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TW201705955A - 包含吡咯啶－２，５－二酮ｉｄｏ１抑制劑及抗－ｐｄ１／抗－ｐｄ－ｌ１抗體之組合療法 - Google Patents

包含吡咯啶－２，５－二酮ｉｄｏ１抑制劑及抗－ｐｄ１／抗－ｐｄ－ｌ１抗體之組合療法 Download PDF

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TW201705955A
TW201705955A TW105114801A TW105114801A TW201705955A TW 201705955 A TW201705955 A TW 201705955A TW 105114801 A TW105114801 A TW 105114801A TW 105114801 A TW105114801 A TW 105114801A TW 201705955 A TW201705955 A TW 201705955A
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TW
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cancer
antibody
dione
pyrrolidine
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TW105114801A
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English (en)
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曼弗德 卡盧斯
珊卓拉 克威柏格斯
史堤法諾 克洛席那尼
蓋格瑞 崔瑞瑟斯
Original Assignee
輝瑞大藥廠
埃帝歐斯醫療公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮化合物與抗-PD1抗體或抗-PD-L1抗體之組合，其係作為經選擇之抗癌或抗病毒劑。本發明亦提供此等組合用於治療及/或預防癌症及子宮內膜異位之用途。

Description

包含吡咯啶-2,5-二酮IDO1抑制劑及抗-PD1/抗-PD-L1抗體之組合療法
本發明係關於利用IDO1抑制劑(吲哚胺2,3-二加氧酶1)之組合療法。
吲哚胺2,3-二加氧酶1(IDO1)為含有血紅素之胞內單體性酶，其會沿著犬尿胺酸途徑催化L-色胺酸(Trp)分解代謝的第一步驟及限速步驟，因而導致產生N-甲醯基犬尿胺酸。95% Trp係藉由此犬尿胺酸途徑代謝。犬尿胺酸途徑(KYN)會啟動神經活性及免疫調節代謝物(統稱為犬尿胺酸)之產生，並且提供補充用於NAD+及NADP+之生物合成的膳食菸酸的前驅體。
藉由局部消耗色胺酸及增加犬尿胺酸，諸如樹突狀細胞(腫瘤引流淋巴結中之漿囊DC)之抗原呈現細胞(APC)表現之IDO1可大大影響T細胞增殖及存活率並且活化調節T細胞，由此減輕促炎性反應。IDO1因此可向經受慢性發炎(諸如傳染性及過敏性疾病、移植及癌症)之組織提供「免疫特權」。因為此類耐受性反應可預期已多種生理病理條件操作，所以經IDO1之色胺酸代謝及犬尿胺酸製造可代表免疫與神經系統之間的關鍵界面。IDO1之表現經促炎性細胞激素上調並 且可在多種組織中偵測到，包括胎盤、脾臟、胸腺、肺、消化道以及中樞神經系統(Munn等人.Trends Immunol,2013,34,137-43中綜述)。
IDO1已作為用於治療癌症以及特徵為以下之其他疾病的新穎治療劑的有前景分子目標出現：局部Trp含量降低及/或犬尿胺酸途徑產生之細胞毒性代謝物含量的不平衡(Munn等人.Trends Immunol,2013,34,137-43中綜述)。已在許多疾病之臨床前模型中使用最常使用之IDO1抑制劑(色胺酸類似物L-1-甲基色胺酸(L-1MT))測試作為治療性策略的IDO1活性的實際抑制。用單獨或與其他試劑組合之L-1MT治療尤其減輕關節炎、缺血性再灌注損傷、內毒素休克、人類免疫缺陷病毒(HIV)/猴免疫缺陷病毒(SIV)感染、氣道發炎以及癌症(Uyttenhove等人，Nat Med,2003,9,10,1269-1274；Holmgaard等人，J Exp Med,2013,210,7,1389-1402)動物模型中的疾病嚴重程度。對於癌症，在同種異體腫瘤排斥反應期間活體內已觀測到IDO1誘導，表明此酶在腫瘤排斥反應過程中之可能作用(Uyttenhove等人，Nat Med,2003,9,10,1269-1274；Holmgaard等人，J Exp Med,2013,210,7,1389-1402)。與周邊血液淋巴細胞(PBL)共同培養之子宮頸癌細胞(或HeLa細胞)藉由上調IDO1活性獲得免疫抑制表型。咸信用介白素-2(IL2)治療時的PBL增殖減少由腫瘤細胞回應於PBL的γ干擾素(IFN)-g(γ)分泌釋放的IDO1引起。腫瘤細胞中之IDO1活性因此可用於削弱抗腫瘤反應，抗腫瘤反應為IFNg起主要作用之過程。IDO1的基於腫瘤免疫抗性機制之色胺酸分解之進一步證據來自以下觀測結果：大部分人類腫瘤組成性表現IDO1，以及免疫原性小鼠腫瘤細胞的IDO1表現防止其排斥反應(Munn等人，Front Biosci,2012,4,734-45；Godin-Ethier等人.Clin Cancer Res 2011,17,6985-6991；Johnson等人.Immunol Invest 2012,41,6-7,765-797中綜述)。此作用伴隨著缺乏特異性T細胞在腫瘤部位積聚並且可以藉由在無明顯毒性存在下用IDO1 抑制劑對小鼠進行全身處理來部分恢復(Holmgaard等人，J Exp Med,2013,210,7,1389-1402)。
已藉由免疫組織化學在廣泛範圍之癌症患者中證實IDO1表現。在尤其患有惡性黑色素瘤、急性骨髓性白血病、胰臟癌、結腸直腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、腦癌、子宮內膜癌及卵巢癌之患者體內已偵測到IDO1 mRNA、蛋白質或色胺酸及犬尿胺酸之比率的改變。在若干惡性疾病中，IDO1之存在為更糟臨床結果的獨立預測因子(Munn等人，Front Biosci,2012,4,734-45中綜述)。
因此，需要針對癌症治療及/或預防之新穎治療方案。
本文之方案及組合物幫助滿足診斷患有癌症之患者或處於發展癌症之風險中的任何個體中的方案的目前需要。
在一個態樣中，組合包含(a)3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮；以及(b)至少一種第二活性藥物，其為抗-PD-1或抗-PD-L1抗體，例如艾維路單抗(avelumab)。視情況而言，組合可包括選自以下之額外免疫調節劑：抗-CTLA4抗體、抗-OX-40抗體、抗-4-1BB抗體、抗癌抗原疫苗、P-鈣黏素LP-雙重親和力重新靶向蛋白、TDO抑制劑或抗體-藥物結合物(ADC)。
在一個實施例中，另一免疫調節劑為抗-CTLA4抗體，例如伊派利單抗(ipilimumab)或曲美單抗(tremelimumab)。在另一實施例中，第二活性藥物為抗-PD-L1抗體，諸如艾維路單抗。在另一態樣中，第三活性劑為p53癌症疫苗。
在另一實施例中，提供組合方案，其包含(a)3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮，(b)艾維路單抗，及視情況選用之(c)第三活性藥物，其為選自以下之信號調節抑制劑：Pi3K/mTOR抑制劑、Pi3K-α選擇性抑制劑、MEK抑制劑、zeste同系物2之強化子(EZH2)抑制劑、 表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑或細胞週期素依賴性激酶CDK4及CDK6之選擇性抑制劑。在另一實施例中，第三試劑為細胞週期素依賴性激酶CDK4及CDK6之選擇性抑制劑，例如帕博西里(palbociclib)。在另一實施例中，第三試劑為alk/rosi抑制劑，例如克卓替尼(crizotinib，Xalkori)、色瑞替尼(ceritiib，Zykadia)、艾樂替尼(alectinib，Chugai)或洛拉替尼(lorlatinib，Pfizer)。
在另一實施例中，提供組合方案，其包含(a)3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮，(b)抗-PD-1或抗-PD-L1抗體(例如艾維路單抗)，以及視情況存在之(c)第三活性藥物，其為依魯替尼或化學治療劑。在一個實施例中，化學治療劑選自烷基化劑，例如替莫唑胺或微管蛋白靶向劑多烯紫杉醇。
在另一態樣中，組合包含作為3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮的外消旋物(-)-(R)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮、(S)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮或其混合物與抗-PD-1或抗-PD-L1抗體(例如艾維路單抗)之組合。視情況而言，此等化合物中之一或多個具有取代氫原子之氘原子，即例如在其對掌性中心處視情況氘化。
在另一實施例中，提供包含式II'之化合物及/或式II"之化合物的組合。組合物可含有外消旋化合物。或者，組合物可含有分別製造的式II'及式II"之化合物的混合物。此類化合物可含有如外消旋物中存在的1：1比率之式II'比式II"，或R-對映異構體可以超過50%的量存在。在另一替代方案中，組合物可含有超過50% S-對映異構體。視情況而言，外消旋物或對映異構體中的一個或兩個可在例如對掌性碳處經氘化。
本發明之其他態樣及優勢將自以下本發明實施方式顯而易見。
圖1為顯示用化合物2與抗-CTLA4抗體之組合或用單獨試劑和媒劑對照物處理後，小鼠體內同系CT26腫瘤內犬尿胺酸濃度之圖式。
圖2為顯示用化合物2及鼠類抗-CTLA4抗體組合處理後，與媒劑相比的鼠類結腸癌模型中存活率之圖式，使用2000mm3腫瘤尺寸截止值。
圖3為顯示接收化合物2、鼠類抗-CTLA4抗體或其組合的Balb/c小鼠中CT26腫瘤之腫瘤生長的圖式。
圖4為顯示用化合物2及鼠類抗-CTLA4抗體組合處理後鼠類結腸癌模型中存活率之圖式，使用400mm3腫瘤尺寸截止值。
圖5A-5E顯示IDO1抑制劑及抗-PD-L1(艾維路單抗)在Balb/c小鼠中的sc CT26同系小鼠結腸腫瘤模型中的組合抗腫瘤作用。圖5A顯示接收化合物1(第二條線)、人類抗-PD-L1抗體(艾維路單抗；從底部起第二)或其組合(底部線)之小鼠中與媒劑(頂部線)相比的腫瘤生長抑制，每組n=10，隨機分組並且在腫瘤植入之後第9天開始處理。圖5B-5E顯示個別腫瘤生長曲線。此等結果顯示艾維路單抗及外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮之療法用此等2種試劑之組合加強。
圖5F-5G顯示CT26腫瘤中的PD調節。腫瘤組織中升高的Kyn含量降低充當外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮介導之IDO抑制的近端生物標記。亦觀測到有效血漿L-犬尿胺酸調節。非腫瘤攜帶小鼠中的血漿Kyn含量由灰色點劃線指示。用ANCOVA進行統計分析。
圖6說明作為抗-PD-L1治療之可能抗性機制的IDO活性。圖6A說明如升高之Kyn含量所證實，MC38腫瘤中抗-PD-L1治療升高之IDO1活性之後的活性觀測到藉由抗-PD-L1將免疫調節與IDO1活性機械地聯繫起來。(n=10；幾何平均值顯示；治療第14天)。圖6B顯示抗-PD- L1處理後MC38腫瘤中整體IDO1表現提高。在第24天藉由nanostring技術對腫瘤(n=3)進行分析，使用nCounter小鼠Pan癌症免疫分析組定量基因表現轉錄物含量。
圖7A-7F顯示IDO1抑制劑外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮營救T細胞-SKOV3共培養物分析法中之T細胞增殖。經輻照之IDO1表現SKOV3細胞與人類PBMC以1：1之比率在CD3/CD28珠粒存在下共培養並且提高外消旋物之濃度。使用三種不同濃度之人類血清(10%、25%或50%)模擬人類中蛋白質結合的結果。圖7A顯示PBL於10% HS中之增殖。圖7B顯示PBL於25% HS中之增殖。圖7C顯示PBL於50% HS中之增殖。藉由在共培養48小時後併入3H-胸苷來測量T細胞增殖。測定T細胞增殖之IC50、色胺酸(Trp)降低及犬尿胺酸(Kyn)增加。圖7D說明10% HS中的Trp至Kyn轉化。圖7E說明25% HS中的Trp至Kyn轉化。圖7F說明50% HS中Trp至Kyn轉化。共培養24小時後，使用LC-MS/MS評定清液層中的色胺酸及犬尿胺酸濃度。
圖8A-8E顯示CT26植入小鼠腫瘤模型中使用外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮與抗-PD-L1處理組合的IDO抑制。對於活體內實驗，將5×105個CT26細胞再懸浮於無補充RPMI中並且使用胰島素注射器皮下注射(100μl)。將小鼠隨機分組並且當腫瘤達到100至120mm3+/-50mm3平均值時開始處理。抗體處理由間隔3天的3次腹膜內注射200μg抗小鼠PDL1組成。IDO1抑制劑(化合物1)在Methocel媒劑(Colorcon)中再懸浮且超音波處理，且在早晨及傍晚藉由經口管飼(100μl)每日兩次(BID)處理小鼠直至模型結束。抗-PD-L1抗體純系為10F.9G2。圖8B顯示劑量及處理時程。圖8C顯示對照組(媒劑處理小鼠)之個別腫瘤生長曲線。圖8D顯示抗-PD-L1處理小鼠。圖8E顯示用外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮及抗-PD-L1療法組合處理之作用。
圖9A-D為顯示如使用在PMA+離子黴素及高爾基體傳輸抑制劑存在下培育3小時後CD4+及CD8+ T細胞中的胞內IFN-γ讀數測定IDO1抑制劑及抗-PD-L1之組合處理特異性引起腫瘤中而非外周(例如脾臟)中的活化T細胞增加的點狀圖。在組合抗-PD-L1及IDO1抑制劑處理之後，CT26腫瘤中CD4+IFNγ及CD8+IFNγ+ T細胞之分數提高。
圖10為顯示與抗-PD-L1抗體及4-1BB抑制劑共投與的所測試IDO1抑制劑的組合益處與抗-4-1BB及抗-PD-L1處理比較的圖式。
