TW201705945A - 用於對動物輸送活性劑的組成物 - Google Patents

Abstract

本發明提供用於對動物輸送活性劑的組成物，其包括活性劑、第一塗層、第二塗層及第三塗層。活性劑塗覆有第一塗層，第一塗層塗覆有第二塗層，且第二塗層塗覆有第三塗層。活性劑與第一塗層接觸，不與第二塗層或第三塗層接觸。第一塗層將活性劑與第二塗層分離，同時第二塗層將第一塗層與第三塗層分離。第一塗層、第二塗層及第三塗層彼此不同。亦提供用於製備及使用所述組成物之方法。

Description

用於對動物輸送活性劑的組成物

本申請案主張2015年6月26日提交之美國臨時申請案第62/185,302號之權益，其內容以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。

投予（尤其是經口投予）藥物、疫苗或除害劑提供若干優勢。可利用極少束縛及人工，經由食物或水向大量動物投予劑量。束縛亦使動物緊張，使藥物或接種疫苗不太有效且增加感染性疾病之風險。對於產肉動物，經口投藥之另一優勢是其避免注射部位之反應。針頭斷裂、注射部位污染或高反應性佐劑之使用會誘發膿腫，從而損害屠體及皮膚。此等反應降低動物在屠宰時之價值。此亦為魚疫苗接種方案之問題，在所述方案中，需要自魚槽或開放之海洋網箱捕獲魚且單獨注射。口服接種快速而高效，且不再需要多次處置動物以投予後續輔助劑接種。經口投藥之後出現不良免疫反應的可能性亦大大減小，因此更安全。

儘管投予（尤其是經口投予）藥物、疫苗或除害劑具有優勢，但所述技術之開發因缺乏適當輸送系統而延遲。在無適合輸送系統存在下，大部分口服藥物、疫苗及除害劑在胃腸（gastrointestinal，GI）道中（尤其在胃部低pH值條件下）經歷降解，使得在具有中性pH值之腸中的吸收有限，有限的腸吸收又導致治療作用、免疫反應或殺蟲作用不足。

已開發出對腸黏膜組織輸送藥物、疫苗及除害劑之各種媒劑。已使用可生物降解聚合物，諸如聚(DL-丙交酯)及聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)製造用於向動物投予（尤其經口投予）藥物、疫苗或除害劑之聚合物粒子。然而，此等聚合物粒子之製造需要使用會損害易受損藥物、疫苗或除害劑之溶劑。另外，使用溶劑阻止減毒之活有機體（諸如病毒或細菌）併入那些聚合物粒子內。

正在開發之適當輸送系統的其他問題包含需要僅選擇適合的（例如食品級或飼料級及可生物降解的）化合物及佐劑，且需要持久且穩定之治療、免疫原性或殺蟲作用。

本發明提供一種用於對動物輸送活性劑的組成物。所述組成物包括活性劑、第一塗層、第二塗層及第三塗層。所述活性劑塗覆有第一塗層，所述第一塗層塗覆有所述第二塗層，所述第二塗層塗覆有所述第三塗層。所述活性劑與所述第一塗層接觸，不與所述第二塗層或所述第三塗層接觸。所述第一塗層將所述活性劑與所述第二塗層分離，同時所述第二塗層將所述第一塗層與所述第三塗層分離。第一塗層、第二塗層及第三塗層彼此不同，且各自可以由以下構成之族群中選出：包括一種或多種腸溶聚合物之腸溶聚合物層、包括一種或多種脂肪、一種或多種蛋白質或其組合之脂肪/蛋白質層，及包括一種或多種黏膜黏附聚合物之黏膜黏附聚合物層。所述活性劑可以用腸溶聚合物層、脂肪/蛋白質層及黏膜黏附聚合物層以任何順序或次序塗覆。取決於組成物中使用之活性劑及其他成分的性質，所述三層之具體順序或次序可以使活性劑在動物體內具有更有利的釋放特徵或生物作用。

根據本發明之第一可選組成物為組成物A，其中第一塗層為黏膜黏附聚合物層，第二塗層為腸溶聚合物層且第三塗層為脂肪/蛋白質層。

第二可選組成物為組成物B，其中第一塗層為黏膜黏附聚合物層，第二塗層為脂肪/蛋白質層且第三塗層為腸溶層。

第三可選組成物為組成物C，其中第一塗層為脂肪/蛋白質層，第二塗層為黏膜黏附聚合物層且第三塗層為腸溶層。

根據本發明，活性劑可以呈溶液、分散液或乾燥粒子形式。所述粒子之平均粒度可以在約0.1微米至10毫米範圍內，較佳低於約1毫米，更佳低於約500微米。

所述組成物可以為液體、固體或漿液。所述組成物可以為乾燥或潮濕的。

所述組成物可以包括約1%至40%活性劑。除活性劑以外，所述組成物可以包括約1%至20%黏膜黏附聚合物、約1%至30%腸溶聚合物及約1%至40%脂肪、蛋白質或其組合。

活性劑可以為生物活性劑。舉例而言，活性劑為治療藥物、免疫原、抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑或抗寄生蟲劑，或除害劑。除害劑可以為滅鼠劑。

腸溶聚合物之實例包含海藻酸鹽、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素（hydroxypropylmethylcellulose，HPMC）、聚(DL-丙交酯)、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)及其混合物。

脂肪/蛋白質層可以為包括一種或多種脂肪之脂肪層（不含任何蛋白質）、包括一種或多種蛋白質之蛋白質層（不含任何脂肪）或包括一種或多種脂肪及一種或多種蛋白質之層。脂肪可以包括氫化油或部分氫化之油、椰油、棕櫚油、棕櫚仁油、硬脂酸鹽、蠟或其混合物。蛋白質可以包括乳蛋白、明膠、白蛋白、麩質、大豆蛋白、玉米蛋白或其混合物。

動物可以為任何昆蟲或哺乳動物。昆蟲之實例包含床虱、螞蟻、火蟻、蒼蠅、蚊子、跳蚤、蜘蛛、扁虱、甲蟲、蟑螂、白蟻、九香蟲、蟎及類似昆蟲。動物可以為水生動物、陸地動物或哺乳動物。水生動物可以為魚類，或貝類，諸如軟體動物、甲殼動物及棘皮類動物。哺乳動物可以為靈長類動物（諸如人類）、犬、貓、馬、鹿、熊、嚙齒動物、狼、狐狸、松鼠、兔、浣熊、臭鼬及蝙蝠。嚙齒動物可以為小鼠或大鼠。嚙齒動物之體重可以為至少約50公克、100公克、150公克、195公克、250公克或500公克。動物可以為有害生物。

對於本發明之每一組成物，提供一種製備方法。所述方法包括： （a）將有效量之活性劑與第一塗層混合以形成第一塗覆產物，其中在所述第一塗覆產物中所述活性劑塗覆有所述第一塗層， （b）將第一塗覆產物與第二塗層混合以形成第二塗覆產物，其中在所述第二塗覆產物中所述第一塗覆產物塗覆有所述第二塗層，及 （c）將第二塗覆產物與第三塗層混合以形成第三塗覆產物，其中在所述第三塗覆產物中所述第二塗覆產物塗覆有第三塗層，由此製備出所述組成物。

本發明之製備方法可更包括乾燥第三層塗覆產物以形成乾燥粒子。所述粒子之平均粒度可以在約0.1微米至10毫米範圍內，較佳低於約1毫米，更佳低於約500微米。所述粒子可更包括界面活性劑、乳化劑、防腐劑及抗氧化劑。

組成物A可以如下製備： （a）用黏膜黏附聚合物層塗覆有效量之活性劑以形成第一塗覆產物，其中在所述第一塗覆產物中所述活性劑塗覆有黏膜黏附聚合物層， （b）用腸溶聚合物層塗覆第一塗覆產物以形成第二塗覆產物，其中所述第一塗覆產物塗覆有腸溶聚合物層，其中在所述第二塗覆產物中，所述活性劑在第一層中塗覆有黏膜黏附聚合物且在第二層中塗覆有腸溶聚合物，及 （c）用脂肪/蛋白質層塗覆第二塗覆產物以形成第三塗覆產物，其中第二層塗覆產物塗覆有脂肪/蛋白質層，其中在所述第三塗覆產物中，所述活性劑在第一層中塗覆有黏膜黏附聚合物，在第二層中塗覆有腸溶聚合物且在第三層中塗覆有脂肪/蛋白質，由此製備出組成物A。

