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TW201602135A - 雙特異性抗體 - Google Patents

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TW201602135A
TW201602135A TW104115700A TW104115700A TW201602135A TW 201602135 A TW201602135 A TW 201602135A TW 104115700 A TW104115700 A TW 104115700A TW 104115700 A TW104115700 A TW 104115700A TW 201602135 A TW201602135 A TW 201602135A
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residues
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TW104115700A
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埃瑞克Ｍ 貝內特
茹絲Ｅ 吉米諾
史考特 奈森 希金森
金伯利Ａ 瑪奎德
珍妮特Ｅ 保爾森
利烏米拉 奇斯蒂亞科瓦
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輝瑞大藥廠
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Abstract

本發明係關於經工程改造之雜多聚體蛋白質，且更特定地關於用於產生及純化諸如雙特異性抗體之雜二聚體蛋白質之方法。亦提供用於產生及純化此經工程改造之雜二聚體蛋白質的方法及該雜二聚體蛋白質在診斷學及治療學中之用途。本發明亦關於一種特異性結合人類TrkB之人類化抗體，及用於產生該抗體及使用該抗體以特別治療聽覺喪失病症之方法。

Description

雙特異性抗體
本發明係關於經工程改造之雙特異性抗體及相關多肽、其多聚體形式，以及此類蛋白質之製造方法。
對至少兩種不同抗原具有結合特異性之抗體稱為雙特異性抗體(BsAb)，已對其進行工程改造。不同於包含兩個一致雜二聚體(亦即輕鏈部分及重鏈部分)「臂」之其中各臂包含抗原結合位點(例如Fab區域)的經典抗體，雙特異性抗體在兩個臂每一者(例如Fab區域)中具有不同序列，使得Y形狀之分子之每個臂結合於不同抗原或相同抗原之不同抗原決定基。
藉由結合兩個不同抗原分子或相同抗原之不同抗原決定基，BsAb提供各種臨床應用，作為活體外及活體內診斷學及免疫療法之靶向劑。雙特異性抗體亦宜用於包括癌症之各種疾病病況的活體外或活體內診斷。舉例而言，BsAb之一個臂可經工程改造以結合腫瘤相關之抗原且另一個臂結合可偵測之標記物。
BsAb可用於使患者之細胞免疫防禦機制針對腫瘤細胞或感染物(例如病毒感染細胞，諸如HIV或流感病毒；原生動物，諸如弓形蟲(Toxoplasma gondii))。詳言之，可藉由將BsAb之一個臂工程改造以結合於所需標靶(例如腫瘤細胞或病原體)且BsAb之另一個臂結合於細胞毒性引發分子，諸如T細胞受體或Fcγ受體來使免疫調節之細胞毒性改 變方向，由此活化下游免疫效應路徑。使用此策略，已展示結合於FcγRIII之BsAb在活體外介導自然殺手(NK)細胞/大顆粒淋巴細胞(LGL)對腫瘤細胞之殺死且在活體內阻止腫瘤生長。或者，靶向與治療適應症有關之兩種分開抗原或標靶可增強特異性且減少不必要的相互作用，由此加寬治療指數。
雖然雙特異性抗體具有優於典型二價單特異性經典抗體之某些優點，但獲得足夠量及純度之BsAb的費用阻礙雙特異性抗體之使用。
為產生多特異性蛋白質，例如雙特異性抗體及其他雜二聚體或雜多聚體，需要使用促進所需雜多聚體優於均多聚體形成之方法。一種獲得含Fc之BsAb的方法仍然為雜交融合瘤技術，其中兩種抗體共表現。然而，就產率及純度而言，此方法效率低，所需雜多聚體常常難以自包含不恰當配對之多肽鏈的相對較大含量之污染物進一步純化。
促進雜多聚體形成及減少不恰當匹配之其他技術包括對多聚結構域中CH3結構域界面的空間互補突變進行工程改造，稱為「杵臼」策略，如Ridgway等人(US5731168)及Merchant等人(US7183076)描述。
Strop等人(WO2011/143545)亦已描述用帶電胺基酸置換構成兩個CH3結構域中CH3-CH3界面之一或多個殘基以促進雜二聚體形成的技術。
近期評述亦論述用於克服在產生雙特異性抗體時之鏈締合問題的各種方法(Klein等人，mAbs 4(6)：653-663(2012))。
然而，此等技術大部分係針對確保重鏈多肽之恰當配對，且不解決各輕鏈多肽與其對應重鏈多肽之進一步匹配以提供功能性抗原結合位點。因此，所需雙特異性抗體之產生仍然為一種技術上困難且昂 貴之方法，因商品成本高而在商業上不可行。
因此，在此項技術中長期感到需要用於工程改造雙特異性抗體片段及/或全長BsAb之方法，該等方法能夠表現BsAb且自重組細胞培養物直接及/或有效回收BsAb及/或可在商業上合理的成本下以有效產率及純度產生BsAb。
E1. 根據本發明之第一實施例，提供一種雜二聚體蛋白質，其包含：(i)第一CHCL結構域(CHCL)，其包含第一CH1結構域(CH1)及第一CL結構域(CL)，其中該第一CH1與該第一CL在第一CHCL界面相互作用在一起；(ii)第二CHCL，其包含第二CH1及第二CL，其中該第二CH1與該第二CL在第二CHCL界面相互作用在一起；其中該第一CH1與該第二CH1之不同之處在於該第一CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該第一CL與該第二CL之不同之處在於該第一CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第一CHCL之該CH1突變殘基與該CL突變殘基優先於該第二CHCL上之對應殘基位置彼此相互作用，該第一CH1及第一CL之該等相互作用突變殘基由此形成第一互補殘基組。
下文描述本發明之此第一實施例的多個其他實施例(E)，其中為方便起見，E1與其一致。
E2. 根據E1之雜二聚體蛋白質，其中該第二CH1與該第一CH1之不同之處在於該第二CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該第二CL與該第一CL之不同之處在於該第二CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第二CHCL之該CH1突變殘基與該CL突變殘基優先於該第一CHCL上之對應殘基位置彼此相互作用，該第二CH1及第二CL之該等相 互作用突變殘基由此形成第二互補殘基組。
E3. 一種雜二聚體蛋白質，其包含(i)第一CH1結構域(CH1)及第一CL結構域(CL)，該第一CH1與該第一CL在第一CHCL界面相互作用在一起以形成第一CHCL結構域(CHCL)；(ii)第二CH1結構域(CH1)及第二CL結構域(CL)，該第二CH1與該第二CL在第二CHCL界面相互作用在一起以形成第二CHCL結構域(CHCL)；其中該第一CH1經工程改造以與該第二CH1之不同之處在於該第一CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該第一CL經工程改造以與該第二CL之不同之處在於該第一CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第一CHCL之該CH1突變殘基與該CL突變殘基優先於該第二CHCL上之對應殘基位置彼此相互作用，該第一CH1及第一CL之該等相互作用突變殘基由此形成第一互補殘基組。
E4. 根據E3之雜二聚體蛋白質，其中該第二CH1經工程改造以與該第一CH1之不同之處在於該第二CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該第二CL經工程改造以與該第一CL之不同之處在於該第二CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第二CHCL之該CH1突變殘基與該CL突變殘基優先於該第一CHCL上之對應殘基位置彼此相互作用，該第二CH1及第二CL之該等相互作用突變殘基由此形成第二互補殘基組。
E5. 根據E1至E4中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於225Å2。
E6. 根據E1至E5中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於220Å2。
E7. 根據E1至E6中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å 探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於150Å2。
E8. 根據E1至E7中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於100Å2。
E9. 根據E1至E8中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於50Å2。
E10. 根據E1至E9中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於20Å2。
E11. 根據E1至E10中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於10Å2。
E12. 根據E1至E11中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於5Å2。
E12. 根據E1至E12中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於1Å2。
E13. 根據E1至E12中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於225Å2。
E14. 根據E1至E13中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於220Å2。
E15. 根據E1至E14中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於150Å2。
E16. 根據E1至E15中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於100Å2。
E17. 根據E1至E16中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於50Å2。
E18. 根據E1至E17中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於20Å2。
E19. 根據E1至E18中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å 探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於10Å2。
E20. 根據E1至E19中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於5Å2。
E21. 根據E1至E20中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於1Å2。
E21. 根據E1至E20中任一者之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一或該第二互補殘基組之溶劑可及表面積為約0Å2。
E22. 根據E1至E21中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一互補殘基組之該等突變殘基不同於該第二互補殘基組之該等突變殘基。
E23. 根據E1至E22中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成發生。
E24. 根據E1至E23中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約4倍發生。
E25. 根據E1至E24中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH1連接於第一可變重鏈結構域(VH)，且該第一CL連接於第一可變輕鏈結構域(VL)，且該第二CH1連接於第二VH，且該第二CL連接於第二VL。
E26. 根據E1至E25中任一者之雜二聚體蛋白質，其中第一CHCL及第二CHCL之該優先形成不依賴於該等可變結構域之互補配對。
E27. 根據E1至E26中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約5倍發生。
E28. 根據E1至E27中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第 一CL構成之CHCL之形成至少約6倍發生。
E29. 根據E1至E28中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約8倍發生。
E30. 根據E1至E29中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約10倍發生。
E31. 根據E1至E30中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約15倍發生。
E32.. 根據E1至E31中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約20倍發生。
E33. 根據E1至E32中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約25倍發生。
E34. 根據E1至E33中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約30倍發生。
E35. 根據E1至E34中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約40倍發生。
E36. 根據E1至E35中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約50倍發生。
E37. 根據E1至E36中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一 CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約60倍發生。
E38. 根據E1至E37中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約80倍發生。
E39. 根據E1至E38中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約90倍發生。
E40. 根據E1至E39中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約100倍發生。
E41. 根據E25至E39中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之該優先形成在該等可變結構域中不存在任何互補配對下發生。
E42. 根據E25至E41中任一者之雜二聚體蛋白質，其中組合在一起之該第一VH、第一VL、第一CH及第一CL形成第一Fab，且組合在一起之該第二VH、第二VL、第二CH1及第二CL形成第二Fab。
E43. 根據E42之雜二聚體蛋白質，其中第一Fab及第二Fab之該優先形成不依賴於該等可變結構域之互補配對。
E44. 根據E42至E43中任一者之雜二聚體蛋白質，其中第一Fab及第二Fab之該優先形成在該等可變結構域中不存在任何互補配對下發生。
E44. 根據E1至E43中任一者之雜二聚體蛋白質，其中第一CHCL及第二CHCL之該優先形成依賴於該等互補殘基組之互補配對。
E45. 根據E1至E46中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該等CL結構域中之至少一者為κ結構域。
E46. 根據E1至E45中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CL與該第二CL均為κ結構域。
E47. 根據E1至E46中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該等互補殘基組在一個結構域中包含帶正電或帶負電殘基，且在另一個結構域中包含極性殘基或帶相反電荷之殘基。
E48. 根據E1至E47中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該等互補殘基組之位置係選自由以下組成之群： 根據Kabat編號，CH1-124及CL-176；(ii)CH1-188及CL-178；(iii)CH1-143及CL-178；(iv)CH1-143及CL-131；(v)CH1-221及CL-123；(vi)CH1-145及CL-131；(vii)CH1-179及CL-131；(viii)CH1-186及CL-131；及(ix)CH1-188及CL-133。
E49. 根據E48之雜二聚體蛋白質，其中在該CH1位置之突變係選自由W、H、K、R、S及T組成之群，且在該CL位置之突變係選自由S、M、D及E組成之群。
E50. 根據E49之雜二聚體蛋白質，其中在該CH1位置之突變係選自由E及D組成之群，且在該CL位置之突變係選自由H、K及R組成之群。
E51. 根據E49至E50中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該等互補殘基組進一步包含一或多個選自由以下組成之群的突變：CH1-143D、CH1-145S、CH1-186A、CH1-186E、CH1-188G、CH1-143S、CH1-190S、CH1-190I、CL-133S、CL-135I、CL-176G、CL-176M及CL-178G、CL-178S。
E52. 根據E1至E51中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一及第二互補殘基組係選自以下之群中的兩者：CH1-124K、CL-176D、CH1-190S、CL-133S；(ii)CH1-124K、CL-176D、CL-133S；(iii)CH1-124E、CL-176K；(iv)CH1-124E、CL-176K、CH1-188G；(v)CH1- 188E、CL-178K、CH1-143E；(vi)CH1-188K、CL-178D、CH1-143D；(vii)CH1-143K、CL-178D；(viii)CH1-143D、CL-178R；(ix)CH1-143K、CL-178D；(x)CH1-143D、CL-178K；(xi)CH1-143D、CL-178K、CL-176M；(xii)CH1-143E、CL-131R；(xiii)CH1-143R、CL-131E；(xiv)CH1-143R、CL-131E、CH1-186A；(xv)CH1-221D、CL-123K；(xvi)CH1-221D、CL-123K、CH1-190I、CL-135I；(xvii)CH1-145E、CL-131H；(xviii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H；(xix)CH1-145E、CL-131H；(xx)CH1-186E、CL-131H、CH1-145S；(xxi)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S；(xxii)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-176G、CL-178G；(xxiii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H、CH-190I、CL-135I、(xxiv)CH-186E、CL-131H、CH-145S；(xxv)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-176C；(xxvi)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-178G、CL-176G；(xxvii)CH1-143S、CH1-188W、CL-131D。
E53. 根據E1至E52中任一者之雜二聚體蛋白質，其在該第一CH1與該第一CL及或該第二CH1與該第二CL之間包含經工程改造之二硫鍵。
E54. 根據E53之雜二聚體蛋白質，其中該經工程改造之二硫鍵位於一或多個以下位置：(i)CH1-122及CL-123；(ii)CH1-139及CL-116；及(iii)CH1-174及CL-176。
E55. 根據E53至E54中任一者之雜二聚體蛋白質，其中已藉由在該第一CHCL及/或第二CHCL上使CH1-C230及CL-214中之一或兩者突變成除C外之任何殘基來移除野生型二硫鍵。
E56. 根據E55之雜二聚體蛋白質，其中該第一及/或第二CH1-C230及第一及/或第二CL-C214突變成S。
E57. 根據E1至E56中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL包含來自以下之群之一的殘基：(i)CH1-124K、CL-176D、CH1-190S、CL-133S；(ii)CH1-124K、CL-176D、CL-133S；(iii)CH1-124E、CL-176K、CL-133S；(iv)CH1-124E、CL-176K、CH1-188G、CL-133S；(v)CH1-188E、CL-178K、CH1-143E；(vi)CH1-188K、CL-178D、CH1-143D；(vii)CH1-143K、CL-178D；(viii)CH1-143D、CL-178R；(ix)CH1-143K、CL-178D；(x)CH1-143D、CL-178K；(xi)CH1-143D、CL-178K、CL-176M；(xii)CH1-143E、CL-131R；(xiii)CH1-143R、CL-131E；(xiv)CH1-143R、CL-131E、CH1-186A；(xv)CH1-221D、CL-123K；(xvi)CH1-221D、CL-123K、CH1-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xvii)CH1-145E、CL-131H；(xviii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H；(xix)CH1-122C、CH1-145E、CH1-230S、CL-123C、CL-131H、CL-214S；(xx)CH1-186E、CL-131H、CH1-145S；(xxi)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S；(xxii)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-176G、CL-178G；(xxiii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H、CH-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xxiv)CH-186E、CL-131H、CH-145S、CH1-139C、CH1-230S、CL-116C、CL-214S；(xxv)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xxvi)CH1-143S、CH1-188W、CH1-122C、CH1-230S、CL-133M、CL-178G、CL-176G、CL-123C、CL-214S；(xxvii)CH1-143S、CH1-188W、CH1-122C、CH1-139C、CH1-174C、CH1-230S、CL-133S、CL-178S、CL-131D、CL-116C、CL-123C、CL-176C、CL-214S。
E58. 根據E57之雜二聚體蛋白質，其中該第二CHCL包含來自群 i-xxvii之一的殘基，限制條件為該第一及第二CHCL兩者不包含來自同一群之殘基。
E59. 根據E1至E58中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH1連接於第一CH2結構域(CH2)，該第一CH2結構域連接於第一CH3結構域(CH3)，且該第二CH1連接於第二CH2，該第二CH2連接於第二CH3。
E60. 根據E59之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH3及第二CH3分別包含第一CH3突變殘基及第二CH3突變殘基，該第一CH3突變殘基及第二CH3突變殘基經工程改造以彼此不同，且優先彼此相互作用且從而優先於CH3均二聚體之形成，形成CH3雜二聚體。
E61. 根據E1至E60中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH1連接於第一可變重鏈結構域(VH)，且該第一CL連接於第一可變輕鏈結構域(VL)，且該第二CH1連接於第二VH，且該第二CL連接於第二VL，且其中該第一VH包含VH-Q39及VH-Q105。
E62. 根據E1至E61中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH1連接於第一可變重鏈結構域(VH)，且該第一CL連接於第一可變輕鏈結構域(VL)，且該第二CH1連接於第二VH，且該第二CL連接於第二VL，且其中該第二VH包含VH-Q39及VH-Q105。
E63. 根據E1至E62中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH1連接於第一可變重鏈結構域(VH)，且該第一CL連接於第一可變輕鏈結構域(VL)，且該第二CH1連接於第二VH，且該第二CL連接於第二VL，且其中該第一VL包含：(i)VL-Q38；及(ii)VL-Q1、VL-S1、VL-D1、VL-E1、VL-A1或VL-N1之一；及(iii)VL-T42、VL-Q42或VL-K42之一。
E64. 根據E1至E63中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH1連接於第一可變重鏈結構域(VH)，且該第一CL連接於第一可變輕 鏈結構域(VL)，且該第二CH1連接於第二VH，且該第二CL連接於第二VL，且其中該第二VL包含：(i)VL-Q38；及(ii)VL-Q1、VL-S1、VL-D1、VL-E1、VL-A1或VL-N1之一；及(iii)VL-T42、VL-Q42或VL-K42之一。
E65. 根據E1至E64中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL包含CH1-124K、CL-176D、CH1-190S及CL-133S。
E66. 根據E1至E65中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第二CHCL包含CH1-124E、CL-176K、CH1-188G及CL-133S。
E67. 根據E1至E66中任一者之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL包含CH1-124K、CL-176D、CH1-190S及CL-133S，且該第二CHCL包含CH1-124E、CL-176K、CH1-188G及CL-133S。
E68. 一種雙特異性抗體，其包含如E1至E67中任一者之雜二聚體蛋白質。
E69. 如E66中所述之雙特異性抗體，其中該第一CHCL包含CH1-124K、CL-176D、CH1-190S及CL-133S。
E70. 如E68至E69中任一者中所述之雙特異性抗體，其中該第二CHCL包含CH1-124E、CL-176K、CH1-188G及CL-133S。
E71. 如E68至E70中任一者中所述之雙特異性抗體，其中該第一CHCL包含CH1-124K、CL-176D、CH1-190S及CL-133S，且該第二CHCL包含CH1-124E、CL-176K、CH1-188G及CL-133S。
E72. 一種核酸，其編碼根據E1至E65中任一者之雜二聚體蛋白質或根據E68至E71中任一者之雙特異性抗體。
E73. 一種載體，其包含根據E72之核酸。
E74. 一種細胞，其包含根據E72之核酸或包含根據E71之載體。
E75. 一種製備根據E1至E67中任一者之雜二聚體蛋白質的方法，其包含：(i)將細胞株與一或多種載體共轉染以表現該第一CHCL 之該第一CH1、該第一CL以及該第二CHCL之該第二CH1及該第二CL；(ii)在表現該一或多種載體且允許該第一CHCL及第二CHCL組裝之條件下培養該細胞株；及(iii)自該細胞培養物純化該雜二聚體蛋白質。
E76. E75之方法，其中該細胞株與以1：1：1：1比率表現該第一CH1、第一CL、第二CH1及第二CL之載體共轉染。
圖1描繪由嘗試經由2個不同抗體輕鏈與2個不同抗體重鏈共表現產生雙特異性抗體所得到之潛在產物，其中CH3界面使用已確定之技術工程改造以促進雜二聚體形成，但重鏈/輕鏈界面不含本發明之突變。LC1與HC1配對提供結合一種抗原決定基之Fab臂，且LC2與HC2配對提供結合可能在不同抗原上之不同抗原決定基之Fab臂。LC1與HC2配對或LC2與HC1配對產生減少或不與彼等抗原決定基結合之Fab。A：代表性雙特異性抗體之正確配對，展示在左臂上，經由第一CHCL之優先形成(由第一互補殘基組之相互作用促進，由實心及空心圓描繪)的第一VH與第一VL(分別由重鏈垂直條帶及輕鏈垂直短劃線表示)之組合，且在右臂上，經由第二CHCL之優先形成(藉由第二互補殘基組之相互作用促進，由實心及空心三角形描繪)的第二VH與第二VL(分別由重鏈對角影線及輕鏈格子圖案表示)之組合。B：雙特異性抗體之不正確配對，展示左臂上，經由第三CHCL之形成的第一VH與第二VL(分別由重鏈垂直條帶及輕鏈格子圖案表示)之組合，且右臂上，經由第四CHCL之形成的第二VH與第一VL(分別由重鏈對角影線及輕鏈垂直短劃線表示)之組合。C及D各展示半功能雙特異性抗體，其中左臂或右臂正確配對，且另一個不正確配對。
圖2描繪野生型人類IgG1 CH1(組A)、κCL(組B)及λCL結構域之序列。胺基酸殘基根據Kabat編號方案編號。虛線(「-」)指示僅在不同類型抗體結構域中或不同物種中佔據之胺基酸位置。
圖3描繪如表1中所詳述，分別對於純系Cys1、Cys3a、Cys3b及Cys6，具有天然二硫橋鍵(A)、無二硫橋鍵(B)或在新穎位置具有二硫橋鍵(C-F)之野生型29D7單株IgG1抗體的非還原及還原SDS-PAGE分析。M：分子量標記物。
圖4描繪具有經工程改造之二硫鍵之構築體的質譜分析。A圖：純系Cys_β，移除野生型二硫鍵之構築體；B圖：純系Cys_1；C圖：純系Cys_3a；D圖：純系Cys_3b；E圖：純系Cys_6。
圖5描繪參與設計S1之界面區域之x射線晶體結構。在各圖中，CH1結構域以深灰色展示在頂部，其中關鍵殘基以球形及棒形呈現。CL結構域以淡灰色展示在底部，其中關鍵殘基以管形呈現。關鍵相互作用由點線指示，距離以埃計。A圖：在包含IgG1 CH1及κ CL之天然Fab臂中關鍵殘基CH1-124及CL-S176，以及支持殘基CL-V133、CH1-S188及CH1-V190之取向。B圖：用於標準雙臂抗體之一個Fab臂中的設計，具有突變CH1-L124K、CL-S176D、CL-V133S及CH1-V190S。C圖：用於標準雙臂抗體之另一個Fab臂中的設計，具有突變CH1-L124E、CL-S176K、CL-V133S及CH1-S188G。不希望受任何特定理論束縛，當B及C中展示之突變引入抗體之兩個Fab臂每一者中時，Lys/Lys或Asp/Glu電荷排斥力將抵制重鏈/輕鏈錯配，及/或Lys/Asp或Lys/Glu電荷吸引力將促進正確配對。A圖描繪PDB條目3QQ9，而B圖及C為未公開之晶體結構。
圖6描繪如實例4中所述，在兩個Fab臂之CH1/CL-κ界面包含經工程改造之有利靜電相互作用的雜二聚體雙特異性抗體Ab1/Ab2(A圖)及具有天然CH1/CL-κ界面之對照Ab1/Ab2構築體(B圖)之質譜分析之結果。新穎的靜電相互作用突變使得分離之Fab片段中不正確配對輕鏈顯著減少。圖解：*潛在不完全前導序列加工；^輕鏈中具有轉譯後修飾之正確配對(H與L鏈)之Ab2 Fab臂。
圖7A及7B描繪雙特異性抗體Ab1/Ab2 Fc結構域(A圖)及含有HC雜二聚突變但無Fab臂CH/CL界面突變之對照Ab1/Ab2的質譜分析。在兩種情況下，偵測到Fc(由來自Ab 1及2之重鏈組成)之預期分子量，同時未偵測到重鏈均二聚體。
圖8描繪展示使用陰離子交換層析法分離雙特異性抗體Ab1/Ab2之結果的圖。陰離子交換層析法用於評估在蛋白A及製備型SEC層析法之後雙特異性Ab1/Ab2抗體製劑內之蛋白質非均質性。親本抗體Ab1及Ab2之分析分別在圖A(i)及圖A(ii)中展示。親本Ab1顯示明顯單峰。親本Ab2展示分別在主峰前後溶離之一群酸性及鹼性帶電物質。雜二聚體雙特異性Ab1/Ab2抗體在B圖中展示。藉由質譜分析來分析來自雙特異性Ab1/Ab2抗體之峰1、峰2A及峰2B之溶離份(B圖)。
圖9描繪展示來自離子交換分級分離之雜二聚體雙特異性抗體Ab1/Ab2的Fab組分之質譜分析的圖(圖8B的衍生圖)。圖9A展示來自圖8B之峰2B含有在各Fab臂中具有正確配對輕鏈但在Ab2 Fab臂中具有轉譯後修飾之富集雙特異性Ab1/Ab2。圖9B展示來自圖8B之峰2A具有富集之不正確輕鏈配對(抗體1重鏈組合抗體2輕鏈)，圖9C展示來自圖8B之峰1。此峰僅僅表示不具有轉譯後修飾之正確配對之雙特異性Ab1/Ab2 Fab臂。圖解：*潛在不完全前導序列加工；^具有轉譯後修飾之Ab2 Fab。
圖10A及10B描繪展示構築體C5×Ab3-M1及C5×Ab3-M1-陰性之雙臂Fab片段之質譜分析的圖。與C5×Ab3-M1-陰性相比，在構築體C5×Ab3-M1中觀測到C5與Ab3之間不正確配對輕鏈顯著減少。圖解：*潛在不完全前導序列加工。
圖11描繪展示構築體C5×Ab3-M2(圖11B)及C5×Ab3-M2-陰性(圖11A)之雙臂Fab片段之質譜分析的圖。與C5×Ab3-M2-陰性相比，在構築體C5×Ab3-M2中觀測到C5與Ab3之間不正確配對輕鏈顯著減少。圖 解：*潛在不完全前導序列加工。
圖12描繪展示使用疏水相互作用層析法分離雙特異性抗體之圖。分別在圖12A(1)及圖12A(2)中展示之親本抗體Ab3及C5各自顯示明顯單峰。雜二聚方法M1在圖12C中展示且雜二聚方法M2在圖12B中展示。圖12B(1)及12C(1)之左側層析圖展示併入單獨重鏈雜二聚突變。右側(圖12B(2)及12C(2))層析圖展示含有實例5中描述之重鏈與輕鏈突變之雙特異性抗體。此等結果證實與僅僅包含CH3/CH3突變之雙特異性(例如「陰性」)相比，在併入CH1與CL-κ突變以正確輕鏈配對及CH3突變下產生之抗體之非均質性的減少。
圖13描繪CH1結構域與CL結構域(來自PDB條目3QQ9)之間的界面區域。視圖沿結構域之間的相互作用邊緣，其中CH1呈深灰色在左邊，且CL呈淡灰色在右邊。
圖14描繪CH1結構域與CL結構域(來自PDB條目3QQ9)之間的界面區域，其中繪製式樣類似於圖13。此視圖突出與CL相互作用之CH1之區域(相互作用殘基之主鏈原子以球及棒呈現)。主要Ig摺疊β股區域自N端至C端編號為1至7。
圖15描繪CH1結構域與CL結構域(來自PDB條目3QQ9)之間的界面區域，其中繪製式樣類似於圖13。此視圖突出與CH1相互作用之CL之區域(相互作用殘基之主鏈原子以球及棒呈現)。主要Ig摺疊β股區域自N端至C端編號為1至7。
圖16描繪PDB條目3QQ9之CH1與CL結構域之間的大部分內埋之溶劑化袋。使用淡灰色帶展示之輕鏈主鏈在視圖前，其中深灰色重鏈主鏈帶更多在背面。界定此袋之關鍵水分子展示為球體。
圖17描繪展示經設計以展示S1及S1_rev突變子集之影響的雙臂Fab片段之質譜分析的圖。A及B圖展示不具有CH1/CL突變之初始單特異性抗體。組合兩種親本抗體之雙特異性抗體在不存在S1及S1_rev突 變下具有顯著錯配(C圖)，但當使用S1及S1_rev時幾乎消除錯配(D圖)。使用S1及S1_rev突變之各種子集產生相對於C圖，錯配減少，但保真度仍然低於用於D圖中之完整S1及S1_rev設計的抗體(E及F圖)。對應於錯配Fab之峰標記為「Ab3H C5L」及「C5H Ab3L」，而正確配對標記為「C5 Fab」及「Ab3 Fab」。
圖18描繪展示使用疏水性層析法分離雙特異性抗體之圖。A圖中，C5與Ab3抗體組合成僅僅併入用於重鏈雜二聚之CH3突變，但在重鏈/輕鏈界面中無促進雙特異性之突變的雙特異性抗體。存在三個主要峰，指示非均質樣品。B圖中，S1及S1 rev設計添加至重鏈/輕鏈界面中以抵制錯誤重鏈及輕鏈之錯配；樣品均質性得到大大改善。若不利用S1及S1_rev設計之一些二級支持突變(圖C及D)，則樣品具有中間程度之非均質性。圖E及F為對照，展示在用於組裝圖A-D之雙特異性抗體的兩個抗體之單特異性型式下所觀測到之均質性程度。
圖19A至19I描繪在各Fab臂中具有如表23中所述之突變各種組合之雙特異性Fab的差示掃描熱量測定(DSC)曲線。實心粗線表明原始數據，而細點線表明適當時原始數據與二轉變或三轉變模型擬合之結果。如表24中概述，所有Fab均展示其最低轉變在65℃以上之優良穩定性。
圖20描繪在各Fab臂中具有如表23中所列舉之設計各種組合之雙臂Fab片段的質譜分析。Ab3 Fab臂中具有S1且C5 Fab臂中具有T1、T2、T3、T4或T9任一者之雙特異性抗體顯示重鏈/輕鏈配對之高保真度(圖A-E)。在一個Fab臂中S1與另一個Fab臂中S1_rev組合之樣品中偵測到少量錯配(約3%)(圖F，錯配標記為「C5 H Ab3 L」)。若一個Fab臂(圖G-H)或兩個Fab臂(圖I)不含有促進雙特異性之設計，則偵測到更大量之錯配Fab(19%或更高)。
圖21描繪使用疏水相互作用層析法分離雙特異性抗體。抗體在 表23中列舉。Ab3 Fab臂中具有S1及C5 Fab臂中具有T1、T2、T3、T4或T9任一者之雙特異性抗體顯示高保真度重鏈/輕鏈配對(圖A-E)。少量錯配呈現為主峰左側上之小尾部。對於Ab3上之S1與C5上S1_rev配對，峰上之此尾部略微更大(圖F，參見箭頭)。此等結果符合實例41及圖20之質譜分析。若一個Fab臂(圖G-H)或兩個Fab臂(圖I)不含促進雙特異性之設計，則偵測到更大量之錯配Fab，如存在額外峰所指示。用於參考，圖J-K展示此等雙特異性設計所基於之單特異性Ab3及C5抗體之對應型態。
圖22描繪根據本發明之雙特異性抗體。結構域標記如下：1-VL：第一可變輕鏈結構域；1-VH：第一可變輕鏈結構域。1-CL：第一恆定輕鏈結構域。1-CH1：第一恆定重鏈1結構域。1-CH2：第一恆定重鏈2結構域。1-CH3：第一恆定重鏈3結構域。2-VL：第二可變輕鏈結構域；2-VH：第二可變輕鏈結構域。2-CL：第二恆定輕鏈結構域。2-CH1：第二恆定重鏈1結構域。2-CH2：第二恆定重鏈2結構域。2-CH3：第二恆定重鏈3結構域。第一CHCL及第二CHCL結構域指示在大括號之間(分別為1-CHCL及2-CHCL)且涵蓋相應CL及CH結構域。加點的卵形線捕捉構成第一及第二Fab(分別為1-Fab及2-Fab)之四個結構域(VL、VH、CL、CH1)。第一CHCL界面及第二CHCL界面以砌磚圖案化。CL及CH1結構域中之突變殘基由實心及空心圓及三角形表示(實心及空心圓組代表第一Fab之互補殘基組且實心及空心三角形組代表第二Fab之互補殘基組)。第一CH3及第二CH3結構域之『杵臼』配對由箭頭及環表示。
此圖進一步展示本發明避免之兩個半功能及一個非功能置換。亦即，與本文及圖1A中展示之促進配對相比，本發明降低第一CH1(1-CH1)與第二CH(2-CL)締合形成CHCL(圖1B，左臂)的概率。類似地，本發明降低第四CHCL(包含第二2-CH1及1-CL)形成之可能性，如 圖1C(右臂)所示。同樣，本發明減少在一個臂中包含第三CHCL及在另一個臂中包含第四CHCL之非功能抗體之形成(例如圖1B)。
圖23：嵌合TOA-1抗體結合人類TrkB
圖24：嵌合TOA-1抗體結合小鼠TrkB
圖25：人類化TOA-1變異體與生物素標記之嵌合TOA-1競爭結合於人類TrkB
圖26：人類化TOA-1變異體與生物素標記之嵌合TOA-1競爭結合於人類TrkB
圖27：人類化TOA-1變異體與生物素標記之嵌合TOA-1競爭結合於人類TrkB
圖28：相對於親本TOA-1抗體，人類化TOA-1型式1.0/1.4完全保留人類TrkB結合特性
圖29：抗-TrkB TOA-1抗體之促效活性
圖30：人類化TOA-1活化TrkB信號級聯
圖31：hTrkB重疊上之TOA-1及BDNF結合位點
圖32：TOA-1結合於嵌合TrkB-TrkA受體
圖33：抗-TrkB抗體結合於小鼠、貓及犬TrkB
圖34：TOA-1抗體不結合於TrkA或TrkC
圖35：人類化TOA-1不結合於p75
圖36：人類化TOA-1不結合於p75
圖37：TOA-1不活化TrkA或TrkC信號傳導級聯
圖38. TAM-163活化hTrkB細胞中之Cre-螢光素酶報導基因
圖39. TAM-163不活化hTrkA-Cre及hTrkC-Cre細胞中之Cre-螢光素酶報導基因
圖40. 在SHC1募集分析中TAM-163活化hTrkB，但不活化hTrkA或hTrkC
圖41. TAM-163活化hTrkB-Cre細胞中之TrkB依賴性磷酸化事件
圖42. TAM-163不活化hTrkA-Cre或hTrkC-Cre細胞中之Trk依賴性磷酸化事件
圖43. TAM-163活化人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中之Trk依賴性磷酸化事件
圖44. TAM-163誘發hTrkB-Cre及人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中TrkB之內化
圖45. TAM-163誘發hTrkB-Cre及人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中TrkB之降解
圖46. TAM-163不結合於人類p75NTR-FACS分析
圖47. TAM-163不結合基於人類p75NTR細胞之ELISA
圖48. TAM-163以高親和性結合於小鼠、犬及貓TrkB
圖49. TAM-163活化經小鼠TrkB轉染之細胞中之TrkB依賴性信號傳導
圖50. TAM-163活化經犬TrkB轉染之細胞中之TrkB依賴性信號傳導
在一些態樣中，本發明係關於一種雜二聚體蛋白質，其包含：(i)第一CH1結構域(CH1)及第一CL結構域(CL)，該第一CH1與該第一CL在第一CHCL界面相互作用在一起以形成第一CHCL結構域(CHCL)；(ii)第二CH1結構域(CH1)及第二CL結構域(CL)，該第二CH1與該第二CL在第二CHCL界面相互作用在一起以形成第二CHCL；其中該第一CH1經工程改造以與該第二CH1之不同之處在於該第一CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該第一CL經工程改造以與該第二CL之不同之處在於該第一CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第一CHCL之該CH1突變殘基與該 CL突變殘基優先於該第二CHCL上之對應殘基位置彼此相互作用，該第一CH1及第一CL之該等相互作用突變殘基由此形成第一互補殘基組。
在一些態樣中，該第二CH1經工程改造以與該第一CH1之不同之處在於該第二CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該第二CL經工程改造以與該第一CL之不同之處在於該第二CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第二CHCL之該CH1突變殘基與該CL突變殘基優先於該第一CHCL上之對應殘基位置彼此相互作用，該第二CH1及第二CL之該等相互作用突變殘基由此形成第二互補殘基組。
第一CH1可經工程改造以不同於野生型CH1。第二CH1可經工程改造以不同於野生型CH1。第一CL可經工程改造以不同於野生型CL。第二CL可經工程改造以不同於野生型CL。
第一CH1可包含至少一個經工程改造以不同於第二CH1上對應位置之CH1突變殘基。第一CL可包含至少一個經工程改造以不同於第二CL上對應位置之CL突變殘基。第二CH1可包含至少一個經工程改造以不同於第一CH1上對應位置之CH1突變殘基。第二CL可包含至少一個經工程改造以不同於第一CL上對應位置之CL突變殘基。
在本發明之一些態樣中，第一互補殘基組之突變殘基之身分不同於第二互補殘基組之突變殘基之身分。在一些態樣中，第一互補殘基組之突變殘基之位置不同於第二互補殘基組之突變殘基之位置(如本文所描述，根據Kabat編號之位置)。在本發明之一些態樣中，第一互補殘基組之突變殘基之身分及位置不同於第二互補殘基組之突變殘基之身分及位置。
雜二聚體之優先形成
在第二CHCL中提供第二互補殘基組進一步降低結構域之錯配風險。當不同結構域之工程改造突變之間幾乎不存在重疊時此策略可更 有效。在一些態樣中，第一CHCL之第一互補殘基組位於與第二CHCL之第二互補殘基組之位置不同的位置。
相應地，在本發明之一些態樣中，第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由第一CH1及第二CL(下文中稱為第三CHCL)或第二CH1及第一CL(下文中稱為第四CHCL)構成的CHCL之形成發生。
圖1A及圖22說明正確配對抗體(包含第一CHCL及第二CHCL)。亦描繪不恰當配對之結構域：第三CHCL(包含第一CH1及第二CL)展示為圖1B及1D之左臂，且第四CHCL(包含第二CH1及第一CL)展示為圖1B及1C之右臂。類似地，圖22之右手及左手輕鏈切換將產生包含第三CHCL及第四CHCL之非功能抗體。
有利地，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約4倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約5倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約6倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約7倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約8倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約9倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約10倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約12倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約15倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約20倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約25倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之 形成至少約30倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約35倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約40倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約50倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約60倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約70倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約75倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約80倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約85倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約90倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約95倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約99倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約100倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約200倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約500倍發生。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成至少約1000倍發生。
