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TW201343198A - 高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關一種高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑及其製法，該製劑包含醫藥有效量之長效人類生長激素共軛物(其中人類生長激素(hGH)係連接免疫球蛋白Fc區)與無白蛋白之穩定劑，該穩定劑包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇、與作為等滲劑之氯化鈉。

Description

高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑
本發明係有關一種高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑及其製法，該製劑包含醫藥有效量之長效人類生長激素共軛物(其中人類生長激素(hGH)係連接免疫球蛋白Fc區)與無白蛋白之穩定劑，該穩定劑包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇、與作為等滲劑之氯化鈉。
人類生長激素(下文稱為‘hGH’)係一種由腦下垂體前葉分泌之由191個胺基酸組成之多肽激素，其分子量約22,000Da。人類生長激素主要用於治療小兒科腦下垂體侏儒症。過去係採用來自人類腦下垂體之hGH，但其供應量有限。因此僅有極少數的人可以接受治療。此外，自從有些接受從腦下垂體所收集之hGH之患者發生退化性神經病變之庫賈氏(Creutzfeldt-Jacob)症後，即禁止使用從腦下垂體萃取之hGH。藉由目前基因工程技術之發展，已經可能在大腸桿菌(E.coli)與酵母中製造hGH。因此由基 因工程製造之生物合成性hGH醫藥已通過毒性與臨床試驗並在1985年後由許多國家核准成為上市商品。
通常，如hGH之多肽具有低穩定性，因此容易變性。此外其亦容易被血清蛋白酶降解，被腎臟或肝臟排出。因此包含多肽作為醫藥成份之蛋白質藥物必需經常投與患者，以維持其血液濃度及效價。然而，由於蛋白質藥物通常呈注射劑形式投藥，為了維持活性多肽之最適當血液濃度而需頻繁注射蛋白質藥物卻會造成患者很多疼痛。為了解決此等問題，已試圖提高蛋白質藥物在血液中之穩定性，並使其血液濃度長期維持在高濃度下，以儘量提高醫藥之醫療效力。為了發展蛋白質藥物之長效製劑，必需在不引起患者任何免疫反應，確保該製劑可提高蛋白質藥物之穩定性，同時維持藥物本身夠高之效價。
穩定蛋白質並防止其與蛋白酶接觸及從腎臟流失之方法，已有在蛋白質藥物表面利用化學方式增加高度可溶性聚合物，如：聚乙二醇(PEG)。PEG結合在標靶蛋白質之專一性位置或各種不同非專一性位置，並提高蛋白質溶解度，藉以穩定蛋白質。此外，PEG可有效防止蛋白質水解，且不會引起任何特別副作用。雖然PEG結合作用可提高蛋白質穩定性，但生理活性蛋白質之效價卻顯著降低，且隨著PEG分子量升高，其與蛋白質之反應性下降，因而降低產量。
另一種提高生理活性蛋白質活體內穩定性之方法為發展一種製造融合蛋白質之方法，其係透過基因重 組法連結可編碼在血液中具有高度穩定性蛋白質之基因與編碼生理活性蛋白質之基因，並培養經該重組基因轉形之動物細胞。例如：由已知可高度有效提高蛋白質穩定性之白蛋白或其片段利用基因重組法連接標靶生理活性蛋白質，以製造融合蛋白質(國際專利公告案案號WO 93/15199與WO 93/15200、歐洲專利公告案案號EP 413,622)。
此外，美國專利案案號5,045,312揭示一種使用免疫球蛋白之方法，當由hGH利用交聯劑與牛血清白蛋白(BSA)或鼠類免疫球蛋白共軛時，該共軛hGH之活性會比未經修飾之生長激素活性高。然而，上述專利案僅揭示以低分子量化合物(如：碳化二亞胺或戊二醛)作為交聯劑。當使用此等低分子量交聯劑時，由於其係非專一性共軛作用，很難得到均質組成物，而且其具有活體內毒性。此外，上述專利案僅揭示利用化學偶聯法提高生長激素活性，但並未說明化學偶聯法對其他多肽藥物型態之活性之影響，無法了解其與蛋白質穩定性之相關性，如：持續性與血清半衰期之提高。
近來，韓國專利案案號10-0567902(改良活體內持續性之生理活性多肽共軛物(Physiologically Active Polypeptide Conjugate Having Improved In Vivo Durability)及韓國專利案案號10-0725315(使用免疫球蛋白片段之蛋白質複合物與其製法(Protein Complex Using An Immunoglobulin Fragment And Method For The Preparation Thereof))揭示由生理活性多肽連接免疫球蛋白Fc區與非 肽聚合物製成共軛物，作為蛋白質藥物之長效製劑，其可使蛋白質活性下降程度減至最低而且可提高蛋白質穩定性。根據此等方法，hGH可作為生理活性多肽，用於製備長效hGH共軛物。包含長效hGH共軛物之藥物進行商品化時，必需防止其物理化學變化，如：在儲存及運送期間受光、熱或添加物中之雜質所誘發之變性、凝集、吸附或水解，同時保留hGH之活體內效力。相較於hGH多肽，長效hGH共軛物之分子更大，且分子量提高，因此很難穩定該共軛物。
