TW201524515A - 治療成骨不全之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係藉由將一治療上有效量之結合轉化生長因子β(TGFβ)的結合劑投予一患者，而提供該患者治療和改善成骨不全(OI)之癥狀的方法。

Description

治療成骨不全之方法 相關申請案

本申請案係關於2013年3月20日申請的美國臨時專利申請案第61/803,647號，2013年9月9日申請的美國臨時專利申請案第61/875,399號，2013年10月26日申請的美國臨時專利申請案第61/883,151號，其各自係以全文引用之方式併入本文中。

政府資金

本發明係由國家衛生研究院所准予的P01 HD070394、P01 HD22657& R01 DE01771之支持下所創。美國政府對本發明有特定之權利。

本發明係關於治療成骨不全(OI)之方法。更特言之，本發明係關於使用結合蛋白，例如專一與人類轉化生長因子β(TGFβ)或其同型結合之抗體或其抗原結合片段，治療OI之方法。

成骨不全(OI)亦稱為「脆骨病」或洛布斯坦症候群(Lobstein syndrome)，為一種弱化及罕見的先天骨骼疾病，其大約每15,000人有1人患有此疾病。雖然在OI類型中表現型多樣，但共通的癥狀包括骨骼和牙齒的不完全骨化、骨質減低和病理性骨折。這些共通的OI癥狀被認為係由基因突變所造成，使其產生第I型膠原蛋白和其他涉及骨基質沉積或體內恆定之蛋白的缺陷。由於這些癥狀和致命的骨折傾向及病發症，相較於一般群 眾，OI病患之壽命較低。

因此，在本項技術中開發有效的OI之治療存有明確的急迫需求。

本發明係關於有效地治療成骨不全(OI)之方法。更特言之，本發明係關於使用結合蛋白，例如專一與轉化生長因子β(TGFβ)或其同型結合之抗體或其抗原結合片段，治療OI之方法。較佳地，此結合蛋白為「泛專一性」及與所有的三種人類TGFβ之同型，亦即TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3相結合。更佳地，此結合蛋白係專一與人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3相結合或中和人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。在一方面，本發明係於有此需要之患者中提供治療OI之方法，其包括將一治療上有效量之專一與TGFβ結合的抗體或其抗原結合片段投予該患者。

在一實施例中，此抗體或其抗原結合片段係包括一包含三個互補決定區(CDR)之重鏈可變區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列SEQ ID NO：4、5和6；以及一包含三個CDR之輕鏈可變區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：7、8和9。

在另一實施例中，此抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈可變區，以及一包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例中，此抗體或其抗原結合片段進一步係包括一人類IgG4恆定區。在一實施例中，此人類IgG4恆定區係包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列。在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段進一步係包括一人類κ輕鏈恆定區。在另外的實施例中，此人類κ恆定區係包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列。在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段 進一步係包括一人類IgG4恆定區及一人類κ輕鏈恆定區。

在另外的實施例中，此人類IgG4恆定區係包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列，及此人類κ輕鏈恆定區係包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列。在另外的實施例中，此抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈。在另外的實施例中，此抗體係包括一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。在另外的實施例中，此抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈，以及一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。

在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段係與人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3結合。在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段係中和人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。

在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段改善了由下列組成之群中選出的骨骼參數：骨體積密度(BV/TV)、總骨表面(BS)、骨表面密度(BS/BV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)及總體積(Dens TV)。

在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段係抑制骨再吸收。

在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段降低了由下列組成之群中選出之骨再吸收的血清生物標記：尿羥脯胺酸、尿總吡啶啉(PYD)、尿游離的去氧吡啶啉(DPD)、尿第I型膠原蛋白交聯的N-端胜肽(NTX)、尿或血清第I型膠原蛋白交聯的C-端胜肽(CTX)、骨涎蛋白(bone sialoprotein)(BSP)、骨橋蛋白(osteopontin)(OPN)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP)。

在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段係增加由下列組成之群中選出之骨沉積的血清生物標記：總鹼性磷酸酶、骨-專一性鹼性 磷酸酶、骨鈣素及第I型前膠原蛋白(C-端/N-端)。

在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段抑制了骨再吸收。在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段促進骨沉積。在另外的實施例中，此抗體或其抗原結合片段改善了受OI影響之由下列組成之群中選出的非骨骼器官功能：聽力功能、肺功能和腎功能。

在另外方面，本發明係於有此需要之患者中提供治療OI之方法，其包括將一治療上有效量之專一與TGFβ結合的抗體或其抗原結合片段投予該患者，其中此抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈，以及一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。

在另外方面，本發明係於有此需要之患者中提供治療OI之方法，其包括將一治療上有效量之專一與TGFβ結合之抗體或其抗原結合片段與至少一種治療劑組合，投予該患者。在另外的實施例中，此治療劑為雙磷酸鹽。

本發明之詳細說明 A.定義

除非另有定義，否則文中所用的所有的技術和科學術語一般係具有與熟習本技術之一般技術者共同理解之意義。

請注意，除非內文中有清楚指出，否則如本說明和所附的申請專利範圍中所用，單數型「一」希望亦包括多數型。

術語「約」或「大約」係指在給予的值或範圍之10%內，及更佳地5%內(或1%或更低)。

術語「投予」或「給藥」係指注射或其他實體遞送存在體外之物質(例如抗體)至一病患，例如藉由黏膜、皮內、靜脈內、皮下、肌肉內遞送，及/或任何其他如文中所述之實體遞送或本項技術中已知的方法。當 欲治療一疾病或其癥狀時，物質之投予典型地係在疾病或其癥狀發生後進行。當欲預防一疾病或其癥狀時，物質之投予典型地係在疾病或其癥狀發生之前進行。

TGFβ之「拮抗劑」或「抑制劑」係指能抑制或另外降低一或多種TGFβ之生物活性的分子，例如在表現TGFβ的細胞中或在表現TGFβ配體的細胞中，或表現TGFβ受體。在特定示例性實施例中，本發明之抗體，當與具有細胞表現TGFβ受體(例如TGFβ受體1、2或3)之細胞接觸，為抑制或另外降低該細胞中TGFβ活性之拮抗劑抗體。在某些實施例中，TGFβ之拮抗劑(例如本發明之抗體)可，例如藉由抑制或另外降低表現TGFβ受體之細胞的活化及/或細胞訊號傳遞路徑來作用，藉此抑制細胞(相對於在缺乏拮抗劑下之TGFβ-媒介的生物活性)之TGFβ-媒介的生物活性。在本發明特定的實施例中，此抗-TGFβ抗體為拮抗性抗-TGFβ抗體，較佳地全人類、單株、拮抗性抗-TGFβ抗體。

術語「抗體」、「免疫球蛋白」或「Ig」在文中可交換使用。術語抗體包括(但不限於)合成抗體、單株抗體、重組產生的抗體、多專一性抗體(包括雙專一性抗體)、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、內抗體、單鏈Fvs(scFv)(例如包括單專一性、雙專一性等)、駱駝化抗體、Fab片段、F(ab')、二硫化物-連接Fvs(sdFv)、抗-個體基因型(抗-Id)抗體及任何上述之表位結合片段。特言之，抗體係包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫學上活性部分，亦即專一與TGFβ抗原結合之含有抗原-結合位置之抗原結合區或分子(例如抗-TGFβ抗體之一或多個互補決定區(CDR))。抗-TGFβ抗體可為任何型式(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，或任何亞類(例如IgG2a和IgG2b)之免疫球蛋白分子。在特定的實施例中，此抗-TGFβ抗體為人源 化，例如人源化單株抗-TGFβ抗體。在其他的實施例中，此抗-TGFβ抗體為全人類，例如全人類單株抗-TGFβ抗體。在較佳的實施例中，此抗-TGFβ抗體為IgG抗體，例如IgG4抗體。

術語「組成物」和「調配物」希望係涵蓋含有特定成份(例如抗-TGFβ抗體)，視需要特定量之產品，以及任何直接或間接由特定成份，視需要特定量組合所產生的產品。

術語「恆定區」係指輕鏈和重鏈之羧基端部分，其不會直接涉及抗體與抗原之結合，但具有各種效應子功能，例如與Fc受體相互作用。此術語係指，相對於其他疫球蛋白分子之部分(含有抗原結合位置之可變區)，具有更保守胺基酸序列之免疫球蛋白分子的部分。恆定區係含有重鏈之CH1、CH2和CH3區及輕鏈之CHL區。

術語「表位」係指抗原表面上之局部區域，例如TGFβ多肽或TGFβ多肽片段，其能與抗體之一或多個抗原結合區結合，且在動物，較佳地哺乳動物，最佳地人類中具有抗原或致免疫活性，而能引發免疫反應。具有致免疫活性之表位為與抗體專一結合之一部份的多肽，如藉由本項技術中熟知的方法，例如免疫分析所測定。抗原表位不一定需要具有致免疫性。表位通常係由化學活性表面聚合之分子所組成，例如胺基酸或糖側鏈，且具有特定的三維結構特性，以及特定的帶電性特性。形成表位之多肽區可為多肽之鄰近的胺基酸，或此表位可共同來自抗體之二或多個非鄰近的胺基酸區。此表位可為或不可為三-維表面特徵之抗原。在特定的實施例中，TGFβ表位為三-維表面特徵之TGFβ多肽(例如，為三聚物形式之TGFβ多肽)。在其他的實施例中，TGFβ表位為一線性特徵之TGFβ多肽(例如，二聚物形式或單體形式之TGFβ多肽)。抗-TGFβ抗體可專一與單體形式之TGFβ的表位、二聚物形式之TGFβ表位，或單體和二聚物形式之TGFβ 的表位相結合。

術語「賦形劑」係指通常用於藥物作為稀釋劑、媒劑、防腐劑、結著劑、安定劑等之惰性物質，並包括(但不限於)蛋白(例如，血清白蛋白等)，胺基酸(例如，天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、甘胺酸、組胺酸等)、脂肪酸和磷脂質(例如，烷基磺酸酯、辛酸酯等)、界面活性劑(例如，SDS、聚三梨醇酯、非離子界面活性劑等)、糖類(例如，蔗糖、麥芽糖、海藻糖等)及多醇類(例如，甘露醇、山梨醇等)。亦參見Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，其係以全文引用的方式併入。

在胜肽或多肽之情況，術語「片段」係指包括少於全長胺基酸序列之胜肽或多肽。此一片段可能係由，例如截去胺基端、截去羧基端，及/或刪除胺基酸序列中間的殘基所產生。片段可，例如由替代的RNA剪接或由活體內蛋白酶活性所產生。在特定的實施例中，TGFβ片段係包括包含TGFβ多肽之至少50個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘及，至少125個相鄰胺基酸殘基，至少150個相鄰的胺基酸殘基，至少175個相鄰胺基酸殘基，至少200個相鄰胺基酸殘基，或至少250個相鄰胺基酸殘基的多肽。在特定的實施例中，專一與TGFβ抗原結合之TGFβ多肽或抗體的片段係保留至少1種，至少2種，或至少3種全長多肽或抗體之功能。

術語「全人類抗體」或「人類抗體」在文中係交換使用並係指包括人類可變區及，最佳地恆定區之抗體。在特定的實施例中，此術語係指包括一人類來源之可變區和恆定區之抗體。「全人類」抗-TGFβ抗體，在特定的實施例中，亦可涵蓋結合TGFβ多肽和由一核酸序列所編碼之抗體，其中該核酸系列為人類生殖系免疫球蛋白核酸序列之天然發生的體細胞變體。在一特定的實施例中，此抗-TGFβ抗體為全人類抗體。術語「全 人類抗體」係包括具有相當於如等人所述之人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區之抗體(參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。製造全人類抗體之方法已為本項技術所知。

「重組的人類抗體」一詞包括藉由重組方法所製備、表現、創造或分離之人類抗體，例如使用重組表現載體轉染至宿主細胞所表現的抗體，或由重組的、組合的人類抗體庫所分離的抗體，由人類免疫球蛋白基因之基因轉殖及/或轉染色體的動物(例如小鼠或牛)所分離的抗體(參見，例如，Taylor,L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或藉由任何涉及人類免疫球蛋白基因與其他DNA序列剪接之其他方法所製備、表現、創造或分離之抗體。此等重組的人類抗體可具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區(參見Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。在特定的實施例中，然而，此等重組的人類抗體係於活體外進行突變(或當使用人類Ig序列之動物基因轉殖時，為活體內體細胞突變)且因此當係由人類生殖系VH和VL序列所衍生或與其相關時，重組抗體之VH和VL區的胺基酸序列可能為非天然存在於活體內人類生殖系儲庫之序列。

術語「重鏈」當用於有關抗體時係指五種不同的類型，以重鏈恆定區的胺基酸為基準，稱為阿爾法(α)、德爾塔(△)、艾蒲賽龍(ε)、伽瑪(γ)和繆(μ)。這些不同類型的重鏈已為本項技術所熟知並產生五種抗體分別為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四種亞類，亦即IgG1、IgG1、IgG3和IgG4。較佳地，此重鏈為人類重鏈。

「分離的」或「純化的」抗體為實質上無細胞物質或其他來自細胞或來自抗體所衍生之組織來源的汙染蛋白，或當由化學合成時，其實質上無化學前驅物或其他化學物質。「實質上無細胞物質」一詞包括抗體之製備物，其中該抗體係由從其分離或重組製造之細胞的細胞組份所分離。因此，實質上無細胞物質之抗體係包括具有低於約30%、20%、10%或5%(乾重比)之異源蛋白(文中亦稱為「汙染蛋白」)的抗體製備物。當此抗體係重組產生時，其亦較佳地係實質上無培養基，亦即培養基係低於約20%、10%或5%之蛋白製備物的容量。當此抗體係由化學合成所製造時，其較佳地係實質上無化學前驅物或其他化學物，亦即其與涉及此蛋白合成的化學前驅物或其他化學物分開。因此，此等抗體製備物係具有低於約30%、20%、10%、5%(重量比)之化學前驅物或相關抗體以外的化合物。在一較佳的實施例中，抗-TGFβ抗體係經分離或純化。

