TW201400617A

TW201400617A - 甲基丙烯酸甲酯之產製方法

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Publication number: TW201400617A
Application number: TW102118833A
Authority: TW
Inventors: Graham Ronald Eastham; David William Johnson; Adrianus Johannes Jozef Straathof; Marco Wilhelmus Fraaije; Remko Tsjibbe Winter
Original assignee: Lucite Int Uk Ltd
Priority date: 2012-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-01-01
Also published as: BR112014029726A2; EA201492264A1; CN104350155B; MY169813A; US9816115B2; GB201209425D0; EP2855689A1; AU2013269391B2; MX2014014370A; WO2013179005A1; ES2733758T3; SG11201407711QA; CA2873620A1; JP6571749B2; US20150112037A1; JP2015519062A; EP2855689B1; CN104350155A; KR20150027141A; AR091181A1

Abstract

本發明闡述產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法。該方法包含以下步驟：(i)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將2-丁酮轉化成丙酸甲酯，及(ii)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。本發明亦闡述製備甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之聚合物或共聚物之方法。

Description

甲基丙烯酸甲酯之產製方法

本發明係關於藉由使用新穎酶催化方法自2-丁酮產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，及由其產製聚合物及共聚物之方法。

甲基丙烯酸(MAA)及其甲基酯(即，甲基丙烯酸甲酯(MMA))係化學工業中之重要單體。其主要應用係產製用於各種應用之塑膠。最重要的聚合應用係澆注、模製或擠出聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以產製高光學透明度塑膠。此外，使用許多共聚物，重要共聚物係甲基丙烯酸甲酯與α-甲基苯乙烯、丙烯酸乙酯及丙烯酸丁酯之共聚物。此外，藉由簡單轉酯化反應，MMA可轉化成其他酯，例如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯等。

當前，MMA(及MAA)係藉由眾多化學程序來產製，該等化學程序中之一者係成功的「α方法」，其中MMA係自酯丙酸甲酯藉由與甲醛之無水反應獲得。在α方法中，丙酸甲酯係藉由乙烯之羰基化來產製。此乙烯原料係源自化石燃料。最近，業內亦需要用於化學工業之可持續生物質原料之來源。因此，在α方法中使用丙酸甲酯之替代生物質來源將係有利的。

因此，本發明之一目標係解決前述問題，且提供用於產製MMA之生物或部分生物方法。

令人驚訝地，本發明者已發現在新穎方法中施加不尋常之酶來以工業上可用位準形成MMA之途徑，由此為關鍵單體提供新的且可行的基於生物的路徑。

本發明之第一態樣提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將2-丁酮轉化成丙酸甲酯，及(ii)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

以上方法可進一步包括自原始原料形成2-丁酮之步驟，其中術語「原始原料」包含任何能夠轉換成2-丁酮之基礎有機化學品，例如(但不限於)2-丁醇、乙偶姻、2,3-丁二醇或甲基乙烯基酮。

以上方法可進一步包括使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體(例如富含CO及/或CO₂之氣體)發醛來產製原始原料之步驟，其中術語「原始原料」係如上文所定義。微生物可轉化氣體之適宜來源包含工業煙道氣、合成氣及重組甲烷。

以上方法可進一步包括自生物質獲得糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體之步驟，其中術語「生物質」在本文中定義為活著或先前活著之植物或動物性物質且其可視為廢棄物或意欲用於本發明中所闡述用途之物質。

較佳處理丙酸甲酯以藉由任何適宜之已知化學或生物化學方法來產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。較佳處理丙酸甲酯以在適宜觸媒存在下藉由與甲醛或其適宜來源反應來產製甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸。此反應通常係在無水條件下進行。

用於製備甲基丙烯酸或酯之適宜方法包括使丙酸甲酯與如下文所定義之式I之甲醛之適宜來源在適宜觸媒存在下且視情況在甲醇存在下接觸：

其中R⁵及R⁶係獨立地選自C₁-C₁₂烴，較佳C₁-C₁₂烷基、烯基或芳基或H，更佳C₁-C₁₀烷基或H，最佳C₁-C₆烷基或H，尤其甲基或H；X為O；n係1至100、較佳1至10、更佳1至5、尤其1至3之整數；且m為1。

在尤佳實施例中，式I化合物係在甲醇及/或水存在下衍生自甲醛。在該情形下，式I化合物可定義為甲醛之適宜來源。

為避免疑問，甲醛之適宜來源包含任何可提供甲醛來源之平衡組合物。該等組合物之實例包含(但不限於)甲縮醛(1,1二甲氧基甲烷)、聚甲醛-(CH₂-O)_i-(其中i=1至100)、福爾馬林(formalin)(甲醛、甲醇、水)及其他平衡組合物(例如甲醛、甲醇及丙酸甲酯之混合物)。

通常，聚甲醛係甲醛與甲醇之較高碳數縮甲醛CH₃-O-(CH₂-O)_i-CH₃(「縮甲醛-i」)，其中i=1至100、較佳1-5、尤其1-3，或具有至少一個非甲基端基之其他聚甲醛。因此，甲醛來源亦可係式R³¹-O-(CH2-O-)_iR³²之聚甲醛，其中R³¹及R³²可係相同或不同基團且至少一者係選自C₂-C₁₀烷基，例如R³¹=異丁基，且R³²=甲基。

較佳地，甲醛之適宜來源係選自1,1二甲氧基甲烷、甲醛與甲醇之高碳數縮甲醛CH₃-O-(CH₂-O)_i-CH₃(其中i=2)、福爾馬林或包括甲醛、甲醇及丙酸甲酯之混合物。

較佳地，術語福爾馬林意指甲醛：甲醇：水之比率以重量計為25%至65%：0.01%至25%：25%至70%之混合物。更佳地，術語福爾馬林意指甲醛：甲醇：水之比率以重量計為30-60%：0.03-20%：35-60%之混合物。最佳地，術語福爾馬林意指甲醛：甲醇：水之比率以重量計為35-55%：0.05-18%：42-53%之混合物。

較佳地，包括甲醛、甲醇及丙酸甲酯之混合物含有少於5重量%之水。更佳地，包括甲醛、甲醇及丙酸甲酯之混合物含有少於1重量 %之水。最佳地，包括甲醛、甲醇及丙酸甲酯之混合物含有0.1重量%至0.5重量%之水。

熟習此項技術者已知使用甲醛將丙酸甲酯(MEP)催化轉化成MMA之適宜觸媒。一已知觸媒係鹼性觸媒，例如載體(例如二氧化矽)上之鹼金屬觸媒，其可包含其他金屬及金屬化合物。適宜二氧化矽係高表面積之多孔二氧化矽。二氧化矽之表面積可係至少30m²g^-1。較佳鹼金屬係銫。鹼金屬可以佔觸媒1-10重量%之量存在。觸媒可含有其他金屬，例如鎂、鋁、鉿、硼及/或鋯。其他金屬之量係可變的，但當其他金屬以使觸媒含有總共0.25克至2克該改質劑元素原子/100莫耳二氧化矽之量存在時可獲得優良結果。

其他適宜觸媒包含混合金屬氧化物(M¹ _wM² _xO_y)，其中M¹係至少一種選自以下之金屬：週期表之第4至第6週期中之3族或4族、週期表之第3至第5週期中之13族或鑭系中之剩餘元素(即鈧、釔、鑭元素、鈦、鋯、鉿；鋁、鎵、銦)且M²係至少一種選自以下之金屬：週期表之第5或第6週期中之5族或週期表之第4或第5週期中之15族(即鈮、鉭、砷及銻)；含有磷之混合金屬氧化物(M¹ _wM² _xP_yO_z)，其中M¹係IIIb族金屬(較佳鋁)，且M²係IVb族金屬(較佳矽)；氮化單金屬氧化物，例如氮化物Ta₂O₅；氮化混合金屬氧化物(M¹ _wM² _xN_yO_z)，其中M¹係選自週期表之2、3、4、13族(亦稱為IIIA族)或14族(亦稱為IVA族)之金屬且M²係選自5或15族(亦稱為VA族)之金屬；及II族磷酸鹽，例如羥磷灰石及正磷酸鹽，尤其棒狀或針狀晶體習性之鈣及鍶羥磷灰石；所有皆視情況在適宜載體(例如二氧化矽或氧化鋁)存在下。

使用甲醛將丙酸甲酯(MEP)催化轉化成MMA或MAA通常係在高溫下(通常250℃至400℃之範圍內)實現。若期望產物係酯，則較佳在相關醇存在下實現反應以使經由酯水解之相應酸形成最小化。而且為方便起見，通常需要以福爾馬林形式引入甲醛。因此，為產製甲基丙烯酸甲酯，進給至觸媒之反應混合物將通常係由丙酸甲酯、甲醇、甲醛及水組成。

Baeyer-Villiger氧化係指將氧原子插入至酮中以形成酯。在不對稱酮中，此插入反應幾乎完全在酮之羰基碳與最穩定碳正離子之間發生。通常已知不對稱酮之Baeyer-Villiger氧插入之適當遷移順序為三級烷基>二級烷基，芳基>一級烷基>甲基(March’s Advanced Organic Chemistry：Reactions,Mechanisms and Structure，第6版，第1619頁)。因此，2-丁酮之Baeyer-Villiger氧化傳統上將與產物乙酸乙酯有關。因此，2-丁酮之Baeyer Villiger氧化作用並非係熟習此項技術者將樂意選擇作為經由丙酸甲酯產生甲基丙烯酸甲酯之路徑的路徑。然而，本發明者已發現，某些Baeyer-Villiger單加氧酶可以異常方式將氧原子插入2-丁酮中，從而產生丙酸甲酯之不太可能產物。

令人驚訝地，此已產生用於聚合物工業之甲基丙烯酸甲酯單體之不尋常且新穎之生物路徑，即經由將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵成醇及其隨後氧化成2-丁酮且因此經由異常Baeyer-Villiger氧化獲得MEP。

已知Baeyer-Villiger氧化酶對於多種生物體而言很普通，包含細菌、植物、動物、古菌及真菌。Baeyer-Villiger氧化酶可催化酮轉化成酯。然而，彼等所報告之酶僅闡述為在生物系統中作用於基於環之酮(內酯)而非直鏈脂肪酮。在少數已測試其對直鏈脂肪酮之活性之研究中，該等酶經報告具有極低活性。

如本文所使用之術語「Baeyer-Villiger單加氧酶」較佳係指能夠催化氧化反應且屬於EC分類1.14.13.X類之酶，且該等酶通常包括以下特徵性序列：分別處在蛋白序列之N端及中間之兩個Rossmann摺疊蛋白序列基序(GxGxxG)及位於摺疊蛋白之環區域中之典型BVMO結合基序FxGxxxHxxxW[P/D]。

Baeyer-Villiger單加氧酶可係野生型酶或改質酶。此外，該酶可按照野生型或其改質形式來合成。

本文所使用之術語「野生型」無論係關於多肽(例如酶)、多核苷酸(例如基因)、生物體、細胞或是任何其他物質，皆指該物質之天然存在形式。

如本文關於多肽(例如酶)、多核苷酸(例如基因)、生物體、細胞或任何其他物質所使用之術語「經改質」皆係指該物質與野生型不同。

如本文所使用之術語「微生物可轉化氣體」意指可藉由微生物轉化成原始原料之氣體。適宜氣體係富含CO之氣體且適宜發酵係闡述於US 2012/0045807A1中，其中在適當培養基中在熟習此項技術者已知之條件下用梭菌(Clostridia，例如自產乙酶梭菌(Clostridium autoethanogenum)、楊氏梭菌(Clostridium ljundahlii)及拉格利梭菌(Clostridium ragsdalei))使用厭氧發酵將CO轉化成2,3-丁二醇。

