TW201639882A - 對ｈｓｖ－１及ｈｓｖ－２具有強中和活性之人類單株抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於適合用於單純皰疹病毒感染之被動式免疫治療的單株抗體的領域且係關於人類單株抗體或該抗體之片段，其與HSV-1及HSV-2結合並中和HSV-1及HSV-2、以及其等於預防或治療HSV-1或HSV-2相關性疾病的用途。
Description
本發明係屬於適合用於單純皰疹病毒1與2(HSV-1與HSV-2)感染之被動式免疫治療的單株抗體的領域且係關於人類單株抗體或該抗體之片段(其與HSV-1與HSV-2結合並中和HSV-1與HSV-2)與其等於預防或治療HSV-1或HSV-2相關性疾病的用途。
單純皰疹病毒(HSV)感染相關性疾病由於在一般大眾中的高感染率而係一個全球的健康問題。臨床表現包含侵襲皮膚、口、唇、眼睛、或生殖器的小型且疼痛的皰、與諸如發燒與不適的全身性症狀。
HSV在宿主之整個壽命中存留於感覺與自律神經之神經節且週期性地再活動。臨床復發係由數種刺激(諸如壓力、經期、發燒或身體不適、暴露至陽光或曬傷)觸發。
HSV感染之臨床過程強烈地受宿主之免疫情況影響，而嚴重與生命威脅性感染在新生兒與免疫減損患者中發生。
通常地，目標是病毒的DNA的抗病毒劑(諸如阿昔洛韋
(acyclovir))係用於管理HSV感染。此等藥物可導致對治療無反應的抗性病毒突變體，無法根絕潛伏的病毒或預防感染之傳播。
開發預防性疫苗的企圖目前為止並未成功，顯現出對HSV的免疫反應之複雜性。
用於HSV感染的基於抗體的治療由於以下事實而受到關鍵性關注：抗體反應對於預防許多病毒感染而言係重要的且亦可對不同的病毒感染之解除有貢獻。在病毒感染後，抗體係針對多種病毒蛋白質上的許多抗原決定基而製造。此等抗體之次組可藉由稱為中和的過程封阻病毒感染。越來越多人感到對用於對抗HSV感染的新穎策略與選擇的需求。具有HSV中和活性的特殊人類單株抗體可為HSV預防或治療提供新穎、安全且有效的藥劑。
一般被病毒(且特別是被HSV)天然感染會引發抗體反應，其相較於其他的IgG子類型包含較少的IgG2同型。
本案之發明人認為此IgG2之相對少量/缺乏可能與HSV逃脫免疫學壓力的能力相關。此外，本案之發明人認為IgG2之少量/缺乏可能對病毒儘管在免疫反應之存在下仍再活動的能力有貢獻。
因此，本案之發明人藉由評估自一小群HSV血清反應陽性的個體之血清純化的IgG2部分之特性而測試了以下假說：能夠與HSV結合並中和HSV的IgG2之存在係保護性的。本案之發明人展示了自被報導在罹患非常頻繁的事件後無唇皰疹之再活動的單一個體純化的IgG2部分中有高
HSV中和活性。
基於此等結果，本案之發明人決定去在噬菌體顯示組合載體中選殖此個體之全部IgG2並挑選抗HSV抗體以產生IgG2子類型的人類單株抗體。事實上，本案之發明人考慮了以下可能性：此等抗體中的一些可被賦予對抗HSV的強中和活性，其可能代表了所報導的臨床改善之分子基礎。
編碼人類IgG2單株抗體Fab片段的基因已被選殖出且展示其等中的一些事實上被賦予了顯著強的對抗HSV-1與HSV-2的中和活性。
本發明因此係關於用於HSV感染之預防或治療的人類單株抗體，其係對HSV有專一性與選擇性且能夠中和HSV感染。此等抗體代表了技術領域中已知的治療劑的有前途的新替代物。
本發明因此係關於單株抗體與該抗體之片段，其與HSV-1與HSV-2結合，並可抑制HSV感染。
在第一個方面，本發明係關於一種HSV-1及/或HSV-2結合性單株抗體或其片段，其包含重鏈可變區域(VH)與輕鏈可變區域(VL)兩者，該抗體或其片段包含選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：12所組成的群組的互補性決定區域(CDR)。
根據本發明且具有選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：12所組成的群組的序列的CDR係包含在重鏈可變功能域(VH)中。
在一個較佳的具體態樣中，本發明提供一種HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該抗體具有SEQ ID NO：1之重鏈可變區域
(VH)與SEQ ID NO：2之輕鏈可變區域(VL)。
在其第二個方面，本發明進一步提供一種醫藥組成物，其包含根據本發明的HSV-1及/或HSV-2結合性單株抗體或其片段與醫藥上可接受的載劑。
在第三個方面，本發明提供一種如以上描述的HSV-1及/或HSV-2結合性單株抗體或其片段，其用於HSV-1或HSV-2相關性疾病之預防或治療。
如本發明之詳細描述會進一步描述的，本發明之人類單株抗體具有中和HSV-1與HSV-2感染兩者的優點。無意受限於任何理論，本發明之單株抗體具有減少由HSV-1與HSV-2兩者所導致的融合細胞之形成的優點。
根據本發明的人類單株抗體被賦予了明顯強的對抗HSV-1與HSV-2兩者的中和活性。
此等抗體之無法預期且令人意外的特性可滿足在HSV感染之領域中尚未被滿足的醫療需求。根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性與中和性單株抗體或其片段被強烈地認為是臨床上重要的。根據本發明的抗體或其片段可能能夠填補特別對於能夠避開目前可得的抗病毒藥物或藥劑(諸如阿昔洛韋、伊巴他濱(ibacitabine)、噴昔洛韋(pencyclovir)、泛昔洛韋(famcyclovir)、更昔洛韋(gancyclovir)、伐昔洛韋(valacyclovir)、foscarnet、西多福韋(cidofovir))之活性的單純皰疹病毒的治療缺口。特別地，於醫學文獻中某些皰疹病毒變體如何可藉由使病毒蛋白質(諸如皰疹胸苷激酶(TK)及/或皰疹聚合酶)突變來逃脫抗HSV藥物活性是廣為人知的。此
外，阿昔洛韋藥物抗性暗示對伐昔洛韋與泛昔洛韋的交叉抗性。能夠藉由靶向與病毒TK和病毒聚合酶酵素不同的HSV蛋白質來中和HSV的抗體可能對該等在上述目前可得的抗HSV藥物存在下亦能夠複製的HSV臨床分離株典型具有的抗性模式不敏感。此外，根據本發明的抗體或其片段亦係foscarnet與西多福韋(其目前被用於治療阿昔洛韋抗性病毒但具有差的安全性輪廓)之有效替代物。事實上，抗體在臨床治療上的巨大重要性已被廣泛地展示。特別地，單株抗體(包含衍生自工程技術的多種多樣的抗體形式，諸如Fab片段、雙重專一性或三重專一性Fab(分別為Fab2與Fab3)單鏈(scFv)、雙重專一性scFv(Bis-scFv)、雙體抗體(diabody)、三體抗體(triabody)(三價scFv)、雙價小體(minibody)、四價scFv(四體抗體(tetrabody))、納體(nanobody)與重組的免疫球蛋白)被用於生物學與醫學研究。最重要地，單株抗體亦已被成功地用作為用於治療許多人類疾病(諸如癌症(即乳癌與白血病)、關節炎、氣喘、克羅恩氏病、牛皮癬、移植排斥)的治療劑。此外，用於治療由病毒(即呼吸道融合細胞病毒感染中的帕利珠單抗(palivizumab))、細菌與真菌造成的感染性疾病的新單株抗體之開發代表了研究領域中與用於治療由微生物(包含該等造成慢性疾病者)造成的感染的新策略之開發中最重要的題目。此外，針對上述感染性劑的單株抗體對於用以預防(及/或限制)由微生物病原體造成的感染的新預防方法之開發而言亦極為重要。此外，使用新的基於抗體的治療闡明了利用該抗體之免疫調節性潛力的可能性。
圖1A顯示在來自二十個不同的個體的人類血清中IgG2之存在。星號指示顯示高ELISA-O.D.(光學密度，Optical Density)訊號的血清。黑色框指示衍生自第18號個體的IgG2部分之高ELISA-OD訊號。
圖1B闡明對人類血清(1：10稀釋)進行使用抗人類IgG2抗體來偵測的西方墨點轉漬法(WB)分析之結果。於此分析，來自第18號供者的血清(白框)亦顯示高IgG2含量。WB分析與ELISA分析之結果(圖1A)一致。
圖2係闡明顯示對抗HSV-1與HSV-2去活化病毒的IgG2反應性的ELISA分析之結果的圖。來自第18號個體的血清顯示針對HSV-1與HSV-2的高結合能力。
圖3係顯示融合細胞形成的被HSV-1感染的細胞之10倍(10X)與40倍(40X)放大。評估係於定性性分析中通過明視野相位差光學顯微鏡進行。影像顯示-圖3a：陽性感染(單獨HSV-1病毒)；圖3b：自第18號個體血清純化的IgG2之效果；圖3c：自第2號個體血清純化的IgG2(陰性實驗對照組)之效果；圖3d：未經感染的細胞。
圖4係顯示融合細胞形成的被HSV-2感染的細胞之10倍(10X)與40倍(40X)放大。評估係於定性性分析通過明視野相位差光學顯微鏡進行。影像顯示-圖4a：陽性感染(單獨HSV-2病毒)；圖4b：自第18號個體血清純化的IgG2之效果；圖4c：自第2號個體血清純化的IgG2(陰性實驗對照組)之效果；圖4d：未經感染的細胞。
圖5顯示藉由IIF(間接免疫螢光，Indirect Immuno-Fluorescence)中和分析的定性性中和活性評估。IgG2中和能力係針
對HSV-1測試。影像顯示-圖5a：陽性感染(單獨HSV-1病毒)；圖5b：自第18號個體血清純化的IgG2之效果；圖5c：自第2號個體血清純化的IgG2之效果；圖5d：未經感染的細胞。如於圖5中描繪的，強的病毒複製之抑制係藉由將病毒以第18號個體純化的IgG2預先培養而觀察到(如圖5b中顯示的，缺乏綠色螢光訊號指示病毒複製之抑制)。箭頭指示被HSV-1感染的細胞；Hoechst核染色係淺灰色。
圖6顯示藉由IIF的定性性中和活性評估分析。IgG2中和能力係對HSV-2測試。影像顯示-圖6a：陽性感染(單獨HSV-2病毒)；圖6b：自第18號個體血清純化的IgG2之效果；圖6c：自第2號個體血清純化的IgG2之效果；圖6d：未經感染的細胞。箭頭指示被HSV-2感染的細胞；Hoechst核染色係淺灰色。
圖7係闡明使用溶菌斑減少技術進行的定量性分析的直方圖。自第18號個體純化的IgG2(pIgG2-18)vs對照組(自其他個體純化的IgG2)之抗HSV-1與抗HSV-2中和活性係於此分析中評估。自第18號個體血清純化的IgG2部分強烈地中和所測試的HSV-1與HSV-2兩者之分離株。
圖8係闡明劑量反應中和分析之結果的圖。此分析係使用IIF技術進行的定量性分析(HSV感染病灶之確實數目係使用InCell分析器自動系統評估)。劑量反應HSV-1與HSV-2中和分析系使用pIgG2-18(自第18號個體純化的IgG2)進行。
圖9顯示藉由對經HSV感染的細胞作生物淘選而挑選的Fab殖系之反應性之IIF分析。所有自所構築的文庫挑選的Fab皆僅專一性地辨識經感染的細胞(綠色的FITC訊號係由箭頭指示)。
圖10顯示顯示融合細胞形成的經HSV感染的細胞之40倍(40X)放大。該評估係於定性性分析中透過明視野相位差光學顯微鏡進行。影像顯示-圖10a未經感染的對照組細胞；圖10b具有HSV-1的陽性感染對照組；圖10c具有HSV-2的陽性感染對照組；經純化的Fab對HSV-1與HSV-2的效果(分別地)：Fab Ex2 vs HSV-1(10d)，Fab Ex2 vs HSV-2(10e)；Fab Ex2B vs HSV-1(10f)，Fab Ex2B vs HSV-2(10g)；Fab Ex2C vs HSV-1(10h)，Fab Ex2C vs HSV-2(10i)；Fab Ex2H vs HSV-1(10l)，Fab Ex2H vs HSV-2(10m)，Ex2I vs HSV-1(10n)，與Fab Ex2I vs HSV-2(10o)。
圖11顯示5倍(5X)與20倍(20X)放大。對抗HSV-1與HSV-2的定性性中和活性係通過融合細胞形成分析評估(感染後21h)。影像顯示-陽性感染(單獨HSV-1病毒)，未經感染的細胞，Fab Ex2B、Fab Ex2C、Fab Ex2、Fab Ex2H與Fab Ex2I(10μg/mL)之效果。