術語「Kabat編號」及類似術語已被本項技術所承認並係指比抗體或其抗原結合蛋白之重鏈和氫鏈可變區的其他胺基酸殘基更可變(亦即高可變)的胺基酸殘基之編號系統(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-391及Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。就重鏈可變區，此高變區典型地範圍係從CDR1之31至35的胺基酸位置，CDR2之50至65的胺基酸位置，CDR3之95至102的胺基酸位置。就輕鏈可變區，此高變區典型地範圍係從CDR1之24至34的胺基酸位置，CDR2之50至56的胺基酸位置，CDR3之89至97的胺基酸位置。

術語「輕鏈」當用於有關抗體時係指二種不同的類型，以輕鏈恆定區的胺基酸為基準，稱為(κ)和(λ)。輕鏈胺基酸序列已為本項技術所 熟知。在較佳的實施例中，此輕鏈為人類輕鏈。

術語「管理(manage)」係指患者由治療(例如，預防或治療劑)所衍生的有利效用，其不會使得疾病或病症痊癒。在特定的實施例中，係將一或多種治療(例如，預防或治療劑)投予一患者，用以「管理」TGFβ-媒介的疾病(例如OI)，或其一或多種癥狀，而得以阻止此疾病的進展或惡化。

術語「單株抗體」係指得自同源或實質上同源抗體之族群的抗體，且各單株抗體典型地將辨識此抗原上的單一表位。在較佳的實施例中，「單株抗體」為由單一雜交瘤或其他細胞所產生的抗體。術語「單株」不限於任何特定之製造此抗體的方法。例如，單株抗體可藉由如Kohler等人；Nature,256：495(1975)中所述之雜交瘤方法來製造，或可從噬菌體庫分離。其他製備選殖細胞株和藉此表現的單株抗體之方法已為本項技術所熟知(參見，例如第11章中：Short Protocols in Molecular Biology,(2002)5th Ed.；Ausube等人，eds.,John Wiley and Sons,New York)。

術語「醫藥上可接受」係指經聯邦或州政府管理當局核准，或列於美國藥典、歐洲藥典或其他一般所知道之藥典中供用於動物，更特言之用於人類。

術語「醫藥上可接受賦形劑」係指與活性分子例如單株抗體組合，供製備一適合的或方便劑型之任何惰性物質。「醫藥上可接受賦形劑」為一在所用的劑量和濃度時對接受者無毒性，且係與包括單株抗體之調配物的其他成份相容。

術語「防止」係指因給予文中所提供的治療或治療組合(例如，預防或治療劑之組合)所導致之完全或部份抑制TGFβ-媒介的疾病及/或其相關癥狀的發展、再發生、發作或擴散。

術語「TGFβ抗原」係指與抗體專一結合之TGFβ多肽部份。TGFβ抗原亦指與抗體專一結合之TGFβ多肽的類似物或衍生物或其片段。在某些實施例中，TGFβ抗原為單體TGFβ抗原或二聚體TGFβ抗原。形成表位之TGFβ多肽的區域可為多肽之相鄰的胺基酸，或此表位可由多肽之二或多個非相鄰區域聚集一起。表位可或不可為抗原之三維表面特徵。能引發免疫反應之TGFβ抗原表面上的局部化區域，為一TGFβ表位。此表位可或不可為抗原之三維表面特徵。如文中所用，TGFβ抗原之「類似物」係指具有與文中所述的TGFβ多肽、TGFβ多肽之片段或TGFβ表位相類似或相同功能之多肽。例如，此類似物可包括與文中所述的TGFβ多肽(例如，SEQ ID NO：1、2或3)、TGFβ多肽之片段、TGFβ表位或抗-TGFβ抗體之胺基酸序列具至少80%，至少85%，至少90%，至少95%或至少99%一致性之序列。另外或另一種選擇，此多肽係於嚴謹條件下由與編碼文中所述的TGFβ多肽、TGFβ多肽之片段或TGFβ表位的核苷酸序列雜交之核苷酸序列所編碼的多肽。

術語「人類TGFβ」、「hTGFβ」或「hTGFβ多肽」及類似術語係指(「多肽」、「胜肽」和「蛋白」在文中係交換使用)包括SEQ ID NO：1、2或3之胺基酸序列之多肽，及相關多肽，包括其SNP變體。相關多肽包括等位基因變體(例如，SNP變體)；剪接變體；片段；衍生物；取代、刪除和插入變體；融合多肽；及種間同源物，較佳地，其係保留TGFβ活性及/或足以產生抗TGFβ免疫反應。亦涵蓋足以產生抗-TGFβ免疫反應之TGFβ的可溶性形式。如熟習本項技術者應了解，抗-TGFβ抗體可與文中所述的TGFβ多肽、多肽片段、抗原或表位結合，因表位為較大抗原之部份，其為較大多肽片段之部份，其轉而為較大多肽之部份。hTGFβ可以二聚體或單體形式存在。

術語「TGFβ-媒介的疾病」和「TGFβ-媒介的病症」係交換使用並係指完全或部份由TGFβ，例如hTGFβ所導致之任何疾病或病症。在特定的實施例中，TGFβ係表現異常。在某些實施例中，TGFβ在特定的細胞類型中可能異常上調。在其他的實施例中，正常、異常或過度的細胞訊號傳遞係由TGFβ與TGFβ受體之結合所造成。在特定的實施例中，TGFβ受體(例如，TGFβ受體1、2或3)係表現於細胞的表面上，例如成骨細胞、破骨細胞或骨髓基質細胞。在特定的實施例中，TGFβ-媒介的疾病為一退化性骨疾病，例如成骨不全。

術語「專一結合」係指與抗原或其片段(例如，TGFβ)專一結合且不會與其他的抗原專一結合。專一與抗原結合之抗體可以較低的親和力與其他多肽結合，如以例如，放射免疫分析(RIA)、酵素連結免疫吸附分析(ELISA)、BIACORE或其他本項技術中已知的分析所測定。在特定的實施例中，本發明之抗-TGFβ抗體可用大於不同的非TGFβ抗原二倍的親和力專一與TGFβ(例如，hTGFβ)結合。專一與抗原結合之抗體或其變體或片段可與相關的抗原交叉反應。例如，在特定的實施例中，抗-TGFβ抗體可與hTGFβ和另外的TGFβ抗原(例如，嚙齒類或非人類靈長類TGFβ抗體)交叉反應。較佳地，專一與抗原結合之抗體或其變體或片段不會與其他非-TGFβ抗原交叉反應。專一與抗原結合之抗體或其變體或片段可藉由，例如免疫分析、BIAcore或其他熟習本項技術者已知的技術來鑑別。典型地，專一或選擇性反應將為至少二倍背景訊號或雜音，且更典型地為大於10倍背景。在某些實施例中，此結合蛋白或抗體將以介於1x10^-6M至1x10^-7之解離常數與其抗原(例如TGFβ)相結合。在其他的實施例中，解離常數係介於1x10^-6M至1x10^-8。參見，例如，Paul,ed.,1989,Fundamental Immunology Second Edition,Raven Press,New York於第332-336頁就有關抗體專一性之 論述。

術語「患者(subject)」和「病患(patient)」係交換使用。如中所述，一患者較佳地為一哺乳動物，例如非靈長類(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類(例如，猴子和人類)，最佳地為人類。在一實施例中，此患者為患有TGFβ-媒介疾病之哺乳動物，較佳地人類。在另外的實施例中，此患者為處於發生TGFβ-媒介疾病風險之哺乳動物，較佳地人類。

術語「治療劑」係指可用於治療、管理或改善TGFβ-媒介疾病及/或其相關癥狀之任何藥劑。在特定的實施例中，術語「治療劑」係指TGFβ抗體。在特定的其他實施例中，術語「治療劑」係指TGFβ抗體以外的藥劑。較佳地，治療劑為一已知可用於，或已用於或目前正用於治療管理或改善TGFβ-媒介疾病或一或多種其相關癥狀之藥劑。

術語「治療(therapy)」係指任何可用預防、管理、治療及/或改善TGFβ-媒介疾病(例如OI)之方案、方法及/或藥劑。在特定的實施例中，術語「治療」係指可用預防、管理、治療及/或改善熟習本項技術者(例如醫療人員)已知的TGFβ-媒介疾病之生物性治療、支持性治療及/或其他治療。

術語「治療(treat)」係指由給予一或多種治療(包括，但不限於給予一或多種預防性或治療性藥劑)所產生之減低或改善TGFβ-媒介疾病(例如OI)的進程、嚴重性及/或期間。在特定的實施例中，此等術語係指減低或抑制TGFβ與TGFβ受體之結合，減低或抑制TGFβ由患者之表現TGFβ受體的細胞產生或分泌，減低或抑制TGFβ由患者之非表現TGFβ受體的細胞產生或分泌，及/或減低或抑制與TGFβ-媒介的疾病(例如OI)有關的一或多種癥狀。

術語「可變區」係指輕鏈和重鏈之一部份，典型地在重鏈中 約胺基端120至130個胺基酸及在輕鏈中約100至110個胺基酸，其在抗體中的序列大不相同且係用於結合及各特定抗體對其特定抗原之專一性。序列的可變性係集中在該等稱為互補決定區(CDR)之區域，而可變區中更高度保守區域係稱為架構區(FR)。輕鏈和重鏈的CDR主要係負責抗體與抗原之相互作用。胺基酸位置的編號係根據EU索引，如Kabat等人(1991)Sequences of proteins of immunological interest.(U.S.Department of Health and Human Services,Washington D.C.)5^th ed.("Kabat et al.")。在較佳的實施例中，此可變區為一人類可變區。

B.成骨不全(OI)

OI係涵蓋一群先天的骨病症，其特徵為涉及骨基質沉積或體內恆定之一或多種蛋白缺陷。有八種類型的OI其係由其特定的基因突變、所產生的蛋白缺陷和影響個體之表現形來定義。雖然表現型在OI類型中各不相同，但共通的癥狀包括骨骼和牙齒之骨化不完全、骨質減低、脆骨和病理性骨折。

第I型膠原蛋白為鈣化和非鈣化組織中最豐富的結締組織蛋白之一。第I型膠原蛋白之精確的合成、後轉譯修飾和分泌為適當的組織發育、維持、修復所必須。在患有OI之個體中所鑑別之大多數的突變造成第I型膠原蛋白合成降低，或第I型膠原蛋白之不正確合成及/或處理。

除了第I型膠原蛋白基因之突變外，其他參與胞內運輸和膠原蛋白處理的基因突變已在患有OI個體中鑑別出。這些基因包括分子伴護子，例如FK506結合蛋白10(FKBP10)和熱休克蛋白47(HSP47)(Alanay等人.，2010；Christiansen等人，2010；Kelley等人，2011)。在分子間膠原蛋白交聯基因中，例如前膠原蛋白-離胺酸、2-酮戊二酸5-雙加氧酶2(PLOD2)，及在膠原蛋白脯醯胺基羥化酶家族之基因成員中，包括白胺酸脯胺酸-富含 的蛋白多糖(leprecan)(LEPRE1)、肽基脯醯胺基異構酶B(cyclophilin B)(CYPB)和軟骨相關蛋白(CRTAP)(Morello等人，2006；Cabral等人，2007；Baldridge等人，2008；van Dijk等人，2009；Choi等人，2009；Barnes等人，2010；Pyott等人，2011)，已鑑別出另外的突變。撇開突變，蛋白例如骨形態發生蛋白(BMP)和轉化生長因子β(TGFβ)及其個別的受體被認為參與各種OI表現型，雖然其確切的作用機制仍未知(Gebken等人，2000)。

在一實施例中，TGFβ表現係由結合第I型和第II型膠原蛋白之分子所調節。在特定的實施例中，小的富含白胺酸之蛋白多糖(SLRP)係調節TGFβ表現。在一特定的實施例中，decorin調節TGFβ合成。在一特定的實施例中，decorin並未與第I型和第II型膠原蛋白結合，其中在第I型及/或第II型膠原蛋白分子之985位置上係缺乏3-羥基脯胺酸位置。

C.骨生物學

脊椎動物骨架係由骨骼組成，其為提供結構、支撐、保護和供調節離子運輸之礦物質來源之活的、鈣化組織。骨骼為一特化的結締組織，其係由細胞和非細胞組份二者所組成。非細胞胞外基質(ECM)含有膠原性蛋白和非膠原性蛋白二者，此二者係參與鈣化過程。正確分泌和有序化ECM對於適當的骨形成很重要。如成骨不全中所驗證，當任何ECM蛋白缺乏、異常或失序時則產生病變。

術語「皮質骨」或「密質骨」係指骨骼的外層，其為緊密、剛硬和堅實的。術語「小梁骨」或「疏鬆骨」為骨骼之海綿狀內層，其比皮質骨輕且緊密度較低。術語「骨小梁」係指海綿狀骨骼之顯微結構單位，其為類桿狀和膠原性組成物。

骨骼為一經歷恆定再塑之動態組織。術語「成骨細胞」係指沉積類骨質之末端分生的骨形成細胞。術語「類骨質」係指不成熟、未礦 化的骨骼，其主要係由第II型膠原蛋白所組成。術語「前-成骨細胞」係指尚未完全分化之增生中的不成熟成骨細胞。術語「骨祖」係指產生數種基質細胞類型，包括成骨細胞之多功能細胞。股祖細胞，其通常稱為「間質幹細胞」，係在骨髓中生成並可從循環血液中少量分離。術語「破骨細胞」係指末端分生的骨吸收細胞，其係傳承自骨髓單核細胞。破骨細胞可藉由其抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)之表現來鑑別。

在正常的體內恆定狀況下，成骨細胞和破骨細胞係和諧運作以維持骨骼完整性。當骨沉積和骨再吸收脫鉤後，則產生病變。例如，骨質石化症為一種骨疾病其特徵為由未再吸收的破骨細胞所造成之過度緊密、硬化骨骼，而骨質疏鬆則為一種骨骼病症其特徵為可能由破骨細胞活性增加所造成的脆化、多孔骨骼。證據顯示破骨細胞活性在成骨不全中可能為增加的，其意味著這些細胞類型係作為治療干預之可能的目標。本揭示文係包括以TGFβ抗體抑制破骨細胞之方法。