圖11A-11B為存活率曲線，其顯示為了與IDO1抑制劑組合，抗-PD-L1抗體及4-1BB抑制劑相較於抗-4-1BB及抗-PD-L1處理的增加的中位存活率。圖11A顯示用4-1BB、IDO1抑制劑或兩種活性組分之組合處理的動物的存活率百分比。圖11B說明用單獨IDO1抑制劑、4-1BB及抗-PD-L1之雙組分組合或4-1BB、抗-PD-L1抗體及IDO1抑制劑的三向組合處理之動物的存活率百分比。
組合
提供包含至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物及抗-PD-1或抗-PD-L1抗體之組合。視情況而言，組合可含有至少一種第三活性組分，其可為不同IDO抑制劑或可具有另一主要功能並且具有一些次要IDO抑制功能。舉例而言，此類組合可包括美國專利公開案第2015/0329525A1號中所述之IDO抑制劑，其主張2014年5月15日申請的美國臨時專利申請案第61/996,976號或其2015年5月14日申請的相應PCT申請案(目前作為WO2015/173764公開)之權益，該等申請案皆題為吡咯啶-2,5-二酮衍生物、醫藥組合物及用作IDO1抑制劑之方法(pyrrolidine-2,5-dione derivatives,pharmaceutical compositions and methods for use as IDO1 inhibitor)。在一個實施例中，此等IDO抑制劑中的一或多個可用於本文所述之組合中，該組合含有抗-PD-1或 抗-PD-L1抗體，視情況具有至少一種其他不同活性組分。視情況而言，與抗-PD-1或抗-PD-L1抗體之組合中可包括超過一種不同IDO抑制劑。更佳地，組合含有單一IDO抑制劑、抗-PD-1或抗-PD-L1抗體及視情況存在之另一活性組分，其來自具有不同作用模式的不同類別之活性藥物。通常，在此類組合療法中，作為至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物的第一活性組分與抗-PD-1或抗-PD-L1抗體調配至各別醫藥組合物或藥劑中。當各別地調配時，至少兩種活性組分可視情況經不同途徑同時或依序投與。視情況而言，組合中之各活性組分的治療方案具有不同但重疊之傳遞方案，例如每日、每日兩次對比單次投與或每週一次。第二活性組分(抗-PD-L1抗體)可在至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物之前、實質上同時或之後傳遞。
本文亦提供含有單種或更多多種適用於組合療法之活性組分之調配物，以及用於治療癌症、子宮內膜異位或病毒感染之治療性及/或預防性方案。
如本文所用之術語「組合療法」或「組合治療」或「組合」表示使用至少兩種相異治療劑同時或並行治療的任何形式。本文所述之組合的範疇內預期進一步至少包括至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物及抗-PD-1或抗-PD-L1抗體作為第二活性組分的組合。視情況而言，組合方案中可使用三種或三種以上組分。另外，本文提供之組合可與其他類型之治療結合使用。舉例而言，在與用於患者的目前護理標準有關的其他治療中，其他抗癌處理可選自由以下組成之群：化學療法、手術、放射療法(輻射)及/或激素療法。類似地，對於抗病毒處理，其他抗病毒劑或其他處理。
化合物
在一個實施例中，本文提供之組合含有至少一種3-(5-氟-1H-吲哚 -3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物與抗-PD-1或抗-PD-L1抗體之組合。在一個實施例中，抗-PD-L1抗體為艾維路單抗。
如本文所用，術語「3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮」係指具有以下結構之外消旋化合物： ，或其對映異構體、其醫藥學上可接受之鹽或溶劑，其中任一者視情況經氘化。在一個實施例中，化合物為游離鹼，即既不為鹽亦不為溶劑合物形式。
3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物可為外消旋物，其中各立體異構體以約50莫耳%(48%至52%)之量存在。或者或另外，醫藥組合物中使用化合物之各別對映異構體。
在一個實施例中，(R)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮對映異構體特徵為式II'之結構： 其以游離鹼(非鹽)形式存在。視情況而言，化合物以其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式存在。
在另一實施例中，(S)對映異構體另外或替代地存在於組合物中。此(S)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮對映異構體特徵在於式II"之結構：
其為游離鹼形式。視情況而言，化合物以其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式存在。醫藥組合物可含有式II'及式II"化合物之混合物。
已發現此等化合物具有下表1中所提供的生物活性。
在200μM初始濃度下在Cerep全配位體特徵篩選中評估外消旋3- (5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物在受體組中之脫靶藥理學活性、離子通道、轉運蛋白及酶(總計64個目標)。標明三個成功結果(由超過50%最大反應的反應定義)並且藉由Cerep進行追蹤曲線。結果表明輔助(脫靶)藥理學之低可能性。
亦已發現此外消旋化合物具有以下藥物動力學特徵。活體外吸收：評估Ralph-Russ犬腎臟(RRCK)細胞中之被動滲透率；高固有滲透率的頂部至底外側(A至B)值為25.5×10-6cm/s。CNS滲透：在雄性大鼠中研究CNS分佈。PF-06840002(活性)的腦比血漿及CSF比血漿的未結合AUC比率為0.20及0.49，並且對於PF-06840001(非活性)分別為0.21及0.56。此等結果指示CNS隔室可達。人類PK預測：經口投與外消旋物之後，活性對映異構體的預測CLp為0.64ml/min/kg並且Vss為1.03L/kg，t½ 19小時。經口給予外消旋物之後的活性對映異構體的生物可用性預計為64%。
從迄今進行的研究可以推斷外消旋物為具有極適宜PK特徵的選擇性IDO1抑制劑。化合物降低血漿及腫瘤中之犬尿胺酸(Kyn)含量。化合物具有約19小時的延長的預計人類半衰期t1/2，此將允許每天一次投與。化合物具有可能影響腦轉移瘤之CNS滲透。另外，針對PD-L1、CTLA4及4-1BB的檢查點拮抗劑/促效劑引起加強的IDO1表現及活性。化合物展現提高之體內抗腫瘤功效與抗-PD-L1、CTLA4及4-1BB之組合。更具體言之，在與aPD-L1、抗-CTLA4或抗-4-1BB共投與之後，腫瘤中之IDO/kyn含量經標準化。另外，用外消旋物及抗-PD-L1組合處理的腫瘤中觀測到較高比例之IFNγ分泌腫瘤細胞。
可以選擇多種比率的兩種化合物。舉例而言，比率可為約1：1，或式II'之化合物可以超過50%、超過95%、超過90%或約95%至100%存在。類似地，在其他組合物中，式II"化合物可以超過50%存在。本說明書上文中與式I及其子式之化合物相關的對映異構體的適合比率 及莫耳百分比的論述以引用的方式併入本文中。
如本文所述，除非另外規定，否則提及式II、II'及II"包括提及其氘化對應物。如本文所述，按異構體中之一者的莫耳比(約48至約52莫耳%，或約1：1比率)計，式II之外消旋化合物可含有約50%式II'之化合物及約50%式II"之化合物。在另一實施例中，組合物、藥劑或處理方法可涉及分別以大致相等的莫耳比(約48至52%)組合所產生的式II'及式II"化合物。在另一實施例中，藥劑或醫藥組合物可含有不同比率的各別式II'及式II"化合物的混合物。在一個實施例中，醫藥組合物含有過量(超過50%)R-對映異構體(式II')。適合莫耳比R/S可為約1.5：1、2：1、3：1、4：1、5：1、10：1或更高。在另一實施例中，醫藥組合物可含有過量S-對映異構體(式II")，其中針對R/S提供之比率顛倒。可選擇其他適合量之R/S。舉例而言，R-對映異構體可以至少約55%至100%，或至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、約95%、約98%或100%之量存在。在其他實施例中，S-對映異構體可按較高百分比，例如至少約55%至100%，或至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、約95%、約98%或100%之量存在。全部此等例示性實施例之間的比率以及比其高或低之比率同時仍在本發明內，全部包括在內。(如本文(上文及下文)所用之術語「比率」始終係指莫耳比)。組合物可含有外消旋物之混合物及各別呈游離鹼及/或鹽形式的式II'及/或式II"之化合物。
視情況而言，外消旋物或一種或兩種對映異構體可經氘化。與外消旋物一樣，氘化對映異構體可為游離鹼，或視情況為鹽或溶劑合物形式。下文實例中提供所說明之氘化外消旋化合物(3-2H)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮。其他氘化化合物可包括例如(-)-(R)-(3-2H)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮：
及(+)-(S)-(3-2H)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮：
不希望受理論約束，一種對映異構體(異構體或立體異構體)可在血漿中轉化成外消旋物及/或另一種對映異構體。咸信此等化合物之對掌性中心處的氘化會減緩個別立體異構體在血漿中轉化成外消旋物及/或另一種立體異構體。
此等化合物使用ChemBioDraw® Ultra 12.0版(PerkinElmer)命名。
其IDO1抑制化合物含有不對稱中心且因此以不同立體異構形式存在。因此，組合可包括全部可能立體異構體且不僅包括外消旋化合物，而且包括個別對映異構體亦及其非外消旋混合物。當希望組合物含有單個對映異構體時，其可藉由立體特異性合成、最終產物之解析或任何適宜中間物獲得，或藉由此項技術中已知的各對掌性層析法獲得。對最終產物、中間物或起始物質之解析可藉由此項技術中已知的任何適合方法進行。
IDO1抑制化合物可呈醫藥學上可接受之鹽形式。術語「醫藥學上可接受之鹽」意欲包括全部可接受之鹽，諸如可用作改良溶解度或水解特徵之劑型或可在持續釋放或前藥調配物中使用。式II化合物的 醫藥學上可接受之鹽包括鹼鹽，其形成無毒鹽，包括例如鋁、鈣、膽鹼、鎂、鉀、鈉、鋅以及四甲基銨氫氧化物。儘管需求較少，但可以選擇其他鹼，包括例如氨氣、乙二胺、N-甲基-麩醯胺酸、離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苯甲基苯乙基-胺、二乙胺、哌嗪、參(羥甲基)胺基甲烷、苯乍生(benzathine)、二乙胺、二乙醇胺、甘胺酸、離胺酸、葡甲胺、乙醇胺、緩血酸胺、2-(二乙胺基)乙醇、乙醇胺、嗎啉以及4-(2-羥乙基)嗎啉。鹼的半鹽亦可形成例如半鈣鹽。
本文所述之IDO1化合物的醫藥學上可接受之鹽可以藉由此等方法中的一或多種製備：(i)使式II化合物與所需鹼反應；(ii)藉由使用所需酸自式II化合物的適合前驅體移除酸不穩定或鹼不穩定保護基，或藉由使適合環狀前驅體(例如內酯或內醯胺)開環；或(iii)藉由與適當酸反應或藉助於適合離子交換管柱將式II化合物的一種鹽轉化成另一種鹽。
所有此等反應通常在溶液中進行。鹽可自溶液沈澱且藉由過濾收集，或可藉由蒸發溶劑來回收。鹽之離子化程度可在完全離子化至幾乎非離子化之範圍內變化。此等鹽可藉由標準程序，例如藉由使游離酸與適合有機鹼或無機鹼反應製備。另外，在存在醇基的情況中，可採用醫藥學上可接受之酯，例如乙酸酯、順丁烯二酸酯、特戊醯氧甲基及其類似物，且彼等酯在此項技術中已知用於改良溶解度或水解特徵以供用作持續釋放或前藥調配物。
另外，儘管游離鹼一般較佳，但應注意本發明之最廣泛含義亦包括非醫藥學上可接受之鹽，其可例如用於分離及/或純化本發明化合物。舉例而言，與光學活性酸或鹼形成之鹽可用於形成非對映異構 鹽，其可促進上述式II化合物的光學活性異構體的分離。
如本文所用，術語「游離鹼」係指化合物3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物(式II化合物)的非鹽形式。
亦可利用3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物(式II化合物)的醫藥學上可接受之前藥。
如本文所用，PD-L1拮抗劑或抑制劑為任何部分且阻斷漸進式細胞死亡蛋白質1配位體(PD-L1)之相互作用，該配位體表現於特定腫瘤細胞及其他免疫細胞上，其受體PD-1定位於經活化T細胞、B細胞及骨髓細胞上。此類拮抗劑可為小分子藥物(例如CA-170；Curis Inc)或抗-PD-L1抗體。如本文所用，抗-PD-L1抗體為結合PD-L1配位體且阻斷漸進式細胞死亡蛋白質1配位體(PD-L1)之相互作用的任何免疫球蛋白，該配位體表現於特定腫瘤細胞及其他免疫細胞上，其受體PD-1定位於經活化T細胞、B細胞及骨髓細胞上。此類抗-PD-L1抗體之實例可包括例如艾維路單抗(先前MSB0010718C，Merck/Pfizer)或以引用之方式併入的WO 2013/079174A1及US 2014/0241917中所述之抗體(Merck)，或MEDI4736(AstraZeneca)[WO2011/066389及US2013/034559中所述]，或拉立珠單抗。
任何免疫球蛋白中的抗-PD-1抗體結合於PD-1且阻斷與其配位體PD1及PD2之相互作用。在某些實施例中，另一類抗-PD-1拮抗劑(例如小分子)可取代抗-PD-1抗體。