在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約4至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約5至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三 及第四CHCL之形成發生，比率為至少約6至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約7至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約8至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約9至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約10至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約12至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約15至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約20至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約25至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約30至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約35至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約40至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約45至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約50至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約55至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約60至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約65至約1。在一些態樣中，該第一 及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約70至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約75至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約80至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約85至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約90至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約95至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約99至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約100至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約200至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約500至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約1000至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約2000至約1。在一些態樣中，該第一及第二CHCL之形成優先於該第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約5000至約1。
相對於『不正確』輕鏈配對(亦即形成之第三及第四CHCL)『正確』雜二聚體輕鏈配對(亦即形成之第一及第二CHCL)之程度可藉由液相層析質譜分析(LCMS)量測。雙特異性抗體製劑可藉由蛋白A層析法及製備型尺寸排阻層析來純化以移除任何聚集物，或用LysC酶消化低分子量組分以釋放呈獨立片段形式之各Fab臂及Fc(總共3個片段)。接 著LCMS可用於量測各Fab臂及Fc之經驗質量，且所獲得之值與兩個可能正確之Fab臂及兩個可能不正確之Fab臂的理論質量相比，且對於Fc，進行均二聚體與雜二聚體Fc之理論質量比較。各片段之信號強度可轉化成超過背景雜訊的偵測之所有片段總強度之%，允許正確Fab產物與不正確Fab產物進行比率比較。在另一個方法中，蛋白A後雙特異性抗體製劑溶離物可使用離子交換或HIC層析法分級分離，且使用LCMS鑑別所溶離之溶離份。隨後鑑別之峰分配來自與層析步驟相關之A280量測值的AUC %。離子交換層析法或疏水相互作用層析法係基於差別電荷或疏水性特性將含有正確及不正確輕鏈配對之雙特異性IgG分級分離。來自所得A280層析圖之曲線下面積%可用於定量正確產物之量。
溶劑可及表面積
當非野生型人類殘基(諸如本文中之互補殘基組；參見以下)引入意欲投與人類患者之抗體中時，存在人類免疫系統將經修飾之殘基識別為外來物且對治療劑產生抗體(抗藥物抗體或ADA反應，其可導致清除更快、循環治療劑之活性降低或兩者)的風險。為由ADA識別，治療抗體之非人類殘基必須為ADA可及。將預期最小化ADA可及表面積以降低ADA與治療抗體相互作用之能力。
在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於225Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於225Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於220Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於220Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於150Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於150Å2。在一些態樣中，如使 用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於120Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於120Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於100Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於100Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於80Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於80Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於50Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於50Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於40Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於40Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於30Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於30Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於20Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於20Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於10Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於10Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於5Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於5Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於2Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於2Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面 積小於1Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於1Å2。
在一些態樣中，使用Maestro 9.6、9.7或9.9(Schrodinger，LLC.)中之表面積演算法量測溶劑可及表面積。解析度可為0.3。較佳地，如使用2.5Å探針在高解析度(例如0.3之解析度)下使用Maestro 9.6、9.7或9.9(Schrodinger，LLC.)中之表面積演算法量測，第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於50Å2。
在此項技術中熟知單側鏈之突變可提高抗體結合效能一個或多個數量級。舉例而言，已知可及表面積為約90Å2之His/Tyr取代引起貝伐單抗(bevacizumab)結合改善超過10倍(J.Chem.Inf.Model.53(11),2937-50(2013))。然而，在此項技術中熟知即使更小表面改變亦可具有類似作用。丙胺酸側鏈具有約20Å2之可及表面積。突變成丙胺酸可足夠改變兩個蛋白質之間的結合親和力超過一個數量級。例如參見Mabs 3(5),479-486(2011)。因此，小的突變表面積可足夠允許免疫系統產生識別經工程改造之生物治療抗體，同時對結合天然人類抗體具有顯著選擇性之抗藥物抗體(ADA)。
溶劑可及表面積(SASA)為溶劑(通常水)可及生物分子之表面。SASA可藉由使用Shrake及Rupley於1973年研發之『滾球』演算法計算，其模擬接近溶劑分子尺寸之球體以『探測』分子之表面。球體半徑之典型值為1.4Å，因為此對應於水分子之近似半徑。然而，當考慮晶體結構中固有之原子位置中之實驗不確定性時，或若討論接近生物分子表面之分子實體大於水分子(例如潛在宿主之免疫系統的生物分子)，則更大值(諸如2.5Å，如本文中所使用)可為適當的。
本發明之一個態樣為提供一種經由在CH1及CL結構域中使用經工程改造之突變來產生及維持雙特異性異質抗體或其Fab片段的方法。然而，用於活體內使用之非典型殘基引入抗體中有引發宿主免疫反應 之風險。因此，宜將抗體或其Fab片段之引入或經工程改造之殘基可引發宿主免疫反應的程度降至最低。因此，如使用2.5Å探針量測，本發明之一些態樣的互補殘基組之溶劑可及表面積小於50Å2。
在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於45Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於40Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於35Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於30Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於25Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於20Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於15Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於10Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於9Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於8Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於7Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於6Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於5Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於4Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於3Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於2Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於1Å2。在一些態樣 中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積小於0.5Å2。在一些態樣中，如使用2.5Å探針量測，本發明之互補殘基組之溶劑可及表面積為約0Å2。
可變結構域
在一些態樣中，第一CH1連接於第一可變重鏈結構域(VH)，且第一CL連接於第一可變輕鏈結構域(VL)，且第二CH1連接於第二VH，且第二CL連接於第二VL。當組合時，第一VH、第一VL、第一CH1及第一CL形成第一Fab。當組合時，第二VH、第二VL、第二CH1及第二CL形成第二Fab。
在一些態樣中，第一VH連接於第一CH1，第一CH1又連接於第一CH2，第一CH2又連接於第一CH3，由此形成第一重鏈。在一些態樣中，第二VH連接於第二CH1，第二CH1又連接於第二CH2，第二CH2又連接於第二CH3，由此形成第二重鏈。
在一些態樣中，第一VL連接於第一CL，由此形成第一輕鏈。在一些態樣中，第二VL連接於第二CL，由此形成第二輕鏈。
在一些態樣中，本發明提供第一Fab及第二Fab之優先形成，其不依賴於可變結構域之互補配對。
在雜二聚體蛋白質結構域相互作用之優先形成論述為不依賴於可變結構域之互補殘基配對的情況下，此意指例如第一CH1及第一CL結構域之互補配對足夠實現第一CHCL(或第一Fab)之優先形成。可變或恆定結構域中之一或多者中的其他工程改造殘基可提供累加效應以增加所需結構域配對之優先形成的保真度。
在一些態樣中，第一CHCL之優先形成需要第一互補殘基組。在一些態樣中，第一Fab之優先形成需要第一互補殘基組。在一些態樣中，第二CHCL之優先形成需要第二互補殘基組。在一些態樣中，第二Fab之優先形成需要第二互補殘基組。
在一些態樣中，第一互補殘基組足夠第一CHCL優先形成。在一些態樣中，第一互補殘基組足夠第一Fab優先形成。在一些態樣中，第二互補殘基組足夠第二CHCL優先形成。在一些態樣中，第二互補殘基組足夠第二Fab優先形成。
在一些態樣中，本發明提供不依賴於可變結構域之互補配對的第一Fab及第二Fab之優先形成，使得第一及第二CHCL之形成優先於第三及第四CHCL之形成發生，比率為至少約4至約1，且可在至少選自以下之群之值的比率下發生：4、5、6、7、8、9、10、12、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、500、1000、2000及5000至1。
存在彼此具有天然親和力之已知VL/VH對的一些情況。因此，在一些態樣中，本發明提供第一Fab及第二Fab之優先形成，其不依賴於包含形成互補殘基組之經工程改造之突變殘基的任一可變結構域。在一些態樣中，本發明之多聚體蛋白質在任一可變結構域中不包含經工程改造以增加互補配對超過未經工程改造或野生型VL/VH構架序列的突變。
藉由避免插入互補殘基組之突變殘基至可變結構域來實現多個優點。舉例而言，有時可變區宜使用不同生殖系構架。各生殖系中之序列變化為可變結構域中進行之任何突變呈現不同局部環境；在一些構架中起作用之突變可能在其他構架中不起作用(例如，可能發生表現、聚集、穩定性或其他物理特性之問題)。此外，VL/VH界面(最可能影響配對特異性之區域)中之突變靠近CDR且可以在抗體之間及構架之間不同的微妙方式影響VL與VH之相對取向。一些抗體可耐受VL/VH取向之微妙變化，但其他則不行。此外，使蛋白質表面之多個區域(可變結構域與恆定結構域)突變為患者之免疫系統提供識別抗體為外來物且經由抗藥物抗體反應(ADA)排斥其之其他機會。ADA反應 之兩種可能結果為治療劑自患者清除之速率更快，以及藥物結合其預期標靶之能力中和(Jawa等人，Clin.Immunol.149(3),534-55(2013))。在研發雙特異性抗體中，需要採取步驟將患者免疫系統發動ADA反應之概率降至最低。雖然存在一些計算模型用於預測T細胞ADA反應，但缺乏用於構形抗原決定基之準確工具。因此，在電腦模擬預測之準確性有限下，較佳將高保真度雙特異性IgG分子之修飾限制於CH1及CL結構域，而非視需要，藉由Lewis等人之方法(參見以下)使多個結構域突變。
在一些態樣中，第一VH包含VH-Q39(如DP54或DP75中)或VH-Q105(如除JH2外之人類J區段)。在一些態樣中，第二VH包含VH-Q39(如DP54或DP75中)或VH-Q105(如除JH2外之人類J區段中)。
在一些態樣中，第一VL包含以下中之一或多者：(i)VL-Q38(如DPK9或DPL16中)；及(ii)VL-Q1(如DPL7中)、VL-S1(如DPL16中)、VL-D1(如DPK9中)、VL-E1(如DPK23中)、VL-A1(如DPK3中)或VL-N1(如DPK2中)之一；及(iii)VL-T42(如DPL7中)、VL-Q42(如DPL16中)或VL-K42(如DPK9中)之一。
在一些態樣中，第二VL包含以下中之一或多者：(i)VL-Q38(如DPK9或DPL16中)；及(ii)VL-Q1(如DPL7中)、VL-S1(如DPL16中)、VL-D1(如DPK9中)、VL-E1(如DPK23中)、VL-A1(如DPK3中)或VL-N1(如DPK2中)之一；及(iii)VL-T42(如DPL7中)、VL-Q42(如DPL16中)或VL-K42(如DPK9中)之一。
在一些態樣中，第一VH包含VH-Q39(如DP54或DP75中)及VH-Q105(如除JH2外之人類J區段中)。在一些態樣中，第二VH包含VH-Q39(如DP54或DP75中)及VH-Q105(如除JH2外之人類J區段中)。在一些態樣中，第一與第二VH均包含此等殘基。
在一些態樣中，第一VL包含：(i)VL-Q38(如DPK9或DPL16中)； 及(ii)VL-Q1(如DPL7中)、VL-S1(如DPL16中)、VL-D1(如DPK9中)、VL-E1(如DPK23中)、VL-A1(如DPK3中)或VL-N1(如DPK2中)之一；及(iii)VL-T42(如DPL7中)、VL-Q42(如DPL16中)或VL-K42(如DPK9中)之一。
在一些態樣中，第二VL包含：(i)VL-Q38(如DPK9或DPL16中)；及(ii)VL-Q1(如DPL7中)、VL-S1(如DPL16中)、VL-D1(如DPK9中)、VL-E1(如DPK23中)、VL-A1(如DPK3中)或VL-N1(如DPK2中)之一；及(iii)VL-T42(如DPL7中)、VL-Q42(如DPL16中)或VL-K42(如DPK9中)之一。
在一些態樣中，第一VL與第二VL均包含以上殘基。
Lewis等人(Nat.Biotechnol.32,191-98(2014)或下文「Lewis公開案」)報導CH1、CL、VL及VH結構域中之突變，其嘗試解決輕鏈與適當重鏈配對之問題。在相關專利申請案WO2014150973中，揭示均包括可變結構域至少一個突變之雙特異性抗體。Lewis公開案陳述：「吾等方法需要將多個突變引入可變與恆定結構域之保守構架區」。作者進一步指出，憑其經驗來看，「可變結構域控制重鏈及輕鏈之特異性組裝」。其假設在蛋白質摺疊路徑期間，可變結構域可「首先識別彼此且驅動CL結構域與展開之CH1相互作用」，使得重鏈/輕鏈配對在CH1與CL相互作用前很大程度上由VH與VL之相互作用決定。該假設將解釋其觀測結果：需要可變區中之突變。
相比之下，本發明提供不需要CDR或甚至可變區其餘區域之突變，而實現高保真度鏈配對之雜二聚體蛋白質(例如雙特異性抗體)。因此，相對於此領域中之近期技術，特別Lewis及WO2014150973，本發明之雜二聚體蛋白質及雙特異性抗體出乎意料且提供顯著有益的優點。
如此項技術中已知，抗體與其抗原之間的相互作用主要由CDR環 驅動。雖然並非所有CDR環均參與所有抗原之抗原結合，但當設計一種將抗體工程改造以嘗試及實現高保真度雙特異性鏈配對之方法時，CDR及可變區內之位置的突變為一個缺點，因為存在負面影響抗體結合親和力之風險。對於涉及同時產生多個Fab序列(或雙特異性IgG)而非單一Fab的情況，WO2014150973之各種實施例均設想使如藉由Kabat所界定之重鏈CDR2區突變(「作為根據Kabat之HFR3第一個殘基上游之四個胺基酸的殘基」突變成麩胺酸，其中HFR3係指重鏈構架3)。本發明之雜二聚體蛋白質及雙特異性抗體不涉及CDR之修飾，且因此避免此風險。此外，輕鏈可變區之位置1(根據WO2014/150973A1之申請專利範圍，其在四鏈混合物產生期間突變成Arg)靠近CDR1及CDR3環，此意指此位置之突變亦可影響對一些抗原之結合親和力。在Lewis公開案中描述之晶體結構PDB條目4LLY中，位置1之側鏈超出Cβ無序，但主鏈原子在CDR L1 5Å內及CDR L3 6Å內，且Cβ面對含有大部分CDR殘基之Fab(亦即預期抗原結合處)取向。相比之下，本發明之雜二聚體蛋白質及雙特異性抗體不涉及此位置或可變結構域中之任何其他位置之突變，因此避免當突變鄰近構架殘基時存在的干擾CDR定位及/或抗原結合之風險。
原則上，促進雜二聚體之突變可包括於重鏈與輕鏈之間的任一主要界面區中，其為CH1與CL結構域之間的界面及可變重鏈與可變輕鏈結構域之間的界面。然而，如以上部分所指出，CH1/CL界面中之突變對於研發穩固雙特異性平台而言極佳。可變結構域界面中之突變可影響CDR環之構形：因為CDR環形成可變結構域界面一部分，在可變結構域中進行突變下其可相互作用(直接相互作用或經由鄰近殘基間接相互作用)。若與雜二聚體增強突變之此類相互作用以影響抗體親和力之方式改變CDR環構形，則將證明此等雜二聚體突變並非在大量抗體中可靠使用之優良候選物。
此外，已知兩個可變結構域之相對取向在所有抗體中並非恆定的；在抗體之間，兩個結構域之間的角度可變化至少30度(Abhinandan及Martin,Protein Eng Des Sel.23(9),689-97,(2010))。此等改變必然改變可變結構域中殘基之間的詳細接觸模式，且相對應地改變在界面中將容許之胺基酸取代範圍。
鑒於此等事實，若可變結構域突變用於促進雜二聚體之平台設計，則在不測試在已知抗體結構中涵蓋通常操作中遇到之各種CDR構形及可變結構域取向角的大量實例下，將難以證實穩固性及可靠適用性。因此，產生根據本發明之雜二聚體及雙特異性抗體的優點之一為僅僅依賴於修飾CH1/CL界面。本發明之實施例均不需要與可變結構域之修飾配對作為實現適用程度之配對保真度的必不可少特徵。
本發明有利地提供，第一Fab及第二Fab之優先形成依賴於互補殘基組之互補配對。
在一些態樣中，優先形成係指包含第一CH1及第一CL之第一Fab(或第一CHCL)之形成程度大於包含第一CH1與第二CL或第二CH1與第一CL之Fab(或CHCL)之形成。在一些態樣中，優先形成係指包含第二CH1及第二CL之第二Fab(或第二CHCL)之形成程度大於包含第一CH1與第二CL或第二CH1與第一CL之Fab(或CHCL)之形成。
在一些態樣中，CL結構域中之至少一者為κ結構域。在一些態樣中，CL結構域中之至少一者為λ結構域。在一些態樣中，CL結構域兩者均為κ結構域。在一些態樣中，CL結構域兩者均為λ結構域。在一些態樣中，CL結構域之一為κ結構域，且另一CL結構域為λ結構域。
在一些態樣中，本發明提供雜二聚體蛋白質及雙特異性抗體，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成優先於由該第一CH1及第二CL或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約選自由以下組成之群之量發生：4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、 50倍、60倍、80倍、90倍、100倍、150倍及200倍。
可藉由質譜分析測定正確CHCL配對。
互補殘基組
在一些態樣中，互補殘基組在一個結構域中包含帶正電或帶負電殘基，且在另一個結構域中包含帶相反電荷之殘基。在一些態樣中，互補殘基組在一個結構域中包含帶正電殘基，且在另一個結構域中包含帶負電殘基。在一些態樣中，互補殘基組在一個結構域中包含帶正電或帶負電殘基，且在另一個結構域中包含極性殘基或帶相反電荷之殘基。帶正電殘基可選自由H、K及R組成之群。帶負電殘基可選自由E及D組成之群。為避免疑義，帶負電殘基稱為帶與帶正電殘基相反電荷，且反之亦然。極性殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、Q、N、W及Y。極性殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、Q、N及W。極性殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、Q、N及Y。極性殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、W及Y。極性殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、W及Y。極性殘基可選自由以下組成之群：S、T、M及W。極性殘基可選自由以下組成之群：S、M、W及Y。極性殘基可選自由以下組成之群：S、M及W。極性殘基可選自由以下組成之群：S及T。在一些態樣中，M不視為極性殘基。
舉例而言，CH1突變殘基可包含帶正電或帶負電殘基，且CL突變殘基可包含極性殘基或帶相反電荷之殘基。CL突變殘基可包含帶正電或帶負電殘基，且CH1突變殘基可包含極性殘基或帶相反電荷之殘基。CL突變殘基可包含帶正電殘基，且CH1突變殘基可包含帶負電殘基。CH1突變殘基可包含帶正電殘基，且CL突變殘基可包含帶負電殘基。
在本發明之一些態樣中，互補殘基組可包含帶相反電荷之側鏈促進靜電相互作用之CH1突變殘基及CL突變殘基。有利地，由經工程 改造之突變殘基引起的相應CH1及CL結構域之改變電荷極性支持第一或第二Fab之形成，且類似地，由經工程改造之突變殘基中之一或多者引起的排斥電荷相互作用遏制第三或第四Fab之形成。
在一些態樣中，互補殘基組之位置係選自由以下組成之群：根據如本文定義之Kabat編號，(i)CH1-124及CL-176；(ii)CH1-188及CL-178；(iii)CH1-143及CL-178；(iv)CH1-143及CL-131；(v)CH1-221及CL-123；(vi)CH1-145及CL-131；(vi)CH1-179及CL-131；(vii)CH1-186及CL-131；及(viii)CH1-143及CL-133。
在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-124及CL-176。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-188及CL-178。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-143及CL-178。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-143及CL-131。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-221及CL-123。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-145及CL-131。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-179及CL-131。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-145，CH1-179，CH1-186及CL-131。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-143、CH1-179、CH1-186及CL-131。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-186及CL-131。在一些態樣中，互補殘基組包含CH1-143及CL-133。
在一些態樣中，CH1位置之突變係選自由W、H、K、R、S及T組成之群，且CL位置之突變係選自由S、M、D及E組成之群。
在一些態樣中，CH1位置之突變係選自由E及D組成之群，且CL位置之突變係選自由H、K及R組成之群。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者進一步包含一或多個其他突變。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者進一步包含一或多個選自由以下組成之群的其他突變：CH1-143D、CH1-145S、CH1- 186A、CH1-186E、CH1-188G、CH1-188W、CH1-190S、CH1-190I、CL-133S、CL-135I、CL-176G、CL-176M及CL-178S。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者進一步包含位於一或多個選自由以下組成之群的位置之其他突變：根據如本文所述之Kabat編號，CH1-143、CH1-145、CH1-186、CH1-188、CH1-188、CH1-190、CH1-190、CL-133、CL-135、CL-176、CL-176及CL-178。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CH1-143之另一CH1突變殘基。CH1-143之突變殘基可選自由以下組成之群：H、K、R、E及D。CH1-143之突變殘基可選自由以下組成之群：E及D。CH1-143之突變殘基可為E。CH1-143之突變殘基可為D。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CH1-145之另一CH1突變殘基。CH1-145之突變殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、Q、N、E、D、W或Y。CH1-145之突變殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、Q、N、E或D。CH1-145之突變殘基可選自由以下組成之群：S、T、M、Q或N。CH1-145之突變殘基可選自由以下組成之群；S、T或M。CH1-145之突變殘基可為S。CH1-145之突變殘基可為T。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CH1-186之另一CH1突變殘基。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、L、V、I、W、F或Y。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、L、V、I或W。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、L、V或I。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、V或L。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A或V。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：G或A。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：A或W。CH1-186之突變殘基可選自由以下組成之群：F、Y或W。CH1-186之突變殘基可為W。CH1-186之突變 殘基可為A。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CH1-188之另一CH1突變殘基。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群；G、A、L、V、I、W、F或Y。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、L、V、I或W。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、L、V或I。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、V或L。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群：G或A。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A或W。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群：G或W。CH1-188之突變殘基可選自由以下組成之群：F、Y或W。CH1-188之突變殘基可為W。CH1-188之突變殘基可為A。CH1-188之突變殘基可為G。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CH1-190之另一CH1突變殘基。CH1-190之突變殘基可選自由以下組成之群：S、T、I、L。CH1-190之突變殘基可選自由以下組成之群：I或L。CH1-190之突變殘基可選自由以下組成之群：S或T。CH1-190之突變殘基可選自由以下組成之群：S或I。CH1-190之突變殘基可為T。CH1-190之突變殘基可為L。CH1-190之突變殘基可為I。CH1-190之突變殘基可為S。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CL-133之另一CL突變殘基。CL-133之突變殘基可選自由以下組成之群：S、T、Q或M。CL-133之突變殘基可為S。CL-133之突變殘基可為T。CL-133之突變殘基可為M。CL-133之突變殘基可為Q。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CL-135之另一CL突變殘基。CL-135之突變殘基可選自由以下組成之群：I、T或M。CL-135之突變殘基可為I。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CL-176之另一CL突變殘基。CL-135之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、V、I、 L、M、N或T。CL-176之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、V、I、L或M。CL-176之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、V、L或M。CL-176之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A、V或M。CL-176之突變殘基可選自由以下組成之群：G、A或M。CL-176之突變殘基可選自由以下組成之群：G或M。CL-176之突變殘基可為G。CL-176之突變殘基可為A。CL-176之突變殘基可為M。CL-176之突變殘基可為N。
在一些態樣中，互補殘基組中之一或多者包含CL-178之另一CL突變殘基。CL-135之突變殘基可選自由以下組成之群：G、S、V或A。CL-135之突變殘基可為S。
在一些態樣中，其中第一及第二互補殘基組係選自以下之群中的兩個：(i)CH1-124K、CL-176D；(ii)CH1-124K、CL-176D、CH1-190S、CL-133S；(iii)CH1-124K、CL-176D、CL-133S；(iv)CH1-124E、CL-176K；(v)CH1-124E、CL-176K、CH1-188G；(vi)CH1-188E、CL-178K、CH1-143E；(vii)CH1-188K、CL-178D、CH1-143D；(viii)CH1-143K、CL-178D；(ix)CH1-143D、CL-178R；(x)CH1-143K、CL-178D；(xi)CH1-143D、CL-178K；(xii)CH1-143D、CL-178K、CL-176M；(xiii)CH1-143E、CL-131R；(xiv)CH1-143R、CL-131E；(xv)CH1-143R、CL-131E、CH1-186A；(xvi)CH1-221D、CL-123K；(xvii)CH1-221D、CL-123K、CH1-190I、CL-135I；(xviii)CH1-145E、CL-131H；(xvix)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H；(xix)CH1-145E、CL-131H；(xx)CH1-186E、CL-131H、CH1-145S；(xxi)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S；(xxii)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-176G、CL-178G；(xxiii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H、CH-190I、CL-135I；(xxiv)CH-186E、CL-131H、CH-145S；(xxv)CH1-143S、CL-131D、 CH1-188W、CL-133S、CL-176C；(xxvi)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-178G、CL-176G；(xxvii)CH1-143S、CH1-188W、CL-131D。
新穎二硫鍵
在一些態樣中，本發明提供第一CH1與第一CL及/或第二CH1與第二CL之間的新穎二硫鍵。新穎二硫鍵可位於以下位置中之一或多者：(i)CH1-122及CL-123；(ii)CH1-139及CL-116；及(iii)CH1-174及CL-176。
可藉由在第一CHCL及/或第二CHCL之任一者或兩者上使CH1-C230及CL-214中之一或兩者突變成除C外之任何殘基來移除野生型二硫鍵。在一些態樣中，在第一及/或第二CHCL之任一者或兩者中CL-C214缺失。在一些態樣中，在第一及/或第二CHCL之任一者或兩者中CH1-C230缺失。
在一些態樣中，第一及/或第二CH1-C230及第一及/或第二CL-C214突變成S。在一些態樣中，第一CHCL包含CH1-C230S及CL-C214S，且進一步包含以下殘基對中之一或多者：CH1-122C及CL-123C；CH1-139C及CL-116C；以及CH1-174C及CL-176C。在一些態樣中，第二CHCL包含CH1-C230S及CL-C214S，且進一步包含以下殘基對中之一或多者：CH1-122C及CL-123C；CH1-139C及CL-116C；以及CH1-174C及CL-176C。有利地，第一CHCL及第二CHCL不包含位於相同對應位置之新穎細胞因子突變。
在一些態樣中，其中既定CHCL包含CH-174C及CL-176C，既定CHCL進一步包含CH-190I及CL-135I。
C H /C L 突變
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含來自以下之群之一的殘基：(i)CH1-124K、CL-176D、CH1-190S、CL-133S；(ii)CH1- 124E、CL-176K、CH1-188G、CL-133S；(iii)CH1-124K、CL-176D、CL-133S；(iv)CH1-124E、CL-176K、CL-133S；(v)CH1-188E、CL-178K、CH1-143E；(vi)CH1-188K、CL-178D、CH1-143D；(vii)CH1-143K、CL-178D；(viii)CH1-143D、CL-178R；(ix)CH1-143K、CL-178D；(x)CH1-143D、CL-178K；(xi)CH1-143D、CL-178K、CL-176M；(xii)CH1-143E、CL-131R；(xiii)CH1-143R、CL-131E；(xiv)CH1-143R、CL-131E、CH1-186A；(xv)CH1-221D、CL-123K；(xvi)CH1-221K、CL-123K、CH1-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xvii)CH1-145E、CL-131H；(xviii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H；(xix)CH1-122C、CH1-145E、CH1-230S、CL-123C、CL-131H、CL-214S；(xx)CH1-186E、CL-131H、CH1-145S；(xxi)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S；(xxii)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-176G、CL-178G；(xxiii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H、CH-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xxiv)CH-186E、CL-131H、CH-145S、CH1-139C、CH1-230S、CL-116C、CL-214S；(xxv)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xxvi)CH1-221D、CL-123K、CH1-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xxvii)CH1-143S、CH1-188W、CH1-122C、CH1-139C、CH1-174C、CH1-230S、CL-133S、CL-178S、CL-131D、CL-116C、CL-123C、CL-176C、CL-214S。