組成物B可以如下製備： （a）用黏膜黏附聚合物層塗覆有效量之活性劑以形成第一塗覆產物，其中在所述第一塗覆產物中所述活性劑塗覆有黏膜黏附聚合物層， （b）用脂肪/蛋白質層塗覆第一塗覆產物以形成第二塗覆產物，其中所述第一塗覆產物塗覆有脂肪/蛋白質層，其中在所述第二塗覆產物中，所述活性劑在第一層中塗覆有黏膜黏附聚合物且在第二層中塗覆有脂肪/蛋白質，及 （c）用腸溶聚合物層塗覆第二塗覆產物以形成第三塗覆產物，其中所述第二塗覆產物塗覆有腸溶聚合物層，其中在所述第三塗覆產物中，所述活性劑在第一層中塗覆有黏膜黏附聚合物，在第二層中塗覆有脂肪/蛋白質且在第三層中塗覆有腸溶聚合物，由此製備出組成物B。

組成物C可以如下製備： （a）用脂肪/蛋白質層塗覆有效量之活性劑以形成第一塗覆產物，其中在所述第一塗覆產物中所述活性劑塗覆有脂肪/蛋白質層， （b）用黏膜黏附聚合物層塗覆第一塗覆產物以形成第二塗覆產物，其中所述第二塗覆產物塗覆有黏膜黏附聚合物層，其中在所述第二塗覆產物中，所述活性劑在第一層中塗覆有脂肪/蛋白質且在第二層中塗覆有黏膜黏附聚合物，及 （c）用腸溶聚合物層塗覆第二塗覆產物以形成第三塗覆產物，其中所述第二塗覆產物塗覆有腸溶聚合物層，其中在所述第三塗覆產物中，所述活性劑在第一層中塗覆有脂肪/蛋白質，在第二層中塗覆有黏膜黏附聚合物且在第三層中塗覆有腸溶聚合物，由此製備出組成物C。

亦提供根據本發明之製備方法製備的組成物。

本發明亦提供一種用於使活性劑在動物體內控制釋放或靶向釋放之方法。所述方法包括投予有效量的如上文所描述之包括活性劑之組成物。所述方法可更包括在前60分鐘、30分鐘或15分鐘內，在胃環境中，例如在約0.1至3或約1至2之pH值下釋放不到約50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%之活性劑。所述方法可更包括在前120分鐘、60分鐘、30分鐘或15分鐘內，在腸環境中，例如在約5至8、約5.5至7.5或約6.5至7.5之pH值下釋放至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%之活性劑。所述方法可更包括在動物胃部通過期間，使至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%，例如約50%至90%之活性劑保持完整。所述方法可更包括將至少50%至90%之活性劑輸送至動物之腸中。

活性劑可以併入具有第一塗層、第二塗層及第三塗層之不同組合的本發明組成物中。組成物A、組成物B及組成物C可以提供同一活性劑之不同釋放特徵。相較於組成物B或組成物C，組成物A可提供更佳的胃後活性劑輸送。舉例而言，如與組成物B或組成物C相比較，組成物A可在胃環境中提供較少之活性劑釋放且在腸環境中提供較多之活性劑釋放。因此，當活性劑之所需作用部位為動物之胃後時，組成物A之有效性可以比組成物B或組成物C高例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%，較佳至少約20%，更佳至少約50%。相較於組成物A或組成物B，組成物C可在腸中提供更快之釋放特徵及/或更佳之生物活性劑吸收。舉例而言，如與組成物A或組成物B相比較，組成物C可使活性劑在腸環境中更快釋放且使動物自腸環境吸收更多活性劑。因此，當生物利用率較低且活性劑之所需作用部位在動物腸之上部時，組成物C之有效性比組成物A或組成物B高例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%，較佳至少約10%，更佳至少約30%。

另外提供一種用於對動物胃後輸送活性劑之方法。所述輸送方法包括向動物投予有效量之本發明組成物。至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%，例如約50%至90%之活性劑可以到達動物腸中。

在一些實施例中，以組成物A調配之活性劑比以組成物B或組成物C調配之活性劑多例如至少約10%、20%、30%、40%或50%到達動物腸中，及/或以組成物A調配之活性劑比以組成物B或組成物C調配之活性劑多例如至少約10%、20%、30%、40%或50%經動物吸收。

在其他實施例中，以組成物B調配之活性劑比以組成物A或組成物C調配之活性劑多例如至少約10%、20%、30%、40%或50%到達動物腸中，及/或以組成物B調配之活性劑比以組成物A或組成物C調配之活性劑多例如至少約10%、20%、30%、40%或50%經動物吸收。

在又其他實施例中，以組成物C調配之活性劑比以組成物A或組成物B調配之活性劑多例如至少約10%、20%、30%、40%或50%到達動物腸中，及/或以組成物C調配之活性劑比以組成物A或組成物B調配之活性劑多例如至少約10%、20%、30%、40%或50%經動物吸收。

提供一種用於治療或預防動物之疾病或病症（例如感染）之方法。所述治療或預防方法包括向動物投予有效量之本發明組成物。活性劑為治療藥物。

亦提供一種用於對動物（例如水生物種或陸地物種）進行疫苗接種之方法。所述疫苗接種方法包括向動物投予有效量之本發明組成物。活性劑為抗原，其可以來源於感染性微生物，例如細菌、真菌、病毒或寄生蟲。可以針對動物體內之微生物誘導特異性保護性免疫反應。

另外提供一種用於防治有害生物之方法。所述有害生物防治方法包括向有害生物投予有效量之本發明組成物。活性劑為除害劑，例如滅鼠劑。有害生物可以為昆蟲（例如螞蟻、火蟻、蟑螂、蒼蠅、白蟻及類似昆蟲）或嚙齒動物（例如小鼠及大鼠）。嚙齒動物可以是平均體重為至少約50公克、100公克、150公克、195公克、250公克或500公克之大型大鼠。經處理之有害生物的存活率可以低於約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%或60%，較佳低於約50%，更佳低於20%，最佳低於5%。

在一些實施例中，如在本發明之方法中使用之活性劑在以組成物A調配時比以組成物B或組成物C調配時更有效。舉例而言，以組成物A調配之活性劑的治療作用、免疫原性或殺蟲作用可以比以組成物B或組成物C調配時高至少約10%、20%、30%、40%或50%。

在其他實施例中，如在本發明之方法中使用之活性劑在以組成物B調配時比以組成物A或組成物C調配時更有效。舉例而言，以組成物B調配之活性劑的治療作用、免疫原性或殺蟲作用可以比組成物A或組成物C調配時高至少約10%、20%、30%、40%或50%。

在又其他實施例中，如在本發明之方法中使用之活性劑在以組成物C調配時比以組成物A或組成物B調配時更有效。舉例而言，以組成物C調配之活性劑的治療作用、免疫原性或殺蟲作用可以比組成物A或組成物B調配時高至少約10%、20%、30%、40%或50%。

術語「有效量」是指實現規定目標（例如活性劑在動物體內之控制釋放、治療或預防動物之疾病或病症、對動物進行疫苗接種或防治有害生物）所需的包括活性劑之組成物的量。包括活性劑之組成物之有效量可取決於規定目標、動物之身體特徵、疾病或病症之性質及嚴重程度、相關或不相關醫學病狀之存在、活性劑之性質、包括活性劑之組成物、向動物投予組成物之方式及投予途徑而變化。用於給定動物之具體劑量一般可以根據醫師或科學家之判斷設定。可以向動物投予一次或多次劑量之組成物。每一劑可以為約0.01毫克/千克至5000毫克/千克，較佳為約0.1毫克/千克至1000毫克/千克，更佳為約1毫克/千克至500毫克/千克。

本發明之組成物可以調配用於經口、舌下、鼻內、眼內、經直腸、經皮、黏膜、局部或非經腸投予。非經腸投予可以包含皮內、皮下（s.c.、s.q.、sub-Q、Hypo）、肌肉內（intramuscular，i.m.）、靜脈內（intravenous，i.v.）、腹膜內（intraperitoneal，i.p.）、動脈內、髓內、心內、關節內（關節）、滑膜內（關節液區域）、顱內、脊柱內及鞘內（脊髓液）注射或輸注。適於非經腸注射或輸注藥物調配物之任何裝置均可以用於此類投予。舉例而言，所述組成物可以包含在無菌預填充注射器中。

除非本文另外定義，否則本發明採用之科技術語將具有一般熟習此項技術者通常所理解且使用之含義。此外，如本文以及申請專利範圍中所使用，術語「至少一個（種）（at least one）」與「一個（種）或多個（種）（one or more）」含義相同且包含一個（種）、兩個（種）、三個（種）或大於三個（種）。除非另外指明，否則組成物中各組分之百分比或份數均以重量計。術語「分散（dispersed）」意謂懸浮及/或溶解。