在製藥工業中，液體中之低蛋白質穩定性成為一種限制。因此蛋白質經過冷凍乾燥，以解決穩定性問題。雖然冷凍乾燥之蛋白質製劑具有長期保留穩定性之優點，但當注射時，必需使用溶解助劑重新配製。此外，當使用溶解助劑重新配製或冷凍乾燥時，常有因形成聚合物而流失其活性等等之缺點，而且冷凍乾燥亦需要高成本與時間。為了克服此等限制，國際專利公告案案號WO93/019776與案號WO94/003198揭示一種穩定之hGH液體製劑。為了發展穩定之液體hGH製劑，重點在於控制hGH之降解，如：調節因脫醯胺化、形成聚合物及氧化過程形成降解產物之速率。液體製劑之溫度、pH與添加劑會影響降解產物之形成速率，但可穩定所有蛋白質型態供臨床應用之製劑仍尚未知。此外，對特定蛋白質具有穩定效力之液體製劑經常無法用於穩定其他蛋白質。因此，上述參考文獻揭示，首先需要選擇及組合可依更廣泛方式降低特定 蛋白質降解產物至最低形成速率，並使液體中hGH蛋白質達到最高穩定性之因素。
此外，不同蛋白質可能基於其化學性質差異，依不同比例及不同儲存條件而逐漸失活。亦即穩定劑對不同蛋白質之延長儲存期效力不一定相同。因此，用於儲存穩定性之穩定劑會依據標靶蛋白質之物理化學性質而具有各種不同合適比例、濃度與型態。然而，當同時使用不同穩定劑時，會因彼此競爭性交互作用而導致相反結果與副作用。此外，所儲存蛋白質之性質與濃度可能在其儲存期間變化，而使穩定劑可能展現不同於預期之結果。因此，欲穩定溶液中之蛋白質必需非常努力及小心。
特定言之，由於連接生理活性肽hGH與免疫球蛋白Fc區且具有顯著不同於其他典型hGH之分子量與體積可製備提高活體內持續性與穩定性之長效hGH共軛物，因此需要可以穩定蛋白質之特殊組成物。此外，生理活性肽hGH與免疫球蛋白Fc區分別具有不同物理化學性質，因此此二者均需要同時穩定化。然而如上述，不同肽或蛋白質可能在不同比例與儲存條件下，隨其物理化學性質差異而逐漸失活。此外，當同時使用適合每種肽或蛋白質之穩定劑時，會因彼此競爭性交互作用而導致相反結果與副作用。此外，所儲存蛋白質之性質與濃度可能在其儲存期間變化，而使穩定劑可能展現不同於預期之結果。因此，很難針對長效hGH共軛物開發一種可同時穩定生理活性肽hGH與免疫球蛋白Fc區之穩定劑製劑。
為了尋求可提高高度濃縮之長效人類生長激素共軛物液體製劑之穩定性，以便長期儲存，不需擔心病毒污染，並可減少蛋白質沉澱之組成物，本發明者已發現當使用包含緩衝劑、糖醇、非離子性表面活性劑、與作為等滲劑之氯化鈉之穩定劑時，可提高高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定性，因此可製備節省成本且穩定之液體製劑。此外，已確定即使添加防腐劑時，該高度濃縮之長效hGH共軛物仍可穩定儲存，而完成本發明。
本發明主題之一為提供一種高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑，其包含醫藥有效量之長效人類生長激素共軛物(其中人類生長激素(hGH)係連接免疫球蛋白Fc區)與無白蛋白之穩定劑，該穩定劑包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇與作為等滲劑之氯化鈉。
本發明另一主題為提供一種製備高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑之方法。
本發明高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑所包含之穩定劑含有緩衝劑、糖醇、非離子性表面活性劑、與作為等滲劑之氯化鈉，但不含人類血清白蛋白及任何可能有害身體之因子。因此，不需要擔心病毒污染。此外，本製劑係由hGH多肽連接免疫球蛋白Fc區所製成之 高度穩定長效hGH共軛物，藉此具有比野生型高之分子量與提高之活體內持續性。此外，即使其中進一步包含防腐劑時，該液體製劑仍保持穩定，因此可作為多次投藥之製劑使用。
第1圖說明包含20mM乙酸鈉緩衝劑(pH 5.6)、150mM氯化鈉、5%甘露糖醇與0.005%聚山梨醇酯(polysorbate)80之長效hGH共軛物液體製劑在其儲存期間，依據長效hGH共軛物之濃度測試之穩定性結果，其顯示IE-HPLC層析法所分析之樣本穩定性。其證實長效hGH共軛物之液體製劑在低濃度與高濃度下均保持類似之穩定程度。
第2圖說明其中除了20mM乙酸鈉(pH 5.6)、150mM氯化鈉、5%甘露糖醇與0.005%聚山梨醇酯80外，尚進一步包含9mg/mL苯甲醇或3mg/mL間甲酚(m-cresol)之高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑在其儲存期間，依據長效hGH共軛物之濃度測試之加速穩定性結果，其顯示IE-HPLC層析法所分析之樣本穩定性。其證實已添加防腐劑，如：苯甲醇或間甲酚之高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑之穩定性仍與無防腐劑(對照組)之製劑類似。