有利地，第一及第二Fab兩者不包含來自同一群之殘基。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124K、CL-176D、CH1-190S及CL-133S。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124K及CL-176D。在一些態樣中，第一CHCL及/或 第二CHCL包含殘基CH1-124K、CL-176E。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124R、CL-176D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124R、CL-176E。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124E、CL-176K、CH1-188G及CL-133S。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124E及CL-176K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124E及CL-176R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124D及CL-176K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-124D及CL-176R。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188E、CL-178K及CH1-143E。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188E及CL-178K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188D及CL-178K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188E、CL-178R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188D、CL-178R。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188K、CL-178D及CH1-143D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188K、CL-178D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188R、CL-178D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188K、CL-178E。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-188R、CL-178E。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143K及CL-178D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143K及CL-178E。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143R及CL-178D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143R及CL-178E。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143D及CL-178R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143E及CL-178R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143D及CL-178K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143E及CL-178K。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143D、CL-178K及CL-176M。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143E及CL-131R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143D及CL-131R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143E及CL-131K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143D及CL-131K。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143R、CL-131E及CH1-186A。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143R及CL-131E。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143K及CL-131E。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143R及CL-131D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143K及CL-131D。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-221D、CL-123K、CH1-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C及CL-214S。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-221D及CL-123K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-221E及CL-123K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-221D及CL-123R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-221E及CL-123R。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-145E及 CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-145D及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-145E及CL-131K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-145E及CL-131R。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-145D及CL-131K。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-145E及CL-131H。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143E、CH1-179D、CH1-186E及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143D、CH1-179D、CH1-186D及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179D、CH1-186D及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179E、CH1-186D及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179E、CH1-186E及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179E、CH1-186D及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179E、CH1-186E及CL-131H。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-145E、CL-131H、CH1-122C、CH1-230S、CL-123C及CL-214S。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-186E、CL-131H及CH1-145S。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-186E及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-186D及CL-131H。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S及CL-178S。在一些態樣中，第一CHCL 及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CH1-188W及CL-131D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143T、CH1-188W及CL-131D。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CH1-188W及CL-131E。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143T、CH1-188W及CL-131E。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-176G及CL-178G。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CH1-188W及CL-133M。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143T、CH1-188W及CL-133M。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H、CH-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C及CL-214S。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179E、CH1-186E及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179D、CH1-186D及CL-131H。在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143H、CH1-179E、CH1-186D及CL-131H。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH-186E、CL-131H、CH-145S、CH1-139C、CH1-230S、CL-116C及CL-214S。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C及CL-214S。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-178G、CL-176G、CH1-122C、CH1-230S、 CL-123C及CL-214S。
在一些態樣中，第一CHCL及/或第二CHCL包含殘基CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S、CH1-122C、CH-139C、CH-174C、CH1-230S、CL-116C、CL-123C、CL-176C及CL-214S。
在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：1具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：2具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：3具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：4具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：5具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：6具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：7具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：8具有至少選 自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。
在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：33具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：34具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：35具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：36具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：37具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：38具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：39具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：40具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：41具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH1結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。
在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：9具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：10具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：11具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：12具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。
在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：24具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：25具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：26具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：27具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：28具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：29具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：30具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：31具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：32具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CL結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。
對抗體之恆定結構域進行修飾以產生雜二聚體揭示於US5731168、WO2009089004及WO2011143545中，內容全文併入本文中。
C H 2及C H 3結合域
在一些態樣中，第一CH1連接於第一CH2結合域(CH2)，且第二CH1連接於第二CH2。第一及第二CH2各可包含第一及第二CH2突變殘 基，該第一及第二CH2突變殘基經工程改造以彼此不同，且優先彼此相互作用，且從而優先於CH2均二聚體之形成，形成CH2雜二聚體。
在一些態樣中，本發明之雜二聚體蛋白質進一步包含第一CH2區及第二CH2區，該第一CH2區及第二CH2區相互作用在一起以形成CH2界面，其中該CH2界面內之一或多個胺基酸使均二聚體形成不穩定且不在靜電學上不利於均二聚體形成。
在一些態樣中，第一CH1或CH2連接於第一CH3結構域(CH3)，且第二CH1或CH2連接於第二CH3。第一及第二CH3各分別可包含第一及第二CH3突變殘基，該第一及第二CH3突變殘基經工程改造以彼此不同，且優先彼此相互作用，且從而優先於CH3均二聚體之形成，形成CH3雜二聚體。亦已在WO2009/089004中描述用帶電胺基酸置換構成兩個CH3結構域中CH3-CH3界面之一或多個殘基以促進雜二聚體形成的技術。
在一些態樣中，本發明之雜二聚體蛋白質進一步包含第一CH3區及第二CH3區，該第一CH3區及第二CH3區相互作用在一起以形成CH3界面，其中該CH3界面內之一或多個胺基酸使均二聚體形成不穩定且不在靜電學上不利於均二聚體形成。在一些實施例中，經工程改造之CH3界面在空間上促進雜二聚體形成超過均二聚體形成。在一些實施例中，經工程改造之CH3界面在靜電學上有利於雜二聚體形成超過均二聚體形成。
在一些實施例中，第一CH3多肽中之胺基酸修飾為CH3-391之胺基酸取代，且第二CH3多肽中之胺基酸修飾為CH3-441之胺基酸取代(根據SEQ ID NO：18之編號)。在一些實施例中，第一CH3多肽中之胺基酸修飾為CH3-441R且第二CH3多肽中之胺基酸修飾為CH3-391E或CH3-391D(更多詳情參見WO2011/143545)。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步在一個臂中包含第一鉸鏈區中SEQ ID NO：42之位置CH2- D232及CH2-P241(鉸鏈IgG1)或SEQ ID NO：79之CH2-C233、CH2-E237及CH2-P241(IgG2鉸鏈序列)的胺基酸修飾，且第一鉸鏈區中之經取代/置換胺基酸具有與另一臂中第二鉸鏈區中之對應胺基酸相反的電荷(更多詳情參見WO2011/143545)。舉例而言，鉸鏈區中之胺基酸修飾可為CH2-D232R、CH2-D232E、CH2-P241R及/或CH2-P241E。在另一實例中，鉸鏈區中之胺基酸修飾可為CH2-C233D、CH2-C233E、CH2-C233K、CH2-C223R、CH2-E237E、CH2-E237K、CH2-E237R、CH2-P241D、CH2-P241E、CH2-P241K及/或CH2-P228R。在一些態樣中，CH3結構域係選自由SEQ ID NO：82、83、84及85組成之群。
在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：13具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH2結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：14具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH2結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：15具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH2結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：16具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH2結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：17具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH2結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：45具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH2結構域：85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。
在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：18具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：19具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：20具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：21具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：22具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：23具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：46具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：47具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：48具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些態樣中，本發明包含序列與SEQ ID NO：49具有至少選自由以下組成之群之量的一致性的CH3結構域：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%。
在一些態樣中，本發明進一步包含CH1與CH2區域之間的IgG鉸鏈區。鉸鏈區可包含SEQ ID NO：42。IgG鉸鏈區可包含SEQ ID NO：43。IgG鉸鏈區可包含SEQ ID NO：44。IgG鉸鏈區可為IgG2鉸鏈區，且可包含SEQ ID NO：79。
Ig同型及子類
在一些實施例中，雜二聚體蛋白質可包含一或多個IgA結構域。在一些實施例中，雜二聚體蛋白質可包含一或多個IgD結構域。在一些實施例中，雜二聚體蛋白質可包含一或多個IgE結構域。在一些實施例中，雜二聚體蛋白質可包含一或多個IgG結構域。在一些實施例中，雜二聚體蛋白質可包含一或多個IgM結構域。
在一些實施例中，至少一個Fab為IgA1或IgA2。在一些實施例中，至少一個Fab為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中，IgG Fab包含人類IgG Fab(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些實施例中，第一及第二Fab為相同子類(亦即均為IgG1，或均為IgG2，或均為IgG3，或均為IgG4)。
在替代實施例中，第一Fab屬於與第二Fab不同之子類(亦即第一Fab及第二Fab各可屬於不同子類，且各可選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2組成之群)。舉例而言，本發明之抗體可包含來自一種抗體子類之第一Fab(例如選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或 IgA2組成之群)及來自不同子類之第二Fab(例如選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2組成之群，限制條件為第二Fab屬於與第一Fab不同之子類)，以及來自單一抗體類別之第一及第二CH2結構域及第一及第二CH3結構域(例如選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2組成之群)。
在本發明之另一態樣中，如本文所描述之抗體或其Fab區域(例如雙特異性抗體)包含全長人類抗體，其中抗體或其Fab之第一抗體可變結構域藉由特異性結合於位於人類免疫效應細胞上之效應抗原而能夠募集人類免疫效應細胞之活性，其中雜二聚體蛋白質之第二抗體可變結構域能夠特異性結合於標靶抗原。在一些實施例中，人類抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
除上下文另外指示外，術語「第一」及「第二」及其變體僅僅為通用標識符，且不視為鑑別特定或特別CH1、CL、VH、VL、CH2、CH3或Fab。
在本發明之另一態樣中，本文所揭示之雜二聚體蛋白質可使用諸如例如PCT公開案WO98/52976及WO00/34317中描述之技術的已知技術去免疫以降低在投與個體時之免疫原性。
在其他實施例中，雜二聚體蛋白質可諸如藉由使包含所有或一部分雜二聚體多肽(例如本文所揭示之雙特異性抗體)之融合抗體或免疫黏附素連接於另一多肽或分子試劑來修飾或衍生。雜多聚體，例如本文所揭示之雜二聚體多肽(例如雙特異性抗體)可例如藉由產生更穩定之融合分子及/或藉由用生物相容性聚合物(諸如聚乙二醇(PEG))處理，通常稱為「聚乙二醇化」或藉由此項技術中熟知之許多其他工程改造方法任一者來修飾或衍生以延長活體內半衰期。
雜二聚體蛋白質可用包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、酯、碳水化合物基團或其類似基團之化學基團，使用熟知之技術 衍生。此等化學基團(及其他如此等基團之已用於在活體內穩定治療化合物之基團)適用於改善雜二聚體多肽之生物特徵，例如增加血清半衰期及生物活性。
雜二聚體蛋白質亦可使用此項技術中已知之眾多方法中的任一者標記。如本文所使用，術語「標記(label)」或「標記(labeled)」係指另一分子併入抗體中。在一個實施例中，標記為可偵測標記物，例如併入經放射性標記之胺基酸或連接於生物素基部分之多肽，該等生物素基部分可由經標記抗生物素蛋白(例如含有螢光標記物或可以光學或比色法加以偵測之酶活性之抗生蛋白鏈菌素)偵測。在另一實施例中，標記或標記物可為治療劑，例如藥物結合物或毒素。各種標記多肽及醣蛋白之方法為此項技術中已知且可加以使用。用於多肽之標記之實例包括(但不限於)：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光標記(例如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶標記(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光標記物、生物素基、由二級報導體(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤)識別之預定多肽抗原決定基、磁性試劑(諸如釓螯合物)、毒素(諸如百日咳毒素、紫杉醇(toxin)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、小紅莓(doxorubicin)、道諾比星(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因 (lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。在一些實施例中，以各種長度之間隔臂連接標記以減少潛在的位阻。
產生本發明之多肽及雜二聚體蛋白質之核酸及方法
在一些實施例中，不同核酸分子編碼例如本文所揭示之雙特異性抗體的雜二聚體蛋白質之一或多個鏈或部分。在其他實施例中，相同核酸分子編碼本文所揭示之雜二聚體蛋白質。
在一個態樣中，本發明提供編碼本文所揭示之雜二聚體蛋白質之一條鏈的核酸序列或如上所述之其部分。本發明之核酸分子包括在極嚴格條件下雜交之核酸，諸如與本發明之核酸序列至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或99%以上一致之核酸。
在一些態樣中，核酸為DNA。在一些態樣中，核酸為RNA。在一些態樣中，核酸為mRNA。在一些態樣中，核酸為非天然核酸，諸如PNA(肽核酸)、嗎啉基及鎖核酸、二醇核酸及蘇糖核酸。
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其包含編碼本文所揭示之雜多聚體或雜二聚體蛋白質之一或多個鏈或部分的核酸序列，或如本文所描述之其部分。
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其適合於表現本文所揭示之雜二聚體蛋白質之一或多個鏈或部分，或如本文所描述之其部分。在一些態樣中，本發明提供一種包含本發明之核酸的載體。
在另一實施例中，本發明之核酸分子用作特定胺基酸序列(例如諸如鉸鏈及恆定重鏈結構域序列中之特定抗體序列)之探針或PCR引子。舉例而言，核酸可用作診斷方法中之探針或用作PCR引子以擴增可尤其用於分離編碼適用序列之額外核酸分子的DNA區域。在一些實施例中，核酸分子為寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸來自相關 抗體之重鏈及輕鏈之鉸鏈及恆定結構域區域。在一些實施例中，寡核苷酸編碼雜二聚體多肽，例如本文所描述之本發明之雙特異性抗體或其片段的修飾Fab區域中之一或多者所有或一部分。
在一些實施例中，本發明之重組表現載體可具有調控序列，其控制宿主細胞中抗體鏈基因之表現。熟習此項技術者應瞭解表現載體之設計，包括調控序列之選擇可視如待轉型之宿主細胞之選擇、所要蛋白質表現之程度等因素而定。較佳用於哺乳動物宿主細胞表現之調節序列包括指引哺乳動物細胞中蛋白質高度表現之病毒性元件，諸如源自反轉錄病毒LTRs、細胞巨化病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/強化子)、猿病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))之啟動子及/或強化子、多瘤病毒及強哺乳動物啟動子，諸如原生免疫球蛋白及肌動蛋白啟動子。
除抗體鏈基因及調控序列以外，本發明之重組表現載體可具有額外序列，諸如調控宿主細胞中載體複製之序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。舉例而言，通常可選擇標記基因賦予已引入載體之宿主細胞以對藥物(諸如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤(methotrexate))之抗性。舉例而言，可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於具有甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞)、neo基因(用於G418選擇)及麩胺酸酯合成酶基因。
如本文所用之術語「表現控制序列」意謂實現所接合之編碼序列之表現及加工所必需的聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；提高轉譯效率之序列(亦即科紮克(Kozak)共同序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉 錄終止序列；在真核生物中，此類控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲至少包括存在對於表現及加工而言為必需的所有組分，且亦可包括存在為有利的額外組分，例如前導序列及融合搭配物序列。
在一些態樣中，本發明包含編碼本發明之至少一個CH1或CL之核酸。本發明進一步提供編碼本發明之Fab的核酸。在一些態樣中，本發明提供編碼本發明之第一Fab之核酸。在一些態樣中，本發明提供編碼本發明之第二Fab之核酸。
在一些態樣中，本發明提供編碼本發明之第一重鏈之核酸。在一些態樣中，本發明提供編碼本發明之第二重鏈之核酸。在一些態樣中，本發明提供編碼本發明之第一輕鏈之核酸。在一些態樣中，本發明提供一種編碼本發明之第二輕鏈之核酸。
在一些態樣中，本發明提供一種包含本發明之載體之細胞。在一些態樣中，本發明提供一種包含本發明之核酸的細胞。在一些態樣中，本發明提供一種表現本發明之核酸的細胞。
有利地，本發明提供一種表現如本文中描述之雜二聚體蛋白質的細胞。第一CHCL及第二CHCL在同一細胞中共表現利用允許雜多聚體蛋白質正確形成之互補殘基組。在一些態樣中，此允許雙特異性抗體以完全組裝形式表現及產生，且幾乎不需要額外純化或加工步驟，優於單株抗體純化通常所需之步驟。
在一些態樣中，本發明之雙特異性抗體可用於mRNA替代療法或RNA轉錄物療法。因此，在一些態樣中，本發明包含一種細胞或載體，其包含編碼本發明之一或多個多肽鏈的一或多種核酸，使得本發明之多肽鏈在活體內之表現使得雙特異性抗體在活體內產生。此類載體之傳遞機制包括基於脂質之系統及奈米粒子(參見例如WO2010053572、WO2012170930及WO2011068810，各自內容全文併 入)。
在一些態樣中，本發明進一步包含轉移媒劑，本文中定義為標準醫藥載劑、稀釋劑、賦形劑及其類似物中之任一者，其可與包括核酸之生物活性劑的投與結合使用。本文所描述之組合物及尤其轉移媒劑能夠將本發明之核酸傳遞至標靶細胞。在一些實施例中，轉移媒劑為脂質奈米粒子，適合於將mRNA轉移至標靶細胞。
在一些態樣中，本發明包含一種編碼本發明之雙特異性抗體的mRNA、一種轉移媒劑及視情況存在之促進接觸及隨後轉染標靶細胞之試劑。
在一些實施例中，編碼本發明之一或多種多肽的mRNA可包含一或多種賦予mRNA穩定性(例如與野生型或天然型式之mRNA)相比之修飾。舉例而言，本發明之核酸可包含5'及3'未轉譯區域中之一或兩者的修飾。此類修飾可包括(但不限於)包括巨細胞病毒(CMV)即刻早期1(IE1)基因之部分序列、多聚A尾、Capl結構或編碼人類生長激素(hGH)之序列。在一些實施例中，mRNA經修飾以減少mRNA免疫原性。
在一些實施例中，本發明之mRNA已經受化學或生物修飾以使其更穩定。mRNA之示例性修飾包括鹼基之缺失(例如藉由一個核苷酸缺失或經另一個核苷酸取代)或鹼基之修飾，例如鹼基之化學修飾。在一些態樣中，多聚A尾可添加至mRNA分子中，因此使得mRNA更穩定。
在一些態樣中，本發明之組合物中之轉移媒劑為脂質體轉移媒劑，例如脂質奈米粒子。轉移媒劑可經選擇及/或製備以優化mRNA傳遞至標靶細胞。舉例而言，若標靶細胞為肝細胞，則轉移媒劑之特性(例如尺寸、電荷及/或pH值)可優化以有效傳遞此類轉移媒劑至標靶細胞，降低免疫清除率及/或促進在該標靶細胞中之滯留。或者，若 標靶細胞為中樞神經系統(例如投與以用於治療神經退化性疾病之mRNA可特異性靶向腦或脊椎組織)，則轉移媒劑之選擇及製備必須考慮滲透血腦障壁且滯留在血腦障壁內及/或直接傳遞此類轉移媒劑至此類標靶細胞之替代性方式的使用。在一些態樣中，本發明之組合物可與促進外源性mRNA轉移之試劑(例如破壞或改善血腦障壁之通透性且從而增強外源性mRNA轉移至標靶細胞之試劑)組合。
本發明涵蓋脂質體轉移媒劑促進核酸傳遞至標靶細胞之用途。在一些態樣中，轉移媒劑調配為脂質奈米粒子。適合脂質之實例包括例如磷脂醯基化合物(例如磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、鞘脂、腦苷脂及神經節苷脂)。亦涵蓋聚合物作為轉移媒劑之用途，無論單獨還是與其他轉移媒劑組合。適合聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己內酯、聚葡萄糖、白蛋白、明膠、海藻酸鹽、膠原蛋白、聚葡萄胺糖、環糊精、樹枝狀聚合物及聚乙烯亞胺。
本發明涵蓋脂質奈米粒子作為轉移媒劑之用途，其包含陽離子脂質以囊封mRNA及/或增強mRNA傳遞至標靶細胞。如本文所使用，短語「陽離子脂質」係指在所選pH值、諸如生理pH值下可具有淨正電荷之許多脂質物質任一者。
在一個態樣中，本發明提供一種用於增強雙特異性抗體形成之策略，其係藉由改變或工程改造抗體之一或多個Fab區域之輕鏈與重鏈之間的界面。在一些實施例中，構成一或多個Fab區域之CH1/CL界面的一或多個殘基經殘基置換，使得經修飾之殘基促進經修飾之Fab區域之特定重鏈及輕鏈的配對超過與蛋白質中其他Fab區域之重鏈或輕鏈錯配。在一個實施例中，修飾在Fab區域中引入新穎二硫橋鍵。在另一實施例中，修飾引入破壞Fab區域之CH1與CL結構域之間的天然界面之破壞突變，以及在界面引入非天然之穩定相互作用的恢復修 飾。在另一實施例中，破壞突變可引入新穎二硫橋鍵與破壞及恢復突變。
在一些實施例中，與不具有此類修飾之野生型雜二聚體蛋白質相比，在本文所揭示之一或多個Fab區域之CH1/CL界面中包含一或多個胺基酸修飾的雜二聚體蛋白質之形成實質上增加。在一些實施例中，與不具有此類修飾之野生型雜二聚體蛋白質相比，在至少一個Fab區域之CH1/CL界面中包含一或多個胺基酸修飾的雜二聚體蛋白質之形成為至少約51%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%任一者。
在另一個態樣中，本發明亦提供產生雜多聚體蛋白質，例如本發明之雜二聚體蛋白質，諸如雙特異性抗體之方法。在一些實施例中，該方法包含以下步驟：a)將細胞株與表現蛋白質之各Fab區域之各重鏈及各輕鏈的載體共轉染；b)在表現蛋白質之各Fab區域之各重鏈及各輕鏈且允許雜多聚體蛋白質組裝的條件下培養細胞株；及c)自細胞培養物純化雜多聚體蛋白質。在一些實施例中，將細胞株與以1：1：1：1比率表現各Fab區域之重鏈及輕鏈的載體共轉染。
在一些實施例中，該方法包含以下步驟：(i)將細胞株與一或多種載體共轉染以表現該第一CHCL之該第一CH1、該第一CL以及該第二CHCL之該第二CH1及該第二CL；(ii)在表現一或多種載體且允許第一CHCL及第二CHCL組裝的條件下培養該細胞株；及(iii)自細胞培養物純化雜多聚體蛋白質。
在一些態樣中，細胞株與以1：1：1：1比率表現第一CH1、第一CL、第二CH1及第二CL之載體共轉染。
熟習此項技術者可容易使用熟知之技術，確定根據本文所揭示之方法使用的相對量之分子或抗體。
在本文所揭示之方法中，可跨越一系列溫度進行培育。此類溫度將由熟習此項技術者識別，且將包括例如使有害的物理改變，諸如變性或分解無法在混合分子或抗體中進行之培育溫度。在某些實施例中，培育在約37℃下進行。
在本發明之方法中可使用大量宿主細胞任一者。此類細胞為此項技術中已知(本文描述其中一些)或可使用此項技術中已知之常規技術，針對用於本發明之方法的適合性，憑經驗確定。在某些實施例中，宿主細胞為原核細胞。在一些實施例中，宿主細胞為革蘭氏陰性細菌細胞(gram-negative bacterial cell)。在其他實施例中，宿主細胞為大腸桿菌。在一些實施例中，大腸桿菌為缺乏內源性蛋白酶活性之菌株。在一些實施例中，大腸桿菌宿主細胞之基因型缺乏degP及prc基因且具有突變spr基因。在本發明之其他實施例中，宿主細胞為哺乳動物，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
在一些實施例中，本發明之方法進一步包含在宿主細胞中使編碼分子之聚核苷酸或重組載體表現，其在宿主細胞中之表現增強本發明之雙特異性抗體或雜二聚體蛋白質的產率。舉例而言，此類分子可為伴隨蛋白。在一個實施例中，該分子為選自由DsbA、DsbC、DsbG及FkpA組成之群的原核多肽。在此等方法之一些實施例中，聚核苷酸編碼DsbA與DsbC。
在一個態樣中，本發明提供允許本發明抗體或其部分重組表現之重組宿主細胞。藉由在此類重組宿主細胞中之此類重組表現產生的抗體在本文中稱為「重組抗體」。本發明亦提供此類宿主細胞之子代細胞及由其產生之抗體。如本文所用之術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意謂其中已引入重組表現載體之細胞。應瞭解 「重組宿主細胞」及「宿主細胞」不僅意謂特定個體細胞，亦意謂此類細胞之子代。由於在後代中因突變作用或環境影響可發生某些改變，因此事實上此類子代可不同於親代細胞，但仍包括於如本文中所使用之術語「宿主細胞」之範疇內。此類細胞可包含如上文所述之本發明之載體。
在另一個態樣中，本發明提供一種製造如上所述之抗體或其部分的方法。根據一個實施例，該方法包含將經如上所述之載體轉染或轉型的細胞培養，且獲取該抗體或其部分。編碼抗體之核酸分子及包含此等核酸分子之載體可用於轉染適合的哺乳動物、植物、細菌或酵母宿主細胞。轉型可藉由用於引入聚核苷酸至宿主細胞之任何已知方法。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞內的方法為此項技術中熟知，且包括葡聚糖介導轉染法、磷酸鈣沈澱法、聚凝胺介導轉染法、原生質體融合法、電穿孔法、將聚核苷酸囊封於微脂粒中及將DNA直接微量注射入核內。此外，核酸分子可藉由病毒載體引入哺乳動物細胞中。細胞轉型方法為此項技術中所熟知。參見例如美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號及第4,959,455號。植物細胞轉型方法為此項技術中所熟知，包括例如土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導轉型法、基因槍轉型、直接注射、電穿孔及病毒轉型。轉型細菌及酵母細胞之方法亦為此項技術中熟知。
用作表現宿主之哺乳動物細胞株為此項技術中熟知且包括自美國菌種保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC)獲得之許多永生化細胞株。此等細胞尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、293 Freestyle細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞及多種其他細胞株。尤其較佳之細胞株經由測定哪些細胞株具有 高表現量來選擇。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9或Sf21細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足以使抗體在宿主細胞中表現或更佳使抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中之時段來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。適合植物宿主細胞可包括例如菸草屬(Nicotiana)、芥菜屬(Arabidopsis)、浮萍(duckweed)、玉米、小麥、馬鈴薯等。適合細菌宿主細胞可包括例如大腸桿菌及鏈黴菌(Streptomyces)物種。適合酵母宿主細胞可包括例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及甲醇酵母(Pichia pastoris)。
本發明之多肽或其部分自產生細胞株之表現可使用大量已知之技術增強。例如，麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)為一種增強在特定條件下表現之常用方法。GS系統整體或部分結合EP0216846、EP0256055、EP0323997及EP0338841論述。
如藉由不同細胞株或在轉殖基因動物中表現的包含Fc多肽或Fc區域及免疫球蛋白樣鉸鏈多肽之多肽，例如抗體很可能將在其糖基化模式上彼此不同。本發明之多肽之所有此類「糖型」，包括包含免疫球蛋白樣鉸鏈序列之多肽的所有雜二聚體、雙特異性多肽、抗體等，均視為本發明之一部分，無論其糖基化狀態如何，且更一般而言，無論存在或不存在任何轉譯後修飾。
在一些實施例中，雜二聚體蛋白質為抗體、最大抗體、單功能抗體、肽體、Fc融合蛋白或以上任一者之Fab區域。在一些實施例中，雜二聚體蛋白質為雙特異性抗體。
其雜二聚體蛋白質可包含一或多個人類結構域。雜二聚體蛋白質可包含一或多個人類化Ig結構域。雜二聚體蛋白質可包含一或多個鼠類Ig結構域。雜二聚體蛋白質可包含一或多個源自選自由以下組成 之群之物種的Ig結構域：人類、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、犬、貓、驢、山羊、駱駝、牛、馬、豬、雞及鯊魚。
在一些態樣中，本發明之抗體來源於哺乳動物、禽類或甲鯰科魚屬(Squaliform)(不管用於產生任何人工突變或以其他方式工程改造之型式的方法)。哺乳動物、禽類或甲鯰科魚屬物種可為人類、小鼠、兔、大鼠、嚙齒動物、豬、牛、綿羊、山羊、驢、馬、駱駝、駱馬、靈長類動物、猴、犬、貓、雞或白斑角鯊。本發明之抗體可人類化。
在一些態樣中，本發明包含突變抗體及其部分，其中突變體定義為序列經工程改造或改變成非其天然典型序列之序列，使得本發明之多肽的某些實施例特定排除在該定義範疇內之天然存在之序列。在一些態樣中，因此，本發明係關於本發明之多肽，其包含能夠使雜二聚體Ig結構域配對，使得Ig結構域多肽序列不同於其天然存在之對應序列的突變。
抗體CH1結構域可選自由CHα1、CHδ1、CHε1、CHγ1及CHμ1組成之群。
在一些態樣中，本發明之恆定輕鏈(CL)結構域連接於可變輕鏈(VL)結構域。總之，此等可包含抗體輕鏈。CL結構域可為CLκ(恆定輕鏈κ)。CL結構域可為CLλ(恆定輕鏈λ)。
在一些態樣中，本發明之CH1結構域連接於可變重鏈(VH)結構域。總之，此等可包含Fab分子之重鏈部分。在一些態樣中，VH及CH1結構域連接於特定Ig同型典型之CH結構域之剩餘部分(亦即CHα1可連接於CHα2及CHα3；CHδ1可連接於CHδ2及CHδ3；CHε1可連接於CHε2、CHε3及CHε4；CHγ1可連接於CHγ2及CHγ3；CHμ1可連接於CHμ2、CHμ3及CHμ4)。
在一些態樣中，本發明提供一種分離之宿主細胞，其以重組方 式產生本發明之抗體。本發明提供一種分離之聚核苷酸，其包含編碼本發明之蛋白質、結構域及抗體的核苷酸序列及包含該等聚核苷酸之載體。在一些態樣中，本發明提供一種產生抗體、免疫球蛋白結構域或蛋白質的方法，其包含在產生抗體、免疫球蛋白結構域或蛋白質之條件下培養宿主細胞且自宿主細胞或培養物分離抗體、免疫球蛋白結構域或蛋白質。
本發明提供改良之用於產生雜多聚體複雜分子、更優選雜二聚體蛋白質、諸如雙特異性抗體之方法、組合物、套組及製品。本發明提供製備及純化雜多聚體複雜分子之方法，產率及純度為生物治療劑之商業製造所需。本發明可有效產生複雜分子，複雜分子繼而可用於診斷和/或治療其中多特異性抗體之使用為所要和/或所需之各種病症或病狀。本文提供本發明之方法、組合物、套組及製品之細節。
本發明之蛋白質之使用方法
本發明亦提供本發明之蛋白質的各種治療應用。在一個態樣中，本發明之蛋白質可藉由第一蛋白質(例如第一人類抗體可變結構域)結合於效應抗原及藉由第二蛋白質(例如第二人類抗體可變結構域)結合於標靶抗原來用於治療各種疾病(例如癌症、自體免疫疾病或病毒感染)。舉例而言，本發明之蛋白質可用於使細胞毒性改變方向、傳遞溶血栓劑至凝塊、傳遞免疫毒素至腫瘤細胞或在標靶位點(例如腫瘤)轉化酶活化前藥。
在另一個態樣中，本發明之蛋白質可用於增加治療劑之特異性及/或調節協同或累加路徑(例如代謝或生物化學通路)。舉例而言，本發明之蛋白質可接合受體/受體、受體/配位體、配位體/配位體、細胞/細胞、配位體/有效負載、受體/有效負載或單一受體。
醫藥組合物
本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之蛋白質及醫藥學 上可接受之載劑。如本文中所使用之「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學可相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及其類似物。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物中之一或多者，以及其組合，且可在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉，且可包括醫藥學上可接受之物質，諸如潤濕或少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增加抗體或抗體部分之存放期或有效性。
在某些實施例中，本發明之蛋白質可呈中性形式(包括兩性離子形式)或呈帶正電或帶負電物質形式存在。在一些實施例中，多肽可與相對離子複合以形成「醫藥學上可接受之鹽」，其係指包含一或多個多肽及一或多個相對離子之複合物，其中相對離子來源於醫藥學上可接受之無機及有機酸及無機及有機鹼。
本發明之組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。較佳形式視預期投藥模式及治療應用而定。典型較佳組合物呈可注射或可輸注溶液之形式，諸如與一般用於使人類經抗體被動免疫之組合物類似的組合物。較佳投藥模式為非經腸(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)投藥。在一較佳實施例中，本發明之蛋白質藉由靜脈內輸注或注射投與。在另一個較佳實施例中，本發明之蛋白質藉由肌肉內或皮下注射投與。
醫藥組合物可進一步包含另一組分，諸如抗腫瘤劑或成像試劑。本發明之另一態樣提供包含本發明之抗體及包含此等抗體之醫藥組合物的套組。除抗體或醫藥組合物之外，套組可包括診斷或治療劑。套組亦可包括在診斷性或治療性方法中之使用說明書。在一些實 施例中，套組包括抗體或其醫藥組合物及診斷劑。在其他實施例中，套組包括抗體或其醫藥組合物及一或多種治療劑，諸如另一抗贅生性藥劑、抗腫瘤劑或化學治療劑。
此等藥劑及本發明之化合物可與醫藥學上可接受之媒劑，諸如生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及其類似物組合。特定給藥方案(亦即劑量、時機及重複)將視特定個體及該個體之病史而定。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、氯化本索寧(benzethonium chloride)；苯酚、丁基醇或苄醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或Igs；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有本發明化合物之脂質體係藉由此項技術中已知之方法(諸如US4485045及US4544545中所述)製備。具有延長循環時間的脂質體揭示於US5013556中。尤其適用之脂質體可用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物以逆相蒸發法產 生。脂質體係經界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。
