TW201639876A

TW201639876A - 嵌合多肽

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Publication number: TW201639876A
Application number: TW105109429A
Authority: TW
Inventors: 丹尼爾關; 大衛伯金; 蓋文哈奇特
Original assignee: 艾普森生物製藥有限公司
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2016-11-16
Also published as: US20180073089A1; WO2016156113A1; EP3274450A1; GB201505306D0; RU2017134724A; RU2017134724A3; JP2018510653A; HK1245832A1; CN107438670A; US10648045B2

Abstract

本發明係與重組梭菌神經毒素有關，其係經過修飾以改善其等之活化。特別是，本發明係與其中該活化環已被同一血清型中，不同亞型的活化環取代之嵌合梭菌神經毒素有關。本發明也與產生此種嵌合梭菌神經毒素之方法，與活化此種經修飾的梭菌神經毒素的方法，以及表現此種嵌合梭菌神經毒素之多核苷酸、載體和細胞，包含有此種嵌合梭菌神經毒素之組成物及其之用途有關。

Description

嵌合多肽

本發明係與重組梭菌神經毒素有關，其係經過修飾以改善其等之活化程度。特別是，本發明係與嵌合梭菌神經毒素有關，其中該活化環係已被來自相同血清型中之不同亞型的活化環取代。本發明也與生產此種嵌合梭菌神經毒素的方法，以及活化此種嵌合梭菌神經毒素的方法，還有表現此種嵌合梭菌神經毒素的多核苷酸、載體與細胞，包含有此種嵌合梭菌神經毒素的組成物及其等之用途有關。

在梭菌屬(Clostridia)中的細菌，會產生高效價且具專一性的蛋白毒素，其可以毒害所遞送至之神經元以及其他細胞。此等梭菌毒素之範例包括有由破傷風梭菌(C.tetani(TeNT))以及肉毒桿菌(C.botulinum(BoNT))血清型A~G所產生，還有那些由巴氏梭菌(C.baratii)與酪酸梭菌(C.butyricum)所產生之神經毒素。

BoNT係由肉毒桿菌(C.botulinum)以大型蛋白質複合體的形式所產生，其係由BoNT本身與若干輔助蛋白複合所構成。目前有至少七種不同類型之類肉毒桿菌神經毒素，分別為：肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、 C₁、D、E、F和G，其等全都具有類似的結構和作用模式。最近也報導了一種可能的第八血清型H。不同的BoNT血清型，可以藉著血清型與在胺基酸層級上之百分比序列一致性之關係，而依據特定之中和抗血清的去活作用來進行區分。特定血清型之BoNT蛋白質，係基於胺基酸百分比序列一致性，而被進一步區分為不同亞型。

BoNTs係為已知最為有效之毒素，其之小鼠的半數致死量(LD₅₀)值，隨著血清型的不同係為0.5至5奈克/公斤。BoNTs可以透過胃腸道而進入人體，同時會在進入全身循環後，與膽鹼性神經末梢的突觸前膜結合，並且能夠抑制神經傳導物質乙醯膽鹼的釋放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G會切割突觸囊泡膜蛋白(synaptobrevin)/囊泡相關膜蛋白(VAMP)；BoNT/C₁、BoNT/A和BoNT/E會切割25kDa的(SNAP-25)的突觸體相關蛋白；而BoNT/C₁則會切割突觸融合蛋白(syntaxin)。雖然BoNTs係作用於神經肌肉結合點上，並抑制週邊神經系統的膽鹼傳遞作用，而TeNT則是作用於中樞神經系統上。

在自然界中，梭菌神經毒素係被合成為單鏈多肽，其係藉由蛋白水解切割作用來進行轉譯後之修飾，以形成由雙硫鍵連接在一起之兩條多肽。該切割動作係發生在通常被稱為活化位之特定切割位上，其係位於提供鏈間雙硫鍵的該等半胱胺酸殘基之間。這種毒素的活性形式正是此種雙鏈形式。這兩條胜肽鏈係被稱為具有約100kDa的分子量之重鏈(H鏈)，以及具有大約 50kDa的分子量之輕鏈(L鏈)。H鏈包含C端標定部分(H_C功能域)，以及N-端易位部分(H_N功能域)。該切割位係位在被稱為活化環之暴露環區域(參見第1圖和表1)內，於該L鏈與易位部分之間。在H_C功能域與其之目標神經元結合，並藉著內吞作用而將所結合之毒素內化至細胞內後，該H_N功能域會將該L鏈易位通過內吞膜而進入細胞質中，同時L鏈還提供了蛋白酶的功能(也稱為非細胞毒性蛋白酶)。

非細胞毒性蛋白酶係藉著蛋白水解作用，來切割被稱為SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白)之細胞內運輸蛋白，以進行作用-參見Gerald K(2002)「Cell and Molecular Biology」(4th edition)John Wiley & Sons,Inc。SNARE此一縮寫係衍生自可溶性NSF附著蛋白受體(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF係指N-乙基馬來醯亞胺-敏感因子。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合，且因此對於透過囊泡運輸而從細胞分泌的分子而言，是不可或缺的。該蛋白酶功能係為一種鋅依賴型胜肽內切酶，並且對於SNARE蛋白呈現出高度的受質專一性，因此一旦其被遞送至所欲之目標細胞後，該非細胞毒性蛋白酶就能夠抑制該目標細胞之細胞分泌。梭菌毒素的L鏈蛋白酶，係為可以切割的SNARE蛋白之非-細胞毒性蛋白酶。

在生理條件下，會與神經元的神經節苷脂(藉由H_C功能域)結合的BoNT重鏈，將藉著受體引導的細胞內吞作用，而收容於該細胞內。在胞吞腔室的酸性介質中，H_N功能域會穿透進入囊泡膜內並形成一孔洞。該輕鏈(其係藉著雙硫鍵而連接至該重鏈)將會藉著讓細胞內之氧化還原體系，與雙硫鍵接觸並使其還原，而與該重鏈切離，因而使得該輕鏈最終會被釋放到細胞質內。

肉毒桿菌神經毒素係因為其等可以導致弛緩性肌肉麻痺之能力，而為人所熟知。鑑於SNARE蛋白分布甚廣之性質，諸如BoNTs之梭菌毒素，已經被成功地應用於範圍廣泛之療程中。舉例來說，我們可以參考William．J.Lipham的「Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin」(Slack公司，2004年)，其描述了使用梭菌毒素，例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F與BoNT/G之肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)，以及破傷風神經毒素(的TeNT)，而在許多治療與美妝或是醫美應用中，被用來抑制神經細胞傳導作用-舉例來說，市售的肉毒桿菌毒素產品，目前已被批准用於例如局部痙攣、上肢痙攣、下肢痙攣、頸部肌緊張不足、臉痙攣、半面痙攣、腋下多汗症、慢性偏頭痛、神經性逼尿肌過動、眉間紋、間斷魚尾紋等等適應症之治療。此外，梭菌毒素療法係被描述可用於治療神經肌肉障礙(參見US 6,872,397)；用於治療子宮病症(參見US 2004/0175399)；用於治療潰瘍和胃食道逆流疾病(參見US 2004/0086531)；治療肌緊張不足疾病(參見US 6,319,505)；用於治療眼部疾病(參見US 2004/0234532)；用於治療臉痙攣(參見US 2004/0151740)；用於治療斜視(參見US 2004/0126396)；用於治療疼痛(參見US 6,869,610，US 6,641,820，US 6,464,986與US 6,113,915)；用於治療纖維肌痛(參見US 6,623,742、US 2004/0062776)；治療下背痛(參見US 2004/0037852)；用於治療肌肉受傷(參見美國6,423,319)；用於治療竇性頭痛(參見US 6,838,434)；用於治療緊張性頭痛(參見US 6,776,992)；用於治療頭痛(參見US 6,458,365)；用於緩減偏頭痛(參見US 5,714,469)；用於治療心血管疾病(參見US 6,767,544)；用於治療例如帕金森氏症之神經系統疾病(參見US 6,620,415、US 6,306,403)；用於治療神經精神障礙(參見US 2004/0180061、US 2003/0211121)；用於治療內分泌失調(參見US 6,827,931)；用於治療甲狀腺疾病(參見US 6,740,321)；治療膽鹼性影響汗腺疾病(參見US 6,683,049)；用於治療糖尿病(參見US 6,337,075、US 6,416,765)；用於治療胰臟疾病(參見US 6,261,572、US 6,143,306)；用於治療例如骨腫瘤之癌症(參見US 6,565,870、US 6,368,605、US 6,139,845、US 2005/0031648)；用於治療耳部病症(參見US 6,358,926、US 6,265,379)；用於治療例如胃腸肌肉失調與其他平滑肌機能障礙之自主神經系統障礙(參見US 5,437,291)；用於治療與皮膚細胞增生失調相關之皮膚損傷(參見US 5,670,484)；對於神經性炎性病症的調理(參見US 6,063,768)；減少落髮並促進頭髮生長(參見US 6,299,893)；治療嘴角下垂(參見US 6,358,917)；用於降低食慾(參見US 2004/40253274)；用於牙科治療和手術 (參見US 2004/0115139)；用於治療與神經肌肉障礙和病症(參見US 2002/0010138)；用於治療各種不同障礙與病症以及相關疼痛(參見US 2004/0013692)；用於治療由例哮喘和慢性阻塞性肺病之黏液過度分泌所導致的病症(參見WO 00/10598)；以及用於治療例如發炎、內分泌病症、外分泌病症、免疫病症、心血管疾病、骨病症等等非神經性病症(參見WO 01/21213)。所有上述文獻之整體內容，均在此被併入以供參考。

目前，所有已經批准的藥物/化妝品製劑中都包含有BoNTs，其包括有BoNT/A(例如DYSPORT^®、BOTOX^®、XEOMIN^®)或BoNT/B神經毒素(eg MYOBLOC^®)。其他BoNT血清型與亞血清型都具有潛在之所欲特性。然而，由於這些BoNTs的單鏈形式係難以被轉化成活化的雙鏈形式，因此這些特性/BoNTs可能就難以被加以利用。

以往試圖要改善BoNT活化程度的嘗試，包括有運用異源(外源)蛋白酶，藉由在BoNT多肽內之適當位置所發現的天然存在之切割位，或者是藉由以基因工程而將一般市售外源性蛋白酶的蛋白酶切割位，插入至該BoNT多肽內，以將單鏈BoNT多肽切割成活化的雙鏈形式。

使用外源性蛋白酶的缺點在於，由於其缺乏蛋白酶專一性而會在不恰當的位置，將蛋白水解切割，而得到不具活性的毒素。舉例來說，最被廣泛用於活化梭菌神經毒素之蛋白酶-胰蛋白酶，在被用於活化血清型 B(BoNT/B)和E(BoNT/E)的梭菌神經毒素時，似乎可能是由於在重鏈次單元的C-端的蛋白水解作用，而會產生其他血清型之副產物，且因此會破壞與其之細胞受體結合的BoNT。因此，此等將某些BoNTs的單鏈形式，轉化為具有活性之雙鏈形式的方法就會變得沒有效率、麻煩並且/或是會導致更高的整體生產成本。

該BoNT/A活化環係為在不同亞型之間所高度保守的(參見第1圖)。其也是最被廣泛研究、充分理解，並且已知係為一種有效率之BoNT活化因子。基於以上結果以及傳統知識，以往其他試圖改善BoNT活化程度的各種嘗試，係與以來自BoNT血清型A的切割位，來替換於預定BoNT內之野生型切割位有關，例如以包含有BoNT/A切割位之BoNT/A活化環，來替換包含有BoNT/B切割位之BoNT/B活化環。

本案發明人已經解決了天然BoNTs的潛在所欲性質可能會因為某些重組亞型活化程度較差而難以進行利用及/或評估的問題。尤其是，本案發明人已經生產了重組肉毒桿菌毒素F₇(rBoNT/F_7-1)，其中天然的BoNT/F₇活化環，已經以BoNT/F₁的活化環來加以取代。BoNT/F₇具有與BoNT/F₁不同之受質結合模式(Kalb S.R.et al.,Applied and environmental microbiology 77.4(2011)：1301-1308)。本案發明人因而積極測試BoNT/F₇是否相較於BoNT/F₁，已經分化出不同的功能性質(例如效價)，卻發現其並不容易被活化。本案發明人驚訝地藉著將F₇的功能域與F₁活化環相結合，而解決了這個問題。本案發明人也驚訝地發現，藉此所獲得之嵌合BoNT/F_7-1具有較佳之特性，特別是具有比BoNT/F₁更佳的效價。

因此，本案發明人已經開發出一種製造完全活化的純化重組肉毒桿菌神經毒素(BoNT)蛋白質的新穎方法，其係由天然存在的BoNT的蛋白質內所演化而來，但是其等本身並不適合用於生產重組蛋白質之所欲功能域。發明人已經藉著製備嵌合BoNTs來達成此一目標，其包含有來自於呈現出較為良好之活性的特定BoNT血清型(以BoNT/F為例)之亞型的活化環，並與活性較差但在成為新藥上具有吸引力之來自同一血清型的亞型結合。

本案發明人也提供了一種新穎的嵌合BoNT/F_7-1，其具有與BoNT/F不同之特性，特別是更高的效價，其對於治療用途而言是更為理想的特性。

因此，本發明提供了一種嵌合多肽，其包含有來自第一肉毒桿菌神經毒素血清型F亞型(BoNT/F)之LH_N主鏈，以及來自不同的BoNT/F亞型之活化環區域。該多肽的LH_N主鏈可以與SEQ ID NO：17~32中之至少一者，具有至少60%的序列一致性。典型地，該多肽的LH_N主鏈包含有：(a)一多肽序列，其係與SEQ ID NOs：33至48中之至少一者，具有至少40%之序列一致性；以及/或是(b)一多肽序列，其係與SEQ ID NOs：49至64中之至少一者，具有至少70%之序列一致性。較佳地該多肽的LH_N主鏈，是來自於一BoNT/F₅亞型或是一BoNT/F₇亞型。

本發明之多肽的活化環，通常包含有配合共通序列KSIIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：65)之一胺基酸序列，或是於該共通序列中添加、刪除或取代不超過五個胺基酸之一胺基酸序列。該活化環可以來自一BoNT/F₁亞型、一BoNT/F₂亞型、一BoNT/F₃亞型、一BoNT/F₄或一BoNT/F₆亞型。在一實施例中，該活化環包含有選自於以下之胺基酸序列：KSVIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：：66)；KSIIPRKGTKQSPSL(SEQ ID NO：67)；或是KSIIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：65)。

典型地，本發明的LH_N主鏈是來自一BoNT/F₇亞型，而該BoNT/F活化環則包含有KSVIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：66)的胺基酸序列。

依據本發明，該多肽係典型地在該BoNT/F活化環中包含有一切割位，其可以被一內肽酶所專一性辨識並進行切割(或切斷)。內肽酶所進行之切割，典型地會導致其形成活化全毒素(holotoxin)。

本發明進一步提供一嵌合雙鏈BoNT/F多肽，其包含有：(a)一輕鏈多肽，其包含有與SEQ ID NOs：33至48中之至少一者，具有至少40%之序列一致性的一胺基酸序列；以及(b)一H_N多肽，其包含有與SEQ ID NOs：49至64中之至少一者，具有至少70%之序列一致性的一胺基酸序列；其中該H_N多肽的N-端包含有來自與其餘的H_N多肽不同之BoNT/F亞型的胺基酸殘基。典型地，該H_N多肽序列的N-端胺基酸殘基，係為A或Q。該H_N多肽序列的N-端，可以由一胺基酸模體(motif)開始，其係選自於由APPRLCIK(SEQ ID NO：70)、APPRLCIT(SEQ ID NO：71)、QSPSLCIK(SEQ ID NO：72)以及QSPSLCIT(SEQ ID NO：73)所構成的群組。該輕鏈多肽序列以及/或是該雙鏈多肽之H_N多肽序列，可以來自於一BoNT/F₅亞型或是一BoNT/F₇亞型。

本發明的雙鏈多肽係典型地可以自在此所描述之本發明的單鏈多肽獲得。

本發明的多肽或雙鏈多肽，可以進一步包含一標定模體，其係適合於藉著將該標定模體直接與一細胞結合，或是藉著將該標定模體直接與和細胞結合之一配體或數個配體進行結合，而將該多肽與一細胞結合。該標定模體可以是來自一梭菌神經毒素之一標定模體。任擇地，該標定模體可以是一非梭菌標定模體。

本發明進一步提供一編碼了本發明之多肽的多核苷酸分子。

本發明進一步提供一表現載體，其包含有本發明的多核苷酸，其係可操作地連接至一啟動子。

本發明也提供了一種生產本發明多肽的方法，其包含有在一細胞中表現本發明的多核苷酸，以及回收所表現的多肽之步驟。該方法可以進一步包括將該多核苷酸導入該細胞的步驟。

本發明也提供一種活化本發明之多肽的方法，其包含將該多肽與一內肽酶進行培養，其中在該 BoNT/F活化環中的切割作用，會將該多肽從一單鏈多肽轉變成一雙鏈多肽，藉此將該多肽加以活化。典型地該內肽酶係為Lys-C。

本發明進一步提供了一種細胞，其表現了本發明之多肽。該細胞可以包含本發明的一多核苷酸或是一表現載體。

本發明進一步提供一種醫藥組成物，其包含有本發明的一多肽或是一雙鏈多肽。該醫藥組成物可以進一步包含有醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。

本發明也提供一種本發明的醫藥組成物，其係用於預防或治療一肉毒桿菌神經毒素療法所顯示之一疾病或病症的方法中。

本發明也提供了一種本發明的醫藥組成物之用途，其係用來製造用於預防或治療一肉毒桿菌神經毒素療法所顯示之一疾病或病症的藥物。

本發明也提供包含有本發明的多肽或雙鏈多肽之化妝品組成物。該化妝品組成物還可以包含美妝上可接受的賦形劑或稀釋劑。

本發明也提供了一種本發明的化妝品組成物之用途，其係用於預防或緩解一肉毒桿菌神經毒素的應用所顯示之美妝適應症。

本發明進一步提供一種嵌合BoNT/F_7-1，其包含有來自BoNT/F₁亞型的一主鏈，以及來自BoNT/F₇亞型的一活化環區域。

依據一較佳實施例中，依據本發明的一嵌合BoNT/F_7-1係用於治療上。

本發明進一步提供一種依據本發明的嵌合BoNT/F_7-1之用途，其係用於預防或緩解一肉毒桿菌神經毒素的應用所顯示之美妝適應症。

第1圖所有BoNT/A亞型與所有BoNT/F亞型之活化環序列的排列比對。每個亞型之活化序列均以底線標記。活化環中的虛線部分係對應於以比對程序的一部分來引入之間隔，以協助在不同的BoNT/A與BoNT/F亞型之間的比對過程。

第2圖基於序列比對之BoNT/F蛋白質序列的親緣分析。

第3圖顯示在個別的BoNT/F序列之間的百分比序列一致性與百分比序列差異性的圖表。

第4圖在UniParc BLAST中所確認之所有非冗餘BoNT/F胺基酸序列的排齊比對。該輕鏈係以粗體、活化環以雙底線、帶序列係以點虛底線、H_N功能域以斜體、H_CN功能域以單底線、H_CC功能域則以破折虛線底線來顯示。在個別的BoNT/F序列中之點虛線，係對應於以比對程序的一部分來引入之間隔，以協助在不同的BoNT/F亞型之間的比對過程。

