TW201506040A

TW201506040A - 對抗介白素－２０之人類化抗體及發炎性疾病之治療

Info

Publication number: TW201506040A
Application number: TW103114270A
Authority: TW
Inventors: Chia-Cheng Wu; Chao-Yang Huang; Yu-Ying Lin; Yu-Jung Chen; Jiann-Shiun Lai
Original assignee: Dev Center Biotechnology
Priority date: 2013-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2015-02-16
Also published as: US20140314741A1; EP2986640B1; JP6358763B2; TWI572618B; EP2986640A2; JP2016521272A; WO2014172591A3; WO2014172591A2; EP2986640A4; US20160068595A1; WO2014172591A9

Abstract

本發明提供一種人類化抗體或其scFv、Fab或f(ab')2，其包括：重鏈可變區或其同源變異體，其中該重鏈可變區包括：重鏈架構區、具有SEQ ID NO：19之序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：20之序列之CDRH2及具有SEQ ID NO：21之序列之CDRH3，其中該重鏈可變區與該同源變異體之該重鏈架構區之間具有至少90%之序列同一性；及輕鏈可變區或其同源變異體，其包括：輕鏈架構區、具有SEQ ID NO：22之序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：23之序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：24之序列之CDRL3，其中該輕鏈可變區與該同源變異體之該輕鏈架構區之間具有至少90%之序列同一性。

Description

對抗介白素-20之人類化抗體及發炎性疾病之治療

本發明之技術領域為對抗介白素-20之人類化抗體。

介白素-20(後稱為"IL-20")屬於IL-10家族。IL-20為多效性細胞素，其具有趨化性、促新血管生成及破骨細胞生成特性，且在不同發炎性疾病及其他病症中亦扮演著重要的角色。已有證據建議IL-20涉及多種病理狀況，其包括：在動脈粥狀硬化病變中、在類風濕性關節炎(RA)病患之滑液中及在人類動脈粥狀硬化血管中上調IL-20及其受體兩者。再者，IL-20顯示可促進缺脂脂蛋白E缺乏小鼠中動脈粥狀硬化之發生，可誘發嗜中性白血球之趨化反應，可誘發類風濕性關節炎(RA)滑液纖維母細胞之遷移，及促進血管新生。參見如頒給張的美國第7,786,274號專利。

再者，已顯示抑制IL-20的功能可預防或降低等疾病或病症之發展。例如，已顯示IL-20受體I(一種誘發物受體)可抑制膠原蛋白誘發關節炎。因此，抗IL-20劑(如抗IL-20抗體)是有希望選擇來治療或管理IL-20誘發疾病的治療劑。

頒給張的美國第7,786,274號專利揭示一種對抗IL-20之單株抗體(mAb 7E)。該單株抗體(mAb 7E)為藉由將BALB/cJ小鼠經重組hIL-20免疫後所產生之小鼠mAb。該mAb 7E已顯示可用於治療多種與IL-20 有關之發炎性疾病，例如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、細菌誘導性胃潰瘍及急性腎衰竭。

諸如，美國第7,611,705號專利顯示mAb 7E可用於治療與IL-20有關之發炎性疾病。美國第7,837,994及8,454,956號專利顯示mAb 7E可用於治療骨質疏鬆。美國第8,012,478號專利顯示mAb 7E可用於治療缺血性中風。

此等先前技術顯示抗IL-20抗體(如mAb 7E)可用作治療及控制多種與IL-20有關之疾病的治療劑。然而，該等抗體為小鼠抗體，當將其用作治療劑時，可能會引發免疫反應。此種免疫反應是該等抗體在臨床使用上的主要限制。近來，頒給張等人的美國第8,597,647號專利揭示了mAb 7E之人類化類似物，其係將源自mAb 7E的所有6個CDR序列移植至人類重鏈及輕鏈可變序列上來產生，但其所產生的人類化抗體相較於原始mAb 7E，具有較低的IL-20親和力。

此等先前技術的結果皆顯示抗IL-20抗體係可用者。然而仍需要更佳的抗IL-20抗體。

本發明之態樣係關於抗IL-20抗體或其片段。該等抗體可為單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體或其片段。該等抗體之片段可包括Fab、scFv、F(ab')₂等。本發明抗體的產生係基於人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈序列，其上之CDR序列則經突變成為源自其他動物(如小鼠)，可與IL-20緊密結合的抗IL-20抗體(如揭示於美國第7,786,274號專利之mAb 7E)者。相較於原始的小鼠抗IL-20抗體，將如此產生的人類化抗體當用作治療劑時，其可進一步改善並使抗體具有實質上較高的IL-20親和力及/或具有較低的免疫反應。

本發明之一種實施態樣係關於人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段。根據本發明之一種態樣，人類化抗體或其scFv、Fab或 F(ab')₂片段包括重鏈可變區或其同源變異體，其包括：重鏈架構區、具有SEQ ID NO：19之序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：20之序列之CDRH2及具有SEQ ID NO：21之序列之CDRH3，其中該重鏈可變區與該同源變異體之該重鏈架構區之間具有至少90%之序列同一性；及輕鏈可變區或其同源變異體，其包括：輕鏈架構區、具有SEQ ID NO：22之序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：23之序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：24之序列之CDRL3，其中該輕鏈可變區與該同源變異體之該輕鏈架構區之間具有至少90%之序列同一性。

於上述之任一所欲之態樣中，該重鏈架構區可包含對應至亞群III(VH3)之人類免疫球蛋白重鏈的架構區之序列，及/或該輕鏈架構區可包含kappa亞群II(Vκ2)之人類免疫球蛋白輕鏈的架構區之序列。

於上述之任一所欲之態樣中，該人類免疫球蛋白重鏈亞群III(VH3)可變區可包含IGHV3-72*01(SEQ ID NO：2)或IGHV3-66*04(SEQ ID NO：15)之序列；及/或該人類免疫球蛋白輕鏈kappa亞群II(Vκ2)可變區可包含IGKV2D-29*02(SEQ ID NO：6)或IGKV1-39*01(SEQ ID NO：17)之序列。

於上述之任一之態樣中，於該人類化抗體中之重鏈可變區可包含SEQ ID NO：4之序列，及/或於該人類化抗體中之輕鏈可變區可包含SEQ ID NO：8之序列。根據本發明之一種態樣，該抗體為FLB5M5，其包含具有SEQ ID NO：4序列的重鏈可變區及具有SEQ ID NO：8序列的輕鏈輕鏈可變區。該FLB5M5抗體可含有源自人類免疫球蛋白的恆定區。例如，FLB5M5可含有具有SEQ ID NO：9所示序列之全長重鏈，及具有SEQ IN NO：10所示序列之全長輕鏈，且其所對應之編碼序列則分別顯示於SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12。