可產製經改質物質之野生型物質之適宜變化包含遺傳材料之變化、蛋白質材料之變化。

遺傳材料之變化可包含任何將使材料與野生型不同之業內已知遺傳改質。

該等遺傳改質之實例包含(但不限於)可對含有欲改質之相關基因之多核苷酸序列實施之缺失、插入、取代、融合等。

本發明範疇內之該等遺傳改質亦可包含任何適宜表觀遺傳改質。表觀遺傳改質可包含任何影響相關遺傳材料而不改質含有欲改質之相關基因之多核苷酸序列之改質。表觀遺傳改質之實例包含(但不限於)核酸甲基化或乙醯化、組蛋白改質、副突變、基因沉默等。

蛋白質材料之變化可包含任何將使材料與野生型不同之業內已知蛋白質改質。

該等蛋白質改質之實例包含(但不限於)：裂解多肽部分，包含片段化；附接其他生物化學官能基；改變胺基酸之化學性質；改變胺基酸殘基，包含保守及非保守取代、缺失、插入等；改變多肽之鍵結等；其可針對摺疊形成欲改質之相關蛋白質之多肽序列來實施。

該等材料之結構之變化可包含任何將使遺傳或蛋白質材料之結構與野生型不同之業內已知結構改質。

該等結構修改形式之實例包含由以下因素引起但不限於以下因素之改質：與其他結構之相互作用；與溶劑之相互作用；與受質、產物、輔因子、輔酶或任何存在於適宜反應中之其他化學品(包含其他多核苷酸或多肽)之相互作用；四級蛋白質結構之產生；可對感興趣之相關遺傳或蛋白質材料之結構實施之環境溫度或pH等變化。

根據以上遺傳變化、蛋白質變化或結構變化之群詳述之改質各自係以熟習此項技術者已知之寬範圍之可能改質之例示給出，且並不意欲限制本發明之範疇。

Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)酶較佳係野生型酶。Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)更佳係源自生物體之野生型酶，其中該生物體可來自任何領域，包含古菌、細菌或真核生物。Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)仍更佳係源自生物體之野生型酶，其中該生物體來自植物、真菌、古菌或細菌界。Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)仍更佳係源自細菌或真菌之野生型酶。

野生型Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)之適宜細菌來源包含(但不限於)來自以下細菌屬之細菌：不動桿菌屬(Acinetobacter)、赤球菌屬(Rhodococcus)、關節桿菌屬(Arthrobacter)、短單胞菌屬(Brachymonas)、奴卡氏菌屬(Nocardia)、外瓶黴屬(Exophiala)、短桿菌屬(Brevibacterium)、戈登氏菌屬(Gordonia)、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、嗜高溫放線菌屬 (Thermbbifida)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)。野生型Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)之較佳細菌來源係來自以下屬之細菌：不動桿菌屬或赤球菌屬。

野生型Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)之適宜真菌來源包含(但不限於)來自以下真菌屬之真菌：赤黴菌屬(Gibberella)、麴菌屬(Aspergillus)、巨座殼屬(Maganporthe)、柱孢菌屬(Cylindrocarpon)、彎孢菌屬(Curvularia)、德雷克斯孢菌屬(Drechslera)、酵母菌屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Caddida)、小克銀漢黴屬(Cunninghamella)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。野生型Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)之較佳真菌來源係來自以下屬之真菌：赤黴菌屬、麴菌屬或巨座殼屬。

Baeyer-Villiger單加氧酶最佳係源自以下細菌種類之野生型酶：醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)NCIMB 9871或約氏赤球菌(Rhodococcus jostii)RHA1或赤球菌屬HI-31或黃色桿菌(Xanthobacter flavus)。

Baeyer-Villiger單加氧酶可係I型、II型或O型Baeyer-Villiger單加氧酶。Baeyer-Villiger單加氧酶較佳係I型Baeyer-Villiger單加氧酶。Baeyer-Villiger單加氧酶更佳係選自以下酶群組中之一者之I型Baeyer-Villiger單加氧酶：環己酮單加氧酶(CHMO)EC，編號為1.14.13.22(GenBank：BAA86293.1)；苯丙酮單加氧酶(PAMO)，EC編號為1.14.13.92(Swiss-Prot：Q47PU3)；4-羥基苯乙酮單加氧酶(HAPMO)，EC編號為1.14.13.84(GenBank：AAK54073.1)；丙酮單加氧酶(ACMO)(GenBank：BAF43791.1)；甲基酮單加氧酶(MEKA)(GenBank：ABI15711.1)；環十五酮單加氧酶(CPDMO)(GenBank：BAE93346.1)；環戊酮單加氧酶(CPMO)(GenBank：BAC22652.1)；類固醇單加氧酶 (STMO)(GenBank：BAA24454.1)。Baeyer-Villiger單加氧酶仍更佳係環己酮單加氧酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶、環十五酮單加氧酶或丙酮單加氧酶，其可係選自以下酶中之一者：來自醋酸鈣不動桿菌NCIMB 9871之環己酮單加氧酶、來自黃色桿菌(GenBank：CAD10801.1)之環己酮單加氧酶、來自赤球菌屬HI-31(GenBank：BAH56677.1)之環己酮單加氧酶、來自派氏短單胞菌(Brachymonas petroleovorans，GenBank：AAR99068.1)之環己酮單加氧酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶(Q93TJ5.1)、環十五酮單加氧酶(GenBank：BAE93346.1)或來自戈登氏菌屬TY-5(Genbank：BAF43791.1)之丙酮單加氧酶。

Baeyer-Villiger單加氧酶仍更佳係環己酮單加氧酶或丙酮單加氧酶，其可係選自來自醋酸鈣不動桿菌NCIMB 9871之環己酮單加氧酶、來自黃色桿菌(GenBank：CAD10801.1)之環己酮單加氧酶、來自赤球菌屬HI-31(GenBank：BAH56677.1)之環己酮單加氧酶、來自派氏短單胞菌(GenBank：AAR99068.1)之環己酮單加氧酶或來自戈登氏菌屬TY-5(Genbank：BAF43791.1)之丙酮單加氧酶。

令人驚訝地，本發明者已發現，環己酮單加氧酶可以較高速率利用濃度僅為5mM之2-丁酮受質產製丙酸甲酯。

因此，Baeyer-Villiger單加氧酶最佳係較佳源自以下之環己酮單加氧酶：醋酸鈣不動桿菌NCIMB 9871、黃色桿菌(GenBank：CAD10801.1)或赤球菌屬HI-31(GenBank：BAH56677.1)。

Baeyer-Villiger單加氧酶最佳係源自以下細菌種類之野生型酶：醋酸鈣不動桿菌NCIMB 9871或約氏赤球菌RHA1或赤球菌屬HI-31或黃色桿菌或派氏短單胞菌。

此外，本發明者已驚奇地發現，4-羥基苯乙酮單加氧酶及環十五酮單加氧酶亦可以工業顯著量產製丙酸甲酯。

因此，在替代較佳實施例中，Baeyer-Villiger單加氧酶係4-羥基苯乙酮單加氧酶或環十五酮單加氧酶。更佳係4-羥基苯乙酮單加氧酶(Q93TJ5.1)或環十五酮單加氧酶(GenBank：BAE93346.1)。

4-羥基苯乙酮單加氧酶較佳源自螢光假單胞菌(Pseudomonas flourescans)。

環十五酮單加氧酶較佳源自假單胞菌屬HI-70 。

因此，Baeyer-Villiger單加氧酶最佳係來自細菌種類螢光假單胞菌之4-羥基苯乙酮單加氧酶或來自細菌種類假單胞菌屬HI-70 之環十五酮單加氧酶。

在任一情形下，Baeyer-Villiger單加氧酶較佳係選自環己酮單加氧酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶或環十五酮單加氧酶中之一者。

視情況，本發明中所使用之Baeyer-Villiger單加氧酶可以一或多種上述Baeyer-Villiger單加氧酶之混合物形式存在。在該情形下，Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)可源自任一種或多種上文所闡述之來源並呈任何組合或調配物形式。例如，Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)可係源自細菌之BVMO酶及源自真菌之BVMO酶之混合物，其中一種酶可為改質酶且一種可為野生型酶。

另一選擇為，在又一實施例中，Baeyer-Villiger單加氧酶可以改質酶形式存在。經改質BVMO酶較佳係遺傳上經改質之酶，其中BVMO酶之遺傳材料與野生型不同。

在一實施例中，經遺傳改質之BVMO酶可係自一或多種上述Baeyer-Villiger單加氧酶之野生型遺傳序列之部分構築以產生嵌合體之融合蛋白。該等嵌合BVMO之較佳實例包含(例如)PASTMO(PAMO與STMO之融合物)或如van Beek等人在Chemical Communications 2012,48,3288-3290中所闡述之PACHMO(PAMO與CHMO之融合物)。

Baeyer-Villiger單加氧酶較佳係藉由以業內已知方式繁殖已經相關核酸轉型以表現該Baeyer-Villiger單加氧酶之宿主生物體來產製。適宜宿主生物體包含(但不限於)：細菌、真菌、酵母菌、植物、藻類、原生生物等。

相關核酸較佳係於宿主生物體內之表現載體上表現。適宜表現載體包含任何業內已知之市售載體，例如(但不限於)噬菌體、質體、黏質體、噬菌粒、福斯質體(fosmid)、細菌人工染色體、酵母菌人工染色體等。

適宜地，如下文針對細菌所論述，最適宜載體、轉型方法及在宿主生物體中表現BVMO酶所需要之所有其他相關過程皆適用於業內已知之相關宿主生物體。

宿主生物體較佳為細菌。因此，所使用之表現載體適宜地係任何市售質體，例如(但不限於)：pBR、pUC、pBS、pBE、ColE、pUT、pACYC、pA、pRAS、pTiC、pBPS、pUO、pKH、pWKS、pCD、pCA、pBAD、pBAC、pMAK、pBL、pTA、pCRE、pHT、pJB、pET、pLME、pMD、pTE、pDP、pSR等。所使用之表現載體更佳係以下市售質體中之一者：pBAD、pCRE或pET。

表現載體視情況可係經改質表現載體，其不為市售品且已經改變以使其適於在宿主生物體內特定表現BVMO酶。因此，在較佳實施例中，所使用之表現載體係pCRE2質體，其係基於商業pBAD質體用於在宿主細菌中表現BVMO酶，如Torres Pazmino等人在ChemoBioChem 10：2595-2598(2009)中所闡述。

宿主細菌較佳藉由任何業內已知之適宜方式來轉型，該等方式包含(但不限於)顯微注射、超音波、冷凍-解凍方法、微穿孔或使用化學感受態細胞。更佳藉由電穿孔來轉型宿主細菌。

適宜宿主細菌包含來自以下屬之彼等：鏈黴菌屬、大腸桿菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)或弧菌屬(Vibrio)。宿主細菌較佳係選自大腸桿菌屬。宿主細菌更佳係大腸桿菌種。宿主細菌最佳係大腸桿菌TOP10菌株。

於表現載體上表現之相關核酸較佳係編碼Baeyer-Villiger單加氧酶之遺傳序列加上如業內已知在宿主細菌中實現其表現所需要之任何其他遺傳序列，例如(但不限於)啟動子、終止子、下游或上游效應子、抑制因子、活化子、增強子、結合輔因子、起始子等。