數種方法可用於測量和定性骨骼結構、密度和質性，包括組織學和組織形態學、原子力顯微鏡、共焦拉曼顯微鏡光譜、奈米壓痕、三點彎曲試驗、X-光造影及微電腦斷層掃描(μ-CT)。在一示例的實施例中，係以至少一種此等方法來測量和定性骨骼。

術語「骨體積密度」係指由鈣化物質(骨體積或BV)所組成之一定體積(總體積或TV)的骨骼分量。因此，骨體積密度係以BV/TV來計算並以百分比來記錄。術語「特定的骨表面」係指每特定體積之骨骼的總骨表面。因此，特定的骨表面係以BS/TV來計算。其他常見的骨骼測量值包括：骨面積(B.Ar)、骨小梁數目(Tb.N)；骨小梁間隙(Tb.Sp)；N.Oc(破骨細胞數目)；Oc.S(破骨細胞表面積)；Oc.S/BS；成骨細胞數目(N.Ob)、成骨細胞表面積(Ob.S)、成骨細胞周長(Ob.Pm)和任何該等測量值之衍生值。較 大的Oc.S/BS為破骨細胞之骨再吸收增加的指標。

D.轉化生長因子β(TGFβ)

TGFβ為涉及細胞增生和分化、胚胎發育、胞外基質形成、骨骼發育、傷口癒合、體內平衡和免疫及發炎反應之多功能的細胞激素(Roberts等人，1981；Border等人，1995a)。分泌的TGFβ蛋白係裂解成潛伏相關胜肽(LAP)和成熟的TGFβ胜肽。成熟的TGFβ胜肽與其他TGFβ家族成員形成同型二聚體和異型二聚體。TGFβ可由任何天然來源純化，或可合成製造(例如，藉由使用重組的DNA技術)。較佳地，TGFβ分子係來自人類，文中稱為「hTGFβ」。

有三種人類TGFβ同型：TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(Swiss Prot登錄號分別為P01137、P08112和P10600)其，就其生物活性狀態，為包括二條112個胺基酸單體藉由鏈內雙硫橋連結之25kDa同型二聚物。TGFβ1與TGFβ2有27個差異，而與TGFβ3有22個差異，主要為保守性胺基酸改變。這些差異可藉由X-光結晶學所測定之TGFβ的3D結構來定位(Schlunegger等人，1992；Peer等人，1996)且此受體結合區已被定義出(Griffith等人，1996；Qian等人，1996)。

hTGFβ1(SEQ ID NO：1)

(SEQ ID NO：1)

hTGFβ2(SEQ ID NO：2)

(SEQ ID NO：2)

hTGFβ3(SEQ ID NO：3)

(SEQ ID NO：3)

在人類中有三種TGFβ受體，TGFβ受體1、2和3，其可藉由其結構和功能性質來區分，包括對TGFβ蛋白家族成員的親和力。TGFβ蛋白與同型二聚性或異型二聚性TGFβ跨膜受體複合物結合使得由胞內SMAD蛋白所媒介的正規TGFβ訊號傳遞路徑活化。

TGFβ之失調導致病理過程，其在人類中已意味著許多的症狀，例如出生缺陷、癌症、慢性發炎、自體免疫疾病和纖維化疾病(Border等人，1994；Border等人，1995b)。

人類TGFβ與小鼠TGFβ非常類似：人類TGFβ1與小鼠TGFβ1僅具有1個胺基酸差異；人類TGFβ2與小鼠TGFβ2僅具有3個胺基酸差異；而人類TGFβ3係與小鼠TGFβ3相同。

E.與轉化生長因子β(TGFβ)結合之分子

本發明係包括包含將一與TGFβ結合之分子投予一患者之方法。此TGFβ結合劑可為任何結合分子，例如抗體、融合蛋白(例如，免疫黏附素)、siRNA、核酸分子、適體、蛋白或小分子有機化合物。

在特定的實施例中，本發明係包括與TGFβ結合之抗體(醫抗-TGFβ抗體)，或其變體，或其抗原結合片段。抗-TGFβ抗體係專一與TGFβ蛋白、多肽片段或表位結合。與TGFβ結合之分子可來自任何物種。

在特定的示例性實施例中，與TGFβ結合之抗體為一人源化抗體、全人類抗體或其變體，或其抗原結合片段。較佳的抗-TGFβ抗體係防止TGFβ與其受體結合並抑制TGFβ生物活性(例如，TGFβ受體-媒介的胞內SMAD訊號傳遞及產生細胞活性)。

在特定的實施例中，此抗體或其抗原結合片段為樂德木單抗(Lerdelimumab)(CAT-152)、美替木單抗(Metelimumab)(CAT-192)、夫蘇木單抗(Fresolimumab)(GC-1008)、LY2382770、STX-100或IMC-TR1。

在特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含任何一或多個下列互補決定區(CDR)之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)：HCDR1-SNVIS(SEQ ID NO：4)；HCDR2-GVIPIVDIANYAQRFKG(SEQ ID NO：5)；或HCDR3-TLGLVLDAMDY(SEQ ID NO：6)。

在其他特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含任何一或多個下列互補決定區(CDR)之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)：LCDR1-RASQSLGSSYLA(SEQ ID NO：7)；LCDR2-GASSRAP(SEQ ID NO：8)；或LCDR3-QQYADSPIT(SEQ ID NO：9)。

在一特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：4、5和6之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)。

在其他特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：7、8和9之胺基酸序列的輕鏈可變區(LH)。

在更特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：4、5和6之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；以及一包含SEQ ID NO：7、8和9之胺基酸序列的輕鏈可變區(LH)。

在一特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)： (SEQ ID NO：10)。

在另外特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)： (SEQ ID NO：11)。

在更特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的輕鏈可變區(LH)。

在某些實施例中，與TGFβ結合之抗體進一步係包括一恆定區，例如，人類IgG恆定區。在某些實施例中，此恆定區為一人類IgG4恆定區。在另外的實施例中，此恆定區為一修飾的人類IgG4恆定區。較佳地， 此IgG4恆定區係包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列： (SEQ ID NO：12)。

在其他的實施例中，此恆定區為人類Cκ恆定區。較佳地，此Cκ恆定區係包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列： (SEQ ID NO：13)。

在特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈： (SEQ ID NO：14)。

位置1-120：重鏈之可變區(VH)。CDR(互補決定區，根據Kabat定義)加底線。

位置121-447：人類IgG4之恆定區(SwissProt IGHG4_HUMAN)。

在其他特定的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈： (SEQ ID NO：15)。

位置1-108：輕鏈之可變區(VL)。CDR(互補決定區，根據Kabat定義)加底線。

位置109-215：人類Cκ之恆定區。

在另外的實施例中，與TGFβ結合之抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈，及一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。

在某些實施例中，與TGFβ結合之抗體係藉由一包括前導序列之宿主細胞。此前導序列較佳地係包括一1-30個胺基酸長度之胺基酸序 列，更佳地25-25個胺基酸，及最佳地19個胺基酸。重鏈、輕鏈，或重鏈和輕鏈二者可包括一前導序列。

例如，輕鏈或重鏈前導序列可包括SEQ ID NO：16：MGWSCIILFL VATATGVHS(SEQ ID NO：16)之胺基酸序列。因此，一可表現未處理重鏈之宿主細胞可包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列： (SEQ ID NO：17) 其中位置1-19：前導序列

位置20-139：重鏈之可變區(VH)。CDR(互補決定區，根據Kabat定義)加底線。

位置140-466：人類IgG4之恆定區(SwissProt IGHG4_HUMAN)。

在其他示例性實施例中，表現未處理輕鏈之宿主細胞可包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列： (SEQ ID NO： 18) 其中位置1-19：前導序列

位置20-127：輕鏈之可變區(VL)。CDR(互補決定區，根據Kabat定義)加底線。

位置128-234：人類Cκ之恆定區。

在本發明示例性實施例中，與TGFβ結合之抗體為一人源化或全長人類抗體。人源化和全長人類抗體同型之實例包括IgA、IgD、IgE、 IgG和IgM。較佳地，抗-TGFβ抗體為一IgG抗體。有四種IgG形式。較佳地，此抗-TGFβ抗體為一IgG4抗體。在本發明一實施例中，此抗-TGFβ抗體為一人源化IgG4抗體。在本發明另外的實施例中，此抗-TGFβ抗體為一全長的人類IgG4抗體。

在本發明一最佳的實施例中，此抗-TGFβ抗體為一IgG4抗-TGFβ抗體，其係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈及一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。在本發明一替代的最佳實施例中，此抗-TGFβ抗體為一包括一重鏈可變區和一輕鏈可變區之IgG4抗-TGFβ抗體，該重鏈可變區係包括3個包含SEQ ID NO：4、5和6之胺基酸序列的互補決定區(CDR)，而該輕鏈係包括3個包含SEQ ID NO：7、8和9之胺基酸序列的CDR。抗-TGFβ抗體，包括包含SEQ ID NO：14之重鏈胺基酸序列和包含SEQ ID NO：15之輕鏈胺基酸序列以及對應SEQ ID NO：4-9之CDR序列的抗-TGFβ抗體之鑑別、分離、製備和定性，已詳述於美國專利第7,723,486號和美國專利第8,383,780號中，其各自係以全文引用的方式併入本文中。

較佳地，此抗體或其抗原結合片段為「泛專一性」並與人類TGFβ1、TGFβ和TGFβ3結合。更佳地，此抗體或其抗原結合片段係與人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3結合並作為一拮抗劑。最佳地，此抗體或其抗原結合片段係與TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3結合並中和人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。適用於本發明方法中之示例的泛-專一性抗-TGFβ單株抗體(mAb)係描述於美國專利第7,723,476號和美國專利第8,383,780號中，其各自係以全文引用的方式併入本文中。

1D11.16為一示例的鼠科泛-專一性抗-TGFβ抗體，其在廣泛範圍之活體外分析中中和人類和小鼠TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(Dasch等人， 1989；Dasch等人，1996；R&D System product sheet for MAB1835，其各自係以全文引用的方式併入本文中)且在纖維化之動物模型的理論證明研究中為有效的(Ling等人，2003；Miyajima等人，2000；Schneider等人，1999；Khanna等人，1999；Shenkar等人，1994)。然而，因為1D11.16為一鼠科單株抗體(Dasch等人，1989；Dasch等人，1996)，其就人類之治療用途而言並不佳。因此，在特定的實施例中，係將1D11.16抗體之變體或衍生物用於本發明之方法中。

如上所示，本發明之特定的實施例亦包括抗-TGFβ抗體之變體或衍生物。特言之，本發明可包括抗-TGFβ抗體之變體，其為一IgG4抗-TGFβ抗體，係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈和一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。在其他的實施例中，本發明係包括1D11.16抗體之變體和衍生物。抗-TGFβ抗體之變體可具有以其高類似性為基礎之類似的物化性質，且因此亦包括在本發明之範圍內。變體係定義為帶有與文中所述的抗-TGFβ抗體至少80%，至少90%，至少95%或至少97%，例如，至少98%或99%同源性之胺基酸序列，且能競爭與TGFβ多肽、TGFβ多肽片段或TGFβ表位結合之抗體。較佳地，此等變體應能改善、中和或另外抑制TGFβ與其受體結合及TGFβ生物活性(例如，TGFβ受體-媒介的胞內SMAD訊號傳遞和產生細胞活性)。測定與目標結合之競爭可藉由熟習本項技術者已知的例行方法來進行。較佳地，此等變體為人類抗體，及較佳地為IgG4分子。在較佳的實施例中，變體在胺基酸序列上係至少90%、95%、96%、97%、98%或99%與IgG4抗-TGFβ抗體相同，其中此IgG4抗-TGFβ抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈和一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。術語「變體」係指包括一胺基酸序列之抗體，其中此胺基酸序列，相較於抗-TGFβ抗體之胺基酸序列，係具有一或 多個胺基酸改變。此變體可具有保守性序列修飾，包括胺基酸取代、修飾、添加和刪除。

修飾之實例包括(但不限於)糖基化、乙醯基化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、以已知的保護/阻斷基團衍生化、蛋白分解性裂解以及連結細胞配體或其他蛋白。胺基酸修飾可藉由本項技術中已知的標準技術來進行，例如定點突變、分子選殖、寡核苷酸定向突變以及編碼抗體之核酸中隨機PCR-媒介的突變。保守性胺基酸取代包括其中胺基酸殘基係經具有類似結構或化學性質之胺基酸殘基所置換。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族在本項技術中已有定義。這些家族包括帶有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)，酸性側鏈(例如，天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電的極性側鏈(例如，天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)，非極性側鏈(例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫銨酸)，β-支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。熟習技術者應明瞭，亦可使用上述所用以外的胺基酸殘基家族種類。再者，一變體可能具有非保守性胺基酸取代，例如，以具有不同結構或化學性質之胺基酸殘基取代一胺基酸。類似小的變異亦可包括胺基酸刪除或插入或二者。測定哪一個胺基酸殘基可被取代、修飾、插入或刪除而不會消除免疫活性之指南，可使用本項技術中熟知的電腦程式來尋找。電腦運算法例如，其中包括，Gap或Bestfit，其已為熟習本項技術者所知，可用於最佳化對齊胺基酸序列進行比較並定義類似或相同的胺基酸殘基。相較於抗-TGFβ抗體，變體可具有相同或不同，更高或更低的結合親和力，但仍能專一與TGFβ結合，且可具有與抗-TGFβ抗體相同、更高或更低的生物活性。

本發明之實施例亦包括抗-TGFβ抗體之抗原結合片段。術語 「抗原結合區」、「抗原結合片段」及類似術語係指包括與抗原相互作用及授予結合劑其對抗原的專一性和親和力之胺基酸殘基的抗體部份(例如，互補決定區(CDR))。抗原結合區可衍生自任何動物物種，例如嚙齒類(例如，兔、大鼠或倉鼠)和人類。較佳地，此抗原結合區應為人類來源。抗原結合片段之非限定實例包括：Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)分子、dAb片段及由模擬抗體之高可變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位。