第5圖rBoNT/F₁、rBoNTF₇和rBoNTF_7-1之示意圖。

第6圖rBoNT/F₁(UPI00000B66D1)、rBoNTF₇(UPI0001DE3DAC)、與rBoNTF_7-1之全長序列的比對。輕鏈係以粗體，活化環以雙底線、帶序列係以點虛底線、H_N功能域以斜體、H_CN功能域以單底線、H_CC功能域則以破折虛線底線來顯示。

第7圖經純化的嵌合rBoNTF_7-1 SXN102875批次DB131202之SDS PAGE凝膠電泳(電泳道1：分子量標記；電泳道2：氧化rBoNTF_7-1樣品；電泳道3：還原rBoNTF_7-1樣品)，每一電泳道均載入1微克的蛋白質。

第8圖rBoNTF_7-1的N-端的處理。第8A圖是辨識在活化環內的切割位之示意圖。第8B圖是證實活化雙鏈rBoNTF_7-1存在之SDS-PAGE凝膠電泳。第8C圖顯示N-端定序的結果。第8D圖係為包括輕鏈的C-端、活化環、以及不同的BoNT/F亞型之H_N功能域的N-端之排列比對。形成該活化環的頸部之半胱胺酸殘基，係以粗體和底線標示。在rBoNTF_7-1 H_N功能域的N-端發現的BoNTF₁殘基，係以粗體、斜體和陰影標示。

第9圖純化嵌合rBoNT/F_7-1的無細胞蛋白酶活性。重組受質蛋白質VAMP-2_2-94-GFP，係在反應停止並以逆相色層分析法進行分析之前，於37℃下與重組(rBoNT/F_7-1)或天然(nBoNT/F)的BoNT/F一起培養30分鐘。第9A圖係為該裂解反應之圖示，其中該受質(VAMP-2_2-94-GFP)係被轉化為產物(VAMP2_2-58與VAMP-2_59-94-GFP)。平面圖第9B圖顯示用來將存在於停止反應混合物中之未切割受質，與經切割 VAMP-2_59-94-GFP產物定量的範例色層分析。第9C圖顯示轉化為產物之受質比例範例，以及所計算出之重組與天然BoNT/F蛋白的比活性(每小時，每pmol的BoNT中有多少nmol之受質轉化成產物)。

第10圖嵌合rBoNT/F_7-1之SCN甘胺酸釋放抑制作用。所培養之原發性脊髓神經元(SCN)，係被暴露於不同濃度之重組(rBoNT/F_7-1)或天然(Met/F/080116/MET)BoNT/F中24小時，然後載入具放射性標記之甘胺酸([³H]-甘胺酸)，並加以去極化(以高鉀緩衝液)來刺激神經傳導質(甘胺酸)的釋放。

第11圖嵌合rBoNT/F_7-1之離體肌肉收縮抑制作用。經分離之膈神經/偏側隔組織配置物，係被設立在組織浴中。該偏側隔肌肉係被附接至一力量傳感器(以測量收縮)，並且該膈神經係在1Hz下進行電刺激(刺激肌肉收縮)。收縮力量係於添加100pM BoNT/F之後，持續測量一段長達100分鐘的時期。相對時間以收縮力量的減低(相較於對照組)以及所需時間，而自添加BoNT開始進行作圖，直到收縮力量降低50%並記錄為t50。

第12圖小鼠足趾外展評分法。小鼠係在短暫的全身麻醉下，於後肢的腓腸肌-比目魚肌之複合肌肉中接受注射；肌肉之弱化程度係運用小鼠足趾外展評分法(DAS)，而以0-4的評分來進行測量。測定每個劑量之DAS最大值，並相對於劑量作圖，並將該數據擬合至4參數對數模式，確認ED 50以及導致DAS 4之劑量值(DAS 4劑量)(參見附表)。

肉毒桿菌毒素(BoNTs)

肉毒桿菌神經毒素(BoNT)係由肉毒桿菌(C.botulinum)以大型蛋白質複合體的形式所產生，其係由BoNT本身與若干輔助蛋白複合所構成。目前有八種不同類型之肉毒桿菌神經毒素，也就是：肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C₁、D、E、F、G和H，其等全都具有類似的結構和作用模式。不同的BoNT血清型，可以藉著血清型與其在胺基酸層級上之百分比序列一致性的關係，而依據特定之中和抗血清的去活作用來進行區分。特定血清型之BoNT蛋白質，係基於胺基酸百分比序列一致性，而被進一步區分為不同亞型。

BoNTs係在胃腸道內吸收，同時在進入全身循環後，會與膽鹼性神經末梢的突觸前膜結合，並且抑制其等之神經傳導物質乙醯膽鹼的釋放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G會切割突觸囊泡膜蛋白/囊泡相關膜蛋白(VAMP)；BoNT/C₁、BoNT/A和BoNT/E會切割25kDa的(SNAP-25)的突觸體相關蛋白；而BoNT/C₁則會切割突觸融合蛋白。

TeNT係為由破傷風梭菌所產生之單一血清型。酪酸梭菌(C.butyricum)係產生BoNT/E，而巴氏梭菌(C.baratii)則會產生BoNT/F。

本發明提供了包含有嵌合BoNT LH_N功能域之多肽，並且也因而包括有嵌合梭菌毒素。「梭菌毒素」這個術語也意欲包含經修飾梭菌毒素，以及其等之衍生物，其包括有但不限於以下所描述者。相較於天然(未經修飾的)形式的梭菌毒素，經修飾的梭菌毒素或是衍生物，可以包含有一或多個經修飾的胺基酸，或者也可以包含一或多個不存在於梭菌毒素的天然(未經修飾的)形式中之插入胺基酸。藉著例示說明的方式，相對於天然(未經修飾)梭菌毒素序列，經修飾的梭菌毒素可以在一或多個功能域中，具有經修飾胺基酸序列。此等修飾作用可以是針對毒素的功能方面之修飾作用，例如生物活性或持久性。因此，在一實施例中，本發明的工程梭菌毒素是一種經工程修飾的梭菌毒素，或者是一經工程修飾的梭菌毒素衍生物，或是一工程梭菌毒素衍生物。

除非有明確地相對說明，在此若引述一特定BoNT血清型，其通常是代表該血清型內的所有亞型。

本案發明人已經分析了胺基酸序列係為已知之BoNT血清型的所有亞型，在BoNT輕鏈和重鏈內之暴露環區域，其也被稱為活化環或是雙鏈環。更詳細地說，發明人已經排齊並註記在UniParc數據庫(其已移除多餘的序列)中，已經過辨識之所有的全長BoNT蛋白之活化環序列。該經過註記與排齊之所有的由BoNT/A至BoNT/F亞型，係被顯示於第1圖中。本案發明人驚訝地發現，該BoNT/F亞型在所有經過排齊的亞型中，係具有最為歧異之活化環。

天然存在的BoNT蛋白係在肉毒桿菌細菌內，以單鏈之前驅蛋白來產生。該單鏈形式係透過在活化環進行切割(在此也稱為蛋白水解)，成為經過轉譯後修飾，而產生完全具活性、成熟的雙鏈BoNT蛋白。本案發明人先前已經在大腸桿菌(Escherichia coli)中，產生係為單鏈前驅蛋白之重組BoNT蛋白，然後在純化的單鏈的BoNT上，進行上述轉譯後蛋白水解步驟。不幸的是，並不是所有的純化重組BoNT蛋白，都呈顯出良好的活化作用，其中良好的活化作用係限定在與天然存在蛋白質相同位置上的專一性蛋白水解作用，而不是在重組的BoNT內的其它位置點上。舉例來說，天然存在的BoNT蛋白-BoNT/F₇亞型，迄今會被所測試的所有蛋白酶，在多個位置上蛋白水解。本案發明人已經藉著建構嵌合蛋白質，來解決這個問題(活化BoNT/F₇亞型)，其中包含有所欲蛋白切割作用位置的區域(其係被稱為活化環)係自F₇亞型移除，並以另一個高度相關之BoNT(其係被稱為BoNT/F₁亞型)的等效區域來將其替換。本案發明人先前已經確認BoNT/F₁亞型，可以確實進行位置專一性活化的條件。因此，藉由以BoNT/F₁的活化環來取代BoNT/F₇的活化環，本案發明人已經證實，可以藉著將一種BoNT亞型的活化環，以源自另一種來自相同血清型的BoNT亞型之活化環來加以取代，而產生具有良好的活化性質的重組BoNT。在不受限於相關理論的前提下，一般相信，由於在不同之BoNT/F亞型的活化環之間的序列歧異性，此種在同一血清型內之活化環的交換現象，係特別與BoNT/F亞型有關。本發明也提供(經活化的)嵌合雙鏈多肽。這些雙鏈多肽本身係為嵌合的，因為其等同時包含有來自於衍生出LH_N主鏈的BoNT/F 亞型之一胺基酸序列，以及來自於衍生出活化環的BoNT/F亞型之一胺基酸序列兩者。因此，所得到的嵌合雙鏈係具有既未見於衍生出LH_N主鏈的BoNT/F亞型，亦未見於衍生出活化環的BoNT/F亞型之獨特胺基酸序列。本發明的嵌合雙鏈多肽通常係藉著將本發明的嵌合單鏈多肽加以切割而產生。

因此，本發明提供一種製備完全活化、經純化的、重組嵌合BoNTs的方法，其包含有具備所欲性能之功能域，即使這些功能域係於不容易表現、純化與活化的蛋白質內演化出來。

因此，本發明提供一種嵌合單鏈多肽，其包含有來自於一第一肉毒桿菌神經毒素血清型F(BoNT/F)的亞型之LH_N主鏈，以及來自於不同BoNT/F亞型的活化環區域。

在本發明內文中，「嵌合多肽」這個術語係指一種包含有來自兩種不同的BoNT/F亞型的兩個構成部分之多肽。特別是，本發明的嵌合單鏈多肽包含有來自一第一BoNT/F亞型之一LH_N主鏈，以及來自不同BoNT/F亞型之一活化環區域。嵌合雙鏈多肽係如在此所描述的，包含有來自一第一BoNT/F亞型的LH_N主鏈之胺基酸序列，以及自一第二BoNT/F亞型的活化環之胺基酸序列。

天然存在的BoNT/F血清型蛋白係被分類為七種亞型(第2圖)。BoNT/F的輕鏈提供了蛋白酶功能(也被稱為非細胞毒性蛋白酶)。特別是，該BoNT/F輕鏈呈現了一種金屬蛋白酶的活性，並且能夠將參與了細胞胞吐作用之囊泡以及/或細胞膜相關蛋白，加以蛋白水解切割。典型地，所有的BoNT/F亞型輕鏈的受質，都是囊泡相關膜蛋白1、2和3(VAMP1、VAMP2，和VAMP3)。BoNT輕鏈或是BoNT/F LH_N主鏈的蛋白酶活性，可以用任何適當的技術來加以確定。用於確定輕鏈或是其的片段或變體之切割活性的標準技術，係為該技術領域中所熟知者，例如小鼠偏側膈分析(HDA)，或者SNARE切割分析(參見，例如，WO95/33850以及Masuyer G,Beard M,Cadd VA,Chaddock JA,Acharya KR；Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B；J Struct Biol.2011 Apr；174(1)：52-7)，這兩份文獻均在此被併入以供參考。

不同的BoNTs係藉著血清學方法確認，來指定為不同血清型，而不是藉著胺基酸序列來界定。事實上，將BoNTs分類為血清型A、B、C、D、E和F，是完全基於並藉著美國疾病管制與預防中心(CDC)，所公布之在一個標準化的小鼠生物分析中，其等對於一組單價抗毒素的的中和作用之敏感度來加以界定[Botulism in the United States,1899-1996,Handbook for epidemiologists,clinicians,and laboratory workers；Centers for Disease Control and Prevention,National Center for Infectious Diseases,Division of Bacterial and Mycotic Diseases,1998，在此其等之整體內容係被併入以供參考]。在這一方面，亦可參見：Dezfulian and Bartlett J.Clin.Microbiol.21(2)：231-233，或是Lindström and Korkeala Clin.Microbiol.Rev.19(2)：298-314,2006，其等揭露了用於界定與區分BoNT血清型的血清學方法，其等都在此被併入以供參考。

因此，在此所引述之BoNT/F係指，以如上所述之一參考抗F血清型的單價抗毒素，來加以中和的BoNT。因此，典型地本發明的LH_N主鏈包含有：(a)一輕鏈多肽序列，其係來自於可以一參考抗F血清型的單價抗毒素所中和的BoNT；以及(b)一H_N多肽序列，其係來自於以一參考抗F血清型的單價抗毒素所中和的BoNT。本發明的嵌合雙鏈多肽，可以如在此所述之一參考抗F血清型的單價抗毒素，來加以中和。在本發明的一實施例中，「BoNT/F」這個術語涵蓋的BoNT/F雜合分子，例如最近才確認之BoNT/H，其係被認為是BoNT/F與BoNT/A之雜合體。

本發明的輕鏈多肽序列及/或該LH_N主鏈的H_N多肽序列，以及/或是本發明之雙鏈多肽，也可以如在此所描述的，以其等與已知BoNT/F亞型的序列一致性來加以定義。

依據本發明，BoNT/F LH_N主鏈可以被界定為一BoNT/F神經毒素區域，其包括有該BoNT/F輕鏈與H_N功能域。在此所使用之LH_N主鏈的術語，也涵蓋包含有BoNT/F輕鏈之功能片段或變體，以及/或是BoNT/F H_N功能域之功能片段或變體的LH_N主鏈。BoNT/F H_N功能域之功能片段或變體，仍會保有全長的BoNT/F H_N功能域之易位活性。BoNT/F輕鏈之功能片段或變體，則仍會保有全長的BoNT/F輕鏈之如在此所界定的切割活性。換句話說，功能性BoNT/F輕鏈片段或變體，可以專一性地標定該神經傳導物質釋放構造的核心部分，並因而會參與執行整體細胞機制，藉此BoNT/F毒素蛋白便會水解切割一受質。在的BoNT/F LH_N主鏈中所包含之該BoNT/F輕鏈的變體，可以具有與BoNT/F輕鏈係為至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、在至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，最多可達100%的序列一致性，只要其仍保有了天然(未經修飾)之輕鏈的切割活性。

該BoNT/F輕鏈的功能性片段，包含有保有了全長輕鏈之活性下，最短之可能的BoNT/F輕鏈片段，也就是如在此所界定之最短的BoNT/F輕鏈序列。同樣地，BoNT/F H_N功能域的功能性片段，包括有保有了全長H_N功能域之活性下，最短之可能的BoNT/F H_N功能域序列，也就是如在此所界定之最短的BoNT/F H_N功能域片段。

本發明的BoNT/F LH_N主鏈，可以在BoNT/F輕鏈序列的胺基酸序列中，具有一或多個修飾作用，舉例來說，在受質結合或催化功能域中之修飾作用，可能會改變或修飾該經修飾輕鏈的受質專一性，並且/或是改變或修飾該經修飾輕鏈之活性，譬如修飾該經修飾輕鏈的活性之效能及/或持續時間。此種經修飾輕鏈可以具有比參考輕鏈更高或更低的活性(效價)，以及/或是更長或更短的持續時間。該參考輕鏈通常係為對應輕鏈之天然(未經修飾)版本。

舉例來說，相較於其他BoNT/F序列，天然存在的BoNT/F亞型(F₅亞型)中之一輕鏈序列內的胺基酸差異，代表BoNT/F₅所切割VAMP2的胜肽鍵中之差異(L54-E55相比於其它BoNT/F亞型(其係於Q58-K59之間進行切割)[Kalb SR,Baudys J,Webb RP,Wright P,Smith TJ,Smith LA,Fernández R,Raphael BH,Maslanka SE,Pirkle JL,Barr JR.；FEBS Lett.2012 Jan 20；586(2)：109-15；Discovery of a novel enzymatic cleavage site for botulinum neurotoxin F₅，其係在此被併入以供參考]。在另一範例中，該輕鏈序列可以被聚乙二醇化，其可以增進經修飾輕鏈的活性之持續時間(參見，例如WO2007/104567，其係在此被併入以供參考)。該輕鏈序列可以含有一降解序列或是被泛素化，其將會減低該經修飾輕鏈的活性之持續時間(參見，例如WO 2011/000929、WO 2013/017522、WO 2013/068476、WO 2014/029497和RV Kukreja等人，Biochim Biophys Acta.(2007)1774(2)：213-22，其等每一個均在此被併入以供參考)。該輕鏈序列可以經過修飾，例如藉著優化受質辨識口袋來增進加效價(參見，例如，Guo等人2013,Toxicon 74：158-166，其係在此被併入以供參考)。

梭菌毒素的輕鏈之長度大約為420-460個胺基酸，並且係包含有酶功能域。典型地，全長的BoNT/F輕鏈之長度係為430個胺基酸(例如對應於SEQ ID NOs：1至16中之任一者的殘基1至430的胺基酸位置，其包括全長BoNT/F的共通序列SEQ ID NO：1)。因此，在此所引述之BoNT/F輕鏈，可以是與包含或者是由對應於SEQ ID NO：1之殘基1至430所組成之胺基酸序列有關，例如SEQ ID Nos：2至16中之任一者胺基酸殘基，較佳地係來自SEQ ID NO：13，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基(如在第4圖或表1中所顯示者)，或是其等之變體。

研究顯示，完整長度之梭菌毒素輕鏈，並不是酶功能域之酶活性的必要條件。因此，包含在LH_N主鏈中之BoNT/F輕鏈的片段，可以包含來自BoNT/F輕鏈的至少100個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個，或更多個連續或不連續胺基酸，只要其仍保有天然(未經修飾)輕鏈的切割活性。典型地，該BoNT/F輕鏈的片段，包含有來自BoNT/F輕鏈的至少350個、至少400個、至少450個或更多個連續胺基酸。本發明的LH_N主鏈之輕鏈部分，可以包括或者是由一最小的BoNT/F輕鏈片段所構成，其本身可以包括或者是由對應於SEQ ID NOs：1至16中之任一者的殘基15至412胺基酸殘基，或是SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13的胺基酸位置，其係對應於該共通序列SEQ ID NO：1之胺基酸殘基15至412(例如，參照表1)，或是其等變體所組成。依據本發明之適當輕鏈片段，係在此於第4和6圖中以粗體顯示。依據本發明的輕鏈片段，可以包含或者是由SEQ ID NOs：33至48中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：45的胺基酸序列(其界定了非冗餘的BoNT/F序列之最小輕鏈片段)，或是其等之變體所組成。

只要該BoNT/F輕鏈的變體，仍保有了該參考BoNT/F輕鏈的切割活性，其可以具有與該參考的BoNT/F輕鏈為至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%的中、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%之的胺基酸序列一致性。典型地，該參考輕鏈功能域或片段是天然(未經修飾的)BoNT/F輕鏈。

