TW201609792A

TW201609792A - 治療ｃｍｖ之手段及方法

Info

Publication number: TW201609792A
Application number: TW104114853A
Authority: TW
Inventors: 沙賓威爾尼茲; 寇琳約翰; 克里斯丁薛布
Original assignee: 輝瑞大藥廠
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2016-03-16
Also published as: WO2015170287A1; JP2017515503A; EP3139953A1; PE20170301A1; KR20170002560A; BR112016025792A2; CA2947938A1; US20150322115A1; IL248803A0; MX2016014660A; PH12016502220A1; RU2016147987A; SG11201608977UA; AU2015257330A1; CN106460010A

Abstract

本發明係關於產生重組蛋白質及製備疫苗之領域。具體而言，本發明提供用於產生CMV之五聚體gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合物之手段及方法。更特定而言，本發明提供在桿狀病毒系統中產生之CMV之五聚體gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合物，該複合物可用作對抗CMV之疫苗。

Description

治療CMV之手段及方法

巨細胞病毒係稱為皰疹病毒科或皰疹病毒之病毒家族之病毒屬。其通常縮寫為CMV。感染人類之物種通常稱為人類CMV(HCMV)或人類皰疹病毒-5(HHV-5)，且係所有巨細胞病毒中研究最多者。已經達到約60%之成年群體且在一些國家中100%地方性感染。感染在有免疫活性之個體中通常係無症狀的，而有時可出現單核白血球增多症樣疾病。感染導致終生潛伏之建立，此偶爾可因再活化而中斷。然而，對於免疫缺陷個體(例如癌症或移植患者、嬰兒或HIV患者)而言，CMV感染可係嚴重威脅，甚至導致死亡。CMV可由於病毒基因體編碼多種干擾病毒抗原之MHC I類呈遞之蛋白質而留在宿主中。一種病毒蛋白阻斷肽易位進入至內質網之內腔中，而兩種其他病毒蛋白使得MHC I類蛋白質在到達細胞表面之前降解。

目前治療施加抗病毒劑，例如更昔洛韋(ganciclovir)、膦甲酸鈉(foscarnet)、阿昔洛韋(acyclovir)、西多福韋(cidofovir)或來氟米特(leflunomide)。儘管該等試劑可適於移植患者及免疫受損患者，但其不能用於孕婦。對於該等孕婦而言，高免疫球蛋白療法係較佳的。儘管先前技術中已作出各種努力以找出疫苗(例如減毒活疫苗、亞單位蛋白質疫苗、亞單位病毒載體編碼之疫苗)，迄今尚無疫苗可利用。

巨細胞病毒(CMV)係導致人類疾病之最大且最複雜之已知病毒。235-kb基因體編碼至少165種蛋白質，但CMV疫苗研究一直專注於在自然感染期間主導細胞或體液免疫反應之有限數量之病毒蛋白。pp65蛋白質係細胞毒性T-細胞反應之主要靶。pp65位於衣殼及病毒套膜之間之被蓋內，pp65係CMV病毒體中之最豐富蛋白質。IE1蛋白質亦係重要細胞毒性T-細胞靶，其不存在於病毒體中，而是在感染後豐富地表現於細胞中。在病毒體表面上且包埋於套膜中者係調介宿主細胞進入之若干糖蛋白複合物。據信包含糖蛋白M及糖蛋白N之異二聚體藉由結合至肝素引發宿主細胞相互作用。包含糖蛋白H及糖蛋白L(gH/gL)之第二異二聚體可調介受體相互作用，該等相互作用以觸發糖蛋白B(gB)中之構象改變而終結，該等構象改變驅動病毒套膜與靶細胞膜之融合。包含gH、gL、UL128、UL130、UL131A之CMV五聚體複合物調介進入上皮及內皮細胞中。所有該等複合物均係體液性免疫之重要靶，此乃因其含有結合稱為中和抗體之選擇類別抗體之表位。開發疫苗之總體目標係誘導對抗CMV之上皮細胞/內皮細胞細胞感染及纖維母細胞感染二者中和活性。

有各種疫苗途徑正在研究，包括簡單肽或亞單位；重組多亞單位複合物，例如gH/gL或完整五聚體複合物；天然五聚體複合物、gB、pp65及其他病毒抗原之不活化CMV病毒體；表現天然五聚體複合物之遺傳失能CMV，其潛在地組合活疫苗之免疫原性與非活性疫苗之安全性；表現亞單位或多亞單位複合物之複製缺陷型病毒載體(例如，pox、腺病毒、α病毒及其他病毒)；及以上初免/加強組合。

有吸引力之疫苗候選者係調介進入上皮及內皮細胞中之CMV之五聚體複合物。然而，其構象及/或多亞單位依賴性表位主導五聚體複合物之「中和表位」之程度尚不清楚。使完整五聚體複合物呈現其構象天然狀態之可能的必要性係由自自然感染之個體分離之單株抗體的研究來暗示：17種五聚體複合物特異性中和抗體，除1個以外所有均識別多亞單位依賴性表位。

儘管在先前技術中進行許多嘗試以提供CMV、尤其HCMV之五聚體複合物，但據本發明者所知，迄今尚未提供呈穩定形式且足夠量、但同樣理想地具有高純度之五聚體複合物。然而，關於疫苗之規定，需要具有免疫原性之足夠量高純度之穩定五聚體複合物以誘導免疫反應。因此，本發明之技術問題係滿足此需要。

本發明藉由提供產生CMV之五聚體複合物之新穎手段及方法來解決此問題。此尤其係基於五聚體複合物可在適宜宿主細胞(包括昆蟲細胞)中使用桿狀病毒載體以高產量穩定地表現之驚人的發現。此外，本發明者意外地發現藉由本發明方法獲得之五聚體複合物尤其有用的用作醫藥及/或疫苗組合物。此明顯係意料之外的，此乃因在昆蟲細胞中產生之重組蛋白質關於其糖基化模式(調節免疫反應之重要參數)不同於其「天然」對應體。此外，本發明者第一次成功提供在表現系統、具體地在桿狀病毒系統中產生之CMV之穩定五聚體複合物，此允許大規模生產高純度且免疫原性五聚體複合物。

本發明者已率先建立能夠以穩定形式且以高產量及純度產生CMV之五聚體複合物之新手段及方法。第一次，本發明者大量使用桿狀病毒載體表現CMV之五聚體複合物之蛋白質組份且觀察到功能性五聚體複合物之組裝。

因此，在第一態樣中，本發明係關於由CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)組成之五聚體複合物，其可藉由包含以下之方法獲得：(i)藉由使用桿狀病毒在宿主細胞中共同表現UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)；(ii)自該宿主細胞及/或上清液中純化該共同表現獲得之五聚體複合物；及 (iii)視情況在包含螯合劑及/或穩定劑之緩衝劑溶液中儲存該經純化五聚體複合物。

宿主細胞可為昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

本發明之較佳生產細胞系係昆蟲細胞系，例如Sf9、Sf21、Super Sf9-1(VE-1)、Super Sf9-2(VE-2)、Super Sf9-3(VE-3)、Hi-5、Mimic Sf9、Vankyrin、Express Sf+及S2 Schneider細胞，其中Super Sf9-2較佳[Oxford Expression Technologies,Cat.編號600103及Fath-Goodin等人(2006),Adv.Virus Res.68,75-90；Kroemer等人，(2006),J.Virol.80(24),12291-12228及US20060134743。Super Sf-9細胞經工程化以穩定表現齒唇姬蜂病毒(Camoletis sonorensis ichnovirus)P-vank-1蛋白質。為在哺乳動物細胞、尤其人類細胞中表現，使用例如HEK293、HEK293F、CHO、HeLa、HUVEC、HUAEC、Huh7、HepG2、BHK、MT-2、Cos-7、Cos-1、C127、3T3、人類包皮纖維母細胞(HFF)、骨髓纖維母細胞、Bowes黑色素瘤、初代神經細胞或上皮細胞。

共同表現步驟可包括以下：用表現該等蛋白質且具有約10⁷pfu/mL或更高之效價之桿狀病毒感染宿主細胞，在感染時該宿主細胞具有約2*10⁶個細胞/mL之感染時細胞計數；在適宜條件下培養該等宿主細胞，及在感染後56h至65h之間收穫該等宿主細胞及/或上清液。

宿主細胞、尤其昆蟲細胞可在解凍及培養後第15天與第50天之間、較佳在第15天與第30天之間、較佳在第18天感染。

純化可包括離子交換層析、疏水相互作用層析、粒徑篩析層析及/或親和層析。

螯合劑可為EDTA或EGTA。較佳地，EDTA係以20mM或以下、例如3mM或以下之濃度存在於該緩衝溶液中。

穩定劑可為聚乙二醇、精胺酸、甘胺酸、山梨醇、海藻糖、甘油、蔗糖、葡萄糖、DMSO、TMAO及/或NP-40。

此外，緩衝溶液可包含Tris緩衝液、NaCl、MgCl₂及/或KCl。

編碼CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH及gL之開放閱讀框(ORF)可位於一或多個載體上、較佳位於單一載體上。

載體可含有用於在細菌(大腸桿菌(E.coli))、酵母(啤酒酵母(S.cerevisiae))、昆蟲細胞及/或哺乳動物細胞中繁殖之元件。

ORF可依5’至3’之以下順序位於該載體中：(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131；或(ii)gL、UL128、UL130、UL131、gH。

較佳地，(a)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131A ORF係在3’方向上轉錄；(b)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在3’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131A ORF係在3’方向上轉錄；(c)在(ii)中，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，UL131A ORF係在3’方向上轉錄，且gH ORF係在3’方向上轉錄。

該等ORF中之每一者可由p10啟動子、polh啟動子、IE-1啟動子、mCMV啟動子、vp39啟動子、lef2啟動子、CAG啟動子、HepB SV40啟動子或本文所述之任何其他啟動子啟動且隨後係終止子序列(例如HSVtk終止子或SV40終止子或本文所述之任何其他終止子)。

該等蛋白質中之至少一者可包含標籤，其可為His標籤、Strep標籤、His-Strep標籤、StrepII標籤、Softag 1、TC標籤、myc標籤、FLAG標籤、HA標籤、V5標籤、Avi標籤、攜鈣蛋白(Calmodulin)標籤、聚麩胺酸鹽標籤、類澱粉蛋白β標籤、GST標籤、MBP標籤或S標籤。較佳地，gH蛋白質配備有His標籤，較佳包含8個His殘基。

該等蛋白質中之一或多者可包含PreScission蛋白酶或PreScission及TEV蛋白酶，較佳gH及/或gL蛋白質包含PreScission蛋白酶或PreScission及TEV蛋白酶。

桿狀病毒基因v-cath及/或ChiA活性可經功能性破壞。

本發明之五聚體複合物亦可呈組合物之形式。

本發明之五聚體複合物亦可能夠誘導抑制上皮細胞/內皮細胞(Epi/EC)及纖維母細胞二者感染之中和活性。

在第二態樣中，本發明亦提供生產由CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)組成之五聚體複合物之方法，其包含(i)在宿主細胞中共同表現桿狀病毒CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)；(ii)自該宿主細胞及/或上清液中純化該共同表現獲得之五聚體複合物；及(iii)視情況在包含螯合劑及/或穩定劑之緩衝劑溶液中儲存該經純化五聚體複合物。

在第三態樣中，提供包含本發明或可藉由本發明方法獲得之五聚體複合物及視情況選用之醫藥上可接受之載劑或佐劑之醫藥組合物或疫苗組合物。

在第四態樣中，在本發明之五聚體複合物中，該等蛋白質中之至少一者、二者、三者或四者所來源之CMV株不同於其餘蛋白質所來源之CMV株。

CMV蛋白質可源自CMV株Towne(Towne具有以登錄號FJ616285.1寄存於NCBI基因庫之基因體)、Toledo(GU937742.1)、AD169(FJ527563)、Merlin(AY446894.2)、TB20/E(KF297339.1)、VR1814(GU179289)。根據Patrone等人，J.Virol.,2005,79,8361-8373，位置204處之aa Y由aa F交換，表現UL130之主要問題係在同一位置處之框移，導致胺基酸擴展至下一個ORF。在第五態樣中，本發明提供經修飾CMV Towne株，其具有以登錄號FJ616285.1寄存於NCBI基因庫之基因體且在UL130 ORF之胺基酸序列的位置204處具有胺基酸F以及修復在實驗室菌株Towne(在人類包皮纖維母細胞上生長)之相同位置處之框移而獲得功能胺基酸Y。

＊＊＊＊＊

必須注意，如本文所用，除非明確指示相反情形，否則單數形式「一(a,an)」及「該(the)」包括複數個參照物。因此，例如，對「一試劑」之提及包括一或多種該等不同試劑且對「該方法」之提及包括提及熟悉此項技術者已知之可經修改或取代本文所述方法之等效步驟及方法。

除非另外指示，否則在一系列要素之前之術語「至少」應理解為係指該系列中之每一要素。熟悉此項技術者僅使用常規實驗即可識別或能夠確定本文所述本發明之特定實施例的許多等效形式。此等等效形式均意欲由本發明涵蓋。

術語「及/或」無論在本文中何處使用均包括「及」、「或」及「所有或任何其他由該術語連接之要素組合」之含義。

本文所用之術語「約」或「大約」意指在既定值或範圍之20%內、較佳在10%內且更佳在5%內。然而，其亦包括名數，例如約20包括20。

術語「小於」或「大於」包括名數。舉例而言，小於20意指小於或等於。類似地，多於或大於分別意指多於或等於、或大於或等於。

在整個本說明書及下文之申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprise)」及變化形式(例如，「comprises」及「comprising」)應理解為暗含包括所述整數或步驟或整數或步驟之群組，但並不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群組。當在本文中使用時，術語「包含」可由術語「含義」或「包括」或有時當在本文中使用時由術語「具有」取代。

當在本文中使用時，「由...組成」排除在申請專利範圍要素中未指定之任何元件、步驟或成份。當在本文中使用時，「基本上由...組成」並不排除不會實質上影響申請專利範圍之基本及新穎特性之材料或步驟。