F.治療性給藥

文中所述的方法包括將一治療上有效量之與TGFβ結合的抗體投予一患者。如文中所述，「治療上有效量」一詞係指與TGFβ結合之抗體的劑量對一或多個與OI有關的癥狀產生可偵測的改善，或造成生物效用(例如，降低特定生物標記之量)其係與引起成骨不全之症狀或癥狀的潛在病理機制相關。例如，與TGFβ結合之抗體的劑量，其增加骨礦物質密度、增加骨量及/或骨強度、降低骨及/或牙齒碎裂，及/或改善任何OI之診斷測量，則被視為一治療上有效量。

在一實施例中，骨礦物質密度、骨量及/或骨強度係在以結合TGFβ的抗體治療後增加約5%至約200%。在特定的實施例中，骨礦物質密度、骨量及/或骨強度係在以結合TGFβ的抗體治療後增加約5%至約10%，10%至約15%，15%至約20%，20%至約25%，25%至約30%，30%至約35%，35%至約40%，40%至約45%，45%至約50%，50%至約55%，55%至約60%，60%至約65%，65%至約70%，70%至約75%，75%至約80%，80%至約85%，85%至約90%，90%至約95%，95%至約100%，100%至約105%，105%至約110%，110%至約115%，115%至約120%，120%至約125%，125%至約130%，130%至約135%，135%至約140%，140%至約145%，145% 至約150%，150%至約155%，155%至約160%，160%至約165%，165%至約170%，170%至約175%，175%至約180%，180%至約185%，185%至約190%，190%至約195%，或195%至約200%。

在特定的實施例中，降低血清之骨再吸收生物標記，例如尿羥脯胺酸、尿總吡啶啉(PYD)、尿油離去氧吡啶啉(DPD)、尿第I型膠原蛋白交聯的N-端胜肽(NTX)、尿或血清第I型膠原蛋白交聯的C-端胜肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP)之抗體劑量，係被視為一治療上有效量。在一實施例中，血清之骨再吸收生物標記係在以結合TGFβ之抗體治療後降低約5%至約200%。

在一實施例中，血清之骨再吸收生物標記，例如尿總吡啶啉(PYD)、尿油離去氧吡啶啉(DPD)、尿第I型膠原蛋白交聯的N-端胜肽(NTX)、尿或血清第I型膠原蛋白交聯的C-端胜肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP)，係在以結合TGFβ的抗體治療後降低約5%至約10%，10%至約15%，15%至約20%，20%至約25%，25%至約30%，30%至約35%，35%至約40%，40%至約45%，45%至約50%，50%至約55%，55%至約60%，60%至約65%，65%至約70%，70%至約75%，75%至約80%，80%至約85%，85%至約90%，90%至約95%，95%至約100%，100%至約105%，105%至約110%，110%至約115%，115%至約120%，120%至約125%，125%至約130%，130%至約135%，135%至約140%，140%至約145%，145%至約150%，150%至約155%，155%至約160%，160%至約165%，165%至約170%，170%至約175%，175%至約180%，180%至約185%，185%至約190%，190%至約195%，或195%至約200%。

在特定的實施例中，增加血清之骨沉積生物標記，例如總鹼性磷酸酶、骨-專一性鹼性磷酸酶、骨鈣素及第I型前膠原蛋白(C-端/N-端) 之劑量，，係被視為一治療上有效量。在一實施例中，血清之骨沉積生物標記係在以結合TGFβ之抗體治療後增加約5%至約200%。

在一實施例中，血清之骨沉積生物標記，例如總鹼性磷酸酶、骨-專一性鹼性磷酸酶、骨鈣素及第I型前膠原蛋白(C-端/N-端)，係在以結合TGFβ的抗體治療後增加約5%至約10%，10%至約15%，15%至約20%，20%至約25%，25%至約30%，30%至約35%，35%至約40%，40%至約45%，45%至約50%，50%至約55%，55%至約60%，60%至約65%，65%至約70%，70%至約75%，75%至約80%，80%至約85%，85%至約90%，90%至約95%，95%至約100%，100%至約105%，105%至約110%，110%至約115%，115%至約120%，120%至約125%，125%至約130%，130%至約135%，135%至約140%，140%至約145%，145%至約150%，150%至約155%，155%至約160%，160%至約165%，165%至約170%，170%至約175%，175%至約180%，180%至約185%，185%至約190%，190%至約195%，或195%至約200%。

其他的實施例包括投予一治療上有效量的抗體，其係改善受OI影響之非骨骼器官的功能。例如，一劑量之結合TGFβ的抗體，其改善了聽力、肺及/或腎功能，係被視為一治療上有效量。

依照本發明之方法，與TGFβ結合之抗體的治療上有效量，將依照患者之年齡和體型大小(例如，體重或體表面積)以及給藥路徑和其他本項技術之一般技術者熟知的因素而變，投予患者。

在特定的示例性實施例中，抗-TGFβ抗體係以皮下給劑投予患者。其他示例性給藥模式包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、鼻內、硬膜外和口服路徑。組成物可藉由任何方便的路徑來給藥，例如藉由輸注或團注，經由上皮或黏膜層吸收(例如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)及可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部的。TGFβ抗體可 以非經腸或皮下給藥。

各種的遞送系統已為所知並可用於投予此醫藥組成物，例如例如，包膠之微脂體、微粒、微膠囊、媒介內吞作用之受體(參見，例如Wu等人，(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。治療組成物係與併入調配物中之適合的載劑、賦形劑和其他試劑，用以提供改良的轉運、遞送、耐受性等等，來給藥。許多適當的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些調配物包括，例如粉末、糊漿、軟膏、膠凍、蠟、油類、脂類、含有囊泡(例如LIPOFECTIN^TM)之脂質(陽離子或陰離子)、DNA接合物、無水吸收糊漿、水包油和油包水乳化液、乳化碳蠟(carbowax)(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠以及含碳蠟之半固體混合物。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。

醫藥組成物可製備成適合活性成份劑量之單位劑量的劑型。此單位劑量之劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。

醫藥組成物亦可使用任何可接受的裝置或機制投予患者。例如，給藥可使用注射器和針或以可重複使用的筆及/或自動注射器遞送裝置來進行。本發明之方法包括使用許多可重複使用的筆及/或自動注射器遞送來投予TGFβ結合劑(或包括結合劑之醫藥調配物)。此等裝置之實例包括(但不限於)AUTOPEN^TM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)，DISETRONIC^TM筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)，HUMALOG MIX 75/25^TM筆，HUMALOG^TM筆，HUMALIN 70/30^TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)，NOVOPEN^TM I,II and III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)，NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk,Copenhagen, Denmark)，BD^TM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)，OPTIPEN^TM，OPTIPEN PRO^TM，OPTIPEN STARLET^TM和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅提出一些。已應用於皮下遞送醫藥組成物之拋棄型筆型及/或自動注射器遞送裝置之實例包括(但不限於)SOLOSTAR^TM筆(sanofi-aventis)，FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)及KWIKPEN^TM(Eli Lilly),the SURECLICKTM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)，PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)，EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park,IL)，僅提出一些。

文中亦涵蓋使用微注入器(microinfusor)將TGFβ結合劑(或包括結合劑之醫藥調配物)遞送給患者。如文中所用，術語「微注入器」係指設計用於在一段較長的時間(例如，約10、15、20、25、30分鐘或更久)緩慢投予大量的(例如，至高約2.5mL或更多)治療組成物之皮下遞送裝置。參見，例如，U.S.6,629,949；US 6,659,982；和Meehan等人，J.Controlled Release 46：107-116(1996)。微注入器對於遞送高濃度內含大劑量的治療性蛋白(例如，約100、125、150、175、200或更高mg/mL)及/或黏性溶液特別有用。

G.組合治療

在特定的方面，本發明係包括治療OI之方法，其包括將結合TGFβ的抗體和至少一種另外的治療劑組合物投予需要此治療的患者。可與抗-TGFβ抗體組合給藥用於施行本發明方法之另外的治療劑之實例包括(但不限於)雙磷酸鹽、降鈣素(calcitonin)、特立帕肽(teriparatide)及任何其他已知用於患者中治療、預防或改善成骨不全之化合物。在本發明方法中，另外的治療劑可與結合TGFβ的抗體同時或先後給藥。例如，就同時給藥，可製造一含有結合TGFβ的抗體和至少一種另外的治療劑二者之醫藥調配 物。在一實施例中，結合TGFβ的抗體係與醫藥雙磷酸鹽組合給藥(例如，依替膦酸鹽(Etidronate)、氯甲雙磷酸鹽(Clodronate)、替魯膦酸鹽(Tiludronate)、帕米膦酸鹽(Pamidronate)、奈立膦酸鹽(Neridronate)、奧帕膦酸鹽(Olpadronate)、阿侖膦酸鹽(Alendronate)、埃本膦酸鹽(Ibandronate)、唑來膦酸鹽(Zoledronate)和利塞膦酸鹽(Risedronate))。在另外的實施例中，結合TGFβ的抗體係與刺激骨形成之藥劑，例如副甲狀腺激素類似物和降鈣素組合給藥。又在另外的實施例中，結合TGFβ的抗體係與選擇性雌激素受體調節劑(SERM)組合給藥。在本發明方法之施行中，與結合TGFβ的抗體組合給藥之另外的治療劑之量可使用本項技術中已知及可取得的例行方法容易地測定。

圖1A(西方墨點)和1B-1F(圖)係顯示，相較於野生型對照組，TGFβ訊號傳遞在Crtap^-/-小鼠之骨骼中為升高的。

圖2A(冷光照片)和2B-C(圖)係顯示，相較於野生型對照組，與TGFβ受體小鼠相交的Crtap^-/-小鼠展現較高的TGFβ活性。

圖3為經小鼠泛專一性抗-TGFβ抗體1D11治療之Crtap^-/-小鼠的椎骨μCT影像。

圖4為含有經小鼠泛專一性抗-TGFβ抗體1D11治療之Crtap^-/-小鼠的椎骨之定量測量值的圖。

圖5為經小鼠泛專一性抗-TGFβ抗體1D11治療之Crtap^-/-小鼠的椎骨之組織形態分析。

圖6A和6B為顯示，如三點彎曲試驗所測定，經小鼠泛專一性抗-TGFβ抗體1D11治療之Crtap^-/-小鼠的股骨之生物力學性質的圖(圖6A-最大承載， 及圖6B-剛度)。

圖7A和7B(顯微影像)和7C(圖)係顯示經小鼠泛專一性抗-TGFβ抗體1D11治療之Crtap^-/-小鼠的肺表現型。

圖8為經抗-decorin抗體染色之Crtap^-/-和WT肺的顯微影像。

圖9為描述decorin結合分析之圖。

圖10為一組顯現Crtap^-/-小鼠中TGFβ訊號傳遞增加之圖式、照片和影像。圖10A為一系列三個圖，其係顯示TGFβ目標基因p21、PAI-1和Col1a1之定量RT-PCR結果。此圖式顯示在P3 WT和Crtap^-/-小鼠之顱骨中TGFβ訊號傳遞增加。結果係以WT組之平均值±SD的倍數變化來表示；每組n=5，*p<0.05。圖10B為P3顱骨蛋白萃取物之西方墨點分析照片，其顯示Crtap^-/-對WT小鼠中活化的Smad2(pSmad2)相對於總Smad2蛋白的增加量，其意味TGFβ-訊號傳遞增加；每組n=3。圖10C為顯示如圖10B中所示的西方墨點之定量分析圖。結果係以WT組之平均值±SD的倍數變化來表示，*p<0.05。圖10D係顯示，相較於與TGFβ-受體小鼠(SBE-Luc小鼠)互交的WT小鼠，在與Crtap^-/-之骨架結構重疊的區域，其生物發光增加之影像。係顯示在P10，3窩之代表性影像。相較於WT小鼠(比例尺=1cm)，在3窩Crtap^-/-小鼠在頭/顱中顯示平均2.86倍(SD±0.34)生物發光訊號。圖10E為顯示使用TGFβ受體細胞株，於條件培養基中評估來自於成骨條件下培養3天的WT和Crtap^-/-骨髓基質細胞之TGFβ活性的圖，其相較於來自WT細胞之培養基，顯現較大的TGFβ活性。結果係以WT組之平均值±SD的倍數變化來表示，每組n=5，*p<0.05。圖10F為二張顯示pSmad2之肺部(P10)免疫染色的照片，其顯示WT和Crtap^-/-小鼠中細胞內染色增加(放大40X)。其係顯示每組n=3隻小鼠之代表性影像(比例尺=20μm)。

圖11為一組顯示經TGFβ中和抗體1D11治療後之Crtap^-/-小鼠的表型 校正之照片和圖式。圖11A為一系列三張16-週-大野生型(WT)、經對照抗體治療的Crtap^-/-和經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠在治療8週後之L4椎骨體的MicroCT影像。圖11B為一組三張顯現L4椎骨體之MicroCT結果的圖，其顯示在WT、對照Crtap^-/-和經1D11治療的Crtap^-/-小鼠中，骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)和厚度(Tb.Th)增加。結果係以平均值±SD來表示，每組n=8，就Crtap^-/- 1D11對Crtap^-/-對照組*p<0.05，就Crtap^-/-對WT，p<0.05。圖11C為一組三張顯示L4椎骨之組織形態分析結果的圖，其顯示，相較於WT，Crtap^-/-小鼠中和每骨表面積之破骨細胞(N.Oc/BS)和成骨細胞(N.Ob/BS)數目增加。經1D11治療後破骨細胞和成骨細胞數目減低表示有效的抑制Crtap^-/-小鼠中加速的骨重塑。在Crtap^-/-小鼠中增加的每骨面積之骨細胞數目(N.Ot/B.Ar)在1D11治療後降至WT程度。結果係以平均值±SD來表示，每組n=6，就Crtap^-/- 1D11對Crtap^-/-對照組，*p<0.05；就Crtap^-/-對WT，p<0.05。圖11D為一系列三張照片顯示16-週-大野生型(WT)、對照Crtap^-/-和經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠在治療8週後之充氣肺部蘇木素(hematoxylin)/伊紅(eosin)染色。相較於WT小鼠，Crtap^-/-對照小鼠顯現末端氣管間隙增加。經1D11治療後，相較於對照Crtap^-/-小鼠，末端氣管直徑降低。所顯示的為每組n=8隻小鼠之代表性影像(比例尺=100μm)。圖11E為顯示藉由平均截線長度(MLI)法定量蜂窩結構間的距離，其相較於經對照抗體治療的Crtap^-/-和WT小鼠，在經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠中顯示末端氣管間隙顯著減低。結果係平均值±SD來表示，每組n=8隻小鼠，每隻小鼠分析10個影像，就Crtap^-/- 1D11對Crtap^-/-對照組*p<0.05，就Crtap^-/-對WT，+p<0.05。