表現載體較佳進一步包括編碼至少一種表現標記之遺傳序列。表現標記能夠正確識別已經轉型之宿主細菌細胞。適宜表現標記包含(但不限於)任何業內已知者：抗細菌抗性基因、色素產製基因、色素抑制基因、代謝能力基因(metabolic capacity gene)或代謝不能基因。表現標記更佳係抗細菌抗性基因。抗細菌抗性基因仍更佳係胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因。因此，僅彼等能夠在含有胺苄青黴素之培養基上生長之細菌表現載體且已經正確轉型。

表現載體較佳進一步包括編碼至少一種活化子之遺傳序列。活化子能夠刺激已經轉型之宿主細菌細胞以藉由與誘導物質相互作用在適宜時間時產製BVMO酶。適宜活化子-誘導物系統包含任何業內已知者，但尤其L-阿拉伯糖為誘導物之阿拉伯糖操縱子(ara operon)或誘導物為異乳糖或IPTG之乳糖操縱子。

視情況，表現載體可進一步包括編碼標籤之遺傳序列。較佳編碼該標籤之遺傳序列可操作以使其連續經編碼Baeyer Villiger單加氧酶之遺傳序列轉錄，以使該標籤形成具有所得Baeyer Villiger單加氧酶之融合蛋白。該標籤使得能夠容易地純化來自宿主細菌溶解物之所得Baeyer Villiger單加氧酶。適宜標籤包含任何業內已知者(但不限於)His-標籤、GST標籤、MBP標籤或抗體標籤。

宿主細菌較佳係在如業內已知之適宜條件下藉由將其於適宜培養基中或其上培養來生長，其中培養基可為培養液或固定凝膠。培養基較佳含有營養素來源、用於在表現標記存在下選擇之選擇性組份及誘導表現載體在細菌中表現之誘導物，其中該選擇性組份及該誘導物對所使用之表現載體具有特異性。培養基較佳為培養液。培養基更佳為Luria-Bertani培養液。

Baeyer-Villiger單加氧酶可以業內已知之任何適宜形式存在於以上製程之反應混合物中，例如(但不限於)游離細胞提取物、合成酶，或包含於宿主生物體細胞內，且該等單加氧酶可以業內已知之任何適宜方式位於反應混合物中，例如(但不限於)在溶液中呈游離形式、固持於膜上或結合至管柱/管柱內。

BVMO較佳係以產製在相對量之溶解氧下能夠產製之需要量之丙酸甲酯所需之濃度存在於反應混合物中。通常，在工業情況下，每公升每小時約0.01莫耳O₂至0.5莫耳O₂溶解於反應混合物中，此能夠獲得每公升每小時約0.01莫耳丙酸甲酯至0.5莫耳丙酸甲酯。

術語「約」指示高於或低於所述值最大20%之邊際限制。較佳在高於或低於所述值10%內。

在一實施例中，Baeyer-Villiger單加氧酶係作為來自表現其之細胞之細胞提取物存在於反應混合物中，其中該細胞較佳係用於產製BVMO酶之宿主細菌細胞。可藉由能夠溶解宿主細菌細胞之任何適宜方式獲得細胞提取物，該等方式包含(但不限於)音波處理、DNA酶/溶菌酶處理、冷凍-解凍處理或鹼處理。

然後較佳處理細胞提取物以移除細胞碎片，然後作為Baeyer-Villiger單加氧酶之來源用於以上製程中。可藉由任何業內已知之適宜方式來處理細胞溶解物，該等方式包含(但不限於)過濾、離心或經鹽純化以獲得澄清細胞提取物。

其他組份較佳存在於以上製程中之反應混合物中以使Baeyer Villiger單加氧酶恰當地發揮作用。其他組份較佳為緩衝液或pH穩定劑、NADPH及視情況NADPH再生劑。

在反應混合物中可使用任何適宜緩衝液，適宜緩衝液包含(但不限於)Tris-HCl、TAPS、二羥乙甘胺酸、三(羥甲基)甲基甘胺酸、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸鹽、SSC或MES。用於反應混合物中之緩衝液較佳為Tris-HCl。

另一選擇為，可使用pH穩定劑來控制反應混合物之pH。

較佳地，緩衝液或pH穩定劑將反應混合物維持在使BVMO酶發揮作用及/或使包括該BVMO酶之宿主生物體活著之適宜pH下。緩衝液或pH穩定劑較佳將反應混合物之pH維持在約pH 6.5至pH 8.5之間。緩衝液或pH穩定劑更佳將反應混合物之pH維持在約pH 7.3與7.7之間。緩衝液或pH穩定劑仍更佳將反應混合物之pH維持在約7.5。

如針對反應混合物之pH使用之術語「約」指示高於或低於所述值最大20%之邊際限制。然而，反應混合物之pH較佳係在高於或低於所述值10%內。

在反應混合物中緩衝液之濃度較佳係介於約25mM至100mM之間。在反應混合物中緩衝液之濃度更佳係介於約40mM與60mM之間。在反應混合物中緩衝液之濃度仍更佳係約50mM。

如針對緩衝液之濃度使用之術語「約」指示高於或低於所述值最大20%之邊際限制。然而，緩衝液之pH較佳係在高於或低於所述值10%內。

NADPH較佳係以相對於BVMO之起始莫耳濃度存在於反應混合物中以使得BVMO酶經NADPH飽和。因此，NADPH較佳係以至少等於BVMO酶濃度之濃度存在於反應混合物中。

在一實施例中，NADPH較佳係以介於約50μM至200μM之間之起始濃度存在於反應混合物中。NADPH更佳係以介於約90μM至110μM之間之起始濃度存在於反應混合物中。NADPH仍更佳係以約100 μM之起始濃度存在於反應混合物中。

如針對NADPH之濃度使用之術語「約」指示高於或低於所述值之最大20%之邊際限制。然而，NADPH之濃度較佳係在高於或低於所述值10%內。

NADPH再生劑較佳係以介於約5μM至20μM之間之濃度存在於反應混合物中。NADPH再生劑更佳係以介於約8μM至12μM之間之濃度存在於反應混合物中。NADPH再生劑仍更佳係以約10μM之濃度存在於反應混合物中。

若使用，則NADPH再生劑較佳係以相對於BVMO之莫耳濃度存在於反應混合物中以使得BVMO酶經NADPH飽和。因此，若使用，則NADPH再生劑之Km較佳至少等效於BVMO對NADPH之消耗速率。

如針對NADPH再生劑之濃度使用之術語「約」指示高於或低於所述值之最大20%之邊際限制。然而，NADPH再生劑之濃度較佳係在高於或低於所述值10%內。

在反應混合物中可使用任何適宜NADPH再生劑，例如(但不限於)亞磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、醇脫氫酶或甲酸脫氫酶。適宜地，NADPH再生劑之相關伴隨受質亦存在於反應混合物中，例如(但不限於)葡萄糖、醇、亞磷酸鹽或甲酸鹽。

另一選擇為，可將NADPH提供至反應混合物中作為與載體(例如膜、樹脂或凝膠)共價連接之大分子輔因子。

伴隨受質較佳係以介於5mM至20mM之間、更佳介於約8mM至12mM之間、仍更佳約10mM之濃度存在於反應混合物中。

伴隨受質較佳係以相對於NADPH再生劑(NADPH再生劑：伴隨受質)約1：4000與1：250之間之莫耳濃度存在於反應混合物中。伴隨受質更佳係以相對於NADPH再生劑約1：1000之莫耳濃度存在於反應混合物中。

如針對伴隨受質對NADPH再生劑之濃度使用的術語「約」指示高於或低於所述值之最大20%之邊際限制。然而，伴隨受質對NADPH再生劑之濃度較佳係在高於或低於所述值10%內。

適宜地，以上反應混合物中存在受質以起始2-丁酮轉化成丙酸甲酯之過程。在該實施例中，存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度較佳係介於約10g/L與200g/L之間。存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度更佳係介於約50g/L與130g/L之間。存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度再更佳係介於約90g/L與110g/L之間。

如針對受質濃度使用之術語「約」指示高於或低於所述值之最大20%之邊際限制。然而，受質濃度較佳係在高於或低於所述值10%內。

在該實施例中，存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度以反應混合物之重量計較佳係至少約10%，以反應混合物之重量計更佳係介於至少約20%至約80%之間。

在替代實施例中，Baeyer-Villiger單加氧酶可以合成酶存在於反應混合物中。在該實施例中，合成酶係在活體外以業內已知方式合成然後純化，繼而用於反應混合物中。反應混合物較佳包括濃度及比率實質上相同之與以上反應混合物中所定義相同之組份。

在又一替代實施例中，Baeyer-Villiger單加氧酶可存在於宿主生物體細胞(例如細菌細胞)內之反應混合物中。在該實施例中，宿主細胞係以業內已知方式製備然後純化，繼而用於反應混合物中。反應混合物較佳包括如以上反應混合物中所定義之緩衝液及受質。緩衝液較佳係以與上文所定義相同之濃度及比率存在。

然而，在該實施例中，存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度較佳小於對宿主細胞有毒性且對於將受質攝取至宿主細胞中為最佳之濃度限制。因此，存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度較佳係介於約0.2g/L與50g/L之間。存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度更佳係介於約0.2g/L與30g/L之間。存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度仍更佳係介於約0.2g/L與20g/L之間。

在該實施例中，存在於以上反應混合物中之2-丁酮受質之濃度以反應混合物之重量計較佳係至少約1%，以反應混合物之重量計更佳係介於至少約2%至約20%之間。

在該實施例中，適宜地藉由存在於反應培養基中之宿主細胞之濃度來測定存在於反應混合物中之BVMO酶之濃度。存在於反應培養基中之宿主細胞之濃度較佳係介於約1g/L與100g/L之間。存在於反應培養基中之宿主細菌細胞之濃度更佳係介於約5g/L與50g/L之間。存在於反應培養基中之宿主細菌細胞之濃度仍更佳係介於約10g/L與20g/L之間。通常，宿主細胞為細菌細胞。

在該實施例中，反應混合物適宜地不包括添加的NADPH或可選NADPH再生劑及伴隨受質，此乃因其在宿主細胞生物化學內已存在。

無論在反應混合物中所使用之BVMO來源之形式如何，原位產物移除系統較佳在反應過程中與受質進給策略一起實施。已發現，產物之移除與恆定受質進給一起進行可使產物產量增加至更高值，如Alphand等人在Trends in Biotechnology第21卷第7期2003年7月中所闡述。可實施業內已知之任何產物移除系統及任何受質進給策略。然而，產物移除系統及受質進給系統較佳係使用相同技術(例如藉由使用可同時用作受質儲存器及產物槽之載體材料)來實施。一種該技術係使用由Simpson等人Journal of Molecular Catalysis B Enzyme 16，第101-108頁所闡述之Optipore L-493樹脂。

有利地，本發明者已進一步發現，在反應混合物中使用某些共溶劑可增加丙酸甲酯產物之相對及/或絕對量。

如本文所使用之術語「絕對量」係指來自2-丁酮轉化之在溶液中作為產物獲得之丙酸甲酯的實際百分比值。如本文所使用之術語「相對量」係指選擇性，即來自2-丁酮轉化之在溶液中作為產物獲得之丙酸甲酯與在溶液中作為產物獲得之替代產物乙酸乙酯相比之百分比。