一項具體實施例中，本發明提供一種高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑，其包含醫藥有效量之長效人類生長激素共軛物(其中人類生長激素(hGH) 係連接免疫球蛋白Fc區)、與無白蛋白之穩定劑，該穩定劑包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇與作為等滲劑之氯化鈉。
本發明高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑包含無白蛋白之穩定劑，其確保長效hGH共軛物之穩定性，且無病毒污染之風險。此外，其係具有優異儲存穩定性之簡單製劑，因此可以在比其他穩定劑或冷凍乾燥製劑更有效益之成本下提供藥物。此外，由於本發明液體製劑所包含之長效hGH共軛物可以比野生型蛋白質提高活體內持續性，因此可以比其他常見hGH製劑更長期保留活體內蛋白質活性，因此可用於作為確保高度濃縮之長效hGH共軛物之高度穩定性之有效藥物製劑。
本文所採用術語'長效性hGH共軛物'係指由生理活性肽人類生長激素(hGH)連接免疫球蛋白Fc區之共軛物，其生理活性之活體內持續性高於野生型hGH。本文所採用術語'長效性'係指其生理活性之持續性高於野生型hGH。本文所採用術語'共軛物'係指與免疫球蛋白Fc區偶聯之hGH。
本文所採用術語'人類生長激素(hGH)'係指刺激人類生長、細胞繁殖與再生之肽激素。有關hGH序列之資訊可得自一般資料庫，如：NCBI基因銀行。此外，本發明之hGH範圍包括與野生型人類生長激素胺基酸序列之序列同源性(homology)為70%或以上，較佳為80%或以上，更佳為90%或以上，甚至更佳為95%或以上，最佳為98% 或以上之蛋白質，只要其具有hGH活性即可。此外，只要其生物活性沒有顯著變化，由野生型hGH經過取代、刪除或嵌插胺基酸殘基而衍生之任何突變株均可用於本發明。
適用於本發明之hGH可具有野生型hGH、其變異體、其衍生物或其片段之胺基酸序列。
本文所採用術語'hGH變異體'係指該肽具有一或多種不同於野生型hGH但仍證實具有hGH活性之胺基酸序列。該hGH變異體係經過取代、添加、刪除或修飾野生型hGH之某些胺基酸或其組合後製成。
本文所採用術語'hGH衍生物'係指該肽與野生型hGH具有至少80%之胺基酸序列同源性並具有hGH活性，其中有些胺基酸殘基已經過化學取代(例如：α-甲基化、α-羥基化)、刪除(例如：脫胺化)、或修飾(例如：N-甲基化)。
本文所採用術語'hGH片段'係指在hGH之N-末端或C-末端添加或刪除一個或多個胺基酸，但仍保留hGH活性之肽，該添加之胺基酸不一定為天然胺基酸(例如：D-型胺基酸)。
此外，用於本發明之hGH可得自天然或重組蛋白質。較佳係採用大腸桿菌(E.coli)作為宿主細胞製備之重組hGH，但不受此限制。
本文所採用術語'免疫球蛋白Fc區'係指不包括免疫球蛋白之重鏈與輕鏈之可變區、重鏈恆定區1(CH1)與輕鏈恆定區1(CL1)之免疫球蛋白之一部份。免疫球蛋白 Fc區可為免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)與重鏈恆定區3(CH3)，且可進一步包含重鏈恆定區之樞紐區，但不受此限制。此外，本發明免疫球蛋白Fc區可為包含免疫球蛋白之部份或全部重鏈恆定區1(CH1)與/或輕鏈恆定區1(CL1)，但不包括重鏈與輕鏈之可變區之延伸Fc區，只要其具有實質上與野生型蛋白質相同或改良之效力即可。此外，免疫球蛋白Fc區可為其中已刪除對應於CH2與/或CH3之相當長部份胺基酸序列之片段。亦即本發明免疫球蛋白Fc區可包含1)CH1功能域、CH2功能域、CH3功能域與CH4功能域，2)CH1功能域與CH2功能域，3)CH1功能域與CH3功能域，4)CH2功能域與CH3功能域，5)一個或多個功能域與免疫球蛋白樞紐區(或部份樞紐區)之組合，及6)重鏈恆定區之功能域與輕鏈恆定區之二聚體，但不受此限制。
本發明免疫球蛋白Fc區包含天然胺基酸序列與其胺基酸序列衍生物(突變株)。胺基酸序列衍生物係指天然胺基酸序列中一個或多個胺基酸殘基經過刪除、嵌插、非保留性或保留性取代而具有不同於天然序列之序列，或其組合。例如：IgG Fc中，已知具有蛋白質結合重要性之位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基即成為適合修飾之標靶。
此外，可使用其他型態之衍生物，包括其中已刪除可形成二硫鍵之區域、已消去天然Fc之N-末端幾個胺基酸殘基或在天然FcN-末端添加甲硫胺酸殘基之衍生物。此外，為了消去效應遺傳因子之功能，可以刪除補 體結合位置，例如：C1q-結合位置或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位置。製備免疫球蛋白Fc區之此等序列之技術已揭示於WO 97/34631與WO 96/32478。
蛋白質與肽中，不會改變整體蛋白質活性之胺基酸取代法係相關技藝上已知者(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見之交換法為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu與Asp/Gly，其包括雙向交換。有些例子中，Fc區可經過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙醯基化、醯胺化，等等方式修飾。上述Fc衍生物證實其具有與本發明Fc區相同之生物活性，其對熱、pH，等等具有加強之結構穩定性。