在本文之每一情形中，術語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」中之任一者皆可由其他兩種術語取代。

應瞭解，本發明並不限於本文所述之具體方法、方案、材料、試劑及物質等且因此可有所變化。本文所用術語僅用於闡述具體實施例之目的而並非意欲限制本發明之範圍，該範圍僅由申請專利範圍定義。

整個說明書中所引用之出版物及專利(包括所有專利、專利申請案、科技出版物、製造商說明書、說明等)(無論在上文或下文)均以其整體引用的方式併入本文中。本文中任何內容均不應解釋為承認本發明無權先於根據先前發明之此類揭示內容。就以引用方式併入之材料與本說明書相矛盾或不一致而言，說明書將取代任何此類材料。

圖1 ：用於表現CMV-五聚體複合物及可溶性CMV蛋白質之重組載體之示意圖示。

將不同變體插入至載體主鏈pRBT136中，旨在使用桿狀病毒表現系統(BEVS)且含有兩個啟動子P1及P2(_p10、_polh)及兩個終止子序列T1及T2(T)(其係SV40及HSVtk)進行重組蛋白表現。為在酵母中繁殖，載體含有複製起點(O)(例如2micron)及標記基因(m)(例如URA3)。此外，載體含有用於使轉基因自轉移載體移位至桿粒(bacmid)(即，用於位點特異性同源重組(質體融合)之loxP位點(L)、複製起點(O)、胺苄青黴素(ampicillin)(A)、氯黴素(chloramphenicol)(C)及僅大黴素(gentamycin)(G)抗性基因)之左側轉位子位點(TL)及右側(TR)及經定義限制位點。為藉由利用桿狀病毒轉導或瞬時表現在哺乳動物細胞中表現，載體主鏈pRBT 393另外含有選自pCMV、ie1及lef2之啟動子及選自SV40pA,BHG pA及HSVtk之終止子。

縮寫：c：共有序列；H：His標籤；SH：鏈黴抗生物素蛋白-His標籤；V：菌株VR1814，pcI：precission蛋白酶，pcII：precission及TEV蛋白酶，DT：二聚工具，T：終止子，O：複製起點，G：僅大黴素抗性，C：氯黴素抗性，L：loxP位點，TL：左側轉位子，TR：右側轉位子。

圖2 ：由His標記之可溶性CMV-五聚體複合物之親和層析步驟、隨後粒徑篩析層析組成之純化製程之分析.

包含表面蛋白質UL75(His標記之gH)-UL115(gL)-UL128-UL130-UL131A(SEQ ID NO：18)之五聚體複合物係藉由使用His-捕獲柱之基於親和之層析(IMAC)、隨後粒徑篩析層析(XK16/60 Superdex200pg)來純化。

(A)第2次IMAC純化係藉由SDS-PAGE(4-12% Bis-Tris凝膠)、隨後考馬斯染色分析。蛋白質標準物(泳道1)之大小(kDa)標注於左側。泳道2：第1次IMAC之彙集物(第2次IMAC製程之負載)，泳道3：流出物，泳道4：洗滌物，泳道5-14代表隨咪唑濃度增加至高達500mM之溶析份。

(B)藉由SDS-PAGE(4-12% Bis-Tris凝膠)之粒徑篩析層析純化、隨後考馬斯染色之分析。蛋白質標準物(泳道1)之大小(kDa)標注於左側。泳道1：溶析彙集物IV-2，沈澱；泳道2：溶析彙集物IV-2，未沈澱；泳道3：溶析彙集物IV-3；泳道4：溶析彙集物V；泳道5：溶析彙集物VI；泳道6：大小標記物。箭頭所指示者係五聚體複合物蛋白質 (gH、gL、UL128、UL130、UL131A)。

(C)使用針對gH之His標籤之抗體的免疫印跡。泳道1代表溶析彙集物IV-2(糰粒)；泳道2：溶析彙集物IV-2(未沈澱)；泳道3：溶析彙集物IV-3；泳道4：溶析彙集物V；泳道5：溶析彙集物VI；泳道6：陽性對照。His標記之gH蛋白質標注於右側。

(D)經純化、可溶性人類CMV(HCMV)五聚體複合物(SEQ ID NO：18)之考馬斯染色之SDS-PAGE(4-12% Bis-Tris凝膠)(泳道6)。為藉由密度分析測定蛋白質濃度，加載不同量之BSA(泳道2：0.1mg/mL；泳道3：0.2mg/mL；泳道4：0.3mg/mL；泳道5：0.5mg/mL)。蛋白質標準物(泳道1)之大小(kDa)標注於左側。

(E)包含表面蛋白質UL75(His標記之gH)-UL115(gL)-UL128-UL130-UL131A之五聚體複合物(SEQ ID NO：18)係藉由一步基於親和之層析(IMAC)使用Ni2+帶電荷管柱(規模取決於總體大小)純化，隨後在PALL macrosep離心裝置上濃縮並針對含有(25mM Tris、150mM NaCl、3mM KCL，pH 6.5，0.2% Brij-35)之儲存緩衝液透析。經純化、可溶性複合物係藉由SDS-PAGE(4-12% Bis-Tris凝膠)分析，隨後考馬斯染色並與不同量之BSA一起進行密度分析(泳道2：0.1mg/mL；泳道3：0.2mg/mL；泳道4：0.3mg/mL；泳道5：0.5mg/mL；泳道6：純化之五聚體複合物)。蛋白質標準物(泳道1)之大小(kDa)標注於左側。

圖3 ：中和分析以驗證基於SEQ ID NO：18之體液性免疫反應

人類CMV血液供體及小鼠血清之中和抗體效價之比較。使存於2倍連續稀釋液(1：20至1：2560)之來自五個陽性(群組G2,D6-D10)及五個陰性(群組G1，D1-D5)HCMV血液供體之血清經受基於細胞之螢光中和分析。顯示給出與自預先經五聚體複合物(SEQ ID NO：18)免疫之八隻小鼠獲得之彙集血清的1：320稀釋液相同之抑制效應的血清稀釋液 (s.d.)。作為用於小鼠免疫之抗原混合物之一種組份的可溶性五聚體複合物的單獨分析顯示與人類血液供體相比中和抗體之誘導。

PR：五聚體免疫前，PO：五聚體免疫後，G1：陰性血液供體，G2：陽性血液供體。

圖4 ：可溶性複合物SEQ ID NO：18作為疫苗候選者之品質控制.

顯示經受基於IMAC之純化後用不同量之咪唑溶析之部分。針對UL75(gH)及gH上之His標籤之存在對該等進行測試。信號強度之相似性指明gH且因此由UL75-UL115-UL128-UL30-UL131A組成之整個複合物之完整性。

1：負載，2：流出物，3：洗滌液，4：250mM咪唑，5-8：300mM咪唑，9-13：350mM咪唑，14：陽性對照，15：陰性對照

圖5 ：可溶性複合物SEQ ID NO：18作為疫苗候選者使用構象依賴性抗體之品質控制.

利用夾心ELISA分析測試不同生產批次之複合物的所指定蛋白質的共同存在。將試樣用抗gH1(UL75)抗體捕獲並利用抗gH2及抗His以及抗UL130/131A及抗UL130構象依賴性(UL130/UL131A)抗體檢測。信號證實在複合物中蛋白質之共存在、複合物之完整性以及其生產再現性。

1：批次451-彙集物1，2：批次459-彙集物2，3：批次459-彙集物1(15mM EDTA)，4：批次459-彙集物1(20mM EDTA)，5：批次458(15mM EDTA)，6：陽性對照，7：陰性對照，8：內部標準物

圖6 ：CMV gH、gL、UL128、UL130及UL131A蛋白質之參考胺基酸序列.

gH(SEQ ID NO：1)，gL(SEQ ID NO：2)，UL128(SEQ ID NO：3)，UL130(SEQ ID NO：4)，UL131A(SEQ ID NO：5)

圖7 ：細胞免疫反應基於SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：67之定性概述

(A)細胞介素分泌之比較顯示Th-1及Th-2反應依賴於用於小鼠免疫之抗原。(B、C、D)脾細胞經AD169病毒溶解產物重新刺激，而細胞介素分泌係根據製造商方案藉由多工分析來驗證。佐劑導致IL-4分泌增加，而其對IFN-γ或IL-5之分泌無刺激效應。細胞介素分泌係劑量依賴於五聚體複合物；較低劑量係有益的。

P1：五聚體複合物(Towne株)；P2：五聚體複合物(Towne及VR1814株)；adj：佐劑；VLP：病毒樣粒子；gB：可溶性糖蛋白gB(UL55)；BV：桿狀病毒

圖8：中和分析以驗證基於SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：67之體液性免疫反應

人類CMV血液供體及小鼠血清之中和抗體效價之比較。使存於2倍連續稀釋液(1：20至1：2560)之來自五個陽性(血清陽性)及五個陰性(血清陰性)HCMV血液供體之血清經受基於細胞之螢光中和分析。顯示給出與自預先經五聚體複合物(SEQ ID NO：18,SEQ ID NO：67)與VLP、gB及佐劑之組合免疫之八隻小鼠中之四隻獲得之彙集血清的1：100稀釋液相同之抑制效應的血清稀釋液(s.d.)。作為用於小鼠免疫之抗原混合物之一種組份的可溶性五聚體複合物的單獨分析顯示與血清陽性及血清陰性人類血液供體相比中和抗體之誘導。

利用兩種不同病毒株VR1814及TB40E株研究纖維母細胞(MRC-5)及上皮細胞(ARPE-19)之中和。

P1：五聚體複合物(Towne株)；P2：五聚體複合物(Towne及VR1814株)；adj：佐劑；VLP：病毒樣粒子；gB：可溶性糖蛋白gB(UL55)；BV：桿狀病毒；preimmune：免疫前；immune：免疫後

圖9：由His標記之可溶性CMV-五聚體複合物之親和層析步驟及離子交換層析組成之純化製程的分析

使用可溶性人類CMV(HCMV)五聚體複合物(批次E0713，泳道6 及批次E0714，泳道7)之考馬斯藍(SimplyBlue,Invitrogen)染色之SDS-PAGE(NuPAGE Invitrogen)用於純度及濃度之密度分析(ImageJ軟體)。圖1中所觀察到之三個條帶代表gH-His以及共遷移gL/UL130及UL128/UL131A蛋白質(所有均藉由質譜在先前批次中鑑別出)。將三個條帶之總和與BSA標準物相比較(密度分析；ImageJ軟體)。為藉由密度分析測定蛋白質濃度，加載不同量之BSA(泳道2：0.2mg/mL；泳道3：0.4mg/mL；泳道4：0.6mg/mL)。分別針對E0713及E0714量測最終試樣上之HCMV五聚體複合物濃度(泳道6及7)。*MM：Precision Plus Protein ^TM所有藍色標準物(Bio-Rad,#161-0373，泳道1)。

圖10：基於SEQ ID NO：18之五聚體複合物的純化表徵.

在DSP製程(IMAC-AEX-IMAC)結束時經由直接ELISA證實產物身份。複合物係利用α-gH-抗體(Santa Cruz,sc-58113)及α-His-抗體(AbD Serotec,MCA1396)證實且利用α-小鼠-HRP抗體(Cell Signaling,7076S)檢測。信號證實gH與標籤共存在且因此表明可溶性HCMV五聚體複合物之完整性。陰性對照(neg.ctrl.)反映桿狀病毒試樣缺少所關注基因。

圖11：穩定劑關於基於SEQ ID NO：18之五聚體複合物之產量的影響.

驗證關於緩衝液、pH及穩定劑(例如EDTA)之五聚體複合物穩定性。在基於先前利用各種緩衝液純化透析之後，實施thermofluor位移分析以驗證穩定劑與不同緩衝液及pH之組合的影響。為藉由密度分析測定法蛋白質濃度，加載不同量之BSA(泳道1：0.2mg/mL；泳道2：0.4mg/mL；泳道3：0.6mg/mL)。顯示利用不同緩衝液透析後之上清液及糰粒中之HCMV五聚體複合物。泳道5：PBS,20mM EDTA,pH 6.0(上清液)；泳道6：PBS,20mM EDTA,pH 6.0(糰粒)；泳道7：Tris,20mM EDTA,pH 7.4(上清液)；泳道8：Tris,20mM EDTA,pH 7.4(糰粒)；泳道9：Tris,20mM EDTA,pH 6.0(上清液)；泳道10：Tris,20mM EDTA,pH 6.0(糰粒)；*MM：Precision Plus蛋白質^TM所有藍色標準物(Bio-Rad,#161-0373，泳道4)。

(B、C)透析期間各種量之EDTA的驗證。10mM EDTA之使用清晰地顯示大約一半之產物因沈澱(糰粒)而損失，增加EDTA之量使複合物穩定。(B)五聚體複合物以及少量EDTA，泳道2：Tris,10mM EDTA,pH 7.4(上清液)；泳道3：Tris,10mM EDTA,pH 7.4(糰粒)；(C)為藉由密度分析測定法蛋白質濃度，加載不同量之BSA(泳道1：0.2mg/mL；泳道2：0.4mg/mL；泳道3：0.6mg/mL)。顯示利用不同緩衝液透析後之上清液及糰粒中之HCMV五聚體複合物。泳道5：Tris,20mM EDTA,pH 7.4(上清液)；泳道6：Tris,20mM EDTA,pH 7.4(糰粒)；泳道7：Tris,15mM EDTA,pH 7.4(上清液)；泳道8：Tris,15mM EDTA,pH 7.4(糰粒)；泳道9：Tris,25mM EDTA,pH 6.0(糰粒)；泳道10：Tris,25mM EDTA,pH 6.0(上清液)；*MM：Precision Plus蛋白質^TM所有藍色標準物(Bio-Rad,#161-0373，泳道4)。對於第1透析步驟而言，具有最小沈澱效應之緩衝液看起來係Tris,20mM EDTA,pH 7.4。