於上述本發明之任一態樣中，該抗IL-20抗體可包括諸如FLB5M5(亦可顯示為hFLB5M5)之人類化單株抗體。FLB5M5為一種人類化單株抗體，該抗體之互補決定區(CDRs)相對於其之親本小鼠抗IL-20單株抗體7E(mAb 7E)，具有3個突變胺基酸，且該抗體之輕鏈架構區相對於人類Vκ2之輕鏈架構區之胺基酸，具有5個突變胺基酸。FLB5M5不僅含有對IL-20的結合特異性，且相較於mAb 7E，其對IL-20的結合親和力亦具有無法預期之較佳效果。尚且，在臨床使用上，FLB5M5對人類宿主的免疫性亦較mAb 7E低。

本發明另一方面係關於用於治療或預防與IL-20有關疾病之方法。根據本發明實施態樣中之一種方法，其可包含向需此治療之個體投予有效量之根據任一上述態樣中之該人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段。

根據上述之任一態樣，該與IL-20有關疾病可為一或多種選自下列所組成之群：發炎性疾病、骨質疏鬆、癌症、中風及腎衰竭。

圖1顯示mAb 7E(SEQ ID NO：1)、人類類似物(IGHV3-72*01)(SEQ ID NO：2)、HH12(SEQ ID NO：3)及FLB5M5(SEQ ID NO：4)之重鏈可變區(V_H區)中胺基酸之序列比較。

圖2顯示mAb 7E(SEQ ID NO：5)、人類類似物(IGKV2D-29*02)(SEQ ID NO：6)、HH12(SEQ ID NO：7)及FLB5M5(SEQ ID NO：8)之輕鏈可變區(V_L區)中胺基酸之序列比較。

圖3顯示mAb 7E(SEQ ID NO：1)、人類類似物((IGHV3-66*04)SEQ ID NO：15)及DD10B5(SEQ ID NO：16)之重鏈可變區(V_H區)中胺基酸之序列比較。DD10B5為人類化抗體，其具有基於IGHV3-66*04之重鏈可變區。

圖4顯示mAb 7E(SEQ ID NO：5)、人類類似物(IGKV1-39*01)(SEQ ID NO：17)及DD10B5(SEQ ID NO：18)之輕鏈可變區(V_L區)中胺基酸之序列比較。DD10B5為人類化抗體，其具有基於IGHV1- 39*01之重鏈可變區。

圖5顯示如圖1至4所示mAb 7E與不同人類類似物之胺基酸之序列比較之摘錄。

圖6顯示多種抗體：mAb E7、FLB5及FLB5M5抑制IL-20引發增生之結果。

圖7A顯示在大鼠類風濕性關節炎模型中，在使用Enbrel(6mg/kg)處理作為陽性對照組下，比較使用不同劑量(1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg)hFLB5M5處理下預防關節炎(測量關節炎分數(AS))之結果。

圖7B顯示在大鼠類風濕性關節炎模型中，在使用Enbrel(6mg/kg)處理作為陽性對照組下，比較使用不同劑量(1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg)hFLB5M5處理下預防關節炎(測量後足拓厚度)之結果。

圖7C顯示在大鼠類風濕性關節炎模型中，在使用Enbrel(6mg/kg)處理作為陽性對照組下，比較使用不同劑量(1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg)hFLB5M5處理下預防關節炎(測量體重)之結果。

圖8顯示以丙胺酸取代HH12及FLB5M5之CDRH3及CDRL3上3個重要殘基的結果。該結果顯示CDRH3上之W100係重要的，因在此位置之丙胺酸取代會同時降低HH12及FLB5M5之結合親和力。CDRL3上之F94似較Q90重要。

定義

除非另有定義，所使用的科學及技術名詞應具有本技術領域人士通常所瞭解之定義。再者，除非基於上下文之需要，單數名詞應包含複數定義且複數名詞應包含單數定義。本發明所使用的縮寫包含下列：Ab：抗體；BaF3：鼠類前驅B細胞；CDRs：互補決定區；C_H：重鏈恆定區；C_L：輕鏈恆定區；HEPES：4-(2-羥乙基)-1-六氫吡乙烷磺酸；IL-20：介白素-20；LTM：穿透突變(look-through mutagenesis)；PBS：磷酸緩衝鹽水；PCR：聚合酶鏈反應；PTH：後足拓厚度(hind paw thickness)；AS：關節炎分數；RPMI培養基：Roswell Park Memorial Institute培養基；scFv：單鏈可變片段；SD大鼠：Sprague-Dawley大鼠；V_L：輕鏈可變域；V_H：重鏈可變域。

重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養和轉形(如電穿孔法、脂質轉染法)係使用標準技術。酵素反應及純化技術係根據製造商說明書或本技術領域所通常使用或如本文所揭示者來進行。此等技術及程序係根據本技術領域所習知的方法來進行，及本說明書所引用或討論之多種一般及更特定文獻所描述的方法來進行。參見如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manul(3^rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)。

本文所使用「抗體」乙詞一般性地及廣泛性地表示免疫球蛋白、單株抗體及多株抗體，以及彼等之活性片段。該片段可因會與同族抗原(即IL-20或IL-20之片段)結合而為活化者，或其可因其具有生物活性而為活化者。使用本技術領域所習知之技術，本發明之抗體可為嵌合、人類化或人類型。

本文所使用「人類化抗體」乙詞係指於該抗體中，最小部分的非人類抗體被導入此外的人類抗體中。

本文所使用「人類抗體」乙詞係指於該抗體中，蛋白質實質上的每一部分在人體內是非免疫源性者，其僅有少數序列發生改變或變異。

一般而言，抗原結合位置係由免疫球蛋白域之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)所形成，其具有抗原結合界面，該抗原結合界面係由6個稱為互補決定區(CDRs)之表面多肽環所形成。VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)及VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)上分別各有3個 CDRs，其還有架構區(FRs)。

「CDR區」或「CDR」乙詞意旨由Kabat等人，1991(Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5^th Edition.US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington)及其後續版本所定義免疫球蛋白之重或輕鏈之高可變區。典型的抗體含有3個重鏈CDRs及3個輕鏈CDRs。

本文中「CDRs組」乙詞意旨其本身包含CDR1、CDR2及CDR3。因此，HCDRs組表示HCDR1、HCDR2及HCDR3(HCDR表示可變重鏈CDR)，且LCDRs組表示LCDR1、LCDR2及LCDR3(LCDR表示可變輕鏈CDR)。除非另有說明，「CDRs組」包括HCDRs及LCDRs。