圖12闡明針對HSV-1與HSV-2的Fab Ex2中和活性評估(IIF分析)之劑量反應曲線，如於實驗章節中討論的。Fab Ex2於非常低的濃度(對於所測試的HSV-1與HSV-2分離株皆低於5μg/mL)會將對經感染的細胞單層的HSV細胞病變性效果減少50%。X軸指示以[Log10*(mAb之μg/mL)]表現的Fab濃度。(CI=信賴區間)
圖13顯示透過針對HSV-1與HSV-2的融合細胞形成分析的定性性劑量反應中和活性評估之5倍(5X)與20倍(20X)放大照片。影像代表-未經感染的細胞，陽性感染(單獨病毒)，10μg/mL Fab Ex2、5μg/mL Fab Ex2、2.5μg/mL Fab Ex2之效果。A框與C框強調透過高量HSV-1或HSV-2的細胞單層之總瓦解。於經HSV-1感染的細胞中細胞病變
性效果之Fab Ex2劑量依賴性強烈抑制係由B框強調。HSV-2感染之完全抑制係由D框強調。
圖14透過溶菌斑減少分析闡明Fab Ex2之對抗HSV-1與HSV-2兩者之分離株的中和活性。Fab Ex2係以5μg/mL、2.5μg/mL與1μg/mL之濃度測試。即使在最低的所測試濃度(1μg/mL)，Fab Ex2亦完全預防HSV-2感染。
圖15A IgG A對抗特徵為對阿昔洛韋有不同敏感性的HSV1與HSV2分離株的中和性活性。在右邊的表顯示IgG A對抗HSV之臨床分離株的IC50。紅框指示HSV 1與2參考病毒株。
圖15B用於吸附後分析中的Fab A與IgG A之生物活性之比較(病毒後代中和與細胞至細胞傳播抑制)。
圖16A Kaplan-Meicr存活曲線。此圖顯示在病毒致命性攻擊前24個小時以兩種不同濃度(15mg/kg與5mg/kg)的對抗HSV-2攻擊的IgGA之單一全身性投予來處理的小鼠之存活率(此圖中亦包含對照組)。
圖16B在病毒致命性攻擊前24個小時以兩種不同濃度(15mg/kg與5mg/kg)的對抗HSV-2攻擊的IgGA之單一全身性投予來處理的小鼠之臨床分數評估。
IgGA圖16C在病毒致命性攻擊前24個小時以兩種不同濃度(15mg/kg與5mg/kg)的對抗HSV-2攻擊的IgGA之單一全身性投予來處理的小鼠之臨床症狀。
IgGA圖17A Kaplan-Meier存活曲線。此圖顯示對抗HSV-2攻擊的兩個劑量組之小鼠之完整保護(在存活百分率率方面)(感染後30
分鐘與24h)。
IgGA圖17B對抗HSV-2攻擊的兩個劑量組之小鼠之臨床分數評估(感染後30分鐘與24h)。
圖17C對抗HSV-2攻擊的兩個劑量組之小鼠之臨床症狀(感染後30分鐘與24h)。
IgGA圖18A Kaplan-Meier曲線：在HSV-2攻擊後30分鐘以IgGA(單一注射)處理的鼠類群之存活率。
圖18B在HSV-2攻擊後30分鐘以IgGA(單一注射)處理的鼠類群之臨床分數評估。接受任一IgGA濃度的小鼠皆未顯示任何HSV臨床症狀。
圖18C在HSV-2攻擊後30分鐘以IgGA(單一注射)處理的鼠類群之臨床症狀。接受任一IgGA濃度的小鼠皆未顯示任何HSV臨床症狀。
圖19A Kaplan-Meier曲線：在HSV-2眼睛致命性攻擊後以IgGA之全身性投予(單一投予)處理的小鼠之存活率。
圖19B在HSV-2或HSV-1攻擊眼睛致命性攻擊後以IgGA之全身性投予(單一投予)處理的鼠類群之臨床分數評估。「Y」軸顯示以上描述的臨床分數。圖上的各值代表每個小鼠組之總臨床分數之平均數±SEM(0至5)。
圖19C以IgGA處理的鼠類群之臨床症狀。
本發明係關於單株抗體與該抗體之片段，其與HSV-1與HSV-2結合，且其可抑制HSV感染性。
在第一個方面，本發明係關於一種HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其抗原結合性片段，其包含重鏈可變區域(VH)與輕鏈可變區域(VL)兩者，該抗體或其片段包含選自由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、與SEQ ID NO.12所組成的群組的互補性決定區域(CDR)。
互補性決定區域(Complementarity Determining Region，CDR)係免疫球蛋白(抗體)中的可變鏈之部分，於該位置此等分子與其等的專一性抗原結合。CDR相當於該等分子變化最大的部分，且對於淋巴球所產生的抗原專一性之多樣性而言是重要的。
根據本發明的CDR序列之優點之一係其等允許該抗體或該抗體之片段對第1型HSV(HSV-1)與第2型HSV(HSV-2)兩者的非常專一的結合親和力。
事實上，根據本發明的單株抗體即使在非常低的濃度亦顯示超過50%的HSV抑制能力。無意受限於任何理論，此專一性與高病毒中和能力亦可歸因於其CDR序列。
在一個進一步的方面，本發明係關於一種HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該重鏈可變區域(VH)係選自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、與SEQ ID NO.10、或其直接等效物所組成的群組。
用於本文，該等重鏈可變區域之直接等效物意指一些序列，其等較佳地與該等VH可變區域具有至少95%總體序列類似性、同源性或一
致性且能夠以低於5μg/ml的濃度抑制HSV-1及/或HSV-2兩者之活性達50%，彼此獨立地。
根據本發明的VH可變區域之直接等效物具有至少96%、97%、98%或99%總體序列類似性或同源性。
在一個進一步的方面，本發明係關於一種HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該輕鏈可變區域(VL)係選自由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、與SEQ ID NO.13、或其直接等效物所組成的群組。
用於本文，輕鏈可變區域之直接等效物意指一些序列，其較佳與該VL可變區域具有至少95%總體序列類似性、同源性或一致性且能夠以低於5μg/ml的濃度抑制HSV-1及/或HSV-2兩者之活性達50%，彼此獨立地。
根據本發明的VL可變區域之直接等效物具有至少96%、97%、98%或99%總體序列類似性或同源性。
於本發明中：
-用於本文，術語「HSV」意指單純皰疹病毒。有兩種類型的HSV，即HSV-1與HSV-2，其等顯示類似的特徵。
-用於本文，術語與HSV-1及/或與HSV-2結合的抗體之「片段」意指Fab、或單鏈抗體片段，其相較於相對應的抗體具有較小的尺寸。
為了本發明之目的，各抗體區域具有相對應的SEQ ID NO.，如下：
SEQ ID NO.1對應於VH1抗體(亦稱為Fab Ex2)之重鏈可變區域(VH)之胺基酸序列；SEQ ID NO.2對應於VH1抗體(亦稱為Fab Ex2)之輕鏈可變區域(VL)之胺基酸序列；SEQ ID NO.3對應於VH1抗體(亦稱為Fab Ex2)之互補性決定區域之胺基酸序列；SEQ ID NO.4對應於VH3抗體(亦稱為Fab Ex2B)與VH51(亦稱為Fab Ex2I)之重鏈可變區域(VH)之胺基酸序列；SEQ ID NO.5對應於VH3抗體(亦稱為Fab Ex2B)之輕鏈可變區域(VL)之胺基酸序列；SEQ ID NO.6對應於VH3抗體(亦稱為Fab Ex2B)與VH51(亦稱為Fab Ex2I)之互補性決定區域之胺基酸序列；SEQ ID NO.7對應於VH5抗體(亦稱為Fab Ex2C)之重鏈可變區域(VH)之胺基酸序列；SEQ ID NO.8對應於VH5抗體(亦稱為Fab Ex2C)之輕鏈可變區域(VL)之胺基酸序列；SEQ ID NO.9對應於VH5抗體(亦稱為Fab Ex2C)之互補性決定區域之胺基酸序列；SEQ ID NO.10對應於VH47抗體(亦稱為Fab Ex2H)之重鏈可變區域(VH)之胺基酸序列；SEQ ID NO.11對應於VH47抗體(亦稱為Fab Ex2H)之輕鏈可變區域(VL)之胺基酸序列；
SEQ ID NO.12對應於VH47抗體(亦稱為Fab Ex2H)之互補性決定區域之胺基酸序列；SEQ ID NO.13對應於VH51抗體(亦稱為Fab Ex2I)之輕鏈可變區域(VL)之胺基酸序列。
該等重鏈與輕鏈在每個單鏈抗體中出現的順序可被顛倒，因此單鏈抗體可由重鏈-輕鏈或由輕鏈-重鏈形成，且其活性無法基於鏈接續而先驗地想像。
有益地，根據本發明的單株抗體可被用於免疫減損個體(諸如癌症患者與移植接受者)中與免疫不足的患者中且在該等個體與患者中係有效的。
有益地，根據本發明的單株抗體可用於新生嬰兒中且於新生嬰兒係有效的。
在一個較佳的具體態樣中，本發明提供HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該抗體具有SEQ ID NO.1之重鏈可變區域(VH)與SEQ ID NO.2之輕鏈可變區域(VL)。
目前，阿昔洛韋(無環鳥苷)係用於治療HSV感染。不幸地，阿昔洛韋並非在所有的病例中皆可有效地控制病毒複製與感染。事實上，當用於治療由抗性病毒變體造成的感染時或在新的病毒酪胺酸激酶(TK)突變授予對此藥物的抗性的個案中，阿昔洛韋係無效的。
如先前討論的，在用於治療阿昔洛韋抗性HSV感染的抗病毒藥物中，foscarnet(膦醯基甲酸)與西多福韋(一種核苷酸類似物)極為重要。在經歷細胞性磷酸化而變成其二磷酸酯形式後，西多福韋競爭性地
抑制病毒DNA聚合酶將去氧胞苷三磷酸酯併入病毒的DNA中。該藥物之併入瓦解進一步的鏈延長。不像諸如阿昔洛韋或更昔洛韋的核苷類似物，西多福韋不會被病毒激酶磷酸化(並因此活化)。
更詳細言之，如以上討論與指出的，目前可得的抗皰疹藥物為臨床相關的缺點所累。更詳細言之，阿昔洛韋藥物抗性意味著對其他抗皰疹藥物的交叉抗性，因此並無其他治療HSV感染的口服治療性選擇。替代性的靜脈內選擇與局部選擇包含foscarnet與西多福韋之調配物，其等為副作用所累。雖然阿糖腺苷(vidarabine，一種優先抑制病毒DNA合成的嘌呤類似物)具有對抗皰疹病毒的活性，其在有阿昔洛韋抗性的患者中並非有效的且相較於許多其他目前使用的抗病毒劑(諸如阿昔洛韋)其毒性更強且新陳代謝上更不穩定。阿糖腺苷亦為抗性病毒的病毒株之存在所累。
最後，對foscarnet顯示不耐受性的患者亦已被描述。用於對foscarnet(在阿昔洛韋抗性病毒感染的病例中使用)不耐受的患者、或用於在治療上有嚴重毒性的患者的治療性選擇係有限的：連續高劑量的阿昔洛韋(30至45mg/kg/日)已於免疫減損患者(即，造血性幹細胞移植接受者)中被成功地利用於阿昔洛韋抗性皰疹。不幸地，於經HIV感染的患者並無此方法之數據；局部治療(例如西多福韋)亦可被考慮，雖然局部給藥西多福韋完全未被標準化。
如自實驗章節可明顯得知的，根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段具有對抗HSV-1與HSV-2兩者的強中和活性，而有益地提供了對於目前可得的抗病毒治療之缺點(諸如抗病毒藥物抗性、不佳的效力與安全性、禁忌症或不耐受性)的替代選擇。
在一個進一步的具體態樣中，本發明提供HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，該抗體具有SEQ ID NO.4之重鏈可變區域(VH)與SEQ ID NO.5之輕鏈可變區域(VL)。
在又一個進一步的具體態樣中，本發明提供HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，該抗體具有SEQ ID NO.7之重鏈可變區域(VH)與SEQ ID NO.8之輕鏈可變區域(VL)。