亦可將活性成分包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、包埋於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或包埋於巨乳液中。此等技術揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing(2000)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)之形式。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(US3773919)、L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸酯異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
欲用於活體內投藥之調配物必須無菌。此易於例如藉由經無菌過濾膜過濾來實現。本發明之治療化合物一般置放於具有無菌存取孔口之容器中，例如具有可用皮下注射針頭刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或瓶。
本發明之一種示例性、非限制性醫藥組合物為呈無菌水溶液形式之調配物，其具有在約5.0至約6.5範圍內之pH值且包含約1mg/mL至約200mg/mL包含本發明之雜二聚體蛋白質之組合物、約1毫莫耳至約100毫莫耳組胺酸緩衝液、約0.01mg/mL至約10mg/mL聚山梨醇酯80、約100毫莫耳至約400毫莫耳海藻糖及約0.01毫莫耳至約1.0毫莫耳EDTA二鈉二水合物。
適合乳液可使用諸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM之市售脂肪乳液製備。活性成分可溶解於預混乳液組合物中，或者其可溶解於油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及在與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合時所形成的乳液中。應瞭解可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節乳液張力。適合乳液通常將含有至多20%油，例如在5%與20%之間。脂肪乳液可包含0.1與1.0μm、尤其0.1與0.5μm之間的脂肪滴且具有在5.5至8.0範圍內的pH值。
乳液組合物可為藉由混合本發明之化合物與IntralipidTM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所製備之乳液組合物。
用於吸入或吹入之組合物包括醫藥學上可接受之水性溶劑或有機溶劑或其混合物中之溶液及懸浮液，以及粉末。液體或固體組合物可含有如上所述之適合醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，組合物係藉由經口或經鼻呼吸途徑投與以得到局部或全身性作用。較佳無菌之醫藥學上可接受之溶劑中的組合物可藉由使用氣體來霧化。霧化溶液可直接自霧化裝置吸入，或霧化裝置可連接至面罩、圍罩或間歇性正壓呼吸機上。溶液、懸浮液或粉末組合物可自以適當方式傳遞調配物之裝置、較佳經口或經鼻投與。
本發明之化合物及組合物可結合針對相關適應症建立之治療使用。
本發明之治療方法
本發明亦提供治療方法。治療方法包含向有需要之個體投與本發明之化合物或組合物。
如本文中所使用，藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑型」或「有效量」為足以影響一或多種有益或所要結果中之任一者之量。對於預防性用途，有益或所要結果包括消除或降低疾病之風險、減輕 疾病之嚴重程度或延遲疾病發作，包括疾病、其併發症及在疾病出現期間所呈現之中間病理性表型之生物化學、組織學及/或行為症狀。對於治療性用途，有益或所要結果包括諸如以下之臨床結果：減小腫瘤尺寸、擴散、腫瘤血管或癌症或與血管生成增加相關之其他疾病的一或多種症狀；降低治療疾病所需要的其他藥物之劑量；增強另一藥物之作用及/或延遲患者疾病之進展。有效劑量可以一或多次投藥來投與。為達成本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療的量。如在臨床背景中所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可與或不與另一藥物、化合物或醫藥組合物聯合達成。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮「有效劑量」，且若與一或多種其他藥劑聯合，所需結果可達成或已達成，則可認為單一藥劑係以有效量給出。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物亦包括(但不限於)農畜、運動型動物、寵物、靈長類動物及馬。
對於投與人類個體，本發明抗體之全月劑量通常在每一患者約0.5至約1200mg範圍內，視投藥模式而定。舉例而言，靜脈內每月劑量可需要每一患者約1至約1000mg。全月劑量可以單次劑量或分次劑量投與，且可依據醫師判斷超出本文所給出之典型範圍。
本文所揭示之雜二聚體蛋白質(例如雙特異性抗體或其部分)之治療或預防有效量的一種示例性、非限制性範圍為約1至約1000毫克/患者/月。在某些實施例中，雜二聚體蛋白質可以約1至約200或約1至約150毫克/患者/月投與。
根據本發明中之方法的本發明化合物之投與可為連續或間歇的，視例如接受者之生理狀況、投藥目的為治療性還是預防性及熟練從業者已知之其他因素而定。本發明化合物之投與可基本上在預先選 擇之時段內為連續的，或可呈一系列間隔的劑量。
抗體
「抗體」為一種免疫球蛋白分子，能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變區的至少一個抗原結合位點特異性結合於諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等標靶或抗原。
如本文中所使用，除非上下文另外指明，否則該術語意欲不僅涵蓋包含兩個一致全長重鏈多肽及兩個一致輕鏈多肽之完整多株或單株抗體，且亦涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)及結構域抗體(dAb)，包括鯊魚及駱駝抗體，以及包含抗體部分、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其顯示所要生物活性即可)及如本文中所述之抗體片段的融合蛋白，及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他修飾組態，例如(但不限於)微型抗體、最大抗體、單功能抗體、肽體、內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv。
抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生。抗原結合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、dAb及互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體及含有足夠賦予特定抗原結合於多肽之Ig之至少一部分的多肽。
免疫球蛋白(Ig)結構域為通常由7至9個β股配置於兩個β-薄片中之2層夾心組成的一種類型蛋白質結構域(不過已知此等配置之變化)。β股為通常3至10個胺基酸長的一條多肽鏈，主鏈呈幾乎完全延伸之構形。β薄片由側向經至少兩個或三個主鏈氫鍵連接之β-股組成，形成總體上扭曲之褶狀薄片。股之主鏈在與薄片中其兩個相反鄰近之股相互作用之間或對於薄片邊緣之股，薄片與非薄片相互作用之間重複轉換。在數百種不同功能之蛋白質中發現Ig超家族之成員。實例包括抗體、巨肌肉激酶肌聯蛋白及受體酪胺酸激酶。Ig樣結構域可與蛋白質 -蛋白質及蛋白質-配位體相互作用有關。
免疫球蛋白(Ig)為雜多聚分子。在天然存在之Ig中，每個多聚體主要由相同對之多肽鏈構成，每一對具有一個「輕」(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。
各鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之約100至110或更多個胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能之恆定區。人類輕鏈分為κ及λ輕鏈。重鏈歸類為α、δ、ε、γ及μ，且分別將抗體之同型分別定義為IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。此等類別中之若干可進一步再分成同型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
在輕鏈及重鏈內，可變及恆定區由約12或更多個胺基酸之「J」區域接合，其中重鏈亦包括約10或更多個胺基酸之「D」區域(在整個抗體序列之情況下，D及J區域在接合之後有時視為可變區之部分)。各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點以使完整Ig具有2個結合位點。
抗體分子中之每個結構域都具有兩個β-薄片彼此抵靠緊密堆積於壓縮之反向平行β-圓筒中之類似結構。此保守結構稱為免疫球蛋白(Ig)摺疊。恆定結構域之Ig摺疊含有彼此抵靠堆積之兩個β薄片，其中每個股由相鄰的多肽鏈帶分離；此等相鄰多肽鏈帶通常包含α螺旋、環、轉角及在兩個β-薄片之間的短的尖銳轉角(稱為β-髮夾)。
可變結構域顯示由3個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)接合之相對保守構架區(FR)之相同通用結構。來自每一對之2個鏈的CDR藉由構架區比對，使得能夠結合於特定抗原決定基。自N端至C端，輕鏈及重鏈均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4結構域。
可使用此項技術中熟知之方法確定特定抗體中構成CDR之胺基酸殘基之身分。舉例而言，抗體CDR可鑑別為藉由Kabat等人最初界定 之高變區(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NIH,Washington D.C.,NIH公開案第91-3242號)。CDR之位置亦可鑑別為藉由Chothia及他人描述之結構環狀結構(Chothia等人，1989,Nature 342：877-883)。CDR鑑別之其他方法包括「AbM定義」，其為Kabat與Chothia之間的折中，且在Abysis程式(www.abysis.org)中衍生，或基於觀測到之抗原接觸的CDR「接觸定義」，闡述於MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.,262：732-745。North已鑑別使用CDR定義之不同較佳組的典型CDR構形(North等人，2011,J.Mol.Biol,406：228-256)。在另一方法(在本文中稱作CDR之「構形定義」)中，CDR之位置可鑑別為向抗原結合貢獻熱焓之殘基(Makabe等人，2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166)。雖然其他CDR邊界定義可不嚴格遵循以上方法中之一者，但仍然將與Kabat CDR之至少一部分重疊，不過其可根據以下預測或實驗發現而縮短或延長：具體殘基或殘基組或甚至整個CDR並不顯著影響抗原結合。如本文所用，CDR可指由此項技術中已知之任何方法，包括方法之組合所界定的CDR。本文所用之方法可利用根據任一此等方法界定之CDR。對於含有一個以上CDR之任何既定實施例，CDR(或抗體之其他殘基)可根據Kabat、Chothia、North、延伸、AbM、接觸及/或構形定義任一者界定。
除另外明確或上下文指示外，本文中描述之所有CH1殘基編號位置係根據SEQ ID NO：1之編號，且所有CL殘基位置在本文中根據SEQ ID NO：9之編號描述。此編號與Kabat編號最緊密相關，其在本文中使用，除以下情況外：(a)在諸如某些實驗數據展示Kabat不正確之IgM結構域的情況下；(b)當Kabat參考在內部不一致時；或(c)當另外指出時。在初始Kabat參考中，位置107A為CL之第一殘基。許多輕鏈序列未分配任何殘基給位置107A且許多在位置108亦不具有殘基。CL之第 一殘基為編號超過107之第一殘基，無論其為何者。
CH1結構域為長度較佳為至少80個殘基且其殘基與以下中之一或多者超過85%相同的蛋白質序列區域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41。在一些態樣中，CH1結構域為其殘基與SEQ ID NO：1超過85%相同之蛋白質序列。
CH2結構域為長度較佳為至少80個殘基且其殘基與以下中之一或多者超過85%相同的蛋白質序列區域：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：45。在一些態樣中，CH2結構域為其殘基與SEQ ID NO：13超過85%相同之蛋白質序列。
鉸鏈區為與以下中之一或多者超過80%一致的蛋白質序列區域：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：81。在一些態樣中，鉸鏈區為其殘基與SEQ ID NO：42超過80%相同之蛋白質序列。
CH3結構域為長度較佳為至少80個殘基且其殘基與以下中之一或多者超過85%相同的蛋白質序列區域：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49。在一些態樣中，CH3結構域為其殘基與SEQ ID NO：18超過85%相同之蛋白質序列。
CL結構域為長度較佳為至少80個殘基且其殘基與以下中之一或多者超過85%相同的蛋白質序列區域：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32。在一些態樣中，CL結構域為CLκ結構域，且與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中之一或多者共享至少85%一致性。在一些態樣中，CL結構域為CLλ結構域，且與SEQ ID NO：12共享至少85%一致性。在一些態樣中，CL結構域為其殘基與SEQ ID NO：9超過85%相同之蛋白質序列。
哺乳動物輕鏈具有兩種類型，κ及λ，且在任何既定天然存在之抗體分子中，僅僅出現一種類型。在人類中產生的κ分子大約為λ分子的兩倍，但在其他哺乳動物中此比率可變化。每個游離輕鏈分子在摺疊形成恆定及可變區結構域之單一多肽鏈中含有大約220個胺基酸。
在B細胞發育期間，在DNA層面下之重組事件用接合(J)區段接合單一可變(V)區段；恆定(C)區段後來藉由在RNA層面下剪接來接合。許多不同V區段與若干J區段重組提供各種抗原識別。藉由由末端去氧核苷醯轉移酶隨機添加核苷酸所產生之連接多樣性及藉由在脾及淋巴結中B細胞成熟期間出現之體細胞超突變實現其他多樣性。恆定κ(CLκ)區域藉由單一基因編碼，而λ恆定(CLλ)區域由多個基因編碼，且進行剪接。已知與CLλ之特定多形種類相關之若干標記物：例如IgCLλ1(Mcg標記物)；IgLC2-IgCLλ2(Kern-Oz-標記物)；IgCLλ 3(Kern-Oz+標記物)及IgCLλ7。熟習此項技術者可容易建立迄今為止在人類CLλ鏈中鑑別之所有多形現象。本發明之序列涵蓋CLκ及CLλ以及一般抗體之其他已知多形現象。已在CLκ、CLκ-V/A153及CLκ-L/V191中鑑別兩個多形基因座。迄今為止鑑別之三個多形現象為：Km(1)：CLκ-V153/L191；Km(1,2)：CLκ-A153/L191；以及Km(3)：CLκ-A153/V191。
如本文中所用之術語「Fc區域」一般係指包含免疫球蛋白重鏈 的C端多肽序列之二聚體複合物，其中C端多肽序列為可藉由木瓜蛋白酶消化完整抗體而獲得之序列。Fc區域可包含原生或變異Fc序列。免疫球蛋白之Fc序列一般包含兩個恆定結構域，即CH2結構域及CH3結構域，且視情況包含CH4結構域。術語「Fc多肽」在本文中用於指構成Fc區之多肽之一。在一些實施例中，Fc多肽可獲自或來源於任何適合之免疫球蛋白，諸如來源於各種IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型中之至少一者或來源於IgA、IgE、IgD或IgM。在某些實施例中，Fc多肽包含野生型鉸鏈序列之部分或全部(一般在其N端)。在一些實施例中，Fc多肽不包含野生型鉸鏈序列。Fc多肽可包含天然或變異Fc序列。
如本文中所使用，「免疫球蛋白樣鉸鏈區」、「免疫球蛋白樣鉸鏈序列」及其變體係指免疫球蛋白樣或抗體樣分子(例如免疫黏附素)之鉸鏈區及鉸鏈序列。在一些實施例中，免疫球蛋白樣鉸鏈區可來自或來源於任何IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型或來自IgA、IgE、IgD或IgM，包括其嵌合形式，例如嵌合IgG1/2鉸鏈區。
「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留當存在於完整抗體中時通常與彼部分相關的至少一種、較佳大多數或所有功能。
「二價抗體」每一分子(例如IgG)包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性(參見下文)。
「單價抗體」每一分子(例如IgG)包含一個抗原結合位點。在一些情況下，單價抗體可具有一個以上抗原結合位點，但結合位點來自不同抗原。
「多特異性抗體」為靶向一種以上抗原或抗原決定基之抗體。「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能性」抗體為具有兩個不同抗 原結合位點之雜合抗體。雙特異性抗體為一種多特異性抗體且可由多種方法產生，該等方法包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接。參加例如Songsivilai及Lachmann(1990),Clin.Exp.Immunol.79：315-321；及Kostelny等人(1992),J.Immunol.148：1547-1553。雙特異性抗體之兩個結合位點將結合於可位於相同或不同蛋白質標靶上之兩個不同抗原決定基。
如本文中所使用，短語「抗原結合臂」、「標靶分子結合臂」及其變體係指能夠特異性結合相關標靶分子之本發明抗體之組分部分。一般而言且較佳地，抗原結合臂為免疫球蛋白多肽序列(例如免疫球蛋白輕鏈及重鏈之CDR及/或可變結構域序列)之複合物。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體群體獲得之抗體，亦即構成此群體之個別抗體除可少量存在之可能天然存在之突變外均相同。單株抗體具有針對單一抗原之高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑不同，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。
如本文中所使用，術語「免疫黏附素」表示抗體樣或免疫球蛋白樣分子，其將異源蛋白質之「結合結構域」(「黏附素」，例如受體、配位體或酶)與免疫球蛋白恆定結構域之效應組分組合。在結構上，免疫黏附素包含具有所要結合特異性之黏附素胺基酸序列(其不同於抗體(亦即具「異源性」)之抗原識別及結合位點(抗原組合位點))與免疫球蛋白恆定結構域序列之融合物。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。
Fab片段為由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；F(ab')2片段為包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；Fd片段由VH及CH1結構域組成；Fv片段由抗體單臂之VL及VH結構域組 成；且dAb片段由VH結構域或VL結構域(例如人類、駱駝或鯊魚)組成。
單鏈抗體(scFv)為其中VL及VH區經由能夠將其製備為單一蛋白質鏈之合成連接子配對形成單價分子之抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL結構域在單一多肽鏈上表現，但使用太短以致不允許2個結構域之間於同一鏈上配對的連接子，從而迫使結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生2個抗原結合位點。一或多個CDR可共價或非共價併入分子中以使其成為免疫黏附素。免疫黏附素可合併作為較大多肽鏈之部分的CDR，可共價連接CDR至另一多肽鏈或可非共價合併CDR。CDR允許免疫黏附素特異性結合於相關特定抗原。
抗體可具有一或多個結合位點。若存在一個以上結合位點，則結合位點可彼此一致或可不同。舉例而言，天然存在之抗體具有2個相同結合位點，單鏈抗體或Fab片段具有一個結合位點，而「雙特異性」或「雙功能」抗體具有2個不同結合位點。
「分離之抗體」為一種抗體，其(1)不與在其天然狀態下伴隨其之天然締合之組分，包括其他天然締合之抗體締合，(2)不含來自相同物種之其他蛋白質，(3)藉由不天然表現抗體之細胞表現或藉由來自不同物種之細胞表現，或(4)在自然界中不存在。
術語「人類抗體」包括具有一或多個來源於人類Ig序列之可變區及恆定區之所有抗體。在本發明之一些實施例中，抗體之所有可變及恆定結構域均來源於人類Ig序列(完全人類抗體)。
人類化抗體為來源於非人類物種之抗體，其中某些胺基酸已突變，以避免或消除在人類中之免疫反應。或者，人類化抗體可藉由來自人類抗體之恆定結構域與非人類物種之可變結構域融合來產生。
術語「嵌合抗體」係指一種含有一或多個來自一種抗體之區域和一或多個來自一或多種其他抗體之區域的抗體。每個抗體可以來源 於分開的物種(諸如人類及小鼠)。
術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合於Ig或T細胞受體之任何分子決定子。抗原決定基決定子通常由諸如胺基酸或糖側鏈之原子之表面基團組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及荷質比特徵。當解離常數<1μM，較佳<100nM且更佳<10nM時，抗體稱為特異性結合抗原。
預期全人類抗體將小鼠或小鼠來源之單株抗體(Mab)內源性的免疫原性及過敏性反應降至最低且因此增加所投抗體之功效及安全性。可預期使用全人類抗體在治療可能需要重複抗體投藥之慢性及復發性人類疾病，諸如發炎及癌症中提供巨大優勢。
另外，可產生將兩個(或兩個以上)單鏈抗體彼此連接之融合抗體。若想要於單一多肽鏈上產生二價或多價抗體或若想要產生雙特異性抗體，則其適用。
如本文所使用，「Fc融合物」意謂其中一或多個多肽可操作地連接於Fc多肽之蛋白質。Fc融合物將免疫球蛋白之Fc區與一般可為任何蛋白質、多肽或小分子之融合搭配物組合。實際上任何蛋白質或小分子均可連接至Fc以產生Fc融合物。蛋白質融合搭配物可包括(但不限於)受體之標靶結合區、黏附分子、配位體、酶、細胞因子、趨化因子或一些其他蛋白質或蛋白質結構域。小分子融合搭配物可包括引導Fc融合物至治療標靶之任何治療劑。此類標靶可為任何分子，例如(但不限於)涉及疾病之細胞外受體。
一種類型之衍生化抗體係藉由使兩種或兩種以上(相同類型或不同類型)抗體交聯(例如以產生雙特異性抗體)而產生。適合交聯劑包括呈異型雙官能(具有2個經適當間隔基(例如間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯)分隔的不同反應基)或同型雙官能(例如辛二酸二丁二醯亞胺酯)的交聯劑。
另一類型衍生化抗體為標記抗體。可衍生本發明之抗體或抗體部分的適用偵測試劑包括螢光化合物，包括螢光素、螢光素異硫氰酸鹽、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素、鑭系元素磷光體及其類似物。抗體亦可用適用於偵測之酶標記，諸如辣根過氧化酶、半乳糖、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶及其類似物。當抗體用可偵測酶標記時，其藉由添加額外試劑偵測，酶使用該等試劑產生可辨別之反應產物。例如，當存在試劑辣根過氧化物酶時，過氧化氫及對二胺基聯苯之添加產生可偵測之有色反應產物。亦可用生物素標記抗體且經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈黴素之結合偵測。抗體可用諸如釓之磁性劑標記。亦可用由第二報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤)標記抗體。在某些實施例中，以各種長度之間隔臂連接標記以減少潛在的位阻
抗體亦可用諸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基團之化學基團衍生。該等基團可用於改良抗體之生物學特徵，例如增加血清半衰期或增加組織結合。
抗體特異性
在包含抗原結合結構域之一些實施例中，至少抗原結合結構域(例如(但不限於)具有所有6個CDR之抗體可變區或與抗體可變區至少90%一致之同等區域)選自以下中發現之抗原結合結構域：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿巴西普(abatacept)(ORENCIA®)、阿昔單抗(abciximab)(REOPRO®、c7E3 Fab)、阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRA®)、阿達木單抗(adecatumumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)(CAMPATH®、MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿非莫單抗(afelimomab)、麻安莫單抗(anatumomab mafenatox)、安圖莫單抗(anetumumab)、安卡祖單抗(anrukizumab)、 阿泊珠單抗(apolizumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿塞珠單抗(aselizumab)、阿利珠單抗(atlizumab)、阿托木單抗(atorolimumab)、貝頻珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)(SIMULECT®)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)(LYMPHOSCAN®)、貝利單抗(belimumab)(LYMPHO-STAT-B®)、柏替木單抗(bertilimumab)、貝斯萊單抗(besilesomab)、βcept(ENBREL®)、貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN®)、波比西單抗(biciromab brallobarbital)、比伐珠單抗美坦辛(bivatuzumab mertansine)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)(ADCETRIS®)、康納單抗(canakinumab)(ACZ885)、坎妥珠單抗美坦辛(cantuzumab mertansine)、卡羅單抗(capromab)(PROSTASCINT®)、卡托莫西單抗(catumaxomab)(REMOV AB®)、西利珠單抗(cedelizumab)(CIMZIA®)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX®)、克立昔單抗(clenoliximab)、達賽珠單抗(dacetuzumab)、達昔單抗(dacliximab)、達利珠單抗(daclizumab)(ZENAPAX(®)、德諾單抗(denosumab)(AMG 162)、地莫單抗(detumomab)、阿托度單抗(dorlimomab aritox)、得利西珠單抗(dorlixizumab)、頓塔姆單抗(duntumumab)、杜瑞姆單抗(durimulumab)、杜姆路單抗(durmulumab)、艾美斯單抗(ecromeximab)、艾庫組單抗(eculizumab)(SOLIRIS®)、埃巴單抗(edobacomab)、依決洛單抗(edrecolomab)(Mab17-1A、PANOREX®)、艾法珠單抗(efalizumab)(RAPTIVA®)、依芬古單抗(efungumab)(MYCOGRAB®)、艾思莫單抗(elsilimomab)、聚乙二醇化恩莫單抗(enlimomab pegol)、西艾莫單抗(epitumomab cituxetan)、艾法珠單抗(efalizumab)、依匹莫單抗(epitumomab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、厄利珠單抗(erlizumab)、 厄吐瑪單抗(ertumaxomab)(REXOMUN®)、艾塔西珠單抗(etaracizumab)(艾塔珠單抗(etaratuzumab)、VITAXIN®、ABEGRINTM)、艾比維單抗(exbivirumab)、法諾索單抗(fanolesomab)(NEUTROSPEC®)、法拉莫單抗(faralimomab)、泛維珠單抗(felvizumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)(HUZAF®)、加利昔單抗(galiximab)、羅氏單抗(gantenerumab)、加維莫單抗(gavilimomab)(ABX-CBL(R))、吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(MYLOTARG®)、戈利木單抗(golimumab)(CNTO 148)、魯昔單抗(gomiliximab)、巴利珠單抗(ibalizumab)(TNX-355)、布突默單抗泰澤坦(ibritumomab tiuxetan)(ZEVALIN®)、伊戈伏單抗(igovomab)、英西單抗(imciromab)、英利昔單抗(infliximab)(REMICAD E®)、伊諾莫單抗(inolimomab)、奧英妥珠單抗(inotuzumab ozogamicin)、伊派利單抗(ipilimumab)(YERVOY®、MDX-010)、伊吐珠單抗(iratumumab)、凱利昔單抗(keliximab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、萊瑪利單抗(lemalesomab)、萊布利珠單抗(lebrilizumab)、樂地單抗(lerdelimumab)、來沙木單抗(lexatumumab)(HGS-ETR2、ETR2-ST01)、萊西姆單抗(lexitumumab)、利比維單抗(libivirumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、盧卡姆單抗(lucatumumab)、魯昔單抗(lumiliximab)、馬帕姆單抗(mapatumumab)(HGS-ETRl、TRM-I)、馬司莫單抗(maslimomab)、馬妥珠單抗(matuzumab)(EMD72000)、美泊利單抗(mepolizumab)(BOSATRIA®)、美泊珠單抗(metelimumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫羅木單抗(morolimumab)、莫維珠單抗(motavizumab)(NUMAXTM)、莫羅莫那(muromonab)(OKT3)、他那可單抗(nacolomab tafenatox)、艾那莫單抗(naptumomab estafenatox)、那他珠單抗(natalizumab)(TYSABRI®、ANTEGREN®)、奈巴庫單抗 (nebacumab)、奈瑞莫單抗(nerelimomab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)(THERACIM hR3®、THERA-CIM-hR3®、THERALOC®)、莫諾非單抗(nofetumomab merpentan)(VERLUMA®)、奧克珠單抗(ocrelizumab)、奧度莫單抗(odulimomab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)(XOLAIR®)、奧戈伏單抗(oregovomab)(OVAREX®)、奧昔珠單抗(otelixizumab)、帕巴西單抗(pagibaximab)、帕利珠單抗(palivizumab)(SYNAGIS®)、帕尼單抗(panitumumab)(ABX-EGF、VECTIBIX®)、帕考珠單抗(pascolizumab)、潘妥莫單抗(pemtumomab)(THERAGYN®)、帕妥珠單抗(pertuzumab)(2C4、OMNITARG®)、培克珠單抗(pexelizumab)、皮圖莫單抗(pintumomab)、珀奈珠單抗(ponezumab)、普立昔單抗(priliximab)、普吐目單抗(pritumumab)、來尼珠單抗(ranibizumab)(LUCENTIS®)、瑞西巴庫單抗(raxibacumab)、瑞加韋單抗(regavirumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、瑞圖西單抗(rituximab)(RITUXAN®、MabTHERA®)、羅維珠單抗(rovelizumab)、盧利珠單抗(ruplizumab)、薩圖莫單抗(satumomab)、賽維如單抗(sevirumab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、希普利珠單抗(siplizumab)(MEDI-507)、索土珠單抗(sontuzumab)、斯塔姆單抗(stamulumab)(Myo-029)、索樂莎單抗(sulesomab)(LEUKOSCAN®)、特他卡珠單抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗(talizumab)、帕塔利單抗(taplitumomab paptox)、特非珠單抗(tefibazumab)(AUREXIS®)、阿替莫單抗(telimomab aritox)、替奈昔單抗(teneliximab)、替利珠單抗(teplizumab)、替西單抗(ticilimumab)、托西利單抗(tocilizumab)(ACTEMRA®)、托珠單抗(toralizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN®)、曲美單抗(tremelimumab)(CP-675,206)、西莫白介素土庫珠單抗 (tucotuzumab celmoleukin)、吐維如單抗(tuvirumab)、烏珠單抗(urtoxazumab)、優西努單抗(ustekinumab)(CNTO 1275)、伐利昔單抗(vapaliximab)、維托珠單抗(veltuzumab)、維帕莫單抗(vepalimomab)、維西珠單抗(visilizumab)(NUVION®)、沃洛昔單抗(volociximab)(M200)、沃圖姆單抗(votumumab)(HUMASPECT®)、紮魯姆單抗(zalutumumab)、紮木單抗(zanolimumab)(HuMAX-CD4)、齊拉木單抗(ziralimumab)或阿佐莫單抗(zolimomab aritox)。
在包含抗原結合結構域之一些實施例中，抗原結合結構域包含具有六個CDR之重鏈及輕鏈可變結構域，及/或與選自前述清單之抗體競爭結合。在包含抗原結合結構域之一些實施例中，抗原結合結構域結合與前述清單中之抗體相同的抗原決定基。在包含抗原結合結構域之一些實施例中，抗原結合結構域包含具有六個總CDR之重鏈及輕鏈可變結構域，且結合於與前述清單中之抗體相同的抗原。
在包含抗原結合結構域之一些實施例中，至少第一抗原結合結構域包含具有六個(6)總CDR之重鏈及輕鏈可變結構域，且特異性結合於選自以下各者之抗原：PDGFRα、PDGFRβ、PDGF、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGF、FGF2、HGF、KDR、flt-1、FLK-1、Ang-2、Ang-1、PLGF、CEA、CXCL13、Baff、IL-21、CCL21、TNF-α、CXCL12、SDF-I、bFGF、MAC-I、IL23p19、FPR、IGFBP4、CXCR3、TLR4、CXCR2、EphA2、EphA4、EphrinB2、EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)、HER4(ErbB4或tyro2)、SC1、LRP5、LRP6、RAGE、s100A8、s100A9、Nav1.7、GLP1、RSV、RSV F蛋白質、流感HA蛋白質、流感NA蛋白質、HMGB1、CD16、CD19、CD20、CD21、CD28、CD32、CD32b、CD64、CD79、CD22、ICAM-I、FGFR1、FGFR2、HDGF、EphB4、 GITR、β-澱粉樣蛋白、hMPV、PIV-I、PIV-2、OX40L、IGFBP3、cMet、PD-I、PLGF、Neprolysin、CTD、IL-18、IL-6、CXCL-13、IL-IR1、IL-15、IL-4R、IgE、PAI-I、NGF、EphA2、uPARt、DLL-4、αvβ5、αvβ6、α5β1、α3β1、干擾素受體I型及II型、CD 19、ICOS、IL-17、因子II、Hsp90、IGF、IGF-I、IGF-II、CD 19、GM-CSFR、PIV-3、CMV、IL-13、IL-9及EBV。
在包含抗原結合結構域之一些實施例中，至少第一抗原結合結構域特異性結合於TNF超家族之成員(受體或配位體)。各種分子包括(但不限於)腫瘤壞死因子-α(「TNF-α」)、腫瘤壞死因子-β(「TNF-β」)、淋巴毒素-α(「LT-α」)、CD30配位體、CD27配位體、CD40配位體、4-1 BB配位體、Apo-1配位體(亦稱為Fas配位體或CD95配位體)、Apo-2配位體(亦稱為TRAIL)、Apo-3配位體(亦稱為TWEAK)、骨保護素(OPG)、APRIL、RANK配位體(亦稱為TRANCE)、TALL-I(亦稱為BIyS、BAFF或THANK)、DR4、DR5(亦稱為Apo-2、TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER)、DR6、DcR1、DcR2、DcR3(亦稱為TR6或M68)、CAR1、HVEM(亦稱為ATAR或TR2)、GITR、ZTNFR-5、NTR-I、TNFL1、CD30、LTBr、4-1BB受體及TR9。
在包含抗原結合結構域之一些實施例中，至少第一抗原結合結構域能夠結合一或多種選自以下各者之標靶：5T4、ABL、ABCB5、ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、AD0RA2A、聚集蛋白聚糖、AGR2、AICDA、AIFI、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、血管生成素(ANG)、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、磷脂結合蛋白A2、ANPEP、APC、APOC1、AR、芳香酶、ATX、AX1、AZGP1(鋅-a-醣蛋白)、B7.1、B7.2、B7-H1、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCR、BCL2、BCL6、BDNF、 BLNK、BLR1(MDR15)、BIyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDF1O)、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP11、BMP12、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(網格蛋白)、BRCA1、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCLI 1(嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、非淋巴組織趨化因子-2(exodus-2)、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CD1C、CD20、CD200、CD-22、CD24、CD28、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD46、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD105、CD137、CDH1(E-鈣黏素)、CDCP1CDH10、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、 CER1、CHGA、CHGB、殼質酶、CHSTlO、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(緊密連接蛋白-7)、CLN3、CLU(群集素)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COL1 8A1、COL1A1.COL4A3、COL6A1、CR2、Cripto、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTL8、CTNNB1(b-連環蛋白)、CTSB(組織蛋白酶B)、CX3CL1(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL1O(IP-IO)、CXCLI1(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL 14、CXCL 16、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、Cyr61、CYSLTR1、c-Met、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、ECGF15EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、ELAC2、ENG、內皮因子、ENO1、EN02、EN03、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA1O、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRIN-A3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRTN-B3、EPHB4、EPG、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、雌激素受體、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、法呢基轉移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF1O、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21(諸如mimAb1)、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FIL1(ε)、FBL1(ζ)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纖維結合蛋白)、FLT1、FLT-3、 FOS、FOSL1(FRA-I)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GD3、GDF5、GDF8、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR1O)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC1O(C1O)、骨形態蛋白(gremlin)、GRP、GSN(膠溶素)、GSTP1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、刺蝟、HGF、HIF1A、HIP1、組織胺及組織胺受體、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、DL-I、IL1O、IL1ORA、IL1ORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、IL-IRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL1 IRA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、1L16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、ILIA、IL1B、IL1F1O、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、DL1F9、IL1HY1、IL1R1、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2、IL1RN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、IL4R、IL6ST(醣蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAKI、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(α6整合素)、ITGAV、ITGB3、 ITGB4(β4整合素)、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KIM-1、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK1O、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(頭髮特異性II型角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦素)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LRP5、LRP6、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MCP-I、MDK、MIB1、中期因子、MIF、MISRII、MJP-2、MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金屬硫黏素-Ui)、mTOR、MTSS1、MUC1(黏蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神經黏蛋白、神經調節蛋白-1、神經纖毛蛋白-1、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、N0X5、NPPB、NROB1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、OCT-1、ODZ1、OPN1、OPN2、OPRD1、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、peg-天冬醯胺酶、PF4(CXCL4)、叢蛋白B2(PLXNB2)、PGF、PGR、磷酸黏蛋白、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG5PLXDC1、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、pro-NGF、鞘脂激活蛋白原、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配位體、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI10(ZNF144)、Ron、R0B02、RXR、選擇素、 S100A2、S100A8、S100A9、SCGB 1D2(親脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(內皮單核活化細胞因子)、SDF2、SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺絲抑蛋白)、SERPINE1(PAI-I)、SERPINF1、SHIP-I、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Spr1)、ST6GAL1、STAB1、STAT6、STEAP、STEAP2、SULF-1、Sulf-2、TB4R2、TBX21、TCP1O、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反應蛋白-1)、THBS2/THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、組織因子、TIKI2、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6JLR7、TLR8、TLR9、TM4SF1、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFI1A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF1O(TRAIL)、TNFSF1 1(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF 18、TNFSF4(OX40配位體)、TNFSF5(CD40配位體)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配位體)、TNFSF8(CD30配位體)、TNFSF9(4-1BB配位體)、TOLLIP、Toll樣受體、TLR2、TLR4、TLR9、T0P2A(局部異構酶Iia)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TRPC6、TROY、TSLP、TWEAK、酪胺酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、Wnt-1、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、XCL2(SCM-Ib)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、YY1及ZFPM2。