已顯示完全抗體的片段亦可與抗原結合。結合片段之例子包括：(i)由VL、VH、CL及CH1域所組成之Fab片段(Ward,E.S.et al.,(1989)Natrue 341,544-546)；(ii)由VH及CH1域所組成之Fd片段(McCafferty et al.,(1990)Nature,348,552-554)；(iii)由單一抗體之VL及VH域所組成之Fv片段(Holt et al.,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)；(iv)由VL或VH域所組成之dAb片段(Ward,E.S.et al.,Nature 341,544-546(1989),McCafferty et al.,(1990)Nature,348,552-554,Holt et al.,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)；(v)經分離CDR區；(vi)F(ab')2片段，其係包含2個經連接Fab的雙價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域與VL域係以肽連接子連結，該連接子會使兩個域組合成一個抗原結合位置(Bird et al.,(1988)Science,242,423-426,Huston et al.,(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚物(PCT/US92/09965)及(ix)「雙體(diabodies)」，藉由基因融合構築之多價或多特異性片段(WO94/13804；Holliger,P.(1993)et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448)。

Fv、scFv或雙體分子可藉由併入雙硫橋連接VH及VL域來穩定 (Reiter,Y.et al.,Nature Biotech,14,1239-1245,1996)。亦可製作迷你體(minibodies)，其包含scFv結合至CH3域(Hu,S.et al.,(1996)Cancer Res.,56,3055-3061)。其他結合片段的例子為Fab'，其與Fab片段之差異在於在重鏈CH1域之羰基端上加上了數個殘基，其包含源自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸，及Fab'-SH，其係Fab'片段中恆定域之半胱胺酸殘基上帶有自由硫基。

將抗體以酵素(木瓜酶)消化後會產生兩個相同已知為「Fab」片段的抗原結合片段，及一個不具有抗原結合能力但具有形成結晶能力之「Fc」片段。將抗體以酵素(胃蛋白酶)消化後會產生一個「Fab'」片段，其中該抗體分子之雙臂依然連接在一起且包含二個抗原結合位置。Fab'片段具有與抗原交叉連結之能力。

本文中所述的「Fv」意表仍保有抗體上抗原辨識及抗原結合位置之最小片段。本文中所使用的「Fab」意指包含抗體之輕鏈恆定域及重鏈CH1域之片段。「mAb」代表單株抗體。

本發明之詳細說明

本發明之實施態樣係有關人類化抗IL-20抗體或其片段。本發明之抗體為使用分子生物技術所產生之單株抗體。該等抗體之片段可包括Fab、scFv、F(ab')₂、嵌合抗體等。相較於揭示於美國第7,786,274號專利之mAb 7E抗體，當將本發明之抗體用作治療劑時，本發明之抗體展現較高的IL-20親和力及/或較低的免疫原性。

由於使用非人類抗體來治療時的主要限制為該等抗體可引發不欲的免疫反應，本發明之發明人因此由人類免疫球蛋白序列來開始設計較佳之抗IL-20抗體。特言之，本發明之抗體係以人類架構序列作為製造的起點。此等人類抗體架構序列接著經修飾以使其具有IL-20結合親和力。該等修飾涉及抗原決定區(CDR)序列之改變。任何習知方法皆可用於製造該IL-20結合位置，包括隨機突變與篩選、噬菌體顯示與淘洗、或移植源自習知抗IL-20抗體之CDR序列。

根據本發明之實施態樣，舉例而言，可藉由將來自習知抗IL-20抗體(如mAb 7E)之CDR序列併入經選擇之免疫球蛋白序列以使其具有IL-20結合親和力。如當使用mAb 7E時，本文下述之內容即提供了某些特定用於製備具有人類架構序列但亦具有mAb 7E CDR序列之例子。然而，本領域之技藝人士皆瞭解可使用源自其他抗IL-20抗體之CDR序列來製造類似的抗體。由CDR移植所獲得之直接產物即為嵌合抗體，其含有人類架構序列及源自其他來源之CDR序列(如小鼠序列)。

當使用CDR移植方法時，所使用的人類抗體架構序列，最好與提供CDR序列之抗體的架構序列具有同源性。可將習知的抗IL-20抗體架構序列當作比對序列(query sequence)，使用一致性或同源性檢索(consensus or homology searches)來鑑定該等同源序列。具有高度同源性的序列可能會提供相同的架構結構，進而能保留靶向CDR序列之結合親和力。簡而言之，可將鑑定與靶向抗體(如mAb 7E)具有高度同源性的人類免疫球蛋白亞群之可變輕(VL)及可變重(VH)域架構序列作為起始點。

根據本發明之實施態樣，該重鏈架構序列可源自VH亞群III，且該輕鏈架構序列可源自VL kappa亞群II(Vκ2)。例如，根據本發明之一種實施態樣，與mAb 7E之架構區具有高度同源性的VH亞群III為IGHV3-72*01，且與mAb 7E之對應架構區具有高度同源性的Vκ2序列為IGKV2D-29*02。圖1即顯示IGHV3-72*01與mAb 7E重鏈可變區之序列比較，而圖2則顯示IGKV2D-29*02與mAb 7E輕鏈可變區之序列比較。於圖1及2中，架構區(即非CDR區)中的序列差異則以框起的殘基顯示。

基於IGHV3-72*01及IGKV2D-29*02序列，其中個別之CDR序列 (即CDR-1、CDR-2及CDR-3)可轉換成靶向抗IL-20抗體(如mAb 7E)之對應CDR序列。此等轉換可產生分別顯示於圖1及圖2之嵌合重鏈及嵌合輕鏈。此等嵌合重鏈及輕鏈可藉由本領域的習知技術來構築scFv或Fab片段。或者，可使用下述實施例中所述之重疊PCR法(overlap PCR)，於單一步驟下將人類架構序列與小鼠CDR序列組裝成scFv或Fab片段。

於本發明之另一態樣中，可基於所鑑定出之VH及VL區人類架構序列(如IGHV3-72*01及IGKV2D-29*02序列)，先行構築scFv或Fab片段。接著，再藉由將scFv或Fab片段中之CDR序列突變成靶向抗IL-20抗體(如mAb 7E)之已知CDR序列或與靶向抗IL-20抗體之已知CDR序列實質上相同之序列，來將scFv或Fab片段修飾成人類化抗IL-20抗體。

如前所述，突變或CDR移植可藉由任合本領域所習知之方法來完成，例如，定位突變或將經突變殘基/片段藉由PCR併入(如重疊PCR法)。

，以IGHV3-72*01為重鏈可變序列基礎及以IGKV2D-29*02為輕鏈可變序列基礎，且含有所有6個源自mAb 7E之CDR序列的scFv片段即為人類化抗IL-20抗體(HH12)的一個例子，該抗體之重鏈及輕鏈可變區係分別顯示於圖1及圖2。