圖12：活體內研究之排程

實施進一步活體內研究以驗證劑量效應、五聚體複合物變體及在有或沒有佐劑之情況下與各種CMV蛋白質之組合。

業內持續需要鑑別引發對CMV之保護性、中和免疫反應之強效CMV抗原、及開發達成高保護位準之CMV疫苗。CMV之五聚體gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合物係開發新穎CMV疫苗之有前途工具。然而，五聚體複合物之大規模生產受無效率蛋白質表現系統之阻礙。本發明者首次使用桿狀病毒系統來共同表現蛋白質組份，且經報告組裝成可引發免疫原性反應活體內之功能五聚體複合物。

因此，在第一態樣中，本發明提供由CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)組成之五聚體複合物，其可藉由包含以下之方法獲得：(i)在宿主細胞中藉由使用桿狀病毒共同表現CMV蛋白質UL128、UL130、UL131a、gH(UL75)及gL(UL115)；(ii)自該宿主細胞及/或上清液中純化該共同表現獲得之五聚體複合物；及(iii)視情況在包含螯合劑及/或穩定劑之緩衝劑溶液中儲存該經純化五聚體複合物。

術語「CMV」係指巨細胞病毒，一種皰疹病毒科或皰疹病毒之病毒屬。一般而言，該術語涵蓋CMV之所有物種，尤其包括人類巨細胞病毒(HCMV)(亦稱為人類皰疹病毒5(HHV-5))、黑猩猩巨細胞病毒(CCMV)、猿猴巨細胞病毒(SCCMV)及恒河猴巨細胞病毒(RhCMV)。較佳地，本發明之CMV係HCMV。大量HCMV株係已知的，包括(但不限於)TR、Towne、AD 169、Toledo、Merlin、TB40、Davis等。

通常，CMV包含至少5種殼蛋白(UL46、UL48A、UL85、UL86、UL104之基因產物)、19種調節蛋白、17種被蓋蛋白(UL25、UL45、UL47、UL48、UL69、UL71、UL72、UL76、UL77、UL83[pp65]、UL88、UL93、UL94、UL95、UL97、UL99、UL103之基因產物)、5種表面或套膜蛋白(UL55[gB]、UL73[gN]、U74[gO]、UL75[gH]、UL100[gM]、UL115[gL]之基因產物)、開放閱讀框UL128、UL130、UL131A之未分類基因產物；15種β-皰疹病毒特異性基因之蛋白質(UL23、UL24、UL32、UL33、UL35、UL36、UL38、UL43、UL74[gO]、UL78、UL82、UL96、IRS1、US22、TRS1)及開放閱讀框 (ORF)UL50、UL80.5之所謂的功能蛋白質。

術語「五聚體複合物」或在本文中亦使用之其簡寫形式「複合物」係指包含五種CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)之蛋白質複合物，認為其促進病毒進入靶細胞、尤其內皮、上皮及纖維母細胞。五聚體複合物及其蛋白質-蛋白質相互作用之模型已由Ryckmann BJ等人，J Virol.2008；82(1)：60-70提出。在本發明之五聚體複合物中，認為gH、gL及pUL128通常藉助二硫鍵鏈接，且UL130及UL131A通常藉由非共價相互作用併入至五聚體複合物(及/或相互鏈接)。五聚體複合物之化學計量假定為1：1：1：1：1(Ryckmann BJ等人，J Virol.2008；82(1)：60-70)。較佳係本發明之五聚體複合物能夠在活體內引發與CMV病毒體產生免疫交叉反應之抗體。五聚體複合物較佳係可溶性。然而，其亦可呈膜結合形式，儘管其較不佳。溶解性較佳藉由刪除gH之跨膜結構域來達成。當在本發明之五聚體複合物之情形中使用術語「由...組成」時，意指該五聚體複合物涵蓋/包含本文所述之五種蛋白質gH、gL、UL128、UL130及UL131A，且另外可涵蓋其他CMV蛋白質。然而，較佳地，該五聚體複合物僅含有五種CMV蛋白質gH、gL、UL128、UL130及UL131A。本發明之五聚體複合物可呈組合物之形式。因此，可將一或多種額外試劑添加或混合至五聚體複合物中，由此獲得組合物。該等額外試劑闡述於本文中，例如緩衝液、螯合劑及/或穩定劑。適宜組合物進一步如本文所述。

在本發明之五聚體複合物中，一或多種蛋白質可包含額外B-及/或T-細胞表位。該T-細胞表位可為CD4T-細胞表位或CD8T-細胞表位。較佳地，該表位係SEQ ID NO：22-66中所述表位中之任一者。

「表位」係由免疫系統(例如B細胞或T細胞)識別之抗原之一部分。該術語涵蓋構象及線性(或連續)表位二者。構象表位包含抗原之胺基酸序列的不連續部分，而線性表位由抗原之胺基酸序列的連續部分組成。該術語進一步包括隱性表位(cryptotope)及新表位(neotope)。「隱性表位」係隱藏在天然抗原(例如病毒)中、但當抗原不以其天然構象存在時可變得可及之表位。「新表位」係僅在蛋白質之四級結構中發現但在蛋白質單體中未發現之表位。

設想額外表位可融合至五聚體複合物之一或多種蛋白質組份之胺基酸序列。胺基酸序列至本發明複合物之期望蛋白質組份之融合可藉由熟悉此項技術者熟知之標準遺傳工程方法來達成。

根據本發明，表位可為B-細胞及/或T-細胞表位。

B細胞表位係由特定膜結合B-細胞受體(BCR)或抗體識別之抗原(例如，天然蛋白質)之區域。許多方法可容易地用於鑑別或選擇B-細胞表位，包括x射線晶體學、基於陣列之寡肽掃描、定點誘變、誘變映射、及噬菌體展示、以及計算方法，如由Sun等人，Comput Math Methods Med.2013；2013：943636所論述。舉例而言，適宜方法包括基於結構之預測模型，其依賴於抗原之3D結構及表位相關之傾向量表，包括幾何屬性及特異性物理化學性質。基於結構之演算法及web伺服器(程式)包括(例如)EPSVR & EPMeta(http：//sysbio.unl.edu/services/)、EPCES(http：//sysbio.unl.edu/services/EPCES/)及Epitopia(http：//epitopia.tau.ac.il/)。基於模擬表位之預測方法係需要抗體親和性選擇之肽及抗原之3D結構二者作為輸入之組合方法。基於模擬表位之預測模型之實例性演算法及程式包括(例如)MimoPro(http：//informatics.nenu.edu.cn/MimoPro)、PepSurf(http：//pepitope.tau.ac.il及EpiSearch(http：//curie.utmb.edu/episearch.html)。此外，基於序列之預測模型係可用的，其僅依賴於抗原之一級序列，例如BEST及Zhang之方法，如在Sun等人Comput Math Methods Med.2013；2013：943636中所論述。另外，可使用結合位點預測模型，其推斷出著重於蛋白質-蛋白質相互作用、抗原及抗體之相互作用之結合位點預測的方法(例如ProMate、ConSurf、PINUP及PIER)。

不希望受限於特定理論，設想在本發明之複合物中存在之一或多個B-細胞表位較佳對B-細胞具有免疫刺激效應，例如其導致B細胞之活化及/或分化且引發免疫原性反應，此可(例如)導致產生中和抗體。B細胞可利用不同方法根據此項技術中已知之標準方案測試以測定表位之免疫刺激潛力。適宜分析為淋巴細胞增殖分析、特異性T細胞上所誘導之活化標記物之檢測、ELIspot、胞質內細胞介素染色(ICS)及細胞介素分泌。

T細胞表位通常衍生自經加工蛋白質抗原。在本發明之上下文中，T細胞表位可為CD4-T細胞表位或CD8 T-細胞表位。儘管細胞毒性(CD8)T細胞識別由MHC I類分子(CD8 T-細胞表位)所展示之細胞內肽，T輔助細胞識別自細胞外空間獲得且由MHC II類分子(CD4 T-細胞表位)展示之肽。肽：MHC複合物(pMHC)與T-細胞受體相互作用，此導致活化且隨後誘導細胞免疫反應。

許多T細胞表位預測及/或選擇之in silico方法係可用的。關於CD8+ T細胞表位預測，可使用NetCTL-1.2(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、EpiJen(http：//www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm)或MAPPP(http：//www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/)，如Larsen等人BMC Bioinformatics 2007,8：424中所論述。關於CD4+ T細胞，表位預測之計算模型已由Oyarzún P等人BMC Bioinformatics 2013,14：52論述且包括依賴於肽序列比較以鑑別結合基序之數據驅動方法(例如Rankpep(http：//imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)、TEPITOPE及NN-比對 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NNAlign/))以及實施分子建模計算以估計結合能量、由此獨立於試驗結合數據提供之基於結構之方法(例如NetMHCIIPan-2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-2.0/)、TEPITOPEpan(http：//www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/TEPITOPEpan/)及Predivac(http：//predivac.biosci.uq.edu.au/)。

不希望受限於特定理論，設想本發明之複合物中一或多種T-細胞表位之存在較佳對T細胞具有免疫刺激效應，例如其導致T細胞之活化及/或分化且較佳引發免疫原性反應。測定T細胞上表位之免疫刺激潛力的適宜方法包括MHC肽多聚體分析、固相MHC-肽複合物分析、淋巴細胞增殖分析、特異性T細胞上誘導之活化標記物的檢測、ELIspot、胞質內細胞介素染色(ICS)、細胞介素分泌及細胞表面捕獲(CSC)、及細胞介素分泌及孔表面捕獲(Cell-ELISA)，如在Li Pira G等人J Biomed Biotechnol.2010；2010：325720中所論述。

在本文所述五聚體複合物之替代中，亦設想藉由本發明之途徑及方法產生之其他CMV複合物且因此應用於本發明之態樣及實施例中。舉例而言，設想產生由gH、gL、UL128、UL130及UL131A中之二者、三者或四者組成之複合物。二聚體複合物之較佳實例係gH及gL或UL130及UL131A之間之複合物。五聚體複合物之替代的另一較佳實例係gH/gL/gO之間之三聚體複合物。因此，本文結合五聚體複合物所述之所有態樣及實施例加以必要的變通完全適用於先前所述之二聚體或三聚體複合物。亦設想本文所述之其他CMV複合物可包含額外B-及/或T-細胞表位。該T-細胞表位可惜本文所述之CD4T-細胞表位或CD8 T-細胞表位。

本發明之複合物較佳以經分離形式製備及使用。本文所用之術語「經分離」意指自其天然環境移除。因此，「經分離五聚體複合物」或「經分離複合物」較佳並不涵蓋CMV感染細胞之表面上或傳染性CMV病毒體內之CMV膜蛋白複合物。

術語「gH」在本文中使用時有時可係指「UL75」或「pUL75」。該等術語中之每一者可替換另一者，且因此該等術語可互換使用。術語「gH」涵蓋相對於SEQ ID NO：1中所示之參照序列具有突變之gH多肽且亦涵蓋具有與本文所述之SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列共有一定程度一致性的胺基酸序列之多肽。該術語亦涵蓋長度為50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個或700個胺基酸之gH多肽之片段，由此該等片段較佳能夠與本文所述之其他四種蛋白質形成五聚體複合物。較佳gH多肽缺乏跨膜結構域(TM)。不存在TM結構域意味著此經修飾多肽不能駐留在脂質雙層內。在一些實施例中，gH多肽缺乏全長天然TM結構域；在其他實施例中，其可保留天然TM結構域之一部分，但不足以導致蛋白質駐留於脂質雙層中。因此，多肽可含有天然gH TM結構域之最多10個胺基酸(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸)。除缺乏一些或所有TM結構域外，多肽亦可缺乏CMV gH之天然C-末端結構域或可缺乏C-末端結構域之一部分。

gH之胞外結構域對應於缺乏疏水跨膜結構域(TM)之gH之部分。胞外結構域、信號序列及TM結構域之位置及長度可基於沿既定gH蛋白質序列之長度之疏水性之計算分析預測。信號序列及TM結構域具有最高疏水性位準且該兩個區域位於較不疏水之胞外結構域側面。

術語「gL」在本文中使用時有時可係指「UL115」或「pUL115」。該等術語中之每一者可替換另一者，且因此該等術語可互換使用。術語「gL」涵蓋相對於SEQ ID NO：2中所示之參照序列具有突變之gL多肽且亦涵蓋具有與本文所述之SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列共有一定程度一致性的胺基酸序列之多肽。該術語亦涵蓋長度為50個、100個、150個、200個或250個胺基酸之gL多肽之片段，由此該等片段較佳能夠與本文所述之其他四種蛋白質形成五聚體複合物。

術語「UL128」在本文中使用時有時可係指「pUL128」。該等術語中之每一者可替換另一者，且因此該等術語可互換使用。術語「UL128」涵蓋相對於SEQ ID NO：3中所示之參照序列具有突變之UL128多肽且亦涵蓋具有與本文所述之SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列共有一定程度一致性的胺基酸序列之多肽。該術語亦涵蓋長度為50個、100個或150個胺基酸之片段UL128多肽，由此該等片段較佳能夠與本文所述之其他四種蛋白質形成五聚體複合物。

術語「UL130」在本文中使用時有時可係指「pUL130」或「UL130A」。該等術語中之每一者可替換另一者，且因此該等術語可互換使用。術語「UL130」涵蓋相對於SEQ ID NO：4中所示之參照序列具有突變之UL130多肽且亦涵蓋具有與本文所述之SEQ ID NO：4中所示之胺基酸序列共有一定程度一致性的胺基酸序列之多肽。該術語亦涵蓋長度為50個、100個、150個或200個胺基酸之片段UL130多肽由此該等片段較佳能夠與本文所述之其他四種蛋白質形成五聚體複合物。