在一個又進一步的具體態樣中，本發明提供HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，該抗體具有SEQ ID NO.10之重鏈可變區域(VH)與SEQ ID NO.11之輕鏈可變區域(VL)。
在一個又進一步的具體態樣中，本發明提供HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段，該抗體具有SEQ ID NO.4之重鏈可變區域(VH)(與SEQ ID NO.13之輕鏈可變區域(VL)。
在一個進一步的方面，本發明提供HSV-1及/或HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該抗體係人類抗體。
即使衍生自動物模型的mAb可被最佳化(其藉由經歷嵌合化及/或人類化)以用於在人類治療或預防中投予，考慮到以下者，完全人類mAb相較於衍生自動物的mAb當然是較佳的：相較於衍生自動物的mAb，所投予的人類mAb被辨識成非自體分子而導致副作用的風險非常低。此外，由被病毒感染的個體製造的抗體係由呈其真實與複製性形式的該病毒引發，而使一動物致免疫通常由該病毒之經純化的蛋白質或非複製性形式之注射組成。因此，在天然宿主中引發的抗體通常具有較強的活性，且由於針對構形性抗原決定基而通常較不會出現病毒逃脫突變體。
在一個進一步的方面，本發明提供一種HSV-1與HSV-2結合性抗體或其片段，其中該抗體係單株抗體。
使用單株抗體而非多株血清有許多臨床優點且在技術領域中是廣為人知的。(“Monoclonal versus polyclonal antibodies：distinguishing characteristics,applications,and information resources.”N.S.Lipman等人ILAR J(2005)46(3)：258-268.與“Passive antibody therapy for infectious diseases.”A.Casadevall等人Nature Reviews Microbiology 2,695-703(2004九月))。
在一個進一步的方面，根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段具有IgG2重鏈恆定區域。
在一個較佳的方面，根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段具有IgG1重鏈恆定區域。
為了在原核與真核(完整IgG1)製造系統兩者中最佳化表現率，根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段已被成功地轉變成IgG1抗體。該抗體之可變區域已被有益地選殖入包含恆定區域重鏈(HC)的經修飾載體。
根據本發明的經IgG1轉變的HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段能夠以高效力辨識HSV-1與2兩者之分離株與中和其等。
本發明之一個又進一步的具體態樣係包含根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段與醫藥上可接受的載劑的醫藥組成物。
根據本發明的抗體可改善原發性、非原發性與復發性HSV感染之症狀。
本發明之抗體係適合用於在種種患者與HSV相關性疾病中治療或預防HSV感染。
此外，本案之抗體係適合用於局部使用，以用於預防與治療兩者。因為其等具有較低的機械學毒性且極不太可能具有相關的無法預期的毒性或副作用，所以其等係特別適合用於低警惕度之情況(其中藥物治療可能係禁忌或非所欲的)。
根據本發明的醫藥組成物具有以下優點：其係一基於被動式免疫治療的新治療性策略，其利用具有HSV-1與HSV-2中和活性的特殊單株抗體，且在治療HSV感染與相關疾病中有用。
在一個進一步的方面，根據本發明的醫藥組成物係用於口服、局部、眼部、肌肉內、靜脈內灌注、皮下、或吸入投予途徑。
在一個進一步的方面，根據本發明的醫藥組成物係與至少一種抗病毒劑組合使用或投予。
在一個較佳的方面，該抗病毒劑可選自由例如阿昔洛韋、伊巴他濱、噴昔洛韋、更昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、foscarnet或西多福韋所組成的群組。
在一個又進一步的具體態樣中，本發明係關於一種如以上描述的HSV-1與HSV-2結合性抗體或其片段，其用於治療HSV-1及/或HSV-2相關性疾病。
在一個又進一步的具體態樣中，本發明係關於一種HSV-1與HSV-2結合性抗體或其片段，其用於治療HSV-1及/或HSV-2相關性疾病(如以上描述的)，其中該治療係用於以下患者：對先前使用至少一種抗
病毒劑的治療係抗性或不耐受的患者或應避免使用抗病毒劑的治療的患者、或免疫不足或免疫受抑制的患者。
在一個較佳的方面，該HSV-1或HSV-2相關性疾病治療係預防性或治療性。
在更佳的方面，該HSV-1或HSV-2相關性疾病係急性或慢性。
在又較佳的方面，該HSV-1及/或HSV-2相關性感染係原發性、非原發性或復發性。
有益地，該根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性抗體因此係有用於HSV-1或HSV-2感染之種種臨床表現。
有益地，根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性抗體係有用於減少病毒排放。
有益地，根據本發明的HSV-1及/或HSV-2結合性抗體係有用於預防傳播。
在一個進一步的方面，本發明提供根據本發明的HSV-1與HSV-2結合性單株抗體或其片段之用途，其中該HSV-1及/或HSV-2相關性疾病係選自由口部皰疹、皰疹角膜炎、皰疹指端化膿、格鬥者皰疹、濕疹性皰疹、新生仔皰疹、生殖器皰疹、非典型生殖器皰疹、皰疹性子宮頸炎、皰疹性直腸炎、皰疹性腦炎、皰疹性腦膜炎、皰疹性腦膜腦炎、散播性單純皰疹感染、阿茲海默氏病與痴呆所組成的群組。
如序言所指出的，咸已越來越感到對於用於治療HSV感染的新穎治療的需求與重要性。根據本發明的單株抗體具有HSV中和活性且
因此係有用於治療HSV感染。
本案之抗體可係治療HSV感染之基礎且亦可藉由抑制病毒複製與潛在地限制由病毒再活化造成的組織損害而對感染之解除有顯著的貢獻。此等活性在對目前的抗病毒藥物有抗性的HSV分離株的實例中係非常有用的。
亦稱為感冒瘡(cold sores)的口部皰疹可為HSV-1或HSV-2感染之結果。因為HSV-2與性傳播間的關係，在兒童的感染通常係HSV-1之結果。
主要診斷為皰疹性齦口炎，其中首先發展出典型的清楚侵蝕斑接著為具有白色外觀的潰爛。該感染(往往最初是在唇部)傳播至口與咽頭之所有部位。自三叉神經神經節再活化可導致稱為感冒瘡者。皰疹咽頭炎往往與上呼吸道之其他病毒感染相關。該疾病在免疫受抑制之人(諸如AIDS患者)中更嚴重。
皰疹角膜炎係一種眼睛之感染且主要係由HSV-1造成。其可復發且可導致目盲。其在美國係角膜性目盲之主要原因。
皰疹指端化膿影響手部與經皰疹感染的身體分泌物接觸的人且可由兩種HSV之一造成。HSV透過在手部或腕部上的小型傷口進入身體。其亦可由HSV-2自生殖器轉移至手造成。
格鬥者皰疹往往在摔角手中找到。其顯然係藉由直接接觸自一個格鬥者身上的皮膚損傷傳播至他/她的對手，且通常出現在頭部與頸部區域(其等在摔角擒抱中係頻繁接觸的位置)。奇怪地，該損傷較常出現在身體之右側(可能係因為大部分格鬥者係右撇子)。其亦於其他接觸性運
動(諸如橄欖球，於該運動其被稱為傳染性膿疱病(scrum pox))中見到。
濕疹性皰疹係一種在有活動中的濕疹或先前已存在的異位性皮膚炎的兒童中找到的小兒科病況。HSV可在濕疹損傷之位置可傳播遍及皮膚。該病毒可傳播至其他器官(諸如肝臟)。
新生仔皰疹係一種來自HSV-2的嚴重疾病且往往係致命的，雖然如此感染很罕見。若母親在分娩時在排放病毒，則感染特別可能發生。病毒可在胎內或在出生期間染上。因為新生兒之免疫系統尚未發育完全，病毒可快速地傳播至許多周邊器官(例如肺臟與肝臟)且可感染中樞神經系統。
生殖器皰疹與皰疹性直腸炎通常係HSV-2感染之結果，而有約10%的病例為HSV-1之結果。原發性感染往往係無症狀的但許多疼痛的損傷可在男性的龜頭或陰莖柄與女性之陰門、陰道、子宮頸與肛門周圍區域(其可能附有陰道溢液)上發展出來。種種感染亦造成直腸炎。生殖器皰疹之繼發性事件(其為薦骨神經節中病毒之再活化之結果)相較於首發事件往往係較不嚴重的(且持續較短的時間)。復發性事件似乎通常係導因於原發性HSV-2感染。無論是否有明顯活動中的疾病或，被感染的患者仍有感染性而無明顯的症狀。
HSV腦炎係HSV-1感染之結果且係最常見的偶發性病毒性腦炎。HSV腦炎係發熱的且可能對顳葉之一造成損害，其臨床特徵在於脊髓液中的血液與癲癇發作。該疾病可為致命的且於美國每年小於1000個病例被描述。
HSV腦膜炎係HSV-2感染之結果。
散播性單純皰疹感染係遍及身體的感染之傳播。此在具有受損的免疫系統的患者中係HSV之嚴重的且威脅生命的併發症。
基於HSV-1之趨神經性、在一般大眾中的高感染率、以及在神經元細胞(尤其是在於AD中通常被改變的相同腦部區域中)中的終生存留性，很久以來其已被懷疑在AD之發病原理上扮演某種角色。
最近的數據(“β-Amyloid peptides display protective activity against the human Alzheimer's disease-associated herpes simplex virus-1.”Bourgade K等人Biogerontology.2014 Nov 7)暗示類澱粉蛋白斑塊(阿茲海默氏病(AD)之標誌)包含纖維狀的β類澱粉蛋白(Aβ)1-40與1-42胜肽。HSV-1已被指出為一風險因子且被發現在類澱粉蛋白斑塊中共局部化。Aβ 1-40與Aβ 1-42展現抗細菌、抗酵母菌與抗病毒活性。
其他數據(“Relationship between herpes simplex virus-1-specific antibody titers and cortical brain damage in Alzheimer's disease and amnestic mild cognitive impairment.”Mancuso R，等人Front Aging Neurosci.2014 Oct 15；6：285)暗示強的HSV-1專一性體液反應可對AD相關性皮質損害有保護性。
此外，可製備經縮小化抗體之其他人工形式，諸如小體與納體。此等供選擇的形式可從本發明之抗體開始來成功地製備與使用。
如以上所描述的且於以下申請專利範圍中請求的本發明之各種具體態樣與方面將於以下實驗章節得到實驗性支持。
現在參考以下實驗章節，其與以上描述一起闡明本發明之一些具體態樣。
特別地，如於以下章節中討論的，經實施以鑑認和HSV-1與HSV-2結合並中和之的單株抗體的工作可總結如下：1.分析個體之多株血清；2.純化IgG2部分；3.評估自血清純化的IgG2之量；4.評估針對HSV的IgG2結合與中和活性；5.挑選個體；6.自所挑選的個體構築IgG2文庫；7.確認文庫與最佳化生物淘選；8.於冷凍與解凍中初步篩選在Fab製造後挑選的IgG2抗體殖系；9.純化Fab IgG2殖系、定序與初步評估針對HSV的中和活性；10.將殖系轉變成Fab IgG1；11.純化與定序經IgG1轉形的殖系；徹底且定量性地評估其等之中和活性(對所有的殖系評估中和活性，然而僅對Fab-Ex2進行徹底且詳細的中和活性評估)。
IgG2部分係從衍生自所挑選的個體之群組之周邊血液樣本收集、偵測、與純化。
挑選標準如下：
1)高IgG2之含量，2)於ELISA分析中辨識HSV-1與HSV-2的能力，與3)HSV再活化之臨床歷史。