因此，在以上反應混合物中較佳包含至少一種共溶劑，適宜共溶劑包含(但不限於)以下中之一者：甲醇、2-丁醇、第三丁醇、二噁烷、丙酮或乙腈。

視情況，共溶劑在反應混合物中之作用亦可由受質2-丁酮來實現。因此，可使用除受質催化所需量以外之過量2-丁酮。

令人驚訝地，受質濃度之增加超出彼等在該等酶轉化中常規使用之量增加BVMO之反應選擇性以相對於正常乙酸乙酯產物產製更多異常插入物及更多丙酸甲酯。令人驚訝地，在相對於BVMO之莫耳濃度超過1000倍之過量濃度下，增加藉由BVMO酶之異常插入物、異常酯之形成以降低乙酸乙酯產製對丙酸甲酯產製之比率。因此，共溶劑/受質之濃度係1000：1或更大mol：mol BVMO，更佳5000：1或更大mol：mol，最佳10000：1或更大mol：mol BVMO。最大濃度將取決於特定反應但應小於使選擇性及/或轉化減小之濃度。在任一情形下，其通常小於1000000：1 mol：mol BVMO，最佳共溶劑/受質之莫耳濃度相對於BVMO介於25000倍與125000倍之間。

有利地，本發明者已發現使用甲醇(特定而言)作為共溶劑極大地增加丙酸甲酯產物相對於乙酸乙酯產物之相對量，且亦極大地使丙酸甲酯之絕對量增加超過任何其他共溶劑所展現之增加量。

因此，所使用之共溶劑最佳為甲醇。

令人驚訝地，在反應混合物中使用濃度增加的甲醇增加BVMO之反應選擇性以相對於正常乙酸乙酯產物產製更多異常插入物及更多丙酸甲酯。

因此，在以上製程中藉由BVMO酶產製之丙酸甲酯：乙酸乙酯之比率較佳係至少1：5，更佳至少1：2，仍更佳至少1：1.5，最佳至少1：0.5。

令人驚訝地，使用濃度增加之甲醇亦增加在以上製程中所產製之丙酸甲酯產物之絕對量。

因此，在以上製程中Baeyer Villiger單加氧酶較佳以至少2%選擇性之絕對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。Baeyer Villiger單加氧酶更佳以至少5%選擇性之絕對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。Baeyer Villiger單加氧酶仍更佳以至少9%選擇性之絕對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。

Baeyer Villiger單加氧酶較佳以至少20%相對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。Baeyer Villiger單加氧酶更佳以至少50%相對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。Baeyer Villiger單加氧酶仍更佳以至少100%相對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。

較佳處理丙酸甲酯以藉由任何適宜已知化學或生物化學方法來產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。較佳處理丙酸甲酯以在如上文所闡述之適宜觸媒存在下藉由與甲醛或其適宜來源反應來產製甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸。

如上文所提及，該方法可進一步包括自原始原料形成2-丁酮之步驟，其中術語「原始原料」包含任何能夠轉換成2-丁酮之基礎有機化學品，例如(但不限於)2-丁醇、乙偶姻、2,3-丁二醇或甲基乙烯基酮。

因此，本發明第一態樣之一實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)自原始原料形成2-丁酮；(ii)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(iii)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

自原始原料形成2-丁酮之步驟較佳包括將2-丁醇轉化成2-丁酮。

因此，本發明第一態樣之較佳實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)自2-丁醇形成2-丁酮；(ii)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(iii)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

此2-丁醇向2-丁酮之轉化可係化學催化或酶催化。此轉化較佳係酶催化。此轉化更佳係經脫氫酶催化。此轉化仍更佳係經EC群組編號為1.1.1.X之醇脫氫酶催化。

醇脫氫酶較佳係能夠使丁醇脫氫之酶，例如彼等EC編號為1.1.1.1者。能夠使丁醇脫氫之醇脫氫酶更佳係源自生物體。能夠使丁醇脫氫之脫氫酶仍更佳可源自(例如)以下生物體中之一者：巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)、醋酸鈣不動桿菌、敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)、果實蠅(Anastrepha species)、燕麥(Avena sativa)、西洋油菜(Brassica napus)、短桿菌、山茶(Camellia sanensis)、念珠菌、莫氏單胞藻(Chlamydomonas moewussi)、西瓜(Citrillus lanatus)、麩胺酸棒狀桿菌(Coxynebacterium glutamicum)、鵪鶉(Coturnix coturnix)、灰地鼠(Cricetulus griseus)、番紅花(Crocus sativas)、甜瓜(Cucumis melo)、巨大脫硫弧菌(Desulfovibrio gigas)、核黃素德沃斯氏菌(Devosia riboflavina)、頭狀雙足囊菌(Dipodascus capitatus)、果蠅(Drosophila species)、構巢裸胞殼(Emericulla nidulans)、溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸桿菌、眼蟲(Euglena species)、冷海黃桿菌(Flavobacterium frigidimaris)、雞(Gallus gallus)、草莓(Fragaria ananassa)、嗜熱芽孢桿菌(Geobacillus species)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、大麥(Hordeum vulgare)、克雷白氏菌(Klebsiella species)、克魯維酵母菌(Kluyveromyces species)、賴氏菌(Leifsonia species)、甲基桿菌(Methylobacterium species)、粗糙鏈胞黴菌(Neurospora crassa)、稻(Oryza sativa)、假單胞菌、赤球菌、酵母菌、硫化葉菌(Sulfobulus species)、高溫厭氧桿菌(Thermoanaerobacter species)、玫瑰紅嗜熱菌(Thermomicrobium roseum)、嗜酸熱原體菌(Thermoplasma acidophilum)、棲熱菌(Thermus species)、小麥(Triticum species)、蠶豆(Vicia fabia)、歐洲葡萄(Vitis vinifera)、玉米(Zea mays)、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)或運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。

在尤佳實施例中，醇脫氫酶係EC群組編號為1.1.1.2之熱穩定的NADP依賴性醇脫氫酶。醇脫氫酶更佳係來自嗜熱微生物之熱穩定的NADP依賴性醇脫氫酶。醇脫氫酶仍更佳係來自嗜熱細菌之熱穩定的NADP依賴性醇脫氫酶。醇脫氫酶最佳係來自細菌布氏熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brockii，Swiss-Prot：P14941.1)之熱穩定的NADP依賴性醇脫氫酶。

醇脫氫酶較佳係與BVMO酶共表現於宿主生物體(較佳細菌)中。因此，上文所論述之表現載體較佳進一步包括編碼醇脫氫酶之遺傳序列及在宿主細菌中實現其表現所需要之任何其他遺傳序列，例如(但不限於)啟動子、終止子、下游或上游效應子、抑制因子、活化子、增強子、結合輔因子等。

另一選擇為，醇脫氫酶可基於與BVMO酶不同之載體在宿主生物體中表現。

有利地，已發現亦可操作醇脫氫酶以提供NADPH再生系統。在2-丁醇至2-丁酮之轉化期間，醇脫氫酶將氧化2-丁醇，由此提供容易獲得之電子以在自2-丁酮至丙酸甲酯之轉化期間自藉由BVMO產製之NADP+再生NADPH。當共表現醇脫氫酶及BVMO酶二者時，閉環NADPH可再生而不需要向系統外部輸入NADPH再生劑。由此改良化學計量且解決BVMO催化所產生之潛在氧化還原瓶頸，此使得2-丁醇至2-丁酮至丙酸甲酯之反應作為真正的級聯反應更快且更有效地進行。

較佳在包括至少醇脫氫酶及受質2-丁醇之反應混合物中以業內已知方式且在對於所給出酶為最佳之條件下實施此步驟。該等條件包含可經由熟習此項技術者知識內之常規方法推斷出之最佳濃度及比率。

另一選擇為，自原始原料形成2-丁酮之步驟可包括乙偶姻轉化成2,3-丁二醇及2,3-丁二醇轉化成2-丁酮。

因此，本發明第一態樣之又一較佳實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)自乙偶姻形成2,3-丁二醇；(ii)自2,3-丁二醇形成2-丁酮；(iii)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(iv)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

該等轉化可係化學催化或酶催化。該等轉化較佳係酶催化。

更佳地，乙偶姻向2,3-丁二醇之轉化係藉由脫氫酶催化且2,3-丁二醇向2-丁酮之轉化係藉由脫水酶來催化。仍更佳地，乙偶姻向2,3-丁二醇之轉化係藉由EC群組編號為1.1.1.X之醇脫氫酶催化，且2,3-丁二醇向2-丁酮之轉化係藉由EC群組編號為4.2.1.X之二醇脫水酶來催化。

醇脫氫酶較佳係能夠使乙偶姻脫氫之酶，例如彼等EC群組編號為1.1.1.4或1.1.1.76者。醇脫氫酶更佳係源自生物體之能夠使乙偶姻脫氫之酶。能夠使乙偶姻脫氫酶脫氫之醇脫氫酶仍更佳可源自(例如)以下生物體中之一者：嗜水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、芽孢桿菌、短芽孢桿菌(Brevibacillus species)、腸桿菌(Enterobacter species)、腸球菌(Enterococcus species)、氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)、克雷白氏菌、乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis)、微球菌(Micrococcus species)、多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)、脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、假單胞菌、強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)、酵母菌、麩胺酸棒狀桿菌或黏質色拉雷菌(Seratia marcescens)。

二醇脫水酶較佳係能夠使2,3-丁二醇脫水之二醇脫水酶，例如彼等EC群組編號為4.2.1.28者。能夠使2,3-丁二醇脫水之二醇脫水酶更佳係源自生物體之二醇脫水酶。能夠使2,3-丁二醇脫水之二醇脫水酶仍更佳可源自(例如)以下生物體中之一者：醋酸桿菌(Acetobacterium species)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)、黃質菌(Flavobacterium species)、克雷白氏菌、乳桿菌(Lactobacillus species)、沙門氏菌或費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)。

醇脫氫酶及二醇脫水酶較佳與BVMO酶共表現於宿主生物體(較佳細菌)中。因此，上文所論述之表現載體較佳進一步包括編碼醇脫氫酶及二醇脫水酶之遺傳序列及在宿主細菌中實現其表現所需要之任何其他遺傳序列，例如(但不限於)啟動子、終止子、下游或上游效應子、抑制因子、活化子、增強子、結合輔因子等。

另一選擇為，醇脫氫酶及/或二醇脫水酶可於與不同於BVMO酶之載體上在宿主生物體中表現。

較佳在包括至少醇脫氫酶、二醇脫水酶及受質乙偶姻之反應混合物中以業內已知方式且在對於所給出酶為最佳之條件下實施此步驟。該等條件包含可經由熟習此項技術者知識內之常規方法推斷出之最佳濃度及比率。

另一選擇為，自原始原料形成2-丁酮之步驟可包括乙偶姻轉化成甲基乙烯基酮及甲基乙烯基酮轉化成2-丁酮。

因此，本發明第一態樣之又一較佳實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)自乙偶姻形成甲基乙烯基酮；(ii)自甲基乙烯基酮形成2-丁酮；(iii)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(iv)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

該等轉化可係化學催化或酶催化。該等轉化較佳係酶催化。

更佳地，乙偶姻向甲基乙烯基酮之轉化係藉由醇脫水酶催化且甲基乙烯基酮向2-丁酮之轉化係藉由烯酮還原酶催化。仍更佳地，乙偶姻向甲基乙烯基酮之轉化係藉由EC群組編號為4.2.1.X之醇脫水酶催化，且甲基乙烯基酮向2-丁酮之轉化係藉由EC群組編號為1.1.1.X或1.3.1.X之烯酮還原酶催化。