術語「抗體」包括單株抗體(包括具有免疫球蛋白Fe區之全長抗體)、具有多表位特異性之抗體組合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體及單鏈分子)以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2及Fv)。術語「免疫球蛋白」(lg)在本文中可與「抗體」互換使用。基礎4鏈抗體單元為由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成的雜四聚醣蛋白。IgM抗體由5個基礎雜四聚單元以及稱為J鏈之額外多肽組 成，且含有抗原結合位點，而IgA抗體包含2-5個基礎4鏈單元，該單元可聚合形成與J鏈組合的多價群集。在lgG的情況下，4鏈單元一般為約150,000道爾頓。各L鏈經一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈視H鏈同型而定經一或多個二硫鍵彼此連接。各H鏈及L鏈亦具有有規律間隔之鏈內30個二硫橋鍵。各H鏈在N端具有可變域(VH)，接著為各a及y鏈之三個恆定域(CH)以及μ及E同型之4個CH域。各L鏈在N端具有可變域(VL)，接著在其另一端為恆定域。VL與VH比對，且CL與重鏈(CH1)之第一恆定域比對。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH及VL對一起形成單一抗原結合位點。對於不同類別之抗體的結構及特性，參看例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(編)，Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994，第71頁及第6章。來自任何脊椎動物物種之L鏈可基於其恆定域的胺基酸序列分配到兩個明確相異類型(稱為κ及λ)中之一者。視免疫球蛋白之重鏈(CH)之恆定域之胺基酸序列而定，其可歸為不同類別或同型。存在五種類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其分別具有命名為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。y及a類別基於CH序列及功能之相對次要差異進一步分成子類，例如人類表現以下子類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1以及IgK1。
在一個實施例中，抗-PD-L1抗體為艾維路單抗[CAS登記號1537032-82-2；FDA UNII KXG2PJ551I]。艾維路單抗為完全人類抗-PD-L1 IgG1單株抗體，獲自Merck/Pfizer。純系A-09-262-2之序列以及其製造及純化方法參看例如WO 2013/079174，其以引用的方式併入本文中。亦參看重鏈
SEQ ID NO：1：
輕鏈：SEQ ID NO：2： 。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體特徵為具有WO 2013/079174的含胺基酸序列SEQ ID NO：24之重鏈(上述SEQ ID NO：1中的前120個胺基酸)及含胺基酸SEQ ID NO：25的輕鏈(上述SEQ ID NO：2中的前110個胺基酸)。
用途
本文提供之組合療法包含至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物(即式II之外消旋化合物)作為第一活性成分及至少一種第二不同活性組分，其為如上文所定義之抗-PD-L1抗體。視情況而言，可選擇第三或額外活性成分，其來自與IDO抑制劑及抗-PD-L1抑制劑不同類別之化合物。在某些實施例中，組合中可使用超過一種IDO抑制劑。或者，組合療法利用R-對映異構體(式II')。在另一替代中，可選擇使用(R)-對映異構體與(S)-對映異構體之混合物。視情況而言，此等外消旋或對映異構化合物可例如在對掌性中心處經氘化。 在另一替代中，外消旋化合物與對映異構體中之一者或兩者之混合物與抗-PD-L1抗體及視情況選用之至少第三活性組分組合使用。
通常，在此類組合療法中，至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物及抗-PD-L1抗體，以及視情況選用之第三不同活性組分調配成各別醫藥組合物或藥劑。當各別地調配時，至少兩種活性組分可視情況經不同途徑以各別劑型形式同時或依序投與。
在一個實施例中，至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物以約0.025mg/kg至600mg/kg，或約1mg/kg至約250mg/mg，或每日劑量約10mg至約5000mg、約20mg至約1200mg，或約25mg至約800mg、約30mg至約675mg，或約400mg至約600mg範圍內之量傳遞給個體。然而，可視組合搭配物(即其他活性組分)選擇較高或較低之量。若藥物針對非經口途徑調配或藉由非經口途徑傳遞，則可能需要降低所傳遞之單元或日劑量量。因此，組合方案可涉及以下作為活性組分中之一者：外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮、(R)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮、(S)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮、(3-2H)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮、(R)-(3-2H)-(3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮、(S)-(3-2H)-(3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮或其混合物。
為了投與抗-PD1或抗-PD-L1 Ab與本文提供之IDO1抑制劑的組合，劑量可在約0.01至約20mg/kg、約0.1至約10mg/kg、約0.1至約5mg/kg、約1至約5mg/kg、約2至約5mg kg、約7.5至約12.5mg/kg或約0.1至約30mg/kg個體體重範圍內。舉例而言，劑量可為約0.1、約0.3、約1、約2、約3、約5或約10mg/kg體重，或約0.3、約1、約2、約3或約5mg kg體重。給藥時程通常基於Ab之典型藥物動力學特性設計成實現導致持續受體佔用(RO)之暴露。示範性治療方案需要約每週一次、約每2週一次、約每3週一次、約每4週一次、約一月一次、約 每3-6個月一次或更長投與。在某些實施例中，抗-PD-1抗體或抗-PD-L1抗體(諸如艾維路單抗)約每2週一次投與個體。在其他實施例中，Ab約每3週一次投與。在治療過程期間，劑量及時程可改變。當與IDO抑制劑及其他視情況選用之免疫調節劑/癌症藥物組合使用時，抗-PD-1 Ab或抗-PD-L1 Ab之劑量可相較於單一療法劑量降低。舉例而言，低於約每3週一次約3mg/kg，例如約每3週或4週一次約0.1mg/kg或更低的艾維路單抗之劑量視為亞治療劑量。在某些實施例中，抗-PD-1抗體或抗-PD-L1抗體之劑量為醫藥組合物中之固定劑量。在其他實施例中，本發明方法可以均一劑量(向患者給予的與患者體重無關的劑量)使用。
然而，在某些情境中需要將至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物及抗-PD-L1抗體及/或此等化合物中之一者及第三不同活性組分調配成單種調配物。因此，根據一個實施例，醫藥組合物及組合除了3-(6-5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物之外含有額外治療劑及/或活性成分。
在某些實施例中，抗-PD-1 Ab及IDO1抑制劑或抗-PD-L1抗體及IDO抑制劑之組合在誘導期約每2週或3週一次向個體靜脈內投與持續1、2、3或4次投與。在某些實施例中，組合在誘導期約每3週一次靜脈內投與持續約4次投與。誘導期之後為維持期，在此期間僅以約0.1、約0.3、約1、約2、約3、約5或約10mg/kg之劑量每兩週或每三週一次向個體投與抗-PD-1或抗-PD-L1抗體，只要治療證實有效或直至產生不可管理之毒性或疾病進展。
本文提供之組合利用包含化合物及/或藥物以及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑及/或助劑的醫藥組合物或藥劑。載劑在調配物的其他成分相容的意義上係「可接受的」並且在醫藥學上可接受之載劑的情況下，藥劑中所用之量對其接受者無害。
除了至少一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物及抗-PD-1或抗-PD-L1抗體的組合之外，此類組合視情況可含有一或多種額外醫藥劑或治療方法，諸如免疫調節劑。免疫調節劑可包括例如免疫抑制劑或免疫強化劑。此類免疫調節劑可包括例如抗-PD-1抗體(例如派立珠單抗(pembrolizumab)、尼沃單抗(nivolumab))、CTLA-4抗體、針對腫瘤壞死因子(TNF)受體4-1BB及Ox40之抗體(例如抗-OX-40抗體或抗-4-1BB抗體)、抗癌抗原疫苗、P-鈣黏素LP-雙重親和力重新靶向蛋白質、TDO抑制劑[參看例如14/076,016，2013年11月8月申請，目前作為US 2015/0133422A1公開；美國專利申請案第14/619589號，2015年2月11日申請，現作為US 2015/0225367A1公開；以及美國專利申請案第14/660,082號，2015年3月17日，現作為US 2015/0266857公開]，或抗體-藥物結合物(ADC)。儘管下文一些工作實例利用鼠類抗體，但此類抗體更好的適於在鼠類模型系統中進行研究，該系統代表人類患者中將觀測到的作用。因此，對於用於本文提供之抗癌(抗贅生性)組合，人類化或完全人類單株抗體可能較佳。在一個實施例中，免疫調節劑為抗-CTLA4抗體，例如曲美單抗(先前CP-675,206，完全人類IgG2 Mab)；伊派利單抗(MDX-0120；Medarex；Bristol-Myers Squibb。其他免疫調節化合物可包括阿西替尼(axitinib)、克卓替尼(crizotinib)、第二代多形性淋巴瘤(ALK)抑制劑。在另一態樣中，第二活性劑為p53癌症疫苗、p53抗原決定基疫苗及其他癌症疫苗(例如活化樹突狀細胞)。
其他免疫調節化合物可包括細胞激素療法(例如介白素(IL)，諸如IL-2、γ干擾素、β干擾素或GM-CSF)及/或酪胺酸激酶抑制劑。舉例而言，依魯替尼[亦稱為PCI-32765，目前由Janssen Pharmaceuticals以名稱Imbruvica®出售，用於經口投與]為TEC激酶家族抑制劑，包括布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)。
其他免疫調節化合物可包括阻斷免疫細胞遷移之抗癌劑，諸如趨化因子受體之拮抗劑(包括CCR2及CCR4)、或抗病毒劑、化學治療劑或其他抗癌劑、輻射、抗腫瘤以及抗病毒疫苗。
適合化學治療劑或其他抗癌劑包括例如烷基化劑(包括(但不限於)氮芥、乙烯亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯)，諸如尿嘧啶氮芥、雙氯乙基甲胺、環磷醯胺(CYTOXAN®)、異環磷醯胺、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、哌泊溴烷(pipobroman)、三伸乙基-三聚氰胺、三伸乙基硫代磷胺、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、鏈脲菌素(streptozocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、吉西他濱(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多西他賽(doclitaxel)以及替莫唑胺(temozolomide)。
本文所述之組合可進一步與疫苗療法組合使用。抗癌疫苗包括樹突狀細胞、合成肽、DNA疫苗以及重組病毒。一個實例為抗p53疫苗，例如其可經複製缺陷腺病毒載體傳遞。
本文提供之組合可包括共投與3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮化合物、抗-PD-1或抗-PD-L1抗體以及至少一種信號轉導抑制劑(STI)。「信號轉導抑制劑」為選擇性抑制癌細胞正常功能中的信號傳導路徑中的一或多個重要步驟，由此導致細胞凋亡的試劑。信號轉導抑制劑(STI)包括(但不限於)bcr/abl激酶抑制劑，諸如甲磺酸伊馬替尼(先前STI 571、Gleevec或Glivec)；表皮生長因子(EGF)受體抑制劑，諸如激酶抑制劑(Iressa、SSI-774)以及抗體(Imclone：C225及Abgenix：ABX-EGF)；her-2/neu受體抑制劑，諸如HerceptinTM(曲妥珠單抗)，以及法呢基轉移酶抑制劑(FTI)，諸如洛那法尼(lonafarnib)(CAS號193275-84-2)；手黴素A、提普替尼(tpifarnib)以及GGTI-297)；Akt家族激酶或Akt路徑之抑制劑；磷脂醯肌醇激酶抑制劑(Pi3K)之抑制劑、Pi3K-α選擇性抑制劑，以及mTOR路徑，諸如mTOR抑制劑雷帕 黴素(西羅莫司)或坦羅莫司(temsirolimus)；MEK抑制劑、zeste同系物2之強化劑(EZH2)的抑制劑、細胞循環激酶抑制劑，諸如夫拉平度(flavopiridol)；表皮生長因子(EGFR)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑或細胞週期素依賴性激酶CDK5及CDK6之選擇性抑制劑。在一具體實施例中，STI選自由以下組成之群：STI 571、SSI-774、C225、ABX-EGF、曲妥珠單抗、L-744,832、雷帕黴素、LY294002、夫拉平度以及UNC-01。
亦提供用於藉由投與本文提供之組合治療患者之慢性病毒感染的方法。尤其希望病毒感染包括與致癌特性有關的彼等感染。此類病毒感染之實例可包括尤其例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)(子宮頸癌)、人類免疫缺陷病毒(HIV)(例如卡波西肉瘤(Kaposi carcoma)、子宮頸癌、非霍奇金淋巴瘤、肛門癌、霍奇金病(Hodgkin disease)、肺癌、口及喉癌、皮膚癌、肝癌)、單純疱疹病毒(HSV)(肝癌、非霍奇金淋巴瘤)；人類疱疹病毒8(卡波西肉瘤相關)；人類T淋巴病毒-1(HTLV-1)(例如淋巴球性白血病及成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL))；梅克爾細胞多瘤病毒(皮膚癌)；以及埃-巴二氏病毒(EBV)(鼻咽癌、淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金淋巴瘤、胃中心)、水痘帶狀疱疹病毒及柯薩奇病毒(coxsackie virus))、猴病毒40(例如間皮瘤、腦瘤、骨骼癌以及淋巴瘤)。
藉助於非限制性實例，化合物、抗-PD-1或抗-PD-L1抗體以及任何其他視情況選用之活性藥物可調配成各別醫藥製劑，作為單一醫藥製劑或其混合物。可選擇適用於以下投與之任何形式，例如適於經口投與、非經腸投與(諸如靜脈內、肌肉內或皮下注射或靜脈內輸注)、局部投與(包括經眼)、吸入投與、皮膚貼、植入、栓劑等之形式。技術人員將明確此類適合投與形式(視投與方式而定可為固體、半固體或液體)以及用於其製備中的方法及載劑、稀釋劑及賦形劑；參考最 新版本之Remington's Pharmaceutical Sciences。