術語「UL131A」在本文中使用時有時可係指「pUL131A」、「UL131」或「pUL131」。該等術語中之每一者可替換另一者，且因此該等術語可互換使用。術語「UL131a」涵蓋相對於SEQ ID NO：5中所示之參照序列具有突變之UL131A多肽且亦涵蓋具有與本文所述之SEQ ID NO：5中所示之胺基酸序列共有一定程度一致性的胺基酸序列之多肽。該術語亦涵蓋長度為50個或100個胺基酸之片段UL131A多肽，由此該等片段較佳能夠與本文所述之其他四種蛋白質形成五聚體複合物。

如所述，本發明之每一蛋白質、尤其分別gH、gL、UL128、UL130及UL131A或其片段分別相對於SEQ ID NO：1(gH)、SEQ ID NO：2(gL)、SEQ ID NO：3(UL128)、SEQ ID NO：4(UL130)及SEQ ID NO：5(UL131A)中所示之參照序列可含有突變(例如插入、缺失及取代)，只要該等突變對於蛋白質作為抗原使用不會有害即可，尤其只要其保留引發可結合至少一五聚體複合物之抗體及/或可中和該五聚體複合物之生物效應之抗體之產生之一或多個表位即可。另外，該等突變不應阻礙蛋白質形成本發明五聚體複合物之能力。形成本發明五聚體複合物之能力可藉由實施蛋白質純化並藉由(例如)非還原性PAGE、西方墨點(Westem blot)及/或粒徑篩析層析分析蛋白質來測試。具體而言，每一蛋白質可包含可(例如)促進檢測、純化及/或增強溶解性之標籤。根據本發明可使用之實例性標籤包括His標籤、Strep標籤、His-Strep標籤、StrepII標籤、Softag 1、TC標籤、myc標籤、FLAG標籤、HA標籤、V5標籤、Avi標籤、攜鈣蛋白標籤、聚麩胺酸鹽標籤、類澱粉蛋白β標籤、GST標籤、MBP標籤或S標籤，His標籤較佳。His標籤可由6或8個His殘基組成，其中8個His殘基較佳。蛋白質亦可經截短及/或加工成其成熟形式，例如蛋白質可缺乏其天然形式中存在之信號序列及/或跨膜結構域。

正如所說，本發明之gH蛋白質或其片段與SEQ ID NO：1可具有各種程度之一致性，例如與SEQ ID NO：1中所列示之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。較佳gH蛋白質：(i)可與CMV gL二聚；(ii)形成三聚體gH/gL/gO複合物之一部分；(iii)形成五聚體gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合物之一部分；(iv)缺少跨膜結構域；及/或(iv)可在活體內引發與CMV病毒體免疫交叉反應之抗體。

正如所說，本發明之gL蛋白質或其片段與SEQ ID NO：2可具有各種程度之一致性，例如與SEQ ID NO：2中所列示之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。較佳gL蛋白質：(i)可與CMV gH二聚；(ii)形成三聚體gH/gL/gO複合物之一部分；(iii)形成五聚體gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合物之一部分；及/或(iv)可在活體內引發與CMV病毒體免疫交叉反應之抗體。

正如所說，本發明之UL128蛋白質或其片段與SEQ ID NO：3可具有各種程度之一致性，例如與SEQ ID NO：3中所列示之序列具有至少60%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。較佳UL128蛋白質：(i)可形成五聚體gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合物之一部分，及/或(ii)可在活體內引發與CMV病毒體免疫交叉反應之抗體。

正如所說，本發明之UL130蛋白質或其片段與SEQ ID NO：4可具有各種程度之一致性，例如與SEQ ID NO：4中所列示之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。較佳pUL130蛋白質：(i)可形成五聚體gH/gL/UL128/UL130/UL131複合物；及/或(ii)可在活體內引發與CMV病毒體免疫交叉反應之抗體。

正如所說，本發明之UL131A蛋白質或其片段與SEQ ID NO：5可具有各種程度之一致性，例如與SEQ ID NO：5中所列示之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。較佳的UL131A蛋白質：(i)可形成五聚體gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A複合物，及/或(ii)可在活體內引發與CMV病毒體免疫交叉反應之抗體。

「序列一致性」或「%一致性」係指使用標準化演算法所比對之至少兩個多肽或多核苷酸序列之間之殘基匹配百分數。此一演算法可以標準化且可重現方式在所比較之序列中插入空隙以最佳化兩個序列之間之比對，且因此達成該兩個序列之更有意義之比較。出於本發明之目的，兩個胺基酸序列或核苷酸之間之之間之序列一致性係使用NCBI BLAST程式2.2.29版(2014年1月06日)(Altschul等人，Nucleic Acids Res.(1997)25：3389-3402)測定。兩個胺基酸序列之序列一致性可利用blastp設置以以下參數測定：矩陣：BLOSUM62，字大小：3；期望值：10；空隙值(Gap cost)：存在=11，延伸=1；過濾器=經活化之低複雜度；過濾字串：L；組成性調整：條件組成性得分矩陣調整。出於本發明之目的，使用NCBI BLAST程式2.2.29版(2014年1月06日)測定兩個核苷酸序列之間之序列一致性，其中blastn設置為以下實例性參數：字大小：11；期望值：10；空隙值：存在=5，延伸=2；過濾器=經活化之低複雜度；匹配/失配得分：2、-3；過濾字串：L；m。

術語「多肽」與「蛋白質」在本文中可互換使用。術語「多肽」係指含有兩個或以上胺基酸、通常至少3個、較佳至少20個、更佳至少30個、例如至少50個胺基酸之蛋白質或肽。因此，多肽包含胺基酸序列，且因此有時包含胺基酸序列之多肽在本文中係指「包含多肽序列之多肽」。因此，在本文中術語「多肽序列」可與術語「胺基酸序列」互換使用。

術語「胺基酸」或「aa」係指天然及合成胺基酸以及以類似於天然胺基酸之方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係彼等藉由基因代碼編碼者以及彼等稍後經修飾之胺基酸，例如，羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然胺基酸具有相同基本化學結構(即，與氫、羧基、胺基及R基團結合之α-碳)之化合物，例如，高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如，正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指結構不同於胺基酸之一般化學結構但以類似於天然胺基酸之方式起作用的化學化合物。

本發明亦提供編碼本文所述之gH、gL、UL128、UL130及/或UL131A蛋白質或片段之核酸分子。該等核酸分子係在(例如)表現該等蛋白質中之一或多者時使用或本身作為核酸分子(例如)用於疫苗接種。出於表現一或多種該等蛋白質之目的，如眾所周知且本文所述將其選殖至載體中。

共同表現步驟

「共同表現」係用於藉由使用桿狀病毒(例如桿狀病毒表現系統或BacMam表現系統)在宿主細胞、較佳昆蟲細胞或哺乳動物細胞中表現之一或多種CMV蛋白質之術語。「表現載體」在本文中係定義為用於將遺傳物質轉移至遺傳物質可在其中表現之靶宿主細胞之媒介。尤其設想CMV蛋白質表現於桿狀病毒表現系統中。「表現系統」係表現載體與該載體之宿主細胞之組合，該組合提供一環境以允許外源基因在宿主細胞中之表現。

本發明之複合物可瞬時或穩定表現。

桿狀病毒係主要在昆蟲中發現之桿狀雙鏈DNA病毒。

桿狀病毒表現系統通常係基於(例如)經由與含靶基因之轉移載體同源重組將外源基因引入至非必要病毒基因體區域中。所得重組桿狀病毒可缺少由編碼可在適宜宿主細胞中表現之異源蛋白質之外源基因替代之非必要基因中之一者(例如polh、v-cath、chiA)。該等技術通常已為熟悉此項技術者所知且已由Kosta等人Nat Biotechnol.2005；23(5)：567-75論述。製備重組桿狀病毒載體之特定途徑係Bac-to-Bac® 桿狀病毒系統(Invitrogen)。

本發明之重組桿狀病毒表現載體能夠優先在宿主細胞且視情況在原核細胞(例如大腸桿菌)中複製。根據本發明，可使用源自通常用於蛋白質之重組表現的桿狀病毒之任何桿狀病毒表現載體。舉例而言，桿狀病毒載體可源自(例如)AcMNPV、家蠶(Bombyx mori)(Bm)NPV、番茄夜蛾(Helicoverpa armigera)(Hear)NPV或甜菜葉蛾(Spodoptera exigua)(Se)MNPV。桿狀病毒載體可為桿粒。

先前技術中之一常見偏見係CMV蛋白質在哺乳動物細胞中之表現係較佳的，因為已知所產生之CMV蛋白質將具有真正的哺乳動物糖基化模式，且因此具有感染性CMV上存在之表位。因此，預期僅該等蛋白質當用於免疫時將能夠生成在感染期間能夠結合至天然CMV粒子之抗體。

令人驚訝的是，本發明者已發現免疫原性五聚體複合物可使用來自哺乳動物細胞、以及昆蟲細胞之桿狀病毒載體獲得。同時，使用桿狀病毒系統能夠大量且以高純度產生本發明之五聚體複合物。較佳地，借助本發明之途徑及方法所產生之五聚體複合物展現特定糖基化模式，即昆蟲-糖基化(參見Harrison及Jarvis(2006),Adv.Virus Res.68,159-191)，其使得其係獨特的且因此不同於哺乳動物-糖基化。

因此，宿主細胞通常可為昆蟲細胞或哺乳動物細胞。一般而言，可使用較佳適於表現核酸分子以產生本發明之五聚體複合物之任何宿主細胞。根據本發明所用之宿主細胞尤其可為昆蟲細胞、較佳Sf9、Sf21、Super Sf9-1(VE-1)、Super Sf9-2(VE-2)、Super Sf9-3(VE-3)、Hi-5、Express Sf+及S2 Schneider細胞，其中Super Sf-9-2較佳[Oxford Expression Technologies,Cat.編號600103,Oxford,UK；Fath-Goodin等人(2006),Adv.Virus Res.68,75-90；Kroemer等人(2006),J.Virol.80(24),12291-12228及US20060134743.]。根據本發明適用之實例性哺乳動物宿主細胞為業內已知且包括自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)獲得之不朽化細胞系，包括(但不限於)HEK293、HEK293F、CHO、HeLa、HUVEC、HUAEC、Huh7、HepG2、BHK、MT-2、Cos-7、Cos-1、C127、3T3、人類包皮纖維母細胞(HFF)、骨髓纖維母細胞、Bowes黑色素瘤、初代神經細胞或上皮細胞。在哺乳動物細胞中表現可使得所產生之蛋白質將具有真正的哺乳動物糖基化模式，且因此具有感染性CMV粒子上存在之表位。因此，不受限於理論，本發明五聚體複合物在哺乳動物細胞中之產生將導致產生在感染期間能夠結合至天然CMV粒子之抗體。然而，由於本發明者觀察到五聚體複合物當在昆蟲細胞中產生時誘導中和活性、具體地中和抗體，其中理想地阻斷或至少減少CMV進入上皮細胞/內皮細胞細胞及纖維母細胞。

然而，且如本文所闡釋，宿主細胞亦可為哺乳動物細胞。例如，在BacMam系統中，使用桿狀病毒表現載體以將基因遞送至哺乳動物細胞。

本發明者意外地發現能夠(例如)以高產量產生本發明之五聚體複合物之特定參數。舉例而言，本發明之五聚體複合物可累積至多於1.0mg/升生長培養基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、650、680、700、800、900、1000mg/升生長培養基或以上)。

根據上述，設想共同表現步驟涉及用表現本發明五聚體複合物之蛋白質之桿狀病毒感染宿主細胞。進一步設想桿狀病毒在感染該宿主細胞時具有約10⁷pfu/mL或更高之效價，其較佳在感染時具有約2*10⁶個細胞/mL之計數。

然後，將宿主細胞在適宜條件下培養。較佳地，在感染後56-65 h，收穫宿主細胞及/或其上清液。在替代中，當至少80%(相對於100%之總數)之宿主細胞有活力時收穫宿主細胞及/或其上清液。宿主細胞之活力可(例如)藉由用台盼藍(trypan blue)使細胞染色來測定。活細胞並不著色，而無活力細胞將被著色。台盼藍染色可如下實施：使1ml細胞懸浮液經受0.4%台盼藍染色達約5分鐘，隨後較佳藉由使用血球計顯微鏡觀察以測定有活力/無活力細胞相對於所有計數細胞之百分比(即所有經計數細胞設定為100%)。

「收穫」在其所有語法形式中意指獲得宿主細胞及/或上清液之行動或製程，且可(例如)包括胰蛋白酶化、過濾及/或離心。可想像任何方法，只要本發明之五聚體複合物可以其完整或功能形式獲得即可。

進一步設想在本發明之方法中，宿主細胞係在解凍及培養之後第15天與第50天之間、較佳第15天與第30天之間、較佳在第18天感染。

在一些實施例中，本發明之五聚體複合物係自其在其中表現之細胞分泌。在本發明之其他實施例中，不分泌本發明之五聚體複合物。一較佳實施例係五聚體複合物之蛋白質均不含有額外分泌信號。不受限於理論，據推測一旦五聚體複合物在宿主細胞、尤其在昆蟲細胞中組裝，gH蛋白質即介導整個複合物之分泌。

純化

「純化」在其所有語法形式中意指移除不期望之化合物，例如細胞、細胞碎片、培養基、桿狀病毒，完整或不完整桿狀病毒等。取決於表現系統、產量等之適宜純化方法在業內可易於獲得。例如，純化可包括離子交換層析、疏水相互作用層析、粒徑篩析層析及/或親和層析，所有該等先前均已廣泛地闡述。正如所說，純化步驟尤其包括移除桿狀病毒。該等桿狀病毒可包含於可自經桿狀病毒載體或 BacMam載體感染之宿主細胞獲得之培養基及/或上清液。較佳在純化本發明之五聚體複合物時移除該等桿狀病毒。本發明者發現特別地可應用離子交換層析、更特別地離子交換層析以自可自本文所述之宿主細胞獲得之培養基及/或上清液移除桿狀病毒。