「片段」這個術語也與在此所描述之BoNT/F輕鏈變體有關。因此，藉著例示說明的方式，本發明的BoNT/F輕鏈片段可以具有至少350個、至少400個、至少450個或更多個連續胺基酸，其中該BoNT/F輕鏈胺基酸序列係在該參考BoNT/F輕鏈之對應胜肽序列上，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%的中、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%之胺基酸序列一致性。因此，BoNT/F輕鏈片段的變體可以具有與在此所揭露之任何BoNT/F輕鏈片段，係為至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%之胺基酸序列一致性。

在一較佳的實施例中，該BoNT/F輕鏈或輕鏈片段，或是其等之變體，係來自於BoNT/F₇或BoNT/F₅。因此，本發明之BoNT/F輕鏈可以包含或者是由來自於SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者的胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸1至430所組成。舉例來說，本發明的BoNT/F輕鏈可以包含有或者是由來自於SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13的胺基酸殘基1至421，或是SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至428，或是其等之片段或變體所組成。

較佳地，本發明的LH_N主鏈包含有一輕鏈片段，其包含或者是由來自BoNT/F₇或BoNT/F₅之最小輕鏈片段所組成。因此，本發明的BoNT/F輕鏈可以包含或者是由來自SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13的胺基酸序列所組成，其係對應於SEQ ID NO：1的第15至412個胺基酸。舉例來說，本發明的BoNT/F輕鏈可以包括或者是由SEQ ID NOs：13至16中之任一者的胺基酸殘基15至403(較佳地為來自SEQ ID NO：13)或是SEQ ID NO：8的胺基酸殘基15至410，或其等之片段或變體所組成。來自BoNT/F₇或BoNT/F₅中之最小輕鏈片段，可以包含或者是由SEQ ID NOs：40或45至48中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：45的胺基酸序列，或是其等之變體所組成。

本發明的LH_N主鏈係典型地包括有(BoNT/F)輕鏈多肽，其與SEQ ID NOs：33至48，較佳地為SEQ ID NOs：40或45至48，更佳地為SEQ ID NO：45，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、在序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，最高可達100%之胺基酸序列一致性。

有證據顯示，BoNT/F亞型1、2、6和7全部都會在相同的胜肽鍵上切割VAMP2，也就是在人類蛋白質之Q58-K59之間(參見Kalb等人(2011)App.Enviro.Microbiol.77(4)：1301-8，其係在此被併入以供參考)，但是BoNT/F₅則會在L54-E55之間的不同胜肽鍵處進行切割(參見Kalb等人(2012)FEBS Lett.586(2)：109-115，其係在此被併入以供參考)。

本發明的LH_N主鏈可以與包含有或者是由對應於SEQ ID NOs：1至16中之任一者的殘基1至873之胺基酸殘基，或是來自SEQ ID NOs：2至16中的任一者，較佳地為SEQ ID NO：13之胺基酸的位置，其係對應於SEQ ID NO：1之共通序列的胺基酸殘基1至873(例如，見表1)，或是其等之變體所組成之胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，最高可達100%之胺基酸序列一致性，其中在SEQ ID NOs：1至16中之任一者的序列內之活化環序列，係以來自不同的BoNT/F亞型之活化環序列來加以取代(在此揭露了典型的活化環序列)。

本發明的LH_N主鏈可以是一最小LH_N主鏈，其包含如在此所揭露之最小輕鏈與H_N功能域片段。因此，本發明的最小LH_N主鏈可以具有與包含有或者是由對應於SEQ ID NOs：1至16中之任一者的胺基酸殘基15至850，或是來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸位置，其係對應於SEQ ID NO：1之共通序列的胺基酸殘基15至850(如在第4圖中所示)，或是其等之變體所組成之胺基酸序列，係為至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%的中、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%的胺基酸序列一致性，其中在SEQ ID NOs：1至16中之任一者的序列內之該活化環序列，係被來自不同BoNT/F亞型的活化環序列所取代。

舉例來說，本發明的LH_N主鏈可以與SEQ ID Nos 17至32中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：29(其中SEQ ID NO：17係為BoNT/F LH_N功能域共通序列)，具有係為至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%的中、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，(最高可達100%的胺基酸序列一致性)，或是更多的序列一致性。

較佳地，本發明的LH_N主鏈包含有一輕鏈片段，以及來自BoNT/F₇或BoNT/F₅之H_N功能域。因此，本發明的LH_N主鏈可以包含有或者是由SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸1至873，更佳地為胺基酸15至850的胺基酸序列所組成。舉例來說，本發明的BoNT/F LH_N主鏈可以包含有或者是由SEQ ID NOs：13至16中之任一者(較佳地為SEQ ID NO：13)的胺基酸殘基1至862，更佳地為胺基酸殘基15至839，或是SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至868，更佳地為15至845或者是其等之片段或變體所組成，只要在SEQ ID NO：8或13至16中之任一者的序列內之活化環序列，係以在此所揭露之不同BoNT/F亞型的活化環序列來取代。

在一較佳實施例中，本發明的LH_N主鏈具有與SEQ ID NOs：24或29至32中之至少一者，較佳地為SEQ ID NO：29，至少為60%或更高之序列一致性，只要在SEQ ID NOs：1至16中之任一者的序列內之活化環序列，係以來自不同之BoNT/F亞型的活化環序列所取代。

通常，本發明的變體LH_N主鏈係與在此所界定的LH_N主鏈序列，具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，高達100%的胺基酸序列一致性。在一不具限制意涵的範例中，本發明的變體LH_N主鏈可以與SEQ ID NO：24或29至32中之至少一者，較佳地為SEQ ID NO：29，具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%的胺基酸序列一致性。

本發明的LH_N主鏈典型地包含如本文揭示之BoNT/F輕鏈片段及H_N功能域，較佳為如本文揭示之最小BoNT/F輕鏈多肽序列及最小H_N功能域片段。

該梭菌毒素H_N功能域的長度係大約為300-400個胺基酸，並且包括有易位功能域。典型的全長BoNT/F H_N功能域的長度，係大約為350個胺基酸(舉例來說，對應於SEQ ID NOs：1至16中之任一者的殘基520至873之胺基酸位置，其包括有全長BoNT/F共通序列SEQ ID NO：1)。因此，在此所引述之BoNT/F H_N功能域，可以是與包含有或由對應於SEQ ID NO：1之殘基520至873的胺基酸之胺基酸序列，或是其等之變體有關，例如來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者的胺基酸殘基，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基520至873(如在第4圖與表1中示)。

依據本發明，該BoNT/F LH_N主鏈包含有一BoNT/F H_N功能域。如在此所使用的「LH_N主鏈」這個術語涵蓋了LH_N主鏈，其包含功能片段或是BoNT/F H_N功能域變體。功能性片段或的BoNT/F H_N功能域變體，仍保有在此所界定之全長H_N功能域的易位活性。換句話說，功能性BoNT/F H_N功能域片段或變體，能夠在低pH值的條件下，於脂質膜(例如胞內體膜)形成離子可滲透之孔隙，而使得BoNT/F輕鏈脫離胞內體。

因此，包括在LH_N主鏈中之BoNT/F H_N功能域片段，可以包含至少100、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400或更多個，來自BoNT/F H_N功能域的連續或不連續胺基酸，只要其仍保有所引用之H_N功能域的易位活性。該所引用H_N功能域可以是天然(未經修飾)H_N功能域。典型地，該BoNT/F H_N功能域片段係包含有至少300、至少350、至少400或更多個，來自BoNT/F H_N功能域的連續胺基酸。

本發明之LH_N主鏈的H_N功能域部分，可以包括有或者是由一最小BoNT/F H_N功能域片段所組成，其本身可以包括或者是由對應於SEQ ID NOs：1至16中之任一者的殘基520至873之胺基酸殘基，或是來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸位置，其係對應於該共通序列SEQ ID NO：1之胺基酸殘基520至873(舉例來說，參照表1)，或是其等之變體所組成。依據本發明之適當的H_N功能域片段，在此係於第4和6圖以斜體標示。

依據本發明的H_N功能域片段，可以包含或者是由SEQ ID NOs：49至64中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：61(其界定了該最小H_N功能域片段之非冗餘的BoNT/F序列)的胺基酸序列，或是其等之變體所組成。該BoNT/F H_N功能域的變體，可以與所引用的BoNT/F H_N 功能域，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%的中、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%的胺基酸序列一致性，只要其仍保有該所引用BoNT/F H_N功能域的易位活性。典型地，該所引用之H_N功能域之功能域或片段，係為如在此所揭露之天然(未經修飾)的BoNT/F H_N功能域。

「片段」這個術語也與在此所描述的的BoNT/F H_N功能域變體有關。因此，藉著例示說明的方式，本發明的BoNT/F H_N功能域片段可以具有至少300、至少350、至少400或更多個連續胺基酸，其中該BoNT/F H_N功能域胺基酸序列，係在來自所引用之BoNT/F H_N功能域之對應胜肽序列上，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%的中、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%的胺基酸序列一致性。因此，變體BoNT/F H_N功能域片段，可以與在此所揭露之任何BoNT/F H_N功能域片段，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%的胺基酸序列一致性。

在一較佳實施例中，BoNT/F H_N功能域或片段或其等之變體的變體，可以與所引用之BoNT/F H_N功能域，具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，最高可達100%的胺基酸序列一致性，只要其仍保有該所引用BoNT/F H_N功能域的易位活性。典型地，該所引用之H_N功能域之功能域，係為天然(未經修飾)的BoNT/F H_N功能域。

在一較佳實施例中，該BoNT/F H_N功能域或H_N功能域片段，或是其等之變體，係來自於BoNT/F₇或BoNT/F₅。因此，本發明的BoNT/FH_N功能域，可以包含有或者是由SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸序列所組成，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸520至873(例如，參見表1)。舉例來說，本發明的BoNT/F H_N功能域，可以包括或者是由SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸殘基509至862，或是SEQ ID NO：8的胺基酸殘基516至868，或是其等之片段或變體所組成。

較佳地，本發明的LH_N主鏈包含有一H_N功能域片段，其包括有或者是由來自BoNT/F₇或BoNT/F₅的最小H_N功能域片段所組成。因此，本發明的BoNT/F H_N功能域可以包含有或者是由SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸序列所組成，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸538至 850(例如，參見表1)。舉例來說，本發明的BoNT/F H_N功能域，可以包括有或者是由SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸殘基527至839，或是SEQ ID NO：8的胺基酸殘基534至845，或是其等之片段或變體所組成。來自BoNT/F₇或BoNT/F₅的最小H_N功能域片段，可以包含有或者是由SEQ ID Nos：56或61至64中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：61的胺基酸序列，或是其等之變體所組成。

本發明的LH_N主鏈係典型地包括有(BoNT/F)H_N功能域多肽序列，其係與SEQ ID NOs：49至64中之至少一者，較佳地為SEQ ID NOs：56或61至64中之至少一者，更佳地為SEQ ID NO：61，具有至少70%的、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，高達100%的胺基酸序列一致性。在一些實施例中，本發明之H_N功能域(或其等之片段或變體)，也可以另外包括來自帶區域的多肽序列之一或多個胺基酸。舉例來說，本發明之H_N功能域(或其等之片段或變體)，可以另外包括全長帶區域多肽序列，或是其等之片段或變體。BoNT帶區域係位於活化環和H_N功能域的起始處之間的多肽序列；其係因為該重鏈序列區域，在該蛋白質的三維結構中，會以令人聯想起纏繞人類腰部的腰帶的方式，來環繞該BoNT輕鏈亞單元而如此命名。在已知的BoNT/F序列中，該帶區域的位置係被顯示於下列的表1中(所述之胺基酸位置係對應於在該全長BoNT序列中之位置)。因此，在此所引述之本發明的H_N功能域，係指一H_N功能域多肽序列，其係包括或未包括來自帶區域多肽之一或多個胺基酸。

在一些實施例中，本發明係與一種BoNT/F多肽序列有關，其包含有來自BoNT/F亞型，較佳地為BoNT/F₇或的BoNT/F₅中之一輕鏈(或是如在此所界定之其等片段或變體)、一H_N功能域(或是如在此所界定之其等片段或變體)、以及一帶區域多肽(或是其之片段或其變體)，以及來自不同BoNT/F亞型，例如的BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄、或BoNT/F₆的一活化環。該BoNT/F輕鏈片段以及/或是H_N功能域片段，可以是如在此所揭露之最小片段，或是其等變體。或者，除了來自天然BoNT/F中的活化環，已經以來自不同的BoNT/F亞型，例如BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄、或BoNT/F₆的活化環來加以替換之外，本發明之嵌合BoNT/F可以由來自一BoNT/F亞型，較佳地為BoNT/F₇或BoNT/F₅之天然全長BoNT/F多肽(其包括輕鏈、H_N功能域與帶區域)中衍生，或者是基本上與其相同。

典型地，本發明的LH_N主鏈包含有：(a)一(BoNT/F)多肽序列，其與包含有或是由對應於SEQ ID NO：1之殘基1至430的胺基酸序列(例如來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13之胺基酸殘基所組成，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至430)；以及/或是SEQ ID NOs：1至16中之任一者的殘基15至412之胺基酸殘基所組成之胺基酸序列，或者是包含有或是由SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸位置組成之胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基15至412；以及/或是包含有或是由SEQ ID NOs：33至48中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：45所組成的胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的或更多，最高達100%之胺基酸序列一致性；以及(b)一(BoNT/F)的多肽序列，其係與包含有或由對應於SEQ ID NO：1之殘基520至873的胺基酸所組成之胺基酸序列(例如來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13之胺基酸殘基所組成之胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基520至873)；以及/或是包含有或是由SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸位置所組成之胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基520至873；以及/或是包含有或是由SEQ ID NOs：49至64中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：61所組成之胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高達100%的胺基酸序列一致性。

在一較佳實施例中，本發明的LH_N主鏈包含有一BoNT/F₇或BoNT/F₅輕鏈或輕鏈片段，以及一BoNT/F₇或BoNT/₅HN功能域或H_N功能域片段。因此，在一較佳實施例中，本發明的LH_N主鏈包含有：(a)一(BoNT/F)多肽序列，其係與包含有或是由來自於SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13之胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸1至430，例如SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸殘基1至421，或是SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至428所組成之胺基酸序列；以及/或是來自SEQ ID NO：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸15至412，例如SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸殘基15至403，或是SEQ ID NO：8的胺基酸殘基15至410；以及/或是SEQ ID NOs：40或45至48中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：45的胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%中、至少99%或更多，最高達多100%的胺基酸序列一致性；以及(b)與包含有或是由來自SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者的胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸520至873，例如SEQ ID NOs：13到16，較佳地為SEQ ID NO：13的胺基酸殘基509至 862，或SEQ ID NO：8的胺基酸殘基516至868；以及/或是來自SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13之胺基酸序列，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸538至850，例如SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13的胺基酸殘基527至839，或是SEQ ID NO：8之胺基酸殘基534至845；以及/或是SEQ ID NOs：56或61至64中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：61所組成的胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、在至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，最高達100%的胺基酸序列一致性。

本發明的多肽包括有一位置，其係用於被一蛋白水解酶所切割，該切割位係為一活化環，其係來自與該BoNT/F LH_N主鏈不同之肉毒桿菌F型(BoNT/F)亞型。該BoNT/F活化環會使得該單鏈多肽，被切割成雙鏈形式。將其切割成雙鏈形式會典型地將該多肽活化，其對於釋放輕鏈或其之片段或變體，以在細胞之細胞質中執行其之蛋白水解切割活性而言是必要的。

如本文所使用者，「BoNT/F活化環」包含其片段或變體，惟該片段或變體保有被裂解的能力，而產生此多肽之二鏈型式，活化該多肽且其片段或變體之輕鏈解脫以實施其蛋白質水解性裂解活性。此BoNT/F活化環可被任何適當的蛋白酶(Lys-C)裂解。任何給予之蛋白酶裂解此活化環之能力可藉由本項技術領域中已知之任何適當的技術來測定，參見例如，WO 1995/033850、Dekleva et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1989)162(2)：767-72、Giminez,Biochimie.(1990)72(4)：213-7、及Giminez,J.Protein Chem.(1993)12(3)：351-63，其各者藉由參考方式被併入本文。

本發明的多肽之活化環，係典型地包括有一配合該共通序列KSIIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：65)之一胺基酸序列，或是於該共通序列中添加、刪除或取代不超過五個、不超過四個、不超過三個、不超過兩個或不超過一個胺基酸之一胺基酸序列。

該活化環可以包含一胺基酸序列，其係選自於(a)KSVIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：66)；(b)KSIIPRKGTKQSPSL(SEQ ID NO：67)；或是(c)KSIIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：65)，或是於該等序列中添加、刪除或取代不超過五個、不超過四個、不超過三個、不超過兩個或不超過一個胺基酸之胺基酸序列。較佳地，該活化環係包含有該胺基酸序列KSVIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：66)，或是於該序列中添加、刪除或取代不超過五個、不超過四個、不超過三個、不超過兩個或不超過一個胺基酸之一胺基酸序列。

表1(如下面所示)顯示BoNT/F亞型的前驅物-天然雙鏈神經毒素，並指出該輕鏈、暴露環(活化環)、帶區域、H_N功能域以及H_C功能域(包括H_CN和H_CC功能域)。

該參考序列應該被視為可以依據不同亞型，來產生微幅變化之指南。

參照表1，其指示該輕鏈、H_N、H_CN與H_CC功能域之該胺基酸位置(殘基)，對應於在全長BoNT/F蛋白質序列中之該區域的胺基酸位置。在表1中提供不同的BoNT/F亞-血清型的UniParc存取序號。因此，在一實施例中，在表1所指示之該輕鏈、H_N、H_CN與H_CC功能域的胺基酸位置，係對應於以存取序號來區辨之全長BoNT/F蛋白序列中之胺基酸位置。上述在表1中所提供之存取序號，係被用來於[輸入申請之申請日]時，被輸入至UniParc資料庫中，以索引對應之胺基酸序列。

本發明的多肽可以包含有一LH_N主鏈，其包括有來自在表1中所指出的該等BoNT/F亞型中之任一者的輕鏈之序列，或是其等之片段(如在此所揭露的最小輕鏈片段)或變體。BoNTs的功能域結構係為本技術領域中眾所周知的，所以引述任何特定BoNT之輕鏈，或是其等之片段或變體係足夠的。任擇地，BoNT/F輕鏈或其等之片段或變體，可以按照其之序列或按照其胺基酸位置來加以界定，其係對應於在表1中的BoNT/F亞型中之任一者(如在此所描述的)的全長序列中之胺基酸位置。舉例來說，該LH_N主鏈可以包含有UPI0001DE3DAC的BoNT/F₇之輕鏈。此一輕鏈可以進一步按照其之序列(例如UPI0001DE3DAC的最小輕鏈片段，係具有SEQ ID NO：45的胺基酸序列)，或是按照其對應於UPI0001DE3DAC的BoNT/F₇之全長胺基酸序列中之胺基酸位置(例如對應於UPI0001DE3DAC(全長UPI0001DE3DAC係具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列)的胺基酸位置1至421(相對於全長輕鏈序列)，或是胺基酸位置15至403(相對於最小輕鏈序列))的胺基酸來進行界定。此等定義方式(按照序列以及/或是胺基酸位置)，係同樣適用於任何其他的BoNT/F LH_N主鏈或輕鏈，包括那些表列於表1中者。