此外，此等Fc區可得自從人類及其他動物(包括：牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠與天竺鼠)中單離之天然蛋白質，或可為得自轉形動物細胞或微生物或其等衍生物之重組體，或其衍生物。其中，從天然免疫球蛋白得到Fc區之方法包括從人類或動物體單離出完整免疫球蛋白，並使用蛋白酶處理。當使用木瓜酵素分解免疫球蛋白時，其可裂解成Fab與Fc區，當使用胃蛋白酶時，可將免疫球蛋白裂解成pF’c與F(ab)2。此等片段可採用分子篩析層析法分離，單離出Fc或pF’c。由人類衍生之Fc區為得自微生物之重組免疫球蛋白Fc區較佳。
此外，本發明免疫球蛋白Fc區可呈天然糖鏈、比天然型更長之糖鏈、比天然型更短之糖鏈、或脫糖基化之型式。可採用相關技藝上已知之方法延長或脫除免疫球蛋白Fc糖鏈，包括化學法、酵素法及使用微生物之基因工程法。脫除免疫球蛋白Fc區之糖鏈會大幅降低其與第一補體組份C1之C1q之結合親和力，因此降低或排除抗體依賴性細胞介導之細胞毒性或補體依賴性細胞毒性，即可避免活體內發生不必要之免疫反應。基於此點，以脫糖基化或非糖基化免疫球蛋白Fc區更適合作為本發明目的之藥物載劑。
本文所採用術語'脫糖基化'係指使用酵素脫除Fc區之糖部份體，且本文所採用術語'非糖基化'係指由原核細胞生物(較佳指大腸桿菌(E.coli))製造之未糖基化態Fc區。
同時，免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或其他動物，包括牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠與天竺鼠，以衍生自人類較佳。
此外，免疫球蛋白Fc區可為彼等衍生自IgG、IgA、IgD、IgE與IgM者，或彼等由其組合或混合體(hybrid)製備者。較佳係衍生自IgG或IgM，其係人類血液中含量最多之蛋白質，最佳係衍生自IgG，已知其可加強配體結合蛋白質之半衰期。
同時，本文所採用術語'組合'係指相同來源之編碼單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽與不同來源之單鏈多肽 之間之共軛(當形成二聚體或多聚體時)。亦即，可由選自下列各物所組成群中之二個或更多個片段形成二聚體或多聚體：IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、與IgE Fc片段。
本文所採用術語'混合體'係指當單鏈免疫球蛋白Fc區具有不同來源之編碼二種或更多種免疫球蛋白Fc片段之序列時。本發明可採用各種不同型態之混合體。亦即，功能域之混合體可由1至4個選自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc與IgD Fc之CH1、CH2、CH3與CH4所組成群中之功能域組成，且可包含樞紐區。
同時，IgG亦可分成子群IgG1、IgG2、IgG3與IgG4，而且本發明亦可使用其組合或混合體，較佳為IgG2與IgG4子群，最佳為缺少效應遺傳因子功能(如：補體依賴性細胞毒性)之IgG4之Fc區。
換言之，本發明共軛物之最佳免疫球蛋白Fc區為衍生自人類IgG4之非糖基化Fc區。衍生自人類之Fc區可成為人體之抗原，因此比可能引起不期望之免疫反應(如：針對抗原產生新抗體)之非衍生自人類之Fc區更佳。
本發明長效hGH共軛物之製法為組合天然hGH或依任何方法製備之重組型hGH，以及使用某種蛋白酶處理野生型IgG或利用重組技術由轉形細胞製備之免疫球蛋白Fc區。
用於此目的之組合法中，共軛物之製法可由hGH與免疫球蛋白Fc區利用非肽基聚合物進行交聯或利用重組技術連接hGH與免疫球蛋白Fc區，製成融合蛋白 質。亦即，共軛物可製成其中利用非肽基連接體連接人類生長激素與免疫球蛋白Fc之型式，或呈hGH與免疫球蛋白Fc之融合蛋白質型式。融合蛋白質包含其中hGH與免疫球蛋白Fc利用肽基連接體組合成之型式，但不受此限制。
本文所採用術語'非肽基聚合物'係指一種生物相容性聚合物，其中組合二個或更多個重覆單位，且重覆單位彼此利用任何共軛法(但非肽鍵結)聯結。本發明中，非肽基聚合物可與非肽基連接體交換使用。
用於交聯之非肽基聚合物可選自下列生物降解性聚合物所組成群者，包括聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚醣、聚乙烯基乙基醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸與其等之組合，較佳為聚乙二醇(PEG)，但不受此限制。此外，相關技藝上已知之其衍生物及可採用相關技藝上已知方法製備之衍生物均包括在本發明範圍內。
製備本發明長效hGH共軛物時，本發明揭示如：韓國專利案案號0725315之文獻作為參考文獻。熟悉此相關技術者可依據參考文獻製造本發明長效hGH共軛物，但不受此限制。
本文所採用術語'高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑'係指包含高濃度長效人類生長激素共軛物之液體製劑。本發明中，長效hGH共軛物液體製劑可包含 醫藥有效量之長效hGH共軛物。通常，hGH之醫藥有效量相當於單次使用小瓶中包含約1至3mg，但不受此限制。
