序列GAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINY(SEQ ID NO：13)或 GAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSL(SEQ ID NO：14)所組成。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段或其變異體係為鉤蟲之免疫原性蛋白、片段或變異體。
如申請專利範圍第24項所述之免疫原性試劑，其中該免疫原性蛋白、其片段或其變異體係為或包含胺基酸序列TSLIAGLKAQVEAIQKYIGAEL(SEQ ID NO：15)或主要由胺基酸序列 TSLIAGLKAQVEAIQKYIGAEL (SEQ ID NO：15)所組成。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其進一步包含一先天性免疫活化劑。
如申請專利範圍第26項所述之免疫原性試劑，其中該先天性免疫活化劑係為或包含一醣脂。
如申請專利範圍第26項所述之免疫原性試劑，其中該先天性免疫活化劑係為海藻糖-6,6′-二山萮酸酯(TDB)或脂質A醣脂佐劑。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其進一步包含一膽鹽。
如申請專利範圍第29項所述之免疫原性試劑，其中該膽鹽係為脫氧膽酸鈉。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其為冷凍乾燥或凍乾的。
如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑，其製成選定的尺寸或在選定的尺寸範圍中。
一種組成物，其包含如申請專利範圍第1項所述之免疫原性試劑。
如申請專利範圍第33項所述之組成物，其包含一單一免疫原性試劑，該單一免疫原性試劑包含同一病原之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物，或來自該同一病原之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物。
如申請專利範圍第33項所述之組成物，其包含一單一免疫原性試劑，該單一免疫原性試劑包含複數個不同病原之每一個的一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物，或來自該複數個不同病原之每一個的一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物。
如申請專利範圍第33項所述之組成物，其包含個不同的複數免疫原性試劑，該複數免疫原性試劑分別包含不同病原之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物，或自該不同病原之一或複數個免疫原性蛋白片段、其變異體或其衍生物。
一種根據申請專利範圍第1項至第32項中任一項所述之免疫原性試劑或根據申請專利範圍第33項至36項中任一項所述之組成物用於製造誘發對於哺乳類中的一或複數個病原之免疫反應的藥劑的用途。
一種根據申請專利範圍第1項至第32項中任一項所述之免疫原性試劑或根據申請專利範圍第33項至36項中任一項所述之組成物用於製造針對一或複數個病原免疫哺乳類之藥劑的用途。
一種根據申請專利範圍第1項至第32項中任一項所述之免疫原性試劑或根據申請專利範圍第33項至36項中任一項所述之組成物用於製造治療或預防哺乳類中因一或複數個病原所引發之感染的藥劑的用途。
如申請專利範圍第37項所述之用途，其中該藥劑可經鼻內施予至該哺乳類。
如申請專利範圍第37項所述之用途，其中該免疫原性試劑誘發黏膜免疫反應。
如申請專利範圍第37項所述之用途，其中該哺乳類係為人類。
如申請專利範圍第38項所述之用途，其中該藥劑能經鼻內施予至該哺乳類。
如申請專利範圍第38項所述之用途，其中該免疫原性試劑誘發黏膜免疫反應。
如申請專利範圍第38項所述之用途，其中該哺乳類係為人類。
如申請專利範圍第39項所述之用途，其中該藥劑能經鼻內施予至該哺乳類。
如申請專利範圍第39項所述之用途，其中該免疫原性試劑誘發黏膜免疫反應。
如申請專利範圍第39項所述之用途，其中該哺乳類係為人類。