定義
一般而言，本文描述之結合生物化學、分析化學、合成有機化 學、藥物及醫藥化學、細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳及蛋白質及核酸化學及雜交使用的命名法及技術為在此項技術中熟知且常用之命名法及技術。除非另外指示，否則本發明之方法及技術一般根據此項技術中熟知且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般及更特定文獻中所描述之習知方法來進行。反應及純化技術係根據製造商之說明書，如此項技術中通常所實現或如本文中所述來進行。如本文中所使用，20種天然或習知胺基酸及其縮寫遵循IUPAC單字母及三字母代碼。
如本文中所使用，「互補殘基組」係指經工程改造以彼此相互作用的CH-1結構域中之至少一個胺基酸與CL結構域中之至少一個胺基酸。藉由彼此相互作用，其驅動其相應結構域雜二聚且形成包含互補殘基組之殘基之間的至少一些相互作用之界面。相互作用特徵可在於鹽橋、靜電相互作用或凡得瓦爾力(van der Waals force)。互補殘基組可在每個結構域中包含一個以上經工程改造之殘基。
互補殘基組內之任何既定殘基將在該互補殘基組之至少一個其他殘基5Å內。
在互補殘基組之情況下，若每個殘基之至少一個原子在彼此5Å內，則兩個殘基稱為相互作用。殘基相互作用特徵可在於鹽橋、靜電相互作用或凡得瓦爾力。為避免疑義，在其他情況下，認識到原子間力可在較長距離上起作用。
結構域之間的「互補配對」係指彼兩個結構域至少部分經由互補殘基組之相互作用。
如本文中所使用，「工程改造」係指未在主要野生型序列中發現之殘基的有意突變，且可為工程改造之插入、缺失或取代突變。
「雜多聚體」、「雜多聚體複合物」或「雜多聚體多肽」為至少包含第一多肽及第二多肽之分子，其中第二多肽與第一多肽之胺基酸 序列的不同之處在於至少一個胺基酸殘基。雜多聚體可包含藉由第一及第二多肽形成之「雜二聚體」或可形成高階三級結構，其中存在除第一及第二多肽之外的多肽。
「雜二聚體」、「雜二聚體蛋白質」、「雜二聚體複合物」或「雜多聚體多肽」為包含第一多肽及第二多肽之分子，其中第二多肽與第一多肽之胺基酸序列的不同之處在於至少一個胺基酸殘基。
在本發明之上下文中，術語雜二聚體用於指示包含至少兩種具有不同胺基酸序列之多肽的雜多聚體；但將容易瞭解，在多個實施例中，特別本發明係關於IgG抗體及類似分子之實施例中，本發明之雜二聚體蛋白質可同等稱作雜多聚蛋白質，因為將必定存在四種不同多肽(第一重鏈及輕鏈及第二重鏈及輕鏈)。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可在本文中互換使用，以指胺基酸殘基之聚合物。如本文中所使用，此等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人造化學類似物的胺基酸聚合物。此等術語亦適用於天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸可呈L-形式或D-形式，只要維持肽之結合及其他所要特徵即可。多肽可為單體或聚合物。該等術語亦涵蓋已天然或藉由介入來修飾之胺基酸鏈；例如，二硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙醯化作用、磷酸化作用，或任何其他操作或修飾(諸如與標記組分結合)。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應瞭解，多肽可作為單一鏈或締合鏈出現。
除非另外藉由「D」字首指示，例如D-Ala或N-Me-D-Ile，或以小寫字母格式書寫，例如a、i、l(Ala、Ile、Leu之D型式)，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所描述之肽中的胺基酸及胺基醯基殘基之α-碳的立體化學為天然或「L」組態。
所有肽序列均根據一般公認之慣例書寫，因此α-N端胺基酸殘基在左側且α-C端胺基酸殘基在右側。如本文所使用，術語「N端」係指肽中胺基酸之游離α-胺基，且術語「C端」係指肽中胺基酸之游離α-羧酸末端。經基團進行N封端之肽係指在N端胺基酸殘基之α-胺基氮上具有基團之肽。經基團進行C封端之胺基酸係指在羧基部分上具有基團之胺基酸，諸如產生甲酯之甲基。
如本文中所使用，「生物活性」係指化合物、組合物或其他混合物之活體內活性或在活體內投與化合物、組合物或其他混合物後的生理反應。因而生物活性涵蓋此類化合物、組合物及混合物之治療作用、診斷作用及醫藥活性。
如本文所使用，術語「生物學上相容」意謂某物為生物惰性或與細胞內及細胞外生物分子不反應，且無毒。
「約」或「大致」在與可量測數值變數一起使用時係指變數之指定值且係指變數之所有在指定值之實驗誤差範圍內(例如，在平均值之95%信賴區間範圍內)或在指定值之±10%範圍內的值，無論哪一者之範圍更大。數值範圍包括界定範圍之數值。
如此項技術中已知，術語「一致性」係指如藉由比較序列所確定，兩種或兩種以上多肽分子或兩種或兩種以上核酸分子之序列之間的關係。在此項技術中，「一致性」亦意謂如藉由核苷酸或胺基酸序列鏈帶之間的匹配所確定，多肽或核酸分子序列之間的序列相關性程度，視具體情況而定。「一致性」量測在藉由計算機程式之特定數學模型(亦即「演算法」)解決之間隙比對下兩個或兩個以上序列之間的一致匹配百分比。
術語「相似性」為一個相關概念，但與「一致性」相對比，係指包括一致匹配與保守取代匹配之相似性的量度。因為保守取代適用於多肽而不適用於核酸分子，所以相似性僅僅處理多肽序列比較。若 兩個多肽序列具有例如10/20之一致胺基酸且剩餘部分均為非保守取代，則一致性及相似性百分比將均為50%。若在相同實例中，尚存在5個存在保守取代之位置，則一致性百分比保持50%但相似性百分比為75%(15/20)。因此，在存在保守取代之情況下，兩個多肽序列之間的相似性程度將高於此兩個序列之間的一致性百分比。
術語「保守胺基酸取代」係指天然胺基酸殘基經非原生殘基取代，使得對該位置之胺基酸殘基的極性、電荷及近似體積幾乎無影響。舉例而言，保守取代由多肽中之非極性殘基經任何其他非極性殘基置換產生。該術語亦可指鑑別為時常出現在高度相似蛋白質之間的取代，如BLOSUM62矩陣或相關矩陣中(PNAS,USA 89(22),10915-9,1992)。
如本文中所使用，術語「載體」欲指一種核酸分子，其能夠輸送已與其連接之另一核酸。一種類型之載體為「質體」，其係指內部可接合其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類載體為噬菌體載體。另一種類型之載體為病毒載體，其中可將其他DNA區段接合至病毒基因組。某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞之後整合至宿主細胞基因組中，且從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其操作性連接之基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「重組載體」)。一般而言，重組DNA技術中所用之表現載體通常呈質體形式。因為質體為載體之最常用形式，所以在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用。
在本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸分子」係指長度為至少10個鹼基的核苷或核苷酸之可能分離之聚合物形式。該術語包括單股及雙股形式。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修 飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何基質。
聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在裝配聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。 核苷酸之序列可由非核苷酸組分中斷。可在合成後諸如藉由與標記結合對聚核苷酸進行進一步修飾。其他類型之修飾例如包括：「帽」，一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等)之核苷酸及具有帶電鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之核苷酸、含有懸垂部分(諸如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-離胺酸等))之核苷酸、具有嵌入劑(例如吖啶(acridine)、補骨脂素(psoralen)等)之核苷酸、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之核苷酸、含有烷化劑之核苷酸、具有經修飾之鍵之核苷酸(例如α變旋異構體核酸等)以及聚核苷酸之未修飾形式。另外，通常存在於糖中之任何羥基均可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基團保護或經活化以製備與額外核苷酸之額外連接；或可與固體或半固體支撐物結合。5'及3'端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機帶帽基部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有該項技術中通常已知之核糖或去氧核糖的類似形式，其例如包括2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基核糖、2'-氟-核糖或2'-疊氮基-核糖、碳環形糖類似物、α-變旋異構體糖、差向異構體糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptuloses))、非環形類似物及非鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖核苷。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性連接基團置換。此等替代連接基團包括但不限於如下實施例，其中磷酸酯基置換為P(O)S(「硫代酸酯」)、P(S)S(「二硫代酸酯」)、(O)NR2(「醯胺化物」)、 P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚鍵(--O--)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)之經取代或未經取代的烷基(1-20 C)。聚核苷酸中之所有連接無需相同。上述描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文中所使用，「寡核苷酸」泛指一般單股之一般合成的短聚核苷酸，其長度一般(但不一定)小於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」及「聚核苷酸」不是互斥的。上文有關聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。
除非另外說明，否則如本文所使用，對一種核酸序列之提及涵蓋其互補序列。因此，應瞭解除非上下文以其他方式界定，對一種具有特定序列之核酸的提及涵蓋其互補股以及其互補序列。
如本文中所使用，「細胞」或「細胞株」包括可用於表現本發明之雜二聚體蛋白質、多肽或核酸的各種細胞類型，例如原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、大鼠細胞、人類細胞。
術語「純化」及其語法變體用於意謂自含有多肽及一或多種雜質之混合物移除至少一種雜質，無論完全還是部分，由此提高組合物中多肽之純度(亦即藉由降低組合物中雜質之量(ppm))。
術語「離子交換」及「離子交換層析法」係指其中在適當pH值及導電性條件下相關可電離溶質(例如混合物中之相關蛋白質)與連接(例如藉由共價連接)至固相離子交換物質之帶相反電荷之配位體相互作用，使得與混合物中之溶質雜質或污染物相比，相關溶質與帶電化合物更多或更少地非特異性地相互作用的層析過程。混合物中之污染溶質可比相關溶質更快或更慢地自離子交換物質之管柱洗滌或結合於樹脂或自樹脂排除。「離子交換層析法」特定包括陽離子交換、陰離子交換及混合模式層析。
「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為抑制或降低所結合之抗原的生物活性的抗體。如本文中所使用之「促效劑抗體」為一種模擬相關多肽之至少一種功能活性的抗體。
如本文所使用，術語「免疫效應細胞」或「效應細胞」係指人類免疫系統中天然細胞譜系內之細胞，其可經活化而影響標靶細胞之活力。標靶細胞之活力可包括細胞存活、增殖及/或與其他細胞相互作用之能力。
鹽橋為一種類型非共價相互作用。鹽橋包含帶相反形式電荷之兩個原子之間的緊密範圍內的直接相互作用。在蛋白質結構之情況下，鹽橋最常在天冬胺酸或麩胺酸之陰離子羧酸根(RCOO-)與離胺酸之陽離子銨(RNH3 +)或精胺酸之鈲(RNHC(NH2)2 +)之間形成，其中組胺酸亦可能。然而，其他胺基酸可參與，視其pKa值之改變及在多肽鏈中之位置(N及C端殘基可離子化，且因此能夠形成鹽橋，無論胺基酸類型如何)而定。
靜電相互作用為具有非零電荷之原子之間的非共價相互作用。其可具有有利、不利或中性相互作用能量，且可包括具有形式電荷或儘管缺乏形式電荷，但經極化之原子。氫鍵、鹽橋及π-陽離子堆疊為時常在蛋白質結構中觀測到之靜電相互作用之實例。
對蛋白質及有時RNA序列通常特定的結構比對使用關於蛋白質或RNA分子之二級及三級結構的資訊來幫助比對序列。此等方法用於兩個或兩個以上序列且通常產生局部比對；然而，因為其視結構資訊之可用性而定，所以其僅可用於對應結構已知之序列(通常經由X射線結晶法或NMR光譜法)。因為蛋白質與RNA結構均比序列更進化保守，所以在距離很遠且廣泛不同，使得序列比對無法可靠地偵測其相似性的序列之間結構比對可更可靠。在關於蛋白質之一的結構數據不可獲得的情況下，若可獲得關於一種或較佳為更緊密相關之蛋白質的 結構數據，諸如跨越物種之免疫球蛋白且在跨越物種及亞型之特定抗體恆定結構域中，則仍然可進行比較。
結構比對用作「最高標準」，因為其明確比對蛋白質序列之在結構上類似的區域，而不僅僅依賴於序列資訊。結構比對之常用演算法為TM-ALIGN(Zhang及Skolnick,Nucleic Acids Research,33：2302-2309(2005))，其在疊合期間將增加之權重分配給結構之最類似區域。
序列比對
在例如由於不存在標靶序列NMR或晶體結構數據，使得本發明之蛋白質序列的結構比對不可能的情況下，可使用序列比對。熟習此項技術者熟悉序列比對工具(諸如BLAST、CLUSTAL及熟習此項技術者已知之其他比對工具，諸如本文描述之比對工具)，且尤其由於已存在跨越亞型及物種，免疫球蛋白結構域、尤其抗體及抗體恆定結構域之大量示例性結構研究，而能夠根據已知結構基元比對序列，特別抗體恆定結構域序列。
序列比對之計算方法一般分成兩個類別：全局比對及局部比對。計算全局比對為「強迫」跨越所有查詢序列之整個長度比對的一種全局最佳化形式。相比之下，局部比對鑑別長序列內常常整體廣泛不同的具有相似性之區域。局部比對常常較佳，但因為鑑別相似性區域之額外挑戰而可更難以計算。多種計算演算法已應用於序列比對問題。此等包括緩慢但形式上正確之方法，如動態程式化且亦有效之啟發演算法或設計用於大規模數據庫搜索之概率性方法，其不保證尋找到最佳匹配。
當查詢組中之序列相似且尺寸粗略相同時嘗試比對每一序列中之每一殘基的全局比對最適用。通用全局比對技術為尼德曼-翁施演算法(Needleman-Wunsch algorithm)，其係基於動態程式化。局部比對 更適用懷疑在較大序列背景下含有相似性之區域或相似序列基元的不相似序列。史密斯-沃特曼演算法(Smith-Waterman algorithm)為亦基於動態程式化之通用局部比對方法。
成對序列比對方法用於分段尋找最佳匹配(局部)或兩個查詢序列全局比對。產生成對比對之三個主要方法為點-陣法、動態程式化及單字法；然而，多個序列比對技術亦可比對成對序列。雖然每種方法具有其個別優點及弱點，但所有三種成對方法均對低資訊內容之高度重複序列有困難-尤其在待比對之兩個序列中重複數目不同的情況下。一種定量既定成對比對之效用的方式為『最大獨特匹配』(MUM)，或在兩個查詢序列中出現之最長子序列。較長MUM序列通常反映更緊密之相關性。設計用於確定一致性及/或相似性的較佳方法以在所測試序列之間產生最大匹配。測定一致性及相似性之方法係以公開可利用之電腦程式編碼。確定兩個序列之間的一致性及相似性之較佳電腦程式方法包括(但不限於)GCG程式套裝，包括GAP(Devereux等人，Nuc.Acids Res.12：387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)、BLASTP、BLASTN及FASTA(Atschul等人，J.Mol.Biol.215：403-10(1990))。BLAST X程式可公開購自美國國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI)及其他來源(Altschul等人，BLAST Manual(NCB NLM NIH,Bethesda,MD)；Altschul等人，1990，上述)。熟知之史密斯-沃特曼演算法亦可用於測定一致性。
藉由實例，使用計算機演算法GAP(Genetics Computer Group)，將有待確定序列一致性%之兩個多肽比對，以最佳匹配其相應胺基酸(「匹配跨度」，如藉由演算法確定)。將間隙開放罰分(其如下計算：3×平均對角線；「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」為由特定比較矩陣分配給各完全胺基酸匹配之得分或數 值)及間隙擴展罰分(其通常為0.1×間隙開放罰分)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與該演算法結合使用。多肽序列比較之較佳參數包括以下：Algorithm：Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443-53(1970)。比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-19(1992)。
熟習此項技術者可使用其他示例性演算法、間隙開放罰分、間隙擴展罰分、比較矩陣、相似性閾值等，包括the Program Manual,WisconsinPackage，第9版，1997年9月中所闡述者。進行之特定選擇將視以下而定：進行之特定比較，諸如DNA與DNA、蛋白質與蛋白質、蛋白質與DNA；以及另外，比對在既定對之序列之間(在此情況下GAP或一般較佳)還是在一種序列與序列大數據庫之間(在此情況下FASTA或BLASTA為較佳)。
對於具有保守結構之特定蛋白質家族，可利用其他比對演算法。在抗體之情況下，可利用用於分配Kabat編號之各種演算法。除非另外說明，否則Abysis之2012版(www.abysis.org)中執行之演算法在本文中用於分配Kabat編號給可變區。
核酸序列上下文中之術語「序列一致性百分比」意謂當兩個序列進行比對以求最大一致性時相同之殘基。序列一致性比較之長度可超過一串至少約9個核苷酸，一般為至少約18個核苷酸，更一般為至少約24個核苷酸，通常為至少約28個核苷酸，更通常為至少約32個核苷酸，且較佳為至少約36、48或更多個核苷酸。此項技術中已知的多種不同運算法可用於量測核苷酸序列一致性。舉例而言，聚核苷酸序列可使用FASTA、Gap或Bestfit比較，該等為Wisconsin Package 10.0版，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin中之程式。包括例如程式FASTA2及FASTA3之FASTA提供查詢與搜索序列之間最佳重疊區域之比對及序列一致性%(Pearson,Methods Enzymol.183：63-98 (1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol.266：227-258(1996)；Pearson,J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；以引用的方式併入本文中)。除非另外規定，否則使用特定程式或演算法之預設參數。舉例而言，可使用GCG 6.1版(其以引用的方式併入本文中)中所提供之具有其預設參數(字長6及用於計分矩陣之NOPAM係數)之FASTA或具有其預設參數之Gap測定核酸序列之間的序列一致性百分比。
序列表
表1序列表。短劃線(「-」)指示經引入以比對使用Kabat編號之各種異型及同型結構域之間隙。調整比對，使得10個殘基之嵌段之間的邊界(空間)始終在編號位置在「0」結束之殘基與編號位置在「1」結束之殘基之間。在結構域未在編號位置以「1」結束之殘基開始的情況下，插入偽填補間隙以調整比對。舉例而言，對於CH1(Seq ID 1)，Kabat結構域始於位置114。將三個間隙特徵插入以將比對置於正 確框架中(以位置111開始)。此三個間隙殘基(與Kabat位置111-113相對應)恰當地為VH結構域之一部分且一般將由屬於完整抗體序列中之VH的真實胺基酸佔據。類似填補間隙可在一些其他序列之開始及結束發現。
本文中針對29D7描述之序列(SEQ ID NO：51及53，及包含彼等序列之其他序列)為抗體TAM-163之序列。本文中描述為使用抗體29D7之所有實例均使用抗體TAM 163。
實例 殘基編號
使用Kabat相容之編號系統，如圖2中所示，將野生型胺基酸殘基編號。如本文所使用，表中所列之突變係指結構域，接著為根據Kabat相容編號之殘基位置(參見例如SEQ ID NO：1(CH1)、SEQ ID NO：9(CL)、SEQ ID NO：13(CH2)及SEQ ID NO：18(CH3))。野生型殘基之身分在殘基位置前以IUPAC單字母密碼指出(例如CH1-S188)。突變殘基之身分在殘基位置之後指出(CH1-188E)。相關地，提供野生型與突變殘基身分(CH1-S188E)。在替代性記法中，首先可列出天然胺基酸，接著圓括號中為鏈及位置，接著為經取代之胺基酸，例如Ser(H188)Glu。
實例1 鑑別用於在抗體中產生促進雜二聚體之突變的位點
蛋白質與另一分子之間的結合親和力常常可藉由對處於結合狀態之空間上最接近的原子進行修飾來改變。在天然抗體中，CH1及CL結構域彼此結合且結合程度可受結合狀態下緊密接觸(小於5.0Å)之原子對、各結構域中之一個原子明顯影響。改變參與此等結合對之原子可引起結合增加或減少。涉及之特定原子可藉由諸如NMR光譜法及蛋白質x射線結晶學之方法確定。與另一結構域緊密接觸之一個結構域上的原子可在兩個結構域之間產生引力或斥力，視原子性質及其局 部環境而定。此外，對於具有在第二結構域12Å內之原子的第一結構域中之殘基(諸如Gly)，若殘基經採用不同構形之不同殘基(諸如Arg)置換，則可與第二結構域緊密接觸，且第一結構域中之此類殘基在本文中亦視為緊密接觸殘基。在修飾之後，新胺基酸可與第二結構域上先前不與第一結構域緊密接觸之殘基緊密接觸，且此等殘基亦視為緊密接觸殘基。舉例而言，第一結構域上Ala突變成Trp可引起不利的與第二結構域之空間相互作用，此可藉由改變第二結構域上之殘基減輕，其中第二結構域上之殘基在Trp引入第一結構域之前不緊密接觸。此原理可用於設計不與野生型CH1(或CL)結構域相互作用的新穎CL(或CH1)結構域。接著可構築恢復與新穎CL(或CH1)結合域相互作用的新穎CH1(或CL)結構域。多特異性抗體可使用此類新穎CL及CH1結構域之一或多個組合來確保各重鏈與各輕鏈之間的正確配對。此類設計不僅基於空間相互作用，且亦基於靜電相互作用，或兩種類型之相互作用。
使用圖形工具，諸如Maestro(Maestro,9.2版，Schrodinger,LLC,New York,NY(2011))檢查蛋白質晶體結構藉由量測原子間距離，使用如上文所定義之標準，揭露直接緊密接觸之原子。在蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB)條目3QQ9(DOI：10.2210/pdb3qq9/pdb)中之晶體結構之情況下，CL結構域中與CH1結構域緊密接觸之殘基包括(但不限於)：116-119、121、123-124、127、129、131、133、135-138、160-164、167、174-176、178、180、209(使用本文所述之編號方案；參見圖2)。CH1中類似地與CL緊密接觸之殘基包括(但不限於)：121-127、137-140、143、145、169、172-180、186、188、190、192、221(使用本文所述之編號方案)。
歸因於實驗量測中存在之不定性及不同晶體形態中蛋白質表面環境之差異，其他蛋白質結構之檢查可展示相對原子位置之變化，使 得檢查此等結構產生與此處所給出實質上類似但不一致的殘基清單。舉例而言，在PDB條目1HZH(Saphire等人，Science 293：1155-59(2001))中，結構含有具有不同局部環境之兩個CH1結構域，且在一個結構域中，Lys221在其搭配物CL結構域4.5Å內，而在另一個CH1結構域中，其不在。一種此類CH1/CL界面中緊密接觸之測定足以確定殘基為緊密接觸殘基。
多個計算方法可用於預測經修飾之胺基酸側鏈的取向，且此類改變對蛋白質/蛋白質界面結合親和力可具有之相對作用。然而，不同方法常常產生不同結果。為彌補方法之間的此變化性，若干方法用以鑑別可降低CH1/CL結合之親和力的胺基酸改變。隨後基於結構模型之檢驗，細化將靶向之潛在胺基酸殘基之清單。
實例2 具有新穎共價C H 1-C L 二硫鍵之抗體
雙特異性抗體可在各Fab臂中含有不同重鏈及輕鏈。舉例而言，若雙特異性抗體具有2個Fab臂，各臂具有不同LC及HC，則產生雙特異性抗體可包括4個不同多肽之表現。由於輕鏈可能跨越不正確重鏈且與其配對，即使重鏈經修飾以促進雜二聚，但4個不同重鏈及輕鏈之共轉染及表現仍然可產生不需產物，如圖1中所示。
CH1與CL之間的野生型界面藉由CH1-C230與CL-C214之間的共價二硫鍵穩定化。在雙特異性抗體組裝期間，若發生任何不正確HC/LC配對，則此二硫鍵之形成可幫助保持不正確配對在原地。
本發明者假定，若錯配抗體臂不可形成天然二硫鍵，則其可增加錯配鏈解離且尋找正確搭配物之機會。為探究此可能性，設計二硫鍵之替代位置。在此等設計中，不正確配對之CH1及CL結構域無法形成二硫鍵，因為半胱胺酸相距過遠。當發生正確CH1/CL配對時，可形成二硫鍵且幫助保持配對在原地。
研發一種常規方法以搜索CH1與CL之間的界面且評估可能二硫 鍵。該方法類似於Dani等人(Prot.Eng.16(3)：187-93(2003))，但執行額外類型之分析將各位點之品質排序。
選擇殘基對，每一鏈上一個，其中兩個殘基之α碳在7.5Å內(Cα1-Cα2距離)，且兩個殘基之β碳在6.0Å內(Cβ1-Cβ2距離)。為移除其中側鏈彼此遠離取向之對，Cβ1與Cβ2之間的距離與Cβ1與Cα2之間的距離相比。若前者距離較大，則側鏈部分遠離彼此取向且因此為形成二硫鍵之不良候選者；若前者距離大超過0.5Å，則該對丟棄。
對於存留之對，在Modeller(Eswar等人，Nuc.Acids Res.31(13)：3375-80(2003))中將每一假定二硫鍵結構模型化，其中9個模型自突變原子之隨機化起始座標建構。野生型之對照模型亦在Modeller中構築。所有模型均使用TM-ALIGN疊加在初始晶體結構上(Zhang及Skolnick,Nuc.Acids Res.33：2302-9(2005))。使用VOIDOO(Kleywegt 及Jones,Acta Cryst,D50：178-85(1994))，在1.0Å及1.5Å之探針半徑下，檢查模型的蛋白質核心中空隙體積之引入。小空隙或空隙不存在為較佳。計算Modeller DOPE Z分數，其中突變分數低至野生型為較佳。使用PROCHECK(Laskowski,Nuc.Acids Res.29(1)：221-2(2001))比較突變前後之Ramachandran曲線圖，以偵測由共價二硫鍵之限制所引起的主鏈品質之任何降解。藉由Modeller客觀功能分級為最佳之突變模型與野生型相比，且指出突變之兩個殘基中之任何主鏈原子的最大位移，其中較小位移為較佳。
最終，計算突變半胱胺酸之χ1、χ2及χ3角且與在40%序列一致性程度下過濾之4500高解析度晶體結構中彼等角之分佈相比。產生幾何形狀與以實驗方式觀測到之分佈偏離最小之模型的推定二硫化物為較佳。
獲自此過程之若干基礎設計列於表2中。藉由手動檢查或藉由上文描述之自動化程序將設計Cys2、Cys4及Cys5分級為不太有利。設 計Cys 3具有兩個變異體：Cys3a及Cys3b。Cys3b中，兩個額外附近殘基改變成Ile以改善二硫化物周圍之填充(V190I及L135I)，因為預測F174C突變將小凹穴引入結構中。
實例3 Cys改變之重鏈/輕鏈之表現及純化
抗體29D7用作平台以確定表2中陳述之三個新穎重鏈/輕鏈二硫橋鍵位置(Cys1、Cys3、Cys6)是否能夠形成二硫鍵。29D7為二價、單特異性、單株抗酪胺酸激酶受體B(TrkB)IgG1抗體(參見Qian等人，J.Neuroscience 26(37)：9394-9403(2006))。
在分析設計中亦使用具有天然二硫橋鍵之陽性對照(在CH-C230與CL-C214之間，「29D7」)及根本無橋之陰性對照(CH-C230S及CL-C214S：「29D7 △Cys」)。使用全新(de novo)基因合成部分構築29D7表現卡匣基因，且使用基於限制酶接合之選殖技術，在表現載體中與29D7重鏈及輕鏈可變區同框次選殖。在pSMEN3中選殖輕鏈基因且在pSMED2中選殖重鏈基因。懸浮HEK293F細胞(美國菌種保藏中心)在無血清FreeStyleTM293表現培養基(Life Technologies)中培養。細胞維持於37℃下具有7% CO2之含濕氣培育箱中。由標準短暫HEK293F轉染過程產生條件培養基。在純化之前，經由0.2μm過濾器過濾條件培養基。構築體在30-50mg/L範圍內在條件培養基中表現。
實例4 在HEK293F細胞中表現之29D7抗體之純化
將經過濾之條件培養基負載至經PBS-CMF(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、2.7mM KH2PO4，pH 7.2)平衡之HiTrapTM蛋白A HP管柱(GE Life Sciences)上。將樹脂用10管柱體積PBS-CMF pH 7.2洗滌，接著用0-100%線性梯度之蛋白A溶離緩衝液(20mM檸檬酸、150mM NaCl，pH 2.5)溶離抗體。將峰溶離份用2M Tris-HCl pH 8.0平衡至pH 7.0且彙集。將該物質負載至在PBS-CMF pH 7.2中平衡之HiLoadTM 16/60 SuperdexTM200製備型尺寸排阻管柱(GE Life Sciences)上。將峰溶離份彙集，使用30kDa旋轉過濾器(Amicon)濃縮且經0.2μm過濾。
使用連接至Agilent 1100系列HPLC系統之SuperdexTM200 10/300 GL管柱(GE Life Sciences)進行分析型SEC。在非還原條件下，SDS-PAGE分析(圖3)揭露陰性對照Ab 29D7 Cys Neg藉由SDS變性驅動，因缺乏重鏈/輕鏈二硫橋鍵而崩解成100kDa重鏈及25kDa輕鏈組分。具有天然二硫橋之陽性對照(「29D7」)顯示98kDa與188kDa標記物之間的單一譜帶遷移，可能表示重鏈及輕鏈藉由二硫橋鍵束縛之完整150kDa IgG1分子。表2中所描述之四個新穎半胱胺酸構築體(29D7 Cys1、Cys 3a、Cys3b及Cys6)行為方式類似於陽性對照，意味在表2中陳述之位置形成二硫橋鍵。
實例5 具有改變之二硫鍵之抗體的質譜分析
為確定針對新穎共價CH1-Cl二硫鍵引入之突變的作用，進行各種29D7構築體之完整質量分析。在PNGaseF存在下將含有表2中所列之二硫化物修飾的抗體29D7之純化形式以及陽性及陰性對照去糖基化，接著如下進行LC/MS。將抗體與Lys-C(Wako Chemicals USA.,Inc)以400：1之蛋白質：酶比率培育且在37℃下培育20分鐘。藉由添加含0.1%甲酸之水淬滅消化反應。在與Water Xevo G2 Q-TOF質譜儀耦 接之Aglient 1100毛細管HPLC上藉由LC/MS分析來分析消化樣品。將分析物負載至具有0.1%甲酸之Zorbax Poroshell 300SB C3管柱(1.0mm×75mm，維持在80℃下)上，且使用15-98%緩衝液B(含0.1%甲酸之乙腈)之梯度在65μl/min之流動速率下經4分鐘溶離。以正離子靈敏度模式，進行質譜偵測，其中毛細管電壓設在3.3kV下。用MassLynx中之MaxEnt 1函數進行數據分析。
對於29D7 △Cys，基礎峰分配給單體輕鏈，其具有23190Da之理論質量(圖4A)。第二峰分配給修去離胺酸之重鏈二聚體(理論質量98086Da)。此結果與破壞CH1與CL之間的二硫鍵之形成的初始設計一致。構築體Cys1之結果展示在圖4B中。基礎峰對應於修去離胺酸之完整IgG(理論重量144438Da)。亦觀測到具有兩個重鏈及僅僅一個輕鏈之部分完整IgG(理論重量121292Da)。對於構築體Cys3a，獲得類似結果，其中除偵測到具有兩個重鏈及僅僅一個輕鏈之部分完整IgG(理論重量121199Da)之外，基礎峰表示修去離胺酸之完整IgG(理論重量144404Da)(圖4C)。
展示大部分為完整抗體且僅僅殘餘為具有兩個重鏈及僅僅一個輕鏈之部分完整IgG的兩個另外構築體展示在圖4D和4E中。
實例6 具有改變之二硫鍵之抗體的DSC分析
使用差示掃描熱量測定(DSC)量測抗體之熱穩定性。在相同緩衝液(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)中稀釋表2中所描述之29D7二硫化物變異抗體至0.3mg/mL之濃度。將樣品及緩衝液(400μL)轉移至96孔深孔盤中且置放在DSC(Cap-DSC，Microcal/GE Healthcare)之自動進樣器中。在注射至儀器後，將樣品以100℃/h自10℃加熱至110℃。將數據進行緩衝液及基線校正，接著擬合成三個非兩態轉變以確定熔融溫度(表2)。所有突變體均為具有高Tm值之穩定蛋白質。可在分別分配給CH2及Fab結 構域之Tm1及Tm2中觀測到一些差異。
總之，表2中概述之具有Fab ID(Cys1、Cys3a、Cys3b及Cys6)之突變體具有引入重鏈之CH1結構域與κ輕鏈之恆定輕鏈結構域中之新穎半胱胺酸殘基，且此等半胱胺酸能夠形成新穎的鏈間二硫鍵，其替代有意移除之天然二硫鍵。隨後評估此等設計在一個Fab臂中具有天然二硫橋鍵且在另一個Fab臂中具有新穎二硫橋鍵之雙特異性抗體的情況下促進正確輕鏈配對之能力。
實例7 使用Rosetta模型化鑑別之破壞突變體
多個模型化方法用於鑑別可列為「破壞突變」之一組突變，因為該突變不促進相應CL及CH結構域之配對。藉由差示掃描熱量測定(DSC)評估突變(表5)(再次使用抗體29D7作為測試抗體)。一種涉及之模型化方法使用Rosetta中執行之界面能量法(Das等人，Ann.Rev.Biochemistry 77：363-82(2008))，2.3版。使用蛋白質中具有不同程度之靈活性的若干方案。「RFlex」方案允許靠近突變殘基之側鏈以結合及未結合狀態分開鬆弛。「ExRFlex」方案允許胺基酸側鏈構形更精細地延伸取樣(Rosetta選項「-extrachi_cutoff 12」、「-ex1 1」、「-ex2 1」、「-ex3 1」及「-ex4 1」)。最初選擇預測破壞鏈間結合親和力超過1kcal/mol而不引起超過10/mol之不利鏈內能量的胺基酸改變(「破壞突 變」)。一些突變破壞結合，且亦引起不利鏈內能量改變(例如對於CH1-S188Y，+22kcal/mol；參見表3)。
對於CH1-S188Y，檢查提出L143突變成較小殘基可減輕此鏈內應力。Rosetta預測CH1-S188Y與CH1-L143A組合將穩定化CH1鏈(-5.9kcal/mol)，同時仍然破壞與輕鏈之相互作用。在一些位置，諸如CH1-A139，預測所有其他胺基酸破壞複合物(僅僅結果子集展示在表3中)。
藉由模型化獲得之可能破壞突變的總數對於實驗性測試而言過大，因此針對設計可恢復結合之搭配物鏈中之補償突變(「恢復突變」)之可行性，將破壞突變進一步模型化。對於各破壞突變，方案如上所述，鑑別相反鏈上所有緊密接觸之殘基。對於各破壞突變，在Rosetta中將多達數百萬個具有恢復突變之候選序列(所有可能單一及雙重恢復突變體組合)模型化。藉由DSC以實驗方式測試至少一種Rosetta預測之破壞突變的代表性胺基酸位置展示在表3中。
之突變。數目(10、10b、9等)係指不同突變構築體。△E為因所列之突變而產生的CH1與CL之間的結合能量之預測改變，而自身鏈△△G反映含有該等突變之鏈的穩定化或破壞。
實例8 使用SCWRL4模型化鑑別之破壞突變體
第二模型化方法包括使用SCWRL4(Krivov等人，Proteins 77(4)：778-95(2009))預測界面中突變之緊密接觸殘基之側鏈位置，接著在MacroModel(MacroModel,9.9版，Schrodinger,LLC,New York,NY(2012))中能量最小化。兩種方案用於此方法，其中SCWRL步驟有變化。對於「基礎」方法，僅僅調整突變側鏈，而對於「重裝(Repack)」方法，重裝所有側鏈。來自「重裝」方法之結果較佳，因為預期其指示破壞將不容易由小的側鏈調整來緩解。MacroModel步驟使用具有GB/SA溶劑化之OPLS-2005力場，且允許所有氫原子及突變殘基自由移動。其他原子由100kJ/mol-Å2約束力約束，但在勢井上具有0.2Å半寬平坦底部。對於各突變體，對結合狀態及未結合個別CH1及CL結構域進行SCWRL4及MacroModel計算，且結合能量計算為結合與未結合形式之間的能量差異。此方法不直接量測突變鏈上之應力，因此人工檢查最有希望之模型的空間碰撞、應變鍵角或張力之其他特徵，且需要時添加補償突變。將大約40鐘不同變異體模型化且評估。藉由此方案鑑別之有希望的代表性設計列於表4中(一些突變藉由Rosetta與SCWRL4+MacroModel鑑別)。
實例9 構築體自模型化之產生
嘗試產生含有各破壞突變組(表3-4中之各列)的突變Ab 29D2構築體。CH1結構域本質上無序，且僅僅在與CL相互作用之後採用正常摺疊IgG結構。在與CL相互作用之前，重鏈保持未摺疊狀態，結合於內質網中之伴隨蛋白結合免疫球蛋白蛋白質(BiP)(Feige等人，Mol.Cell 34(5)：569-79(2009))。因此，若模型化之設計完全破壞CH1/CL相互作用，則無物質可分離用於進一步表徵。構築體H2、H3、H6、H10、H11、H16、H17、L1、L3、L4、L5、L8、L11、L12及L14足夠表現用於純化，表明不超過部分之CH1/CL結合破壞。在COS細胞中，對於構築體L4及L8，觀測到適當減少之表現(與>15μg/mL之親本表現相比較，<4μg/mL)。不嘗試9b、9c、10b及10c之表現。
實例10表現構築體之DSC
基於位點之結構多樣性及類似數目之CH1及CL位點之選擇，選擇實例9之表現之Ab 29D7抗體變異體子集藉由差示掃描熱量測定(DSC)檢查(參見下表5)。將含構築體之PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)在相同緩衝液中稀釋至0.3mg/mL之濃度。將樣品及緩衝液(400μL)轉移至96孔深孔盤中且置放在DSC(Cap-DSC，Microcal/GE Healthcare)之自動進樣器中。在注射至儀器後，將樣品以100℃/h自10℃加熱至110℃。將數據進行緩衝液及基線校正，接著擬合成三個非兩態轉變以確定熔融溫 度。分配給Fab結構域之轉變Tm2中見到大部分改變。考慮表5中展示之標準誤差，發現表5中之所有構築體相對於缺乏破壞突變之抗體，熱穩定性至少略微減少，表明CH1/CL界面之突變使抗體不穩定。選擇CH1(H2 H10)及CL(L1、L4)具有最大破壞之構築體用於後續工作。
理論上，仍然可形成一個鏈上具有恢復突變(尤其經設計以容納相反鏈上之空間『凸塊』之『臼』)且在另一鏈上具有天然序列之錯配抗體。假定須在CH1與CL結構域上均進行破壞突變，以不利於所有可能的錯配組合。因此，選擇L1及L4勝過H17，儘管在DSC實驗中其破壞程度較小，因為對於CH1與CL而言，較佳具有多個破壞選擇。
實例11恢復突變
使用上述SCWRL+MacroModel及Rosetta 2方案或藉由使用Rosetta 3序列耐受性方法(Smith及Kortemme,PLoS One 6(7)：e20451(2011))設計恢復突變。在SCWRL+MacroModel下，藉由人工檢查來鑑別相反鏈上來自破壞突變之殘基，且指出可能增加兩個鏈之空間或靜電互補性的殘基。利用SCWRL+MacroModel詳盡地列舉此等殘基之雙重或三重 突變組合，且將結合能量與野生型序列比較，以鑑別顯著減少由破壞突變所引起之結合能量損失之胺基酸取代。在現代計算集群上，此方案能夠評估成千上萬之突變組合。舉例而言，對於表5之H10破壞實例，考慮>1000個恢復突變組合。對於評估多達數百萬個突變體之Rosetta 2方案，上文描述用於恢復突變之搜索。Rosetta 3序列耐受性方法並非設計用於尋找破壞突變，其設計適合於尋找恢復突變。破壞突變之一個模型(使用其他方法之一構築)作為輸入提供，連同其中突變可改善破壞作用之附近殘基清單(藉由人工檢查確定)一起。來自此方案之主要輸出為在每一附近位點胺基酸類型之有利性分級；隨後使用序列耐受性軟體及/或在SCWRL+MacroModel中將含有此等殘基之特定序列模型化。除序列耐受性套裝中執行之預設波茲曼加權序列分級(Boltzmann-weighted sequence ranking)之外，亦使用一種其中藉由階梯函數確定關於各位置上胺基酸頻率之統計數據的方法，階梯函數將權重1施加給序列最高評分1%，且權重0施加給剩餘序列。
對於所有方案，均使用方案能量評分與模型人工檢查之組合選擇最佳設計。在人工檢查期間較佳為其中突變側鏈之旋轉異構體緊密匹配已知之旋轉異構體(來自用Maestro軟體分佈之旋轉異構體資料)的模型。多個恢復設計對於特定破壞突變體常常似乎均合理。代表性恢復設計展示在表6中。在顛倒諸如CL-E123與CH1-K221之間的天然鹽橋的狀況下，可任意考慮哪個殘基破壞且哪個恢復之分配。
概言之，對於在藉由DSC證實之後選擇的破壞組之突變(L1、L4、H2、H10)，使用多個計算模型化技術之組合鑑別推定恢復突變。對於L1(野生型序列中之鹽橋)，鹽橋之顛倒(但Glu經Asp置換)為判斷值得測試之唯一設計。對於其他三個破壞設計，鑑別多個似乎合理之恢復設計。
實例12具有破壞、恢復及新穎二硫化物突變之設計
適當時基於分子模型化，額外一組突變體由將表2中突出顯示之新穎鏈間二硫鍵設計與一或多個表6中列出之設計合併組成。在新穎二硫化物組合至雙特異性設計之情況下，天然二硫化物半胱胺酸殘基(CH1-C230及CL-C214)均突變成絲胺酸殘基，從而除去天然二硫鍵。
大部分組合呈現互補，但在一些情況下待突變之殘基彼此靠近(增加突變之間意外相互作用的風險)或一致。舉例而言，Cys6設計使用突變CL-E123C，其意謂其與表6中之CL-E123K構築體不相容。R4.2及R10.3均突變殘基CH1-L143。R4.1及R10.3不突變相同殘基，但在結構上相鄰，增加其間未預期之相互作用的風險；在天然結構中，R4.1 中使用之殘基CL-S131接觸R10.3中使用之CH1-L143。示例相容設計展示在表7之列中，其中各列之CH1及CL行構成配對設計。
實例13具有新穎靜電相互作用之雙特異性抗體
蛋白質界面選擇性設計之一種類型包含靜電互補性，其中界面一側上之正電荷與界面另一側上之負電荷配對。若界面之一種替代變異體進行工程改造，其中電荷顛倒，則可發生選擇性。
在本發明之實例中，與現有CH-CL結構域鹽橋有關之各結構域之配對殘基可在相互作用結構域之間顛倒。一種此類實例為E123K與K221D組合，如表6中。在最終雙特異性抗體中，抗體之一個結合臂具有野生型鹽橋且一個具有顛倒鹽橋。
上述雙階段設計過程(首先尋找如表5中之破壞突變，隨後尋找如 表6中之補償恢復突變)亦可對靜電選擇性進行工程改造，其中兩個帶電殘基中僅一者存在於天然蛋白質中，諸如表6之R4.1設計中。此處，天然殘基為CL-S131及CH1-K145。該過程之第一階段發現與離胺酸相同電荷之破壞突變，在此情況下為CL-S131H。隨後，第二階段使天然Lys突變成相反電荷作為恢復突變CH1-K145E，其產生有利的靜電相互作用。
然而，在概念上可設計其中天然殘基均不帶電之全新(de novo)有利靜電荷相互作用，且使用此新穎電荷相互作用驅動界面選擇性。在不存在第二帶電殘基下，第一帶電殘基之引入可無破壞性(除非因其他原因，諸如空間接觸)，且因此藉由上述雙階段過程無法發現。因此，亦使用一種用於全新靜電相互作用工程改造之不同過程。
全新靜電相互作用可放在幾乎不暴露於大部分溶劑(bulk solvent)之界面核心中，或可放在溶劑與兩蛋白鏈會合之邊界。核心區域，包括CH1/CL界面核心，一般為疏水性且並非帶電側鏈之理想環境。除非完全滿足兩個殘基之氫鍵結潛能之最佳氫鍵結網狀物可進行工程改造，否則推定帶電殘基可能在能量上優先與溶劑相互作用(其中CH1及CL結構域保持未結合)而非彼此相互作用。另一方面，若在界面邊緣上對電荷相互作用進行工程改造，則帶電殘基(特別Lys、Arg及Glu)足夠靈活，一對電荷/電荷錯配可能允許兩個類似帶電之殘基彼此遠離取向，其中靜電排斥由溶劑介入而顯著降低。若免疫系統對突變之暴露殘基發起抗藥物抗體(ADA)反應，則暴露殘基亦產生不想要的清除蛋白質治療劑之風險。全新電荷相互作用設計之一種理想情況為構形上限制之袋，其不允許顯著的側鏈靈活性，而是亦具有足夠極性，使得相互作用之帶電殘基藉由與附近殘基或水分子之額外極性相互作用而穩定。
鑑別CH1/CL界面上之此區域，且努力集中於該區域。CH1/CL界面 包括兩個水分子袋，其與兩個結構域緊密接觸且大大地屏蔽大部分溶劑。在PDB條目3QQ9中，此等水分子包括標記殘基CH-292、CH-319、CH-498、CH-504、CH-544、CL-254、CL-279、CL-359及CL-490之水分子(圖16)。此等水接觸包括CH-L124、CH-L143、CH-K145、CH-Q179、CH-S186、CH-S188、CL-S131、CL-V133、CL-S162、CL-S176、CL-T178及CL-T180之蛋白質側鏈。此等殘基大部分為極性，但僅CH-K145帶電。SCWRL/MacroModel方法用於評估涉及CH1上一種突變及CL上一種突變的此等殘基之所有可能雙重突變體，且其中天然殘基突變成Arg、Asp、Glu及Lys之所有可能組合。此程序在單一設計階段中將新穎有利的電荷相互作用之兩個殘基進行工程改造。無需完整蛋白質重裝之該方案之結果較佳，有利於天然側鏈旋轉異構體輕易適應而無需重大調整的設計。指出袋中之額外殘基，諸如CH-F174、CH-V177、CL-F118及CL-Q128用於參考，但不為初始設計掃描之一部分。