根據本發明之實施態樣，起始嵌合抗體(如HH12)可進一步修飾來增加其對IL-20的親和力。此種修飾可稱為親和力熟成(affinity maturation)，其可藉由本技術領域所熟知的技術來完成，例如，隨機突變與篩選及噬菌體顯示與淘洗等。此等親和力熟成可涉及CDR區及/或非CDR區之殘基。

將HH12親和力熟成獲得的scFv片段(FLB5M5(後亦稱為hFLB5M5))即為一個例子。相對於起始HH12抗體或親本小鼠抗IL-20 單株抗體7E(mAb 7E)，FLB5M5含有3個位於CDRs中之胺基酸突變。圖2中以圓圈標示此等3個胺基酸突變。

此外，相對於人類Vκ2輕鏈架構區之胺基酸，FLB5M5之輕鏈架構區上含有5個胺基酸突變。該架構區上之5個胺基酸突變係為圖2中以底線標示的殘基。該非CDR區(即架構區)上之突變可由隨機突變產生。或者，可將與"範本(model)"小鼠抗體(如mAb 7E)架構區上對應胺基酸不同的胺基酸殘基，以原始"範本"抗體上之胺基酸作選擇性的替換。將不同的胺基酸換回原始抗體所存在者(後稱為「回復突變」)的理由在於，架構區上之該等胺基酸可能會直接影響抗體對抗原的結合力，因為其會造成互補位區(paratope regions)構造的輕微改變。FLB5M5架構區上之5個胺基酸突變即係肇因於該「回復突變」。

FLB5M5係為藉由將輕鏈可變區上胺基酸突變獲得親和力熟成產物之代表性實施例。技藝人士可預期並了解亦可獲得其他類似的親和力熟成抗體。

雖然FLB5M5係為人工產生之抗體，然其被驚人地發現不僅可展現對IL-20的結合特異性，亦具有比天然mAb 7E更佳的結合親和力。再者，由於FLB5M5含有多數為人類免疫球蛋白之序列，故可預期此人類化單株抗體在人類宿主中所引發的免疫反應會較少。因此，FLB5M5及其類似的人類化抗體在臨床施用上為具有前途的治療劑。

使用結構活性關係(SAR)研究來瞭解FLB5M5促進親和力的作用機制。可使用本技術領域所熟知的任何技術來進行SAR研究，例如丙胺酸掃描。

由該SAR研究之結果發現，位於輕鏈可變域CDR1上之酪胺酸殘基(Y32)在增進FLB5M5對IL-20之親和力上扮演著重要的角色。同時發現，該酪胺酸與其他胺基酸殘基突變的組合可增進結合親和力。

於某些態樣中，本發明係關於一種用於製造本發明人類化抗體之方法。一種用於製造人類化抗體之方法可含有下列步驟：(1)獲得用作範本之小鼠單株抗體(如mAb 7E)序列，可基於該序列來設計人類化抗體；(2)基於與該"範本"小鼠單株抗體之同源性來選擇人類架構供體(donor)抗體序列；及(3)將該架構供體抗體上之CDR區序列以該小鼠單株抗體上所對應之CDR序列來取代。根據本發明之某些實施態樣，該方法可進一步含有：親和力熟成步驟，其可包括將該CDR區上之胺基酸突變及/或將架構區上之胺基酸進行取代以增進抗體之親和力。該架構區上之突變可為將胺基酸以"範本"小鼠單株抗體上之胺基酸來取代。

例如，於製備人類化抗體之過程中，範本小鼠單株抗體(如mAb 7E)之胺基酸序列可透過資料庫或使用習知方法測定獲得。mAb 7E之胺基酸序列可再用於搜尋與該mAb 7E架構區具有高度同源性之人類生殖細胞系V_L及V_H序列。該同源性搜尋可使用任何本技術領域所熟知之方法來進行，如可或自National Center for Biotechnology Information(NCBI)之BLAST(基本位置排序搜尋工具)。

對mAb 7E之人類同源性搜尋後發現，IGHV3-72*01與mAb 7E之V_H同源，且IGKV2D-29*02與mAb 7E之V_L同源。mAb 7E與該二序列之序列排序則示於圖1(V_H區)及圖2(V_L區)。於圖1及2中，mAb 7E與人類同源序列(IGHV3-72*01及IGKV2D-29*02)架構區上不相同的胺基酸以框線標示。由該序列排序可發現，於該架構區上的差異相對地微小，此建議該等同源序列為將抗體人類化中的好候選人。

因此，該兩種人類同源序列可在人類化抗體之製作中當作基礎序列。於一個實施例中，使用本技術領域所熟知的方法(如定位突變或CDR移植)，將人類同源物(用作V_H的IGHV3-72*01及用作V_L的IGKV2D-29*02)之CDR區置換成mAb 7E之對應CDR區。CDR移植之完成，可藉由諸如獲得CDR區之寡核苷酸序列(如藉由PCR或化學合成) 後，接著將其接合及/或選殖至適當的載體來與架構區上之剩餘序列連結。該CDR置換會產生一種人類化抗IL-20抗體(HH12)。如圖1及圖2所示，HH12含有全部6個源自小鼠mAb 7E之CDR序列，而剩餘的全為人類架構序列。

HH12可進一步修飾來使其對IL-20之結合親和力最佳化(即親和力熟成)。再者，進一步的修飾可將其在人類宿主中的免疫原效果最小化。首先，HH12結合親和力係藉由CDR區之突變來最佳化。該突變可為在經選擇的位置(在CDRL1、CDRL2或CDRL3之殘基)上進行隨機突變，再挑選結合較緊密者。本技術領域已有許多將突變導入CDR中的習知方法，其包括隨機、化學突變及易錯PCR(error-prone PCR)。經此突變後，根據其結合親和力篩選突變株。經選出具有較緊密結合力者，可再進一步進行親和力突變。上述最佳化過程產生了一個新抗體，其含有圖2中所圈起的3個突變。

該帶有最佳化CDR序列之抗體可作進一步的改良，將人類序列上之某些架構胺基酸變回小鼠序列中之胺基酸。雖然架構區不直接涉及抗原結合，但其可因構造性效應而直接影響結合性。如圖2所示，FLB5M5之架構區上之5個胺基酸(圖2中劃底線者)即被突變回該等發現於小鼠mAb 7E序列者。此等突變可依序或同時進行，即先修飾架構再修飾CDR，或者先修飾CDR再修飾架構。