來自第18號個體的血清係唯一能夠符合所有上述的第一挑選標準的樣本(圖1A、1B與2)。第18號個體已被報導過往有頻繁的唇HSV之再活化的歷史而最近有自發的臨床改善。
鑑於自第18號個體血清純化的IgG2之極高的量與其在ELISA分析中辨識HSV-1與2兩者的能力，挑選此個體以研究其經純化的IgG2中和HSV-1與2感染的能力。來自第18號供者的IgG2部分係使用於以下材料與方法章節中描述的方案(IgG2純化與定量方案)來純化。
衍生自第18號個體的IgG2部分(pIgG2-18)顯示了非凡的對抗HSV-1與HSV-2兩者的中和活性。特別地，對抗所測試的HSV-1與HSV-2病毒的pIgG2-18中和活性係使用定性性分析(透過明視野相位差光學顯微鏡與免疫螢光分析的融合細胞形成評估，圖3-6)與定量性分析(透過間接免疫螢光(IIF)的溶菌斑減少分析與定量性中和活性評估；圖7-8)兩者評估與確認。
圖3顯示在不同的實驗條件下經HSV-1感染的細胞之形態。
特別地：
-經HSV-1感染的細胞(陽性感染對照組)相較於未經感染的細胞顯示由該病毒造成的明顯的細胞單層瓦解與融合細胞之存在。
-以自對照組個體純化的IgG2預先培養的經HSV-1感染的細胞顯示由該病毒造成的細胞單層瓦解與散佈的融合細胞。
-以自第18號個體純化的IgG2預先培養的經HSV-1感染的細胞維持正常的細胞形態且顯現明顯較少的融合細胞形成，表示HSV-1感染被強烈抑制。
圖4顯示在不同的實驗條件下經HSV-2感染的細胞之形態。
特別地：
-經HSV-2感染的細胞(陽性感染對照組)相較於未經感染的細胞顯示由該病毒造成的細胞單層瓦解與融合細胞之強烈存在。
-以自對照組個體純化的IgG2預先培養的經HSV-2感染的細胞顯示由該病毒造成的重大的細胞單層瓦解與融合細胞之存在。
-以自第18號個體純化的IgG2預先培養的經HSV-2感染的細胞相較於對照組(未經感染的細胞)幾乎完全保存細胞形態。此外，融合細胞形成減少極為明顯，表示HSV-2感染被強烈地抑制。
圖5與6顯示在不同的實驗條件中的不同螢光模式。
特別地：
-陽性對照組顯示對由HSV-1與HSV-2形成的融合細胞而言是典型的漫射的細胞質螢光模式。
-以自對照組個體純化的IgG2預先培養的經HSV-1或HSV-2感染的細胞顯示與在陽性感染對照組中觀察到者類似的細胞質螢光模式。
-經以自第18號個體純化的IgG2預先培養的HSV-1與HSV-2感染的細胞並未顯示免疫螢光訊號，表示HSV-1感染被強烈地抑制。
挑選第18號個體作為B淋巴球來源，而此係基於對抗所測試的HSV-1與HSV-2分離株的高中和活性、與在經HSV-1與HSV-2感染的VERO-E6細胞中融合細胞形成之抑制，由自其血清純化的IgG2部分顯示。
自第18號個體收集新的血液樣本以分離株其B淋巴球。在
自此等細胞萃取與逆轉錄mRNA後，將IgG2 HC(重鏈)與LC(輕鏈)選殖入噬菌質粒載體中(L Solforosi，等人“A phage display vector optimized for the generation of human antibody combinatorial libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments”(2012)New Microbiologica 35(3),289-294.)。
人類組合性噬菌體展示抗體文庫係如於以下材料與方法章節描述獲得。
能夠交叉辨識HSV-1與HSV-2兩者並中和之的人類Fab片段之選殖係藉由允許特徵為如此生物特性的人類Fab之分子選殖的經最佳化生物淘選程序來獲得。挑選回合之篩選係藉由如於以下材料與方法章節中描述的冷凍&解凍程序進行。
基於此挑選策略，產生了五個人類單株IgG2 Fab片段，分別為：Fab Ex2：對應於SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2；Fab Ex2B：對應於SEQ ID NO.4與SEQ ID NO.5；Fab Ex2C：對應於SEQ ID NO.7與SEQ ID NO.8；Fab Ex2H：對應於SEQ ID NO.10與SEQ ID NO.11；Fab Ex2I：對應於SEQ ID NO.4與SEQ ID NO.13。
此五種單株IgG2 Fab片段係於IIF中針對經HSV-1與HSV-2
感染的細胞挑選與測試(圖9)。所有的所挑選的殖系皆選擇性地辨識經HSV-1感染的細胞與經HSV-2感染的細胞兩者。
所挑選的Fab係如於以下材料與方法章節中描述的於原核系統中製造並藉由親和力色層分離法純化。
經純化的Fab(Ex2(G2)、Ex2B(G2)、Ex2C(G2)、Ex2H(G2)與Ex2I(G2)係以標準量的HSV-1或HSV-2分離株預先培養(10μg/mL)。亦包含適當的實驗對照組。使用不同的「感染混合物」以感染Vero E6細胞(在改變培養基之前吸附2個小時)。
在二十個小時之後，將細胞單層固定並以含結晶紫溶液可滲透化，使得可首先定性性評估Fab對抗HSV-1分離株與HSV-2分離株兩者的生物活性(程序在材料與方法章節中描述)。融合細胞形成之減少係藉由明視野相位差光學顯微鏡評估(圖10)。如先前已陳述的，此分析允許Fab效力之基本評估。特別地，基於圖10，可以察知Ex2(G2)對抗HSV-1與HSV-2兩者的高中和效力。然而，另外四種Fab亦顯示對抗HSV-1分離株與2分離株兩者的良好中和活性。僅Ex2C(G2)與Ex2H(G2)當與Ex2(G2)與其他Fab比較時顯示較低的對抗HSV-2的效力。
為了在原核製造系統與真核製造系統(完整IgG1)兩者中最佳化表現率，所有針對HSV-1與HSV-2兩者的所挑選的IgG2-Fab被成功地轉變成IgG1 Fab。屬於所挑選的Fab的重鏈(HC)與LC上的可變區域被成功地選殖入包含IgG1之恆定區域(CH1)的經修飾載體中(程序係於材料與方法章節中描述)。當未明確地或藉由(G2)指明時，於本專利案中描述的Fab係如所描述轉變成IgG1的IgG2 Fab。
重複所有用於定該等IgG2經挑選的Fab的程序以定所挑選的Fab之IgG1形式的特徵，以允許去比較IgG2與IgG1 Fab格式各自的生物特性。
基於生物活性分析，可以展示出經IgG1轉變的Fab仍然能夠以高效力辨識HSV-1分離株與2分離株兩者並與中和之。此外，可以顯示出Fab Ex2之IgG1格式相較於其原來的殖系格式以較高的效力中和HSV-1與HSV-2兩者。
所進行的生物學分析係於以下列舉：
定性性分析(於材料與方法章節中描述)係於所挑選的抗HSV-1與2Fab之IgG1格式進行(圖11)。此等分析顯示了所挑選的Fab之IgG1格式亦能夠中和HSV-1與HSV-2兩者(表2)。
進行此等分析以定量所挑選的抗HSV Fab群組之效力。所有對抗HSV-1與2的Fab生物活性首先係藉由IIF分析評估。
Fab Ex2、Ex2B、Ex2C、Ex2H與Ex2I之中和活性係使用InCellAnalyzer自動化計數系統評估以計算所有Fab之IC50與獲得劑量反應曲線。使用不同Fab之數個稀釋度以獲得劑量反應曲線。在所有群組的中和實驗中，進行數次Fab稀釋，而此係因為只有在使用生物學化合物限制稀釋下才能夠獲得確實的能夠抑制病毒感染的Fab之量。
此外，相同的「劑量反應」曲線允許去計算有效地描繪試管內Fab效力的Fab IC50。IC50係能夠減少導因於細胞單層以標準量的病毒(HSV-1與HSV-2)感染的細胞損害達50%的Fab濃度。
換言之，低的IC50意謂抑制病毒感染僅需極低量的Fab。
Fab Ex2係以三重複測試(誤差槓指示對於不同三重複物的平均偏差)(圖12)。
圖12顯示已在先前描述的定性性分析中測試的Fab Ex2之劑量反應曲線(稀釋度)。基於該圖，該等抗體之IC50係使用GraphPad軟體(Prism)計算。
Fab Ex2之IC50係總結如下：
Fab Ex2顯示對抗HSV-1與HSV-2最有前途的結果。
為了進一步定其生物活性之特性並確認之，數個中和實驗係根據以下材料與方法章節中描述的程序進行。
此分析顯示Fab之有效效力，其允許去評估在Fab Ex2存在或不存在下細胞病變性效果(細胞形態之完全瓦解)之存在/不存在。
為了評估Fab Ex2之效力，進行了使用不同稀釋度的定性性分析。三種不同濃度的Ex2(10μg/ml、5μg/ml與2.5μg/ml)係透過融合細胞形成分析來針對HSV-1與2測試。
如於圖13中清楚地描繪的，Fab Ex2能夠以劑量依賴性方式強烈地抑制由HSV-1感染造成的細胞瓦解與融合細胞形成，且在極低的濃度能夠完全抑制HSV-2感染。
HSV分離株在Fab Ex2不存在下對細胞的細胞病變性效果係於圖13顯示。
當在感染細胞單層前將不同濃度的Fab Ex2加至相同感染劑量的HSV-1或2時，細胞形態瓦解明顯係與Fab Ex2濃度成反比。
對Fab Ex2觀察到的極佳結果(融合細胞形成分析中之抑制)係與以下所描述的Fab A中和效力之定量性評估一致。
劑量反應定量性分析：Fab Ex2抑制HSV感染的能力係藉由評估在Fab Ex2存在或不存在下細胞單層中HSV感染造成的溶胞溶菌斑之存在而評價。為了確認IIF中和數據，進行溶菌斑減少分析作為定量性評估。如在文獻中廣泛地描述的，溶菌斑分析被認為是用於對抗HSV感染的中和活性之試管內評估的精選實驗且目前係用於mAb IC50之評估的黃金標準。
如於圖14中顯示與報導的，Fab Ex2對抗HSV-1與2的生物活性之劑量依賴性定量性評估不僅與先前描述的定性性結果符合，且亦顯示Fab Ex2效力係無法預期地高。事實上，如於圖中清楚顯示的，即使在非常低的濃度(1μg/mL)，Fab Ex2仍會抑制HSV-1溶菌斑形成(測量成PFU(溶菌斑形成性單位))。如於圖14(HSV-2中和分析)中顯示的，甚至更強的對抗HSV-2分離株的Fab Ex2中和效力被展示出來。此外，HSV-1中和
分析顯示Fab Ex2劑量反應效果，如定性性劑量依賴性分析已證明的。
由於Fab Ex2之效力非常高，劑量反應效果無法藉由以HSV-2分離株進行的中和分析來測量。
來自所挑選的Fab的HC與LC兩者之序列顯露出所有的鏈皆正確地符合讀框且無任何可影響其等之表現水平的終止密碼子。
使用免疫球蛋白序列之參考資料庫(IMGT-http：//www.imgt.org)進行的基因用途分析允許初步地檢查所挑選的殖系相較於其等之生殖細胞系序列的突變率(表4)。
所有所挑選的Fab殖系當與各自的生殖細胞系序列比較時皆在其等之CDR(互補性決定區域)中有突變。此意謂著不同的殖系展現在與抗原接觸後成熟的獨特體突變。此通常允許更專一性的抗原辨識。
IgGA之ScFv基因被成功地構築並選殖入表現載體中。進行了IgGA之ScFv格式小規模製造。ScFv A之結合活性係藉由IIF分析對經HSV感染的細胞評估。ScFv A能夠辨識經HSV感染的細胞。然而，ScFv A顯示高IIF背景訊號與低結合度。
Fab Ex2：對應於SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2
FabA或IgGA之中和性活性係藉由將IgGA以病毒預先培養(於37℃下1h)並將IgGA/病毒混合物加至細胞單層來評估。
IgG A強有力地中和所有所測試的HSV-1與2測試分離株。
重要地，用於進行中和分析的HSV分離株被賦予了不同的對阿昔洛韋(ACV)抗HSV藥物的敏感性。IgGA中和上述HSV分離株的能力表明了該IgGA非凡的生物活性係完全獨立於由不同的所測試HSV分離株顯示的對ACV的敏感性，暗示IgGA於治療由ACV抗性分離株造成的HSV感染的可能用途(圖15A)。
已開發了吸附後分析以推測於病毒開始在宿主內活躍地複製後投予IgG A以治療HSV感染的可能性。