結果之檢查展示位置CH-L124及CL-S176之突變為有希望的。此等殘基之野生型取向展示在圖5A中。模型化(未顯示)指示有利的靜電相互作用可由組合CH-L124K與CL-S176D配對形成，且電荷相互作用之顛倒取向可用CH-L124E及CL-S176K形成。然而，在每種情況下顯而易見一些不好的空間接觸。該等模型之人工檢查表明，對於前一電荷對，突變CH-V190S及CL-V133S將減輕應力，且此外，CL-S133可與位置CH-K124及/或CL-D176形成額外氫鍵。類似地，對於相互作用之顛倒取向，添加突變CH-S188G及CL-V133S來改善填充接觸。在此等設計產生及實驗性驗證之後，測定各電荷對設計之x射線晶體結構，且結果展示在圖5之圖B及C中。
以上程序鑑別大量額外的可有利地以任一取向形成之潛在電荷相互作用(具有帶正電胺基酸之VH與具有帶負電胺基酸之VL，或顛 倒，因此可考慮此等為『可顛倒』電荷相互作用)。通常，一或多個突變側鏈與另一附近側鏈接觸不佳，或另一附近側鏈阻止該一或多個突變側鏈採用較佳旋轉異構體。在此等情況下，預測雙重突變結構進行Rosetta序列耐受性方案以優化其他附近圍繞之殘基。
經鑑別之有利電荷相互作用設計展示在表8中。此表中之各列為一種可用於修飾單一CH1/CL界面之設計。然而，第一行指示設計之較佳配對，其中抗體之兩個CH1/CL界面分開工程改造以各含有兩個配對設計之一(電荷相互作用之『正向』及『反向』取向)。若任一CL嘗試與不正確之CH1結構域締合，則較佳配對將引起明顯電荷/電荷排斥。
實例14 S1及S1_rev之X射線晶體結構
為證實分子模型化正確預測有利靜電相互作用之形成，測定來自表8之S1及S1_rev設計之x射線晶體結構(圖5，圖B及C)。設計藉由在HEK-293細胞中短暫轉染而各表現為重組Fab分子(針對可變結構域使用抗體Ab1)。藉由分批結合於Poros蛋白A樹脂，接著用0.1M甘胺酸pH 2.5溶離，將Fab自條件培養基純化。隨後溶離之Fab藉由尺寸排阻層析在經20mM Tris pH 7.0、50mM NaCl平衡之Superdex 200 16/60管柱上來純化。S1 Fab在100mM HEPES pH 7.5、10% PEG 3350、200mM脯胺酸中結晶且在具有106.7、127.1、84.5Å之單位晶胞邊緣之空間群P21212中結晶。S1_rev在100mM檸檬酸鈉pH 5.9、14% PEG 6000條件下在空間群P42212(晶胞邊緣118.4、118.4、84.2Å)中形成晶體。
在先進光子源中，在光束線17-ID下收集資料。使用Autoproc(Global Phasing Ltd.)處理資料。使用先前在與配位體之複合物中解析之野生型Fab之結構作為搜索模型(資料未圖示)，用Phaser(Phenix)進行分子置換來解析結構。使用buster(Global Phasing Ltd.)優化結構且使用coot建構。S1設計之Fab繞射至1.3Å解析度且優化至16.8%之R因子(19.0% Rfree)。S1_rev晶體繞射至2.1Å解析度，且結構優化至17.8%之R因子(21.7% Rfree)。
在S1_rev設計中，CL-K176與CH1-E124之兩個羧基氧進行有利的靜電接觸(3.3Å及3.5Å，圖5C)。在S1設計中，CH1-K124與CL-D176接觸類似，但稍微更長(3.5Å及3.7Å)。此實驗性結果證實理論設計，S1與S1_rev在關鍵設計之殘基之間具有有利的靜電相互作用。
實例15 Fab臂工程改造設計之混合
額外一組組合使用如來自表7之任一列中工程改造之抗體之一個Fab臂及使用表8中給出之S1胺基酸取代進行工程改造之抗體的另一 Fab臂。表9展示所得組合。
實例16經修飾之雙特異性抗體Ab1/Ab2之設計
使對抗原1(AG1)具有特異性之抗體1(Ab1)突變，使得其Fab臂在CH1及C-κ結構域中含有如表8 Fab ID S1中表示之突變，在恆定結構域界面引入新穎靜電相互作用。使對抗原2(AG2)具有特異性之抗 體2(Ab2)突變，使得其Fab臂在CH1及C-κ結構域中含有如表8 Fab ID S1_REV中表示之突變，亦在結構域界面引入新穎靜電相互作用。將杵-臼突變引入CH3結構域界面中以偏向重鏈雜二聚(參見Ridgway等人，上文及Merchant等人，上文)。在一個CH3結構域中，CH3-Y370突變成C且CH3-T389突變成W，產生空間隆凸(稱為「杵」鏈；相比於初始參考之EU編號，殘基編號與Kabat一致)。在相反CH3結構域中，CH3-S375突變成C，CH3-T389突變成S，CH3-L391突變成A且CH3-Y438突變成V，在兩個不同CH3結構域之間產生空腔(稱為「臼」鏈)且因此產生互補性。CH3-C370與CH3-C375形成鏈間二硫鍵以穩定化雜二聚體。產生適當對照，其中重鏈/輕鏈界面不具有突變(野生型界面)但重鏈雜二聚突變仍然存在。將包含Ab1重鏈、Ab2重鏈、Ab1輕鏈及Ab2輕鏈之總共四個鏈同時轉染至哺乳動物細胞中且經由基於BIAcore之化學計量分析、質譜分析及藉由陰離子交換層析法之非均質性評估，評估正確輕鏈配對之程度。將生物物理分析結果與含有重鏈雜二聚突變但在重鏈與輕鏈之間的界面不含有突變之對照比較。抗體同型為具有除去效應功能之鉸鏈/CH2重鏈突變(L247A、L248A及G250A)之人類IgG1。如表9中陳述之額外突變設計亦使用Ab1/Ab2抗體以實驗方式評估，以評估正確輕鏈配對之傾向。
實例17雙特異性抗體之表現
使用全新基因合成及基於限制酶接合之選殖技術構築雙特異性抗體基因。在pSMEN3中選殖輕鏈基因，且在pSMED2中選殖重鏈基因。懸浮HEK293F細胞(美國菌種保藏中心)在無血清FreeStyleTM293表現培養基(Life Technologies)中培養。細胞維持於37℃下具有7% CO2之含濕氣培育箱中。由標準短暫HEK293F轉染過程產生條件培養基。在純化之前經由0.2μm過濾器過濾條件培養基。通常雙特異性抗體在5-50mg/L範圍內表現至條件培養基。
實例18在HEK293F細胞中表現之抗體之純化
將經過濾之條件培養基負載至經PBS-CMF(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、2.7mM KH2PO4，pH 7.2)平衡之HiTrapTM蛋白A HP管柱(GE Life Sciences)上。將樹脂用10管柱體積PBS-CMF pH 7.2洗滌，接著用0-100%線性梯度之蛋白A溶離緩衝液(20mM檸檬酸、150mM NaCl，pH 2.5)溶離抗體。將峰溶離份用2M Tris-HCl pH 8.0平衡至pH 7.0且彙集。將該物質負載至在PBS-CMF pH 7.2中平衡之HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200製備型尺寸排阻管柱(GE Life Sciences)上。將峰溶離份彙集，使用30kDa旋轉過濾器(Amicon)濃縮且經0.2μm過濾。
使用連接至Agilent 1100系列HPLC系統之SuperdexTM200 10/300 GL管柱(GE Life Sciences)進行分析型SEC。視抗體v結構域組合而定，典型%高分子量物質介於2-20%且除表示150kDa雙特異性抗體物質之相關主要峰外未觀測到低分子量物質。
實例19雙特異性抗體(Ab1/Ab2)之質譜分析
為證實雙特異性抗體之產生，藉由質譜分析來分析Ab1及Ab2之Fab片段。來自Ab1及Ab2之Fab片段之分子量藉由其獨特胺基酸序列界定，且精確分子量測定提供正確配對抗體存在之證據。
將雙特異性抗體與Lys-C(Wako Chemicals USA,Inc)以400：1之蛋白質：酶比率培育且在37℃下培育20分鐘。藉由添加含0.1%甲酸之水淬滅消化反應。在與Water Xevo G2 Q-TOF質譜儀耦接之Aglient 1100毛細管HPLC上藉由LC/MS分析來分析消化樣品。將分析物負載至具有0.1%甲酸之Zorbax Poroshell 300SB C3管柱(1.0mm×75mm，維持在80℃下)上，且使用15-98%緩衝液B(含0.1%甲酸之乙腈)之梯度在65μl/min之流動速率下經4分鐘溶離。以正離子靈敏度模式，進行質譜偵測，其中毛細管電壓設在3.3kV下。用MassLynx中之MaxEnt 1函 數進行數據分析。
雙特異性抗體Ab1/Ab2之Fab分析證實大多數所偵測之Fab片段為正確配對之Ab1及Ab2，如圖6中所示。在CH1/CL-κ界面引入吾等新穎突變下，在Ab1與Ab2之間不正確配對之輕鏈顯著減少。Fc分析表明大多數重鏈由來自Ab 1之一個重鏈及來自Ab 2之一個重鏈構成。未偵測到重鏈均二聚體(圖7)。
實例20雙特異性抗體(Ab1/Ab2)之串聯陰離子交換及質譜分析
使用安裝有Q-STAT(Tosoh Bioscience)之Agilent Infinity 1290 UHLPC(Agilent Technologies)，將藉由蛋白A及製備型SEC層析法純化的大約20至30μg雙特異性Ab1/Ab2蛋白質以1mL/min之流動速率注射至在20mM Tris pH 8.6中平衡之管柱上。隨後將蛋白質用1M NaCl/20mM Tris pH 8.6，經7分鐘0-100%線性梯度溶離。
藉由280nm下吸收偵測蛋白質。此分析之結果展示在圖8中。親本抗體展示在圖8圖A中。親本Ab1(圖8A(i))顯示明顯均一之單峰。Ab2之陰離子交換層析圖(圖8A(ii))展示一群分別在主峰前後溶離之酸性及鹼性電荷物質，表示由Ab2 Fab臂內影響一定比例之抗體製備之轉譯後修飾所引起的非均質性。雙特異性雜二聚體Ab1/Ab2抗體展示在圖8之圖B中。此層析圖展示來自親本抗體(Ab2)之電荷非均質性併入雙特異性抗體中。曲線由佔大約蛋白質物質60%之主峰(峰1)組成。佔剩餘蛋白質32%之峰2由兩個子峰(峰2A及峰2B)組成。剩餘8%蛋白質分成兩個較小峰。
收集含有或富含來自雙特異性Ab1/Ab2分級分離之峰1、2A及2B之物質的溶離份且如上所述進行處理以進行Fab臂分離，且藉由質譜分析來分析(圖9)。基於預期MW，三個陰離子交換溶離份之分析揭露峰1僅僅含有具有正確輕鏈配對之兩個Fab臂。除正確配對之ab 2 Fab之外，溶離份2A富含由Ab 1重鏈及來自Ab 2之輕鏈組成之不正確配 對Fab。溶離份2B由正確配對之Ab 1 Fab及正確配對之Ab 2 Fab組成，但後者含有遺傳自親本抗體之轉譯後修飾。
實例21 DSC分析
將含雙特異性抗體Ab1/Ab2之PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)在相同緩衝液中稀釋至0.3mg/mL之濃度。另外，使用10kDa截止Slide-A-Lyzer透析盒，在兩次緩衝液改變成His：蔗糖(20mM His、8.5%蔗糖、50mg/L EDTA，pH 6.0)下，將蛋白質透析隔夜，且隨後稀釋至0.3mg/mL。將樣品及緩衝液(400μL)轉移至96孔深孔盤中且置放在DSC(Cap-DSC，Microcal/GE Healthcare)之自動進樣器中。在注射至儀器後，將樣品以100℃/h自10℃加熱至110℃。將數據進行緩衝液及基線校正，接著擬合成三個非兩態轉變以確定熔融溫度。在圖形上，PBS及His：蔗糖中之熱型態大體上類似。此亦反映在獲得之Tm值上(表10)。
實例22在高濃度下雙特異性抗體之穩定性
使用10kDa截止Slide-A-Lyzer透析盒，在兩次緩衝液改變成His：蔗糖(20mM His、8.5%蔗糖、50mg/L EDTA，pH 6.0)下，將雙特異性抗體Ab1/Ab2透析隔夜。將蛋白質轉移至Vivaspin 500濃縮器，10kDa截止且以14,000g旋轉。最終達到之最終濃度為112mg/mL。將樣品轉移至塑膠SEC小瓶且上覆20μL礦物油。樣品儲存在黑暗中室溫下。對於每個時間點，將樣品置放在Agilent 1200中且注射1μL至TOSOH QC-PAK 300管柱上，使用PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)作為操作緩衝液，流動速率為0.5mL/min，15min操作。在各注射下監測峰下面積。平均回 收率為106±2%。假定回收率良好，藉由將單體峰之曲線下面積與聚集物峰之曲線下面積比較來獲得聚集物百分比。在室溫下14週之後，觀測到僅僅2.4%聚集(表11)。
實例23抗體1(Ab1)×抗體2(Ab2)對比細胞因子1×細胞因子2之BIAcore分析 使用之Fab臂突變來自表8之對1(Fab ID S1及S1_Rev)
使用BIAcore表面電漿子共振生物感測器(T200型號；GE Healthcare)，進行結合化學計量之分析。使用由含有300mM NaCl、3.4mM EDTA及0.01% Tween-20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水組成之操作緩衝液進行結合分析。按照與人類抗體捕捉套組(部件BR-1008-39，GE Healthcare)一起供應之製造商說明書，將12,000 RU抗人類抗體(GE Healthcare)經由胺偶合化學固定至CM5羧基甲基化聚葡萄糖晶片(GE Healthcare)表面。抗人類抗體經胺偶合於參考與測試流動池。為量測結合化學計量，在測試流動池上，在10μL/min之流動速率下30-60s，在1-10nM濃度下，捕捉100-200 RU經純化之推定雙特異性抗體。隨後細胞因子1以50μL/min之流動速率，在超過細胞因子/抗體相互作用之KD 100倍之飽和濃度下流過兩個流動池，歷時60s，此時反應達到穩定狀態。使用3M MgCl2，在10μL/min下暴露於晶片表面30-40s，自表面去除細胞因子及測試抗體。隨後在下一次循環之前用操作緩衝液洗滌注射端口。隨後使用細胞因子2重複所述過程。基於細胞因子之分子量(MWC)、抗體之分子量(MWA)、捕捉之測試抗體之量(AB-RU)及在飽和下觀測到之細胞因子之結合(Rmax_Obs)，計算觀測到之結合化學計量(OBST)。針對此之等式為： OBST=[Rmax_Obs]/[(MWC/MWA)×AB-RU]。
在此等研究中，等式之已知要素為細胞因子及抗體之MW、捕捉抗體之RU及在飽和下細胞因子結合之RU，其中後兩個變數以實驗方式量測。自該資訊，計算觀測到之結合化學計量，其推斷出針對各相應抗原具有正確形成之Fab臂的捕捉抗體分子%，因為具有不正確重鏈/輕鏈配對之Fab臂將引起既定Fab臂與既定細胞因子之結合不可偵測且因此彙集之表示整個抗體群體的結合化學計量減少。此後一事實由其中抗體1重鏈經抗體2輕鏈轉染且抗體2之重鏈經抗體1輕鏈轉染的研究檢驗，且藉由ELISA測試與各抗原之結合(資料未圖示)。自減去參考之資料產生Rmax_Obs之資料，且針對由抗體隨時間推移自晶片表面之潛在解離所引起的基線偏移及非特異性結合調整。基於與親本二價陽性對照抗體之飽和結合，將結合化學計量標準化。
將推定雙特異性抗體對細胞因子1及細胞因子2之飽和結合化學計量與二價單特異性陽性對照及不具有顯示所有輕鏈配對置換之Fab臂工程改造，因此影響整體化學計量之對照相比較。資料(表12)展示Fab臂工程改造之新穎靜電相互作用增加正確輕鏈配對至至少90%，其中與缺乏偏向正確輕鏈締合之Fab臂工程改造靜電相互作用的陰性對照比較，結合化學計量顯著更靠近1：1。
與v1.0不同的抗體可變區構架。
實例24 抗體1(Ab1)×抗體2(Ab2)對比細胞因子1×細胞因子2-評估多個其他設計 使用之Fab臂突變在一個Fab臂中來自表7且另一Fab臂具有天然界面
使用BIAcore表面電漿子共振生物感測器(T200型號；GE Healthcare)，進行結合化學計量之分析。使用由含有300mM NaCl、3.4mM EDTA及0.01% Tween-20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水組成之操作緩衝液進行結合分析。按照與人類抗體捕捉套組(部件BR-1008-39，GE Healthcare)一起供應之製造商說明書，將12,000 RU抗人類抗體(GE Healthcare)經由胺偶合化學固定至CM5羧基甲基化聚葡萄糖晶片(GE Healthcare)表面。抗人類抗體經胺偶合於參考與測試流動池。為量測結合化學計量，在測試流動池上，在10μL/min之流動速率下30-60s，在1-10nM濃度下，捕捉100-200 RU推定雙特異性抗體。隨後細胞因子1以50μL/min之流動速率，在超過細胞因子/抗體相互作用之KD 100倍之飽和濃度下，流過兩個流動池，歷時60s，此時反應達到穩定狀態。使用3M MgCl2，在10μL/min下暴露於晶片表面30-40s，自表面去除細胞因子及測試抗體。隨後在下一次循環之前用操作緩衝液洗滌注射端口。隨後使用細胞因子2重複所述過程。基於細胞因子之分子量(MWC)、抗體之分子量(MWA)、捕捉之測試抗體之量(AB-RU)及在飽和下觀測到之細胞因子之結合(Rmax_Obs)，計算觀測到之結合化學計量(OBST)。針對此之等式為：OBST=[Rmax_Obs]/[(MWC/MWA)×AB-RU]。
在此等研究中，等式之已知要素為細胞因子及抗體之MW、捕捉抗體之RU及在飽和下細胞因子結合之RU，其中後兩個變數以實驗方式量測。自該資訊，計算觀測到之結合化學計量，其推斷出針對各相應抗原具有正確形成之Fab臂的捕捉抗體分子%，因為具有不正確重 鏈/輕鏈配對之Fab臂將引起既定Fab臂與既定細胞因子之結合不可偵測且因此彙集之表示整個抗體群體的結合化學計量減少。自減去參考之資料產生Rmax_Obs之資料，且針對由抗體隨時間推移自晶片表面之潛在解離所引起的基線偏移及非特異性結合調整。基於與親本二價陽性對照抗體之飽和結合，將結合化學計量標準化。
將推定雙特異性抗體對細胞因子1及細胞因子2之飽和結合化學計量與不具有顯示所有輕鏈配對置換之Fab臂工程改造，因此影響整體化學計量之對照相比較。資料(表13)展示與具有天然重鏈/輕鏈Fab臂界面之陰性對照比較，來自表7之Fab臂工程改造之突變增加正確輕鏈配對。
實例25 抗體1(Ab1)×抗體2(Ab2)對比細胞因子1×細胞因子2-評估多個其他設計 使用之Fab臂突變來自表7(在一個臂中)及靜電相互作用突變來自表8(在另一臂中Fab ID S1)，如表9中概述
使用BIAcore表面電漿子共振生物感測器(T200型號；GE Healthcare)，進行結合化學計量之分析。使用由含有300mM NaCl、 3.4mM EDTA及0.01% Tween-20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水組成之操作緩衝液進行結合分析。按照與人類抗體捕捉套組(部件BR-1008-39，GE Healthcare)一起供應之製造商說明書，將12,000 RU抗人類抗體(GE Healthcare)經由胺偶合化學固定至CM5羧基甲基化聚葡萄糖晶片(GE Healthcare)表面。抗人類抗體經胺偶合於參考與測試流動池。為量測結合化學計量，在測試流動池上，在10μL/min之流動速率下30-60s，在1-10nM濃度下，捕捉100-200 RU推定雙特異性抗體。隨後細胞因子1以50μL/min之流動速率，在超過細胞因子/抗體相互作用之KD 100倍的飽和濃度下，流過兩個流動池，歷時60s，此時反應達到穩定狀態。使用3M MgCl2，在10μL/min下暴露於晶片表面30-40s，自表面去除細胞因子及測試抗體。隨後在下一次循環之前用操作緩衝液洗滌注射端口。隨後使用細胞因子2重複所述過程。基於細胞因子之分子量(MWC)、抗體之分子量(MWA)、捕捉之測試抗體之量(AB-RU)及在飽和下觀測到之細胞因子之結合(Rmax_Obs)，計算觀測到之結合化學計量(OBST)。針對此之等式為：OBST=[Rmax_Obs]/[(MWC/MWA)×AB-RU]。
在此等研究中，等式之已知要素為細胞因子及抗體之MW、捕捉抗體之RU及在飽和下細胞因子結合之RU，其中後兩個變數以實驗方式量測。自該資訊，計算觀測到之結合化學計量，其推斷出針對各相應抗原具有正確形成之Fab臂的捕捉抗體分子%，因為具有不正確重/輕鏈配對之Fab臂將引起既定Fab臂與既定細胞因子之結合不可偵測且因此彙集之表示整個抗體群體的結合化學計量減少。自減去參考之資料產生Rmax_Obs之資料，且針對由抗體隨時間推移自晶片表面之潛在解離所引起的基線偏移及非特異性結合調整。基於與親本二價陽性對照抗體之飽和結合，將結合化學計量標準化。
將推定雙特異性抗體對細胞因子1及細胞因子2之飽和結合化學 計量與不具有顯示所有輕鏈配對置換之Fab臂工程改造，因此影響整體化學計量之對照相比較。資料(表14)展示與具有天然重鏈/輕鏈Fab臂界面之陰性對照比較，來自表9之所選Fab臂工程改造之突變增加正確輕鏈配對。
實例26經修飾之雙特異性抗體C5×Ab3
將對人類CCL20具有特異性之抗-CCL20抗體(純系C5)自噬菌體文庫分離且轉化成IgG1格式。其Fab臂在CH1及C-κ結構域中含有如表8 Fab ID S1_Rev中表示之突變，在該恆定域界面引入新穎靜電相互作用。使對人類IL13具有特異性之抗-IL13抗體(純系Ab3)突變，使得其Fab臂在CH1及C-κ結構域中含有如表8 Fab ID S1中表示之突變，亦在該結構域界面引入新穎靜電相互作用。將兩組不同突變引入CH3結構域界面中以偏向重鏈雜二聚，杵臼法(參見Ridgway等人，上文及Merchant等人，上文)，於以下實例中稱為方法1(M1)，或Strop等人，上文及WO 2011/143545中揭示之雜二聚法，稱為方法2(M2)。對於M1，抗-IL13純系Ab3重鏈(具有Fab ID S1)，CH3結構域具有用於重鏈雜二聚之以下突變：CH3-Y370突變成C且CH3-T389突變成W，產生空 間隆凸(稱為「杵」鏈)。在抗-CCL20純系C5重鏈(具有Fab ID S1_Rev)中，CH3結構域具有用於重鏈雜二聚之以下突變：CH3-S375C、CH3-T389S、CH3-L391A及CH3-Y438V，在兩個不同CH3結構域之間產生空腔(稱為「臼」鏈)且因此產生空間互補性。Cys-370及Cys-375形成鏈間二硫鍵以穩定化雜二聚體。在M2設計中，使用之突變包括抗-IL13Ab3重鏈上之D232R、P441R及K440R以及抗-CCL20 C5重鏈上之D'232E、P'441E、L'391E。產生適當對照物，從而Fab重鏈/輕鏈界面不具有突變(野生型界面)，但重鏈雜二聚突變(方法1或方法2)仍然存在。所有抗體均為具有鉸鏈/CH2效應功能去除突變(L247A、L248A及G250A)之IgG1同型。將包含Ab3重鏈、C5重鏈、Ab3輕鏈及C5輕鏈之總共四個鏈同時轉染至哺乳動物細胞且經由各種生物物理分析技術，與含有重鏈雜二聚突變但在重鏈與輕鏈之間的界面不含有突變之對照比較，評估正確輕鏈配對之程度。進行四個分開的表現。第一個(稱為「Ab3×C5-M1」)由如上文所述之Fab臂突變(來自表7之Fab ID S1及S1_Rev)與重鏈雜二聚方法M1組合組成。第二個表現為在Fab臂中不具有突變但存在重鏈雜二聚突變(方法M1)之第一個的對照(稱為「Ab3×C5-M1-陰性」)，第三個表現(稱為「Ab3×C5-M2」)由如上文所論述之Fab臂突變(來自表7之Fab ID S1及S1_Rev)與重鏈雜二聚方法M2組合組成。第四個表現為在Fab臂中不具有突變但存在重鏈雜二聚突變(方法M2)之第三個的對照(稱為「Ab3×C5-M2-陰性」)。藉由將對照與測試中存在之正確輕鏈配對之程度比較，可評估突變影響。雙特異性抗體CCL20×Ab3如上文在實例16及17中針對Ab1/Ab2所論述來表現及純化。
實例27雙特異性抗體C5×Ab3之質譜分析
使用與以上針對Ab1/Ab2所述相同之方法，進行雙臂抗體(C5及Ab3)構築體之Fab產生及LC/MS分析。分析如上所述之總共四個構築 體以基於Fab分子量量測值確定重鏈及輕鏈之存在。
C5×Ab3-M1及C5×Ab3-M1-陰性構築體之去卷積質譜展示在圖10中，其中在構築體C5×Ab3-M1-陰性中偵測到大量不正確配對之Fab(C5重鏈與Ab3輕鏈及C5輕鏈與Ab3重鏈)(24.8%總強度來自不正確配對之Fab)。然而，C5×Ab3-M1中不正確配對之Fab之量減少，其Fab臂中存在所述靜電相互作用突變。正確輕鏈配對之IgG之程度上升至大約95%。
C5×Ab3-M2及C5×Ab3-M2-陰性(圖11)之資料展示構築體C5×Ab3-M2-陰性中不正確配對之Fab的強度等於28.5%，其中構築體C5×Ab3-M2中之錯配Fab減少至4.6%。不正確配對之顯著減少證實工程改造之靜電相互作用突變的有效性。
實例28 DSC分析
如下表15中所列之蛋白質接收於PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)中且在相同緩衝液中稀釋至0.3mg/mL之濃度。將樣品及緩衝液(400μL)轉移至96孔深孔盤中且置放在DSC(Cap-DSC，Microcal/GE Healthcare)之自動進樣器中。在注射至儀器後，將樣品以100℃/h自10℃加熱至110℃。將數據進行緩衝液及基線校正，接著擬合成兩個或三個非兩態轉變以確定熔融溫度。全部此等均為具有高Tm值之穩定蛋白質。
實例29 pH可逆性
如下表16中所列之蛋白質接收於PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)中且使用相同緩 衝液稀釋至1mg/mL之濃度。向兩個20μL等分試樣添加0.8μL PBS。藉由添加0.8μL 10x蛋白A溶離緩衝液(200mM檸檬酸、1.5M NaCl，pH 2.0)將兩個另外20μL之等分試樣酸化至約pH 3.5。在4℃下24小時之後，將另一0.5μL PBS添加至先去已添加PBS之彼等樣品，而藉由添加0.5μL 2M Tris pH 8.0緩衝液平衡酸化樣品。將樣品負載至Agilent 1200系統上且15μL注射在TOSOH QC-PAK 300管柱，使用PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)作為操作緩衝液，流動速率為0.5mL/min，15min操作。記錄來自各注射之單體百分比，且用於計算各樣品中之聚集物百分比。在酸化之後未觀測到聚集顯著增加。
實例30強迫聚集
如下表17中所列之蛋白質接收於PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)中且使用相同緩衝液稀釋至1mg/mL之濃度。將等分試樣(20μL)置放於96孔盤中，上覆40μL礦物油且在40℃、43.9℃、50℃、54℃、60.1℃及64℃下在梯度PCR阻斷中培育24小時。此後，將樣品負載至Agilent 1200系統上且15μL注射在TOSOH QC-PAK 300管柱，使用PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)作為操作緩衝液，流動速率為0.5mL/min，15min操作。記錄來自各注射之單體百分比，且用於計算各樣品中之聚集物百分比。在因顯著聚集而回收低的情況下，峰面積用於計算聚集物百分比。單價雙特異性抗體展示自54℃顯著聚集，而二價雙特異性抗體在此溫度下仍然穩定。單價 C5×Ab3-M2比C5×Ab3-M1更易於聚集。
實例31 CCL20-純系5(C5)×IL13-純系Ab3(Ab3)之Biacore分析 抗原：人類CCL20×人類IL13 使用之Fab臂突變來自表8之對1(Fab ID S1及S1_Rev)
使用BIAcore表面電漿子共振生物感測器(T200型號；GE Healthcare)，進行結合化學計量之分析。使用由含有500mM NaCl及0.01%界面活性劑p20之hepes緩衝生理食鹽水(HBS)組成之操作緩衝液進行結合分析。將1500 RU重組蛋白A(Pierce)經由胺偶合化學固定至CM5羧基甲基化聚葡萄糖晶片。重組蛋白A經胺偶合於參考與測試流動池。為量測結合化學計量，在測試流動池上，在10μL/min之流動速率下30-60s，在1-10nM濃度下，捕捉100-200 RU推定雙特異性抗體。隨後重組人類CCL20(Peprotech)以50μL/min之流動速率，在超過CCL20/抗體相互作用之KD 100倍之飽和濃度下，流過兩個流動池，歷時60s，此時反應達到穩定狀態。使用10mM甘胺酸-HCL pH 1.7，在10μL/min下暴露於晶片表面30s，自表面去除細胞因子及測試抗體。隨後在下一次循環之前用操作緩衝液洗滌注射端口。隨後使用重組人類IL13(R&D Systems)重複所述過程。基於細胞因子之分子量(MWC)、抗體之分子量(MWA)、捕捉之測試抗體之量(AB-RU)及在飽和下觀測到之細胞因子之結合(Rmax_Obs)，計算觀測到之結合化學計量(OBST)。針對此之等式為：OBST=[Rmax_Obs]/[(MWC/MWA)×AB-RU]。
在此等研究中，等式之已知要素為細胞因子及抗體之MW、捕捉抗體之RU及在飽和下細胞因子結合之RU，其中後兩個變數以實驗方式量測。自該資訊，計算觀測到之結合化學計量，其推斷出針對各相應抗原具有正確形成之Fab臂的捕捉抗體分子%，因為具有不正確重鏈/輕鏈配對之Fab臂將引起既定Fab臂與既定細胞因子之結合不可偵測且因此彙集之表示整個抗體群體的結合化學計量減少。自減去參考之資料產生Rmax_Obs之資料，且針對由抗體隨時間推移自晶片表面之潛在解離所引起的基線偏移及非特異性結合調整。基於與親本二價陽性對照抗體之飽和結合，將結合化學計量標準化。
將推定雙特異性抗體對CCL20及1L13之飽和結合化學計量與不具有顯示所有輕鏈配對置換之Fab臂工程改造，因此影響整體化學計量之對照相比較。資料(表18)展示Fab臂工程改造之靜電相互作用增加正確輕鏈配對至約95%，其中對於各細胞因子/趨化因子，結合化學計量靠近1：1。
實例32使用疏水相互作用層析法分離雙特異性抗體
使用疏水相互作用層析法，根據自構築體C5×Ab3-M1、C5×Ab3- M1-陰性、C5×Ab3-M2及C5×Ab3-M2-陰性之條件培養基之兩步抗體純化方法，評估蛋白質非均質性。使用安裝有ProPac HIC-10(Dionex)之Agilent Infinity 1290 UHLPC(Agilent Technologies)，將大約20至30μg蛋白質以1mL/min之流動速率注射至在100mM磷酸鈉及1M硫酸銨pH 7.0中平衡之管柱上。隨後蛋白質用100mM磷酸鈉pH 7.0，經7分鐘0-100%線性梯度溶離。藉由280nm下吸收偵測蛋白質。此分析之結果展示在圖12中。圖12圖A中展示之親本C5及Ab3抗體展示明顯單峰。雜二聚方法M2展示在圖12圖C中且雜二聚方法M1展示在圖12圖B中。圖B與C左側之層析圖展示併入單獨重鏈雜二聚突變。右側層析圖為含有重鏈與輕鏈突變之雙特異性抗體。此等結果清楚地展示在併入重鏈與輕鏈突變下非均質性減少。
實例33計算可及表面積
當將非人類殘基引入意欲投與人類患者之抗體中時，存在人類免疫系統將識別經修飾之殘基為外來物且產生針對治療劑之抗體(抗藥物抗體或ADA反應，其可導致清除更快、減少循環治療劑之活性或兩者)的風險。
一種最小化ADA反應之此等後果之方法為選擇在很大程度上限制於治療劑核心之突變，意謂其不在治療劑之表面上，且因此無法由ADA結合。因此，一種將雙特異性設計之優先性分級之方式為量測經修改之殘基的可及表面積(ASA)。所有其他因素相同，突變殘基之ASA值較低的一種雙特異性設計應比ASA值較高之雙特異性設計的ADA風險低。基於上述分子模型，量測表6之互補殘基組之ASA，且亦基於x射線結晶分析，量測來自表8之設計S1及S1_rev的ASA。如上所述，表8中之設計(實例13)特別設計成將ASA減至最少之內埋式袋。結果展示在表19中，且在移除溶劑及緩衝液分子之後，在高解析度設置下，使用各涉及結構域之結構作為背景(『輸入』作為背景設 置)，使用Maestro 9.7(Schrodinger,LLC,2014)或Maestro 9.9(Schrodinger,LLC,2015)中之分子表面工具計算。探針半徑設定成2.5Å。常常選擇溶劑分子之半徑為1.4Å；此處使用2.5Å來解釋x射線結構中之實驗座標誤差、在x射線結構中不明顯之側鏈運動及與如許多其他ASA計算中所假設之水分子相反，ADA進入表面中極其狹窄開口之困難。如在β股相互作用中所觀測，蛋白質主鏈之緊密靠近一般將產生2.5Å或更長之氫鍵接觸，且因此，此為比非支鏈側鏈寬之任何蛋白質化學基團可穿透之最小孔洞的近似尺寸。
ADA反應之後果可視適應症而變化。在抑制免疫系統之某些疾病中，ADA反應風險可較低，使得具有較高ASA之設計更為可行。在免疫系統過度活化之某些疾病中，ADA風險可較高，因此需要使用具有低(較佳<50Å2、<40Å2、<30Å2、<20Å2、<10Å2)或零ASA值之雙特異性設計。一些先前報導之設計(諸如Lewis等人及WO2014/150973A1中)具有比本文中報導之某些設計(諸如S1及S1_rev)高的ASA，且此類先前報導之設計可更易於有不希望之ADA反應。WO2014150973中所揭示之各種實施例均具有經工程改造之殘基，其ASA為至少148Å2，或更大(如Lewis等人報導，自PDB條目4LLY(WO2014150973之請求項1)或4LLW(WO2014150973之請求項7)計算。對於WO2014150973之請求項1及相關請求項中所揭示之實施例，報導值低估，因為輕鏈可變結構域上之殘基1之側鏈在晶體結構中無序。在存在所主張之精胺酸下，模型化提出230.3之增加值)。
單一例外為位置CL-135之突變，其在一些變異體中為Phe而非請求項1之更大Tyr；然而，此殘基內埋且當將WO2014150973之請求項1及請求項7揭示之殘基組合時，其排除在整體ASA計算之外，仍然產生149Å2之值(亦參見WO2014150973之表19)。此外，對於Lewis報導之晶體結構4LLY(其含有與WO2014150973相關之突變)，突變為Arg 之輕鏈殘基1具有無序側鏈。若藉由以最常出現之旋轉異構體構形將此殘基模型化來添加其(使用Maestro軟體中之旋轉異構體文庫)，則WO2014150973中所涉及之突變殘基的總ASA進一步增加至230Å2。當在具有兩個不同重鏈序列及兩個不同輕鏈序列之雙特異性抗體的情況下執行時，本文中報導之設計(最特別S1及S1_rev)之暴露表面積低得多。
在設計具有有利特性之治療性抗體時，引入一些表面可及外來殘基可為賦予某些功能特徵(包括(但不限於)穩定性)所必須。因此，在其他工程改造步驟期間引入之外來殘基的ASA佔據面積之任何最小化視為有利於減小外來殘基之總最終ASA。
實例34量測配對保真度
使用疏水相互作用層析法，無法區分正確雙特異性分子與含有此特定雙特異性抗體之錯配輕鏈之分子，最可能因為具有錯配輕鏈之分子與HIC管柱樹脂相互作用之傾向不夠不同。然而，陰離子交換層析法(圖8B)能夠將完整雙特異性抗體(圖8B之峰1)與含有錯配輕鏈/重鏈相互作用之雙特異性抗體(圖8B之峰2A)分離。不利地，親本抗體之一的攜帶至雙特異性分子(圖8B之峰2B)的轉譯後修飾(硫酸化)引起雙特異性陰離子交換溶離時間發生改變，使得其不自含有錯配輕鏈之雙特異性分子進行基線解析。因此，藉由陰離子交換層析法無法精確定量雙特異性抗體%。圖8B峰1之%AUC(60%)添加至等於17%之硫酸化形式(圖8B峰2B)接近正確雙特異性抗體%，其為蛋白質製劑78%。下表20表示Ab1×Ab2實例製劑中正確配對之Fab臂的質譜相對定量。
之相關峰%。*相關峰%藉由代表二價、單特異性IgG親本抗體(C5及Ab3)或二價雙特異性IgG物質(表中之所有其他純系)之曲線下面積%定義。
實例35 S1及S1_rev中二級突變之影響
如表8中所示，設計S1由一級突變CH1-L124K及CL-S176D與二級突變CL-V133S及CH1-V190S組成。設計S1_rev由一級突變CH1-L124E及CL-S176K與二級突變CL-V133S及CH1-S188G組成。二級突變經設計以優化界面中之側鏈填充。為測試此等突變是否有助於輕鏈配對之保真度，產生C5×Ab3之變異體，其中不省去、省去一些或所有二級突變。C5 Fab臂用於測試S1_rev之變化，而Ab3 Fab臂用於測試S1之變化。稱為M1之杵臼(Ridgway等人，上文及Merchant等人，上文)法用於偏向各組合之重鏈雜二聚。自M1，針對此實例製備的各Ab3變異體之CH3結構域具有以下用於重鏈雜二聚之突變：CH3-Y370突變成C及CH3-T389突變成W(「杵」鏈)。自M1，針對此實例製備的各C5變異體之CH3結構域具有以下用於重鏈雜二聚之突變：CH3-S375C、CH3-T389S、CH3-L391A及CH3-Y438V(「臼」鏈)。Cys-370及Cys-375形成鏈間二硫鍵以穩定化雜二聚體。測試六個構築體以將突變作用去卷積。「Ab3 C5-M1-陰性」僅僅含有上文針對C5及Ab3所述之M1突變，而無S1或S1_rev突變。去卷積-2再用作對照且針對此實例，亦稱為去卷積-1。「Ab3 C5-M1」含有如上所述之M1突變，C5 Fab臂中 S1_rev，且Ab3臂中S1，其再用作對照且針對此實例，亦稱為去卷積-2。去卷積-3與去卷積-2一致，其中例外為其不包括如表8中所列之S1及S1_rev的「二級突變」任一者。去卷積-4與去卷積-2一致，其中例外為其省去S1與S1_rev的CH1結構域之二級突變。因此，出於清楚起見，去卷積-4之Ab3 Fab臂含有CH1-L124K、CL-S176D及CL-V133S，但不含CH1-V190S。且出於清楚起見，去卷積-4之C5 Fab臂含有CH1-L124E、CL-S176K及CL-V133S，但不含CH1-S188G。親本單特異性構築體「C5」及「Ab3」(亦分別稱為去卷積-5及去卷積-6)既不具有M1突變亦不具有S1或S1_rev突變(CH序列54及CL序列9)，且作為對照測試以建立各抗體之單特異性變異體的行為。所有六個設計均為具有鉸鏈/CH2效應功能去除突變(L247A、L248A及G250A)之IgG1。對於去卷積-1至去卷積-4設計，包含Ab3重鏈、C5重鏈、Ab3輕鏈及C5輕鏈之總共四個鏈同時轉染至哺乳動物細胞。經由各種生物物理分析技術評估正確輕鏈配對之程度，且與Ab3Ab3 C5-M1-陰性、C5及Ab3Ab3對照相比。針對所述構築體進行分開的表現。藉由將對照與測試中存在之正確輕鏈配對之程度比較，可評估突變影響。Ab如實例16及17中針對Ab1/Ab2所論述表現及純化。構築體去卷積-1至去卷積-6之表現介於9至200mg/L範圍內。
實例36 S1及S1_rev去卷積之質譜分析
使用與上文針對Ab1/Ab2所述相同之方法，進行雙臂抗體構築體去卷積-1至去卷積-6(先前實例中描述)的Fab產生及LC/MS分析。分析如上所述之全部六個構築體以基於Fab分子量確定重鏈及輕鏈之配對。
去卷積質譜展示在圖17中。圖A及B展示單特異性對照抗體C5C5及Ab3Ab3呈現一個對應於其相應Fab片段之預測分子量的主要峰。缺乏S1及S1_rev突變之陰性對照雙特異性Ab3Ab3 C5-M1-陰性(圖C)展 示所有四個可能重鏈/輕鏈配對：兩個正確及兩個不正確(Ab3重鏈+C5輕鏈，及Ab3輕鏈+C5重鏈)。分析指示大約30%樣品由錯配Fab組成。含有S1及S1_rev突變全組之陽性對照雙特異性Ab3Ab3 C5-M1(圖D)未展示具有47397及46906之預測質量的重鏈/輕鏈錯配之明顯證據。此等值之較小讀數(圖中不易見)預測此樣品中0.5%錯配。相比之下，相對於去卷積-2移除重鏈及輕鏈中之二級S1及S1_rev突變(參見表8)之去卷積-3(圖E)展示佔樣品大約18%的可能重鏈/輕鏈錯配之清晰證據。最終，去卷積-4(圖F)展示自重鏈移除二級S1及S1_rev突變(但在輕鏈中留下其)亦使得錯配鏈以可偵測含量形成，且11%樣品評估為錯配。概言之，S1及S1_rev之全組突變提供最高保真度，而S1及S1_rev設計之部分執行相對於缺乏CH1/CL雙特異性工程改造突變之陰性對照，提供可偵測(但較小)改善。
實例37 S1及S1_rev去卷積構築體之疏水相互作用層析法分析
使用疏水相互作用層析法，根據自構築體去卷積-1至去卷積-6之條件培養基之兩步抗體純化方法，評估蛋白質非均質性。使用安裝有ProPac HIC-10(Dionex)之Agilent Infinity 1290 UHLPC(Agilent Technologies)，將大約20至30μg蛋白質以1mL/min之流動速率注射至在100mM磷酸鈉及1M硫酸銨pH 7.0中平衡之管柱上。隨後蛋白質用100mM磷酸鈉pH 7.0，經7分鐘0-100%線性梯度溶離。藉由280nm下吸收偵測蛋白質。此分析之結果展示在圖18中。對照單特異性抗體「C5」及「Ab3」各展示尖銳主峰(圖E-F)。若兩個抗體組裝成其中僅僅CH3結構域經工程改造之雙特異性抗體，則重疊峰代替單一主峰，指示因重鏈及輕鏈之各種組合引起的樣品非均質性(圖A)。當添加S1及S1_rev突變至CH1/CL界面中以僅僅促進正確重鏈/輕鏈配對時，樣品非均質性大大減少(圖B)。S1及S1_rev設計含有直接形成靜電相互作用之一級突變以及如表8中所示之支持二級突變。若移除重鏈支持 突變(圖C)，而輕鏈支持突變保持完整，則藉由HIC，非均質性程度類似，但藉由質譜分析可偵測到差異(實例36)。若所有支持突變均移除(圖D)，則相對於「Ab3 C5-M1-陰性」非均質性減少，但相對於去卷積-2「Ab3 C5-M1」仍然更明顯。結合實例36之質譜資料，此等結果總體上說明當完整S1及S1_rev設計組合時產生最少量之非均質性。
實例38產生具有混合Fab臂設計之雙特異性抗體
概念上，可藉由如實例15中所論述，使用本文所描述之CH1/CL工程改造設計之不同組合，將雙特異性Fab進行工程改造。為測試此項假設，產生具有Ab3及C5 Fab臂之雙特異性抗體，其中Ab3 Fab臂不含雙特異性工程改造突變(陰性對照)或表8之S1設計。C5臂不含雙特異性工程改造突變(陰性對照)、表8之S1_rev設計(陽性對照)或如表7中指定之設計T1、T2、T3、T4、T9之一。亦製備在C5中含有S1_rev突變但在Ab3中不含Fab臂雙特異性突變的另一對照。表23中概述及提出之此9個構築體均作為以實例35中所描述之相同組態，在Ab3及C5重鏈中具有M1杵臼(Ridgway等人，上文及Merchant等人，上文)突變及如先前所描述，在兩個重鏈之CH2中具有效應功能去除突變之IgG1產生。
對於各設計，將包含Ab3重鏈、C5重鏈、Ab3輕鏈及C5輕鏈之四個鏈同時轉染至哺乳動物細胞。經由各種生物物理分析技術評估正確輕鏈配對之程度，且與含有重鏈雜二聚突變但在重鏈與輕鏈之間的界面不含突變的對照相比。針對剛剛描述之構築體進行分開的表現。藉由將對照與測試中存在之正確輕鏈配對之程度比較，可評估突變影響。抗體如上文在實例16及17中針對Ab1/Ab2所論述來表現及純化。 表23中之構築體的表現在4至73mg/L範圍內變化。
實例39混合Fab臂設計之DSC分析
實例38中所描述及下表24中所列之蛋白質接收於PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mM KH2PO4，pH 7.2)中且使用相同緩衝液稀釋至0.3mg/mL之濃度。將樣品及緩衝液(400μL)轉移至96孔深孔盤中且置放在DSC(Cap-DSC，Microcal/GE Healthcare)之自動進樣器中。在注射至儀器後，將樣品以100℃/h自10℃加熱至110℃。將數據進行緩衝液及基線校正，接著擬合成兩個或三個非兩態轉變以確定熔融溫度。所有突變體均為具有高Tm值之穩定蛋白質。各抗體之詳細熔融溫度型態提供於圖19中。
實例40混合Fab臂設計之Biacore結合化學計量分析 所用Fab臂突變來自表23(實例38)
使用BIAcore表面電漿子共振生物感測器(T200模型；GE Healthcare)，如實例31所述，進行結合化學計量之分析。將推定雙特異性抗體對CCL20及IL13之飽和結合化學計量與二價單特異性陽性對照及不具有顯示所有輕鏈配對置換之Fab臂工程改造，因此影響整體結合化學計量的對照相比較。資料(表25)展示對於各對抗體與標靶細胞因子及趨化因子，在兩個Fab臂中具有工程改造之所有組合實現靠近1：1之結合化學計量(來自1：1結合不超過10%變化)，而在一個或兩個臂中缺乏工程改造之組合在一個臂中具有小於0.7：1之化學計量。此等結果表明雙特異性設計之不同組合可用於減少重鏈/輕鏈錯配。
實例41混合Fab臂設計之質譜分析
使用與上文針對Ab1/Ab2所述相同之方法，進行在各Fab臂中具有各種設計組合(如表23及實例38中所述)之雙臂抗體構築體的Fab產生及LC/MS分析。分析如上所述之全部9個構築體以基於Fab分子量確定重鏈及輕鏈之配對。去卷積質譜展示在圖20中。當Ab3 Fab臂中之 S1設計與C5 Fab臂中之T1、T2、T3、T4或T9配對(圖20，圖A-E)時，偵測到最少量之錯配Fab：T1、T2及T3為0.5%；T4為0.4%，且T9為1.3%。Ab3×S1與C5 Fab臂中之S1_rev配對亦得到高保真度，僅僅3.2%錯配(圖F；注意此雙特異性設計使用與實例37之去卷積-2相同的Fab臂突變且因此為此設計有效性之第二種量測)。然而，當任一Fab臂缺乏促進雙特異性之設計時，產生更大量之錯配樣品：具有Ab3-S1及天然C5下19%(圖G)，具有天然Ab3及C5-S1rev下41%(圖H)，且一個Fab臂中具有天然Ab3且另一個臂中具有天然C5下35%(圖I)。因此，在嘗試各Fab臂使用不同的促進雙特異性之設計之不同組合的每種情況下，如藉由質譜分析所量測，樣品純度明顯提高。
實例42混合Fab臂設計之疏水相互作用層析法分析
使用疏水相互作用層析法，根據自在各Fab臂中具有各種設計組合(如表23及實例38中所述)之構築體之條件培養基之兩步抗體純化方法，評估蛋白質非均質性。使用安裝有TOSOH丁基管柱之Agilent Infinity 1290 UHLPC(Agilent Technologies)，將大約20至30μg蛋白質以1mL/min之流動速率注射至在50mM磷酸鈉及2M硫酸銨pH 7.2中平衡之管柱上。隨後蛋白質用50mM磷酸鈉pH 7.2，經7分鐘0-100%線性梯度溶離。藉由280nm下吸收偵測蛋白質。此分析之結果在圖21中展示。Ab3 Fab臂中具有S1及C5 Fab臂中具有T1、T2、T3、T4或T9任一者之雙特異性抗體顯示高保真度重鏈/輕鏈配對(圖A-E)。少量錯配呈現為主峰左側上之小尾部。對於Ab3上之S1與C5上S1_rev配對，峰上之此尾部略微更大(圖F，參見箭頭)。此等結果與實例41及圖20之質譜分析一致。若一個Fab臂(圖G-H)或兩個Fab臂(圖I)不含促進雙特異性之設計，則偵測到更大量之錯配Fab，如額外峰之存在指示。對於參考，圖J-K展示此等雙特異性設計所基於之單特異性Ab3及C5抗體之對應型態；均展示尖銳單峰。因此，在嘗試具有使用不同的促 進雙特異性之設計的各Fab臂之不同組合的每種情況下，如藉由疏水相互作用層析法所量測，與缺乏Fab工程改造設計之設計相比，樣品純度明顯提高。
實例43小鼠抗-TrkB TOA-1抗體
本發明包括特異性結合人類TrkB之人類化小鼠抗體。
在小鼠中使用人類及小鼠TrkB-細胞外域抗原及標準免疫接種方法製備抗-TrkB抗體。產生TOA-1抗體之融合瘤細胞株藉由個別B細胞與骨髓瘤細胞融合產生。鼠類TOA-1抗體亦稱為「29D7」，揭示於以全文引用的方式併入本文中之US7,750,122中。
使用SMART® cDNA合成系統(Clontech Laboratories Incof Mountain View,California)，接著PCR擴增，將TOA-1抗-TrkB抗體重鏈及輕鏈可變區選殖。使用低聚(dT)及SMART® IIA oligo(Clontech Laboratories Inc.)與POWERSCRIPTTM逆轉錄酶(Clontech Laboratories Inc.)，由自TOA-1融合瘤細胞分離之1μg總RNA合成cDNA。隨後藉由PCR，使用退火至SMART® IIA oligo序列之引子及小鼠恆定區特定引子(輕鏈為小鼠κ且重鏈為小鼠IgG1)與VENT®聚合酶(New England Biolabs Incof Ipswich,Massachusetts)，擴增cDNA。將重鏈及輕鏈PCR產物次選殖至pED6表現載體中且確定核酸序列。此方法為有利的，因為不需要DNA序列之先驗知識。此外，所得DNA序列未藉由使用簡併PCR引子而改變。
TOA-1重鏈可變區之核苷酸序列闡述為SEQ ID NO：104之核苷酸58-411。TOA-1重鏈可變區之胺基酸序列闡述為SEQ ID NO：105之核苷酸20-137。TOA-1輕鏈可變區之核苷酸序列闡述為SEQ ID NO：106之核苷酸61-381。TOA-1輕鏈可變區之胺基酸序列闡述為SEQ ID NO：107之核苷酸20-137。