此類製劑之一些較佳但非限制性實例包括錠劑、丸劑、粉末、口含錠、藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣霧劑、軟膏、乳霜、洗劑、軟及硬明膠膠囊、栓劑、滴劑、推注投與及/或連續投與之無菌可注射溶液及無菌封裝粉末(其一般在使用之前復原)，其可與本身適於此類調配物之載劑、賦形劑及稀釋劑調配，諸如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙二醇、纖維素、(無菌)水、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯及丙酯、滑石、硬脂酸鎂、食用油、植物油及礦物油或其適合混合物。調配物可視情況含有醫藥調配物中通常使用之其他物質，諸如潤滑劑、濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、分散劑、崩解劑、膨化劑、填充劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、流量調節劑、脫模劑等。組合物亦可經調配從而提供其中所含之活性化合物的快速、持續或延時釋放。
醫藥製劑較佳呈單位劑型，且可適合地封裝於例如盒、泡罩、小瓶、瓶子、藥囊、安瓿中，或呈任何其他適合單次劑量或多次劑量保持器或容器(其可適當地經標識)；視情況呈試劑盒，其亦包含一或多個含有產物資訊及/或使用說明書之散頁資料。
視待預防或治療之病狀及投與途徑而定，不同活性化合物中之每一者可作為單個日劑量獨立地投與、分成一或多個日劑量投與或例如使用點滴基本上連續投與。
本發明亦提供組合用於治療及/或預防癌症或子宮內膜異位之用途。在一個實施例中，本文提供之組合適用於增加免疫認知及癌細胞的破壞。在一個實施例中，在本文提供之組合中，IDO1抑制化合物及/或抗-PD-1或抗-PD-L1組分提高至少一種第三活性組分之活性。
本文之組合適用作藥劑，尤其用於預防及/或治療癌症。
此項技術中已知多種癌症。癌症可為轉移性或非轉移性的。癌症可為家族性或偶發性的。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：白血病及多發性骨髓瘤。在一實施例中，癌症為白血病。在一個實施例中，癌症為多發性骨髓瘤。
可使用本文中提供之方法治療的額外癌症包括例如良性及惡性實體腫瘤以及良性及惡性非實體腫瘤。在一個實施例中，癌症為良性實體腫瘤。在一個實施例中，癌症為惡性實體腫瘤。在一個實施例中，癌症為良性非實體腫瘤。在一個實施例中，癌症為惡性非實體腫瘤。
實體腫瘤之實例包括(但不限於)膽道癌、腦癌(包括神經膠母細胞瘤及神經管胚細胞瘤)、乳癌、子宮頸癌、絨膜癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、上皮內贅瘤(包括鮑文氏病(Bowen's disease)及佩吉特氏病(Paget's disease))、肝癌、肺癌、神經母細胞瘤、口腔癌(包括鱗狀細胞癌)、卵巢癌(包括由上皮細胞、基質細胞、胚細胞以及間葉細胞產生之癌症)、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌(包括腺癌及威爾姆斯腫瘤(Wilms tumour))、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤及骨肉瘤)、皮膚癌(包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基質細胞癌以及鱗狀細胞癌)、睪丸癌，包括胚細胞瘤(精原細胞瘤以及非精原細胞瘤，諸如畸胎瘤及絨膜癌)、基質腫瘤、生殖細胞腫瘤，以及甲狀腺癌(包括甲狀腺腺癌及髓性癌)。
在一個實施例中，癌症為膽道癌。在一個實施例中，癌症為腦癌，包括神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤及神經管胚細胞瘤。在一個實施例中，癌症為乳癌。在一個實施例中，癌症為子宮頸癌。在一個實施例中，癌症為絨膜癌。在一個實施例中，癌症為結腸癌。在一個實施例中，癌症為子宮內膜癌。在一個實施例中，癌症為食道癌。在一個實施例中，癌症為胃癌。在一個實施例中，癌症為上皮內贅瘤，包 括鮑文氏病及佩吉特氏病。在一個實施例中，癌症為肝癌。在一個實施例中，癌症為肺癌。在一個實施例中，癌症為神經母細胞瘤。在一個實施例中，癌症為口腔癌，包括鱗狀細胞癌。在一個實施例中，癌症為卵巢癌，包括由上皮細胞、基質細胞、胚細胞以及間葉細胞產生之癌症。在一個實施例中，癌症為胰臟癌。在一個實施例中，癌症為前列腺癌。在一個實施例中，癌症為直腸癌。在一個實施例中，癌症為腎癌，包括腺癌及威爾姆斯腫瘤。在一個實施例中，癌症為肉瘤，包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤以及骨肉瘤。在一個實施例中，癌症為皮膚癌，包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤、基質細胞癌以及鱗狀細胞癌。在一個實施例中，癌症為睪丸癌，包括胚細胞瘤(精原細胞瘤及非精原細胞瘤，諸如畸胎瘤及絨膜癌)。在一個實施例中，癌症為基質腫瘤。在一個實施例中，癌症為生殖細胞腫瘤。在一個實施例中，癌症為甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌及髓性癌。在某些實施例中，本文提供之組合適用於治療腦轉移瘤。
非實體腫瘤之實例包括(但不限於)血液贅瘤。如本文所用，血液科贅瘤為包括淋巴性病症、骨髓病症及AIDS相關白血病之技術術語。
淋巴性病症包括(但不限於)急性淋巴球性白血病及慢性淋巴增生病症(例如淋巴瘤、骨髓瘤及慢性淋巴性白血病)。淋巴瘤包括例如霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤淋巴瘤及淋巴球性淋巴瘤。慢性淋巴性白血病包括例如T細胞慢性淋巴性白血病及B細胞慢性淋巴性白血病。
在一個實施例中，淋巴性病症為急性淋巴球性白血病。在一個實施例中，淋巴性病症為慢性淋巴增生病症(例如淋巴瘤、骨髓瘤及慢性淋巴性白血病)。在一個實施例中，淋巴瘤為霍奇金氏病。在一個實施例中，淋巴瘤為非霍奇金氏淋巴瘤。在一個實施例中，淋巴瘤 為淋巴球性淋巴瘤。在一個實施例中，慢性淋巴性白血病為T細胞慢性淋巴性白血病。在一個實施例中，慢性淋巴性白血病為B細胞慢性淋巴性白血病。
亦提供用於延遲個體體內癌症發作之方法，包含向有需要之個體投與醫藥學上有效量的本文提供之組合。
亦提供組合用於調節3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮)化合物之IDO抑制活性的用途。因此，根據另一特徵，為用於提高3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮)化合物在需要此治療之個體體內之IDO1活性，其包含向該個體投與有效量的本文提供之組合。
以下術語具有以下含義： 本文使用術語「溶劑合物」描述含有化學計量或亞化學計量量之一或多種醫藥學上可接受之溶劑分子(諸如乙醇)的化合物。術語「水合物」係指當該溶劑為水時。
如本文所用之術語「前藥」意謂式II化合物的活體內生物轉化產物產生生物活性藥物的藥理學上可接受之衍生物，諸如醯胺。前藥一般特徵為生物可用性增加且容易活體內代謝成生物活性化合物。
如本文所用，術語「前藥」意謂將經改質形成藥物物質的任何化合物，其中改質可在身體內部或外部進行，並且在前藥到達指定藥物投與之身體區域之前或之後進行。
術語「個體」係指哺乳動物，較佳人類。在一個實施例中，個體可為「患者」，即溫血動物，更佳人類，其等待接收或正在接收醫學護理或已經/正在/將成為醫學程序之目標，或被監測疾病發展。
術語「人類」係指兩種性別及任何發育階段(即新生兒、嬰兒、幼兒、青少年、成人)之個體。
如本文所用之術語「治療」意欲包括減輕、緩解或消除病狀或疾病及/或其伴隨症狀。
如本文所用之術語「預防」係指延遲或阻止病狀或疾病及/或其伴隨症狀發作、阻礙個體獲得病狀或疾病或降低個體獲得病狀或疾病之風險的方法。
如本文所用之術語「治療有效量」(或較簡單地稱為「有效量」)意謂在所投與之個體體內足以實現所要治療或預防作用的活性劑或活性成分之量。
術語「投與(administration)」或其變體(例如「投與(administering)」)意謂向打算治療或預防病狀、症狀或疾病之個體提供單獨或作為醫藥學上可接受之組合物之部分的活性劑或活性成分。
「醫藥學上可接受」意謂醫藥組合物之成分彼此相容並且對所投與之個體無害。
術語「抑制劑」係指具有抑制或顯著減輕或下調基因及/或蛋白質表現之生物學作用或具有抑制或顯著降低蛋白質生物活性之生物學作用的天然或合成化合物。因此，「IDO1抑制劑」係指具有抑制或顯著降低或下調編碼IDO1之基因的表現及/或IDO1之表現及/或IDO1之生物活性的生物學作用的化合物。
「D」及「d」皆係指氘。「dx.y」係指經x至y數目個氘原子取代。「立體異構體」係指對映異構體及非對映異構體兩者。當基團之一或多個氫原子經相應數目之取代基原子(若取代基為原子)或基團(若取代基為基團)置換時，基團經取代基「取代」。舉例而言，「經氘取代」係指一或多個氫原子經相應數目之氘原子置換。
措辭「包含」應解釋為包括在內而非排他性的。措辭「由……組成」及其變體應解釋為排他性的而非包括在內。
如本文所用，除非另外規定，否則術語「約」意謂從指定參考值變化10%。
實例
參考以下實例將更好地理解本發明。此等實例打算代表本發明之特定實施例，並且不打算限制本發明之範疇。
I. 化學實例
如下獲得下文所述之實例中提供的MS資料：質譜：LC/MS Agilent 6110(ESI)或Waters Acquity SQD(ESI)
如下獲得下文所述之實例中提供的NMR資料：使用Bruker Ultrashield TM 400 PLUS及Bruker Fourier 300MHz及TMS作為內標。
在來自Biotage之單模微波反應器引發劑微波系統EU上進行微波化學方法。
除非另外報導，否則使用來自Waters並且裝備有XbridgeTM Prep C18 OBD管柱19×150mm 5μm的質量引導之自動純化Fractionlynx進行製備型HPLC純化。全部HPLC純化使用CH3CN/H2O/NH4HCO3(5mM)、CH3CN/H2O/TFA(0.1%)或CH3CN/H2O/NH3 H2O(0.1%)梯度進行。
化合物1：3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮
A. 途徑A
在微波反應中，在170℃下攪拌5-氟-1H-吲哚(300mg；2.22mmol)、順丁烯二醯亞胺(646mg；6.65mmol)於AcOH(2mL)中之混合物2小時。將反應混合物真空濃縮。殘餘物用NaHCO3飽和水溶液中和到pH 7~8且用EtOAc(10mL×3)萃取。經合併之有機層經無水Na2SO4乾燥，過濾，濃縮且藉由製備型HPLC純化獲得180mg(35%)呈黃色固體狀之標題化合物。C12H9FN2O2-H-[M-H]之LC-MS：計算值： 231.1；實驗值：231.0。1H NMR(300MHz,DMSO-d 6)δ[ppm]：11.30(brs,1H),11.14(s,1H),7.41(d,J=2.5Hz,1H),7.36(dd,J=9.0,4.6Hz,1H),7.20(dd,J=10.1,2.5Hz,1H),6.94(ddd,J=9.2,9.0,2.5Hz,1H),4.33(dd,J=9.5,5.5Hz,1H),3.17(dd,J=18.0,9.5Hz,1H),2.79(dd,J=18.0,5.5Hz,1H)。
途徑B：
或者，將5-氟吲哚(5.00g，5.00g，35.5mmol，96質量%，1.00)及順丁烯二醯亞胺(1.5當量，5.17g，53.3mmol，1.50)之混合物裝入50mL容器中，接著添加乙腈(3L/kg，15.0mL，11.7g，286mmol，100質量%)及氯化鋅(1.05當量，5.08g，37.3mmol，100質量%)。將反應物經10分鐘加熱至85℃，接著在85℃下保持24小時。當仍在85℃下時，緩慢添加水(6L/kg，30.0mL，30.0g，1670mmol，100質量%)，同時維持溫度高於80℃。沈澱黃色固體。反應混合物經1小時冷卻至50℃，隨後在50℃下攪拌2小時，接著經1小時冷卻10℃。在10℃下攪拌反應物1小時。濾出固體，接著濾餅用5ml 1：1 ACN/水洗滌2次以獲得經分離之化合物(6.85g，6.85g，29.5mmol，83.1%產率)。
對於純化，將所得經分離化合物(6.85g，6.85g，29.5mmol，100質量%)裝入容器中，隨後添加四氫呋喃(6L/kg，41.1mL，36.4g，505mmol，100質量%)。將此混合物加熱至66℃形成均質溶液。在66℃下緩慢添加庚烷(4L/kg，27.4mL，18.7g，187mmol，100質量%)；在5體積後固體開始沈澱。將混合物經3小時冷卻至25℃，接著過濾且用庚烷洗滌，隨後在高真空烘箱中乾燥隔夜。分離化合物(4.93g，4.93g，21.2mmol，100質量%，72.0%產率)。
此經分離化合物(1.00g，4.3mmol，100質量%)裝入2至50ml容器中並且添加四氫呋喃(6L/kg，6mL，100質量%)及庚烷(6L/kg，6mL，100質量%)。在25℃下攪拌漿液48小時。濾出固體且在高真空烘 箱中乾燥隔夜。分離化合物：(0.89g，0.89g，3.83mmol，100質量%，89.00%產率)。
化合物1a：(3-2H)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮
向3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)-吡咯啶-2,5-二酮(化合物1，200mg，0.87mmol)於D2O(3mL)中之溶液中添加K2CO3(300mg，2.2mmol)。在40℃下攪拌反應物隔夜。用EtOAc萃取混合物。有機層乾燥、過濾、濃縮且藉由製備型HPLC純化獲得呈黃色固體狀之標題化合物(20mg，10%)。C12H8DFN2O2-H-[M-H]-之LC-MS：計算值232.1；實驗值：232.1。1H NMR(300MHz,DMSO-d 6)δ[ppm]：11.28(s,1H),11.15(s,1H),7.41(d,J=2.1Hz,1H),7.36(dd,J=8.7,4.5Hz,1H),7.20(dd,J=10.2,2.4Hz,1H),6.97-6.90(m,1H),3.19-3.13(m,1H),2.80-2.74(m,1H)。