圖12為一系列顯示與第I型膠原蛋白結合的核心蛋白聚糖(decorin)和P986 3Hyp位置重疊之圖且在Crtap^-/-小鼠之第I型膠原蛋白中為降低的。圖 12A為一組三張圖，顯示P3小鼠之顱骨的定量RT-PCR結果，其相較於WT，在Crtap^-/-小鼠的顱骨內小的富含白胺酸蛋白聚糖decorin(Dcn)、雙糖鏈蛋白聚糖(Bgn)和asporin(Aspn)之RNA表現並未顯現差異。結果係以WT組之平均值±SD的倍數變化來表示；每組n=5。圖12B為顯示表面電漿共振分析之結果的圖，其係指出重組的decorin核心蛋白與Crtap^-/-小鼠之第I型膠原蛋白的結合係比WT第I型膠原蛋白低約45%。使用3、5和12μM的decorin進行三個獨立的實驗。所顯示的為正常化至固定在晶片上之第I型膠原蛋白的總decorin結合量之反應單位。與Crtap^-/-第I型膠原蛋白結合的decorin之平均下降為44.6±7.9%。

圖13為一系列圖和照片，係顯示抑制TGFβ訊號傳遞增加，改善了因Col1a2基因中之G610C突變(Col1α2^tml.1Mcbr)造成顯性遺傳OI之小鼠模型中的骨表現型。圖13A為二個顯示TGFβ目標基因p21和PAI-1之定量RT-PCR結果的圖，其係指出P3 WT和Col1α2^tml.1Mcbr小鼠的顱骨中TGFβ訊號傳遞增加。結果係以WT組之平均值±SD的倍數變化來表示；每組n=3，*p<0.05。圖13B為西方墨點分析之結果照片，其係顯示在WT和Col1α2^tml.1Mcb小鼠的P3顱骨中，相較於WT，活化的Smad2(pSmad2)相對於Smad2蛋白總量的增加量，其意味TGFβ-訊號傳遞增加；每組n=3。圖13C為顯示圖13B中所示的西方墨點之定量圖。結果係以WT組之平均值±SD的倍數變化來表示；*p<0.05。圖13D為一系列16-週-大野生型(WT)、對照抗體治療的Col1α2^tml.1Mcbr和1D11-治療的Col1α2^tml.1Mcbr小鼠在治療8週後之L4椎骨體的MicroCT影像照片。圖13E為一系列來自L4椎骨體之MicroCT的數據照片，其顯示在經1D11治療的Col1α2^tml.1Mcbr小鼠中骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)和厚度(Tb.Th)增加。結果係以平均值±SD來表示；每組n=6，就Col1α2^tml.1Mcbr 1D11對Col1α2^tml.1Mcbr對照組，*p<0.05；就 Col1α2^tml.1Mcbr對WT，+p<0.05。

圖14為重量曲線圖，其係顯示在研究期間，相較於WT，Crtap^-/-小鼠之重量降低(就所有的時間點p<0.05，係以平均值±SE表示)。相較於對照的Crtap^-/-小鼠，在1D11-治療的Crtap^-/-小鼠中並未觀察到統計上顯著差異。

圖15為一系列的圖和表格，係顯示Crtap^-/-小鼠中TGFβ抑制對異常的第I型膠原蛋白後轉譯修飾並無效用。圖15A為一系列三個圖，係顯示由WT、對照Crtap^-/-和1D11-治療的Crtap^-/-小鼠(16週大，治療8週後)之脛骨所萃取的第I型膠原蛋白之串聯式質譜。上方圖式中的序列為SEQ ID NO：19，中間圖式中的序列為SEQ ID NO：20，下方圖式中的序列為SEQ ID NO：21。圖15B為一顯示串聯式質譜分析之彙總的表格。在骨樣本中1D11治療並未顯著地影響膠原蛋白殘基Pro986 α1(I)之3-羥基化狀態。所顯示的為3-羥基化殘基之平均百分比(±SD)，每組n=5。圖15C為一組三個圖，係顯示，相較於WT小鼠，對照Crtap^-/-和1D11-治療的Crtap^-/-小鼠之骨第I型膠原蛋白在羥離胺酸吡啶啉(HP)和離胺酸吡啶啉交聯(LP)量上出現變化，且HP/LP比率增加。相較於對照Crtap^-/-小鼠，1D11治療的Crtap^-/-小鼠並未顯著地影響這些參數。結果係以平均值±SD來表示；每組n=4，就Crtap^-/-對WT，+p<0.05。

圖16為一系列的圖，係顯示在治療研究開始(圖16A=8週大)和結束(圖16B=16週大)時，血清骨-轉換標記骨鈣素(osteocalcin)(OCN)和骨膠原蛋白之C-端交聯的端胜肽(CTX)。圖16A為二個圖，係顯示相較於研究開始時的WT小鼠，在8週大的Crtap^-/-中OCN和CTX血清量增加，表示Crtap^-/-小鼠中骨轉換增加。結果係以平均值±SD來表示；WT每組n=8，對照Crtap^-/-每組n=14，就Crtap^-/-對WT，+p<0.05。圖16B為二個圖，其係顯示，相較於對照的Crtap^-/-小鼠，在16週大經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠中顯現血清 OCN降低及CTX血清量顯著降低之趨勢，其表示藉由抑制TGFβ而抑制了增加的骨轉換。結果係以平均值±SD來表示；WT每組n=8，對照Crtap^-/-每組n=7，就Crtap^-/- 1D11對Crtap^-/-對照組，*p<0.05；就Crtap^-/-對WT，+p<0.05。

圖17為一表格係顯示WT、對照Crtap^-/-和經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠(16-週-大，治療8週後)之椎骨體L4的MicroCT分析結果。平均值±SD係顯示骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)和骨體積之骨礦物質密度(BMD BV)；每組n=8，+表示Kruskal-Wallis單因子等級ANOVA，其中相同變異數試驗失效。n.s.=非統計上顯著的。

圖18為一表格係顯示WT、對照Crtap^-/-和經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠(16-週-大，治療8週後)之近端股骨中骨小梁之MicroCT分析結果(16-週-大，治療8週後)。平均值±SD係顯示骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和骨體積之骨礦物質密度(BMD BV)；每組n=8，+表示Kruskal-Wallis單因子等級ANOVA，其中相同變異數試驗失效。n.s.=非統計上顯著的。

圖19為一表格係顯示WT、對照Crtap^-/-和經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠(16-週-大，治療8週後)之股骨中段的皮質骨之MicroCT分析結果(16-週-大，治療8週後)。平均值±SD係顯示皮質骨厚度、骨礦物質密度(BMD BV)、前後(a.p.)徑、橫截面面積(CSA)和中側(m.l.)及前後(a.p.)軸之截面慣性矩(CSMI)；每組n=8。n.s.=非統計上顯著的。

圖20為一表格係顯示三點彎曲之股骨的生物力學試驗結果(16-週-大，治療8週後)。相較於WT小鼠，對照的Crtap^-/-小鼠，除了彈性模數和彈性移位外，係展現顯著的生物力學參數下降。1D11之抗TGFβ-治療使得Crtap^-/- 股骨中最大承載和極限強度顯著改善，其表示整體骨骼和組織強度增加。然而，在降服後移位中並未觀察到顯著變化，其表示1D11並未影響OI骨骼中脆性增加。WT為N=6，對照Crtap^-/-為n=4，而1D11治療Crtap^-/-小鼠為n=3。n.s.=非統計上顯著的。

圖21為一表格係顯示WT、對照Crtap^-/-和經1D11-治療的Crtap^-/-小鼠(16-週-大，治療8週後)之L4椎骨體的組織型態學分析結果。平均值±SD係顯示骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、破骨細胞數目/骨表面(N.Oc/BS)、破骨細胞表面/骨表面(Oc.S/BS)、破骨細胞數目/骨表面(N.Ob/BS)、破骨細胞表面/骨表面(Oc.S/BS)和骨細胞數目/骨面積(N.Ot/B.Ar)；每組n=6，+表示Kruskal-Wallis單因子等級ANOVA，其中相同變異數試驗失效。n.s.=非統計上顯著的。

圖22為一表格係顯示WT、對照Col1α2^tml.1Mcbr和經1D11治療的Col1α2^tml.1Mcbr小鼠(16-週-大，治療8週後)之L4椎骨體的MicroCT分析結果。平均值±SD係顯示骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和骨體積之骨礦物質密度(BMD BV)；每組n=6，n.s.=非統計上顯著的。

圖23為顯示表面電漿共振分析之圖，其係測量重組的decorin核心蛋白與WT和Crtap^-/-小鼠之第I型膠原蛋白的結合。由二個獨立性生物樣本(◆樣本1，▲樣本2)於各所指濃度進行三重複技術性樣本。結果係以WT之平均值的百分比表示(條形係指每組之平均)。

圖24(顯微影像)係顯示WT和Crtap^-/-小鼠之遠端股骨幹骺端中decorin之免疫染色，放大20X，每表現型n=3，比例尺=100μm(圖24A-24C)及放大40X，每表現型n=3，比例尺=50μm(圖24D-24F)。對照的股骨僅以第二抗體培養。

圖25(顯微影像)係顯示WT和Crtap^-/-小鼠之遠端股骨幹骺端中TGFβ1之免疫染色，放大20X，每表現型n=3，比例尺=100μm(圖25A-25C)及放大40X，每表現型n=3，比例尺=50μm(圖25D-25F)。對照的股骨僅以第二抗體培養。

圖26(顯微影像)係顯示WT和Col1α2^tml.1Mcbr小鼠之遠端股骨幹骺端中TGFβ1之免疫染色，放大20X，每表現型n=3，比例尺=100μm(圖26A-26C)及放大40X，每表現型n=3，比例尺=50μm(圖26D-26F)。對照的股骨僅以第二抗體培養。

實例

OI為一廣泛性結締組織疾病，其中罹患的個體由於第I型膠原蛋白之α1或α2鏈的主要序列突變，出現第I型膠原蛋白原纖維形成異常以及第I型膠原蛋白之後轉譯修飾和結合第I型膠原蛋白原纖維之蛋白異常。CRTAP係編碼一稱為軟骨相關蛋白之蛋白，一脯醯胺基-3-羥基化複合物之成員，其功能係協助第I型膠原蛋白之妥適的摺疊、後轉譯修飾和分泌。CRTAP之突變造成了第VII型成骨不全。缺乏Crtap基因(Crtap^-/-)之小鼠出現模擬成骨不全症之表現型，並用作為此疾病的模型(Morello等人，2006)。在下列實例中係使用Crtap^-/-小鼠和年齡-相符的野生型(WT)同窩對照組。

材料和方法 動物、抗-TGFβ治療及組織收集

以混合的C57Black/6J/129Sv基因為背景產生和維護Crtap^-/-小鼠。得到在Col1a2基因上帶有G610C突變之小鼠(Col1α2^tml.1Mcbr)並與野生型C57Bl/6J小鼠交配。使用Col1α2^tml.1Mcbr等位基因雜合的小鼠進行實驗。得到表現反應Smad2/3依賴的TGFβ訊號傳遞路徑之螢光酶TGFβ-受體小 鼠(SBE-Luc小鼠)並與Crtap^+/-小鼠交配二代，產生Crtap^-/-小鼠和表現受體轉殖基因之野生型同窩。所有的小鼠係圈養於一飼養箱且動物實驗係依照核准的動物照護及使用委員會之協議(IACUC)來進行。

就蛋白和RNA分析，係將P3小鼠的顱骨分離，清潔骨骼外組織，並以液態氮急速冷凍。就Crtap^-/- P10小鼠肺之免疫染色，係將各小鼠的肺在25cm H₂O恆壓施予4%三聚甲醛安樂死後立即同等地充氣，及然後輕緩地從胸腔剖開並固定於4%三聚甲醛中至隔夜。

以泛-TGFβ中和抗體1D11治療8週大雌性Crtap^-/-和Col1α2^tml.1Mcbr小鼠8週(10mg/kg體重，I.P.注射每週3次)。對照的Crtap^-/-、Col1α2^tml.1Mcbr和WT小鼠係接受相同的IgG1同型之對照抗體(13C4)。治療後，讓小鼠安樂死，並收集脊椎和股骨，及固定於10%福馬林中供microCT和骨組織形態測定之用。將Crtap^-/-小鼠的對側股骨以浸泡食鹽水的紗布包裹儲存於-20℃直到進行生物力學試驗。如P10小鼠所述，將這些Crtap^-/-小鼠的肺同樣充氣、收集和固定。在治療期間並無盲化(blinding)可能，因為1D11或對照抗體係根據群組分配來注射。在所有後續的分析中，研究人員對於基因型和治療組為盲性(未知)。