經過此等突變/最佳化程序，於是鑑定出一種更佳的抗體FLB5M5。在FLB5M5中，源自HH12輕鏈架構區之5個胺基酸被源自小鼠單株抗體7E之胺基酸取代(即I2F、Q3V、Y36L、Q45K及L46H)，且於輕鏈CDR1及CDR2上之3個胺基酸亦被突變(即S32Y、L50Q及D55N)。

圖1及圖2分別顯示mAb 7E、人類類似物(IGHV3-72*01為V_H且IGKV2D-29*02為V_L)、HH12及FLB5M5中V_H與V_L胺基酸之序列排序結果。於圖2中，FLB5M5與HH12之間CDR的不同處係以矩形框線標示，架構區的不同處係以底線標示。

本發明發現於CDR中的3個突變(圖2之CDR區中以圓圈標記的殘基)有助於親和力熟成，尤其是輕鏈CDR-1上的一個突變(將絲胺酸變成酪胺酸)特別有幫助。

表1顯示CDR區上導致親和力熟成之數個胺基酸對IL-20之結合特徵(k _a：結合率；k _b：解離率；及k _d：解離常數(即親和力之倒數))。該等結合參數可使用任何本領域之習知方法獲得，例如下述之ELISA或BIACore結合分析。

由表1之數據可發現，CDRH3上之突變對IL-20的結合親和力並無太大的影響。然而，將CDRL1上絲胺酸-32突變為酪胺酸-32(即CDRL1上之27E位置)則對IL-20的結合親和力會產生顯著的增進效果。

回復突變發現HH12之輕鏈架構區中的5個胺基酸可增進對IL-20的結合親和力。此等胺基酸在圖2中係以底線標示。

最後，將在CDR上的3個突變與輕鏈架構區內的5個突變組合起來，將其全部一起表現成一個人類化抗IL-20抗體FLB5M5。

抗IL-20抗體(如mAb 7E)已顯示具有治療或預防多種與IL-20有關疾病之效果，該疾病包括骨質疏鬆(美國第7,837,994及8,454,956號專利)、缺血性中風(美國第8,012,478號專利)、類風濕性關節炎(美國第 7,786,274號專利)等。因此，本發明比mAb 7E更佳之抗IL-20抗體當然亦可有效治療或預防此等與IL-20有關之疾病或病症。

本發明之某些實施態樣係關於本發明抗體於治療或預防與IL-20有關之疾病或病症(如發炎性疾病)之用途。根據本發明之實施態樣，係將治療有效量之本發明之抗體給予需要對與IL-20有關之疾病進行治療或預防之個體。該治療有效量係指足以產生所欲臨床效果之量。本領域之技藝人士可瞭解醫藥上之有效量會受多種因素影響，該因素包括病患之年齡、體重、病狀、投藥路徑、劑型及抗體。然而，有效量可在無需創造努力下，由例行實驗來發現，且本領域之技藝人士可在無需過度實驗下獲得該有效量。

下述之實施例中將進一步例示本發明之態樣。此等特定實施例僅具例示性而非用於對本發明範圍的限制。本領域之技藝人士可瞭解，在不脫離本發明範圍之前提下，各種不同的修飾及變異皆可能適用。

實施例

人類V區架構序列的選擇：由IMGT資料庫(the International Immunogenetics Information System®)中鑑定出與mAb 7E架構區具有最高度同源性之人類生殖細胞系V_L及V_H序列。該同源性搜尋可藉由BLAST或類似的方法來進行。mAb 7E之可變區序列係被用作比對序列，且其可獲自文獻資料，如美國第7,786,274號專利。

VH亞群III(VH3)之人類重鏈架構區序列已成功地用在許多人類化抗體中，VL κ亞群II(Vκ2)之人類輕鏈架構區亦顯示可為極佳的候選人。因此，選擇VH3及Vκ2亞群之架構序列來分別尋找V_H及V_L架構。該尋找的結果分別鑑定出IGHV3-72*01及IGKV2D-29*02，其為與mAb 7E中對應重鏈及輕鏈架構序列間同源性最高的VH及VL序列。

如圖1所示，IGHV3-72*01重鏈架構區之序列與mAb 7E相差19個胺基酸(框起的殘基)，其對應至23.45%(19/81架構區總殘基數)變異性。如圖2所示，IGKV2D-29*02輕鏈架構區之序列與mAb 7E相差10個胺基酸(框起的殘基)，其對應至13.16%(10/76架構區總殘基數)變異性。

即使於該架構區上具有該等程度的差異性，仍將mAb 7E上的CDR序列移植到IGHV3-72*01及IGKV2D-29*02序列中產生一個scFv(HH12)，其對IL-20具有相當好的親和力(K_D=2.68 x 10^-9M)(用於比對，mAb 7E的K_D=7.810^-10M)(參見如下表2所示)。此結果建議該等架構區可承受相對高的變異性，而不會影響CDR區的構型。

將IGHV3-72*01及IGKV2D-29*02此二序列用作構築人類抗IL-20抗體之例子。然而，本領域之技藝人士會瞭解亦可使用其他具有高度同源性的類似序列。其他序列的例子可包括，諸如人類IGHV3-66*04(圖3)及人類IGKV1-39*01(圖4)。此等例子的同源性則顯示於圖5中之表。

本領域之技藝人士可瞭解此等特定的例子僅係具例示性，而非意圖作為本發明範圍的限制。使用同源性檢索方法及人類免疫球蛋白庫搜尋範本抗體(其中該架構區將置換成人類序列)的同源性序列僅涉及例行的技術，且本領域之技藝人士可基於所欲之目的來鑑定適當的同源性序列。任何類似同源性人類序列皆可被使用。較佳為，此等人類序列與範本抗體(如7E)上架構區之間具有高度同源性。尚且，亦可使用多種與天然發生人類重鏈或輕鏈可變序列實質同源的序列(即「同源變異體」)。例如，該同源變異體可與人類重鏈或輕鏈可變序列間具有90%或更高(如93%、95%、98%或99%)的同一性。

HH12 scFv之構築及展現：根據所選擇之人類重鏈及輕鏈可變區同源體(如IGHV3-72*01及 IGKV2D-29*02)，可將已知抗IL-20抗體(如mAb 7E)之已知CDR序列移植至該同源性人類重鏈及輕鏈可變序列來獲得一種抗IL-20抗體或其片段(如scFv、Fab等)。以下的實施例係使用源自mAb 7E之CDR序列。然而，本領域之技藝人士可瞭解，任何抗IL-20抗體之CDR序列皆可被使用。