較佳地，醇脫水酶係能夠使乙偶姻脫水之酶，例如彼等EC群組編號為4.2.1.53或4.2.1.43或4.2.1.3或彼等Jianfeng等人在Chemical Communications,2010,46,8588-8590中所闡述之酶。醇脫水酶更佳係源自生物體之能夠使乙偶姻脫水之酶。能夠使乙偶姻脫水之醇脫水酶仍更佳可源自(例如)以下生物體中之一者：假單胞菌、腦膜膿毒性伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)、巴西固氮螺菌(Azospirillium brasilense)、織片草螺菌(Herbaspirillium seropedicae)、嗜糖假單胞菌(Pelomonas saccharophila)、根瘤菌(Rhizobium species)、硫化葉菌、槭樹(Acer pseudoplatanus)、擬南芥(Arabidopiss thaliana)、黑麴菌(Aspergillus niger)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、芽孢桿菌、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、歐洲牛(Bos taurus)、扁形蟲(Caenorhabditis elegans)、麩胺酸棒狀桿菌、果蠅、大腸桿菌、美洲牡蠣(Crassostrea virginica)、南瓜(Cucurbita species)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、小鼠(Mus musculus)、菸草(Nicotiana species)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、鼠(Rattus species)、酵母菌、沙門氏菌、鏈黴菌、玉米或野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)。

烯酮還原酶較佳係能夠還原甲基乙烯基酮之酶，例如彼等EC群組編號為1.1.1.54或1.3.1.31或彼等Yamamoto等人在美國專利6780967中所闡述之酶。烯酮還原酶更佳係源自生物體之能夠還原甲基乙烯基酮之酶。能夠還原甲基乙烯基酮之烯酮還原酶仍更佳可源自(例如)以下生物體中之一者：酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、克魯佛梭菌(Clostridium kluyveri)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、菸草、纖細裸藻(Euglena gracilis)、腐生型眼蟲長變胞藻(Astasia longa)、乳酸克魯維酵母(Klyveromyces lactis)、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、大腸桿菌或鼠。

在宿主生物體(較佳細菌)中，烯酮還原酶及醇脫水酶較佳與BVMO酶共表現。因此，上文所論述之表現載體較佳進一步包括編碼醇脫氫酶之遺傳序列及在宿主細菌中實現其表現所需要之任何其他遺傳序列，例如(但不限於)啟動子、終止子、下游或上游效應子、抑制因子、活化子、增強子、結合輔因子等。

另一選擇為，烯酮還原酶及/或醇脫水酶可基於與BVMO酶不同之載體在宿主生物體中來表現。

較佳在包括至少烯酮還原酶、醇脫水酶及受質乙偶姻之反應混合物中以業內已知方式且在對於所給出酶為最佳之條件下實施此步驟。該等條件包含可經由熟習此項技術者知識內之常規方法推斷出之最佳濃度及比率。

如上文所提及，該方法可進一步包括使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體(例如富含CO及/或CO₂之氣體)發酵產製原始原料之步驟，其中術語「原始原料」包含任何能夠轉型成2-丁酮之基礎有機化學品，例如(但不限於)2-丁醇、乙偶姻、2,3-丁二醇或甲基乙烯基酮。

因此，本發明第一態樣之又一實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)使該等糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵以產製原始原料；(ii)自該等原始原料形成2-丁酮；(iii)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(iv)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵產製原始原料之步驟較佳包括使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵產製2-丁醇。

因此，本發明第一態樣之又一較佳實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵以產製2-丁醇；(ii)自2-丁醇形成2-丁酮； (iii)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(iv)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

糖向2-丁醇之發酵較佳係經酶催化。實施該發酵之方法已為業內所熟知，例如一種該方法係闡述於美國專利第US5753474號或最近闡述於PCT申請案第WO2007/130521號中。

特定而言，WO2007/130521揭示生物質、尤其係可發酵糖來源之生物質發酵之四種不同途徑，(參見第59頁及第60頁所給出之列表)，其可用於以工業規模產製2-丁醇(參見WO2007/130521之圖1)。

適宜地，發酵生物體係利用碳水化合物之生物體，因此，生物質中可利用之糖係藉由天然路徑攝取且進入埃姆登-邁耶霍夫-帕那斯途徑(Embden Myerhof-Parnas Pathway,EMP)途徑、恩特納-杜多羅夫(Entner-Douderoff)途徑及戊糖磷酸途徑，該等途徑係為生長提供來自碳水化合物之能量之中心代謝路徑。該等途徑之關鍵係中間體甘油醛-3-磷酸，其在呼吸產製能量期間轉化成丙酮酸酯。因此，丙酮酸酯係在大多數利用碳水化合物之生物體中產生之可容易獲得之天然存在的化學品。

如WO2007/130521中所闡述，可藉由使用經改質碳水化合物利用已經遺傳改造含有適當生物化學品之生物體來實施圖1中之以上四種途徑中之任一者將丙酮酸轉化成2-丁醇。例如可使用途徑1，途徑1含有轉化步驟a、b、c、d、e及f。

步驟(a)包括將兩分子丙酮酸轉化成α-乙醯乳酸。較佳使用EC群組編號為EC 2.2.1.6之酶來催化此反應，例如乙醯乳酸合酶或乙醯羥酸合酶。用於催化此反應之酶更佳係乙醯乳酸合酶。其仍更佳係以下乙醯乳酸合酶中之一者：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，GenBank：AAA22222 NCBI L04470)、土生克雷白氏菌(Klebsiella terrigena， GenBank：AAA25055 NCBI L04507)或克雷白氏肺炎菌(Klebisella Pneumoniae，GenBank：AAA25079 NCBI M73842)。

步驟(b)包括將α-乙醯內酯轉化成乙偶姻。較佳使用EC群組編號為EC 4.1.1.5之酶來催化此反應，例如乙醯乳酸脫羧酶。其更佳係以下乙醯乳酸脫羧酶中之一者：枯草芽孢桿菌(GenBank：AAA22223 NCBI L04470)、土生克雷白氏菌(GenBank：AAA25054 NCBI L04507)或克雷白氏肺炎菌(GenBank：AAU43774 NCBI AY22056)。

步驟(c)包括將乙偶姻轉化成3-胺基-2-丁醇。較佳使用轉胺酶或還原胺酶之一般群組之酶來催化此反應，例如可視為乙偶姻胺酶之磷酸吡哆醛依賴性轉胺酶。磷酸吡哆醛依賴性轉胺酶更佳係胺基：丙酮酸轉胺酶。其仍更佳係來自河流弧菌(Vibrio Fluvialis)JS17之胺基：丙酮酸轉胺酶(參見WO2007/130521之實例13)。

步驟(d)包括將3-胺基-2-丁醇轉化成3-胺基-2-丁醇O-磷酸酯。較佳使用胺基醇激酶之普通群組之酶來催化此反應，例如可視為胺基丁醇激酶之EC編號為2.7.1.82之ATP依賴性乙醇胺激酶。ATP依賴性乙醇胺激酶更佳源於假單胞菌屬或伊文氏桿菌屬(Erwinia)之種類。其仍更佳係來自噬胡蘿蔔伊文氏桿菌(Erwinia carotovera)菌株SCRI1043之ATP依賴性乙醇胺激酶(參見WO2007/130521之實例14)。

步驟(e)包括將3-胺基-2-丁醇O-磷酸酯轉化成2-丁酮。較佳使用磷酸胺基醇磷酸裂解酶之一般群組之酶來催化此反應，例如可視為磷酸胺基丁醇磷酸裂解酶之磷酸吡哆醛依賴性磷酸乙醇胺磷酸裂解酶。磷酸吡哆醛依賴性磷酸乙醇胺磷酸裂解酶更佳源於假單胞菌屬或伊文氏桿菌屬之種類。其仍更佳係來自噬胡蘿蔔伊文氏桿菌菌株SCRI1043之磷酸吡哆醛依賴性磷酸乙醇胺磷酸裂解酶(參見WO2007/130521之實例15)。

步驟(f)包括將2-丁酮轉化成2-丁醇。較佳使用EC群組編號為EC 1.1.1.2之酶來催化此反應，例如丁醇脫氫酶或環己酮脫氫酶。用於催化此反應之酶更佳係丁醇脫氫酶。用於催化此反應之酶仍更佳係以下丁醇脫氫酶中之一者：強烈熾熱球菌(GenBank：AAC25556 NCBI AF013169)或大腸桿菌(GenBank：NP_417484NCBI NC_000913)。

WO2007/130521進一步闡述可用於構築編碼多種酶之質體載體之業內已知技術及程序，以使得途徑可在宿主生物體中表現，作為展示，途徑3係完全例示。

此外，相關專利申請案WO2007/146377闡述多種可在工業產製2-丁醇之該方法中使用之丁醇耐受生物體，尤其乳桿菌屬之生物體。尤其有利的丁醇耐受種類識別為胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)PN0510、胚芽乳桿菌(PN0511)、胚芽乳桿菌(PN0512)及亞利桑納乳桿菌(Lactobacillus arizonensis)PN0514。在本發明之尤佳實施例中，使用該等特異性丁醇耐受種類中之至少一者作為表現WO2007/130521所闡述之以上途徑中之任一者之宿主生物體。

使甘油向2-丁醇之發酵較佳係經酶催化。實施該發酵之方法已為業內所熟知，例如一種該方法係闡述於美國專利第US8119844B2號或最近闡述於美國專利申請案第US2011/207191號中。

特定而言，US8119844揭示商業甘油或含有來自工業廢物之副產物之甘油的厭氧發酵以使用生物體巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)來產製丁醇。

US8119844闡述厭氧發酵係在來自(例如)Biebel(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology(2001)27，第18-26頁)之業內已知生物反應器中使用能夠經由天然途徑將甘油受質轉化成2-丁醇之野生型巴氏梭菌細菌來實施。

因此，用於將甘油轉化成2-丁醇之步驟中之細菌較佳係野生型細菌，更佳梭菌屬之野生型細菌，仍更佳巴氏梭菌DSMZ 525之野生型細菌。

用於將甘油轉化成2-丁醇之步驟中之細菌可視情況經改質以藉由業內已知相關技術以有利方式增強或改變其實施該轉化之能力。

甘油受質較佳係源自工業廢物之副產物以使得本發明方法之總生態影響或化石燃料使用最小化。該廢甘油之適宜來源包含(但不限於)：生物柴油產製、脂肪皂化、酒精飲料產製、棕櫚油產製或油脂化學製程。甘油受質較佳係源自生物柴油產製。

適宜地，在供應甘油受質下使用於將甘油轉化成2-丁醇之細菌發酵且自發酵培養基分離2-丁醇產物。可使用如US8119844中所論述之任何適宜發酵技術。然而，較佳如US8119844之實例中所闡述來製備發酵培養基，且較佳根據US8119844中所給出之實例將發酵技術外推至工業情況，且較佳如US8119844之第10行及第11行中所闡述來分離丁醇產物。

可視情況存在乙酸鹽以增強2-丁醇自甘油之產製，且甲醇可視情況自甘油受質移除以增強2-丁醇自甘油之產製。乙酸鹽較佳係以至少1g/L之濃度存在於發酵培養基中。在甘油受質中甲醇之濃度較佳係至多10g/L。自甘油受質移除甲醇之方法闡述於US8119844中之第8行及「來自生物柴油廢物之甘油製備」之實例中。

發酵較佳係藉由一或多種生物體來實施。發酵更佳係藉由能夠產製將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成2-丁醇所需要之酶之生物體來實施。發酵較佳係藉由野生型生物體來實施，該等生物體天然表現將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成2-丁醇所需要之相關酶。因此，發酵更佳係藉由包括內源性遺傳序列之野生型生物體來實施，該等內源性遺傳序列編碼將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成2-丁醇所需要之酶。較佳用於本發明中之該等生物體之實例詳述於闡述該等發酵程序之上述參考文獻中。