此外，本發明液體製劑中之長效hGH共軛物濃度在1至150mg/mL之範圍內，較佳為15至100mg/mL，更佳為20至100mg/mL，但不受此限制。
本發明高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑中，每單位製劑包含高濃度hGH共軛物，其濃度高於過去之低濃度液體製劑，因此其可載運穩定型之hGH至體內，並保存高濃度hGH共軛物，不會如同過去之液體製劑一般引起蛋白質沉澱。尤其甚至當製劑包含20至100mg/mL hGH共軛物時，其仍保留共軛物之穩定性。
高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑包含醫藥有效量之長效hGH共軛物與無白蛋白之穩定劑。
本文所採用術語'穩定劑'係指可以讓長效hGH共軛物保持儲存穩定性之物質。較佳之穩定劑係包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇與作為等滲劑之氯化鈉者。在如長效hGH共軛物之蛋白質方面，儲存穩定性對確保準確劑量及抑制可能針對長效hGH共軛物形成抗原等方面很重要。
本文所採用術語'緩衝劑'係指含在本發明穩定劑中維持液體製劑穩定pH值之溶液，以防止pH急遽變化，保持長效hGH共軛物之穩定活性。緩衝劑可包括鹼金屬鹽(磷酸鈉或鉀或其一鹼鹽(monobasic salt)或二鹼鹽(dibasic salt))、檸檬酸鈉/檸檬酸、乙酸鈉/乙酸，及相關技 藝上已知任何其他醫藥上可接受之pH緩衝劑，與其組合。為了本發明之目的，較佳緩衝劑為乙酸鹽緩衝劑，但不受此限制。構成乙酸鈉緩衝劑之乙酸鹽濃度較佳在5至100mM之範圍內，更佳為10至50mM之範圍，但不受此限制。緩衝劑之pH在4.0至7.0之範圍內較佳，更佳為5.0至6.0之範圍內，最佳為5.2至6.0之範圍內。本發明一項實施例中，已證實pH 5.6之乙酸鈉緩衝劑適合維持具有各種不同濃度之長效hGH共軛物之穩定性(表5)。
本文所採用術語'糖醇'係指包含在本發明液體製劑中之氫化碳水化合物，其作用在於改善長效hGH共軛物之穩定性。用於本發明之糖醇濃度較佳佔製劑總體積之1至10%(w/v)之範圍內，更佳在5至10%(w/v)之範圍內，但不受此限制。本發明所使用糖醇可為選自甘露糖醇與山梨糖醇所組成群中之一或多種糖醇，較佳為甘露糖醇，但不受此限制。
本文所採用術語'等滲劑'係指當長效hGH共軛物之高度濃縮溶液注射至體內時，可維持適當滲透壓之物。等滲劑可具有進一步穩定溶液中長效hGH共軛物之效力。等滲劑實例為水溶性無機鹽，以氯化鈉較佳。本發明所使用氯化鈉濃度較佳為5至200mM之範圍內，但不受此限制。此外，隨製劑中所包含物質之型態與含量而定，可以調整等滲劑之含量，使包含所有成份之液體製劑成為等滲性。
本文所採用術語'非離子性表面活性劑'係指 可降低蛋白質溶液表面張力之物質，以防止蛋白質吸附或凝集在疏水性表面。本發明可使用之非離子性表面活性劑較佳實例包括聚山梨醇酯型與泊洛沙姆(poloxamer)型非離子性表面活性劑與其組合，以聚山梨醇酯型非離子性表面活性劑較佳。聚山梨醇酯型非離子性表面活性劑實例為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60與聚山梨醇酯80，其中以聚山梨醇酯80較佳，但不受此限制。
同時，不適合添加高濃度非離子性表面活性劑至液體製劑中，因為當利用分析方法(如：UV-光譜儀法或等電焦集法(IEF))測定蛋白質濃度或穩定性來分析蛋白質時，高濃度非離子性表面活性劑會產生干擾效應，因此很難準確測定蛋白質穩定性。因此，本發明液體製劑可能包含之非離子性表面活性劑濃度較佳為0.1%(w/v)或以下，更佳為0.001至0.1%(w/v)之範圍內，甚至更佳為0.001至0.05%(w/v)之範圍內，但不受此限制。本發明一項實例中，已在包含乙酸鹽緩衝劑、糖醇、作為等滲劑之氯化鈉、與聚山梨醇酯80之穩定劑中證實，當聚山梨醇酯80之濃度為0.2%(w/v)時，經過2週之後，會誘發長效hGH共軛物沉澱(表8)。
此外，本發明穩定劑較佳係不含白蛋白。
由於可作為蛋白質穩定劑使用之人類血清白蛋白係從人類血清製造，因此仍有受到衍生自人類之致病性病毒污染之風險。此外，明膠或牛血清白蛋白可能在某些患者中導致疾病或可能誘發過敏反應。本發明蛋白質之 無白蛋白穩定劑不包含異源性蛋白質，如衍生自人類或動物之血清白蛋白或純化之明膠，因此沒有病毒感染風險。
較佳係本發明穩定劑進一步包含糖類、多元醇類或中性胺基酸。
可進一步包含在製劑中以提高長效hGH共軛物儲存穩定性之糖類及多元醇之糖類之較佳實例為單醣，如：甘露糖、葡萄糖、岩藻糖與木糖，及多醣，如：乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖與葡聚糖。多元醇之較佳實例包括丙二醇、低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇、及其組合。
此外，本發明液體製劑中除了上述緩衝劑、等滲劑、糖醇類與非離子性表面活性劑外，尚可進一步選擇性包含相關技藝上已知之其他成份或材料，但其不可以損害本發明之效力。
明確言之，本發明液體製劑可進一步包含防腐劑。
