TW201520226A

TW201520226A - 泛－ｅｌｒ＋ｃｘｃ趨化因子抗體

Info

Publication number: TW201520226A
Application number: TW103106908A
Authority: TW
Inventors: Catherine Brautigam Beidler; Jeffrey Streetman Boyles; Kristine Kay Kikly; Beth Ann Strifler; Derrick Ryan Witcher
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2015-06-01
Also published as: LT2970447T; ES2993153T3; CN109134652A; MX2015013053A; EA201591514A1; EP2970447A1; EP3348569B1; TN2015000377A1; TR201807613T4; HK1212714A1; CN105143259A; EP3348569A1; PH12015502090A1; AU2014237898B2; IL269387B; UA116008C2; ES2675404T3; CN105143259B; WO2014149733A1; BR112015020174A2

Abstract

本發明提供特異性結合七種人類ELR+ CXC趨化因子之抗體。本發明之該等抗體適用於治療各種發炎性疾病/自體免疫疾病(諸如發炎性腸病(IBD)、斑塊狀牛皮癬及掌蹠膿皰病)及癌症(諸如腎癌或卵巢癌)。

Description

泛-ELR + CXC趨化因子抗體

本發明係關於抗ELR⁺ CXC趨化因子之抗體及其在治療發病機制係藉由ELR⁺ CXC趨化因子介導之疾病中之用途。

ELR⁺ CXC趨化因子(所謂的由於趨化因子家族之成員均具有緊鄰其CXC基序之E-L-R胺基酸基序)在多種發病機制(包括嗜中性白血球遷移至發炎部位及血管生成)中起重要作用。嗜中性白血球導致若干急性及慢性發炎性疾病/自體免疫疾病(諸如發炎性腸病(IBD)、斑塊狀牛皮癬及掌蹠膿皰病)之發病。ELR⁺ CXC趨化因子亦在腫瘤形成及腫瘤轉移中起關鍵作用。此等趨化因子在腫瘤中高度表現。在腫瘤環境中，ELR⁺ CXC趨化因子涉及各種路徑，例如腫瘤部位之內皮細胞及白血球之血管生成、移動及侵入以及腫瘤細胞之增殖及存活。

趨化因子分成四個子族：CXC、CC、(X)C及CX3C。在CXC趨化因子中，一個胺基酸將前兩個半胱胺酸隔開(「CXC基序」)。ELR⁺ CXC趨化因子為CXCR1及/或CXCR2趨化因子受體之配位體，該等受體為特異性結合ELR⁺ CXC趨化因子之G蛋白偶合七跨膜區域型受體。七種人類ELR⁺ CXC趨化因子為人類Gro-α(亦稱為CXCL1)、人類Gro-β(亦稱為CXCL2)、人類Gro-γ(亦稱為CXCL3)、人類ENA-78(亦稱為CXCL5)、人類GCP-2(亦稱為CXCL6)、人類NAP-2(亦稱為CXCL7)及人類IL-8(亦稱為CXCL8)。所有ELR⁺ CXC趨化因子均結合CXCR2受體；此外，一些ELR⁺ CXC趨化因子結合CXCR1與CXCR2受體兩者(亦即CXCL6及CXCL8)，所有ELR⁺ CXC趨化因子導致活化路徑之冗餘。

之前已經描述了結合至個別ELR⁺ CXC趨化因子之抗體。已在早期臨床試驗中評估兩個抗CXCL8(IL-8)之單株抗體在發炎性疾病中之功效。(J Leuk Biol 66：401-410；J Immunol 181：669-679。)此外，WO 2008/130969揭示結合至人類IL-8(CXCL8)、人類Gro-α(CXCL1)、人類Gro-β(CXCL2)、人類Gro-γ(CXCL3)及人類ENA-78(CXCL5)之抗體。然而，所揭示內容未顯示抗體緊緊結合至GCP-2(CXCL6)且就結合至NAP-2(CXCL7)保持沉默。

然而，尚未揭示能夠結合且中和所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子之抗體。靶向一個或幾個人類ELR⁺ CXC趨化因子為其他ELR⁺ CXC趨化因子引發多種生物功能敞開機會。中和所有七個ELR⁺ CXC趨化因子可影響CXCR1⁺或CXCR2⁺細胞遷移至發炎部位之能力且可抑制血管生成。考慮到CXCR1及CXCR2受體活化路徑中有大量冗餘，仍需要以特異性且高親和性結合所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子之抗體。需要中和所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子之抗體。亦需要物理上穩定的抗體。因此宜提供能夠結合及中和所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子且為物理上穩定的七重特異性抗體。

本發明提供一種中和人類Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2及IL-8之抗體。本發明亦提供一種中和人類Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2及IL-8之抗體，其中該抗體在以下胺基酸處結合IL-8(SEQ ID NO：27)：Arg 6、Ile 10、Ala 35、Ile 40。本發明進一步提供一種中和人類Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2及IL-8之抗體，其中該抗體在以下胺基酸處結合IL-8(SEQ ID NO：27)：Arg 6、Ile 10、Ala 35、Ile 40及Leu 49。

本發明提供一種包含輕鏈及重鏈之抗體，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3且該HCVR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中LCDR1為RASQSISNNLH(SEQ ID NO：7)、LCDR2為YTSRSVS(SEQ ID NO：8)、LCDR3為GQNNEWPEV(SEQ ID NO：9)、HCDR1為GYEFTSYWIH(SEQ ID NO：10)、HCDR2為NISPNSGSANYNEKFKS(SEQ ID NO：11)、且HCDR3為EGPYSYYPSRXaaYYGSDL(SEQ ID NO：20)，其中Xaa為E或Q。

本發明在另一態樣中提供一種抗體，其中HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14。本發明進一步提供一種抗體，其中LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：16。

本發明提供一種抗體，其中重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：1或13。本發明亦提供一種抗體，其中輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：3或15。