「交聯（Crosslink）」及其變化形式是指兩種或多於兩種材料及/或物質（包括本文所揭示之材料及/或物質中之任一者）經由一種或多種共價及/或非共價（例如，離子）締合進行之連接。交聯可以自然地（例如，胱胺酸殘基之二硫鍵）進行或經由合成或半合成途徑進行。帶電聚合物之交聯可以由離子與帶相反電荷之多價相對離子締合實現。可以藉由所述交聯製備堅固之固體結構，例如水凝膠。

「胃保護（Gastric protection）」是指保護生物活性劑免受胃破壞且免於損失活性。

「塗覆有（Being coated with）」是指第一材料經第二材料包圍或包埋於第二材料中。

「有效量」是指在一種或多種動物中實現規定目標（例如胃後輸送、治療或預防動物之疾病或病症，或防治有害生物）所需的包括活性劑之組成物的量。包括活性劑之組成物之有效量可取決於規定目標、動物之身體特徵、疾病或病症（例如感染）之性質及嚴重程度、相關或不相關病狀之存在、活性劑之性質、包括活性劑之組成物、向動物投予組成物之方式及投予途徑而變化。用於動物之具體劑量一般可以根據相關領域之科學家、獸醫或醫師的判斷設定。可以向動物投予一次或多次劑量之組成物。

本發明之組成物包含包括生物活性劑之顆粒狀物質，所述生物活性劑具有三層塗層，包括黏膜黏附聚合物層、腸溶聚合物層及脂肪/蛋白質層，所述塗層可以按任何所需順序或次序施加。腸溶聚合物保護生物活性劑免於暴露於動物胃中之低pH值條件，因為所述聚合物在低pH值下仍不可溶且保持完整的保護塗層或層形式。所述粒子通常可以具有在10微米至5000微米範圍內的平均幾何尺寸（有時稱作直徑）且可以在所述尺寸範圍內直接施加或藉由碾磨、研磨或其他方式減小至所述尺寸。通常，所述粒子之直徑低於1000微米，較佳低於500微米。

在一些實施例中，使黏膜黏附聚合物與生物活性劑混合在一起且在粒子內相互接觸，締合在一起，所述粒子又依序塗覆腸溶聚合物及第三脂肪或蛋白質塗層。黏膜黏附聚合物及/或腸溶塗層聚合物可以經交聯或不經交聯。

在其他實施例中，生物活性劑如上分散於小油滴內，且這些生物活性劑隨後經黏膜黏附聚合物塗覆。所得粒子又經腸溶塗層聚合物塗覆。黏膜黏附聚合物及/或腸溶塗層聚合物可以經交聯或不經交聯。

在一些實施例中，本發明提供一種用於向水生物種及陸地物種經口投予針對特定疾病之生物活性劑的組成物。所述組成物包括有效量之生物活性劑。本發明之組成物經設計成使生物活性物質與動物之腸黏膜接觸以刺激吸收及黏膜黏附。根據本發明之組成物通常在飼料或醫藥學上可接受之載劑存在下經口投予以將所述組成物攜帶至目標物種之腸中，所述飼料或醫藥學上可接受之載劑包括例如水（例如動物飲用水）、錠劑、膠囊、大丸劑劑型、飼料糰粒或食品添加劑。

本發明之組成物在對動物輸送生物活性劑方面具有若干優勢。第一，製造輸送系統之方法不再使用藉由其他方法製備粒子常常需要之有機溶劑或高溫及高pH。藉由在本發明組成物之整個製備過程中將水性環境維持在適度pH值條件及低溫，可以經口輸送敏感性生物活性劑，諸如蛋白質、肽、DNA片段及RNA片段，及抗生素。第二，額外的腸溶塗層聚合物層保護生物活性劑免於在胃腸道中降解。第三，包圍生物活性劑之額外脂肪或蛋白質層提供遮蔽特性且防止諸如蛋白質、肽及藥物之小生物活性分子在製備期間以及服用及胃暴露期間浸出至水性環境中。另外，所述輸送系統可以容易地調配用於有效輸送至水生物種及陸地物種。

較佳地，用於製備本發明組成物之所有組分均為食品級、無毒且可生物降解的，且為天然存在的。以下描述適用於製備所述組成物之材料。生物活性劑

生物活性劑可以為能夠直接或間接地引發一個或多個物理、化學及/或生物效應的天然存在、合成或半合成之材料（例如，化合物、醱酵物、提取物、細胞結構）。生物活性劑能夠諸如藉由殺滅寄生有機體或藉由限制疾病或異常之影響來預防、緩解、治療及/或治癒活體之異常及/或病理病狀。取決於作用及/或其應用，生物活性劑可以為藥劑（諸如預防劑或治療劑）、診斷劑及/或美容劑，且包含（但不限於）疫苗、藥物、前藥、親和力分子、合成有機分子、激素、抗體、聚合物、酶、低分子量分子蛋白質化合物、肽、維生素、類固醇、類固醇類似物、脂質、核酸、碳水化合物、其前驅物及其衍生物。生物活性劑亦可為營養補充劑。非限制性營養補充劑包含蛋白質、碳水化合物、水溶性維生素（例如維生素C、維生素B複合維生素及類似維生素）、脂溶性維生素（例如維生素A、維生素D、維生素E、維生素K及類似維生素）、礦物質及草本提取物。生物活性劑可以為可商購的及/或可以藉由已知技術製備。

本發明中之生物活性劑包含（但不限於）疫苗（疫苗亦可以作為免疫刺激複合物，即抗原與霍亂毒素（cholera toxin）及其B次單元、凝集素及佐劑偶聯物的一部分輸送）、抗生素、親和力分子、合成有機分子、聚合物、低分子量蛋白質化合物、肽、維生素、類固醇、類固醇類似物、脂質、核酸、碳水化合物、其前驅物及其衍生物。生物活性劑亦可為除害劑，例如滅鼠劑。

生物活性劑可以為免疫原，亦即，能夠在動物體內建立特異性免疫反應之物質。免疫原之實例包含抗原及疫苗。舉例而言，免疫原可以包含免疫原性肽、蛋白質或重組蛋白，包含包括免疫原性肽及/或蛋白質及細菌（例如菌苗）之混合物；完整無活性病毒粒子、減毒病毒粒子及感染性病毒粒子；完整之經殺滅原核生物、減毒原核生物及感染性原核生物；完整之經殺滅原生動物、減毒原生動物及感染性原生動物，包含其任何生命週期階段；以及完整之經殺滅多細胞病原體、減毒多細胞病原體及感染性多細胞病原體；重組次單元疫苗；及用以輸送及表現編碼免疫原性蛋白質之基因的重組載體（例如DNA疫苗）。

一種或多種生物活性劑可以佔粒子重量（不包括水）之至少0.1%，或至少1%，或至少5%。較佳其佔至多40%，或至多20%，或至多10%。黏膜黏附聚合物

黏膜黏附聚合物為特異性結合至黏膜組織，且有助於使生物活性劑保持緊密接近黏膜，藉此改善投藥之聚合物。適合實例包含合成聚合物，諸如聚(丙烯酸)、羥丙基甲基纖維素及聚(丙烯酸甲酯)、羧基官能化之聚合物、硫酸酯官能化之聚合物、胺官能化之聚合物及其衍生物或改質形式，以及天然存在之聚合物，諸如角叉菜膠、玻尿酸、聚葡萄胺糖、陽離子膠豆及海藻酸鹽。亦可以使用天然存在之聚合物之衍生化形式或其他改質形式，且多種此類聚合物為此項技術中所知。非限制性實例包含丙二醇海藻酸酯及果膠、羧甲基聚葡萄胺糖、羧甲基聚葡萄胺糖、甲基乙二醇聚葡萄胺糖、三甲基聚葡萄胺糖及類似物。

較佳黏膜黏附聚合物為聚葡萄胺糖及改質或衍生化之聚葡萄胺糖，其可以經由甲殼動物外骨骼之主要化合物甲殼素去乙醯化獲得。聚葡萄胺糖[a-(1~4)-2-胺基-2-去氧-ß-D-葡聚糖]為與纖維素密切相關之黏多糖，其展現藉由分子量、去乙醯化程度及黏度確定之化學特性。聚葡萄胺糖可以形成微米粒子及奈米粒子，所述粒子可以藉由與諸如磷酸根離子、戊二醛或硫酸根離子之交聯劑發生化學反應而結合大量抗原。