本發明的LH_N主鏈可以包含有在表1中所指出的BoNT/F亞型中之任一者的H_N功能域，或是其等之片段(如在此所揭露的最小H_N功能域片段)或是其等之變體。該BoNTs功能域結構係為在本技術領域中眾所周知的，所以引述任何特定BoNT之HN功能域，或是其等之片段或變體係足夠的。任擇地，BoNT/F功能域或其等之片段或變體，可以按照其之序列或按照其胺基酸位置來加以界定，其係對應於在表1中的BoNT/F亞型中之任一者(如在此所描述的)的全長序列中之胺基酸位置。舉例來說，該LH_N主鏈可以包含UPI0001DE3DAC的BoNT/F₇之H_N功能域。此一H_N功能域可以進一步依照其之序列(例如UPI0001DE3DAC之具有SEQ ID NO：61的胺基酸序列的最小H_N功能域片段)，或是依照其對應於UPI0001DE3DAC的BoNT/F₇之全長胺基酸序列中之胺基酸位置(例如對應於UPI0001DE3DAC(全長UPI0001DE3DAC係具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列)的胺基酸位置509至862(相對於全長輕鏈序列)，或是胺基酸位置527至839(相對於最小輕鏈序列))的胺基酸來進行界定。此等定義方式(按照序列以及/或是胺基酸位置)，同樣適用於任何其他的BoNT/F LH_N主鏈或輕鏈，包括那些表列於表1中者。

本發明的多肽可以包含有在表1中所指出的BoNT/F亞型中之任一者的活化環，或是其等之片段或變體。該BoNTs功能域結構係為在本技術領域中眾所周知的，所以引述任何特定BoNT之H_N功能域，或是其等之片段或變體是足夠的。任擇地，BoNT/F活化環或其等之片段或變體，可以按照其之序列或按照其胺基酸位置來加以界定，其係對應於在表1中的BoNT/F亞型中之任一者(如在此所描述的)的全長序列中之胺基酸位置。舉例來說，該多肽可以包含UPI00000B66D1的BoNT/F₁之活化環。此一活化環可以進一步依照其之序列(SEQ ID NO：66)，或是依照其對應於UPI00000B66D1的BoNT/F₁之全長胺基酸序列中之胺基酸位置(對應於UPI00000B66D1之胺基酸位置430至444之胺基酸)的胺基酸來進行界定。此等定義方式(按照序列以及/或是胺基酸位置)，同樣適用於任何其他的BoNT/F活化環，包括那些表列於表1中者。

依據本發明，該多肽包含有一活化環，其係來自於與BoNT/F LH_N主鏈不同之BoNT/F亞型。

因此，本發明的多肽可以包含來自BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄、BoNT/F₅、BoNT/F₆、或BoNT/F₇中之任一者的BoNT/F LH_N主鏈。典型地該BoNT/F LH_N主鏈，是來自於BoNT/F₅或BoNT/F₇亞型。在一較佳實施例中，該BoNT/F LH_N主鏈是來自於一BoNT/F₇亞型。

本發明的多肽可以包括有來自於BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄、BoNT/F₅、BoNT/F₆、或BoNT/F₇中之任一者的BoNT/F活化環，只要該活化環係來自於與該BoNT/F LH_N主鏈不同的BoNT/F亞型。典型地，該BoNT/F活化環係來自於BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄、或BoNT/F₆中之任一者。在一較佳實施例中，BoNT/F活化環係來自於BoNT/F₁或BoNT/F₆。

本發明的多肽係典型地包括來自於BoNT/F₅或BoNT/F₇亞型之BoNT/F LH_N主鏈，以及來自 BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄或BoNT/F₆亞型之BoNT/F活化環。在一較佳實施例中，本發明的多肽係典型地包括來自BoNT/F₅或BoNT/F₇亞型之BoNT/F LH_N主鏈，以及來自BoNT/F₁或的BoNT/F₆亞型的BoNT/F活化環。

本發明所也涵蓋其中輕鏈(或其之片段或變體)與H_N功能域(或其之片段或變體)，係衍生自不同BoNT/F亞型之嵌合LH_N主鏈。舉例來說，依據本發明之嵌合LH_N主鏈，可以包括有來自BoNT/F₇亞型之輕鏈(或其之片段或變體)，以及來自BoNT/F₅亞型的H_N功能域(或其之片段或變體)，或是反之亦然。當本發明的多肽包含有此種嵌合LH_N主鏈時，典型地該活化環是衍生自與輕鏈(或其之片段或變體)或H_N功能域(或其之片段或變體)不同之BoNT/F亞型。如在此所描述的，較佳地，該BoNT/F活化環係來自BoNT/F₁或BoNT/F₆亞型。因此，本發明的嵌合單鏈多肽可以包含來自第一BoNT/F亞型(例如BoNT/F₇)的輕鏈(或其之片段或變體)、來自第二BoNT/F亞型(例如BoNT/F₁)的活化環、以及來自第三BoNT/F亞型(例如BoNT/F₅)之H_N功能域(或其之片段或變體)。

本發明的多肽，特別是其之輕鏈部分可以被聚乙二醇化，這將有助於增加安定性，例如蛋白酶部分之作用持續時間。聚乙二醇化係較佳地包括將PEG添加至蛋白酶部分的N-端上。藉著例示說明的方式，輕鏈的N-端可以用一或多個胺基酸(例如半胱胺酸)殘基來延展，其可以是相同或不同的。該等胺基酸殘基之一或多者，可以具有連接(例如，共價連接)於其上之其等自己的PEG分子。此種技術的範例係被描述於WO2007/104567中，其係在此被併入以供參考。

本發明的多肽可以包含有增加或降低該多肽的生物活性，以及/或是生物持續性的一或多種修飾作用。舉例如來說，多肽可以包括有白胺酸型或酪胺酸型模體，其中該模體會增加或降低該多肽的生物活性以及/或是生物持續性。適當白胺酸型模體包括有xDxxxLL，xExxxLL，xExxxIL和xExxxLM(其中x係為任何胺基酸)。適當的酪胺酸型模體則包括有Y-x-x-Hy(其中Hy係為疏水性胺基酸)。包含有白胺酸型與酪胺酸型模體之經修飾梭菌毒素的範例，係被描述於WO 2002/08268中，其之整體內容係在此被併入以供參考。

本發明的多肽可以包含有一或多種陽離子修飾作用。此類多肽具有可以在給藥位置增進組織駐留的性質，並因此呈現較少之自該給藥部位置擴散的現象。此種陽離子梭菌毒素的範例，係被描述於PCT/GB2014/052097中，其之整體內容係在此被併入以供參考。

如在此所描述的，本發明的多肽之各種元件(LH_N主鏈、活化環以及/或是標定模體)，都可以被加以修飾，其中每個元件都可以獨立地包含至少一種選自於：胺基酸取代、胺基酸插入、以及胺基酸刪除之胺基酸修飾作用。

在胺基酸取代作用中，形成部分的梭菌毒素胺基酸序列之胺基酸殘基，係以不同的胺基酸殘基來進行取代。用來取代的胺基酸殘基，可以是在下表中之20種標準胺基酸中之一者。

以下胺基酸係被視為帶電荷之胺基酸：天門冬胺酸(負電)、麩胺酸(負電)、精胺酸(正電)和離胺酸(正電)。

以下胺基酸係被認為是不帶電荷、具極性(這意味著它們可以參與形成氫鍵)之胺基酸：天冬醯胺、穀胺醯胺、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、色胺酸。

以下胺基酸係被認為是不帶電、疏水性的胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸和甘胺酸。

任擇地，在胺基酸取代作用中用於進行取代的胺基酸，可以是一非標準胺基酸(一種不屬於上述標準組之20種的一部分之胺基酸)。藉著例示說明的方式，該用於進行取代的胺基酸可以是鹼性非標準胺基酸，例如L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸、或是離胺酸、精胺酸和鳥胺酸的D-異構物)。用於將非標準胺基酸引入蛋白質的方法，係為本技術領域中已知的，其包括運用E.coli營養缺陷型表現宿主之重組蛋白合成技術。

在胺基酸插入作用中，額外的胺基酸殘基(一般並不存在者)係被併入至該多肽胺基酸序列內，因而增加了在該序列中之胺基酸殘基總數。在胺基酸刪除作用中，胺基酸殘基係自該多肽的胺基酸序列中刪移除，從而減少了在該序列中之胺基酸殘基總數。

用於藉著胺基酸殘基的取代、插入或刪除作用，來修飾蛋白質的方法，係為本技術領域中已知的。藉著例示說明的方式，胺基酸修飾作用可以藉著修飾編碼有該多肽之DNA序列而導入。其可以運用標準的分子選殖技術來達成，例如藉著定點誘變技術來達成，其中編碼有所需胺基之短股DNA(寡核苷酸)，係運用聚合酶而被用來取代原始編碼序列，或者是藉著以各種酶(例如，連接酶與限制性內切酶)來插入/刪除一部分之基因。任擇地也可以化學地合成經修飾之基因序列。

該至少一種胺基酸修飾作用，可以選自於：以鹼性胺基酸殘基，來取代酸性胺基酸殘基；以不帶電荷的胺基酸殘基，來取代酸性胺基酸殘基；以鹼性胺基酸殘基，來取代不帶電荷胺基酸殘基；插入鹼性胺基酸殘基；以及刪除酸性胺基酸殘基。

在一較佳的實施例中，該至少一胺基酸修飾作用係為取代作用，其係有利地將該多肽中之胺基酸殘基，維持在相同數目下。

本發明的多肽可以包含超過一個的胺基酸修飾作用。因此，在一實施例中，該多肽(如上所述)包括有介於1和80個之間的胺基酸修飾作用(例如，介於1和70個之間、介於1和60個之間、介於1和50個之間、介於1和40個之間、介於1和30個之間、介於1和20個之間、介於1和10、或9、8、7、6、5、4、3或2個之間的胺基酸修飾作用)。

修飾作用的較佳之目標胺基酸可能會具備一定的特質。藉著例示說明的方式，較佳之目標胺基酸可以是：(i)一暴露於表面的胺基酸；(ii)位於該多肽二級結構的外部；(iii)位在對於該蛋白質功能而言，並不是必要之多肽區域；(iv)在不同梭菌毒素類型、亞型或血清型之間，並不保有一致性之胺基酸；(iv)其之修飾不會產生所預期之泛素化位置的胺基酸；或是(v)上述條件之任何組合。

本發明的多肽可以不具備天然存在之梭菌毒素複合物中，所出現之複合蛋白質。

本發明的多肽還可以包含有限數量之非標準胺基酸。因此，除了20種標準胺基酸，非標準胺基酸(例如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺異丁酸、異纈胺酸以及α甲基絲胺酸)，可以取代本發明的多肽之胺基酸殘基。有限數量之非保留性胺基酸(未以遺傳密碼進行編碼之胺基酸)，以及非天然胺基酸，可以用來取代梭菌多肽胺基酸殘基。本發明的多肽還可以包括有非天然存在的胺基酸殘基。非天然存在的胺基酸包括有，但不侷限於，反式-3-甲基脯胺酸、2,4-亞甲基-脯胺酸、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基同半胱胺酸、硝基-穀胺醯胺、同穀胺醯胺、2-哌啶甲酸、三級-白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯基丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸、以及4-氟苯丙胺酸。在本技術領域已知數種用於將非天然存在的胺基酸殘基，結合至蛋白質中的方法。舉例來說，可以運用一種試管內系統，其中無意義突變係藉著使用化學胺醯化壓制型tRNA來加以抑制。用於合成胺基酸與胺醯化tRNA的方法，是本技術領域中所已知。含有無意義突變的質體之轉錄和轉譯作用，是在包含有E.coli S30萃取物，以及商業上可取得之酶與其他試劑的無細胞系統中進行。蛋白質係經過層析純化。參見，例如Robertson等人的J.Am.Chem.Soc.113：2722,1991；Ellman等人的Methods Enzymol.202：301,1991；Chung等人的Science 259：806-9,1993；以及Chung等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10145-9,1993)。在第二種方法中，轉譯作用係藉著顯微注射突變mRNA與化學胺醯化壓制型tRNA，而在爪蟾卵母細胞中進行(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271：19991-8,1996)。在第三種方法中，E.coli細胞係在缺乏欲進行替換之天然胺基酸(例如，苯丙胺酸)，並在所欲非天然存在胺基酸(例如，2-氮雜苯基丙胺酸、3-氮雜苯基丙胺酸、4-氮雜苯基丙胺酸、以及4-氟苯丙胺酸)存在的情況下進行培養。該非天然存在胺基酸，將會於其之天然對應物的位置處，被結合至該多肽內。參見Koide等人的Biochem.33：7470-6,1994。

本發明的多肽可以用重組核酸技術來產生。因此，在一實施例中，多肽(如上所述)係為重組多肽。

將BoNTs切割為活化雙鏈形式

梭菌屬細菌會以每個具有1251至1315個胺基酸之單鏈多肽，來釋放該神經毒素。然後天然存在的蛋白酶會在限定的位置上，將這些蛋白質各自切割('切痕')成2個鏈，然而這兩條鏈係藉著雙硫鍵來互相橋接。這些雙鏈(雙重鏈)蛋白質係被稱為全毒素(參見Shone等人的(1985),Eur J Biochem 151,75-82)。該等兩種鏈係如在此所描述的具有不同的功能。依據本發明，Lys-C係被用於將該單鏈多肽切割成雙鏈的形式。該切割作用可以透過任何適當的技術來確認，其之範例係為本技術領域中所已知。參見，例如WO 1995/033850，其係在此被併入以供參考。舉例來說，SDS-PAGE凝膠、全蛋白質染色、在還原與非還原條件下操作，可以用來確認本發明的多肽之單鏈以及/或是雙鏈形式的存在。

標定模體

本發明的多肽可以包含有一標定模體(TM)，其係適合藉著將該TM直接與目標細胞結合，或是藉著將該TM與和目標細胞結合之配體進行結合，而將該多肽與細胞結合。典型地，直接與細胞結合之TM係藉著與該細胞表面上的結合位置功能性地相互作用來進行，以在本發明之多肽與目標細胞的表面之間，產生物理連結。

隨後，該易位部分(H_N功能域或其之片段或變體)會使得蛋白酶部分(輕鏈或其之片段或變體)，被輸送進入目標細胞的細胞質內。最後，一旦進入內部，該輕鏈會藉著切割存在於目標細胞之細胞質中的SNARE蛋白，而抑制目標細胞之胞吐融合過程。因此，藉著將目標細胞的胞吐融合構造去活化，本發明的多肽會抑制目標細胞的分泌作用(舉例來說，抑制神經傳導物質的分泌，例如來自目標膽鹼性運動神經元之乙醯膽鹼)。

標定模體(TM)係指會與結合位置功能性地相互作用，以使得本發明之多肽與目標細胞的表面之間產生物理連結之任何化學結構。TM這個術語涵蓋任何分子(也就是，天然存在的分子，或是其等之化學/物理修飾變體)，其能夠與目標細胞上之結合位置結合，該結合位置能夠進行內化作用(例如形成胞內體)-也被稱為受體引導的細胞內吞作用。該TM可以具有胞內體膜易位功能，在這種情況下，在本發明藥劑中並不需要存在獨立的TM和H_N功能域部分。任何適當的TM都可以與本發明的多肽一起使用。

在一較佳的實施例中，TM是選自於BoNT的TM，也就是包括有或是由一BoNT H_CC功能域所組成的TM。如在此所使用的，BoNT H_CC功能域這個術語，涵蓋了BoNT H_CC功能域的功能性片段與變體，也就是仍保有全長H_CC功能域之標定活性的H_CC功能域片段與變體。任擇地，該TM可以包括有或是由來自非肉毒桿菌毒素的H_CC功能域所組成。所有在此與BoNT H_CC功能域或H_C功能域TMs有關之揭露內容，也同樣適用於非肉毒桿菌H_CC功能域或H_C功能域TMs，其包括TeNT H_CC功能域或H_C功能域TMs。

由於BoNT H_CC功能域係被包含於較大的BoNT H_C功能域內，本發明之多肽的TM可以包括有或是由BoNT H_C功能域所組成。在此所有關於BoNT H_CC功能域的所有相關說明，因此同樣都適用於較大的BoNT H_C功能域。

本發明之多肽的TM可以包括有或是由來自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C₁、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G中之任一者的H_CC功能域或H_C功能域。不同BoNT血清型和亞型(亞-血清型)之該等H_CC和H_C功能域，係為本技術領域中所已知者。參見，例如，表1中在此被併入以供參考的WO 2006/027207或WO 2006/099590。

梭菌毒素的H_CC功能域參考序列之範例包括有：

BoNT/A-胺基酸殘基1092至1296，例如R1092至L1296

BoNT/B-胺基酸殘基1079至1291，例如S1079至E1291

BoNT/C₁-胺基酸殘基1093至1291，例如Q1093至E1291

BoNT/D-胺基酸殘基1080至1276，例如I1080至E1276

BoNT/E-胺基酸殘基1067至1252，例如P1067-K1252

BoNT/F-胺基酸殘基1087至1274，例如P1087-E1274

BoNT/G-胺基酸殘基1087至1297，例如S1087-E1297

TeNT-胺基酸殘基1109至1315，例如L1109-D1315

上述序列位置可能會隨著血清型/亞型的不同而略有改變。

梭菌毒素H_C功能域的參考序列之範例包括有：

BoNT/A-胺基酸殘基872-1296，例如N872-L1296

BoNT/B-胺基酸殘基859-1291，例如E859-E1291

BoNT/C₁-胺基酸殘基867-1291，例如N867-E1291

BoNT/D-胺基酸殘基863-1276，例如S863-E1276

BoNT/E-胺基酸殘基846-1252，例如R846-K1252

BoNT/F-胺基酸殘基865-1274，例如K865-E1274

BoNT/G-胺基酸殘基864-1297，例如N864-E1297

TeNT-胺基酸殘基880-1315，例如I880-D1315

上述序列位置可能會隨著血清型/亞型的不同而略有改變。

在一實施例中，本發明的多肽包括有一TM，其係包括有或是由來自BoNT/F亞型之H_CC功能域或H_C功能域所組成。該BoNT/F的H_CC功能域或H_C功能域，可以來自於BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄、BoNT/F₅、BoNT/F₆或BoNT/F₇。舉例來說，該H_CC功能域或H_C功能域，可以來自於BoNT/F₅或BoNT/F₇。

H_CC功能域或H_C功能域，可以衍生自與本發明的多肽之該BoNT/F LH_N主鏈相同的BoNT/F亞型。舉例來說，如果BoNT/F LH_N主鏈是來自一BoNT/F₇亞型，該TM就可以是BoNT/F₇ H_CC功能域或H_C功能域。因此，在一實施例中，除了該活化環已經以來自不同的BoNT/F亞型的活化環來加以取代之外，本發明的多肽係與天然存在的BoNT/F的單鏈相同(且因此，為了避免造成疑惑，本發明的多肽並不是天然存在的BoNT)。