另一選擇為，發酵係藉由經遺傳改質之生物體來實施，該等生物體已經改質以表現將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成2-丁醇所需要之酶。因此，重組生物體各自較佳包括表現載體，該表現載體進而包括編碼將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成2-丁醇所需要之酶之外源性遺傳序列，加上在宿主生物體中實現其表現所需要之任何其他遺傳序列，例如(但不限於)啟動子、終止子、下游或上游效應子、抑制因子、活化子、增強子、結合輔因子等。

一或多種用於使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵形成2-丁醇之宿主生物體較佳係細菌或真菌。因此，宿主細菌或真菌較佳進一步包括編碼將所產製之2-丁醇自細菌細胞輸出進入環境培養基中之能力之遺傳序列。該等遺傳序列可係內源性或外源性。將2-丁醇輸出至環境培養基之能力可藉由編碼透膜轉運途徑、至細胞膜之靶向途徑、至細胞膜之排泄途徑之遺傳序列賦予，或可藉由跨過細胞膜之簡單擴散梯度來賦予。

例如，在細菌情形下，透膜途徑可係以下中之任一者：存在於革蘭氏陰性細菌(gram negative bacterium)之膜中之I型、II型、III型、IV型、V型、VI型轉運子；存在於革蘭氏陽性細菌(gram positive bacteria)之膜中之Sec或TaT途徑；革蘭氏陰性細菌中之囊泡胞吐途徑；或革蘭氏陽性細菌中之N端標籤途徑。

然而，較佳藉由簡單擴散將2-丁醇產物自細菌或真菌細胞輸出。

在較佳實施例中，用於發酵步驟之生物體係胚芽乳桿菌、阿瑞乳桿菌及/或巴氏梭菌。

另一選擇為，使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵產製原始原料之步驟可包括使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵產製乙偶姻。

因此，本發明第一態樣之又一較佳實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵以產製乙偶姻；(ii)自乙偶姻形成2,3-丁二醇；(iii)自2,3-丁二醇形成2-丁酮；(iv)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(v)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

另一選擇為，本發明第一態樣之又一實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵以產製乙偶姻；(ii)自乙偶姻形成甲基乙烯基酮；(iii)自甲基乙烯基酮形成2-丁酮；(iv)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(v)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

糖向乙偶姻之發酵較佳係經酶催化。實施該發酵之方法為業內所熟知，例如一種該方法係由Hespell闡述於Current Microbiology第32卷(1996)，第291-296頁中，且又一方法亦係闡述於歐洲專利第EP0430406B1號中。

特定而言，EP0430406B1揭示藉由使用振盪發酵培養物將糖來源轉化成高產量之乙偶姻，其中該轉化係藉由乳酸細菌來實施。

EP0430406B1闡述乳酸細菌可自丙酮酸來源(例如檸檬酸或葡萄糖)產製較大量之乙偶姻。具體而言，該較大量之乙偶姻可在添加有金屬鹽及鐵卟啉之來源下以振盪發酵技術自乳酸細菌與糖來源之需氧發酵來產製。

因此，用於糖向乙偶姻轉化之步驟中之細菌較佳係野生型細菌，更佳野生型乳酸細菌，仍更佳乳球菌屬、白色念珠菌屬或乳桿菌屬之野生型乳酸細菌，仍更佳以下細菌種類之野生型乳酸細菌：乳鏈球菌(Streptococcus lactis，ATCC 11007)、乳酸鏈球菌(FERM-BP-2805)、酪蛋白乳桿菌(Lactobacillus casei，FERM-BP-2806)、酪蛋白乳桿菌(ATCC334)或乳酪白念珠菌(Leuconostoc cremoris，ATCC19254)。

用於將糖轉化成乙偶姻之步驟中之細菌可視情況經改質以藉由業內已知相關技術以有利方式增強或改變其實施該轉化之能力。

糖受質較佳係源自任何能夠經發酵細菌利用之碳來源。糖受質更佳係葡萄糖或乳糖。

適宜地，在供應糖受質下使用於將糖轉化成乙偶姻之細菌發酵且自發酵培養基分離乙偶姻產物。可使用任何適宜發酵技術。然而，發酵培養基較佳係MRS培養基，MRS培養基更佳係如可推廣至工業情況之EP0430406B1之第4頁第5行所闡述來製備。所使用之發酵技術較佳係如亦可推廣至工業情況之EP0430406B1中之任一實例所闡述，所使用之發酵技術更佳係闡述於0430406B1之實例3中者。

甘油向乙偶姻之發酵較佳係經酶催化。實施該發酵之方法為業內所熟知，例如一種該方法係闡述於上述PCT申請案WO2007/130521及更早出版物Dobrogosz等人Journal of Bacteriology第84卷(1962)第716-723頁中。

特定而言，Dobogosz等人證實某些生物體直接自甘油產製乙偶姻之知識早在1962年即已存在。表3顯示乙偶姻在細菌乳酸戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)中之顯著累積。

Dobrogosz闡述在需氧發酵條件下，來自家族乳桿菌科(Lactobacillaceae，或乳酸細菌)之細菌可經由固有途徑自甘油受質產製乙偶姻，該固有途徑係經由關鍵中間體丙酮酸來進行(參見圖4)。

因此，用於甘油向乙偶姻轉化之步驟中之細菌較佳係野生型細菌，更佳野生型乳酸細菌，仍更佳小球菌屬(Pediococcus)或鏈球菌屬之野生型乳酸細菌，仍更佳乳酸戊糖片球菌Az-25-5/啤酒小球菌(Pediococcus cerevisiae)或糞鏈球菌(Streptoccocus faecalis)B33A/10C1之野生型乳酸細菌。

用於甘油向乙偶姻轉化之步驟中之細菌視情況可經改質以藉由業內已知相關技術以有利方式增強或改變其實施該轉化之能力。

適宜地，在供應甘油受質下使用於將甘油轉化成乙偶姻之細菌發酵且自發酵培養基分離乙偶姻產物。可使用任何適宜發酵技術。然而，發酵培養基較佳係添加有甘油受質之NYE基礎培養基，發酵培養基更佳係如Dobrogosz之第717頁所闡述添加有如Dobrogosz之表3中所闡述之至少0.163M甘油之NYE基礎培養基。所使用之發酵方法較佳係如可外推至工業條件之Dobrogosz之第717頁所闡述，其中僅甘油存在於NYE培養基中且未添加葡萄糖，適宜地維持需氧生活以在甘油受質上生長。發酵較佳係以分批型配置實施，其中將每批發酵實施24與48小時之間之時間段。

發酵較佳係藉由一或多種生物體來實施。發酵更佳係藉由能夠產製將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成乙偶姻所需要之酶之生物體來實施。發酵較佳係藉由野生型生物體來實施，該等生物體天然表現將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成乙偶姻所需要之相關酶。因此，發酵更佳係藉由包括內源性遺傳序列之野生型生物體來實施，該等內源性遺傳序列編碼將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成乙偶姻所需要之酶。較佳用於本發明中之該等生物體之實例詳述於闡述該等發酵程序之上述參考文獻中。

另一選擇為，發酵係藉由經遺傳改質之生物體來實施，該等生物體已經改質以表現將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成乙偶姻所需要之酶。因此，重組生物體各自較佳包括表現載體，該表現載體繼而包括編碼將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體轉化成乙偶姻所需要之酶之外源性遺傳序列，加在宿主生物體中實現其表現所需要之任何其他遺傳序列，例如(但不限於)啟動子、終止子、下游或上游效應子、抑制因子、活化子、增強子、結合輔因子等。

一或多種用於使糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵形成乙偶姻之宿主生物體較佳係細菌或真菌。因此，宿主細菌或真菌較佳進一步包括編碼將所產製之乙偶姻輸出細菌細胞進入環境培養基中之能力之遺傳序列。該等遺傳序列可係內源性或外源性。將乙偶姻輸出至環境培養基之能力可藉由編碼透膜轉運途徑、至細胞膜之排泄途徑、至細胞膜之靶向途徑之遺傳序列賦予，或可藉由跨過細胞膜之擴散梯度來簡單賦予。

例如，在細菌情形下，透膜途徑可係以下中之任一者：存在於革蘭氏陰性細菌之膜中之I型、II型、III型、IV型、V型、VI型轉運子；存在於革蘭氏陽性細菌之膜中之Sec或TaT途徑；革蘭氏陰性細菌中之囊泡胞吐途徑；或革蘭氏陽性細菌中之N端標籤途徑。

然而，較佳藉由簡單擴散將乙偶姻產物自細菌或真菌細胞輸出。

在較佳實施例中，發酵步驟所使用之生物體係乳酸鏈球菌及/或乳酸戊糖片球菌。

用於發酵中之糖較佳係天然存在之單糖或二糖。該等糖包含(但不限於)葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、核酮糖、阿洛糖 (allose)、阿卓糖(altrose)、半乳糖、木糖、果糖、古洛糖(gulose)、來蘇糖、甘露糖、鼠李糖、異赤藻糖、塔羅糖(talose)、艾杜糖(iodose)、蔗糖、乳糖、乳果糖、麥芽糖、海藻糖、纖維素二糖、麴二糖、黑麯黴糖、異麥芽糖、槐糖、海帶二糖、龍膽二糖、松二糖、麥芽酮糖、巴拉金糖(palatinose)、龍膽二糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、芸香糖、芸香糖或木二糖。該等糖更佳係葡萄糖或麥芽糖。該等糖仍更佳係葡萄糖，尤其D-葡萄糖。

另一選擇為，用於發酵中之糖可作為天然存在之多糖來提供，該等多糖然後能夠藉由發酵生物體或其他額外酶水解以產製以上單糖及二糖。適宜多糖包含(但不限於)：纖維素、直鏈澱粉、支鏈澱粉、肝糖、阿糖基木聚糖(arabinoxylan)、幾丁質、果膠等。

藉由生物體之發酵較佳係以厭氧或微氧方式實施。

適宜厭氧發酵技術包含彼等業內通常已知者，例如(但不限於)深層發酵、表面發酵、半固態發酵或固態發酵。所使用之發酵技術較佳係深層發酵，此乃因其易於自動化操作且因此其效率較高。

藉由生物體之發酵較佳係在如業內已知之適宜發酵培養液中實施。發酵培養液較佳包括：與水混合之糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體、生物體、豐富培養基或基本培養基加額外組份，例如(但不限於)氮源(例如氨溶液)；礦物鹽，例如鈣、鎂、鋅及銅；及微量元素，例如硒、硼、鐵、錳、磷及硫；螯合劑，例如EDTA；亞鐵氰化物；炭；陽離子交換樹脂；消泡劑，例如硬脂醇、棉子油、亞麻子油、橄欖油、蓖麻油、聚矽氧或磺酸鹽；及甲醇。

較佳在發酵過程期間將糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體受質進給至發酵培養液中以避免受質抑制酶製程。發酵培養液內之糖及/或甘油之濃度較佳維持在至少約25g/L。發酵培養液內之糖及/或甘油之濃度更佳維持在約25g/L至125g/L之間。較佳採用向發酵培養液中恆定進給受質將糖及/或甘油維持在該等量之間，其中進給濃度至少足以保持大部分宿主生物體活著，但不足以抑制產物形成。

微生物可轉化氣體可以0.1-15mol/L.hr之量、更佳0.2-5mol/L.hr、最佳0.3-1mol/L.hr之量進給至發酵受質中。

本發明之發酵及BVMO催化反應可連續或分批，較佳使用連續方法。

如針對糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體之濃度所使用之術語「約」指示高於或低於所述值之最大20%之邊際限制。然而，糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體之濃度較佳係在高於或低於所述值10%內。

