TW201529079A - 龍葵萃取物用於降低體脂肪、體重及治療肥胖性肝炎 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種組合物包含龍葵水萃取物用於降低體重和降低體脂肪之用途，其中該組合物進一步用於治療或預防肥胖性肝炎。

Description

龍葵萃取物用於降低體脂肪、體重及治療肥胖性肝炎

本發明是關於一種使用龍葵萃取物用於降低體脂肪、體重及治療肥胖性脂肪肝病之用途。

根據台灣肝病防治學術基金會調查，發現脂肪肝已是台灣國人普遍的肝臟問題，其罹患比率高達40%。脂肪肝雖然不會對生命造成立即危害，不過卻是健康的一個重要警訊，若未即時治療可能進而造成肝硬化、肝癌。調查亦顯示，酗酒、肥胖及高血脂控制等都是造成脂肪肝的危險因子，體重過重者，有76.3%有脂肪肝。此外脂肪肝罹患率亦和肥胖具顯著相關性。

肝病基金會曾經對九千個上班族做超音波檢查，發現罹患脂肪肝的比例高達43%，男性上班族更達49%。另有研究指出，台灣成人脂肪肝盛行率超過三成，每三至四個成人就有一人有脂肪肝，遠高於過去被視為「國病」的B型肝炎和C型肝炎。脂肪肝已經成為台灣人最普遍的肝病。

在臨床上所謂的「脂肪肝」是指肝臟內所屯積的脂肪(主要為三酸甘油脂)的重量超過全肝臟重量的百分之五，或是在肝組織切片中超 果百分之十以上的肝細胞呈現脂肪空泡變性的現象而謂之；而輕度脂肪肝是含脂肪變性的肝細胞少於33%，中度為介於33-66%之間而重度則佔66%。

肥胖性脂肪肝病，從單純脂肪肝、脂肪肝炎、脂肪纖維化到 脂肪肝硬化都包含在內。而病程中的脂肪變性及其所衍生成NASH的真正致病機轉目前尚不明確，但近年來大量的臨床實驗及動物實驗研究所得的假說，得知以氧壓力、胰島素抗性以及脂質過氧化作用(lipid peroxidation)導致肝臟發生瀰漫性脂肪浸潤、炎症反應、壞死、凋亡、再生損害以及肝星狀細胞活化等一系列病理連鎖性免疫攻擊反應。

龍葵(Solanum nigrum)全草含甾類生物鹼；茄邊鹼(澳洲茄邊鹼Solamargine[C₄₅H₇₃O₁₅N])、茄解鹼(澳洲茄鹼Solasonine[C₄₅H₇₃O₁₆N])、茄微鹼(Solavilline[C₅₀H₈₁O₂₀N])、茄達鹼(Solasodamine[C₅₁H₈₂O₂₀N])、醣苷類、醣蛋白、多酚及皂苷。龍葵在台灣民間俗稱黑甜仔菜，屬野生植物，為農田雜草，民間有取其幼苗，嫩葉炒熟當菜食用，也有取其成熟的果實食用。龍葵在醫療上的功能，具有防止自由基所造成的DNA傷害、保肝作用、保護肝臟免於四氯化碳誘導的肝損傷、誘導氮氧化物的產生。關於龍葵萃取物的研究包含在TPA所刺激的乳癌細胞MCF-7中，能抑制細胞內轉錄因子NF-κ B和AP-1與DNA結核的活性；在墨西哥的傳統醫學中已被視為鎮定神經之藥物；具有抑制小鼠肉瘤S-180的活性；抑制乳癌細胞MCF-7的生長及誘導細胞凋亡；另外中國大陸亦有多項醫學功能的報導，包含用於肺癌、膀胱癌治療、輔助腫瘤治療及抑制腸癌乙烯轉移酵素活性。

本發明是利用一種包含龍葵萃取物及其活性成分的組合物與高脂肪飼料合併餵食小鼠10週，結果證實該組合物具有潛力發展為健康食品以降低高脂肪誘導之體重，體脂肪及肥胖性肝炎。