本文所用之純化亦包括可自培養基移除共同表現CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)之宿主細胞。該培養基較佳包含本發明之五聚體複合物，此乃因該等宿主細胞較佳分泌該五聚體複合物。自培養基移除宿主細胞可藉由機械力(例如藉由離心或過濾)來實施。過濾較佳藉由使用過濾介質(例如，微過濾過濾器或深度過濾器)來實施。微過濾過濾器可由聚醚碸或再生纖維素構成。深度過濾器可由聚丙烯或玻璃纖維構成。

然而，亦設想該宿主細胞並非必須分泌該五聚體複合物。若如此，則可收穫該等宿主細胞。收穫之後，該等宿主細胞可(例如)以酶促方式或機械方式破碎以釋放五聚體複合物，其隨後可如本文所述純化。

純化之後，較佳將螯合劑(例如EDTA或EGTA)添加至複合物。較佳地，EDTA係以20mM之最終濃度存在。隨後，較佳藉由透析使EDTA之20mM最終濃度降低至3mM最終濃度或更低，如本文所述。

儲存

「儲存」在其所有語法形式中意指較佳在維持本發明之五聚體複合物呈其完整或功能形式之條件下寄存(用於未來使用)，即，五聚體複合物較佳類似其天然形式及/或能夠誘導中和抗體。因此設想儲存條件不會促進(或甚至阻止)本發明五聚體複合物之崩解。術語「崩解」應在其最廣泛意義理解且可意指「拆卸」及/或「變性」。本發明五聚體複合物之儲存設想存於包含螯合劑及/或穩定劑之緩衝溶液中。

一般而言，任何螯合劑及/或穩定劑係適宜的，只要其能夠儲存本發明之五聚體複合物且不會促進其崩解即可。在本發明之上下文中，實例性有用螯合劑係EDTA。EDTA可以20mM或以下(例如15mM、10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM或1mM)之濃度存在於該緩衝溶液中。具體而言，EDTA可以3mM或以下之濃度存在。根據本發明使用之實例性穩定劑包括乙二醇、精胺酸、山梨醇、甘油及/或蔗糖。具體而言，緩衝溶液可包含100-200mM精胺酸、100mM山梨醇、20%甘油(w/v)、20%蔗糖(w/v)、0.5% NP-40、0.2% Brij-35及0.5% Chaps。

本發明之緩衝溶液可包含Tris緩衝劑、NaCl、KCl且具有6.5之pH。具體而言，緩衝溶液可包含25mM Tris緩衝劑、150mM NaCl、3mM KCl。緩衝溶液亦可為鈉/磷酸鉀緩衝液。該緩衝液可具有介於6.0與7.0之間之pH。

載體設計

本發明提供包含編碼CMV蛋白質UL128、UL130、UL131、gH及gL之開放閱讀框(ORF)的一或多個載體。

載體可含有用於在細菌(例如，大腸桿菌)、酵母(例如，啤酒酵母)、昆蟲細胞及/或哺乳動物細胞中繁殖之元件。較佳地，該載體係桿狀病毒載體或桿狀病毒BacMam載體。

在BacMam系統中，桿狀病毒載體用於將基因遞送至哺乳動物細胞中。BacMam系統可用於將基因遞送至寬範圍細胞系及原代細胞作為宿主細胞，其實例性列表包括在本文其他地方。未經修飾之桿狀病毒能夠進入哺乳動物細胞，然而除非將哺乳動物可識別啟動子併入所關注基因之上游，否則其基因不能表現。因此，設想本發明之BacMam載體在編碼本發明五聚體複合物之蛋白質之基因上游包含哺乳動物啟動子。載體可包含本文其他地方所述之額外元件，例如抗生素抗性基因、用於在大腸桿菌、啤酒酵母等中繁殖之元件。

在該桿狀病毒載體中，v-cath及/或ChiA基因可經功能性破壞。

一般而言，編碼本發明五聚體複合物之CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH及gL的開放閱讀框(ORF)可呈現於一或多個載體上，例如於兩個載體上。因此，1個、2個、3個或4個ORFS位於第一載體上，而其餘ORF/ORF位於第二載體上。然而，較佳地，該等ORF呈現於單一載體上。ORF亦可以多基因形式呈現(EP1945773)。

該等ORF可(例如)依5’至3’之以下順序位於該載體中：(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131A；或(ii)gL、UL128、UL130、UL131A、gH。

具體而言，設想(a)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131A ORF係在3’方向上轉錄；(b)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在3’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131A ORF係在3’方向上轉錄；(c)在(ii)中，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，UL131A ORF係在3’方向上轉錄，且gH ORF係在3’方向上轉錄。

載體之額外實例係用於生成CMV之五聚體複合物之以下載體(pRBT136-x)(該等載體之構築及加工闡述於PCT/EP2013/072717之實例1中)且因此係可應用以表現本發明五聚體複合物之較佳載體。因此，下表1中所列示之載體係用於共同表現五聚體複合物之一或多種蛋白質之載體的較佳實例性載體。顯而易見地，獨立於下表左側行中所示之特定核苷酸序列，如下表1中所示編碼五聚體複合物之蛋白質之基因的配置亦係本發明實施例之較佳配置。

縮寫：c：共有序列；H：His標籤；SH：鏈黴抗生物素蛋白-His標籤；V：VR1814，pcI：precission蛋白酶，pcII：precission及TEV蛋白酶，DT：二聚工具。對於表1中基因之描述，使用簡寫CMV術語(gB、gH、gL、gO以及無前綴之「UL」及無前綴「A」之UL48)。

較佳用於本發明之載體主鏈pRBT136含有大腸桿菌之複製起點(例如pBR322ori及酵母，例如，2micron ori、polh及用於在昆蟲細胞中表現之p10啟動子)、終止子SV40及HSVtk、若干抗性標記(胺苄青黴素、僅大黴素)、酵母選擇標記(URA3)、轉位子位點(Tn)及多選殖位點(MCS)。

舉例而言，含有啟動子-所關注基因-終止子之表現盒係在5’位點處利用5’位點處之35-40nt突出且在3’位點處利用其他且不同35-40nt突出進行PCR擴增。對於利用具有相同組織之第二表現盒之同源重組，PCR產物在5’位點處含有先前PCR產物之3’位點之35-40nt突出之互補序列。在第一PCR產物之5’位點及第二PCR產物之3’位點處之其餘突出分別與線性化載體(pRBT136)之3’及5’末端同源。然後在酵母、較佳啤酒酵母中實施序列中之同源重組。與前述策略平行之欲組裝之表現盒/PCR產物之數量根據所需欲組裝基因之數量增加。藉由此方式平行組裝多個基因/表現盒。所組裝基因側接轉位子位點。其等係用於使基因轉位至桿狀病毒基因體中。所得桿狀病毒共同表現載體，確保由相同單一細胞共同表現該基因。產量及產物組合視蛋白質數量及生產參數而變。使用矩陣系統及小規模生產系統確定關於產量及早期收穫之生產參數(例如細胞系、感染時細胞計數(CCI)、重組病毒接種物之量(感染倍數，MOI)及收穫時間(TOH))(2-20ml；Ries,C.,John C.,Eibl R.(2011),A new scale down approach for the rapid development of Sf21/BEVS based processes-a case study.In Eibl R.,Eibl D.(編者)：Single-use technology in Biopharmaceutical Manufacture,207-213,John Wiley & Sons,Hoboken,New Jersey)。然後使用所定義參數進行較大規模生產各別產物。本發明之五聚體複合物係使用允許高生產能力之現代可棄式組織培養技術製造。

載體可含有一或多種其他元件，包括(例如)複製起點、啟動子、選殖位點、遺傳標記、抗生素抗性基因、表位、報導基因、靶向序列及/或蛋白質純化標籤。熟悉此項技術者應易於得知該適用於特定表現系統之元件。

具體而言，本發明之載體可進一步含有用於在細菌(大腸桿菌)、酵母(啤酒酵母)、昆蟲細胞及/或哺乳動物細胞中繁殖之元件，例如複製起點、選擇標記等。

設想載體包含用於基因表現之啟動子。本文所述之各ORF係由啟動子驅動。啟動子較佳選自由以下組成之群：polh、p10及p_XIV極晚期桿狀病毒啟動子、vp39桿狀病毒晚期啟動子、vp39polh桿狀病毒晚期/極晚期雜合啟動子、pca/polh、pcna、etl、p35、egt、da26桿狀病毒早期啟動子；CMV-IE1、UBc、EF-1、RSVLTR、MT、猿猴病毒40啟動子、CAG啟動子(具有CMV-IE1增強子之β-肌動蛋白啟動子)、B型肝炎病毒啟動子/增強子、人類泛素C啟動子、雜合神經元啟動子、p_DS47、Ac5及P_GAL及P_ADH。本文所述各ORF之後係終止子序列，例如HSVtk終止子、SV40終止子或牛生長激素(BGH)終止子。

本發明五聚體複合物之一或多種蛋白質可包含PreScission蛋白酶或PreScission及TEV蛋白酶。尤其設想，例如gH及/或gL蛋白質可包含PreScission蛋白酶或PreScission及TEV蛋白酶。

進一步設想桿狀病毒v-cath及/或ChiA活性可經功能性破壞，此意味著較佳不存在功能v-cath及/或ChiA及/或所表現Most桿狀病毒編碼幾丁質酶(chiA)及病毒性細胞自溶酶樣蛋白酶(v-cath)，該等駐留於細胞中且當病毒誘導之細胞溶解時釋放以在感染結束時液化宿主屠體(Hawtin,RE等人，Virology.1997；238,243-253.)。該等金銀並非桿狀病毒複製必需的且因此可(例如)藉由部分或完全缺失、插入突變或藉由一或多種失活點突變而失活。

本發明之五聚體複合物可以各種純度位準製備，例如以質量計總蛋白質之至少80%、85%、90%、95%或99%，例如如藉由凝膠電泳所測定。該等高純度位準使得複合物適於(例如)在診斷應用中用作免疫原或在疫苗調配物中用作抗原。該等純度位準較佳可藉由以下獲得：(i)如本文所述自培養基移除宿主細胞，(ii)如本文所述實施層析(例如實施親和層析)，若五聚體複合物之經標記型式係由宿主細胞表現，則隨後(iii)移除桿狀病毒，若使用桿狀病毒表現系統，則藉助離子交換層析、尤其離子交換層析。該等步驟中之任一者均可重複，其中步驟(ii)較佳作為最後步驟重複。該等步驟可為以下順序(i)、(ii)及(iii)；(ii)、(i)及(iii)；(i)、(iii)及(ii)；(iii)、(ii)及(i)；(ii)、(iii)及(i)；或(iii)、(i)及(ii)。較佳地，步驟(ii)作為最後步驟重複。

組合物

本發明之五聚體複合物亦可呈組合物之形式。本發明之組合物可進一步包含緩衝劑、還原劑、穩定劑、螯合劑、增積劑、滲透平衡劑(張度劑)；表面活性劑、多元醇、抗氧化劑；冷凍保護劑；消泡劑；防腐劑；及著色劑、清潔劑、鈉鹽及/或抗菌劑等。組合物可不含聚丙烯醯胺。

在一些實施例中，組合物不含聚丙烯醯胺。在一些實施例中，組合物係液體(例如水性液體)，不為凝膠。在一些實施例中，蛋白質複合物未固定在組合物內。舉例而言，該五聚體複合物可不存在於凝膠中，或在膜、薄膜、紙或載玻片上。

組合物可為無菌及/或無熱原。組合物關於人類可係等滲的。

中和活性

本發明者發現本發明之五聚體複合物能夠誘導免疫原性反應。術語「免疫原性反應」意指「適應性免疫反應」，且一般而言包括體液性及/或細胞介導之免疫反應、較佳活體內。較佳地，免疫原性反應涉及誘導中和活性，由此中和活性較佳呈中和抗體之形式。

「中和抗體」係可中和(消除或降低)抗原之生物效應(例如病原體引發宿主中之感染及/或使感染持久)之能力之抗體。較佳地，響應於本發明之五聚體蛋白質複合物生成之中和抗體與CMV病毒體粒子交叉反應，由此賦予針對CMV感染之免疫力。不受限於理論，據信響應於本發明之五聚體蛋白質複合物所生成之中和抗體消除或至少降低CMV病毒體粒子進入上皮細胞、內皮細胞(Epi/EC)及/或纖維母細胞之能力，「且」組合較佳。設想進入細胞中之效率降低至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%，如藉由熟悉此項技術者已知之標準化測試所測定。如本文所用，「效率」係定義為在抗體之存在下所感染細胞之數量佔在不存在抗體之情形下所感染數量之百分比。用於在具體中和抗體中篩選/鑑別/測定之中和分析可如圖3之圖例及實例3中所述實施。

因此設想本發明之五聚體複合物可能夠誘導對抗CMV感染之免疫力。該兩種功能(即，誘導免疫原性反應及誘導免疫力)依賴於本發明之五聚體複合物上可引發抗體(包括中和抗體)之產生之表位的保留。五聚體複合物之一系列構象表位係已知的；參見Macagno(2010),Journal of Virology 84(2010)：1005-13。

根據上文，本發明提供五聚體複合物，其較佳能夠誘導抑制上皮細胞/內皮細胞(Epi/EC)及纖維母細胞感染之中和活性。

生產方法

在第二態樣中，本發明亦提供產生由CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)組成之五聚體複合物之方法，其包含(i)在宿主細胞中共同表現桿狀病毒CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)；(ii)自該宿主細胞及/或上清液中純化該共同表現獲得之五聚體複合物；及(iii)視情況在包含螯合劑及/或穩定劑之緩衝劑溶液中儲存該經純化五聚體複合物。

應注意，在本發明之五聚體複合物之情形中所述之實施例加以必要的變通亦適用於本發明方法。

醫藥/疫苗組合物

在第三態樣中，提供包含治療有效量之本發明或可藉由本發明方法獲得之五聚體複合物及視情況選用之醫藥上可接受之載劑或佐劑之醫藥組合物或疫苗組合物。本發明之醫藥組合物或疫苗組合物亦可包含本文所述之載體。