本文所採用'防腐劑'係指可實質上降低製劑中細菌污染之物質。尤其在製劑中包含防腐劑有助於製造多劑量製劑。防腐劑實例包括十八碳基二甲基-苯甲基銨氯化物、六甲基氯化銨(hexamethonium chloride)、氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)(具有長烷基鏈之烷基苯甲基二甲基銨氯化物之混合物)、與氯化苄乙氧銨(benzethonium chloride)。其他防腐劑型態包括芳香醇類，如：苯酚(phenol)醇、丁基醇、與苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯類，如：對 羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；與間甲酚，但不受此限制。本發明液體製劑中之防腐劑較佳為苯甲醇或間甲酚，但不受此限制。防腐劑之濃度較佳在1至10mg/mL之範圍內。
本發明一項實施例中，在不同pH與緩衝劑下檢測免疫球蛋白Fc區之穩定性。以pH為例，免疫球蛋白Fc區在pH 5.6至6.0下保持穩定，在pH 5.6下甚至具有更高穩定性(實施例2與表1)。在檸檬酸鈉、乙酸鈉與組胺酸緩衝劑中，以使用乙酸鈉緩衝劑時之穩定性較高(實施例3與表2)。依據此等結果，製備包含20mg/mL或以上之高濃度長效hGH共軛物、緩衝劑、作為等滲劑之氯化鈉、作為醇之甘露糖醇、及作為表面活性劑之聚山梨醇酯80之液體製劑。當使用乙酸鈉作為緩衝劑時，即使經過2週後，共軛物亦未出現沉澱。此外，當與對照組比較時，共軛物之穩定性高於對照組(實施例4)。此外，並檢測液體製劑所包含糖醇與表面活性劑之濃度對長效hGH共軛物之影響。然後，在5%至10%甘露糖醇下測得共軛物保持穩定，且在0.2%(w/v)或更低濃度之聚山梨醇酯80(實施例5)下未出現沉澱。此外，檢測本發明液體製劑中添加防腐劑與否對長效hGH共軛物之穩定性之影響。結果證實，即使添加防腐劑(如：苯甲醇或甲酚)，共軛物之穩定性仍類似對照組。因此證實如果需要重覆投藥時，本液體製劑可以進一步包含防腐劑(實施例6)。
另一項具體實施例中，本發明提供一種製備 高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑之方法。本發明方法可以製備高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定液體製劑，其包含長效hGH共軛物與無白蛋白之穩定劑，該穩定劑包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇與作為等滲劑之氯化鈉。
該長效hGH共軛物、液體製劑、緩衝劑、糖醇、等滲劑與非離子性表面活性劑係與上述相同。
製備高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑之方法可包括混合長效hGH共軛物與包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇與作為等滲劑之氯化鈉之穩定劑之步驟。更明確言之，該方法可包括下列步驟(a)製造長效hGH共軛物或製備所製造之長效hGH共軛物；及(b)混合步驟(a)所製備之長效hGH共軛物與包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇與作為等滲劑之氯化鈉之穩定劑，但不受此限制。
此外，當在該方法之步驟(b)混合長效hGH共軛物與穩定劑時，可能進一步添加防腐劑，但不受此限制。
當根據本發明方法製備之液體製劑包含防腐劑時，其亦可用於多重投藥。
根據本發明之實施例，即使添加高濃度長效hGH共軛物時，包含乙酸鈉緩衝劑、作為等滲劑之氯化鈉、作為糖醇之甘露糖醇、與作為表面活性劑之聚山梨醇酯80之穩定劑不會引起共軛物沉澱，仍保持其穩定性(實施例1至5)。亦即，20.0mg/mL或以上之高濃度長效hGH共軛物 可在本發明液體製劑中保持穩定，不會出現蛋白質沉澱。此外，即使在液體製劑中添加苯甲醇或間甲酚作為防腐劑時，仍保有穩定性。因此證實若需要重覆投藥時，可以進一步添加防腐劑至製劑中(實施例6與第2圖)。
(發明模式)
下文中參考實施例更詳細說明本發明。然而，此等實施例僅供說明，本發明無意受到此等實施例之限制。
實施例1：長效hGH共軛物之製法
取ALD-PEG-ALD(其係兩端均具有醛基之分子量(MW)約3.4kDa之聚乙二醇)與hGH(MW 22kDa)共軛，然後連接衍生自人類IgG4非糖基化Fc區(MW 50kDa)之N-末端。透過此作法，製成代表本發明長效hGH共軛物之終產物hGH-PEG-Fc共軛物，並純化。
實施例2：免疫球蛋白Fc區在不同pH之穩定性分析法
在不同條件下測定構成長效hGH共軛物之hGH多肽與免疫球蛋白Fc區之穩定性。在包含緩衝劑、氯化鈉、甘露糖醇、與聚山梨醇酯80之液體製劑中，比較不同pH下之免疫球蛋白Fc區之穩定性。
採用表1之各組成物作為免疫球蛋白Fc區之緩衝劑，然後於緩衝劑中，在40℃下儲存4週，利用離子交換層析法(IE-HPLC)分析免疫球蛋白之穩定性。表2中，由IE-HPLC(%)顯示免疫球蛋白Fc區之殘留純度，其係相較於初始純度，以(面積%/初始面積%)%表示。