是以，本發明是一種組合物用於製備降低體脂肪或降低體脂肪之醫藥組合物之用途，其中該組合物包括：一龍葵萃取物；在一較佳實施例中，該醫藥組合物進一步用於治療及預防肥胖性肝炎，而該龍葵萃取物為龍葵葉水萃物，其食用萃取物之有效劑量為每日總食量乾重之0.5%~2%；而該龍葵萃取物進一步包含活性成分係選自由酚酸、類黃酮及多酚所組成之群組。

在一具體實施例中，該組合物可由榨取法、萃取法或蒸餾法所獲得；在一較佳實施例中，本發明之龍葵萃取物係將龍葵葉乾燥磨碎後，經溶解、過濾、離心及乾燥方式獲得。

在一具體實施例中，該組合物降低血液中的丙胺酸轉胺酶、天門冬胺轉胺酶、鹼性磷酸酶，另一方面，該組合物更具有降低脂質過氧化作用、抗氧化或抑制發炎反應之功效。

在一具體實施例中，該組合物可增加血清中高密度脂蛋白膽固醇、減少血清中低密度膽固醇或降低血清中或肝臟中三酸甘油脂及總膽固醇含量，另一方面，該組合物具有抑制因高脂肪所誘導之肝臟脂肪堆積及發炎蛋白的功效。

在一具體實施例中，該組合物可包括一醫藥上可接 受之載劑，在另一具體實施例中，該組合物可用於製備藥品、膳食補充物、食品、保健食品。

本文中所使用的術語「醫藥上可接受之載劑」意指 為了藥物製造過程之需要、便於藥物劑量調配，或不同投藥劑型等需求，根據習知醫藥組合技術將醫藥組合物與醫藥可接受載劑混合，合適的醫藥可接受載劑為此項技術領域中所熟知，其中該載劑可有廣範之形式。某些醫藥可接受載劑之處方可見於由美國醫藥協會及英國醫藥協會(American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Society of Great Britain)所出版的醫藥賦形劑手冊(The Hand Book of Pharmaceutical Excipients)中。舉例而言，錠劑、膠囊、凝膠、溶液或懸浮液亦可包含下述成分：醫藥可接受賦形劑或載劑，其為無毒性、惰性固體或半固體、稀釋劑、封裝物質(encapsulating material)、凝膠基劑或任何形式之配方佐劑，例如：微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)、葡萄糖、脫脂奶粉、澱粉、矽石、無水磷酸氫鈣、磷酸鎂、硬脂酸、硬脂酸鎂，或人工香料等物質。

本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明 之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。

本文中的用語「或」其意同「及/或」。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能 更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

圖1顯示HPLC分析龍葵萃取物之多酚類組成比例。高效液相色譜的九種標準多酚色譜圖。1：沒食子酸(Gallic acid)，2：原兒茶酸(Protocatechuic acid)，3：兒茶素(Catechin)，4：沒食子兒茶素沒食子酸酯(Gallocatechin gallates)，5：咖啡酸(Caffeic acid)，6.表兒茶酚(Epicatechin)，7.對-香豆酸(P-counaric acid)，8.蘆丁(Rutin)，12：槲皮素(Quercetin)，13：柚皮素(Naringenin)。

圖2顯示餵食SWE之高脂肪老鼠之體重有明顯下降的表現。此數據是從每組12隻C57BL/6小鼠之平均值±標準差。每組(不同符號代表：對照組、高脂肪飲食組、HFD+0.5%SWE、HFD+1%SWE和HFD+2%SWE)平均值有顯著的差別。(p<0.05)#,p<0.05高脂肪飲食組和對照組別有顯著差異。*,p<0.05 SWE和HFD組別有顯著差異。

圖3顯示SWE顯著的降低高脂肪老鼠之腎周邊脂肪、睪丸脂肪和體脂肪。#,p<0.05和高脂肪飲食組別有顯著差異。*,p<0.05和對照組別有顯著差異。

圖4顯示SWE降低高脂肪誘導肥胖之小鼠肝臟及脂肪之重量。數據顯示每組12隻C57BL/6小鼠之平均值±標準差。#,p<0.05使用Student’s t檢定和對照組別比較有顯著差異。*,p<0.05由ANOVA統計和HFD組別比較後有顯著差異。