實例44嵌合TOA-1抗體之構築
為檢驗小鼠重鏈及輕鏈可變區序列正確，構築嵌合TOA-1抗體。為產生嵌合TOA-1重鏈，將TOA-1重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：104之核苷酸58-411)接合至編碼經突變以使效應功能最少之人類IgG1恆定結構域的cDNA。此等突變將藉由EU編號界定之殘基234、235及237之人類IgG1胺基酸序列自白胺酸、白胺酸及甘胺酸分別改變成丙胺酸、丙胺酸及丙胺酸。嵌合TOA-1輕鏈經構築，使TOA-1輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：106之核苷酸61-381)接合至編碼人類κ恆定區之DNA。存在於TOA-1輕鏈可變區之殘基1的丙胺酸改變成通常在此位置發現之天冬胺酸，且隨後此融合於人類κ恆定區，產生嵌合TOA-1 A1D輕鏈(核苷酸序列SEQ ID NO：108及胺基酸序列SEQ ID NO：109)。編碼嵌合TOA-1抗體之兩個型式之DNA短暫轉染至COS-1細胞中，產生蛋白質。含有TOA-1抗體之所得條件培養基藉由總人類IgG夾心ELISA定量。嵌合TOA-1抗體之活性藉由直接結合ELISA評估。直接結合分析係藉由用人類或小鼠TrkB-細胞外域蛋白質(R and D Systems)塗佈ELISA盤，添加連續稀釋之含有嵌合TOA-1抗體之條件培養基及用山羊抗人類IgG-HRP(Southern Biotech)偵測結合抗體來進行。嵌合TOA-1抗體以與小鼠TOA-1抗體類似的親和力結合人類及小鼠TrkB(圖23及24)。在TOA-1輕鏈可變區之位置1丙胺酸改變成天冬胺酸不影響與人類或小鼠TrkB之結合特性(圖23及24)。嵌合TOA-1抗體藉由標準蛋白A純化技術，自藉由用編碼嵌合TOA-1之DNA短暫轉染COS-1細胞所產生的條件培養基純化。
實例45小鼠TOA-1抗體之人類化
使用AbM定義鑑別小鼠TOA-1抗體之CDR，AbM定義係基於序列變化性以及結構環區域之位置。人類化TOA-1重鏈可變區經構築，以包括移植至人類DP-54構架區上之小鼠TOA-1之CDR，且此胺基酸序列闡述為SEQ ID NO：51 huTOA-1 VH v1.0。huTOA-1 VH v1.0藉由 SEQ ID NO：110中之核酸序列編碼。進行人類構架接受體序列之額外突變，例如以恢復咸信參與抗原接觸之小鼠殘基及/或與抗原結合位點之結構完整性有關的殘基。將預測對保持TrkB結合特性而言重要之A24T、R72V及L79A突變引入DP-54構架，且此胺基酸序列闡述為SEQ ID NO：111且在本文中稱為huTOA-1 VH v1.1。huTOA-1 VH v1.1藉由SEQ ID NO：112中之核酸序列編碼。另外，人類化TOA-1重鏈可變區經構築，以包括移植至基於與小鼠TOA-1重鏈可變區之構架區實質上類似而選擇的DP-3人類生殖系受體構架上之小鼠TOA-1之CDR，且此胺基酸序列闡述為SEQ ID NO：113 huTOA-1 VH v2.0。huTOA-1 VH v2.0藉由SEQ ID NO：114中之核酸序列編碼。類似地，DPK21人類生殖系受體構架用於構築人類化TOA-1輕鏈可變區之CDR移植型式，因為此生殖系構架顯示與TOA-1輕鏈可變區之高度序列一致性且此胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：132 huTOA-1 VL v2.0中。huTOA-1 VL v2.0藉由SEQ ID NO：133中之核酸序列編碼。另一人類化TOA-1輕鏈可變區經構築，以包括移植至人類DPK9生殖系受體構架區上之小鼠TOA-1之CDR且此胺基酸序列闡述為SEQ ID NO：115 huTOA-1 VL v1.0。huTOA-1 VL v1.0藉由SEQ ID NO：116中之核酸序列編碼。另外，將預測對保持TrkB結合特性而言重要之K42E、A43S及Y49K突變引入含有TOA-1可變輕鏈區CDR之DPK9構架，且此胺基酸序列闡述為SEQ ID NO：117 huTOA-1 VL v1.1。huTOA-1 VL v1.1藉由SEQ ID NO：118中之核酸序列編碼。包含VH v1.0及VL v1.4之huTOA-1在本文中可互換稱為huTOA-1及TAM-163。構築其他基於DPK9構架之變異體且其對應核苷酸及胺基酸序列由表27中所列之SEQ ID NO表示。編碼人類化TOA-1抗體之所有可能型式之DNA短暫轉染至COS-1細胞中以產生蛋白質。含有人類化TOA-1抗體變異體之所得條件培養基藉由總人類IgG夾心ELISA定量。使用利用生物素標記之嵌合TOA-1抗體 之競爭ELISA及藉由表面電漿子共振(SPR：Biacore)，評估TrkB結合特性。
實例46評估huTOA-1變異體之TrkB結合特性
使用競爭ELISA分析，利用生物素標記之嵌合TOA-1抗體，評估huTOA-1變異體之TrkB結合特性。對於此分析程序，將96孔盤用rhTrkB-ECD(R&D #397-TR/CF)以1μg/ml塗佈，在4℃下隔夜。隨後在室溫下，將培養盤用PBS+0.02%酪蛋白阻斷1小時。將於PBS+0.5% BSA+0.02% tween-20中25ng/ml之生物素標記之嵌合TOA-1與變化濃度之huTOA-1變異體或未標記之嵌合TOA-1混合且在室溫下培育1小時。將孔用PBS+0.03% tween-20洗滌四次。添加以1：10,000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP(Southern Biotech目錄號7100-05)且在室溫下培育30分鐘。將孔用PBS+0.03% tween-20洗滌四次且添加TMB(BioFx)。反應進行5-10分鐘且隨後用0.18N H2SO4淬滅。測定450nm下吸光度。概述於表28中之結果展示相對於嵌合TOA-1抗體，人類化TOA-1 VH型式1.0及VL型式1.1完全保留TrkB結合特性(圖25、26及27)。進行進一步表徵，以確定TOA-1 VL型式1.1內所含之哪一小鼠構架殘基為結合TrkB所需。人類化TOA-1 VL型式1.4含有單一小鼠構架殘基K49(Kabat編號)，且此型式具有與TOA-1 VL型式1.1類似的活性(圖28)。
實例47 huTOA-1變異體之動力學評估
進行BIACORE®分析以確定TOA-1及人類化TOA-1變異體對人類及小鼠TrkB之親和力常數。BIACORE®技術利用在TOA-1抗體變異體與固定在表層上之TrkB蛋白質結合時該層上折射率之改變。藉由自表面折射之雷射光之表面電漿子共振(SPR)偵測結合。信號動力學締合速率及解離速率之分析可區別非特異性與特異性相互作用。人類及小鼠TrkB胞外域蛋白質(R&D Systems，#397/TR/CF及#1494-TB/CF)以低密度固定在CM5晶片(分別41及30 RU)上且接著將各種濃度TOA-1及人類化TOA-1變異體注射在表面上。在注射循環之間，用4M MgCl2使表面再生。結果表明相對於親本小鼠TOA-1抗體以及嵌合TOA-1抗體，人類化TOA-1變異體對人類與小鼠具有類似的親和力常數(表29)，證實此等人類化變異體具有完全保留之TrkB結合特性。
實例48抗-TrkB抗體之促效活性
使用1)轉錄報導體監測TrkB信號傳導活化，及2)評估hTrkB之自體磷酸化及ERK1/2、AKT及PLCγ1(TrkB信號傳導之已知介體，Friedman等人Exp Cell Res 1999；253：131-142中綜述)之磷酸化，來評估人類化抗-TrkB TOA-1抗體活化TrkB信號傳導級聯之能力。
表現TrkB之穩定細胞株
使用標準技術(Zhang等人，2007,Neurosignals 15：29-39)，產生表現CRE-螢光素酶報導體及rhuTrkB(nm_006180)或rmuTrkB(nm_001025074)之HEK-293細胞的穩定細胞株。穩定細胞株稱為rhuTrkB-CRE及rmuTrkB-CRE。
轉錄報導體分析
螢光素酶報導體分析如下進行，將rhuTrkB-CRE細胞於生長培養基(10% FCS-DMEM)中以35,000個細胞/100微升/孔塗鋪於白底96孔盤中。次日，在不改變培養基下將10微升/孔鼠類TOA1、人類化TOA-1變異體或同型對照(mIgG1或hIgG1)抗體呈10X添加至分析盤。16-18小時後根據製造商方案，使用Steady-Glo螢光素酶分析系統(Promega，E2520)量測螢光素酶活性。簡言之，培養基用100微升/孔1x PBS置換。接著，添加100微升/孔Steady-Glo試劑。將培養盤用TopSeal(PerkinElmer目錄號6005185)密封且在盤式震盪器(IKA Works,Inc.)以速度600震盪5分鐘。使用VICTOR 3 1420多標記計數器(Perkin Elmer)量測發光。
如圖29中所例示且表30中概述，在小鼠TOA-1及所有人類化 TOA-1變異體下TOA-1抗體處理引起螢光素酶活性之劑量依賴性增加，指示此等抗體能夠活化TrkB信號傳導級聯。
TOA-1抗體對TrkB自體磷酸化及PLCγ1、AKT及ERK1/2之磷酸化的刺激
進行磷酸化分析以量測過度表現TrkB之經工程改造之細胞株(如上所述產生之rhuTrkB-CRE及rmuTrkB-CRE穩定細胞株)及表現人類TrkB之分化人類SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞中TrkB信號傳導之近接標記物之活化。此等細胞中之人類TrkB表現藉由西方分析，使用如下所述之標準技術，使用抗-TrkB抗體(BD Transduction Labs目錄號610102)證實。將表現TrkB之細胞用TOA-1抗體處理且如下詳述，進行西方分析以監測hTrkB(Tyr490)之自體磷酸化及ERK1/2 (Thr202/Tyr204)、AKT(Ser473)、p38(Thr180/Tyr182)及PLCγ1(Tyr783)之磷酸化。
將rhuTrkB-CRE或rmuTrkB-CRE細胞於10% FCS-DMEM生長培養基中以5×105個細胞/孔塗鋪於6孔培養盤中，且培養，直至細胞為85%-90%匯合。將細胞用0.1% FCS-DMEM(低血清培養基)洗滌一次且在低血清培養基中再培育4小時。隨後，將細胞用BDNF(R&D #248BD)或TOA-1抗體在指定濃度下處理15-60分鐘。將培養基自孔抽吸且每孔添加0.6ml 1X加樣緩衝液(Invitrogen，具有1% b-ME)以溶解細胞。將細胞溶解物轉移至Eppendoff管，且在100℃下加熱5分鐘。25μL各樣品在NuPAGE 4-20% Bis-Tris梯度凝膠(Invitrogen)上解析。
如下進行西方分析：在電泳之後，將尺寸分級分離之蛋白質轉移至硝化纖維膜上。將膜用含5%牛奶之T-TBS(含0.15% Tween 20之TBS)阻斷，與適當初級抗體[抗-P-TrkB：磷酸化-TrkA(Tyr490)，Cell signaling(CS)#9141；抗-磷酸化PLCγ1(Tyr783)，CS #2821；抗-磷酸化AKT(Ser473)，CS#9271；抗-P-ERK1/2(磷酸化-P44/P42(Thr202/Tyr204)，CS #9101；抗肌動蛋白，Sigma A2066]於1%牛奶T-TBS中在擺動平台上在4℃下培育隔夜。膜在T-TBS中洗滌3次，隨後與適當HRP結合之二級抗體(Cell Signaling #7974)一起培育2小時。隨後，將膜在T-TBS中洗滌4次且在TBS中洗滌一次。使用ECL套組(GE RPN2106V)及製造商方案，使信號顯影，接著x射線膜暴露或Gel-Doc(Bio-Rad)捕捉影像。
將人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞於生長培養基(DMEM：F12(1：1)，補充有2mM L-麩醯胺酸、15% FBS及青黴素/鏈球菌)中以2×105個細胞/孔塗鋪於6孔盤中且進行培養。將細胞與視黃酸(10μM)一起培育3天以誘發分化。隨後，細胞在低血清培養基(具有1% FBS之生長培養基)中培養隔夜，且在0.1% FBS培養基中進一步培養4小 時。添加指定濃度之BDNF(R&D #248BD)或TOA-1抗體且細胞培育15-60分鐘。將培養基自孔抽吸且每孔添加0.6ml 1X加樣緩衝液(Invitrogen，具有1% b-ME)以溶解細胞。將細胞溶解物轉移至Eppendoff管，且在100℃下加熱5分鐘。20μL各樣品在NuPAGE 4-20% Bis-Tris梯度凝膠(Invitrogen)上解析。如上所述進行西方分析。
如圖30中所示，在表現人類TrkB(圖30A過度表現之TrkB及圖30C內源性TrkB)或小鼠TrkB(圖30B)之細胞中用人類化TOA-1抗體處理誘發TrkB之劑量依賴性自體磷酸化及信號傳導分子ERK1/2、AKT及PLCγ1之磷酸化。
在如上所述進行之磷酸化分析中亦展示BDNF及mTOA-1之相對活性。如藉由TrkB自體磷酸化及PLCγ1磷酸化所量測，與mTOA-1相比，BDNF為TrkB信號傳導級聯之更有效刺激劑(圖30D)。
概言之，轉錄報導體分析與磷酸化分析均證實TOA-1抗體活化TrkB信號傳導路徑。
實例49相對於BDNF，抗體結合抗原決定基之表徵
競爭ELISA用於評估抗-TrkB抗體與TrkB蛋白質之結合如何影響BDNF與TrkB蛋白質之相互作用。
在一種格式中，在4℃下將96孔盤(Costar，目錄號3590)用含BDNF(0.3μg/ml，R&D systems，目錄號248-BD)之PBS塗佈且培育隔夜。將培養盤用PBS、0.1% Tween-20洗滌，隨後在室溫下用PBS、1% BSA、0.05% Tween-20阻斷孔1小時。在室溫下將多個濃度之經ProA純化之抗-TrkB抗體與rhTrkB/Fc嵌合體(150ng/ml，R&D systems，目錄號688-TK)一起預培育30分鐘，隨後添加混合物至培養盤中且在室溫下培育1小時。將培養盤用PBS、0.1% Tween-20洗滌6次，添加過氧化酶結合之山羊抗人類IgG(Fc)抗體(PIERCE，目錄號31413)且在室溫下培育1小時。將孔用PBS洗滌3次且添加受質TMB(BioFX Laboratories，目錄號TMBW-0100-01)，歷時10分鐘。用0.18N H2SO4停止反應。測定450nm下吸光度。
在第二種格式中，在4℃下將96孔盤用含rhTrkB-ECD-His(1μg/ml)之PBS塗佈隔夜。隨後在室溫下培養盤用PBS+0.02%酪蛋白阻斷1小時。將25ng/ml生物素標記之人類化TOA-1與變化濃度之rhBDNF、未標記之huTOA-1或不相關人類IgG1抗體一起培育且接著添加混合物至培養盤中且在室溫下培育1小時。將培養盤用PBS+0.03% tween-20洗滌四次，添加1：10,000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP(Southern Biotech目錄號7100-05)且在室溫下培育30分鐘。將孔用PBS+0.03% tween-20洗滌四次且添加TMB(BioFx)。反應進行5-10分鐘且隨後用0.18N H2SO4淬滅。測定450nm下吸光度。
如圖31中所示，使用兩種競爭ELISA格式之結果指示TOA-1與BDNF部分競爭結合於人類TrkB，表明TOA-1結合位點與hTrkB上之BDNF對接位點至少部分重疊。
實例50定位人類TrkB上之TOA-1結合位點
為進一步描繪TrkB上之TOA-1結合位點，產生一系列嵌合TrkB-TrkA受體且在基於細胞之ELISA中評估TOA-1結合。
產生TrkB-TrkA嵌合受體表現構築體
產生TrkA-TrkB嵌合受體，且使用標準分子選殖技術，選殖至哺乳動物表現載體pcDNA3.1(Invitrogen)中。藉由用TrkA結構域5殘基280-377(np_002520，序列33)替換稱為TrkB之結構域5的殘基284-377(np_001018074序列34)，產生嵌合TrkB(d5TrkA)受體(序列35)。類似地，藉由用TrkB之殘基281-377替換TrkA之殘基283-377，產生嵌合TrkA(d5TrkB)(序列36)。藉由用TrkA之殘基187-281替換TrkB之殘基190-282，產生嵌合TrkB(d4TrkA)(序列37)。藉由用TrkB之殘基190-282替換TrkA之殘基187-281，產生嵌合TrkA(d4TrkB)(序列38)。
基於細胞之ELISA如下進行，以評估人類化TOA-1抗體與TrkB-TrkA嵌合受體之結合：
細胞轉染：
將人胚腎293細胞(ATCC)以每10cm2組織培養盤4.5×106個細胞塗鋪且在37℃下培養隔夜。次日，使用製造商方案，使用LF2000試劑(Invitrogen，目錄號11668-019)以試劑與質體DNA 3：1比率，將細胞用嵌合TrkA-B表現質體轉染。在轉染之後48小時使用胰蛋白酶收穫細胞，用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌一次，隨後以2×106個細胞/毫升懸浮於無血清之生長培養基中
基於細胞之ELISA分析
使用96孔盤，將1μg/ml抗-TrkB或對照抗體在含有1% BSA之PBS中以1：3連續稀釋。添加100μl於無血清生長培養基中2×106個細胞/毫升之適當嵌合TrkA-B轉染293細胞或對照親本293細胞至U形底96孔盤中，得到1×105個細胞/孔。細胞在1600cpm下離心2分鐘。藉由擺動一次，丟棄上清液，且輕拍培養盤以使細胞集結粒鬆散。添加100μl於含有10% FCS之冷PBS中之稀初級抗-TrkB或同型匹配對照抗體至細胞中且在冰上培育1小時。隨後將細胞用100μl稀二級抗-IgG抗體HRP結合物(驢抗兔IgG，Thermo，目錄號31458；山羊抗小鼠IgG FC，Pierce，31439；山羊抗人類IgG Fc，Pierce，目錄號31413)在冰上染色1小時。初級抗體及二級抗體培育各步驟後，將細胞用冰冷PBS洗滌3次。添加100μl受質TMB1組分(BIO FX，TMBW-0100-01)至培養盤中且在室溫下培育10分鐘。藉由添加100μl 0.18M H2SO4中止顯色。將細胞離心且上清液轉移至新培養盤且在450nm下讀數(Soft MAX pro 4.0，Molecular Device)。
如圖33中所示，在此基於細胞之ELISA中，抗-TrkB抗體TOA-1結合於細胞表面表現之TrkB(序列34)，而非TrKA(序列33)。在此相同 分析格式中，TOA-1結合於嵌合TrkA(d5TrkB)，而非TrkB(d5TrkA)。另外，TOA-1結合於TrkB(d4TrkA)而非TrkA(d4TrkB)。總之，結果表明TOA-1抗體結合於TrkB之結構域5，且TrkB之結構域4不足夠用於結合TOA-1。
實例51分離貓NTRK2(TrkB)cDNA 方法 分離貓(家貓)TrkB
使用標準聚合酶鏈反應(PCR)方法分離及選殖TrkB貓編碼序列。使用Stratagene Easy-A高保真度系統(目錄號600640)及提出之方案，使用寡核苷酸5'GGATCCGCCGCCACCATGTCGTCCTGGACGAGGTGGCATGG(SEQ ID NO：144)及5'GCGGCCGCCTAGCCCAGAATATCCAGGTAGACCGGAGAT(SEQ ID NO：145)作為引子，自貓腦cDNA池(BioChain)擴增全長貓(家貓)TrkB序列。用BamHI及NotI限制酶位點，將cDNA選殖至pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)且隨後次選殖至pcDNA3.1-Hyg(Invitrogen)。將所得質體測序(SEQ ID NO：140、141)。
如上所述，藉由PCR，使用寡核苷酸5'GGATCCGCCGCCACCATGTCGTCCTGGACGAGGTGGCATGG(SEQ ID NO：146)及5'GCGGCCGCCTAGCCTAGAATATCCAGGTAGACTGGAG(SEQ ID NO：147)作為引子，自犬腦cDNA池(BioChain)擴增犬(家犬)全長TrkB(XM_851329)編碼序列。選擇人類TrkB同功異型物c之犬直系同源物次選殖至如上所述之pcDNA3.1-Hyg中。將所得質體測序(SEQ ID NO：142、143)。
實例52藉由基於細胞之ELISA量測抗體與不同物種之TrkB的結合
進行基於細胞之ELISA以評估抗-TrkB抗體與小鼠(nm_001025074)、貓及犬TrkB受體之結合。
細胞轉染：
將人胚腎293細胞(ATCC)以每10cm2組織培養盤5×106個細胞塗鋪且在37℃下培養隔夜。次日，使用製造商方案，使用Fugene6(Roche Applied Sciences)以試劑與質體DNA 3：1比率，將細胞用人類、犬或貓TrkB表現質體轉染。在轉染之後24小時使用Accutase(Millipore)收穫細胞，用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌一次，隨後以2×106個細胞/毫升懸浮於具有0.2% BSA之DMEM中。
基於細胞之ELISA分析
使用96孔盤，將10μg/ml抗-TrkB或對照抗體在含有0.2% BSA之DMEM中以1：3.17連續稀釋。添加50μl來自上文之適當TrkB轉染293細胞或對照LacZ轉染293細胞至U形底96孔盤中，得到1×105個細胞/孔。培養盤置於4℃下15分鐘，接著添加50μl稀初級抗-TrkB或同型匹配對照抗體至細胞中。藉由緩緩吸液將細胞與抗體混合，隨後在4℃下培育1小時。藉由在1600cpm下離心2分鐘，將細胞用冰冷PBS洗滌3次。每次藉由擺動一次，丟棄上清液，且輕拍培養盤以使細胞集結粒鬆散，接著添加隨後緩衝液或培養基。隨後，添加100μl於具有0.2% BSA之DMEM中稀二級抗-IgG抗體HRP結合物(Pierce)至細胞中。將細胞在4℃下培育1小時，且如上洗滌3次。為染色，將100μl受質TMB1組分(BIO FX，TMBW-0100-01)添加至各孔中且在室溫下培育5-30分鐘。藉由添加100μl 0.18M H2SO4中止顯色。將細胞離心且上清液轉移至新培養盤且在450nm下讀數(Soft MAX pro 4.0，Molecular Device)。
圖33中展示，如藉由基於細胞之ELISA測定，抗-TrkB抗體小鼠TOA-1及人類化TOA-1結合於小鼠、貓及犬TrkB。表31中展示如藉由基於細胞之ELISA測定，TOA-1結合於細胞表面小鼠、犬及貓TrkB的EC50值。
實例53 抗-TrkB抗體對TrkA、TrkC及p75之選擇性
多個實驗方法用於證實相比於人類TrkA、TrkC及低親和力BDNF受體p75 NTR，抗-TrkB抗體TOA-1對人類TrkB具選擇性。
直接結合ELISA
如下藉由針對重組人類TrkA-Fc、TrkB-Fc或TrkC-Fc之直接結合ELISA，利用生物素標記之人類化TOA-1、嵌合TOA-1及小鼠TOA-1抗體，評估TOA-1對TrkB之選擇性。
將96孔盤(Costar)用含1μg/ml rhTrkB-ECD(R&D system，688-TK)、5μg/ml rhTrkA-ECD(R&D system，175-TK)或5μg/ml rhTrkC-ECD(R&D system，373-TC/TF)之PBS塗佈且在4℃下培育隔夜。在室溫下將培養盤用PBS+0.2%酪蛋白(每孔100μl)阻斷3小時。隨後，將6.7nM 100μl生物素標記之抗體(鼠類TOA1、嵌合TOA1、人類化TOA-1或同型對照)添加至孔中且在室溫下培育1小時。將孔用PBS+-0.03% tween-20洗滌四次。添加1：10,000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP(Southern Biotech目錄號7100-05)且在室溫下培育30分鐘。將孔用PBS+0.03% tween-20洗滌四次且添加TMB(BioFx)。反應進行5-10分鐘且隨後用0.18N H2SO4淬滅。測定450nm下吸光度。
如圖34中所示，人類化TOA-1(亦即TAM-163)、嵌合TOA-1及小鼠TOA-1結合TrkB-Fc而非TrkA-Fc或TrkC-Fc。
FACs分析
根據製造商說明，使用Fugene6(Roche Applied Sciences)將90% 匯合之HEK293細胞用表現人類TrkB(來自nm_006180之開放閱讀框架，選殖至哺乳動物表現載體pcDNA3.1-hyg中，Invitrogen)或人類p75NTR(來自NM_002507之開放閱讀框架，選殖至載體pSMED2中)之質體短暫轉染。藉由西方分析檢驗人類TrkB及人類p75NTR之表現。轉染後24小時，收穫細胞，用PBS洗滌，再懸浮於PBS/0.5% BSA中，且如下將2.5×105個huTrkB及hu p75NTR細胞用抗體染色。為偵測p75NTR，將細胞與1μg/ml小鼠抗-P75-Alexa488(Millipore MAB5368X)在4℃下一起培育30分鐘，接著經由離心(1500rpm 5分鐘)用PBS洗滌。為進行TrkB染色，將細胞與1μg/ml人類化TOA-1抗體在4℃下一起培育30分鐘，接著如上所述用PBS洗滌。隨後，將細胞與FITC標記之小鼠抗人類IgG(Southern Biotech S9670-02)在4℃下一起培育30分鐘，接著如上所述用PBS洗滌。在FACSCalibur上，使用CellQuest軟體(Becton Dickinson)分析染色細胞。
如圖35中所示，使用FACS分析，TOA-1抗體結合於細胞表面表現之人類TrkB，但不結合於細胞表面表現之人類p75NTR。在各別細胞株上使用抗-p75之FACS分析證實此等細胞株中p75之細胞表面表現。
基於細胞之ELISA
進行基於細胞之ELISA以評估TOA-1與人類TrkB受體而非p75NTR之結合。
將人胚腎293細胞如上轉染及收穫，除了以2×106個細胞/毫升再懸浮於含有0.2% BSA之DMEM中。使用96孔盤，將20μg/ml抗-TrkB(TOA-1)、對照抗體(抗-p75NTR，R&D AF367)或抗-huIgG同型抗體在含有0.2% BSA之DMEM中以1：3.17連續稀釋。添加來自以上之50μl經轉染或對照293細胞至U形底96孔盤中，得到1×105個細胞/孔。培養盤在4℃下培育15分鐘，接著添加50μl於冷PBS中之稀初級抗-TrkB或同型匹配對照抗體至細胞中。藉由上下吸液三次使細胞與抗體混合，接 著在4℃下培育1小時。藉由在1600cpm下離心2分鐘，將細胞用冰冷PBS洗滌3次。每次藉由擺動一次，丟棄上清液，且輕拍培養盤以使細胞集結粒鬆散，接著添加隨後緩衝液或培養基。隨後，添加100μl於具有0.2% BSA之DMEM中稀二級抗-IgG抗體HRP結合物(Pierce)至細胞中。細胞在4℃下培育1小時，且如上洗滌3次。為染色，將100μl受質TMB1組分(BIO FX，TMBW-0100-01)添加至各孔中且在室溫下培育5-30分鐘。藉由添加100μl 0.18M H2SO4中止顯色。將細胞離心且上清液轉移至新培養盤且在450nm下讀數(Soft MAX pro 4.0，Molecular Device)。
如圖36中所示，TOA-1抗體結合於表現TrkB之細胞，但不結合於經p75NTR構築體轉染之細胞(圖36A)，如藉由抗-p75NTR抗體偵測，p75NTR構築體在細胞表面上表現p75NTR(圖36B)。
Trk信號轉導
藉由監測Trk之自體磷酸化及ERK1/2、AKT及PLCγ1(Trk信號傳導之已知介體，Friedman等人Exp Cell Res 1999；253：131-142中綜述)之磷酸化，來評估小鼠、嵌合及人類化抗-TrkB TOA-1抗體活化TrkB信號傳導級聯而非TrkA或TrkC級聯之能力。
使用標準技術(Zhang等人，2007,Neurosignals 15：29-39)，產生表現CRE-螢光素酶報導體與rhuTrkA(來自NM_002529.3之開放閱讀框架)、rhuTrkB(來自nm_006180之開放閱讀框架)及rhuTrkC(來自NM_001012338.1之開放閱讀框架)的HEK-293細胞之穩定細胞株。穩定細胞株稱為rhuTrkA-CRE、rhuTrkB-CRE及rhuTrkC-CRE。
將表現Trk之細胞用TOA-1抗體、同型對照抗體或神經營養因子配位體BDNF、NGF及NT3處理。如下詳述，進行西方分析以評估hTrk(Tyr490)之自體磷酸化及ERK1/2(Thr202/Tyr204)、AKT(Ser473)、p38(Thr180/Tyr182)及PLCγ1(Tyr783)之磷酸化。
將rhuTrkA-CRE、rhuTrkB-CRE、rhuTrkC或親本HEK-293細胞於10% FCS-DMEM生長培養基中以5×105個細胞/孔塗鋪於6孔培養盤中，且培養，直至細胞為85%-90%匯合。將細胞用0.1% FCS-DMEM(低血清培養基)洗滌一次且在低血清培養基中再培育4小時。隨後，將細胞用TOA-1抗體(最終濃度100nM)或神經營養因子(TrkB：BDNF，R&D #248BD，10nM最終濃度；TrkA：NGF，R&D 256GF，10nM最終濃度；TrkC：NT3，R&D267N3，25nM最終濃度)處理15-60分鐘。將培養基自孔抽吸且每孔添加0.6ml 1X加樣緩衝液(Invitrogen NP0007，具有1% b-ME)以溶解細胞。將細胞溶解物轉移至Eppendoff管，且在100℃下加熱5分鐘。25μL各樣品在NuPAGE 4-20% Bis-Tris梯度凝膠(Invitrogen)上解析。
西方分析如下進行。在電泳之後，將尺寸分級分離之蛋白質轉移至硝化纖維膜上。將膜用含5%牛奶之T-TBS(含0.15% Tween 20之TBS)阻斷，與適當初級抗體[抗-P-TrkB：磷酸化-TrkA(Tyr490)，Cell signaling(CS)#9141；抗-磷酸化PLCγ1(Tyr783)，CS #2821；抗-磷酸化AKT(Ser473)，CS#9271；抗-P-ERK1/2(磷酸化-P44/P42(Thr202/Tyr204)，CS #9101；抗-肌動蛋白，Sigma A2066]於1%牛奶T-TBS中在擺動平台上在4℃下培育隔夜。膜在T-TBS中洗滌3次，隨後與適當HRP結合之二級抗體(Cell Signaling #7974)一起培育2小時。隨後，將膜在T-TBS中洗滌4次且在TBS中洗滌一次。使用ECL套組(GE RPN2106V)及製造商方案，使信號顯影，接著x射線膜暴露或Gel-Doc(Bio-Rad)捕捉影像。
如圖37中所示，在表現TrkA及TrkC之細胞中TOA-1抗體未能引起Trk自體磷酸化及PLCγ1、AKT及ERK1/2磷酸化超過基線水準之可偵測增加。相比之下，分別為TrkA及TrkC配位體之NGF及NT3誘發反應，指示細胞信號傳導系統完整。
在所有其他實例中，huTOA-1(SEQ ID NO：51及53)稱為TAM-163。
實例54催化及非催化TrkB同功異型物之表現
在準備進行功能研究時且為鑑別內源性TrkB表現量高之組織及細胞株，使用塔克曼定量PCR(Taqman quantitative PCR，Q-PCR)檢驗與TrkB之非催化同功異型物相比，TrkB之催化同功異型物之組織分佈。引子-探針對經設計以識別所有hTrkB同功異型物共用之細胞外域(ECD)或催化hTrkB-a及hTrkB-c同功異型物共用之催化結構域。使用TrkB質體cDNA，產生各引子探針對之標準曲線，且用於將原始數據轉化成TrkB cDNA分子。假設不同mRNA樣品之逆轉錄效率類似，則此數值反映各組織之TrkB mRNA分子。針對各區域設計兩個獨立引子-探針對且用兩對獲得類似結果。如表32中可見，hTrkB在腦中表現最高，且在此組織中，TrkB之催化同功異型物佔所有TrkB同功異型物之約35%。神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y當用視黃酸分化時，TrkB mRNA之表現量與人腦中發現之表現量相當，其中催化同功異型物佔TrkB mRNA之87%。因此，選擇此細胞株評估TAM-163對內源性TrkB之作用。當檢查所有同功異型物之表現時，非神經元組織展示<10%之在腦中發現之TrkB mRNA含量；催化同功異型物之表現甚至更低，且<2%之腦中觀測到之量。TrkB之最低表現在外周血液白細胞中觀測到，其中TrkB mRNA幾乎不可偵測。
實例55表現重組hTrkB、hTrkA及hTrkC之細胞株中TAM-163之信號傳導
使用1)轉錄報導體分析監測TrkB信號傳導活化，2)酶互補分析監測信號傳導分子SHC1募集至TrkB，及3)評估hTrkB之自體磷酸化及ERK1/2、AKT及PLCγ1(TrkB信號傳導之已知介體)之磷酸化，來評估TAM-163活化TrkB信號傳導級聯之能力。相同分析亦用於檢查TAM-163活化TrkA及TrkC信號傳導路徑之能力。
實例56在表現hTrkB之細胞株中TAM-163活化Cre-螢光素酶報導基因，但在表現hTrkA或hTrkC之細胞株中不活化
Cre-螢光素酶(Cre-luc)轉錄報導體分析量測TrkB配位體活化CRE 反應元件之能力且因而整合多個上游信號傳導路徑。先前已描述用於此分析之細胞株hTrkB-Cre、hTrkA-Cre及hTrkC-Cre且展示對適當內源性配位體特異性反應(Zhang等人Neurosignals.2006-2007；15(1)：26-39,Qian等人J Neurosci.2006年9月13日；26(37)：9394-9403)。用TAM-163處理hTrkB-Cre細胞使螢光素酶活性劑量依賴性增加；EC50為0.2nM且最大增加倍數為5倍(圖38)。在同一實驗中，人類BDNF(Peprotech,Rocky Hill,NJ)展示5.2nM之EC50及7.5倍之最大增加倍數，而hIgG對照抗體不具有作用(圖38)。在實驗之間，對於TAM-163，EC50及最大誘發倍數在0.10nM-0.79nM及2.5-5.4倍範圍內，且對於人類BDNF，在5.2-8.2nM及6-7.5倍範圍內。下文展示在hTrkB Cre-luc報導體分析中測試多次之不同批次TAM-163的個別活性資料(表33)。跨越所有分析求平均值，測得此分析中TAM-163之EC50值為0.37±0.06nM，誘發倍數為4.2±0.3。
使用hTrkB-Cre、hTrkA-Cre及hTrkC-Cre與適當內源性對照(hTrkA為NGF，hTrkB為BDNF，且hTrkC為NT-3)及20nM或100nM TAM-163測試TAM-163與人類TrkA及TrkC之交叉反應性(圖39)。雖然內源性配位體產生預期反應(NGF：hTrkA-Cre增加倍數為4.5；NT-3： hTrkC-Cre增加倍數為2.9)，但在hTrkA或hTrkC細胞中，TAM-163未展示與hIgG對照相比螢光素酶活性之任何增加。在同一實驗中，TAM-163活化hTrkB-Cre細胞3.4-4.1倍，證實正如所料，TAM-163對TrkB有效。
實例58在表現hTrkB之細胞中而非表現hTrkA或hTrkC之細胞中TAM-163介導之SHC1募集
亦在酶互補分析中分析TAM-163活化hTrkA、hTrkB及hTrkC之能力(圖40；表34)。此分析使用Discoverx Pathhunter技術監測U2OS細胞中信號傳導分子SHC1募集至自身磷酸化之TrkB。在此分析中TAM-163活化hTrkB，效能類似於在Cre-螢光素酶報導體分析中觀測到之效能(EC50=0.67nM)(圖40；表34)。類似於Cre-螢光素酶分析，藉由TAM-163誘發之最大信號明顯小於在BDNF下觀測到之最大信號，表明TAM-163在此分析中為部分促效劑。重要地，TAM-163在高達670nM濃度下未活化hTrkA或hTrkC，而此等受體之內源性配位體在極低濃度下展示強活化(圖40；表34)。在此分析中hTrkA、hTrkB及hTrkC藉由不常見的一系列內源性Trk配位體活化，此可反映所分析之特定信號傳導路徑(SHC1募集)、細胞背景(U2OS細胞)或Pathhunter系統之特性(此分析使用與小肽抗原決定基融合之hTrkB-a同功異型物，而吾等其他分析用天然hTrkB-c同功異型物進行)。明顯地，TAM-163未交叉活化hTrkA及hTrkC，儘管此分析中內源性配位體之特異性明顯鬆弛。
實例59在表現hTrkB之細胞中而非表現hTrkA或hTrkC中TAM-163活化Trk依賴性磷酸化事件
為直接監測TrkB下游之信號傳導事件，使用西方墨點法。使用上述hTrkA-Cre、hTrkB-Cre及hTrkC-Cre細胞株，評估TrkB(Y490)之自體磷酸化以及TrkB下游之信號傳導分子，包括ERK1/2(Thr202/Tyr204)、PLCγ1(Tyr783)及AKT(Ser473)之磷酸化。在hTrkB-Cre細胞中，TAM-163而非hIgG對照抗體誘發TrkB(Y490)、ERK1/2(Thr202/Tyr204)、PLCg1(Tyr783)及AKT(Ser473)之劑量依賴性磷酸化(圖42)。
在hTrkA-Cre或hTrkC Cre細胞中TAM-163無法誘發信號傳導(圖42)。在hTrkA-Cre及hTrkC-Cre細胞中，hTrkA(NGF)及hTrkC(NT-3)之內源性配位體誘發Trk自體磷酸化與信號傳導中間物ERK1/2及PLCγ1之磷酸化，證實此等細胞株對其適當配位體起反應。在同一實驗中，TAM-163能夠活化hTrkB下游之信號傳導，證實TAM-163為活性。
實例60在表現內源性hTrkB之人類神經母細胞瘤細胞株中TAM-163活化Trk依賴性磷酸化事件
為檢查TAM-163在表現內源性TrkB之細胞中信號傳導之能力，使用分化之人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞。在此等細胞中TAM-163而非hIgG對照抗體，以劑量依賴性方式誘發ERK1/2、PLCγ1及AKT之磷酸化；在濃度1nM TAM-163下作用變得明顯(圖43)。與BDNF相比，TAM-163呈現略微更小的效力，且展示明顯更低的對磷酸化之最 大刺激，表明在此系統中TAM-163為部分促效劑。
實例61 TAM-163誘發hTrkB之內化及降解
已報導BDNF介導TrkB之內化及降解。使用表現重組(hTrkB-Cre)或內源性(SH-SY5Y)TrkB之細胞株，檢驗TAM-163對TrkB內化及降解之作用。為監測內化，將細胞用TAM-163或BDNF活化所指示之時間，隨後用生物素標記細胞表面蛋白質，藉由抗生蛋白鏈菌素親和力純化分離且藉由西方墨點法鑑別細胞表面TrkB蛋白質。此分析中，生物素標記之TrkB表示在活化之後保留在細胞表面上之TrkB。如圖44中可見，在表現重組TrkB之細胞(hTrkB-Cre)中及在表現內源性TrkB之細胞(SH-SY5Y)中TAM-163而非對照hIgG抗體，誘發TrkB之顯著內化。TAM-163不影響不相關蛋白質(EGF受體、NMDA受體)之細胞表面含量。在hTrkB-Cre與SH-SY5Y細胞中，藉由TAM-163誘發之TrkB內化之時程及量與BDNF相當(圖44)。
為監測TrkB降解，將細胞表面蛋白質用生物素標記，隨後暴露配位體且隨後用TAM-163或BDNF活化細胞所指示之時間。藉由抗生蛋白鏈菌素親和力純化分離標記蛋白質且藉由西方墨點法鑑別TrkB。在此分析中，生物素標記之TrkB表示在活化之後保留之總TrkB；標記TrkB之消失為其自細胞清除之量度。如圖45中可見，在表現重組TrkB之細胞(hTrkB-Cre)中及在表現內源性TrkB之細胞(SH-SY5Y)中TAM-163而非對照hIgG抗體，誘發細胞表面標記之TrkB降解。TAM-163不影響不相關蛋白質(EGF受體、NMDA受體)。在hTrkB-Cre與SH-SY5Y細胞中，藉由TAM-163誘發之TrkB降解之時程及量與BDNF相當(圖45)。
實例62 TAM-163不結合於人類p75NTR
TAM-163與人類p75NTR之交叉反應性藉由螢光活化細胞分選儀(FACS)分析，使用經hTrkB或人類p75NTR短暫轉染之HEK293細胞檢 驗。TAM-163(6.7nM)能夠特異性結合於經hTrkB轉染之細胞，如與經對照空載體轉染之細胞相比，螢光增加所證明(圖46)。TAM-163未展示與經人類p75NTR轉染之細胞的任何結合；實際上，與對照轉染細胞相比，染色稍微更少(圖46，上圖)。為檢驗p75NTR實際上在細胞表面表現且存在，細胞用ALEXA標記之抗p75NTR抗體染色。如圖46下圖中可見，抗-p75NTR抗體強有力地染色表現p75NTR之細胞，但不染色表現hTrkB或對照載體之細胞。
作為第二方法，使用基於細胞之ELISA測試TAM-163與表現p75NTR之細胞的結合。將經hTrkB、人類p75NTR或對照載體短暫轉染之HEK293細胞與TAM-163或抗-p75NTR抗體一起培育。TAM-163特異性結合於表現人類TrkB之細胞，在低至0.2nM濃度下結合可偵測(圖47)。即使在極高濃度(67nM)下TAM-163亦未展示與表現人類p75NTR之細胞的任何結合。為檢驗p75NTR實際上在細胞表面表現及存在，用抗-p75NTR抗體染色。正如所料，抗-p75NTR抗體染色表現人類p75NTR之細胞，但不染色對照細胞或表現hTrkB之細胞(圖47)。
實例63 TAM-163與猴、小鼠、犬及貓TrkB之交叉反應性
因為食蟹獼猴TrkB無可用序列資訊，所以使用標準選殖生物技術及腦作為模板，自此物種分離TrkB cDNA。測序揭露TrkB-c與TrkB-a同功異型物之存在，其中大部分純系(8/10)含有TrkB-c同功異型物。獼猴TrkB cDNA序列與人類TrkB序列之比較展示，除信號序列中之一個胺基酸改變外，成熟食蟹獼猴TrkB蛋白質的胺基酸序列與人類TrkB一致。發現恆河猴TrkB序列(在公眾資料庫中可作為XP_001107264獲得)與成熟人類TrkB(未顯示)一致。因為猴TrkB蛋白質與人類一致，所以以上展示之所有人類TrkB結合及信號傳導資料同等適用於猴TrkB。
使用結合與信號傳導實驗，評估TAM-163與小鼠及犬TrkB之交叉 反應性。對於結合，使用基於細胞之ELISA。將經小鼠、犬或貓TrkB或對照載體短暫轉染之HEK293細胞與各種濃度TAM-163抗體一起培育。觀測到與來自所有物種之TrkB的劑量依賴性結合，而未觀測到與表現lacz之對照細胞株的結合。在物種之間EC50類似(小鼠TrkB=0.34nM；犬TrkB=0.94nM；貓TrkB=0.39nM)，指示TAM-163以高親和性結合於小鼠、犬及貓TrkB(圖48)。
為評估TAM-163誘發小鼠及犬TrkB上信號傳導之能力，產生表現小鼠或犬TrkB之穩定細胞株。在小鼠(圖49；TAM-163)與犬(圖50；TAM-163)TrkB細胞中，TAM-163而非hIgG對照抗體，劑量依賴性地活化TrkB(Y490)、ERK1/2(Thr202/Tyr204)、PLCγ1(Tyr783)及AKT(Ser473)之磷酸化。在小鼠與犬中在1nM濃度下可偵測到信號傳導路徑之活化，與在結合分析中針對小鼠及犬TrkB所觀測到之EC50一致。
實例64 感覺神經元聽覺喪失中之TrkB：
暫時性及永久性聽覺喪失由各種來源，包括過度暴露於強大聲音、化療誘發之破壞或由衰老引起之神經退化(老年性耳聾)誘發。來自Liberman,2009,J.Neurosci.29(45)：14077-14085之近期證據提出帶狀突觸為刺耳噪音暴露與老年性耳聾後的第一損傷部位。此帶狀突觸破壞先於螺旋神經節神經元(SGN)及毛髮細胞喪失，使得帶狀突觸成為聽覺喪失介入之具有吸引力的目標。
已知稱為神經營養素之因子相關肽為神經發育及維持所必不可少，且若干神經營養素作用於許多神經元受體，促進神經元存活及分化。此類別肽已展示影響帶狀突觸，特別大腦衍生神經營養因子(BDNF)。Wise等人(J.Comp.Neurol.2000,487：147-165，其內容以引用的方式併入本文中)之良好工作清楚地證實BDNF治療預防回應於一致跨越所有耳蝸區域之變聾的SGN喪失。確切而言，在測試模型中 BDNF之應用預防聽覺神經元死亡，減少持續神經元喪失且增強耳蝸效能，對聽覺產生深遠作用。Melster等人(Curr Biol,2014：24(6)：658-663，其內容以引用的方式併入本文中)證實在鼠類耳蝸中TrkB介導之對噪音外傷之生理節奏敏感性的保護。Schimmang等人(Development,2003,130：4741-4750，其內容以引用的方式併入本文中)證實在產後耳蝸中BDNF及TrkB信號傳導之缺乏導致沿音質分佈軸之神經分佈在空間上重新成形及聽覺喪失。
酪胺酸激酶受體B(TrkB)為若干生長因子相關肽(神經營養素)，尤其BDNF及神經營養因子-3(NT-3)之一種高親和性催化受體。TrkB主要在整個中樞神經系統中，包括帶狀突觸，在神經元中表現且起作用，使得其成為多種感覺神經聽覺喪失病症(包括突然聽覺喪失、噪音誘發之聽覺喪失、年齡相關之聽覺喪失(老年性耳聾)、噪音誘發之聽覺喪失、藥物誘發之聽覺喪失及遺傳聽覺病症)之強大潛在治療標靶。因此，TrkB促效劑可為治療此類聽覺喪失病症之潛在治療劑。
TAM-163為設計為促效劑之人類化單株抗體。已展示TAM-163(亦稱為huTOA-1及PF-05230901)為展示強力活化下游信號傳導級聯之此類選擇性抗體TrkB(圖41，TRK、PLCγ1及ERK½)且證實優良選擇性型態(圖42)。因此，TAM-163可為治療需要此類治療之患者中可用TrkB促效劑治療之聽覺喪失病症的潛在治療劑。
此類患者可藉由確定聽覺喪失之測試來鑑別，測試可藉由聽力學家使用聽度計進行，以確定個體在不同頻率下之聽覺敏感性。在此項技術中已知之許多此類測試中，可使用其他聽覺測試，例如韋伯測試(Weber test)、里尼測試(Rinne test)、噪音測試中之聽覺、聲波反射測試及鼓室圖。
實例65結論
本發明之資料證實TAM-163為人類TrkB之一種有效及特定促效 劑，其活化TrkB信號級聯之所有態樣。雖然TAM-163之效能(EC50)與內源性TrkB配位體BDNF相當，但最大作用小於在BDNF下觀測到之作用(視分析而定，最大信號之約50-80%)，表明TAM-163為人類TrkB之部分促效劑。TAM-163以類似於BDNF之方式誘發人類TrkB之內化及降解。在細胞表面結合實驗中TAM-163不與人類TrkA、人類TrkC或人類p75NTR交叉反應，且在表現人類TrkA或TrkC之細胞株中不誘發信號傳導。TAM-163在低奈莫耳濃度下結合於小鼠及犬TrkB且活化，類似於其對人類TrkB之作用。因為猴TrkB與人類TrkB 100%一致，所以TAM-163亦完全與猴TrkB交叉反應。在正常人類組織中TrkB之催化同功異型物以及所有同功異型物之mRNA表現的檢查證實TrkB之催化同功異型物在腦中最高表現，且人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y可用於檢查藉由內源性TrkB介導之信號傳導。
本發明之其他實施例
E77. 根據本發明之第77個實施例(E77)，提供一種分離之人類酪胺酸受體激酶B(huTrkB)抗體，其特異性結合於huTrkB，其中VH區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：113，且其中VL結構域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130及SEQ ID NO：132。
E78. 如E77中所闡述之抗體，其中該VH區包含SEQ ID NO：51之胺基酸且該VH區包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列。
E79. 如E77至E78中任一者中所闡述之抗體，其中該抗體為IgG1子類。
E80. 如E77至E79中任一者中所闡述之抗體，其中該HC包含SEQ ID NO：75且該LC包含SEQ ID NO：78。
E81. 一種分離之人類酪胺酸受體激酶B(huTrkB)抗體，其特異性結合於huTrkB，其中VH區包含由選自由以下組成之群的序列編碼的胺基酸序列：SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：113；且其中VL區藉由包含選自由以下組成之群的序列之核酸編碼：SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131及SEQ ID NO：133。
E82. 如E77至E81中任一者中所闡述之抗體，其中該VH區藉由包含SEQ ID NO：110之核酸編碼，且該VL區藉由包含SEQ ID NO：123之核酸編碼。
E83. 一種核酸，其編碼如E77至E82中任一者中所闡述之抗體。
E84. 一種核酸，其編碼如E77至E82中任一者中所闡述之抗體，其中VH區係由包含選自由以下組成之群的序列之核酸編碼：SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：113；且其中該VL區係由包含選自由以下組成之群的序列之核酸編碼：SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131及SEQ ID NO：133。