本發明亦提供一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO：1或13之胺基酸序列之多肽的第一聚核苷酸序列；且包含編碼具有SEQ ID NO：3或15之胺基酸序列之多肽的第二聚核苷酸序列。

本發明提供一種包含上文所述之DNA分子的哺乳動物細胞，其中該細胞能夠表現包含具有SEQ ID NO：1或13之胺基酸序列之重鏈及具有SEQ ID NO：3或15之胺基酸序列之輕鏈的抗體。已知能夠表現功能性免疫球蛋白之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞及NS0細胞。用於本發明之較佳宿主細胞為NS0細胞。

本發明進一步提供一種製備包含胺基酸序列為SEQ ID NO：3或15之輕鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO：1或13之重鏈的抗體之製程，該製程包含在抗體得以表現之條件下培養上文所述之哺乳動物細胞及回收經表現之抗體。

本發明提供一種治療潰瘍性結腸炎、腎癌或卵巢癌之方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之本發明之抗體。

本發明進一步提供一種用於療法中之本發明之抗體。此外，本發明提供一種用於治療潰瘍性結腸炎、腎癌或卵巢癌之本發明之抗體。另外，本發明提供一種本發明之抗體用於製造供治療潰瘍性結腸炎、腎癌或卵巢癌之藥物之用途。

本發明提供一種包含本發明之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。

如本文所使用，術語「人類ELR⁺ CXC趨化因子」意欲係指具有E-L-R基序且結合至CXCR1及/或CXCR2受體之七種已知CXC趨化因子。人類ELR⁺ CXC趨化因子為人類Gro-α(亦稱為CXCL1)(SEQ ID NO：21)、人類Gro-β(亦稱為CXCL2)(SEQ ID NO：22)、人類Gro-γ(亦稱為CXCL3)(SEQ ID NO：23)、人類ENA-78(亦稱為CXCL5)(SEQ ID NO：24)、人類GCP-2(亦稱為CXCL6)(SEQ ID NO：25)、人類NAP-2(亦稱為CXCL7)(SEQ ID NO：26)及人類IL-8(亦稱為CXCL8)(SEQ ID NO：27)。總起來說，本文中將所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子稱為「人類泛-ELR⁺ CXC趨化因子」。

如本文所用，術語「抗體」意欲係指包含四條多肽鏈之單株免疫球蛋白分子，即兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈由二硫鍵相互連接。各重鏈包含重鏈可變區(HCVR)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)及輕鏈恆定區(CL)。HCVR及LCVR區可進一步再分成穿插著更保守區(稱為構架區(FR))之高變區(稱為互補性決定區(CDR))。各HCVR及LCVR由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。HCVR中之CDR區被稱為HCDR1、HCDR2及HCDR3。LCVR中之CDR區被稱為LCDR1、LCDR2及LCDR3。CDR含有與抗原形成特異性相互作用的大部分殘基。目前有三種用於序列描繪之抗體的CDR分配系統。Kabat CDR定義(Kabat等人,「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」美國國家衛生研究院,Bethesda,Md.(1991))係基於抗體序列可變性。Chothia CDR定義(Chothia等人,「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987)；Al-Lazikani等人,「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))係基於抗體之三維結構及CDR環之拓撲結構。Chothia CDR定義除HCDR1及HCDR2之外與Kabat CDR定義相同。出於本發明之目的，使用Kabat及Chothia定義之混合定義以定義CDR。HCVR及LCVR區中之胺基酸的分配符合Kabat編號規定。進一步瞭解術語「抗體」涵蓋抗體之任何細胞轉譯後修飾，該等轉譯後修飾包括(但不限於)醯化及糖基化。

如本文所使用，術語「中和抗體」意欲係指結合至ELR⁺ CXC趨化因子之抗體對由所述趨化因子誘導之生物活性產生抑制。由ELR⁺趨化因子誘導之生物活性的此抑制作用可藉由此項技術中已知之若干標準活體外檢定中之一或多種來評估(參見實例)。進一步瞭解如本文所用術語「抑制」或「中和」就本發明之抗體活性而言意謂拮抗、降低、或破壞由一或多個ELR⁺ CXC趨化因子誘導之生物活性之發展、強度或嚴重程度的能力。

如本文所使用，術語「七重特異性抗體」意欲涵蓋以高親和性(例如結合親和力(K_D)在約5×10^-11M至約1×10^-9M範圍內)結合所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子之抗體。

如本文所用，「患者」係指患有將受益於人類ELR⁺ CXC趨化因子含量之降低或由人類ELR⁺ CXC趨化因子誘導之生物活性的降低之疾病、病症或病狀的哺乳動物，較佳係指人類。

如本文所用，「治療(treatment/treating)」意欲係指減緩、控制或阻止本文所揭示之病症之發展的所有方法，但未必指完全消除所有病症症狀。治療包括投與本發明之抗體以治療患者(尤其人類)之疾病或病狀。

本發明之抗體以高親和性結合人類泛-ELR⁺ CXC趨化因子。舉例而言，本發明之抗體當表現為全長IgG4抗體時，如表面電漿子共振所量測以約5×10^-11M至約1×10^-9M(例如約1.0×10^-10M至約8.6×10^-10M)範圍內之結合親和力(K_D)結合所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子。本發明之抗體進一步特徵在於當其以特異性結合人類泛-ELR⁺ CXC趨化因子時，其不特異性結合至其他CXC趨化因子(例如來源於基質細胞之因子-1α(SDF-1α，亦稱為CXCL12))。

在一實施例中，本發明之抗體可具有重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含具有以下胺基酸序列之CDR區：HCDR1(SEQ ID NO：10)、HCDR2(SEQ ID NO：11)及HCDR3(SEQ ID NO：12)；且其中該輕鏈可變區包含具有以下胺基酸序列之CDR區：LCDR1(SEQ ID NO：7)、LCDR2(SEQ ID NO：8)及LCDR3(SEQ ID NO：9)。