儘管在一些較佳實施例中使用聚葡萄胺糖，但亦可使用其他聚合物以獲得類似之黏膜黏附功能。這些聚合物包含（但不限於）明膠、海藻酸鹽、聚葡萄糖、玻尿酸、瓊脂及抗性澱粉。

所述一種或多種黏膜黏附聚合物可以佔所述粒子重量（不包括水）之至少1%，或至少10%，或至少15%。較佳地，其佔至多50%，或至多30%，或至多20%。脂肪塗層

在一些傳統產物中，在所述粒子製備及通過胃通道期間，大量生物活性劑由於浸出粒子而損失於水性環境中，尤其是分子尺寸較小之生物活性劑，諸如病毒、蛋白質、藥物、抗生素、除害劑及類似物。在本發明中，生物活性劑自粒子浸出主要藉由離散粒子消除，含有生物活性劑之域或相分散於油中或經油塗覆。可以使用任何類型之油，包含呈液體或固體形式之植物油、動物油或合成油及脂肪，或蠟來塗覆生物活性劑。本發明中所使用之植物來源的油包含（但不限於）蓖麻油、椰油、椰子脂、玉米油、棉籽油、橄欖油、橄欖鯊烷、棕櫚油、花生油、菜籽油、紅花油、芝麻油、大豆油、葵花油、硬脂酸酯、巴西棕櫚蠟及其混合物。本發明中所使用之動物來源的油包含（但不限於）魚油、鯊魚鯊烷、乳脂、蜂蠟、羊毛蠟、豬油及類似物。在一些情況下，分散油為橄欖鯊烷或鯊魚鯊烷與任何其他類型之油、脂肪或蠟之混合物。油之質量可以大於生物活性劑與黏膜黏附聚合物之組合質量。蛋白質塗層

在一些傳統產物中，在所述粒子製備及通過胃通道期間，大量生物活性劑由於浸出粒子而損失於水性環境中，尤其是分子尺寸較小之生物活性劑，諸如病毒、蛋白質、藥物、抗生素、除害劑及類似物。在本發明中，生物活性劑自粒子浸出主要藉由離散粒子消除，含有生物活性劑之域或相分散於蛋白質中或經蛋白質塗覆。任何類型之蛋白質，包含植物蛋白質、動物蛋白質或乳製品蛋白質，均可以用於塗覆生物活性劑。本發明中所使用之植物來源的蛋白質包含（但不限於）大豆蛋白、小麥蛋白、稻米蛋白、豌豆蛋白及任何其他植物來源的蛋白質。本發明中所使用之動物來源的蛋白質包含（但不限於）魚蛋白質、肉蛋白質及血液蛋白質牛及卵白蛋白及類似物。本發明中所使用之乳製品來源的蛋白質包含（但不限於）任何類型之乳蛋白質，包含酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白及類似物。腸溶塗層聚合物

具有或不具有油塗層的塗覆黏膜黏附聚合物之粒子用一層腸溶塗層聚合物塗覆，所述腸溶塗層聚合物提供胃保護及完整生物活性劑之胃後釋放或輸送，亦即，釋放於腸中。

例示性腸溶塗層聚合物包含在足夠高之pH值下可溶於水中，但在低pH值下不可溶於水之聚合物。其在高於5.0之pH值下是可溶的，且在低於4.0之pH值下是不可溶的。適合聚合物在欲釋放生物活性物質之動物腸中相對溫和之pH條件下實質上為可溶或可消化的，但在胃中為不可溶且難消化的，在胃中腸溶塗層聚合物之外部基質保護敏感性生物活性劑不被降解。在一些情況下，腸溶塗層聚合物例如與二價陽離子交聯以防止在胃中溶解或消化。

適合腸溶塗層聚合物可選自多種親水性聚合物中之任一種，包含例如聚丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸酯、羧甲基纖維素、甲基纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素及水溶性、天然或合成多醣膠。一種例示性合成腸溶塗層聚合物為尤奇特（EUDRAGIT^® ）FS30D（贏創工業（Evonik Industries））。由於海藻酸鈉及果膠之溫和交聯條件，故其為較佳之水溶性膠。

特別是由於海藻酸鹽易用於形成固體凝膠組成物，故其為胃敏感性生物活性劑提供較佳之親水性載劑基質。當與二價陽離子組合或混合時，海藻酸鹽溶液形成固體凝膠。儘管在一些實施例中，海藻酸鹽未交聯，但其在胃環境中仍為難消化且不可溶的，且因此當處於動物胃之低pH值條件下時保護粒子內含物。

海藻酸鹽包括不同比例之1,4-鍵聯之β-D-甘露糖酸（M）、α-L-古洛糖酸（G）及交替（MG）嵌段。海藻酸鹽溶液之黏度主要由M/G嵌段之分子比率測定。低黏度海藻酸鹽可以含有最少50%甘露糖酸單元，且其黏度在20毫帕至200毫帕之範圍內。中等黏度及高黏度海藻酸鹽含有最少50%古洛糖酸單元且其黏度可以超過＞ 200毫帕秒（mPas）。

在一些實施例中，腸溶聚合物為海藻酸鹽、果膠或其混合物。低黏度級海藻酸鹽及低甲氧基果膠為較佳的。一些低甲氧基果膠具有低於50%之甲基化程度，且此等果膠可以與諸如Ba、Ca、Mg、Sr或Zn之二價陽離子交聯。

所述一種或多種腸溶塗層聚合物可以佔粒子重量（不包括水）之至少10%，或至少20%，或至少30%。其可以佔至多70%，或至多50%，或至多40%。可選成分

在一些實施例中，除主要生物活性劑以外，組成物視情況包含養分、營養藥劑、誘食劑及/或掩味化合物。亦可包含滲透增強劑或佐劑。製造組成物

在典型程序中，呈粉末形式之乾燥生物活性物質可以塗覆一層黏膜黏附聚合物。或者，可以將含有生物活性劑之水溶液溶解於黏膜黏附聚合物溶液中，視情況，所述黏膜黏附聚合物溶液可以藉由交聯而凝固。舉例而言，藉由降低溫度或改變乳液之pH值使明膠及瓊脂聚合物凝固；而聚葡萄胺糖是藉由升高乳液之pH值至高於6.5及/或藉由添加諸如三聚磷酸（tripolyphosphate，TPP）鈉之相對離子而凝固。凝固之交聯溶液藉由冷凍乾燥或噴霧乾燥進行乾燥，以形成乾燥顆粒狀物質。乾燥物質接著以一重量份乾燥粒子比1.1重量份至5重量份油的比率塗覆脂肪層，直至產生均勻塗層。為幫助形成均勻且穩定之塗層，可以添加非離子界面活性劑。適合非離子界面活性劑包含（但不限於）乙氧基化脂族醇、聚氧乙烯界面活性劑及羧酸酯等。

第一種製造粒子之通用方式如下。用黏膜黏附聚合物溶液塗覆包括生物活性劑之乾粉物質且接著乾燥以形成具有包括黏膜黏附聚合物之第一塗層的生物活性劑粒子。接著用第二脂肪塗層，通常以1重量份乾燥粒子比1.1重量份至5重量份脂肪之比率塗覆乾燥的塗有黏膜黏附聚合物之生物活性劑。接著用第三腸溶聚合物層，通常以0.5份至1.5份腸溶聚合物比1份生物活性劑之比率塗覆塗有脂肪之粒子。

在第二種通用方法中，對包括分散或溶解之生物活性劑及黏膜黏附聚合物的水性混合物進行噴霧乾燥或冷凍乾燥以產生乾燥的塗有黏膜黏附聚合物之生物活性物質。接著依序用第二脂肪層及第三腸溶聚合物層塗覆所述乾燥物質。

在第三種通用方法中，依序用第二腸溶聚合物塗層及第三脂肪塗層塗覆根據第一通用方法或第二通用方法製造的塗有黏膜黏附聚合物之生物活性劑。

在第四種通用方法中，將根據以上三種通用方法之脂肪層與蛋白質層混合或用蛋白質層替換。使用組成物

本發明之組成物可以儲存於水性懸浮液中，或藉由此項技術中已知之任何乾燥方法乾燥且以脫水狀態長期儲存，而無顯著活性損失。

本發明之組成物可以作為飲用水之一種組分、作為食物添加劑或作為含有醫藥學上可接受之載劑及可選佐劑之調配物的一部分經口投予。或者，本發明之組成物可以包含於其他標準口服劑型中。熟習此項技術者應瞭解，存在多種適用於將組成物輸送至目標動物的技術公認之食物、飼料、營養藥劑或醫藥劑型及可接受之載劑。

根據本發明之組成物可以按單次或多次劑量方案進行投予。在一個實施例中，生物活性組成物是以多劑量方案，經約3天至約10天或超過10天之時間段投予，且其可依據目標物種免疫性損失之證據而定期重複。