圖5顯示SWE減少高脂肪誘導肥胖之小鼠的肝脂肪空泡。利 用肝臟切片以蘇木紫&伊紅染色。肝臟切片光顯微圖片分別為(A)對照組、(B)高脂肪飲食組、(C)HFD+0.5% SWE組、(D)HFD+1% SWE組、(E)HFD+2% SWE組。(400X倍)黑色箭頭指向白色肝脂肪空泡。

圖6顯示SWE減少肥胖小鼠發炎蛋白表現量。肝臟切片光顯 微圖片分別為(A)對照組、(B)高脂肪飲食組、(C)HFD+0.5% SWE組、(D)HFD+1% SWE組、(E)HFD+2% SWE組。(400X倍)圖6A為IL-6在肝臟過度表現量之結果。圖6B為TNF-α在肝臟過度表現量之結果。黑色箭頭在圖6A代表IL-6表現位置而在圖6B代表TNF-α表現位置。白色箭頭為發炎反應表現位置。

圖7顯示利用HFD誘導脂質過氧化作用及抑制抗氧化酵素， 經SWE處理後有增加抗氧化酵素的趨勢。圖六ABCD分別使用不同檢測儀器如下：(A)MDA檢測組、(B)超氧化物岐化酶(SOD)檢測、(C)過氧化氫酶(Catalase)活性檢測、(D)麩胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)檢測。數據顯示每組12隻C57BL/6小鼠之平均值±標準差。#,p<0.05使用Student’s t檢定和對照組別比較有顯著差異。*,p<0.05由ANOVA統計和HFD組別比較後有顯著差異。

圖8顯示SWE增加AMPK磷酸化及降低TG合成之蛋白質表現量。蛋白質由西方墨點法偵測。數據顯示每組12隻C57BL/6小鼠之平均值±標準差。#,p<0.05使用Student’s t檢定和對照組別比較有顯著差異。*,p<0.05由ANOVA統計和高脂肪飲食組別比較後有顯著差異。

圖9顯示SWE治療降低膽固醇合成之蛋白質。蛋白質由西方墨點法偵測。數據顯示每組12隻C57BL/6小鼠之平均值±標準差。#,p<0.05 使用Student’s t檢定和對照組別比較有顯著差異。*,p<0.05由ANOVA統計和OA誘導組別比較後有顯著差異。

圖10顯示SWE可以增加CPT-1及PPAR-α表現量。#,p<0.05使用Student’s t檢定和對照組別比較有顯著差異。*,p<0.05由ANOVA統計和OA誘導組別比較後有顯著差異。

以下將以圖示及詳細說明清楚說明本發明之精神，如熟悉此技術人員在瞭解本發明之實施例後，當可由本發明所教示之技術，加以改變及修飾，其並不脫離本發明之精神與範圍。

實施例一 龍葵水萃取物(SWE)的製備及分析

龍葵(S.nigrum Linn.)為茄科茄屬一年生草本植物，收集於台灣中部苗栗山區，龍葵葉水萃取物(SWE)的製備方法為先將龍葵洗淨並浸泡於水中30分鐘後加熱至100℃，連續加熱40分鐘。將所得到的水萃取液過濾並濃縮，放置於水浴槽中加熱90℃直到成為乳狀，隨後放置烘箱中以70℃乾燥。

SWE總多酚含量分析

取沒食子酸(gallic acid)(5mg/mL)以甲醇溶解後，分別製成不同濃度(50,100,250,500μg/mL)的標準品，各取20μL的不同濃度的標準品以二次水補體積至1.6mL，接著加入2N Folin-Ciocalteu酚試劑100μL後，再加入20% Na₂CO₃ 300μL後混合均勻，在40℃下反應40分鐘，以725nm測吸光值，同時處理一組以二次水代替標準品同樣進行加試劑與加熱步驟的組別進行歸零，以吸光值為結果繪製標準曲線。取20μL待測樣品(濃 度為1mg/mL)以相同的方式進行處理，依回歸方程式計算SWE中總多酚類的含量。