化合物2：(-)-(R)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮
藉由對掌性製備型HPLC分離150mg化合物1獲得呈黃色固體狀之50mg標題化合物。製備型對掌性HPLC：Chiralpak® AS-H 250mm×20mm 5μm；移動相：CO2/IPA=60/40；流動速率：50mL/min 214nm環境溫度。分析型對掌性HPLC：Chiralpak® IC 250mm×4.6mm 5μm；移動相：己烷/EtOH=70/30；流動速率：1.0mL/min 230nm環境溫度；滯留時間：6.25min.P1：96.3% e.e.[α]254 D=-75.4(c= 0.0014,MeOH)。C12H9FN2O2+H+[M+H]+之LC-MS：計算值233.1；實驗值：233.1。1H NMR(300MHz,DMSO-d 6)δ[ppm]：11.30(brs,1H),11.14(s,1H),7.41(d,J=2.5Hz,1H),7.36(dd,J=9.0,4.6Hz,1H),7.20(dd,J=10.1,2.5Hz,1H),6.94(ddd,J=9.2,9.0,2.5Hz,1H),4.33(dd,J=9.5,5.5Hz,1H),3.17(dd,J=18.0,9.5Hz,1H),2.79(dd,J=18.0,5.5Hz,1H)。
化合物2a：(+)-(S)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮
自針對化合物2a所述之對掌性分離以第二溶離對映異構體分離。對掌性HPLC滯留時間：6.96min.98.5% e.e.[α]254 D=70(c=0.0014,MeOH)。
II. 生物學實例 II.1. 用於IDO1酶活性測定之分析法
所測試化合物抑制人類IDO1之酶活性。
為了量測人類IDO1之酶活性，反應混合物含有(最終濃度)磷酸鉀緩衝液(50mM，pH 6.5)、抗壞血酸(10mM)、亞甲基藍(5μM)及人類重組IDO1酶(如Rohrig等人.J Med Chem,2012,55,5270-5290中所述製備；最終濃度5μg/mL)，不具有或具有指定濃度的本文提供之IDO1抑制化合物(總體積112.5μL)。藉由在室溫下添加37.5μL L-Trp(最終濃度100μM)起始反應。在室溫下在15分鐘期間進行反應，並且藉由添加30μL 30%(w/v)三氯乙酸停止。
為了將N-甲醯基犬尿胺酸轉化成犬尿胺酸，在65℃下培育反應混合物30分鐘。接著，添加120μL含2.5%(w/v)4-(二甲胺基)-苯甲 醛之乙酸且在室溫下培育混合物5分鐘。藉由量測480nm下之吸光度來測定犬尿胺酸濃度。使用純犬尿胺酸製備標準曲線。如上文所述使用十個連續濃度的本文所提供之IDO1抑制化合物來量測IDO1活性。使用Prism軟體(GraphPad Software,Inc.)擬合資料。
代表性IDO1抑制化合物之生物活性的早期測試結果概述於下表中：
說明書中先前提供之表格中反映更多近期研究。在一個實施例中，一般希望選擇IC50低於5μM之化合物用於進一步研究。
II.2.用於IDO活性測定之細胞分析法：hIDO1 P815細胞
本文所述之化合物抑制人類IDO於hIDO1 P815細胞[(ATCC® TIB-64TM)，小家鼠肥胖細胞瘤細胞)]，獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC),Manassas VA]中之活性。
在用P815細胞過表現hIDO1(如Rohrig等人.J Med Chem,2012,55,5270-5290中所述製備)以濃度2×105細胞/控制以最終體積200μL接種的96孔平底培養板中進行分析。為了測定IDO1活性，將細胞在37℃下在5% CO2下在補充有2% FBS及2%青黴素/鏈黴素之IMDM(Invitrogen)中，在不同濃度的本文所提供之IDO1抑制化合物存在下培育24小時。
培養板接著在1000rpm下離心5分鐘，並且將100μL清液層收集於錐形培養板中，添加30μL TCA 30%並且在3000×g下再離心10分鐘。將100μL清液層收集於平底培養板中及100μL含2%(w/v)4-(二甲胺基)-苯甲醛之乙酸中，並且在室溫下培育5分鐘。藉由量測480nm下之吸光度來測定犬尿胺酸濃度。使用純犬尿胺酸製備標準曲線。如 上文所述使用十種不同濃度的本文所提供之化合物量測IDO1活性。使用Prism軟體(GraphPad Software,Inc.)擬合資料。
代表性化合物之生物活性概述於下表中：
在一個實施例中，一般希望選擇IC50低於5μM之化合物用於進一步研究。
II.2.B用於IDO1活性測定之細胞分析法：HeLa細胞
本文所提供之化合物抑制人類IDO1於HeLa細胞中之活性[人類腺癌細胞，® CCL-2TM]。
在用IFNγ刺激之人類宮頸癌HeLa細胞株接種的96孔平底培養板中進行分析。
為了黏附，將HeLa細胞(濃度為5×103個細胞/孔)在37℃下在5% CO2下在補充有10% FBS、2%青黴素/鏈黴素及2mM Ultraglutamin且最終體積200μL之EMEM(Lonza)中培育隔夜。
為了促進IDO1之表現，接著將細胞在37℃下，在5% CO2下，在補充有2% FBS、2%青黴素/鏈黴素及2mM Ultraglutamine及100ng/mL IFNγ(R&D)之EMEM(Lonza)中培育兩天。
為了測定IDO1活性，移除培養基，接著將細胞在37℃下，在5% CO2下，在補充有2% FBS及2%青黴素/鏈黴素之EMEM(Lonza)中，在不同濃度的本文所提供之IDO1抑制化合物存在下培育一天。接著，將100μL清液層收集於錐形培養板中，添加30μL TCA 30%並且在3000×g下離心10分鐘。將100μL清液層收集於平底培養板中及100μL含2%(w/v)4-(二甲胺基)-苯甲醛之乙酸中，並且在室溫下培育5分鐘。藉由量測480nm下之吸光度來測定犬尿胺酸濃度。使用純犬尿胺 酸製備標準曲線。使用Prism軟體(GraphPad Software,Inc.)擬合資料。
代表性化合物之生物活性概述於下表中：
在一個實施例中，一般希望選擇IC50低於5μM之化合物用於進一步研究。
II.2.C用於人類血液中IDO1活性測定之分析法：全血白細胞濃縮物
本文所提供之化合物抑制人類IDO1於人類全血分析法(全血白細胞濃縮物)中之活性。
作為自全血供給製造紅血球及血小板濃縮物之副產物獲得人類全血白細胞濃縮物(如van der Meer等人，Vox Sang,1999,76(2),90-99中所述)。
在含有未經稀釋人類全血白細胞濃縮物(具有2%青黴素/鏈黴素)之96孔平底培養板中進行分析，該濃縮物用脂多糖(LPS)(12.5μg/mL)及重組人類γ干擾素(rhIFNg)(50ng/mL)刺激18小時以誘發色胺酸轉化成犬尿胺酸。離心後收集血漿且用LC-MS/MS(HPLC管柱UnisonTM UK-Phenyl，75×4.6，3μm，流動速率0.8mL/min，水+0.2%乙酸至甲醇+0.1%甲酸之4分鐘梯度，滯留時間2.7min；來自AB Sciex之API 4000TM MS-MS系統，ESI+模式，母離子209.2，子離子94.1)測定血漿犬尿胺酸含量。
為了測定對犬尿胺酸產量的IDO1抑制作用，在不同濃度下共培育化合物1及2。使用Prism軟體(GraphPad Software,Inc.)擬合資料。
代表性化合物之生物活性概述於下表中(結果為來自若干不同供體之血液的結果的平均值)：
II.2.D用於IDO1依賴性T細胞增殖測定之細胞分析法：SKOV-3 PBMC共培養物
本文所提供之化合物在SKOV-3 PBMC共培養物分析法中恢復T細胞增殖。
在用人類卵巢腺癌SKOV-3細胞株[SKOV-3；SKOV3](ATCC® HTB-77TM)]接種且與CD3/CD28珠粒及rhIL-2刺激的人類周邊血液單核細胞(PBMC)共培養的96孔平底培養板中進行分析。
為了黏附，將經照射SKOV-3細胞(濃度為150×103個細胞/孔)在37℃下，在5% CO2下，在補充有50% FBS、2%青黴素/鏈黴素及2mM Ultraglutamin且最終體積150μL的伊斯寇氏改質杜爾貝科氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)(Lonza)中培育隔夜。以1：1比率添加經分離PBMC(用CD3/CD28珠粒及rhIL-2(30U/mL)刺激)。共培養24小時後，在50%血清存在下培育隔夜後，添加3H-胸苷(1μCurie/10μL)來評定增殖(TopCount counter,Perkin Elmer)。
為了測定對T細胞增殖之恢復的IDO1抑制作用，本文所提供之化合物在不同濃度下共培養。
化合物2顯示次分析法中EC50為0.074μM(三個獨立實驗之平均值)。
II.3.健康小鼠中血液犬尿胺酸含量的活體內抑制
本文所提供之化合物減少健康小鼠血液中犬尿胺酸之量。
簡言之，藉由口服途徑，藉由管飼(給予體積5mL/kg，每組10隻小鼠)，小鼠用不同劑量的本文所提供之一種化合物於0.5%羥丙基甲基纖維素(HPMC)K4M/0.25% Tween 20中之懸浮液或媒劑對照(0.5% HPMC K4M/0.25% Tween 20)處理。兩小時後，採集血液，製備血漿且藉由LC-MS-MS(HPLC管柱Unison UK-Phenyl，75×4.6，3μm，流動速率0.8mL/min，水+0.2%乙酸至甲醇+0.1%甲酸之4分鐘梯度，滯留時間2.7min；來自AB Sciex之API4000TM MS-MS系統，ESI+模式，母離子209.2，子離子94.1)測定存在之犬尿胺酸的量。
化合物1將100mg/kg的循環犬尿胺酸抑制41%(p<0.0001)且將200mg/kg的循環犬尿胺酸抑制59%(p<0.0001)：參看下表。
化合物2將10mg/kg的循環犬尿胺酸抑制39%(p<0.0001)，將30mg/kg的循環犬尿胺酸抑制55%(p<0.0001)且將100mg/kg的循環犬尿胺酸抑制68%(p<0.0001)：參看下表。
實例II.4：4T1乳癌同系模型中之活體內功效研究
對乳腺中正位植入的Balb/c小鼠之4T1同基因型腫瘤模型進行活體內功效研究。將十萬4T1乳癌細胞(ATCC® CRL-2539TM)]正位植入7週大Balb/c小鼠乳腺內(第0天)。當腫瘤平均值達到60mm3(第7天與第11天之間)時，將動物基於腫瘤尺寸隨機分成不同處理組。在隨機分組當天開始，每天兩次經口投與測試化合物(約9 am及5 pm)。將測試化合物懸浮至MethocelTM纖維素醚媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前進行音波處理。每天投與處理直至研究結束。全部實驗動物均每週兩次監測體重改變。腫瘤體積每週兩次藉由測徑規裝置量測且使用下式計算：腫瘤體積=0.5×(長度×寬度2)。在腫瘤體積達到 2000毫米之前終止研究。根據測定TGI(腫瘤生長抑制%)。下表顯示化合物1活體內抑制4T1腫瘤生長。
實例II.5：使用PancO2胰臟癌同系模型之活體內功效研究
對皮下植入之C57/B16小鼠的PancO2同基因型腫瘤模型進行活體內功效研究。將五百萬PancO2胰臟癌細胞皮下植入7週大C57/B16小鼠中(第0天)。當腫瘤平均值達到60mm3(第10天與第12天之間)時，將動物基於腫瘤尺寸隨機分成不同處理組。在隨機分組當天開始，每天兩次經口投與化合物(約9 am及5 pm)。將下表所示之測試化合物懸浮於Methocel®媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前音波處理。每天投與處理直至研究結束。全部實驗動物均每週監測體重改變。腫瘤體積每週藉由測徑規裝置量測且使用下式計算：腫瘤體積=0.5×(長度×寬度2)。在腫瘤體積達到2000mm之前終止研究。根據測定TGI(腫瘤生長抑制%)。下表顯示化合物1活體內抑制PancO2腫瘤生長。
在相同條件下進行獨立研究，研究化合物2(100mg/kg BID)。從隨機分組當天開始，每天兩次經口投與(8小時間隔)甲基纖維素媒劑或100mg/kg化合物2。將化合物2再懸浮於甲基纖維素媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前音波處理。每天投與處理直至研究結束。腫瘤體積每週藉由測徑規裝置量測且使用下式計算：腫瘤體積=0.5×(長度×寬度2)。當腫瘤尺寸達到400mm3時，認為小鼠死亡。 下表顯示化合物2活體內抑制PancO2腫瘤生長。SEM係指測量標準誤差。
實例II.6：4T1腫瘤組織中色胺酸分解抑制的活體內功效研究
本文所提供之化合物能夠降低小鼠腫瘤內之犬尿胺酸濃度，例如乳腺中正位植入之Balb/c小鼠的4T1同系腫瘤。十萬4T1乳癌細胞正位植入7週大Balb/c小鼠的乳腺內(第0天)。當腫瘤平均值達到60mm3(第6天)時，將動物基於腫瘤尺寸隨機分成不同處理組(n=10/組)。第6天至第26天用甲基纖維素媒劑處理動物直至腫瘤達到尺寸介於1500與2000mm3之間。將化合物1懸浮於甲基纖維素媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前音波處理。在第26天及27天每天兩次經口投與甲基纖維素媒劑或200mg/kg化合物1(約9 am及5 pm)。第二天早晨，投與處理且在化合物1投與後4小時處死小鼠。移除腫瘤，稱重且在乾冰上冷凍。藉由LC/MS-MS分析腫瘤之犬尿胺酸濃度。化合物1使犬尿胺酸濃度降低47%(p<0.0001)：參看下表。
實例II.7：CT26腫瘤組織中色胺酸分解抑制的活體內功效研究 A. 本文所提供之化合物能夠降低小鼠腫瘤內的犬尿胺酸濃度
在本發明研究中，在Balb-c小鼠中皮下植入CT26同系腫瘤。更具體言之，將五十萬(500,000)CT26結腸癌癌細胞[CT26.WT，獲自ATCC® CRL-2628TM]皮下植入7週大Balb/c小鼠中(第0天)。當腫瘤平均值達到150mm3(第11天)時，將動物基於腫瘤尺寸隨機分成不同處 理組(n=10/組)。將化合物1懸浮於MethocelTM(甲基纖維素)媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前音波處理。向小鼠每天兩次(約9 am及5 pm)經口投與200mg/kg之甲基纖維素媒劑或化合物1持續2天，直至腫瘤達到介於1500與2000mm3之間的尺寸。第二天早晨，投與處理且在化合物1投與後2小時處死小鼠。移除腫瘤，稱重且在乾冰上冷凍。藉由LC/MS-MS分析腫瘤之犬尿胺酸濃度。