本發明的BoNT/F Hcc功能域或H_C功能域TM，可以是如表1中所指出之BoNT/F的H_CC功能域或H_C功能域。舉例來說，如上述所指出的，在一較佳實施例中，H_CC功能域或H_C功能域是來自BoNT/F₇。在這種情況下，H_CC功能域或H_C功能域，可以包括有或是由BoNT/F₇亞型的H_CC功能域或H_C功能域所組成，例如UPI0001DE3DAC的BoNT/F₇或是其之片段或變體。如在此所描述的，其係足以引述例如UPI0001DE3DAC之BoNT/F₇的H_CC功能域或H_C功能域，或其等之片段或變體。任擇地，BoNT/F₇(例如UPI0001DE3DAC)之H_CC功能域或H_C功能域、或是其等之片段或變體，可以依照其之序列，或是依照其對應於BoNT/F₇之全長胺基酸序列中之胺基酸位置(如上所述)的胺基酸來進行界定。藉著運用UPI0001DE3DAC之非限制性範例子，全長H_CC功能域可以代表對應於UPI0001DE3DAC(全長UPI0001DE3DAC係具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列)的胺基酸位置到1077至1268(全長H_CC功能域)，或是胺基酸位置1095至1260(最小H_CC功能域)之胺基酸。此等定義方式(按照序列以及/或是胺基酸位置)，同樣適用於任何其他的BoNT/F H_CC功能域或H_C功能域，包括那些表列於表1中者。

因此，在一較佳的實施例中，除了BoNT/F₅或BoNT/F₇活化環序列，已經被BoNT/F₅或BoNT/F₇以外的BoNT/F亞型活化環序列所取代之外，本發明的多肽包含有衍生自全長BoNT/F₅或BoNT/F₇胺基酸序列之胺基酸序列。在一特別較佳實施例中，該BoNT/F₅或BoNT/F₇活化環區域，係以BoNT/F₁的活化環區域所取代。舉例來說，本發明的多肽可以包括有或是由SEQ ID NO：75的胺基酸序列，或是其之變體(如在此所界定者)所組成。

本發明的TM可以是經修飾的梭菌H_CC或H_C功能域，參見例如WO 2006/027207、WO 2006/114308以及WO 2013/180799，其等之整體內容係在此被併入以供參考。

如在此所使用的，「結合」這個術語可以代表一個分子(在此範例中為H_CC或H_C功能域)，係透過至少一分子間或分子內的作用力，而直接或間接地與另一個分子接觸，其包括但不限於，共價鍵、離子鍵、金屬鍵、氫鍵、疏水性作用、凡得瓦作用、以及類似作用例、或是其等之任意組合。因此，「結合親和力」係指一分子(在此範例中為H_CC或H_C功能域)對於特定受體之結合強度。

或者，本發明的多肽可以是重新進行標定之梭菌毒素，也就是，該多肽可以包括有如在此所揭露的BoNT/F LH_N主鏈以及BoNT/F活化環，但是其可以包括有一非梭菌TM。

非梭菌TM的範例係被描述於，例如EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；WO 2005/023309；WO 2006/059113；WO 2006/059105；WO 2007/138339；WO 2009/150469；WO 2010/055358；WO 2009/150470；WO 2010/020811；WO 2010/094905；WO 2014/128497和WO1999/58571；所有這些文獻的整體內容均在此被併入以供參考。在此所提及的TSI以及/或是非梭菌TM，包括有例如那些在WO 2011/018665中所描述之結構等效物，其係在此被併入以供參考。

本發明的多核苷酸

本發明還提供了編碼了本發明之多肽的多核苷酸。多核苷酸這個術語包括有DNA和RNA序列兩者，儘管典型的多核苷酸係包含DNA序列。

本發明進一步提供了包含本發明之多核苷酸的表現載體。典型地在表現載體中，本發明的多核苷酸係可操作地連接至適當的啟動子。該多核苷酸也可以被連接至適當的終止子序列。適當的啟動子和終止子序列，係為本技術領域中所已知的。

在這種情況下，啟動子的選擇取決於用於進行表現的表現系統。在一般情況下，組成型啟動子係為較佳的，但同樣也可以使用誘導型啟動子。以這種方式產生的構建體，包括有載體中的至少一部分，特別是調節單元件，該載體可以選自於例如A-衍生物、腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、SV40-病毒和反轉錄病毒。該載體係較佳地能夠表現在給定宿主細胞中之核酸。

該表現載體可以具有一啟動子，其係選自於：

在另一較佳的實施例中，載體係具有選自以下的啟動子：

本發明的核酸分子可以使用本技術領域中已知的任何適當的方法來進行製備。因此，核酸分子可以使用化學合成技術來加以製備。或者，本發明的核酸分子也可以使用分子生物學技術來加以製備。

本發明的表現載體係較佳地在電腦上設計，然後以傳統的多核苷酸合成技術來進行合成。

多核苷酸序列資訊係依據所欲使用之最終宿主細胞(例如E.coli)表現系統，而針對密碼子偏好性(codon-biasing)來選擇性地進行修飾。

多核苷酸主鏈係較佳地針對任何固有核酸序列來進行篩選，其在被轉錄和轉譯時，將會產生對應於由該輕鏈編碼序列，所編碼之蛋白酶切割位的胺基酸序列。此一篩選過程可以手動地或是在電腦軟體(例如DNASTAR，Inc.的MapDraw程式)的協助下進行。

本發明也提供了由上述多核苷酸序列所編碼之多肽。

在兩個或更多個核酸或胺基酸序列之間的「百分比序列一致性」，係為這些序列所共有之相同位置的數量之函數。因此，%一致性可以用相同核苷酸/胺基酸的數量，除以核苷酸/胺基酸的總數，再乘以100而加以計算。%序列一致性的計算，也可以把為了將兩個或更多個序列優化排齊，而需要導入之間隙的數量以及各個間隙的長度納入考量。兩個或更多個序列之間的序列比對與百分比一致性的認定，可以使用習於此藝者所熟悉之特定數學演算法來進行，例如BLAST。

生產方法

本發明還提供了生產本發明的多肽的方法，該方法包括有在細胞中表現本發明的多核苷酸，並回收所表現之多肽的步驟。該方法典型地進一步包括將本發明的多肽引入細胞的步驟。舉例來說，本發明的多核苷酸可以如在此所描述的，以表現載體的形式引入至細胞中。

例如，該用於生產本發明的多肽的方法可以在包含表現多核苷酸在適當的宿主細胞(如上述)，裂解宿主細胞以提供含有該多肽的宿主細胞勻漿，並分離多肽。

提供/引入至細胞中的多核苷酸，可以是DNA、RNA或是其等之混合物。該多核苷酸可以被進一步針對於其之抗核酸酶性來加以修飾，譬如例如透過插入硫代磷酸酯鍵。該核酸可以由起始核酸來製備，後者是可以例如藉著由基因組或cDNA數據庫進行選殖而取得。此外，該核酸可以直接地透過固相合成方法來製備。適當的方法係為習於此藝者所已知的。如果人們採用例如藉由特定局部誘變而進行之特定修飾作用的起始核酸，就可以在胺基酸層級上造成至少一加成、插入、刪除及/或是取代作用。該核酸然後係如在此所描述的，可操作地連接至適當的啟動子。

典型地，來自細胞之本發明的多肽，係在從細胞回收後加以純化以及/或是濃縮。任何適當的方法都可以用來回收、純化以及/或是濃縮本發明的多肽。用於回收、純化以及/或是濃縮之標準技術，係為本技術領域中所已知的，例如層析法以及/或是電泳法。

本發明的多肽可以包含有一或多個位於N-端以及/或是C-端之純化標籤，以協助該多肽之純化作用。雖然任何純化標籤都可以被使用的，但以下係為較佳的標籤：His-標籤(例如6×組胺酸)(SEQ ID NO：126)，較佳地係作為C-端以及/或是N-端標籤；MBP-標籤(麥芽糖結合蛋白)，較佳地係作為N-端標籤；GST標籤(穀胱甘肽-S-轉移酶)，較佳地係作為N-端標籤；His-MBP-標籤，較佳地係作為N-端標籤；GST-MBP-標籤，較佳地係作為N-端標籤；硫醇氧化還原蛋白-標籤，較佳地係作為N-端標籤；以及/或是CBD-標籤(幾丁質結合功能域)，較佳地係作為N-端標籤。

在該多肽中可以包括一或多個胜肽間隔序列/接頭序列分子。例如，胜肽間隔物可以被用於純化標籤與多肽分子的其餘部分之間。

活化方法

本發明的多肽係以單鏈形式來製備(參見，例如，WO98/07864)，並且典型地需要一蛋白水解活化步驟以取得完全之活性。因此，本發明提供一種藉著將該多肽由單鏈形式轉換為多肽的雙鏈形式，以活化本發明的多肽之方法。此一技術是以活體內細菌機制為基礎，天然梭菌神經毒素(也就是，全毒素)係透過其而產生，並得到具有以下「簡化」結構架構之多肽：NH2-[輕鏈]-[切割位]-[H_N功能域]-COOH

因此，典型地該多肽係藉著以蛋白酶進行處理來活化，其會在輕鏈與LH_N主鏈的H_N功能域之間的切割位(活化環)進行切割。因此其將會產生一雙鏈蛋白，其包含有係為單多肽鏈之輕鏈，其係共價連接(透過一雙硫鍵)至含有H_N功能域之另一單多肽鏈的。

本發明之多肽的其他結構，係被描述在例如WO 2006/059113、WO 06/059093、WO 98/07864和WO 2012/156743中，其等每一個均全部在此被併入以供參考。

因此，本發明提供一種活化本發明的多肽之方法，其包含有將該多肽與BoNT/F活化環蛋白酶一起培養，其中在BoNT/F切割位切割該多肽，會將該多肽從一單鏈多肽轉變一雙鏈多肽。典型地，此一從單鏈多肽轉變為雙鏈多肽此的轉變，會使得該多肽活化。

該BoNT/F切割位(活化環)可以由任何適當的酶來進行切割(例如Lys-C)。可以商業上取得，並且可以從產酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)中分離之Lys-C係為較佳的。

經活化雙鏈多肽

如在此所描述的，經活化的BoNT係為雙鏈多肽，其係藉著在活化環內的酶切割作用而產生。本案發明人已經針對在此所描述之嵌合BoNT/F_7-1的活化雙鏈形式，進行N-端定序(參見實施例)，並且已經發現包含有H_N功能域的胺基酸鏈，係具有未見於野生型(未經修飾)的BoNT/F₁或是BoNT/F₇亞型中，獨特之N-端胺基酸序列。

特別地，發明人已經發現包含H_N功能域的胺基酸鏈，係包含有該N-端胺基酸序列APPR(SEQ ID NO：127)，更具體地為APPRLCIKV(SEQ ID NO：74)。因此，該嵌合BoNT/F_7-1的經活化雙鏈形式，包含有一包含該H_N功能域之胺基酸鏈，其係另外包括一些來自BoNT/F₁活化環之胺基酸，以及來自BoNT/F₇的H_N功能域之胺基酸(見第8圖)。

因此，本發明提供了一種嵌合雙鏈BoNT/F多肽，其包括有：(a)如在此所揭露的一輕鏈多肽序列，以及(b)如在此所揭露的一H_N多肽序列；其中H_N多肽的N-端包括有與該H_N多肽的其餘部分，來自不同的BoNT/F亞型之胺基酸殘基。典型地，H_N多肽的N-端胺基酸殘基係為A或Q。舉例來說，H_N多肽的N-端可以由選自於APPR(SEQ ID NO：127)或QSPS(SEQ ID NO：128)的胺基酸模體開始。在一較佳實施例中，H_N多肽的N-端係由選自於APPRLCIK(SEQ ID NO：70)，APPRLCIT(SEQ ID NO：71)、QSPSLCIK(SEQ ID NO：72)、以及QSPSLCIT(SEQ ID NO：73)的胺基酸模體開始。

在一較佳實施例中，本發明提供了一種嵌合雙鏈BoNT/F多肽，其包括有：(a)一(BoNT/F)輕鏈多肽序列，其具有與包含有或是由對應於SEQ ID NO：1的殘基1至430(例如來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸殘基，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至430)之胺基酸：以及/或是對應於SEQ ID NOs：1至16中之任一者的殘基15至412之胺基酸殘基所組成的胺基酸序列，或是包含有或是由來自SEQ ID NO：2到16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13之胺基酸位置，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基15至412的胺基酸位置所組成的胺基酸序列；以及/或是包含有或由SEQ ID NO：33至48中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：45所組成的胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多，最高達100%之胺基酸序列一致性；以及(b)一(BoNT/F)H_N功能域多肽序列，其係與包含有或是由對應於SEQ ID NOs：1中之任一者的殘基520至873之胺基酸(例如來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13之胺基酸殘基，其係對應於SEQ ID NO：1之殘基520至873)所組成之胺基酸序列，以及/或是包含有或是由來自SEQ ID NOs：2至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13之胺基酸位置，其係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基520至 873的所組成之胺基酸序列；以及/或是包含有或是由來自SEQ ID NOs：49至64中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：61所組成之胺基酸序列，具有至少40%的至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高，最高可達100%之胺基酸序列一致性；其中H_N多肽的N-端包括有來自與該H_N多肽的其餘部分不同之BoNT/F亞型的胺基酸殘基之胺基酸序列。

在一較佳實施例中，本發明的嵌合雙鏈BoNT/F多肽包含有一BoNT/F₇或BoNT/F₅輕鏈或輕鏈片段，以及一BoNT/F₇或BoNT/₅ H_N功能域或H_N功能域片段。因此，在一較佳實施例中，本發明之嵌合雙鏈的BoNT/F多肽包含有：(a)一(BoNT/F)多肽序列，其係與包含有或是由來自於SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸1至430，例如SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸殘基1至421的胺基酸序列，或是SEQ ID NO：8的胺基酸殘基1至428胺基酸序列；以及/或是來自SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13，其係對應於SEQ ID NO：1的胺基酸15至412，例如SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13的胺基酸殘基15至403，或是SEQ ID NO：8的胺基酸殘基15至410之胺基酸序列；以及/或是SEQ ID NOs：40或45至48中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：45的胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%中、至少99%或更多，最高達多100%的胺基酸序列一致性；以及(b)與包含有或是由來自SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13，其係其對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基520至873，例如SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13的胺基酸殘基509至862，或是SEQ ID NO：8之胺基酸殘基516至868之胺基酸序列；以及/或是來自SEQ ID NOs：8或13至16中之任一者，較佳地為來自SEQ ID NO：13，其係其對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基538至850，例如SEQ ID NOs：13至16中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：13的胺基酸殘基527至839，或是SEQ ID NO：8之胺基酸殘基534至845；以及/或是SEQ ID NOs：56或61至64中之任一者，較佳地為SEQ ID NO：61之胺基酸序列所組成之胺基酸序列，具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、在至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99與胺基酸序列，其包含或%或更多，高達100%的胺基酸序列一致性；其中H_N多肽的N-端包括有來自與該H_N多肽的其餘部分不同之BoNT/F亞型的胺基酸殘基之胺基酸序列。

在一特別較佳實施例中，本發明提供一種嵌合雙鏈的BoNT/F多肽，其包括有：(a)一輕鏈多肽，其包含與SEQ ID NOs：33至48中之至少一者，較佳地為SEQ ID NO：45，具有至少40%的序列一致性之胺基酸序列；以及(b)一H_N多肽，其包含具與SEQ ID NOs：49至64中之至少一者，較佳地為SEQ ID NO：61，具有至少70%的序列一致性之胺基酸序列，其中H_N多肽的N-端包括有來自與該H_N多肽的其餘部分不同之BoNT/F亞型的胺基酸殘基之胺基酸序列。

典型地，H_N多肽的N-端胺基酸殘基係為A或Q。舉例來說，H_N多肽的N-端可以由選自於APPR(SEQ ID NO：127)或QSPS(SEQ ID NO：128)的胺基酸模體開始。在一較佳實施例中，H_N多肽的N-端係由選自於APPRLCIK(SEQ ID NO：70)、APPRLCIT(SEQ ID NO：71)、QSPSLCIK(SEQ ID NO：72)、以及QSPSLCIT(SEQ ID NO：73)的胺基酸模體開始。

本發明之嵌合雙鏈可以包含來自於任何BoNT/F亞型的輕鏈多肽序列，較佳地為來自BoNT/F₅或BoNT/F₇。本發明之嵌合雙鏈可以包含來自於任何BoNT/F亞型的H_N多肽序列，較佳地為來自BoNT/F₅或BoNT/F₇。該等輕鏈多肽序列與H_N多肽序列，可以是來自相同的BoNT/F亞型。舉例來說，該等輕鏈多肽序列與H_N多肽序列，可以都是來自於BoNT/F₅或BoNT/F₇。該等輕鏈多肽序列與H_N多肽序列可以是來自於關係密切的亞型。舉例來說，該輕鏈多肽序列可以是來自 BoNT/F₅，而H_N多肽序列則可以是來自BoNT/F₇，或是反之亦然。在一較佳實施例中，該輕鏈多肽序列以及/或是H_N多肽序列，係來自於BoNT/F₅亞型或BoNT/F₇亞型。在一甚至更佳之實施例中，該等輕鏈多肽序列與H_N多肽序列，都是來自BoNT/F₅亞型或BoNT/F₇亞型，最佳地為來自BoNT/F₇亞型。該輕鏈多肽序列與H_N多肽序列，可以是來自於不同的BoNT/F亞型。典型地，該等輕鏈多肽序列與H_N多肽序列，係來自於相同或關係密切之BoNT/F亞型。

本發明的嵌合雙鏈包括有一或多個活化環的胺基酸殘基，其係來自於與該輕鏈多肽序列，以及/或是H_N多肽序列的BoNT/F亞型不同之BoNT/F亞型。該來自不同BoNT/F亞型之一或多個胺基酸，可以被保留在輕鏈多肽序列的C-端，以及/或是H_N多肽序列的N-端。典型地，本發明的嵌合雙鏈多肽之H_N多肽序列，係為一BoNT/F₅或BoNT/F₇序列，並且其之N-端包括有來自如在此所描述的BoNT/F₁、BoNT/F₂、BoNT/F₃、BoNT/F₄或BoNT/F₆活化環中之一或多個胺基酸。在一較佳實施例中，該等一或多個胺基酸是來自於如在此所描述的BoNT/F₁活化環。

本發明的嵌合雙鏈多肽可以包含有對應嵌合單鏈多肽之所有胺基酸，也就是除了其係被切割成兩個多肽，而不是位在單一鏈內之外，該雙鏈多肽的序列可以是與該單鏈多肽相同。或者，相較於對應的嵌合單鏈多肽，本發明的嵌合雙鏈多肽也可以是缺少一或多個胺基酸。典型地，其可以是源自於在活化環中的第二(或後續)位置上進行切割，而導致該活化環序列自該活化嵌合雙鏈多肽上損失一短片段。因此，相較於對應的嵌合單鏈多肽，該嵌合雙鏈多肽可缺少至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十個或更多個胺基酸。

任何在此與本發明的單鏈嵌合多肽之輕鏈多肽序列和H_N多肽序列有關的定義之揭露內容，同樣適用於本發明之嵌合雙鏈多肽內之序列。例如，在本發明的雙鏈多肽中之輕鏈多肽序列以及/或是H_N多肽序列，係較佳地來自於BoNT/F₅亞型或BoNT/F₇亞型。在此與本發明的TM有關之任何揭露內容，係如單鏈嵌合多肽一般同樣適用於該雙鏈多肽。