如Table 1.為SWE主成成份：

SWE：龍葵葉水萃取物。以沒食子酸和槲皮素為標準值。

SWE碳水化合物含量分析

此原理乃根據五碳糖(pentose)和六碳糖(hexose)在酸性、高溫的條件之下會因脫水作用分解成喃甲醛(furfural)，喃甲醛進一步與酚(phenol)反應而生成橘黃色產物，最後，以吸光值變化換算出多醣類含量。配製10mg/mL之SWE，加入5%酚溶液0.5mL，再加入2.5mL濃硫酸混合均勻(待測液：5%酚：濃硫酸=1：1：5)，於100℃水浴20分鐘，待溫度冷卻後，以490nm波長測定吸光值。利用0，10，20，30，40，50μg/ml glucose為標準品。

SWE蛋白含量分析

蛋白質的定量採用Broadford蛋白質濃度檢測方法。取30μL SWE，加入1mL藍色染劑(Coomassie brilliant blue)，在室溫下反應1分鐘後，以波長595nm下測定吸光值，以0，0.2，0.4，0.8，1.6mg/mL BSA為 標準品。

SWE酚分析

a.HPLC標準品溶液配製：以二次水配製0.05mg/mL標準品。b.HPLC使用之龍葵萃取物配製：以二次水配製10mg/mL SWE後，再以0.22μm filter過濾。c.HPLC分析：HPLC分析條件如下---使用Mightysil RP-18 GP 250管柱，偵測波長525nm，注射體積為10μL，最後以偵測器進行分析。龍葵主要的多酚類組成比例請見Table 2，如下表：

實施例二 動物試驗

高膽固醇飲食誘導小鼠形成體脂肪過量堆積之模式

待小鼠適應環境一週後，開始進入本試驗。隨機將動物分成四組，控制組(Group A)、誘導組(Group B)、試驗組I(SWE 0.5%，Group C)與試驗組II(SWE 1%，Group D)，每組10隻。其詳細分組如下：(Table 3)

Group A：控制組，餵食標準配方飼料

Group B：誘導組，餵食高油脂飼料(high fat diet,HFD)

Group C：HFD飼料+SWE 0.5%。

Group D：HFD飼料+SWE 1%。

ND：正常飲食組；HFD：高脂肪飲食組。

動物血脂肪測定分析

動物抽取血液樣品以及肝臟組織前，已先將動物空腹12-14小時為原則，採樣後進行下列項目分析：三酸甘油酯(triacylglycerol,TG)

三酸甘油酯經由酵素自解脂酶(lipase)水解後，生成甘油和 脂肪酸，再透過一連串氧化還原作用產生過氧化氫，再加入4-氯苯酚與4-胺基安替比林(4-aminophenazone)作用，經過氧化氫酵素氧化後得醌亞胺(quinoneimine)產物，在波長500nm下，即可透過吸光值變化反映三酸甘油酯之濃度。取10μL血清加入反應溶液作用，在室溫下反應10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_sample。取10μL的200mg/dL標準品，加入反應溶液作用，在室溫下反應10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_standard。欲求得血清中三酸甘油酯的濃度，則將A_sample除以A_standard在乘以200即為血清中三酸甘油酯的濃度(mg/dL)。

總膽固醇(total cholesterol,TC)

平時生物體內的膽固醇是以乙醯態的膽固醇(cholesterol ester)方式儲存於細胞中，故藉由膽固醇乙醯水解酶(cholesterol esterase)，將乙醯化膽固醇水解為膽固醇和脂肪酸，再經過膽固醇氧化脢氧化成膽烯(cholesterol-3-one)和過氧化氫，再加入酚與4-胺基安替吡碄(4-aminoantipyrine)作用，經過氧化脢氧化後得醌亞胺(quinoneimine)產物，在波長500nm下，即可透過吸光值變化反映膽固醇之濃度。取10μL血清加入反應溶液作用，在室溫下反應10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_sample。取10μL的200mg/dL標準品，加入反應溶液作用，在室溫下反應10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_standard。欲求得血清中膽固醇的濃度，則將A_sample除以A_standard在乘以200即為血清中膽固醇的濃度(mg/dL)。