化合物1使犬尿胺酸濃度降低59%(p<0.0001)：參看下表。
B. 化合物1活體內抑制腫瘤生長.
在各別研究中，使用一定範圍之不同治療方案在結腸同系小鼠腫瘤模型CT26中測試IDO-1抑制之抗腫瘤功效。模型基本上如上文所述，但在第0天將磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中之1×106個細胞皮下植入8週大Balb/c雌性側腹中(每組中10隻)。當處理開始時，基於第9天的腫瘤尺寸將小鼠隨機分成處理組(100mg/kg BID，200mg/kg BID或600mg/kg BID)。結果顯示於下表中。
在最高劑量600mg/kg BID下，顯著腫瘤生長抑制(TGI)高達51%。在較低劑量100及200mg/kg BID下，基於腫瘤量測之組平均值的TGI略微較低且因此表明劑量比例。
實例II.8：IDO抑制劑PF06840003(化合物1)之活性 A. 酶分析法 1. IDO1蛋白質之表現及純化
人類IDO1之全長互補去氧核糖核酸(cDNA)選殖至基於pEastbac-1之載體中，而小鼠及犬之全長cDNA選殖至基於pET24a之載體中。全部構築體均具有N端可裂解His標籤且未經標記IDO1可藉由TEV蛋白酶處理釋放。人類IDO1係在昆蟲細胞中表現且使用Ni親和力管柱純化。小鼠及犬IDO1係表現於大腸桿菌BL21(DE3)中且使用Ni親和力管柱純化。為了獲得未經標記之純IDO1及血晶素負載IDO1，經TEV蛋白酶處理且移除標籤之蛋白質與相對蛋白質為10×莫耳比之血晶素(溶解於25mM NaOH中)在4℃下一起培育隔夜，隨後針對人類IDO1進行尺寸排阻層析(SEC)，且針對小鼠及犬IDO1進行陰離子交換及SEC。
2. 藉由質譜分析法量測酶活性
人類、犬及小鼠IDO1之抑制係藉由定量色胺酸量測，而犬尿胺酸之產生係藉由MS量測。IDO1酶(1nM)與多種濃度之抑制劑(50mM至1nM)在室溫下在100mL緩衝液(Mg2+、Ca2+-PBS、20mM抗壞血酸、10mM亞甲基藍、800nM催化酶、15mM色胺酸)中一起培育(一式兩份)。22分鐘後，向各孔中添加15mL 25% HCl。HCl會停止酶反應且亦會將N-甲醯基犬尿胺酸轉化成犬尿胺酸。室溫下15分鐘內會完成轉化。接著將密封之培養板轉移至與6495三重四極質譜儀(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)偶聯的RapidFire 365高通量固相萃取(SPE)層析系統中。分析反應物(進樣環體積為10μL)注射至Agilent Graphite D型濾芯上之後偵測色胺酸及犬尿胺酸，該濾芯在0.01%三氟乙酸(TFA)加0.09%甲酸中且使用80%乙腈、0.09%甲酸及0.01% TFA溶離。最終RapidFire設置如下：吸氣時間：600ms或直至每個sip感應器的迴路完整，裝載時間：5000ms，溶離時間：5000ms，且再平衡時間：500ms，流動速率1.5mL/min。
RapidFire SPE之後，樣品溶離至Agilent 6495三重四極質譜儀 中，其中Agilent Jet Stream源具有離子漏斗技術，設為正離子模式。多個反應監測(MRM)方案分別採用針對色胺酸及犬尿胺酸的205及209之Q1 m/z比率最佳化。第二四極(Q2)用作採用房間氮氣作為碰撞氣體之碰撞室。第三四極(Q3)設為選擇色胺酸(m/z=188)及犬尿胺酸(m/z=146)的產物離子。碎裂器電壓為380V，碰撞能量(CE)為10V且池加速電壓為10V。色胺酸及犬尿胺酸之AUC使用RapidFire整合器軟體(Agilent)定量。各化合物針對各物種的經純化IDO1酶至少測試三次，但犬酶重複兩次。所顯示的值為全部測定值的幾何平均值(2至7個獨立實驗)±95%信賴區間。
3. 藉由分光光度分析量測酶活性
反應溶液含有200mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中的120mM L-色胺酸(Km 14mM)、20mM L-抗壞血酸、10mM亞甲基藍、800nM(500U/mL)催化酶、1% DMSO(±抑制劑)。藉由添加30nM人類IDO1起始分析。分析法隨著在21℃下，在326nm下，在Beckman DU800分光光度計上增加的吸光度(ε321=3.75cm-1mM-1)監測色胺酸轉化成N甲醯基-犬尿胺酸。自11點劑量-反應曲線測定IC50。所示值為兩個獨立實驗±95%信賴區間之幾何平均值。
4. 抑制劑機制研究
在多種濃度之PF-06840003及色胺酸下使用酶分析量測酶活性以評估抑制機制。針對競爭性、非競爭性、不具競爭性及混合抑制將資料與模型全局擬合。獲得最佳擬合之模型視特定資料集及酶種類而不具競爭性或非競爭性。為了進一步告知機制，針對人類IDO1的不同三價鐵及二價鐵形式進行平衡結合研究且測定結合親和力。使用開放比色皿(三價鐵+O2)或在氬氣環境(三價鐵-O2及二價鐵)中在用矽酮隔片封閉的比色皿中用抑制劑滴定人類IDO1之三價鐵及二價鐵形式。在室溫下，典型結合條件為50mM MOPS緩衝液(pH 7.0)、4.5 μM人類IDO1(僅100倍過量之二亞硫磺酸亞鐵)、100μM色胺酸(使用時)。用氣密性注射器添加幾微升體積之滴定液。使用雙倒數作圖法在GraphPad Prism 6.0上進行表觀抑制劑解離常數(Kdapp)值的滴定結果之分析。
5. 人類TDO2酶分析
方案自Dolusic等人，2011改編。簡言之，反應混合物(150mL)含有TRIS緩衝液(50mM，pH 7.5)、亞甲基藍(0.125mM)、抗壞血酸(0.25M)、催化酶(40單位/mL)及人類重組TDO2酶(如Dolusic等人，2011中所述製備；0.9mg)，其中化合物濃度增加(1.0nM至50mM)。反應進行一次。藉由添加底物L-色胺酸(1mM)起始反應。培育1小時後，藉由添加TCA(30%(w/v)停止反應，且添加p-DMAB(2.5%(w/v)將N-甲醯基犬尿胺酸轉化成犬尿胺酸。藉由量測480nm下之吸光度來測定犬尿胺酸濃度。擬合資料且藉由使用PrismÔ軟體(GraphPad Software Inc.)測定IC50。
B. 細胞分析
HeLa人類子宮頸癌細胞株及THP-1人類單核細胞性周邊血液細胞株獲自美國菌種保藏中心(ATCC)。HeLa細胞黏著保存於伊氏最低培養基(Eagles Minimal Essential Media，EMEM)中，該培養基具有厄爾平衡鹽溶液(Earle's Balanced Salt Solution)，不具有酚紅(Lonza)，補充有1mM丙酮酸鈉(Gibco-Life Technologies)、1×非必需胺基酸(Gibco-Life Technologies)、10%胎牛血清(FBS)(Sigma)、2mM Ultraglutamine(Lonza)以及青黴素-鏈黴素(Gibco-Life Technologies)。THP-1細胞保持於洛斯維公園紀念所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)培養基(Gibco-Life Technologies)中之懸浮液中，其補充有10mM HEPES、0.05mM b-巰基乙醇(Sigma)、10% FBS(Sigma)以及青黴素-鏈黴素(Gibco-Life Technologies)。全部細胞均保持於37℃下 且具有5%二氧化碳(CO2)之含濕氣培育箱中。
PF-06840003針對hIDO1之活性在至少五個獨立實驗中，在THP-1細胞中與其兩個對映異構體PF-06840002(活性)及PF-06840001(非活性)平行評估。細胞中之hIDO1活性藉由細胞激素誘導及分泌至培養基中的犬尿胺酸含量的相對量之量測間接測定。THP-1細胞用50μM至0.847μM之抑制劑在hIFNγ及LPS存在下處理24小時且允許將色胺酸異化成犬尿胺酸以供偵測。相較於IC50為1112nM之對映異構體PF-06840002及IC50為5844nM之PF-06840001對映異構體，PF-06840003外消旋物證實針對hIDO1之活性(細胞IC50為1658nM)。高達50μM濃度下的THP-1細胞存活率中不存在明顯降低。
1. HeLa細胞IDO1分析法
為了測試細胞情境中之IDO1活性，使用兩種人類IDO1誘導型細胞模型。HeLa細胞自使用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco-Life Technologies)之細胞培養燒瓶採集且用EMEM生長培養基中和。再懸浮於新鮮生長培養基中之後，細胞以20,000個細胞/孔接種於96孔培養板中的200mL生長培養基中，並且使其在37℃下在5% CO2下黏附隔夜。第二天，生長培養基置換為200mL含有100ng/mL重組人類干擾素γ(rhIFNg)之減(2%)血清培養基且在37℃及5% CO2下培育48小時以誘導IDO表現。第四天，化合物在二甲亞碸(DMSO)中稀釋至10mM，且針對11點曲線製備3倍稀釋液。移除含有rhIFNg之培養基且隨後稀釋至EMEM中，化合物以最高濃度(50mM至0.847nM)添加至細胞且使其在最終分析讀數之前在37℃及5% CO2下培育16至24小時。
亦在人類周邊血液源單核細胞性THP-1細胞株中測試人類IDO1活性。THP-1細胞再懸浮於含有4% FBS加100ng/mL脂多糖(LPS)及50ng/mL rhIFNγ之伊斯寇氏改性杜爾貝科氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's media，IMDM)中促進人類IDO1表現，接著以每孔100,000 個細胞以100μL接種至96孔培養板中。化合物在DMSO中稀釋至10mM。在IMDM培養基中製備在50μM下開始的十一個3倍稀釋液且添加至細胞。細胞在37℃及5% CO2下培育16至24小時。
對於兩種細胞株皆相同的分析讀數，將100mL細胞清液層轉移至v形底96孔培養板。向各孔添加30mL 30%三氯乙酸(TCA)以沈澱蛋白質，且培養板在3000RPM下離心10分鐘。100mL轉移至新鮮平底96孔培養板中且每孔添加100mL含2% 4-(二甲胺基)苯甲醛(pDMAB)之乙酸，使N-甲醯基犬尿胺酸衍生成犬尿胺酸以供定量比色讀數。分析培養板在A492下在Envision培養板讀取器(Perkin Elmer)上讀取。使用Activity Base軟體(8.0.5.4型)及抑制百分比對比IDO抑制劑化合物的Log10濃度之非線性回歸計算IC50值。PF-06840003與PF-06840002(活性對映異構體)及PF-06840001(非活性對映異構體)平行操作且進行比較。
2. A172細胞中之TDO2活性分析
化合物1(PF-06840003)及經分離之對映異構體(化合物2(PF-06840002及PF-06840001)在人類TDO2生物化學及細胞分析以及鼠類TDO2細胞分析中進行評估。此等濃度高達50μM之抑制劑在人類或小鼠TDO2分析中之任一者中均不展現任何顯著抑制活性。