如表2所示，在pH 5.6(#5)4週後，IE-HPLC(%)為67.9%，表示最高之免疫球蛋白Fc區穩定性。此外，在pH 4.8至5.2(#1至#3)，從開始即誘發蛋白質沉澱，因此未分析其穩定性，在pH 5.4(#4)經過3週後出現沉澱。
實施例3：免疫球蛋白之穩定性與緩衝劑之相關性分析
以市面上取得之hGH製劑商品為主，在常用為緩衝劑之不同緩衝劑(包括乙酸鹽、檸檬酸鹽與組胺酸)中比較免疫球蛋白Fc區之穩定性。
採用表3之各組成物作為免疫球蛋白Fc區之緩衝劑，然後於40℃下儲存3週，利用離子交換層析法分析免疫球蛋白Fc區之穩定性。表4中，由IE-HPLC(%)顯 示免疫球蛋白Fc區之殘留純度，其係相較於初始純度，以(面積%/初始面積%)%表示。
如表4所示，當使用pH 5.6之乙酸鈉(#2)作 為緩衝劑時，免疫球蛋白Fc區之殘留純度為88.9%(1週)、77.6%(2週)與68.2%(3週)。
此等結果顯示，當使用乙酸鈉(#2)作為緩衝劑時，免疫球蛋白Fc區之穩定性高於使用檸檬酸鈉(#1)與組胺酸(#3)時之穩定性。
實施例4：長效hGH共軛物之穩定性與蛋白質濃度及緩衝劑之相關性分析
採用實施例3所檢測之緩衝劑，比較高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定性。採用表5中各組成物作為高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑，然後於25℃下儲存4週，利用離子交換層析法與分子篩析層析法(SE-HPLC)分析共軛物之穩定性。
表6中，IE-HPLC(%)與SE-HPLC(%)顯示高度濃縮之長效hGH共軛物在分析時間點之純度。
如表6所示，當使用pH 5.6之20mM乙酸鈉(#3、#6、#9)作為緩衝劑時，在儲存4週後，高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定性高於使用pH 5.6之20mM檸檬酸鈉時之穩定性(#2、#5、#8)。
此外，在高達39.0mg/mL至78.0mg/mL之蛋白質濃度，當使用pH 5.2之檸檬酸鈉(#1、#4、#7)或pH 5.6之檸檬酸鈉(#2、#5、#8)作為緩衝劑時，在儲存2週後開 始出現蛋白質沉澱，儲存3週後沉澱程度增加。
實施例5：高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定性與糖醇及表面活性劑濃度之相關性分析
採用實施例4所檢測之液體製劑(包含pH 5.6之20mM乙酸鈉、150mM氯化鈉、5%(w/v)甘露糖醇、0.005%(w/v)聚山梨醇酯80)，在不同濃度之糖醇與表面活性劑下，檢測高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定性。此時，在可取得之製劑所設定或核准機關所建議之最大容許範圍內選擇糖醇與表面活性劑之濃度。
採用表7中各組成物作為高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑，然後於25℃儲存4週，利用離子交換層析法與分子篩析層析法分析共軛物之穩定性。
表8中，IE-HPLC(%)與SE-HPLC(%)顯示高度濃縮之長效hGH共軛物在分析時間點之純度。
如表8所示，當使用pH 5.6之20mM乙酸鈉與甘露糖醇及聚山梨醇酯80時，對照組-1與對照組-2之高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定性最高。此外，當聚山梨醇酯80之濃度為0.2%(w/v)時，試驗組#2、#3、#5與#6顯示，儲存2週後，任一種濃度均出現蛋白質沉澱。
實施例6：高度濃縮之長效hGH共軛物製劑之穩定性與防腐劑之相關性分析法
採用實施例5所示之液體製劑(包含pH 5.6之20mM乙酸鈉、150mM氯化鈉、5%(w/v)甘露糖醇、0.005%(w/v)聚山梨醇酯80)，檢測高度濃縮之長效hGH共軛物之穩定性與防腐劑之相關性。此時使用苯甲醇與間甲酚作為代表性防腐劑。
明確言之，採用表9之各組成物作為高度濃縮之長效hGH共軛物之液體製劑，然後於25℃儲存4週，利用離子交換層析法與分子篩析層析法分析該製劑之穩定性。
表10中，IE-HPLC(%)與SE-HPLC(%)顯示高度濃縮之長效hGH共軛物在分析時間點之純度。
如表10所示，當使用9mg/mL苯甲醇或3mg/mL間甲酚作為防腐劑時，該製劑之穩定性係與對照組類似。
此結果說明即使當本發明包含高度濃縮之長效hGH共軛物之製劑進一步包含防腐劑時，仍不影響該hGH之穩定性。因此該包含防腐劑之本發明製劑可應用於重覆投藥。
熟悉此相關技術者咸了解，可能在不偏離本發明範圍與本質下進行各種不同修飾與變化。因此應了解，上述具體實施例沒有限制，僅供說明所有態樣。本發明之範圍係由附錄之申請專利範圍界定，而不由其前文說明界定，因此落在申請專利範圍界線內之所有變化與修飾或此等界線之同等物均包括在申請專利範圍內。

Claims (26)