高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)

利用低密度脂蛋白膽固醇(LDL)與高密度脂蛋白膽固 醇(HDL)比重不同之特性，加入含有磷鎢酸(phosphotungstic acid)與氯化鎂 (magneium chloride)溶液，經過離心後將低密度脂蛋白膽固醇(LDL)與極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL)沉澱，僅HDL存於上清液當中，藉由膽固醇乙醯水解酶，將乙醯化膽固醇水解為膽固醇和脂肪酸，再經過膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase)氧化成膽烯(cholesterol-3-one)和過氧化氫，再加入酚與4-胺基安替吡碄(4-aminoantipyrine)作用，經過氧化酶氧化後得醌亞胺產物，在波長500nm下，即可透過吸光值變化反映膽固醇之濃度。取200μL血清加入分離溶液作用，在室溫下反應10分鐘，以4000rpm轉速離心15分鐘後，取100μL上清液加入反應溶液作用，在室溫下反應10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_sample。取10μL的200mg/dL標準品，加入反應溶液作用，在室溫下反應10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_standard。欲求得血清中HDL-cholesterol的濃度，則將A_sample除以A_standard在乘以200即為血清中HDL-cholesterol的濃度(mg/dL)。

低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)

利用LDL與HDL比重不同之特性，加入含有肝素(heparin)與 檸檬酸鈉(sodium citrate)溶液，經過離心後將VLDL與HDL沉澱，僅LDL存於上清液當中，藉由膽固醇乙醯水解酶，將乙醯化膽固醇水解為膽固醇和脂肪酸，再經過膽固醇氧化酶氧化成膽烯和過氧化氫，再加入酚與4-胺基安替吡碄作用，經過氧化酶氧化後得醌亞胺產物，在波長500nm下，即可透過吸光值變化反映膽固醇之濃度。取100μL血清加入分離溶液作用，在室溫下反應10分鐘，以4000rpm轉速離心15分鐘後，取50μL上清液加入反應溶液作用，在室溫下反應10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_sample。取10μL的200mg/dL標準品，加入反應溶液作用，在室溫下反應 10分鐘，在波長500nm下測定吸光值A_standard。欲求得血清中低密度膽固醇的濃度，則將A_sample除以A_standard在乘以200即為血清中低密度膽固醇的濃度(mg/dL)。

體脂肪含量變化之測定

待實驗結束後，將小鼠犧牲，取出實驗動物腎(perirenal)周圍、睪丸(epididymal)周圍、腹壁後白色脂肪(retroperitoneal)及大腸中間(mesenteric)之脂肪組織後秤重並紀錄之。

實施例三 小鼠肝臟檢測方法

肝臟中脂質分佈變化

待實驗期間結束後，將小鼠犧牲並摘取其0.5克之肝臟組織，再以0.5ml之己烷(hexane)：異丙醇(isopropanol)(3：2,v/v)萃取肝臟所含之脂質，將脂質萃取物移至玻璃離心管中自然風乾，再以200μL的異丙醇回溶，即可得細胞內脂質萃取液，利用市售之酵素測定法試劑，測定肝臟內脂質含量之變化，包含總膽固醇、三酸甘油酯。

肝臟脂質萃取

取定量之肝臟，加入20倍質量的三氯甲烷(chloroform)/甲醇methanol(2：1)，以均質機均質後利用濾紙過濾，取澄清液以減壓真空濃縮機去除有機溶劑，再以三氯甲烷/甲醇(1：2)混合劑量回溶，並置於保存瓶中待測。

肝臟中總膽固醇、三酸甘油酯之測定

取出固定量之肝臟脂質萃取液，以酵素作用與比色測定原理，加入膽固醇或三酸甘油酯測定試劑，以分光光度計在適當波長下測定 吸光值，經計算後，可得肝臟中所含總膽固醇與三酸甘油酯含量。