較佳自發酵培養液原位移除所產製之產物2-丁醇或乙偶姻以避免產物抑制酶製程。因此，較佳將發酵培養液中之2-丁醇及/或乙偶姻之濃度保持在能夠抑制發酵過程之量以下，較佳此係在約50g/L以下，更佳約25g/L以下，仍更佳約10g/L以下。

如針對2-丁醇及/或乙偶姻之濃度所使用之術語「約」指示高於或低於所述值之最大20%之邊際限制。然而，2-丁醇及/或乙偶姻之濃度較佳係在高於或低於所述值10%內。

較佳地，小心控制氮源。氮源較佳係銨溶液且其較佳係以約0-4g/L之濃度存在於培養液中。

如針對氮源濃度所使用之術語「約」指示高於或低於所述值之最大20%之邊際限制。然而，氮源濃度較佳係在高於或低於所述值10%內。

較佳將培養液保存在用於工業目的之尺寸較大之容器中。該容器可係介於40立方米至200立方米範圍內之罐或介於200立方米至900立方米容量範圍內之更大發酵罐。

較佳保持發酵培養液無菌以停止任何外源微生物生長。

較佳在最佳溫度下實施發酵以使自生物體產生之期望產物之量最大化。較佳在以下溫度下實施發酵：介於約20℃與50℃之間，較佳介於約20℃至35℃之間，最佳介於約28℃至32℃之間。

如針對溫度所使用之術語「約」指示高於或低於所述值最大10%之邊際限制。然而，溫度較佳係在高於或低於所述值5%內。

較佳在對細菌代謝為最佳之pH 6.5至pH 8.5下實施發酵。緩衝液更佳將反應混合物之pH維持在約pH 7.3與7.7之間。緩衝液仍更佳將反應混合物之pH維持在約7.5。

如針對pH所使用之術語「約」指示高於或低於所述值最大10%之邊際限制。然而，pH較佳係在高於或低於所述值5%內。

較佳攪動發酵培養液；較佳劇烈攪動發酵培養液。攪動使糖受質圍繞生物體均勻循環且增加生物體對糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體之攝取以轉化成期望產物。攪動可藉由任何業內已知之適宜方式來達成，例如氣升技術、擋板、Rushton葉片或圓盤式渦輪、開啟渦輪式葉輪或船用葉輪。

如上文所提及，該方法可進一步包括自生物質獲得糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體之步驟，其中術語「生物質」在本文中定義為活著或已死去之植物或動物性物質，且其可視為廢物質或意欲如本發明所闡述來使用之物質。

因此，本發明第一態樣之又一實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)自生物質獲得糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體；(ii)使該等糖或甘油發酵以產製原始原料；(iii)自該等原始原料形成2-丁酮；(iv)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(v)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

所使用之生物質較佳包括大量碳水化合物，尤佳為葡萄糖來源之碳水化合物，例如(但不限於)澱粉、纖維素、肝糖、阿糖基木聚糖、幾丁質或果膠。

另一選擇為，所使用之生物質包括大量脂肪，尤佳為甘油來源之脂肪或油，尤其三酸甘油酯。適宜三酸甘油酯包含任何容易自植物或動物來源獲得之油或脂肪。該等油及脂肪之實例包含：棕櫚油、亞麻子油、菜籽油、豬油、乳酪、鯡魚油、椰子油、植物油、向日葵油、蓖麻油、大豆油、橄欖油、可可脂、水牛酪油、鯨脂等。

生物質可係由一或多種不同生物質來源組成。適宜生物質來源之實例如下：處女木材、能量作物、農業殘餘物、食物廢物及工業廢物或共產物。

原始木材生物質來源可包含(但不限於)木屑、樹皮、碎片、原木、鋸屑、木屑顆粒或木塊。

能量作物生物質來源可包含(但不限於)短期輪作的矮樹叢或森林；非木本草，例如芒草、大麻、風傾草、蘆葦或黑麥；農作物，例如糖、澱粉或油作物；或水生植物，例如微型藻類或大型藻類及雜草。

農業殘餘物可包含(但不限於)秕、乾草、玉米秸稈、麵粉、穀粒、雞糞、肥料、漿液或青貯飼料。

食物廢物可包含(但不限於)皮/外皮、外殼、秕、核心、果仁/石、動物或魚之不可食用部分、來自果汁及油提取物之漿、來自釀造之廢穀粒或啤酒花、家用廚房廢物、豬油或油或脂肪。

工業廢物可包含(但不限於)未經處理之木材(包含托板)、經處理木材、木材複合物(包含MDF/OSD)、木材壓層、紙漿/撕碎物/廢物；紡織物，包含纖維/紗線/流出物；或污水污泥。

在糖合意之一較佳實施例中，所使用之生物質較佳係一種木質纖維素來源或不同木質纖維素來源之混合物。所使用之生物質更佳係一種木質纖維素能量作物或其混合物。仍更佳地，所使用之木質纖維素能量作物富含源自基礎糖(例如葡萄糖或麥芽糖)之碳水化合物，但相對容易以高速率生長，例如短期輪作之草。所使用之生物質最佳係芒草。

在甘油合意之另一較佳實施例中，所使用之生物質較佳係一種三酸甘油酯來源或其混合物。所使用之生物質更佳係油或脂肪之混合物中之一或多者。所使用之油或脂肪仍更佳係容易地源自動物及/或植物廢物。所使用之生物質最佳係棕櫚油。

視情況可使用以上所列示生物質中之任一者之混合生物質來源以一起產製糖及甘油。

糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體較佳係藉由自原生物質產生水解產物自生物質來獲得。水解產物較佳含有多種糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體及其他副產物或細胞碎片。水解產物較佳在用作發酵之糖/甘油/氣體受質之前經歷多個純化步驟，該等純化步驟包含(但不限於)過濾、離心及化學清潔。

自生物質獲得之水解產物中所含有之糖較佳係天然存在之單糖或二糖。該等糖包含(但不限於)葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、核酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、木糖、果糖、古洛糖、來蘇糖、甘露糖、鼠李糖、異赤藻糖、塔羅糖、艾杜糖、蔗糖、乳糖、乳果糖、麥芽糖、海藻糖、纖維素二糖、麴二糖、黑麯黴糖、異麥芽糖、槐糖、海帶二糖、龍膽二糖、松二糖、麥芽酮糖、巴拉金糖、葡果糖、甘露二糖、蜜二糖、芸香糖、芸香糖或木二糖。該等糖更佳係葡萄糖或麥芽糖。該等糖仍更佳係葡萄糖，尤其D-葡萄糖。

較佳藉由以下方法自原生物質產生水解產物：例如(但不限於)機械撕碎、研磨、壓碎、擠出、化學處理(例如酸/鹼活性)、蒸汽處理或水解以自碳水化合物及三酸甘油酯分別釋放糖及/或甘油。此可能尤其需要生物質之木本來源，其中必須分解纖維素與木質素之較大生物聚合物以達成簡單糖。一旦水解產物經分離且中和，則其較佳然後與水、豐富培養基或基本培養基混合以產製基礎形式之發酵培養液。

最佳地，總是使水解產物經受去離子化以移除任何微量重金屬，該等重金屬可用作欲用於發酵步驟中之生物體之酶抑制劑。

另一選擇為，水解產物可與以上方法之發酵步驟同時而非在其之前自生物質產生，例如藉由意指「同步糖化與發酵(simultaneous saccharification and fermentation)」之術語「SSF」所知。

因此，本發明第一態樣之尤佳實施例提供產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，該方法包括以下步驟：(i)自生物質獲得葡萄糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體；(ii)使該葡萄糖及/或甘油及/或微生物可轉化氣體發酵成2-丁醇；(iii)將該2-丁醇轉化成2-丁酮；(iv)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將該2-丁酮轉化成丙酸甲酯；及(v)處理所產製之丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。

本發明之第二態樣提供製備甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之聚合物或共聚物之方法，該方法包括以下步驟：(i)根據本發明之第一態樣製備甲基丙烯酸甲酯或其衍生物；(ii)將(i)中所製備之甲基丙烯酸甲酯視情況與一或多種共單體聚合以產製其聚合物或共聚物。

有利地，若並非所有單體殘餘物皆源自除化石燃料以外之可再生生物質來源，則該等聚合物將佔相當的部分。

在任一情形下，較佳共單體包含(例如)單烯系不飽和羧酸及二羧酸及其衍生物，例如酯、醯胺及酐。

尤佳共單體係丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸第三丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸異莰基酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸第三丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸異莰基酯、甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯、三丙二醇二丙烯酸酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、異氰酸酯(包含甲苯二異氰酸酯及p,p'-二苯甲烷二異氰酸酯)、丙烯腈、丁二烯、丁二烯與苯乙烯(MBS)及ABS，在(i)中之該酸單體或(ii)中之該酯單體與共單體中之一或多者的任一給定共聚作用中，條件係以上共單體中之任一者不為選自以上(i)或(ii)中之甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯之單體。

當然亦可使用不同共單體之混合物。共單體自身可藉由或可不藉由與來自以上(i)之單體相同的方法製備。

本發明之第三態樣提供根據本發明第二態樣之方法形成之聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)均聚物或共聚物。

有利地，本發明提供自生物來源產製MMA及其衍生物之方法，該方法藉由使用Baeyer Villiger單加氧酶來催化脂肪酮2-丁酮以工業上可用位準至丙酸甲酯之異常轉化。

本文所含有之所有特徵皆可與以上態樣中之任一者組合成允許形成2-丁酮以供使用BVMO酶轉化成丙酸甲酯之任何組合。

為更好地理解本發明，且顯示如何實施本發明之實施例，現將以實例方式參考以下圖及實例，其中：圖1顯示不同濃度之2-丁酮藉由5μM CHMO之轉化率。

實例1-2-丁酮至丙酸甲酯之BVMO轉化 化學品及酶

所有化學品皆為分析級且係自Sigma Aldrich獲得。表現來自不動桿菌屬NCIMB 9871之環己酮單加氧酶(CHMO,EC 1.14.13.22)並純化，與熱穩定的亞磷酸脫氫酶(PTDH,EC 1.20.1.1)之N端融合以供輔因子再生，如上文所闡述。

生物催化方案

在15ml pyrex試管中實施轉型。反應體積(1ml)含有存於50mM Tris-HCl(pH 7.5)中之5mM 2-丁酮、100μM NADPH、10mM Na₂HPO₃及5μM CHMO。在24℃下在軌道式振盪(200rpm)下培育混合物。為測定轉化率，用含有0.1%均三甲苯(1,3,5-三甲基苯)作為內部標準物之0.5ml 1-辛醇來萃取1ml反應體積。藉由渦旋1min、然後離心步驟(5000rpm)達10min來萃取樣品。移除有機層，用MgSO₄乾燥且置於氣相層析(GC)小瓶中。在裝配有Heliflex® AT^TM-5管柱之Shimadzu GC儀器(Grace Discovery Sciences)上進行GC分析。使用以下溫度曲線來分離組份：40℃下6min，然後以20℃/分鐘增加至250℃。在相同環境下實施不含酶及具有不同量之受質(2-丁酮)及產物(丙酸甲酯、乙酸乙酯)之空白反應且用來製備用於產物識別及轉化測定之校準曲線。

GC分析

下表1詳述藉助GC然後用1-辛醇+0.1%均三甲苯自50mM Tris-HCl(pH 7.5)萃取之化合物之分離時間(AT-5管柱，5mM總化合物)。所有三種化合物(1種受質及2種產物)可可靠地藉由GC分離。