實驗方法之第一步(包含FabA或IgGA之HSV吸附後評估)係以標準量的先前未以FabA或IgGA處理的HSV感染VERO E6細胞。
在病毒感染後30分鐘才將FabA或IgGA加至經感染的細胞。接著將感染進行48h以鑑別VERO E6細胞上的HSV溶胞溶菌斑。實驗結果係藉由相較於病毒實驗陽性對照組計數接受(HSV感染後)FabA或IgGA的經感染細胞之溶菌斑來評估。
於吸附後分析中測試的Fab係分別以50與200ug/mL之濃度對抗所測試的HSV-1與HSV-2分離株使用*。
於吸附後分析中測試的IgG係分別以25與100ug/mL的濃度對抗所測試的HSV-1與HSV-2分離株使用*。
*自科學文獻推斷的mAb濃度
如由吸附後分析展示的，IgGA相較於病毒對照組強烈地抑
制HSV-1與HSV-2兩者之新感染事件且亦抑制造成溶菌斑的感染性病灶之數目。IgGA抑制強度比該等使用FabA所觀察到者高(圖15B)。
在HSV感染策略中，一個很重要者係稱為「細胞至細胞」感染策略者。
進行了吸附後分析以評估IgGA在抑制「細胞至細胞」感染的貢獻，而此係藉由測量得自以FabA或IgGA處理或未以FabA或IgGA處理的經感染細胞的溶菌斑面積。
於吸附後細胞至細胞感染抑制分析中測試的Fab亦分別初步以50與200ug/mL的濃度對抗所測試的HSV-1與HSV-2分離株使用*。
於吸附後「細胞至細胞」感染抑制分析中測試的IgG亦分別初步以25與100ug/mL的濃度對抗所測試的HSV-1與HSV-2分離株使用*。
*自科學文獻推斷的mAb濃度
如吸附後分析展示的，FabA抑制HSV-1與HSV-2兩者之溶菌斑面積。溶菌斑面積之IgGA抑制甚至比Fab A抑制活性更高。此等數據清楚地展示IgGA感染後投予如何亦可強有力地抑制「細胞至細胞」HSV感染(圖15B)。
為了評估在IgGA之選擇性壓力下產生的逃脫病毒突變之存
在，經HSV-1感染的VERO-E6細胞係以漸增濃度的Fab A處理。更詳細言之，VERO細胞係以於先前的報導(「病毒增殖技術」)中廣泛地描述的實驗條件培養在T25燒瓶中。細胞單層接著係藉由HSV-1 HF病毒株使用50pfu/mL的無細胞病毒感染。在病毒完全吸附後，經感染的細胞係以0.2ug/mL與1ug/mL的IgGA處理三日。亦在實驗中包含實驗對照組，不相關的IgG(以0.2ug/mL與1ug/mL的濃度)與「單獨」病毒。三日後，收集經感染的細胞培養基並將其離心以將培養基經離心上清液用於新的細胞感染回合。此等新的感染回合係在0.2ug/mL與1ug/mL的IgGA與實驗對照組之存在下進行。五次相繼的完全相同的感染回合係在以上描述的兩種濃度的IgGA與對照組IgG之存在下進行。接著離心最後感染回合之細胞上清液並在增加濃度的IgGA(5ug/mL與10ug/mL)之存在下使用其以進行五個新回合的感染。為了測試在恆定的IgGA存在下培養的病毒自IgGA抑制活性逃脫的能力，屬於在IgGA存在下的最後感染的無細胞上清液係在高IgGA濃度之存在下於37℃下培養1h。在預先培養後，中和混合物係用於感染新的VERO-E6細胞。
預先以HSV培養的IgGA仍能夠中和病毒分離株，意謂在5與10ug/mL的IgGA選擇性壓力下並無「逃脫突變體」產生。
此表明了：於此等實驗中測試的HF HSV-1分離株在被吾人之抗體辨識的區域幾乎不會經歷允許其自IgG A之抗病毒活性逃脫的胺基酸突變(在用於進行此分析的兩種濃度的IgGA之存在下)。
並無「逃脫突變體」在IgGA選擇性壓力下產生。此結果之可能解釋可總結如下：於此等實驗中測試的HF HSV-1分離株無法輕易地經歷允許其自IgGA之抗病毒活性逃脫胺基酸突變(在用以進行此分析的兩種濃度的IgGA之存在下)。
總體來說，IgGA在不同群組的經陰道內HSV攻擊的小鼠的生物效果係藉由以下者評估：(i)存活率與(ii)臨床分數。用於定義不同的群組的小鼠之臨床情況的臨床分數係：0=無症候，1-1.5=輕微的生殖器紅斑與浮腫，2-2.5：中等的生殖器發炎，無化膿性生殖器損傷，3-3.5=化膿性生殖器損傷及/或後肢麻痺，4=死亡。
於預防實驗中，全身性IgGA係通過尾巴側靜脈注射全身性地投予。
IgGA係以兩種不同的濃度i.v.投予至不同群組的小鼠(分別接受5與15mg/kg的IgG A)，其係以單劑的形式且在以107 TCID50的MS-HSV-2病毒(大約對應於1致命劑量50(LD50)的病毒(LD50係能夠殺死50%的經感染小鼠的病毒劑量))陰道攻擊前24h。亦包含由僅接受病毒攻擊的小鼠群組與僅接受不相關的人類IgG陰性對照組(15mg/Kg)的小鼠群組組成的實驗對照組。實驗係進行到HSV-2攻擊後8日以避免不必要的且不合法的小鼠苦難。
兩種劑量的IgGA皆於C57BL/6小鼠顯示對抗HSV-2感染的保護(圖16A)。5mg/kg與15mg/kg之抗體濃度皆確實顯著地抑制HSV-2感染之死亡率與臨床症狀兩者(圖16B與16C)。
所有以5mg/kg與15mg/kg的IgGA處理的小鼠皆存活(100%存活率)。相反地，在接受15mg/Kg的不相關的人類IgG的小鼠群組與該等僅接受病毒攻擊者中偵測到的死亡率皆完全與HSV-2 LD攻擊一致。
為了進一步研究人類抗體IgGA之保護性活性，使經HSV-2感染的C57BL/6小鼠於HSV-2攻擊後30分鐘與24h接受治療性全身性IgG A(藉由尾巴側靜脈注射投予IgG A)。
IgGA係以兩種不同的濃度i.v.投予至兩個不同群組的小鼠(分別接受5與15mg/kg的IgGA)，其係在以107 TCID50的MS-HSV-2病毒(大約對應於1 LD50)陰道攻擊後30分鐘與24h。亦包含由僅接受病毒攻擊的小鼠群組與接受不相關的人類IgG陰性對照組(15mg/Kg)的群組與接受ACV標準治療(腹膜內注射50mg/Kg 2X每日)的小鼠組成的實驗對照組。在此等群組中，實驗係進行到HSV-2攻擊後12日以避免不必要的且不合法的小鼠苦難。
兩種劑量的IgGA皆於C57BL/6小鼠顯示對抗HSV-2感染的保護(圖17A)。5mg/kg與15mg/kg的抗體濃度皆確實顯著地抑制HSV-2
感染之死亡率與臨床症狀兩者(圖17B與17C)。
此外，在此例子中，所有以5mg/kg與15mg/kgIgGA處理的小鼠皆存活(100%存活率)。相反地，在接受15mg/Kg的不相關的人類IgG的小鼠群組與該等僅接受病毒攻擊者中偵測到的死亡率皆與HSV-2 LD攻擊完全一致。
為了研究人類抗體IgGA之保護性活性，使經HSV-2感染的C57BL/6小鼠於HSV-2攻擊後30分鐘時接受治療性全身性IgGA(藉由尾巴側靜脈注射投予IgGA)。
IgGA係以兩種不同的濃度i.v.投予至不同群組的小鼠(分別接受5與15mg/kg的IgGA)，其呈在以107 TCID50的MS-HSV-2病毒(大約對應於1 LD50)陰道攻擊後30分鐘的單一促升。實驗對照組係由僅接受病毒攻擊的小鼠群組與接受不相關的人類IgG陰性對照組(15mg/Kg)的群組組成。實驗係進行至HSV-2攻擊後8日以避免不必要的且不合法的小鼠苦難。
兩種劑量的IgGA在C57BL/6小鼠皆顯示對抗HSV-2感染的保護(圖18A)。5mg/kg與15mg/kg的抗體濃度皆確實顯著地抑制HSV-2感染之死亡率與臨床症狀兩者(圖18B與18C)。此外，在此例子中，所有以5mg/kg與15mg/kg的IgGA處理的小鼠皆存活(100%存活率)。相反地，在接受15mg/Kg的不相關的人類IgG的小鼠群組與該等僅接受病毒攻擊者
中偵測到的死亡率與HSV-2 LD攻擊完全一致。
在致命性HSV-2或HSV-1眼部攻擊後的IgGA之靜脈內投予所賦予的全身性保護係藉由活體內測試兩種類型的HSV來評估。
經HSV-2或HSV-1感染的C57BL/6小鼠(在角膜擦傷後的眼部感染)於HSV攻擊後30分鐘接受了單一促升治療性全身性IgGA(藉由尾巴側靜脈注射投予的IgGA)。
IgGA係在使用107 TCID50的MS-HSV-2(大約對應於1 LD50)或108 TCID50的LV-HSV-1(大約對應於1 LD50)作眼部病毒攻擊後30分鐘以15mg/kg i.v.投予。亦包含由僅接受病毒攻擊的小鼠群組與接受不相關的人類IgG陰性對照組(15mg/Kg)的群組所組成的實驗對照組。
IgGA在不同群組的小鼠中的生物效果係藉由評估以下者來評估：(i)存活率與(ii)臨床分數，於以下「臨床分數表」解釋(Berdugo M.Antimicrob Agents Chemother.2012 Mar)。所有的小鼠皆被每日觀察HSV感染之臨床症狀。
於此等群組，實驗係進行至HSV攻擊後8日避免不必要的且不合法的小鼠苦難。
IgGA之全身性投予有效地保護C57BL/6小鼠對抗HSV-2與HSV-1致命性眼部感染。
特別地，圖19A顯示IgGA單一促升全身性投予如何完全地保護(100%存活率)先前透擦傷以HSV-2病毒感染的小鼠
此外，圖19B與19C清楚地描繪IgGA之全身性投予如何可顯著地減少源於HSV-1與HSV-2眼部感染的嚴重臨床症狀。
IgGA提供對抗致命性病毒眼部攻擊的保護的能力係透過藉由全身性途徑投予IgGA來評估。IgGA對抗眼部HSV感染的全身性保護係對HSV-1與HSV-2兩者評估。在此套實驗中，IgGA完全保護以第1型或第2型病毒感染的小鼠而使之免於死亡(100%保護)。此表明了由全身性mAb A進行的散播性病毒複製之幾乎完全抑制。此外，如接受不相關的對照組mAb或僅接受病毒攻擊的經感染小鼠所顯示的神經臨床症狀之觀察結果所暗示的，接受全身性IgGA的小鼠群組完全消除神經症候之開始。重要地，IgGA對於HSV-1與2兩者亦強有力地抑制感染之臨床症狀(臨床計分)。
使用VERO-E6細胞株以進行所有在真核細胞上的實驗程序。
培養在VERO-E6細胞上的HSV-1分離株：HF病毒株(VR-260 ATCC)
培養在VERO-E6細胞上的HSV-2分離株：MS病毒株(VR-540 ATCC)
-以經PBS稀釋的所收集的血清塗覆96槽孔平底ELISA微量滴定盤(COSTAR)(於4℃下過夜)，包含陰性對照組。
-藉由以1% PBS/BSA溶液培養該盤(37℃下一個小時)
來封阻非專一性位置。
-在洗滌(包含0.2%(v/v)吐溫20(Tween20)(西格瑪奧瑞奇(Sigma-Aldrich))的PBS溶液)後，按照製造商的操作指南方案加入商業上可購得的小鼠抗人類IgG2專一性單株抗體(於37℃下1個小時)。
-以包含0.2%(v/v)吐溫20的PBS溶液洗滌。
-加入與過氧化酶結合的抗小鼠IgG(西格瑪奧瑞奇)(於37℃下45’)。
-在以包含0.2%(v/v)吐溫20的PBS溶液洗滌後，加入TMB受質套組(Thermo Scientific)並將盤於37℃下培養5’。
-接著加入1N硫酸以終止反應。
-於450nm波長偵測訊號。
-以兩種不同的稀釋度(分別為1：10與1：100)於8% Tris-甘胺酸凝膠(Bio-Rad)上分析所收集的血清。
-於4℃下以30V將蛋白質轉移至PVDF膜(珀金埃爾默(PerkinElmer))共15個小時。
-於4℃下將膜在包含0.2%(v/v)吐溫20的PBS溶液(西格瑪奧瑞奇)與5%(w/v)脫脂奶粉中培養過夜來封阻非專一性位置。
-於室溫下使用對人類IgG2有專一性的商業上可購得的小鼠mAb作為初級試劑培養1個小時。
-以包含0.1%(v/v)吐溫20的PBS溶液洗滌。
-以與過氧化酶結合的抗小鼠IgG(西格瑪奧瑞奇)探測墨漬(於室溫下45’)。
-使用超級訊號西方微微化學發光受質(Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate，Thermo Scientific)偵測與過氧化酶結合的Ab。
-以使用ECB稀釋(1：10)的經熱去活化的HSV-1與HSV-2塗覆96槽孔平底ELISA微量滴定盤(COSTAR)(於4℃下過夜)，包含陰性對照組。