肝功能之測定

以動物血清中天冬胺酸轉胺脢(AST)、丙胺酸轉胺脢(ALT)為肝功能測定指標。在含有α-氧代戊二酸脂和L-丙胺酸的情況下，ALT可將之轉變為L-谷氨酸和丙酮酸(pyruvate)，透過丙酮酸與NADH及H⁺作用下，會形成L-乳酸和NAD⁺，可在波長340nm下測得吸光值變化。取100μL血清加入反應溶液作用，在波長340nm下測定每分鐘單位時間內吸光值變化，將每分鐘單位時間內吸光值乘以1746即為ALT之活性(U/L)。在有AST存在的情況下，α-氧代戊二酸脂會與L-天冬氨酸反應，經AST作用下，會形成L-谷氨酸和草醯乙酸鹽(oxaloacetate)，再加入NADH經由酵素作用下，產生L-蘋果酸酯和NAD+，藉由測定NADH的消耗可反映出AST的活性。取100μL血清加入反應溶液作用，在波長340nm下測定每分鐘單位時間內吸光值變化，將每分鐘單位時間內吸光值乘以1746即為AST之活性(U/L)。

肝組織病理切片觀察

蘇木紫-伊紅染色法

將老鼠斷頭後，切小塊肝臟置於6%福馬林中固定，然後做蘇木紫&伊紅染色，觀察肝組織有無病變，並以倒立螢光顯微鏡拍照觀察。

脂質過氧化分析

脂質過氧化分析是依據Buege和Aust之方法加以修改(Buege and Aust,1978)，脂質氧化過程中會產生脂質過氧化物丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)，此時加入硫巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)會與MDA產生反應物硫巴比妥酸反應物(TBARS)，可利用吸光值(OD)測定反應物，以判定MDA形成量，而得知脂質過氧化程度。

抗氧化酵素活性分析

麩胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)

麩胱甘肽過氧化酶活性是根據Lawrence和Burk的方法，用分光光度法測定。麩胱甘肽過氧化酶的活性可用NADPH在波長340nm下進行5分鐘的吸光值變化情形來表示。

超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,SOD)

超氧化物岐化酶檢測是參照Marklund與Marklund(Marklund & Marklund,1974)的方法修改後的方法進行。以分光光度計(Hitachi U-2900,Japan)波長420nm測量吸光值，每隔20秒測量一次，總共測量3分鐘。

過氧化氫酶(Catalase)

過氧化氫酶活性檢測是依據Aebi之方法加以修改，檢測過氧化氫酶分解過氧化氫的能力.以分光光度計波長240nm測量吸光值，每隔20秒測量一次，總共測量3分鐘。

肝臟組織蛋白萃取及定量

蛋白萃取肝臟組織蛋白質，取0.1g組織塊加入適量的RIPA緩衝液及蛋白酶抑制劑於冰上研磨避免溫度過高，造成蛋白質的分解。研磨後將組織均質液取到離心管後於4℃冰箱中震盪30分鐘，置入高速離心，並取上層液定量蛋白質濃度。

西方墨點法(Western blotting)

取定量後之肝臟組織均質液配置sample，取等量之sample 進行SDS聚丙烯醯胺膠電泳，電泳結束後，將膠片取下，放置膠體轉印器(gel sandwich)中，再將轉印器(sandwich)置入蛋白質轉移槽中，在400安培環境下轉印4小時，取出轉印器(sandwich)中的轉印紙(NC paper)，以5%脫脂牛奶/緩衝溶液(PBST)(blocking buffer)搖晃1小時，之後以緩衝溶液搖晃15分鐘，清洗完後加入一級抗體反應15分鐘，放入4℃冰箱靜置一晚後再以緩衝溶液每次10分鐘，搖晃3次，加入二級抗體反應2小時再以緩衝溶液搖晃3次，清洗完畢後加山葵過氧化酵素(HRP)呈色劑(試劑A+試劑B以1：1比例)(ECL)反應1分鐘，再利用冷光影像分析儀分析。