  1. 一種高度濃縮之長效人類生長激素(hGH)共軛物之液體製劑，其包含醫藥有效量之長效人類生長激素共軛物與無白蛋白之穩定劑，該人類生長激素(hGH)係連接免疫球蛋白Fc區，且該穩定劑包含緩衝劑、非離子性表面活性劑、糖醇與作為等滲劑之氯化鈉。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該緩衝劑為乙酸鹽緩衝劑。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中長效人類生長激素共軛物之濃度為20至100mg/mL之範圍內。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該糖醇係選自下列各物所組成群中：甘露糖醇、山梨糖醇與其組合。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之液體製劑，其中該糖醇之使用濃度為製劑總體積之1至10%(w/v)之範圍內。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該緩衝劑之pH為5.0至6.0之範圍內。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該氯化鈉之使用濃度為5至200mM之範圍內。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該非離子性表面活性劑為聚山梨醇酯80。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之液體製劑，其中該非離子性表面活性劑之使用濃度為製劑總體積之0.001至 0.05%(w/v)之範圍內。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該穩定劑進一步包含一或多種選自下列各物所組成群中之成份：糖、多元醇與胺基酸。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其包含防腐劑。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之液體製劑，其中該防腐劑為苯甲醇或間甲酚。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之液體製劑，其中該防腐劑之使用濃度為1至10mg/mL之範圍內。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該人類生長激素(hGH)具有與野生型人類生長激素相同之胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該免疫球蛋白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之液體製劑，其中該免疫球蛋白Fc區之各功能域為衍生自選自IgG、IgA、IgD、IgE與IgM所組成群中之免疫球蛋白之不同來源功能域之混合體。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之液體製劑，其中該免疫球蛋白Fc區為由相同來源功能域組成之單鏈免疫球蛋白所構成之二聚體或多聚體。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之液體製劑，其中該免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之液體製劑，其中該免疫球蛋白Fc區為非糖基化之人類IgG4 Fc區。
  20. 如申請專利範圍第1項所述之液體製劑，其中該長效人類生長激素共軛物為利用非肽基聚合物連接人類生長激素與免疫球蛋白Fc區之共軛物或利用基因重組技術製造之共軛物。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之液體製劑，其中該非肽基聚合物係選自下列生物可降解性聚合物所組成之群中，如：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚醣、聚乙烯基乙基醚、聚乳酸(PLA)、及聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、與其等之組合。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之液體製劑，其中該非肽基聚合物為聚乙二醇。
  23. 一種高度濃縮之長效人類生長激素共軛物之液體製劑，其包含長效人類生長激素共軛物與無白蛋白之穩定劑，該人類生長激素(hGH)係利用聚乙二醇連接免疫球蛋白片段，該穩定劑包含乙酸鹽緩衝劑、甘露糖醇、聚山梨醇酯80、與氯化鈉。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之液體製劑，其進一步包含防腐劑。
  25. 一種製備如申請專利範圍第1至22項中任一項所述之液體製劑之方法，其包括混合長效人類生長激素共軛 物與穩定劑，該穩定劑包含緩衝劑、糖醇、非離子性表面活性劑與作為等滲劑之氯化鈉。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該方法進一步包括將防腐劑與長效人類生長激素共軛物及穩定劑加以混合。
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