「治療有效量」係足以引發期望治療效應之量。例如，在疫苗組合物中，治療有效量可為足以在個體中誘導免疫反應(例如產生中和抗體)之量。個體較佳可為哺乳動物，其可為(例如)小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔、狗、貓或靈長類動物。較佳地，個體係人類。

術語「醫藥上可接受」可尤其意指由管理機構或其他通常公認之藥典批准用於動物、且更具體地人類。

本發明之醫藥/疫苗組合物設想用於個體之治療性治療。術語「治療性治療」在其所有語法形式中包括治療性或預防性治療。「治療性或預防性治療」包含旨在完全阻止臨床及/或病理表現之預防性治療或旨在改善或緩解臨床及/或病理表現之治療性治療。

為減少先天性疾病之機會，期望預防性疫苗以防止母親之第一次CMV感染，而在母親經診斷患有活性CMV感染之情形下需要有效療法。本發明之五聚體複合物尤其設想作為預防性疫苗施加於(例如)孕婦、兒童或移植之前之移植患者。

疫苗組合物可進一步包含gB蛋白質、gM蛋白質、pp65蛋白質、IE-1蛋白質、gL/gH蛋白質之二聚體、gM/gN蛋白質之二聚體、gL/gH/gO之三聚體、包含一或多種衣殼或衣殼前體蛋白質、一或多種來自CMV之表面蛋白質及/或一或多種被蓋蛋白質之病毒樣粒子(VLP)。「gB」在本文中可與UL55互換使用。「gM」在本文中可與UL100互換使用。「pp65」在本文中可與UL83互換使用。「IE-1」在本文中可與UL123互換使用。「gO」在本文中可與UL74互換使用。應瞭解，上文所提及之蛋白質並不關於特異性序列受限。上文所提及蛋白質之突變或截短形式亦設想涵蓋於本發明疫苗組合物中。蛋白質亦可以經修飾形式存在於本發明疫苗中。實例性修飾已在本發明五聚體複合物之蛋白質之情形中闡述且亦適用於gB、gM、pp65、IE-1及gO。

本發明之疫苗或載體疫苗可分別進一步包含補體受體1型之可溶形式(sCR1)。

「病毒樣粒子(VLP)」係病毒結構蛋白質(例如，表面蛋白質)之複合物，其類似於病毒，但不含任何病毒遺傳物質且因此不具有感染性。本發明中所用之VLP原則上可包含期望引發免疫反應之任何病毒蛋白。例如，本發明中所用之VLP可包含CMV衣殼或衣殼前體蛋白質，表面蛋白質及/或被蓋蛋白質、B-細胞及/或T細胞表位及/或選自由以下組成之群之蛋白質：額外外源抗原序列、細胞介素、CpG基序、g-CMSF、CD19及CD40配體及/或螢光蛋白質、用於粒子之純化目的或用於附接標記之蛋白質及/或轉運過程所需之蛋白質結構。

另外，疫苗組合物可包含編碼gB、gM、pp65、IE-1或IE-2之核酸分子。例如，核酸可為DNA或RNA。例如，核酸可呈載體或質體之形式。亦設想複雜及穩定形式。

本發明亦提供疫苗組合物，其包含編碼本發明之五聚體複合物或本文所述之任何其他CMC複合物之載體。該載體可基於DNA或RNA。根據疫苗組合物使用之適宜載體包括基於DNA之載體，例如桿狀病毒載體、BacMam載體、腺病毒載體、慢病毒載體、AAV載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體及Eppstein-Barr病毒(EBV)載體。亦設想使用裸DNA；例如，呈質體之形式及視情況複合及/或穩定化形式(例如脂質複合物(lipoplexes)、人工合成多聚物(polyplexes)、樹枝狀聚合物、病毒顆粒及具有無機奈米粒子之複合物)。適宜之基於RNA之載體包括逆轉錄載體、森林病毒(Semliki forest virus,SFV)、辛得比斯病毒(Sindbis virus,SIN)及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEE)載體。

本發明之疫苗組合物可進一步包含經修飾之牛痘病毒安卡拉(modified vaccinia virus Ankara,MVA)，其包含一或多種由UL128、 UL130、UL131、gH(UL75)及gL(UL115)構成之CMV五聚體複合物的蛋白質。

此外，本發明提供用於對個體接種疫苗對抗CMV之方法中之疫苗組合物，該方法包含向該個體投與該疫苗組合物至該個體作為初免組合物及作為加強組合物，(i)gH/gL二聚體、(ii)UL130/UL131A-二聚體、(iii)gM/gN二聚體、(iv)gH/gL/UL128/UL130/UL131A-五聚體、(v)gB、(vi)gM、(vii)pp65、(viii)IE-1、(ix)IE-2、(x)包含一或多種由UL128、UL130、UL131、gH(UL75)及gL(UL115)構成之CMV五聚體複合物的蛋白質之經修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)、(xi)包含gB、gH/gL二聚體、pp65蛋白質或IE-1蛋白質之經修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)、(xii)包含一或多種衣殼或衣殼前體蛋白質、一或多種來自CMV之表面蛋白質或一或多種被蓋蛋白質之病毒樣粒子(VLP)、(xiii)編碼在(i)至(xii)中所定義化合物中之任一者的核酸序列、(xiv)來自鞭毛蛋白之肽、(xv)CpG基序及/或(xvi)LCMV。

該加強組合物亦可用作初免組合物且該初免組合物用作加強組合物。

在初免加強方案中，使用由兩種或以上類型之疫苗組成之初免/加強疫苗，包括用於初次接種(初免(prime或priming))中之疫苗及用於加強接種(加強(boost或boosting))中之疫苗。通常，用於初次接種中之疫苗及用於加強接種中之疫苗彼此不同。初次接種及加強接種可依次實施，然而，此並非強制性的。初免/加強方案包括(但不限於)(例如)DNA初免/蛋白質加強、DNA初免/病毒載體加強(例如使用MVA)。

載劑

術語「載體」及「賦形劑」在本文中可互換使用。醫藥上可接受之賦形劑包括(但不限於)稀釋劑(填充劑、增積劑(例如乳糖、微晶纖維素)、崩解劑(例如羥乙基澱粉鈉、交聯羧甲纖維素鈉)、黏合劑 (例如PVP、HPMC)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂)、助流劑(例如膠態SiO₂)、溶劑/共溶劑(例如水性媒劑、丙二醇、甘油)、緩衝劑(例如檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽)、防腐劑(例如苯甲酸鈉、對羥苯甲酸酯(Me、Pr及Bu)、BKC)、抗氧化劑(例如BHT、BHA、抗壞血酸)、潤濕劑(例如聚山梨醇酯、山梨糖醇酐酯)、消泡劑(例如，Simethicone)、增稠劑(例如甲基纖維素或羥乙基纖維素)、甜味劑(例如山梨醇、糖精、阿斯巴甜(aspartame)、安賽蜜(acesulfame))、矯味劑(例如薄荷、檸檬油、奶油糖果等)、潤濕劑(例如丙烯、二醇、甘油、山梨醇)。熟悉此項技術者將能夠容易地視(例如)醫藥組合物之調配及投與途徑選擇適宜醫藥上可接受之賦形劑。

實例性醫藥上可接受之賦形劑之非詳盡列表包括(生物可降解)脂質體；由生物可降解聚合物聚(D,L)-乳酸-共乙醇酸(PLGA)製成之微球、白蛋白微球；合成聚合物(可溶性)；奈米纖維、蛋白質-DNA複合物；蛋白質偶聯物；紅血球；或病毒顆粒。各種基於載劑之劑型包含固體脂質奈米粒子(SLN)、聚合物奈米粒子、陶瓷奈米粒子、水凝膠奈米粒子、共聚肽奈米粒子、奈米晶體及奈米懸浮液、奈米晶體、奈米管及奈米線、功能化奈米載劑、奈米球、奈米膠囊、脂質體、脂質乳液、脂質微管/微柱體、脂質微泡、脂質球、脂質聚合物複合體(lipopolyplexes)、逆脂質膠束、樹枝狀聚合物、醇質體、多複合物超薄膠囊、磷脂囊(aquasomes)、醫藥質體、膠質體(colloidosomes)、類脂質體(niosomes)、盤狀體(discomes)、前非離子體(proniosomes)、微球、微乳液及聚合膠束。其他適宜醫藥上可接受之賦形劑尤其闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publishing Co.,New Jersey(1991)及Bauer等人，Pharmazeutische Technologie，第5版，Govi-Verlag Frankfurt(1997)。

佐劑

本發明之醫藥或疫苗組合物可進一步包含佐劑以刺激免疫系統對五聚體複合物之反應。根據本發明可用之實例性佐劑包括無機化合物(例如明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、鹼式磷酸鈣)、礦物油(例如石蠟油)、病毒顆粒、細菌產物(例如經殺滅細菌百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、類毒素、非細菌有機物(例如角鯊烯、乙汞硫柳酸鈉(thimerosal))、清潔劑(Quil A)、細胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-10及IL-12)及複合物組合物(例如弗氏(Freund's)完全佐劑及弗氏不完全佐劑)。一般而言，本發明所用之佐劑較佳強化對本發明之五聚體複合物之免疫反應及/或調節其朝向所期望之免疫反應。

各種途徑適用於投與本發明之醫藥或疫苗組合物，包括(但不限於)經口、局部、經皮、皮下、靜脈內、經腹膜內、經肌內或經眼內。然而，若期望，任何其他途徑可容易地由熟悉此項技術者選擇。

投與有需要之個體的本發明之醫藥/疫苗組合物的準確劑量將取決於治療目的(例如治療急性疾病對預防性疫苗接種)。投與途徑之調整、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、投與時間、藥物相互作用及病狀之嚴重性可係必要的，且將由熟悉此項技術者利用常規實驗確定。

來源

在第四態樣中，在本發明之五聚體複合物中，該等蛋白質中之至少一者、二者、三者或四者可來自除其餘蛋白質來自其之CMV株以外之CMV株。

根據本發明，「菌株」係指CMV基因型變體。表述「來自CMV株」在本文中可與表述「源自CMV株」互換使用且在本文中在其最廣泛意義上應理解為「可追溯至」CMV株，即，具有CMV株中之天然對應體或祖先。該術語亦涵蓋經修飾蛋白質(例如具有突變，例如關於其天然存在之對應體之胺基酸缺失、插入或轉換)或經標記蛋白質。

舉例而言，CMV蛋白質可源自CMV株Towne(Towne具有以登錄號FJ616285.1寄存於NCBI基因庫中之基因體)、Toledo(GU937742.1)、AD169(FJ527563)、Merlin(AY446894.2)、TB20/E(KF297339.1)、VR1814(GU179289)。在位置204處之aa Y由aa F交換，根據Patrone等人，J.Virol.,2005,79,8361-8373，UL130之表現之主要問題係在相同位置處之框移，此導致胺基酸擴展至下一個ORF。顯而易見地，CMV株Towne(ACCN：FJ616285.1)自身不能表現功能五聚體複合物；然而，本發明者已驚訝地發現當使用來自以登錄號FJ616285.1寄存於基因庫之Towne之核苷酸序列用於基因合成時，可自Towne獲得功能五聚體複合物(ORF UL75(蛋白質ID：ACM48053.1)、UL115(ACM48085.1)、UL128(AAR31451.1)、UL130、UL131A(AAR31453.1))。此一五聚體複合物在小鼠中引發中和抗體之生成，該等中和抗體能夠阻止CMV進入纖維母細胞。因此，以登錄號FJ616285.1寄存於基因庫之編碼CMV Towne株之UL75、UL115、UL128、UL130、UL131A之ORF係較佳的。同樣，由該等ORF編碼之蛋白質係較佳的。

另外，本發明者已發現亦可能使用CMV株Towne中存在之ORF，該CMV株Towne在UL130 ORF之胺基酸序列的位置204處具有胺基酸F(Phe)以及修復實驗室株Towne(生長於人類包皮纖維母細胞上)之相同位置處的框移，此獲得功能胺基酸Y(Tyr)。使用經修飾pUL130仍提供功能五聚體複合物。

病毒

在第五態樣中，本發明提供經修飾CMV Towne株，其具有以登錄號FJ616285.1寄存於NCBI基因庫之基因體且在UL130 ORF之胺基酸序列的位置204處具有胺基酸F(Phe)以及修復實驗室株Towne(生長於人類包皮纖維母細胞上)之相同位置處的框移，此獲得功能aa Y。