於此特定的實施例中，產生了一個scFv片段。該scFv片段(命名為HH12)係由分別來自IGHV3-72*01及IGKV2D-29*02的完整人類重鏈及輕鏈架構序列及6個來自mAb 7E之完整小鼠CDR序列所組成。於此實施例中，HH12 scFv構築體係使用重疊PCR法來組裝。首先，製備具有重疊序列之寡核苷酸。接著，根據製造商之方法，使用0.5μl之Pfx50 DNA聚合酶及5μl之Pfx50緩衝液(Invitrogen)將該等寡核苷酸之等莫耳混合物進行PCR組裝。

於使用重疊擴張PCR完成HH12 scFv構築體之組裝後，再進行第二個PCR，使用寡核苷酸引子於其中併入5' SfiI及3' NotI限制酶位置。經此程序，製備出一個全長HH12 scFv構築體，其具有所欲的5'及3'末端限制酶位置，該等位置可將該構築體指向性次選殖至噬菌體展現載體pCANTAB5e(Amersham Pharmacia Biotech)中。此載體可用來製備HH12 scFv。

回復突變：為了在自由型293細胞中表現全長抗體，使用質體pTCAE8.3來次選殖該可變區。此質體包含編碼人類κ CL區及人類γ CH區之DNA片段。為在可變區中產生突變，於是使用PCR來合成編碼所欲突變之個別寡核苷酸。此等寡核苷酸含有足夠的重複，可由HH12模板進行PCR引子作用。接著將PCR產物以凝膠純化。再將該經純化PCR產物之等莫耳部分組合，用來進行巨型引子(megaprime)PCR以再生全長V_L(或者，當突變係位於重鏈時，則為V_H)。將該全長V_L片段次選殖至pTCAE8.3載體中，還表現含有所欲突變之全長抗體。

穿透突變(LTM)庫之構築：穿透突變(LTM)係為一種多維突變，其可在一標靶胜肽區段中，同時對經選擇之胺基酸進行評估及最佳化組合突變。LTM已成功地用在CDR序列的最佳化。該突變過程典型地著重於抗原結合中胺基酸側鏈之一或多個CDR域並探索其貢獻(包含協乘貢獻)。參見Rajpal et al.,"A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries," P.N.A.S.,102(24),pp.8466-8471,2005.

為了製備LTM庫，先合成編碼各CDR位置上各取代胺基酸之寡核苷酸。各寡核苷酸含有足夠的重複，可由HH12模板進行PCR引子作用。將含有對應至個別CDRs之LTM寡核苷酸混合物進行PCR來擴增LTM經取代CDR片段。接著，將該等CDR片段以凝膠純化。再將該經純化片段之等莫耳部分組合，用來進行巨型引子PCR以再生全長可變區。將該全長可變區插入pCANTAB5e噬粒載體中。將該經接合DNA(該噬粒)以電穿孔導入大腸菌TG1細胞中來產生庫原料(library stock)。

噬菌體之製備及噬菌體抗體庫之篩選

為了以生物掏洗篩選噬菌體(LTM)庫，將上述之大腸菌庫原料生長至對數期。藉由以M13KO7協助噬菌體(helper page(NEB)轉染來救回會展現scFv之噬菌體顆粒，並於2YTAK(2YT含有100μg/mL安比西林及25μg/mL康黴素)中30℃下進行隔夜擴增。以PEB/NaCl(20% PEG 8000/2.5M NaCl)沉澱出該噬菌體，再將其懸浮於PBS中。該庫之篩選係使用下述之生物素化IL-20及卵白素(streptavidin)包覆順磁性珠M280(Dynal)來進行。

為篩選該LTM庫，分別使用濃度為4.0x10^-8M、1.0x10^-9M、1.0x10^-11M、1.0x10^-12M及1.0x10^-13M之生物素化IL-20來篩選第1、 2、3、4及5循環。將噬菌體與生物素化IL-29抗原之混合物在室溫下緩和地轉動1小時，再使用50~100μl之卵白素包覆M280磁珠來捕捉與生物素化IL-29抗原接合之噬菌體5分鐘。於捕捉該噬菌體後，使用Dynal磁化顆粒濃縮器沖洗該珠子10次(4×PBST(PBS含有0.05% Tween 20)、2×PBSM(含有2%脫脂奶粉)、4×PBS)。於第3、4及5次沖洗時，其係在與1.4μM IL-20(非生物素化)競爭下進行。再與1ml之100mM三乙胺(TEA)接續培養30分鐘，會將結合噬菌體由珠子上洗提出。將沖提物組合並以0.5ml之1M Tri HCl(pH 7.4)中和，再用一半的沖提物來感染對數期之大腸菌TG1。視所欲之週期數，重複進行該接合、捕捉、沖洗、沖提及再感染。

HH12之表現及親和力測量

將編碼HH12及其突變株之V_H及V_L鏈的基因插入pTCAE8.3表現載體來製備scFv構築物。將構築物轉染至自由型293細胞(Invitrogen)。根據製造商(Invitrogen)所提供之使用手冊，使用螢光金奈米團簇(lipofectamine)2000來將載體轉染至宿主細胞中。將全長scFv由懸浮物池中純化出後，使用競爭ELISA及BIACore結合分析來偵測並評估抗原決定基特異性及結合親和力。

組合性有益選殖株

由上述實驗，可鑑定出仍能與IL-20結合的突變抗體，但不會鑑定出該等喪失IL-20結合親和力之突變株。分析結果顯示，在HH12輕鏈CDR區上有3個突變所產生的抗體具有增進之IL-20結合力。此3個突變包括S32Y(於CDRL-1)、L50Q(於CDRL-2)及D55N(於CDRL-2)，其在圖2中係為以圓圈標示之殘基。

此結果進一步建議，於CDR區上之其他殘基突變可能會產生親和力相對較低之抗體，因此不會由噬菌體掏洗中選出，因該掏洗頃向選擇最緊密結合的噬菌體族群。因此於CDR區上之此等其他胺基酸對 IL-20的結合交互作用可能會有相對的助益，只是對此等其他位置的取代是否有顯著的增進效果為沒瞭解。

除了CDR區上的3個"增進"取代外，由噬菌體展現生物掏洗過程中所鑑定出之最佳抗體FLB5M5中，HH12架構區中亦含有5個有益的突變。已發現該5個突變係為將HH12上的殘基突變回mAb 7E上之對應殘基(即回復突變)。如圖2所示，該5個胺基酸為F2、V3、L36、K45及H46，其皆位於輕鏈可變序列。回復突變產生較佳結合力之事實建議，此等架構區上的殘基對IL-20的結合具有間接的貢獻。此等殘基可能對CDR區構型之維護具有貢獻。