在另一實施例中，本發明之抗體可具有重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含具有以下胺基酸序列之CDR區：HCDR1(SEQ ID NO：10)、HCDR2(SEQ ID NO：11)及HCDR3(SEQ ID NO：19)；且其中該輕鏈可變區包含具有以下胺基酸序列之CDR區：LCDR1(SEQ ID NO：7)、LCDR2(SEQ ID NO：8)及LCDR3(SEQ ID NO：9)。

在另一實施例中，本發明之抗體可包含具有SEQ ID NO：2或14之胺基酸序列的重鏈可變區及具有SEQ ID NO：4或16之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在又一實施例中，本發明之抗體可包含具有SEQ ID NO：1或13之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO：3或15之胺基酸序列的輕鏈。

抗體較佳地包含兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。具有如SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列的輕鏈較佳地由包含SEQ ID NO：6中所示之聚核苷酸序列的核酸編碼。具有如SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列的重鏈較佳地由包含SEQ ID NO：5中所示之聚核苷酸序列的核酸編碼。如SEQ ID NO：15中所示之輕鏈胺基酸序列較佳地由包含SEQ ID NO：18中所示之聚核苷酸序列的核酸編碼。如SEQ ID NO：13中所示之重鏈胺基酸序列較佳地由包含SEQ ID NO：17中所示之聚核苷酸序列的核酸編碼。

本發明之最佳實施例為包含兩條具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的相同重鏈及兩條具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的相同輕鏈之抗體。

本發明之抗體可併入適用於向患者投與之醫藥組合物中。通常該醫藥組合物包含本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及類似物。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含少量增強抗體之存放期或效力的助劑物質。

本發明之組合物可呈多種形式。較佳形式視預期之投藥模式及治療應用而定。典型之較佳組合物呈可注射或可輸注之溶液形式，諸如類似於用於人類之被動免疫接種之彼等物的組合物。較佳投藥模式為非經腸(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內)。在一實施例中，抗體藉由腹膜內或皮下注射投與。然而，如熟習此項技術者應瞭解投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。

補充性活性化合物亦可併入該等醫藥組合物中。在某些實施例中，本發明之抗體與一或多種適用於治療其中ELR⁺ CXC趨化因子活性為有害之病症的其他治療劑共調配及/或共投與。舉例而言，本發明之抗體可與一或多種化療劑(例如舒尼替尼(sunitinib)或順鉑(cisplatin))共調配及/或共投與。

本發明之醫藥組合物可包括「治療有效量」之本發明之抗體。「治療有效量」係指以必要的劑量及時段有效達成所需治療結果之量。抗體之治療有效量可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及重量以及抗體引起個體中期望性反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為抗體之治療有益效應超過其任何毒性或有害效應的量。

可調整給藥方案以提供最佳所需之反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單個藥團，可隨時間投與若干分次劑量，或劑量可按治療情況之緊急狀態所指示按比例減少或增加。

劑量值可隨待減輕之病狀的類型及嚴重程度而變化。進一步應瞭解對於任何特定個體，特定給藥方案應根據個別需要及投與組合物或監督組合物投與之人士的專業判斷隨時間進行調整。

本發明之抗體與人類ELR⁺ CXC趨化因子的特異性結合及中和允許該抗體用作受益於人類ELR⁺ CXC趨化因子生物活性之抑制作用的疾病及病症的治療劑。考慮到本發明之抗體結合及中和所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子之能力，該等抗體經由靶向單一人類ELR⁺ CXC趨化因子之單一療法及靶向多種人類ELR⁺ CXC趨化因子之組合療法提供優點。

在一實施例中，本發明提供一種治療潰瘍性結腸炎或諸如腎癌或卵巢癌之癌症的方法。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療潰瘍性結腸炎或諸如腎癌或卵巢癌之癌症的抗體。

本發明藉由以下非限制性實例進一步說明。

實例 抗體之表現及製備

本發明之抗體可如下表現及純化。將含有SEQ ID NO：5(編碼SEQ ID NO：1之重鏈多肽)及SEQ ID NO：6(編碼SEQ ID NO：3之輕鏈多肽)之DNA序列的表現載體用於轉染NS0細胞。由此表現載體產生之抗體為「抗體1」。

另外，將含有SEQ ID NO：17(編碼SEQ ID NO：13之重鏈多肽)及SEQ ID NO：18(編碼SEQ ID NO：15之輕鏈多肽)之DNA序列的表現載體用於轉染NS0細胞。由此表現載體產生之抗體為「抗體2」。

對於抗體1或抗體2，轉染池係依低密度塗佈，以供穩定表現之細胞長出近乎純系。在大量孔中篩選抗體表現，且隨後在無血清懸浮培養物中按比例擴大，準備用於生產。將澄清之介質(其中已有分泌之抗體)施加至已經用相容性緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水，pH 7.4)平衡之蛋白質A或G管柱。洗滌該管柱以移除非特異性結合之組分。藉由pH梯度(諸如0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)至0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5))溶離出結合之抗體。藉由SDS-PAGE偵測抗體溶離份，且隨後彙集。視期望用途而定，可視需要進一步純化。可使用常見技術將抗體濃縮及/或無菌過濾。可溶性聚集體及多聚體可藉由常見技術有效移除，該等技術包括粒徑篩析、疏水性相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析。經過此等層析步驟之後，抗體的純度可能超過99%。產物可在-70℃下立即冷凍或可凍乾。