本發明的雙鏈多肽係典型地由本發明之如在此所描述的單鏈嵌合多肽所獲得。

細胞

本發明的多肽可以透過一個適當的細胞(也稱為宿主細胞)來生產，例如Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris或Bacillus megaterium，其會將一重組表現載體增殖，該載體編碼有本發明之多肽。

因此，本發明還另外提供表現本發明之多肽的細胞。典型地，本發明的細胞中包含有本發明之多核苷酸或表現載體，並且係適合用於表現該多核苷酸或載體。在本技術領域中已知許多種的原核與真核表現系統，該細胞可以選自於例如大腸桿菌或巨桿菌(B.megaterium)之原核細胞，例如啤酒酵母菌(S.cerevisiae)和畢氏酵母菌(P.pastoris)之真核細胞。雖然其也可以使用例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞等等之較高等真核細胞，然而例如肉毒桿菌之其中不具有糖基化器者係為較佳。

組成物和治療/美妝適應症

本發明也提供一種醫藥組成物，其包含有本發明的多肽或雙鏈多肽。該醫藥組成物可以選擇性地包含有藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載體、推進劑、鹽類以及/或是添加劑。典型地，本發明的醫藥組成物係適合用於治療或預防一肉毒桿菌神經毒素之療法所顯示的疾病或病症。該醫藥組成物係特別適合用於皮下、肌內、植入性以及/或是局部給藥。肌內給藥係為較佳的。適合進行注射的組成物，可以是溶液、懸浮液或乳液，或乾燥粉末的形式，其在使用之前會以適當的載體進行溶解或懸浮。

本發明還提供一種化妝品組成物，其包含有本發明的多肽或雙鏈多肽。該化妝品組成物可以選擇性地包含有化妝品上可接受之賦形劑、稀釋劑、載體、推進劑、鹽類以及/或是添加劑。典型地，本發明的化妝品組成物係適合用於緩解一肉毒桿菌神經毒素所顯示之化妝品適應症。

該化妝品組成物係特別適合用於皮下、肌內、植入性以及/或是局部給藥。肌內或皮下給藥係為較佳的。適合進行注射的組成物，可以是溶液、懸浮液或乳液，或乾燥粉末的形式，其在使用之前會以適當的載體進行溶解或懸浮。

在局部遞送多肽、雙鏈多肽或組成物的情況下，工程梭菌毒素可以被配製成乳膏(例如用於局部施用)，或是用於真皮下注射。局部遞送構件可以包括透皮遞送(例如，經由黏附貼片)。

本發明的藥物或化妝品組成物之任一者，也構思局部遞送作用。局部遞送這個術語係典型地代表作用部位，是位在(或接近於)施用位置。在一非侷限性範例中，被注射欲鬆弛之肌肉的BoNT，將會藉著肌內注射而局部遞送至該肌肉。

本發明的藥物或化妝品組成物之任一者，也構思全身遞送作用。全身遞送這個術語係典型地代表作用部位，並不是位在(或接近於)施用位置，而是將BoNT從其係被施用處輸送(典型地係是在血液中)至其進行作用之處。在一非侷限性範例中，在意欲鬆弛具備專一性的特定肌肉下，被注射至全身循環內之BoNT，將會進行全身遞送。

本發明的多肽，雙鏈多肽以及/或是組成物，可以在與受影響之器官的神經支配相關之脊柱節段區段，透過在脊柱內之脊椎內或硬膜外注射而對患者給藥。

較佳的給藥途徑是透過腹腔鏡以及/或是局部來進行，特別是肌內注入來給藥。

本發明的多肽、雙鏈多肽或組成物的給藥劑量範圍，係為可以產生所需的治療或美容效果之劑量。應該要理解的是，所需之劑量範圍係取決於該等多肽、雙鏈多肽或組成物的確切性質、給藥途徑，配方的性質、患者的年齡、患者的病情之性質、程度或嚴重程度、禁忌性(如果有的話)、以及主治醫師的判斷。這些劑量水平上的變化，可以使用標準經驗性例行分析來進行優化與調整。

適當的日劑量(每公斤患者體重)範圍是落在0.001-10奈克/公斤，較佳地為0.001-5奈克/公斤，更佳地為0.02-5奈克/公斤，特別較佳地為0.04-5奈克/公斤。該單元劑量可以從不到10微微克變化至300奈克，但典型地將會落在每劑為0.1到10奈克，其可以每日施用或較佳地較不頻繁施用，例如每週或是每六個月。

一種特別較佳的給藥方案係以0.5奈克多肽/雙鏈多肽作為1X劑量為基礎。在這一方面，較佳的劑量是落在1X-100X(也就是0.5-50奈克)的範圍內。

液體劑型係典型地運用多肽/雙鏈多肽和無熱原無菌載體來加以製備。隨著載體和濃度的不同，該多肽或雙鏈多肽可以被溶解或懸浮在載體中。在製備溶液中的多肽或雙鏈多肽，可以被溶解於載體中，該溶液係在必要時藉著添加氯化鈉而製成等張溶液，然後在填充至適當的無菌小瓶或安瓿並密封之前，藉著通過無菌過濾器而運用無菌技術來進行過濾滅菌。另外，如果溶液穩定性適當，存於其之密封容器內的溶液就可以進行高溫高壓滅菌。有利的是，可以將例如緩衝劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑及/或局部麻醉劑等等之添加劑，溶解在載體中。

在使用前被溶解或懸浮於適當載體中之乾燥粉末，可以在無菌區中運用無菌技術，藉著將預先滅菌的成分填充至無菌容器來內而加以製備。任擇地，該成分可以使用無菌技術，而在無菌區被溶解於適當的容器中。然後將該產物冷凍乾燥，並將該容器無菌地密封。

除了該無菌成分係被懸浮而不是溶解於無菌載體中，同時滅菌並不能透過過濾來達成之外，適合於進行肌內、皮下或皮內注射之非經腸胃懸浮液，係以基本上相同的方法來進行製備。該成分可以在無菌狀態下分離，或是在分離之後透過γ輻射來另外進行滅菌。

在組成物中可以包括例如聚乙烯基吡咯烷酮之懸浮劑，以促進該成分之均勻分佈。

本依據本發明之給藥方式，可以運用包括微粒封包、病毒遞送系統或高壓氣霧噴射等等許多種之遞送技術。

本發明還提供了如在此所描述的多肽、雙鏈多肽、以及/或是醫藥組成物，其係用於預防或治療一次肉毒桿菌神經毒素所顯示之療法的疾病或病症。本發明進一步提供將如在此所描述的多肽、雙鏈多肽、以及/或是醫藥組成物，用於製備預防或治療一次肉毒桿菌神經毒素之療法所顯示的疾病或病症之藥劑的用途。本發明還進一步提供一種預防或治療一次肉毒桿菌神經毒素之療法所顯示的疾病或病症之方法，其包含將藥學上有效劑量之如在此所描述的多肽、雙鏈多肽、以及/或是醫藥組成物，投藥至需要其等之個體。該等疾病或病症可以是如在此所描述的任何疾病或病症。

本發明還提供了一種BoNT/F_7-1多肽以及/或是醫藥組成物，其包含有用於預防或治療一次肉毒桿菌神經毒素之療法所顯示的疾病或病症之方法中的BoNT/F_7-1多肽。本發明進一步提供BoNT/F_7-1多肽以及/或是醫藥組成物之用途，其包含用於製備預防或治療一次肉毒桿菌神經毒素之療法所顯示的疾病或病症之藥劑的一BoNT/F_7-1多肽。本發明還進一步提供一種預防或治療其中指明使用肉毒桿菌神經毒素之療法的疾病或病症之方法，其包含將藥學上有效劑量之BoNT/F_7-1多肽，以及/或是包含有BoNT/F_7-1多肽的醫藥組成物，投藥至需要其等之個體。該等疾病或病症可以是如在此所描述的任何疾病或病症。該BoNT/F_7-1多肽較佳地係為一雙鏈(活化)BoNT/F_7-1多肽。

本發明進一步提供了一種如在此所描述的多肽、雙鏈多肽以及/或是化妝品組成物之用途，其係用於預防止或緩解一肉毒桿菌神經毒素所顯示之美妝適應症。該美妝適應症可以是如在此所描述的的任何美妝適應症。

本發明進一步提供一種BoNT/F_7-1多肽以及/或是包含有BoNT/F_7-1多肽之化妝品組成物的用途，其係用於預防或緩解一肉毒桿菌神經毒素所顯示之美妝適應症。該美妝適應症可以是如在此所描述的的任何美妝適應症。該BoNT/F_7-1多肽係較佳地為一雙鏈(活化)BoNT/F_7-1多肽。

任何在此所稱之治療以及/或是美妝適應症，或是藥學以及/或是化妝品組成物，都同樣適用於在此所描述之本發明的單鏈嵌合多肽與雙鏈多肽。

實施例

以下實施例係用於說明本發明的具體實施例，並且不會以任何方式來侷限於申請專利範圍中所界定之本發明的範圍。

實施例1-所有的BoNT血清型與亞型之活化環的胺基酸序列比對

藉由基本局部比對檢索工具(BLAST)來檢索該UniParc資料庫，以檢索全長BoNT蛋白。在BLAST檢索中所確認之所有全長BoNTs的胺基酸序列，係被進行進行分析並鑑定活化環序列。所有的BoNT/A和BoNT/F亞型之活化環序列係針對任何顯著異同，進行比對與分析(第1圖)。

人們驚訝地發現，雖然在BoNT/A序列之間的活化環序列，在不同血清型內具有高度的保守性，但是在BoNT/F亞型之間的保守性層級則要低得多。特別是，人們發現相較於其他BoNT/F亞型，來自BoNT/F₅ 與BoNT/F₇亞型之活化環，係特別地分歧異(第1、3與4圖)。

實施例2-製備編碼了嵌合BoNT/F _7-1 之表現質體

進行不同的BoNT/F亞型之親緣分析(第2圖)，以辨識用於產生嵌合蛋白質BoNT/F_7-1的BoNT/F₁亞型與BoNT/F₇亞型。

天然存在的蛋白質，UniParc編號UPI00000B66D1，係為F₁亞型(BoNT/F₁)。此一BoNT/F₁係被製備成重組蛋白質，並命名為SXN102691，重組BoNT/F₁(rBoNT/F₁)。

天然存在的蛋白質，UniParc編號UPI0001DE3DAC，係與其他三個高度相似的蛋白質排齊歸入F₇亞型(BoNT/F₇)。此一BoNT/F₇係被製備成重組蛋白質，並命名為SXN102697，重組BoNT/F₇(rBoNT/F₇)。

rBoNT/F₁與rBoNT/F₇係被純化成為單鏈前驅蛋白質。純化單鏈rBoNT/F₁的轉譯後修飾作用的條件，係藉著以蛋白酶Lys-C來選擇性進行水解而確定。其將會產生rBoNT/F₁蛋白的成熟雙鏈形式。轉譯後支蛋白水解步驟，係因為相較於單鏈形式，BoNT蛋白的成熟(活化)形式，會在功能性分析中呈現出更高的比活性，因而被稱為活化作用。

相對於rBoNT/F₁，rBoNT/F₇並無法確認選擇性活化之條件。相反地，在所有條件下進行測試之rBoNT/F₇蛋白質水解並不具選擇性，而是發生在蛋白質中之幾個其他位置上。在非所欲位置所發生之蛋白水解係被稱為降解。

包括有選擇性蛋白水解位置，而使其活化之位置的BoNT蛋白整體結構，是非常具保守性的。不同BoNTs之間的保守性，在二級和三級結構的層級上尤其明顯。因此說明了，以來自rBoNT/F₁的活化環來取代rBoNT/F7的結構，將會產生一種嵌合蛋白，其既保留了rBoNT/F₇的功能特性，也適合於進行如rBoNT/F₁之轉譯後活化作用。我們稱其為嵌合蛋白rBoNT/F_7-1(第5圖)。

該嵌合蛋白質rBoNT/F_1-7係由來自UPI0001DE3DAC(BoNT/F₇)的胺基酸1-421、來自UPI00000B66D1(BoNT/F₁)的430-444、以及來自UPI0001DE3DAC(BoNT/F₇)的435-1268所組成，(參見第6圖之全胺基酸序列)。該嵌合蛋白質rBoNT/F_7-1係被命名為SXN102875。rBoNT/F₁、rBoNT/F₇與rBoNT/F_7-1之百分比一致性與歧異性，係被顯示於以下表2中。

編碼了嵌合BoNT/F_7-1之表現質體，係藉著兩輪以PCR為基礎之定點誘變(SDM)技術所產生，以修飾BoNT/F₇的活化環區域之密碼子(在我們現有之針對SXN102697的表現質體中)，來編碼來自BoNT/F₁的活化環區域之該胺基酸序列。現有用於SXN102697之表現質體，係使用化學合成技術來製備並含有一個編碼了BoNT/F₇(SEQ ID NO：13-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001DE3DAC)的閱讀框，並且係針對於E.coli細菌細胞中之有效蛋白質表現，而進行密碼子優化。

BoNT/F₁活化環的胺基酸序列是：KSVIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：66)

BoNT/F₇活化環的胺基酸序列是：KSIVSKKGTKN--SL(SEQ ID NO：69)

定點誘變(SDM)的引子係分別為：

[第一輪之定點誘變(SDM)]

第一輪的SDM之模板質體是A002697(以及編碼了BoNT/F₇之表現質體)。第一輪的SDM分別設立了四個獨立的反應：

所有反應之PCR循環條件如下：

95℃ 30秒

95℃ 30秒|

55℃ 1分鐘>18個循環

72℃ 5分鐘|

72℃ 10分鐘

維持於4℃

該PCR反應產物係在37℃下以DpnI進行消化2小時，然後轉形至Top10細胞(Life Technologies公司，單次細胞批號1419720)。該DpnI消化反應混合物為：

轉形至Top10細胞的過程，係依據製造商的說明來進行。簡而言之，細胞係置於冰上解凍，然後5μl消化反應溶液係被加入至50μl的勝任細胞，並在冰上培育30分鐘。然後在42℃下對該細胞進行熱休克處理30秒，並置回到冰上另外2分鐘。然後200μl SOC培養基(與勝任細胞一起提供)，係被加入至該轉形反應中，並將細胞下於振盪培養箱中培育1小時。轉形細胞係被鋪到瓊脂-康黴素之培養皿上，於37℃下培養隔夜。

反應1得到34個菌落

反應2得到122個菌落

反應3得到59個菌落

反應4得到42個菌落

平行進行操作之pUC控制轉形組，係得到92個菌落。

自四個反應條件中每個挑選單一個菌落，生長隔夜(10毫升L-培養液，康黴素)，並且該質體DNA係根據製造商的說明，透通Wizard Plus Miniprep(Promega)來進行回收。

來自四個反應條件中每個質體DNA，都進行DNA定序，其證實了在這四種情況下，所預期之點突變皆已被插入。

[第二輪之定點誘變(SDM)]

第二輪之SDM的模板質體，係為來自第一輪(反應2)之質體DNA。五種不同的反應係被設立：

所有反應之PCR循環條件如下：

95℃ 30秒

95℃ 30秒|

55℃ 1分鐘>18個循環

72℃ 5分鐘|

72℃ 10分鐘

維持於4℃

PCR反應產物係如第1輪中所述，以DpnI進行消化然後轉形至Top10細胞中：

反應1產生了13個菌落

反應2產生了16個菌落

反應3產生了15個菌落

反應4產生了0個菌落

反應5產生了0個菌落

每個來自反應1和2以及2自3中的一個菌落都被生長隔夜；DNA係如上所述的進行萃取並加以定序。

在確認所需序列編碼的蛋白質的BoNT/F_7-1確實存在後，該序列經驗證之DNA係根據製造商的說明，而被轉形至勝任BL21(DE3)細胞(Invitrogen)中，並建立細胞銀行。

實施例3-rBoNT/F _7-1 的純化 [透過細胞粉碎/均質機來進行細胞裂解作用]

表現rBoNT/F_7-1之E.coli細胞，係通過離心收集，然後再懸浮於3毫升/g的細胞裂解緩衝液(pH值為8.0之50mM的Tris，200mM的NaCl)中，補充16ul的Benzonase(90%純度，25U微升)。該再懸浮細胞係於進行細胞裂解作用之前置於冰上5分鐘。

透過超音波處理來裂解細胞(Misonix 3000超音波儀，30秒的脈衝期與45秒的休止期，8個週期)。該以超音波處理的樣本係被轉移到一次性500毫升離心盆(康寧，#431123)，蓋緊瓶蓋並且該裂解物係於4℃下以4300g離心澄清1小時。

[丁基瓊脂糖凝膠高效能捕獲步驟]

將澄清的裂解物係藉著添加固體(粉末)(NH₄)₂SO₄，而被調整為pH值為8.0之50mM Tris，100mM NaCl，1.35M(NH₄)₂SO₄。該(NH₄)₂SO₄係在10分鐘內，於間斷攪拌下小量添加。該樣品然後係被傾析至500ml的康寧管內，平衡並於20℃在4300g下離心澄清1小時。然後將澄清的裂解產物，然後在以平衡/洗滌緩衝液(pH值為8.0之50mM Tris，1.35M(NH₄)₂SO₄)進行平衡之2×丁基瓊脂糖高效能HiTrap管柱(10毫升樹脂)來進行捕獲。該管柱係被裝入樣本(200毫升)，以10倍管柱體積之平衡/洗滌緩衝液來加以洗滌，然後25倍柱體積，由pH值為8.0之Tris，1.35M(NH₄)₂SO₄至pH值為8.0之Tris來進行洗脫，在整個梯度中以5毫升為區分進行收集；每個區分之25微升樣本係被添加至25微升之4×LDS緩衝液中，以蒸餾水增量至100μl然後在SDS-PAGE上操作。含有目標蛋白質之區分係被集中。

[將rBoNT/F_7-1脫鹽成為低鹽Q結合緩衝液]

從丁基HP捕獲步驟中所匯集之物料，係被裝載至一預平衡HiPrep 26/10脫鹽柱(53ml管柱，以pH 8.5之50mM Tris來平衡)。然後在以緩衝液重新平衡該管柱之前，於8毫升/分鐘的流速下，將樣本以12毫升批次裝載。於<2mSv/cm下之低導電率下洗脫出來的蛋白質，係被收匯集集中。

[HiScreen Q高效能中間純化步驟]

來自該脫鹽步驟所匯集之物料，係被裝載到以1.2毫升/分鐘的流速預平衡之Q HiScreen HP層析柱(4.7毫升)。該管柱係以pH 8.5之50mM Tris進行平衡。該管柱係在1.2毫升/分鐘的流速下，以3倍管柱體積之pH 8.5的10mM Tris進行洗滌。該蛋白質然後透過以下線性梯度來洗脫：20管柱體積之pH8.5的50毫莫耳Tris，至pH8.5的50毫莫耳Tris，300毫莫耳NaCl，接著以5管柱體積之pH8.5的10毫莫耳Tris，1M NaCl高鹽來洗滌。該洗脫液係於1.2毫升/分鐘的流速下完成，並在整個洗脫過程中收集了2.5ml的區分。抽取25微升之所裝載、流經與區分的樣品，以SDS-PAGE進行分析。