將自以下實例更好的理解本發明及其優點，該等實例僅出於說明目的而提供。該等實例並不欲以任何方式限制本發明之範圍。

實例

實例1：五聚體CMV複合物之表現、純化及表徵

根據基於系統最佳化所定義之蛋白質表現參數(參見PCT/EP2013/072717之實例1)，包含gpUL75(gH-His)-gpUL115(gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A之五聚體CMV複合物係藉由自單一桿狀病毒(SEQ ID NO：18)共同表現在草地貪夜蛾(fall army worm Spodoptera frugiperda)細胞(St9)中在可棄式2L搖瓶(培養體積700ml)中產生。生產參數係如下：感染時之初始細胞計數(CCI)為2x10⁶個細胞/mL，感染倍數(MOI)為0.25pfu/ml，在100rpm下在27℃下培育。感染後(p.i.)第3天時實施收穫，其中活力大約為80%。藉由每天取樣、測定細胞計數及活力控制產生。將含有上清液之複合物加載於2×5ml HisTrap管柱(GE Healthcare)上。經50管柱體積(CV，等效於500ml)使用自0至500mM咪唑之線性梯度純化複合物。藉由生物化學方法分析不同之層析流份。將150μl不同流份用丙酮沈澱，重新懸浮於30μl 20mM Tris、150mM NaCl緩衝液(pH 7.4)中。為加載於4-12% Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)上，根據製造商之方案添加4x負載染料，隨後使用MOPS運行緩衝液在150V下實施電泳15min且在180V下45分鐘。利用SimplyBlue SafeStain試劑(Invitrogen)使該等凝膠染色過夜並利用水脫色。對於濃縮及進一步純化，藉由經50管柱體積自0-500mM咪唑之線性梯度使用1ml HisTrap管柱實施第2次IMAC層析。如同第1個IMAC步驟藉由考馬斯染色之SDS-PAGE及使用抗His抗體之免疫印跡分析不同的流份。將所有含有複合物之流份彙集，使用 50kDa截止Amicon過濾單元(Millipore)濃縮至5ml之最終體積並加載於粒徑篩析管柱(XK16/69,Superdex200pg)上用於最終純化步驟並藉由SDS-PAGE、隨後考馬斯染色及使用抗His抗體之免疫印跡來分析。經由適於96孔板格式(BCA,Pierce)之Bradford分析測定總蛋白質。將20μl未知或標準試樣稀釋於180μl緩衝液中。製得標準一式三份(純牛血清白蛋白)或未知試樣之連續2倍稀釋液。每一孔添加100μl 2x儲積Bradford試劑(Pierce)。然後將板混合並在微量滴定板讀取器中在595nm下量測吸光度。進一步藉由研究針對添加至gpUL75之His標籤(gH，小鼠-抗His,AbD Serotec)及gpUL75自身(gH，小鼠-抗gH,Santa Cruz)之特異性抗體之結合分析來自基於層析之純化之不同流份中所含之五聚體CMV複合物。因此，將不同試樣1：10稀釋於96孔預吸附ELISA板中之100μl/孔塗覆緩衝液(0.1M Na₂HPO₄,pH 9)中並於4℃下培育過夜。之後，將板用3x with 195μl/孔洗滌緩衝液(1xPBS,0.05% Tween 20)洗滌3x，隨後於室溫下用195μl/孔存於1x PBS溶液中之3%BSA阻斷1h。3個洗滌步驟之後，添加以1μg/ml之濃度存於3%BSA、1x PBS、0.05% Tween 20(pH 7)中之特異性抗體、抗His抗體(抗His)以及抗gpUL75(抗gH)(100μl/孔)並於室溫下培育1h，隨後再3個洗滌步驟。對於檢測，利用適當二級抗體(抗小鼠-IgG-HRP,1：1000稀釋於3%BSA,1x PBS,0.05% Tween20,pH 7中)實施1h培育。使用100μl/孔TMP受質試劑(BD Biosciences,San Diego,USA；根據製造商方案)檢測特異性抗體對五聚體複合物之結合，為此在3-15min之後利用100μl 1M HCl終止反應，隨後在微板讀取器中在450nm下進行OD量測。藉由質譜術以高覆蓋率鑑別五聚體複合物之蛋白質並五聚體複合物蛋白質之分子量經測定如下：UL128(MW：19702.982)、UL130(MW：24618.466、UL131A(MW：14865.502)、gL 8MW：30894.892)、gH(MW：83203.292)。

用於生成五聚體CMV複合物之實例性表現載體(pRBT136-x)說明於上表1中。

表現及純化之後，五聚體複合物可與(例如)本文所述之螯合劑及/或穩定劑混合。

實例2：小鼠中之活體內研究

對於活體內研究，在初免-加強-加強方案中使用Balb/C小鼠。每組含有8隻小鼠且每隻小鼠接受每次注射20μg蛋白質。在小鼠隔離14天之後(第0天)獲得免疫前血清。首次注射發生在10天後，隨後在第42天進行加強注射。在第49天進行首次採血。在第61天實施第二次加強注射，隨後在第70天再次採血。最後採血發生在第85天，隨後研究體液性及細胞免疫反應。

實例3：基於中和分析之體液性免疫反應

藉由將來自實例2之小鼠血清的中和分析與來自CMV陰性及CMV陽性人類血液供體之血清相比較研究基於五聚體複合物(SEQ ID：18)之疫苗候選者的體液性免疫反應。使用出於分析原因攜載GFP分子(固定-EGFP)之BAC(細菌人工染色體)重建VR1814株用於感染纖維母細胞(MRC-5)及上皮細胞(ARPE-19)以顯現來自實例9之小鼠血清的中和潛力。將2x10⁴個細胞/孔接種於96孔板於含10% FCS(胎牛血清)之RPMI培養基中。產生8隻小鼠之血清彙集物並添加於100μl/孔RPMI/FCS培養基中之2倍連續稀釋液(1：20至1：2560)中。以在預分析中測定之1000個病毒分子/孔之組織培養感染劑量(TCID)添加上述固定-EGFP VR1814病毒。將96孔板在37℃下在CO₂受控氣氛中培育8天。在板讀取器中利用以下參數實施綠色細胞之測定：螢光素濾光器(激發485/20，發射530/25)，底部讀取模式，時間：0.1sec，96h培育之後25x量測/孔。中和功效測定為能夠顯示50%病毒感染抑制之血清稀釋度。實施以下對照：細胞對照(細胞+PBS)、病毒對照(僅感染細胞)及來自人類血液供體之5CMV陽性及5CMV陰性血清。

實例4：基於EliSpot數據(多工分析)之細胞免疫反應

在活體內研究(實例2)之第85天，將小鼠殺死並準備脾細胞用於分析10種不同的細胞介素。為再刺激脾細胞，使用複合物以及合成肽之混合物。驗證以下蛋白質：HIVgag、pUL83、gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL128、gpUL130及gpUL131A。使用若干生物資訊學演算法實施每一蛋白質之表位預測。對於每一蛋白質，生成4種肽之混合物用於再刺激脾細胞。對於HIVgag，使用130種肽之市售肽混合物(JPT,Berlin)。藉由來自Invitrogen之多工分析套組根據製造商方案研究細胞介素(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、gCMSF及TNFα)。

實例5：基於EliSpot數據(多工分析)之細胞免疫反應

在活體內研究(實例2)之第85天，將小鼠殺死並準備脾細胞用於分析10種不同的細胞介素。為再刺激脾細胞，使用複合物[2μg/mL]以及re-CMV-VLP[2μg/mL]來接收同源及/或異源初免-加強方案之初始數據。驗證複合物之以下蛋白質：gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130及gpUL131A。藉由來自Invitrogen之多工分析套組根據製造商方案研究細胞介素(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、gCMSF及TNFα)。利用複合物免疫之小鼠之reCMV-VLP再刺激導致誘導T-細胞反應，如由IL-4、gCMSF及IL-5之分泌所驗證。與前一者相比，利用相同血清之複合物再刺激之後細胞介素分泌降低。基於該等結果，利用複合物(在1-10ug/小鼠範圍內)初免及利用reCMV-VLP(包含其他蛋白質，例如gpUL83、gpUL55)加強可係有前途之方法。

實例6：包含來自兩種不同株系之蛋白質的五聚體CMV複合物的表現、純化及表徵

根據基於系統最佳化(參見PCT/EP2013/072717之實例1)定義之蛋白質表現參數，藉由自單一桿狀病毒(SEQ ID NO：67)共同表現在草地貪夜蛾細胞(Super-Sf9)之變體中在可棄式搖瓶或塑膠袋(wave bag)(培養體積高達25L)中產生包含gpUL75(gH-His)-gpUL115(gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A之五聚體CMV複合物。此複合物含有來自兩種不同HCMV株(Towne[NCBI FJ616285.1及VR1814[NCBI GU179289)之蛋白質。生產參數係如下：初始感染時細胞計數(CCI)為2x10⁶個細胞/mL，感染倍數(MOI)為0.25pfu/ml，在27℃下在100rpm下培育。在感染後3天(55-65hp.i.)進行收穫，其中活力大約為80%。藉由每天取樣、測定細胞計數、平均細胞直徑、聚集及活力控制產生。將含複合物之上清液依賴於總體積以不同規模加載於Ni²⁺-帶電瓊脂糖管柱(GE Healthcare)上。經等效於約460ml之23管柱體積(CV)自0至500mM咪唑使用步驟梯度純化複合物。藉由生物化學方法分析不同的層析流份。利用丙酮沈澱150-300μl不同流份，重新懸浮於33μl 20mM Tris、150mM NaCl緩衝液(pH 7.4)中。為加載於4-12% Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)上，根據製造商方案添加4x負載染料，隨後使用MOPS運行緩衝液在150V下實施電泳15min且在180V下實施45min。利用SimplyBlue SafeStain試劑(Invitrogen)將凝膠染色至少1h並利用水脫色。為進行濃縮及進一步純化，使用其他瓊脂糖管柱(5mL HisTrap)及經31管柱體積(CV)自0至500mM咪唑之步驟梯度實施第2次IMAC層析。如同第1個IMAC步驟藉由考馬斯染色之SDS-PAGE分析不同流份。所有含複合物之流份係一致的且在PALL macrosep離心裝置上濃縮並針對含有25mM Tris、150mM NaCl、3mM KCl(pH 6.5)、3mM EDTA之儲存緩衝液進行透析。純化之可溶性複合物係藉由SDS-PAGE(參見上文)分析，隨後考馬斯染色並與不同量之BSA一起進行密度分析。

實例7：小鼠中包含不同抗原之活體內研究

對於活體內研究，在初免-加強-加強方案中使用Balb/C小鼠。每組含有8隻小鼠且每隻小鼠在有或沒有佐劑之情形中接受每次注射5μg、10μg或20μg蛋白質。作為陰性對照，使用PBS，陽性對照係不活化AD169溶解產物，且為研究其餘桿狀病毒(BV)，同樣注射在純化後具有相應效價之其餘桿狀病毒之生產病毒。在小鼠隔離6天之後(第0天)獲得免疫前血清。首次注射發生在10天後，隨後在第28天進行加強注射。在第36天進行首次採血。在第48天實施第二次加強注射，隨後在第55天再次採血。最後採血發生在第60天，隨後研究體液性及細胞免疫反應。每週一次量測體重(參見圖12)。

實例8：基於中和分析之體液性免疫反應.

藉由將來自實例7之小鼠血清的中和分析與來自CMV陰性及CMV陽性人類血液供體之血清相比較研究五聚體複合物變體之疫苗候選者(SEQ ID：18；SEQ ID：67以及與病毒樣粒子[VLP；包含UL86、UL85、UL48、UL83及UL74之載劑上之SEQ ID：6]之組合)之體液性免疫反應。使用出於分析原因攜載GFP分子(固定-EGFP)之BAC(細菌人工染色體)重建VR1814株以及TB40E株用於感染纖維母細胞(MRC-5)及上皮細胞(ARPE-19)以顯現來自實例7之小鼠血清的中和潛力。將2x10⁴個細胞/孔接種於96孔板於含10% FCS(胎牛血清)之RPMI培養基中。產生8隻小鼠中4隻小鼠之血清彙集物並添加於100μl/孔RPMI/FCS培養基中之2倍連續稀釋液(1：20至1：2560)中。以在預分析中測定之1000個病毒分子/孔之組織培養感染劑量(TCID)添加上述固定-EGFP VR1814病毒以及TB40E。將96孔板在37℃下在CO₂受控氣氛中培育8天。在板讀取器中利用以下參數實施綠色細胞之測定：螢光素濾光器(激發485/20，發射530/25)，底部讀取模式，時間：0.1sec，96h培育之後25x量測/孔。中和功效測定為能夠顯示50%病毒感染抑制之血清稀釋度。實施以下對照：細胞對照(細胞+PBS)、病毒對照(僅感染細胞)及來自人類血液供體之5CMV陽性及5CMV陰性血清。有趣地，自利用五聚體複合物免疫釋放之中和抗體同樣具有減少或抑制不依賴於病毒株之經由纖維母細胞之病毒進入。該等數據使得可達成基於含有五聚體複合物之疫苗之廣泛免疫反應大有希望(參見圖8)。

實例9：基於EliSpot數據(多工分析)之細胞免疫反應。

在活體內研究(實例2)之第60天，將小鼠殺死並準備脾細胞用於分析3種不同的細胞介素。為再刺激脾細胞，使用AD169病毒溶解產物。藉由來自Invitrogen之多工分析套組根據製造商方案研究(IFN-γ、IL-4、IL-5)。利用含有非功能性五聚體複合物之病毒溶解產物再刺激之後之細胞介素分泌導致Th-1及Th-2反應。利用功能性蛋白質再刺激將導致有前途之細胞介素誘導。佐劑導致特異性Th-2反應增加，如經由IL-4分泌量測。較低劑量(5μg)之五聚體複合物看起來比高劑量(10μg)更有益。桿狀病毒抗原僅導致可忽略之細胞介素分泌(參見圖7)。

實例10：包含來自Towne株之蛋白質的五聚體CMV複合物之經改良表現、純化及表徵.