與人類ELR ⁺ CXC趨化因子之結合親和力

表面電漿子共振分析法係採用Biacore 2000儀器及Biacore 2000分析軟體4.1版。使用製造商之EDC/NHS胺偶合法製備CM5晶片。簡言之，依10μL/min注射EDC/NHS之混合物(1：1)持續7分鐘，活化所有四個流槽之表面。用10mM醋酸鹽緩衝液(pH 4.5)稀釋蛋白質A至100μg/ml，且固定化，以便在10微升/分鐘之流動速率下注射7分鐘時可在所有4個流槽上達成約10,000RU。未反應之位置則經過乙醇胺依10微升/分鐘注射7分鐘而被阻斷。以10微升/分鐘注射兩次甘胺酸(pH 1.5)持續30秒，用於移除任何非共價締合之蛋白質。操作緩衝液為HBS-EP+。

用操作緩衝液稀釋抗體1或抗體2至2μg/mL，且在流槽(Fc)中捕捉約400-600RU。用操作緩衝液將配位體自100μg/mL稀釋至50nM，且隨後用操作緩衝液兩倍連續稀釋至3.125nM。每一種配位體濃度均依100μL/min重複注射150秒後，接著進入解離期。解離期對於所有配位體而言為1800秒。藉由以50μL/min注射10mM甘胺酸(pH 1.5)持續60秒對所有流槽進行再生。收集減去參考之資料作為Fc2-Fc1、Fc3-Fc1及Fc4-Fc1。在25℃下獲得該等量測值。使用「1：1(質量轉移)結合」結合模型評估各配位體之結合速率(k _on)及解離速率(k _off)。根據以下關係式由結合動力學計算親和力(K_D)：K_D=k _off/k _on。

人類ELR⁺ CXC趨化因子與抗體1及抗體2產生濃度依賴性結合反應。表1及表2概述抗體1及抗體2之k _on、k _off及K_D值。此等結果顯示抗體1及抗體2以高親和性結合所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子。

物理穩定性評估

蛋白質聚集及自締合為抗體中不合需要之特性，由於其可潛在加劇不良效應(諸如觸發免疫反應)。由此，使抗體維持在單體狀態為極其需要的。高分子量百分比(%HMW)聚集體指示蛋白質聚集及自締合。%HMW更高之聚集體指示蛋白質聚集/自締合增加及物理不穩定性增加。抗體1及抗體2之物理穩定性按以下進行測定。

抗體在4℃下於10mM檸檬酸鹽(pH 6+/- 150mM NaCl)中透析隔夜。第二天早晨，將該等樣品濃縮至50mg/mL，經0.2微米濾紙過濾，且隨後添加吐溫-80至0.02%之最終濃度。各樣品在25℃下培育指定時間。接著使用TSK3000SWXL(尺寸為30cm×0.78cm之5微米管柱)對可溶性聚集體形成進行SEC分析。移動相為50mM磷酸鈉(pH 7)，175mM NaCl，流動速率為0.5mL/min。以1μL注射液施加樣品且在280nm處監測以測定%HMW聚集體之增量(表3)。

50mg/mL調配物在25℃下培育1及4週以評估在應力條件下更長時期之穩定性。△%HMW聚集體藉由自1週或4週時點時之%HMW減去時間零時之%HMW聚集體(在表3中稱作『初始』)而測定。在1及4週之後，抗體1與抗體2兩者均顯示△%HMW小於1%，由此顯示良好的物理穩定性。

抗體1之抗體的抗原決定基定位

多種方法用來表徵抗體1之抗原決定基，該等方法包括西方墨點分析、抗體與若干ELR⁺ CXC趨化因子共結晶及針對結合及中和之突變分析。

西方墨點分析

為確定抗體1是否能夠結合線性或構形抗原決定基，使用還原性及非還原性條件進行西方墨點分析。使用NuPAGE® 4-12% Bis-Tris預製凝膠進行蛋白質電泳。向小型槽之內室(200mL)與外室(至少600mL)中添加NuPAGE® MES SDS操作緩衝液。用含有或不含NuPAGE® 10X樣品還原劑之NuPAGE® LDS 4X樣品緩衝液連續稀釋人類CXCL8(每個泳道400ng、100ng或25ng)。樣品在95℃下加熱2分鐘。上樣體積為每個泳道10μL樣品，且每個泳道5μL SeeBlue Plus2預染色標準標記物。凝膠在室溫下在200V下運行35分鐘。

使用具有iBlot® Transfer Stack,Nitrocellulose,Mini之iBlot®乾式墨點法系統將蛋白質轉移至PVDF。膜在室溫下用阻斷溶液(磷酸鹽緩衝鹽水中3%脫脂奶)阻斷1小時。向該阻斷溶液中添加抗體1至1μg/mL之最終濃度，且隨後在室溫下培育2小時。在初次培育之後，移除抗體/阻斷溶液，且用洗滌緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水+0.05%吐溫20)洗滌膜3次持續15分鐘。膜隨後在室溫下與HRP所結合之驢抗人Fc特異性IgG二次抗體(0.1μg/mL於阻斷溶液中)一起培育1小時。移除二次抗體之後，用洗滌緩衝液洗滌膜4次持續10分鐘。膜隨後與穩定的過氧化物溶液及魯米諾(Luminol)/增強劑溶液(Super Signal West Pico化學發光底物)之工作溶液一起培育5分鐘。將膜置放在具有CL-X Posure^TM膠片之X射線膠片盒中的塑膠膜保護器中30秒。使用Konica SRX-101系統使膠片顯色。

在非還原性條件下，在400ng之CXCL8濃度下，在約17kDa及約10kDa處出現兩個條帶。在100ng之CXCL8濃度下，在約10kDa處出現一個條帶。在25ng之CXCL8濃度下未出現條帶。在還原性條件下，在任何測試濃度下均未出現條帶。

結果顯示抗體1能夠結合非還原性及變性之人類CXCL8，但不能結合還原性及變性之人類CXCL8。因此，在CXCL8中需要兩個二硫鍵以維持抗體之抗原決定基。此等結果顯示抗體1之構形抗原決定基。