為了應用於豬、家禽、牛或水生動物之飲用水中，可以將其他油或惰性聚丙烯或聚酯粒子併入組成物中以增加浮力（亦即，降低密度）以使在魚類培養槽中進行輸送之供水裝置可以用於輸送本發明組成物。因此，所述組成物可以作為動物日常飼料之組分或其飲用水之組分向動物投予。實例 實例 1a 製備本發明之組成物

按以下製備本發明之組成物。在50℃下將三公克黏膜黏附聚合物（聚葡萄胺糖，FMC生物聚合物公司（FMC Biopolymers Inc.））溶解於100毫升0.5 N冰醋酸溶液中。用氫氧化鈉將溶液之pH值調整至5.8且使溶液冷卻至室溫。添加吐溫80（Tween 80）（0.2%，密蘇里州聖路易之西格瑪（Sigma, St Louis, MO））及消泡劑（0.5%，密蘇里州聖路易之西格瑪）且將聚葡萄胺糖溶液保持於4℃待用。將30毫升含有300毫克卵白蛋白（「ovalbumin（OVA）」，一種模型疫苗）之溶液添加至聚葡萄胺糖溶液中以產生混合物。將所得溶液添加至195公克含有5%斯潘-80（Span-80）（西格瑪）之橄欖油中且於冰浴中以每分鐘10,000轉均質化30分鐘以形成油包水乳液。在混合下，將20毫升三聚磷酸鈉水溶液（5%）及0.5 N NaOH緩慢添加至在連續油相中含有卵白蛋白及交聯聚葡萄胺糖微米粒子之生物活性劑乳液中。使粒子硬化至少2小時，但不自油相移出。

將粒子於油中之分散液攪拌加入330毫升9%之低黏度級海藻酸鈉（FMC生物聚合物公司）水溶液中，所述水溶液亦含有66公克寡醣（即溶菊糖，明尼蘇達州明尼阿波利斯之嘉吉（Cargill, Minneapolis, MN））、10公克卵磷脂及3公克吐溫-80。將所得水性分散液注入含有5% CaCl₂ 之交聯溶液中以形成海藻酸鹽基質珠粒，各珠粒含有多個小油滴，小油滴又各自含有卵白蛋白及交聯聚葡萄胺糖之微米粒子。冷凍乾燥所述珠粒且將其研磨成尺寸小於150微米之粒子以獲得乾燥之本發明組成物。實例 1b

形成本發明組成物之一替代方法利用生物活性劑水溶液於油中之乳液。將10毫升含有100毫克卵白蛋白之水溶液與15公克含有5%斯潘-80之菜籽油組合且均質化以形成精細油包水乳液。將乳液與100毫升3%聚葡萄胺糖水溶液混合，且將分散液注入含有5%三聚磷酸溶液（5% TPP）之交聯溶液中。使粒子硬化至少2小時。所得固體狀交聯聚葡萄胺糖粒子含有包埋之小油滴，且這些小油滴各自又分散有小於10微米之卵白蛋白水溶液液滴。藉由過濾分離固體粒子且將其精細地分散於400毫升9%低黏度級海藻酸鹽水溶液中。將所得水性分散液注入含有5% CaCl₂ 之交聯溶液中以形成海藻酸鹽基質珠粒。冷凍乾燥所述珠粒且將其研磨成尺寸小於150微米之粒子以獲得乾燥之本發明組成物。實例 2 製備免疫原性組成物

在50℃下將聚葡萄胺糖（3公克，FMC生物聚合物）溶解於100毫升0.5 N冰醋酸溶液中。用氫氧化鈉將溶液之pH值調整至5.8且使溶液冷卻至室溫。將10毫升含有100毫克卵白蛋白（OVA，作為模型疫苗）之溶液與50毫克免疫刺激劑（β葡聚糖，佐治亞州亞特蘭大之AHD國際（AHD International，Atlanta, GA））混合且添加至聚葡萄胺糖溶液中。以每分鐘10,000轉使所得混合物在150公克含有5%（w/w）斯潘-80的鯊魚鯊烷油（傑德沃德國際（Jedwards International））中乳化30分鐘，形成OVA、聚葡萄胺糖及β葡聚糖之水溶液液滴於連續油相中之乳液。在攪拌下，將乳液添加至400毫升9%低黏度級海藻酸鈉於0.5 N NaOH中之水溶液中，所述水溶液亦含有寡醣（40 g，即溶菊糖）。將所得乳液注入5% CaCl₂ 溶液中以交聯海藻酸鹽，產生本發明之免疫原性組成物。冷凍乾燥所述組成物且將其研磨成尺寸小於250微米之粒子。實例 3 製備用於治療 / 預防魚類寄生物感染之組成物

製備用於治療魚類寄生物感染的含有蛋白質抗原或殺寄生物化合物之組成物。如以上實例2中所述，將10毫克生物活性劑溶解於10毫升3%聚葡萄胺糖水溶液中，且在15公克含有75%橄欖油、20%鯊烷油及5%斯潘-80之油混合物中乳化。

在1公克橄欖油中乳化1毫升5%三聚磷酸鈉水溶液、0.5 N NaOH溶液且將其混合至生物活性劑乳液中，產生含有生物活性劑及交聯聚葡萄胺糖之粒子於油中之分散液。使分散液靜置2小時以使交聯聚葡萄胺糖硬化。在攪拌下，將所得粒子於油中之分散液添加至20毫升含有9%低黏度級海藻酸鈉、1%低甲氧基果膠、30% w/w即溶菊糖及1%吐溫-80之溶液中。將所得混合物注入含有3% CaCl₂ 之交聯溶液中，形成含有包埋之分散小油滴的海藻酸鹽-果膠基質珠粒，所述分散小油滴各自又含有生物活性劑及交聯聚葡萄胺糖之微米粒子。冷凍乾燥所述珠粒且將其研磨成尺寸小於150微米之粒子以獲得乾燥之本發明組成物。實例 4 製備含有醫藥級藥物之組成物

製備用於治療結腸疾病的含有醫藥級藥物（糖皮質激素，諸如地塞米松（dexamethasone）或甲基潑尼龍（methyl prednisolone）)之組成物。如以上實例1或實例2中所述，將藥物添加至聚葡萄胺糖溶液中，且在95%鯊烷油與5%斯潘-80之混合物中乳化。製備在鯊烷油中含有5%三聚磷酸鈉之0.5 N NaOH溶液的鹼性乳液，且將其緩慢混合（20% w/w）至生物活性劑乳液中以交聯聚葡萄胺糖，且使混合物靜置至少2小時以使經交聯之粒子硬化。以1:3之乳液/尤特奇（Eudragit）液體比率將聚葡萄胺糖微米粒子之油分散液混合至含有腸溶塗層聚合物（30% w/w尤特奇FS30D，贏創工業）中，且將其噴霧乾燥，形成乾燥之本發明之顆粒狀組成物。實例 5 本發明組成物中生物活性劑之包封效率

使用卵白蛋白（OVA）模擬典型蛋白質藥物或疫苗來評價本發明組成物中其他油分散液及腸溶塗層聚合物基質之作用。製備三種含有OVA（西格瑪）之組成物。組成物1由OVA結合之聚葡萄胺糖微米粒子組成，所述微米粒子是藉由將100毫克OVA溶解於10毫升3%聚葡萄胺糖溶液中，且將所述溶液注入10% TPP水溶液中以形成經交聯之珠粒，隨後保持2小時以使珠粒硬化且接著進行冷凍乾燥及研磨來製備。組成物2是藉由以下方式製造：在15公克含有3%斯潘-80之鯊烷油中乳化10毫升含有100毫克OVA之水溶液，且將所得乳液混合於20毫升3%聚葡萄胺糖溶液中。隨後將所得漿液注入10% TPP溶液中以形成珠粒，隨後如上進行硬化、冷凍乾燥及碾磨。組成物3是由如實例2中所製備的根據本發明之OVA結合之聚葡萄胺糖微米粒子組成。

如下測定三種類型組成物中OVA之包封效率。使500毫克各組成物分散於10毫升RIPA緩衝液中且在室溫下培養30分鐘。渦旋懸浮液5分鐘，且接著以每分鐘3000轉離心15分鐘。如下使用西方墨點分析（Western Blot analysis）來分析上清液中之OVA含量。