-藉由以1% PBS/BSA溶液培養該盤(37℃下一個小時)來封阻非專一性位置。
-在洗滌(包含0.2%(v/v)吐溫20的PBS溶液(西格瑪奧瑞奇))後，加入以PBS/BSA稀釋(1：200)的所收集的血清(於37℃下1個小時)。
-以包含0.2%(v/v)吐溫20的PBS溶液洗滌。
-加入與過氧化酶結合的抗人類IgG(西格瑪奧瑞奇)(於37℃下45’)。
-在以包含0.2%(v/v)吐溫20的PBS溶液洗滌後，加入TMB受質套組(Thermo Scientific)並將盤於37℃下培養5’。
-接著加入1N硫酸以終止反應。
-於450nm波長偵測訊號。
為了純化與分析IgG2部分，使用兩個不同的步驟純化所挑選的血清。首先，以親和力管柱純化全體IgG。接著，進一步以對IgG2部分有專一性的親和力管柱純化所洗提出的全部IgG內容物。
-以30-40mL PBS1x洗滌1mL的gammabind Sepharose樹脂(於4℃下儲存在PBS1X-乙醇20%中)3次以排除過量乙醇(於2500rpm於室溫下離心5min與2-3次加速與減速)。
-將抗人類IgG(Cf=4mg/mL)加至該樹脂並於室溫下溫和地攪拌90min。
-以10倍體積(1倍體積=1mL的樹脂)的硼酸鈉0,2M pH 9洗滌該樹脂3次。於2500rpm離心15min。
-在第一次離心後，回收上清液以用於進一步的分析。
-將樹脂再懸浮於10倍體積的硼酸鈉0,2M pH 9並搖動之。
-移出小量的珠粒以用於交聯前檢查。
-加入DMP(二甲基-庚二醯亞胺酸)達20mM(最終濃度)。於此步驟中，在IgG與樹脂之蛋白質G間發生交聯。於室溫下溫和地攪拌30min。
-移出小量的珠粒以用於交聯後檢查。
-在離心(2500rpm)15min後，移出上清液並以20倍體積
的乙醇胺0,2M pH 8洗滌樹脂。
-重複此步驟3次。此步驟允許穩定化新的共價連接。
-接著以20倍體積的乙醇胺(0,2M pH 8)洗滌樹脂並於室溫下溫和地攪拌120min。
-在離心(2500rpm)15min後，移出上清液並以30mL PBS1x洗滌樹脂3次。
-在離心(2500rpm)15min後，移出上清液並加入20mL以NaN3補充的的PBS1x(最終濃度0.05%)。
-最後將樹脂加至色層分離法管柱上並接著儲存於4℃下。
使用用於製備以上描述的全體IgG-親和力純化管柱的方案以製備允許純化IgG2部分的新管柱。在該方案中進行單一修飾(以上描述的管柱1製備方案之第二步驟)。
特別地：
-將商業上可購得的小鼠抗人類IgG2 Fc單株抗體(Acris Antibodies)以3mg/mL的最終濃度加至樹脂並於室溫下溫和地攪拌90min。
-首先在「第1號管柱」(全體IgG純化管柱)中純化所收集的血清。簡言之，於室溫下培養不同的血清後，以PBS1X洗滌管柱以允
許洗提出非專一性血清蛋白質。接著藉由改變管柱之pH(pH 2.2)來洗提IgG部分。
-在洗提後，中和包含全體IgG的溶液(pH 7.0)並再次將其加至「第2號管柱」(IgG2部分純化管柱)中。如對管柱1純化描述的，中和管柱2經洗提樣本並將其儲存於4℃下以進一步分析。
以上描述的親和力管柱允許自人類血清純化IgG2。為了評估所純化的樣本之品質，進行SDS-PAGE分析然後進行考馬斯染色：
-在4-15%Tris-甘胺酸預澆鑄凝膠(Bio-Rad)上分析樣本。
-於200V下進行跑電泳1個小時。
-使用考馬斯藍溶液將電泳凝膠染色20min。
-於包含去染色劑的溶液中洗滌經考馬斯染色的凝膠2個小時並接著以乾淨的自來水洗滌。
-在完全DMEM+10% FCS中於96槽孔盤中使104個Vero細胞/槽孔生長直到100%匯合。
-於37℃與5% CO2下以100μL完全DMEM的最終體積使用不同濃度(10、5與2.5μg/mL)的所關注的經純化Fab預先培養HSV-1與HSV-2病毒儲存稀釋物(分別為-3與-2)1h。
-亦加入實驗對照組。
-在以PBS 1x溶液洗滌細胞後，將病毒溶液加至單層並在37℃與5% CO2下培養2h以供吸附。
-於PBS 1X中洗滌各槽孔一次，接著將以2% FCS補充的完全DMEM加至各槽孔並在37℃與5% CO2下培養22h。
-以1mL的70%甲醇與1%結晶紫之基於水的溶液固定並染色細胞單層。於培養5’後移除固定/染色溶液，並接著於H2O中洗滌細胞單層一次並乾燥。
-藉由明視野相位差光學顯微鏡評估融合細胞形成之減少程度。特別地，比較在經以Fab或IgG1 Fab處理的病毒感染的細胞單層中觀察到的細胞形態與經病毒對照組(相同的病毒量但無經純化的IgG2)感染的細胞之形態。
-在完全DMEM+10% FCS中於96槽孔盤中使104個Vero細胞/槽孔生長直到100%匯合。
-以與中和分析中所使用者相同的HSV-1與HSV-2病毒儲備物之稀釋物感染細胞，接著如先前針對病毒滴定所描述者進行吸附與培養。
-移除培養基，於PBS 1X中洗滌細胞單層一次並以200μL/槽孔的1：1=丙酮：甲醇冰冷溶液固定。移除固定溶液。將盤儲存在-20℃下。
-藉由添加商業上可購得的抗HSV-1與HSV-2 gD2蛋白質mAb來進行IIF染色(於黑暗潮濕的箱子中於37℃下1h)。
-將盤洗滌兩次(於PBS1X中5’)。
-將結合FITC的次級mAb加至初級染色產物(於黑暗潮濕的箱子中於37℃下1h)。
-將盤洗滌兩次(於PBS1X中5’)。
-藉由添加Hoechst溶液進行核染色(於黑暗潮濕的箱子中於37℃下15min)。
-將盤洗滌兩次(於PBS1X中5’)。
-通過InCell分析器系統分析感染病灶。
-將7x105個Vero細胞/槽孔接種到6槽孔盤中並在適當的以10% FCS補充的完全培養基中生長。以達到100%匯合的細胞進行實驗。
-於37℃與5% CO2下以800μL完全DMEM的最終體積使用不同濃度(5、2.5與1μg/mL)的所關注的經純化Fab預先培養HSV-1與HSV-2病毒儲備物之稀釋物(分別為-5與-4)1h。
-亦加入實驗對照組。
-在以PBS 1x溶液洗滌細胞後，於37℃與5% CO2下將病毒溶液加至單層並培養2h以供吸附。
-於PBS 1X中洗滌各槽孔一次，接著將2mL以2% FCS與1%瓊脂糖補充的完全DMEM加至各槽孔並於37℃與5% CO2下培養46h。
-移出瓊脂糖層並以1mL的70%甲醇與1%結晶紫之基於水的溶液固定並染色細胞單層。在培養5’後移除固定/染色溶液，接著於
PBS 1X中洗滌細胞單層一次並乾燥。
-接著藉由計數溶菌斑形成單位(PFU)評估中和活性。特別地，比較在經以Fab處理的病毒感染的細胞單層中的PFU數目與病毒對照組(相同病毒量)之PFU計數。
-在完全DMEM+10% FCS中於96槽孔盤中使104個Vero細胞/槽孔生長直到100%匯合。
-於37℃與5% CO2下以100μL完全DMEM的最終體積使用不同濃度的所關注的經純化Fab預先培養HSV-1與HSV-2病毒儲存物之稀釋物(分別為-4與-2)1h。
-亦加入實驗對照組。
-在以PBS 1x溶液細胞洗滌後，將病毒溶液加至單層並於37℃與5% CO2下培養2h以供吸附。
-於PBS 1X中洗滌各槽孔一次，接著將以2% FCS補充的完全DMEM加至各槽孔並於37℃與5% CO2下培養22h。
-移除培養基，於PBS 1X中洗滌細胞單層一次並以200μL/槽孔的1：1=丙酮：甲醇冰冷溶液固定。移除固定溶液。將盤儲存在-20℃下。
-藉由添加商業上可購得的抗HSV-1與HSV-2mAb進行IIF染色(於黑暗潮濕的箱子中於37℃下1h)。
-將盤洗滌兩次(於PBS1X中5’)。
-將結合FITC的次級mAb加至初級染色產物(於黑暗潮濕
的箱子中於37℃下1h)。
-將盤洗滌兩次(於PBS1X中5’)。
-藉由添加Hoechst溶液進行核染色(於黑暗潮濕的箱子中於37℃下15min)。
-將盤洗滌兩次(於PBS1X中5’)。
-接著藉由透過InCell分析器系統計數免疫螢光感染病灶來評估中和活性。
-比較在使用經不同的Fab製劑處理的病毒感染的細胞單層中的感染病灶數目與病毒對照組(相同病毒量)的病灶計數。
-接著評估中和百分比且亦計算離開平均值的標準偏差(以三重複進行實驗)。
使用Histopaque 1077(Sigma)(一種被設計用於血液細胞分離的Ficoll梯度溶液)自血液樣本分離PBMC(周邊血液單核細胞)。
按照產品操作指南，使用Rneasy Mini套組(Qiagen)自經分離的淋巴球萃取RNA，並使用用於RT-PCR AMV的Transcriptor第一股cDNA合成套組(羅氏(Roche))將其逆轉錄成cDNA。
使用先前獲得的cDNA作為PCR模版。特別地，使用Solforosi et al.(2012)“A phage display vector optimized for the generation of human antibody combinatorial libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments”New Microbiologica 35(3),289-294所描述的一組特別的引子，進
行屬於IgG2子類型的免疫球蛋白之輕鏈(LC)與重鏈(HC)之放大(引子序列參見補充1章節)。
在使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)「跑」電泳瓊脂糖凝膠後純化所有經放大的HC與LC。在純化步驟後，亦定量兩鏈(NanoDrop 8000，較高資料產出量，全光譜微體積UV-Vis測量，ThermoScientific)並以所挑選的限制酶消化其等(如解釋酵素性消化反應混合物的下兩個表所強調的)以將其等選殖入pCM載體中(Solforosi等人(2012)“A phage display vector optimized for the generation of human antibody combinatorial libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments”New Microbiologica 35(3),289-294)，此係按照已描述的方案。
更詳細言之，使用SacI與XbaI限制酶(NEB)按照在表5中顯示的方案消化LC與pCM：
於37℃下將消化分別進行45min(載體)與3個小時(LC)並接著透過透過Sybr Safe染色檢查經消化的產物。
自瓊脂糖凝膠萃取顯示正確的分子量的經消化pCM與LC DNA(分別為3500與670bp)，純化(QIAquick凝膠萃取套組，Qiagen)、並接著使用T4 DNA連接酶(NEB)連接(於室溫2個小時)。接著使用連接產物轉形電勝任細胞(大腸桿菌XL-1 Blue電勝任細胞，Stratagene)。
接著自經轉形的細胞純化包含LC的pCM(pCMLc)(Qiagen質體Midi套組，Qiagen)。
亦消化pCMLc載體與先前已放大的HC，如顯示消化條件的下表所解釋。
使用XhoI與SpeI限制酶(NEB)，如以下表6所示：
於37℃下分別將消化進行45min(載體)與3個小時(HC)並透過Sybr Safe染色檢查經消化的產物(圖10)。
自瓊脂糖凝膠萃取顯示正確分子量的經消化的pCMLc與HC DNA(分別為4000與730bp)、純化(QIAquick凝膠萃取套組，Qiagen)、並接著使用T4 DNA連接酶(NEB)連接(於室溫2個小時)。接著使用連接產物轉形「自製」XL-1 Blue電勝任細胞。
接著自經轉形的細胞純化包含LC與HC的pCM(pCMLcHc)(Qiagen質體Midi套組，Qiagen)。
-以文庫DNA轉形一份XL1-Blue電勝任細胞。