晶體結構分析

獲得人類CXCL8及食蟹獼猴CXCL2、CXCL3及CXCL7之Fab/抗原錯合物的晶體結構以確定抗體1之整個結合表面。野生型截短之人類CXCL81-66、人類CXCL8點突變體及食蟹獼猴CXCL7均在具有N端His-SUMO標籤之大腸桿菌中表現。此等蛋白質再摺疊；標籤裂解；且該等蛋白質藉由標準純化技術純化。食蟹獼猴CXCL2及CXCL3在HEK293 EBNA細胞中表現且藉由標準純化技術純化。二硫鍵之形成藉由胰蛋白酶消化及質量指紋分析確認，且活性藉由嗜中性白血球趨化性檢定確認。抗體1之Fab在HEK293 EBNA細胞中表現且藉由標準純化技術純化。Fab/抗原錯合物由向Fab中添加稍莫耳過量之抗原形成，接著進行粒徑篩析層析純化以移除過量游離抗原。錯合物經結晶，且藉由使用Buster 2.9.5(Global Phasing Ltd.)進行分子置換來解析晶體結構。

此等晶體結構確認抗體1之抗原決定基包括ELR⁺ CXC趨化因子之N端，但其亦顯示Fab與ELR⁺ CXC趨化因子之β1-β2環與β2及β3股之間的接點。由於晶體結構為可重疊的，故晶體結構亦顯示抗體特異性識別ELR⁺ CXC趨化因子之摺疊。亦觀測到許多氫鍵結與凡得瓦爾力之相互作用。最特別地，位於深的結合袋中之ELR基序之保守的R6側鏈由位於殘基W33、Y102及Y110處之Fab重鏈及位於殘基W94處之Fab輕鏈形成。野生型截短之人類CXCL8趨化因子亦與位於殘基E99處之Fab重鏈與位於N91主鏈羰基處之Fab輕鏈兩者氫鍵結。所觀測到之其他氫鍵位於野生型截短之人類CXCL8趨化因子之L5主鏈羰基與Fab輕鏈W94主鏈醯胺之間；野生型截短之人類CXCL8趨化因子之I10主鏈羰基與Fab重鏈S52側鏈之間；野生型截短之人類CXCL8趨化因子之K11側鏈與Fab重鏈T30及S31側鏈之間；野生型截短之人類CXCL8趨化因子之H33側鏈與Fab輕鏈W94主鏈羰基之間；A35主鏈醯胺與Fab重鏈N59側鏈之間；及野生型截短之人類CXCL8趨化因子之C50主鏈醯胺與Fab重鏈Y104主鏈羰基之間。另外，由於N端位於Fab重鏈CDR2與CDR3之間的凹槽中，故野生型截短之人類CXCL8趨化因子之N端殘基5至13與Fab多處接觸。另外，Fab重鏈CDR3環自此凹槽向外延伸且與野生型截短之人類CXCL8趨化因子之β2股上之非N端殘基 I40及β3股上之殘基Glu48、Leu49及Cys50相互作用。最後，野生型截短之人類CXCL8趨化因子中之β1-β2環的殘基33至36壓擠著Fab重鏈CDR2。

突變分析

在晶體結構中觀測到在抗體1 Fab與野生型人類CXCL8之間有若干關鍵接點，且經由結合動力學研究及U937-huCXCR2螢光成像讀板儀(FLIPR)中和人類CXCL8點突變體進一步測試。為研究此等關鍵接點，基於人類CXCL8序列(SEQ ID NO：27)製得若干點突變體(R6A、I10A、A35P、I40A及L49A)。根據標準技術表現、再摺疊及純化野生型、R6A、I10A、A35P、I40A及L49A人類CXCL8點突變體。二硫鍵之形成藉由胰蛋白酶消化及質量指紋分析確認，且活性藉由嗜中性白血球趨化性檢定確認。

用具有如上所述之Biacore 2000評估軟體4.1版之Biacore 2000儀器測試結合動力學。測試野生型及突變人類CXCL8之生物活性及使用U937-huCXCR2檢定測試抗體1的中和。U937-huCXCR2為由反轉錄病毒轉導用於表現人類CXCR2之單核細胞性細胞株。

在v形底96孔聚丙烯板之孔中用含有0.2% BSA之檢定緩衝液連續稀釋CXCL8突變體。配位體濃度為最終檢定濃度(最終檢定濃度在300nM至0.0051nM範圍內)之3倍。將細胞板及配位體板裝入螢光成像讀板儀(FLIPR-3,Molecular Devices)中，該讀板儀經程式化以轉移50μL配位體至細胞板之孔中。每隔1秒記錄螢光持續90秒。螢光變化[△相對螢光單位(DRFU)，最大RFU-最小RFU]由影像10至90計算。繪製DRFU對log(配位體濃度)圖表且藉由使用Graph Pad Prism之非線性回歸測定EC₅₀值。一式三份在三個檢定板上進行檢定。

用含有0.2% BSA之檢定緩衝液連續稀釋抗體1。抗體濃度為最終檢定濃度(最終濃度在10μg/ml至0.0195μg/ml範圍內)之3倍。用檢定緩衝液+0.2% BSA製得240nM(30×8nM之最終檢定濃度)之野生型人類CXCL8及CXCL8突變體的儲備溶液。在v形底96孔聚丙烯板之孔中將20μL配位體與180μL抗體1混合。配位體及抗體在室溫下培育30分鐘。將細胞板及配位體-抗體板裝入螢光成像讀板儀(FLIPR-3,Molecular Devices)中，該讀板儀經程式化以轉移50μL配位體-抗體至細胞板之孔中。每隔1秒記錄螢光持續90秒。螢光變化(DRFU)由影像10至90計算。繪製DRFU對log(抗體濃度)圖表且藉由使用Graph Pad Prism之非線性回歸測定IC₅₀值。一式三份在三個檢定板上進行檢定。