實施例三 小鼠生理狀況與體重變化

C57BL/6小鼠飼養10週期間，每隔兩週測量體重一次，觀 察各組動物外觀狀態、活動力與毛色隨飼育期增加皆正常無異狀，攝食量與飲水狀況也顯示正常，各組小鼠活動力皆旺盛，反應敏捷。圖2表示各組動物在飼養期間體重變化的情形，並以曲線圖記錄，結果顯示各組體重隨週齡逐漸增加，飼養到第6週時，發現處理0.5-2.0% SWE之組別的老鼠體重增加的幅度都比HFD組低，隨著SWE劑量之增加，能夠有意義的降低(p<0.05)因HFD高油脂食物所造成體重增加的現象。

實施例四 小鼠臟器脂肪變化

各組老鼠犧牲之後取出肝臟、腎臟周邊脂肪組織，以生理食 鹽水清洗後，瀝除水分秤重並統計重量變化。

由脂肪組織的重量變化評估SWE對體脂肪是否具有調節的 作用。圖2顯示各臟器其脂肪組織之重量。結果表現在透過高脂肪食物誘導的組別(HFD)，在睪丸、腎臟、週邊的脂肪組織及體脂肪堆積情況和對照組(ND)相比都明顯增加；而在體內器官週邊組織脂肪和體脂肪的全部含量在利用HFD誘導的組別和對照組相比表現增加，然而在給予0.5%-2.0% SWE的組別分別為有顯著意義的降低，顯示SWE有助於減少體脂肪。

實施例五 肝臟三酸甘油酯和總膽固醇含量分析

以HFD餵食之動物試驗中，將各組動物肝臟檢體進行均質， 萃取油脂進行含量分析。各試驗組別之肝臟總膽固醇與三酸甘油酯濃度示於圖3。HFD誘導組中，其肝臟中所含之三酸甘油脂，LDL-C及膽固醇堆積的情形明顯上升，均高於對照組，可證明高油、高膽固醇飲食確實會造成肝臟三酸甘油酯，LDL-C及膽固醇濃度增加。而在2% SWE之肝臟三酸甘油脂及LDL-C濃度較HFD誘導組則有下降趨勢(p<0.05)，總膽固醇含量在SWE的作用下其分析結果0.5% SWE，可以有意義抑制對於高油脂所造成的影響；結果證實SWE確實有排除肝臟脂肪堆積之效果。

實施例六 血清生化檢查

血清中所含的脂肪，主要是指膽固醇、三酸甘油酯(又稱中 性脂肪)、磷脂質以及游離脂肪酸，膽固醇又分為總膽固醇、低密度膽固醇酯和高密度膽固醇酯，最後都到肝臟進行分解代謝，一旦肝臟對脂肪代謝發生異常，體內所有堆積的脂肪將全部都停留在血液中，因此血脂檢查為重要的評估指標，分析結果顯示於Table 3。

(1).總膽固醇(TCHO)與三酸甘油酯(TG)：在各組動物血清中，0.5%，1.0和2.0% SWE的總膽固醇含量分別為135.41，118.54及102.88，相較於用HFD誘導的組別141.07，有下降的趨勢，具有統計意義。0.5%，1.0和2.0% SWE之三酸甘油酯含量相較於誘導組均有顯著降低(p<0.01)。此結果顯示，SWE可降低血液中三酸甘油酯與膽固醇的堆積。

(2).肝臟功能指數天門冬胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)：一般脂肪肝患者，AST、ALT值會有升高之情形，故本試驗進一步分析測定各組動物肝功能指標AST、ALT之表現變化。0.5%，1.0%及2.0% SWE之AST數值，相較於誘導組有下降的趨勢，具有統計意義(p<0.05)，而SWE的使用對於ALT數值上的分析觀察到數據有下降趨勢且於2.0%組為有意義降低，顯示SWE，能明顯降低HFD所誘導肝臟功能損傷之作用。

(3)血漿低密度脂蛋自膽固醇(LDL-C)與高密度脂蛋自膽固醇(HDL-C)：由表一比較發現，1.0%和2.0% SWE組別之血中LDL-C濃 度相較於誘導組有明顯下降的趨勢(P<0.05)；2.0% SWE組別之HDL-C數值上的分析和誘導組相比有統計意義上升。