SDS-PAGE樣本係如下所製備：25μl的區分樣本、25微升的LDS緩衝液以及50微升的dH₂O。該等區分係進行混合、離心、煮沸5分鐘、混合，並於裝載到凝膠前再次離心，已經確認取得該純化rBoNT/F_7-1(第7圖)。

[蛋白質濃度和儲存]

該蛋白質係採用一6毫升vivaspin超濾柱(的50kda MWCO)來進行濃縮。這是透過在4300g下離心來進行，直至阻流物體積已經減少至得以得到適當之濃度。然後以nanodrop lite紫外分光光度計來確定濃度，並自其導出最終數值。

實施例4-rBoNT/F _7-1 的活化

7毫升之純化單鏈rBoNT/F_7-1(0.201毫克/毫升)，係自-80℃冰櫃內移出並於MSC1櫃中解凍。加入2.8微升之Lys-C溶液(0.1毫克/毫升)，以得到0.04微克/ml之最終濃度(比例為1：5025)。該Lys-C最初係於蒸餾水中重組還原，以得到一0.1mg/ml的儲備液。

該樣本伴隨著未添加蛋白酶之控制組，在4℃下培養隔夜(16小時)。該樣本進行SDS-PAGE分析，以至被還原與未還原樣本。SDS樣本緩衝液(Invitrogen#LC2376)係用於氧化條件下。LDS樣本緩衝液(Invitrogen#NP0007)與DTT，則是被用於還原條件下。

實施例5-rBoNT/F _7-1 之苯基HP精緻純化步驟

rBoNT/F_7-1係在鹽濃度藉由1.6倍體積之pH值8.0的50mM Tris，5M NaCl，而調節至3莫耳NaCl後，被活化隔夜16小時。然後將樣本裝載至以pH值8.0的50mM Tris，3M NaCl預平衡之1毫升HiTrap苯基HP管柱。

該管柱然後以10倍管柱體積平衡緩衝液進行洗滌，然後將蛋白質係在從3M NaCl至0M鹽之25 cv線性梯度下進行洗脫。在該梯度階段收取1毫升之區分。

取用2×10微升之樣本以進行SDS-PAGE分析。該等樣本係在SDS樣本緩衝液(未還原)或LDS緩衝液+100mM DTT(還原的)之任一者中製備，並在SDS-PAGE上進行分析。

實施例6-活化rBoNT/F _7-1 的N-端定序

活化rBoNT/F_7-1係進行N-端定序。rBoNT/F_7-1係如上所述的被純化成為活化雙鏈蛋白。該等樣品係透過將200微升的最終樣本(0.1毫克/毫升)，添加至100μl的SDS裝載緩衝液、40μl的DTT(1M)、以及60μl的H₂O中而加以製備。該等樣品係在95℃下加熱5分鐘，然後在每條電泳道(負載體積為20μl)裝入1微克至凝膠上，以進行SDS-PAGE(第8圖)處理。

該BoNT/F_7-1重鏈(~100kDa帶處)係自9條-電泳道(由具有10條電泳道之凝膠)切下，並傳送給契約合作研究組織Alta Bioscience公司，並藉由艾德曼降解技術來進行N-端定序。Alta Bioscience公司之服務，係通過N端蛋白質定序之ISO 17025：2005認證。

所回覆之活化BoNT/F_7-1鏈的重鏈之N-端序列為：

這些結果顯示，活化rBoNT/F_7-1係為一種與活化rBoNT/F₇不同的蛋白質(在一級序列層級上)。活化rBoNT/F_7-1在重鏈部分之極N-端處，包含有胺基酸APPR。該胺基酸序列並未出現於天然序列rBoNT/F₇中。

這代表該H_N功能域所含有之活化雙鏈多肽的胺基酸鏈，包含有N-端胺基酸序列APPRLCIKV(第8圖)。因此，此一N-端序列包含來自BoNT/F₁的活化環之胺基酸模體APPR，該模體LCI(其係常見於BoNT/F₁與BoNT/F₇亞型兩者中)，以及來自BoNT/F₇ H_N功能域的N端之胺基酸KV。該APPR模體(以及延伸之APPRLCIKV模體)並未見於天然的BoNT/F₇(如同在第8圖中圓圈標示之對應BoNT/F₇序列)。因此，rBoNT/F_7-1的活化雙鏈形式，含有獨特的胺基酸序列，其未見於任何一種天然(未經修飾的)形式之BoNT/F₁或BoNT/F₇亞型中。

實施例7-rBoNT/F _7-1 的活性

rBoNT/F_7-1的活性可以使用許多標準來測定，其等包括有無細胞蛋白酶活性測定法(第9圖)、脊髓神經元(SCN)甘胺酸(Gly)釋放抑制測定法(第10圖)、離體肌肉收縮抑制作用測定法(第11圖)、以及活體內DAS測定法(第12圖)。

[無細胞的蛋白酶活性測定法]

rBoNT/F_7-1的無細胞蛋白酶測定法之試驗方法如下：BEH300 C4逆相分析HPLC管柱係於0.7毫升/分鐘(從0.1mL/分鐘開始，並在開始的幾分鐘內逐漸增加流速)下，在配置於水中的0.1%TFA(緩衝液A)中平衡30分鐘。該等參考與測試樣品，係以0.2mg/mL BSA、20mM DTT、50mM Hepes以及20μM氯化鋅(測定緩衝液)，於總體積為100μl下稀釋至1nM。該等試驗樣品與分析緩衝液100μl(用於負控制對照組)，係於37℃下預先培養30分鐘。該受質係藉著以測定緩衝液，而將一濃縮VAMP2-GFP儲備液稀釋至20μM來加以製備。50μl的各個測試樣品(或是緩衝成為負控制對照組者)，係被添加至50μl的受質中並溫和地進行吸液混合，然後在37℃下培養保溫30分鐘。該反應然後藉著每管加入25μl 0.3M的EDTA來停止。該樣品係藉著對每一反應混合物，添加375μl的緩衝液A來進行稀釋。每個樣品螺旋鎖定針筒(luer lock syringe)，以及0.2微米的PTFE過濾器來進行過濾。為了要分析該等樣品，該管柱溫度係被設定於 40℃，檢測波長則被設定於280nm，同樣地注入100μl而該梯度係如下表6所示：

一式兩份的注入樣品係在0.7毫升/分鐘下的15分鐘洗脫期間內進行分析。

如第9B圖所示，rBoNT/F_7-1能夠根據第9A圖的示意圖中所指出之過程來切割VAMP2受質。如第9C圖所示，rBoNT/F_7-1係被顯示可以產生相較於天然BoNT/F控制組，更高的切割產物%(65%相對於46%，以及更大的比活性(26nmol/h/pmol相對於18nmol/h/pmol))。

[SCN甘胺酸釋放抑制試驗]

rBoNT/F_7-1的SCN甘胺酸釋放抑制測定方法如下：製備大鼠脊髓神經元(SCN)的初代培養，並於96孔組織培養板中生長3週(如描述於：Masuyer et al.,2011,J.Struct.Biol.Structure and activity of a functional dcrivative of Clostridium botulinum neurotoxin B；以及描述於：Chaddock et al.,2002,Protein Expr.Purif. Expression and purification of catalytically active,non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A)。BoNT係以SCN進料培養液(feeding medium)來進行序列稀釋。來自待處理孔中之生長培養基，係被收集並加以過濾(0.2μm的過濾器)。125μl之經過濾培養基係被加回至每個測試孔。然後125μl之經稀釋毒素係被加入至培養板(一式三份培養孔)。該經處理的細胞係於37℃，10% CO₂中培養，24±1小時。

本例顯示由List Biological laboratories(Cambell，CA，USA)，所提供之相對於重組試驗蛋白質的用於天然BoNT/F的範例濃度範圍。所顯示之濃度是被預期可以產生這兩種蛋白質之定義良好的劑量反應曲線，其之資料點會涵蓋上端與下端漸近線區域。在其他情況下，對於任何特定實驗而言係為最適當之實際濃度測試，首先係藉由經驗而確定。

正如第10圖所示，rBoNT/F_7-1的%甘胺酸釋放，係比以相同濃度下之天然BoNT/F控制組還要更大。

[[³H]甘胺酸釋放法] 經BoNT處理之載有放射性標記的甘胺酸SCN

經BoNT處理之SCN係自培養箱移出(在暴露於BoNT後24±1小時)，然後將該培養基移除。280微升之溫熱的以HEPES緩衝之MEM(配置於500ml MEM中之12.5毫升HEPES在，最終濃度為25mM)係被添加至每個培養孔中(首次洗滌)。然後將培養板放回培養箱內5分鐘。該280微升之溫熱的以HEPES緩衝之MEM(於上述步驟中所加入)係被移除，並以第二次之280微升之溫熱的以HEPES緩衝之MEM(第二次洗滌)來取代，並在35℃下培養5分鐘。該第二次洗滌溶液係被移除，並將180微升之[³H]甘胺酸(2微居里/毫升(Perkin Elmer 1mCi/ml NET00400)，配置於以HEPES緩衝之MEM中)加入至每個培養孔中。然後將培養板在35℃下培養30分鐘。3×20μl之[³H]甘胺酸工作儲備液係被保留進行計數。經過培養30分鐘後，將[³H]甘胺酸自細胞中移除。將細胞以HEPES緩衝液MEM(250μl/孔)洗滌五分鐘一次，然後以HEPES緩衝液(10mM)HBSS，於連續洗滌(每次洗滌5分鐘)下，洗滌三次：200、210、230μl/孔。

收集基礎與刺激分泌物之樣本

針對於「基線」之讀數，100μl/孔的HBSS係被溫和地施加至所有的培養孔中。從添加至第一個培養孔開始計時。5分鐘後，將該等培養孔之內容物轉移到預冷之管件中，並將這些樣品維持在4℃下，直到進行進一步處理。針對於「刺激」之讀數，含有56mM氯化鉀之100μl/孔的HBSS，係被溫和地施加至所有的培養孔中。從添加至第一個培養孔開始計時。5分鐘後，將該等培養孔之內容物轉移到預冷之管件中，並將這些樣品維持在4℃下，直到進行進一步處理。該等細胞係於培養板中，以100μl的2M乙酸/0.1%三氟乙酸(裂解液)進行裂解10分鐘後，藉著吸液與吐液三次然後轉移到收集管的最終機架。「基線」與「刺激」的樣品在微量離心機中，以13000rpm(16.100×g下)離心5分鐘。將50μl之各個上清液轉移至6毫升閃爍小瓶內，並加入4毫升的Optima Gold MV閃爍液。使用Perkin Elmer TriCarb 2100 liquid scintillation analyser(LSA)(或等效裝置)，以3分鐘做為計算時間，並提供DPM輸出以得到計數值。

資料分析

所記錄之每分鐘去極化(DPM)數值，係被乘以二(因為在100微升收集物中只有50微升會於小瓶中進行計數)。基礎DPM係以(基底+刺激+裂解物)DPM的百分比來計算。刺激DPM則是以(刺激+裂解物)DPM的百分比來計算。淨釋放百分比係透過將刺激DPM%減去基礎DPM%而進行計算。每個BoNT處理之淨釋放百分比，將以該處理之相關一式三份「基礎」控制培養孔之平均淨%釋放值，來計算百分比數值(也就是「基礎」控制組在加以平均之後將等於100%)。每個BoNT濃度之一式三份的淨%釋放值係被加以平均，並且每個BoNT濃度之平均控制%釋放值的一式三份的淨%釋放值也會被加以平均。

下列表8提供了在SCN甘胺酸抑制測定法中，rBoNT/F_7-1與控制組(F/080166/Metv3)所測定之EC₅₀值。控制組(F/080166/Metv3)係為可以商業上取得之天然(未重組)BoNT/F。這些結果顯示，在該試驗中，重組BoNT/F_7-1是比純化的天然存在BoNT/F更為有效的。

[離體肌肉收縮抑制測定]

在離體肌肉收縮抑制測定法中，測量BoNT/F_7-1的活性之方法如下所示：Krebs-Henseleit緩衝液係於測定當天進行製備：將以下原料加入至大約1400毫升之蒸餾水內：47ml*5M氯化鈉(Sigma公司S6546)、2.4ml*1M MgSO₄(Sigma公司M3409)、8.9ml*45% D-葡萄糖(Sigma公司G8769)、100ml*20X氯化鉀、100ml*20X KH₂PO₄、20ml*250mM氯化鈣50毫升*1M NaHCO₃，並且必須將pH值調節成7.5。最終體積再以dH₂O調節為2升。

EmkaBath4組織浴系統(或是其它適合的器官浴設備)係依據製造商的說明來設立。左側膈神經/偏側隔組織配置物係先前所描述的方法來製備(Rasetti-Escarguil等人，2009,Toxicon,Measurement of botulinum types A,B,and E neurotoxicity using the pherenic nerve-hemidiaphragm：improved precision with in-bred mice；以及在Rasetti-Escarguil等人，2011, Toxicon,Pherenic nerve-hemidiaphragm as a highly sensitive replacement assay for determination of functional botulinum toxin antibodies中)。膈神經/偏側隔係被附接至組織浴中之組織維持器/電極總成上。然後該傳感器係被上/下移動以將張力設定在大約1g。監測組織中的張力，並初始基線穩定階段，根據需要微幅調整以將其維持在接近1g處。筒箭毒鹼(tubocurarine)控制組，係透過將100微升的100X筒箭毒鹼直接加入組織浴中來進行。當被登記進行追踪之組織完全癱瘓(由筒箭毒鹼所引起)時，洗掉該筒箭毒鹼並與許其重新建立基線收縮。該待測試BoNT係在包含0.05%明膠之緩衝液中，稀釋成10X所需最終濃度。將1毫升緩衝液從組織浴中取出，並將1ml的10X BoNT直接加入到該組織浴中，然後透過吸液/吐液5次來加以混合。監測該組織中之張力，並且該毒素處理後之力量，係以毒素處理前之平均力量的百分比來計算並相對於時間進行作圖。然後將該數據擬合至Hill方程式的變化公式內(公式1)

其中x係為時間(分鐘)、y係為力量，而t₅₀則是收縮減少至毒素處理前之水平的50%之時間。在以下情況下，來自該測定之數據將被排除：該預處理所培養之力量係小於0.5克；對於3μM筒箭毒鹼的反應係為<94%抑制效果；以及/或是在實驗結束時所短脈衝直接肌肉刺激，並未導致肌肉收縮。

如在第11圖(左圖)中所示，rBoNT/F_7-1能夠藉著80分鐘-後處理，而完全抑制肌肉的收縮。第11圖(右圖)顯示rBoNT/F_7-1、rBoNT/F₁以及控制組(F/080166/Metv3)的t₅₀值，並證明rBoNT/F_7-1係具有比rBoNT/F₁或控制組任一者更短的t₅₀。以下表9提供了rBoNT/F_7-1、rBoNT/F₁以及控制組(F/080166/Metv3)，在第11圖中所顯示的活體外肌肉收縮測定之t₅₀值。該控制組(F/080166/Metv3)係為商業上可取得的之天然(未重組)BoNT/F。這些結果顯示在該試驗中，重組BoNT/F_7-1係比純化的天然存在之BoNT/F以及重組BoNT/F₁更為有效(較低之t₅₀值=更有效)。

[足趾外展評分(DAS)測定法]

在DAS測定法中BoNT/F_7-1之活性的測量方法係如下所示：該方法是以小鼠在由尾巴來短暫懸吊時之驚嚇反應，延展腳趾的反射為基礎。此一反射係以足趾外展評分(DAS)來進行評估，並且係在將BoNT的施用至後肢的腓腸肌-比目魚肌之後被抑制。小鼠係由尾巴來短暫懸吊，以誘發特定之驚嚇反應，其中該動物會伸展其後肢並將其之後趾外展(Aoki等人，1999,Eur.J.Neurol.；6(suppl.4)S3-S10)。

於注射當天，小鼠係於一會接受配置於氧中之3%異氟烷的吸氣室內麻醉。每隻小鼠都在右後足的腓腸肌-比目魚肌處，接受BoNT或載體(含有0.2%明膠之磷酸鹽緩衝液)之肌內注射。

在注射神經毒素之後，不同程度之足趾外展係以零至四的分數來進行評分：其中0=正常而4=在足趾外展與腿部延伸上有最大之減低。ED50是藉著運用每個劑量之最大效果的平均值之非線性調整分析而確定。其所使用之數學模型係為4參數對數模式。

DAS測定係在給藥後的第一天中，每2小時進行一次；之後其係持續4天，每日進行3次。第12圖顯示nBoNT/F₁(作為參考)、rBoNT/F₁和rBoNT/F_7-1之擬合曲線。雖然nBoNT/F₁和rBoNT/F₁顯示出非常相似之劑量反應，但是rBoNT/F_7-1曲線卻向左偏移，這代表相較於nBoNT/F₁和rBoNT/F₁，較低劑量的rBoNT/F_7-1，可以達到類似的DAS反應，並因而顯示在該小鼠DAS分析中，rBoNT/F_7-1係比其他者更為有效；亦請參見以下之表(表10)，其提供所計算出之ED50以及每個的BoNT可以獲致DAS 4(最高評分)之劑量值：BoNT/F_7-1要達到類似的2或4 DAS反應，所需要的劑量係遠低於rBoNT/F₁和nBoNT/F₁。

序列資訊

SEQ ID NO：1-BoNT/F共通序列

SEQ ID NO：2-BoNT/F₁-UniParc存取編號UPI00000B66D1

SEQ ID NO：3-BoNT/F₂-UniParc存取編號UPT00016BB5D7

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SEQ ID NO：12-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0004E7C8CE

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SEQ ID NO：14-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B220

SEQ ID NO：15-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI00000BAF8C

SEQ ID NO：16-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B221

SEQ ID NO：17-BoNT/F共通序列最短LH_N主鏈(包括活化環)

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SEQ ID NO：19-BoNT/F₂-UniParc存取編號UPI00016BB5D7最短LH_N主鏈(包括活化環)

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SEQ ID NO：22-BoNT/F₄-UniParc存取編號UPI0001A92658最短LH_N主鏈(包括活化環)

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SEQ ID NO：24-BoNT/F₅-UniParc存取編號UPI0001C0B12E最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：25-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0001C0B1D1最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：26-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0000126B8A最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：27-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0001C0B1D0最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：28-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0004E7C8CE最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：29-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001DE3DAC最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：30-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B220最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：31-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI00000BAF8C最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：32-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B221最短LH_N主鏈(包括活化環)

SEQ ID NO：33-BoNT/F共通序列最短L鏈片段

SEQ ID NO：34-BoNT/F₁-UniParc存取編號UPI00000B66D1最短L鏈片段

SEQ ID NO：35-BoNT/F₂-UniParc存取編號UPI00016BB5D7最短L鏈片段

SEQ ID NO：36-BoNT/F₂-UniParc存取編號UPI00000B50F1最短L鏈片段

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SEQ ID NO：39-BoNT/F₄-UniParc存取編號UPI0001C0B12D最短L鏈片段