表2顯示，由LTM庫中掏洗鑑定出之FLB5M5抗體可與IL-20更緊密地結合(相較於mAb 7E)，且圖3顯示其具有較佳的治療功效。此人類化抗體比天然抗體佳係驚人的發現，因為mAb 7E為由免疫系統所製造的天然抗體。已知免疫系統的效能係用於製造能與抗原結合的"完美"抗體。因此，就抗體與標的抗原的結合而言，一般咸認為將抗體人類化會產生較差的抗體。

圖1及圖2分別顯示該重鏈可變區序列(SEQ ID NO：4)及該輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：8)。SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10則分別顯示整個重鏈序列(包括來自人類免疫球蛋白之恆定區)及整個輕鏈序列(包括該恆定區)，SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12則分別顯示編碼SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之對應聚核苷酸序列。

丙胺酸掃描獲得CDR區上之重要殘基

上述LTM庫之噬菌體掏洗可鑑定出最佳化(結合更緊密)之抗體。然而此噬菌體掏洗方法，僅能因當CDR區上某些胺基酸發生取代而因此不具緊密結合性來推論該等胺基酸的重要性。為了能正向評估CDR區上不同胺基酸側鏈對IL-20結合的貢獻，於是進行丙胺酸掃描，用丙胺酸來取代CDR區上之各別胺基酸。如果原始胺基酸側鏈對結合係重要者，該丙胺酸取代會導致結合親和力的降低。圖5即顯示此種結構活性關係(SAR)研究的一種範例。

圖8顯示丙胺酸取代所產生抗體的結合分析結果。結果發現HH12與FLM5M5之CDRH3及CDRL3上的3個殘基為重要者。特言之，CDRH3上之W100為重要者，因為在此位置知丙胺酸取代會實質降低HH12與FLM5M5兩者之結合親和力。於CDRL3中，F94似較Q90更重要。

結果發現在其他位置之丙胺酸取代並不會造成對IL-20之結合產生明顯的改變。

IL-20結合活性

使用BIAcore T100生物感應系統進行表面電漿共振量測來評估各別經純化抗IL-20抗體對人類IL-20之結合動力學。使用抗人類IgG固定化CM5感應晶片來捕捉抗IL-20抗體。該抗人類IgG之固定量為約9,000-10,000 RU，且該抗IL-20抗體之捕捉量為約350-400 RU。結合係在IL-20(以HEPES緩衝鹽水(BIA確認)稀釋成不同濃度)之流速固定為30μL/分鐘下進行60秒。藉由通透過HEPES緩衝液480秒來進行解離。表面之再生係在以10mM甘胺酸pH 2.0/1.5(50：50)處理40秒下進行。

各抗IL-20抗體之IL-20親和力係使用由Biacore T100評估軟體2.0所提供的預先定義模型(1：1結合)所獲得之親和力結合曲線擬合(affinity binding curve fit)來計算。表2顯示mAb 7E、HH12及FLB5M5之結合親和力數據。由表2之數據可發現，即使相較於mAb 7E，HH12具有較低的親和力，FLB5M5的親和力卻比mAb 7E高(即較低的K_D值)。

人工抗體FLB5M5對IL-20的結合力是數倍於mAb 7E與IL-20間者的事實確屬無法預期者。mAb 7E為小鼠免疫系統所產生的天然抗體。在多種細胞素及協助者細胞的交互作用下，已知免疫系統的效能係用於製造能與抗原結合的"完美"抗體。因此，對天然抗體進行人類化通常會產生"較不完美"的抗體，亦即人類化抗體的親和力通常都會低於原始抗體(參見美國8,597,647號專利)。

IL20R2/IL22R BaF3增生分析

IL-20是一種多效細胞素，且已知其涉及多種發炎性疾病及其他病症，且已知藉由對IL-20功能的抑制，可預防或降低多種與IL-20有關之疾病及病症。本發明之抗體對IL-20具有高度的結合親和力。因此亦可用做治療或預防與IL-20有關疾病或病症之治療劑。

本發明之某些態樣係有關治療或預防與IL-20有關疾病之方法，例如該疾病包括發炎性疾病(如類風濕性關節炎)、骨質疏鬆、癌症、中風、腎衰竭、雌激素不足(如更年期)、雄激素不足(男性更年期)或癌症引發骨質溶解。根據本發明之一種態樣，該方法可包括向需此治療之個體投予有效量之本發明之抗體。

於本實施例中，係測試本發明抗體於抑制或降低IL-20誘發細胞增生之能力。簡言之，以全長人類IL-20受體複合物IL-22R及IL-20R2穩定轉染Ba/F3細胞來製備用作標靶之BaF-3(IL-20R2/IL22R)細胞。Ba/F3細胞為早期淋巴母細胞系之鼠類前驅B細胞，其依賴IL-3生存及增生。該等細胞可培養於含有10%胎牛血清及1ng/mL IL-3之RPMI培養基。人類重組IL-20可誘發此等細胞的增生作用。此IL-20誘發的細胞增生系統可用於評估本發明抗體在抑制IL-20功能上之能力，因其會與IL-20結合。

在此增生分析中，將BaF-3(IL-20R2/IL22R)細胞接種於微量滴定盤的孔中，在沒有IL-3之培養基中的接種量為每孔10⁴個細胞，培養於37℃、5% CO₂培養器中2小時。接著，將BaF-3(IL-20R2/IL22R)細胞與預培養之300pM人類細胞素IL-20及增量之受測抗體(由1000nM 3倍稀釋至0.15nM)再培養72小時。於本實施例中，對3種抗體(mAb 7E、FLB5及FLB5M5)進行測試。如圖2所示，相較於HH12，FLB5為CDR區上含有3個胺基酸改變的抗體。然而，FLB5含有與HH12相同的架構區。換言之，FLB4並沒有相對於FLB5M5架構區上的5個"回復"突變胺基酸。

經培養後，將AlamarBlue(Promega；一種比色/螢光生長指示劑)加入培養物，將細胞再培養6小時。將微量滴定盤置於螢光機，並在530nm激發與580nm放射下進行讀取。將該等螢光讀數以SigmaPlot Sofrwar分析獲得抗人類IL-20抗體之半最大反應值(EC₅₀)。

圖6即顯示該增生分析的結果。如圖6所示，FLB5抗體在抑制IL-20誘發增生的效果為佳，且比mAb 7E好些，然FLB5M5則顯著優於mAb 7E。此經修飾抗體具有較天然產生抗體更佳結合緊密度的事實係無法預期者。

表3顯示FLB5M5之EC₅₀值與mAb 7E之EC₅₀值的比較。此等數據顯示FLB5M5於抑制IL-20誘發細胞增生的效果較mAb 7E好上數倍。再次，此人造抗體較天然抗體mAb 7E更有效的事實係無法預期者。