免疫墨點

從快速冷凍的P3顱骨樣本萃取蛋白，轉置於300μl解離緩衝液中(0.0625M Tris-HCl pH 7.5,2% SDS,5mM NaF,2mM Na₃VO₄和RocheComplete蛋白酶抑制劑)並均質化1分鐘，接著於95℃培養40分鐘。將上清液轉置於離心過濾元件/Amicon Ultra 3K(Millipore)並離心濃縮蛋白。使用Micro BCA試劑(Pierce)，依照製造商的說明，測定解離物之總蛋白濃度。將40μg的顱骨蛋白萃取物懸浮於含有5% β-巰基乙醇之laemmeli緩衝液中並於Mini Protean TGX SDS-PAGE凝膠上分離(梯度4-20%；Bio-Rad)， 及轉置於PVDF膜上進行西方墨點分析。將PVDF膜以pSmad2單株抗體培養(Cell Signaling #3108,1：750溶於含5% BSA之TBST中，至隔夜)，接著第二HRP-連結的抗-兔抗體(GE,1：5000溶於含5% BSA之TBST中，2小時)，以ECL Plus西方墨點偵測系統(GE)處理並曝光於X-光片。隨後，使用ReBlot Plus試劑(Millipore)從膜上剝除抗體，並以Smad2單株抗體培養(Cell Signaling #5339,1：2000溶於含5% BSA之TBST中，至隔夜)，接著類似的第二抗體培養和ECL媒介的顯影(可視化)。掃描X-光片並使用ImageJ軟體(National Institutes of Health)定量各色帶之密度。

定量的即時PCR

總RNA係由急速冷凍的P3小鼠顱骨使用三唑試劑(Invitrogen)萃取。使用Superscript III RT系統(Invitrogen)根據製造商的方法由總RNA來合成cDNA。於LightCycler.v 1.5(Roche)上使用基因-專一性引子和SYBR Green I試劑(Roche)進行定量RT-PCR。使用β2-微小球蛋白作為參照基因用以正常化cDNA濃度。

活體內生物冷光造影

以D-螢光素(Goldbio,150mg/kg,IP)注射P10 Ctrap^-/-小鼠和表現TGFβ-受體轉植殖基因之野生型(SBE-Luc小鼠)，以異氟烷(isoflurane)麻醉，並於注射後10分鐘使用生物冷光造影系統(Xenogen)攝影。

初級成骨細胞培養，TGFβ-受體細胞

由大約2個月大的Crtap^-/-和野生型小鼠之脛骨和股骨分離骨髓細胞並置於添加10% FBS、100U/mL青黴素和100ug/mL鏈黴素之α-MEM中培養。每隔一天更換培養基並將未附著的細胞丟棄。7天後，將附著的細胞，定義為骨髓基質細胞(BMSC)，以每cm² 2.5 x10⁴細胞再植入24-孔盤並於生骨性培養基中(α-MEM,10% FBS,500μM抗壞血酸和10mM β-甘油磷酸)培養3天。收集條件培養基並以PAI-螢光素酶報導子貂肺表皮細胞培養。24小時後，收集細胞溶離液用於螢光素酶活性分析，其係使用雙-螢光素酶報導子系統(Promega)來測量。將結果正常化至使用Micro BCA試劑(Pierce)所定量的總蛋白量。

MicroCT，骨組織形態測量

使用Scanco μCT-40 microCT掃描腰椎和股骨進行骨小梁和皮質骨參數之量化。脊椎和股骨骨小梁參數係使用分析軟體藉由手動調整椎體L4之骨小梁以及股骨之遠側幹骺端切片來分析。在股骨中段中心的皮質骨參數係使用包含在軟體中之自動閥值運算法來量化。

然後將掃描過未脫鈣的Crtap^-/-小鼠脊椎樣本嵌入塑膠進行切片。甲苯胺藍(Toluidine blue)染色及TRAP染色係分別使用Ob's和Oc's之顯影和量化的標準方法，使用Bioquant Osteo造影分析系統來進行。

免疫染色和組織學

就免疫組織化學，係收集P5小鼠的後肢，以4%三聚甲醛固定至隔夜並嵌入石蠟中。去除三聚甲醛和復水後，進行熱-誘導抗原修復(Dako,S1700)，接著以玻尿酸酶(hyaluronidase)處理30分鐘(2mg/ml；Sigma)。使用3%過氧化氫阻斷內生性過氧化酶10min。以阻斷溶液(3%一般山羊血清，0.1% BSA,0.1% Triton X-100溶於PBS)培養後，將切片以TGFβ1之抗體(G1221,Promega)和decorin(LF-113，由Larry Fisher,National Institute of Dental and Craniofacial Research,Bethesda,MD,USA所提供)於37C培養60min(各以PBS之1：25稀釋度，對照樣本僅以PBS培養)，及隨後以第二抗體培養(SuperPicTure Ploymer Detection kit,Invitrogen)。根據製造商的建議加入DAB基質並將樣本脫水及使用Cytoseal XYL二甲苯為基底的封片液(Thermo Scientific)封片。同時處理WT的突變同窩小鼠的切片。以光學 顯微鏡(Axioplan 2,Zeiss)，就WT和突變同窩小鼠係使用相同的曝光時間進行骨小梁之造影。

於組織收集期間將P10和16週大Crtap^-/-小鼠的肺同樣充氣，以4%三聚甲醛固定，及嵌入石蠟中。使用P10 Crtap^-/-和野生型小鼠的肺進行pSmad2之免疫染色。簡言之，以二甲苯處理石蠟切片，復水並加熱20分鐘進行抗原修復(pH 6；Dako)。然後將切片以阻斷溶液培養(3%一般的驢血清，0.1% BSA,0.1% Triton X-100溶於PBS)，及隨後以兔-抗-pSmad2抗體(1：500)(Cell signaling,#3108)，與Alexa flour 594接合之驢抗-兔第二抗體(1：600)(Invitrogen)培養，並以Prolong Gold抗褪色試劑以DAPI(Invitrogen)封片。使用Zeiss顯微鏡(Axiovision Software)使用相同的曝光時間進行這些切片之螢光造影。

就16週大小鼠之肺組織學和形態測量，係使用蘇木素和伊紅染色之標準方法將縱側切片染色。平均截線長度法(MLI)定量蜂窩結構間的距離。簡言之，每隻小鼠係使用光學顯微鏡(Axioplan 2,Zeiss)以放大20X從二邊肺之所有肺葉捕捉10個組織學視野。使用修改的ImageJ軟體(National Institutes of Health,modified by Paul Thompson)測量MLI。以人工移除血管、大氣管和其他非肺泡結構後，此軟體自動測定各影像中肺泡組織的閥值及於影像上以測量21像素之各直線交疊成由1,353條線所組成的線格。使用截取肺泡結構的直線數目來計算MLI。

3-點彎曲之生物力學試驗

Crtap^-/-和WT股骨係藉由三點彎曲使用6mm的跨距以Instron 5848裝置(Instron Inc.,Norwood MA)來測試。所有的股骨係於室溫濕性測量。將其以0.05N/s之速率歷時5秒預先負載至1N。在預負載後，以0.1mm/sec之速率讓股骨負載斷裂。負載和位移數據係於40Hz之速率時藉 由使用BLUEHILL軟體(Instron 5848)來獲取。

降服點之測定，在負載-位移曲線上辨識出於預負載後和最大負載前的區域。將此區域分成5個部份，從其取出具有最大斜率之擬合線段。之後，在線上實行0.012mm偏離。偏離線和負載-位移曲線間的相交點為0.012偏離降服點。此降服點更接近相當0.2%偏移應變(文獻中常選用)。彈性區經鑑別為來自完成預負載至降服點的區域。後-降服區經鑑別為來自降服點後直到負載超過-1N之變化，顯示斷裂點之區域。彈性位移為樣本仍留在彈性區期間的位移。後-降服位移為樣本留在後-降服區期間的位移。總位移係以彈性位移和後-降服位移之總和來計算。使用梯形數值積分法，斷裂能係以負載-位移曲線下的面積來計算。最大負載係藉由找出樣本斷裂前，BLUEHILL所記錄的最高負載值來測定。將最小平方擬合法應用於負載-位移曲線之彈性區的最陡部份，計算硬度。硬度為為最小平方擬合線之斜率。將由股骨中段之microCT分析所得到的幾何數據(直徑和轉動慣量)用於計算材料本徵性質：極限強度、斷裂之硬度和彈性模數。

血清骨轉換標記

使用來自Biomedical Technologies Inc公司之小鼠骨鈣素EIA套組定量血清骨鈣素(steocalcin)(OCN)。骨膠原蛋白之C-端交聯的端胜肽(CTX)係使用來自Immunodiagnostic Systems Ltd.公司之RatLaps^TM EIA套組來定量。二種分析係根據製造商的方法來進行。

膠原蛋白SDS-PAGE，質譜法和交聯分析

就質譜測量，係由Crtap^-/-和野生型脛骨製備第I型膠原蛋白。將骨骼以氯仿/甲醇(3：1 v/v)脫脂，及以0.5M EDTA,0.05M Tris-HCl,pH 7.5去礦化，所有的步驟皆在4℃。將骨骼細碎並將膠原蛋白藉由熱變性(90℃)溶於SDS-PAGE樣本緩衝液中。由SDS-PAGE膠體中切下膠原蛋白α-鏈並 進行膠體內胰蛋白酶消化。於胰蛋白酶肽上使用配置有線上液相層析(LC)(ThermoFinnigan)之LCQ Deca XP離子阱質譜使用C8毛細管柱(300μm x 150mm；Grace Vydac 208 MS5.315)以4.5μl min溶離，進行電噴灑MS。使用NCBI蛋白資料庫，使用Sequest搜尋軟體(ThermoFinnigan)進行胜肽辨識。

吡啶啉交聯(HP和LP)係在以6N HCl將骨骼水解去礦化後，以HPLC來定量。

表面電漿共振分析

表面電漿共振實驗係使用BIACore X儀器(GE Healthcare Bio-Science Corp.)來進行。將來自野生型和Crtap^-/-小鼠之純化的天然小鼠肌腱第I型膠原蛋白，分別在約0.05ng/mm²(500 RU)和0.08ng/mm²(800 RU)濃度藉由醯胺偶合，固定在CM5感測晶片上。實驗係於10μl/min之流速和20℃在HBS-P緩衝液中(10mM Hepes緩衝劑，pH 7.4，含150mM NaCl和0.005%界面活性劑P20)進行。將重組的人類decorin核心蛋白(R&D systems)注射至二個第I型CM5晶片。人類decorin之儲存液濃度係藉由胺基酸分析來測定。decorin對野生型和Crtap^-/-小鼠第I型膠原蛋白之結合反應係藉由CM5感測晶片上固定的第I型膠原蛋白之量來正常化。使用三種decorin濃度(3、5和12μM)，就各濃度，係重複此分析三次。此實驗係以每次分離自不同小鼠的膠原蛋白進行二次。

統計方法

使用非配對、雙尾學生t-試驗進行二組間之比較。就3組間的比較，若確認各組的變異數相等，係進行單因子變異數分析(ANOVA)，接著使用Holm-Sidak法進行全配對多重比較。若等變異數試驗失效，則進行Kruskal-Wallis單因子等級ANOVA，接著使用Tukey試驗進行全配對多 重比較。就學生t-試驗、ANOVA和Kruskal-Wallis單因子等級ANOVA，P值低於0.05係視為統計上顯著的。就事後檢定配對多重比較，依照P值的等級，各P值係與臨界值比較，且比較的總數係用於決定組間的差異是否為顯著的。使用Sigma Plot V11.0(Systat Software Inc.)進行統計分析。

1D11對OI小鼠之骨骼和肺的效用在研究開始時為未知的。就決定每組小鼠之起初的樣本大小，吾等計算出，以90%能量藉由MicroCT偵測1D11和的對照治療OI小鼠間骨量(BV/TV)之20%最小差異，係需要8隻小鼠之群組大小。

實例1：Crtap ^-/- 顱骨中改變TGFβ訊號傳遞

將Crtap^-/-小鼠和年齡相符的野生型(WT)同窩對照就活化的pSmad 2之表現(一TGFβ訊號傳遞路徑之成員)以及其他TGFβ下游目標，進行分析。將顱骨切除並萃取RNA和蛋白及分別以即時-PCR和西方墨點分析。如圖1A和1B所示，如西方墨點所測量及密度測定所定量，相較於WT小鼠，Crtap^-/-小鼠具有100%較高的活化Smad2與總Smad2之比率，其顯示TGFβ訊號傳遞在Crtap^-/-小鼠中為升高的。如RT-PCR所測量及如分別圖1C和圖1D所示，TGFβ之轉錄目標，例如Col1a1和p21，相較於WT對照組為升高的。如RT-PCR所測定及如圖1E所示，測量前纖維化ECM蛋白結締組織生長因子(CTGF)並發現Crtap^-/-小鼠高於WT對照組大約50%。如圖1F所示，RT-PCR分析顯示周期素-依賴的基酶抑制劑p27之表現並未改變Crtap^-/-或WT小鼠。

實例2：在活體及crtap ^-/ -成骨細胞中Crtap ^-/- 小鼠中增加的TGFb活性

將Crtap^-/-小鼠與表現回應TGFβ訊號傳遞活化之螢光素酶的TGFβ報導子小鼠(Jackson Laboratory；B6.Cg-Tg(SBE/TK-luc)7Twc/J)相交。以D-螢光素基質(150mg/kg)注射P9小鼠，10分鐘後進行造影(Xenogen； IVIS攝影系統)。如圖2A所示，Crtap^-/-小鼠在其尾部、長骨和顱骨具有遠高於WT對照組之發光，其顯示在crtap^-/-小鼠中TGFb活性增加。圖2B，顱骨之螢光素酶活性之定量。

從Crtap^-/-小鼠和WT小鼠分離出骨髓基質細胞(BMSC)，於活體外生骨性條件下培養，並使用表現回應TGFβ訊號傳遞活化之螢光素酶的細胞株對條件培養基分析TGFβ活性。如圖2C所示，來自Crtap^-/- BMSC之條件培養基，相較於來自WT小鼠之BMSC，產生大於接近2-倍的報導細胞之螢光素酶活性。這些數據共同係顯示TGFβ分泌和活性在Crtap^-/-小鼠的骨骼和成骨細胞為升高的。