-在於37℃下於2mL SOC培養基(2%胰腖、0.5%酵母菌萃取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、與20mM葡萄糖)中伴隨搖動恢復60’後，將其加至10mL具有10μg/mL四環素與20μg/mL胺芐青黴素的SB培養基(3.2%胰腖、2%酵母菌萃取物、0.5%氯化鈉-pH：7.0±0.2)(「低Amp」)。
-文庫滴定：將10-2至10-5的稀釋物系列塗盤在Tet-Amp瓊脂盤上。
-於37℃伴隨搖動培養低Amp 60’。
-添加50mL具有100μg/mL胺芐青黴素的SB培養基(「高Amp」)並於37℃伴隨搖動培養60’。
-添加1012PFU(溶菌斑形成單位：一種每單位體積能夠形成溶菌斑的顆粒之數目的度量單位)的輔助噬菌體(自製並經滴定的)並於37℃下伴隨搖動培養60’。
-添加70μg/mL康黴素並於30℃培養過夜(ON)。
-製備用於噬菌體之親和力挑選的盤：將Vero E6細胞種在CostarTM 96槽孔EIA/RIA盤中(4x104
個細胞/槽孔，於DMEM+10% FBS中，每個感染4個槽孔)，並於37℃、5% CO2下培養ON。於次日，在無FBS的DMEM中10-2稀釋HSV-1(HF病毒株)儲備物並將其種在細胞上與吸附2個小時。接著，以DMEM+2% FBS替換包含培養基的培養基且將盤於37℃、5% CO2下培養20個小時。於室溫使用40uL/槽孔的多聚甲醛溶液(Invitrogen IC固定緩衝劑-FB001)固定經感染的細胞15’。在培養時間後，以100μL/槽孔的PBS置換溶液。
-使用以式計算第1日之噬菌體力價：104 x(稀釋因數)x盤上(菌落之數目)/μL。
-接種在具有10μg/mL四環素的SB中的XL1-Blue菌落(對每種抗原是4mL，對使用輸出噬菌體的感染是2mL且對使用輸入噬菌體的感染是2mL)並於37℃伴隨搖動來培養直到達到於550nm波長為0.5的光學密度(OD)。
-在離心ON細菌培養生長物後(於4℃下40’，RCF：1540 x g)，將上清液倒入具有8mL的PEG/NaCl溶液的無菌50mL管中並在冰上培養30’以允許噬菌體沈澱。
-在離心後(於4℃下25’，RCF：12130 x g)，丟棄上清液並以1mL的PBS/BSA 1%溶液溫和地再懸浮沈澱小丸。
-在離心後(於室溫下5’，RCF：21380 x g)，收集上清液(「未經淘選的噬菌體」)。
-於室溫使用500μL的多聚甲醛溶液(Invitrogen IC固定緩衝劑-FB001)固定得自100%匯合的T75燒瓶的Vero E6細胞之懸浮液15’。在培養時間後，於PBS溶液中洗滌細胞。在將經再懸浮的噬菌體加至包含以經處理的HSV感染的細胞的盤(挑選步驟)之前，於37℃伴隨搖動以1,5x106個細胞/槽孔預先培養噬菌體溶液60’(淘汰步驟)。在離心後(於室溫下2’，RCF：21380 x g)，接著收集上清液並將其加至具有經固定且經可滲透化的經HSV感染的細胞的盤。
-於37℃下培養70μL/槽孔的未經淘選噬菌體120’。
-自每個抗原之4個槽孔收集上清液作為「輸入」並在冰上儲存。
-於37℃下以100μL/槽孔的PBS/吐溫0,5%溶液將每槽孔洗滌10次，每次以移液管抽放10次。
-加入50μL/槽孔的洗提緩衝劑(0.1M甘胺酸-HCl，pH 2.2)，培養1’並刮擦槽孔之底部。
-以中和緩衝劑(2M Tris，pH 8.0)收集經洗提的噬菌體作為「輸出」並在冰上儲存。
通常需要五個挑選回合(六日)以從自Fab之DNA文庫獲得的噬菌體群體獲得具有明顯抗原結合活性的殖系之高親和力挑選。
重要地，進行了在第一淘選挑選回合的在經HSV-1與HSV-2感染的細胞上的噬菌體抗體文庫之交叉挑選。
-萃取從回合4與5之高Amp獲得的DNA並於37℃下以SpeI與NheI限制酶(NEB)雙重消化60’。
-自先前融合至Fab的噬菌體蛋白質(cpIII)分離所關注的DNA(包含HC兩者LC的質體)，進行瓊脂糖1%凝膠電泳跑膠(85V共3個小時)並以QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)萃取。
-使用T4連接酶(NEB)連接所萃取DNA並轉形一份XL1-Blue電勝任細胞。
-在於SOC培養基恢復後，塗盤在LB瓊脂上。
-對每一者將第1日獲得的菌落接種在3mL具有10μg/mL四環素與100μg/mL胺芐青黴素的SB培養基中。將未經轉形的XL1-Blue電勝任細胞之菌落加至3mL僅具有10μg/mL四環素的SB培養基中作為陰性對照組。於37℃伴隨搖動培養接種物直到達到於550nm波長為0.5的光學密度(OD)。
-誘發Fab之製造，以1：1000之建議的稀釋度添加IPTG(異丙基β-D-1-硫代半乳哌喃醣苷-Sigma I6758)並於30℃伴隨搖動培養ON。
-在將細菌培養生長物離心ON(於4℃下20’，RCF：1540 x g)後，丟棄上清液並以1mL的PBS再懸浮沈澱小丸。
-添加蛋白酶抑制劑並按照冷凍&解凍程序進行三次：˙在乾冰上培養直到完全冷凍，˙於37℃下伴隨搖動培養直到完全解凍。
-在離心(於室溫下10’，RCF：21380 x g)後，將上清液用於蛋白質(Fab)表現篩選並將沈澱小丸用於DNA萃取與分析。
-將一盤新鮮的菌落接種在10mL包含10μL胺芐青黴素(Cf=50μg/mL,C.儲備物=100mg/mL)與20μL四環素(Cf=100μg/mL，C.儲備物=5mg/mL)的SB(超級培養液)中並於37℃下在旋轉搖晃器中(180rpm)培養過夜。
-將5mL的接種物分接種至500mL包含500μL胺芐青黴素(Cf=50μg/mL，C.儲備物=100mg/mL)與1mL四環素(Cf=100μg/mL，C.儲備物=5mg/mL)的SB(超級培養液)中並於37℃下在軌道搖晃器中(180rpm)培養6-8個小時。
-當培養OD達到0,8-1(指數生長)時，以1mmol/L的最終濃度添加IPTG(異丙基-b-D-硫代半乳哌喃醣苷)。
-於30℃下於軌道搖晃器中(180rpm)培養過夜。
-將細菌培養物轉移至乾淨的250mL瓶中。
-於4℃或室溫下離心(以3500-4500rpm 20-30’)。
-將細胞沈澱小丸以最終體積25mL的PBS1X再懸浮至falcon 50mL中，添加蛋白酶抑制劑並將falcon放置於4℃下。
-將falcon維持在冰上，音振細胞性懸浮液90’’，暫停60’’。將此重複3-4次。
-將細菌溶胞產物轉移至瓶(30mL)中。藉由於4℃下以15.000rpm離心30’來排除細胞殘骸。
-使用注射器50ml與0.45um和然後0.2um的Millipore PVDF來過濾上清液。將濾出物收集至falcon 50mL中。
-於4℃下儲存。
-以20mL PBS1X洗滌管柱。重複兩次。
-以10mL洗提緩衝劑pH 2.2洗提。
-以PBS1X再平衡管柱之pH，檢查pH。
-關上管柱之蓋子。將樣本裝載到管柱上，一次2-4mL。等待幾分鐘並將管柱再打開。
-以50mL PBS1X洗滌管柱。
-關上管柱之蓋子。將10mL洗提緩衝劑pH 2.2裝載到管柱上，一次2-4mL。等幾分鐘並將管柱再打開。
-在含有中和緩衝劑pH 11的falcon中收集洗提產物。
-檢查pH並使用中和緩衝劑pH 11中和溶液(pH 7-8)。
-以PBS1X再平衡管柱之pH。
-以10mL洗提緩衝劑pH 2.2洗提。
-以PBS1X再平衡管柱之pH，檢查pH。
-添加20mL PBS1X+200μL NaN3100X並於4℃下儲存管柱。
以PBS1X洗滌Centricon：以4000rpm離心10-15'。接著，藉由以4000rpm離心10-15'來濃縮Fab。
取濾膜所留下與純化的Fab並於4℃下儲存。
分別藉由SDS-PAGE/考馬斯染色計算經純化的Fab之正確表現與濃度(如已於IgG2純化與定量方案中描述的)。
使用已包含IgG1抗體之HC與LC序列的pCM載體進行此選殖程序(Solforosi等人(2012)“A phage display vector optimized for the generation of human antibody combinatorial libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments”New Microbiologica 35(3),289-294)。將NheI限制位置引入上述的IgG1-Fab之VH與CH1序列間以允許僅HC之VH片段之分子選殖。
將所挑選的抗HSV Fab之VH序列以與IgG1-CH1符合讀框的方式選殖。更詳細言之，藉由使用經特別設計以包含限制位置的引子來
進行PCR放大來將NheI限制位置加至所挑選的Fab VH序列之3’端。
使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化所有經放大的VH。在純化步驟後，亦定量VH鏈(NanoDrop 8000，較高資料產出量，全光譜微體積UV-Vis測量，ThermoScientific)並以所挑選的限制酶消化其等以將其等選殖入表現載體中，此係按照已描述的方案。
更詳細言之，使用XhoI與NheI限制酶(NEB)按照在表7中的方案消化經放大的VH與載體兩者：
於37℃下將消化進行1個小時並接著透過透過Sybr Safe染色檢查經消化的產物。
自瓊脂糖凝膠萃取顯示正確的分子量的經消化產物(對於VH-經消化載體是4474bp且對於VH是426bp)，純化之(QIAquick凝膠萃取套組，Qiagen)，並接著使用T4 DNA連接酶(NEB)(於室溫10分鐘)連接。接著使用連接產物以轉形電勝任細胞(大腸桿菌XL-1 Blue電勝任細胞，Stratagene)。
接著自經轉形的細胞純化包含與IgG1-CH1符合讀框地連接
的VH的質體(pVH-CH1-IgG1)(Qiagen質體Midi套組，Qiagen)並分析正確的插入以定序具有特殊引子次組的所關注部分。
亦消化屬於HSV Fab群組的pVH-CH1-IgG1構築體與LC，如顯示消化條件的表8中解釋的。
於37℃下進行消化1個小時並接著透過Sybr Safe染色檢查消化產物。
自瓊脂糖凝膠萃取顯示正確的分子量的經消化pVH-CH1-IgG1與LC DNA(分別為4230與670bp)，純化之(QIAquick凝膠萃取套組，Qiagen)，並接著使用T4 DNA連接酶(NEB)(於室溫10分鐘)連接。接著使用連接產物以轉形XL-1 Blue電勝任細胞(Stratagene)。接著自經轉形的細胞純化包含不同抗HSV殖系之LC與HC的質體(pVH-CH1_LC-IgG1Fab)(Qiagen質體Midi套組，Qiagen)並分析正確的插入以定序具有特殊引子次組的所關注部分。
如在選殖方案段落中描述的，定序所有的新IgG1 Fab殖系以檢查VH-HC與LC之正確的插入。
為了廣泛地確定不同格式的mAb A(或Ex2)之特徵，亦將mAb以單鏈抗體A(ScFvA)的形式表現。
放大Fab A之可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)並將其等用於構築單鏈(ScFv)。
ScFv基因序列盒係由以下構成：a)編碼Fab A VL與VH的DNA、b)編碼連接子區域[(Glyx3Ser)x3]的DNA、c)編碼蛋白質標籤(聚組胺酸)的DNA。
如下構築ScFv FabA(Fab Ex2)基因序列盒：
如以上所述，已成功地藉由PCR(聚合酶連鎖反應)自編碼mAb A輕鏈與重鏈可變區域的DNA模版放大用於輕鏈與重鏈(分別為VL與VH)的Fab A可變區域。用於自DNA模版放大mAb A LC與HC的引子包含：位於5’VL端的用於將整個ScFv基因序列盒插入載體中的限制位置SacI(New England Biolabs，NEB)。
位於3’VL端的編碼連接子區域的DNA序列之部分(連接子重疊區域)。