膠原蛋白誘發關節炎大鼠模型

如前所述，IL-20與發炎性疾病有關，且抗IL-20抗體已被證明可有效降低發炎性疾病(如類風濕性關節炎)。本發明之抗體亦應可用於治療關節炎。此功效係使用膠原蛋白誘發關節炎大鼠模型來測驗。

於此動物模型中，於第0天及第7天，使用第II型膠原蛋白免疫6週大的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來引發關節炎。例如，將該大鼠以含有等量之Freund氏完全佐劑、4mg/ml熱處死結核菌及牛第II型膠原蛋白(穩定於2mg/ml之0.05M乙酸中)之乳液進行免疫。各鼠於第0天時，於其背部皮下注射200μl之乳液。於第7天時，於大鼠尾巴根部之皮下注入100μl之相同乳液作為加強劑量。將注射緩衝液(沒有膠原蛋白(空白))的大鼠作為負對照組(無關節炎)。

於關節炎開始後(通常發生在第10-13天)，即開始進行治療。在每週2次且總共注射3次下投予大鼠，意即於第10、14及18天時，於所有治療組動物之背部進行單一團的皮下注射。該治療之劑量為1mg/kg(mpg)、3mg/kg及9mg/kg之hFLB5M5抗體。使用Embrel(6mg/kg)作為陽性治療對照組。將體重(圖4C)、後足拓厚度(PTH)(圖4B)及關節炎分數(AS)(圖4A)用作該抗體3種劑量療效的評估依據。

圖7A顯示以關節炎分數(AS)評估的測驗結果。如圖7A所示，FLB5M5之投予可使AS產生實質上的降低，此表示該抗體可有效降低關節炎之病徵。FLB5M5抗體即使在1mg/kg下就可有效降低AS，而此抗體在3mg/kg及9mg/kg下所產生的效果與陽性對照組(6mg/kg之Embrel)相似。此結果明確證明FLB5M5可用於治療或預防關節炎。

圖7B顯示以後足拓厚度分析的結果。如圖7B所示，FLB5M5之投予可使後足拓厚度產生實質上的降低，此表示該抗體可有效降低關節炎之病徵。FLB5M5抗體即使在1mg/kg下就可有效降低後足拓厚度，而此抗體在3mg/kg及9mg/kg下所產生的效果與陽性對照組(6mg/kg之Embrel)相似。此結果明確證明FLB5M5可用於治療或預防關節炎。

圖7C顯示以體重分析的結果。如圖7C所示，FLB5M5之投予可使體重產生實質上的降低，此表示該抗體可有效降低關節炎之病徵。FLB5M5抗體即使在1mg/kg下就可有效降低體重，而此抗體在3mg/kg及9mg/kg下所產生的效果與陽性對照組(6mg/kg之Embrel)相似。此結果明確證明FLB5M5可用於治療或預防關節炎。

除關節炎外，抗IL-20抗體亦可有效治療與IL-20調節信息通道有關的疾病，其包括但不限定為骨質疏鬆、類風濕性關節炎、癌症、中風或腎衰竭。根據本發明之實施態樣，該疾病可包括骨質疏鬆，其可由發炎性疾病(如類風濕性關節炎)、骨質疏鬆、癌症、中風及腎衰竭所引起、雌激素不足(如更年期)、雄激素不足(男性更年期)或癌症引發骨質溶解。已知抗IL-20抗體可用於治療此等疾病，參見如頒給張等人的美國第8,597,647號專利。

雖然本案僅揭示有限量的實施態樣，本領域之技藝人士基於此揭露確可瞭解可推知的其他實施態樣亦當然不該排除於本發明之範圍外。據此，僅有所附的申請專利範圍對本發明之範圍具有限制力。

<110> 財團法人生物技術開發中心

<120> 對抗介白素-20之人類化抗體及發炎性疾病之治療

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<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類

<400> 2

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

<210> 5

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 人類

<400> 6

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

<210> 9

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

<210> 10

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

<210> 11

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 11

<210> 12

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 12

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> 人類

<400> 15

<210> 16

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

<210> 17

<211> 108

<212> PRT

<213> 人類

<400> 17

<210> 18

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 19

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 20

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 21

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 22

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 24

Claims

一種人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段，其包含：重鏈可變區或其同源變異體，其包含：重鏈架構區、包含SEQ ID NO：19之CDRH1、包含SEQ ID NO：20之CDRH2及包含SEQ ID NO：21之CDRH3，其中該重鏈可變區及其同源變異體之該重鏈架構區具有至少90%之序列同一性；及輕鏈可變區或其同源變異體，其包括：輕鏈架構區、包含SEQ ID NO：22之序列之CDRL1、包含SEQ ID NO：23之序列之CDRL2及包含SEQ ID NO：24之序列之CDRL3，其中該輕鏈可變區及該同源變異體之該輕鏈架構區具有至少90%之序列同一性。
如請求項1之人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段，其中該重鏈架構區包含對應至亞群III(VH3)之人類免疫球蛋白重鏈的架構區之序列，及/或該輕鏈架構區包含對應至kappa亞群II(Vκ2)之人類免疫球蛋白輕鏈的架構區之序列。
如請求項2之人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段，其中該人類免疫球蛋白重鏈亞群III(VH3)可變區包含IGHV3-72*01(SEQ ID NO：2)或IGHV3-66*04(SEQ ID NO：15)之序列；及/或該人類免疫球蛋白輕鏈kappa亞群II(Vκ2)可變區包含IGKV2D-29*02(SEQ ID NO：6)或IGKV1-39*01(SEQ ID NO：17)之序列。
如請求項1-3中任一項之人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段，其中該人類化抗體中之該重鏈可變區包含SEQ ID NO：9，及/或該人類化抗體中之該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：10。
一種組合物，其包含如請求項1-4中任一項之人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段，其係用於治療或預防與IL-20有關之疾病。
如請求項5之組合物，其中該與IL-20有關之疾病為選自發炎性疾病、骨質疏鬆、癌症、中風及腎衰竭所組成之群。
如請求項6之組合物，其中該發炎性疾病為類風濕性關節炎。
一種如如請求項1-4中任一項之人類化抗體或其scFv、Fab或F(ab')₂片段之用途，其係用以製備用於治療或預防與IL-20有關疾病之藥物。
如請求項8之用途，其中該與IL-20有關之疾病為選自發炎性疾病、骨質疏鬆、癌症、中風及腎衰竭所組成之群。
如請求項9之用途，其中該發炎性疾病為類風濕性關節炎。