在表4中概述結合動力學、生物活性及中和結果。該等量測值在25℃下獲得。使用「1：1(質量轉移)結合」結合模型評估各配位體之結合速率(k _on)及解離速率(k _off)。根據以下關係式由結合動力學計算親和力(K_D)：K_D=k _off/k _on。

若干突變體去除對受體之活性(EC₅₀)且因此不能進行中和測試。應注意A35P突變體儘管對於受體具有完整活性但澈底消除中和活性。此等結果強調CXCL8抗原之結合界面中的關鍵接點(R6、I10、A35、I40及L49)對於抗體結合很重要。

總體而言，抗體1之抗原決定基定位分析顯示抗原之結合界面包括ELR⁺ CXC趨化因子之N端(胺基酸5至13)、β1-β2環(胺基酸33至36)及β2及β3股(胺基酸40、48至50)。此界面中之關鍵接點對於抗體結合很重要，其包括CXCL8中(SEQ ID NO：27)之胺基酸R6、I10、A35、I40及L49。

中和檢定 使用經人類CXCR2轉染之HMEC細胞活體外中和人類ELR ⁺ CXC趨化因子

由於所有ELR⁺ CXC趨化因子可結合CXCR2受體，故選擇表現CXCR2之細胞用於活體外研究。HMEC-huCXCR2為由反轉錄病毒轉導用於表現人類CXCR2受體之永生化人類內皮細胞株。表現人類CXCR2之HMEC細胞能夠誘導回應於人類、食蟹獼猴、大鼠及小鼠ELR⁺ CXC趨化因子之細胞內Ca²⁺流入。細胞內Ca²⁺流入可藉由螢光成像讀板儀(FLIPR)偵測。因此趨化因子中和應亦中和由此等趨化因子誘導之細胞內Ca²⁺流入。

HMEC-huCXCR2在37℃下維持在含5% CO₂之補充有10%胎牛血清、2×GlutaMax、1×非必需胺基酸、1μg/mL氫皮質酮、10ng/mL人類表皮生長因子及0.4μg/mL嘌呤黴素之MCDB 31培養基中。培養物維持在次匯合密度(50%至80%匯合)。用TrypLE Express收集細胞，在完全培養基中將細胞密度調整至3×10⁵個細胞/毫升，且向黑色透明底部的檢定板之孔中接種100μL細胞懸浮液。將細胞板在室溫下培育30分鐘以允許細胞沉至孔之底部，然後將板在37℃下在5% CO₂中培育隔夜。對於各檢定板，將一瓶Fluo-4NW試劑之內容物懸浮於10mL檢定緩衝液及100μL丙磺舒(probenecid)中以製得1×Fluo-4NW試劑。培育之後，抽吸培養基且向檢定板之各孔中添加100μL 1×Fluo-4NW溶液。板在37℃下培育30分鐘，接著在室溫下經歷另外30分鐘且避光。用含有0.2% BSA之檢定緩衝液連續稀釋抗體1。抗體濃度為最終檢定濃度(最終濃度在10μg/mL至0.0195μg/mL範圍內)之3倍。用檢定緩衝液+0.2% BSA製備300nM(30×10nM之最終檢定濃度)之配位體儲備溶液。在v形底96孔聚丙烯板之孔中將20μL配位體與180μL抗體混合。配位體及抗體在室溫下培育30分鐘。將細胞板及配位體-抗體板裝入螢光成像讀板儀(FLIPR-3,Molecular Devices)中，該讀板儀經程式化以轉移50μL配位體-抗體至細胞板之孔中。每秒記錄螢光持續90秒。螢光變化(DRFU)由影像10至90計算。繪製DRFU對log(抗體濃度)圖表且藉由使用Graph Pad Prism之非線性回歸測定IC₅₀值。一式三份在三個檢定板上進行檢定。資料以三次重複之平均值表示。

結果概述於表5中。此等結果顯示抗體1能夠中和所有七種人類ELR⁺ CXC趨化因子。IC₅₀值表示為μg/mL之抗體(標準差在圓括號中)。使用CXCL8之72胺基酸與77胺基酸兩個形式。資料為2至5次重複之平均值。

使用主要人類嗜中性白血球進行由人類CXCL8或CXCL1誘導之趨化性的活體外中和

選擇使用人類嗜中性白血球之趨化性檢定以測定在天然表現CXCR1與CXCR2二者之細胞中抗體1之中和活性。將來自健康志願者之末梢血液抽入兩個10mL肝素鈉管子中。為分離嗜中性白血球，在四個15mL管子中將5mL血液在5mL Polymorphprep上分層。將管子在18℃下以470×g離心30分鐘。將血漿及頂部細胞帶(單核細胞)移除且丟棄。自四個管子收集第二條帶(嗜中性白血球)且添加相同體積之 PBS。將管子在18℃下以400×g離心10分鐘。用12mL PBS洗滌集結粒，如之前離心，用11mL HBSS/BSA(7.5mg/mL BSA,HBSS)重新懸浮集結粒。用12mL HBSS/BSA及5μM CMFDA懸浮60×10⁶個細胞且在37℃下培育30分鐘。培育後，將管子離心以使細胞集結，用12mL HBSS/BSA洗滌一次，且隨後用12mL HBSS/BSA(5×10⁶個細胞/毫升)重新懸浮該等細胞。

使用HBSS/BSA(稀釋液1)將抗體1及同型對照(人類IgG4抗體)稀釋至1495nM，且隨後用HBSS/BSA按1：5連續稀釋。用HBSS/BSA將CXCL8稀釋至20nM。用HBSS/BSA將CXCL1稀釋至10.1nM。

將70μL抗體1或HBSS/BSA與70μL CXCL8或CXCL1溶液混合且在室溫下培育約30分鐘。將30μL混合物一式三份分配至ChemoTx板之下部腔室孔中。僅含HBSS/BSA(無趨化因子或抗體)之孔將顯示背景信號。將ChemoTx濾紙置放在下部腔室上方且在各孔上方分配50μL(250,000個細胞)。ChemoTx板在5% CO₂中在37℃下培育3小時。在培育之後，用PBS自上表面沖洗細胞且移除ChemoTx濾紙。僅使用底部偵測器在485/535下讀取螢光(Wallac Victor³ 1420計數器)。自測試孔螢光減去背景孔(僅含HBSS/BSA)之平均螢光，且用Excel計算平均值及標準差。