位於5’VH的編碼連接子區域的DNA序列之部分(連接子重疊區域)。
位於3’VH的編碼His標籤與用於將整個ScFv基因序列盒插入表現載體中的限制位置SpeI(NEB)的DNA序列。使用所有如以上描述放大的基因片段來進行重疊PCR以構築完整長度的ScFv基因序列盒。
連接子區域(在LC與HC之間)之主要功能係結構性的，特別地，由[(Gly)3Ser]3構成的連接子區域之特徵在於允許表現後的適當ScFv折疊的高彈性。藉由PCR重疊技術在VL與VH間加入連接子區域。
聚組胺酸標籤區域(His標籤)對於藉由親和力色層分離法純化ScFv而言是十分重要的。特別地，此區域選擇性地與Ni2+NiNta樹脂(商業上可購得的，QIAGEN)(其係例行地用於純化含His標籤的蛋白質)結合。將His標籤DNA序列加至ScFv基因序列盒以將聚His DNA編碼序列引入已包含Spe I限制位置的3’VH引子中。
基因序列盒被選殖入載體，接著使用以下方案製造ScFvA：
以包含ScFv A基因序列盒的載體轉形(藉由電穿孔)XL-1 Blue細菌。
培養具有ScFv載體的經正確地轉形的XL1 Blue細菌並基於載體所攜帶的ampr(胺芐青黴素抗性基因)抗性標記以抗生素(胺芐青黴素)挑選。
藉由將所謂的「誘發劑」(IPTG)加至包含經ScFv轉形的細菌的培養液來誘發ScFv A之表現。
為了在誘發步驟後收集由細菌製造的ScFv，音振ScFvA表現性細菌以瓦解細菌壁並釋放由細菌製造的ScFvA。
5.離心無細胞上清液以將細胞殘骸沈澱成小丸。充分離心經音振細菌產物以將細菌之細胞殘骸沈澱成小丸。
收集得自步驟5的上清液並將其裝載至Ni2+親和力色層分離法管柱中以藉由His標籤純化ScFv。
接著收集經純化的ScFv並於-20℃下儲存。
<110> 波利化學公司
<120> 對HSV-1及HSV-2具有強中和活性之人類單株抗體
<130> 13519PT外國提申
<160> 13
<170> Patent In第3.5版
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(112)
<223> VH1：Fab A重鏈可變區域(VH)
<400> 1
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(106)
<223> VL1 Fab A輕鏈可變區域(VL)
<400> 2
<210> 3
<211> 8
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<213> 智慧人
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<223> VH1CDR Fab A互補性決定區域
<400> 3
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<211> 118
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<221> 變體
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<223> VH3：Fab B重鏈可變區域(VH)
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(118)
<223> VH51 Fab I重鏈可變區域(VH)
<400> 4
<210> 5
<211> 107
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<213> 智慧人
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<221> 變體
<222> (1)..(107)
<223> VL3 Fab B輕鏈可變區域(VL)
<400> 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 智慧人
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<221> 變體
<222> (1)..(12)
<223> VH3CDR Fab B互補性決定區域
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<221> 變體
<222> (1)..(12)
<223> VH51CDR Fab I互補性決定區域
<400> 6
<210> 7
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<213> 智慧人
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<221> 變體
<222> (1)..(120)
<223> VH5 Fab C重鏈可變區域(VH)
<400> 7
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<212> PRT
<213> 智慧人
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<221> 變體
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<223> VL5 Fab C輕鏈可變區域(VL)
<400> 8
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<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<221> 變體
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<223> VH5CDR Fab C互補性決定區域
<400> 9
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 智慧人
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<221> 變體
<222> (1)..(121)
<223> VH47 Fab H重鏈可變區域(VH)
<400> 10
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(107)
<223> VL47 Fab H輕鏈可變區域(VL)
<400> 11
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(15)
<223> VH47CDR Fab H互補性決定區域
<400> 12
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(106)
<223> VL51 Fab I輕鏈可變區域(VL)
<400> 13
Claims (18)
- 一種HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其包含重鏈可變區域(VH)與輕鏈可變區域(VL)兩者，該抗體或其片段包含選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：12所組成的群組的互補性決定區域(CDR)。
- 根據申請專利範圍第1項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該重鏈可變區域(VH)係選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：10、或其直接等效物所組成的群組。
- 根據申請專利範圍第2項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該直接等效物與該等重鏈可變區域(VH)有至少95%總體序列同源性/一致性且能夠以低於5μg/ml的濃度抑制HSV-1及/或HSV-2各自之活性達50%。
- 根據申請專利範圍第1至3項中任一項的HSV-1及/或HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該輕鏈可變區域(VL)係選自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：13、或其直接等效物所組成的群組。
- 根據申請專利範圍第4項的HSV-1及/或HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該直接等效物與該等輕鏈可變區域(VL)有至少95%總體序列同源性/一致性且能夠以低於5μg/ml的濃度抑制HSV-1及/或HSV-2各自之活性達50%。
- 根據申請專利範圍第1至5項中任一項的HSV-1及/或HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該抗體具有SEQ ID NO：1之重鏈可變區域(VH) 與SEQ ID NO：2之輕鏈可變區域(VL)。
- 根據申請專利範圍第1至6項中任一項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該抗體係人類抗體。
- 根據申請專利範圍第1至7項中任一項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該抗體具有IgG1重鏈恆定區域。
- 根據申請專利範圍第1至8項中任一項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其中該抗體具有IgG2重鏈恆定區域。
- 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至9項中任一項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段與醫藥上可接受的載劑。
- 根據申請專利範圍第10項的醫藥組成物，其係用於口服、局部、眼部、肌肉內、靜脈內灌注、皮下、或吸入投予途徑。
- 根據申請專利範圍第10或11項的醫藥組成物，其係與至少一種抗病毒劑組合使用。
- 一種根據申請專利範圍第1至9項中任一項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其用於治療HSV-1及/或HSV-2相關性疾病。
- 根據申請專利範圍第13項的用途，其中該治療係於對使用至少一種抗病毒劑的先前治療有抗性或不耐受或其中應避免使用抗病毒劑治療的患者、或其中該患者係免疫被削弱的(immunodepressed)或免疫受抑制的(immunosupressed)。
- 根據申請專利範圍第13或14項中任一項的用途，其中該治療係預防性或治療性。
- 根據申請專利範圍第13至15項中任一項的用途，其中該HSV-1及 /或HSV-2相關性疾病係急性或慢性的且其中HSV-1及HSV-2感染係原發性感染、非原發性感染或復發。
- 根據申請專利範圍第16項的用途，其中該HSV-1及/或HSV-2相關性疾病係選自由口部皰疹、皰疹角膜炎、皰疹指端化膿、格鬥者皰疹、濕疹性皰疹、新生仔皰疹、生殖器皰疹、非典型生殖器皰疹、皰疹性子宮頸炎、皰疹性直腸炎、皰疹性腦炎、皰疹性腦膜炎、皰疹性腦膜腦炎、散播性單純皰疹感染、阿茲海默氏病與痴呆所組成的群組。
- 一種根據申請專利範圍第1至9項中任一項的HSV-1及HSV-2結合性單株抗體或其片段，其係用於減少病毒排放(shedding)與預防傳播。
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