E85. 一種核酸，其編碼如E77至E82中任一者中所闡述之抗體，其中VH區藉由包含SEQ ID NO：110之核酸編碼，且VL區藉由包含SEQ ID NO：123之核酸編碼。
E86. 一種載體，其包含如E83至E85中任一者中所闡述之核酸。
E87. 一種載體，其包含如E83至E86中任一者中所闡述之編碼抗體之核酸。
E88. 一種細胞，其包含如E83至E85中任一者中所闡述之核酸。
E89. 一種細胞，其包含如E86至E87中任一者中所闡述之載體。
E90. 一種細胞，其表現如E77至E82中任一者中所闡述之抗體。
E91. 一種細胞，其包含如E83至E85中任一者中所闡述之核酸。
E92. 一種產生抗體之方法，其包含在有利於抗體表現之條件下培養如E88至E91中任一者中所闡述之細胞且使該細胞表現該抗體。
E93. 一種醫藥組合物，其包含如E77至E82中任一者中所闡述之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
E94. 一種治療個體之聽覺喪失的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如E93中所闡述之醫藥組合物。
E95. 一種預防個體中進一步聽覺喪失之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如E93中所闡述之醫藥組合物。
E96. 如E94至95中任一者中所闡述之方法，其中該聽覺喪失係選自由突然聽覺喪失、年齡相關之聽覺喪失、噪音誘發之聽覺喪失、藥物誘發之聽覺喪失及遺傳聽覺病症組成之群。
E97. 如E94至E96中任一者中所闡述之方法，其中該聽覺喪失之特徵為聽覺神經元死亡。
E98. 如E94至E97中任一者中所闡述之方法，其中該聽覺神經元死亡藉由TrkB活化減至最少或抑制。
E99. 如E97至E98中任一者中所闡述之方法，其中該聽覺神經元死亡發生在帶狀突觸。
E100. 如E94至E99中任一者中所闡述之方法，其中該方法提高耳蝸效能。
E101. 如E77至E82中任一者中所闡述之抗體，其用於治療聽覺喪失。
E102. 如E77至E82中任一者中所闡述之抗體，其用於預防個體中進一步聽覺喪失。
E103. 如E101至102中任一者中所闡述之抗體，其中該聽覺喪失係選自由突然聽覺喪失、年齡相關之聽覺喪失、噪音誘發之聽覺喪失、藥物誘發之聽覺喪失及遺傳聽覺病症組成之群。
E104. 如E101至E103中任一者中所闡述之抗體，其中該聽覺喪失之特徵為聽覺神經元死亡。
E105. 如E104中所闡述之抗體，其中該聽覺神經元死亡藉由TrkB活化減至最少或抑制。
E106. 如E104至E105中任一者中所闡述之抗體，其中該聽覺神經元死亡發生在帶狀突觸。
E107. 如E101至E106中任一者中所闡述之抗體，其中該抗體投與具有聽覺喪失之個體提高耳蝸效能。
E108. 如E93中所闡述之醫藥組合物，其用於治療聽覺喪失。
E109. 如E93中所闡述之醫藥組合物，其用於預防個體中進一步聽覺喪失。
E110. 如E108至109中任一者中所闡述之醫藥組合物，其中該聽覺喪失係選自由突然聽覺喪失、年齡相關之聽覺喪失、噪音誘發之聽覺喪失、藥物誘發之聽覺喪失及遺傳聽覺病症組成之群。
E111. 如E108至E110中任一者中所闡述之醫藥組合物，其中該聽覺喪失之特徵為聽覺神經元死亡。
E112. 如E111中所闡述之醫藥組合物，其中該聽覺神經元死亡 藉由TrkB活化減至最少或抑制。
E113. 如E111至E112中任一者中所闡述之醫藥組合物，其中該聽覺神經元死亡發生在帶狀突觸。
E114. 如E108至E113中任一者中所闡述之醫藥組合物，其中該抗體投與具有聽覺喪失之個體提高耳蝸效能。
E115. 如E1至71及E77至E107中任一者中所闡述之抗體。
因此本發明已廣泛揭示且參考上述代表性實施例說明。熟習此項技術者將認識到在不背離本發明之精神及範疇下可進行各種修改。所有公開案、專利申請案及頒予專利以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同每個個別的公開案、專利申請案或頒予專利經特定及個別地指示以全文引用的方式併入本文中一般。在以引用的方式併入之文本中所含之定義若與本揭示案中之定義矛盾，則將其排除在外。
應瞭解，為清楚起見描述於獨立實施例內容中之本發明的某些特徵亦可以單一實施例之組合提供。相反，出於簡略起見而在單一實施例之背景中描述的本發明之各種特徵亦可獨立地或以任何適宜子組合來提供。
特定預期關於本發明之一個實施例所述的任何限制可應用於本發明之任何其他實施例。此外，本發明之任何組合物均可用於本發明之任何方法，且本發明之任何方法均可用於產生或利用本發明之任何組合物。詳言之，應瞭解單獨或與一或多個其他技術方案及/或實施方式之態樣組合的技術方案中所述之本發明之任何態樣可與技術方案及/或實施方式及/或序列表及/或圖式中別處陳述之本發明之其他態樣組合。
在本文中發現之特定實例不在本發明之範疇內的程度上，該特定實例可明確不主張。
除非明確指示申請專利範圍中術語「或」之使用係指唯一選擇 項或選擇項互相排斥，否則係用以意謂「及/或」，不過本揭示案支持係指唯一選擇項及「及/或」之定義。除非另外清楚指示，否則如本說明書中所使用，「一(a)」或「一(an)」可意謂一或多個。如本文在申請專利範圍中所用，當結合詞「包含」使用時，詞「一」可意謂一或多個。如本文中所用，「另一」可意謂至少第二或以上。除非本文另有定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有由一般技術者所通常理解之含義。此外，除非上下文另有所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。「包含(comprises)/包含(comprising)」及詞「具有/包括」在本文中提及本發明使用時用以指定所陳述特徵、整數、步驟或組件之存在但不排除一或多個其他特徵、整數、步驟、組件或其群組之存在或添加。
雖然已參考不同申請案、方法及組合物描述所揭示之教示內容，但將瞭解在不背離本文中之教示及下文所主張之本發明下可進行不同改變及修改。提供該等實例以更好地說明所揭示之教示內容，且不意欲限制本文中所呈現之教示內容之範疇。雖然已根據此等示例性實施例描述本發明之教示內容，但在不進行過度實驗下可對此等示例性實施例進行大量變化及修改。所有此類變化及修改皆在本教示內容之範疇內。
當本發明之態樣或實施例根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代群組進行描述時，本發明不僅涵蓋整體列出之全部群組，而且亦涵蓋獨立群組之各成員及主群組之所有可能子組，且亦涵蓋缺乏一或多個群組成員之主群組。本發明亦涵蓋所主張之發明中任何組成員中之一或多者明確排除。
本文中所引用之全部參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似文獻，以及其中所引用之參考文獻，均以全文引用的方式，以其前所未有之程度併入本文中。在所併入之文獻、專利及 類似物質中之一或多者不同於本申請案或與本申請案相悖之情況下(包括(但不限於)所定義術語、術語用法、所述技術或其類似者)，以本申請案為準。
實施方式及實例詳述本發明之某些特定實施例，且描述本發明人預期之最佳模式。然而，應瞭解，無論上述內容以多麼詳細之文字出現，本發明均可以多種方式實施，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何同等物解釋。
<110> 美商輝瑞大藥廠 貝內特 埃瑞克 M 希金森-史考特 奈森 奇斯蒂亞科瓦 利烏米拉 瑪奎德 金伯利 A 保爾森 珍妮特 E 吉米諾 茹絲 E
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<213> 人工序列
<220>
<223> 自殘基111至226編號之IgM CH1 seq1
<400> 7
<210> 8
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 7之編號範圍的IgM CH1 seq2
<400> 8
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自位置101至215編號之CL-κ-KM3
<400> 9
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-κ-KM1
<400> 10
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-κ-KM1、2
<400> 11
<210> 12
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-λ
<400> 12
<210> 13
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自241至360B編號之IgG1 CH2
<400> 13
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 13之編號範圍的IgG2 CH2
<400> 14
<210> 15
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 13之編號範圍的IgG3 CH2
<400> 15
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 13之編號範圍的IgG4 CH2
<400> 16
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 13之編號範圍的IgM CH2
<400> 17
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自361至478編號，具有插入398A之IgG1 CH3
<400> 18
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之編號範圍的IgG1 CH3替代同型
<400> 19
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之編號範圍的IgG2 CH3
<400> 20
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之編號範圍的IgG3 CH3
<400> 21
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之編號範圍的IgG4 CH3
<400> 22
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之編號範圍的IgM CH3
<400> 23
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-V133S-S176D
<400> 24
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-V133S-S176K
<400> 25
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-L1.1
<400> 26
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-L4.1
<400> 27
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-L4.2
<400> 28
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-L4.3
<400> 29
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-H10.1
<400> 30
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-H10.4
<400> 31
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-5.6
<400> 32
<210> 33
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自殘基111至230編號之CH1-L124K-V190S
<400> 33
<210> 34
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-L124E-S188G
<400> 34
<210> 35
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-L1.1
<400> 35
<210> 36
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-L4.1
<400> 36
<210> 37
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-L4.2
<400> 37
<210> 38
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-L4.3
<400> 38
<210> 39
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-H10.1
<400> 39
<210> 40
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-H10.4
<400> 40
<210> 41
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-5.6
<400> 41
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自231至243編號之IGG1-鉸鏈
<400> 42
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 42之範圍編號的IgG1-鉸鏈-EE
<400> 43
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 42之範圍編號的IGG1-鉸鏈-RR
<400> 44
<210> 45
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 13之範圍編號的CH2-WINTER
<400> 45
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之範圍編號的CH3-CW(「杵」)
<400> 46
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之範圍編號的CH3-CSAV(「臼」)
<400> 47
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之範圍編號的CH3-E
<400> 48
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 18之範圍編號的CH3-R
<400> 49
<210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自1至113編號，具有插入52A、82A、82B、82C、100A、100B、100C之C5-VH
<400> 50
<210> 51
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 50之範圍編號的TAM-163 VH
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自1至107編號之C5-VL
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自1至107編號之TAM-163 VL
<400> 53
<210> 54
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自111至478編號之SeqID：1、42、45、18
<400> 54
<210> 55
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：33、42、45、46
<400> 55
<210> 56
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：1、42、45、46
<400> 56
<210> 57
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：33、44、45、49
<400> 57
<210> 58
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：1、44、45、49
<400> 58
<210> 59
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：34、42、45、47
<400> 59
<210> 60
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：1、42、45、47
<400> 60
<210> 61
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：35、42、45、47
<400> 61
<210> 62
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：36、42、45、47
<400> 62
<210> 63
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：37、42、45、47
<400> 63
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：38、42、45、47
<400> 64
<210> 65
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：39、42、45、47
<400> 65
<210> 66
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：40、42、45、47
<400> 66
<210> 67
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：41、42、45、47
<400> 67
<210> 68
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：34、43、45、48
<400> 68
<210> 69
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 54之編號範圍的SeqID：1、43、45、48
<400> 69
<210> 70
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自1至478編號之SeqID：50、54
<400> 70
<210> 71
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 70之編號範圍的SeqID：50、59
<400> 71
<210> 72
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 70之編號範圍的SeqID：50、60
<400> 72
<210> 73
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 70之編號範圍的SeqID：50、68
<400> 73
<210> 74
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 70之編號範圍的SeqID：50、69
<400> 74
<210> 75
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 70之編號範圍的SeqID：51、54
<400> 75
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自位置1至215編號之SeqID：52、9
<400> 76
<210> 77
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 76之編號範圍的SeqID：52、25
<400> 77
<210> 78
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 76之編號範圍的SeqID：53、9
<400> 78
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 42之編號範圍的IgG2鉸鏈
<400> 79
<210> 80
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自231至243之IgG3鉸鏈
<400> 80
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 42之編號範圍的IgG4鉸鏈
<400> 81
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自361至478編號，具有E391之IgG1 CH3替代異型
<400> 82
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自361至478編號，具有R441之IgG1 CH3替代異型
<400> 83
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自361至478編號，具有R441之IgG2 CH3替代異型
<400> 84
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自361至478編號，具有E391之IgG2 CH3替代異型
<400> 85
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-S176D
<400> 86
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 9之編號範圍的CL-S176K
<400> 87
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 76之編號範圍的CL-去卷積-C3臂
<400> 88
<210> 89
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-L124K
<400> 89
<210> 90
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用Seq 33之範圍編號的CH1-L124E
<400> 90
<210> 91
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH-L124K-杵
<400> 91
<210> 92
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH-L124E-臼
<400> 92
<210> 93
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-C5_去卷積S1_rev
<400> 93
<210> 94
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-C5-T1
<400> 94
<210> 95
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-C5-T2
<400> 95
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-C5-T3
<400> 96
<210> 97
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-C5-T4
<400> 97
<210> 98
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-C5-T9
<400> 98
<210> 99
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-C5-T1
<400> 99
<210> 100
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-C5-T2
<400> 100
<210> 101
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-C5-T3
<400> 101
<210> 102
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-C5-T4
<400> 102
<210> 103
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-C5-T9
<400> 103
<210> 104
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOA-1 VH
<400> 104
<210> 105
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOA-1 VH(前導，CDR加下劃線且由Kabat界定)
<400> 105
<210> 106
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOA-1 VL
<400> 106
<210> 107
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOA-1 VL(前導，CDR加下劃線，由Kabat界定)
<400> 107
<210> 108
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：5 TOA-1 A1D VL
<400> 108
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TOA-1 A1D VL(前導，CDR加下劃線，由Kabat界定)
<400> 109
<210> 110
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VH v1.0
<400> 110
<210> 111
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VH v1.1(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 111
<210> 112
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VH v1.1
<400> 112
<210> 113
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VH v2.0(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 113
<210> 114
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VH v2.0
<400> 114
<210> 115
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.0(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 115
<210> 116
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.0
<400> 116
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.1(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 117
<210> 118
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.1
<400> 118
<210> 119
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.2(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 119
<210> 120
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.2
<400> 120
<210> 121
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.3(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 121
<210> 122
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：20 huTOA-1 VL v1.3
<400> 122
<210> 123
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.4
<400> 123
<210> 124
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.5(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 124
<210> 125
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.5
<400> 125
<210> 126
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.6(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 126
<210> 127
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.6
<400> 127
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.7(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 128
<210> 129
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.7
<400> 129
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.8(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 130
<210> 131
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v1.8
<400> 131
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v2.0(CDR加下劃線，由AbM界定)
<400> 132
<210> 133
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huTOA-1 VL v2.0
<400> 133
<210> 134
<211> 796
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TrkA，NP_002520 NP_002520長度：796 2009年6月8日11：29類型：P檢查：1056
<400> 134
<210> 135
<211> 822
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TrkB，NP_001018074 NP_001018074長度：822 2007年12月1日13：31類型：P檢查：9157
<400> 135
<210> 136
<211> 826
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合TrkB(d5TrkA)
<400> 136
<210> 137
<211> 798
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合TrkA(d5TrkB)
<400> 137
<210> 138
<211> 824
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合TrkB(d4TrkA)
<400> 138
<210> 139
<211> 794
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合TrkA(d4TrkB)
<400> 139
<210> 140
<211> 2469
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB，貓(家貓)核苷酸
<400> 140
<210> 141
<211> 822
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB，貓(家貓)蛋白質：
<400> 141
<210> 142
<211> 2469
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB，犬(家犬，XM_851329)
<400> 142
<210> 143
<211> 822
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB，犬(家犬，XM_851329)，胺基酸序列：
<400> 143
<210> 144
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 貓TrkB正向引子
<400> 144
<210> 145
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 貓TrkB反向引子
<400> 145
<210> 146
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 犬TrkB正向引子
<400> 146
<210> 147
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 犬TrkB反向引子
<400> 147

Claims (29)

  1. 一種雜二聚體蛋白質，其包含(i)第一CH1結構域(CH1)及第一CL結構域(CL)，該第一CH1與該第一CL在第一CHCL界面相互作用在一起形成第一CHCL結構域(CHCL)；(ii)第二CH1結構域(CH1)及第二CL結構域(CL)，該第二CH1與該第二CL在第二CHCL界面相互作用在一起形成第二CHCL結構域(CHCL)；其中該第一CH1經工程改造以與該第二CH1不同在於該第一CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該第一CL經工程改造以與該第二CL不同在於該第一CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第一CHCL之CH1突變殘基與CL突變殘基彼此相互作用優先於該第二CHCL上之對應殘基位置，該第一CH1及第一CL之相互作用突變殘基由此形成第一互補殘基組，且其中該第一CH1連接於第一可變重鏈結構域(VH)，且該第一CL連接於第一可變輕鏈結構域(VL)，且該第二CH1連接於第二VH，且該第二CL連接於第二VL，使得當組合時，該第一VH、第一VL、第一CH及第一CL一起形成第一Fab，且當組合時，該第二VH、第二VL、第二CH1及第二CL形成第二Fab，且其中該第一Fab及該第二Fab之優先形成不依賴於該等可變結構域之互補配對。
  2. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第一互補殘基組之溶劑可及表面積小於225Å2。
  3. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該第二CH1經工程改造以與該第一CH1不同在於該第二CH1中之至少一個CH1突變殘基；且該 第二CL經工程改造以與該第一CL不同在於該第二CL中之至少一個CL突變殘基；使得該第二CHCL之CH1突變殘基與CL突變殘基彼此相互作用優先於該第一CHCL上之對應殘基位置，該第二CH1及第二CL之相互作用突變殘基由此形成第二互補殘基組。
  4. 如請求項3之雜二聚體蛋白質，其中如使用2.5Å探針量測，該第二互補殘基組之溶劑可及表面積小於225Å2。
  5. 如請求項2至4中任一項之雜二聚體蛋白質，其中該第一互補殘基組之突變殘基不同於該第二互補殘基組之突變殘基。
  6. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL及第二CHCL之形成發生優先於由該第一CH1及第二CL構成或第二CH1及第一CL構成之CHCL之形成至少約4倍。
  7. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該CL結構域中之至少一者為κ結構域。
  8. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該等互補殘基組在一個結構域中包含帶正電或帶負電殘基，且在另一個結構域中包含極性殘基或帶相反電荷之殘基。
  9. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該等互補殘基組之位置係選自由以下組成之群：(i)CH1-124及CL-176；(ii)CH1-188及CL-178；(iii)CH1-143及CL-178；(iv)CH1-143及CL-131；(v)CH1-221及CL-123；(vi)CH1-145及CL-131；(vii)CH1-179及CL-131；(viii)CH1-186及CL-131；及 (ix)CH1-188及CL-133。
  10. 如請求項9之雜二聚體蛋白質，其中在該CH1位置之突變係選自由W、H、K、R、S及T組成之群，且在該CL位置之突變係選自由S、M、D及E組成之群，或在該CH1位置之突變係選自由E及D組成之群，且在該CL位置之突變係選自由H、K及R組成之群。
  11. 如請求項10之雜二聚體蛋白質，其中該等互補殘基組進一步包含一或多個選自由以下組成之群的突變：CH1-143D、CH1-145S、CH1-186A、CH1-186E、CH1-188G、CH1-143S、CH1-190S、CH1-190I、CL-133S、CL-135I、CL-176G、CL-176M及CL-178G、CL-178S。
  12. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該第一及第二互補殘基組係選自以下之群中的兩者：(i)CH1-124K、CL-176D、CH1-190S、CL-133S；(ii)CH1-124K、CL-176D、CL-133S；(iii)CH1-124E、CL-176K；(iv)CH1-124E、CL-176K、CH1-188G；(v)CH1-188E、CL-178K、CH1-143E；(vi)CH1-188K、CL-178D、CH1-143D；(vii)CH1-143K、CL-178D；(viii)CH1-143D、CL-178R；(ix)CH1-143K、CL-178D；(x)CH1-143D、CL-178K；(xi)CH1-143D、CL-178K、CL-176M；(xii)CH1-143E、CL-131R；(xiii)CH1-143R、CL-131E；(xiv)CH1-143R、CL-131E、CH1-186A； (xv)CH1-221D、CL-123K；(xvi)CH1-221D、CL-123K、CH1-190I、CL-135I；(xvii)CH1-145E、CL-131H；(xviii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H；(xix)CH1-145E、CL-131H；(xx)CH1-186E、CL-131H、CH1-145S；(xxi)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S；(xxii)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-176G、CL-178G；(xxiii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H、CH-190I、CL-135I；(xxiv)CH-186E、CL-131H、CH-145S；(xxv)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-176C；(xxvi)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-178G、CL-176G；(xxvii)CH1-143S、CH1-188W、CL-131D。
  13. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其包含經工程改造之二硫鍵在該第一CH1與該第一CL之間及或該第二CH1與該第二CL之間。
  14. 如請求項13之雜二聚體蛋白質，其中該經工程改造之二硫鍵位於一或多個以下位置：(i)CH1-122及CL-123；(ii)CH1-139及CL-116；及(iii)CH1-174及CL-176。
  15. 如請求項13至14中任一項之雜二聚體蛋白質，其中野生型二硫 鍵已藉由使該第一CHCL及/或第二CHCL上CH1-C230及CL-214中之一或兩者突變成除C外之任何殘基來移除，且其中該第一及/或第二CH1-C230及第一及/或第二CL-C214突變成S。
  16. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL包含以下之群之一的殘基：(i)CH1-124K、CL-176D、CH1-190S、CL-133S；(ii)CH1-124K、CL-176D、CL-133S；(iii)CH1-124E、CL-176K、CL-133S；(iv)CH1-124E、CL-176K、CH1-188G、CL-133S；(v)CH1-188E、CL-178K、CH1-143E；(vi)CH1-188K、CL-178D、CH1-143D；(vii)CH1-143K、CL-178D；(viii)CH1-143D、CL-178R；(ix)CH1-143K、CL-178D；(x)CH1-143D、CL-178K；(xi)CH1-143D、CL-178K、CL-176M；(xii)CH1-143E、CL-131R；(xiii)CH1-143R、CL-131E；(xiv)CH1-143R、CL-131E、CH1-186A；(xv)CH1-221D、CL-123K；(xvi)CH1-221D、CL-123K、CH1-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xvii)CH1-145E、CL-131H；(xviii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H；(xix)CH1-122C、CH1-145E、CH1-230S、CL-123C、CL-131H、CL-214S； (xx)CH1-186E、CL-131H、CH1-145S；(xxi)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S；(xxii)CH1-143S、CH1-188W、CL-133M、CL-176G、CL-178G；(xxiii)CH1-143H、CH1-179D、CH1-186E、CL-131H、CH-190I、CL-135I、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xxiv)CH-186E、CL-131H、CH-145S、CH1-139C、CH1-230S、CL-116C、CL-214S；(xxv)CH1-143S、CL-131D、CH1-188W、CL-133S、CL-178S、CH1-174C、CH1-230S、CL-176C、CL-214S；(xxvi)CH1-143S、CH1-188W、CH1-122C、CH1-230S、CL-133M、CL-178G、CL-176G、CL-123C、CL-214S；(xxvii)CH1-143S、CH1-188W、CH1-122C、CH1-139C、CH1-174C、CH1-230S、CL-133S、CL-178S、CL-131D、CL-116C、CL-123C、CL-176C、CL-214S。
  17. 如請求項16之雜二聚體蛋白質，其中該第二CHCL包含群(i)-(xxvii)之一的殘基，限制條件為該第一及第二CHCL兩者不包含同一群之殘基。
  18. 如請求項1之雜二聚體蛋白質，其中該第一CH1連接於第一CH2結構域(CH2)，該第一CH2結構域連接於第一CH3結構域(CH3)，且該第二CH1連接於第二CH2，該第二CH2連接於第二CH3，使得該第一CH3及第二CH3分別包含第一CH3突變殘基及第二CH3突變殘基，該第一CH3突變殘基及第二CH3突變殘基經工程改造以彼此不同且彼此優先相互作用，且從而形成CH3雜二聚體優先於形成CH3均二聚體。
  19. 一種雙特異性抗體，其包含如請求項1至18中任一項之雜二聚體蛋白質，其中該第一CHCL包含CH1-124K、CL-176D、CH1-190S及CL-133S，且該第二CHCL包含CH1-124E、CL-176K、CH1-188G及CL-133S。
  20. 一種核酸，其編碼如請求項1至18中任一項之雜二聚體蛋白質。
  21. 一種載體，其包含如請求項20之核酸。
  22. 一種細胞，其包含如請求項20之核酸，或包含如請求項21之載體。
  23. 一種製備如請求項1至18中任一項之雜二聚體蛋白質的方法，其包含：(i)將細胞株與一或多種載體共轉染以表現第一CHCL之第一CH1、第一CL以及第二CHCL之第二CH1及第二CL；(ii)該細胞株在表現該一或多種載體且允許該第一CHCL及該第二CHCL組裝的條件下培養；及(iii)自該細胞培養物純化該雜二聚體蛋白質。
  24. 如請求項23之方法，其中該細胞株與以1：1：1：1比率表現該第一CH1、第一CL、第二CH1及第二CL之載體共轉染。
  25. 一種分離之抗體，其特異性結合人類TrkB，其中該抗體包含含有SEQ ID NO：51之胺基酸的VH區及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的VH區。
  26. 如請求項25之分離之抗體，其中該重鏈包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項25之分離之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  28. 一種分離之核酸，其編碼如請求項25之分離之抗體。
  29. 一種如請求項27之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療聽覺喪失病症之藥劑。
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