CXCL8濃度為5nM時，抗體1(MW 150,000kDa)之IC₅₀為26.4(±0.236)nM。CXCL8濃度為10nM時，抗體1之IC₅₀為43.7(±0.086)nM。CXCL1濃度為5nM時，抗體1之IC₅₀為18.5(±0.158)nM。CXCL1濃度為20nM時，抗體1之IC₅₀為40.3(±0.112)nM。在CXCL1及CXCL8之所有測試濃度下，同型對照抗體不影響趨化性。資料顯示抗體1依劑量依賴性方式可阻斷人類CXCL8或CXCL1之趨化性活性，而趨化性活性不受同型對照抗體影響。

小鼠中活體內急性DSS結腸炎模型

硫酸葡聚糖鈉(DSS)為潰瘍性結腸炎(UC)之最常使用的模型。在此模型中，DSS為添加至飲用水中而誘導類似於UC之急性疾病的化學刺激劑。DSS結腸炎急性期之特徵在於嗜中性白血球募集在黏膜及黏膜下層，及ELR⁺ CXC趨化因子之表現增加。然而，慢性暴露於DSS會造成嚴重腸損害及顯著的體重減輕，此點並不適合結腸炎模型。為適應此模型之急性性質，以預防性方式使用抗體1以測試其抑制嗜中性白血球之募集及結腸炎之發展的能力。在此模型中應注意小鼠CXCL5(LIX)蛋白質在結腸組織中顯著增加(Kwon 2005)；然而，抗體1並未中和此小鼠趨化因子。

獲得8至10週大，體重為18至22g之C57BL/6小鼠。藉由心臟穿刺採集血液且分析以建立基線。為誘導發結腸炎，小鼠接受含2.5% DSS(MW=36,000至50,000)之飲用水5天(天數1至5)接著接受6天不含DSS的水(顯示出急性炎症)。對照健康小鼠僅接受水(「不含DSS」組)。接受DSS之小鼠在第0天、第2天、第4天及第8天藉由皮下注射給予人類IgG4對照抗體(25mg/kg)或抗體1(25mg/kg)。每日記錄體重。用於各處理之小鼠數目為9(除5隻健康小鼠用於健康「不含DSS」組之外)。該研究以一式四份進行。

如表6中所示，接受人類IgG4對照抗體之DSS小鼠的體重在第5天與第8天之間顯著減輕。在結腸炎誘導之前及在疾病之急性期期間接受抗體1之DSS小鼠顯示在第5天與第8天之間體重減輕小於經人類IgG4對照抗體處理之彼等DSS小鼠(在第8天抗體1之94.0%初始體重相較於IgG4對照之85.3%初始體重)。此等結果顯示全身性投與抗體1有效減輕DSS誘導之結腸炎中的體重減輕，支持抗體1中和某些小鼠ELR⁺ CXC趨化因子之活性且減少嗜中性白血球募集至結腸之結論。

786-O透明細胞腎細胞異種移植模型中之活體內中和

786-O腎細胞癌(RCC)細胞與基質膠1：1混合且以每次注射3.0×10⁶個細胞經皮下植入無胸腺裸雌性小鼠之右後側腹中。在連續給藥方案下，腫瘤體積達100mm³之帶有786-O異種移植的小鼠每天兩次經口管飼10mg/kg舒尼替尼(sunitinib)直至小鼠即使在用舒尼替尼處理下開始取得腫瘤生長方面之進展如同對照處理之小鼠(IgG4及10%媒劑)。將用舒尼替尼療法在腫瘤生長方面取得進展之小鼠隨機分成2組。一個組接受每天兩次10mg/kg舒尼替尼加每週一次20mg/kg對照IgG4抗體。另一組接受每天兩次10mg/kg舒尼替尼加每週一次20mg/kg抗體1。表7中顯示平均腫瘤體積(標準誤差在圓括號中)。向舒尼替尼處理中添加抗體1隨時間推移顯著降低腫瘤生長(p<0.0001)，表明抗體1使透明細胞RCC腫瘤對舒尼替尼處理再敏感。

SKOV3-Luc卵巢癌異種移植模型中之活體內中和

SKOV3-Luc為表現螢火蟲螢光素酶基因之人類卵巢癌細胞株。SKOV3-Luc細胞通常用於活體內以建立人類卵巢腺癌腫瘤生長。

SKOV3-Luc卵巢癌細胞與基質膠1：1混合且以每次注射3.0×10⁶個細胞經皮下植入無胸腺裸雌性小鼠之右後側腹中。在異種移植生長至200mm³之平均腫瘤體積之後，根據腫瘤體積在基線將小鼠隨機分成4組。小鼠藉由腹膜內注射接受對照IgG4抗體(2.5mg/kg每週一次)、順鉑(2.5mg/kg每週一次)、抗體1(20mg/kg每週一次)或順鉑(2.5mg/kg每週一次)與抗體1(20mg/kg每週一次)之組合。表8中顯示腫瘤生長。順鉑單一療法與同型對照相比未顯示統計學上顯著抑制腫瘤生長。然而，順鉑與抗體1之組合與同型對照及順鉑單一療法相比顯示統計學上顯著抑制腫瘤生長(p0.001)，表明抗體1協同加強SKOV3-Luc卵巢癌異種移植模型中之化學療法。

序列

抗體1重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：1

抗體1重鏈可變區：SEQ ID NO：2

抗體1輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：3

抗體1輕鏈可變區：SEQ ID NO：4EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYTSRSVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCGQNNEWPEVFGGGTKVEK

抗體1重鏈DNA序列：SEQ ID NO：5

抗體1輕鏈DNA序列：SEQ ID NO：6

抗體1/抗體2 LCDR1：SEQ ID NO：7 RASQSISNNLH

抗體1/抗體2 LCDR2：SEQ ID NO：8 YTSRSVS

抗體1/抗體2 LCDR3：SEQ ID NO：9 GQNNEWPEV

抗體1/抗體2 HCDR1：SEQ ID NO：10 GYEFTSYWIH

抗體1/抗體2 HCDR2：SEQ ID NO：11 NISPNSGSANYNEKFKS

抗體1 HCDR3：SEQ ID NO：12 EGPYSYYPSREYYGSDL

抗體2重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：13

抗體2重鏈可變區：SEQ ID NO：14

抗體2輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：15

抗體2輕鏈可變區：SEQ ID NO：16 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYTSRSVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCGQNNEWPEVFGGGTKVEIK

抗體2重鏈DNA序列：SEQ ID NO：17

抗體2輕鏈DNA序列：SEQ ID NO：18

抗體2 HCDR3：SEQ ID NO：19 EGPYSYYPSRQYYGSDL

HCDR3共同序列：SEQ ID NO：20 EGPYSYYPSRXaaYYGSDL其中Xaa為E或Q

人類Gro-α(CXCL1)：SEQ ID NO：21 ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTEVIATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN

人類Gro-β(CXCL2)：SEQ ID NO：22 APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTEVIATLKNGQKACLNPASPMVKKIIEKMLKNGKSN

人類Gro-γ(CXCL3)：SEQ ID NO：23 ASVVTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTEVIATLKNGKKACLNPASPMVQKIIEKILNKGSTN

人類ENA-78(CXCL5)：SEQ ID NO：24 AAVLRELRCVCLQTTQGVHPKMISNLQVFAIGPQCSKVEVVASLKNGKEICLDPEAPFLKKVIQKILDGGNKEN

人類GCP-2(CXCL6)：SEQ ID NO：25 VSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTIGKLQVFPAGPQCSKVEVVASLKNGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGNKKN

人類NAP-2(CXCL7)：SEQ ID NO：26 AELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLAGDESAD

人類IL-8(CXCL8)：SEQ ID NO：27 SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS

<110> 美國禮來大藥廠

<120> 泛-ELR⁺ CXC趨化因子抗體

<130> X19897

<150> 61/792800

<151> 2013-03-15

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 1

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 2

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 3

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 4

<210> 5

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 5

<210> 6

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 6

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 7

<210> 8

<211> 7

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<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

<400> 8

<210> 9

<211> 9

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<400> 9

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

<400> 12

<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

<400> 13

<210> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

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<210> 15

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<223> 合成構築體

<400> 15

<210> 16

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<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

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<210> 17

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

<400> 17

<210> 18

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

<400> 18

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11..(11)

<223> Xaa位置11為Glu或Gln

<400> 20

<210> 21

<211> 73

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

<210> 22

<211> 73

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

<210> 23

<211> 73

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

<210> 24

<211> 74

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

<210> 25

<211> 75

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

<210> 26

<211> 70

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

<210> 27

<211> 72

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Claims

一種結合人類Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2及IL-8之抗體，該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3且該HCVR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中LCDR1為RASQSISNNLH(SEQ ID NO：7)、LCDR2為YTSRSVS(SEQ ID NO：8)、LCDR3為GQNNEWPEV(SEQ ID NO：9)、HCDR1為GYEFTSYWIH(SEQ ID NO：10)、HCDR2為NISPNSGSANYNEKFKS(SEQ ID NO：11)且HCDR3為EGPYSYYPSRXaaYYGSDL(SEQ ID NO：20)，其中Xaa為E或Q。
如請求項1之抗體，其中該LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：4或16且該HCVR為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈之胺基酸為SEQ ID NO：3或15且其中該重鏈之胺基酸為SEQ ID NO：1或13。
一種結合人類Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2及IL-8之抗體，該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3且該HCVR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中LCDR1為RASQSISNNLH(SEQ ID NO：7)、LCDR2為YTSRSVS(SEQ ID NO：8)、LCDR3為GQNNEWPEV(SEQ ID NO：9)、HCDR1為GYEFTSYWIH(SEQ ID NO：10)、HCDR2為NISPNSGSANYNEKFKS(SEQ ID NO：11)且HCDR3為EGPYSYYPSRXaaYYGSDL(SEQ ID NO：20)，其中Xaa為E或 Q。
如請求項4之抗體，其中該HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14。
如請求項4之抗體，其中該LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：4或16。
如請求項4之抗體，其中該HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：2且該LCVR之該胺基酸序列為SEQ ID NO：4。
如請求項4之抗體，其中該重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：1且該輕鏈之該胺基酸序列為SEQ ID NO：3。
如請求項4之抗體，其中該抗體包含兩條具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈及兩條具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的輕鏈。
一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO：1或13之胺基酸序列之多肽的第一聚核苷酸序列；且包含編碼具有SEQ ID NO：3或15之胺基酸序列之多肽的第二聚核苷酸序列。
一種哺乳動物細胞，其包含如請求項10之DNA分子，其中該細胞能夠表現如請求項1至9中任一項之抗體。
一種製備如請求項1至9中任一項之抗體的製程，該製程包括在可以表現該抗體之條件下培養如請求項11之哺乳動物細胞，及回收該表現之抗體。
一種藉由如請求項12之方法製備的抗體。
一種如請求項1至9及13中任一項之抗體的用途，其用於製造供治療患者潰瘍性結腸炎、腎癌或卵巢癌之藥物。
如請求項1、2、4至9及13中任一項之抗體，其用於醫療法。
如請求項1、2、4至9及13中任一項之抗體，其用於治療潰瘍性結腸炎、腎癌或卵巢癌。