實例3：Crtap ^-/- 脊椎之μCT分析

將1D11(10mg/kg,I.P.,3次/週，總共8週)，一種與TGFβ結合鼠科泛-專一性抗體之替代品(係包括包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈)，投予成年8週大Crtap^-/-小鼠(每組N=6)。將一不相關的13C4抗體投予不同組的Crtap^-/-小鼠和WT小鼠作為對照(N=6)。將16週大的小鼠(從第8-16週治療)之L4椎體以μ-CT造影。經TGFβ中和抗體1D11(Genzyme；10mg/kg,I.P.,3次/週)治療8週之8週大Crtap^-/-小鼠(每組N=6)和野生型(WT)及經對照抗體(13C4-安慰劑)治療的對照Crtap^-/-小鼠的L4椎體之MicroCT數據，係如圖3所示。如圖3所示，相較於WT對照組脊椎，Crtap^-/-脊椎為洞穴狀。然而，1D11治療產生了與WT狀況相當的骨骼表現型。

圖3之數據係量化於圖4中，經泛-專一性抗-TGFβ抗體治療解救了Crtap^-/-小鼠之骨骼表現型。在所測的參數上，包括骨體積密度(BV/TV)、總骨表面(BS)、骨表面密度(BS/BV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)及總體積(Dens TV)，經治療的Crtap^-/-小鼠 之脊椎統計上係類似WT對照小鼠。

實例4：經抗-TGFβ治療的Crtap ^-/- 脊椎之組之形態測量

除了μ-CT之外，係以組織形態測量來分析經抗體治療、經安慰劑治療和WT小鼠之脊椎骨。如圖5A和5B所示，係以組織形態學分析確認μ-CT結果。此外，將組織切片染色用於破骨細胞標記TRAP之表現。分析顯示，相較於WT對照組，在Crtap^-/-小鼠中有更多的破骨細胞覆蓋更多的骨表面(N.Oc/BS和Oc.S/BS)，其表示破骨細胞活性增加。以1D11抗-TGFβ治療將所有的破骨細胞-特定性參數降至WT數值以下。因此，破骨細胞經鑑定為TGFβ抗體，及更特言之泛-專一性抗-TGFβ抗體之一潛在目標。

實例5：抗-TGFβ抗體治療的Crtap ^-/- 股骨之三點彎曲試驗

於16週大(從第8-16週治療後)小鼠之切除的股骨上，使用標準三點彎曲試驗以Instron 5848裝置(Instron Inc.,Norwood MA)以6mm跨距，以0.05N/s之速率歷時5秒預先負載至1N，進行生物力學試驗。在預負載後，以0.1mm/sec之速率壓迫股骨至斷裂。負載和位移數據係於40Hz之速率時藉由使用BLUEHILL軟體(Instron 5848)來獲取。

如圖6所示，Crtap^-/-小鼠股骨剛硬度較低且能抵擋遠小於WT對照小鼠之最大負載。經1D11治療的Crtap^-/-小鼠股骨顯現大幅增加的最大負載，且相較於對照的crtap^-/-小鼠，剛硬度趨向增加。

因此，以1D11泛-專一性抗-TGFβ抗體治療，在質性、量性和生物力學上修復了Crtap^-/-小鼠之骨骼表型。

實例6：以1D11抑制TGFβ訊號傳遞改善了肺表型

Crtap^-/-小鼠具有廣泛性結締組織疾病，其表現為低骨量、腎絲球硬化症及肺發育不良(Baldridge等人；PLoSone,5(5)：e10560(2010))。 如pSmad2之陽性免疫染色所證明及如圖7A中所驗證，在Crtap^-/-小鼠的肺中可看到TGFβ表現增加。如圖7B所示，組織學上，相較於WT小鼠，Crtap^-/-小鼠顯現末端氣管間隙增加。如圖7A和7B所示及圖7C中量化(*P<0.05與對照Crtap^-/-；每隻小鼠分析10個影像，每組n=8隻小鼠)，在Crtap^-/-小鼠中1D11治療(10mg/kg,IP,3x/週進行8週)降低了pSmad2表現並降低末端氣管間隙及改善肺表型。

實例7：Crtap ^-/- 肺中之Decorin表現

評估TGFβ表現之轉錄調節劑以便於了解Crtap^-/-小鼠之骨骼和肺中失調的TGFβ訊號傳遞之依據。一種可調節ECM中TGFβ之主要胞外蛋白係包括富含白胺酸小的蛋白多糖(SLRP)，例如decorin。如圖8所示，相較於WT對照組肺部，在Crtap^-/-肺中免疫染色顯示decorin之表現增加。

因decorin為一成熟TGFβ之調節劑，此發現顯示改變的膠原蛋白之後轉譯修飾，如OI中所發生的，改變了ECM蛋白，包括SLRP之相互作用。Decorin與羥脯胺酸位置結合，例如位於第I和第II型膠原蛋白之396胺基酸殘基者，其在Crta^p-/-小鼠中為缺乏的。進行一decorin結合分析用以測定OI中decorin結合是否為改變的，及此項是否至少部分造成在Crta^p-/-骨骼和小鼠中所觀察到的表現型。如圖9所示，decorin與3-羥基化膠原多肽之結合(如第I和II型膠原蛋白中)多於無羥基化膠原多肽(如第III型膠原蛋白中)。

實例8：TGFβ訊號傳遞增加為全骨不全之共通機制

OI其特徵為脆骨、低骨量、骨骼變形和骨折。此外，骨骼外的表現包括肺異常實質上造成發病和死亡。大多數的OI案例係由編碼第I型膠原蛋白之基因中(COL1A1和COL1A2)體染色體顯性突變所造成。在 最近幾年，另外的基因突變(其中該基因係編碼涉及膠原蛋白之後轉譯修飾的蛋白)已鑑定出係造成OI的隱性型。首先描述的係在軟骨相關蛋白(CRTAP)，一脯醯胺基-3-羥基酶複合物之成員，其係負責第I型膠原蛋白中986 α1(I)脯胺酸殘基之3-羥基化。次形態的CRTAP突變導致纖維狀膠原蛋白中局部喪失3-羥脯胺酸(3Hyp)以及其他殘基之過度修飾並造成第VII型隱性OI，其在臨床上係與嚴重OI之主要型重疊。雖然並未完全了解3Hyp之生理功能，但生化研究顯示其可能涉及膠原蛋白-蛋白交互作用，而非負面的影響膠原蛋白安定性。

ECM為訊號傳遞分子及其調節子之重要儲庫。在骨骼中，TGFβ係藉由局限化骨吸收破骨細胞之活性並形成成骨細胞，作為骨重塑之中樞協調劑。TGFβ係由成骨細胞大量製造，主要係以非活化的潛在形式分泌，並沉積於骨基質中。本處其可在骨再吸收期間由破骨細胞釋放及活化。就另外層級的調節，活化的TGFβ可被蛋白多糖所束縛，調節其與膠原纖相關聯的生物活性。因為第I型膠原蛋白為骨骼中ECM之最豐富的組份，由此引出有趣的假說，在OI中觀察到的膠原蛋白結構之改變不僅增加骨脆弱性，亦影響骨基質之訊號傳遞儲庫功能。有趣地，Crtap^-/-小鼠顯現與TGFβ訊號傳遞增加之動物模型重疊的表現型。例如，TGFβ過度表現造成低骨量。此外，Crtap^-/-小鼠顯現肺中肺泡氣道間隙加大，其係與馬凡氏症候群之小鼠模型中所觀察到的相類似，其中TGFβ訊號傳遞增加已顯示為肺病變之主要因素。因此，係於Crtap^-/-小鼠模型中研究TGFβ訊號傳遞狀態是否為隱性OI。

評估Crtap^-/-小鼠顱骨中TGFβ目標基因的表現量，用以評估骨中TGFβ訊號傳遞之狀態。與野生型(WT)樣本相比，Crtap^-/-骨骼顯示TGFβ下游目標p21(週期素-依賴的基酶抑制劑1)、PAI-1(胞漿素元活化劑抑制劑 -1)和Col1a1之表現增加，與TGFβ活性升高一致(圖10A)。評估Smad2(一種胞內第二信使蛋白，其在TGFβ受體活化後被磷酸化)之狀態，用以確認胞內TGFβ訊號傳遞路徑之活化增加。與目標基因表現一致，免疫墨點分析顯示Crtap^-/-小鼠骨樣本中較高的磷酸化Smad2(pSmad2)與總Smad2之比率，其表示TGFβ訊號傳遞增加(圖10B和10C)。

為了測定這些靜態測量是否反映活體內TGFβ活性增加，係將Crtap^-/-小鼠與於控制TGFβ-反應性Smad結合元素下表現螢光素酶之TGFβ-報導子小鼠(SBE-Luc小鼠)互交。相較於WT/SBE-Luc同窩，Crtap^-/-/SBE-Luc小鼠在骨骼結構上的生物發光面積上顯示增加，其表示活體內TGFβ活性增加(圖10D)。在3窩小鼠中，相較於WT小鼠，Crtap^-/-小鼠在頭/顱骨顯示平均2.86倍(SD±0.34)生物發光訊號。再者，為了測試與Crtap喪失有關的TGFβ/Smad訊號傳遞增加是否為骨骼固有的，亦即組織自主，係於活體外將骨髓基質細胞(BMSC)分化成成骨細胞。藉由使用TGFβ報導細胞株，發現Crtap^-/- BMSC之條件培養基比WT BMSC培養基顯現較高的TGFβ活性(圖10E)。這些發現共同指出，喪失Crtap在骨中係以組織自主的方式促進TGFβ訊號傳遞。

患有嚴重OI之病患亦可能出現內生性肺異常，且呼吸衰竭為這些個體中首要的死亡因素。有趣的，Crtap^-/-小鼠在肺泡氣道間隙中顯現擴散增加，一種在其他發展的模型中與TGFβ訊號傳遞增加有關的特徵。因此，Crtap^-/-小鼠的肺就肺泡細胞中之pSmad2顯現細胞內染色增加，其表示TGFβ活性增加亦出現在骨骼外組織中(圖10F)。

為了瞭解TGFβ訊號傳遞增加是否代表造成Crtap^-/-小鼠中骨骼和肺表現型之原因機制，係以泛-TGFβ中和抗體(1D11)進行一拯救實驗。以1D11治療8週大的Crtap^-/-小鼠共計8週；對照的Crtap^-/-和WT小鼠係 接受非專一性對照抗體(13C4)。1D11並未顯著地改變經治療的Crtap^-/-小鼠之體重，其表示TGFβ抑制並未影響一般的營養狀態(圖14)。此外，質譜和交聯分析顯示1D11並未顯著地改變Crtap^-/-小鼠中第I型膠原蛋白P986 3-羥基化或膠原蛋白交聯，其顯示失調的TGFβ訊號傳遞為分子膠原蛋白結構改變之結果，且並不直接涉及胞內膠原蛋白處理或胞外原纖維組合(圖15)。Crtap^-/-小鼠顯現低骨量和異常的骨小梁參數(圖11A和11B)。脊椎之MicroCT造影分析顯示，相較於對照的Crtap^-/-小鼠，TGFβ抑制顯著地改善骨小梁參數，包括骨體積/總體積、骨小梁數目和骨小梁厚度至近似WT層度(圖11A和11B，及圖17)。在Crtap^-/-小鼠之股骨骨小梁中觀察到類似的有利效用，其中TGFβ抑制顯著地改善骨小梁參數(圖18)。以1D11抑制TGFβ對骨骼的效用先前在WT小鼠和Esl-1^-/-小鼠11中(一種由於正常的TGFβ成熟缺陷所造成之TGFβ活性增加的模型)，已有報告提出。當1D11適度地增加WT小鼠中脊椎骨小梁BV/TV 33%時，Esl-1^-/-小鼠BV/TV顯示增加106%。此項表示，在病理生理情況下靶向TGFβ在骨骼中為增加的，其可能導致相當明顯的正向效用。在本研究中，1D11在Crtap^-/-小鼠中增加了脊椎骨小梁BV/TV 235%，其支持著失調的TGFβ訊號傳遞為Crtap^-/-小鼠中低骨量之一重要因素。在股骨中段，皮質骨建構參數，包括皮質骨厚度、直徑、橫切面面積和截面慣性矩，相較於WT小鼠，在Ctrap^-/-小鼠中係顯著降低。在1D11治療後，這些參數與WT小鼠不再有顯著的差異(圖19)。為了測試這些皮質骨和小梁骨中的變化是否轉換成增進骨強度，係以3-點彎曲進行股骨之生物力學試驗。發現，TGFβ抑制在經治療的Crtap^-/-小鼠中能增加最大負載和極限強度，其表示整體骨骼和組織強度改善及對骨折的抗性改善。然而，如在對照和1D11治療的Crtap^-/-小鼠中後-降服位移降低所示，1D11治療對於OI骨骼之脆性增加並無效用(圖20)。此項可能反映與 膠原蛋白結構改變有關之先天的礦化異常。整合這些發現，顯示TGFβ訊號傳遞增加為Crtap缺陷所造成的隱性OI中骨表現型之主要因素，且抑制失調的TGFβ訊號傳遞恢復了骨量、顯微結構參數及改善整體骨強度。

為了瞭解TGFβ抑制在Crtap^-/-小鼠中於細胞層級上的效應，係於經治療的小鼠上進行組織型態學分析。在椎體的切片中於此研究中發現，相較於WT小鼠，對照的Crtap^-/-每骨表現之破骨細胞(Oc)和成骨細胞(Ob)數目數目增加，其表示脊椎中骨重塑增加(圖11C和圖21)。一致地，血清骨轉換標記骨鈣素(OCN)和骨膠原蛋白之C-端交聯的端胜肽(CTX)在8週大(OCN和CTX)和16週大(僅CTX)對照Crtap^-/-小鼠中為升高的(圖19)。類似的骨細胞組成中之變化於患有顯性和隱性的OI病患中已有描述，其顯示Oc和Ob數目增加係與骨轉換增加一致。有趣地，TGFβ訊號傳遞增加之小鼠模型亦顯示伴隨破骨細胞骨再吸收和異常骨重塑增加之低骨量。大多數TGFβ對骨細胞之效用的報告係與其中TGFβ可刺激骨修復位置之Oc和Ob前驅物的招募和初始分化，接著類胰島素生長因子1(IGF-1)媒介的Ob分化一致。然而，在持續的高劑量下，TGFβ可藉由壓制分化因子RUNX2來抑制Ob分化。給予對Oc/Ob相互作用之重要效用，微調TGFβ可利用性為骨重塑期間骨再吸收與形成之局部結合的關鍵因素，且其失衡可能導致明顯的骨病變。