西方墨點法：如上所述，用RIPA緩衝液溶解所述組成物，且將相當於每個樣品12微克之計算量的蛋白質裝載於10% SDS-聚丙烯醯胺梯度凝膠（SDS-polyacrylamide，SDS-PAGE；加利福尼亞州赫拉克勒斯之拜耳雷德（Bio-Rad, Hercules, CA））上。將蛋白質轉印至PVDF薄膜（拜耳雷德）上且用含有5%脫脂牛奶之含0.5%吐溫-20之PBS（PBS-T）阻斷1小時。在室溫下，將墨點與以1:5000稀釋之適當初級抗體一起培養1小時。用PBS-T（3×10毫升，各5分鐘）洗滌之後，將膜與以1:5000稀釋之適當的HRP偶聯之二級抗體（美國馬薩諸塞州比勒利卡之EMD密理博公司（EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA））一起培養1小時。用PBS-T（3×10毫升，各5分鐘）洗滌之後，用ECL基質（安沙拉姆生物科學公司（Amsheram Biosciences））使化學發光薄膜顯影。OVA之包封效率（OVA初始量之保留百分比）呈現於表1中。 表1

結果表明，組成物2及組成物3中油分散液之保護作用防止生物活性劑浸出（損失）至單純水性環境中。然而，如以下實例7中所述，在胃條件下測試時，發現比較性組成物2與本發明組成物3之間存在顯著差異。實例 6 模擬胃液中未保護之蛋白質抗原活性之降解

為評價蛋白質抗原在典型胃暴露之後的活性損失情況，在37℃下，在振盪器上於10毫升含有0.08%胃蛋白酶之pH-2模擬胃液中培養未包封之OVA（10毫克）2小時。在培養15分鐘、30分鐘、60分鐘及120分鐘時間時抽出培養基，且使用如上所述之西方墨點分析來分析殘餘OVA之量。表2顯示經2小時模擬胃液暴露之OVA之降解情況，以殘留活性相對於暴露前活性之百分比指示。 表2

這些結果表明，未保護之蛋白質類抗原或生物活性劑之活性將在動物消化道中完全降解。實例 7 本發明組成物中生物活性劑之胃保護

為了評價胃暴露之後蛋白質抗原之殘留活性，如實例5中所述製備三種組成物。在37℃下，在振盪器上於10毫升含有0.08%胃蛋白酶之pH-2模擬胃液中培養500毫克三種組成物中之每一者2小時。在2小時暴露結束時，抽取胃溶液且如實例5中所述量測組成物中OVA之殘留活性。表3顯示在暴露於模擬胃液2小時之後每一組成物中OVA之殘留活性。 表3

這些結果清楚地表明，相對於先前技術組成物1及組成物2，本發明之組成物3具有優良之胃保護作用。實例 8 組成物中海藻酸鹽之黏度等級對於胃保護之影響

根據以上實例2製備含有9%低級黏度之海藻酸鹽（50厘泊）、6%中級黏度之海藻酸鹽（300厘泊）及1%高級黏度之海藻酸鹽（800厘泊）之三種組成物。如實例7中所述，使三種組成物暴露於模擬胃液且如實例5中所述量測組成物中OVA之殘留活性。表4顯示在暴露於模擬胃液2小時之後每一組成物中OVA之殘留活性。 表4

這些結果表明，含有較低黏度等級海藻酸鹽之組成物在模擬動物消化道中為蛋白質類抗原或生物活性劑提供較高保護作用。實例 9 本發明組成物之最佳粒度

在本實例中，評估乾燥且經碾磨之本發明組成物之粒度在模擬胃環境中的保護作用。如實例5中所述製備OVA組成物，隨後將乾燥粉末分成2種粒度：穿過50微米篩網之小粒子，及捕捉在50微米篩網上但通過100微米篩網之大粒子。表5顯示在模擬胃液中暴露2小時之後每一粒度之組成物中OVA之殘留活性。 表5

這些結果顯示，乾燥組成物當碾磨成大於50微米之粒度時提供最佳胃保護。實例 10 向小鼠經口投予 OVA 組成物

向小鼠經口投予卵白蛋白以測試本發明組成物在誘導免疫反應方面之功效。

動物：使用10週齡至12週齡之雌性BALB/C小鼠。使小鼠隨意取食。每一實驗組圈養在單獨的籠內。

卵白蛋白組成物：如實例5中所述將卵白蛋白（1毫克/公克卵白蛋白，密蘇里州聖路易之西格瑪）併入本發明組成物中。每組4隻之三組小鼠接種如下：1）經口投予呈組成物形式之卵白蛋白（OVA），2）皮下（subcutaneously，SC）投予OVA溶液，3）經口投予不含抗原之組成物。在0週及3週時接種小鼠。每一劑投予塗覆至飼料糰粒上的呈1:2 w/w之乾燥組成物/油比率的乾燥組成物與玉米油之混合物總共100毫克。在第4週時對每隻小鼠實施安樂死且收集血清及脾細胞。

免疫分析：藉由ELISA分析血清中之IgG及IgA。ELISA是使用吸收至聚苯乙烯盤之OVA進行。在1:25之血清稀釋度下將樣品一式三份地置放於孔中。依序使用與辣根過氧化酶偶聯之山羊抗小鼠抗體，以及鄰苯二胺受質（美國密蘇里州聖路易之西格瑪）。藉由將盤置放於微量滴定盤分光光度計中且在490奈米下讀取盤來測定每個孔之光學密度。使用先前所述之技術測試脾細胞中的OVA特異性抗體分泌細胞（antibody secreting cells，ASC）。

藉由測定光學密度隨時間之增加來定量OVA特異性IgG及IgA抗體。預期用OVA接種之每隻小鼠的OVA特異性血清以及IgA、IgG及ASC分泌細胞將在注射OVA之小鼠與經口飼餵本發明組成物之小鼠中同等地增加。預期在飼餵不含抗原之組成物的小鼠中不能偵測到OVA特異性IgG或IgA抗體。因此，預期所述組成物在經口投予時有效誘導免疫反應。實例 11 向雞經口投予含有抗原之組成物

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis ）為產蛋母雞患病之主要原因。感染使產蛋減少且增加雞群之死亡率。此外，腸炎沙門氏菌可以經由雞蛋傳至小雞，從而感染隨後數代或食用受感染雞蛋的人類。由於感染始於此細菌附著及侵襲腸黏膜，且長期感染涉及腸淋巴組織之感染，故刺激黏膜免疫性為控制此疾病必不可少的。

為評估用本發明之疫苗組成物對雞進行疫苗接種之功效，將腸炎沙門氏菌之鞭毛蛋白（一種關鍵免疫原）併入根據實例2之組成物內，不同之處在於以1:2之重量比將疫苗乳液混合於鹼性海藻酸鈉相中且噴霧乾燥漿液。將乾燥組成物頂塗於飼料上且經口投予小雞。以2週之時間間隔，使10週齡之雞接受3次口服劑量的載有300微克腸炎沙門氏菌之鞭毛蛋白抗原或牛血清白蛋白之組成物。口服最後一劑抗原後一週，收集血清及腸液且藉由ELISA分析鞭毛蛋白特異性抗體。預期結果顯示經口疫苗接種之鳥類在血清中具有顯著增加之鞭毛蛋白特異性抗體。實例 12 向牛犢經口投予含有抗原之組成物

展示經口投予根據本發明製備的含有卵白蛋白之組成物刺激牛犢肺中之免疫反應的功效。

將卵白蛋白併入如實例1a中所述之組成物中。為向牛犢經口投藥，在飼料中投予每毫克含有40微克劑量卵白蛋白之組成物。每個實驗組使用四頭牛犢且每一牛犢接受每劑5毫克卵白蛋白，連續5天。

使用兩組牛犢評估經口投予之卵白蛋白誘導特異性免疫反應之功效。第1組間隔3週藉由皮下（SC）注射以不完全弗氏佐劑（incomplete Freund's ajuvant）給予的2劑卵白蛋白。這一組充當非經腸對照組，疫苗接種方法常規地用於任何疫苗。第2組間隔3週接受2個口服療程的含有卵白蛋白之組成物。評價血清對卵白蛋白之同型抗體反應。預期結果顯示，在經口飼餵含OVA之組成物的牛犢中產生大量OVA特異性IgG及IgA。預期之極高含量之血清IgA預示著刺激牛全身免疫反應之較高效用。實例 13 向魚經口投予含有抗原之組成物

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus ）為水產養殖中之嚴重細菌感染，在虹鱒魚(rainbow trout)中特別嚴重。目前其為所有產鱒魚之國家中特有的，在這些國家中其可造成重大經濟損失。其亦逐漸變為養殖鮭魚之較重要之病原體，主要見於淡水生長期中，而且據報告，其亦造成海洋中之損失。疫苗接種可防止溶藻弧菌在鮭魚養殖週期之任何階段造成顯著影響。典型疫苗接種方案涉及2公克至5公克魚苗之初次疫苗接種以及在初次疫苗接種4個月至6個月後之口服輔助劑疫苗接種。然而，為了在整個培養期中使魚血清維持有效抗體力價，理想的疫苗接種方案涉及定期提供給魚僅一種類型之疫苗接種。