根據基於系統最佳化(參見PCT/EP2013/072717之實例1)定義之蛋白質表現參數，藉由自單一桿狀病毒(SEQ ID NO：67)共同表現在草地貪夜蛾細胞(Super-Sf9)之變體中在可棄式搖瓶或塑膠袋(培養體積高達25L)中產生包含gpUL75(gH-His)-gpUL115(gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A之五聚體CMV複合物。此複合物含有含有來自 HCMV株Towne([NCBI FJ616285.1)蛋白質。生產參數係如下：初始感染時細胞計數(CCI)為2x10⁶個細胞/mL，感染倍數(MOI)在0.1與1之範圍內，在27℃下在100rpm下培育。在感染後2-3天(48-65h p.i.)進行收穫，其中活力大約為80%。藉由每天取樣、測定細胞計數、平均細胞直徑、聚集及活力控制產生。為在塑膠袋中生產，選擇不同的參數：速度介於19rpm與22rpm之間，角度為6且與受控之氧供應組合。將含複合物之上清液依賴於總體積以不同規模加載於Ni²⁺-帶電瓊脂糖管柱(GE Healthcare)上。經7至15管柱體積(CV)自0至500mM咪唑使用步驟梯度純化複合物。藉由生物化學方法分析不同的層析流份，其藉由直接加載15μl或藉由丙酮沈澱150-300μl不同流份(重新懸浮於33μl 20mM Tris，150mM NaCl緩衝液(pH 7.4))。為加載於4-12% Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)上，根據製造商方案添加4x負載染料，隨後使用MOPS運行緩衝液在150V下實施電泳15min且在180V下實施45min。利用SimplyBlue SafeStain試劑(Invitrogen)將凝膠染色至少1h並利用水脫色。為減少剩餘桿狀病毒之量，以陰性模式實施陰離子交換層析。將含有五聚體複合物之流出物進一步濃縮並使用其他瓊脂糖管柱(規模取決於體積)及經15-30管柱體積(CV)自0至500mM咪唑之步驟梯度實施第2次親和層析來純化。如同第1個IMAC步驟藉由考馬斯染色之SDS-PAGE分析不同流份。所有含複合物之流份係一致的且品質受控的。濃縮以及PALL macrosep離心裝置可經整合。咪唑之置換係藉由若干透析步驟實施。第一透析緩衝液含有20mM EDTA，其然後減少至較低量0-3mM EDTA。如此完全緩衝液切換成PBS亦係可能的。為儲存及穩定化複合物，可添加不同化學試劑，例如Tween20、Tween80、甘油。藉由SDS-PAGE(參見上文)分析純化之可溶性複合物，隨後考馬斯染色並與不同量之BSA一起進行密度分析。蛋白質濃度以及剩餘桿狀病毒係藉由BCA分析測定。剩餘桿狀病毒基因體係基於病毒參考基因(IE-1)藉由qPCR、以及使用平衡染料之組合利用病毒計數器(Virocyt)基於病毒衣殼中病毒基因體(且通常核酸)及蛋白質之螢光量測來測定。測定核酸及病毒膜蛋白之同時吸光度的此「組合」途徑允許檢測病毒粒子之總量，然而感染粒子係藉由噬菌斑分析量測。使用來自Charles River(PTS20F)基於LAL分析之Endosafe裝置使用經驗證單次使用筒用於內毒素測定。使用來自Invitrogen(P7589)之Quant-iT^TM PicoGreen® Assay用於測定最終產物中之dsDNA含量。

在DSP製程(IMAC-AEX-IMAC)結束時經由直接ELISA確認產物身份。複合物經驗證具有α-gH-抗體(Santa Cruz,sc-58113)及α-His-抗體(AbD Serotec,MCA1396)且係利用α-小鼠-HRP抗體(Cell Signaling,7076S)檢測(參見圖9及10)。

表現及純化之後，五聚體複合物可與(例如)本文所述之螯合劑及/或穩定劑混合(參見圖11)。

<110> 瑞士商瑞德維克斯公司

<120> 治療CMV之手段及方法

<130> RBT15047PCT

<160> 72

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 716

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 278

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 171

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 4

<210> 5

<211> 128

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 5

<210> 6

<211> 11317

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 6

<210> 7

<211> 11317

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 7

<210> 8

<211> 11363

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 8

<210> 9

<211> 11363

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 9

<210> 10

<211> 11432

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 10

<210> 11

<211> 11432

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 11

<210> 12

<211> 11338

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 12

<210> 13

<211> 11338

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 13

<210> 14

<211> 11503

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 14

<210> 15

<211> 11503

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 15

<210> 16

<211> 11619

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 16

<210> 17

<211> 11619

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 17

<210> 18

<211> 11787

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 18

<210> 19

<211> 11848

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 19

<210> 20

<211> 11811

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 20

<210> 21

<211> 11841

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 21

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成序列

<400> 22

<210> 23

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成序列

<220>

<221> misc

<222> (17)..(17)

<223> X=L-環己基丙胺酸

<220>

<221> misc

<222> (28)..(28)

<223> X=胺基己酸

<400> 23

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成序列

<400> 24

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成序列

<400> 25

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 26

<210> 27

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 27

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 28

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 29

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 30

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 31

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 32

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 33

<210> 34

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 34

<210> 35

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gB(UL55)之表位

<400> 36

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 37

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 38

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 39

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 40

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 41

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 42

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 43

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 44

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 45

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 46

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 47

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 48

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 50

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 51

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-1之表位

<400> 52

<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自IE-2之表位

<400> 53

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自pp65之表位

<400> 54

<210> 55

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自pp65之表位

<400> 55

<210> 56

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自pp65之表位

<400> 56

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自pp65之表位

<400> 57

<210> 58

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自pp65之表位

<400> 58

<210> 59

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自pp65之表位

<400> 59

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自pp65之表位

<400> 60

<210> 61

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gH之表位

<400> 61

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 源自gH之表位

<400> 62

<210> 63

<211> 561

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 63

<210> 64

<211> 907

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 64

<210> 65

<211> 491

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 65

<210> 66

<211> 579

<212> PRT

<213> 巨細胞病毒

<400> 66

<210> 67

<211> 9449

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 67

<210> 68

<211> 9449

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 68

<210> 69

<211> 8986

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 69

<210> 70

<211> 8986

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 70

<210> 71

<211> 8038

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 71

<210> 72

<211> 8038

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用於表現五聚體CMV複合物之合成序列

<400> 72

Claims

一種由CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)組成之五聚體複合物，其可藉由包含以下之方法獲得：(i)在宿主細胞中藉由使用桿狀病毒共同表現CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)；(ii)自該宿主細胞及/或上清液中純化該共同表現獲得之五聚體複合物；及(iii)視情況在包含螯合劑及/或穩定劑之緩衝劑溶液中儲存該經純化五聚體複合物。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該宿主細胞係昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
如請求項2之五聚體複合物，其中該昆蟲細胞係Sf9、Sf21、HighFive、S2、Super Sf9-1、Super Sf9-2或Super Sf-9-3。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該共同表現步驟包括(i)用表現該等蛋白質且具有約10⁷pfu/mL或更高之效價之桿狀病毒感染宿主細胞，在感染時該宿主細胞具有約2*10⁶個細胞/mL之感染時細胞計數；(ii)在適宜條件下培養該等宿主細胞，及(iii)在感染後56h至65h之間收穫該等宿主細胞及/或上清液。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該等宿主細胞係在解凍及培養後第15天至第50天之間、較佳在第15天至第30天之間、較佳在第18天感染。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中純化法包括離子交換層析、疏水相互作用層析、粒徑篩析層析及/或親和層析。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該螯合劑係EDTA或EGTA。
如請求項7之五聚體複合物，其中EDTA係以20mM或以下、例如3mM或以下之濃度存在於該緩衝溶液中。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該穩定劑係聚乙二醇、精胺酸、山梨醇、甘油、蔗糖及/或NP-40。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該緩衝溶液包含Tris緩衝液、NaCl、KCl。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中編碼CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH及gL之開放閱讀框(ORF)係位於一或多個載體上、較佳位於單一載體上。
如請求項11之五聚體複合物，其中該載體含有用於在細菌(大腸桿菌(E.coli))、酵母(啤酒酵母(S.cerevisiae))、昆蟲細胞及/或哺乳動物細胞中繁殖之元件。
如請求項11或12之五聚體複合物，其中該等ORF係依5’至3’之以下順序位於該載體中：(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131A；或(ii)gL、UL128、UL130、UL131A、gH。
如請求項13之五聚體複合物，其中(a)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131A ORF係在3’方向上轉錄；(b)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在3’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131A ORF係在3’方向上轉錄； (c)在(ii)中，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，UL131A ORF係在3’方向上轉錄，且gH ORF係在3’方向上轉錄。
如請求項11至14中任一項之五聚體複合物，其中該等ORF中之每一者係由p10啟動子、polh啟動子、IE-1啟動子、mCMV啟動子、vp39啟動子、lef2啟動子、CAG啟動子或HepB SV40啟動子驅動且隨後係終止子序列，例如HSVtk終止子或SV40終止子。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該等蛋白質中之至少一者包含標籤。
如請求項16之五聚體複合物，其中該標籤係His標籤、Strep標籤、His-Strep標籤、StrepII標籤、Softag 1、TC標籤、myc標籤、FLAG標籤、HA標籤、V5標籤、Avi標籤、攜鈣蛋白(Calmodulin)標籤、聚麩胺酸鹽標籤、類澱粉蛋白β標籤、GST標籤、MBP標籤或S標籤。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該等蛋白質中之一或多者包含PreScission蛋白酶或PreScission及TEV蛋白酶，較佳該gH及/或gL蛋白質包含PreScission蛋白酶或PreScission及TEV蛋白酶。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其中該桿狀病毒中v-cath及/或ChiA活性係經功能性破壞。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其呈組合物之形式。
如前述請求項中任一項之五聚體複合物，其能夠誘導抑制上皮細胞/內皮細胞(Epi/EC)及纖維母細胞感染之中和活性。
一種用於產生由CMV蛋白質UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)組成之五聚體複合物之方法，其包含(i)在宿主細胞中藉由使用桿狀病毒共同表現CMV蛋白質 UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)及gL(UL115)；(ii)自該宿主細胞及/或上清液中純化該共同表現獲得之五聚體複合物；及(iii)視情況在包含螯合劑及/或穩定劑之緩衝劑溶液中儲存該經純化五聚體複合物。
如請求項1至21中任一項之五聚體複合物，其中該等蛋白質中之一或多者包含額外B-及/或T-細胞表位。
如請求項23之五聚體複合物，其中該T-細胞表位係CD4 T-細胞表位或CD8 T-細胞表位。
如請求項23或24之五聚體複合物，其中該表位係SEQ ID NO：22-66中所示表位中之任一者。
一種醫藥組合物或疫苗組合物，其包含如請求項1至21及23至25中任一項之五聚體複合物或可藉由如請求項22之方法獲得之五聚體複合物及視情況選用之醫藥上可接受之載劑或佐劑。
如請求項1至21及23至25中任一項之五聚體複合物或如請求項26之醫藥組合物，其中該等蛋白質中之至少一者、二者、三者或四者所來源之CMV株不同於其餘蛋白質所來源之CMV株。
如請求項27之五聚體複合物，其中該等CMV蛋白質係來自CMV株Towne(Towne具有以登錄號FJ616285.1寄存於NCBI基因庫之基因體)、Toledo(GU937742.1)、AD169(FJ527563)、Merlin(AY446894.2)、TB40/E(KF297339.1)、VR1814(GU179289)。
如請求項26之疫苗組合物，其進一步包含gB蛋白質、gM蛋白質、pp65蛋白質、IE-1蛋白質、gL/gH蛋白質之二聚體、gM/gN蛋白質之二聚體、gL/gH/gO之三聚體、包含一或多種衣殼或衣殼前體蛋白質、一或多種來自CMV之表面蛋白質及/或一或多種被蓋蛋白質之病毒樣粒子(VLP)。
如請求項26之疫苗組合物，其進一步包含編碼gB、gM、pp65、IE-1或IE-2之核酸分子。
一種疫苗組合物，其包含編碼如請求項1至25中任一項之五聚體複合物之載體。
如請求項31之疫苗組合物，其中該載體係基於DNA或RNA。
如請求項26至32中任一項之疫苗組合物，其進一步包含經修飾牛痘病毒安卡拉(Ankara)(MVA)，其包含一或多種由UL128、UL130、UL131、gH(UL75)及gL(UL115)構成之CMV五聚體複合物的蛋白質。
如請求項26至33中任一項之疫苗組合物，其用於對個體接種疫苗對抗CMV之方法中，該方法包含向該個體投與該疫苗組合物至該個體作為初免組合物及作為加強組合物，(i)gH/gL二聚體、(ii)UL130/UL131A-二聚體、(iii)gM/gN二聚體、(iv)gH/gL/UL128/UL130/UL131A-五聚體、(v)gB、(vi)gM、(vii)pp65、(viii)IE-1、(ix)IE-2、(x)包含一或多種由UL128、UL130、UL131、gH(UL75)及gL(UL115)構成之CMV五聚體複合物的蛋白質之經修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)、(xi)包含gB、gH/gL二聚體、pp65蛋白質或IE-1蛋白質之經修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)、(xii)包含一或多種衣殼或衣殼前體蛋白質、一或多種來自CMV之表面蛋白質或一或多種被蓋蛋白質之病毒樣粒子(VLP)、(xiii)編碼如(i)至(xii)中所定義之任一種化合物之核酸序列、(xiv)來自鞭毛蛋白之肽、(xv)CpG基序及/或(xvi)LCMV。
如請求項34之疫苗組合物，其中該加強組合物用作初免組合物且該初免組合物用作加強組合物。
一或多種載體，其包含編碼CMV蛋白質UL128、UL130、 UL131、gH及gL之開放閱讀框(ORF)。
如請求項36之載體，其中該載體含有用於在細菌(例如，大陽桿菌(E.coli))、酵母(例如，啤酒酵母(S.cerevisiae))、昆蟲細胞及/或哺乳動物細胞中繁殖之元件。
如請求項36或37之載體，其中該載體係桿狀病毒載體或桿狀病毒BacMam載體。
如請求項36至38中任一項之載體，其中在該桿狀病毒載體中，v-cath及/或ChiA基因經功能性破壞，(a)如請求項24至27中任一項之載體，其中該等ORF係依5’至3’之以下順序位於該載體中；(b)gH、gL、UL128、UL130、UL131；或(c)gL、UL128、UL130、UL131、gH。
如請求項39之載體，其中(a)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131 ORF係在3’方向上轉錄；(b)在(i)中，gH ORF係在3’方向上轉錄，gL ORF係在3’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，且UL131 ORF係在3’方向上轉錄；(c)在(ii)中，gL ORF係在5’方向上轉錄，UL128 ORF係在3’方向上轉錄，UL130 ORF係在3’方向上轉錄，UL131 ORF係在3’方向上轉錄，且gH ORF係在3’方向上轉錄。
如請求項36至40中任一項之載體，其中該等ORF中之每一者係由p10啟動子、polh啟動子、IE-1啟動子、mCMV啟動子、vp39啟動子、lef2啟動子、CAG啟動子或HepB SV40啟動子驅動且隨後係終止子序列，例如HSVtk終止子或SV40終止子。
一種疫苗，其包含如請求項36至41中任一項之載體及視情況選用之醫藥上可接受之載劑或佐劑。