A172細胞接種於96孔培養板(12500細胞/孔)中，用增加濃度之化合物處理且在37℃，5% CO2下培育16-18小時。接著向清液層添加TCA以停止反應。添加p-DMAB將N-甲醯基犬尿胺酸轉化成犬尿胺酸。藉由量測480nm下之吸光度來測定犬尿胺酸濃度。反應進行一次。
3. THP-1細胞中之TDO2活性分析
THP-1細胞用2ng/ml PMA刺激24小時，接著接種於96孔培養板(100,000個細胞/孔)中，用2ng/ml PMA及增加濃度之化合物處理，且 培育24小時。如上文所述測定犬尿胺酸濃度。反應進行一次。
4. P815小鼠TDO2純系12細胞中之TDO2活性分析
如Pilotte等人，Proc Natl Acad Sci,109(7)：2497-2502(2012)中所述產生P815 mTDO2 cl12細胞。將其接種於96孔培養板(50,000個細胞/孔)中，用增加濃度之化合物處理且培育16-18小時。如上文所述測定犬尿胺酸濃度。反應進行一次。
5. 細胞活力分析
犬尿胺酸產量降低之條件在此分析中將呈現活性。重要的是確認分析端點時的細胞存活率。為了測試IDO抑制劑化合物在IDO活性分析期間是否影響細胞存活率，在移除清液層之後，細胞在上文所述之HeLa及THP-1分析期間保留。接著，50mL/孔CellTiterGlo(Promega)直接添加至剩餘細胞中且培養板在室溫下培育10分鐘。分析培養板在Envision培養板讀取器(Perkin Elmer)上針對發光讀取。為了計算樣品中之細胞存活率百分比，發光值根據培養板上僅對照DMSO處理孔的平均值標準化，其中僅DMSO設為100%活力。
C. 人類全血分析
人類全血收集於肝素鈉中且溫和混合。接著，添加25mg/mL LPS(Sigma)及100ng/mL IFNg(R&D)且立即轉移至96孔U型培養板，每孔200mL。PF-06840003在二甲亞碸(DMSO)中之被且等分至個別孔中達到0.01至100μM之最終濃度。最終DMSO濃度為0.5%。在37℃下培育隔夜後，30mL等分試樣與270mL乙腈/HPLC水(70：30)一起沈澱，劇烈渦旋，且在3220×g下，在10℃下離心15分鐘。清液層有機溶液之等分試樣稀釋於0.1%甲酸中且在分析之前外加經同位素穩定標記之犬尿胺酸及色胺酸作為內標。藉由用藥物處理之內標調整之犬尿胺酸計數初一陽性對照內標調整值來測定犬尿胺酸抑制。未經藥物處理的含有DMSO之樣品用作陽性對照。為了定量PF-06840002，在未經 處理(即無藥物LPS或IFNg)之全血中製備校正標準曲線。在GraphPad Prism型號6.03中進行IC50及IC90計算。
為了測定人類細胞系統中之化合物效能，自9名個體收集人類全血。自標稱外加PF-06840003濃度及量測之PF-06840002濃度兩者測定IC50值。因為PF-06840003為外消旋物，所以實際活性對映異構體PF-06840002在於全血及促效劑一起培育隔夜後進行量測。標稱PF-06840003之平均值及標準差IC50為(4.710±2.408μM)，且PF-06840002之平均值及標準差IC50為(2.505±1.477μM)。藉由應用全血中之未經結合部分值0.419之轉化，計算未經結合之抑制劑IC50及IC90值。分別測得未經結合之PF-06840003 IC50及IC90為(2.114及10.697μM)。分別測得未經結合之PF-06840002 IC50及IC90為(1.050及5.691μM)。人類全血分析法提供相關模型中IDO-1活性的選擇性評定。從來自9名供體之樣品測定的PF-06840003之IC50為4.710±2.408μM。
D. 結果 1. 酶抑制
測定PF-06840003(外消旋混合物)以及PF-06840002(活性對映異構體)，及PF-06840001(非活性對映異構體)之生物化學效能(IC50)。此等資料概述於表1中。所列IC50值為具有圓括號中的95%信賴區間的幾何平均值。因為此等研究中所用之MS分析法未描述於文獻中，所以在文獻(Sono及Cady,1989)中先前描述之光譜分析中測定生物化學效能以支持此新穎分析法之結果。兩種分析法之結果相當。
2. 抑制機制
因為PF-06840002及PF-06840003皆為吲哚，所以吾人研究此等抑制劑隨色胺酸濃度變化之活性，判斷抑制劑是否與色胺酸競爭。使用酶促MS分析法，在1μM至150μM的多個色胺酸底物濃度以及多個抑制劑濃度(0、0.023、0.069、0.21、0.625、1.9以及5.6μM)下量測抑 制。此外，研究此等抑制劑針對不同氧化還原形式的human IDO1之結合親和力。
3. 動力學研究
使用Prism軟體(GraphPad Software,Inc)之模型比較獲得與用於人類酶研究之不具競爭性抑制模型以及用於犬類酶研究之非競爭性抑制模型的最佳擬合
4. UV光譜結合研究
進行PF-06840002及PF-06480003至多個氧化還原形式之hIDO1中的滴定。具體言之，評估化合物結合hIDO1之三價鐵及二價鐵形式的能力。此外，亦針對在O2耗盡後結合於三價鐵IDO對色胺酸進行研究。亦進行活性對映異構體PF-06840002之評估以確保研究性化合物PF-06840003之特性未經非活性對映異構體之存在而改變。PF-06840002之資料與PF-06840003之資料類似。在氧耗盡後將PF-06840003滴定至三價鐵IDO1加色胺酸中的特定條件遭遇技術困難。405nm處之峰值的量值不穩定。峰值高度不穩定，在相同條件下重複量測時上下波動。因此，化合物滴定不可能。進行操作以理解變化之起因。活性對映異構體PF-06840002未見此特性；因此，PF-06840002結果顯示於圖2中且概述於表2中。
E. 結論
PF-06840003(外消旋物)及兩種對映異構體PF-06840002及PF-06840001針對抑制小鼠、犬及人類IDO1酶活性之能力進行生物化學表徵。PF-06840003之IC50值與犬及人類酶形式(分別0.59μM對比0.40μM)類似，且顯示小鼠酶之功效相較於人類低3.8倍(1.5μM對比0.40μM)。對於活性對映異構體PF-06840002，犬及人類之IC50值相當(分別0.20μM對比0.20μM)，而小鼠酶之抑制比人類弱3.7倍(0.73μM對比0.20μM)。PF-06840001顯示無高達10μM之抑制。為了更佳理解抑 制機制，使用酶促MS分析法進一步研究PF-06840002及PF-06840003之抑制活性。在色胺酸底物之若干不同濃度以及多種不同抑制劑濃度下量測抑制。對於兩種活性化合物，與使用人類酶之不具競爭性抑制模型及使用犬類酶之非競爭性抑制模型的擬合較佳。在所有情況下，化合物與色胺酸競爭的機制排除在外。若人類與犬類同功異構物之間的機制差異真實且並非實驗誤差或兩種酶之間的血紅素載荷差異引起的偽訊，則需要進一步操作來測定。IDO1為以多種氧化還原形式(包括三價鐵(Fe3+)及二價鐵(Fe2+)形式)存在的血紅素結合蛋白。已知色胺酸與二價鐵形式結合之親和力相較於與三價鐵形式結合之親和力顯著較高(Sono及Cady,Biochemistry,29(13)：5392-5399(1989)。使用分光光度結合分析之進一步分析顯示在氧存在下，PF-06840003與IDO1之三價鐵形式及二價鐵形式弱結合，表觀結合常數分別為14及22.3μM。當化合物結合指示化合物不干擾血紅素結合或與血紅素直接相互作用時，光譜之Soret區域中的峰不變換。在氧含量耗盡之條件下，PF-06840003以表觀結合常數0.32μM結合於IDO1之三價鐵形式。此值符合以動力學方式測定之IC50值，且表明在血紅素處未結合氧的三價鐵形式為催化劑期間抑制劑結合之酶形式。因為色胺酸不會緊密結合此形式之酶，所以不包括PF-06840003與色胺酸競爭的機制，與動力學結果相符。為了進一步說明，測定耗盡氧的三價鐵IDO1之表觀抑制劑結合常數。PF-06840003在此實驗中未良好表現，因此使用PF-06840002。與非競爭性機制相符，添加色胺酸時的PF-06840002之IC50未改變。因此，PF-06840003為IDO1的強效色胺酸非競爭性非血紅素結合抑制劑。活性對映異構體PF-06840002顯示類似結果，指示外消旋混合物及純對映異構體之特性相當。
PF-06840003抑制細胞hIDO1酶產量，導致HeLa子宮頸癌及單核細胞性THP-1細胞中的犬尿胺酸含量降低。此在用促炎性細胞激素處 理誘導IDO1之後在HeLa及THP-1細胞中證實。PF-06840003外消旋物在兩種細胞模型(HeLa中IC50=1769nM，THP-1中1658nM)中的效力低於對映異構體PF-06840002(HeLa中的IC50=1047nM，THP-1中1112nM)，與作為活性對映異構體之PF-06840002表徵相符。非活性對映異構體PF-06840001在HeLa及THP-1細胞分析法兩者中活性低得多(分別IC50=12764nM及5844nM)。IDO活性/效能的降低並非由於此等實驗期間細胞存活率降低。如藉由兩個細胞模型中犬尿胺酸產量所量測，該臨床前研究證明小分子抑制劑PF-06840003抑制hIDO1。
實例II.9：在T細胞-SKOV3共培養分析法中，IDO1抑制劑PF06840003拯救T細胞增殖
為了模擬腫瘤微環境中IDO1表現對T細胞增殖的生理學後果，基於IDO1表現腫瘤細胞及T淋巴細胞的共培養物設計分析法。SKOV3人類卵巢癌細胞株組成性表現IDO1。
SKOV3細胞(ATCC)接種於具有10%、25%或50%人類血清(HS)(Sigma)的IMDM中，用增加濃度之PF-06840003處理，接著照射(10,000rad)。人類周邊血液單核細胞與白血球層分離，藉由在LymphoprepTM(StemCell)上密度梯度離心，用含CD3/CD28珠粒(Invitrogen)及hIL-2(Novartis)且具有10%、25%或50% HS之IMDM刺激15分鐘，接著添加至SKOV3培養板。全部樣品在一個培養板中針對T細胞增殖量測一式兩份地進行，且在另一培養板中針對色胺酸及犬尿胺酸量測進行一次。培育24小時後，使用LC-MS/MS評定改良性培養基中的色胺酸及犬尿胺酸濃度。向共培養物添加3H-胸苷再持續24小時培育期。使用TopCount計數器(Perkin Elmer)量測胸苷併入。擬合資料且藉由使用PrismTM軟體(GraphPad Software Inc.)測定IC50。
IDO1抑制劑外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮有效拯救此分析法中IDO1誘導之T細胞失能，在50%血清存在下的IC50為74 nM(圖7A-7C)。所測試之外消旋化合物在同一分析法中有效抑制SKOV3細胞將色胺酸轉化成犬尿胺酸(圖7D-7F)。外消旋3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮拯救T細胞增殖之能力看似非血清依賴性(在10%至50%的血清濃度中，IC50自60nM變化至74nM)。
實例III.1：使用IDO抑制劑化合物與抗-CTLA4抗體之組合對CT26腫瘤組織中的色胺酸分解抑制進行體內功效研究 A. IDO抑制劑化合物降低腫瘤中抗-CTLA4抗體誘導的犬尿胺酸濃度.