實驗設計：展示經口投予根據本發明製備的含有ERM疫苗之組成物刺激鱒魚血清中之免疫反應的功效。

將減毒溶藻弧菌併入如實例1b中所述之組成物內。為向魚經口投藥，在飼料中投予每毫克含有2微克劑量溶藻弧菌疫苗之組成物。每個實驗組使用20條平均尺寸為5公克之魚，且每條魚在飼料定量中接受1劑溶藻弧菌疫苗，連續5天。

使用三組魚，相對於藉由注射進行之標準疫苗接種來評估經口投予溶藻弧菌疫苗誘導免疫反應之功效。第1組是使用藉由注射方案進行之疫苗接種來疫苗接種。這一組充當非經腸對照組，疫苗接種方法常規地用於任何疫苗。第2組接受含有溶藻弧菌疫苗之組成物的口服療程。第3組接受不含疫苗之組成物的口服療程。疫苗接種6週後評價血清對溶藻弧菌之同型抗體反應。預期結果顯示，在經口飼餵含溶藻弧菌之組成物之魚中產生大量溶藻弧菌特異性IgA。預期經口與注射疫苗接種之魚中之血清免疫反應是類似的。預期之極高含量之血清IgA預示著在魚中刺激全身性免疫反應之良好效用。實例 14 含有滅鼠劑之組成物

a）此實例描述含有塗覆脂肪，隨後塗覆另外的腸溶聚合物塗層之殺寄生蟲化合物之乾燥組成物的製備，所述脂肪用作掩蔽劑且用以改善動物飼料之可口性。在45℃下，將CEBES 27-70（新澤西州紐瓦克港奧胡斯聯合美國公司（Aarhus United USA Inc., Port Newark, NJ））及17-硬脂（伊利諾伊州查納恩之羅德斯克拉安南美有限公司（Lodres Croklaan N. America LLC., Channahon, IL））之350公克混合物（1:1 w/w）熔融。在45℃及攪動下，將350公克呈乾粉形式之滅鼠劑緩慢混合於所述熔融脂肪中。在持續攪動下，使所述物質冷卻至室溫且冷凍最終顆粒狀物質，接著研磨並經由400微米篩網進行篩分。首先在攪動下，用350公克9%低黏度海藻酸鹽（西格瑪）溶液塗覆硬化之生物活性劑脂肪混合物，以在所述顆粒狀粉末上形成海藻酸鹽沈積層。空氣乾燥所述物質且經由500微米篩網篩分。將1050公克尤特奇FS30D（德國埃森（Essen Germany）之贏創工業）緩慢噴塗於攪動之物質上且空氣乾燥所述物質，並經由600微米篩網篩分。

b）第二實例描述含有首先塗覆腸溶聚合物，隨後塗覆另外的脂肪塗層之抗原疫苗或殺寄生蟲化合物之乾燥組成物的製備，所述脂肪塗層用作掩蔽劑且用以改善動物飼料之可口性。在攪動下，將350公克呈乾粉形式之滅鼠劑與350公克9%低黏度海藻酸鹽（西格瑪）溶液混合以在顆粒狀粉末上聚結並形成海藻酸鹽沈積層。空氣乾燥所述物質且經由250微米篩網篩分。將1050公克尤特奇FS30D（德國埃森之贏創工業）噴塗於攪動之物質上且空氣乾燥所述物質，並經由400微米篩網篩分。在45℃下，將CEBES 27-70（新澤西州紐瓦克港奧胡斯聯合美國公司）及17-硬脂（伊利諾伊州查納恩之羅德斯克拉安南美有限公司）之320公克混合物（1:1 w/w）熔融且接著在45℃及攪動下緩慢混合於所述乾粉中。在持續攪動下，使所述物質冷卻至室溫且經由600微米篩網篩分最終顆粒狀物質。

c）第三實例描述塗覆腸溶聚合物，隨後塗覆另外的蛋白質塗層之抗原疫苗或殺寄生蟲化合物之乾粉的製備，所述蛋白質塗層用作掩蔽劑且用以改善動物飼料之可口性。在攪動下，將350公克呈乾粉形式之乾燥滅鼠劑與350公克9%低黏度海藻酸鹽（西格瑪）溶液混合以在顆粒狀粉末上聚結並形成海藻酸鹽沈積層。空氣乾燥所述物質且經由250微米篩網篩分。將1050公克尤特奇FS30D（德國埃森之贏創工業）噴塗於攪動之物質上且空氣乾燥所述物質，並經由400微米篩網篩分。接著在持續攪動下，以與利用尤特奇所描述相同之方式施加2000公克含有16%酪蛋白鹽（西格瑪）之溶液且空氣乾燥最終顆粒狀物質並經由600微米篩網篩分。實例 15 小鼠侵擾之防治

使用最常見的滅鼠劑華法林（Warfarin）來防治大鼠及小鼠侵擾。攝取含華法林之誘餌的嚙齒動物在15分鐘至30分鐘內展現明顯中毒症狀，且在1小時至2小時內變得無意識。然而，由於其快速起效，嚙齒動物通常攝取亞致死量之華法林且在8小時內出現恢復。包封華法林可延緩症狀發作，使其可攝取完整致死劑量。

實驗方法：使用10週齡至12週齡之雌性BALB/C小鼠。使小鼠隨意取食。每一實驗組圈養在單獨的籠內。

本發明之華法林組成物：將華法林（400毫克/公克組成物，密蘇里州聖路易之西格瑪）併入如實例14a中大體上描述之組成物中。每組4隻之三組小鼠各自隨意取食如下：1）以4%華法林活性混合於誘餌中的本發明之華法林組成物；2）以4%華法林活性混合於誘餌飼料中之未包封華法林；3）含有如實例14a中之組成物且不含華法林或其他生物活性劑之誘鉺。監測飼料之攝入及對小鼠之殺滅效果。

結果顯示，第1組與第3組之飼料攝入為類似的，而第2組之飼料攝入（未包封華法林）減少超過25%。預期第1組中之所有小鼠在取食8小時後死亡，而所有第2組小鼠在取食8小時後仍然存活。實例 16 大鼠侵擾之防治

實驗方法：使用250公克至500公克大鼠。使大鼠隨意取食。每一實驗組圈養在單獨的籠內。

本發明之華法林組成物：將華法林（400毫克/公克組成物，密蘇里州聖路易之西格瑪）併入如實例14b中大體上描述之組成物中。每組4隻之三組大鼠各自隨意取食如下：1）以4%華法林活性混合於誘餌中的本發明之華法林組成物；2）以4%華法林活性混合於誘餌飼料中之未包封華法林；3）含有如實例14b中之組成物且不含華法林或其他生物活性劑之誘鉺。監測飼料之攝入及對大鼠之殺滅效果。

結果顯示，第1組與第3組之飼料攝入為類似的，而第2組之飼料攝入（未包封華法林）減少超過25%。預期第1組中之所有大鼠在攝食8小時後死亡，而所有第2組大鼠在攝食8小時後仍然存活。實例 17 模型蛋白質之胃保護

此實例描述蛋白質（BSA，西格瑪）在模擬胃液中之釋放特徵。如實例15a中所描述，使用具有不同pH釋放特徵之兩種腸溶塗層聚合物（尤奇特 FS30D及L30D55）包封所述蛋白質。使用模擬胃液（pH=2）進行活體外釋放研究。將0.5公克經包封之蛋白質樣品懸浮於10毫升模擬胃液中且在37℃下，在旋轉振盪器上以每分鐘150轉培養2小時。培養30分鐘及120分鐘之後，取出樣品，在595奈米下以分光光度法讀取。表6中之結果證實，具有高pH釋放尤特奇FS30D（約pH 6.5）之第二塗層的生物活性劑在胃暴露中之保護作用明顯優於具有低pH釋放尤特奇L30D55（約pH 5.5）之第二塗層的生物活性劑。 表6.模型蛋白質在模擬胃液中之釋放特徵 實例 18 模型蛋白質之胃釋放及腸釋放