表1. GC分離後化合物之滯留時間(RT)。用1-辛醇+0.1%均三甲

丙酸甲酯之合成

下表2詳述2-丁酮藉助CHMO向乙酸乙酯及丙酸甲酯之轉化。藉由CHMO融合夥伴PTDH實施輔因子再生(1)。明顯地，24小時後形成工業顯著量之丙酸甲酯。

亦使用上文針對表2中之CHMO所述之方法來測試其他BVMO酶對2-丁酮向丙酸甲酯之轉化。表3顯示篩選10種BVMO酶A-J(包含CHMO)之結果。對於BVMO酶、CPDMO及HAPMO，20小時後形成工業顯著量之丙酸甲酯。

表3. 100mM 2-丁酮藉由5μM CHMO之轉化率。在24℃下在含有100μM NADPH及10mM Na₂HPO₃之1mL 50mM Tris-HCl(pH 7.5)中反應20小時。藉由GC實施產物識別及測定。實例K係使用過氧化氫之2-丁酮之對照。

實例2-受質對2-丁酮向丙酸甲酯之BVMO轉化之效應

圖1顯示較高受質濃度產生更多期望異常產物。例如：與5mM 2-丁酮一起培育產生比率為5：1之乙酸乙酯：丙酸甲酯，且與1000mM 2-丁酮一起培育產生1.5：1之比率。

實例3-10 共溶劑對2-丁酮轉化之效應

測試多種共溶劑對在不動桿菌屬DSM 17874 CHMO與2-丁酮之反應中所形成之產物之比率的影響。如在先前實例中，觀察到200mM 2-丁酮對此比率具有正效應。特定而言，增加2-丁酮之濃度可形成更多丙酸甲酯，從而改良乙酸乙酯：丙酸甲酯比率。亦測試此濃度(200mM)下之眾多共溶劑。如表4中可見，200mM甲醇具有顯著效應，其使該比率逆轉而完全有利於丙酸甲酯。在該等條件下，所形成之丙酸甲酯多於乙酸乙酯。其他所測試之共溶劑亦顯示正效應。二噁烷、2-丁醇、丙酮及乙腈皆對比率具有顯著正效應。

實例11-13

亦研究共溶劑對總轉化量之效應且顯示於表5中。在一些情形(二噁烷、丙酮及乙腈)下形成顯著較多之丙酸甲酯同時形成較少乙酸乙酯。

不能計算敏感的相對轉化率。

為慮及在共溶劑存在下受質及產物之不同萃取效率，此處使用共溶劑重新實施校準以排除任何顯著差異。

實例14-16 一組新穎BVMO之純化及其篩選以供2-丁酮之轉化。

已達成若干不同BVMO之過表現及純化且概述於表6中。將該等基因皆選殖至pCRE3C亞磷酸脫氫酶融合載體中且在大腸桿菌TOP10中表現。藉由將培養溫度限制於17℃，獲得RmCHMO及XfCHMO之顯著可溶過表現。亦獲得BpCHMO之顯著可溶表現。純化方案涉及在具有以下添加劑之10mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.4)中藉由音波處理製備細胞游離提取物：10%甘油、0.5mM二硫蘇糖醇、100mM NaCl及25mM咪唑。

AcCHMO：來自不動桿菌屬NCIMB 9871之環己酮單加氧酶；XfCHMO，來自黃色桿菌之環己酮單加氧酶；RmCHMO，來自赤球菌屬菌株HI-31之環己酮單加氧酶。

藉由離心澄清細胞提取物且在4℃下與Ni²⁺-瓊脂糖樹脂一起培育2hr。用相同緩衝液洗滌管柱材料，然後將純蛋白質洗脫為濃縮黃色部分(或在富含酶之情形下為淺色條帶)且藉由凝膠過濾脫鹽。

令人安慰的是，所有經純化之CHMO皆對2-丁酮展示相似活性，將其轉化成丙酸甲酯及丙酸乙酯，且所有經純化之CHMO皆具有當增加2-丁酮濃度時所形成產物之比率向丙酸甲酯遷移之相同特徵。不同CHMO對丙酸甲酯具有相似轉化量，但所形成產物之比率並不相同。

如將瞭解，一些實例顯示使用不同BVMO酶來產製丙酸甲酯或乙酸乙酯。在該等實例中，特定BVMO酶有利地顯示產製丙酸甲酯，但乙酸乙酯較多。然而，一些所測試之BVMO酶顯示根本不轉化或僅向乙酸乙酯轉化。有利地，本發明者亦已發現在異常轉化中有顯著活性之BVMO酶。在本發明之此較佳特徵中，不顯示向丙酸甲酯轉化之BVMO酶可闡述為比較實例，即實例A、B、D、E及H-J。

應注意與本說明書連同本申請案同時或先於其提出並與本說明書一起供大眾查閱之所有論文及文件，且所有該等論文及文件之內容皆以引用方式併入本文中。

本說明書(包含任何附隨申請專利範圍、摘要及附圖)中所揭示之所有特徵及/或如此揭示之任一方法或製程之所有步驟皆可以任何組合進行組合，但其中該等特徵及/或步驟中之至少一些相互排斥之組合除外。

除非另有明確說明，否則本說明書(包含任何附隨申請專利範圍、摘要及附圖)中所揭示之每一特徵可經用於相同、等效或相似目的之替代性特徵替代。因此，除非另有明確說明，否則每一所揭示特徵僅係一系列通用的等效或相似特徵之一實例。

本發明並不限於上述實施例之細節。本發明可擴展至本說明書(包含任何附隨申請專利範圍、摘要及附圖)中所揭示特徵之任何新穎特徵或任何新穎組合，或擴展至如此揭示之任何方法或製程之步驟之任何新穎步驟或任何新穎組合。

Claims

一種產製甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之方法，其包括以下步驟：(i)使用Baeyer-Villiger單加氧酶將2-丁酮轉化成丙酸甲酯，及(ii)處理所產製之該丙酸甲酯以獲得甲基丙烯酸甲酯或其衍生物。
如請求項1之方法，其中該丙酸甲酯係經處理以在適宜觸媒存在下藉由與甲醛或其適宜來源反應來產製甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸。
如請求項1或2中任一項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係野生型酶，且其中該野生型Baeyer-Villiger單加氧酶之細菌來源係來自以下細菌屬之細菌：不動桿菌屬(Acinetobacter)、赤球菌屬(Rhodococcus)、關節桿菌屬(Arthrobacter)、短單胞菌屬(Brachymonas)、奴卡氏菌屬(Nocardia)、外瓶黴屬(Exophiala)、短桿菌屬(Brevibacterium)、戈登氏菌屬(Gordonia)、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、嗜高溫放線菌屬(Thermobifida)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係源自以下細菌種類之野生型酶：醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)NCIMB 9871或約氏赤球菌(Rhodococcus jostii)RHA1或赤球菌屬HI-31或黃色桿菌(Xanthobacter flavus)或派氏短單胞菌(Brachymonas petroleovorans)。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係I 型、II型或O型Baeyer-Villiger單加氧酶。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係選自以下酶群組中之一者之I型Baeyer-Villiger單加氧酶：環己酮單加氧酶(CHMO)，EC編號為1.14.13.22(GenBank：BAA86293.1)；苯丙酮單加氧酶(PAMO)，EC編號為1.14.13.92(Swiss-Prot：Q47PU3)；4-羥基苯乙酮單加氧酶(HAPMO)，EC編號為1.14.13.84(GenBank：AAK54073.1)；丙酮單加氧酶(ACMO)(GenBank：BAF43791.1)；甲基酮單加氧酶(MEKA)(GenBank：ABI15711.1)；環十五酮單加氧酶(CPDMO)(GenBank：BAE93346.1)；環戊酮單加氧酶(CPMO)(GenBank：BAC22652.1)：類固醇單加氧酶(STMO)(GenBank：BAA24454.1)。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶為環己酮單加氧酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶、環十五酮單加氧酶或丙酮單加氧酶，其係選自以下酶中之一者：來自醋酸鈣不動桿菌NCIMB 9871之環己酮單加氧酶、來自黃色桿菌(GenBank：CAD10801.1)之環己酮單加氧酶、來自赤球菌屬HI-31(GenBank：BAH56677.1)之環己酮單加氧酶、來自派氏短單胞菌(GenBank：AAR99068.1)之環己酮單加氧酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶(Q93TJ5.1)、環十五酮單加氧酶(GenBank：BAE93346.1)或來自戈登氏菌屬TY-5(Genbank：BAF43791.1)之丙酮單加氧酶。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係選自以下之環己酮單加氧酶或丙酮單加氧酶：來自醋酸鈣不動桿菌NCIMB 9871之環己酮單加氧酶、來自黃色桿菌(GenBank：CAD10801.1)之環己酮單加氧酶、來自赤球菌屬HI-31(GenBank：BAH56677.1)之環己酮單加氧酶、來自派氏短單胞菌(GenBank： AAR99068.1)之環己酮單加氧酶或來自戈登氏菌屬TY-5(Genbank：BAF43791.1)之丙酮單加氧酶。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係選自環己酮單加氧酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶或環十五酮單加氧酶。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶為環己酮單加氧酶。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係源自以下之環己酮單加氧酶：醋酸鈣不動桿菌NCIMB 9871、黃色桿菌(GenBank：CAD10801.1)或赤球菌屬HI-31(GenBank：BAH56677.1)。
如請求項1至7或9中任一項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係源自螢光假單胞菌(Pseudomonas flourescans)之4-羥基苯乙酮單加氧酶。
如請求項1至7或9中任一項之方法，其中該Baeyer-Villiger單加氧酶係源自假單胞菌屬HI-70 之環十五酮單加氧酶。
如任一前述請求項之方法，其中在該以上方法之反應混合物中包含至少一種共溶劑，其中該共溶劑係選自以下中之一者：甲醇、2-丁醇、第三丁醇、二噁烷、丙酮或乙腈。
如請求項14之方法，其中所使用之該共溶劑係甲醇。
如請求項14或15之方法，其中共溶劑/受質之濃度係1000：1或更大mol：mol Baeyer-Villiger單加氧酶。
如任一前述請求項之方法，其中藉由該Baeyer-Villiger單加氧酶產製之丙酸甲酯：乙酸乙酯之比率係至少1：5。
如任一前述請求項之方法，其中該Baeyer Villiger單加氧酶以至少2%選擇性之絕對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。
如任一前述請求項之方法，其中該BaeyerVilliger單加氧酶以至少20%相對量將2-丁酮轉化成丙酸甲酯。
一種製備甲基丙烯酸甲酯或其衍生物之聚合物或共聚物之方法，其包括以下步驟：(i)根據如請求項1至19中任一項之方法製備甲基丙烯酸甲酯或其衍生物；(ii)將(i)中所製備之該甲基丙烯酸甲酯視情況與一或多種共單體聚合以產製其聚合物或共聚物。
如請求項20之方法，其中該等共單體係單烯系不飽和羧酸及二羧酸及其衍生物，包含酯、醯胺及酐。
如請求項20或21之方法，其中該等共單體係選自：丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸第三丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸異莰基酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸第三丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸異莰基酯、甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯、三丙二醇二丙烯酸酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、異氰酸酯(包含甲苯二異氰酸酯及p,p'-二苯甲烷二異氰酸酯)、丙烯腈、丁二烯、丁二烯與苯乙烯(MBS)及ABS，條件係在(i)中之該酸單體或(ii)中之該酯單體與該等共單體中之一或多者的任一給定共聚作用中，該等以上共單體中之任一者不為選自以上(i)或(ii)中之甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯之該單體。
一種聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)均聚物或共聚物，其係自如請求項20至22中任一項之方法形成。