對如實例II.7之部分A中所述皮下植入的Balb/c小鼠的CT26同基因型腫瘤模型進行本文提供之IDO抑制劑化合物與抗-CTLA4抗體[鼠類單株抗體，抗mCD152(鼠類CTL-4)，純系9H10，獲自BioXCell,目錄號BEO131]之組合的進一步研究。簡言之，五十萬CT26結腸癌癌細胞皮下植入7週大Balb/c小鼠中(第0天)。當腫瘤平均值介於100與150mm3之間(第10天)時，將動物基於腫瘤尺寸隨機分成不同處理組(Methocel®甲基纖維素、抗CTLA-4(60μg，腹膜內(i.p.))、化合物2 100mg/kg每天兩次(BID)+抗CTLA-4(60μg，i.p.)n=10/組)。從隨機分組當天開始，每天兩次經口投與(8小時間隔)Methocel®媒劑或100mg/kg化合物2。在第10天、第13天及第16天投與抗-CTLA4(純系9h10，60μg/小鼠，PBS中i.p.)。將化合物2再懸浮於Methocel®媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前音波處理。每天投與處理直至研究結束。腫瘤體積每週藉由測徑規裝置量測且使用下式計算：腫瘤體積=0.5×(長度×寬度2)。當腫瘤達到2000mm3尺寸時，投與化合物2之後4小時處死小鼠。移除腫瘤，稱重且在乾冰上冷凍。藉由LC/MS-MS分析腫瘤之犬尿胺酸濃度。圖1顯示化合物2及抗-CTLA4抗體之組合降低腫瘤中的犬尿胺酸濃度。
B. 使用CT26結腸癌同系模型之活體內功效研究
在基本上如上文所述的皮下植入之Balb/c小鼠的CT26同基因型腫瘤模型上進行化合物2的IDO1抑制劑之活體內功效研究。五十萬CT26結腸癌癌細胞皮下植入7週大Balb/c小鼠中(第0天)。當腫瘤平均值介於120與150mm3之間(第10天)時，將動物基於腫瘤尺寸隨機分成不同處理組(甲基纖維素、抗CTLA-4(60μg，i.p.)、化合物2 100mg/kg BID+抗CTLA-4(60μg，i.p.)n=10/組)。從隨機分組當天開始，每天兩次經口投與(8小時間隔)甲基纖維素媒劑或100mg/kg化合物2。在第10天、第13天及第16天投與抗-CTLA4(純系9h10，60μg/小鼠，PBS中i.p.)。將化合物2再懸浮於甲基纖維素媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前音波處理。每天投與處理直至研究結束。腫瘤體積每週藉由測徑規裝置量測且使用下式計算：腫瘤體積=0.5×(長度×寬度2)。當腫瘤尺寸達到2000mm3時，處死小鼠。圖2及3顯示IDO1抑制劑與抗-CTLA4抗體之組合延長存活率且抑制腫瘤生長(參看下表)。
實例III.2：使用IDO抑制劑化合物與抗-CTLA4抗體之組合的PancO2同系模型之活體內功效研究
在基本上如實例II.5所述的皮下植入之C57/B16小鼠的PancO2同 基因型腫瘤模型上進行IDO1抑制劑之活體內功效研究。將五百萬PancO2胰臟癌細胞皮下植入7週大C57/B16小鼠中(第0天)。當腫瘤尺寸介於30與70mm3之間(第11天)時，將動物基於腫瘤尺寸隨機分成不同處理組(Methocel®甲基纖維素媒劑、化合物2 100mg/kg BID、抗CTLA-4(200μg，i.p.)，化合物2 100mg/kg BID+抗CTLA-4(200μg，i.p.)n=10/組)。從隨機分組當天開始，每天兩次經口投與(8小時間隔)Methocel媒劑或100mg/kg化合物2。在第11天、第14天及第17天投與抗-CTLA4(純系9h10，200μg/小鼠，PBS中i.p.)。將化合物2再懸浮於Methocel®媒劑中且在使用管飼針向動物經口投與之前音波處理。每天投與處理直至研究結束。腫瘤體積每週藉由測徑規裝置量測且使用下式計算：腫瘤體積=0.5×(長度×寬度2)。當腫瘤尺寸達到400mm3時，認為小鼠死亡。下表及圖4顯示IDO1抑制劑與抗-CTLA4抗體之組合延長存活率。
實例III.3：抗-PD-L1+IDO1i顯示CT26腫瘤中的組合益處
此研究在基本上如實例III.2中所述執行的同系小鼠結腸癌模型中進行，用抗-PD-L1抗體、艾維路單抗取代其中所述之抗-CTLA4抗體與化合物1組合。艾維路單抗為完全人類抗-PD-L1 IgG1單株抗體，且因此對小鼠並非最佳。
此研究顯示化合物1與抗-PD-L1抗體之組合相較於單獨艾維路單抗(約50% TGI)及單獨化合物1(約30至40% TGI)具有約70%的腫瘤生長抑制(TGI)。參看圖5。
在最近研究中，針對皮下CT26腫瘤測試IDO1抑制劑化合物1之功效。
a. 小鼠、細胞株及Ab
7週大雌性Balb/C小鼠購自Charles River。CT26細胞株獲自ATCC。CT26生長於補充有10體積% FCS、Hepes(10mM最終)及2%青黴素/鏈黴素的RPMI中。阻斷活體內模型之抗小鼠PDL1抗體獲自BioXcell(純系10F.9G2)。APCeFluor780結合之抗小鼠CD45(30F11)、FITC結合之抗小鼠CD4(RM4-5)、PECy7結合之抗小鼠CD8a(53-6.7)、APC結合之抗小鼠IFN-γ(XMG1.2)以及細胞刺激混合物試劑盒(+蛋白質傳輸抑制劑)均獲自eBiosciences。
B. 活體內腫瘤處理
對於活體內實驗，將5×105個CT26細胞再懸浮於無補充RPMI中並且使用胰島素注射器皮下注射(100μL)。將小鼠隨機分組並且當腫瘤達到100至120mm3+/-50mm3平均值時開始處理。抗體處理由間隔3天的3次腹膜內注射200μg抗小鼠PDL1組成。IDO1抑制劑(化合物1)在Methocel媒劑(Colorcon)中再懸浮且超音波處理，且在早晨及傍晚藉由經口管飼每日兩次(BID)(100μL)處理小鼠直至模型結束。
C. TIL及脾細胞的離體分析
最後一次抗體處理(處理開始後7天)後一天處死小鼠，且從動物切除腫瘤及脾臟。在MACS Smart Strainer 70上碾碎脾臟且將紅血球溶解於RBC溶解緩衝液(Sigma)中。在PBS中洗滌脾細胞且計數。遵照製造商說明在來自Miltenyi的使用gentlemACS解離劑及腫瘤消化試劑盒(小鼠)之gentleMACS C試管中酶消化腫瘤。解離後，藉由梯度離心 在Lymphoprep上增濃TIL。接著在PBS中洗滌增濃之TIL且計數。根據製造商方案在PMA、伊屋諾黴素、布雷菲爾德菌素A及莫能菌素存在下處理細胞3小時(來自eBioscience的細胞刺激混合物試劑盒)。細胞置於4℃下隔夜。第二天，活脾細胞及增濃之TIL使用Livid染料(Life Technologies)染色。在使用a-CD45、a-CD4及a-CD8第二次染色之前，藉由與Fc阻斷液(eBiosciences)一起培育來阻斷Fc受體。洗滌細胞且在IC固定緩衝液(eBiosciences)中培育隔夜。最終，細胞用再懸浮於Perm緩衝液(eBiosciences)中的a-IFN-γ染色。洗滌後，在MACSQuant裝置上進行流動式細胞量測術且使用FlowJo分析資料。
D. 統計
使用ANCOVA分析腫瘤生長資料.
III.4-IDO抑制劑與抗-PD-L1抗體及4-1BB組合的免疫調節及抗腫瘤功效
B16-F10細胞獲自ATCC且遵照ATCC網站上的說明生長。將100ml PBS中的2×105個細胞皮下植入雌性C57BL/6J(Jackson labs)小鼠的右側腹中。小鼠(n=20)隨機分成處理組且在第9天，在平均腫瘤尺寸為60mm3植入之後開始處理。在第9天、第12天、第15天及第18天以腹膜內注射形式給予抗體處理。抗-PD-L1抗體(純系10F.9G2；大鼠IgG2b)購自BioxCell。抗-4-1BB抗體(MAB9371；大鼠IgG1-murinized)購自R&D systems。IDO1抑制劑(PF-06840003)再懸浮於甲基纖維素媒劑(0.5%甲基纖維素，Colorcon)中且在其中音波處理，且小鼠藉由經口管飼持續每日兩次處理(BID，相隔8/16小時)。全部動物實驗事先由Pfizer's IACUC批准且遵照Pfizer's IACUC執行。
圖10中所示之結果顯示抗-4-1BB+抗-PD-L1抗體+化合物1比抗-4-1BB+抗-PD-L1之組合處理更有效(p值<0.00005)。圖11顯示個別動物結果。圖12說明連續IDO抑制改良中位存活率。
低免疫原性皮下同系黑素瘤小鼠腫瘤模型B16-F10中的抗-4-1BB抗體+PF-06840003(600mg/kg，BID)處理對比抗-4-1BB Ab(p<0.02)或PF-06840003單一療法的顯著腫瘤生長抑制(第17天)及存活率益處(設為腫瘤尺寸<2000mm3的存活率截止值)益處。
此外，藉由將PF-06840003的IDO1抑制與組合抗-4-1BB+抗-PD-L1組合發現強顯著TGI及存活率益處。
(列出自由文本之序列)
以下資訊針對含有從屬於數字標識符<223>的自由文本之序列提供。
本說明書中引用的全部專利文獻及公開案均以引用的方式併入本文中，如2016年4月13日申請的美國臨時專利申請案第62/231122號、2015年5月14日申請之美國臨時專利申請案第62/161,654號以及序列表。雖然本發明已關於特定實施例進行描述，但應瞭解，可在不偏離本發明之精神之情況下進行修改。此等修正打算在隨附申請專利範圍之範疇內。
<110> 美商輝瑞大藥廠比利時商埃帝歐斯醫療公司
<120> 包含吡咯啶-2,5-二酮IDO1抑制劑及抗-PD1/抗-PD-L1抗體之組合療法
<130> PC72223PCT
<150> 61/161,654
<151> 2015-05-14
<150> 62/321112
<151> 2016-04-11
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1抗體重鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1抗體輕鏈
<400> 2

Claims (33)

  1. 一種適用於癌症治療的組合方案，其包含(a)3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮及(b)第二活性組分，其為選自抗-PD-1或抗-PD-L1抗體之免疫調節劑。
  2. 如請求項1之組合方案，其中該抗-PD-L1抗體為艾維路單抗(avelumab)。
  3. 如請求項1或2之組合方案，其包含至少一種選自以下之第三活性組分作為免疫調節劑：抗-CTLA4抗體、抗-OX-40抗體、抗-4-1BB抗體、抗癌疫苗、P-鈣黏素LP-雙重親和力重新靶向蛋白、TDO抑制劑、信號調節抑制劑、抗體-藥物結合物(ADC)、依魯替尼(ibrutinib)或化學治療劑。
  4. 如請求項3之組合方案，其中該免疫調節劑為抗-CTLA4抗體。
  5. 如請求項4之組合方案，其中該抗-CTLA4抗體為伊派利單抗(ipilimumab)或曲美單抗(tremelimumab)。
  6. 如請求項3之組合方案，其中該第三活性組分為抗癌疫苗。
  7. 如請求項3之組合方案，其中該第三活性藥物為信號調節抑制劑，其中該信號調節抑制劑選自Pi3K/mTOR抑制劑、Pi3K-α選擇性抑制劑、MEK抑制劑、zeste同系物2之強化子(EZH2)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑或細胞週期素依賴性激酶CDK4及CDK6之選擇性抑制劑。
  8. 如請求項7之組合方案，其中該第三活性藥物為Pi3ik/mTOR抑制劑，其為吉達力絲(gedatolisib)。
  9. 如請求項7之組合方案，其中該第三試劑為Pi3K-α選擇性抑制劑。
  10. 如請求項7之組合方案，其中該第三試劑為該細胞週期素依賴性 激酶CDK4及CDK6的選擇性抑制劑，其為帕博西里(palbociclib)。
  11. 如請求項7之組合方案，其中該第三活性劑為烷基化劑之化學治療劑。
  12. 如請求項11之組合方案，其中該化學治療劑為替莫唑胺(temozolomide)。
  13. 如請求項11之組合方案，其中該化學治療劑為多西他賽(docetaxel)。
  14. 如請求項1之組合方案，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮為外消旋化合物、其(R)-對映異構體或其(S)-對映異構體或其混合物。
  15. 如請求項1之組合方案，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮及該抗-PD-1或抗-PD-L1抗體係以實質上同時方式投與給個體。
  16. 如請求項1之組合方案，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮及該抗-PD-1或抗-PD-L1抗體係依序傳遞。
  17. 如請求項1之組合方案，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮及該抗-PD-1或抗-PD-L1抗體係經不同途徑傳遞。
  18. 如請求項1之組合方案，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮係以經口方式投與給個體。
  19. 如請求項1之組合方案，其中該抗-PD-1或抗-PD-L1經以注射投與給個體。
  20. 如請求項1之組合方案，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮為游離鹼形式。
  21. 如請求項1之組合方案，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮外消旋物用於該組合中，該外消旋物包含約50%(R)-對 映異構體及(S)-對映異構體。
  22. 如請求項1之組合方案，其中3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮之(R)-對映異構體及(S)-對映異構體的混合物用於該組合中，其中係使用該(R)-對映異構體及該(S)-對映異構體。
  23. 如請求項22之組合方案，其中使用超過50%(R)-對映異構體。
  24. 如請求項23之組合方案，其中(R)對映異構體及(S)對映異構體之混合物包含至少95%至100%該(R)-對映異構體。
  25. 如請求項1之組合，其中該3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮選自(3-2H)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮、(3-2H)-(R)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮或(3-2H)-(S)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮以及其混合物。
  26. 如請求項1之組合，其中該癌症選自惡性黑色素瘤、急性骨髓性白血病、胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、前列腺癌、子宮頸癌、腦癌、肝癌、頭部及頸部癌、子宮內膜癌及卵巢癌。
  27. 如請求項1之組合，其中該組合用於患有與瘤形成有關之慢性病毒感染的個體中。
  28. 一種(a)3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮及(b)至少一種包含抗-PD-1或抗-PD-L1抗體之第二活性藥物之用途，其用於製造用以治療癌症或慢性病毒感染之藥物。
  29. 如請求項28之用途，其中該癌症選自惡性黑色素瘤、急性骨髓性白血病、肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、腦癌、子宮內膜癌及卵巢癌。
  30. 如請求項28之用途，其中在診斷出癌症之前將該組合傳遞至患有慢性病毒感染之個體。
  31. 如請求項30之用途，其中該引起慢性病毒感染之病毒選自人類乳頭狀瘤病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein barr virus)、人類免疫缺 陷病毒、單純疱疹病毒或腺病毒。
  32. 如請求項29至31中任一項之用途，其中該抗-PD-L1抗體為艾維路單抗。
  33. 一種3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯二啶-2,5-二酮化合物，其用於包含至少一種第二活性藥物之組合方案中，該第二活性藥物為艾維路單抗。
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