實施例七 肝臟病理組織切片觀察

將老鼠犧牲後，利用肝臟切片以蘇木紫&伊紅染色，結果呈 現於圖5，以高油脂食物HFD誘導之組別，相對於ND組，可見細胞中有明顯脂肪空泡產生，而於多加入0.5%、1.0及2.0% SWE之組別，在SWE的作用下，細胞中脂肪空泡明顯減少。圖6也顯示處理SWE組顯著的降低白血球的浸潤，圖6(A)顯示IL-6及圖6(B)顯示TNF-α均顯著的被抑制，因此SWE有抑制HFD誘導之脂肪肝炎。

實施例八 SWE抑制過氧化作用

利用HFD誘導脂質過氧化作用及抑制抗氧化酵素，經SWE 處理後有增加抗氧化酵素的趨勢，圖7顯示2% SWE抑制MDA產生及增加過氧化氫脢(catalase)(p<0.05)，1% SWE有意義增加超氧化物岐化酶(SOD)，因此SWE有抑制HFD誘導之過氧化作用。

實施例九 SWE調控動物肝臟中脂肪酸及三酸甘油酯合成相關蛋白之作用

由於細胞實驗證明SWE具有抑制脂質相關蛋白之作用，所以利用老鼠犧牲後之肝臟萃取物做西方墨點法來觀察相關蛋白之表現。圖8中結果得知HFD誘導組別明顯提升脂質生成酵素蛋白之表現，包含FAS，GPAT，AMPK-P及SREBP-1，可見高油飲食確實會促進肝臟脂肪合成蛋白之表現，再以SWE餵食小鼠10週之後，這些蛋白在動物體內都呈現減少的趨勢。此實驗之結果可以證明SWE具有抑制脂肪生成蛋白表現之能力，推 測可能與SWE降低三酸甘油酯與總膽固醇之作用機轉有關。

實施例十 SWE調控動物肝臟中膽固醇合成相關蛋白之作用

圖9中顯示，HFD餵食小鼠之組別，HMGCoR蛋白表現為對照組之1.3倍。和對照組相較下，以1.0%和2% SWE餵食處理後蛋白表現量分別有意義降低。而SREBP-2蛋白受到HFD誘導之後與對照組相比為1.2倍。與對照組相比，以SWE餵食處理後蛋白表現量分別為有意義降低(p<0.05)。此結果顯示，在SWE的作用下能抑制高油脂食物所誘導HMGCoR及SREBP-2蛋白的表現，抑制肝臟膽固醇。

實施例十一 SWE調控動物肝臟中β氧化相關蛋白之作用

圖10顯示HFD餵食之組別，PPARα蛋白表現為對照組之0.8倍，與對照組相較下，以SWE餵食處理後PPARα蛋白表現量均為有意義增加(p<0.05)。CPT-I蛋白表現與對照組相較下，以1.0%和2.0% SWE餵食處理後CPT-1蛋白表現量分別增加(p<0.05)。結果顯示，CPT-I及PPARα蛋白之表達，相較於誘導組有明顯因SWE濃度增加而促進脂肪利用。

Claims (10)

1. 一種組合物用於製備降低體脂肪或降低體重之醫藥組合物之用途，其中該組合物包括：龍葵萃取物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物進一步用於治療或預防肥胖性肝炎。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該龍葵萃取物為龍葵葉水萃取物。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物之龍葵萃取物的重量百分比介於0.5%-2%。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該龍葵萃取物進一步包含活性成分係選自多酚所組成之群組。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其降低血液中丙胺酸轉胺酶或天門冬胺酸轉胺酶。
7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其進一步具有降低脂質過氧化作用、抗氧化或抑制發炎反應。
8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其增加血清中高密度脂蛋白膽固醇、減少血清中低密度膽固醇、降低血清中或肝臟中三酸甘油脂及總膽固醇含量。
9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物進一步包括一醫藥上可接受之載體。
10. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其用於製備藥品、膳食補充物、食品或保健食品。