SEQ ID NO：40-BoNT/F₅-UniParc存取編號UPI0001C0B12E最短L鏈片段

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SEQ ID NO：43-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0001C0B1D0最短L鏈片段

SEQ ID NO：44-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0004E7C8CE最短L鏈片段

SEQ ID NO：45-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001DE3DAC最短L鏈片段

SEQ ID NO：46-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B220最短L鏈片段

SEQ ID NO：47-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI00000BAF8C最短L鏈片段

SEQ ID NO：48-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B221最短L鏈片段

SEQ ID NO：49-BoNT/F共通序列最短H_N片段

SEQ ID NO：50-BoNT/F₁-UniParc存取編號UPI00000B66D1最短H_N片段

SEQ ID NO：51-BoNT/F₂-UniParc存取編號UPI00016BB5D7最短H_N片段

SEQ ID NO：52-BoNT/F₂-UniParc存取編號UPI00000B50F1最短H_N片段

SEQ ID NO：53-BoNT/F₃-UniParc存取編號UPI0001C0B12F最短H_N片段

SEQ ID NO：54-BoNT/F₄-UniParc存取編號UPI0001A9265a最短H_N片段

SEQ ID NO：55-BoNT/F₄-UniParc存取編號UPI0001C0B12D最短H_N片段

SEQ ID NO：56-BoNT/F₅-UniParc存取編號UPI0001C0B12E最短H_N片段

SEQ ID NO：57-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0001C0B1D1最短H_N片段

SEQ ID NO：58-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0000126B8A最短H_N片段

SEQ ID NO：59-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0001C0B1D0最短H_N片段

SEQ ID NO：60-BoNT/F₆-UniParc存取編號UPI0004E7C8CE最短H_N片段

SEQ ID NO：61-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001DE3DAC最短H_N片段

SEQ ID NO：62-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B220最短H_N片段

SEQ ID NO：63-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI00000BAF8C最短H_N片段

SEQ ID NO：64-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001C0B221最短H_N片段

SEQ ID NO：65-BoNT/F共通序列最短活化環(也是UPI0001A92658(BoNT/F₄)與UPI0001C0B12D(BoNT/F₄)之活化環序列)KSIIPRKGTKAPPRL

SEQ ID NO：66-BoNT/F₁-UniParc存取編號UPI00000B66D1最短活化環(也是UPI0001C0B1D1(BoNT/F₆),UPI0000126B8A(BoNT/F₆),UPI0001C0B1D0(BoNT/F₆)與UPI0004E7C8CE(BoNT/F₆)之活化環序列)KSVIPRKGTKAPPRL

SEQ ID NO：67-BoNT/F₂-UniParc存取編號UPI00016BB5D7最短活化環(也是UPI00000B50F1(BoNT/F₂)與UPI0001C0B12F(BoNT/F₃)之活化環序列)KSIIPRKGTKQSPSL

SEQ ID NO：68-BoNT/F₅-UniParc存取編號UPI0001C0B12E最短活化環LNSSFKKNTKKPL

SEQ ID NO：69-BoNT/F₇-UniParc存取編號UPI0001DE3DAC最短活化環(也是UPI0001C0B220(BoNT/F₇),UPI00000BAF8C(BoNT/F₇)與UPI0001C0B221(BoNT/F₇)之活化環序列)KSIVSKKGTKNSL

SEQ ID NO：70-F1/4/6活化環序列(位於切割位之後)+F7重鏈序列之起始序列APPRLCIK

SEQ ID NO：71-F1/4/6活化環序列(位於切割位之後)+F5重鏈序列之起始序列APPRLCIT

SEQ ID NO：72-F2/3活化環序列(位於切割位之後)+F7重鏈序列之起始序列QSPSLCIK

SEQ ID NO：73-F2/3活化環序列(位於切割位之後)+F5重鏈序列之起始序列QSPSLCIT

SEQ ID NO：74-F1/4/6活化環序列(位於切割位之後)+F7重鏈序列之起始序列APPRLCIKV

SEQ ID NO：75-全長重組BoNT/F7-1(SXN102875_rBoNT-F7-1)

SEQ ID NO：76-UPI0000001386(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：77-UPI0000ED909E(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：78-UPI0000EF85BD(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：79-UPI00016529B7(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：80-UPI00027EE164(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：81-UPI000003409D(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：82-UPI0002AA7E5E(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：83-UPI0001A954C8(BoNT/A₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：84-UPI000016EA88(BoNT/A₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：85-UPI0000EF84BD(BoNT/A₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：86-UPI000067C53E(BoNT/A₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：87-UPI000290BDD5(BoNT/A₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：88-UPI0001C0B376(BoNT/A₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：89-UPI000290BEB1(BoNT/A₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：90-UPI0001F3B30D(BoNT/A₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：91-UPI0001C32E84(BoNT/A_2v2)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：92-UPI0003C9D2A1(BoNT/A_2or3)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：93-UPI000290B995(BoNT/A_5,3or2)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：94-UPI00005B712C(BoNT/A₃)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：95-UPI00016DBC11(BoNT/A₃)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：96-UPI000290C3D0(BoNT/A₃)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：97-UPI00005B712D(BoNT/A₄)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：98-UPI00019DB885(BoNT/A₄)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：99-UPI0001AE7D6A(BoNT/A₅)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：100-UPI000198BDAE(BoNT/A₅)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：101-UPI0001B7D251(BoNT/A₆)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：102-UPI00000B66D1(BoNT/F₁)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：103-UPI00016BB5D7(BoNT/F₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：104-UPI00000B50F1(BoNT/F₂)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：105-UPI0001C0B12F(BoNT/F₃)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：106-UPI0001A92658(BoNT/F₄)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：107-UPI0001C0B12D(BoNT/F₄)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：108-UPI0001C0B12E(BoNT/F₅)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：109-UPI0001C0B1D1(BoNT/F₆)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：110-UPI0000126B8A(BoNT/F₆)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：111-UPI0001C0B1D0(BoNT/F₆)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：112-UPI0001DE3DAC(BoNT/F₇)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：113-UPI00000BAF8C(BoNT/F₇)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：114-UPI0001C0B221(BoNT/F₇)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：115-UPI0001C0B220(BoNT/F₇)跨越活化環之序列

SEQ ID NO：116-BoNT/F₇/₁跨越活化環之嵌合核苷酸序列

SEQ ID NO：117-BoNT/F₇/₁跨越活化環之嵌合胺基酸序列GLCKSVIPRKGTKAPPRLCIKV

SEQ ID NO：118-BoNT/F在活化環附近之共通胺基酸序列

SEQ ID NO：119-SXN102691 F₁在活化環附近之胺基酸序列

SEQ ID NO：120-SXN102692 F₂在活化環附近之胺基酸序列

SEQ ID NO：121-SXN102693 F₃在活化環附近之胺基酸序列

SEQ ID NO：122-SXN102694 F₄在活化環附近之胺基酸序列

SEQ ID NO：123-SXN102695 F₅在活化環附近之胺基酸序列

SEQ ID NO：124-SXN102696 F₆在活化環附近之胺基酸序列

SEQ ID NO：125-SXN102697 F₇在活化環附近之胺基酸序列

SEQ ID NO：126-組胺酸標籤HHHHHH

SEQ ID NO：127-F₁/₄/₆活化環序列(位於切割位之後)+F₇重鏈序列之起始序列APPR

SEQ ID NO：128-F₂/₃活化環序列(位於切割位之後)+F₅重鏈序列之起始序列QSPS

SEQ ID NO：129-F₇ 1順向引子

SEQ ID NO：130-F₇ 1反向引子

SEQ ID NO：131-F₇ 2順向引子

SEQ ID NO：132-F₇ 2反向引子

<110> Ipsen Biopharm公司

<120> 嵌合多肽

<130> P43354WO

<150> GB 1505306.9

<151> 2015-03-27

<160> 132

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1279

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (109)..(109)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (113)..(113)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (129)..(129)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (165)..(165)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (173)..(173)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (178)..(178)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (185)..(185)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (240)..(240)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (253)..(253)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (660)..(660)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (811)..(811)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (818)..(818)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (827)..(827)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (974)..(974)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (976)..(976)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (999)..(999)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (1061)..(1061)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (1121)..(1121)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (1137)..(1138)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (1194)..(1194)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<400> 1

<210> 2

<211> 1278

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 1280

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 1280

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 1279

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 1278

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 1277

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 7

<210> 8

<211> 1277

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 8

<210> 9

<211> 1275

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 9

<210> 10

<211> 1274

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 10

<210> 11

<211> 1275

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 11

<210> 12

<211> 1275

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 12

<210> 13

<211> 1268

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 13

<210> 14

<211> 1268

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 14

<210> 15

<211> 1268

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 15

<210> 16

<211> 1268

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 16

<210> 17

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (95)..(95)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (99)..(99)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (115)..(115)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (151)..(151)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (159)..(159)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (164)..(164)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (171)..(171)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (226)..(226)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (239)..(239)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (646)..(646)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (797)..(797)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (804)..(804)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (813)..(813)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<400> 17

<210> 18

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 18

<210> 19

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 19

<210> 20

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 20

<210> 21

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 21

<210> 22

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 22

<210> 23

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 23

<210> 24

<211> 831

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 24

<210> 25

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 25

<210> 26

<211> 833

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 26

<210> 27

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 27

<210> 28

<211> 834

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 28

<210> 29

<211> 825

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 29

<210> 30

<211> 825

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 30

<210> 31

<211> 825

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 31

<210> 32

<211> 825

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 32

<210> 33

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (95)..(95)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (99)..(99)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (115)..(115)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (151)..(151)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (159)..(159)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (164)..(164)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (171)..(171)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (226)..(226)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (239)..(239)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<400> 33

<210> 34

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 34

<210> 35

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 35

<210> 36

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 36

<210> 37

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 37

<210> 38

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 38

<210> 39

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 39

<210> 40

<211> 396

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 40

<210> 41

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 41

<210> 42

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 42

<210> 43

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 43

<210> 44

<211> 397

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 44

<210> 45

<211> 389

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 45

<210> 46

<211> 389

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 46

<210> 47

<211> 389

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 47

<210> 48

<211> 389

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 48

<210> 49

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (124)..(124)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (275)..(275)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (282)..(282)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> 無法歸類之特徵

<222> (291)..(291)

<223> Xaa可以是任何天然存在之胺基酸

<400> 49

<210> 50

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 50

<210> 51

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 51

<210> 52

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 52

<210> 53

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 53

<210> 54

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 54

<210> 55

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 55

<210> 56

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 56

<210> 57

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 57

<210> 58

<211> 311

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 58

<210> 59

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 59

<210> 60

<211> 312

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 60

<210> 61

<211> 313

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 61

<210> 62

<211> 313

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 62

<210> 63

<211> 313

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 63

<210> 64

<211> 313

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 64

<210> 65

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 65

<210> 66

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 66

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 67

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 68

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 69

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F1/4/6活化環序列(位於切割位之後)+F7重鏈序列之起始序列

<400> 70

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F1/4/6活化環序列(位於切割位之後)+F5重鏈序列之起始序列

<400> 71

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2/3活化環序列(位於切割位之後)+F7重鏈序列之起始序列

<400> 72

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2/3活化環序列(位於切割位之後)+F5重鏈序列之起始序列

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 74

<210> 75

<211> 1270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全長重組BoNT/F7-1(SXN102875_rBoNT-F7-1)

<400> 75

<210> 76

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 76

<210> 77

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 77

<210> 78

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 78

<210> 79

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 79

<210> 80

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 80

<210> 81

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 81

<210> 82

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 82

<210> 83

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 83

<210> 84

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 84

<210> 85

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 85

<210> 86

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 86

<210> 87

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 87

<210> 88

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 88

<210> 89

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 89

<210> 90

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 90

<210> 91

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 91

<210> 92

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 92

<210> 93

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 93

<210> 94

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 94

<210> 95

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 95

<210> 96

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 96

<210> 97

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 97

<210> 98

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 98

<210> 99

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 99

<210> 100

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 100

<210> 101

<211> 56

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 101

<210> 102

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 102

<210> 103

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 103

<210> 104

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 104

<210> 105

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 105

<210> 106

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 106

<210> 107

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 107

<210> 108

<211> 46

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 108

<210> 109

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 109

<210> 110

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 110

<210> 111

<211> 48

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 111

<210> 112

<211> 46

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 112

<210> 113

<211> 46

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 113

<210> 114

<211> 46

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 114

<210> 115

<211> 46

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 115

<210> 116

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BoNT/F7/1跨越活化環之嵌合核苷酸序列

<400> 116

<210> 117

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BoNT/F7/1跨越活化環之嵌合胺基酸序列

<400> 117

<210> 118

<211> 41

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 118

<210> 119

<211> 41

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 119

<210> 120

<211> 41

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 120

<210> 121

<211> 41

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 121

<210> 122

<211> 41

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 122

<210> 123

<211> 39

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 123

<210> 124

<211> 41

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 124

<210> 125

<211> 39

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 125

<210> 126

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> His tag

<400> 126

<210> 127

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F1/4/6活化環序列(位於切割位之後)+ F7重鏈序列之起始序列

<400> 127

<210> 128

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2/3活化環序列(位於切割位之後)+F5 重鏈序列之起始序列

<400> 128

<210> 129

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F7 1順向引子

<400> 129

<210> 130

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F7 1反向引子

<400> 130

<210> 131

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F7 2順向引子

<400> 131

<210> 132

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F7 2反向引子

<400> 132

Claims

一種嵌合多肽，其包含來自於一第一肉毒桿菌神經毒素血清型F(BoNT/F)的亞型之LH_N主鏈，以及來自於不同BoNT/F亞型的活化環區域。
如請求項1的多肽，其中該LH_N主鏈係與SEQ ID NOs：17至32中之至少一者，具有至少為60%之序列一致性。
如請求項1或2的多肽，其中該LH_N主鏈包含有：(a)一多肽序列，其係與SEQ ID NOs：33至48中之至少一者，具有至少40%之序列一致性；以及/或是(b)一多肽序列，其係與SEQ ID NOs：49至64中之至少一者，具有至少70%之序列一致性。
如請求項1至3中之任一項的多肽，其中該LH_N主鏈係來自於一BoNT/F₅亞型或一BoNT/F₇亞型。
如請求項1至4中之任一項的多肽，其中該活化環包含有配合該共通序列KSIIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：65)之一胺基酸序列，或是其中加入、刪除或取代不超過五個胺基酸之一胺基酸序列。
如請求項5的多肽，其中該活化環係來自於一BoNT/F₁亞型、一BoNT/F₂亞型、一BoNT/F₃亞型、一BoNT/F₄或一BoNT/F₆亞型。
如請求項5或6的多肽，其中該活化環包含選自以下胺基酸序列的多肽：(a)KSVIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：66)；(b)KSIIPRKGTKQSPSL(SEQ ID NO：67)；或是(c)KSIIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：65)。
如前述請求項中之任一項的多肽，其中該LH_N主鏈係來自一BoNT/F₇亞型，而該BoNT/F活化環則包含有KSVIPRKGTKAPPRL(SEQ ID NO：66)的胺基酸序列。
如前述請求項中之任一項的多肽，其中該BoNT/F活化環中的切割位，係可以被專一性地由一內肽酶所識別與切割。
如請求項9的多肽，其中內切酶的切割會形成一活化全毒素(holotoxin)。
一種嵌合雙鏈BoNT/F多肽，其包含有：(a)一輕鏈多肽，其包含有與SEQ ID NOs：33至48中之至少一者，具有至少40%之序列一致性的一胺基酸序列；以及(b)一H_N多肽，其包含有與SEQ ID NOs：49至64中之至少一者，具有至少70%之序列一致性的一胺基酸序列；其中該H_N多肽的N-端包含有來自與該H_N多肽的其餘部分不同之BoNT/F亞型的胺基酸殘基。
如請求項11的雙鏈多肽，其中該H_N多肽序列的N-端胺基酸殘基係為A或Q。
如請求項11或12的雙鏈多肽，其中該H_N多肽序列的N-端係以選自於由APPRLCIK(SEQ ID NO：70)、APPRLCIT(SEQ ID NO：71)、QSPSLCIK(SEQ ID NO：72)以及QSPSLCIT(SEQ ID NO：73)所構成的群組之胺基酸模體開始。
如請求項11至13中之任一項的雙鏈多肽，其中該輕鏈多肽序列以及/或是H_N多肽序列，係來自於一BoNT/F₅亞型或一BoNT/F₇亞型。
如請求項11至14中之任一項的雙鏈多肽，其係由如請求項1至10中之任一項該多肽所獲得。
如請求項1至10中之任一項的多肽或如請求項11至15中之任一項的雙鏈多肽，其係進一步包含一標定模體(targeting moiety)，其係適合於藉著將該標定模體與一細胞直接結合，或是藉著將該標定模體與和細胞結合之一配體或數個配體進行結合，而將該多肽與一細胞結合。
如請求項16的多肽或雙鏈多肽，其中該標定模體係為一來自梭菌神經毒素之標定模體。
如請求項17的多肽或雙鏈多肽，其中該標定模體係為一非梭菌標定模體。
一種多核苷酸分子，其編碼如請求項1至10中之任一項的多肽。
一種表現載體，其包含如請求項19的多核苷酸，其係可操作地連接至一啟動子。
一種生產如請求項1至10中之任一項的多肽之方法，其包含有在一細胞中表現如請求項19的多核苷酸，並回收該所表現的多肽之步驟。
如請求項21的方法，其進一步包含將如請求項19的中多核苷酸引入至細胞內的步驟。
一種活化如請求項1至10中之任一項的多肽之方法，其包含有將該多肽與一內肽酶進行培育，其中在該BoNT/F活化環中的多肽切割作用，會將該多肽從一單鏈多肽轉變成一雙鏈多肽，藉此將該多肽加以活化。
如請求項23的方法，其中該內肽酶是Lys-C。
一種細胞，其表現如請求項1至10中之任一項的多肽。
如請求項25的細胞，其包含有如請求項19的多核苷酸，或是如請求項20的表現載體。
一種醫藥組成物，其包含有如請求項1至10或16至18中之任一項的多肽，或是如請求項11至18中之任一項的雙鏈多肽。
如請求項27的醫藥組成物，其進一步包含有醫藥上可接受的賦形劑或稀釋劑。
如請求項27或28的醫藥組成物，其係用於一種預防或治療以肉毒桿菌神經毒素療法所顯示之疾病或病症的方法。
一種如請求項27或28的醫藥組成物之用途，其係用於製造用於預防或治療以肉毒桿菌神經毒素療法所顯示之疾病或病症的藥物。
一種化妝品組成物，其係含有如請求項1至10或16至18中之任一項的多肽，或是如請求項11至18中之任一項的雙鏈多肽。
如請求項31的化妝品組成物，其進一步包含一美妝上可接受的賦形劑或稀釋劑。
一種如請求項31或32的化妝品組成物之用途，其係用於預防或緩解施用肉毒桿菌神經毒素所顯示之美妝適應症。
一種嵌合BoNT，其包含來自BoNT/F1亞型之主鏈，以及來自BoNT/F7亞型之活化環區。
一種如請求項34的嵌合BoNT，其係用於治療。