與對照Crtap^-/-小鼠之發現相反，經1D11治療之Crtap^-/-小鼠的骨切片顯示Oc和Ob數目降低，甚至低於WT小鼠中所測量的值，其表示失調的骨重塑之超生理抑制為在此實驗所用的1D11劑量時TGFβ抑制之結果(圖11C)。與早期的報告一致，觀察到的Oc和Ob下降至WT量以下亦強調TGFβ之局部量的生理需求，以正常協調骨重塑過程期間Oc和Ob量。此發現於先前WT小鼠中的研究不同，其中1D11治療係降低Oc數目 但增加Ob數目。此項可反映，與WT小鼠中正常骨骼相比，TGFβ抑制在TGFβ訊號傳遞增加及骨重塑增加之病理生理情況不同的細胞效應。TGFβ已顯現抑制成骨細胞前驅細胞之分生，且TGFβ訊號傳遞增加可能因此造成較高的不成熟成骨細胞譜系細胞比例。在另一方面，骨表面上數目增加或較高比例的不成熟Ob可能造成這些細胞所分泌的TGFβ量增加。此項以1D11抑制TGFβ顯著地降低Crtap^-/-小鼠中增加的Ob數目之發現顯示，TGFβ訊號傳遞增加因果上造成成骨細胞譜系細胞增加。

除了有關Oc和Ob數目之發現外，在對照的Crtap^-/-小鼠中觀察到較多的每骨面積之骨細胞(Ot)數目，其在經1D11治療的Crtap^-/-小鼠中係降至與WT小鼠之數目相當的程度(圖11C和圖21)。在OI病患中，已在患有較嚴重此疾病類型的個體中觀察到Ot密度增加，可能係反映由於OI骨骼中生理成熟上的缺陷而存有不成熟的初生骨。與吾等之假設一致，TGFβ訊號傳遞增加造成OI中骨病變，WT小鼠中TGFβ之過度表現同樣地造成Ot密度增加。可能解釋為，TGFβ可抑制Ob過度至Ot期間，Ob細胞凋亡，並藉此導致Ot密度增加。集合這些發現指出，在Crtap^-/-小鼠中TGFβ訊號傳遞增加造成高的骨轉換狀態並使得骨成熟產生障礙，而抑制失調的TGFβ訊號傳遞逆轉了這些細胞改變。

給予這些對Oc/Ob相互作用之重要效用，微調TGFβ可利用性為骨重塑期間骨再吸收與骨形成之局部結合的關鍵因素，且其失衡可能導致明顯的骨病變。此發現指出，在Crtap^-/-小鼠中抑制失調的TGFβ訊號傳遞恢復了骨量以及顯微結構參數，改善了整體骨強度，及反轉了Crtap^-/-小鼠中所觀察到的細胞改變。因此，失調的TGFβ訊號傳遞為此隱性OI之小鼠模型中骨表現型之重要貢獻者。

吾等亦對TGFβ抑制是否會影響Crtap^-/-小鼠之肺表現型感 興趣。相較於WT小鼠，對照的Crtap^-/-小鼠之肺顯現末端氣管間隙增加(圖11D)。有趣地，經TGFβ中和抗體治療的Crtap^-/-小鼠之肺，在肺泡結構間的距離中顯現60%改善(圖11D和11E)。此發現表示，過度的TGFβ訊號傳遞亦為出現在Crtap^-/-小鼠中肺異常之重要致病因素。TGFβ訊號傳遞增加已與發展的肺異常以及成熟肺中的疾病相關聯。例如，肺中TGFβ過度表現造成帶有氣管間隙加大區域之肺發育障礙，及TGFβ訊號傳遞增加為馬凡氏症候群中肺異常以及肺氣腫和支氣管性氣喘之發病機制。此等結果指出，過量的TGFβ訊號傳遞為出現在Crtap^-/-小鼠中肺異常之重要致病因素。當TGFβ抑制能改善表現型時，除了在後期維護肺組織之外，在Crtap^-/-小鼠中給予1D11部份拯救肺表現型，當內部組織構造建立時，失調的TGFβ訊號傳遞影響肺組織發育為可能的。

下個詢問的問題為由於喪失Crtap(導致喪失P986上的3Hyp和膠原蛋白之後轉譯過度修飾)產生失調的TGFβ訊號傳遞，膠原蛋白如何改變。生化分析指出，膠原蛋白脯醯胺基-3-羥基化根本上不會影響膠原蛋白分子之安定性，但取而代之的可能會影響膠原蛋白-蛋白的交互作用。另一個吸引人的假設為喪失3Hyp可能會影響膠原蛋白與富含白胺酸的小蛋白多糖(SLRP)之交互作用。SLRP已知係與第I型膠原蛋白以及TGFβ結合，並藉此調節TGFβ活性。例如，SLRP decorin能抑制骨肉瘤中TGFβ不同的效應，然而其係促進前成骨細胞中之TGFβ活性。第I型膠原蛋白上的decorin之結合區暗示係在三螺旋區之961/962殘基的中心，其係位於接近P986殘基處，該殘基在OI中由於Crtap缺陷為未羥基化。因此，可能將P986 3Hyp位置標記為decorin與第I型膠原蛋白結合之相互作用位置，藉此媒介成熟的TGFβ與膠原蛋白隔離。

因此，假設decorin與膠原蛋白結合對於TGFβ調節為重要 的且此結合被改變的膠原蛋白破壞，例如在隱性OI情況下，藉由喪失第I型膠原蛋白的α1鏈中P986之後轉譯3-脯胺醯基-羥基化修飾。已鑑定出的為，雖然喪失Crtap不會改變顱骨中decorin和其他SLRP之RNA表現(圖12A)以及骨小梁中的質性豐度(圖24)，但其會減低重組的decorin核心蛋白與分離自Crtap^-/-小鼠和WT小鼠的第I型膠原蛋白之結合(圖12B)。表面電漿共振分析測量重組的decorin核心蛋白與WT小鼠和Crtap^-/-小鼠的第I型膠原蛋白之結合，顯示在三種測試濃度時Crtap^-/-小鼠中的結合下降(圖23)。以各所指的decorin濃度，由來自二重複獨立生物樣本(◆樣本1，▲樣本2)進行三重複技術樣本。結果係以WT平均值之百分比表示(長條係指每組織平均)。在3、5和12μM之decorin時，decorin與Crtap^-/-第I型膠原蛋白結合分別為28.5%、33.5%和38.1%。

此項發現顯示，膠原蛋白-蛋白多糖交互作用之改變可能造成OI之骨骼和其他富含膠原蛋白的組織中TGFβ訊號傳遞失調。基於報告提出的decorin-膠原蛋白結合為decorin有效降低TGFβ生物活性所需，OI膠原蛋白之缺陷導致decorin之結合改變，且因此其隔離基質中的TGFβ及調節TGFβ功能之能力為可能的。因此，蛋白多糖-膠原蛋白交互作用改變可能造成OI之骨骼和其他富含膠原蛋白的組織中TGFβ訊號傳遞失調，即使未出現絕對TGFβ量之重大變化(圖24和圖25)。此觀念藉由更嚴重型之顯性OI中COL1A1和COL1A2突變係群集在已知與蛋白多糖結合的特定區域中得到支持，進一步支持蛋白多糖-膠原蛋白交互作用對正常的骨恆定之生理關聯性。此項亦意味著其他與decorin競爭膠原蛋白結合位置之蛋白多糖亦可能造成TGFβ活性失調，且另外的訊號傳遞路徑可能改變。

因為有些隱性和顯性OI之臨床重疊，其中有缺陷的膠原纖維結構導致脆骨和骨骼外的表現，所以TGFβ訊號傳遞失調為一共通的病 理生理疾病機制係為可能的。為了說明此項假說，係研究顯性OI之小鼠模型中TGFβ訊號傳遞狀態。在Col1a2基因中帶有G610C突變之基因嵌入小鼠(Col1α2 ^tml.1Mcbr )表型模擬顯性遺傳、中度OI型，其最初係在阿米甚人(Amish)中鑑別出。在Col1α2 ^tml.1Mcbr 小鼠得骨樣本中，發現TGFβ目標基因p21和PAI-1之表現增加，其表示TGFβ訊號傳遞上調(圖13A)。一致地，Col1α2 ^tml.1Mcbr 小鼠之骨萃取物的免疫默點分析亦顯示活化的pSmad2/總Smad2之比率增加，類似吾等於Crtap^-/-小鼠中之觀察(圖13B和13C)。

為了測試在此顯性OI之模型中TGFβ訊號傳遞增加是否亦代表一原因機制，係將8週大的Col1α2 ^tml.1Mcbr 小鼠以TGFβ-中和抗體1D11治療8週；對照的Col1α2 ^tml.1Mcbr 和WT小鼠係以對照抗體13C4治療。類似Crtap^-/-小鼠中的發現，1D11-治療使脊椎中骨小梁參數恢復至WT程度(圖13D、13E和22)。整合這些發現指出，TGFβ訊號傳遞失調亦為顯性OI之發病機理的重要因素，而抗-TGFβ治療矯正了顯性OI中骨表現型。

從臨床-轉譯觀點，必須考量OI病患中全身性TGFβ抑制之潛在的負面效應。當TGF-β1 ^-/- 小鼠在出生第1週內發生嚴重得多發性發炎疾病及免疫系統失調時，在以1D11治療的Crtap ^-/- 和Col1α2 ^tml.1Mcbr 小鼠中就整體健康、行為和生長上並未觀察到明顯的負面效應，其顯示部分藥理上抑制成年小鼠之TGFβ配體與發育期間完全喪失TGFβ1並不相同。在人類中，係於第I階段研究中使用夫蘇木單抗(GC1008,Genzyme)，其在親和力和對TGFβ之3種同型的專一性上係類似1D11，治療患有難治型原發性局部部份腎絲球硬化症、特發性肺纖維化和惡性黑色素瘤或腎細胞癌之病患。在這些研究中，夫蘇木單抗一般可完全耐受，其中可能的劑量-相關的不良事件包括皮疹或皮膚損傷、鼻出血、牙齦流血和疲勞。

OI之分子機制並未完全了解。因此，目前對於OI病患之治 療選項主要係局限於如用於治療骨質疏鬆症之抗再吸收治療。有趣地，最近一項患有OI成人之同化劑特立帕肽(teriparatide)的隨機、安慰劑對照試驗中顯示，嚴重的第III/IV型OI與輕度第I型OI反應不同(Orwoll等人，2014)。此項意味著回應以修改細胞訊號傳遞為靶向之治療和TGFβ-靶向治療之基因型差異，可能為進一步研究由於膠原蛋白和膠原蛋白後轉譯修飾基因突變所致的嚴重OI之有希望的選項。整體而言，吳等之數據支持基質-細胞訊號傳遞失調為脆骨病之不同基因上遺傳形式的發病機理之觀念，並指向疾病-特異性機制為基礎的策略，藉由中和骨骼和骨骼外組織中過度活化的TGFβ活性來治療OI。

<110> GENZYME CORP. BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE

<120> 治療成骨不全之方法

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Claims (24)

1. 一種治療上有效量之專一與轉化生長因子β(TGFβ)結合的抗體或其抗原結合片段之用途，係用於製造醫藥品供有此需要之患者治療成骨不全症(OI)in a subject in need thereof.
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該此抗體或其抗原結合片段係包括一包含三個互補決定區(CDR)之重鏈可變區，而該CDR具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列SEQ ID NO：4、5和6；以及包含三個CDR之輕鏈可變區，而該CDR具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：7、8和9。
3. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈可變區，以及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的輕鏈可變區。
4. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段進一步係包括人類IgG4恆定區。
5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該人類IgG4恆定區係包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段進一步係包括人類κ輕鏈恆定區。
7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該人類κ輕鏈恆定區係包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
8. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段進一步係包括人類IgG4恆定區及人類κ輕鏈恆定區。
9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該類IgG4恆定區係包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列，及此人類κ輕鏈恆定區係包括SEQ ID NO：13之胺 基酸序列。
10. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈。
11. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體係包括一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。
12. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈，以及一包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。
13. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係與人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3結合。
14. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係中和人類TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。
15. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段改善了由下列組成之群中選出的骨參數：骨體積密度(BV/TV)、總骨表面(BS)、骨表面密度(BS/BV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)及總體積(Dens TV)。
16. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係抑制骨再吸收。
17. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係降低了由下列組成之群中選出之骨再吸收的血清生物標記：尿羥脯胺酸、尿總吡啶啉(PYD)、尿游離的去氧吡啶啉(DPD)、尿第I型膠原蛋白交聯的N-端胜肽(NTX)、尿或血清第I型膠原蛋白交聯的C-端胜肽(CTX)、骨涎蛋白(bone sialoprotein)(BSP)、骨橋蛋白(osteopontin)(OPN)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP)。
18. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係增加由下列組成之群中選出之骨沉積的血清生物標記：總鹼性磷酸酶、骨-專一性鹼性磷酸酶、骨鈣素及第I型前膠原蛋白(C-端/N-端)。
19. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係抑制骨再吸收。
20. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係促進骨沉積。
21. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段改善了受OI影響之由下列組成之群中選出之非骨骼器官的功能：聽力功能、肺功能和腎功能。
22. 一種治療上有效量之專一與轉化生長因子β(TGFβ)結合的抗體或其抗原結合片段之用途，係用於製造醫藥品供有此需要之患者治療全骨不全症(OI)，其中該抗體係包括一包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈，以及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。
23. 一種治療上有效量之專一與轉化生長因子β(TGFβ)結合的抗體或其抗原結合片段與至少一種治療劑組合之用途，係用於製造醫藥品供有此需要之患者治療全骨不全症(OI)。
24. 如申請專利範圍第23項之用途，其中該藥劑為雙磷酸鹽。