此實例描述蛋白質（BSA，西格瑪）在模擬胃液及模擬腸液中之釋放特徵。如實例15a中所描述，使用如實例16中所描述的具有不同pH釋放特徵之兩種腸溶塗層聚合物（尤奇特FS30D及L30D55）包封所述蛋白質。使用模擬胃液及模擬腸腸液（分別為pH=2及pH=6.8）進行活體外釋放研究。將0.5公克經包封之蛋白質樣品懸浮於10毫升模擬胃液中，保持30分鐘或120分鐘，隨後對應地在腸液中培養相同時間。所有培養均在37℃下於旋轉振盪器上以每分鐘150轉進行。培養30分鐘及120分鐘之後，取出樣品，在595奈米下以分光光度法讀取。表7中之結果證實，具有高pH釋放尤特奇FS30D（約pH 6.5）之第二塗層的生物活性劑在腸中之2小時暴露內逐漸釋放，而具有低pH釋放尤特奇L30D55（約pH 5.5）之第二塗層的生物活性劑大部分在胃中暴露的前30分鐘內釋放。總的來說，實例2及實例3中之結果顯示，本發明之組成物在動物胃環境中有效地保護生物活性劑且活性損失低於20%，而在腸環境中，其完全釋放。 表7.模型蛋白質在模擬胃液及模擬腸液中之釋放特徵 實例 19 第二塗層之層厚度的優化

為了評價第二塗層之層厚度對胃釋放及腸釋放的影響，如實例15a中所描述，用50%或100%之尤特奇FS30D塗層製備組成物。活體外釋放研究如實例16及及實例17中所描述進行。表8中之結果顯示具有100%或僅50%之第二塗層之組成物中生物活性劑之釋放特徵。其顯示，在較低量之腸溶聚合物塗層下可以更好地實現有利的釋放特徵。 表8.模型蛋白質在模擬胃液及模擬腸液中之釋放特徵隨組成物中腸溶塗層物質之量的變化 實例 20 在飼料粒化暴露期間組成物之穩定性

如實例15a中所描述製備經包封之模型蛋白質。所述組成物經歷模擬工業飼料粒化條件，藉由在80℃水浴中培養5分鐘，隨後在製錠機中在1公噸壓力下製錠。將經製錠之組成物碾碎，懸浮於10毫升水中且在595奈米下藉由分光光度計評價釋放之蛋白質的量。發現在苛刻之粒化暴露之後，組成物中68.4%之蛋白質保持完整。

當提及可量測值，諸如量、百分比及類似值時，如本文中所用的術語「約」意欲涵蓋自指定值之±20%或±10%，更佳±5%，甚至更佳±1%，且再更佳±0.1%之變化，因此變化是適當的。

本文中引用的所有文獻、書、手冊、論文、專利、公開之專利申請案、指南、摘要及其他參考文獻以全文引用之方式併入。考慮本文中所揭示之本發明之說明書及實踐，熟習此項技術者將清楚本發明之其他實施例。預期說明書及實例僅被視為例示性的，且本發明之真實範疇及精神是由以下申請專利範圍指示。

無

無

無

Claims (20)

1. 一種用於對動物輸送活性劑的組成物，其包括活性劑、第一塗層、第二塗層及第三塗層，其中所述活性劑塗覆有所述第一塗層，其中所述第一塗層塗覆有所述第二塗層，其中所述第二塗層塗覆有所述第三塗層，其中所述活性劑與所述第一塗層接觸，不與所述第二塗層或所述第三塗層接觸，其中所述第一塗層將所述活性劑與所述第二塗層分離，其中所述第二塗層將所述第一塗層與所述第三塗層分離，其中所述第一塗層、所述第二塗層及所述第三塗層彼此不同，並且其中所述第一塗層、所述第二塗層及所述第三塗層各自是由以下所構成的族群中選出：（a）包括一種或多種腸溶聚合物之腸溶聚合物層、（b）包括一種或多種脂肪、一種或多種蛋白質或其組合之脂肪/蛋白質層及（c）包括一種或多種黏膜黏附聚合物之黏膜黏附聚合物層。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用於對動物輸送活性劑的組成物，其中所述第一塗層為所述黏膜黏附聚合物層，其中所述第二塗層為所述腸溶聚合物層，並且其中所述第三塗層為所述脂肪/蛋白質層。
3. 如申請專利範圍第1項所述的用於對動物輸送活性劑的組成物，其中所述第一塗層為所述黏膜黏附聚合物層，其中所述第二塗層為脂肪/蛋白質層，並且其中所述第三塗層為所述腸溶層。
4. 如申請專利範圍第1項所述的用於對動物輸送活性劑的組成物，其中所述第一塗層為所述脂肪/蛋白質層，其中所述第二塗層為所述黏膜黏附聚合物層，並且其中所述第三塗層為所述腸溶層。
5. 如申請專利範圍第1項所述的用於對動物輸送活性劑的組成物，其中所述腸溶聚合物是由以下所構成的族群中選出：海藻酸鹽、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素（HPMC）、聚(DL-丙交酯)、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)及其混合物。
6. 如申請專利範圍第1項所述的用於對動物輸送活性劑的組成物，其中所述脂肪是由以下所構成的族群中選出：氫化油或部分氫化之油、椰油、棕櫚油、棕櫚仁油、硬脂酸鹽、蠟及其混合物。
7. 如申請專利範圍第1項所述的用於對動物輸送活性劑的組成物，其中所述蛋白質是由以下所構成的族群中選出：乳蛋白、明膠、白蛋白、麩質、大豆蛋白、玉米蛋白及其混合物。
8. 一種用於製備組成物之方法，其包括： （a）將有效量之活性劑與第一塗層混合以形成第一塗覆產物，其中在所述第一塗覆產物中所述活性劑塗覆有所述第一塗層， （b）將所述第一塗覆產物與第二塗層混合以形成第二塗覆產物，其中在所述第二塗覆產物中所述第一塗覆產物塗覆有所述第二塗層，及 （c）將所述第二塗覆產物與第三塗層混合以形成第三塗覆產物，其中在所述第三塗覆產物中所述第二塗覆產物塗覆有所述第三塗層，由此製備出所述組成物，其中所述活性劑與所述第一塗層接觸，不與所述第二塗層或所述第三塗層接觸，其中所述第一塗層將所述活性劑與所述第二塗層分離，其中所述第二塗層將所述第一塗層與所述第三塗層分離，其中所述第一塗層、所述第二塗層及所述第三塗層彼此不同，並且其中所述第一塗層、所述第二塗層及所述第三塗層各自是由以下所構成的族群中選出：（a）包括一種或多種腸溶聚合物之腸溶聚合物層、（b）包括一種或多種脂肪、一種或多種蛋白質或其組合之脂肪/蛋白質層及（c）包括一種或多種黏膜黏附聚合物之黏膜黏附聚合物層。
9. 如申請專利範圍第8項所述的用於製備組成物之方法，其更包括乾燥所述第三層塗覆產物以形成乾燥粒子，其中所述乾燥粒子之平均粒度在約0.1微米至10毫米範圍內。
10. 一種組成物，其藉由如申請專利範圍第8項或第9項所述的用於製備組成物之方法製備。
11. 一種用於使活性劑在動物體內控制釋放之方法，其包括向動物投予有效量的如申請專利範圍第1項至第7項及第10項中任一項所述的組成物。
12. 如申請專利範圍第11項所述的用於使活性劑在動物體內控制釋放之方法，其更包括在pH值為約0.1至3之胃環境中在60分鐘內釋放低於50%之所述活性劑。
13. 如申請專利範圍第11項所述的用於使活性劑在動物體內控制釋放之方法，其更包括在pH值為5至8之腸環境中在120分鐘內釋放至少50%之所述活性劑。
14. 如申請專利範圍第11項所述的用於使活性劑在動物體內控制釋放之方法，其更包括在動物之胃中通過期間使至少50%至90%之所述活性劑保持完整。
15. 如申請專利範圍第11項所述的用於使活性劑在動物體內控制釋放之方法，其更包括將至少50%至90%之所述活性劑輸送至動物之腸中。
16. 一種用於治療或預防動物之疾病或病症之方法，其包括向動物投予有效量的如申請專利範圍第1項至第7項及第10項中任一項所述的組成物，其中活性劑為治療藥物。
17. 一種用於對動物進行疫苗接種之方法，其包括向動物投予有效量的如申請專利範圍第1項至第7項及第10項中任一項所述的組成物，其中活性劑為抗原。
18. 如申請專利範圍第17項所述的用於對動物進行疫苗接種之方法，其中所述抗原來源於由細菌、真菌、病毒及寄生蟲所構成的族群中選出之感染性的微生物，由此在動物中誘導針對所述微生物之特異性保護性免疫反應。
19. 一種用於防治有害生物之方法，其包括向所述有害生物投予有效量的如申請專利範圍第1項至第7項及第10項中任一項所述的組成物，其中活性劑為除害劑。
20. 如申請專利範圍第19項所述的用於防治有害生物之方法，其中所述有害生物之存活率低於5%。